CN112898228B - 基于混合组装的混合聚集体fret探针及其在检测线粒体自噬中的用途 - Google Patents

基于混合组装的混合聚集体fret探针及其在检测线粒体自噬中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于混合组装的混合聚集体FRET探针及其在检测线粒体自噬中的用途。该探针体系含有A和B两种分子，具有如下式所示的结构特征。A和B分子可以在水溶液环境中通过混合组装，构建出同时含有A和B的混合聚集体。A的荧光发射波长与B的吸收波长有部分交叠，能够产生荧光共振能量转移(FRET)效应。在活细胞内，该探针体系可以被用来检测自噬。

Description

基于混合组装的混合聚集体FRET探针及其在检测线粒体自噬 中的用途
技术领域
本发明涉及化学生物学领域，具体涉及荧光探针及其在检测线粒体自噬中的用途，更具体地，涉及具有荧光共振能量转移(FRET)性能的荧光探针及其在检测线粒体自噬中的用途和确定细胞内是否存在线粒体自噬的方法。
背景技术
荧光共振能量转移FRET是指在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团(供体)的发射光谱与另一个基团(受体)的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时(一般小于
Figure BDA0002902457330000011
)，就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即以前一种基团的激发波长激发时，可观察到后一个基团发射的荧光。简单地说，就是在供体基团的激发状态下由一对偶极子介导的能量从供体向受体转移的过程，此过程没有光子的参与，所以是非辐射的。供体分子被激发后，当受体分子与供体分子相距一定距离，且供体和受体的基态及第一电子激发态两者的振动能级间的能量差相互适应时，处于激发态的供体将把一部分或全部能量转移给受体，使受体被激发，在整个能量转移过程中，不涉及光子的发射和重新吸收。
能量供给体-接受体对之间发生有效能量转移的条件是苛刻的，主要包括：(1)能量供体的发射光谱与能量受体的吸收光谱必须重叠；(2)能量供体与能量受体的荧光生色团必须以适当的方式排列；(3)能量供体、能量受体之间必须足够接近，这样发生能量转移的几率才会高。此外，对于合适的供体、受体分子在量子产率、消光系数、水溶性、抗干扰能力等方面还有众多的要求。一个合适的供给体-接受体对是很不容易获得的。
FRET在很多领域如纳米技术、分析化学、生物传感器、生物学研究等均有着广泛的应用。通常的方法是将两个荧光团通过化学键连接在同一个分子的不同位点，当分子构象发生变化时，FRET信号也随之变化；或者是将两个荧光团分别连接到两个不同的分子上，当两个分子发生相互作用时，FRET信号也同时改变。这种通过化学键构建的FRET荧光对制备方法繁琐，成本也高。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种FRET荧光分子对，该荧光分子对由两种不同结构的菁染料分子组成，它们在水溶液体系或者细胞内生理环境中能够自发聚集形成一种同时含有A和B的混合聚集体。该混合聚集体具有发生FRET荧光的能力，并且具有良好的生物相容性、低细胞毒性，可以用来监测线粒体自噬的生理过程。
本发明所提供的FRET荧光分子对，由化合物A或其立体异构体与化合物B或其立体异构体构成，其中化合物A的结构式如下所示，
Figure BDA0002902457330000021
化合物B的结构式如下所示，
Figure BDA0002902457330000022
其中，R1可为氢、C1-6烷基(具体可为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基或异己基)、芳基或C1-4烷基取代的苯基(甲基苯基或二甲基苯基)；具体地，R1可为H、乙基；
