JP2010500355A - Dll4アンタゴニストによる血管性眼障害を治療するための治療法 - Google Patents
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Abstract
Description
「Dll4アンタゴニスト」なる語句により、Dll4とその受容体との相互作用をブロックすることによって、Dll4の生物活性を阻害することができる薬剤を意味する。Dll4活性の阻害は、Dll4に対する抗体によるか又は受容体に結合するが活性化しない(非生産的な結合)Dll4アナログ若しくはフラグメントによるかのいずれかによる、受容体活性化の阻害を介すると考えられる。一般的な阻害剤としては、抗体、可溶性受容体、オリゴヌクレオチドアプタマー、ペプチド若しくは他の小分子アンタゴニスト及びそれらの誘導体、及びそれらのノッチ受容体を結び付けるが該結合を介してシグナル伝達を活性化できない、修飾Dll4リガンドが含まれるが、これらに限定されない。他の方法としては、Dll4をコードする遺伝子の発現を妨害すること、又はノッチ受容体活性をブロックすること、例えば、siRNA又はガンマセクレターゼ阻害剤が挙げられる。
ノッチシグナル伝達経路は進化的に保存され、そして胚及び生後発生時に多くの組織の細胞運命決定及び分化において重要な役割を担う。ノッチ経路の主要成分は血管系に発現し、そしてノッチ1、ノッチ1/ノッチ4、Jagged1、Dll1、Dll4、Hey1/Hey2又はプレセニリン類を含む、特定のノッチ経路成分の遺伝子欠失は、血管のリモデリング欠陥に関与する胚致死をもたらす。これらの遺伝子の大部分は複数の組織及び細胞型に発現するが、Dll4は大部分が血管内皮に限定されることから、血管系ではDll4がノッチ受容体の主要リガンドであることが示唆される。
Dll4アンタゴニストとしては、Dll4に対する抗体及びノッチ受容体へのDll4の結合をブロックすることができるそれらのフラグメント、例えば、ノッチ1;及び多量体化成分に融合してもよいDll4の細胞外ドメインを含むタンパク質又はタンパク質フラグメント;ペプチド及びペプチド抗体(例えば、特許文献1を参照)が含まれる。
本明細書で使用される「免疫グロブリン又は抗体」なる語句は、ヒトを含む哺乳動物の、抗原を特異的に結合して認識する免疫グロブリン遺伝子又はそのフラグメントの骨格領域を含むポリペプチド及びタンパク質を示しており、本発明の場合には、Dll4タンパク質又はその一部分である。所望の抗体又は抗体様タンパク質が哺乳類の治療法として使用される場合、免疫グロブリン結合領域は、対応する哺乳類の免疫グロブリンに由来するものであってよい。分子が診断薬及びELISA用などの非治療的使用を目的とする場合、免疫グロブリン結合領域はヒトか又はマウスなどの非ヒト哺乳類に由来するものであってよい。ヒト免疫グロブリン遺伝子又は遺伝子フラグメントとしては、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、及びミュー定常領域、並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、カッパか又はラムダに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、又はイプシロンに分類され、これらは順次免疫グロブリンクラスの、それぞれIgG、IgM、IgA、IgD、及びIgEを特徴付ける。各IgGクラス内には、異なるイソタイプ(例えば、IgG1、IgG2など)及びそのアロタイプがある。
Dll4アンタゴニストは、場合により多量体化成分に結合したDll4フラグメントであってもよい。特定の実施態様では、Dll4フラグメントは、免疫グロブリンドメイン、切断免疫グロブリンドメイン、又は場合により少なくとも1つのシステイン残基を含む、1から約500のアミノ酸長間のアミノ酸配列などの多量体化成分に融合されてもよい。好ましい実施態様では、多量体化成分は免疫グロブリンドメイン、好ましくはFcドメイン、例えば、ヒトFc(配列番号5)である。タンパク質又はタンパク質フラグメントは、場合により、天然又は合成配列を含む細胞由来のポリペプチド又はタンパク質の分泌を命令する当業者に公知のいずれの配列をも含むことができる、単一シグナル配列を含んでもよい。一般的に、シグナル配列は、本発明の融合タンパク質の開始点又はアミノ末端に配置されている。このようなシグナル配列は、細胞に固有のもの、組換え体、又は合成体であってよい。
