JP2010521424A - 感染症の治療のための組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は感染症、特にヘリコバクターにより引き起こされる感染症の治療のための薬剤組成物として利用される一般化学構造式（Ｉ）の化合物およびその塩に関する。Ｒ_１はＨ原子、Ｘ原子またはＣＸ_ｍＨ_３−ｍの基であり、Ｘは同一または異なるものであり、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩから選択され、ｍは１から３であり、Ｒ_２はＮＯ_２基、ＣＯＯＲ’基またはＳＯ_３Ｒ’基であり、Ｒ’は水素原子（Ｈ）またはＣ_１−Ｃ_６アルキル基であり、ｎは１から５の値である。
【選択図】化１

Description

本発明は、感染症、特にヘリコバクターにより引き起こされる感染症の治療のための薬剤組成物として利用するためのフラボドキシンを阻害することができる一般化学構造式（Ｉ）の化合物に関する。

ヘリコバクターピロリによる感染症は今日の最も一般的な慢性疾患の１つである。事実、このバクテリアは５０％以上の人間の胃粘膜でコロニー形成していることが発見されている。

ヘリコバクターピロリは慢性胃炎、胃潰瘍および十二指腸潰瘍を引き起こすグラム陰性かん菌（バシラス）であり、ＭＡＬＴリンパ腫や腺ガン（最も多発し、致命的なガンの一種）の発症に関与する危険因子である。

ヘリコバクターピロリを根絶させるのに利用される従来の治療法は２種の広域スペクトル抗生物質とプロトンポンプ阻害剤の利用で成る。従って、この状態の特別な治療法はなく、治療成功率が８０％を超えないため、現在の治療法は特に効果的であるとは言えない。加えて、従来の抗生物質に対する抵抗性の進行する増加により、高い突然変異的な変異性は従来の治療法の効果を低下させている。

本発明は薬剤組成物の利用のための新規な化合物を提供する。さらに本発明は感染症、特にヘリコバクターピロリにより引き起こされる病気の治療のための、これら組成物の利用法も提供する。

ここでいう“薬剤組成物”とは薬物治療剤のことである。

従って、本発明の第１の形態は薬剤組成物として使用するための一般化学構造式（Ｉ）の化合物またはその塩（“発明化合物”）の利用に関する。

式中、Ｒ_１とｎは以下のものである。

Ｒ_１は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子（Ｘ）または一般化学式ＣＸ_ｍＨ_３−ｍの基である。ここで、Ｘはフッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、ブロミン（Ｂｒ）およびヨウ素（Ｉ）から選択することができるハロゲンであり、好適にはＸはＦまたはＣｌであり、さらに好適にはＸはＦである。

ｍは可能なハロゲン原子の数であり、１から３である。ｍが２または３であるとき、Ｘは同じハロゲン、あるいは異なるハロゲンでもよく、前述のハロゲン群から選択されるものでよい。好適にはｍは３である。すなわち、三ハロゲン化物（ＣＸ_３）であり、さらに好適にはＣＦ_３である。

ｎは芳香環の置換基の数であり、１から５であり、好適には１、２または３である。さらに好適にはｎは２である。

Ｒ_２はＮＯ_２、ＣＯＯＲ’およびＳＯ_３Ｒ’の基から選択される基である。ここでＲ’は水素原子（Ｈ）またはＣ_１−Ｃ_６アルキル基である。好適にはＲ_２はＮＯ_２、ＣＯＯＨまたはＳＯ_３Ｈの基である。さらに好適にはＮＯ_２である。

このアルキルＣ_１−Ｃ_６基は直鎖または分岐鎖であり、好適には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、三ブチルのごときアルキルＣ_１−Ｃ_４基でよい。さらに好適には非置換アルキル基である。

