JP2010512796A - 抗Notch3アンタゴニスト抗体とNotch3関連疾患の予防及び治療におけるその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、その開示を出典明示によりここに援用する2006年12月18日出願の米国仮特許出願第60/875597号及び2007年1月6日出願の米国仮特許出願第60/879218号の優先権を主張する。
この出願を通して使用される用語は、当業者にとって通常の典型的な意味を持つものと解されるものである。しかしながら、本出願人は、次の用語には、以下に記載される特定の定義が与えられることを所望する。
可溶型標的又はその断片は抗体の生産のための免疫原として使用することができる。抗体は対象の標的に対してつくられる。好ましくは、標的は生物学的に重要なポリペプチドであり、疾患又は障害を被っている哺乳類への投与がその哺乳類において治療的効果を生じうる。全細胞を、抗体を作製するための免役原として使用することができる。免役原は組換え的に生産され又は合成法を使用して作製されうる。免役原は天然源から単離することもまたできる。
本発明の抗体は、当該分野で周知のいかなる適切な方法により生産してもよい。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体を含みうる。ポリクローナル抗体の調製方法は、当業者に周知である(出典明示によりここに援用するHarlow等, Antibodies: a Laboratory Manual, Cold spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988))。
本発明は、Notch3の作用を阻害及び中和するアンタゴニストモノクローナル抗体を提供する。特に、本発明の抗体は、Notch3に結合し、その活性を阻害する。本発明の抗体は、ここに開示される、256A−4及び256A−8と命名する抗体を含む。本発明はまた、これら抗体の一つと同じエピトープに結合する抗体を含む。
別の態様において、本発明は、ここに開示の抗体をコードする単離された核酸配列、本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列を含むベクターコンストラクト、かかるベクターを含む宿主細胞、及び抗体を生産するための組換え技術を提供する。
多くのベクターが利用できる。ベクター成分は通常、限定するものではないが、以下のもの:シグナル配列、複製起点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列の一又は複数を含む:。本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターは、周知の技術を用いて調製できる。発現ベクターは、適切な転写又は翻訳制御ヌクレオチド配列、例えば哺乳類、微生物、ウィルス、又は昆虫遺伝子由来のものに作用可能に連結されたヌクレオチド配列を含む。制御配列の例としては、転写プロモーター、オペレーター、エンハンサー、mRNAリボソーム結合部位、及び/又は転写及び翻訳の開始及び終結を制御する他の適切な配列が挙げられる。ヌクレオチド配列は、制御配列が適切なポリペプチドのヌクレオチド配列と機能的に関連するとき「作用可能に連結」する。このように、プロモーターヌクレオチド配列は、該配列が適切なヌクレオチド配列の転写を制御する場合、例えば抗体重鎖配列と作用可能に連結する。
本発明の抗体は、任意の適切な宿主細胞から発現できる。本発明で有用な宿主細胞の例としては、原核、酵母、又は高等真核細胞が挙げられ、及び、限定するものではないが、抗体コード配列を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA又はコスミドDNA発現ベクターで形質転換されたバクテリア(例えば大腸菌、枯草菌)といった微生物;抗体コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母(例えばサッカロミセス、ピチア);抗体コード配列を含む組換えウィルス発現ベクター(例えばバキュロウィルス)で感染させた昆虫細胞系;組換えウィルス発現ベクター(例えばカリフラワーモザイクウィルス,CaMV;タバコモザイクウィルス,TMV)で感染させた、又は抗体コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター(例えばTiプラスミド)で形質転換した植物細胞系;又は哺乳類細胞のゲノム由来のプロモーター(例えばメタロチオネインプロモーター)又は哺乳類ウィルス由来のプロモーター(例えばアデノウィルス遅発性プロモーター;ワクシニアウィルス7.5Kプロモーター)を含む組換え発現コンストラクトを内部に持つ哺乳類細胞系(例えばCOS、CHO、BHK、293、3T3細胞)が含まれる。
本発明は更に、本発明の抗体及びその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド又は核酸、例えばDNAを提供する。例示的なポリヌクレオチドとしては、ここに記載の一又は複数のアミノ酸配列を含む抗体鎖をコードするものが挙げられる。本発明はまた、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドにストリンジェントな又はより低いストリンジェンシーのハイブリダイズ条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドも包含する。
本発明の抗体は、抗体合成のための当該分野で周知の任意の方法によって、特に化学合成によって、又は好ましくは組換え発現技術によって生産できる。