本発明は、本発明の薬剤の有効量を被験者に投与することを含む治療法を提供する。好ましい態様では、薬剤は実質的に精製される(例えば、その効果を抑え又は好ましくない副作用をもたらす物質を実質的に含まない)。被験者は、好ましくは、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物であり、また好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトである。特定の実施態様では、本発明の医薬組成物を、治療を必要とする部位に局所的に投与することが望ましい;これは、手術時の局所注入、局所適用、例えば、注射により、カテーテルにより、又は埋込物により達成することができるが、これらに限定されない。
種々の実施態様では、本発明の方法は、Dll4抗体などのDll4アンタゴニストを、1つ又はそれ以上の追加の化合物又は療法若しくは医学的処置との併用によって達成することができる。例えば、交互か又は同時に併用して使用される好適な治療薬としては、血管内皮成長因子(VEGF)に結合し活性を阻害することができる融合タンパク質(特許文献2、3)、コルチコステロイド、デキサメタゾン、シクロスポリンA、FK506などの免疫抑制薬、又は代謝拮抗薬(非特許文献12を参照)を含む。本発明のDll4アンタゴニストと交互か又は同時に併用して使用されるその他の好適な治療薬としては、VEGF−C及びVEGF−Dなどの他のVEGFファミリーメンバーの生物活性をブロックし得る薬剤を含むことができる。
発生中の網膜血管系の血管出芽に対する、単一Dll4対立遺伝子の遺伝子欠失の影響
正常発生網膜血管新生時の血管出芽に対する、Dll4の部分的遺伝子欠失の影響を明らかにするための検討を行なった。
動物
Velocigene(登録商標)技術 (非特許文献13、特許文献4)を用いて、C57BL/6:129ハイブリッドマウス胚性幹細胞において、全Dll4コード領域をβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子で置換した。キメラ雄性をICR雌性と交配させた。3世代にわたってICR(87.5%ICR)に戻し交配したDll4+/lacZマウスを本研究に使用した。
組織化学及び免疫染色
マウスの子をP7に人道的に安楽死させた。目を摘出し、網膜を解剖して、1夜4%パラホルムアルデヒドで固定し、更にFITC標識Griffonia simplicifolia(GS)レクチンI(Vector Laboratories, Burlingame, CA)で染色して伸展標本にした。画像はNikon(Melville, NY)顕微鏡を用い手撮影した。
定量
Scion Imageソフトウェアを用いて測定を行った。各実験条件は少なくとも3重複でアッセイした。Studentのt検定及び2方向分散分析を用いて統計的有意差を評価した。
結果
末梢神経叢は、Dll4+/lacZマウスでは野生型同腹子よりもかなり高密度であった。高倍率視野では、Dll4+/lacZマウスの網膜の高密度末梢神経叢は、より大きい径で、高度相互接続しそして高度融合した毛細血管から構成されており、そのためにある領域では血管が癒着して合胞体を形成することと、それに加えて、成長最前部で更に多くの萌芽の存在が明らかになった(図1);糸状仮足も叢のより内部に正常より高い頻度で観察された。定量分析の結果は、野生型対照に比べて、Dll4+/lacZマウスの網膜は、表在性網膜血管系の成長最前部で68%の萌芽数の増加(図1)、並びに単位面積当り毛細血管相互接続数の2倍以上の増加を示し、その結果血管被覆の著しい増加をもたらすことを示した。顕著な形態変化にもかかわらず、蛍光レクチンの血管内注射は、野生型マウスのようにDll4+/lacZマウスにおいて発生する表在性血管叢を、端細胞から伸長する糸状仮足を除いて、完全に満たしたことから、発生中の血管の全成分は管腔を有し機能性であることを示した。
