ES2398253T3

ES2398253T3 - Uso de antagonistas de DII4 en lesión isquémica o insuficiencia vascular

Info

Publication number: ES2398253T3
Application number: ES07811137T
Authority: ES
Inventors: Stanley J. Wiegand; Nicholas J. Papadopoulos; Ivan B. Lobov
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2006-08-07
Filing date: 2007-08-07
Publication date: 2013-03-14
Anticipated expiration: 2027-08-07
Also published as: PL2054082T3; AU2007281916B2; JP2010500355A; HRP20130271T1; CA2660235A1; AU2007281916A1; RU2429876C2; SV2009003161A; RU2009107921A; ME00591A; EP2054082B1; CO6150190A2; SI2054082T1; ZA200900337B; MA30667B1; CN101500605B; KR101497355B1; TN2009000036A1; ME00591B; DK2054082T3

Abstract

Uso de un antagonista de ligando de tipo delta 4 (Dll4) en la fabricacion de un medicamento para prevenir oreducir la perdida de vasos sanguineos o para promover la angiogenesis productiva, o ambos, en un sujeto quetiene una lesion isquemica o insuficiencia vascular, en el que el antagonista de Dll4 comprende un anticuerpo ofragmento de anticuerpo que se une especificamente a Dll4 y que bloquea la union de Dll4 a un receptor Notch oque comprende el dominio extracelular de Dll4, conectado opcionalmente a un componente multimerizante.

Description

Uso de antagonistas de Dll4 en lesión isquémica o insuficiencia vascular

5 Campo de la invención

Esta invención se refiere, en líneas generales, al tratamiento de trastornos vasculares e isquémicos administrando composiciones que inhiben la interacción de Dll4 con receptores Notch y/o la activación de receptor Notch. Más específicamente, esta invención se refiere al tratamiento de trastornos vasculares y/o isquémicos del ojo administrando composiciones que inhiben la interacción de Dll4 con receptores Notch.

Antecedentes

La angiogénesis es un proceso fundamental requerido para el desarrollo y el crecimiento normales de tejidos y

15 órganos e implica la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos preexistentes. La angiogénesis y la homeostasis de vasos sanguíneos están estrechamente controladas a través de un sistema altamente regulado de moduladores angiogénicos. La desviación de un control tan estrecho con frecuencia conduce a o está asociado con enfermedad.

Aunque la angiogénesis "excesiva" o anormal no regulada es característica de numerosos estados patológicos, la angiogénesis insuficiente, la pérdida de vasos sanguíneos o la oclusión funcional o estructural de vasos sanguíneos también puede ser un grave problema médico. Es deseable promover la angiogénesis y/o prevenir la regresión de vasos sanguíneos existentes en situaciones en las que el tejido se convierte en isquémico, por ejemplo, en isquemia retiniana, cerebral, cardiovascular y de extremidades y en afecciones en las que tiene que establecerse, re

25 establecerse, aumentarse o expandirse el suministro vascular, por ejemplo, en la cicatrización y después de trasplante de tejidos u órganos o para estimular el establecimiento de vasos colaterales o aumentar de otro modo la perfusión de un tejido u órgano con circulación inadecuada.

La ruta de señalización de Notch es un sistema para la comunicación célula a célula usado por una amplia variedad de eucariotas para muchos procesos biológicos, tales como diferenciación, proliferación y homeostasis (Artavanis-Tsakonas et al. (1999) Science 284: 770-776). La señalización de Notch también se ha implicado en el control del desarrollo vascular (Iso et al. (2003) Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23: 543-553).

El tipo delta (DI4) o ligando de tipo delta 4 (DII4) (en lo sucesivo en este documento, "DII4") es un miembro de la

35 familia Delta de ligandos de Notch que muestra una expresión altamente selectiva por el endotelio vascular (Shutter et al. (2000) Genes Dev. 14: 1313-1318). El DII4 es un ligando para receptores Notch, incluyendo Notch1 y Notch4. Las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos para Dll4 humano y de ratón se muestran respectivamente en las SEC ID Nº: 1-2 y SEC ID Nº: 3-4. Se han generado ratones DII4 con modificación génica dirigida (véase, por ejemplo, Duarte et al. (2004) Genes Dev. 18: 2474 -2478; Krebs et al. (2004) Genes Dev. 18: 2469 -2473: Gale et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101: 15949-15954). Estos estudios mostraron que Dll4 estaba altamente expresado en vasos sanguíneos en desarrollo en el embrión de ratón y que la deleción genética de incluso un único alelo de Dll4 dio como resultado mortalidad embrionaria asociada con anormalidades vasculares marcadas.

El documento US 2006/134121 desvela antagonistas, ensayos y métodos terapéuticos de Dll4. El documento US

45 2006/030529 desvela el uso de inhibidores de VEGF para el tratamiento de trastornos del ojo. El documento WO 2007/028110 desvela métodos para usar e identificar moduladores de tipo delta 4. El documento WO 2007/143689 desvela composiciones y métodos para modular el desarrollo vascular.

Breve resumen de la invención

La presente invención se refiere al tratamiento de enfermedades que afectan al sistema cardiovascular con agentes capaces de bloquear la interacción de Dll4 con sus receptores ("antagonistas de Dll4"). Los resultados experimentales proporcionados en este documento respaldan el uso de antagonistas de Dll4 para tratar enfermedades caracterizadas por la neovascularización patológica y la insuficiencia vascular, donde la insuficiencia

55 vascular se debe a la pérdida de vasos sanguíneos o cambios vasculares funcionales que dan como resultado perfusión tisular insuficiente. Los antagonistas de Dll4 son particularmente útiles para tratar trastornos vasculares del ojo, por ejemplo, retinopatía diabética, retinopatía de prematuridad y otras enfermedades oculares caracterizadas por angiogénesis patológica y/o isquemia retiniana, tales como oclusión de vena o arteria retiniana.

La invención proporciona el uso de un antagonista de ligando de tipo delta 4 (Dll4) en la fabricación de un medicamento para prevenir o reducir la pérdida de vasos sanguíneos o para promover la angiogénesis productiva, o ambos, en un sujeto que tiene una lesión isquémica o insuficiencia vascular en el que el antagonista de Dll4 comprende un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une específicamente a Dll4 y bloquea la unión de Dll4 a un receptor Notch o que comprende el dominio extracelular de Dll4, conectado opcionalmente a un 65 componente multimerizante. La invención también proporciona un antagonista de ligando de tipo delta 4 (Dll4) para el uso en la prevención o reducción de la pérdida de vasos sanguíneos o promoción de angiogénesis productiva, o

ambas, en un sujeto que tiene una lesión isquémica o insuficiencia vascular, en el que el antagonista de Dll4 comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a Dll4 y bloquea la unión de Dll4 a un receptor Notch o que comprende el dominio extracelular de Dll4, conectado opcionalmente a un componente multimerizante.

