JP2017538663A - 皮質下梗塞及び白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症の免疫学的処置 - Google Patents
皮質下梗塞及び白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症の免疫学的処置 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2017538663A JP2017538663A JP2017515698A JP2017515698A JP2017538663A JP 2017538663 A JP2017538663 A JP 2017538663A JP 2017515698 A JP2017515698 A JP 2017515698A JP 2017515698 A JP2017515698 A JP 2017515698A JP 2017538663 A JP2017538663 A JP 2017538663A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- seq
- fragment
- notch3
- chain variable
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
- A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
本発明は、皮質下梗塞及び白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症を有する患者の処置に有用な抗Notch3抗体治療に関する。
Notch遺伝子は、ショウジョウバエの1種であるキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)が切欠けのある(notched)羽根を有していることが発見された1917年に最初に記載された(Morgan, Am Nat 51:513 (1917))。この遺伝子は、およそ70年後にクローニングされ、そして、多くの異なる細胞型及び組織の発生において重要な役割を担っている細胞表面受容体であることが判明した(Wharton et al., Cell 43:567-581 (1985))。それ以来、この遺伝子及びその分子機序が幅広く研究されている。Notch経路の普遍性は、それ自体異なるレベルで現れる。
本発明は、Notch3抗体又はその断片に関する。これらの抗体は、とりわけ、Notch1又はNotch2の2倍、4倍又は10倍高いNotch3への親和性を有することを特徴とする。特に、本抗体は、Notch3ECD沈着物、及びヒトNotch3のアミノ酸40−1643(配列番号:3)に含まれるエピトープに結合することができる。
配列番号:8を含む重鎖可変領域H−CDR1
配列番号:9を含む重鎖可変領域H−CDR2
配列番号:10を含む重鎖可変領域H−CDR3
配列番号:12を含む軽鎖可変領域L−CDR1
配列番号:13を含む軽鎖可変領域L−CDR2、及び
配列番号:14を含む軽鎖可変領域L−CDR3。
定義
用語「Notch3」は、Notch3ポリペプチドと同義語であり、示されている文脈から別の意味が明らかでない限り、配列番号:1(UniProt番号Q9UM47)で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。配列番号:1において、アミノ酸1−39はシグナルペプチド(配列番号:2)を構成し、アミノ酸40−1643は細胞外ドメイン(配列番号:3)を構成し、アミノ酸1644−1664は膜貫通ドメイン(配列番号:4)を構成し、そして、アミノ酸1665−2321はNotch3細胞内ドメイン(配列番号:5)を構成する。アミノ酸1571−1572はフリン様プロテアーゼによる切断部位であり、そして、アミノ酸40−1571はNotch3ECD(配列番号:6)(CADASIL中に異常に蓄積する)を構成する。
本発明は、ヒトNotch3に結合するがNotch1にもNotch2にも結合しないマウスモノクローナル抗体である単離抗体5E1(実施例1及び2)によって例示されるような、CADASIL患者の抗Notch3抗体治療に関する。単離5E1抗体は、追加的に、ヒト、マウス及びラットの両方において血管のNotch3ECD沈着物を動脈内(i.a.)検出でき、それによって動物モデルからヒト病理への非常に優れた変換を示す抗体を提供することができる。5E1抗体は、ヒトNotch3に対して作製され、ヒトとラットの両方のNOTCH3を近い結合定数(KD=55nM)で認識する(図1、実施例3)。
配列番号:8を含む重鎖可変領域H−CDR1
配列番号:9を含む重鎖可変領域H−CDR2
配列番号:10を含む重鎖可変領域H−CDR3
配列番号:12を含む軽鎖可変領域L−CDR1
配列番号:13を含む軽鎖可変領域L−CDR2、及び
配列番号:14を含む軽鎖可変領域L−CDR3。
ハイブリドーマクローン5E1の生成