発生中の網膜血管系に対する、Dll4−Fc又は抗Dll4抗体を用いたDll4/ノッチ阻害の効果
正常発生網膜血管新生時の内皮細胞増殖及び血管出芽に対し、Dll4/ノッチシグナル伝達の薬理学的阻害の効果を明らかにするための検討を行なった。
抗体及び試薬
Dll4−Fcは、マウス又はヒトDll4の細胞外ドメイン及びヒトIgGのFc部分を含む。Dll4−FcはCHO細胞に発現し、親和性はプロテインAクロマトグラフィーで精製した。抗Dll4抗体を、組換えmDll4−hFcによるウサギの免疫感作により作製した。抗血清は、使用前にプロテインAクロマトグラフィーにより部分的に精製した。
動物
C57/B16マウス(Taconic)を使用して、発生中の網膜血管系に対するDll4−Fc又はDll4中和抗体の効果を検討した。
硝子体内微量注入
研究用化合物の硝子体内微量注入(30〜100nl)を、ガラス針を備えたDrummond Scientific(BroPA)ナノインジェクタを用いることにより、眼球赤道と角膜縁間に行なった。
BrdUの標識
増殖中の細胞を、hFc又はDll4−Fcの硝子体内注射の20時間後にBrdU(1mg/kg、腹腔内)の投与により標識した。網膜を4時間後に回収して、抗BrdU(Dako North America, Inc., Carpinteria, CA)及びVE−カドヘリン(BD PharMingen, San Diego, CA)抗体で染色した。
結果
Dll4/ノッチシグナル伝達における、そして未検出全身異常に続発しない局所網膜内欠損の影響を研究するために、それらを活性化することなくノッチ受容体に結合し、それにより内因性Dll4、又はDll4の細胞外ドメインに特異的なポリクローナル中和抗体の作用をブロックする、可溶型のDll4(Dll4−Fcと称する)を野生型マウスの硝子体内に注射した。いずれかのDll4遮断薬の眼内投与の3日後に、網膜血管は、血管密度と血管径の劇的増加を含み、Dll4+/lacZマウスに見られた血管異常に非常に類似した形態変化を示した。更に、これらの特徴的な形態変化は急激に現われ、24時間以内にはっきりそれと分かった。
BrdU標識でも、Dll4遮断の24時間以内に内皮細胞増殖の増加を示した(図2)。観察された増殖率の〜17%の増加は、3から4の倍加時間内に50%を越える細胞数増加をもたらし得た。
OIRによるマウスの網膜血管新生、潅流及び血管異常に対する、Dll4−Fc及び抗Dll4抗体の効果
酸素誘発静脈欝血性網膜症(OIR)における網膜血管の増殖、血管異常の形成及び網膜潅流に対する、Dll4−Fc及び抗Dll4抗体の効果を明らかにするための検討を行った。
Dll4/ノッチシグナル伝達が病的血管新生並びに正常な発生時に役割を果たすかどうかを明らかにするために、OIRモデルを活用した。OIRモデルにおいて、P7に酸素過剰へのマウスの曝露は中心網膜での毛細血管の急激閉塞をもたらす。P12に室内空気に戻した後、無血管帯は重度の低酸素になり、順に広範囲の異常血管新生を誘発することが、硝子体への血管の異所性増殖(網膜上血管「タフト」)及び異常動静脈シャントの形成によって特徴付けられ;網膜の中心部は長期間にわたって大部分無血管となる。
動物及びOIRモデル
C57/Bl6マウス(Taconic)を用いて、OIRの網膜血管新生に対するDll4−Fc又はDll4中和抗体の効果を検討した。OIRは、Smith et al.(非特許文献14)によって開発された方法に従って誘導された。簡潔にいえば、マウスの子及びその母を生後(P)7日からP12まで75%の酸素環境に置き、次いで室内空気に戻した。酸素過剰への曝露は中心網膜に急激な血管閉塞を誘導する。マウスを室内空気に戻した場合(P12)、中心網膜からの血管の損傷は重篤な低酸素/虚血を引き起こし、順次上述の病的血管変化を促進する。