5 Se demuestra que la inhibición farmacológica de Dll4 ejerce varios efectos beneficiosos en un modelo de retinopatía isquémica, que incluyen atenuación de la pérdida de vasos sanguíneos cuando se aplica en el momento de una lesión que conduce a pérdida de vasos sanguíneos y supresión del desarrollo de cambios patológicos en la vasculatura mientras que se aumenta la regeneración de vasos sanguíneos funcionales más normales cuando se aplica después del establecimiento de la isquemia.

Se espera que los agentes farmacológicos que inhiben la señalización de Dll4 sean similarmente beneficiosos al tratar otras formas de lesión isquémica, que incluyen isquemia cerebral, isquemia cardiaca y afecciones isquémicas que afectan a las extremidades y otros órganos o tejidos corporales. También se espera que los inhibidores de Dll4

15 sean clínicamente beneficiosos en otras afecciones que requieran el establecimiento o el re-establecimiento de un suministro vascular o que se beneficiarían de otro modo de la perfusión tisular aumentada. Son ejemplos de tales afecciones las malformaciones arteriovenosas, cicatrización, trasplante de órganos o tejidos e insuficiencia placentaria. Como se muestra en el trabajo experimental indicado más adelante, la inhibición de Dll4 previene el estrechamiento y la oclusión arterial, indicando que los inhibidores de Dll4 también serían eficaces en el tratamiento de hipertensión sistémica o pulmonar y trastornos relacionados.

Ahora se demuestra que los antagonistas de Dll4 son eficaces en la promoción de la angiogénesis productiva tanto en estados normales como en afecciones patológicas. Específicamente, se demuestra que el bloqueo de la señalización de Dll4-Notch mejora la brotación angiogénica y la proliferación de células endoteliales vasculares en la

25 vasculatura retiniana en desarrollo y suprime la formación de neovascularización ectópica patológica y el desarrollo de derivaciones arteriovenosas en favor de formación de vasos más apropiada en la retina isquémica. Además, se demuestra que la aplicación de bloqueantes de Dll4 en el momento de la lesión vascular reduce marcadamente la pérdida posterior de vasos sanguíneos. Estos hallazgos respaldan el uso de un antagonista de Dll4 en el tratamiento de enfermedades del ojo caracterizadas por anormalidades vasculares, especialmente cuando están acompañadas de isquemia y pérdida de vasos normales. Los ejemplos de tales enfermedades del ojo incluyen retinopatías isquémicas, tales como degeneración macular relacionada con la edad, oclusión de la vena retiniana central u oclusión de rama de vena retiniana, retinopatía diabética y retinopatía de prematuridad.

En este documento se describe también un procedimiento de tratamiento de un trastorno o una enfermedad del ojo

35 caracterizada por anormalidades vasculares, que comprende administrar un antagonista de Dll4 a un sujeto que lo necesite. El método promueve el crecimiento de vasos normales funcionales, inhibe el crecimiento de vasos anormales o alterados y previene la regresión patológica de vasos sanguíneos.

En una realización, el antagonista de Dll4 es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a Dll4 y que bloquea la unión de Dll4 a un receptor Notch (por ejemplo, receptores Notch1 y Notch4). En otra realización, el antagonista de Dll4 es una proteína o un fragmento proteico que comprende el dominio extracelular de Dll4 o un fragmento del mismo, que, en realizaciones específicas, puede estar fusionado a un componente multimerizante y que se une a los receptores Notch sin activar los mismos, bloqueando de este modo las acciones de Dll4 endógeno.

45 El trastorno o la enfermedad del ojo tratada mediante el método es un trastorno de la vasculatura ocular caracterizado por la presencia de vasos anormales y/o pérdida de vasos normales o de la función normal de los vasos. En realizaciones específicas, la afección o el trastorno tratado incluye retinopatía de prematuridad, retinopatía isquemia, oclusión de vena o arteria retiniana, retinopatía diabética, neovascularización coroidea, degeneración macular relacionada con la edad, neovascularización corneal, glaucoma neovascular o trasplante corneal.

El anticuerpo o el fragmento de anticuerpo usado en el método puede ser policlonal o monoclonal y puede estar humanizado, ser quimérico o ser completamente humano. Preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo monoclonal completamente humano. El fragmento de anticuerpo puede ser

55 un anticuerpo de cadena sencilla, ScFv, un Fab o un F(ab')2.

Cuando el antagonista de DII4 es una proteína o un fragmento proteico, el fragmento es preferentemente el dominio extracelular de Dll4 o un fragmento o fragmento modificado del mismo y puede estar fusionado a un componente multimerizante. El componente multimerizante es preferentemente un dominio de inmunoglobulina, tal como, por ejemplo, un dominio Fc, por ejemplo, un Fc humano (SEC ID Nº: 5). La proteína puede comprender opcionalmente una secuencia señal que puede ser nativa de la célula, recombinante o sintética.

En un aspecto más amplio, el método es útil para tratar cualquier enfermedad o afección isquémica causada por un suministro de sangre insuficiente debido a pérdida de vasos sanguíneos y/o mala perfusión, por ejemplo, lesión

65 isquémica, isquemia cerebral, isquemia cardiaca, afecciones isquémicas que afectan a las extremidades u otros órganos o tejidos, malformaciones arteriovenosas, cicatrización, trasplante de órganos o tejidos, insuficiencia placentaria, estrechamiento y oclusión arterial, ateroesclerosis e hipertensión sistémica o pulmonar.

En este documento se describe también el uso de un agente capaz de inhibir la actividad de Dll4 en la fabricación de un medicamento para tratar, inhibir o mitigar un trastorno isquémico o vascular, en el que el antagonista de Dll4 es

5 un anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de bloquear la unión de Dll4 a un receptor Notch o un fragmento de Dll4 conectado opcionalmente a un componente multimerizante (tal como un dominio Fc). En una realización, el trastorno isquémico o vascular es una enfermedad o afección del ojo caracterizada por la presencia de vasos sanguíneos anormales y/o pérdida de vasos sanguíneos normales o de función vascular. La enfermedad del ojo es retinopatía de prematuridad, retinopatía isquémica, oclusión de vena o arteria retiniana, retinopatía diabética, neovascularización coroidea, degeneración macular relacionada con la edad, neovascularización corneal, glaucoma neovascular o trasplante corneal.

En otra realización, el trastorno isquémico o vascular es lesión isquémica, isquemia cerebral, isquemia cardiaca, afecciones isquémicas que afectan a las extremidades u otros órganos o tejidos, malformaciones arteriovenosas,

15 cicatrización, trasplante de órganos o tejidos, insuficiencia placentaria, estrechamiento y oclusión arterial, ateroesclerosis o hipertensión sistémica o pulmonar.

