JP2010500355A - Ｄｌｌ４アンタゴニストによる血管性眼障害を治療するための治療法 - Google Patents
Ｄｌｌ４アンタゴニストによる血管性眼障害を治療するための治療法 Download PDFInfo
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Abstract
虚血性の又は血管の障害を治療することを必要とする被験者に対して、ヒトデルタ様リガンド４（Ｄｌｌ４）活性を阻害することができる薬剤を投与することによる、その治療法。好ましくは、薬剤は、ノッチ受容体へのＤｌｌ４の結合を阻害することができる抗Ｄｌｌ４抗体又は抗体フラグメントである。１つの実施態様では、虚血性の又は血管の障害は、虚血性傷害、脳虚血、心虚血、肢及び他の器官又は組織を冒す虚血状態、動静脈奇形、創傷治癒、器官又は組織移植、胎盤機能不全、動脈狭窄及び閉塞、アテローム性動脈硬化症、並びに全身性又は肺高血圧症である。別の実施態様では、治療される疾患は、未熟児網膜症、静脈欝血性網膜症、網膜静脈若しくは動脈閉塞、糖尿病性網膜症、脈絡膜血管新生、加齢黄斑変性症、角膜血管新生、血管新生緑内障又は角膜移植などの、眼の疾患又は状態である。
Description
本発明は、一般的に、ノッチ受容体及び／又はノッチ受容体の活性化によりＤｌｌ４相互作用を阻害する組成物を投与することによる、血管及び虚血性障害を治療する方法に関する。更に詳細には、本発明は、ノッチ受容体によりＤｌｌ４相互作用を阻害する組成物を投与することによる、眼血管及び／又は虚血性障害を治療する方法に関する。
血管新生は、組織及び器官の正常な発達及び成長に必須の基本的過程であり、そして既存血管からの新しい血管の形成を包含する。血管新生及び血管のホメオスタシスは、血管新生モジュレータの高度調節系を介して厳密に制御されている。このような厳密な制御からの逸脱は、しばしば疾患を引き起こすか又はそれに関与する。
無秩序な「過剰な」又は異常な血管新生は、多くの病状に特徴的である一方で、不十分な血管新生、血管損傷又は機能的若しくは構造的血管閉塞も、また重大な医学上の問題になり得る。血管新生を促進すること及び／又は既存血管の退行を防止することは、組織が、例えば、網膜、脳、心血管及び肢虚血において虚血性になる状況においては、そして血管供給が、例えば、創傷治癒時及び組織若しくは器官移植後におけるように、成立し、再建され、強化され又は拡大されるべき状態においては、又は側副血管の成立を促進し、あるいはそれとは逆に循環不全の組織若しくは器官の潅流を増加させる場合には望ましい。
ノッチ−シグナル伝達経路は、分化、増殖、及びホメオスタシスなどの多くの生物過程に対して、広範囲な真核細胞によって使用されている細胞間コミュニケーションのためのシステムである(非特許文献１)。ノッチシグナル伝達も、血管発生の調節に関わっている(非特許文献２)。
デルタ様４（Ｄｌ４）又はデルタ様リガンド４（Ｄｌｌ４）（以下「Ｄｌｌ４」）は、血管内皮による高選択性発現を示すノッチリガンドのデルタファミリーの一員である(非特許文献３)。Ｄｌｌ４は、ノッチ１及びノッチ４を含むノッチ受容体のリガンドである。ヒト及びマウスＤｌｌ４の核酸及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１〜２及び配列番号３〜４に示される。遺伝子で標識されたＤｌｌ４マウスは作製されている(例えば、非特許文献４、５、６を参照)。これらの研究の結果、Ｄｌｌ４がマウス胚において血管の発生時に高発現すること、及びたとえ単一Ｄｌｌ４対立遺伝子でも、遺伝子欠失は顕著な血管異常を伴って胚致死につながることを示した。
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Valenzuela et al., (2003), Nat. Biotechnol. 21: 652-9;
Smith et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1994, 35: 101-111
本発明は、Ｄｌｌ４とその受容体（「Ｄｌｌ４アンタゴニスト」）との相互作用をブロックすることができる薬剤による、心血管系を冒す疾患を治療する方法に関する。実験結果は、血管不全が不十分な組織潅流をもたらす血管損傷又は機能的血管変化に因る、病的血管新生及び血管不全によって特徴付けられる疾患の治療に対するＤｌｌ４アンタゴニストの使用を、この点で支持するものであった。Ｄｌｌ４アンタゴニストは、目の血管障害、例えば、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症並びに病的血管新生及び／又は網膜静脈若しくは網膜動脈閉鎖などの網膜虚血によって特徴付けられる、他の眼の疾患の治療に特に有用である。
Ｄｌｌ４の薬理学的阻害は、血管損傷に至る傷害の時点に適用される場合の血管損傷の低減、及び虚血の成立後に適用される場合のより正常で機能的血管の再生を増強する間の脈管の病的変化の進展の抑制を含む、静脈欝血性網膜症のモデルにおいて、いくつかの有益な効果を発揮することが示されている。
Ｄｌｌ４のシグナル伝達を阻害する薬物は、脳虚血、心虚血、並びに肢及び他の生体器官又は組織を冒す虚血状態を含む、他の形態の虚血性傷害の治療に同様に有益なことが期待される。Ｄｌｌ４阻害剤は、また、血管供給の成立又は再建を必要とする、又はさもなければ組織潅流の強化により便益を受けるであろう他の状態において臨床的に有益なことが期待される。当該状態の例としては、動静脈奇形、創傷治癒、器官又は組織移植、及び胎盤機能不全がある。以下に報告される実験研究に示されるように、Ｄｌｌ４阻害は動脈狭窄及び閉塞を防止することから、Ｄｌｌ４阻害剤は、全身性又は肺高血圧症及び関連疾患の治療にも有効なことが示唆される。
Ｄｌｌ４アンタゴニストは、現在、正常又は病的状態の両方において、生産的血管形成を促進するのに有効なことが示されている。特に、Ｄｌｌ４ノッチシグナル伝達の遮断は、発生中の網膜血管系における血管新生出芽及び血管内皮細胞増殖を強化すること、並びに虚血網膜での適切な血管形成に有利なように病的な異所性血管新生の形成及び動静脈シャントの発生を抑制することが示されている。更に、血管傷害時点でのＤｌｌ４遮断薬の適用は、その後の血管損傷を顕著に低減させることが示されている。これらの結果は、特に虚血及び正常血管の損傷を伴う場合に、血管異常によって特徴付けられる眼の疾患の治療におけるＤｌｌ４アンタゴニストの使用を支持する。当該眼の疾患の例としては、加齢黄斑変性症、網膜中心静脈閉塞症又は網膜静脈分枝閉塞症、糖尿病性網膜症、及び未熟児網膜症などの虚血性網膜症が含まれる。
第１の態様では、本発明は、それを必要としている被験者にＤｌｌ４アンタゴニストを投与することを含む、眼障害又は血管異常によって特徴付けられる疾患を治療する方法を特徴とする。本発明の方法は、機能的正常血管の増殖を促進し、異常な又は障害を有する血管の増殖を阻害し、更に血管の病的退行を防止する。
１つの実施態様では、Ｄｌｌ４アンタゴニストは、特異的にＤｌｌ４に結合しまたノッチ受容体（例えば、ノッチ１及びノッチ４受容体）に結合する、Ｄｌｌ４をブロックする抗体又は抗体フラグメントである。別の実施態様では、本発明のＤｌｌ４アンタゴニストは、Ｄｌｌ４の細胞外ドメイン又はそのフラグメントを含むタンパク質又はタンパク質フラグメントであり、具体的な実施態様においては、それらは多量体化成分に融合してもよく、そしてそれらはノッチ受容体に結合してそれを活性化せず、それにより内因性Ｄｌｌ４の作用をブロックする。
