KR20090039823A

KR20090039823A - 혈관 안구 질환을 Ｄｌｌ4 길항제로 치료하는 치료방법

Info

Publication number: KR20090039823A
Application number: KR1020097004668A
Authority: KR
Inventors: 스탠리 제이. 위갠드; 니콜라스 제이. 파파도폴로스; 이반 베. 로보프
Original assignee: 리제너론 파아마슈티컬스, 인크.
Priority date: 2006-08-07
Filing date: 2007-08-07
Publication date: 2009-04-22
Also published as: CA2660235C; AU2007281916A1; CN101500605B; HRP20130271T1; HK1137339A1; IL196612A; ES2398253T3; TN2009000036A1; BRPI0716424A2; MY150092A; SG174033A1; EP2054082A2; NO341857B1; MA30667B1; RU2429876C2; BRPI0716424B1; ME00591A; WO2008019144A2; UA95304C2; PL2054082T3

Abstract

본 발명은, 허혈 또는 혈관 질환의 치료를 필요로 하는 대상에게 사람 델타-유사 리간드 4(Dll4) 활성을 억제할 수 있는 제제를 투여함으로써 상기 허혈 또는 혈관 질환을 치료하는 치료방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 당해 제제는 노치(Notch) 수용체에 대한 Dll4의 결합을 억제할 수 있는 항-Dll4 항체 또는 항체 단편이다. 한가지 양태에서, 허혈 또는 혈관 질환은 허혈성 손상, 뇌경색, 심장 허혈, 사지 및 다른 기관 또는 조직에 영향을 미치는 허혈 상태, 동정맥 기형, 창상 치유, 기관 또는 조직 이식, 태반 기능부전, 동맥 협착 및 폐색, 죽상경화증, 및 전신 또는 폐동맥 고혈압이다. 또 다른 양태에서, 치료되는 질환은 미숙아 망막병증, 허혈성 망막병증, 망막 정맥 또는 동맥 폐색, 당뇨 망막병증, 맥락막 신생혈관, 연령 관련 황반 변성, 각막 신생혈관, 신생혈관 녹내장 또는 각막 이식과 같은 안구 질환 또는 상태이다.

사람 델타-유사 리간드 4(Dll4), 허혈 질환, 혈관 질환, 안구 질환, Dll4 길항제, 노치(Notch) 수용체

Description

혈관 안구 질환을 Ｄｌｌ4 길항제로 치료하는 치료방법{Therapeutic methods for treating vascular eye disorders with Dll4 antagonists}

본 발명은 일반적으로 노치(Notch) 수용체와의 Dll4 상호작용 및/또는 노치 수용체 활성화를 억제하는 조성물을 투여함으로써 혈관 및 허혈 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 노치 수용체와의 Dll4 상호작용을 억제하는 조성물을 투여함으로써 안구 혈관 및/또는 허혈 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

혈관형성은 조직 및 기관의 정상 발생 및 성장에 요구되는 기초 과정이고, 기존 혈관으로부터의 새로운 혈관의 형성을 포함한다. 혈관형성 및 혈관 항상성은 혈관형성 조정자의 고도 조절된 시스템을 통해 엄격하게 제어된다. 이러한 엄격한 제어로부터의 일탈은 질병을 유도하거나 질병과 관련된다.

조절되지 않은 "과다" 또는 이상 혈관형성은 다수의 질환 상태의 특징이지만, 불충분한 혈관형성, 혈관의 상실 또는 기능적 또는 구조적 혈관 폐쇄도 또한 심각한 의학적 문제가 될 수 있다. 혈관형성을 촉진하고/하거나 기존 혈관의 퇴행 을 방지하는 것은, 조직이 허혈성으로 되는 상태, 예를 들면, 망막, 뇌, 심혈관 및 사지 허혈에서, 및 혈관 공급이 확립, 재확립, 향상 또는 신장되어야 하는 상태, 예를 들면, 창상 치유 및 조직 또는 기관 이식후, 또는 곁맥관의 확립을 자극하거나 또는 부적절한 순환에 의한 조직 또는 기관의 관류를 증가시키는데 바람직하다.

노치-신호 경로는 다수의 생물학적 과정, 예를 들면, 분화, 증식 및 항상성을 위해 다양한 진핵세포에 의해 사용되는 세포 대 세포 신호전달 시스템이다[참조: Artavanis-Tsakonas et al. (1999) Science 284:770-776]. 노치 신호는 또한 혈관 발생의 조절에 관련되어 있다[참조: Iso et al. (2003) Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23:543-553].

델타-유사 4(Dl4) 또는 델타-유사 리간드 4(Dll4)(이하 "Dll4"라 한다)는 혈관 내피에 의한 고도의 선택적 발현을 나타내는 노치 리간드의 델타 부류의 구성원이다[참조: Shutter et al. (2000) Genes Dev. 14:1313-1318]. Dll4는 노치 수용체에 대한 리간드이고, 노치 수용체에는 노치 1 및 노치 4가 포함된다. 사람 및 마우스 Dll4의 핵산 및 아미노산 서열은 각각 서열번호 1 내지 2 및 서열번호 3 내지 4에 제시되어 있다. 유전자 표적화된 Dll4 마우스는 생산되었다[참조: Duarte et al. (2004) Genes Dev. 18:2474-2478; Krebs et al. (2004) Genes Dev. 18:2469-2473: Gale et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101: 15949-5954]. 이들 연구는, Dll4가 마우스 배아에서 발생하는 혈관에서 고도로 발현되었고, 단일 Dll4 대립유전자의 유전자 결실이 표지된 혈관 이상과 관련된 배아 치사를 초래하였음을 나타내었다.

발명의 개요

본 발명은 Dll4와 이의 수용체와의 상호작용을 차단할 수 있는 제제("Dll4 길항제")를 사용하여, 심혈관계에 영향을 미치는 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본원에 제공된 실험 결과는 병리학적 신생혈관 및 혈관 기능부족을 특징으로 하는 질환을 치료하는 Dll4 길항제의 용도를 뒷받침하며, 여기서 혈관 기능부족은 불충분한 조직 관류를 초래하는 혈관의 상실 또는 기능적 혈관 변화에 기인한다. Dll4 길항제는 특히 안구의 혈관 질환, 예를 들면, 당뇨 망막병증, 미숙아 망막병증 및 병리학적 혈관형성 및/또는 망막 허혈을 특징으로 하는 다른 안과 질환, 예를 들면, 망막 정맥 또는 동맥 폐색의 치료에 특히 유용하다.

Dll4의 약리학적 억제는, 허혈의 확립 후에 적용할 때에, 보다 정상적인 기능적 혈관의 재생을 향상시키면서, 혈관 상실을 유도하는 손상시에 적용할 때의 혈관 상실의 감쇠 및 혈관계에서 병리학적 변화 발생의 억제를 포함하는, 허혈성 망막병증의 모델에서 몇몇 유리한 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다.

Dll4 신호를 억제하는 약제는, 뇌 허혈, 심장 허혈 및 사지 및 기타 신체 기관 또는 조직에 영향을 미치는 허혈 상태를 포함하는 허혈성 손상의 다른 형태를 치료하는데 있어서 유사하게 유익할 것으로 예상된다. Dll4 억제제는 또한 혈관 공급의 확립 또는 재확립을 필요로 하는 다른 상태에서 임상적으로 유익할 것으로 예상되고, 또는 조직 관류의 향상이라는 점에서 유익할 것이다. 이러한 상태의 예는 동정맥 기형, 창상 치유, 기관 또는 조직 이식 및 태반 기능부전이 있다. 하기 기재된 실험부에 제시된 바와 같이, Dll4 억제는 동맥 협착 및 폐색을 방지하고, 이는 Dll4 억제제가 또한 전신 또는 폐동맥 고혈압 및 관련 질환의 치료에 효과적일 수 있음을 나타낸다.

Dll4 길항제는 본 발명에 이르러 정상 및 병리학적 상태 둘 다에 있어서 생산적 혈관형성을 촉진하는데 효과적인 것으로 밝혀졌다. 구체적으로, Dll4 노치 신호를 차단하는 것은 망막 혈관계 발생에 있어서 혈관형성 발아(angiogenic sprouting) 및 혈관 내피 세포 증식을 향상시키고, 허혈성 망막에서 보다 적절한 혈관 형성을 위해 병리학적 이소성 신생혈관의 형성 및 동정맥 지름길의 발생을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 더욱이, 혈관 손상시에 Dll4 차단제의 적용은 혈관의 후속 상실을 현저히 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 이들 발견은, 특히 허혈 및 정상 혈관의 상실을 수반하는 경우, 혈관 이상을 특징으로 하는 안구 질환의 치료에 있어서 Dll4 길항제의 용도를 뒷받침한다. 이러한 안구 질환의 예에는 허혈성 망막병증, 예를 들면, 연련 관련 황반 변성, 망막 중심 정맥 폐색 또는 망막 동맥 분지 폐색, 당뇨 망막병증 및 미숙아 망막병증이 포함된다.

첫번째 양태에서, 본 발명은, 혈관 이상을 특징으로 하는 안구 질환 또는 질병의 치료를 필요로 하는 대상에게 Dll4 길항제를 투여함을 포함하는, 상기 질환 또는 질병의 치료방법을 특징으로 한다. 본 발명의 방법은 기능적 정상 혈관의 성장을 촉진하고, 이상 또는 발병 혈관의 성장을 억제하며, 혈관의 병리학적 퇴행을 방지한다.