R2-R9各自独立地为氢、氟、氯、溴、碘、C1-6烷基、C1-6卤代烷基(具体可为一氟甲烷基、二氟甲烷基、三氟甲烷基、一溴甲烷基、二溴甲烷基或三溴甲烷基)或C1-6烷氧基(具体可为甲氧基、乙氧基或丙氧基)；具体可为：三氟甲基、甲氧基、氟；
R10和R11各自独立地为C1-6烷基磺酸基(具体可为：正丙基磺酸基，乙基磺酸基)、C1-6烷基羟基(具体可为-CH2CH2OH)、C1-6烷基(具体可为乙基)；
X1和X2独立地为碳(-CH2-)、氧、硫、硒或碲。
具体地，R1可为氢、C1-3烷基或芳基；
R2-R9各自独立地为氢、氟、氯、溴、碘、C1-3烷基、C1-3卤代烷基或C1-3烷氧基；R10和R11各自独立地为C1-6烷基、C1-6烷基磺酸基、C1-6烷基羟基、C1-6烷氧基。
根据本发明的实施例，化合物A具体可为如下任意一种或其立体异构体：
Figure BDA0002902457330000031
化合物B为如下任意一种或其立体异构体：
Figure BDA0002902457330000032
所述FRET荧光分子对中，化合物A或其立体异构体与化合物B或其立体异构体的摩尔比可为0:1至20:1，端点值0不取，具体可为1:1至8:1；
由化合物A或其立体异构体与化合物B或其立体异构体在水溶液体系中自发聚集形成的混合聚集体也属于本发明的保护范围。
本发明的另一目的是提供上述FRET荧光分子对或由化合物A或其立体异构体与化合物B或其立体异构体在水溶液体系中自发聚集形成的混合聚集体作为荧光探针在检测线粒体自噬中的应用。
本发明的FRET荧光分子对可以分别进入线粒体和溶酶体，非自噬状态下没有FRET荧光信号，当自噬发生时才出现FRET信号；或者FRET荧光分子对可以同时进入线粒体或者溶酶体，非自噬状态下出现FRET信号，而自噬发生时FRET信号减弱甚至消失。通过对细胞内FRET荧光信号的检测可以有效地判断细胞内是否出现了线粒体自噬现象。这些荧光分子的膜通透性好，不需要对细胞进行固定、通透等处理，在保持细胞活性的条件下对细胞内自噬进行检测；同时具有生物相容性好、细胞毒性低的优点，且不易受细胞内pH值的影响。此外，该FRET荧光分子对制备简单，检测操作简便、快捷，有望发展成为检测活细胞线粒体自噬的通用染料。
本发明再一目的是提供一种确定细胞内是否存在线粒体自噬的方法。
本发明所提供的确定细胞内是否存在线粒体自噬的方法，包括：将上述FRET荧光分子对作为荧光探针与细胞接触；以及对接触后的细胞进行荧光信号检测；
其中，接触后的细胞出现FRET荧光信号变化，是所述细胞内存在线粒体自噬的指示。
如前所述，根据本发明实施例的FRET荧光分子对可以分别进入线粒体和溶酶体，非自噬状态下没有FRET荧光信号，当自噬发生时才出现FRET信号；或者FRET荧光分子对可以同时进入线粒体或者溶酶体，非自噬状态下出现FRET信号，而自噬发生时FRET信号减弱甚至消失。通过对细胞内FRET荧光信号的检测可以有效地判断细胞内是否出现了线粒体自噬现象。需要说明的是，线粒体自噬检测方法具有前述荧光探针的全部技术特征和优点，在此不再一一赘述。
根据本发明的实施例，所述荧光探针是以溶液的形式提供的，所述溶液中的溶剂选自生理盐水、钾盐溶液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液、磷酸盐的缓冲溶液、甲醇溶液、乙醇溶液、乙腈溶液、二甲基亚砜溶液和二甲酰胺溶液的至少一种。
其中，需要说明的是，“甲醇溶液”可以是纯的甲醇，也可以是甲醇和水以任意比例混合得到的溶液。同理，“乙醇溶液”、“乙腈溶液”、“二甲基亚砜溶液”和“二甲酰胺溶液”也是如此，在此不再一一赘述。
根据本发明的实施例，三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液和磷酸盐的缓冲溶液的pH值均为6.2-8.2，浓度均为0.1-50mmol/L。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