本発明の方法によって治療される眼の障害又は疾患は、異常血管及び／又は正常血管若しくは正常血管機能の損傷の存在によって特徴付けられる眼血管系の障害である。特定の実施態様では、治療される状態又は疾患としては、未熟児網膜症、静脈欝血性網膜症、網膜静脈若しくは動脈閉塞、糖尿病性網膜症、脈絡膜血管新生、加齢黄斑変性症、角膜血管新生、血管新生緑内障又は角膜移植が含まれる。
本発明の方法で使用される抗体又は抗体フラグメントはポリクローナル又はモノクローナルであってもよく、またヒト化された、キメラ的な、又は完全にヒトのそれらであってよい。好ましくは、抗体は完全にヒトのモノクローナル抗体又はモノクローナル抗体フラグメントである。抗体フラグメントは、一本鎖抗体、ＳｃＦｖ、Ｆａｂ、又はＦ（ａｂ′）2であってよい。
Ｄｌｌ４アンタゴニストがタンパク質又はタンパク質フラグメントの場合、フラグメントは、好ましくはＤｌｌ４の細胞外ドメイン又はそのフラグメント若しくは修飾フラグメントであり、そして多量体化成分に融合してもよい。多量体化成分は、好ましくは、例えば、ヒトＦｃ（配列番号５）などのＦｃドメイン等の免疫グロブリンドメインである。タンパク質は、場合により、細胞に固有の、組換え体の、又は合成されたものであってよいシグナル配列を含んでもよい。
１つの広義の態様では、本発明の方法は、血管損傷及び／又は潅流不良に因る血管供給不足によって引き起こされるあらゆる虚血性疾患又は状態、例えば、虚血性傷害、脳虚血、心虚血、肢及び他の器官又は組織を冒す虚血状態、動静脈奇形、創傷治癒、器官又は組織移植、胎盤機能不全、動脈狭窄及び閉塞、アテローム性動脈硬化症、並びに全身性又は肺高血圧症の治療に有用である。
第２の態様では、本発明は、虚血性の又は血管の障害を治療し、抑制し又は改善する医薬品の製造において、Ｄｌｌ４活性を阻害することができる薬剤の使用であって、Ｄｌｌ４アンタゴニストが、ノッチ受容体のＤｌｌ４への結合をブロックすることができる抗体又は抗体フラグメントである、又は場合により多量体化成分（Ｆｃドメインなど）に結合するＤｌｌ４フラグメントである使用を提供する。１つの実施態様では、虚血性の又は血管の障害は、異常血管及び／又は正常血管若しくは血管機能の喪失の存在によって特徴付けられる、眼の疾患又は状態である。眼の疾患は、未熟児網膜症、静脈欝血性網膜症、網膜静脈若しくは動脈閉塞、糖尿病性網膜症、脈絡膜血管新生、加齢黄斑変性症、角膜血管新生、血管新生緑内障又は角膜移植である。
別の実施態様では、虚血性の又は血管の障害は、虚血性傷害、脳虚血、心虚血、肢及び他の器官若しくは組織を冒す虚血状態、動静脈奇形、創傷治癒、器官又は組織移植、胎盤機能不全、動脈狭窄及び閉塞、アテローム性動脈硬化症、又は全身性若しくは肺高血圧症である。
他の目的及び利点は、詳細な説明を確実にするレビューから明らかになるであろう。
図１は、単一Ｄｌｌ４対立遺伝子の遺伝子欠失は、網膜血管系の発生における血管新生出芽数を増加させた。出芽数は１００倍の顕微鏡視野で定量した。結果は、ｐ＜０.００００１レベルで有意差があった。
図２は、Ｄｌｌ４−Ｆｃの眼内送達は、網膜血管系の発生における増殖ＢｒｄＵ陽性細胞の数を増加させた。４．１５ｍｃｇのｍＤｌｌ４−ｈＦｃ又は５ｍｃｇのヒトｈＦｃ制御タンパク質を、７日齢のマウスの子に硝子体内注射した。網膜血管系を２４時間後に解析した。ＢｒｄＵ陽性細胞数を２００倍の顕微鏡視野で定量した。結果は、ｐ＜０.０５レベルで有意差があった。
図３Ａ、Ｂは、Ｄｌｌ４−Ｆｃ又は抗Ｄｌｌ４抗体の眼内送達は、酸素誘発静脈欝血性網膜症（ＯＩＲ）マウスの網膜血管の再生を促進する。（Ａ）０．４８ｍｃｇのｍＤｌｌ４−ｈＦｃ又は０.５ｍｃｇのヒトｈＦｃ制御タンパク質を、１３日齢（生後１３日、すなわちＰ１３）のＯＩＲのマウスの子に硝子体内注射した。網膜血管系をＰ１７に解析した。（Ｂ）２．５５ｍｃｇのウサギポリクローナル抗ｍＤｌｌ４抗体又は５ｍｃｇのヒトｈＦｃ制御タンパク質を、Ｐ１３に硝子体内注射した。網膜血管系をＰ１７に解析した。無血管面積を網膜の伸展標本にて測定した。結果は、ｐ＜０.０００１（Ａ）及びｐ＜０.０５（Ｂ）レベルで有意差があった。
図４Ａ、Ｂは、Ｄｌｌ４−Ｆｃ又は抗Ｄｌｌ４抗体の眼内送達は、ＯＩＲの病的血管新生の形成を改善する。（Ａ）０．４８ｍｃｇのｍＤｌｌ４−ｈＦｃ又は０.５ｍｃｇのヒトｈＦｃ制御タンパク質を、Ｐ１３に硝子体内注射した。網膜血管系をＰ１７に解析した。（Ｂ）２．５５ｍｃｇのウサギポリクローナル抗ｍＤｌｌ４抗体又は５ｍｃｇのヒトｈＦｃ制御タンパク質を、Ｐ１３に硝子体内注射した。網膜血管系をＰ１７に解析した。異常血管面積（異所性血管「タフト」を含む面積）を網膜の伸展標本にて測定した。結果は、ｐ＜０.０００１（Ａ）及びｐ＜０.０５（Ｂ）レベルで有意差があった。
図５は、Ｄｌｌ４−Ｆｃの眼内送達は網膜潅流を改善する。０．４８ｍｃｇのｍＤｌｌ４−ｈＦｃ又は０.５ｍｃｇのヒトｈＦｃ制御タンパク質を、Ｐ１３に硝子体内注射した。Ｐ１７に動物をTexas Redで標識したトマトレクチンで潅流し、網膜血管系をＰ１７に解析した。非潅流血管面積を網膜の伸展標本にて測定した。結果は、ｐ＜０.０００５レベルで有意であった。
図６Ａ、Ｂは、Ｄｌｌ４−Ｆｃ又は抗Ｄｌｌ４抗体の眼内送達は、網膜低酸素／虚血を軽減する。（Ａ）４．１ｍｃｇのｈＤｌｌ４−ｈＦｃ又は５ｍｃｇのヒトｈＦｃ制御タンパク質を、Ｐ１２に硝子体内注射した。Hypoxyprobe-1（登録商標）を動物の屠殺の１時間前に腹腔内投与した。網膜血管系をＰ１７に解析した。Hypoxyprobe標識面積を網膜の伸展標本にて測定した。（Ｂ）２．５５ｍｃｇのウサギポリクローナル抗ｍＤｌｌ４抗体又は５ｍｃｇのヒトｈＦｃ制御タンパク質を、Ｐ１３に硝子体内注射した。Hypoxyprobe-1（登録商標）を動物の屠殺の１時間前に腹腔内投与した。網膜血管系をＰ１７に解析した。Hypoxyprobe標識面積を網膜の伸展標本にて測定した。結果は、ｐ＜０.００１（Ａ）及びｐ＜０.０５（Ｂ）レベルで有意差があった。
図７は、単一Ｄｌｌ４対立遺伝子の遺伝子欠失は、酸素過剰への曝露によって誘発された血管損傷を低減する。Ｄｌｌ４+/lacZ及び同腹子ＷＴ対照マウスをＰ７に７５％酸素チャンバーに入れた。網膜血管系を伸展標本にてＰ１２に解析した。結果は、ｐ＜０.０５レベルで有意差があった。
図８Ａ、Ｂは、Ｄｌｌ４又は抗Ｄｌｌ４抗体の眼内送達は、酸素過剰への曝露によって誘発された血管損傷を軽減又は防止する。（Ａ）４．１ｍｃｇのｈＤｌｌ４−ｈＦｃ又は５ｍｃｇのヒトｈＦｃ制御タンパク質を、Ｐ８に硝子体内注射した。マウスの子をＰ９に７５％酸素環境に入れた。網膜血管系をＰ１０に解析した。（Ｂ）２．５５ｍｃｇのウサギポリクローナル抗ｍＤｌｌ４抗体又は５ｍｃｇのヒトｈＦｃ制御タンパク質を、Ｐ８に硝子体内注射した。マウスの子をＰ９に７５％酸素環境に入れた。網膜血管系をＰ１０に解析した。結果は、ｐ＜０.００００１（Ａ）及びｐ＜０.０００１（Ｂ）レベルで有意差があった。
図９Ａ、Ｂは、Ｄｌｌ４又は抗Ｄｌｌ４抗体の眼内送達は、網膜血管閉塞を低減する。（Ａ）４．１ｍｃｇのｈＤｌｌ４−ｈＦｃ又は５ｍｃｇのヒトｈＦｃ制御タンパク質を、Ｐ８に硝子体内注射した。マウスの子をＰ９に７５％酸素環境に入れた。マウスの子を蛍光レクチンで潅流し、網膜血管系をＰ１０に解析した。（Ｂ）２．５５ｍｃｇのウサギポリクローナル抗ｍＤｌｌ４抗体又は５ｍｃｇのヒトｈＦｃ制御タンパク質を、Ｐ８に硝子体内注射した。マウスの子をＰ９に７５％酸素環境に入れた。マウスの子を蛍光レクチンで潅流し、網膜血管系をＰ１０に解析した。結果は、ｐ＜０.００００１（Ａ）及びｐ＜０.０００１（Ｂ）レベルで有意差があった。
図１０は、Ｄｌｌ４−Ｆｃの全身送達は、網膜血管損傷を低減又は防止する。４．１ｍｃｇのｈＤｌｌ４−ｈＦｃ又は５ｍｃｇのヒトｈＦｃ制御タンパク質を、Ｐ７に硝子体内注射（ＩＴＶ）し、又はｈＤｌｌ４−ｈＦｃを体重ｋｇ当り２５ｍｇの用量で腹腔内注射した。マウスの子をＰ８に７５％酸素環境に入れた。網膜血管系をＰ９に解析した。結果は、ｐ＜０.０００１レベルで有意差があった。