Otros objetos y ventajas serán evidentes a partir de una revisión de la siguiente descripción detallada.

Breve resumen de las figuras

Figura 1. La deleción genética de un único alelo de Dll4 aumentó los números de brotes angiogénicos en la vasculatura retiniana en desarrollo. El número de brotes se cuantificó en campos de microscopía 100X. Los resultados fueron significativamente diferentes en el nivel p<0,00001.

25 Figura 2. El suministro intraocular de Dll4-Fc aumentó los números de células positivas a BrdU en proliferación en la vasculatura retiniana en desarrollo. Se inyectaron 4,15 µm de mDll4-hFc o 5 µm de proteína de control hFc humana por vía intravítrea en crías de ratón de 7 días de edad. La vasculatura retiniana se analizó 24 horas después. El número de células positivas a BrdU se cuantificó en campos de microscopía 200X. Los resultados fueron significativamente diferentes en el nivel p<0,05.

Figura 3A-B. El suministro intraocular de Dll4-Fc o anticuerpo anti-Dll4 promueve la regeneración de vasos retinianos en ratones con retinopatía isquémica inducida por oxígeno (OIR). (A) Se inyectaron 0,48 µm de mDll4-hFc o 0,5 µm de proteína de control hFc humana por vía intravítrea en crías con OIR de 13 días de edad (día postnatal 13 o P13). 35 La vasculatura retiniana se analizó en P17. (B) Se inyectaron 2,55 µm de anticuerpo policlonal de conejo anti-mDll4

o 5 µm de proteína de control hFc humana por vía intravítrea en P13. La vasculatura retiniana se analizó en P17. Se midieron las áreas avasculares en preparaciones retinianas en plano. Los resultados fueron significativamente diferentes en los niveles p<0,0001 (A) y p<0,05 (B).

Figura 4A-B. El suministro intraocular de Dll4-Fc o anticuerpo anti-Dll4 mitiga la formación de neovascularización patológica en OIR. (A) Se inyectaron 0,48 µm de mDll4-hFc o 0,5 µm de proteína de control hFc humana por vía intravítrea en P13. La vasculatura retiniana se analizó en P17. (B) Se inyectaron 2,55 µm de anticuerpo policlonal de conejo anti-mDll4 o 5 µm de proteína de control hFc humana por vía intravítrea en P13. La vasculatura retiniana se analizó en P17. Se midieron las áreas vasculares anormales (áreas que contenían "penachos" vasculares ectópicos)

45 en preparaciones retinianas en plano. Los resultados fueron significativamente diferentes en los niveles p<0,0001 (A) y p<0,05 (B).

Figura 5. El suministro intraocular de Dll4-Fc mejora la perfusión retiniana. Se inyectaron 0,48 µm de mDll4-hFc o 0,5 µm de proteína de control hFc humana por vía intravítrea en P13. En P17, los animales se perfundieron con lectina de tomate marcada con Rojo Texas y la vasculatura retiniana se analizó en P17. Se midieron las áreas vasculares no perfundidas en preparaciones retinianas en plano. Los resultados fueron significativos en el nivel p<0,0005.

Figura 6A-B. El suministro intraocular de Dll4-Fc o anticuerpo anti-Dll4 reduce la hipoxia/isquemia retiniana. (A) Se inyectaron 4,1 µm de hDII4-hFc o 5 µm de proteína de control hFc humana por vía intravítrea en P12. Se inyectó

55 Hypoxyprobe™-1 por vía intraperitoneal una hora antes de eutanasiar a los animales. La vasculatura retiniana se analizó en P17. Se midieron las áreas marcadas con Hypoxyprobe en preparaciones retinianas en plano. (B) Se inyectaron 2,55 µm de anticuerpo policlonal de conejo anti-mDll4 o 5 µm de proteína de control hFc humana por vía intravítrea en P13. Se inyectó Hypoxyprobe™-1 por vía intraperitoneal una hora antes de eutanasiar a los animales. La vasculatura retiniana se analizó en P17. Se midieron las áreas marcadas con Hypoxyprobe en preparaciones retinianas en plano. Los resultados fueron significativamente diferentes en los niveles p<0,001 (A) y p<0,05 (B).

Figura 7. La deleción genética de un único alelo de Dll4 reduce la pérdida de vasos sanguíneos inducida por exposición a hiperoxia. Se pusieron ratones Dll4+/lacZ y de control de tipo silvestre (WT) de la misma camada en la cámara de oxígeno al 75% en P7. La vasculatura retiniana se analizó en preparaciones en plano en P12. Los

65 resultados fueron significativamente diferentes en los niveles p<0,05.

Figura 8A-B. El suministro intraocular de DII4-Fc o anticuerpo anti-DII4 reduce o previene la pérdida de vasos sanguíneos inducida por exposición a hiperoxia. (A) Se inyectaron 4,1 µm de hDll4-hFc o 5 µm de proteína de control hFc humana por vía intravítrea en P8. Las crías se pusieron en un entorno de oxígeno al 75% en P9. La vasculatura de las retinas se analizó en P10. (B) Se inyectaron 2,55 µm de anticuerpo policlonal de conejo anti-mDll4

5 o 5 µm de proteína de control hFc humana por vía intravítrea en P8. Las crías se pusieron en un entorno de oxígeno al 75% en P9. La vasculatura retiniana se analizó en P10. Los resultados fueron significativamente diferentes en los niveles p<0,00001 (A) y p<0,0001 (B).

Figura 9A-B. El suministro intraocular de DII4-Fc o anticuerpo anti-DII4 reduce la oclusión de vasos retinianos. (A) Se inyectaron 4,1 µm de hDII4-hFc o 5 µm de proteína de control hFc humana por vía intravítrea en P8. Las crías se pusieron en un entorno de oxígeno al 75% en P9. Las crías se perfundieron con lectina fluorescente y la vasculatura retiniana se analizó en P10. (B) Se inyectaron 2,55 µm de anticuerpo policlonal de conejo anti-mDll4 o 5 µm de proteína de control hFc humana por vía intravítrea en P8. Las crías se pusieron en un entorno de oxígeno al 75% en P9. Las crías se perfundieron con lectina fluorescente y se analizó la vasculatura retiniana en P10. Los resultados

15 fueron significativamente diferentes en los niveles p<0,00001 (A) y p<0,0001 (B).

Figura 10. El suministro sistémico de DII4-Fc reduce o previene la pérdida de vasos sanguíneos retinianos. Se inyectaron 4,1 µm de hDII4-hFc o 5 µm de proteína de control hFc humana por vía intravítrea (ITV) o se inyectó hDII4-hFc por vía intraperitoneal a una dosis de 25 mg por kg de peso corporal en P7. Las crías se pusieron en un entorno de oxígeno al 75% en P8. La vasculatura retiniana se analizó en P9. Los resultados fueron significativamente diferentes en el nivel p<0,0001.

