CN111100627A - 荧光探针及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了荧光探针在检测活细胞自噬溶酶体的新用途。该荧光探针含有下式所示的结构或其立体异构体的化合物以及反离子,该荧光探针可以实现对活细胞样品自噬过程的实时观测,具体染色简单、细胞毒性低、对生物样品损伤小的优点,且不受细胞内pH值的影响。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学领域,具体地,涉及荧光探针及其应用,更具体地,涉及荧光探针及其在检测自噬溶酶体中的用途和确定细胞内是否存在自噬溶酶体的方法。
背景技术
溶酶体是一种非常重要的细胞器,直径约200~500nm,几乎存在于所有的真核细胞中。溶酶体中有很多酶和蛋白质,包括酸性水解酶、膜蛋白酶和组织蛋白酶,为细胞内的消化器官,可分解各种蛋白质等大分子物质,具有溶解或消化的功能。自噬溶酶体,又称胞溶酶体,它是初级溶酶体与来自自噬作用的含有内源性物质的囊泡即自噬体融合或溶酶体吞噬细胞质而形成,在细胞内起“清道夫”作用,作为细胞内细胞器和其它结构自然减员和更新的正常途径。正常细胞中的自噬性溶酶体在消化、分解、自然更替一些细胞内的结构上起着重要作用。当细胞受到药物作用、射线照射和机械损伤时,其数量明显地增多。在病变的细胞中也常可见到自噬溶酶体。因此,通过检测自噬溶酶体,能为很多疾病的诊断及治疗跟踪提供有用的信息。
荧光探针具有操作简便、灵敏度高、细胞毒性小等优势,在生物检测领域引起了广泛的关注和研究。目前市场上已售有几种标记溶酶体的荧光探针例如LysoTracker Red、LysoTracker Green等,但是仍缺少商业化的标记自噬溶酶体的探针。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此,本发明的一个目的在于提出一种荧光探针,该荧光探针具有530~570nm激发波长,可以识别自噬溶酶体,从而有效地辨别是否出现细胞自噬且对细胞的损伤较小。并且,该荧光探针的生物相容性好、细胞毒性低、具有良好的抗光漂白性能,可以实现对细胞样品较长时间有效观测,且不受细胞内 pH值的影响。
根据本发明的一个方面,本发明提供了一种荧光探针。根据本发明的实施例,该荧光探针含有下式所示的结构或其立体异构体的化合物以及反离子,
其中,
R1为氢、C1-6烷基、苯基或C1-4烷基取代的苯基;
R2-R9独立地为氢原子、氟、氯、溴、碘、C1-6烷基、C1-6卤代烷基或C1-6烷氧基;
R10和R11独立地为磺酸基或磺酸基取代的C1-6烷基;
X1和X2独立地为碳、氧、硫、硒或碲。
根据本发明实施例的荧光探针可以进入细胞的溶酶体中,其本身并不发出荧光信号。当细胞出现自噬时,被吞噬的物质(例如自身细胞质蛋白或细胞器)会被包被进入囊泡,并与溶酶体融合形成自噬溶酶体。自噬溶酶体中的某些物质会与该荧光探针反应而产生可检测的荧光信号,激发波长为530~570nm,通过对该细胞进行荧光信号检测可以有效地判断细胞是否出现自噬现象。并且,该荧光探针膜通透性好,对细胞损伤小,不需要对细胞进行固定、通透等处理,在保持细胞活性的条件下对细胞内自噬溶酶体进行特异性标记;同时具有生物相容性好、细胞毒性低的优点,并具有良好的抗光漂白性能,可以实现对细胞样品较长时间有效观测,且不受细胞内pH值的影响。此外,该探针成分简单,检测操作简便、快捷,有望成为检测活细胞自噬溶酶体的通用染料。
另外,根据本发明上述实施例的荧光探针还可以具有如下附加的技术特征:
根据本发明的实施例,所述烷基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基或异己基。
根据本发明的实施例,所述烷基取代的苯基为甲基苯基或二甲基苯基。
根据本发明的实施例,所述卤代烷基为一氟甲烷、二氟甲烷、三氟甲烷、一溴甲烷、二溴甲烷或三溴甲烷。
根据本发明的实施例,所述烷氧基为甲氧基、乙氧基或丙氧基。
根据本发明的实施例,R1为氢或C1-3烷基;R2-R9独立地为氢原子、氟、氯、溴、碘、C1-3烷基、C1-3卤代烷基或C1-3烷氧基;R10和R11独立地为磺酸基、磺酸基甲基、磺酸基乙基或磺酸基丙基。