組換え技術を利用する場合、抗体は、細胞内のペリプラズム空間に生産するか、又は培地に直接分泌することができる。抗体が細胞内で生産される場合、第一工程として、微粒子状破片、宿主細胞か溶解断片のいずれか、が例えば遠心分離又は限外ろ過によって除去されうる。Carter等, Bio/Technology 10:163 (1992)に、大腸菌のペリプラズム空間に分泌される抗体を単離する手順が記載されている。簡潔には、細胞ペーストが酢酸ナトリウム(pH3.5)、EDTA、及びフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)の存在下で約30分以上溶解される。細胞破片は遠心分離により除去できる。抗体が培地に分泌されると、通常、かかる発現系からの上清が、市販のタンパク質収集フィルター、例えばAmicon又はMillipore Pellicon限外ろ過ユニットを用いてまず収集される。PMSFといったプロテアーゼインヒビターが、タンパク質分解を阻害するために前述の工程のいずれかに含まれてよく、そして抗生物質が、外来性汚染物質の増殖を防止するために含まれてよい。
ポリペプチド又は抗体の治療製剤は、所定の純度を持つポリペプチドを、当該分野で典型的に用いられる任意の「製薬的に許容される」担体、賦形剤又は安定化剤、つまり緩衝剤、安定化剤、保存料、等張化剤、非イオン性洗浄剤、酸化防止剤及び他の添加剤と混合することにより凍結乾燥製剤又は水溶液として調製され保存されうる。Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Osol編, (1980)を参照。このような添加剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性でなければならない。
本発明の抗体は哺乳類を治療するために用いてもよいと考えられる。一実施態様において、抗体は、例えば、臨床前データを得るためにヒト以外の哺乳類に投与される。治療されるヒト以外の哺乳類の例には、ヒト以外の霊長類、イヌ、ネコ、齧歯動物と他の哺乳類が含まれ、それらについて臨床前研究が実施される。このような哺乳類は、抗体で治療される疾患のために確立された動物モデルであってもよく、又は、興味の抗体の毒性を研究するために用いられてもよい。これら実施態様の各々において、用量漸増研究が哺乳動物において実施されうる。
本発明の他の実施態様では、前述した疾患の治療に有用な物質を含有する製造品が提供される。製造品は容器及び説明書を含んでなる。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、シリンジ、及び試験管が含まれる。容器はガラス又はプラスチックのような様々な材料で形成することができる。容器は病状の治療に有効な組成物を収容しており、滅菌した出入口を有している(例えば、容器は皮下注射針により貫通可能なストッパーを具備する静脈溶液用のバック又はバイアルであってよい)。容器上の又は容器に付随する説明書には、組成物が、選択された病状の治療に使用されることが示されている。さらに製造品は、製薬的に許容可能なバッファー、例えばリン酸緩衝生理食塩水、リンガル液及びブドウ糖液を収容する第2の容器をさらに具備しうる。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用指示書を含む、市販及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含んでいてもよい。
本発明の別の態様において、抗体又はその機能的な誘導体をコードする配列の核酸は、遺伝子療法として、Notch3の異常な発現及び/又は活性に伴う疾患又は障害を治療、抑制又は予防するために投与される。遺伝子療法とは発現した又は発現可能な核酸を、患者に投与することによって実施される治療法を意味する。本発明の実施態様において、核酸はそれらがコードする、治療効果をもたらタンパク質を産生する。利用可能な遺伝子療法の任意の方法が、本発明によって使用できる。以下に、典型的な方法について説明する。
ヒトNotch3のLIN12/二量体形成ドメイン(以降「LD」)に特異的に結合する抗Notch3モノクローナル抗体を、組換えNotch3-Fc融合タンパク質を、カルボキシ末端においてγ1Fc領域に融合したNotch3LDを含む免疫原として用いて生産した。特に、免疫原は、Notch3LDのアミノ酸残基1378から1640(図1参照)とヒトγ1Fc融合タンパク質とを含んだ。アミノ酸残基43から1377由来のNotch3EGFリピート領域を含むコントロール抗体を生成した(255A−79と呼ぶ)。
8−12週齢の雄A/Jマウス(Harlan, Houston, TX)に、200μlのPBS中のフロイント完全アジュバント(Difco Laboratories, Detroit, MI)中の25μgのNotch3−EGF/Fc又はNotch3−LD/Fcを皮下的に注射した。注射の2週間後で屠殺の3日前に、マウスにまたPBS中の同じ抗原25μgを腹腔内注射した。各融合体について、単一の細胞懸濁液を免疫化細胞の脾臓から調製し、Sp2/0ミエローマ細胞との融合に使用した;5×108のSp2/0及び5×108の脾臓細胞を、50%のポリエチレングリコール(分子量1450) (Kodak, Rochester, NY)及び5%のジメチルスルホキシド(Sigma, St. Louis, MO)を含む培地中で融合させた。ついで、細胞を、10%のウシ胎仔血清、100ユニット/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、0.1μMのヒポキサンチン、0.4μMのアミノプテリン、及び16μMのチミジンを補填したIscove培地(Invitrogen, Carlsbad, CA)中において200μlの懸濁液中1.5×105脾臓細胞の濃度まで調整した。200マイクロリットルの細胞懸濁液を約96ウェルプレートの各ウェルに加えた。約10日後、培養上清を、ELISAを使用するその抗原結合活性についてのスクリーニングのために取り出した。