Descripción detallada

25 Antes de que se describan los presentes métodos, ha de entenderse que esta invención no está limitada a métodos particulares y las condiciones experimentales descritas, ya que tales métodos y condiciones pueden variar. También ha de entenderse que la terminología usada en este documento es con el fin de describir solamente realizaciones particulares y no debe entenderse como limitante, ya que el alcance de la presente invención se limitará solamente por las reivindicaciones adjuntas.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado como un experto habitual en la materia, a la que pertenece esta invención, comprende comúnmente. Aunque se puede usar cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en este documento en la puesta en práctica o el ensayo de la presente invención, ahora se describen los métodos y materiales preferentes.

Definiciones

Con la expresión "antagonista de Dll4" se quiere decir un agente capaz de inhibir la actividad biológica de Dll4 bloqueando la interacción de Dll4 con sus receptores. La inhibición de la actividad de Dll4 puede ser a través de inhibición de la activación de receptor con un anticuerpo para Dll4 o con un análogo o fragmento de Dll4 que se una, pero que no active el receptor (unión no productiva). Los inhibidores comunes incluyen, pero sin limitación, anticuerpos, receptores solubles, aptámeros de oligonucleótido, péptidos u otros antagonistas de molécula pequeña y sus derivados y ligandos de Dll4 modificados que se unen a su receptor Notch pero que son incapaces de activar la señalización a través de tal unión. Otras estrategias incluyen la interferencia con la expresión del gen que codifica

45 Dll4 o el bloqueo de la activación del receptor Notch, por ejemplo, con ARNip o con inhibidores de gamma secretasa, respectivamente.

Un anticuerpo "neutralizante" o "bloqueante" tiene por objeto referirse a un anticuerpo cuya unión a Dll4 da como resultado la inhibición de la actividad biológica de Dll4. Esta inhibición de la actividad biológica de Dll4 puede evaluarse midiendo uno o más indicadores de la actividad biológica de Dll4. Estos indicadores de la actividad biológica de Dll4 pueden evaluarse por uno o más de varios ensayos convencionales in vitro o in vivo conocidos en la técnica (véase ejemplos a continuación). Preferentemente, la capacidad de un anticuerpo de neutralizar la actividad de Dll4 se evalúa mediante inhibición de la unión de Dll4 a un receptor Notch, tal como Notch1 y Notch4.

55 Descripción general

Las rutas de señalización de Notch están conservadas evolutivamente y desempeñan papeles clave en la determinación del destino celular y la diferenciación en muchos tejidos durante el desarrollo embrionario y posnatal. Los componentes principales de la ruta de Notch se expresan en la vasculatura y la deleción genética de ciertos componentes de la ruta de Notch incluyendo Notch1, Notch1/Notch4, Jagged1, DII1, DII4, Hey1/Hey2 o presenilinas, da como resultado mortalidad embrionaria asociada con defectos de remodelado vascular. Aunque la mayoría de estos genes se expresan en múltiples tipos tisulares y celulares, Dll4 está restringido en gran medida al endotelio vascular, sugiriendo que Dll4 es un ligando clave para los receptores Notch en la vasculatura.

65 Durante el desarrollo embrionario temprano, la deleción genética de incluso un único alelo de Dll4 produce anormalidades vasculares graves que dan como resultado mortalidad embrionaria en la mayoría de las cepas de ratón. De hecho, entre los muchos genes implicados en la vasculogénesis y la angiogénesis, se ha descrito que la insuficiencia haploide da como resultado graves defectos vasculares y mortalidad embrionaria solamente para Dll4 y VEGF-A. La mortalidad embrionaria temprana impide la mayoría de las manipulaciones experimentales, haciendo difícil comprender precisamente el papel de Dll4 durante el desarrollo vascular y en situaciones patológicas.

5 Para superar esta limitación se estudiaron los efectos de la deleción del gen de Dll4 en ratones de la cepa ICR, en la que la insuficiencia haploide produce solo mortalidad embrionaria limitada. El fenotipo vascular observado en estos ratones mutantes se comparó con el obtenido en ratones de tipo silvestre en los que la señalización de Dll4/Notch estaba inhibida selectivamente por inyección intravítrea de un inhibidor soluble de Dll4, Dll4-Fc o un anticuerpo policlonal neutralizante contra el dominio extracelular de Dll4. Para estos experimentos se seleccionó la retina como un sistema de modelo en el que estudiar la biología de Dll4, debido a que la vasculatura retiniana se desarrolla postnatalmente de una manera estereotípica que está altamente organizada, temporal y espacialmente.

El modelo murino de retinopatía isquémica inducida por oxígeno (OIR) es un modelo bastante caracterizado de

15 neovascularización patológica asociada con expresión elevada del factor pro-angiogénico esencial, VEGF (Smith et al. 1994 Invest Ophthalmol Vis Sci 35: 101-111; Neely et al. 1998 Am J. Pathol 153: 665-670; Saint-Geniez et al. 2004 Int J Dev Biol 48: 1045-1058) y, por tanto, pertinente para la angiogénesis patológica asociada con diversas afecciones patológicas (Ferrarra et al. 2005 Nature 438: 967-974). Finalmente, la vasculatura retiniana es fácilmente accesible para manipulaciones experimentales, que incluyen microinyecciones intravítreas de agentes experimentales.

Los experimentos descritos a continuación muestran que durante el desarrollo vascular retiniano normal y en el modelo de OIR, la supresión farmacológica de la señalización de Dll4/Notch aumenta marcadamente la brotación angiogénica y promueve la formación de una red capilar primaria más densa. De modo coherente con esto, se halló

25 que la expresión de Dll4 endógeno es particularmente destacada en las regiones más activas del crecimiento vascular tanto durante el desarrollo normal como en el modelo de OIR. Además, la inhibición de Dll4 suprimió marcadamente la formación de la vasculatura anormal y evitó la oclusión y regresión de vasos sanguíneos.

Antagonistas de DII4

Los antagonistas de DII4 incluyen anticuerpos para Dll4 y fragmentos de los mismos capaces de bloquear la unión de Dll4 a un receptor Notch, por ejemplo, Notch1, y proteínas o fragmentos proteicos que comprenden el dominio extracelular de Dll4 que se pueden fusionar a un componente multimerizante; péptidos y pepticuerpos (véase, por ejemplo, la publicación de patente de Estados Unidos 2003/0229023 Oliner et al.).