１好適実施形態では、本発明化合物は次の化学構造式（ＩＩ）を有する。

本発明の別形態は薬剤組成物の生成のための、一般化学構造式（Ｉ）の化合物の利用を含む。この組成物は感染症の治療に利用される。

一部の感染症はヘリコバクター菌の場合のようにグラム陰性バクテリアによって引き起こされる。

これら特定タイプの病気の治療のための効果的な治療標的は、α/β構造を有する酸化還元タンパク質であるフラボドキシンである。フラボドキシンの機能は様々な代謝経路での電子伝播である。ヘリコバクターピロリでは、フラボドキシンはピルビン酸塩をアセチルＣｏＡに変換するためにピルビン酸酸化脱炭酸経路の酵素ピルビン酸塩：フラボドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯＲ）から電子を受け取る。電子仲介物質としてこの機能を果たすため、フラボドキシンは非共有結合的に結合されたフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）分子を運搬する。他の種のフラボドキシンに対するその構造的類似性にも拘わらず、ヘリコバクターピロリの構造はＦＭＮ結合部位に非常に大きな差異を提供する。そこではアラニンの残基が他のフラボドキシンの特徴であるトリプトファンを置換する。この理由でその構造は、生物活性の電位阻害物質である分子の結合のために適した部位である補因子結合部位に隣接して弱点を発生させる。なぜなら、それら阻害物質がＲＦＯＲへのＦＭＮ酸化還元電位が電子移動を阻害し変性させるためであるか、あるいは、それら阻害物質が２つのタンパク質の結合を単に阻止するからである。ピルビン酸塩酸化経路の遮断はこの細菌を死滅に導く。

よってフラボドキシンはこの細菌の生存には必須であり、人の体内には存在せず、前述したように、感染症に関係する病気の根治のために治療的に適した標的を構成する。

本発明の化合物は、ヘリコバクターピロリフラボドキシンが関与するピルビン酸塩酸化の阻害によってミクロモル濃度範囲のヘリコバクターピロリ菌を完全に阻害することは証明済みである（実施例参照）。

従って、本発明の１好適実施例は、ヘリコバクター属のバクテリア、特にヘリコバクターピロリ種により引き起こされる感染症の治療のための一般化学構造式（Ｉ）の化合物の利用を含む。

従って、これら化合物はそれらの病気の治療のための薬剤または薬剤組成物の生成に使用可能である。これらの化合物に加えて、それら薬剤組成物は薬学的に利用可能な賦形剤、添加剤、等々を含むことができる。

よって、フラボドキシンを阻害することができるこれら化合物は、感染症、特にヘリコバクターにより引き起こされる病気、その中でも特にヘリコバクターピロリによって引き起こされる病気の治療にとって非常に良好な代用物となるであろう。

一般化学構造式（Ｉ）の本発明化合物の利用は、これら化合物がフラボドキシンタンパク質に対する特定阻害物質であるため、この病原菌に対する特定治療の不在を補うであろう。また人体内の同相タンパク質の欠如は、これら阻害物質を特定分子治療剤とし、宿主に対して副作用が皆無か、限定的とする。

ヘリコバクターピロリにより引き起こされる感染症は、慢性胃炎、胃潰瘍または十二支潰瘍、リンパ腫および胃ガン等の胃腸病に関する。従って、さらに好適な実施例は、慢性胃炎、胃潰瘍及び/又は十二支潰瘍、リンパ腫および胃ガン等の感染症の治療のための本発明化合物の利用を含む。

本明細書と「請求の範囲」を通じて“含む”なる表現は他の特徴、追加要素、成分または工程を排除するものではない。この分野の専門家であれば、本発明の他の目的、利点および特徴は本明細書の説明と本発明の実施により明らかとなろう。よって以下の実施例と図面は本発明の説明のために提供されており、本発明を限定するものではない。

図１は、５０μＭの濃度の化学構造式（ＩＩ）の化合物の存在下および不在下におけるヘリコバクターピロリの基本的反応での生成物産生曲線を比較するグラフである。時間（秒）（ｔ）に対する３４０ｎｍにおける吸光度（Ａ）の測定値（ＡＵは吸光度単位）を示す。