6個のヒスチジン残基のC末端ストレッチを有するヒトNotch3タンパク質の細胞外エピトープ(アミノ酸657−846)をコードするヒトNotch3 cDNAを、強力なバキュロウイルスポリヘドリンプロモーターの制御下でgp67シグナルペプチド融合タンパク質として発現させるために、pACGP67Bバキュロウイルス補完導入ベクター(complementing transfer vector)(Pharmingen)に挿入した。Insectin-Plus(商標)試薬(Invitrogen)を使用して、その導入プラスミドと致死欠失を含有する改変バキュロウイルスDNA(BaculoGold (商標)DNA, Pharmingen)を一緒に、単一層として成長させたSf9細胞にトランスフェクトした。ウイルスプラークアッセイによって組み換えバキュロウイルスを同定及び精製し、そして、サザンブロットによってNotch3 cDNAの存在を確認した。次に、Notch3 cDNAを有する組み換えバキュロウイルスを増幅させて、高力価溶液(108〜109個のウイルス粒子/ml)を得た。組み換えタンパク質を産生させるために、T175培養フラスコ内のウシ胎児血清(20ml)(Biowhittaker, Boehringer)を含有するGrace培地中で単一層として成長させた5.107個のSf9細胞に高力価原液1.5mlを感染させ、27℃で3〜4日間インキュベートした。次に、組み換えタンパク質を含有する上清を採取し、硫酸アンモニウム(60%)沈殿によって濃縮した。ペレットを、300mM NaCl 50mM NaH2PO4(pH8.0)中に再懸濁し、同じ緩衝液で一晩透析した。透析した上清をNi2+アガロースビーズ上で精製して、250mMイミダゾールを含有する透析緩衝液中に組み換えタンパク質を溶出させた。タンパク質の純度をSDS−PAGE分析及びクーマシーブルー染色によってチェックした。
5E1のためのスクリーニングアッセイ
293T細胞を、8ウェルのNunc(登録商標)Lab-Tek(登録商標)II カバーガラスチャンバー(chambered coverglass)中で成長させ、ヒト完全長Notch1、Notch2若しくはNotch3 cDNAをコードするプラスミド又は空のベクタープラスミドをリン酸カルシウム沈殿によって一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの2日後、細胞をエタノール中で固定し、5E1抗Notch3、抗ヒトNotch1、抗ヒトNotch2一次モノクローナル抗体及び適切なFITCコンジュゲート抗体を使用する免疫蛍光用に処理した。5E1抗体は、Notch3構築物をトランスフェクトした293T細胞を染色し、Notch1又はNotch2構築物をトランスフェクトした細胞を染色しなかったが、抗Notch1及び抗Notch2抗体は後者の細胞をそれぞれ標識した。
Octet結合系を使用したNOTCH3に対する5E1の相対的親和性の決定
速度論分析を、ForteBio社のOctet RED技術を使用して、製造業者の指示に従って実施した。ビオチン化したNOTCH3 657−848を、ストレプトアビジンチップ上に、各々約3RUのレベルで固定化した。その後の5E1抗体との会合及び解離を、333nM〜3,3nMの範囲の濃度で分析した。続いて、ForteBio Data Analysis 7.0 ソフトウェアを使用してデータ分析を行った(図1)。
5E1の配列決定
RNeasy Mini Kitを使用し、製造業者のプロトコール(Quiagene Sciences, Valencia, CA)に従って、ハイブリドーマ細胞ペレットからトータルmRNAを抽出した。Superscriptase III kit(Invitrogene, Carlsbad, CA)を使用し、オリゴ(dT)プライマーを用いた逆転写によってRNAからcDNAを作製した。可変ドメインプライマーを使用してモノクローナル抗体のVH領域とVL領域の両方を増幅するPCR反応は、Ig可変ドメインプライマーのいくつかの組み合わせを使用する(High Fidelity PCR systems, Roche)。
方法に使用するためのマウス
TgPAC−Notch3R169C(88系統)を、以前に記載されているとおりFVB/Nバックグラウンドの異型接合状態で維持した(Joutel A, Monet-Lepretre M, Gosele C, Baron-Menguy C, Hammes A, Schmidt S, Lemaire-Carrette B, Domenga V, Schedl A, Lacombe P, Hubner N. 2010. “Cerebrovascular dysfunction and microcirculation rarefaction precede white matter lesions in a mouse genetic model of cerebral ischemic small vessel disease.”J Clin Invest 120(2):433-45)。これらのマウス及びそれらの野生型の対照同腹仔を、パリ・ディドゥロ大学(Paris Diderot University)(Paris, France)のヴィルマンサイト(Villemin site)の動物施設内で繁殖させた。マウスを通常の明/暗サイクル(12時間)下で飼育し、標準的な齧歯動物用飼料及び水道水を自由に摂取させた。ここに記載する実験は全て、発明者らの施設内動物管理使用委員会(local institutional animal care and use committee)(n9 Lariboisiere-Villemin)のガイドラインに十分に従い、使用する動物数を最小限に抑えるようあらゆる努力をしながら実施した。