根据本发明的实施例,所述反离子选自N+H(C2H5)3、氟离子、氯离子、溴离子或碘离子。
根据本发明的另一方面,本发明提出了前面所述荧光探针在检测自噬溶酶体中的用途。如前所述,根据本发明实施例的荧光探针可以进入细胞的溶酶体中,其本身并不发出荧光信号。当细胞出现自噬时,被吞噬的物质(例如自身细胞质蛋白或细胞器)会被包被进入囊泡,并与溶酶体融合形成自噬溶酶体。自噬溶酶体中的某些物质会与该荧光探针反应而产生可检测的荧光信号,通过对该细胞进行荧光信号检测可以有效地判断细胞中是否存在自噬溶酶体。此外,需要说明的是,该荧光探针具有前述荧光探针的全部技术特征和优点,在此不再一一赘述。
根据本发明的另一方面,本发明提出了前面所述荧光探针在确定是否发生细胞自噬中的用途。如前所述,根据本发明实施例的荧光探针可以进入细胞的溶酶体中,其本身并不发出荧光信号。当细胞出现自噬时,被吞噬的物质(例如自身细胞质蛋白或细胞器)会被包被进入囊泡,并与溶酶体融合形成自噬溶酶体。自噬溶酶体中的某些物质会与该荧光探针反应而产生可检测的荧光信号,通过对该细胞进行荧光信号检测可以有效地判断是否出现细胞自噬。此外,需要说明的是,该荧光探针具有前述荧光探针的全部技术特征和优点,在此不再一一赘述。
根据本发明的又一方面,本发明提出了一种确定细胞内是否存在自噬溶酶体的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:将前面所述荧光探针与细胞接触;以及对接触后的细胞进行荧光信号检测;其中,接触后的细胞出现荧光信号,是所述细胞内存在自噬溶酶体的指示。如前所述,根据本发明实施例的荧光探针可以进入细胞的溶酶体中,其本身并不发出荧光信号。当细胞出现自噬时,被吞噬的物质(例如自身细胞质蛋白或细胞器)会被包被进入囊泡,并与溶酶体融合形成自噬溶酶体。自噬溶酶体中的某些物质会与该荧光探针反应而产生可检测的荧光信号,通过对该细胞进行荧光信号检测可以有效地判断细胞是否存在自噬溶酶体。此外,需要说明的是,该荧光探针具有前述荧光探针的全部技术特征和优点,在此不再一一赘述。
根据本发明的实施例,所述荧光探针是以溶液的形式提供的,所述溶液中的溶剂选自生理盐水、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液、磷酸盐的缓冲溶液、甲醇溶液、乙醇溶液、乙腈溶液、二甲基亚砜溶液和二甲酰胺溶液的至少一种。其中,需要说明的是,“甲醇溶液”可以是纯的甲醇,也可以是甲醇和水以任意比例混合得到的溶液。同理,“乙醇溶液”、“乙腈溶液”、“二甲基亚砜溶液”和“二甲酰胺溶液”也是如此,在此不再一一赘述。
根据本发明的实施例,三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液和磷酸盐的缓冲溶液的pH值均为6.2-8.2,浓度均为0.1-50mmol/L。由此,缓冲液的pH值与细胞内的pH值接近,与细胞的生物相容性好。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1~6分别显示了根据本发明一个实施例的荧光成像示意图;
图7显示了根据本发明一个实施例的质谱图;
图8显示了根据本发明另一个实施例的质谱图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例,所述实施例的示例在附图中示出,其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
荧光探针
根据本发明的一个方面,本发明提供了一种荧光探针。根据本发明的实施例,该荧光探针含有下式所示的结构或其立体异构体的化合物以及反离子,
其中,
R1为氢、C1-6烷基、苯基或C1-4烷基取代的苯基;
R2-R9独立地为氢原子、氟、氯、溴、碘、C1-6烷基、C1-6卤代烷基或C1-6烷氧基;
R10和R11独立地为磺酸基或磺酸基取代的C1-6烷基;
X1和X2独立地为碳、氧、硫、硒或碲。