本方法について記載する前に、当然のことながら、本発明は特定の方法に限定されず、またある方法及び条件で記載された実験条件は変更し得るものである。また当然のことながら、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって限定されるものであるので、本明細書で使用される用語は特定の実施態様を記載することだけを目的とするものであり、限定することを意図するものではない。
特に明示されないかぎり、本明細書で使用される全ての専門及び科学用語は、本発明が帰属する当業者によって一般的に理解される用語と同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似又は同等のいずれの方法及び材料でも、本発明の実施又は試験に使用可能であるが、好ましい方法及び材料は以下に記載される。
定義
「Ｄｌｌ４アンタゴニスト」なる語句により、Ｄｌｌ４とその受容体との相互作用をブロックすることによって、Ｄｌｌ４の生物活性を阻害することができる薬剤を意味する。Ｄｌｌ４活性の阻害は、Ｄｌｌ４に対する抗体によるか又は受容体に結合するが活性化しない（非生産的な結合）Ｄｌｌ４アナログ若しくはフラグメントによるかのいずれかによる、受容体活性化の阻害を介すると考えられる。一般的な阻害剤としては、抗体、可溶性受容体、オリゴヌクレオチドアプタマー、ペプチド若しくは他の小分子アンタゴニスト及びそれらの誘導体、及びそれらのノッチ受容体を結び付けるが該結合を介してシグナル伝達を活性化できない、修飾Ｄｌｌ４リガンドが含まれるが、これらに限定されない。他の方法としては、Ｄｌｌ４をコードする遺伝子の発現を妨害すること、又はノッチ受容体活性をブロックすること、例えば、ｓｉＲＮＡ又はガンマセクレターゼ阻害剤が挙げられる。
「Ｄｌｌ４アンタゴニスト」なる語句により、Ｄｌｌ４とその受容体との相互作用をブロックすることによって、Ｄｌｌ４の生物活性を阻害することができる薬剤を意味する。Ｄｌｌ４活性の阻害は、Ｄｌｌ４に対する抗体によるか又は受容体に結合するが活性化しない（非生産的な結合）Ｄｌｌ４アナログ若しくはフラグメントによるかのいずれかによる、受容体活性化の阻害を介すると考えられる。一般的な阻害剤としては、抗体、可溶性受容体、オリゴヌクレオチドアプタマー、ペプチド若しくは他の小分子アンタゴニスト及びそれらの誘導体、及びそれらのノッチ受容体を結び付けるが該結合を介してシグナル伝達を活性化できない、修飾Ｄｌｌ４リガンドが含まれるが、これらに限定されない。他の方法としては、Ｄｌｌ４をコードする遺伝子の発現を妨害すること、又はノッチ受容体活性をブロックすること、例えば、ｓｉＲＮＡ又はガンマセクレターゼ阻害剤が挙げられる。
「中和」又は「遮断」抗体は、Ｄｌｌ４への結合がＤｌｌ４の生物活性の阻害をもたらす抗体を指すことを意図している。Ｄｌｌ４の生物活性のこの阻害は、Ｄｌｌ４の生物活性の１つ又はそれ以上の指標を測定することによって評価し得る。Ｄｌｌ４の生物活性のこれらの指標は、業界で公知の１つ又はそれ以上の幾つかの標準インビトロ又はインビボアッセイによって評価し得る（以下の実施例を参照されたい）。好ましくは、Ｄｌｌ４の活性を中和する抗体の能力は、ノッチ１及びノッチ４などのノッチ受容体へのＤｌｌ４結合の阻害によって評価される。
概要
ノッチシグナル伝達経路は進化的に保存され、そして胚及び生後発生時に多くの組織の細胞運命決定及び分化において重要な役割を担う。ノッチ経路の主要成分は血管系に発現し、そしてノッチ1、ノッチ１／ノッチ４、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｄｌｌ１、Ｄｌｌ４、Ｈｅｙ１／Ｈｅｙ２又はプレセニリン類を含む、特定のノッチ経路成分の遺伝子欠失は、血管のリモデリング欠陥に関与する胚致死をもたらす。これらの遺伝子の大部分は複数の組織及び細胞型に発現するが、Ｄｌｌ４は大部分が血管内皮に限定されることから、血管系ではＤｌｌ４がノッチ受容体の主要リガンドであることが示唆される。
ノッチシグナル伝達経路は進化的に保存され、そして胚及び生後発生時に多くの組織の細胞運命決定及び分化において重要な役割を担う。ノッチ経路の主要成分は血管系に発現し、そしてノッチ1、ノッチ１／ノッチ４、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｄｌｌ１、Ｄｌｌ４、Ｈｅｙ１／Ｈｅｙ２又はプレセニリン類を含む、特定のノッチ経路成分の遺伝子欠失は、血管のリモデリング欠陥に関与する胚致死をもたらす。これらの遺伝子の大部分は複数の組織及び細胞型に発現するが、Ｄｌｌ４は大部分が血管内皮に限定されることから、血管系ではＤｌｌ４がノッチ受容体の主要リガンドであることが示唆される。
初期胚発生時に、単一Ｄｌｌ４対立遺伝子の遺伝子欠失でさえ、大部分のマウス株に胚致死をもたらす重大な血管異常を引き起こす。実際、脈管形成及び血管形成に関与する多くの遺伝子のうち、ハプロ不全がＤｌｌ４及びＶＥＧＦ−Ａに対してのみ主要血管系欠損及び胚致死をもたらすことが報告されている。初期胚致死は大部分の実験操作を不可能にし、血管発生時及び病的セッティングにおけるＤｌｌ４の役割を正確に理解することを困難にする。
これらの制限を克服するために、Ｄｌｌ４の遺伝子欠失の影響を、ハプロ不全が限られた胚致死だけをもたらすＩＣＲ株のマウスで検討した。これらの変異体マウスに観察される血管表現型を、Ｄｌｌ４／ノッチシグナル伝達が、Ｄｌｌ４の可溶性阻害剤、Ｄｌｌ４−Ｆｃ、又はＤｌｌ４の細胞外ドメインに対するポリクローナル中和抗体の硝子体内注射によって選択的に阻害された、野生型マウスで得られるものと比較した。これらの実験では、網膜血管系が一過性に空間的に高度に組織化されたステレオタイプ式に出生後に発生することから、網膜がＤｌｌ４の生物学を研究するモデル系として選択された。
酸素誘発静脈欝血性網膜症（ＯＩＲ）のマウスモデルは、必須の前血管新生因子、ＶＥＧＦ(非特許文献７、８、９) の発現上昇に関わる病的血管新生の十分特徴付けされたモデルであり、そして様々な疾病状態（非特許文献１０)に関わる病的血管新生に関係する。最終的に、網膜血管系は、実験薬剤の硝子体内微量注入を含み、実験的操作に利用し易い。
以下に記載される実験は、正常網膜血管発生時及びＯＩＲモデルにおいて、Ｄｌｌ４／ノッチシグナル伝達の薬理学的抑制が血管形成出芽を顕著に強化し、また高密度初期毛細血管網の形成を促進することを示す。これと調和して、正常発生時及びＯＩＲモデルにおいて、内因性Ｄｌｌ４発現は血管増殖の最も活性な領域において特に顕著なことが見出された。更に、Ｄｌｌ４阻害は異常血管系の形成を顕著に抑制し、血管閉塞及び退行を防止した。
Ｄｌｌ４アンタゴニスト
Ｄｌｌ４アンタゴニストとしては、Ｄｌｌ４に対する抗体及びノッチ受容体へのＤｌｌ４の結合をブロックすることができるそれらのフラグメント、例えば、ノッチ1；及び多量体化成分に融合してもよいＤｌｌ４の細胞外ドメインを含むタンパク質又はタンパク質フラグメント；ペプチド及びペプチド抗体(例えば、特許文献１を参照)が含まれる。
Ｄｌｌ４アンタゴニストとしては、Ｄｌｌ４に対する抗体及びノッチ受容体へのＤｌｌ４の結合をブロックすることができるそれらのフラグメント、例えば、ノッチ1；及び多量体化成分に融合してもよいＤｌｌ４の細胞外ドメインを含むタンパク質又はタンパク質フラグメント；ペプチド及びペプチド抗体(例えば、特許文献１を参照)が含まれる。
Ｄｌｌ４抗体