抗Notch3MAbを特徴付けるために使用する細胞ベース結合アッセイには、ベクター、この場合にはpcDNA3.1/Hygro(Invitrogen, Carlsbad, CA)中へのヒトNotch3オープンリーディングフレームの完全長のクローニングが必要であった。Notch3コーディング領域は、鋳型としてヒト肝臓腫瘍RNA (Ambion, Inc., Austin, TX) を使用してRT−PCRによって合成した。最終のプラスミドコンストラクトNotch3/Hygroは、図1に示されるように完全長Notch3タンパク質を発現した。Notch3を発現する安定な細胞株は、実施例1に記載されたものと同じ手順に従ってリポフェクタミン2000キットを使用して、Notch3/Hygroプラスミドコンストラクトを293T細胞(ATCC番号CRL−11268)中に形質移入させることによって生産した。形質移入後、細胞をDMEM増殖培地で一晩培養し、ついで200μg/mlのハイグロマイシンを含む増殖培地に再播種し、12−14日間培養した。良好に単離された単一コロニーを取り上げ、別個のウェルで、十分なコロニー細胞が増幅されるまで増殖させた。ハイグロマイシン選択に耐性があり高レベルのNotch3タンパク質を発現した安定な293Tクローンを、ウェスタンブロット分析と、ポリクローナル抗Notch3抗体を使用する蛍光電子顕微鏡観察(R&D Systems, Minneapolis, MN)によって同定した。
変性条件下でのNotch3に対する抗Notch3MAbの結合活性、並びにヒト細胞株中でのNotch3及び他のNotch関連タンパク質の発現レベルを評価するためにウェスタンブロットを実施した。精製したNotch3−LD/Fc融合タンパク質をタンパク質負荷バッファーと組み合わせた。タンパク質試料をまた実施例1に記載された一過性に又は安定に形質移入された細胞から調製し、これを培養皿から収集し、PBSで一回洗浄し、全細胞性タンパク質抽出物バッファー(Pierce, Rockford, IL)に再懸濁させ、等容量の2×タンパク質試料負荷バッファーの添加後に100℃で加熱した。全試料を4−15%勾配のSDS−PAGEでの電気泳動によって分離した。タンパク質をゲルからPVDF膜に移し、抗Notch3MAbを一次検出抗体としてウェスタンブロット膜に適用した。HRP結合二次抗体を検出に使用し、上述のように化学発光基質を使用してシグナルを生成した。ヒトFc、V5タグ、Notch3及びNotch1に対して陽性のコントロール抗体は(Invitrogen, R&D Systems, Santa Cruz Biotechnologies, 及びOrbigen)から購入した。
A.プラスミドコンストラクト
上の実施例3に記載された完全長Notch3発現コンストラクトを配列決定により確認したところ、図1に示された発表されている配列と一致していた。ヒトJagged1プラスミドをOriGene(Rockville, MD)から入手し、配列決定によりNM_000214(NCBI/Genbank受託番号)と同一であることを証明した。OriGeneのJagged1プラスミドは抗菌性の選択マーカーを有さないので、Jagged1コード化配列を含むNot I断片をpcDNA3.1/ハイグロマイシンに形質移入した。ヒトJagged2 cDNAの3.7Kbのサブクローンを、ヒトT細胞白血病細胞株であるHH(ATCC番号CRL−2105)からの第1鎖cDNA合成及びPCR増幅により生成した。次いでJagged2 cDNAをサブクローニングした。Notch3、Jagged1、及びJagged2の発現は、実施例4に記載されたように一過性トランスフェクションとウェスタンブロットによって確証した。
5’GCTCGAGCTCGTGGGAAAATACCGTGGGAAAATGAACCGTGGGAAAATCTCGTGG (配列番号7)
5’GCTCGAGATTTTCCCACGAGATTTTCCCACGGTTC (配列番号8)
2つの安定な細胞株を、ヒト胚性腎細胞株 (HEK293)を使用して機能的アッセイのために生産した。一つの細胞株は核ゲノム中に組み込まれたNotch3発現プラスミド及びCBF1−Lucレポータープラスミドを含んでいた。この細胞株は、製造者のプロトコルに従ってリポフェクタミン2000を使用して293T細胞中にNotch3/ハイグロマイシン及びCBF1−Lucプラスミドを同時形質移入することによって生産した。安定な形質移入細胞クローンを、DMEM増殖培地において200μg/mlのハイグロマイシンに対して選択し、ルシフェラーゼレポーターアッセイ及びウェスタンブロットによってスクリーニングした。比較的高いレベルのNotch3発現(ウェスタンブロットに基づく)及びルシフェラーゼ活性を有する細胞株を機能アッセイに使用するために選択し、NC85と標示した。