方法に使用する注射用抗体
5E1モノクローナル抗体(アイソタイプIgG1)を、ヒトNotch3のEGFR17−21(アミノ酸残基657−846)に由来する組み換えタンパク質に対して作製した;それは、ヒト、マウス及びラットNotch3を認識する(Joutel, A et al . 2000. “The Ectodomain of the Notch3 Receptor Accumulates within the Cerebrovasculature of CADASIL Patients.” J Clin Invest 105 (5): 597-605)。ヒトpyro-Glu Abeta に対する5C9E7マウスモノクローナル抗体(アイソタイプIgG1)及びニワトリ卵白リゾチームに対するマウスモノクローナル抗体(アイソタイプIgG1)を対照抗体として使用した。全ての抗体をPBSで透析した。
抗体血漿中動態の決定
TgPAC−Notch3R169Cマウス(n=10匹の雄及び10匹の雌;6週齢、体重範囲:16〜26g)に、10mg/kgの5E1の単回腹腔内注射を受けさせた。マウスを5つの別個の群に無作為に割り当てた(1群当たりn=2匹の雄及び2匹の雌)。群1では、血漿試料を注射の15分及び24時間後に回収し;群2では、血漿を注射の30分及び48時間後に回収し;群3では、血漿を注射の1時間及び96時間後に回収し;群4では、血漿を注射の4時間及び1週間後に回収し、そして、群5では、血漿を注射の8時間及び2週間後に回収した。5匹の未注射のTgPAC−Notch3R169Cマウス(n=5匹の雌;6週齢、体重範囲18〜22g)を対照として使用した。2回目の血液サンプリング後直ちに、全てのマウスを屠殺して組織を採取した。抗体の血漿中レベルを決定した。T1/2は6〜7日であることが決定され、そして、Cmax(4時間)は約500ug/mlであった。遊離血漿mAbレベルの定量化を、標準として5E1及びNotchドメインコートプレートを使用して実施した。
Notch3ECD沈着物のインビボ抗体認識の決定
5E1及び対照5C9E7抗体を濃縮し、Alexa488分子にコンジュゲートさせた。10〜12月齢で、TgPAC−Notch3R169Cマウスは、脳血管と末梢血管の両方に広範なNotch3ECD沈着物を示す。10〜12月齢のTgPAC−Notch3R169Cマウス又は野生型マウス(1処置当たりn=4匹)に、10mg/kg(体重)の5E1又は対照IgG1抗体(Alexaコンジュゲート又は非コンジュゲート)を腹腔内注射した。3日後、ペントバルビタールナトリウム(80mg/kg)でマウスに深い麻酔をかけ、リン酸緩衝液(PB)で経心腔的にフラッシュ潅流した。脳及び末梢組織を採取し、液体窒素中で凍結し、−80℃で保存した。次に、凍結切片(12μm)を、直接蛍光によって分析するか、あるいは、マウス免疫グロブリンに対するAlexa488コンジュゲート抗体(1:500、Life technologies)を、musNotch3のN末端(Ala40−Glu468)に対する抗体(1:2000希釈;R&D AF 1308)と一緒に用いて共免疫標識し、二次抗ヤギAlexa594(1:500、Life technologies)で検出するか、又は組み換えラットNOTCH3タンパク質(aa 649−859、配列NP_064472)に対する抗体(1:16,000希釈)を一緒に用いて、二次Alexa594抗ウサギ(1:500、Life technologies)で検出した。切片を洗浄し、PBS中のDAPI(1:10,000;Sigma-Aldrich)を用いて室温で5分間対比染色し、1滴のDako蛍光マウンティングメディウムでマウントし、そして、落射蛍光イメージング(Nikon eclipse 80i)に供した。結果を図2及び2bisに示す。
インビボ標的捕捉の組織学
5E1又は対照の卵白IgG1の急性標的捕捉を2月齢のTgPAC−Notch3R169Cマウスで評価した。マウス(1処置当たりn=4匹)に10mg(抗体)/kg(体重)を腹腔内注射した。72時間後、ペントバルビタールナトリウム(80mg/kg)でマウスに深い麻酔をかけ、リン酸緩衝液(PB)で経心腔的にフラッシュ潅流し、脳及び腎臓を摘出し、液体窒素中で凍結し、−80℃で保存した。アセトン固定した凍結連続切片(12μm)を、Notch3ECD沈着物を捕捉したマウス抗体を可視化するために、Alexa594コンジュゲート抗マウス抗体で染色し、Alexa488コンジュゲート5E1、又は二次抗ヤギAlexa488コンジュゲートIgGで検出するmusNotch3のN末端に対する抗体(1:2000希釈;R&D AF 1308)、又は二次Alexa488抗ウサギ(1:500、Life technologies)で検出する組み換えラットNOTCH3タンパク質(aa 649−859、配列NP_064472)に対する抗体(1:16,000希釈)のいずれかで共免疫標識して、Notch3ECD沈着物の総量を決定した。結果を図2及び2bisに示す。
受動免疫化