開存血管を標識するために、50mlのテキサスレッド標識トマト(Lycopersicon esculentum)(LE)レクチン(1mg/ml;Vector Laboratories, CA)を左心室に注射して、5分間循環させた。
結果
Dll4−Fcか又は抗Dll4抗体によるDll4/ノッチの阻害は、病的血管新生を改善し(図3A−B)、新しい血管の増殖を促進させ(図4A−B)、更に網膜再潅流を改善した(図5)。
Dll4−Fc若しくは抗Dll4抗体又は対照タンパク質(hFc)を、動物が室内空気に戻った1日後、十分に血管閉塞が完了した後に、P13に硝子体内注射した。網膜をP17に評価した場合、Dll4−Fc又は抗Dll4抗体の投与は、硝子体中の病的新血管タフトの異所性増殖を劇的に抑制し(図1)、また異常な動静脈シャントの形成を防止した。新血管タフトが占める面積は、hFc処置対照網膜に比べて、Dll4−Fcで処置した網膜では43%減少し、そして抗Dll4抗体で処置した網膜では85%減少した。
更に、Dll4−Fc及び抗Dll4抗体は、無血管帯に隣接する毛細血管及び静脈からの新しい血管のより広範な出芽を促進させ、血管系が激減し、次いで無血管網膜野を縮小させる中心網膜への血管のより迅速な再生をもたらすことが示された(図4A−B)。無血管野は、Dll4−Fcで処置した網膜では43%減少し、そして抗Dll4抗体で処置した網膜では63%減少した。特に注目すべき点は、Dll4−Fc処置網膜の無血管帯の静脈から生じる広範な毛細血管の再生であった。このように、Dll4/ノッチシグナル伝達の減弱は、網膜表面沿いの新しい血管の出芽の伸展に有利に働き、また網膜上血管新生の形成を鈍化させたことから、表面血管叢のより急速な改善をもたらした。新生血管は機能性であり、Dll4−Fcで処置した網膜における非潅流面積の45%低下から明らかなように、網膜再潅流の改善を示した(図5)。
OIRモデルでの網膜低酸素/虚血に対する、Dll4−Fc及び抗Dll4抗体の効果
病的血管新生のOIRモデルにおける網膜低酸素/虚血に対する、Dll4−Fc及び抗Dll4抗体の効果を明らかにするための検討を行なった。
特定の環境下での過剰血管増殖は、正常な血液循環を妨害し、組織酸素化を低下させる可能性がある。Dll4/ノッチ阻害が組織酸素化を改善できるかどうかを試験するために、HYPOXYPROBE(登録商標)-1(Chemicon)を非侵襲アッセイに用いて、組織低酸素を検出し、そして網膜低酸素/虚血に対するDll4−Fc処置の効果を調べた。100mg/kgのHYPOXYPROBE(登録商標)-1を、評価のために網膜を採取する1時間前に腹腔内注入した。
結果
Dll4/ノッチ阻害剤の硝子体内投与後の機能的新血管増殖は、Dll4−Fc又は抗Dll4抗体処置網膜において、それぞれHYPOXYPROBE 陽性面積の69%及び30%減少から明らかなように、組織低酸素/虚血を有効に低減した(図6A−B)。
単一Dll4対立遺伝子の遺伝子欠失は酸素過剰誘発血管閉塞を低減する
酸素過剰誘導血管退行に対する、Dll4の部分的遺伝子欠失の影響を明らかにするための検討を実施した。
動物
3世代にわたってICR(87.5%ICR)に戻し交配したDll4+/lacZマウスを上記のように作製した。劣性(rd/rd)突然変異に因り、網膜光受容体細胞層は、ICRマウスのP12に変性を開始する。そこで、網膜血管系に対する光受容体欠損の二次的影響の可能性を未然に防ぐために、網膜発生の後期を評価し、また全てのOIR実験で、光受容体変性を示さないRd/rdマウスを作製するために、Dll4+/lacZ(87.5%ICR)マウスをC57BL/6に戻し交配した。
マウスの子を生後(P)7日から12日まで75%の酸素環境に置いた。網膜を回収して、網膜血管系を伸展標本で解析した。
結果