NC85細胞を混合し、ヒトのJagged1(Jagged1/293T)、Jagged2/293F、又は、pcDNA3.1/293Tをそれぞれ安定して発現する他の293T細胞株と共に24〜48時間培養した。共培養終了後、培地を吸引によって除去し、細胞を1×Passive Lysis Buffer(E1501, Promega, Madison, WI)に溶解し、ルシフェラーゼ活性をTD−20/20ルミノメーター(Turner Designs Instrument, Sunnyvale, CA)において製造業者のプロトコール(E1501, Promega, Madison, WI)に従ってルシフェラーゼアッセイシステムを用いてアッセイした。図6及び図7に示すように、NC85細胞をJagged1/293T又はJagged2/293Fと共に培養すると、ルシフェラーゼ活性がpcDNA3.1/293T細胞と共に培養したものと比較して2〜4倍増加した。抗Notch3 MAbの阻害作用を評価するために、共培養した細胞の播種及び混合の始めの細胞培養物に抗体を添加した。(256−A、256A−8及びEGF−リピートドメインコントロール255A−79)。
Becton Dickinson Labware (#18779, Palo Alto, CA)の通常の96ウェル組織培養プレートを、ラットJagged1/Fc、ヒトDLL−4(R&D Systems, Minneapolis, MN)又はヒトFc(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)、ウシ血清アルブミン(Sigma, St Louis, MO)にてコートした。各タンパク質(3μg/mlPBS)を100μlづつウェルに分注し、使用前のコート溶液を除去するまで少なくとも8時間、室温又は4℃で維持した。NC85細胞又は癌細胞を、1ウェル当たり3〜5×104細胞で播き、28〜48時間生育させた。ルシフェラーゼレポーターアッセイ及び抗体阻害アッセイは、上のセクションCにて説明したように、実施した。ルシフェラーゼレポーターアッセイは、LIN12/二量体化ドメインに対する256A−4及び256A−8の2つのMAbの結合は、Jagged1及びJagged2の誘導性ルシフェラーゼレポーター活性をほぼ完全に遮断したことを示す(図6及び7)。対照的に、コントロールとしてのNotch3−EGFドメイン(255A−79)に対するMAb特異的結合は、Jagged1誘導性ルシフェラーゼレポーター活性のみを阻害するが(およそ60%阻害、図6)、Jagged2誘導性ルシフェラーゼレポーター活性を阻害しない(図7)。DLL−4−誘導性ルシフェラーゼレポーター活性を遮断するMAb 256A−4及び256A−8の能力は、図8に示す。
抗Notch3 MAbがヒト癌細胞に発現される天然のNotch3に結合し、レセプターシグナル伝達を遮断するか否かを確認するために、OV/CAR3及びA2780の2つの卵巣癌細胞株を用いてレポーターアッセイを行った。256A−4及び256A−8は、OV/CAR3細胞において天然のNotch3に媒介されるJagged1誘導性Notchシグナル伝達を有意に遮断した(図9a)。同様に、両MAbは、プレート上にコートしたDll4によって誘導されるおよそ50%のルシフェラーゼ活性を阻害した(図9b)。後の結果は、Notch1及びNotch3がA2780細胞において発現されるという事実と一致している。これらの結果は、抗Notch3 MAbが癌細胞における天然Notch3媒介性シグナル伝達を阻害しうることを示唆する。
アネキシンVは細胞表面上の早期アポトーシスのマーカーであり、アポトーシスの細胞群は蛍光体標識した抗アネキシンV抗体によって印付けされ、FACS分析によって定量化されうる。上記のように、NC85細胞をFc−又はJagged1/Fc−コート96ウェルプレートの1ウェルにつき5〜6×104細胞で播き、無血清DMEM培地に24時間維持した。アポトーシス細胞は、FITC−標識抗アネキシンV抗体(BD Biosciences, Palo Alto, CA)によって染色し、FACSによって分析した。Jagged1/Fcコート表面上で培養した細胞は、Fcコートプレート上で培養したものと比較して有意にアポトーシス細胞群が低かった(図10)。抗体の機能効果を調べるために、抗Notch3 MAbを、研究の始めの細胞培養物に加えた。図10に示すように、抗Notch3 MAb 256A−4及び256A−8はJagged1によって誘導される細胞生存作用のおよそ50〜65%を遮断した。
インビトロ細胞遊走及び浸潤アッセイは、癌細胞の転移能力を評価するために多用される。これらのアッセイは、腫瘍原性の293T/Notch3−安定性細胞株(NC85)に対する抗Notch3 MAbによって発揮される阻害効果をアッセイするために実施した。浸潤アッセイは、Costar48-ウェルインサートプレート(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)を使用して実施した。インサートは、インサートの底にある多孔性メンブラン(孔直径=8μm)によって分離される上下のチャンバに、ウェルを分ける。上記のセクションで記述したように、Notchリガンド、Jagged1/Fc、DLL−4又はヒトFcをメンブラン表層に固定した。NC85細胞は、1ウェルにつき100000細胞で播き、上部チャンバの無血清DMEM中、及び下部チャンバの10%FCS/DMEM中に維持した。10〜24時間後に、インサートメンブランの上表面に残った細胞を取り除き、インサートメンブランの底に付着しているメンブランを通過した細胞を0.05%結晶ビロードを含むPBSにて染色した。30%酢酸により細胞から色素を抽出し、590nmで読み取られる吸収を記録した。抗Notch3 MAbを細胞培養物に添加して24時間後にCostarアッセイプレートにNC85細胞を播き、すべてのMAbを細胞培養物に添加して24時間後にCostarアッセイプレートにNC85細胞を播いた。新鮮なMAbを加えて、遊走アッセイプレート中で同じ濃度を維持した。実験結果を図11Aに示す。