根据本发明实施例的荧光探针可以进入细胞的溶酶体中,其本身并不发出荧光信号。当细胞出现自噬时,被吞噬的物质(例如自身细胞质蛋白或细胞器)会被包被进入囊泡,并与溶酶体融合形成自噬溶酶体。自噬溶酶体中的某些物质会与该荧光探针反应而产生可检测的荧光信号,激发波长为530~570nm,例如559nm,通过对该细胞进行荧光信号检测可以有效地判断细胞是否出现自噬现象。并且,目前一些物质(如下式化合物)的激发波长较低,为 405nm,相比于这些化合物,本发明的化合物激发波长较长,相对而言更能够减少对细胞的损伤程度。另外,该荧光探针膜通透性好,不需要对细胞进行固定、通透等处理,在保持细胞活性的条件下对细胞内自噬溶酶体进行特异性标记;同时具有生物相容性好、细胞毒性低的优点,并具有良好的抗光漂白性能,可以实现对细胞样品较长时间有效观测,且不受细胞内pH值的影响。此外,该探针成分简单,检测操作简便、快捷,有望成为检测活细胞自噬溶酶体的通用染料。
此外,需要说明的是,该荧光探针还可以作为激光染料、非线性光学材料以及生物传感器等。
需要说明的是,除非以其他方式明确指出,在本文中通篇采用的描述方式“各…独立地为”、“…独立地为”和“…各自独立地为”可以互换,均应做广义理解,其既可以是指在不同基团中,相同符号之间所表达的具体选项之间互相不影响,也可以表示在相同的基团中,相同符号之间所表达的具体选项之间互相不影响。
本发明中立体化学的定义和惯例的使用通常参考以下文献:S.P.Parker,Ed.,McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company,NewYork;and Eliel,E.and Wilen,S.,"Stereochemistry of Organic Compounds",JohnWiley&Sons,Inc.,New York,1994。本发明的化合物可以包含不对称中心或手性中心,因此存在不同的立体异构体。本发明的化合物所有的立体异构形式,包括但绝不限于,非对映体、对映异构体、阻转异构体和它们的混合物,如外消旋混合物,组成了本发明的一部分。很多有机化合物都以光学活性形式存在,即它们有能力旋转平面偏振光的平面。在描述光学活性化合物时,前缀D、L 或R、S用来表示分子手性中心的绝对构型。前缀d、l或(+)、(-)用来命名化合物平面偏振光旋转的符号,(-)或l是指化合物是左旋的,前缀(+)或d是指化合物是右旋的。这些立体异构体的化学结构是相同的,但是它们的立体结构不一样。特定的立体异构体可以是对映体、异构体的混合物通常称为对映异构体混合物。50:50的对映体混合物被称为外消旋混合物或外消旋体,这可能导致化学反应过程中没有立体选择性或立体定向性。术语“外消旋混合物”和“外消旋体”是指等摩尔的两个对映异构体的混合物,缺乏光学活性。
在此需要说明的是,对于式(I)的化合物,其制备方法可以参考Hamer,F.M.TheChemistry of Heterocyclic Compounds.The Cyanine Dyes and RelatedCompounds.Interscience Publishers,New York-London,1964和Ficken,G.E.TheChemistry of Synthetic Dyes.Cyanine Dyes.Academic Press,1971中记载的合成路线,也可以使用本领域熟知的其他方法来制备。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著,黄培堂等译的《分子克隆实验指南》,第三版,科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品,例如可以采购自Sigma公司。
下述实施例中用于观测细胞荧光的仪器为激光共聚焦显微镜(OLYMPUS FV1000-IX81 (Olympus,Japan))。
实施例1
1、化合物(1)~(5)的合成方法如下所示,其中,反应比例以及纯化方法采用本领域常规比例或常规纯化方法即可。另外,发明人通过对各化合物的氢谱、碳谱和/或质谱数据进行分析,确认上述化合物的结构无误,其中,化合物(1)和(2)的质谱分别参考图7和图8所示。
实施例2
利用本发明实施例的荧光探针(1)进行细胞毒性实验,具体如下:
(1)用少量甲醇分别溶解荧光探针(1);