本发明的FRET荧光探针膜通透性好，不需要对细胞进行固定、通透等处理，在保持细胞活性的条件下对细胞内线粒体自噬进行特异性标记；同时该探针具有光稳定性好和细胞毒性低的优点，可以实现对细胞样品较长时间有效观测。此外，该探针成分简单，检测操作简便、快捷，有望成为检测活细胞线粒体自噬的通用染料。
附图说明
图1显示了本发明实施例1制得的化合物(1)的1H-NMR图；
图2显示了本发明实施例1制得的化合物(1)的质谱图；
图3显示了本发明实施例2中化合物(2)的细胞毒性分析图；
图4显示了本发明实施例3中化合物(2)和化合物(4)混合聚集体的吸收光谱图；
图5显示了本发明实施例4中化合物(2)和化合物(4)混合聚集体的FRET荧光光谱图；
图6显示本发明实施例5中化合物(1)和化合物(5)混合聚集体的FRET荧光光谱图；
图7显示本发明实施例6中化合物(7)和化合物(8)混合聚集体的细胞定位图；
图8显示本发明实施例7中化合物(3)和化合物(4)混合聚集体的细胞定位图；
图9显示本发明实施例8中化合物(6)和化合物(9)混合聚集体的细胞定位图；
图10显示本发明实施例9中化合物(3)和化合物(4)组成的FRET荧光对的线粒体自噬成像图；
图11显示了本发明实施例10中化合物(2)和化合物(5)组成的FRET荧光对的线粒体自噬成像图；
图12显示了本发明实施例11中化合物(6)和化合物(4)组成的FRET荧光对的线粒体自噬成像图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，该荧光探针还可以作为激光染料、非线性光学材料以及生物传感器等的组成。
除非以其他方式明确指出，在本文中通篇采用的描述方式“各…独立地为”、“…独立地为”和“…各自独立地为”可以互换，均应做广义理解，其既可以是指在不同基团中，相同符号之间所表达的具体选项之间互相不影响，也可以表示在相同的基团中，相同符号之间所表达的具体选项之间互相不影响。
本发明中立体化学的定义和惯例的使用通常参考以下文献：S.P.Parker,Ed.,McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company,NewYork；and Eliel,E.and Wilen,S.,"Stereochemistry of Organic Compounds",JohnWiley&Sons,Inc.,New York,1994。本发明的化合物可以包含不对称中心或手性中心，因此存在不同的立体异构体。本发明的化合物所有的立体异构形式，包括但绝不限于，非对映体、对映异构体、阻转异构体和它们的混合物，如外消旋混合物，组成了本发明的一部分。很多有机化合物都以光学活性形式存在，即它们有能力旋转平面偏振光的平面。在描述光学活性化合物时，前缀D、L或R、S用来表示分子手性中心的绝对构型。前缀d、l或(+)、(-)用来命名化合物平面偏振光旋转的符号，(-)或l是指化合物是左旋的，前缀(+)或d是指化合物是右旋的。这些立体异构体的化学结构是相同的，但是它们的立体结构不一样。特定的立体异构体可以是对映体、异构体的混合物通常称为对映异构体混合物。50:50的对映体混合物被称为外消旋混合物或外消旋体，这可能导致化学反应过程中没有立体选择性或立体定向性。术语“外消旋混合物”和“外消旋体”是指等摩尔的两个对映异构体的混合物，缺乏光学活性。
在此需要说明的是，对于A和B的化合物，其制备方法可以参考Hamer,F.M.TheChemistry of Heterocyclic Compounds.The Cyanine Dyes and RelatedCompounds.Interscience Publishers,New York-London,1964和Ficken,G.E.TheChemistry of Synthetic Dyes.Cyanine Dyes.Academic Press,1971中记载的合成路线，也可以使用本领域熟知的其他方法来制备。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Sigma公司。
下述实施例中用于观测细胞荧光的仪器为激光共聚焦显微镜(OLYMPUS FV1000-IX81(Olympus,Japan))。
实施例1
1、化合物(1)～(3)的合成方法如下所示，其中，反应比例以及纯化方法采用本领域常规比例或常规纯化方法即可。另外，发明人通过对各化合物的氢谱、碳谱和/或质谱数据进行分析，确认上述化合物的结构无误，其中，化合物(1)的1H-NMR和质谱分别如图1和图2所示。
Figure BDA0002902457330000071
实施例2
本专利化合物具有相近的特性，利用本发明实施例的化合物(2)进行细胞毒性实验，具体如下：
Figure BDA0002902457330000072
(1)用少量甲醇分别溶解化合物(2)；
(2)培养好的HeLa和MCF-7细胞，加入不同浓度的化合物(2)溶液，继续培养48h；
(3)吸干培养基后加入10％MTT溶液，继续培养4h；
(4)吸干培养基后加入DMSO溶解，利用酶标仪测定559nm处的吸光度。以不加化合物细胞559nm处的吸光度值作为对照，加入化合物组559nm处的吸光度除以不加化合物细胞559nm处的吸光度值作为纵坐标，化合物(2)的浓度值为横坐标，作图。结果如图3所示，加入化合物(2)后559nm处的吸光度值相对于对照组无明显差异，表明化合物(2)对细胞毒性较低。
实施例3
利用本发明实施例的化合物(2)和化合物(4)在含有钾离子的水溶液进行组装，形成具有FRET性能的混合聚集体，具体如下：
Figure BDA0002902457330000081
(1)用少量甲醇分别溶解化合物(2)和化合物(4)；
(2)将步骤(1)的化合物(2)和化合物(4)溶液按不同浓度比率混合并用含有钾离子的水稀释，配置成具有FRET性能的混合聚集体，化合物(2)和化合物(4)的摩尔浓度之比为0:1、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、8:1；化合物4的摩尔浓度为4μM；
(3)利用紫外吸收光谱仪检测步骤(2)样品溶液的吸收光谱，结果如图4所示，随着化合物(2)浓度的增加，化合物(4)的吸光度逐渐增强，表明化合物(2)和化合物(4)发生了自组装形成混合聚集体。(图4中的箭头表示化合物(2)浓度的增加)
实施例4
利用本发明实施例的化合物(2)和化合物(4)在含有钾离子的水溶液进行组装，形成具有FRET性能的混合聚集体，具体如下：
Figure BDA0002902457330000082
(1)用少量甲醇分别溶解化合物(2)和化合物(4)；
(2)将步骤(1)的化合物(2)和化合物(4)溶液按不同浓度比率混合并用含有钾离子的水稀释，配置成具有FRET性能的混合聚集体，化合物(2)和化合物(4)的摩尔浓度之比为0:1、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、8:1；化合物4的摩尔浓度为4μM；
(3)以430nm作为激发波长，利用荧光光谱仪检测步骤(2)样品溶液的荧光光谱，结果如图5所示，随着化合物(2)浓度的增加，600nm处的荧光强度逐渐增强，表明化合物(2)和化合物(4)形成的混合聚集体发生了FRET。(图5中的箭头表示化合物(2)浓度的增加)
实施例5
利用本发明实施例的化合物(1)和化合物(5)在含有钾离子的水溶液进行组装，形成具有FRET性能的混合聚集体，具体如下：
Figure BDA0002902457330000091
(1)用少量甲醇分别溶解化合物(1)和化合物(5)；
(2)将步骤(1)的化合物(1)和化合物(5)溶液按不同浓度比率混合并用含有钾离子的水稀释，配置成具有FRET性能的混合聚集体，化合物(1)和化合物(5)的摩尔浓度之比为0:1、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、8:1、10:1、15:1、20:1；化合物5的浓度为10μM；
(3)以420nm作为激发波长，利用荧光光谱仪检测步骤(2)样品溶液的荧光光谱，结果如图6所示，随着化合物(1)浓度的增加，化合物(5)在600nm处的荧光强度逐渐增强，表明化合物(1)和化合物(5)形成的混合聚集体发生了FRET。(图6中的箭头表示化合物(1)浓度的增加)
实施例6
分别利用本发明实施例的化合物(7)和化合物(8)进行细胞定位，具体如下：
Figure BDA0002902457330000092
(1)用少量二甲基亚砜分别溶解化合物(7)、化合物(8)及Lyso Brite NIR探针；
(2)将步骤(1)的两种化合物溶液分别加入到培养基中，分别配置成含有10μM化合物(7)和10μM化合物(8)的培养液和50nM浓度的Lyso Brite NIR的培养液；
(3)用移液枪分别移取1mL步骤(2)配制的培养液，分别加入培养有MCF-7细胞的培养皿中，并将其放入于37℃、5％CO2培养箱中培养4h；
(4)将培养后的细胞分别用PBS洗涤三次，再加入1mL空白混合培养基进行荧光共聚焦成像，激发波长为405nm，收集波段为420-500nm；激发波长为559nm，收集波段为570-620nm；激发波长633nm，收集波段为650-700nm。结果如图7所示，其中图a为化合物(7)在420-500nm的荧光共聚焦成像示意图；图b为化合物(8)在570-620nm的荧光共聚焦成像示意图；图c为Lyso Brite NIR在650-700nm的荧光共聚焦成像示意图。图a和图b的荧光信号与图c的荧光信号高度重合，表明化合物(7)和化合物(8)对细胞内溶酶体具有良好的靶向性。
实施例7
分别利用本发明实施例的化合物(3)和化合物(4)进行细胞定位，具体如下：
Figure BDA0002902457330000101
(1)用少量二甲基亚砜分别溶解化合物(3)、化合物(4)、Lyso Brite NIR、MitoTracker Deep Red探针；
(2)将步骤(1)的两种化合物溶液分别加入到培养基中，分别配置成含有20μM化合物(3)、10μM化合物(4)、50nMLyso Brite NIR、50nMMito Tracker Deep Red的培养液；
(3)用移液枪分别移取1mL步骤(2)配制的培养液，分别加入培养有MCF-7细胞的培养皿中，并将其放入于37℃、5％CO2培养箱中培养4h；
(4)将培养后的细胞分别用PBS洗涤三次，再加入1mL空白混合培养基进行荧光共聚焦成像，激发波长为405nm，收集波段为420-500nm；激发波长为559nm，收集波段为570-620nm；激发波长633nm，收集波段为650-700nm。结果如图8所示，其中图a为化合物(3)在420-500nm的荧光共聚焦成像示意图；图b为化合物(4)在570-620nm的荧光共聚焦成像示意图；图c为Lyso Brite NIR在650-700nm的荧光共聚焦成像示意图；图d为Mito TrackerDeep Red在650-700nm的荧光共聚焦成像示意图。图a和图c的荧光信号高度重合，表明化合物(1)对细胞内溶酶体具有良好的靶向性。图b和图d的荧光信号高度重合，表明化合物(4)对细胞内线粒体具有良好的靶向性。
实施例8
分别利用本发明实施例的化合物(6)和化合物(9)进行细胞定位，具体如下：
Figure BDA0002902457330000111
(1)用少量二甲基亚砜分别溶解化合物(6)、化合物(9)、Mito Tracker Deep Red探针；