更に、細胞「球体」のJagged−1−誘導性の形成に対するMAb 256A−4及び256A−8の効果を調べた。Notch3を過剰に発現する293T細胞をJagged1コートプレート上で培養した場合に、形成された細胞は「細胞ボール」又は「球体」を軽く接着した。しかしながら、MAb 256A−4及び256A−8の存在下では、これら細胞球体の形成は阻害された(データは示さない)。
A.ドメインSwap策略と原理
第一に、アンタゴニストNotch3 MAbは、Notch3 LIN12/二量体化ドメイン(LD)と結合するが、相同なヒトNotch1 LIN12/二量体化ドメインには結合しない(図12及び13を参照)。第二に、実施例4で述べられるように、抗Notch3 MAbはウエスタンブロットにおいて変性Notch3タンパク質に結合しないことから、MAbは立体配座的エピトープに結合することが示される。第三に、Notch3及びNotch1はLIN12/二量体化ドメインのおよそ55%のアミノ酸配列相同性を共有するので、この領域内のNotch3とNotch1間のドメインswapはタンパク質立体配座を壊さないと結論づけられた。
配列分析は、Notch3が3つのLIN12リピートを有し、その二量体化ドメインは2つのセグメントに分かれることを示す。したがって、5つのドメインswapタンパク質コンストラクトは、Notch1の対応するドメインによって置換される2つの二量体化セグメントと3つのLIN12リピートのそれぞれによって生成される。図12に図示したように、ドメインswapコンストラクトは、PCR−SOE を用いて生成した(Ho, et al., Gene 77:51 (1989);Horton, et al., BioTechniques 8:528 (1990))。PCR及びPCR−SOE反応は、反応に添加した1Mベタインと5%DMSOによるPCRを用いて行った。PCRサーモサイクルは、各々のPCRサイクルのアニーリング工程がPCR−SOEでは1分の伸展としたことを除いては、PCR及びPCR−SOEとほぼ同じとした。最終PCR−SOE生成物をサブクローニングして、配列決定によって確認した。正しいインサート配列を有するプラスミドクローンを、NheI及びXhoIにより切断して、インサートを切り出し、ゲル精製してサブクローニングした。5つのNotch3/Notch1ドメインswapコンストラクトを図12に例示する。エピトープマッピングを容易にするために、ヒトIgGκ鎖シグナル伝達ペプチドを、ドメインswapコンストラクトのリーダーペプチドとして用いた。アミノ酸配列を図16及び17に示す。
前セクションに記載の方法及びPCRを用いて、Notch1-LD cDNAをPCR増幅した。PA−1細胞総RNA(ATCC番号 CRL−1572)から第一鎖cDNAテンプレートを合成した。ヒトIgGκ鎖リーダーペプチドコード配列を、PCR増幅し、PCR−SOEによりNotch1-LDの5'に結合させるためにリーダーペプチドとして用い、His-γ1Fc/pSecにサブクローニングした。
ELISA分析結果に基づいて、標的ドメインLI、D1及びD2をサブドメインにさらに分けた。サブドメイン発現コンストラクトを用いたELISA結合分析は、L1及びD2だけがNotch3 MAb結合に必要であることを示した。D1ドメインは必要でなかった。したがって、L1及びD2のドメインは、特定の結合部位の更なる分析のためにアミノ酸突然変異の複数のクラスターに分けた。図16及び図17に示すアミノ酸突然変異のクラスター又はL1及びD2サブドメインswapを含むコンストラクトを生成した。
Notch3/Notch1−LDドメインswapプラスミドを、リポフェクタミン2000を用いてCHO細胞に過渡的に形質移入した。CHO細胞を、6ウェルプレートの1ウェル当たり0.8〜1×106細胞で、10%FCSを含むDMEM成長培地に播き、形質移入の前終夜にわたってCO2インキュベーターに維持した。およそ3時間成長培地中で形質移入した後細胞を回収し、次いで2%FCSを有するDMEMに切り換え、3日間培養した。条件培地を回収して、3500回転数/分で10分間遠心分離した。CHOから分泌されるNotch3−LDドメインswapタンパク質を含む上清を集め、ウエスタンブロット及びELISA結合分析のために調製した。ELISAは、すべてのドメイン−swap融合タンパク質が発現され、培養上清中に分泌されたことを示し(表4)、これはウエスタンブロット分析によって更に確認された(データは示さない)。
ELISA読み値は、すべてのタンパク質が培地上清に発現されていることを示す検出抗体として抗ヒトFc抗体を用いた。ヒトIgG/Fcをコントロールとして用いた。各ウェルにコートされるヒトIgG/Fcの開始点は100ngである。
表4のELISA結合アッセイにおいて使用するタンパク質の略記号は以下の通りである。N1−LD、Notch1−LD/Fc。N3−LD、Notch3−LD/Fc。L1−swap:第一LIN12ドメインswap。L2−swap:第二LIN12ドメインswap。L3−swap:第三LIN12ドメインswap。D1−swap:第一二量体化ドメインswap。D2−swap:第二二量体化ドメインswap。hIgG−Fc、ヒトIgG Fc。