本発明は、フラボドキシン阻害物質の特殊性および効果を示す、発明者によって実施された実験を利用して以下において解説される。

組み換えフラボドキシンのための遺伝子の複製
ヘリコバクターピロリのゲノムＤＮＡはＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｓｔｏｏｌ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抗原陽性患者から単離された。

フラボドキシンのためのＤＮＡ配列コードは制限酵素Ｎｃｏ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）と、制限酵素ＢａｍＨＩ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）とＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｄｇｅｎ）を使用してＰＣＲにより増幅された。

増幅後に、６００程度のヌクレオチドの破断片が、フラボドキシン遺伝子の破断片（６１３のヌクレオチド）に対応して検出された。

これら破断片は精製され、標準技術を利用してｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）発現ベクターのＮｃｏ−ＢａｍＨＩ部位にクローン化された。遺伝子の注入、その方向性および一体性は、バクテリオファージＴ７促進物質を使用してプラスミドのＤＮＡ配列によって審査された。

ヘリコバクターピロリ組み換えフラボドキシンの発現および精製
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１コンピテント細胞が挿入物を含んだｐＥＴ２８ａプラスミドで変質あるいはガン化され、カナマイシン（３０μｇ/ｍｌ）の存在下、３７℃にて１０ｍｌのＬＢ培地内において培養された。

培養液は同一条件にて１０倍に希釈され、６００ｎｍで光学濃度（吸光度）が０．８となるまで成長が継続された。それらはＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）で誘導され、それら細胞は３〜４時間、成長が継続された。

その後、培養液は遠心分離され、細胞が採取された。それらは０．１５ＭのＮａＣｌで洗浄された。

遠心分離後、それら細胞は５０ｍＭのトリスＨＣｌバッファ（ｐＨ８）、１ｍＭのβメルカプトエタノール、１ｍＭのＥＤＴＡおよび１ｍＭのＰＭＳＦ内で再縣濁された。

それら細胞は超音波サイクルで粉砕され、細胞破断片は遠心分離（１８００ｒｐｍで４５分間、４℃）によって除去された。

得られた未処理抽出物は６５％の飽和硫酸アンモニウムで沈殿され、遠心分離された。上澄液は、６５％の硫酸アンモニウムにて５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）で平衡化処理されたＤＥＡＥ ＤＥ−５２セルロースカラム上に充填された。

タンパク質は６５％から０％の（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４の浸透である逆相勾配で溶離された。

５０ｍＭのトリスＨＣｌバッファ（ｐＨ８）でのタンパク質の透析後、それは同一バッファで平衡化された別ＤＥＡＥ ＤＥ−５２セルロースカラム上に充填された。

タンパク質は０から１ＭのＮａＣｌの勾配で溶離された。タンパク質の（補因子のない）アポ形態と（補因子を有する）ホロ形態とを分離するには、サンプルをＦＰＬＣシステムでＭｏｎｏＱ１０/１０カラムを通過させることが必要であるものの、このカラム通過後に精製されたタンパク質が得られた。

得られたタンパク質は−２０℃で保存された。

阻害試験
ヘリコバクターピロリは、ピルビン酸塩の酸化脱炭酸作用からエネルギーを得るための基本的反応に関与するため、フラボドキシンはヘリコバクターピロリの生存に必須である。

この反応では、フラボドキシンはＰＦＯＲ酵素とＦｑｒＢ酵素との間で電子を移動させ、電子をＮＡＤＰ^＋に放出する。

以下の実施例では、ｐＢＳ（ＫＳ）ベクターに挿入されたＰＦＯＲ酵素の遺伝子とｐＥＴ２９ｂベクターに挿入されたＦｑｒＢ酵素の遺伝子に対応するｃＤＮＡが利用された。

それら両方の組み換え酵素は溶解性フラクションとして発現され、レダクターゼ（ｎｓｆＡおよびｎｆｓＢ）が欠落したＥ．ｃｏｌｉ ＪＶＱ２コンピテント細胞内のＰＦＯＲ並びにＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞内のＦｑｒＢとして発現される。