(2)培养好的HeLa和MCF-7细胞,加入不同浓度的探针(1)溶液,继续培养24h;
(3)吸干培养基后加入10%MTT溶液,继续培养4h;
(4)吸干培养基后加入DMSO溶解,利用酶标仪测定492nm处的吸光度。以492nm 处的吸光度值为纵坐标,探针(1)的浓度值为横坐标,作图。结果如图1所示,492nm处的吸光度值在不同探针(1)浓度时无明显差异,表明探针(1)对细胞生长未有抑制效果。
实施例3
分别利用本发明实施例的荧光探针(1)和LysoTracker探针对细胞进行荧光成像,具体如下:
(1)用少量二甲基亚砜分别溶解荧光探针(1)及LysoTracker探针;
(2)将步骤(1)的两种荧光探针溶液分别加入到培养基中,分别配置成含有10μM浓度的荧光染料1的培养液和1.0μM浓度的LysoTracker的培养液;
(3)用移液枪分别移取1mL步骤(2)配制的培养液,分别加入培养有HEK293细胞的培养皿中,并将其放入于37℃、5%CO2培养箱中培养30min;
(4)将培养后的细胞分别用PBS洗涤三次,再加入1mL空白混合培养基进行荧光共聚焦成像,激发波长为559nm。结果如图2所示,其中,a为荧光探针(1)的荧光共聚焦成像示意图,b为LysoTracker的荧光共聚焦成像示意图,图a的荧光信号与图b的荧光信号高度重合,表明荧光探针(1)在细胞内标记物质为溶酶体,实验结果表明荧光探针1对细胞内溶酶体具有良好的靶向性。
实施例4
分别利用本发明实施例的荧光探针(2)来监测细胞饥饿诱导溶酶体自噬过程的荧光成像,具体如下:
(1)用少量甲醇分别溶解荧光探针(2);
(2)将步骤(1)的荧光探针溶液加入到含0、5%和10%胚胎牛血清的培养基中,配置成含有4μM浓度的荧光染料2的培养液;
(3)用移液枪分别移取1mL步骤(2)配制的培养液,分别加入到用含0、5%和10%胚胎牛血清培养基培养的人肺癌细胞A549的培养皿中,并将其放入于37℃、5%CO2培养箱中培养1h;
(4)将培养后的细胞分别用PBS洗涤三次,再加入1mL空白混合培养基进行荧光共聚焦成像,激发波长为559nm。结果如图3所示,其中,a为采用不含胚胎牛血清的培养基 (即含0胚胎牛血清)培养的细胞的荧光共聚焦成像示意图,b为采用含5%胚胎牛血清的培养基培养的细胞的荧光共聚焦成像示意图,c为采用含10%胚胎牛血清的培养基培养的细胞的荧光共聚焦成像示意图,随着胚胎牛血清浓度的增加,荧光探针(2)在细胞内的荧光信号逐渐减弱,表明胚胎牛血清浓度增加,细胞饥饿程度减弱。由此,细胞内自噬溶酶体减少实验结果表明荧光探针(2)能够检测饥饿诱导活细胞溶酶体自噬的变化。
实施例5
分别利用本发明实施例的荧光探针(4)监测巴佛洛霉素A1抑制细胞内溶酶体自噬过程的荧光成像,具体如下:
(1)用少量乙腈分别溶解荧光探针(4);
(2)将步骤(1)的荧光探针溶液加入到培养基中,配置成含有20μM浓度的荧光染料4的培养液;
(3)用移液枪分别移取1mL步骤(2)配制的培养液,分别加入用0、200nM和400nM 巴佛洛霉素A1处理的人纤维肉瘤细胞HT1080的培养皿中,并将其放入于37℃、5%CO2培养箱中培养2h;
(4)将培养后的细胞分别用PBS洗涤三次,再加入1mL空白混合培养基进行荧光共聚焦成像,激发波长为559nm。结果如图4所示,其中,a为未经巴佛洛霉素(即0nM)A1 处理的人纤维肉瘤细胞HT1080的荧光共聚焦成像示意图,b为经200nM巴佛洛霉素A1处理的人纤维肉瘤细胞HT1080的荧光共聚焦成像示意图,c为为经400nM巴佛洛霉素A1处理的人纤维肉瘤细胞HT1080的荧光共聚焦成像示意图。随着巴佛洛霉素浓度的增加,荧光探针(4)在细胞内的荧光信号逐渐减弱,表明细胞内自噬溶酶体减少。实验结果表明荧光探针(4)能够监测巴佛洛霉素A1抑制细胞内自噬溶酶体的变化。
实施例6
分别利用本发明实施例的荧光探针(5)监测雷帕霉素诱导细胞内溶酶体自噬过程的荧光成像,具体如下:
(1)用少量二甲基亚砜分别溶解荧光探针(5);
(2)将步骤(1)的荧光探针溶液加入到培养基中,配置成含有15μM浓度的荧光染料5的培养液;
(3)用移液枪分别移取1mL步骤(2)配制的培养液,分别加入到用0、2和5μM雷帕霉素处理的人乳腺癌细胞MCF-7的培养皿中,并将其放入于37℃、5%CO2培养箱中培养10min;