本明細書で使用される「免疫グロブリン又は抗体」なる語句は、ヒトを含む哺乳動物の、抗原を特異的に結合して認識する免疫グロブリン遺伝子又はそのフラグメントの骨格領域を含むポリペプチド及びタンパク質を示しており、本発明の場合には、Ｄｌｌ４タンパク質又はその一部分である。所望の抗体又は抗体様タンパク質が哺乳類の治療法として使用される場合、免疫グロブリン結合領域は、対応する哺乳類の免疫グロブリンに由来するものであってよい。分子が診断薬及びＥＬＩＳＡ用などの非治療的使用を目的とする場合、免疫グロブリン結合領域はヒトか又はマウスなどの非ヒト哺乳類に由来するものであってよい。ヒト免疫グロブリン遺伝子又は遺伝子フラグメントとしては、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、及びミュー定常領域、並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、カッパか又はラムダに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、又はイプシロンに分類され、これらは順次免疫グロブリンクラスの、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥを特徴付ける。各ＩｇＧクラス内には、異なるイソタイプ（例えば、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2など）及びそのアロタイプがある。
本明細書で使用される「免疫グロブリン又は抗体」なる語句は、ヒトを含む哺乳動物の、抗原を特異的に結合して認識する免疫グロブリン遺伝子又はそのフラグメントの骨格領域を含むポリペプチド及びタンパク質を示しており、本発明の場合には、Ｄｌｌ４タンパク質又はその一部分である。所望の抗体又は抗体様タンパク質が哺乳類の治療法として使用される場合、免疫グロブリン結合領域は、対応する哺乳類の免疫グロブリンに由来するものであってよい。分子が診断薬及びＥＬＩＳＡ用などの非治療的使用を目的とする場合、免疫グロブリン結合領域はヒトか又はマウスなどの非ヒト哺乳類に由来するものであってよい。ヒト免疫グロブリン遺伝子又は遺伝子フラグメントとしては、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、及びミュー定常領域、並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、カッパか又はラムダに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、又はイプシロンに分類され、これらは順次免疫グロブリンクラスの、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥを特徴付ける。各ＩｇＧクラス内には、異なるイソタイプ（例えば、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2など）及びそのアロタイプがある。
ヒトＩｇＧの典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、テトラマーを含む。各テトラマーはポリペプチド鎖の２つの相同対から成り、各ペアは１つの軽鎖（約２５ｋＤ）及び１つの重鎖（約５０〜７０ｋＤ）から成る。各鎖のＮ末端は、抗原認識に主として関与する約１００〜１１０又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を特徴付ける。「可変軽鎖」（ＶL）及び可変重鎖（ＶH）という用語は、それぞれこれらの軽鎖及び重鎖を指す。
抗体は原型の免疫グロブリンとして、又は種々のペプチダーゼに因る消化により産生された一定数の十分特徴付けられたフラグメントとして存在する。例えば、ペプシンは、ヒンジ領域中のジスルフィド結合の下で抗体を消化し、それ自体がジスルフィド結合によりＶH−ＣHに結合された軽鎖であるＦａｂの２量体であるＦ（ａｂ）′2を産生する。Ｆ（ａｂ）′2は穏和な条件下で還元され、ヒンジ領域のジスルフィド結合を切断し、それによりＦ（ａｂ）′2２量体をＦａｂ′単量体に変換することができる。Ｆａｂ′単量体は基本的にヒンジ領域の一部分を有するＦａｂである。種々の抗体フラグメントが原型抗体の消化の観点から記載されているが、業界では当然のことながら、当該フラグメントは化学的に又は組換えＤＮＡ手法を用いることによりデノボで合成できる。従って、本明細書に使用される抗体なる用語は、全抗体の修飾によって産生される抗体フラグメントか、組換えＤＮＡ手法を用いてデノボ合成されるか、又はファージ、Ｅ.ｃｏｌｉ又は酵母ディスプレーライブラリーなどのディスプレーライブラリーを経由して生成されるものをも含む(例えば、 非特許文献１１を参照)。
Ｄｌｌ４アナログ又はタンパク質フラグメント
Ｄｌｌ４アンタゴニストは、場合により多量体化成分に結合したＤｌｌ４フラグメントであってもよい。特定の実施態様では、Ｄｌｌ４フラグメントは、免疫グロブリンドメイン、切断免疫グロブリンドメイン、又は場合により少なくとも１つのシステイン残基を含む、１から約５００のアミノ酸長間のアミノ酸配列などの多量体化成分に融合されてもよい。好ましい実施態様では、多量体化成分は免疫グロブリンドメイン、好ましくはＦｃドメイン、例えば、ヒトＦｃ（配列番号５）である。タンパク質又はタンパク質フラグメントは、場合により、天然又は合成配列を含む細胞由来のポリペプチド又はタンパク質の分泌を命令する当業者に公知のいずれの配列をも含むことができる、単一シグナル配列を含んでもよい。一般的に、シグナル配列は、本発明の融合タンパク質の開始点又はアミノ末端に配置されている。このようなシグナル配列は、細胞に固有のもの、組換え体、又は合成体であってよい。
Ｄｌｌ４アンタゴニストは、場合により多量体化成分に結合したＤｌｌ４フラグメントであってもよい。特定の実施態様では、Ｄｌｌ４フラグメントは、免疫グロブリンドメイン、切断免疫グロブリンドメイン、又は場合により少なくとも１つのシステイン残基を含む、１から約５００のアミノ酸長間のアミノ酸配列などの多量体化成分に融合されてもよい。好ましい実施態様では、多量体化成分は免疫グロブリンドメイン、好ましくはＦｃドメイン、例えば、ヒトＦｃ（配列番号５）である。タンパク質又はタンパク質フラグメントは、場合により、天然又は合成配列を含む細胞由来のポリペプチド又はタンパク質の分泌を命令する当業者に公知のいずれの配列をも含むことができる、単一シグナル配列を含んでもよい。一般的に、シグナル配列は、本発明の融合タンパク質の開始点又はアミノ末端に配置されている。このようなシグナル配列は、細胞に固有のもの、組換え体、又は合成体であってよい。
Ｄｌｌ４の細胞外ドメインは、デルタ／Ｓｅｒｒａｔｅ／Ｌａｇ２（ＤＳＬ）ドメイン及び８つの上皮成長因子（ＥＧＦ）様タンデム反復から構成されている。一般的に、ＥＧＦドメインは、約２１８〜２５１位（ドメイン１）、２５２〜２８２位（ドメイン２）、２８４〜３２２位（ドメイン３）、３２４〜３６０位（ドメイン４）、及び３６２〜４００位（ドメイン５）に存在することが認識されており、ＤＳＬドメインは約１７３〜２１７位に、またＮ末端ドメインはｈＤｌｌ４（配列番号２）の約２７〜１７２位にあるとされる。特定の実施態様では、Ｄｌｌ４アンタゴニストは、配列番号２の約２７〜１７２、２７〜２１７、２１８〜４００、２１８〜３６０、２１８〜３２２、又は２１８〜２８２のアミノ酸を、場合によりｈＦｃ（配列番号５）に融合されて含む。
投与方法
本発明は、本発明の薬剤の有効量を被験者に投与することを含む治療法を提供する。好ましい態様では、薬剤は実質的に精製される（例えば、その効果を抑え又は好ましくない副作用をもたらす物質を実質的に含まない）。被験者は、好ましくは、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物であり、また好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトである。特定の実施態様では、本発明の医薬組成物を、治療を必要とする部位に局所的に投与することが望ましい；これは、手術時の局所注入、局所適用、例えば、注射により、カテーテルにより、又は埋込物により達成することができるが、これらに限定されない。