Dll4+/lacZマウスの網膜血管系におけるDll4の発現低下は、酸素過剰誘導網膜血管損傷を部分的に防止する(図7)。OIRモデルでは、P7での酸素過剰へのマウスの子の曝露は、中心網膜において毛細血管の急速閉塞及び閉鎖をもたらす。Dll4/ノッチ阻害が血管への保護作用を有する可能性を明らかにするために、酸素過剰誘導血管閉塞に対するDll4+/lacZマウスのDll4部分的遺伝子欠失の影響を解析した。P12に動物を評価すること(酸素過剰誘導血管閉塞の程度を評価するために)により、野生型同腹子対照動物に比べて血管閉塞はDll4+/lacZマウスで40%低減することが見出されたことから、Dll4阻害剤が残存血管を退行から保護する可能性を示唆する。
酸素過剰誘導血管閉塞に対する、Dll4−Fc及び抗Dll4抗体の効果
酸素過剰誘導血管退行に対する、Dll4‐Fc及び抗Dll4抗体によるDll4/ノッチ阻害の効果を明らかにするための検討を行なった。
動物
C57/Bl6マウス(Taconic)を用いて、酸素誘導網膜血管閉塞に対するDll4−Fc又はDll4中和抗体の効果を検討した。研究用化合物の硝子体内微量注入を、生後8日に実施した。生後9日にマウスの子を75%の酸素環境に置いた。網膜を24時間後に回収して、網膜血管系を伸展標本で解析した。
結果
Dll4−Fc又はDll4中和抗体の硝子体内注射は、閉塞血管系の面積をそれぞれ97%及び41%劇的に減少させた(図8A−B)。
酸素過剰誘導血管閉塞に対する、Dll4−Fc又は抗Dll4抗体の効果
酸素過剰誘導血管閉塞に対する、Dll4−Fc及び抗Dll4抗体によるDll4/ノッチ阻害の効果を明らかにするための検討を行なった。手順は全て上述のように実施した。
Dll4−Fc及び抗Dll4抗体処置は、非潅流網膜面積をそれぞれ40%及び29%低減した(図9A−B)。
酸素過剰誘導血管退行に対する、Dll4−Fcの全身投与の効果
酸素過剰誘導血管退行に対する、Dll4−Fcによる全身療法の効果を明らかにするための検討を行なった。
P7に4.1mcgのhDll4−hFc又は5mcgのヒトhFc対照タンパク質を硝子体内注射(ITV)するか、又はhDll4−hFcを体重kg当り25mgの用量で腹腔内注射した。マウスの子をP8に75%酸素環境に置き、網膜血管系をP9に解析した。他の手順は全て上述のように実施した。
結果
Dll4−Fcの局所(硝子体内)及び全身(腹腔内)投与は、いずれも閉塞血管系の面積をそれぞれ86%及び56%減少させたことから、Dll4阻害剤は、投与経路に無関係に血管を退行から保護するために効果的に使用できることを示す(図10)。
Claims (7)
- 虚血性の又は血管の障害を治療し、抑制し又は改善する医薬品の製造におけるDll4活性を阻害することができる薬剤の使用であって、Dll4アンタゴニストがノッチ受容体へのDll4の結合をブロックすることができる抗体若しくは抗体フラグメントを含む、又は場合により多量体化成分に結合されたDll4のフラグメントを含む使用。
- Dll4抗体又は抗体フラグメントがポリクローナル又はモノクローナルである、請求項1に記載の使用。
- 抗体若しくは抗体フラグメントが、ヒト化された、キメラ的な、又は完全にヒトの抗体若しくは抗体フラグメントである、請求項2に記載の使用。
- 虚血性の又は血管の障害が、異常血管の存在及び/又は正常血管若しくは血管機能の損傷を特徴とする眼の疾患又は状態である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の使用。
- 眼の疾患が、未熟児網膜症、静脈欝血性網膜症、網膜静脈若しくは動脈閉塞、糖尿病性網膜症、脈絡膜血管新生、加齢黄斑変性症、角膜血管新生、血管新生緑内障又は角膜移植である、請求項4に記載の使用。
- 治療される被験者がヒトである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の使用。
- 虚血性の又は血管の障害が、虚血性傷害、脳虚血、心虚血、肢及び他の器官又は組織を冒す虚血状態、動静脈奇形、創傷治癒、器官又は組織移植、胎盤機能不全、動脈狭窄及び閉塞、アテローム性動脈硬化症、並びに全身性又は肺高血圧症である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の使用。
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