これら細胞は３７℃のＬＢ培地内で成長し、ＪＶＱ２の場合にはアンピシリンに対する抵抗性で選択され、ＢＬ２１の場合にはカナマイシンに対する抵抗性で選択される。

その後、それらはＩＰＴＧで誘導され、３時間の誘導（光密度約０．８）後に−８０℃で保存された。

ＦｑｒＢ酵素は、ニッケルアフィニティクロマトグラフィによって精製されるようにアミノ酸配列のＮ端末にて６個のヒスチジン残基の末尾で発現される。よって、細胞は破砕バッファ（５０ｍＭの燐酸ナトリウム、３００ｎＭのＮａＣｌ（ｐＨ８）、１０ｍＭのイミダゾール）内で再縣濁され、１分間隔の１０秒間の超音波サイクルによって破砕された。

残った細胞は４℃の３０分間にわたる１００００ｒｐｍの遠心分離によって排除され、上澄液は破砕バッファで既に平衡化されていたニッケルアフィニティカラム（Ｎｉ−ＮＴＡアガロース、Ｑｉａｇｅｎ）上に充填された。２０ｍＭ、４０ｍＭおよび６０ｍＭのイミダゾールで３回の洗浄が実施され、他のタンパク質とのマトリックスの非特定相互作用が排除され、ＦｑｒＢ酵素は２５０ｍＭのイミダゾールの勾配でカラムから溶離された。

最後に酵素は１０％のグリセロールでＰＢＳ保存バッファ内で透析された。試験された酵素に対して、それが活性に影響を及ぼさないことが理解されたため、ヒスチジンの末尾は除去されなかった。

ＰＦＯＲ酵素は空気に曝露することで不活性化され（酸素で不活性化）、窒素流が前に通過し、接続部が密封されたシステムで純化された。

細胞は５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）と１ｍＭのＭｇＣｌ、１ｍＭのＤＴＴおよび１０％のグリセロールで再縣濁され、１分間隔の１０秒間超音波サイクルによって超音波処理され、１０分間の４℃における８０００ｒｐｍの遠心分離され、細胞破断片が除去された。その後にさらに高速（２時間、２４０００ｒｐｍ）で遠心分離され、タンパク質の濃度はブラッドフォードアッセイによって決定された。

無処理抽出液はタンパク質濃度が２５ｍｇ/ｍｌとなるまで以前のバッファで希釈された。タンパク質は０から０．５Ｍの塩化ナトリウムの勾配のＤＥＡＥ ＤＥ−５２カラム内で部分的に精製された。酵素を含有する破断片は、２５μｌの反応バッファ（５００ｍＭのピルビン酸塩、１０ｍＭのＣｏＡおよび１００ｍＭのベンジルビオロゲン）に加えられた５０から１００μｌの破断片と、無色から青色に変色した酵素を含有する破断片とで成る好気条件の急速エッセイによって所在確認された。

その後に、酵素を含有する破断片は保存バッファ（細胞を再縣濁したものと同一）で透析された。その後の精製ステップは産量を相当程度減少させ、特定酵素活性は不純物によって変化したとは確認されなかったので、これらの試験のために酵素は前述のように部分的に精製された。