한가지 양태에서, Dll4 길항제는 Dll4에 특이적으로 결합하고 노치 수용체 (예: 노치 1 및 노치 4 수용체)에 대한 Dll4 결합을 차단하는 항체 또는 항체 단편이다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 Dll4 길항제는 Dll4의 세포외 도메인 또는 이의 단편을 포함하는 단백질 또는 단백질 단편이고, 특정한 양태에서 이는 다량체화(multimerizing) 성분과 융합할 수 있고 이의 활성화 없이 노치 수용체에 결합하여 내인성 Dll4의 작용을 차단한다.

본 발명의 방법으로 치료되는 안구 질환 또는 질병은 이상 혈관의 존재 및/또는 정상 혈관 및 정상 혈관 기능의 상실을 특징으로 하는 안구 혈관계 질환이다. 특정한 양태에서, 치료되는 상태 또는 질환은 미숙아 망막병증, 허혈성 망막병증, 망막 정맥 또는 동맥 폐색, 당뇨 망막병증, 맥락막 신생혈관, 연련 관련 황반 변성, 각막 신생혈관, 신생혈관 녹내장 또는 각막 이식을 포함한다.

본 발명의 방법에 사용되는 항체 또는 항체 단편은 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 또는 항체 단편일 수 있고, 사람화된, 키메라 또는 완전 사람 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 바람직하게는 항체는 완전 사람 모노클로날 항체 또는 모노클로날 항체 단편이다. 항체 단편은 단일쇄 항체, ScFv, Fab 또는 F(ab')₂일 수 있다.

Dll4 길항제가 단백질 또는 단백질 단편인 경우, 이러한 단편은 바람직하게는 Dll4의 세포외 도메인 또는 이의 단편 또는 변형된 단편이고, 다량체화 성분과 융합될 수 있다. 다량체화 성분은 바람직하게는 면역글로불린 도메인, 예를 들면, Fc 도메인, 예를 들면, 사람 Fc(서열번호 5)이다. 단백질은 임의로 시그날 서열을 포함할 수 있고, 이는 세포 기원, 재조합체 또는 합성된 것일 수 있다.

보다 광범위한 양태에서, 본 발명의 방법은 혈관 상실 및/또는 불량한 관류에 기인하여 불충분한 혈액 공급에 의해 유발된 임의의 허혈 질환 또는 상태, 예를 들면, 허혈성 손상, 뇌경색, 심장 허혈, 사지 또는 다른 기관 또는 조직에 영향을 미치는 허혈 상태, 동정맥 기형, 창상 치유, 기관 또는 조직 이식, 태반 기능부전, 동맥 협착 및 폐색, 죽상경화증 및 전신 또는 폐동맥 고혈압을 치료하는데 유용하다.

두번째 양태에서, 본 발명은, 허혈 또는 혈관 질환을 치료, 억제 또는 완화하기 위한 약제의 제조에 있어서 Dll4 활성을 억제할 수 있는 제제의 용도로서, Dll4 길항제가, 노치 수용체에 대한 Dll4의 결합을 차단할 수 있는 항체 또는 항체 단편이거나, 다량체화 성분(예: Fc 도메인)에 임의로 결합된 Dll4 단편인 용도를 제공한다. 한가지 양태에서, 허혈 또는 혈관 질환은 이상 혈관의 존재 및/또는 정상 혈관 또는 혈관 기능의 상실을 특징으로 하는 안구 질환 또는 상태이다. 안구 질환은 미숙아 망막병증, 허혈성 망막병증, 망막 정맥 또는 동맥 폐색, 당뇨 망막병증, 맥락막 신생혈관, 연련 관련 황반 변성, 각막 신생혈관, 신생혈관 녹내장 또는 각막 이식이다.

또 다른 양태에서, 허혈 또는 혈관 질환은 허혈성 손상, 뇌경색, 심장 허혈, 사지 및 다른 기관 또는 조직에 영향을 미치는 허혈 상태, 동정맥 기형, 창상 치유, 기관 또는 조직 이식, 태반 기능부전, 동맥 협착 및 폐색, 죽상경화증 및 전신 또는 폐동맥 고혈압이다.

다른 목적 및 잇점은 상세한 설명을 고찰함으로써 명백해질 것이다.

도 1. 단일 Dll4 대립유전자의 유전자 결실은 망막 혈관계 발생에서 혈관형성 발아체(angiogenic sprout)의 수를 증가시켰다. 발아체 수는 100배 현미경 시야에서 정량화되었다. 결과는 p<0.00001 수준에서 유의적인 차이가 있었다.

도 2. Dll4-Fc의 안구내 전달은 망막 혈관계 발생에서 증식 BrdU-양성 세포 수를 증가시켰다. mDll4-hFc 4.15mcg 또는 사람 hFc 조절 단백질 5mcg를 7일령 마우스 새끼에게 유리체내에 주사하였다. 망막 혈관계를 24시간 후에 분석하였다. BrdU 양성 세포의 수는 200배 현미경 시야에서 정량화하였다. 결과는 p<0.05 수준에서 유의적인 차이가 있었다.

도 3A 및 3B. Dll4-Fc 또는 항-Dll4 항체의 안구내 전달은 산소-유도 허혈성 망막병증(OIR)을 갖는 마우스에서 망막 혈관의 재생을 촉진시킨다. (A) mDll4-hFc 0.48mcg 또는 사람 hFc 조절 단백질 0.5mcg를 13일령(출생후 13일 또는 P13) OIR 새끼에게 유리체내에 주사하였다. 망막 혈관계를 P17에서 분석하였다. (B) 래빗 폴리클로날 항-mDll4 항체 2.55mcg 또는 사람 hFc 조절 단백질 5mcg를 P13에서 유리체내에 주사하였다. 망막 혈관계를 P17에서 분석하였다. 무혈관 면적을 망막 플랫 마운트(retinal flat-mount)로 측정하였다. 결과는 p<0.0001(A) 및 p<0.05(B) 수준에서 유의적인 차이가 있었다.

도 4A 및 4B. Dll4-Fc 또는 항-Dll4 항체의 안구내 전달은 OIR에서 병리학적 신생혈관의 형성을 개선시킨다. (A) mDll4-hFc 0.48mcg 또는 사람 hFc 조절 단 백질 0.5mcg를 P13에서 유리체내에 주사하였다. 망막 혈관계를 P17에서 분석하였다. (B) 래빗 폴리클로날 항-mDll4 항체 2.55mcg 또는 사람 hFc 조절 단백질 5mcg를 P13에서 유리체내에 주사하였다. 망막 혈관계를 P17에서 분석하였다. 이상 혈관 면적(이소성 혈관 "속(tuft)"을 함유하는 면적)을 망막 플랫 마운트로 측정하였다. 결과는 p<0.0001(A) 및 p<0.05(B) 수준에서 유의적인 차이가 있었다.

도 5. Dll4-Fc의 안구내 전달은 망막 관류를 개선시킨다. mDll4-hFc 0.48mcg 또는 사람 hFc 조절 단백질 0.5mcg를 P13에서 유리체내에 주사하였다. P17에서 동물을 텍사스 레드(Texas Red)로 표지된 토마토 렉틴으로 관류시키고, 망막 혈관계를 P17에서 분석하였다. 비관류된 혈관계 면적을 망막 플랫 마운트로 측정하였다. 결과는 p<0.0005 수준에서 유의적이었다.

도 6A 및 6B. Dll4-Fc 또는 항-Dll4 항체의 안구내 전달은 망막 저산소증/허혈을 감소시킨다. (A) hDll4-hFc 4.1mcg 또는 사람 hFc 조절 단백질 5cmg를 P12에서 유리체내에 주사하였다. 하이폭시프로브(Hypoxyprobe)^TM-1을 동물 희생 1시간 전에 유리체내로 주사하였다. 망막 혈관계를 P17에서 분석하였다. 하이폭시프로브 표지된 면적을 망막 플랫 마운트로 측정하였다. (B) 래빗 폴리클로날 항-mDll4 항체 2.55mcg 또는 사람 hFc 조절 단백질 5mcg를 P13에서 유리체내에 주사하였다. 하이폭시프로브^TM-1을 동물 희생 1시간 전에 유리체내로 주사하였다. 망막 혈관계를 P17에서 분석하였다. 하이폭시프로브 표지된 면적을 망막 플랫 마운트로 측정하였다. 결과는 p<0.001(A) 및 p<0.05(B) 수준에서 유의적인 차이가 있었다.

표 7. 단일 Dll4 대립유전자의 유전자 결실은 저산소증에의 노출에 의해 유도된 혈관 상실을 감소시킨다. Dll4^+/ ^lacZ 및 동배(littermate) WT 대조군 마우스를 P7에서 75% 산소 챔버에 넣었다. 망막 혈관계를 P12에서 플랫 마운트로 분석하였다. 결과는 p<0.05 수준에서 유의적인 차이가 있었다.

도 8A 및 8B. Dll4-Fc 또는 항-Dll4 항체의 안구내 전달은 저산소증에의 노출에 의해 유도된 혈관 상실을 감소 또는 방지한다. (A) hDll4-hFc 4.1mcg 또는 사람 hFc 조절 단백질 5mcg를 P8에서 유리체내에 주사하였다. 새끼를 P9에서 75% 산소 환경에 넣었다. 망막 혈관계를 P10에서 분석하였다. (B) 래빗 폴리클로날 항-mDll4 항체 2.55mcg 또는 사람 hFc 조절 단백질 5mcg를 P8에서 유리체내에 주사하였다. 새끼를 P9에서 75% 산소 환경에 넣었다. 망막 혈관계를 P10에서 분석하였다. 결과는 p<0.00001(A) 및 p<0.0001(B) 수준에서 유의적인 차이가 있었다.

도 9A 및 9B. Dll4-hFc 또는 항-Dll4 항체의 안구내 전달은 망막 혈관 폐색을 감소시킨다. (A) hDll4-hFc 4.1mcg 또는 사람 hFc 조절 단백질 5mcg를 P8에서 유리체내에 주사하였다. 새끼를 P9에서 75% 산소 환경에 넣었다. 새깨를 형광 렉틴으로 관류시키고, 망막 혈관계를 P10에서 분석하였다. (B) 래빗 폴리클로날 항-mDll4 항체 2.55mcg 또는 사람 hFc 조절 단백질 5mcg를 P8에서 유리체내에 주사하였다. 새끼를 P9에서 75% 산소 환경에 넣었다. 새끼를 형광 렉틴으로 관류시키고, 망막 혈관계를 P10에서 분석하였다. 결과는 p<0.00001(A) 및 p<0.0001(B) 수준에서 유의적인 차이가 있었다.

도 10. Dll4-Fc의 전신(systemic) 전달은 망막 혈관 상실을 감소 또는 방지 한다. hDll4-hFc 4.1mcg 또는 사람 hFc 조절 단백질 5mcg를 유리체내(ITV) 주사하거나, hDll4-hFc를 P7에서 체중kg당 25mg의 용량으로 복강내 주사하였다. 새끼를 P8에서 75% 산소 환경에 넣었다. 망막 혈관계를 P9에서 분석하였다. 결과는 p<0.0001 수준에서 유의적인 차이가 있었다.

본 발명의 방법을 기재하기에 앞서, 본 발명은 기재된 특정한 방법 및 실험 조건으로 한정되지 않고 이러한 방법과 조건은 달라질 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 발명의 범위는 첨부된 청구의 범위에 의해서만 한정될 것이므로, 본원에 사용된 용어는 단지 특정한 양태를 기재하기 위한 것이고 한정하는 것으로 의도되지 않는다.

달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료를 본 발명의 실시 또는 시험에 사용할 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료를 아래에 기재한다.

정의

어구 "Dll4 길항제"란 Dll4와 이의 수용체와의 상호작용을 차단함으로써 Dll4 생물학적 활성을 억제할 수 있는 제제를 의미한다. Dll4 활성의 억제는, Dll4에 대한 항체, 또는 수용체에 결합하지만 이를 활성화하지 않는(비생산적 결합) Dll4 유사체 또는 단편을 사용한 수용체 활성화의 억제를 통해 이루어질 수 있다. 통상의 억제제에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 항체, 가용성 수용체, 올리고뉴클레오타이드 앱타머(aptamer), 펩타이드 또는 기타 소 분자 길항제 및 이들의 유도체, 및 이들의 노치 수용체에 결합하지만 이러한 결합을 통해 신호를 활성화할 수는 없는 변형 Dll4 리간드가 포함된다. 다른 방법은, 예를 들면, 각각 siRNA 또는 감마 세크레타제 억제제를 사용하여, Dll4를 암호화하는 유전자의 발현을 간섭하거나 노치 수용체 활성화를 차단하는 것을 포함한다.

"중화" 또는 "차단" 항체는 Dll4에 대한 이의 결합이 Dll4의 생물학적 활성의 억제를 초래하는 항체를 의미하는 것으로 의도된다. Dll4의 생물학적 활성의 이러한 억제는 Dll4 생물학적 활성의 하나 이상의 지시인자를 측정함으로써 평가할 수 있다. Dll4 생물학적 활성의 이들 지시인자는 당해 기술분야에 공지된 몇몇 표준 시험관내 또는 생체내 분석법 중의 하나 이상에 의해 평가할 수 있다(하기 실시예 참조). 바람직하게는, Dll4 활성을 중화하는 항체의 능력은 노치 수용체, 예를 들면, 노치 1 및 노치 4에 대한 Dll4 결합의 억제에 의해 평가한다.

개괄적인 설명

노치 신호 경로는 진화학적으로 보존되어 있고, 배아 및 출생후 발생 동안에 다수의 조직에서 세포-사멸 결정 및 분화에 중요한 역할을 담당한다. 노치 경로의 주성분은 혈관계에서 발현되고, 노치 1, 노치 1/노치 4, 재기드(Jagged) 1, Dll1, Dll4, Hey1/Hey2 또는 프레세닐린을 포함하는 특정한 노치 경로 성분의 유전자 결실은 혈관 재형성 결손과 관련된 배아 치사를 초래한다. 이들 유전자 대부분은 다수의 조직 및 세포 유형에서 발현되지만, Dll4는 대부분 혈관 내피로 한정되며, 이는 Dll4가 혈관계에서 노치 수용체에 대한 주요 리간드임을 시사한다.

초기 배아 발생 동안, 단일 Dll4 대립유전자의 유전자 결실은 대부분의 마우스 주(strain)에서 배아 치사를 초래하는 심각한 혈관 이상을 일으킨다. 실제로, 혈관형성 및 신생혈관과 관련된 다수의 유전자 중에서, 일배체 기능부전은 Dll4 및 VEGF-A에 대해서만 주요 혈관 결손 및 배아 치사를 초래하는 것으로 보고되었다. 초기 배아 치사는 대부분의 실험적 조작을 방해하여, 혈관 발생 동안 및 병리학적 환경에서 Dll4의 역할을 정확하게 이해하는 것을 어렵게 한다.

이러한 문제점을 극복하기 위해, Dll4 유전자 결실의 효과는, 일배체 기능부전이 제한된 배아 치사만을 일으키는 ICR주 마우스에서 연구되었다. 이들 돌연변이 마우스에서 관찰된 혈관 표현형을 야생형 마우스에서 수득된 것과 비교하였고, 여기서 Dll4/노치 신호는 Dll4의 가용성 억제제, Dll4-Fc, 또는 Dll4의 세포외 도메인에 대한 중화 폴리클로날 항체의 유리체내 주사에 의해 선택적으로 억제되었다. 이들 실험에 있어서, Dll4 생물학을 연구하기 위해 망막을 모델 시스템으로서 선택하였는데, 여기서 망막 혈관계는 고도로 조직화된 정형화된 방식으로 출생후에 시간적 및 공간적으로 발생하기 때문이다.

산소-유도 허혈성 망막병증(OIR)의 쥐 모델은 필수적인 혈관형성촉진 인자인 VEGF의 발현 증가와 관련된 병리학적 신생혈관의 우수한 특성화된 모델이고[참조: Smith et al. 1994 Invest Ophthalmol Vis Sci 35: 101-111; Neely et al. 1998 Am J. Pathol 153: 665-670; Saint-Geniez et al. 2004 Int J Dev Biol 48: 1045-1058], 따라서 다양한 질병 상태와 관련된 병리학적 혈관형성과 관련된다[참조: Ferrarra et al. 2005 Nature 438: 967-974]. 마지막으로, 망막 혈관계는 실험 제제의 유리체내 미세주사를 포함하는 실험 조작에 용이하게 이용할 수 있다.

하기에 기재된 실험은 정상 망막 혈관 발생 동안 및 OIR 모델에서 Dll4/노치 신호의 약리학적 억제가 혈관형성 발아를 현저히 향상시키고 보다 조밀한 1차 모세관 네트워크의 형성을 촉진함을 나타낸다. 이와 일치하게, 내인성 Dll4 발현은 정상 발생 동안 및 OIR 모델 둘 다에 있어서 혈관 성장이 가장 활발한 영역에서 특히 현저한 것으로 밝혀졌다. 더욱이, Dll4 억제는 이상 혈관계의 형성을 현저히 억제하였고, 혈관 폐쇄 및 퇴행을 방지하였다.

Dll4 길항제

Dll4 길항제는 노치 수용체(예: 노치 1)에 대한 Dll4의 결합을 차단할 수 있는 Dll4에 대한 항체 및 이의 단편; 다량체화 성분과 융합될 수 있는 Dll4의 세포외 도메인을 포함하는 단백질 또는 단백질 단편; 펩타이드 및 펩티바디(peptibody)를 포함한다[참조: 미국 특허공보 제2003/0229023호(Oliner et al)].

Dll4 항체. 본원에 사용된 어구 "면역글로불린 또는 항체"는, 항원(본 발명의 경우에는 Dll4 단백질 또는 이의 부분)과 특이적으로 결합하고 이를 인식하는 면역글로불린 유전자 또는 이의 단편으로부터의 골격 영역을 포함하는 포유동물(사람 포함)의 폴리펩타이드 또는 단백질을 의미한다. 의도된 항체 또는 항체 유사 단백질이 포유동물 치료제로서 사용되는 경우, 면역글로불린 결합 영역은 상응하는 포유동물 면역글로불린으로부터 유도되어야 한다. 당해 분자가 비치료적 용도(예: 진단 및 ELISA용)로 의도되는 경우, 면역글로불린 결합 영역은 사람 또는 비-사람 포유동물(예: 쥐)로부터 유도될 수 있다. 사람 면역글로불린 유전자 또는 유전자 단편은 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역 뿐만 아니라 미리어드(myriad) 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로서 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되며, 이들은 차례로 각각 면역글로불린 부류, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 한정한다. 각각의 IgG 부류내에는 상이한 이소형(isotype)(예: IgG₁, IgG₂ 등) 뿐만 아니라 이들의 알로형(allotype)이 있다.

사람 IgG의 대표적 면역글로불린 (항체) 구조 단위는 테트라머를 포함한다. 각 테트라머는 폴리펩타이드 쇄의 2개의 동일한 쌍으로 구성되며, 각 쌍은 1개의 경쇄(약 25kD)와 1개의 중쇄(약 50 내지 70kD)를 갖는다. 각 쇄의 N-말단은 항원 인식에 주로 관여하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산으로 이루어진 가변 영역을 한정한다. 용어 "가변 경쇄"(V_L) 및 가변 중쇄(V_H)는 각각 이들 경쇄 및 중쇄를 의미한다.

항체는 순수한 면역글로불린으로서 존재하거나, 다양한 펩티다제로 분해시켜 생성된 다수의 잘 특성화된 단편으로서 존재한다. 예를 들면, 펩신은, 자체가 디설파이드 결합에 의해 V_H-C_H에 결합된 경쇄인 Fab의 이량체인 F(ab)'₂를 생성하기 위해 힌지 영역에서 디설파이드 결합 아래에서 항체를 분해한다. F(ab)'₂는 온화한 조건하에 환원되어 힌지 영역에서 디설파이드 결합을 파괴하고, 이에 의해 F(ab)'₂ 이량체를 Fab' 단량체로 전환시킬 수 있다. Fab' 단량체는 실질적으로 힌지 영역의 일부를 갖는 Fab이다. 다양한 항체 단편이 순수 항체의 분해와 관련하여 기재되어 있지만, 당업자는 이러한 단편이 화학적으로 또는 재조합 DNA 기술을 사용함으로써 새롭게(de novo) 합성될 수 있음을 이해한다. 따라서, 본원에 사용된 용어 항체는 또한 전체 항체의 변형에 의해 생성된 항체 단편 또는 재조합 DNA 방법을 사용하여 새롭게 합성하거나 디스플레이 라이브러리(예: 파지, 이.콜라이(E. coli) 또는 효모 디스플레이 라이브러리)를 통해 생성한 것들을 포함한다[참조: McCafferty et al. (1990) Nature 348: 552-554].

Dll4 유사체 또는 단백질 단편. Dll4 길항제는 다량체화 성분과 임의로 결합된 Dll4 단편일 수 있다. 특정한 양태에서, Dll4 단편은 면역글로불린 도메인, 절단된 면역글로불린 도메인, 또는 하나 이상의 시스테인 잔기를 임의로 포함하는 1 내지 약 500개 아미노산 길이의 아미노산 서열 등의 다량체화 성분과 융합될 수 있다. 바람직한 양태에서, 다량체화 성분은 면역글로불린 도메인, 바람직하게는 Fc 도메인, 예를 들면, 사람 Fc(서열번호 5)이다. 단백질 또는 단백질 단편은 시그날 서열을 임의로 포함할 수 있고, 여기서 시그날 서열은 천연 또는 합성 서열을 포함하여, 세포로부터 폴리펩타이드 또는 단백질의 분비를 유도하는 당업자에게 공지된 임의의 서열을 포함할 수 있다. 일반적으로, 시그날 서열은 본 발명의 융합 단백질의 개시부 또는 아미노 말단부에 위치한다. 이러한 시그날 서열은 세포 기원, 재조합체 또는 합성된 것일 수 있다.

Dll4의 세포외 도메인은 Delta/Serrate/Lag-2(DSL) 도메인 및 8개의 상피 성장 인자(EGF)-유사 직렬 반복체로 구성된다. 일반적으로, EGF 도메인은 hDll4(서열번호 2)의 대략 218-251번(도메인 1), 252-282번(도메인 2), 284-322번(도메인 3), 324-360번(도메인 4) 및 362-400번(도메인 5) 위치에서, DSL 도메인은 대략 173-217번 위치에서 및 N-말단 도메인은 대략 27-172번 위치에서 존재하는 것으로 인식된다. 특정한 양태에서, Dll4 길항제는 hFc(서열번호 5)와 임의로 융합된 서열번호 2의 대략 27-172번, 27-217번, 218-400번, 218-360번, 218-322번 또는 218-282번 아미노산을 포함한다.

투여 방법

본 발명은 본 발명의 제제의 유효량을 대상에게 투여함을 포함하는 치료방법을 제공한다. 바람직한 양태에서, 당해 제제는 실질적으로 정제되어 있다(예를 들면, 이의 효과를 제한하거나 바람직하지 않은 부작용을 생성하는 물질을 실질적으로 포함하지 않음). 대상은 바람직하게는 동물(예: 소, 돼지, 말, 닭, 고양이, 개 등)이고, 바람직하게는 포유동물 및 가장 바람직하게는 사람이다. 특정한 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 치료를 필요로 하는 부분에 국소 투여하는 것이 바람직하고, 이는, 예로서 및 비제한적으로, 수술 동안의 국소 주입, 국소 적용(예: 주사)에 의해, 카테터에 의해 또는 임플란트에 의해 달성될 수 있다.

본 발명의 방법은 유리하게는 유리체내, 안구내, 안구 주변, 결막하, 공막옆, 힘줄하 또는 국소 투여에 의해 치료를 필요로 하는 부분에 투여함으로써 실시하는 것이 유리할 수 있다.

병용 치료

다양한 양태에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 추가 화합물 또는 요법 또는 의학적 과정과 병용하여 Dll4 항체와 같은 Dll4 길항제에 의해 달성된다. 예를 들면, 교대로 또는 동시에 병용하기 위한 적합한 치료제는, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)에 결합하고 이의 활성을 억제할 수 있는 융합 단백질[참조: 미국 특허 제7,070,959호 및 제7,087,411호], 코르티코스테로이드, 덱사메타손, 사이클로스포린 A, FK506 또는 항대사제 등의 면역억제제[참조: Barker, NH, et al., (2000) Clin Exp Opthal 28: 357-360]를 포함한다. 교대로 또는 동시에 본 발명의 Dll4 길항제와 병용하기 위한 다른 적합한 치료제는, VEGF-C 및 VEGF-D 등의 다른 VEGF 부류 구성원의 생물학적 활성을 차단할 수 있는 제제를 포함할 수 있다.

다음 실시예는 당업자들에게 본 발명의 방법 및 조성물의 제조 및 사용 방법의 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제시된 것이며, 본 발명자들이 발명으로서 고려하는 것의 범위를 한정하기 위한 것이 아니다. 사용된 수(예: 양, 면적 측 정 등)와 관련하여 정확성을 보장하는 노력이 이루어졌지만, 다소의 실험적 오차 및 편차도 고려되어야 한다.

실시예 1. 단일 Dll4 대립유전자의 유전자 결실이 망막 혈관계 발생에서 혈관 발아에 미치는 효과

Dll4 부분 유전자 결손이 정상 발생 망막 혈관형성 동안에 혈관 발아에 미치는 효과를 측정하기 위한 연구를 수행하였다.

동물. Velocigene^TM 기술[참조: Valenzuela et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21: 652-9; 미국 특허 제6,586,251호]을 사용하여 C57BL/6:129 하이브리드 마우스 배아 줄기 세포에서 전체 Dll4 암호화 영역을 β-갈락토시다제 리포터 유전자로 치환시켰다. 키메라 수컷을 ICR 암컷과 교배시켰다. ICR(87.5% ICR)에 대해 3대 동안 역교배시킨 Dll4^+/ ^lacZ 마우스를 본 연구에 사용하였다.

조직화학 및 면역염색. 마우스 새끼를 P7에서 인도적으로 안락사시켰다. 눈을 적출하고, 망막을 절개하고, 4% 파라포름알데하이드로 밤새 고정시키고, FITC 표지된 그리포니아 심플리시폴리아(GS; Griffonia simplicifolia) 렉틴 I(Vector Laboratories, Burlingame, CA)으로 염색하고, 플랫 마운팅(flat-mounting)하였다. 니콘(Nikon)(Melville, NY) 현미경을 사용하여 영상을 얻었다.

정량화. 측정은 Scion Image 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 각 실험 조건은 적어도 삼중으로 검정하였다. 스튜던트 t-검정 및 이원 분산 분석을 사용 하여 통계학적 유의성을 평가하였다.

결과. 주변 망상조직은 야생형 동배에서보다 Dll4^+/ ^lacZ 마우스에서 더 조밀하였다. 고출력 관찰은, 직경이 더 큰 모세관으로 이루어진 Dll4^+/ ^lacZ 마우스에서 더 조밀한 주변 망상조직이 더욱 고도로 상호연결되고 과융합되어, 몇몇 부분에서 혈관이 합체되어 합포체를 형성하였고, 또한 성장 전방(growing front)에 더 많은 발아체가 존재하였으며(도 1), 필로포디아(filopodia)가 또한 정상 주기보다 더욱 높게 망상조직의 보다 많은 내부 부분에서 관찰되었음에 주목하였다. 정량 분석은, 야생형 대조군과 비교하여, Dll4^+/ ^lacZ 마우스가 표면 망막 혈관계의 성장 전방에서 발아체 수의 65% 증가를 나타냈을 뿐만 아니라(도 1), 단위 면적당 모세관 상호연결 수의 2배 이상의 증가를 나타내어, 혈관 피복의 현저한 증가를 초래한 것으로 밝혀졌다. 현저한 형태학적 변화에도 불구하고, 형광 렉틴의 혈관내 주사는, 야생형 마우스에서와 같이 Dll4^+/ ^lacZ 마우스에서, 정단 세포(tip cell)로부터 연장하는 필로포디아를 제외하고는, 발생 표면 혈관 망상조직을 완전히 채웠고, 이는 발생 혈관계의 모든 성분이 내강을 가졌고 기능적임을 나타내었다.

실시예 2. Dll4-Fc 또는 항-Dll4 항체에 의한 Dll4/노치 억제가 망막 혈관계 발생에 미치는 효과

Dll4/노치 신호 약리학적 억제가 정상 발생 망막 혈관형성 동안에 내피 세포 증식 및 혈관 발아에 미치는 효과를 측정하기 위한 연구를 수행하였다.

항체 및 시약. Dll4-Fc는 마우스 또는 사람 Dll4의 세포외 도메인 및 사람 IgG의 Fc 부분을 포함한다. Dll4-Fc는 CHO 세포에서 발현시켰고, 단백질-A 크로마토그래피로 친화성 정제하였다. 항-Dll4 항체는 래빗을 재조합 mDll4-hFc로 면역화하여 생성하였다. 항혈청은 사용 전에 단백질-A 크로마토그래피로 부분 정제하였다.

동물. C57/B16 마우스(Taconic)를 사용하여 망막 혈관계 발생에 대한 Dll4-Fc 또는 중화 Dll4 항체의 효과를 연구하였다.

유리체내 미세주사 . 연구 화합물의 유리체내 미세주사(30 내지 100nl)는 유리 침이 구비된 Drummond Scientific(BroPA) 나노주사기를 사용하여 적도(equator)와 각막윤부(corneal limbus) 사이에서 이루어졌다.

BrdU 표지. 증식 세포를 hFc 또는 Dll4-Fc의 유리체내 주사 20시간 후에 BrdU(1mg/kg i.p.)의 투여에 의해 표지하였다. 망막을 4시간 후에 수집하고, 항-BrdU(Dako North America, Inc., Carpinteria, CA) 및 VE-Cadherin(BD PharMingen, San Diego, CA) 항체로 염색시켰다.

결과. Dll4/노치 신호에서, 미검출된 전신 이상에 대한 속발성이 아닌 국소 유리체내 결손의 효과를 조사하기 위해, 이들을 활성화하지 않고서 노치 수용체에 결합하여 내인성 Dll4의 작용을 차단하는 Dll4의 가용형(Dll4-Fc라고 명명), 또는 Dll4의 세포외 도메인에 특이적인 중화 폴리클로날 항체를 야생형 마우스의 유리체에 주사하였다. Dll4 차단제의 안구내 투여 3일 후에, 망막 혈관은, 현저히 증가 한 혈관 밀도 및 혈관 직경을 포함하여, Dll4^+/ ^lacZ 마우스에서 발견된 혈관 이상과 매우 비슷한 형태학적 변화를 나타냈다. 더욱이, 이들 특징적인 형태학적 변화는 신속하게 발생하였고, 24시간 이내에 명백하게 나타났다.

BrdU 표지는 또한 Dll4 차단 24시간 이내에 내피 세포 증식의 증가를 나타냈다(도 2). 증식율에서 관찰된 약 17% 증가는 3 내지 4회의 2배 증가시간 이내에 50% 이상의 세포수 증가를 제공할 수 있었다.

실시예 3. Dll4-Fc 및 항-Dll4 항체가 OIR을 갖는 마우스에서 망막 혈관형성, 관류 및 혈관 이상에 미치는 효과

Dll4-Fc 및 항-Dll4 항체가 산소-유도 허혈성 망막병증(OIR)에서 망막 혈관의 성장, 혈관 이상의 형성 및 망막 관류에 미치는 효과를 측정하기 위한 연구를 수행하였다.

Dll4/노치 신호가 정상 발생 동안 뿐만 아니라 병리학적 혈관형성에서 어떠한 역할을 하는지를 연구하기 위해, OIR 모델을 사용하였다. OIR 모델에서, P7에서 고산소혈증에의 마우스 새끼의 노출은 중심 망막에서 모세관의 급속한 제거를 초래한다. P12에서 실내 공기로 복귀한 후, 무혈관 영역은 심하게 저산소성으로 되고, 이는 차례로, 혈관의 유리체내로의 이소성 성장(망막외 혈관 "속") 및 이상 동정맥 발아체의 형성을 특징으로 하는 광범위한 이상 신생혈관을 유도하였고, 망막의 중심부는 연장된 기간 동안 대부분 무혈관으로 잔류한다.

동물 및 OIR 모델. C57/B16 마우스(Taconic)를 사용하여, Dll4-Fc 또는 중 화 Dll4 항체가 OIR에서 망막 신생혈관에 미치는 효과를 조사하였다. OIR은 스미스 등[참조: Smith et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1994, 35: 101-111]이 개발한 방법에 따라 생성하였다. 요약하면, 마우스 새끼 및 이들의 어미를 출생후 일(P) 7에서부터 P12까지 75% 산소 환경에 넣은 다음, 실내 공기로 복귀시켰다. 고산소혈증에의 노출은 중심 망막에서 급속한 혈관제거를 유도한다. 마우스를 실내 공기로 복귀(P12)시키는 경우, 중심 망막으로부터의 혈관 상실은 심각한 저산소혈증/허혈을 초래하고, 이는 또한 상기 기재한 병리학적 혈관 변화를 자극한다.

본 발명의 혈관을 표지하기 위해, 텍사스 레드-표지된 리코퍼시콘 에스쿨렌툼(LE; Lycopersicon esculentum) 렉틴(1mg/ml; Vector Laboratories, CA) 50ml를 좌심실에 주사하고, 5분 동안 순환하게 하였다.

결과. Dll4-Fc 또는 항-Dll4 항체에 의한 Dll4/노치 억제는 병리학적 신생혈관을 개선시켰고(도 3A 및 3B), 새로운 혈관의 성장을 자극하였으며(도 4A 및 4B), 망막 재관류를 향상시켰다(도 5).

Dll4-Fc 또는 항-Dll4 항체 또는 대조군 단백질(hFc)을, 동물을 실내 공기로 복귀시킨 후 1일 경과하여 및 혈관 제거가 완결된 후에, P13에서 유리체내로 주사하였다. 망막을 P17에서 평가하는 경우, Dll4-Fc 또는 항-Dll4 항체의 투여는 유리체내로 병리학적 신생혈관 속의 이소성 성장을 현저히 억제시켰고(도 1), 또한 이상 동정맥 발아체의 형성을 방지하였다. 신생혈관 속이 차지하는 면적은, hFc 처리된 대조군 망막과 비교하여, Dll4-Fc로 처리한 망막에서는 43% 감소되고, 항-Dll4 항체로 처리한 망막에서는 85% 감소되었다.

더욱이, Dll4-Fc 및 항-Dll4 항체는 무혈관 영역에 접한 모세관 및 정맥으로부터 새로운 혈관의 보다 광범위한 발아를 자극하는 것으로 밝혀졌고, 이는 혈관계가 고갈된 중심 망막으로의 혈관의 보다 신속한 재생을 초래하여 무혈관 망막 면적을 감소시킨다(도 4A 및 4B). 무혈관 면적은 Dll4-Fc로 처리한 망막에서는 43% 감소되고 항-Dll4 항체로 처리한 망막에서는 63% 감소되었다. Dll4-Fc 처리된 망막의 무혈관 영역에서 정맥으로부터 나오는 광범위한 모세관 재생이 특히 현저하였다. 따라서, Dll4/노치 신호의 감쇠는 망막 표면을 따라 새로운 혈관 발아의 연장을 촉진시켰고 망막앞 신생혈관의 형성을 완화시켰으며, 이는 표면 혈관 망상조직의 보다 신속한 재형성을 초래하였다. 새롭게 형성되는 혈관은 기능적이었고, Dll4-Fc 처리된 망막에서 비관류 면적의 45% 감소에 의해 입증된 바와 같이 개선된 망막 재관류를 나타냈다(도 5).

실시예 4. Dll4-Fc 및 항-Dll4 항체가 OIR 모델에서 망막 저산소증/허혈증에 미치는 효과

Dll4-Fc 및 항-Dll4 항체가 병리학적 신생혈관의 OIR 모델에서 망막 저산증/허혈증에 미치는 효과를 측정하기 위한 연구를 수행하였다.

특정한 상황하에 과다한 혈관 성장은 정상 혈액 순환을 방해하고 조직 산소화를 감소시킬 수 있다. Dll4/노치 억제가 조직 산소화를 향상시킬 수 있는지를 시험하기 위해, 하이폭시프로브(HYPOXYPROBE)^TM-1(Chemicon)을 비침습성 분석에 사용하여 조직 저산소증을 검출하고, 망막 저산소증/허혈증에 대한 Dll4-Fc 처리의 효과를 측정하였다. 하이폭시프로브^TM-1을 평가를 위한 망막의 수집 1시간 전에 100mg/kg으로 복강내 주사하였다.

결과. Dll4/노치 억제제의 복강내 투여 후에 새로운 기능적 혈관의 성장은, 각각 Dll4-Fc 및 항-Dll4 항체 처리된 망막에서 하이폭시프로브-양성 면적의 69% 및 30% 감소에 의해 입증된 바와 같이 조직 저산소증/허혈증을 효과적으로 감소시켰다.

실시예 5. 단일 Dll4 대립유전자 의 유전자 결실은 고산소혈증 -유도 혈관제거를 감소시킨다.

Dll4 부분 유전자 결손이 고산소혈증-유도 혈관 퇴행에 미치는 효과를 측정하기 위한 연구를 수행하였다.

동물. ICR(87.5% ICR)에 대해 3대 동안 역교배시킨 Dll4^+/ ^lacZ 마우스를 상기 기재한 바와 같이 생성하였다. 열성(rd/rd) 돌연변이로 인하여, ICR 마우스에서 망막 광수용체 세포 층은 P12에서 퇴행하기 시작한다. 따라서, 망막 혈관계에 대한 광수용체 상실의 잠재적 2차 효과를 방지하기 위해, 망막 발생의 후기 단계의 평가 및 모든 OIR 실험에 있어서, Dll4^+/ ^lacZ(87.5% ICR) 마우스를 C57BL/6에 역교배시켜 Rd/rd 마우스를 생산하였고, 이는 광수용체 퇴행을 나타내지 않는다.

마우스 새끼를 출생후 일(P) 7에서부터 P12까지 75% 산소 환경에 넣었다. 망막을 수집하고, 망막 혈관계를 플랫 마운트로 분석하였다.

결과. Dll4^+/ ^lacZ 마우스의 망막 혈관계에서 Dll4의 발현 감소는 고산소혈증-유도 망막 혈관 상실을 부분적으로 방지한다(도 7). OIR 모델에서, P7에서 고산소혈증에의 마우스 새끼의 노출은 중심 망막에서 모세관의 급속한 폐색 및 제거를 초래한다. Dll4/노치 억제가 혈관에 대한 보호 효과를 갖는지를 측정하기 위해, 고산소혈증-유도 혈관제거에 미치는 Dll4^+/ ^lacZ 마우스의 Dll4 부분 유전자 결손의 효과를 분석하였다. P12에서 동물을 평가하여(고산소혈증 혈관제거의 범위를 평가하기 위해), 혈관제거는 야생형 동배 대조군 동물과 비교하여 Dll4^+/ ^lacZ 마우스에서 40% 감소한 것으로 밝혀졌고, 이는 Dll4 억제제가 기존 혈관의 퇴행을 보호할 수 있음을 시사한다.

실시예 6. Dll4 - Fc 및 항- Dll4 항체가 고산소혈증 -유도 혈관제거에 미치는 효과

Dll4-Fc 및 항-Dll4 항체에 의한 Dll4/노치 억제가 고산소혈증-유도 혈관 퇴행에 미치는 효과를 측정하기 위한 연구를 수행하였다.

동물. C57/Bl6(Taconic)을 사용하여 Dll4-Fc 또는 중화 Dll4 항체가 산소-유도 망막 혈관제거에 미치는 효과를 조사하였다. 연구 화합물의 유리체내 미세주사는 출생후 8일에 수행하였다. 출생후 9일에 새끼를 75% 산소 환경에 넣었다. 망막을 24시간 후에 수집하고, 망막 혈관계를 플랫-마운트로 분석하였다.

결과. Dll4-Fc 또는 항-Dll4 항체의 유리체내 주사는 각각 혈관 제거 면적 을 현저하게 각각 97% 및 41% 감소시켰다(도 8A 및 8B).

실시예 7. Dll4 - Fc 및 항- Dll4 항체가 고산소혈증 -유도 혈관 폐색에 미치는 효과

Dll4-Fc 및 항-Dll4 항체에 의한 Dll4/노치 억제가 고산소혈증-유도 혈관 폐색에 미치는 효과를 측정하기 위한 연구를 수행하였다. 모든 절차는 상기 기재한 바와 같이 수행하였다.

Dll4-Fc 및 항-Dll4 항체 처리는 비관류 망막 면적을 각각 40% 및 29% 감소시켰다(도 9A 및 9B).

실시예 8. Dll4 - Fc 의 전신 투여가 고산소혈증 -유도 혈관 퇴행에 미치는 효과

Dll4-Fc에 의한 전신 투여가 고산소혈증-유도 혈관 퇴행에 미치는 효과를 측정하기 위한 연구를 수행하였다.

hDll4-Fc 4.1mcg 또는 사람 hFc 대조군 단백질 5mcg를 유리체내(ITV) 주사하거나 hDll4-hFc를 P7에서 체중kg당 25mg의 용량으로 복강내로 주사하였다. 새끼를 P8에서 75% 산소 환경에 넣었고, 망막 혈관계를 P9에서 분석하였다. 모든 다른 절차는 상기 기재한 바와 같다.

결과. Dll4-Fc의 국소(유리체내) 및 전신(복강내) 투여는 혈관계 제거 면적을 각각 86% 및 56% 감소시켰고, 이는 투여 경로와는 독립적으로 Dll4 억제제가 혈 관 퇴행의 보호에 효과적으로 사용될 수 있음을 나타낸다(도 10).

<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. <120> Therapeutic methods for treating vascular eye disorders with Dll4 antagonists <130> 3090A-WO <150> US 60/836,003 <151> 2006-08-07 <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2058 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggcggcag cgtcccggag cgcctctggc tgggcgctac tgctgctggt ggcactttgg 60 cagcagcgcg cggccggctc cggcgtcttc cagctgcagc tgcaggagtt catcaacgag 120 cgcggcgtac tggccagtgg gcggccttgc gagcccggct gccggacttt cttccgcgtc 180 tgccttaagc acttccaggc ggtcgtctcg cccggaccct gcaccttcgg gaccgtctcc 240 acgccggtat tgggcaccaa ctccttcgct gtccgggacg acagtagcgg cggggggcgc 300 aaccctctcc aactgccctt caatttcacc tggccgggta ccttctcgct catcatcgaa 360 gcttggcacg cgccaggaga cgacctgcgg ccagaggcct tgccaccaga tgcactcatc 420 agcaagatcg ccatccaggg ctccctagct gtgggtcaga actggttatt ggatgagcaa 480 accagcaccc tcacaaggct gcgctactct taccgggtca tctgcagtga caactactat 540 ggagacaact gctcccgcct gtgcaagaag cgcaatgacc acttcggcca ctatgtgtgc 600 cagccagatg gcaacttgtc ctgcctgccc ggttggactg gggaatattg ccaacagcct 660 atctgtcttt cgggctgtca tgaacagaat ggctactgca gcaagccagc agagtgcctc 720 tgccgcccag gctggcaggg ccggctgtgt aacgaatgca tcccccacaa tggctgtcgc 780 cacggcacct gcagcactcc ctggcaatgt acttgtgatg agggctgggg aggcctgttt 840 tgtgaccaag atctcaacta ctgcacccac cactccccat gcaagaatgg ggcaacgtgc 900 tccaacagtg ggcagcgaag ctacacctgc acctgtcgcc caggctacac tggtgtggac 960 tgtgagctgg agctcagcga gtgtgacagc aacccctgtc gcaatggagg cagctgtaag 1020 gaccaggagg atggctacca ctgcctgtgt cctccgggct actatggcct gcattgtgaa 1080 cacagcacct tgagctgcgc cgactccccc tgcttcaatg ggggctcctg ccgggagcgc 1140 aaccaggggg ccaactatgc ttgtgaatgt ccccccaact tcaccggctc caactgcgag 1200 aagaaagtgg acaggtgcac cagcaacccc tgtgccaacg ggggacagtg cctgaaccga 1260 ggtccaagcc gcatgtgccg ctgccgtcct ggattcacgg gcacctactg tgaactccac 1320 gtcagcgact gtgcccgtaa cccttgcgcc cacggtggca cttgccatga cctggagaat 1380 gggctcatgt gcacctgccc tgccggcttc tctggccgac gctgtgaggt gcggacatcc 1440 atcgatgcct gtgcctcgag tccctgcttc aacagggcca cctgctacac cgacctctcc 1500 acagacacct ttgtgtgcaa ctgcccttat ggctttgtgg gcagccgctg cgagttcccc 1560 gtgggcttgc cgcccagctt cccctgggtg gccgtctcgc tgggtgtggg gctggcagtg 1620 ctgctggtac tgctgggcat ggtggcagtg gctgtgcggc agctgcggct tcgacggccg 1680 gacgacggca gcagggaagc catgaacaac ttgtcggact tccagaagga caacctgatt 1740 cctgccgccc agcttaaaaa cacaaaccag aagaaggagc tggaagtgga ctgtggcctg 1800 gacaagtcca actgtggcaa acagcaaaac cacacattgg actataatct ggccccaggg 1860 cccctggggc gggggaccat gccaggaaag tttccccaca gtgacaagag cttaggagag 1920 aaggcgccac tgcggttaca cagtgaaaag ccagagtgtc ggatatcagc gatatgctcc 1980 cccagggact ccatgtacca gtctgtgtgt ttgatatcag aggagaggaa tgaatgtgtc 2040 attgccacgg aggtataa 2058 <210> 2 <211> 685 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Ala Ala Ser Arg Ser Ala Ser Gly Trp Ala Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Val Ala Leu Trp Gln Gln Arg Ala Ala Gly Ser Gly Val Phe Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Gln Glu Phe Ile Asn Glu Arg Gly Val Leu Ala Ser Gly Arg 35 40 45 Pro Cys Glu Pro Gly Cys Arg Thr Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys His 50 55 60 Phe Gln Ala Val Val Ser Pro Gly Pro Cys Thr Phe Gly Thr Val Ser 65 70 75 80 Thr Pro Val Leu Gly Thr Asn Ser Phe Ala Val Arg Asp Asp Ser Ser 85 90 95 Gly Gly Gly Arg Asn Pro Leu Gln Leu Pro Phe Asn Phe Thr Trp Pro 100 105 110 Gly Thr Phe Ser Leu Ile Ile Glu Ala Trp His Ala Pro Gly Asp Asp 115 120 125 Leu Arg Pro Glu Ala Leu Pro Pro Asp Ala Leu Ile Ser Lys Ile Ala 130 135 140 Ile Gln Gly Ser Leu Ala Val Gly Gln Asn Trp Leu Leu Asp Glu Gln 145 150 155 160 Thr Ser Thr Leu Thr Arg Leu Arg Tyr Ser Tyr Arg Val Ile Cys Ser 165 170 175 Asp Asn Tyr Tyr Gly Asp Asn Cys Ser Arg Leu Cys Lys Lys Arg Asn 180 185 190 Asp His Phe Gly His Tyr Val Cys Gln Pro Asp Gly Asn Leu Ser Cys 195 200 205 Leu Pro Gly Trp Thr Gly Glu Tyr Cys Gln Gln Pro Ile Cys Leu Ser 210 215 220 Gly Cys His Glu Gln Asn Gly Tyr Cys Ser Lys Pro Ala Glu Cys Leu 225 230 235 240 Cys Arg Pro Gly Trp Gln Gly Arg Leu Cys Asn Glu Cys Ile Pro His 245 250 255 Asn Gly Cys Arg His Gly Thr Cys Ser Thr Pro Trp Gln Cys Thr Cys 260 265 270 Asp Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe Cys Asp Gln Asp Leu Asn Tyr Cys 275 280 285 Thr His His Ser Pro Cys Lys Asn Gly Ala Thr Cys Ser Asn Ser Gly 290 295 300 Gln Arg Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Arg Pro Gly Tyr Thr Gly Val Asp 305 310 315 320 Cys Glu Leu Glu Leu Ser Glu Cys Asp Ser Asn Pro Cys Arg Asn Gly 325 330 335 Gly Ser Cys Lys Asp Gln Glu Asp Gly Tyr His Cys Leu Cys Pro Pro 340 345 350 Gly Tyr Tyr Gly Leu His Cys Glu His Ser Thr Leu Ser Cys Ala Asp 355 360 365 Ser Pro Cys Phe Asn Gly Gly Ser Cys Arg Glu Arg Asn Gln Gly Ala 370 375 380 Asn Tyr Ala Cys Glu Cys Pro Pro Asn Phe Thr Gly Ser Asn Cys Glu 385 390 395 400 Lys Lys Val Asp Arg Cys Thr Ser Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Gln 405 410 415 Cys Leu Asn Arg Gly Pro Ser Arg Met Cys Arg Cys Arg Pro Gly Phe 420 425 430 Thr Gly Thr Tyr Cys Glu Leu His Val Ser Asp Cys Ala Arg Asn Pro 435 440 445 Cys Ala His Gly Gly Thr Cys His Asp Leu Glu Asn Gly Leu Met Cys 450 455 460 Thr Cys Pro Ala Gly Phe Ser Gly Arg Arg Cys Glu Val Arg Thr Ser 465 470 475 480 Ile Asp Ala Cys Ala Ser Ser Pro Cys Phe Asn Arg Ala Thr Cys Tyr 485 490 495 Thr Asp Leu Ser Thr Asp Thr Phe Val Cys Asn Cys Pro Tyr Gly Phe 500 505 510 Val Gly Ser Arg Cys Glu Phe Pro Val Gly Leu Pro Pro Ser Phe Pro 515 520 525 Trp Val Ala Val Ser Leu Gly Val Gly Leu Ala Val Leu Leu Val Leu 530 535 540 Leu Gly Met Val Ala Val Ala Val Arg Gln Leu Arg Leu Arg Arg Pro 545 550 555 560 Asp Asp Gly Ser Arg Glu Ala Met Asn Asn Leu Ser Asp Phe Gln Lys 565 570 575 Asp Asn Leu Ile Pro Ala Ala Gln Leu Lys Asn Thr Asn Gln Lys Lys 580 585 590 Glu Leu Glu Val Asp Cys Gly Leu Asp Lys Ser Asn Cys Gly Lys Gln 595 600 605 Gln Asn His Thr Leu Asp Tyr Asn Leu Ala Pro Gly Pro Leu Gly Arg 610 615 620 Gly Thr Met Pro Gly Lys Phe Pro His Ser Asp Lys Ser Leu Gly Glu 625 630 635 640 Lys Ala Pro Leu Arg Leu His Ser Glu Lys Pro Glu Cys Arg Ile Ser 645 650 655 Ala Ile Cys Ser Pro Arg Asp Ser Met Tyr Gln Ser Val Cys Leu Ile 660 665 670 Ser Glu Glu Arg Asn Glu Cys Val Ile Ala Thr Glu Val 675 680 685 <210> 3 <211> 3427 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ctcgcaggct aggaacccga ggccaagagc tgcagccaaa gtcacttggg tgcagtgtac 60 tccctcacta gcccgctcga gaccctagga tttgctccag gacacgtact tagagcagcc 120 accgcccagt cgccctcacc tggattacct accgaggcat cgagcagcgg agtttttgag 180 aaggcgacaa gggagcagcg tcccgagggg aatcagcttt tcaggaactc ggctggcaga 240 cgggacttgc gggagagcga catccctaac aagcagattc ggagtcccgg agtggagagg 300 acaccccaag ggatgacgcc tgcgtcccgg agcgcctgtc gctgggcgct actgctgctg 360 gcggtactgt ggccgcagca gcgcgctgcg ggctccggca tcttccagct gcggctgcag 420 gagttcgtca accagcgcgg tatgctggcc aatgggcagt cctgcgaacc gggctgccgg 480 actttcttcc gcatttgcct taagcacttc caggcaacct tctccgaggg accctgcacc 540 tttggcaatg tctccacgcc ggtattgggc accaactcct tcgtcgtcag ggacaagaat 600 agcggcagtg gtcgcaaccc tctgcagttg cccttcaatt tcacctggcc gggaaccttc 660 tcactcaaca tccaagcttg gcacacaccg ggagacgacc tgcggccaga gacttcgcca 720 ggaaactctc tcatcagcca aatcatcatc caaggctctc ttgctgtggg taagatttgg 780 cgaacagacg agcaaaatga caccctcacc agactgagct actcttaccg ggtcatctgc 840 agtgacaact actatggaga gagctgttct cgcctatgca agaagcgcga tgaccacttc 900 ggacattatg agtgccagcc agatggcagc ctgtcctgcc tgccgggctg gactgggaag 960 tactgtgacc agcctatatg tctttctggc tgtcatgagc agaatggtta ctgcagcaag 1020 ccagatgagt gcatctgccg tccaggttgg cagggtcgcc tgtgcaatga atgtatcccc 1080 cacaatggct gtcgtcatgg cacctgcagc atcccctggc agtgtgcctg cgatgaggga 1140 tggggaggtc tgttttgtga ccaagatctc aactactgta ctcaccactc tccgtgcaag 1200 aatggatcaa cgtgttccaa cagtgggcca aagggttata cctgcacctg tctcccaggc 1260 tacactggtg agcactgtga gctgggactc agcaagtgtg ccagcaaccc ctgtcgaaat 1320 ggtggcagct gtaaggacca ggagaatagc taccactgcc tgtgtccccc aggctactat 1380 ggccagcact gtgagcatag taccttgacc tgtgcggact caccctgctt caatgggggc 1440 tcttgccggg agcgcaacca ggggtccagt tatgcctgcg aatgcccccc caactttacc 1500 ggctctaact gtgagaagaa agtagacagg tgtaccagca acccgtgtgc caatggaggc 1560 cagtgcctga acagaggtcc aagccgaacc tgccgctgcc ggcctggatt cacaggcacc 1620 cactgtgaac tgcacatcag cgattgtgcc cgaagtccct gtgcccacgg gggcacttgc 1680 cacgatctgg agaatgggcc tgtgtgcacc tgccccgctg gcttctctgg caggcgctgc 1740 gaggtgcgga taacccacga tgcctgtgcc tccggaccct gcttcaatgg ggccacctgc 1800 tacactggcc tctccccaaa caacttcgtc tgcaactgtc cttatggctt tgtgggcagc 1860 cgctgcgagt ttcccgtggg cttgccaccc agcttcccct gggtagctgt ctcgctgggc 1920 gtggggctag tggtactgct ggtgctgctg gtcatggtgg tagtggctgt gcggcagctg 1980 cggcttcgga ggcccgatga cgagagcagg gaagccatga acaatctgtc agacttccag 2040 aaggacaacc taatccctgc cgcccagctc aaaaacacaa accagaagaa ggagctggaa 2100 gtggactgtg gtctggacaa gtccaattgt ggcaaactgc agaaccacac attggactac 2160 aatctagccc cgggactcct aggacggggc agcatgcctg ggaagtatcc tcacagtgac 2220 aagagcttag gagagaaggt gccacttcgg ttacacagtg agaagccaga gtgtcgaata 2280 tcagccattt gctctcccag ggactctatg taccaatcag tgtgtttgat atcagaagag 2340 aggaacgagt gtgtgattgc cacagaggta taaggcagga gcctactcag acacccagct 2400 ccggcccagc agctgggcct tccttctgca ttgtttacat tgcatcctgt atgggacatc 2460 tttagtatgc acagtgctgc tctgcggagg aggagggaat ggcatgaact gaacagactg 2520 tgaacccgcc aagagttgca ccggctctgc acacctccag gagtctgcct ggcttcagat 2580 gggcagcccc gccaagggaa cagagttgag gagttagagg agcatcagtt gagctgatat 2640 ctaaggtgcc tctcgaactt ggacttgctc tgccaacagt ggtcatcatg gagctcttga 2700 ctgttctcca gagagtggca gtggccctag tgggtcttgg cgctgctgta gctcctgtgg 2760 gcatctgtat ttccaaagtg cctttgccca gactccatcc tcacagctgg gcccaaatga 2820 gaaagcagag aggaggcttg caaaggatag gcctcccgca ggcagaacag ccttggagtt 2880 tggcattaag caggagctac tctgcaggtg aggaaagccc gaggagggga cacgtgtgac 2940 tcctgcctcc aaccccagca ggtggggtgc cacctgcagc ctctaggcaa gagttggtcc 3000 ttcccctggt cctggtgcct ctgggctcat gtgaacagat gggcttaggg cacgcccctt 3060 ttgccagcca ggggtacagg cctcactggg gagctcaggg ccttcatgct aaactcccaa 3120 taagggagat ggggggaagg gggctgtggc ctaggccctt ccctccctca cacccatttt 3180 tgggcccttg agcctgggct ccaccagtgc ccactgttgc cccgagacca accttgaagc 3240 cgattttcaa aaatcaataa tatgaggttt tgttttgtag tttattttgg aatctagtat 3300 tttgataatt taagaatcag aagcactggc ctttctacat tttataacat tattttgtat 3360 ataatgtgta tttataatat gaaacagatg tgtacataaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3420 aaaaaaa 3427 <210> 4 <211> 686 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Thr Pro Ala Ser Arg Ser Ala Cys Arg Trp Ala Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ala Val Leu Trp Pro Gln Gln Arg Ala Ala Gly Ser Gly Ile Phe Gln 20 25 30 Leu Arg Leu Gln Glu Phe Val Asn Gln Arg Gly Met Leu Ala Asn Gly 35 40 45 Gln Ser Cys Glu Pro Gly Cys Arg Thr Phe Phe Arg Ile Cys Leu Lys 50 55 60 His Phe Gln Ala Thr Phe Ser Glu Gly Pro Cys Thr Phe Gly Asn Val 65 70 75 80 Ser Thr Pro Val Leu Gly Thr Asn Ser Phe Val Val Arg Asp Lys Asn 85 90 95 Ser Gly Ser Gly Arg Asn Pro Leu Gln Leu Pro Phe Asn Phe Thr Trp 100 105 110 Pro Gly Thr Phe Ser Leu Asn Ile Gln Ala Trp His Thr Pro Gly Asp 115 120 125 Asp Leu Arg Pro Glu Thr Ser Pro Gly Asn Ser Leu Ile Ser Gln Ile 130 135 140 Ile Ile Gln Gly Ser Leu Ala Val Gly Lys Ile Trp Arg Thr Asp Glu 145 150 155 160 Gln Asn Asp Thr Leu Thr Arg Leu Ser Tyr Ser Tyr Arg Val Ile Cys 165 170 175 Ser Asp Asn Tyr Tyr Gly Glu Ser Cys Ser Arg Leu Cys Lys Lys Arg 180 185 190 Asp Asp His Phe Gly His Tyr Glu Cys Gln Pro Asp Gly Ser Leu Ser 195 200 205 Cys Leu Pro Gly Trp Thr Gly Lys Tyr Cys Asp Gln Pro Ile Cys Leu 210 215 220 Ser Gly Cys His Glu Gln Asn Gly Tyr Cys Ser Lys Pro Asp Glu Cys 225 230 235 240 Ile Cys Arg Pro Gly Trp Gln Gly Arg Leu Cys Asn Glu Cys Ile Pro 245 250 255 His Asn Gly Cys Arg His Gly Thr Cys Ser Ile Pro Trp Gln Cys Ala 260 265 270 Cys Asp Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe Cys Asp Gln Asp Leu Asn Tyr 275 280 285 Cys Thr His His Ser Pro Cys Lys Asn Gly Ser Thr Cys Ser Asn Ser 290 295 300 Gly Pro Lys Gly Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Pro Gly Tyr Thr Gly Glu 305 310 315 320 His Cys Glu Leu Gly Leu Ser Lys Cys Ala Ser Asn Pro Cys Arg Asn 325 330 335 Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln Glu Asn Ser Tyr His Cys Leu Cys Pro 340 345 350 Pro Gly Tyr Tyr Gly Gln His Cys Glu His Ser Thr Leu Thr Cys Ala 355 360 365 Asp Ser Pro Cys Phe Asn Gly Gly Ser Cys Arg Glu Arg Asn Gln Gly 370 375 380 Ser Ser Tyr Ala Cys Glu Cys Pro Pro Asn Phe Thr Gly Ser Asn Cys 385 390 395 400 Glu Lys Lys Val Asp Arg Cys Thr Ser Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly 405 410 415 Gln Cys Leu Asn Arg Gly Pro Ser Arg Thr Cys Arg Cys Arg Pro Gly 420 425 430 Phe Thr Gly Thr His Cys Glu Leu His Ile Ser Asp Cys Ala Arg Ser 435 440 445 Pro Cys Ala His Gly Gly Thr Cys His Asp Leu Glu Asn Gly Pro Val 450 455 460 Cys Thr Cys Pro Ala Gly Phe Ser Gly Arg Arg Cys Glu Val Arg Ile 465 470 475 480 Thr His Asp Ala Cys Ala Ser Gly Pro Cys Phe Asn Gly Ala Thr Cys 485 490 495 Tyr Thr Gly Leu Ser Pro Asn Asn Phe Val Cys Asn Cys Pro Tyr Gly 500 505 510 Phe Val Gly Ser Arg Cys Glu Phe Pro Val Gly Leu Pro Pro Ser Phe 515 520 525 Pro Trp Val Ala Val Ser Leu Gly Val Gly Leu Val Val Leu Leu Val 530 535 540 Leu Leu Val Met Val Val Val Ala Val Arg Gln Leu Arg Leu Arg Arg 545 550 555 560 Pro Asp Asp Glu Ser Arg Glu Ala Met Asn Asn Leu Ser Asp Phe Gln 565 570 575 Lys Asp Asn Leu Ile Pro Ala Ala Gln Leu Lys Asn Thr Asn Gln Lys 580 585 590 Lys Glu Leu Glu Val Asp Cys Gly Leu Asp Lys Ser Asn Cys Gly Lys 595 600 605 Leu Gln Asn His Thr Leu Asp Tyr Asn Leu Ala Pro Gly Leu Leu Gly 610 615 620 Arg Gly Ser Met Pro Gly Lys Tyr Pro His Ser Asp Lys Ser Leu Gly 625 630 635 640 Glu Lys Val Pro Leu Arg Leu His Ser Glu Lys Pro Glu Cys Arg Ile 645 650 655 Ser Ala Ile Cys Ser Pro Arg Asp Ser Met Tyr Gln Ser Val Cys Leu 660 665 670 Ile Ser Glu Glu Arg Asn Glu Cys Val Ile Ala Thr Glu Val 675 680 685 <210> 5 <211> 227 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225

Claims

허혈 또는 혈관 질환을 치료, 억제 또는 완화하기 위한 약제의 제조에 있어서의, Dll4 활성을 억제할 수 있는 제제의 용도로서,

Dll4 길항제가, 노치(Notch) 수용체에 대한 Dll4의 결합을 차단할 수 있는 항체 또는 항체 단편을 포함하거나, 다량체화(multimerizing) 성분에 임의로 결합된 Dll4의 단편을 포함하는,

Dll4 활성을 억제할 수 있는 제제의 용도.
제1항에 있어서, Dll4 항체 또는 항체 단편이 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 또는 항체 단편인 용도.
제2항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 사람화된 항체 또는 항체 단편, 키메라 항체 또는 항체 단편이거나, 완전 사람 항체 또는 항체 단편인 용도.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 허혈 또는 혈관 질환이, 이상 혈관의 존재 및/또는 정상 혈관 또는 혈관 기능의 상실을 특징으로 하는 안구 질환 또는 상태인 용도.
제4항에 있어서, 안구 질환이 미숙아 망막병증, 허혈성 망막병증, 망막 정맥 또는 동맥 폐색, 당뇨 망막병증, 맥락막 신생혈관, 연령 관련 황반 변성, 각막 신생혈관, 신생혈관 녹내장 또는 각막 이식인 용도.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 치료 대상이 사람인 용도.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 허혈 또는 혈관 질환이 허혈성 손상, 뇌경색, 심장 허혈, 사지 및 다른 기관 또는 조직에 영향을 미치는 허혈 상태, 동정맥 기형, 창상 치유, 기관 또는 조직 이식, 태반 기능부전, 동맥 협착 및 폐색, 죽상경화증, 및 전신 또는 폐동맥 고혈압인 용도.