本発明は、本発明の薬剤の有効量を被験者に投与することを含む治療法を提供する。好ましい態様では、薬剤は実質的に精製される（例えば、その効果を抑え又は好ましくない副作用をもたらす物質を実質的に含まない）。被験者は、好ましくは、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物であり、また好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトである。特定の実施態様では、本発明の医薬組成物を、治療を必要とする部位に局所的に投与することが望ましい；これは、手術時の局所注入、局所適用、例えば、注射により、カテーテルにより、又は埋込物により達成することができるが、これらに限定されない。
本発明の方法は、硝子体内、眼内、眼周囲、結膜下、強膜近傍、テノン嚢下、又は局部投与を含む局所投与により、治療を必要とする部位への投与によって有利に実施することができる。
併用療法
種々の実施態様では、本発明の方法は、Ｄｌｌ４抗体などのＤｌｌ４アンタゴニストを、１つ又はそれ以上の追加の化合物又は療法若しくは医学的処置との併用によって達成することができる。例えば、交互か又は同時に併用して使用される好適な治療薬としては、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に結合し活性を阻害することができる融合タンパク質（特許文献２、３）、コルチコステロイド、デキサメタゾン、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６などの免疫抑制薬、又は代謝拮抗薬（非特許文献１２を参照）を含む。本発明のＤｌｌ４アンタゴニストと交互か又は同時に併用して使用されるその他の好適な治療薬としては、ＶＥＧＦ−Ｃ及びＶＥＧＦ−Ｄなどの他のＶＥＧＦファミリーメンバーの生物活性をブロックし得る薬剤を含むことができる。
種々の実施態様では、本発明の方法は、Ｄｌｌ４抗体などのＤｌｌ４アンタゴニストを、１つ又はそれ以上の追加の化合物又は療法若しくは医学的処置との併用によって達成することができる。例えば、交互か又は同時に併用して使用される好適な治療薬としては、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に結合し活性を阻害することができる融合タンパク質（特許文献２、３）、コルチコステロイド、デキサメタゾン、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６などの免疫抑制薬、又は代謝拮抗薬（非特許文献１２を参照）を含む。本発明のＤｌｌ４アンタゴニストと交互か又は同時に併用して使用されるその他の好適な治療薬としては、ＶＥＧＦ−Ｃ及びＶＥＧＦ−Ｄなどの他のＶＥＧＦファミリーメンバーの生物活性をブロックし得る薬剤を含むことができる。
以下の実施例は、本発明の方法及び組成物の作成法及び使用法に関する完全開示及び記載を当業者に提供するために示すものであり、本発明者らが彼らの発明として考えているものの範囲を限定することを目的とするものではない。使用される数量について正確さを確保する努力はなされているが（例えば、量、面積測定など）、ある程度の実験誤差及び偏差は当然ながら含まれる。
〔実施例１〕
発生中の網膜血管系の血管出芽に対する、単一Ｄｌｌ４対立遺伝子の遺伝子欠失の影響
正常発生網膜血管新生時の血管出芽に対する、Ｄｌｌ４の部分的遺伝子欠失の影響を明らかにするための検討を行なった。
動物
Velocigene（登録商標）技術 (非特許文献１３、特許文献４）を用いて、Ｃ５７ＢＬ／６：１２９ハイブリッドマウス胚性幹細胞において、全Ｄｌｌ４コード領域をβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子で置換した。キメラ雄性をＩＣＲ雌性と交配させた。３世代にわたってＩＣＲ（８７.５％ＩＣＲ）に戻し交配したＤｌｌ４+/lacZマウスを本研究に使用した。
組織化学及び免疫染色
マウスの子をＰ７に人道的に安楽死させた。目を摘出し、網膜を解剖して、１夜４％パラホルムアルデヒドで固定し、更にＦＩＴＣ標識Griffonia simplicifolia（ＧＳ）レクチンＩ（Vector Laboratories, Burlingame, CA）で染色して伸展標本にした。画像はNikon（Melville, NY）顕微鏡を用い手撮影した。
定量
Scion Imageソフトウェアを用いて測定を行った。各実験条件は少なくとも３重複でアッセイした。Studentのｔ検定及び２方向分散分析を用いて統計的有意差を評価した。
結果
末梢神経叢は、Ｄｌｌ４+/lacZマウスでは野生型同腹子よりもかなり高密度であった。高倍率視野では、Ｄｌｌ４+/lacZマウスの網膜の高密度末梢神経叢は、より大きい径で、高度相互接続しそして高度融合した毛細血管から構成されており、そのためにある領域では血管が癒着して合胞体を形成することと、それに加えて、成長最前部で更に多くの萌芽の存在が明らかになった（図１）；糸状仮足も叢のより内部に正常より高い頻度で観察された。定量分析の結果は、野生型対照に比べて、Ｄｌｌ４+/lacZマウスの網膜は、表在性網膜血管系の成長最前部で６８％の萌芽数の増加（図１）、並びに単位面積当り毛細血管相互接続数の２倍以上の増加を示し、その結果血管被覆の著しい増加をもたらすことを示した。顕著な形態変化にもかかわらず、蛍光レクチンの血管内注射は、野生型マウスのようにＤｌｌ４+/lacZマウスにおいて発生する表在性血管叢を、端細胞から伸長する糸状仮足を除いて、完全に満たしたことから、発生中の血管の全成分は管腔を有し機能性であることを示した。
発生中の網膜血管系の血管出芽に対する、単一Ｄｌｌ４対立遺伝子の遺伝子欠失の影響
正常発生網膜血管新生時の血管出芽に対する、Ｄｌｌ４の部分的遺伝子欠失の影響を明らかにするための検討を行なった。
動物
Velocigene（登録商標）技術 (非特許文献１３、特許文献４）を用いて、Ｃ５７ＢＬ／６：１２９ハイブリッドマウス胚性幹細胞において、全Ｄｌｌ４コード領域をβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子で置換した。キメラ雄性をＩＣＲ雌性と交配させた。３世代にわたってＩＣＲ（８７.５％ＩＣＲ）に戻し交配したＤｌｌ４+/lacZマウスを本研究に使用した。
組織化学及び免疫染色
マウスの子をＰ７に人道的に安楽死させた。目を摘出し、網膜を解剖して、１夜４％パラホルムアルデヒドで固定し、更にＦＩＴＣ標識Griffonia simplicifolia（ＧＳ）レクチンＩ（Vector Laboratories, Burlingame, CA）で染色して伸展標本にした。画像はNikon（Melville, NY）顕微鏡を用い手撮影した。
定量
Scion Imageソフトウェアを用いて測定を行った。各実験条件は少なくとも３重複でアッセイした。Studentのｔ検定及び２方向分散分析を用いて統計的有意差を評価した。
結果