35 Anticuerpos de DII4. La expresión "inmunoglobulina o anticuerpo" como se usa en este documento se refiere a un polipéptido o una proteína de mamífero, incluyendo de ser humano, que comprende una región marco conservada de un gen de inmunoglobulina o fragmentos del mismo que se une específicamente a y que reconoce un anticuerpo que, en el caso de la presente invención, es una proteína de Dll4 o una porción de la misma. Si el anticuerpo o la proteína de tipo anticuerpo pretendida se usará como un producto terapéutico de mamífero, las regiones de unión a inmunoglobulinas deben obtenerse de las correspondientes inmunoglobulinas de mamífero. Si la molécula tiene por objeto el uso no terapéutico, tal como para diagnóstico y ELISA, las regiones de unión a inmunoglobulina pueden obtenerse de mamíferos humanos o no humanos, tales como ratones. Los genes o fragmentos génicos de inmunoglobulina humana incluyen las regiones constantes kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mi (µ) así

45 como la miríada de genes de región variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mi, alfa, delta o épsilon que, a su vez, definen las clases de inmunoglobulina IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Dentro de cada clase de IgG existen diferentes isotipos (por ejemplo, IgG1, lgG2, etc.) así como alotipos de los mismos.

Una unidad estructural de inmunoglobulina (anticuerpo) ilustrativa de IgG humana comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena ligera (aproximadamente 25 kD) y una cadena pesada (aproximadamente 50-70 kD). El extremo N de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100-110 o más aminoácidos responsables principalmente del reconocimiento de antígeno. Las expresiones "cadena ligera variable" (VL) y cadena pesada variable (VH) se refieren

55 a estas cadenas ligera y pesada respectivamente.

Los anticuerpos existen como inmunoglobulinas intactas o como varios fragmentos bastante caracterizados producidos por digestión con diversas peptidasas. Por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo por debajo de los enlaces disulfuro en la región bisagra para producir F(ab)'2, un dímero de Fab que por sí mismo es una cadena ligera unida a VH-CH por un enlace disulfuro. El F(ab)'2 puede reducirse en condiciones suaves para romper el enlace disulfuro en la región bisagra, convirtiendo de este modo el dímero de F(ab)'2 en un monómero de Fab'. El monómero de Fab' es esencialmente Fab con parte de la región bisagra. Aunque se describen diversos fragmentos de anticuerpo en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, el experto entenderá que tales fragmentos se pueden sintetizar de nuevo químicamente o usando metodología de ADN recombinante. Por tanto, el término

65 anticuerpo, como se usa en este documento, incluye también fragmentos de anticuerpo producidos mediante la modificación de anticuerpos enteros o los sintetizados de nuevo usando metodologías de ADN recombinante o generados mediante bibliotecas de presentación tales como fago, E. coli o bibliotecas de presentación en levadura (véase, por ejemplo, McCafferty et al. (1990) Nature 348: 552-554).

Análogos o fragmentos proteicos de DII4. El antagonista de DII4 puede ser un fragmento de Dll4 conectado

5 opcionalmente a un componente multimerizante. En realizaciones específicas, un fragmento de Dll4 puede fusionarse a un componente multimerizante tal como un dominio de inmunoglobulina, un dominio de inmunoglobulina truncado o una secuencia de aminoácidos entre 1 y aproximadamente 500 aminoácidos de longitud, que comprende opcionalmente al menos un resto de cisteína. En una realización preferente, el componente multimerizante es un dominio de inmunoglobulina, preferentemente un dominio Fc, por ejemplo, un Fc humano (SEC ID Nº: 5). La proteína o el fragmento proteico puede comprender opcionalmente una secuencia señal, que puede comprender cualquier secuencia conocida por un experto para dirigir la secreción de un polipéptido o una proteína de una célula, incluyendo secuencias naturales o sintéticas. Generalmente se pone una secuencia señal al comienzo o en el extremo amino de la proteína de fusión. Tal secuencia señal puede ser nativa de la célula, recombinante o sintética.

15 El dominio extracelular de Dll4 está compuesto de un dominio Delta/Serrate/Lag-2 (DSL) y ocho repeticiones en tándem de tipo factor de crecimiento epidérmico (EGF). Generalmente, los dominios de EGF se reconocen como aparecen aproximadamente en la posición 218-251 (dominio 1), 252-282 (dominio 2), 284-322 (dominio 3), 324-360 (dominio 4) y 362-400 (dominio 5), con el dominio de DSL aproximadamente en la posición 173-217 y el dominio N terminal aproximadamente en la posición 27-172 de hDII4 (SEC ID Nº: 2). En realizaciones específicas, el antagonista de Dll4 comprende aproximadamente los aminoácidos 27-172, 27-217, 218-400, 218-360, 218-322 o 218-282 de la SEC ID Nº: 2, fusionado opcionalmente a hFc (SEC ID Nº: 5).

Métodos de administración

25 La presente divulgación se refiere a métodos de tratamiento que comprenden administrar a un sujeto una cantidad eficaz de un agente descrito en este documento. En un aspecto preferente, el agente está sustancialmente purificado (por ejemplo, sustancialmente libre de sustancias que limitan su efecto o que producen efectos secundarios deseados). El sujeto es preferentemente un animal, por ejemplo, tal como una vaca, cerdo, caballo, pollo, gato, perro, etc. y preferentemente es un mamífero y mucho más preferentemente un ser humano. En una realización específica puede ser deseable administrar las composiciones farmacéuticas descritas en este documento localmente al área que necesita tratamiento; esto puede conseguirse, por ejemplo y no a modo de limitación, mediante infusión local durante cirugía, aplicación tópica, por ejemplo, a través de inyección, mediante un catéter o mediante un implante.

35 Los métodos descritos en este documento pueden llevarse a cabo ventajosamente mediante administración al área que necesita tratamiento mediante administración local, incluyendo administración intravítrea, intraocular, perocular, subconjuntival, yuxtaescleral, subtenoniana o tópica.

Terapias de combinación

En diversas realizaciones, el método descrito en este documento se consigue con un antagonista de Dll4, tal como un anticuerpo de Dll4, en combinación con uno o más compuestos o terapias o procedimientos médicos adicionales. Por ejemplo, los agentes terapéuticos adecuados para el uso en combinación, de forma alterna o simultánea,

45 incluyen proteínas de fusión capaces de unirse e inhibir la actividad del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (véase los documentos U.S. 7.070.959 y 7.087.411), agentes inmunosupresores tales como corticoesteroides, dexametasona, ciclosporina A, FK506 o agentes antimetabólicos (véase Barker, NH, et al., (2000) Clin Exp Opthal 28: 357-360). Otros agentes terapéuticos adecuados para el uso en combinación, de forma alterna o simultánea, con antagonistas de Dll4 pueden incluir agentes que pueden bloquear la actividad biológica de otros miembros de la familia de VEGF, tales como VEGF-C y VEGF-D.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se exponen a fin de proporcionar a los expertos habituales en la materia una divulgación y

55 descripción completas de cómo preparar y usar los métodos y las composiciones de la invención y no tienen por objeto limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención. Se han realizado intentos de garantizar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, mediciones de área, etc.), pero pueden existir algunos errores y desviaciones experimentales.