実験マウスを2つの群に分けた。第一群について、2月齢のTgPAC−Notch3R169C雄性マウスを無作為化し、10mg/kgの5E1又は対照卵白IgG1を4か月間にわたり週1回腹腔内投与した。投与の最後に、マウス(1処置当たりn=12〜14匹)をインビボ脳血管反応性又は加圧軟膜動脈のアクティブ及びパッシブ直径の測定値について分析し、続いて、脳を摘出して血管のNotch3ECD及びGOM沈着物を定量化し、そして、血漿を回収して抗体レベルを決定した。第二の群は、未処置TgPAC−Notch3R169C及び野生型雄性マウス(n=30)を含み、平均2月齢の研究開始時にNotch3ECD及びGOM沈着物の初期荷重量並びに初期脳血管機能を決定し、そして、平均6月齢の研究終了時に脳血管機能障害の範囲を追跡調査するため分析した。結果を図3及び4に示す。
Notch3ECD及びGOM沈着物の定量分析
マウスにイソフルランを過量投与し、断頭し、そして脳を摘出した。Notch3ECD沈着物の免疫検出のために、半分の脳を液体窒素中で凍結し、−80℃で保存した。アセトン固定した凍結切片(12μm)を、(1)ヤギポリクローナル抗Notch3ECD(1:2000希釈;R&D AF 1308)又は組み換えラットNOTCH3タンパク質(aa 649−859、配列NP_064472)に対するウサギポリクローナル抗体(1:16,000希釈)、(2)ウサギポリクローナル抗コラーゲンIV(αColIV)(1:250希釈;Novotec 20411)又はラットモノクローナル抗ペルレカン(1:1000希釈;クローンA7L6、Millipore)及び(3)FITCコンジュゲートアルファ平滑筋アクチン(SMA)(1:2500希釈、Sigma-Aldrich)、続いて、適切な二次抗体(抗ヤギAlexa594、抗ウサギAlexa594、抗ウサギAlexa350又は抗ラットAlexa350)(1:500、Life technologies)で染色した。染色した切片を、Nikon 80i エクリプス顕微鏡を使用して40×の倍率設定で撮像し、そして、デジタルカメラ(Nikon)及びNIS Elements BR v 3.0 ソフトウェア(Nikon)を使用してこれを取得した。比較した群全体にわたり同一の設定とした。
脳血管反応性のインビボ分析
マウスにイソフルラン(維持、2%)で麻酔をかけ、次にマウスに挿管し、そして、動脈のPO2が120〜130mmHg及びPCO2が33〜36mmHgになるように調整したO2/N2混合物を人工的に通気した。動脈圧の記録のために及び血中ガス決定のための血液サンプリングのために、大腿動脈にカニューレを挿入した。直腸温度を、加温パッドに接続されたサーモスタット制御の直腸プローブを使用して37℃に維持した。外科手術後、イソフルランを徐々に中断し、ウレタン(750mg/kg、i.p.)及びα−クロラロース(50mg/kg、i.p.)で麻酔を維持した。麻酔のレベルを、角膜反射及びテールピンチに対する応答を試験することによってモニタリングした。
筋原性緊張及び動脈リモデリングのエクスビボ分析
CO2を過量投与した後、マウスを断頭し、その脳を摘出した。後大脳動脈の動脈セグメントを解剖し、37℃に維持した生理的食塩水(PSS)(pH7.4)を含有する臓器チャンバー中、2個のガラスマイクロピペットでカニューレを挿入し、そして、動脈波形システム(Living Systems Instrumentation, Inc., VT, USA)を使用して加圧した。作製したら、基礎緊張分析を開始する前に50mmHgの圧力で少なくとも30分間動脈を安定化させた。圧力サーボ制御ポンプを使用して10〜100mmHgで段階的に管腔内圧を増加させることによって、筋原性緊張を決定した。CCDカメラ及びエッジ検出ソフトウェア(Biopac MP150 and AcqKnowledge software, Biopac Systems Inc, CA, USA)を使用して血管の内径を連続して記録した。PSS中で測定した直径をアクティブ直径とした。各実験の最後に、EGTA(2〜5mmol/L、Sigma)及びニトロプルシドナトリウム(10μmol/L、Sigma)を含有する公称上Ca2+フリーのPSS中で最大膨張を得た。加圧工程を繰り返して動脈のパッシブ直径を決定した。動脈直径をマイクロメーターで示す。筋原性緊張をパッシブ直径の百分率として表す([パッシブ直径−アクティブ直径]/パッシブ直径×100)。結果を図4bisに示す。
Claims (23)
- 治療に使用するための、Notch1又はNotch2の2倍、4倍又は10倍高いNotch3への親和性を有する抗Notch3抗体又はその断片。
- Notch3ECD沈着物及び/又は野生型Notch3ECDに結合することができる、請求項1に記載の使用のための抗体又はその断片。
- Notch1又はNotch2に本質的に結合しない、請求項1又は2に記載の使用のための抗体又はその断片。
- ヒトNotch3のアミノ酸40〜1643(配列番号:3)を含むエピトープに結合する、先行請求項のいずれか一項に記載の使用のための抗体又はその断片。
- ヒトNotch3のアミノ酸657−846(配列番号7)に含まれるエピトープに結合する、請求項5に記載の使用のための抗体又はその断片。
- 単離されている、請求項1〜5に記載の使用のための抗体又はその断片。
- 以下の少なくとも1つを含む、請求項1〜6に記載の使用のための抗体又は断片:
配列番号:8を含む重鎖可変領域H−CDR1
配列番号:9を含む重鎖可変領域H−CDR2
配列番号:10を含む重鎖可変領域H−CDR3