末梢神経叢は、Ｄｌｌ４+/lacZマウスでは野生型同腹子よりもかなり高密度であった。高倍率視野では、Ｄｌｌ４+/lacZマウスの網膜の高密度末梢神経叢は、より大きい径で、高度相互接続しそして高度融合した毛細血管から構成されており、そのためにある領域では血管が癒着して合胞体を形成することと、それに加えて、成長最前部で更に多くの萌芽の存在が明らかになった（図１）；糸状仮足も叢のより内部に正常より高い頻度で観察された。定量分析の結果は、野生型対照に比べて、Ｄｌｌ４+/lacZマウスの網膜は、表在性網膜血管系の成長最前部で６８％の萌芽数の増加（図１）、並びに単位面積当り毛細血管相互接続数の２倍以上の増加を示し、その結果血管被覆の著しい増加をもたらすことを示した。顕著な形態変化にもかかわらず、蛍光レクチンの血管内注射は、野生型マウスのようにＤｌｌ４+/lacZマウスにおいて発生する表在性血管叢を、端細胞から伸長する糸状仮足を除いて、完全に満たしたことから、発生中の血管の全成分は管腔を有し機能性であることを示した。
〔実施例２〕
発生中の網膜血管系に対する、Ｄｌｌ４−Ｆｃ又は抗Ｄｌｌ４抗体を用いたＤｌｌ４／ノッチ阻害の効果
正常発生網膜血管新生時の内皮細胞増殖及び血管出芽に対し、Ｄｌｌ４／ノッチシグナル伝達の薬理学的阻害の効果を明らかにするための検討を行なった。
抗体及び試薬
Ｄｌｌ４−Ｆｃは、マウス又はヒトＤｌｌ４の細胞外ドメイン及びヒトＩｇＧのＦｃ部分を含む。Ｄｌｌ４−ＦｃはＣＨＯ細胞に発現し、親和性はプロテインＡクロマトグラフィーで精製した。抗Ｄｌｌ４抗体を、組換えｍＤｌｌ４−ｈＦｃによるウサギの免疫感作により作製した。抗血清は、使用前にプロテインＡクロマトグラフィーにより部分的に精製した。
動物
Ｃ５７／Ｂ１６マウス（Taconic）を使用して、発生中の網膜血管系に対するＤｌｌ４−Ｆｃ又はＤｌｌ４中和抗体の効果を検討した。
硝子体内微量注入
研究用化合物の硝子体内微量注入（３０〜１００ｎｌ）を、ガラス針を備えたDrummond Scientific（BroPA）ナノインジェクタを用いることにより、眼球赤道と角膜縁間に行なった。
ＢｒｄＵの標識
増殖中の細胞を、ｈＦｃ又はＤｌｌ４−Ｆｃの硝子体内注射の２０時間後にＢｒｄＵ（１ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）の投与により標識した。網膜を４時間後に回収して、抗ＢｒｄＵ（Dako North America, Inc., Carpinteria, CA）及びＶＥ−カドヘリン（BD PharMingen, San Diego, CA）抗体で染色した。
結果
Ｄｌｌ４／ノッチシグナル伝達における、そして未検出全身異常に続発しない局所網膜内欠損の影響を研究するために、それらを活性化することなくノッチ受容体に結合し、それにより内因性Ｄｌｌ４、又はＤｌｌ４の細胞外ドメインに特異的なポリクローナル中和抗体の作用をブロックする、可溶型のＤｌｌ４（Ｄｌｌ４−Ｆｃと称する）を野生型マウスの硝子体内に注射した。いずれかのＤｌｌ４遮断薬の眼内投与の３日後に、網膜血管は、血管密度と血管径の劇的増加を含み、Ｄｌｌ４+/lacZマウスに見られた血管異常に非常に類似した形態変化を示した。更に、これらの特徴的な形態変化は急激に現われ、２４時間以内にはっきりそれと分かった。
ＢｒｄＵ標識でも、Ｄｌｌ４遮断の２４時間以内に内皮細胞増殖の増加を示した（図２）。観察された増殖率の〜１７％の増加は、３から４の倍加時間内に５０％を越える細胞数増加をもたらし得た。
発生中の網膜血管系に対する、Ｄｌｌ４−Ｆｃ又は抗Ｄｌｌ４抗体を用いたＤｌｌ４／ノッチ阻害の効果
正常発生網膜血管新生時の内皮細胞増殖及び血管出芽に対し、Ｄｌｌ４／ノッチシグナル伝達の薬理学的阻害の効果を明らかにするための検討を行なった。
抗体及び試薬
Ｄｌｌ４−Ｆｃは、マウス又はヒトＤｌｌ４の細胞外ドメイン及びヒトＩｇＧのＦｃ部分を含む。Ｄｌｌ４−ＦｃはＣＨＯ細胞に発現し、親和性はプロテインＡクロマトグラフィーで精製した。抗Ｄｌｌ４抗体を、組換えｍＤｌｌ４−ｈＦｃによるウサギの免疫感作により作製した。抗血清は、使用前にプロテインＡクロマトグラフィーにより部分的に精製した。
動物
Ｃ５７／Ｂ１６マウス（Taconic）を使用して、発生中の網膜血管系に対するＤｌｌ４−Ｆｃ又はＤｌｌ４中和抗体の効果を検討した。
硝子体内微量注入
研究用化合物の硝子体内微量注入（３０〜１００ｎｌ）を、ガラス針を備えたDrummond Scientific（BroPA）ナノインジェクタを用いることにより、眼球赤道と角膜縁間に行なった。
ＢｒｄＵの標識
増殖中の細胞を、ｈＦｃ又はＤｌｌ４−Ｆｃの硝子体内注射の２０時間後にＢｒｄＵ（１ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）の投与により標識した。網膜を４時間後に回収して、抗ＢｒｄＵ（Dako North America, Inc., Carpinteria, CA）及びＶＥ−カドヘリン（BD PharMingen, San Diego, CA）抗体で染色した。
結果
Ｄｌｌ４／ノッチシグナル伝達における、そして未検出全身異常に続発しない局所網膜内欠損の影響を研究するために、それらを活性化することなくノッチ受容体に結合し、それにより内因性Ｄｌｌ４、又はＤｌｌ４の細胞外ドメインに特異的なポリクローナル中和抗体の作用をブロックする、可溶型のＤｌｌ４（Ｄｌｌ４−Ｆｃと称する）を野生型マウスの硝子体内に注射した。いずれかのＤｌｌ４遮断薬の眼内投与の３日後に、網膜血管は、血管密度と血管径の劇的増加を含み、Ｄｌｌ４+/lacZマウスに見られた血管異常に非常に類似した形態変化を示した。更に、これらの特徴的な形態変化は急激に現われ、２４時間以内にはっきりそれと分かった。
ＢｒｄＵ標識でも、Ｄｌｌ４遮断の２４時間以内に内皮細胞増殖の増加を示した（図２）。観察された増殖率の〜１７％の増加は、３から４の倍加時間内に５０％を越える細胞数増加をもたらし得た。
〔実施例３〕
ＯＩＲによるマウスの網膜血管新生、潅流及び血管異常に対する、Ｄｌｌ４−Ｆｃ及び抗Ｄｌｌ４抗体の効果
酸素誘発静脈欝血性網膜症（ＯＩＲ）における網膜血管の増殖、血管異常の形成及び網膜潅流に対する、Ｄｌｌ４−Ｆｃ及び抗Ｄｌｌ４抗体の効果を明らかにするための検討を行った。
Ｄｌｌ４／ノッチシグナル伝達が病的血管新生並びに正常な発生時に役割を果たすかどうかを明らかにするために、ＯＩＲモデルを活用した。ＯＩＲモデルにおいて、Ｐ７に酸素過剰へのマウスの曝露は中心網膜での毛細血管の急激閉塞をもたらす。Ｐ１２に室内空気に戻した後、無血管帯は重度の低酸素になり、順に広範囲の異常血管新生を誘発することが、硝子体への血管の異所性増殖（網膜上血管「タフト」）及び異常動静脈シャントの形成によって特徴付けられ；網膜の中心部は長期間にわたって大部分無血管となる。
動物及びＯＩＲモデル
Ｃ５７／Ｂｌ６マウス（Taconic）を用いて、ＯＩＲの網膜血管新生に対するＤｌｌ４−Ｆｃ又はＤｌｌ４中和抗体の効果を検討した。ＯＩＲは、Smith et al.（非特許文献１４）によって開発された方法に従って誘導された。簡潔にいえば、マウスの子及びその母を生後（Ｐ）７日からＰ１２まで７５％の酸素環境に置き、次いで室内空気に戻した。酸素過剰への曝露は中心網膜に急激な血管閉塞を誘導する。マウスを室内空気に戻した場合（Ｐ１２）、中心網膜からの血管の損傷は重篤な低酸素／虚血を引き起こし、順次上述の病的血管変化を促進する。
開存血管を標識するために、５０ｍｌのテキサスレッド標識トマト（Lycopersicon esculentum）（ＬＥ）レクチン（１ｍｇ／ｍｌ；Vector Laboratories, CA）を左心室に注射して、５分間循環させた。
結果
Ｄｌｌ４−Ｆｃか又は抗Ｄｌｌ４抗体によるＤｌｌ４／ノッチの阻害は、病的血管新生を改善し（図３Ａ−Ｂ）、新しい血管の増殖を促進させ（図４Ａ−Ｂ）、更に網膜再潅流を改善した（図５）。