Ejemplo 1. Efecto de deleción genética de un único alelo de Dll4 en la brotación de vasos sanguíneos en la vasculatura retiniana en desarrollo.

Se llevó a cabo una investigación para determinar los efectos de la deficiencia genética parcial de Dll4 en la brotación de vasos sanguíneos durante la angiogénesis retiniana en desarrollo normal.

65 Animales. Se usó la tecnología Velocigene™ (Valenzuela et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21: 652-9; Patente de Estados Unidos 6.586.251) para sustituir toda la región codificante de Dll4 con el gen indicador de β-galactosidasa en células madre embrionarias de ratón de híbrido C57BL/6:129. Los machos quiméricos se cruzaron con hembras ICR. Se usaron para este estudio ratones Dll4+lacZ sometidos a retrocruzamiento durante 3 generaciones con ICR (87,5% de ICR).

5 Histoquímica e inmunotinción. Las crías de ratón se eutanasiaron humanamente en P7. Se enuclearon los ojos y se diseccionaron las retinas, se fijaron durante una noche con paraformaldehído al 4%, se tiñeron con lectina I de Griffonia simplicifolia (GS) marcada con FITC (Vector Laboratories, Burlingame, CA) y se montaron en plano. Se tomaron imágenes usando un microscopio Nikon (Melville, NY).

10 Cuantificaciones. Se realizaron mediciones usando el software Scion Image. Cada estado experimental se ensayó al menos por triplicado. Se usaron el ensayo t de Student y el análisis de varianza de dos vías para evaluar la significación estadística.

15 Resultados. El plexo periférico era mucho más denso en ratones DII4+lacZ que en cachorros de la misma camada de tipo silvestre. Las vistas de mayor aumento resaltaron que el plexo periférico más denso en las retinas de ratones

DII4+lacZ

consistía en capilares que eran mayores en diámetro, estaban más intensamente interconectados e hiperperfundidos, de tal manera que en algunas áreas los vasos se fundieron hasta formar un sincitio, y, además, había muchos más brotes en el frente de crecimiento (Figura 1); también se observaron filopodios en partes más

20 internas del plexo a una frecuencia superior a la normal. Los análisis cuantitativos mostraron que, en comparación con los controles de tipo silvestre, las retinas de ratones DII4+lacZ mostraron un aumento del 68% en el número de brotes en el frente de crecimiento de la vasculatura retiniana superficial (Figura 1) así como más de un aumento de factor dos en el número de las interconexiones capilares por área unitaria, dando como resultado un aumento significativo en el recubrimiento vascular. A pesar de los marcados cambios morfológicos, la inyección intravascular

25 de lectina fluorescinada llenó completamente el plexo vascular superficial en desarrollo, excepto los filopodios que se extendían desde las células guía tanto en ratones DII4+lacZ como en ratones de tipo silvestre, indicando que todos los componentes de la vasculatura en desarrollo tenían lúmenes y eran funcionales.

Ejemplo 2. Efecto de la inhibición de DII4/Notch con DII4-Fc o anticuerpo anti-DII4 en la vasculatura retiniana 30 en desarrollo.

Se llevó a cabo una investigación para determinar los efectos de la inhibición farmacológica de la señalización de Dll/Notch en la proliferación de células endoteliales y la brotación de vasos sanguíneos durante la angiogénesis retiniana en desarrollo normal.

35 Anticuerpos y reactivos. El DII4-Fc comprende el dominio extracelular de Dll4 de ratón o humano y la parte Fc de IgG humana. El Dll4-Fc se expresó en células CHO y se purificó por afinidad mediante cromatografía de proteína A. El anticuerpo anti-Dll4 se produjo mediante inmunización de conejos con mDll4-hFc recombinante. El antisuero se purificó parcialmente mediante cromatografía de proteína A antes del uso.

40 Animales. Se usaron ratones C57/BI6 (Taconic) para estudiar el efecto de DII4-Fc o anticuerpo de DII4 neutralizante sobre la vasculatura retiniana en desarrollo.

Microinyecciones intravítreas. Se realizaron microinyecciones intravítreas (30 -100 nl) de los compuestos en 45 investigación entre el ecuador y el limbo corneal usando un nanoinyector Drummond Scientific (BroPA) equipado con una aguja de vidrio.

Marcaje con BrdU. Las células en proliferación se marcaron mediante administración de BrdU (1 mg/kg i.p.) 20 h después de la inyección intravítrea de hFc o DII4-Fc. Se recogieron las retinas 4 horas más tarde y se tiñeron con 50 anti-BrdU (Dako North America, Inc., Carpinteria, CA) y anticuerpos de VE-Cadherina (BD PharMingen, San Diego, CA).

Resultados. Para estudiar el efecto de la deficiencia intra-retiniana local en la señalización de Dll4/Notch y no secundaria a una anormalidad sistémica no detectada se inyectó una versión soluble de DII4 (denominada DII4-Fc) 55 que se une a receptores Notch sin activar los mismos, bloqueando de este modo las acciones de Dll4 endógeno, o un anticuerpo policlonal neutralizante específico para el dominio extracelular de Dll4 en el cuerpo vítreo de los ratones de tipo silvestre. Tres días después de la administración intraocular de bloqueante de Dll4 los vasos retinianos mostraron cambios morfológicos que se parecían mucho a las anormalidades vasculares encontradas en ratones Dll4+/lacZ incluyendo una densidad de vasos sanguíneos y un calibre vascular espectacularmente

60 aumentados. Además, estos cambios morfológicos característicos tuvieron lugar rápidamente, siendo claramente evidentes en el intervalo de 24 horas.

El marcaje con BrdU también mostró un aumento en la proliferación de células endoteliales en el intervalo de 24 h del bloqueo de Dll4 (Figura 2). El aumento del 17% observado en la tasa de proliferación podría producir un aumento 65 de más del 50% en el número de células en el intervalo de tres a cuatro tiempos de duplicación.

Ejemplo 3. Efecto de DII4-Fc y anticuerpo anti-DII4 sobre la vascularización, perfusión y anormalidades vasculares retinianas en ratones con OIR.

Se llevó a cabo una investigación para determinar los efectos de Dll4-Fc y anticuerpo anti-Dll4 sobre el crecimiento 5 de vasos retinianos, formación de anormalidades vasculares y perfusión retiniana en retinopatía isquémica inducida por oxígeno (OIR).

Para determinar si la señalización de Dll4/Notch desempeña un papel en la angiogénesis patológica así como durante el desarrollo normal se utilizó el modelo de OIR. En el modelo de ORI, la exposición de crías de ratón a hiperoxia en P7 da como resultado una rápida obliteración de los capilares en la retina central. Después de la vuelta al aire ambiental en P12, la zona avascular se convierte en gravemente hipóxica, lo que, a su vez, causa una extensa neovascularización anormal, caracterizada por el crecimiento ectópico de vasos en el cuerpo vítreo ("penachos" vasculares epirretinianos) y la formación de derivaciones arteriovenosas anormales; las partes centrales de la retina permanecen en gran medida avasculares durante un prolongado periodo.

15 Animales y modelo de OIR. Se usaron ratones C57/BI6 (Taconic) para estudiar el efecto de DII4-Fc o anticuerpo de DII4 neutralizante sobre la neovascularización retiniana en OIR. Se produjo OIR siguiendo el método desarrollado por Smith et al. (Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1994, 35: 101-111). En resumen, las crías de ratón y sus madres se pusieron en un entorno de oxígeno al 75% desde los días postnatales (P) 7 a P12 y después se devolvieron al aire ambiental. La exposición a hiperoxia induce la vaso-obliteración rápida en la retina central. Cuando los ratones se devuelven al aire ambiental (P12), la pérdida de vasos de la retina central da como resultado hipoxia/isquemia grave que, a su vez, estimula los cambios vasculares patológicos descritos anteriormente.

Para marcar los vasos sanguíneos permeables se inyectaron 50 ml de lectina de Lycopersicon esculentum (LE)

25 marcada con rojo Texas (1 mg/ml; Vector Laboratories, CA) en el ventrículo cardiaco izquierdo y se dejó circular durante 5 min.

Resultados. La inhibición de DII4/Notch con DII4-Fc o anticuerpo anti-DII4 mitigó la neovascularización patológica (Fig. 3A-B), estimuló el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos (Fig. 4A-B) y mejoró la re-perfusión retiniana (Fig. 5).

El DII4-Fc o anticuerpo anti-DII4 o una proteína de control (hFc) se inyectó por vía intravítrea en P13, un día después de que los animales se hubiesen devuelto al aire ambiental, bastante después de que hubiese finalizado la vaso-obliteración. Cuando las retinas se evaluaron en P17, la administración de Dll4-Fc o anticuerpo anti-Dll4

35 suprimió espectacularmente el crecimiento ectópico de penachos neovasculares patológicos en el cuerpo vítreo (Figura 1) y también evitó la formación de derivaciones arteriovenosas anormales. Las áreas ocupadas por penachos neovasculares se redujo el 43% en las retinas tratadas con Dll4-Fc y el 85% en las retinas tratadas con anticuerpo anti-Dll4, ambas en comparación con retinas de control tratadas con hFc.

Además se observó que el DII4-Fc y anticuerpo anti-DII4 estimulan una brotación más extensa de nuevos vasos a partir de capilares y venas que bordean la zona avascular, dando como resultado una regeneración más rápida de vasos sanguíneos en la retina central donde la vasculatura se había agotado, reduciendo de este modo el área retiniana avascular (Fig. 4A-B). Las áreas avasculares se redujeron el 43% en las retinas tratadas con Dll4-Fc y el 63% en las retinas tratadas con anticuerpo anti-Dll4. Fue particularmente notable la regeneración capilar extensa

45 que surgía de las venas en la zona avascular de retinas tratadas con Dll4-Fc. Por tanto, la atenuación de la señalización de Dll4/Notch favoreció la extensión de nuevos brotes vasculares a lo largo de la superficie retiniana y redujo la formación de neovascularización epirretiniana, dando como resultado una reformación más rápida del plexo vascular superficial. Los nuevos vasos en formación eran funcionales y mostraron una reperfusión retiniana mejorada, como fue evidente por la reducción del 45% de las áreas no perfundidas en retinas tratadas con Dll4-Fc (Figura 5).

Ejemplo 4. Efecto de DII4-Fc y anticuerpo anti-DII4 sobre la hipoxia/isquemia retiniana en el modelo de OIR.

Se llevó a cabo una investigación para determinar los efectos de Dll4-Fc y anticuerpo anti-Dll4 sobre la 55 hipoxia/isquemia retiniana en el modelo de OIR de neovascularización patológica.

El crecimiento excesivo de vasos sanguíneos en ciertas circunstancias puede interferir con la circulación normal de la sangre y reducir la oxigenación tisular. Para ensayar si la inhibición de Dll4/Notch puede mejorar la oxigenación tisular se usó HYPOXYPROBE™-1 (Chemicon) en un ensayo no invasivo para detectar hipoxia tisular y para determinar el efecto del tratamiento de DII4-Fc sobre la hipoxia/isquemia retiniana. Se inyectó por vía intraperitoneal HYPOXYPROBE™-1 con 100 mg/kg una hora antes de recoger las retinas para la evaluación.

Resultados. El crecimiento de nuevos vasos funcionales después de la administración intravítrea de inhibidores de Dll4/Notch redujo efectivamente la hipoxia/isquemia tisular como es evidente por la reducción del 69% y del 30% de

65 las áreas positivas a hydroxyprobe en retinas tratadas con Dll4-Fc o anticuerpo anti-Dll4, respectivamente (Fig. 6A-B).

Ejemplo 5. La deleción genética de un único alelo de DII4 reduce la vaso-obliteración inducida por hiperoxia.

Se llevó a cabo una investigación para determinar los efectos de la deficiencia genética parcial de Dll4 sobre la regresión de vasos sanguíneos inducida por hiperoxia.

5 Animales. Se generaron ratones DII4+/lacZ sometidos a retrocruzamiento durante 3 generaciones para ICR (87,5% de ICR) como se ha descrito anteriormente. Debido a una mutación recesiva (rd/rd), la capa celular de fotorreceptores retinianos comienza a degenerarse en P12 en los ratones ICR. Por lo tanto, para obviar los potenciales efectos secundarios de la pérdida de fotorreceptores en la vasculatura retiniana, para evaluar estadios más tardíos del

10 desarrollo retiniano y para todos los experimentos de OIR, los ratones DII4+/lacZ (87,5% de ICR) se sometieron a retrocruzamiento hasta C57BL/6 para producir ratones Rd/rd que no muestran degeneración de fotorreceptores.

Las crías de ratones se pusieron en un entorno de oxígeno al 75% desde los días postnatales (P) 7 a P12. Las retinas se recogieron y se analizó la vasculatura retiniana en preparaciones en plano.

15 Resultados. La expresión reducida de Dll4 en la vasculatura retiniana de ratones Dll4+/lacZ previene parcialmente la pérdida de vasos sanguíneos retinianos inducida por hiperoxia (Figura 7). En el modelo de OIR, la exposición de crías de ratón a hiperoxia en P7 da como resultado una rápida oclusión y obliteración de capilares en la retina central. Para determinar si la inhibición de Dll4/Notch puede tener un efecto protector sobre los vasos sanguíneos se

20 analizó el efecto de la deficiencia genética parcial de Dll4 en ratones DII4+/lacZ en la vaso-obliteración inducida por hiperoxia. Al evaluar los animales en P12 (a fin de evaluar el alcance de la vaso-obliteración hiperóxica), se halló que la vaso-obliteración estaba reducida el 40% en ratones DII4+/lacZ en comparación con animales de control de la misma camada de tipo silvestre, sugiriendo que los inhibidores de Dll4 pueden proteger los vasos sanguíneos existentes de regresión.