配列番号:12を含む軽鎖可変領域L−CDR1
配列番号:13を含む軽鎖可変領域L−CDR2、又は
配列番号:14を含む軽鎖可変領域L−CDR3。 - 以下の全てを含む、請求項9に記載の抗体又はその断片:
配列番号:8を含む重鎖可変領域H−CDR1
配列番号:9を含む重鎖可変領域H−CDR2
配列番号:10を含む重鎖可変領域H−CDR3
配列番号:12を含む軽鎖可変領域L−CDR1
配列番号:13を含む軽鎖可変領域L−CDR2、及び
配列番号:14を含む軽鎖可変領域L−CDR3。 - 配列番号:11を含む重鎖可変領域を含む、請求項7又は8に記載の使用のための抗体又はその断片。
- 配列番号:15を含む軽鎖可変ドメインを含む、請求項7又は8に記載の使用のための抗体又はその断片。
- 請求項12及び13に記載の重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの両方を含む、請求項7又は8に記載の使用のための抗体又はその断片。
- ヒト化されている、先行請求項のいずれか一項に記載の使用のための抗体又はその断片。
- 以下:
(A)ヒトNotch3のアミノ酸40−1643(配列番号:3)若しくはその断片;
(B)ヒトNotch3のアミノ酸657−846(配列番号7)若しくはその断片;又は
(C)(A)及び(B);
を含む治療に使用するためのワクチンであって、患者への投与がNotch3ECD沈着物に結合することができる抗体を誘導する、ワクチン。 - 補助剤をさらに含む、請求項6に記載の使用のためのワクチン。
- 皮質下梗塞及び白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症(CADASIL)を処置する際に使用するための、請求項1〜14に記載の抗体又はワクチン。
- 処置が慢性的である、請求項16に記載の使用のための抗体又はワクチン。
- 慢性処置が少なくとも2週間、例えば少なくとも1ヶ月、6ヶ月、1年以上である、請求項17に記載の使用のための抗体又はワクチン。
- CADASILの処置のための医薬の製造のための、請求項1〜15のいずれか一項に記載の抗体の使用。
- CADASILを処置するための方法であって、それを必要とする個体に有効量の請求項1〜15のいずれか一項に記載の抗体又はワクチンを投与することによる、方法。
- 処置が慢性的である、請求項20に記載の方法。
- 慢性処置が少なくとも2週間、例えば少なくとも1ヶ月、6ヶ月、1年以上である、請求項21に記載の方法。
- 治療に使用するための請求項1〜15に記載の抗体又はワクチンを含むキット。
- 標識Notch3抗体又はその断片をさらに含む、請求項23に記載の使用のためのキット。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DKPA201400547 | 2014-09-25 | ||
DKPA201400547 | 2014-09-25 | ||
PCT/EP2015/071311 WO2016046053A1 (en) | 2014-09-25 | 2015-09-18 | Immunological treatment of cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2017538663A true JP2017538663A (ja) | 2017-12-28 |
JP6912375B2 JP6912375B2 (ja) | 2021-08-04 |
Family
ID=59153358
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017515698A Active JP6912375B2 (ja) | 2014-09-25 | 2015-09-18 | 皮質下梗塞及び白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症の免疫学的処置 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US10407500B2 (ja) |
EP (1) | EP3197494A1 (ja) |
JP (1) | JP6912375B2 (ja) |
WO (1) | WO2016046053A1 (ja) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017190025A1 (en) * | 2016-04-29 | 2017-11-02 | Aveo Pharmaceuticals, Inc. | Anti-notch3 antibody |
US11453718B2 (en) | 2017-03-27 | 2022-09-27 | The Schepens Eye Research Institute, Inc. | NOTCH3 agonist compositions and methods for treating small vessel diseases |
CN108753833B (zh) * | 2018-05-28 | 2021-12-03 | 上海海洋大学 | 斑马鱼notch3基因突变体的制备方法 |