96ウェル平底Immulon IIマイクロテストプレート(Dynatech, Laboratories, Chantilly, VA)を、1×フェノールレッド及び3−4滴のpHix/リットル(Pierce, Rockford, IL)を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の100μlの抗体(0.1μg/ml)を添加することによって抗ヒトFc抗体(Jackson ImmunoResearch)でコートし、室温で一晩インキュベートした。コーティング溶液を、プレートをはじいて除去した後、0.1%のメルチオレート及びPBST中に2%のBSAを含む200μlのブロッキングバッファーを、非特異的結合をブロックするために各ウェルに1時間加えた。ついで、そのウェルをPBSTで洗浄した。Notch3/Notch1ドメインswapコンストラクトの各形質移入体から50マイクロリットルの上の条件培地を集め、50μlのブロッキングバッファーと混合し、マイクロプレートの個々のウェルに添加した。1時間のインキュベーション後、Notch3/Notch1−LDドメインswapタンパク質をコートした抗Fc抗体によって捕捉し、ウェルをPBSTで洗浄した。抗Notch3MAb及びアイソタイプ一致コントロールMAbを上のようにブロッキングバッファーで連続希釈し、50μlの希釈したMAbを各ウェルに添加して、結合Notch3/Notch1ドメインswapタンパク質への結合を評価した。セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合Fc特異的ヤギ抗マウスIgGを検出に使用した。0.1%の3,3,5,5−テトラメチルベンジジン及び0.0003%の過酸化水素を含むHRP基質溶液を、30分間、発色のためにウェルに添加した。50mlの2MのH2SO4/ウェルを添加して反応を終了させた。450nmでのODをELISAリーダーで読み取った。サブドメインswapコンストラクト及び変異のクラスターを上のELISA分析によって同様にして検査した。
MAb 256A−4及び256A−8はL1及びD2を含む立体配置的エピトープに結合するアンタゴニスト抗体であるのに対して、L1のみに結合する他の抗体256A−13はアゴニスト性である(2007年10月18日に出願の同時係属米国特許出願番号第11/874682号を参照)。さらに、アゴニスト256A−13はL1内のエピトープについてアンタゴニスト256A−4と競合し、エピトープマッピング研究により、これらはL1上のオーバーラップするエピトープに結合することが示唆される。主な相違は、アンタゴニスト抗体もD2に結合するのに対して、アゴニスト抗体は結合しないことである。L1及びD2への同時結合が拮抗性活性の原因であるという仮説を試験するために、256A−4と類似のD2のエピトープに結合する256A−2を分析した。MAb 256A−2はアンタゴニストでもアゴニストでもない(データは示さない)。試験は、256A−2が256A−13と競合せず、同時にNotch3に結合しうることを示した。さらに、256A−2及び256A−13はそれぞれ256A−4と一部競合しているが、これら2つの抗体が組み合わさるとNotch3に対する256A−4の結合を完全に遮断する(データは示さない)。また、試験から、L1及びD2のエピトープに対して2つの抗体が別々に結合してもリガンド依存性Notch3活性化は阻害されないことを示した。このことから、アンタゴニスト抗体は、おそらくL1及びD2相互作用を固定して安定化し、リガンドが誘導する立体配位的変化を阻害する、ブリッジを形成することが示唆される。(図18を参照) 。
抗体結合特性は重鎖と軽鎖の双方の可変領域に依存するので、256A−4及び256A−8の可変配列をサブタイプ化し、配列決定した。抗体IgGサブタイプを、Isostripマウスモノクローナル抗体キット(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)を使用して決定した。その結果は、256A−4及び256A−8の量MAbがIgG1重鎖とカッパ軽鎖を有していることを示した。
重鎖及び軽鎖の可変領域配列をRT−PCR及びcDNAクローニングを通して解読した。ハイブリドーマクローン256A−13からの全RNAを、製造者のプロトコルに従って RNeasy Miniキット(Qiagen, Valencia, CA)を使用して単離した。第一ストランドcDNAを、RNA鋳型とSuperscriptaseIIIキットを使用して合成した。軽鎖及び重鎖cDNAsの可変領域を、マウスカッパ鎖コード領域の 5’-末端をカバーする変性順方向プライマーと可変領域の3’-末端との接合部で定常領域に対応する逆方向プライマーを使用して、又はマウス重鎖コード領域の5’-末端をカバーする変性順方向プライマーとマウス重鎖の定常領域逆方向プライマーを使用して、第一ストランドcDNAからPCR増幅させた。PCR産物を市販のベクター中にクローニングし、Lone Star Lab(Houston, TX)によって配列決定した。ヌクレオチド配列を、コンピュータソフトウェアプログラムDNAStar(DNASTAR, Inc., Madison, WI)を利用して解析した。各抗Notch3 MAb配列を、同じハイブリドーマクローンから誘導した複数のPCRクローンからの配列によって決定した。
MAb 256A−4は、重鎖及び軽鎖の可変領域にそれぞれ123及び116アミノ酸残基を含む(図4A及び4B)。MAb 256A−8は、それぞれ重鎖及び軽鎖の可変領域の122及び123のアミノ酸残基からなる(図5A及び5B)。
Notchレセプター活性化は膜近傍部位(S2)でのリガンド誘導メタロプロテアーゼ切断を含み、細胞外サブユニットを生じる。この切断は、活性化されたNotch細胞内領域を放出するためのS3切断に対する必須の条件である。256A−4及び256A−8は共に、その結合にNotch3のL1及びD2ドメインの少なくとも一部の存在を必要とすることが判明した。これら2つのドメインは、線形配列内に近接して位置せずに、2つの別々のポリペプチドに位置しており、これら抗体が、不活性の自己抑制されたNotch構造を安定させることができることを示唆している。アンタゴニスト抗体が、2つのタンパク分解性切断を含むリガンド独立性の逐次Notch活性化事象を阻害しうるかどうかを試験するために、組換えNotch3レセプターを安定に発現する293T細胞(NC85細胞)を、固定した組換えJagged−1で処理するか又はJagged−1を発現する293T細胞と共培養した。培養培地においてタンパク分解性切断によって生成された可溶型細胞外サブユニットを、Notch3切断産物を認識する固体表面に結合した抗体を使用してELISAアッセイによって検出した。Notch3アンタゴニストMAbは、条件培地において可溶型Notch3細胞外サブユニットの生成を減少させると思われ、一方非機能的Notch3結合抗体は減少させないと思われた。
S2切断断片を直接検出するために、Notch3 C末端抗体を用いて7.5%SDS−PAGE電気泳動及びウェスタンブロットを行った。S2断片は57のアミノ酸残基であり、切断していないNotch3小サブユニット(膜貫通サブユニット)よりも小さく、わずかに速く遊走する。
Notch3アンタゴニストMAbがS2でNotch3のリガンド誘導性のメタロプロテアーゼ切断を阻害するか否かを調べるために、組換えNotch3を発現する293T細胞を、γセクレターゼインヒビター化合物E(1μM)にて4時間処理し、部位S2での切断の生成物を安定化し、蓄積させた。MAb 256A−4及び256A−8の存在下では、S2でのNotch3のJagged−1誘導性メタロプロテアーゼ切断は阻害された(データは示さない)。
A.ヒト癌細胞及び腫瘍形成細胞
HCC2429、HCC95等のNotch3発現を有するヒト癌細胞株は、Academic Institutesから、又はATCCから得られうる。293T/pcDNA3.1、及び293T/Notch3(NC85)は、前セクションに記載したように、関連した遺伝子を293Tに形質移入し、ハイグロマイシンにて選別することによって生成する。すべての細胞は、10%ウシ胎児血清、ナトリウムピルベート、非必須アミノ酸、L-グルタミン、ビタミン溶液及びペニシリン−ストレプトマイシンを有するRPMI1640培地又はDMEM培地中で培養する(Flow Laboratories, Rockville, MD)。細胞株は、インキュベーター中で、5%CO2及び95%の空気の混合下、37℃でインキュベートする。培養物は、凍結貯蔵物から回復させてから3週間未満の間維持される。90%の生存度を有する対数的に増殖する単細胞懸濁液細胞を、PBSにて洗浄した後に、腫瘍細胞注入のために用いる。
例えば、マウスは、フレデリック癌技術研究所, Frederick, MDの国立癌研究所の動物産生部門から得られる。動物は目的繁殖させ、研究の始めには実験的にナイーブである。研究に用いるために選択するマウスは、できるだけ年齢と体重が均一になるように選択する。6〜8週齢であり、開始時の体重はおよそ18〜25グラムとする。この研究で使用する動物の生年月日の記録は研究生データに取り置き、グループ帰属時の体重範囲を報告書に明記する。各動物は、番号を付した耳タグによって識別する。動物は、NIHガイドラインを満たすないしは上回る、セルロースベッドを含むポリスチレン使い捨て靴箱ケージに、処理群ごとにグループ化する(4マウス/ケージ)。研究の経過の間、動物室の環境条件をモニターし、18〜26℃の温度範囲内に維持し、相対的な湿度を毎日記録する。12時間の明/暗照明周期を研究期間中維持する。動物には放射線照射した食物を与える。この研究の結果を妨げうるレベルの汚染物質が食物中に存在することは明らかとなっていない。加圧滅菌水をウォーターボトルにより各動物に与える。この研究の結果を妨げうるレベルの汚染物質が水に存在することは明らかとなっていない。研究を行う前に、すべての研究動物は、投薬の初日前の少なくとも7日間の間、所定の住居に慣れさせる。
マウスは、ナトリウムペントバルビタール(50mg/kg体重)を用いて麻酔し、右側側臥位に置く。非小細胞肺癌(NSCLC)細胞株であるHCC2429(Haruki, et al. Cancer Res. 65: 3555 (2005))、HCC95(John Mina博士より)、及びH2122(ATCC番号 CRL5985)等の癌細胞を含む、10%マトリゲル含有の50μlハンクを脚の左葉に注射する。腫瘍細胞の注射後、マウスを左側臥位に向け、十分に回復するまで45〜60分間観察する。腫瘍細胞注射の記録は、生の研究データに書きおく。
すべての動物は、研究生データに記録される研究及び臨床所見の間、少なくとも1日1回ケージ内で観察される。顕著な有害効果を示す動物は研究から除外することが必要であろう。体重は処置の間週に1回測定する。可能であれば、各マウスからの癌組織を回収し、将来可能性のある生物学的特徴付けのために保存する。