Ejemplo 6. Efectos de Dll4-Fc y anticuerpo anti-Dll4 sobre la vaso-obliteración inducida por hiperoxia.

Se llevó a cabo una investigación para determinar los efectos de la inhibición de Dll4/Notch con Dll4-Fc y anticuerpo anti-Dll4 sobre la regresión de vasos sanguíneos inducida por hiperoxia.

30 Animales. Se usaron ratones C57/BI6 (Taconic) para estudiar el efecto de DII4-Fc o anticuerpo de DII4 neutralizante sobre la vaso-obliteración retiniana inducida por oxígeno. Se llevaron a cabo microinyecciones intravítreas de los compuestos en investigación el día postnatal 8. El día postnatal 9, las crías se pusieron en un entorno de oxígeno al 75%. Se recogieron las retinas 24 horas después y la vasculatura retiniana se analizó en preparaciones en plano.

35 Resultados. La inyección intravítrea de DII4-Fc o anticuerpo anti-DII4 redujo espectacularmente las áreas de vasculatura con obliteración el 97% y el 41%, respectivamente (Fig. 8A-B).

Ejemplo 7. Efectos de DII4-Fc y anticuerpo anti-DII4 sobre la oclusión de vasos sanguíneos inducida por 40 hiperoxia.

Se llevó a cabo una investigación para determinar los efectos de la inhibición de Dll4/Notch con Dll4-Fc y anticuerpo anti-Dll4 sobre la oclusión de vasos sanguíneos inducida por hiperoxia. Todos los procedimientos se realizaron como se ha descrito anteriormente.

45 El tratamiento con DII4-Fc y anticuerpo anti-DII4 redujo las áreas retinianas no perfundidas en el 40% y el 29%, respectivamente (Fig. 9A-B).

Ejemplo 8. Efectos de la administración sistémica de DII4-Fc sobre la regresión de vasos sanguíneos 50 inducida por hiperoxia.

Se llevó a cabo una investigación para determinar los efectos del tratamiento sistémico con Dll4-Fc sobre la regresión de vasos sanguíneos inducida por hiperoxia.

55 Se inyectaron 4,1 µm de hDII4-hFc o 5 µm de proteína de control hFc humana por vía intravítrea (ITV) o se inyectó hDII4-hFc por vía intraperitoneal a una dosis de 25 mg por kg del peso corporal en P7. Las crías se pusieron en un entorno de oxígeno al 75% en P8 y se analizó la vasculatura retiniana en P9. Todos los otros procedimientos se llevaron a cabo como se ha descrito anteriormente.

60 Resultados. La administración tanto local (intravítrea) como sistémica (intraperitoneal) de Dll4-Fc redujo las áreas de vasculatura con obliteración el 86% y el 56%, respectivamente, indicando que, independientemente de la vía de administración, los inhibidores de Dll4 pueden usarse de forma eficaz para proteger los vasos sanguíneos de regresión (Fig. 10).

65 LISTA DE SECUENCIAS

<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc 5 <120> Métodos terapéuticos para tratar trastornos vasculares del ojo con antagonistas de DLL4

<130> 3090A-WO

<140> A asignar 10 <141>

<150> 60/836.003

<151> 15 <160> 5

<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

<210> 1 20 <211> 2058

<212> ADN

<213> Homo sapien

<400> 1 25

<210> 2

<211> 685

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 2 <210> 3

<211> 3427

<212> ADN

<213> Homo sapien

<400> 3 <210> 4

<211> 686

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 4

<210> 5

<211> 227

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Claims

REIVINDICACIONES

1. Uso de un antagonista de ligando de tipo delta 4 (Dll4) en la fabricación de un medicamento para prevenir o reducir la pérdida de vasos sanguíneos o para promover la angiogénesis productiva, o ambos, en un sujeto que

5 tiene una lesión isquémica o insuficiencia vascular, en el que el antagonista de Dll4 comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a Dll4 y que bloquea la unión de Dll4 a un receptor Notch o que comprende el dominio extracelular de Dll4, conectado opcionalmente a un componente multimerizante.
2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de Dll4 es policlonal o 10 monoclonal.
3. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo está humanizado, es quimérico o es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo completamente humano.

15 4. Uso de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo de cadena sencilla, un Fab, o un F(ab')2.
5. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el componente multimerizante es un dominio Fc.

20 6. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la lesión isquémica o la insuficiencia vascular se selecciona entre retinopatía de prematuridad, retinopatía isquémica, oclusión de vena o arteria retiniana y retinopatía diabética.
7. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la lesión isquémica o la insuficiencia

25 vascular se selecciona entre isquemia cerebral, isquemia cardiaca, afecciones isquémicas que afectan a las extremidades y otros órganos o tejidos, malformaciones arteriovenosas, cicatrización, insuficiencia placentaria, estrechamiento y oclusión arterial, ateroesclerosis e hipertensión sistémica o pulmonar.
8. Un antagonista de ligando de tipo delta 4 (DII4) para el uso en la prevención o reducción de la pérdida de vasos

30 sanguíneos o la promoción de angiogénesis productiva, o ambas, en un sujeto que tiene una lesión isquémica o insuficiencia vascular, en el que el antagonista de Dll4 comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a Dll4 y que bloquea la unión de Dll4 a un receptor Notch o que comprende el dominio extracelular de Dll4, conectado opcionalmente a un componente multimerizante.

35 9. El antagonista de Dll4 para el uso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo de Dll4 es policlonal o monoclonal.
10. El antagonista de Dll4 para el uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el anticuerpo o fragmento de

anticuerpo está humanizado, es quimérico o es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo completamente humano. 40
11. El antagonista de Dll4 para el uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo de cadena sencilla, un Fab o un F(ab')2.
12. El antagonista de Dll4 para el uso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el componente multimerizante es 45 un dominio Fc.
13. El antagonista de Dll4 para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en el que la lesión isquémica o la insuficiencia vascular se selecciona entre retinopatía de prematuridad, retinopatía isquémica, oclusión de vena o arteria retiniana y retinopatía diabética.
14. El antagonista de Dll4 para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el que la lesión isquémica o la insuficiencia vascular se selecciona entre isquemia cerebral, isquemia cardiaca, afecciones isquémicas que afectan a las extremidades y otros órganos o tejidos, malformaciones arteriovenosas, cicatrización, insuficiencia placentaria, estrechamiento y oclusión arterial, ateroesclerosis e hipertensión sistémica o pulmonar.
15. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o el antagonista de Dll4 para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, en el que el sujeto tratado es un ser humano.