Ｄｌｌ４−Ｆｃ若しくは抗Ｄｌｌ４抗体又は対照タンパク質（ｈＦｃ）を、動物が室内空気に戻った１日後、十分に血管閉塞が完了した後に、Ｐ１３に硝子体内注射した。網膜をＰ１７に評価した場合、Ｄｌｌ４−Ｆｃ又は抗Ｄｌｌ４抗体の投与は、硝子体中の病的新血管タフトの異所性増殖を劇的に抑制し（図１）、また異常な動静脈シャントの形成を防止した。新血管タフトが占める面積は、ｈＦｃ処置対照網膜に比べて、Ｄｌｌ４−Ｆｃで処置した網膜では４３％減少し、そして抗Ｄｌｌ４抗体で処置した網膜では８５％減少した。
更に、Ｄｌｌ４−Ｆｃ及び抗Ｄｌｌ４抗体は、無血管帯に隣接する毛細血管及び静脈からの新しい血管のより広範な出芽を促進させ、血管系が激減し、次いで無血管網膜野を縮小させる中心網膜への血管のより迅速な再生をもたらすことが示された（図４Ａ−Ｂ）。無血管野は、Ｄｌｌ４−Ｆｃで処置した網膜では４３％減少し、そして抗Ｄｌｌ４抗体で処置した網膜では６３％減少した。特に注目すべき点は、Ｄｌｌ４−Ｆｃ処置網膜の無血管帯の静脈から生じる広範な毛細血管の再生であった。このように、Ｄｌｌ４／ノッチシグナル伝達の減弱は、網膜表面沿いの新しい血管の出芽の伸展に有利に働き、また網膜上血管新生の形成を鈍化させたことから、表面血管叢のより急速な改善をもたらした。新生血管は機能性であり、Ｄｌｌ４−Ｆｃで処置した網膜における非潅流面積の４５％低下から明らかなように、網膜再潅流の改善を示した（図５）。
ＯＩＲによるマウスの網膜血管新生、潅流及び血管異常に対する、Ｄｌｌ４−Ｆｃ及び抗Ｄｌｌ４抗体の効果
酸素誘発静脈欝血性網膜症（ＯＩＲ）における網膜血管の増殖、血管異常の形成及び網膜潅流に対する、Ｄｌｌ４−Ｆｃ及び抗Ｄｌｌ４抗体の効果を明らかにするための検討を行った。
Ｄｌｌ４／ノッチシグナル伝達が病的血管新生並びに正常な発生時に役割を果たすかどうかを明らかにするために、ＯＩＲモデルを活用した。ＯＩＲモデルにおいて、Ｐ７に酸素過剰へのマウスの曝露は中心網膜での毛細血管の急激閉塞をもたらす。Ｐ１２に室内空気に戻した後、無血管帯は重度の低酸素になり、順に広範囲の異常血管新生を誘発することが、硝子体への血管の異所性増殖（網膜上血管「タフト」）及び異常動静脈シャントの形成によって特徴付けられ；網膜の中心部は長期間にわたって大部分無血管となる。
動物及びＯＩＲモデル
Ｃ５７／Ｂｌ６マウス（Taconic）を用いて、ＯＩＲの網膜血管新生に対するＤｌｌ４−Ｆｃ又はＤｌｌ４中和抗体の効果を検討した。ＯＩＲは、Smith et al.（非特許文献１４）によって開発された方法に従って誘導された。簡潔にいえば、マウスの子及びその母を生後（Ｐ）７日からＰ１２まで７５％の酸素環境に置き、次いで室内空気に戻した。酸素過剰への曝露は中心網膜に急激な血管閉塞を誘導する。マウスを室内空気に戻した場合（Ｐ１２）、中心網膜からの血管の損傷は重篤な低酸素／虚血を引き起こし、順次上述の病的血管変化を促進する。
開存血管を標識するために、５０ｍｌのテキサスレッド標識トマト（Lycopersicon esculentum）（ＬＥ）レクチン（１ｍｇ／ｍｌ；Vector Laboratories, CA）を左心室に注射して、５分間循環させた。
結果
Ｄｌｌ４−Ｆｃか又は抗Ｄｌｌ４抗体によるＤｌｌ４／ノッチの阻害は、病的血管新生を改善し（図３Ａ−Ｂ）、新しい血管の増殖を促進させ（図４Ａ−Ｂ）、更に網膜再潅流を改善した（図５）。
Ｄｌｌ４−Ｆｃ若しくは抗Ｄｌｌ４抗体又は対照タンパク質（ｈＦｃ）を、動物が室内空気に戻った１日後、十分に血管閉塞が完了した後に、Ｐ１３に硝子体内注射した。網膜をＰ１７に評価した場合、Ｄｌｌ４−Ｆｃ又は抗Ｄｌｌ４抗体の投与は、硝子体中の病的新血管タフトの異所性増殖を劇的に抑制し（図１）、また異常な動静脈シャントの形成を防止した。新血管タフトが占める面積は、ｈＦｃ処置対照網膜に比べて、Ｄｌｌ４−Ｆｃで処置した網膜では４３％減少し、そして抗Ｄｌｌ４抗体で処置した網膜では８５％減少した。
更に、Ｄｌｌ４−Ｆｃ及び抗Ｄｌｌ４抗体は、無血管帯に隣接する毛細血管及び静脈からの新しい血管のより広範な出芽を促進させ、血管系が激減し、次いで無血管網膜野を縮小させる中心網膜への血管のより迅速な再生をもたらすことが示された（図４Ａ−Ｂ）。無血管野は、Ｄｌｌ４−Ｆｃで処置した網膜では４３％減少し、そして抗Ｄｌｌ４抗体で処置した網膜では６３％減少した。特に注目すべき点は、Ｄｌｌ４−Ｆｃ処置網膜の無血管帯の静脈から生じる広範な毛細血管の再生であった。このように、Ｄｌｌ４／ノッチシグナル伝達の減弱は、網膜表面沿いの新しい血管の出芽の伸展に有利に働き、また網膜上血管新生の形成を鈍化させたことから、表面血管叢のより急速な改善をもたらした。新生血管は機能性であり、Ｄｌｌ４−Ｆｃで処置した網膜における非潅流面積の４５％低下から明らかなように、網膜再潅流の改善を示した（図５）。
〔実施例４〕
ＯＩＲモデルでの網膜低酸素／虚血に対する、Ｄｌｌ４−Ｆｃ及び抗Ｄｌｌ４抗体の効果
病的血管新生のＯＩＲモデルにおける網膜低酸素／虚血に対する、Ｄｌｌ４−Ｆｃ及び抗Ｄｌｌ４抗体の効果を明らかにするための検討を行なった。
特定の環境下での過剰血管増殖は、正常な血液循環を妨害し、組織酸素化を低下させる可能性がある。Ｄｌｌ４／ノッチ阻害が組織酸素化を改善できるかどうかを試験するために、HYPOXYPROBE（登録商標）-1（Chemicon）を非侵襲アッセイに用いて、組織低酸素を検出し、そして網膜低酸素／虚血に対するＤｌｌ４−Ｆｃ処置の効果を調べた。１００ｍｇ／ｋｇのHYPOXYPROBE（登録商標）-1を、評価のために網膜を採取する１時間前に腹腔内注入した。
結果
Ｄｌｌ４／ノッチ阻害剤の硝子体内投与後の機能的新血管増殖は、Ｄｌｌ４−Ｆｃ又は抗Ｄｌｌ４抗体処置網膜において、それぞれHYPOXYPROBE 陽性面積の６９％及び３０％減少から明らかなように、組織低酸素／虚血を有効に低減した（図６Ａ−Ｂ）。
ＯＩＲモデルでの網膜低酸素／虚血に対する、Ｄｌｌ４−Ｆｃ及び抗Ｄｌｌ４抗体の効果
病的血管新生のＯＩＲモデルにおける網膜低酸素／虚血に対する、Ｄｌｌ４−Ｆｃ及び抗Ｄｌｌ４抗体の効果を明らかにするための検討を行なった。
特定の環境下での過剰血管増殖は、正常な血液循環を妨害し、組織酸素化を低下させる可能性がある。Ｄｌｌ４／ノッチ阻害が組織酸素化を改善できるかどうかを試験するために、HYPOXYPROBE（登録商標）-1（Chemicon）を非侵襲アッセイに用いて、組織低酸素を検出し、そして網膜低酸素／虚血に対するＤｌｌ４−Ｆｃ処置の効果を調べた。１００ｍｇ／ｋｇのHYPOXYPROBE（登録商標）-1を、評価のために網膜を採取する１時間前に腹腔内注入した。
結果
Ｄｌｌ４／ノッチ阻害剤の硝子体内投与後の機能的新血管増殖は、Ｄｌｌ４−Ｆｃ又は抗Ｄｌｌ４抗体処置網膜において、それぞれHYPOXYPROBE 陽性面積の６９％及び３０％減少から明らかなように、組織低酸素／虚血を有効に低減した（図６Ａ−Ｂ）。
〔実施例５〕
単一Ｄｌｌ４対立遺伝子の遺伝子欠失は酸素過剰誘発血管閉塞を低減する
酸素過剰誘導血管退行に対する、Ｄｌｌ４の部分的遺伝子欠失の影響を明らかにするための検討を実施した。
動物
３世代にわたってＩＣＲ（８７.５％ＩＣＲ）に戻し交配したＤｌｌ４+/lacZマウスを上記のように作製した。劣性（ｒｄ／ｒｄ）突然変異に因り、網膜光受容体細胞層は、ＩＣＲマウスのＰ１２に変性を開始する。そこで、網膜血管系に対する光受容体欠損の二次的影響の可能性を未然に防ぐために、網膜発生の後期を評価し、また全てのＯＩＲ実験で、光受容体変性を示さないＲｄ／ｒｄマウスを作製するために、Ｄｌｌ４+/lacZ（８７.５％ＩＣＲ）マウスをＣ５７ＢＬ／６に戻し交配した。
マウスの子を生後（Ｐ）７日から１２日まで７５％の酸素環境に置いた。網膜を回収して、網膜血管系を伸展標本で解析した。
結果