他のNotch3関連疾患を同定するために、患者試料のNotch3遺伝子を配列決定し、患者細胞を用いてFISH(蛍光インサイツハイブリダイゼーション)及びCGH(比較ゲノムハイブリダイゼーション)分析を行って遺伝子増幅や転座を探すか、又は患者組織ないしは腫瘍切片を用いて免疫組織化学を行ってNotch3レセプターの過剰発現を調べることができる。さらに、Notch3関連疾患を有すると思われる患者からの細胞を単離・培養して、細胞移動、浸潤、生存及び増殖に対する本発明のアンタゴニスト抗体の影響を調べることができる。細胞移動及び浸潤アッセイのためのプロトコールは実施例7に記述しており、アポトーシスアッセイのためのプロトコールは実施例6に記述している。細胞増殖アッセイのために、患者試料から培養した細胞を、Notchリガンドにてコートした96ウェルプレートとコートしていない96ウェルプレートに播く。アンタゴニスト抗体は培養開始時に添加する。細胞数は、トリパンブルー染色を用いて所定の時間点で計数する。Notch3 FISH及びCGH分析は、Park, et al.(Cancer Res, 66: 12 (2006))の公開されたプロトコールを使用して実行してもよい。
Claims (45)
- 配列番号2に記載のものと少なくとも95%の同一性を有するアミノ配列を含む可変重(「VH」)鎖領域。
- 定常領域を更に含む請求項1に記載のVH鎖領域。
- 定常領域のCH1、CH2及びCH3ドメインを含む請求項2に記載のVH鎖領域。
- 定常領域がIgG抗体のものである請求項2に記載のVH鎖領域。
- IgG抗体が、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、又はIgG4抗体である請求項4に記載のVH鎖領域。
- 配列番号3に記載のものと少なくとも95%の同一性を有するアミノ配列を含む可変軽(「VL」)鎖領域。
- 定常領域を更に含む請求項6に記載のVL鎖領域。
- 配列番号4に記載のものと少なくとも95%の同一性を有するアミノ配列を含む可変重(「VH」)鎖領域。
- 定常領域を更に含む請求項8に記載のVH鎖領域。
- 定常領域のCH1、CH2及びCH3ドメインを含む請求項9に記載のVH鎖領域。
- 定常領域がIgG抗体のものである請求項9に記載のVH鎖領域。
- IgG抗体が、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、又はIgG4抗体である請求項11に記載のVH鎖領域。
- 配列番号5に記載のものと少なくとも95%の同一性を有するアミノ配列を含む可変軽(「VL」)鎖領域。
- 定常領域を更に含む請求項13に記載のVL鎖領域。
- 配列番号35、36及び37を含むVL鎖配列。
- 配列番号32、33及び34を含むVH鎖配列。
- 配列番号41、42及び43を含むVL鎖配列。
- 配列番号38、39及び40を含むVH鎖配列。
- 配列番号2から5、又は32から43の一又は複数をコードする核酸。
- 請求項19に記載の一又は複数の核酸を含むベクター。
- 請求項20に記載のベクターを含む細胞。
- 抗体がNotch3に特異的に結合する、請求項1又は8に記載のVH鎖領域を含む抗体又は抗体断片。
- 抗体がNotch3に特異的に結合する、請求項6又は13に記載のVL鎖領域を含む抗体又は抗体断片。
- 請求項6又は13に記載のVL鎖領域を更に含む請求項22に記載の抗体。
- VL鎖領域が配列番号3を含み、VH鎖領域が配列番号2を含む請求項24に記載の抗体。
- VL鎖領域が配列番号5を含み、VH鎖領域が配列番号4を含む請求項24に記載の抗体。
- 定常軽鎖領域及び定常重鎖領域を更に含む、請求項22から26の何れか一項に記載の抗体。
- 抗体がNotch3に特異的に結合する、請求項16に記載のVH鎖配列を含む抗体又は抗体断片。
- 請求項15に記載のVL鎖配列を更に含む請求項28に記載の抗体。
- 抗体がNotch3に特異的に結合する、請求項18に記載のVH鎖配列を含む抗体又は抗体断片。
- 請求項17に記載のVL鎖配列を更に含む請求項30に記載の抗体。
- 定常軽鎖領域及び/又は定常重鎖領域を更に含む、請求項28から31の何れか一項に記載の抗体。
- 抗体が単鎖Fvである請求項22から32の何れか一項に記載の抗体。
- 標識を更に含む請求項22から32の何れか一項に記載の抗体。
- 配列番号9に記載のものと少なくとも90%の配列同一性を有するLIN12ドメインと、配列番号18に記載のものと少なくとも90%の配列同一性を有する二量体形成ドメイン2を含むNotch3立体構造エピトープ。
- LIN12ドメインが配列番号9からなる、請求項35に記載の立体構造エピトープ。
- 二量体形成ドメインが配列番号18からなる、請求項35に記載の立体構造エピトープ。
- L1 LIN12ドメインのアミノ酸残基1395−1396、1402−1404及び1420−1422と、D2二量体形成ドメインのアミノ酸残基1576−1578及び1626−1628とを含む、Notch3立体構造エピトープ。
- 請求項35から38の何れか一項に記載の立体構造エピトープに結合する抗体。
- 請求項22から27及び39の何れか一項に記載の抗体のヒト化形態。
- 医薬の調製における請求項22から33及び請求項39から40の何れか一項に記載の抗体の使用。
- Notch3関連疾病又は疾患の治療のための請求項22から33及び請求項39から40の何れか一項に記載の抗体の使用。
- 疾病が、T細胞性急性リンパ性白血病、リンパ腫、異常血管新生を伴う肝臓疾患、糖尿病、卵巣癌、血管細胞運命を伴う疾患、関節リウマチ、膵臓癌、非小細胞肺癌、形質細胞腫瘍(例えば多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、及び髄外性形質細胞腫)、並びに神経芽細胞腫である、請求項42に記載の使用。
- Notch3関連疾病を検出するための、請求項34に記載の抗体の使用。
- 抗体の生成に適した条件下で請求項21に記載の細胞を培養し、生成された抗体を単離する、抗体生成方法。
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