ピルビン酸塩、ＰＦＯＲ、フラボドキシン、ＦｑｒＢおよびＮＡＤＰ^＋（活性アッセイ）の間の電子移動の連続的反応後に、ＮＡＤＰＨの形成を伴う３４０ｎｍの信号の出現が分光的に続いた。その反応混合物は１００ｍＭの燐酸カリウム（ｐＨ７）、１０ｍＭのピルビン酸塩、０．１８ｍＭのＣｏＡ、１ｍＭのＭｇＣｌ、０．３ｍＭのＮＡＤＰ^＋、０．０９、ｇ/ｍｌのＰＦＯＲ、１０μＭのＦｌｄおよび０．１５μＭのＦｑｒＢを含んだ。ＣｏＡを除外した混合物は嫌気性条件に合わせて特に設計されたキュベットに入れられた。酸素は真空とアルゴンを交互に５分間の交互に流すサイクルによって除去された。反応はそのキュベットの内側の小部屋に保持されていた０．１８ｍＭのコエンザイムＡ（ＣｏＡ）の追加によって開始された。ＣｏＡ試薬を加えた後、反応は１５分で完了した。どの反応成分の欠落もＮＡＤＰＨの形成には結びつかなかった。すなわち全成分が、ピルビン酸塩とＮＡＤＰ^＋との間の電子の移動のために不可欠であることが解った。

阻害アッセイは前述の活性アッセイと同一条件下で実施され、一般化学構造式（ＩＩ）の本発明化合物が５０μＭ、反応キュベットにさらに加えられた。

図１で示すように、阻害はこの濃度でほぼ全面的であった。

阻害物質の結合エネルギー
本発明の阻害物質のヘリコバクターピロリのフラボドキシンに対する特異結合は等温適定熱量計（ＩＴＣ）により確認された。この技術は標的タンパク質に対するそれぞれの化合物の親和性を測定するだけではなく、結合のエンタルピー成分およびエントロピー成分の貢献度をも測定する。

結合実験は７％のＤＭＳＯを含んだ５０ｍＭのＥＰＰＳバッファ（ｐＨ９）内で実施された。３００から５００μＭの濃度の阻害物質が注射器内に入れられ、約２０μＭのタンパク質が測定セル内に収容された。

阻害物質の親和定数は約１μＭであり、（ミクロモル濃度でピルビン酸塩の脱炭酸化を完全に阻害する）阻害アッセイ内で得られた結果と一致した。

特に、一般化学構造式（ＩＩ）の化合物はフラボドキシンに対する親和定数が８．０（±２．０）μＭである。

Claims (9)

1. 薬剤組成物として利用するための下記の一般化学構造式（Ｉ）の化合物またはその塩であって、
   

   

   式中、Ｒ_１はＨ原子、Ｘ原子またはＣＸ_ｍＨ_３−ｍの基であり、ＸはＦ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩから選択されるハロゲンであり、これらは同一ハロゲンまたは異種ハロゲンであり、ｍは１から３であり、
   Ｒ_２はＮＯ_２、ＣＯＯＲ’またはＳＯ_３Ｒ’基であり、Ｒ’は水素原子（Ｈ）またはＣ_１−Ｃ_６アルキル基であり、
   ｎは１から５である、
   ことを特徴とする化合物。
2. ｎは１から３であり、Ｒ_１はＣＸ_ｍＨ_３−ｍの基であり、このＸはＦまたはＣｌであり、Ｒ_２はＮＯ_２、ＣＯＯＨまたはＳＯ_３Ｈ基であることを特徴とする請求項１記載の化合物。
3. ｎは２であり、ｍは３であり、Ｒ_２はＮＯ_２であることを特徴とする請求項１または２記載の化合物。
4. ＸはＦであることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の化合物。
5. 下記の化学構造式（ＩＩ）の構造を有することを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の化合物。
   

   
6. 感染症の治療に利用される請求項１から５のいずれかに記載の化合物を含んでいることを特徴とする薬剤組成物。
7. 感染症はヘリコバクターによって引き起こされることを特徴とする請求項６記載の薬剤組成物。
8. 感染症はヘリコバクターピロリによって引き起こされることを特徴とする請求項７記載の薬剤組成物。
9. 感染症は胃炎、胃十二指腸潰瘍、リンパ腫または胃ガンであることを特徴とする請求項６から８のいずれかに記載の薬剤組成物。

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