US11969475B2 (en) | 2021-07-09 | 2024-04-30 | Dyne Therapeutics, Inc. | Muscle targeting complexes and uses thereof for treating facioscapulohumeral muscular dystrophy |
US11638761B2 (en) | 2021-07-09 | 2023-05-02 | Dyne Therapeutics, Inc. | Muscle targeting complexes and uses thereof for treating Facioscapulohumeral muscular dystrophy |
WO2023283629A1 (en) * | 2021-07-09 | 2023-01-12 | Dyne Therapeutics, Inc. | Muscle targeting complexes and formulations thereof for treating facioscapulohumeral muscular dystrophy |
US11931421B2 (en) | 2022-04-15 | 2024-03-19 | Dyne Therapeutics, Inc. | Muscle targeting complexes and formulations for treating myotonic dystrophy |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010506596A (ja) * | 2006-10-19 | 2010-03-04 | ジェネンテック インコーポレイテッド | 抗ノッチ3アゴニスト抗体とノッチ3関連疾患の治療におけるその使用 |
JP2010512796A (ja) * | 2006-12-18 | 2010-04-30 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | 抗Notch3アンタゴニスト抗体とNotch3関連疾患の予防及び治療におけるその使用 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2010207073B8 (en) * | 2009-01-26 | 2017-05-18 | Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc | Means and methods for modulating NOTCH3 protein expression and/or the coding region of NOTCH3; compositions and use thereof in the treatment of CADASIL |
ES2737649T3 (es) * | 2012-12-19 | 2020-01-15 | Aveo Pharmaceuticals Inc | Anticuerpos anti-Notch3 |
-
2015
- 2015-09-18 WO PCT/EP2015/071311 patent/WO2016046053A1/en active Application Filing
- 2015-09-18 JP JP2017515698A patent/JP6912375B2/ja active Active
- 2015-09-18 EP EP15780771.0A patent/EP3197494A1/en not_active Withdrawn
- 2015-09-18 US US15/514,173 patent/US10407500B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2019
- 2019-07-23 US US16/519,683 patent/US20200048342A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010506596A (ja) * | 2006-10-19 | 2010-03-04 | ジェネンテック インコーポレイテッド | 抗ノッチ3アゴニスト抗体とノッチ3関連疾患の治療におけるその使用 |
JP2010512796A (ja) * | 2006-12-18 | 2010-04-30 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | 抗Notch3アンタゴニスト抗体とNotch3関連疾患の予防及び治療におけるその使用 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
J. BIOL. CHEM., vol. 283巻12号, JPN6019028270, 2008, pages 8046 - 8054, ISSN: 0004282684 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US10407500B2 (en) | 2019-09-10 |
US20200048342A1 (en) | 2020-02-13 |
JP6912375B2 (ja) | 2021-08-04 |
WO2016046053A1 (en) | 2016-03-31 |
US20170247450A1 (en) | 2017-08-31 |