(2)将步骤(1)的两种化合物溶液分别加入到培养基中，分别配置成含有4μM化合物(6)、4μM化合物(9)、50nMMito Tracker Deep Red的培养液；
(3)用移液枪分别移取1mL步骤(2)配制的培养液，分别加入培养有HT1080细胞的培养皿中，并将其放入于37℃、5％CO2培养箱中培养30min；
(4)将培养后的细胞分别用PBS洗涤三次，再加入1mL空白混合培养基进行荧光共聚焦成像，激发波长为405nm，收集波段为420-500nm；激发波长为559nm，收集波段为570-620nm；激发波长633nm，收集波段为650-700nm。结果如图9所示，其中图a为化合物(3)在420-500nm的荧光共聚焦成像示意图；图b为化合物(4)在570-620nm的荧光共聚焦成像示意图；图c为Mito Tracker Deep Red在650-700nm的荧光共聚焦成像示意图。图a、图b和图c的荧光信号均高度重合，表明化合物(6)和化合物(9)对细胞内线粒体具有良好的靶向性。
实施例9
分别利用本发明实施例的化合物(3)和化合物(4)组成的FRET荧光对来监测细胞饥饿诱导线粒体自噬过程的荧光成像，具体如下：
Figure BDA0002902457330000112
(1)用少量二甲基亚砜溶解化合物(3)和化合物(4)；
(2)将步骤(1)的两种化合物溶液分别加入到培养基中，分别配置成含有20μM化合物(3)和10μM化合物(4)的培养液；
(3)用移液枪分别移取1mL步骤(2)配制的培养液，分别加入培养有HT1080细胞的培养皿中，并将其放入于37℃、5％CO2培养箱中培养8h；
(4)将步骤(3)的培养液替换为1mL不含胚胎牛血清的空白培养液，并将其放入于37℃、5％CO2培养箱中，分别饥饿处理细胞0、0.5和1小时；
(4)将培养后的细胞分别用PBS洗涤三次，再加入1mL空白混合培养基进行荧光共聚焦成像，激发波长为405nm、FRET荧光收集波段为550-620nm。结果如图10所示，其中，a为经0小时饥饿处理过的HT1080的荧光共聚焦成像示意图，b为经0.5小时饥饿处理过的HT1080的荧光共聚焦成像示意图，c为经1小时饥饿处理过的HT1080的荧光共聚焦成像示意图，随着饥饿时间的增加，化合物(3)和化合物(4)组成的FRET荧光对在细胞内550-620nm的荧光信号逐渐增强，表明随饥饿时间增加，细胞内自噬增强。实验结果表明化合物(3)和化合物(4)组成的FRET荧光对能够检测饥饿诱导的线粒体自噬。
实施例10
分别利用本发明实施例的化合物(2)和化合物(5)组成的FRET荧光对来监测雷帕霉素诱导线粒体自噬过程的荧光成像，具体如下：
Figure BDA0002902457330000121
(1)用少量二甲基亚砜溶解化合物(2)和化合物(5)；
(2)将步骤(1)的化合物(2)和化合物(5)溶液加入到含有胚胎牛血清的培养基中，分别配置成含有10μM化合物(2)和10μM化合物(5)的培养液；
(3)用移液枪分别移取1mL步骤(2)配制的培养液，分别加入到用0、0.5和1μM雷帕霉素处理的人乳腺癌细胞MCF-7的培养皿中，并将其放入于37℃、5％CO2培养箱中培养2小时；
(4)将培养后的细胞分别用PBS洗涤三次，再加入1mL空白培养基进行荧光共聚焦成像，激发波长为405nm，FRET荧光收集波段为570-620nm。结果如图11所示，其中，a为经0μM雷帕霉素处理的人乳腺癌细胞MCF-7的荧光共聚焦成像示意图，b为经0.5μM雷帕霉素处理的人乳腺癌细胞MCF-7的荧光共聚焦成像示意图，c为经1μM雷帕霉素处理的人乳腺癌细胞MCF-7的荧光共聚焦成像示意图。随着雷帕霉素浓度的增加，化合物(2)和化合物(5)FRET荧光对在细胞内570-620nm的荧光信号逐渐减弱。由此，表明化合物(2)和化合物(5)FRET荧光对能够监测雷帕霉素诱导的线粒体自噬。
实施例11
分别利用本发明实施例的化合物(6)和化合物(4)来监测雷帕霉素诱导溶酶体自噬过程的荧光成像，具体如下：