Ｄｌｌ４+/lacZマウスの網膜血管系におけるＤｌｌ４の発現低下は、酸素過剰誘導網膜血管損傷を部分的に防止する（図７）。ＯＩＲモデルでは、Ｐ７での酸素過剰へのマウスの子の曝露は、中心網膜において毛細血管の急速閉塞及び閉鎖をもたらす。Ｄｌｌ４／ノッチ阻害が血管への保護作用を有する可能性を明らかにするために、酸素過剰誘導血管閉塞に対するＤｌｌ４+/lacZマウスのＤｌｌ４部分的遺伝子欠失の影響を解析した。Ｐ１２に動物を評価すること（酸素過剰誘導血管閉塞の程度を評価するために）により、野生型同腹子対照動物に比べて血管閉塞はＤｌｌ４+/lacZマウスで４０％低減することが見出されたことから、Ｄｌｌ４阻害剤が残存血管を退行から保護する可能性を示唆する。
単一Ｄｌｌ４対立遺伝子の遺伝子欠失は酸素過剰誘発血管閉塞を低減する
酸素過剰誘導血管退行に対する、Ｄｌｌ４の部分的遺伝子欠失の影響を明らかにするための検討を実施した。
動物
３世代にわたってＩＣＲ（８７.５％ＩＣＲ）に戻し交配したＤｌｌ４+/lacZマウスを上記のように作製した。劣性（ｒｄ／ｒｄ）突然変異に因り、網膜光受容体細胞層は、ＩＣＲマウスのＰ１２に変性を開始する。そこで、網膜血管系に対する光受容体欠損の二次的影響の可能性を未然に防ぐために、網膜発生の後期を評価し、また全てのＯＩＲ実験で、光受容体変性を示さないＲｄ／ｒｄマウスを作製するために、Ｄｌｌ４+/lacZ（８７.５％ＩＣＲ）マウスをＣ５７ＢＬ／６に戻し交配した。
マウスの子を生後（Ｐ）７日から１２日まで７５％の酸素環境に置いた。網膜を回収して、網膜血管系を伸展標本で解析した。
結果
Ｄｌｌ４+/lacZマウスの網膜血管系におけるＤｌｌ４の発現低下は、酸素過剰誘導網膜血管損傷を部分的に防止する（図７）。ＯＩＲモデルでは、Ｐ７での酸素過剰へのマウスの子の曝露は、中心網膜において毛細血管の急速閉塞及び閉鎖をもたらす。Ｄｌｌ４／ノッチ阻害が血管への保護作用を有する可能性を明らかにするために、酸素過剰誘導血管閉塞に対するＤｌｌ４+/lacZマウスのＤｌｌ４部分的遺伝子欠失の影響を解析した。Ｐ１２に動物を評価すること（酸素過剰誘導血管閉塞の程度を評価するために）により、野生型同腹子対照動物に比べて血管閉塞はＤｌｌ４+/lacZマウスで４０％低減することが見出されたことから、Ｄｌｌ４阻害剤が残存血管を退行から保護する可能性を示唆する。
〔実施例６〕
酸素過剰誘導血管閉塞に対する、Ｄｌｌ４−Ｆｃ及び抗Ｄｌｌ４抗体の効果
酸素過剰誘導血管退行に対する、Ｄｌｌ４‐Ｆｃ及び抗Ｄｌｌ４抗体によるＤｌｌ４／ノッチ阻害の効果を明らかにするための検討を行なった。
動物
Ｃ５７／Ｂｌ６マウス（Taconic）を用いて、酸素誘導網膜血管閉塞に対するＤｌｌ４−Ｆｃ又はＤｌｌ４中和抗体の効果を検討した。研究用化合物の硝子体内微量注入を、生後８日に実施した。生後９日にマウスの子を７５％の酸素環境に置いた。網膜を２４時間後に回収して、網膜血管系を伸展標本で解析した。
結果
Ｄｌｌ４−Ｆｃ又はＤｌｌ４中和抗体の硝子体内注射は、閉塞血管系の面積をそれぞれ９７％及び４１％劇的に減少させた（図８Ａ−Ｂ）。
酸素過剰誘導血管閉塞に対する、Ｄｌｌ４−Ｆｃ及び抗Ｄｌｌ４抗体の効果
酸素過剰誘導血管退行に対する、Ｄｌｌ４‐Ｆｃ及び抗Ｄｌｌ４抗体によるＤｌｌ４／ノッチ阻害の効果を明らかにするための検討を行なった。
動物
Ｃ５７／Ｂｌ６マウス（Taconic）を用いて、酸素誘導網膜血管閉塞に対するＤｌｌ４−Ｆｃ又はＤｌｌ４中和抗体の効果を検討した。研究用化合物の硝子体内微量注入を、生後８日に実施した。生後９日にマウスの子を７５％の酸素環境に置いた。網膜を２４時間後に回収して、網膜血管系を伸展標本で解析した。
結果
Ｄｌｌ４−Ｆｃ又はＤｌｌ４中和抗体の硝子体内注射は、閉塞血管系の面積をそれぞれ９７％及び４１％劇的に減少させた（図８Ａ−Ｂ）。
〔実施例７〕
酸素過剰誘導血管閉塞に対する、Ｄｌｌ４−Ｆｃ又は抗Ｄｌｌ４抗体の効果
酸素過剰誘導血管閉塞に対する、Ｄｌｌ４−Ｆｃ及び抗Ｄｌｌ４抗体によるＤｌｌ４／ノッチ阻害の効果を明らかにするための検討を行なった。手順は全て上述のように実施した。
Ｄｌｌ４−Ｆｃ及び抗Ｄｌｌ４抗体処置は、非潅流網膜面積をそれぞれ４０％及び２９％低減した（図９Ａ−Ｂ）。
酸素過剰誘導血管閉塞に対する、Ｄｌｌ４−Ｆｃ又は抗Ｄｌｌ４抗体の効果
酸素過剰誘導血管閉塞に対する、Ｄｌｌ４−Ｆｃ及び抗Ｄｌｌ４抗体によるＤｌｌ４／ノッチ阻害の効果を明らかにするための検討を行なった。手順は全て上述のように実施した。
Ｄｌｌ４−Ｆｃ及び抗Ｄｌｌ４抗体処置は、非潅流網膜面積をそれぞれ４０％及び２９％低減した（図９Ａ−Ｂ）。
〔実施例８〕
酸素過剰誘導血管退行に対する、Ｄｌｌ４−Ｆｃの全身投与の効果
酸素過剰誘導血管退行に対する、Ｄｌｌ４−Ｆｃによる全身療法の効果を明らかにするための検討を行なった。
Ｐ７に４．１ｍｃｇのｈＤｌｌ４−ｈＦｃ又は５ｍｃｇのヒトｈＦｃ対照タンパク質を硝子体内注射（ＩＴＶ）するか、又はｈＤｌｌ４−ｈＦｃを体重ｋｇ当り２５ｍｇの用量で腹腔内注射した。マウスの子をＰ８に７５％酸素環境に置き、網膜血管系をＰ９に解析した。他の手順は全て上述のように実施した。
結果
Ｄｌｌ４−Ｆｃの局所（硝子体内）及び全身（腹腔内）投与は、いずれも閉塞血管系の面積をそれぞれ８６％及び５６％減少させたことから、Ｄｌｌ４阻害剤は、投与経路に無関係に血管を退行から保護するために効果的に使用できることを示す（図１０）。
酸素過剰誘導血管退行に対する、Ｄｌｌ４−Ｆｃの全身投与の効果
酸素過剰誘導血管退行に対する、Ｄｌｌ４−Ｆｃによる全身療法の効果を明らかにするための検討を行なった。
Ｐ７に４．１ｍｃｇのｈＤｌｌ４−ｈＦｃ又は５ｍｃｇのヒトｈＦｃ対照タンパク質を硝子体内注射（ＩＴＶ）するか、又はｈＤｌｌ４−ｈＦｃを体重ｋｇ当り２５ｍｇの用量で腹腔内注射した。マウスの子をＰ８に７５％酸素環境に置き、網膜血管系をＰ９に解析した。他の手順は全て上述のように実施した。
結果
Ｄｌｌ４−Ｆｃの局所（硝子体内）及び全身（腹腔内）投与は、いずれも閉塞血管系の面積をそれぞれ８６％及び５６％減少させたことから、Ｄｌｌ４阻害剤は、投与経路に無関係に血管を退行から保護するために効果的に使用できることを示す（図１０）。
Claims (7)
- 虚血性の又は血管の障害を治療し、抑制し又は改善する医薬品の製造におけるＤｌｌ４活性を阻害することができる薬剤の使用であって、Ｄｌｌ４アンタゴニストがノッチ受容体へのＤｌｌ４の結合をブロックすることができる抗体若しくは抗体フラグメントを含む、又は場合により多量体化成分に結合されたＤｌｌ４のフラグメントを含む使用。
- Ｄｌｌ４抗体又は抗体フラグメントがポリクローナル又はモノクローナルである、請求項１に記載の使用。
- 抗体若しくは抗体フラグメントが、ヒト化された、キメラ的な、又は完全にヒトの抗体若しくは抗体フラグメントである、請求項２に記載の使用。
- 虚血性の又は血管の障害が、異常血管の存在及び／又は正常血管若しくは血管機能の損傷を特徴とする眼の疾患又は状態である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
- 眼の疾患が、未熟児網膜症、静脈欝血性網膜症、網膜静脈若しくは動脈閉塞、糖尿病性網膜症、脈絡膜血管新生、加齢黄斑変性症、角膜血管新生、血管新生緑内障又は角膜移植である、請求項４に記載の使用。
- 治療される被験者がヒトである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
- 虚血性の又は血管の障害が、虚血性傷害、脳虚血、心虚血、肢及び他の器官又は組織を冒す虚血状態、動静脈奇形、創傷治癒、器官又は組織移植、胎盤機能不全、動脈狭窄及び閉塞、アテローム性動脈硬化症、並びに全身性又は肺高血圧症である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
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