(4)将培养后的细胞分别用PBS洗涤三次,再加入1mL空白混合培养基进行荧光共聚焦成像,激发波长为559nm。结果如图5所示,其中,a为经0μM雷帕霉素处理的人乳腺癌细胞MCF-7的荧光共聚焦成像示意图,b为经2μM雷帕霉素处理的人乳腺癌细胞MCF-7 的荧光共聚焦成像示意图,c为经5μM雷帕霉素处理的人乳腺癌细胞MCF-7的荧光共聚焦成像示意图,随着雷帕霉素浓度的增加,荧光探针(5)在细胞内的荧光信号逐渐增强。由此,细胞内自噬溶酶体增多实验结果表明荧光探针5具有良好的膜通透性,能够监测雷帕霉素诱导细胞内自噬溶酶体的过程。
实施例7
分别利用本发明实施例的荧光探针(6)监测氯喹抑制细胞内溶酶体自噬过程的荧光成像,具体如下:
(1)用少量乙醇分别溶解荧光探针(6);
(2)将步骤(1)的荧光探针溶液加入到培养基中,配置成含有8μM浓度的荧光染料6的培养液;
(3)用移液枪分别移取1mL步骤(2)配制的培养液,分别加入到含0、2和5μM氯喹的人喉癌细胞Hep-2的培养皿中,并将其放入于37℃、5%CO2培养箱中培养4h;
(4)将培养后的细胞分别用PBS洗涤三次,再加入1mL空白混合培养基进行荧光共聚焦成像,激发波长为559nm。结果如图6所示,其中,a为经0μM氯喹的人喉癌细胞Hep-2 的荧光共聚焦成像示意图,b为经2μM氯喹的人喉癌细胞Hep-2的荧光共聚焦成像示意图, c为经5μM氯喹的人喉癌细胞Hep-2的荧光共聚焦成像示意图,随着氯喹浓度的增加,荧光探针(6)在细胞内的荧光信号逐渐减弱。由此,细胞内自噬溶酶体减少实验结果表明荧光探针(6)具有良好的膜通透性,能够监测氯喹抑制细胞内自噬溶酶体的过程。
总结
综合实施例1-7可得出,本发明实施例的荧光探针膜通透性好,不需要对细胞进行固定、通透等处理,在保持细胞活性的条件下对细胞内自噬溶酶体进行特异性标记;同时该探针具有光稳定性好和细胞毒性低的优点,可以实现对细胞样品较长时间有效观测。此外,该探针成分简单,检测操作简便、快捷,有望成为检测活细胞自噬溶酶体的通用染料。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,本领域的普通技术人员可以理解:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (9)
2.根据权利要求1所述的荧光探针,其特征在于,所述烷基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基或异己基;
任选地,所述烷基取代的苯基为甲基苯基或二甲基苯基;
任选地,所述卤代烷基为一氟甲烷、二氟甲烷、三氟甲烷、一溴甲烷、二溴甲烷或三溴甲烷;
任选地,所述烷氧基为甲氧基、乙氧基或丙氧基。
3.根据权利要求1所述的荧光探针,其特征在于,R1为氢或C1-3烷基;
R2-R9独立地为氢原子、氟、氯、溴、碘、C1-3烷基、C1-3卤代烷基或C1-3烷氧基;
R10和R11独立地为磺酸基、磺酸基甲基、磺酸基乙基或磺酸基丙基。
4.根据权利要求1所述的荧光探针,其特征在于,所述反离子选自N+H(C2H5)3、氟离子、氯离子、溴离子或碘离子。
6.权利要求1~5任一项所述荧光探针在检测自噬溶酶体中的用途。
7.权利要求1~5任一项所述荧光探针在确定是否发生细胞自噬中的用途。
8.一种确定细胞内是否存在自噬溶酶体的方法,其特征在于,包括:
将权利要求1~5任一项所述荧光探针与细胞接触;以及
对接触后的细胞进行荧光信号检测;
其中,接触后的细胞出现荧光信号,是所述细胞内存在自噬溶酶体的指示。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述荧光探针是以溶液的形式提供的,所述溶液中的溶剂选自生理盐水、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液、磷酸盐的缓冲溶液、甲醇溶液、乙醇溶液、乙腈溶液、二甲基亚砜溶液和二甲酰胺溶液的至少一种。
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