Figure BDA0002902457330000131
(1)用少量二甲基亚砜溶解化合物(6)和化合物(4)；
(2)将步骤(1)的化合物(6)和化合物(4)溶液加入到含有胚胎牛血清的培养基中，分别配置成含有10μM化合物(6)和10μM化合物(4)的培养液；
(3)用移液枪分别移取1mL步骤(2)配制的培养液，分别加入到用0、0.5和1μM雷帕霉素处理的人乳腺癌细胞MCF-7的培养皿中，并将其放入于37℃、5％CO2培养箱中培养2小时；
(4)将培养后的细胞分别用PBS洗涤三次，再加入1mL空白培养基进行荧光共聚焦成像，激发波长为405nm，FRET荧光收集波段为570-620nm。结果如图12所示，其中，a为经0μM雷帕霉素处理的人乳腺癌细胞MCF-7的荧光共聚焦成像示意图，b为经0.5μM雷帕霉素处理的人乳腺癌细胞MCF-7的荧光共聚焦成像示意图，c为经1μM雷帕霉素处理的人乳腺癌细胞MCF-7的荧光共聚焦成像示意图。随着雷帕霉素浓度的增加，化合物(6)和化合物(4)FRET荧光对在细胞内570-620nm的荧光信号逐渐减弱。由此，表明化合物(6)和化合物(4)FRET荧光对能够监测雷帕霉素诱导的线粒体自噬。
总结
综合实施例可得出，本发明实施例的FRET荧光探针膜通透性好，不需要对细胞进行固定、通透等处理，在保持细胞活性的条件下对细胞内线粒体自噬进行特异性标记；同时该探针具有光稳定性好和细胞毒性低的优点，可以实现对细胞样品较长时间有效观测。此外，该探针成分简单，检测操作简便、快捷，有望成为检测活细胞线粒体自噬的通用染料。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.一种FRET荧光分子对，由化合物A或其立体异构体与化合物B或其立体异构体构成，其中化合物A的结构式如下所示：
Figure FDA0003708056940000011
化合物B的结构式如下所示：
Figure FDA0003708056940000012
2.根据权利要求1所述的FRET荧光分子对，其特征在于：所述FRET荧光分子对中，化合物A或其立体异构体与化合物B或其立体异构体的摩尔比为0:1至20:1之间任意比，端点值0不取。
3.权利要求1或2所述的FRET荧光分子对的化合物A或其立体异构体与化合物B或其立体异构体在水溶液体系中自发聚集形成的混合聚集体。
4.权利要求1或2所述的FRET荧光分子对或权利要求3所述的混合聚集体作为荧光探针在检测线粒体自噬中的应用。
5.一种确定细胞内是否存在线粒体自噬的方法，包括：将权利要求1或2所述的FRET荧光分子与细胞接触；以及对接触后的细胞进行荧光信号检测。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：接触后的细胞出现FRET荧光信号变化，是所述细胞内存在线粒体自噬的指示。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：FRET荧光分子对分别进入线粒体和溶酶体，非自噬状态下没有FRET荧光信号，当自噬发生时才出现FRET信号；或者FRET荧光分子对同时进入线粒体或者溶酶体，非自噬状态下出现FRET信号，而自噬发生时FRET信号减弱甚至消失；
通过对细胞内FRET荧光信号的检测判断细胞内是否出现了线粒体自噬现象。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述FRET荧光分子以溶液的形式提供，所述溶液中的溶剂选自生理盐水、钾盐溶液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液、磷酸盐的缓冲溶液、甲醇溶液、乙醇溶液、乙腈溶液、二甲基亚砜溶液和二甲酰胺溶液的至少一种。
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