EP3197494A1 (en) | 2017-08-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6912375B2 (ja) | 皮質下梗塞及び白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症の免疫学的処置 | |
US10301380B2 (en) | Anti-jagged 1/jagged 2 cross-reactive antibodies, activatable anti-jagged antibodies and methods of use thereof | |
JP6878395B2 (ja) | 過リン酸化タウに特異的な抗体およびその使用方法 | |
TWI557136B (zh) | 特異性結合β-類澱粉蛋白之抗體及相關核酸分子、表現載體、細胞、組合物、套組、方法及用途 | |
JP4695133B2 (ja) | 抗ミオスタチン抗体 | |
TWI688403B (zh) | 人類cgrp受體結合蛋白 | |
RU2571859C2 (ru) | Применение антитела против амилоида-бета при глазных заболеваниях | |
CN103380145B (zh) | 人类抗-sod1抗体 | |
CN108350067A (zh) | 抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体及其用途 | |
CN110267985B (zh) | 用于治疗眼科疾病的特异性针对过度磷酸化τ蛋白的抗体 | |
JP7246320B2 (ja) | ヒト抗セマフォリン4d抗体 | |
KR20160065981A (ko) | 신경퇴행성 장애의 치료를 위한 세마포린-4d 결합 분자의 용도 | |
TW200533680A (en) | Immunoglobulins | |
WO2009074583A1 (en) | Antigen binding proteins | |
CN109476729A (zh) | 淀粉样蛋白β的抗体 | |
CN110494445A (zh) | 抗α-SYN抗体及其用途 | |
JP2008520204A (ja) | 非アシル化グレリン抗体及びその治療への使用 | |
KR20220054600A (ko) | Il-38-특이적 항체 | |
US20110064743A1 (en) | Human anti-cancer antibodies | |
KR20210025063A (ko) | 항-마리노부파게닌 항체 및 이의 용도 | |
KR20240004375A (ko) | Il-38-특이적 항체 | |
CN118355027A (zh) | 抗淀粉样蛋白β抗体及其使用方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20180911 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20190712 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190730 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20190924 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20191225 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200109 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200616 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20200902 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20201110 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20201215 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210608 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210708 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6912375 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313115 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
S633 | Written request for registration of reclamation of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313633 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |