JP2010169519A - プラズモン励起センサおよびそれを用いたアッセイ法 - Google Patents

Abstract

【課題】高感度かつ高精度であり、イムノアッセイに必要不可欠である特異性に優れたプラズモン励起センサおよびそれを用いたアッセイ法、アッセイ用装置ならびにアッセイ用キットを提供。
【解決手段】透明平面基板１と、該基板の表面に形成された金属薄膜１１と、該金属薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された、誘電体からなるスペーサ層と、該スペーサ層の、該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に固定化された、蛍光色素５により標識されたリガンドとを含むことを特徴とするプラズモン励起センサ。
【選択図】図３

Description

本発明は、プラズモン励起センサおよびそれを用いたアッセイ法、該アッセイ用装置ならびに該アッセイ用キットに関する。さらに詳しくは、本発明は、金属薄膜の上に蛍光色素とリガンドとが固定化されているプラズモン励起センサ、および表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ−ｆｉｅｌｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）の原理に基づき該センサを用いたアッセイ法、該アッセイ用装置ならびに該アッセイ用キットに関する。

表面プラズモン励起増強蛍光分析法（ＳＰＦＳ）とは、照射したレーザ光が金薄膜表面で全反射減衰（ＡＴＲ）する条件において、金属薄膜表面に粗密波（表面プラズモン）を発生させることによって、照射したレーザ光が有するフォトン量を数十倍〜数百倍に増やし（表面プラズモンの電場増強効果）、これにより金薄膜近傍の蛍光色素を効率良く励起させることによって、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができる方法である。

このようなＳＰＦＳの原理に基づいたバイオセンサまたはバイオチップに関わる例として、特許文献１には、金属基板表面にカルボキシメチルデキストランを用いたリガンド（１次抗体）固定化膜を配し、表面プラズモンにより増強された電場で抗原に関係付けられた蛍光色素を検出する方法が示されている。

しかしながら、極微量アナライト(標的抗原)の検出においては、アッセイで抗原に関係付けられるコンジュゲート中の蛍光色素量も極微量であり、このことが蛍光発生量のボトルネックとなるため、プラズモン電場増強を用いても蛍光シグナル量が上がらず、アッセイ感度の向上は難しい。

一方、表面プラズモン励起増強において蛍光強度を効果的に増強する研究が行われており、特許文献２には、電場増強効果が高い金ナノ粒子（直径：２〜３０ｎｍ）を含むハイブリッド・プローブ粒子が開示されており、該ハイブリッド・プローブ粒子は、該金ナノ粒子の表面の一方において１〜１００の抗体タイプのタンパク質が金−硫黄結合により結合され、そして他方において少なくとも１０の蛍光有機色素が金−硫黄結合により結合している。

また、特許文献３には、１００〜８００ｎｍの断面粒径と３０〜５０ｎｍの厚さを有する平板状銀粒子をアイランド膜として基板上に密に配列した表面上に、単層または多層に蛍光物質を担持させている蛍光素子が記載され、銀粒子表面と蛍光物質との距離を調節するために、金属粒子表面にスペーサを備えている。

特許文献２および３に記載の発明は、蛍光色素層を金属近傍に配置することによりフォトンの利用効率を向上させて、蛍光発生の効率も改良される可能性があるが、蛍光色素の絶対量が少ない場合は対応できない。また、蛍光色素はコンジュゲートの形態に発展することは難しく、検出すべきアナライト量と関係付けられていないため、それ自体に特異性はなく、イムノアッセイに利用することもできない。

特許第３２９４６０５号 特表２００７−５１２５２２号公報 特開２００７−１３９５４０号公報

本発明は、高感度かつ高精度であり、イムノアッセイに必要不可欠である特異性に優れたプラズモン励起センサおよびそれを用いたアッセイ法、アッセイ用装置ならびにアッセイ用キットを提供することを目的とする。

本発明者らは、上記の問題および従来のサンドイッチイムノアッセイ法（図１）が抱える問題、すなわち、極微量のアナライトを検出する場合、通常のサンドイッチイムノアッセイ法を行っても、コンジュゲート自体も理論的に極微量なため、しばしば増強電場に見合う蛍光プローブ量が存在せず、感度的に満足するものとはならないという問題を解決すべく鋭意研究した結果、従来のサンドイッチイムノアッセイ法（図１）と、表面プラズモン励起増強蛍光分析法とを組み合わせ、さらにセンサとアナライトとの結合の有無により蛍光を消光する機構を設ける、すなわち発光と消光との機能を分担することによって、極微量のアナライト（例えば、標的抗原）であってもフォトン量に見合った蛍光発光と特異性とを両立できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明のプラズモン励起センサは、透明平面基板と、該基板の表面に形成された金属薄膜と、該金属薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された、誘電体からなるスペーサ層と、該スペーサ層の、該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に固定化された、蛍光色素により標識されたリガンドとを含むことを特徴とする。

上記金属薄膜は、金、銀、アルミニウム、銅および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属から形成されていることが好ましく、該金属は、金からなることがより好ましい。

上記誘電体は、二酸化ケイ素（ＳｉＯ₄）または二酸化チタン（ＴｉＯ₂）層を含むことが好ましい。
上記リガンドは、シランカップリング剤からなるＳＡＭ（自己組織化単分子膜）を介して上記スペーサ層に固定化されていることが好ましく、腫瘍マーカーまたはがん胎児性抗原を認識し結合する１次抗体であってもよい。

また、本発明のアッセイ法は、下記工程（ａ）〜（ｄ）を含むことを特徴とする。
工程（ａ）：請求項１〜６のいずれかに記載のプラズモン励起センサに、検体を接触させる工程、
工程（ｂ）：該工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサに、さらに、該プラズモン励起センサに含まれるリガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと蛍光を消光または吸収し得る化合物とのコンジュゲートを反応させる工程、
工程（ｃ）：該工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサに、上記透明平面基板の、上記金属薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程、および
工程（ｄ）：該工程（ｃ）で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程。

上記アナライトに、上記コンジュゲートが結合してもよく、または上記アナライトとは異なるアナライトであって、上記アナライトと競合するアナライトが、上記コンジュゲートと予め結合していてもよい。

上記検体は、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液および唾液からなる群から選択される少なくとも１種の体液であることが好ましい。
上記アナライトは、腫瘍マーカーまたはがん胎児性抗原であってもよい。

本発明の装置は、上記工程（ｃ）に用いられることを特徴とする。
本発明のキットは、上記アッセイ法に用いられることを特徴とする。

従来、極微量のアナライトを測定する超高感度な系において、表面プラズモンの電場増強（電場増強フォトン量の例）と微量な蛍光色素量（蛍光フォトン量の例）のミスマッチが起こり感度の限界が生じる。

それに対して、本発明のプラズモン励起センサは、本発明のアッセイ法に用いた場合、図２に従えば、蛍光色素層を設けることにより電場増強に見合う蛍光を発生（シグナル量＝色素層で発生可能なフォトン量の例）させることができ、かつ蛍光をアナライトの量に応じて消光剤により調整(ノイズ量＝消光剤で消光可能なフォトン量の例)することができるため、ノイズが少なく、シグナルが多い高Ｓ／Ｎ比のアッセイが可能となる。

すなわち、本発明は、１リットル当り１０^-18モル（１ａｍｏｌ/Ｌ）〜１０^-12モル（１ｐｍｏｌ/Ｌ）レベルの濃度のアナライト（例えば、標的抗原）を含む検体から、高感度かつ高精度で該アナライトを検出できるプラズモン励起センサを提供することができる。

また、微量のアナライトを検出する際、従来のサンドイッチイムノアッセイ法では蛍光信号（蛍光シグナル）量が少なくＳ／Ｎ比が劣化するが、本発明は、プラズモン励起センサ、およびリガンド（例えば、２次抗体）と消光剤とのコンジュゲートを用いて本発明のアッセイ法に適用した場合、標的抗原量と比例するのが消光剤であるためＳ／Ｎ比が劣化しないプラズモン励起センサを提供することができる。

また、本発明は、消光剤の能力次第で蛍光信号量を調整できるため、本発明のアッセイ法が最適なＳ／Ｎ比で実施可能なプラズモン励起センサを提供することができる。
さらに、本発明は、本発明のアッセイ法において、アナライト（標的抗原）と、該アナライトと競合する抗原を予め結合させた２次抗体（リガンド）と消光剤とのコンジュゲートとを競合させることにより、蛍光信号（蛍光シグナル）量と標的抗原量とを比例させることができるプラズモン励起センサを提供することができる。

図１は、従来のサンドイッチイムノアッセイ法において、基板１に固定化された１次抗体２に、検体中に含有される標的抗原３が結合した後、蛍光色素５により標識された２次抗体４を反応させている状態を模式的に示す。 図２は、透明平面基板と、該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と、該金属薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された誘電体からなるスペーサ層と、該スペーサ層の、該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に固定化された１次抗体とを有するＳｅｎｓｅｒ Ｃｈｉｐにレーザ光を照射して、蛍光量をＣＣＤにより検出している状態を模式的に示したＳＰＦＳ装置の光学配置図；および、Ｌａｓｅｒ Ｄｉｏｄｅ（半導体レーザ）を光源とする「入射光子数」、該光源により励起された表面プラズモンの電場増強効果による「励起光子数」、２次抗体に標識された蛍光色素が励起される「吸収光子数」ならびにＣＣＤに検出された「蛍光光子数」をそれぞれ算出したフローチャートを示し、 フローチャート中の具体的な数値は、下記（１）〜（３）の仮定に基づき算出されたものである：（１）Ｌａｓｅｒ Ｄｉｏｄｅを用いてレーザ光を照射する際、Ｐ偏光した後、ＮＤ ｆｉｌｔｅｒで光量を調整し、０．１ｍＷをＳｅｎｓｅｒ Ｃｈｉｐに入射する、（２）Ｓｅｎｓｅｒ Ｃｈｉｐが固定された流路中の含まれる２次抗体に標識された蛍光色素は０．４ｎｍｏｌ／Ｌであり（計測抗原量を０．２ｎｍｏｌ／Ｌ、２次抗体の蛍光剤標識率２％に相当する。）、有効プラズモン領域が１００ｎｍの厚さで存在する、（３）蛍光色素のモル吸光係数を２５０，０００、蛍光量子収率を０．４７とする； すなわち、０．１ｍＷのレーザ光が入射し、金基板で１７倍の電場増強があるとすると、光子数は約１５乗個にのぼるが、実際にｎｍｏｌ／Ｌレベルの抗原測定においては、蛍光色素を介して発生する光子数は６乗個にまで減少し、増強電場された光子の多くは利用されず、検出されるシグナルも光子量が極めて少ないことから、アッセイの精度が向上するとは言えない。 図３は、本発明のアッセイ法のタイプ１（例えば、実施例８〜１４）、およびタイプ２（例えば、実施例１〜７）であって、本発明のプラズモン励起センサと検体とを反応させた後、消光色素６を固定化された２次抗体４をさらに反応させ、表面プラズモンにより励起された蛍光色素が発した蛍光１３を表している状態を模式的に示す。

以下、本発明について具体的に説明する。
＜プラズモン励起センサ＞
本発明のプラズモン励起センサは、透明平面基板と、該基板の表面に形成された金属薄膜と、該金属薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された、誘電体からなるスペーサ層と、該スペーサ層の、該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に固定化された、蛍光色素により標識されたリガンドとを含むことを特徴とするものである。

本発明のプラズモン励起センサは、例えば、ＧＥヘルスケア バイオサイエンス（株）製のＢｉａｃｏｒｅシステムに用いられるセンサーチップなどのように金薄膜を有するものも、本発明のプラズモン励起センサに利用することができる。

（透明平面基板）
本発明で用いられる透明平面基板としては、ガラス製であっても、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）などのプラスチック製であってもよく、屈折率〔ｎｄ〕が好ましくは１．４０〜２．２０であり、厚さが好ましくは０．０１〜１０ｍｍ、より好ましくは０．５〜５ｍｍであれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。

なお、ガラス製の透明平面基板は、市販品として、ＳＣＨＯＴＴ ＡＧ社製のＢＫ７（屈折率〔ｎｄ〕１.５２）およびＬａＳＦＮ９（屈折率〔ｎｄ〕1.８５）、（株）住田光学ガラス製のＫ−ＰＳＦｎ３（屈折率〔ｎｄ〕１．８４）、Ｋ−ＬａＳＦｎ１７（屈折率〔ｎｄ〕１．８８）およびＫ−ＬａＳＦｎ２２（屈折率〔ｎｄ〕１．９０）、（株）オハラ製のＳ−ＬＡＬ１０（屈折率〔ｎｄ〕１．７２）などが光学的特性と洗浄性との観点から好ましい。

透明平面基板は、その表面に金属薄膜を形成する前に、その表面を酸および／またはプラズマにより洗浄することが好ましい。
酸による洗浄処理としては、０．００１〜１Ｎの塩酸中に、１〜３時間浸漬することが好ましい。
プラズマによる洗浄処理としては、例えば、プラズマドライクリーナー（ヤマト科学（株）製のＰＤＣ２００）中に、０．１〜３０分間浸漬させる方法が挙げられる。

（金属薄膜）
上記「透明平面基板」の一方の表面に形成された金属薄膜としては、好ましくは、金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなり、より好ましくは金からなることが望ましく、これら金属の合金であってもよい。このような金属種は、酸化に対して安定であり、かつ表面プラズモンによる電場増強が大きくなることから好適である。

なお、上記「透明平面基板」としてガラス製平面基板を用いる場合に限り、ガラスと上記金属薄膜とをより強固に接着することができることから、あらかじめクロム、ニッケルクロム合金またはチタンの薄膜を形成することが好ましい。

透明平面基板上に金属薄膜を形成する方法としては、例えば、スパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法等）、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられる。薄膜形成条件の調整が容易なことから、スパッタリング法または蒸着法によりクロムの薄膜および／または金属薄膜を形成することが好ましい。

金属薄膜の厚さとしては、金：５〜５００ｎｍ、銀：５〜５００ｎｍ、アルミニウム：５〜５００ｎｍ、銅：５〜５００ｎｍ、白金：５〜５００ｎｍ、およびそれらの合金：５〜５００ｎｍが好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１〜２０ｎｍが好ましい。

電場増強効果の観点から、金：２０〜７０ｎｍ、銀：２０〜７０ｎｍ、アルミニウム：１０〜５０ｎｍ、銅：２０〜７０ｎｍ、白金：２０〜７０ｎｍ、およびそれらの合金：１０〜７０ｎｍがより好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１〜３ｎｍがより好ましい。

金属薄膜の厚さが上記範囲内であると、表面プラズモンが発生し易いので好適である。また、このような厚さを有する金属薄膜であれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。

（誘電体からなるスペーサ層）
「誘電体からなるスペーサ層」は、上記「金属薄膜」による蛍光色素の金属消光を防止することを目的として、該金属薄膜の、上記「透明平面基板」と接していないもう一方の表面に形成したものであって、該誘電体としては、光学的に透明な各種無機物、天然または合成ポリマーを用いることもできるが、化学的安定性、製造安定性および光学的透明性に優れていることから二酸化ケイ素（ＳｉＯ₂）または二酸化チタン（ＴｉＯ₂）を含むことが好ましい。

該スペーサ層の厚さは、通常１０ｎｍ〜１ｍｍであり、共鳴角安定性の観点からは、３０ｎｍ以下が好ましく、１０〜２０ｎｍがより好ましい。また、電場増強の観点からは、２００ｎｍ〜１ｍｍが好ましく、電場増強効果の安定性の観点からは、４００〜１,６００ｎｍが好ましい。本発明のプラズモン励起センサが、今後、大量生産される際、該センサが有するスペーサ層の厚さが変動することが想定され、特に４００ｎｍ以上の厚さを有すると共鳴角の変動が一層大きくなる可能性があるため、測定の安定性を確保する目的から、該スペーサ層の厚さとして、特に１０〜２０ｎｍが好ましい。

該スペーサ層の形成方法としては、例えば、スパッタリング法、電子線蒸着法、熱蒸着法、ポリシラザン等の材料を用いた化学反応による形成方法、またはスピンコータによる塗布などが挙げられる。

（蛍光色素）
本発明に係る蛍光色素は、下記「リガンド」に標識するために用いられるものであり、本発明において、所定の励起光を照射する、または電界効果を利用して励起することによって蛍光を発光する物質の総称であり、該「蛍光」は、燐光など各種の発光も含む。

本発明で用いられる蛍光色素は、特に限定されず、公知の蛍光色素のいずれであってもよい。一般に、単色比色計（ｍｏｎｏｃｈｒｏｍｏｍｅｔｅｒ）よりむしろフィルタを備えた蛍光計の使用をも可能にし、かつ検出の効率を高める大きなストークス・シフトを有する蛍光色素が好ましい。

このような「蛍光色素」としては、例えば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、クマリン・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ローダミン・ファミリーの蛍光色素（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス（株）製）、シアニン・ファミリーの蛍光色素、インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素、オキサジン・ファミリーの蛍光色素、チアジン・ファミリーの蛍光色素、スクアライン・ファミリーの蛍光色素、キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素、ピレン・ファミリーの蛍光色素、トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン（株）製）などが挙げられ、さらに米国特許番号第６,４０６,２９７号、同第６,２２１,６０４号、同第５,９９４,０６３号、同第５,８０８,０４４号、同第５,８８０,２８７号、同第５,５５６,９５９号および同第５,１３５,７１７号に記載の蛍光色素も本発明で用いることができる。

これらファミリーに含まれる代表的な蛍光色素の吸収波長（ｎｍ）および発光波長（ｎｍ）を表１に示す。

（蛍光色素により標識されたリガンド）
「リガンド」とは、検体中に含有されるアナライトを特異的に認識し（または、認識され）結合し得る分子または分子断片であって、このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などであれば、特に限定されない。

「タンパク質」としては、例えば、抗体などが挙げられ、具体的には、抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（（株）日本医学臨床検査研究所などから入手可能）、抗ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）モノクローナル抗体、抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体、抗ＰＳＡモノクローナル抗体などが挙げられる。

なお、本発明において、「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、遺伝子組換えにより得られる抗体、および抗体断片を包含する。
「蛍光色素により標識されたリガンド」とは、上記「蛍光色素」を、このような「リガンド」に標識したものである。

標識する方法としては、例えば、蛍光色素の活性エステル体を作製し、さらにリガンドとアミンカップリングする方法が一般的であり、蛍光色素の反応基として、アミノ基、イソチオシアネート基、スルホニルクロリド基、メルカプト基、ヨードアセトアミド基などの様々な官能基を導入することができるので、該反応基とリガンドが有する官能基とを反応可能な条件で化学結合を形成させること方法なども挙げられる。

「蛍光色素により標識されたリガンド」の固定化方法としては、シランカップリング剤からなるＳＡＭ（自己組織化単分子膜）を介して上記「誘電体からなるスペーサ層」に固定化する方法が好適である。

また、該スペーサ層に固定化したリガンドに蛍光色素を標識する方法も利用可能であり、リガンドと反応可能な官能基を有するシランカップリング剤でリガンドを固定化した後、さらに上記反応性基を有する蛍光色素を流路中で反応させ、蛍光色素により標識された固定化リガンドを作製することもできる。

「シランカップリング剤」としては、加水分解でシラノール基（Ｓｉ-ＯＨ）を与えるエトキシ基（またはメトキシ基）を有し、他端にアミノ基やグリシジル基、カルボキシル基などの反応基を有するシランカップリング剤であればよく、具体例として、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、８−アミノ−オクチルトリエトキシシラン、６−アミノ−ヘキシルトリエトキシシラン、７−カルボキシ−ヘプチルトリエトキシシラン、５−カルボキシ−ペンチルトリエトキシシランなどが挙げられるが、本発明はこれらに限定されず、従来公知のシランカップリング剤も用いることができる。

シランカップリング剤以外に、リガンドの固定化能に優れることから、例えば、カルボキシメチルデキストラン、ポリエチレングリコール、イミノジ酢酸誘導体（（Ｎ−５−ａｍｉｎｏ−１−ｃａｒｂｏｘｙｐｅｎｔｙｌ）ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ等）、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧなども用いることができる。

このような「蛍光色素により標識されたリガンド」の固定化方法の具体例として、まず金薄薄膜および誘電体からなるスペーサ層が、その一方の表面に順に形成された透明平面基板を、シランカップリング剤を通常０．１〜１０％、好ましくは０．５％の濃度で含む水溶液に、３０分〜２時間浸漬後、室温の場合、通常１〜２４時間、好ましくは１０時間、１００℃の場合、通常１０分〜１時間、好ましくは３０分の乾燥を行い、この後、通常、上記基板を水で洗浄する。この時点で、シランカップリング剤の一方の末端が加水分解して得られたシラノール基（Ｓｉ−ＯＨ）を該スペーサ層側にして並べたＳＡＭ（Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；自己組織化単分子膜）が形成されている。シランカップリング剤からなるＳＡＭの外側には、シランカップリング剤が有するアミノ基やカルボキシル基が露出している状態となっている。

次に、リガンドが有するカルボキシル基を、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）など）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）とにより活性エステル化し、このように活性エステル化したカルボキシル基と、上記シランカップリング剤が有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる。

＜アッセイ法＞
本発明のアッセイ法は、下記工程（ａ）〜（ｄ）を含むことを特徴とするものである。
工程（ａ）：本発明のプラズモン励起センサに、検体を接触させる工程、
工程（ｂ）：該工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサに、さらに、該プラズモン励起センサに含まれるリガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと蛍光を消光または吸収し得る化合物とのコンジュゲートを反応させる工程、
工程（ｃ）：該工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサに、上記透明平面基板の、上記金属薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程、および
工程（ｄ）：該工程（ｃ）で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程。

（工程（ａ））
工程（ａ）とは、本発明のプラズモン励起センサに、検体を接触させる工程である。
「検体」としては、例えば、血液（血清・血漿）、尿、鼻孔液、唾液、便、体腔液（髄液、腹水、胸水等）などが挙げられ、所望の溶媒、緩衝液等に適宜希釈して用いてもよい。これら検体のうち、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液および唾液が好ましい。

「接触」は、流路中に循環する送液に検体が含まれ、プラズモン励起センサの蛍光色素およびリガンドが固定化されている片面のみが該送液中に浸漬されている状態において、プラズモン励起センサと検体とを接触させる態様が好ましい。

「流路」とは、微量な薬液の送達を効率的に行うことができ、反応促進を行うために送液速度を変化させたり、循環させたりすることができる直方体または管状のものであって、プラズモン励起センサを設置する個所近傍は直方体構造を有することが好ましく、薬液を送達する個所近傍は管状を有することが好ましい。

その材料としては、プラズモン励起センサ部ではメチルメタクリレート、スチレン等を原料として含有するホモポリマーまたは共重合体、ポリエチレン、ポリオレフィン等からなり、薬液送達部ではシリコンゴム、テフロン（登録商標）、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリマーを用いる。

プラズモン励起センサ部においては、検体との接触効率を高め、拡散距離を短くする観点から、プラズモン励起センサ部の流路の断面として、縦×横がそれぞれ独立に１００ｎｍ〜１ｍｍ程度が好ましい。

流路にプラズモン励起センサを固定する方法としては、小規模ロット（実験室レベル）では、まず、該プラズモン励起センサの金属薄膜が形成されている表面に、流路高さ０．５ｍｍを有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートを該プラズモン励起センサの金属薄膜が形成されている部位を囲むようにして圧着し、次に、該ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートと該プラズモン励起センサとをビス等の閉め具により固定する方法が好ましい。

工業的に製造される大ロット（工場レベル）では、流路にプラズモン励起センサを固定する方法としては、プラスチックの一体成形品に金基板を形成、または別途作製した金基板を固定し、金表面に誘電体層、蛍光色素層およびリガンド固定化を行った後、流路の天板に相当するプラスチックの一体成形品により蓋をすることで製造できる。必要に応じてプリズムを流路に一体化することもできる。

「送液」としては、検体を希釈した溶媒または緩衝液と同じものが好ましく、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）などが挙げられるが、特に限定されるものではない。

送液を循環させる温度および時間としては、検体の種類などにより異なり、特に限定されるものではないが、通常２０〜４０℃×１〜６０分間、好ましくは３７℃×５〜１５分間である。

送液中の検体中に含有されるアナライトの初期濃度は、１００μｇ／ｍＬ〜０．００１ｐｇ／ｍＬであってもよい。
送液の総量、すなわち流路の容積としては、通常０．００１〜２０ｍＬ、好ましくは０．１〜１ｍＬである。
送液の流速は、通常１〜２,０００μＬ／ｍｉｎ、好ましくは５〜５００μＬ／ｍｉｎである。

（洗浄工程）
洗浄工程とは、下記工程（ｂ）の前および／または後に含まれることが好ましく、上記工程（ａ）で得られたプラズモン励起センサの表面、および／または下記工程（ｂ）で得られたプラズモン励起センサの表面を洗浄する工程である。

該工程に使用される洗浄液としては、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ１００などの界面活性剤を、工程（ａ）および（ｂ）の反応で用いたものと同じ溶媒または緩衝液に溶解させ、好ましくは０．００００１〜１重量％含有するものが望ましい。

洗浄液を循環させる温度および流速は、上記工程（ａ）の「送液を循環させる温度および流速」に等しいことが好ましい。
洗浄液を循環させる時間は、通常０．５〜１８０分間、好ましくは５〜６０分間である。

（工程（ｂ））
工程（ｂ）とは、上記工程（ａ）、好ましくは上記洗浄工程を経て得られたプラズモン励起センサに、さらに、該プラズモン励起センサに含まれるリガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと蛍光を消光または吸収し得る化合物とのコンジュゲートを反応させる工程である。

「蛍光を消光または吸収し得る化合物」、すなわち「消光剤（消光色素）」または「クエンチャー」とは、上記「蛍光色素」の励起されたエネルギーを吸収できる適切なエネルギー準位を有する化合物であって、ある蛍光色素に対して適切な消光剤を添加すると、蛍光が消失する。

「消光剤」としては、フルオレセイン・ファミリーの消光色素、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの消光色素、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの消光色素、クマリン・ファミリーの消光色素、ローダミン・ファミリーの消光色素、シアニン・ファミリーの消光色素、オキサジン・ファミリーの消光色素、チアジン・ファミリーの消光色素、スクアライン・ファミリーの消光色素、キレート化ランタニド・ファミリーの消光色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）・ファミリーの消光色素などが挙げられ、より具体的には、例えば、ＢＨＱ（登録商標）・ファミリーの色素（国際公開第０１／８６００１号パンフレットに記載されているクエンチャー：ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２およびＢＨＱ−３を含む。）（バイオサーチテクノロジーズ ジャパンＢＴＪ（株）製）、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＤＡＢＣＹＬ（４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＴＡＭＲＡ（Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン）（インビトロジェン（株）製）、Ｃｙ３（登録商標）（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス（株）製）、Ｃｙ５（登録商標）（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス（株）製）、１−ベンジル−１，４−ジヒドロニコチンアミド（ＢＮＡＨ）、９−アントラセンカルボニトリル、２−ナフトール、２−メトキシナフタレン、１，４−ナフトキノン、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−１，４−ベンゾキノン、３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−１，２−ベンゾキノン、１−ナフトエ酸（１−ＮＡ）、２−ナフトエ酸（２−ＮＡ）、１−ピレン酪酸（ＰｙＢＡ）、４−ニトロ安息香酸（ＰＮＢＡ）、アントラキノン−２−カルボン酸（ＡＱＣＡ）、ピレンなどが挙げられる。また、本発明は、米国特許番号第６,３９９,３９２号、同第６,３４８,５９６号、同第６,０８０,０６８号および同第５,７０７,８１３号に記載の消光剤を用いることもできる。

これらの消光剤のうち、バイオサーチテクノロジーズ ジャパンＢＴＪ（株）製のＢＨＱ−１（最大波長５３４ｎｍ）、ＢＨＱ−２（最大波長５７９ｎｍ）、ＢＨＱ−３（最大波長６７２ｎｍ）等のシリーズが広い波長領域をカバーするダーククエンチャー（自らは発光しない消光剤）として好ましい。

上記以外の「消光剤」の系統としては、通常、テトラシアノキノジメタン類、アミニウム類、ジインモニウム類、ヒドラジン類、ヒドラジド類、ヒドロキシルアミン類、ハイドロキノン類、四置換ホウ素陰イオン類、またはニッケル類、アゾ色素の重金属錯体類、フォルマザン重金属錯体、ジピロメテン金属錯体類、ポルフィリン重金属錯体類、重金属フタロシアニン類、重金属ナフタロシアニン類、メタロセン類等の金属錯体などが挙げられる。

表面プラズモンによって励起された蛍光色素によって放射されるフォトンは、電子励起状態で消光剤にエネルギー移動されてクエンチされると考えられる。すなわち、電子励起状態のエネルギーを吸収した消光剤は、異なった波長のフォトンまたは熱としてエネルギーを放出すると考えられる。したがって、消光剤は蛍光色素でもあってもよい。

一般に、蛍光色素と消光剤とのエネルギー転移は、蛍光色素と消光剤との間の距離、すなわち臨界転移距離に依存する。「臨界転移距離」とは、蛍光色素の電子励起準位（通常1重項）と消光剤の最低空軌道とが相互作用できる距離であり、消光剤が有機物の場合、通常１０ｎｍ前後の距離、金属含有物の場合では通常３０ｎｍ程度の距離である。特定の蛍光色素と消光剤との臨界転移距離については、当該技術分野において周知であり、例えば、ＷｕおよびＢｒａｎｄ、１９９４年、Ａｎａｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ. ２１８：１〜３ページの論文に記載の臨界転移距離を参照することができる。

特定の蛍光色素と消光剤との組み合わせの基準としては、例えば、蛍光色素による蛍光発光の量子収率；蛍光色素によって放たれる蛍光波長；消光剤の減衰係数；消光剤によって放たれる蛍光波長；消光剤による蛍光発光の量子収率などが挙げられる。また、消光剤が蛍光色素でもある場合、消光剤と蛍光色素とが、一方によって放射された蛍光がもう片方によって放射された蛍光と容易に区別できるように組み合わせることが好ましい。特定の蛍光色素と消光剤との組み合わせの選択については、ＫｌｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒおよびＭｉｌｌａｒ、２００２年、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ６１：１５９〜１７９ページの総論を参照することができる。

本発明で用いられる蛍光色素と消光剤との例示的な組み合わせは、蛍光色素として６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）と消光剤としてＣｙ５（登録商標）；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（蛍光色素）とＢＨＱ−３（消光剤）；ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＨＥＸおよびＯｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（蛍光色素）とＢＨＱ−１（消光剤）；ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ３.５、ＣＡＬ ＲｅｄおよびＲｅｄ ６４０（蛍光色素）とＢＨＱ−２（消光剤）；Ｃｙ５およびＣｙ５.５（蛍光色素）とＢＨＱ−３（消光剤）、米国特許番号第６,２４５,５１４号に記載されている組み合わせ、表２に記載の組み合わせなどが挙げられるが、本発明はこれらに限定されない。

蛍光色素および消光剤の両方として使用可能である分子は、例えば、フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、２’,７’−ジメトキシ−４’,５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、ローダミン、６−カルボキシローダミン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）などが挙げられる。

「プラズモン励起センサに含まれるリガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと蛍光を消光または吸収し得る化合物とのコンジュゲート」は、リガンドとして２次抗体を用いる場合、以下の態様（Ｉ）または（ＩＩ）が好ましい。

態様（Ｉ）：２次抗体は、検体中に含有されるアナライト（標的抗原）を認識し結合し得る抗体である。ただし、本発明のプラズモン励起センサに固定化されているリガンドとして用いる１次抗体抗がポリクローナル抗体である場合、２次抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよいが、該１次抗体がモノクローナル抗体である場合、２次抗体は、該１次抗体が認識しないエピトープを認識するモノクローナル抗体であるか、またはポリクローナル抗体であることが望ましい。

本発明のプラズモン励起センサに固定化されているリガンドとして用いる１次抗体抗が、例えば、ＡＦＰモノクローナル抗体である場合、態様（Ｉ）の２次抗体としては、検体中に含有されるＡＦＰに競合する抗原を認識し結合することができるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を必要とする。

態様（Ｉ）は、消光剤の能力次第で蛍光信号量を調整できるため、本発明のアッセイ法が最適なＳ／Ｎ比で実施可能であるから好適である。
態様（ＩＩ）：２次抗体は、検体中に含有されるアナライト（標的抗原）と競合するアナライト（競合抗原；ただし、標的抗原とは異なるものである。）を予め結合した抗体である。検体中に含有される競合抗原は０種または１種以上であるから、２次抗体自体を必要としないか、または１種以上の２次抗体を必要とする。

態様（ＩＩ）は、蛍光信号（蛍光シグナル）量と標的抗原量とを比例させることができるため好適である。
上記１次抗体が抗ＡＦＰモノクローナル抗体である場合、態様（ＩＩ）の２次抗体としては、抗ＡＦＰポリクローナル抗体、または該抗ＡＦＰモノクローナル抗体が認識しないエピトープを認識し結合することができる抗ＡＦＰモノクローナル抗体を必要とする。

「プラズモン励起センサに含まれるリガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと蛍光を消光または吸収し得る化合物とのコンジュゲート」の作製方法としては、リガンドとして上記「２次抗体」を用いる場合、例えば、まず消光剤にカルボキシル基を付与し、該カルボキシル基を、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）など）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）とにより活性エステル化し、次いで活性エステル化したカルボキシル基と２次抗体が有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法；イソチオシアネートおよびアミノ基をそれぞれ有する２次抗体および消光剤を反応させ固定化する方法；スルホニルハライドおよびアミノ基をそれぞれ有する２次抗体および消光剤を反応させ固定化する方法；ヨードアセトアミドおよびチオール基をそれぞれ有する２次抗体および消光剤を反応させ固定化する方法；ビオチン化された消光剤とストレプトアビジン化された２次抗体とを反応させ固定化する方法などが挙げられる。

このように作製された「プラズモン励起センサに含まれるリガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと蛍光を消光または吸収し得る化合物とのコンジュゲート」の送液中の濃度は、０.００１〜１０,０００μｇ／ｍＬが好ましく、１〜１,０００）μｇ／ｍＬがより好ましい。

送液を循環させる温度、時間および流速は、それぞれ上記工程（ａ）の場合と同様である。
また、工程（ｂ）と下記工程（ｃ）との間に、上記洗浄工程を含むことが好ましい。

（工程（ｃ））
工程（ｃ）とは、上記工程（ｂ）、好ましくは上記洗浄工程を経て得られたプラズモン励起センサに、上記金属薄膜を形成していない上記透明平面基板の片面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程である。

レーザ光は、光学フィルタを通して、プリズムに入射する直前のエネルギーおよびフォトン量を調節することが望ましい。
レーザ光の照射により、全反射減衰条件（ＡＴＲ）において、金属薄膜の表面に表面プラズモンが発生する。表面プラズモンの電場増強効果により、照射したフォトン量の数十〜数百倍に増えたフォトンにより蛍光色素を励起する。なお、該電場増強効果によるフォトン増加量は、基板となるガラスの屈折率、金属薄膜の金属種および膜厚に依存するが、通常、金では約１０〜２０倍の増加量となる。

蛍光色素は光吸収により分子内の電子が励起され、短時間のうちに第一電子励起状態に移動し、この状態（準位）から基底状態に戻る際、そのエネルギー差に相当する波長の蛍光を発する。

しかしながら、蛍光色素の基底状態から第一電子励起状態に移行する際に必要なエネルギーに相当するエネルギーを吸収することができる消光剤が近傍にあると、蛍光色素から消光剤へエネルギーが移動し、蛍光色素は蛍光を発生することなく第一電子励起状態から基底状態に戻ってしまう。この現象を消光という。

消光剤により消光されなかった蛍光は、カットフィルタを通して、集光レンズによりＳＰＦＳ検出部に入射し、入射光のカウント値を測定する。
「レーザ光」の光源としては、例えば、波長４００〜８４０ｎｍ、入射光量として１ｍＷ程度のレーザ光を照射できるＬＥＤ、波長２３０〜８００ｎｍ（金属薄膜に用いる金属種によって共鳴波長が決まる。）、０．０１〜１００ｍＷのレーザ光を照射できる半導体レーザ（ＬＤ）などが挙げられる。これら光源のうち、ＳＰＲではＬＥＤ、ＬＤともに用いることができるが、ＳＰＦＳでは蛍光色素を励起するために高エネルギーが必要であり、高感度の観点から、ＬＤが好ましい。

「プリズム」は、各種フィルタを介したレーザ光が、プラズモン励起センサに効率よく入射することを目的としており、屈折率が上記「透明平面基板」と同じであることが好ましい。本発明は、全反射条件を設定できる各種プリズムを適宜選択することができることから、角度、形状に特に制限はなく、例えば、６０度分散プリズムなどであってもよい。このようなプリズムの市販品としては、上述した「ガラス製の透明平面基板」の市販品と同様のものが挙げられる。

「光学フィルタ」としては、例えば、減光（ＮＤ）フィルタ、ダイアフラムレンズなどが挙げられる。
「減光（ＮＤ）フィルタ」（または、中性濃度フィルタ）は、入射レーザ光量を調節することを目的とするものである。特に、ダイナミックレンジの狭い検出器を使用するときには精度の高い測定を実施する上で用いることが好ましい。

「偏光フィルタ」は、レーザ光を、表面プラズモンを効率よく発生させるＰ偏光とするために用いられるものである。
「カットフィルタ」は、外光（装置外の照明光）、励起光（励起光の透過成分）、迷光（各所での励起光の散乱成分）、プラズモンの散乱光（励起光を起源とし、プラズモン励起センサ表面上の構造体または付着物などの影響で発生する散乱光）、酵素蛍光基質の自家蛍光、などの各種ノイズ光を除去するフィルタであって、例えば、干渉フィルタ、色フィルタなどが挙げられる。

「集光レンズ」は、検出器に蛍光シグナルを効率よく集光することを目的とするものであり、任意の集光系でよい。簡易な集光系として、顕微鏡などで使用されている、市販の対物レンズ（例えば、（株）ニコン製またはオリンパス（株）製等）を転用してもよい。対物レンズの倍率としては、１０〜１００倍が好ましい。

「ＳＰＦＳ検出部」としては、超高感度の観点からは光電子増倍管（浜松ホトニクス（株）製のフォトマルチプライヤー）が好ましい。また、これらに比べると感度は下がるが、画像として見ることができ、かつノイズ光の除去が容易なことから、多点計測が可能なＣＣＤイメージセンサも好適である。

（工程（ｄ））
工程（ｄ）とは、上記工程（ｃ）で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程である。

より具体的には、既知濃度のアナライトでの測定を実施することで検量線を作成し、作成された検量線に基づいて被測定検体中のアナライト（標的抗原）を測定シグナルから算出する工程である。

「アナライト（標的抗原）」としては、上記「誘電体からスペーサ層」に固定化された「蛍光色素により標識されたリガンド」を特異的に認識され（または、認識し）結合し得る分子または分子断片であって、このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）等のがん胎児性抗原や腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。

さらに、工程（ｄ）は、上記工程（ｃ）の前に測定したブランク蛍光シグナル、上記工程（ｃ）で得られたアッセイ蛍光シグナル、および何も修飾していない金基板を流路に固定し、超純水を流しながらＳＰＦＳを測定して得られたシグナルを初期ノイズとしたとき、下記式で表されるアッセイＳ／Ｎ比を算出することができる。
アッセイＳ／Ｎ比＝｜（アッセイ蛍光シグナル）−（ブランク蛍光シグナル）｜／（初期ノイズ）

＜装置＞
本発明の装置は、上記工程（ｃ）に用いられることを特徴とするものである。
すなわち、本発明の装置は、本発明のプラズモン励起センサを用いて、本発明のアッセイ法を実施するためのものである。

「装置」としては、少なくとも光源、光学フィルタ、プリズム、流路とプラズモン励起センサと送液ポンプと、カットフィルタ、集光レンズおよびＳＰＦＳ検出部を含むものとする。また、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）検出部、すなわちＳＰＲ専用の受光センサとしてのフォトダイオード、ＳＰＲおよびＳＰＦＳの最適角度を調製するための角度可変部（サーボモータで全反射減衰（ＡＴＲ）条件を求めるためにフォトダイオードと光源とを同期して、４５〜８５°の角度変更する。分解能は０．０１°以上が好ましい。）、ＳＰＦＳ検出部に入力された情報を処理するためのコンピュータなども含んでもよい。

光源、光学フィルタ、カットフィルタ、集光レンズおよびＳＰＦＳ検出部の好ましい態様は上述したものと同様である。
「送液ポンプ」としては、例えば、送液が微量な場合に好適なマイクロポンプ、送り精度が高く脈動が少なく好ましいが循環することができないシリンジポンプ、簡易で取り扱い性に優れるが微量送液が困難な場合があるチューブポンプなどが挙げられる。

＜キット＞
本発明のキットは、本発明のアッセイ法に用いられることを特徴とするものであって、本発明のアッセイ法を実施するにあたり、検体、１次抗体および２次抗体以外に必要とされるすべてのものを含むことが好ましい。

例えば、本発明のキットと、検体として血液と、特定の腫瘍マーカーに対する抗体とを用いることによって、特定の腫瘍マーカーの含有量を、高感度かつ高精度で検出することができる。この結果から、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌（上皮内癌）の存在も高精度で予測することができる。

このような「キット」としては、具体的に、透明平面基板上に金属薄膜、誘電体からなるスペーサ層をこの順に形成させたもの；蛍光色素；蛍光色素をリガンドに標識するための試薬類（例えば、水溶性カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）など）；シランカップリング剤；検体を溶解または希釈するための溶解液または希釈液；プラズモン励起センサと検体とを反応させるための各種反応試薬および洗浄試薬；蛍光を消光または吸収し得る化合物（例えば、ＢＨＱ−３など）；２次抗体に、蛍光を消光または吸収し得る化合物を固定化するための各種試薬（例えば、水溶性カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）など）が挙げられ、本発明のアッセイ法を実施するために必要とされる各種器材または資材や上記「装置」を含めることもできる。

さらに、キット要素として、検量線作成用の標準物質、説明書、多数検体の同時処理ができるマイクロタイタープレートなどの必要な器材一式などを含んでもよい。

次に、本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。なお、実施例１〜７および比較例１，２は、サンドイッチイムノアッセイ法を、実施例８〜１４および比較例３，４は、競合イムノアッセイ法を実施した。

［作製例１］（消光剤を固定化した２次抗体の作製）
ＢＨＱ−２ならびにＢＨＱ−３（バイオサーチテクノロジーズ ジャパンＢＴＪ（株）製／（株）日本バイオサービス製）およびＤＡＢＣＹＬ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を、それぞれ抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（１Ｄ５、２．５ｍｇ／ｍＬ、（株）日本医学臨床検査研究所製）に固定化した。
具体的には、消光剤のカルボキシル基と抗体のアミノ基とをアミノカップリング法により反応させた。

［作製例２］（消光剤を固定化し、競合抗原と複合化した２次抗体の作製）
ＢＨＱ−２、ＢＨＱ−３（バイオサーチテクノロジーズ ジャパンＢＴＪ（株）製／（株）日本バイオサービス製）およびＤＡＢＣＹＬ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を、２次抗体として抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（１Ｄ５、２．５ｍｇ／ｍＬ、（株）日本医学臨床検査研究所製）にそれぞれアミノカップリング法により固定化した。さらに過剰量のＡＦＰを混合し、消光剤を固定化した２次抗体に複合化した後、遠心分離およびクロマトグラフィーを用いて精製した。

［作製例３］（蛍光色素を標識したリガンドの作製）
蛍光色素（Ｃｙ３（登録商標）、Ｃｙ５（登録商標）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３，６４７またはＴＲＩＴＣ）により、リガンドとして１次抗体である抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（６Ｄ２、２．５ｍｇ／ｍＬ、（株）日本医学臨床検査研究所製）をアミノカップリング法により標識した。標識されなかった１次抗体を除去するため、さらに遠心分離およびクロマトグラフィーを用いて精製した。

［実施例１］
ＡＦＰ（抗原）が微量な領域(ｐｍｏｌ／Ｌ〜ｆｍｏｌ／Ｌ)でＳＰＦＳを用いてアッセイを行う。

(プラズモン励起センサの作製)
屈折率〔ｎｄ〕１．５２、厚さ１ｍｍで外形が２０ｍｍ×２０ｍｍのガラス製の透明平面基板（ＳＣＨＯＴＴ ＡＧ社製のＢＫ７）をプラズマ洗浄し、該基板の片面にクロム薄膜をスパッタリング法により形成した後、その表面にさら金薄膜をスパッタリング法により形成した。クロム薄膜の厚さは２ｎｍ、金薄膜の厚さは４８ｎｍであった。

金薄膜の、クロム薄膜とは接していない片面に対して、誘電体として二酸化ケイ素（ＳｉＯ₂）からなるスペーサ層をスパッタリング法により形成した。該スペーサ層の厚さは、１０ｎｍであった。

このようにして得られた基板を、７−カルボキシ−ヘプチルトリエトキシシランを５重量％含む５０％エタノール水溶液に浸漬し、３０℃で３０分間反応させた後、１００℃で３０分間乾燥を行った。これにより、該スペーサ層の上に、シランカップリング剤からなるＳＡＭが形成された。

上記スペーサ層にシランカップリング剤処理を行った表面に、２ｍｍ×１０ｍｍの流路を有する、外形が２０ｍｍ×２０ｍｍ、厚さ０．５ｍｍのポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製スペーサを設け、蛍光色素層表面が流路の内側となるように基板を配置する、次に液体を出し入れする貫通穴を２個有する厚さ４ｍｍで同外形のポリメチルメタクリレート板を流路の外側から基板を覆うように乗せ圧着し、ビスで流路と該ポリメチルメタクリレート板とを固定した。

送液として超純水を１０分間、その後ＰＢＳを３０分間、ペリスタポンプにより、３０℃、流速５００μＬ／ｍｉｎで循環させた。送液の総量は１５ｍＬである。
ここで、光源としてＬＤレーザを用いて、波長６３３ｎｍのレーザ光を照射し、光学フィルタとして減光フィルタ（中性濃度フィルタ）を用いてフォトン量を調節し、シグマ光機（株）製の６０度プリズムを通して、流路に固定されているリガンド固定化前のプラズモン励起センサに照射し、表面プラズモンの測定を開始した。

さらに、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を５０ｍＭと、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を１００ｍＭとを含むＰＢＳを５ｍＬ添加し（終濃度はそれぞれＮＨＳ：５０ｍＭ、ＷＳＣ：１００ｍＭ）、２０分間循環させた後に、作製例３で得られたリガンド（蛍光色素としてＣｙ５（登録商標）により標識された１次抗体）４０μＬ、を２時間循環させて、プラズモン励起センサを作製した。表面プラズモンで共鳴角のシフトを測定しリガンドの固定化を確認した。固定化量は４００ｎｇ／ｃｍ²であった。さらに、重量１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ緩衝生理食塩水にて３０分間循環送液することで、非特異吸着防止処理を行った。

（アッセイ法の実施）
工程（ａ）：送液をＰＢＳに代え、ＡＦＰを２０ｎｇ／ｍＬ含むＰＢＳを５ｍＬ添加し、３０分間循環させた。

洗浄工程：Ｔｗｅｅｎ２０を０.０５重量％含むＰＢＳを送液として１０分間循環させることによって洗浄した。ここで表面プラズモンを測定し最適角に固定した後、ＬＤレーザを用いて流路に固定されているプラズモン励起センサに照射し、カットフィルタとして（日本真空光学社製）、集光レンズとして２０倍の対物レンズ（（株）ニコン製）を用いてＣＣＤイメージセンサ（テキサスインスツールメント社製）を通してＳＰＦＳによる蛍光を検出し、ブランクの蛍光とした。

工程（ｂ）：作製例１で得られた二次抗体を１,０００ｎｇ／ｍＬ含むＰＢＳを５ｍＬ添加し、３０分間循環させた。
洗浄工程：Ｔｗｅｅｎ２０を０.０５重量％含むＰＢＳを送液として２０分間循環させることによって洗浄した。

工程（ｃ）：洗浄開始から２０分後のＣＣＤから観察したときのＳＰＦＳシグナル値を計測しアッセイシグナルとした。なお、別途金基板に何も修飾していないもう一方の流路をＳＰＦＳに設置し超純水を流しながら共鳴角を、表面プラズモン測定を元に再設定し、ＳＰＦＳを測定して得られたシグナルを「初期ノイズ」とした。

工程（ｄ）：（アッセイＳ／Ｎ比の評価）。
また、本発明のプラズモン励起センサにおけるアッセイ測定開始前のブランクの蛍光シグナルおよび比較サンプルのアッセイ開始前のブランクの蛍光シグナルを「ブランク蛍光シグナル」とし、「アッセイ蛍光シグナル」と「ブランク蛍光シグナル」との関係から、以下の式でＳ／Ｎ比を評価した。すなわち、抗原量に比例する２次抗体量により変化するアッセイ蛍光シグナルの数値の絶対値が大きく、また初期ノイズに対して数値的に充分大きいことがアッセイシグナルの信頼性が高いことになる。

アッセイＳ／Ｎ比＝｜（アッセイ蛍光シグナル）−（ブランク蛍光シグナル）｜／（初期ノイズ）
得られた結果を表３に示す。

［実施例２］
実施例１において、蛍光色素をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７に変更した以外は実施例１と同様にして本発明のプラズモン励起センサを作製し、アッセイ法を実施した。得られた結果を表３に示す。

［実施例３］
実施例１において、蛍光色素をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３に変更した以外は実施例１と同様にして本発明のプラズモン励起センサを作製し、アッセイ法を実施した。得られた結果を表３に示す。

［実施例４］
実施例１において、金属種を銀に、金属薄膜の厚さを４５ｎｍとし、蛍光色素をＴＲＩＴＣに、レーザ光の波長を５３２ｎｍとした以外は実施例１と同様にして本発明のプラズモン励起センサを作製し、アッセイ法を実施した。得られた結果を表３に示す。

［実施例５］
実施例４において、金属種をアルミニウムに、金属薄膜の厚さを１５ｎｍとした以外は実施例４と同様にして本発明のプラズモン励起センサを作製し、アッセイ法を実施した。得られた結果を表３に示す。

［実施例６］
実施例５において、金属薄膜の厚さを２０ｎｍとした以外は実施例５と同様にして本発明のプラズモン励起センサを作製し、アッセイ法を実施した。得られた結果を表３に示す。

［実施例７］
実施例６において、蛍光色素をＣｙ３（登録商標）に変更した以外は実施例６と同様にして本発明のプラズモン励起センサを作製し、アッセイ法を実施した。得られた結果を表３に示す。

［比較例１］
(プラズモン励起センサの作製)
屈折率〔ｎｄ〕１．５２、厚さ１ｍｍで外形が２０ｍｍ×２０ｍｍのガラス製の透明平面基板（ＳＣＨＯＴＴ ＡＧ社製のＢＫ７）をプラズマ洗浄し、該基板の片面にクロム薄膜をスパッタリング法により形成した後、その表面にさら金薄膜をスパッタリング法により形成した。クロム薄膜の厚さは２ｎｍ、金薄膜の厚さは４８ｎｍであった。

このような基板を、１０−カルボキシ−１−デカンチオールを１ｍＭ含むエタノール溶液に２４時間以上浸漬し、金薄膜の片面にＳＡＭを形成した。基板を該溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールで洗浄した後、エアガンで乾燥させた。

ＳＡＭの表面に、流路高さ０．５ｍｍを有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートを設け、さらにポリメチルメタクリレー製天板を配置して同様なプラズモン励起センサを作成した。送液として超純水を１０分間、その後ＰＢＳを２０分間、ペリスタポンプにより、室温、流速５００μＬ／ｍｉｎで循環させ、その表面を平衡化した。

続いて、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を５０ｍＭと、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を１００ｍＭとを含むＰＢＳを５ｍＬ送液し、２０分間循環送液させた後に、作製例３で得られたリガンド（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７を標識した１次抗体）溶液２.５ｍＬを３０分間循環送液することで、ＳＡＭ上に該リガンドを固相化した。重量１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ緩衝生理食塩水にて３０分間循環送液することで、非特異吸着防止処理を行った。

（アッセイ法の実施）
送液をＰＢＳに代え、ＡＦＰを１０ｎｇ／ｍＬ含むＰＢＳ溶液を５ｍＬ添加し、３０分間循環させた。

Ｔｗｅｅｎ２０を０.０５重量％含むＴＢＳを送液として１０分間循環させることによって洗浄した。
消光剤を標識しない２次抗体（１,０００ｎｇ／ｍＬとなるように調製したＰＢＳ溶液）を２．５ｍＬ添加し、３０分間循環させた。

その後、Ｔｗｅｅｎ２０を０.０５重量％含むＴＢＳを送液として２０分間循環させることによって洗浄した。
共鳴角を最適にしてＣＣＤから観察したときのシグナル値を計測しアッセイシグナルとした。なお、ＡＦＰを０ｎｇ／ｍＬ時のＳＰＦＳ測定シグナルをブランクシグナルとした。アッセイ評価としては実施例１と同様のアッセイＳ／Ｎ比を算出することで評価した。得られた結果を表３に示す。

［比較例２］
比較例１において、金属種をアルミニウムに、金属薄膜の厚さを２０ｎｍとして、蛍光色素をＣｙ３（登録商標）に変更した以外は比較例１と同様にしてアッセイ法を実施した。得られた結果を表３に示す。

表３から、アッセイＳ／Ｎ比では元の蛍光量に対して変化した測定蛍光量を求めており、測定における数値の信頼可能なダイナミックレンジを示す、さらにベースとなる基板のノイズレベルで除することによりノイズレベルを加えた信頼限界を求めることができる。すなわち、アッセイＳ／Ｎ比が高いほど、測定抗原量に対してより精度ある数値を提供していることになる。

本発明に係る、蛍光色素で標識した1次抗体を固定化し、かつ消光色素を２次抗体に結合した実施例においてはいずれも、比較例１および２に比べて高い蛍光シグナル値を有しており、単位抗原当たり、より多くの蛍光色素で信号を担っており数値の信頼性が高いことがわかった。またアッセイＳ／Ｎ比が比較例よりも桁違いに高いため測定感度もより高く設定できることがわかった。

［実施例８］
実施例１で作製したプラズモン励起センサを用いて、作製例２で得られた消光剤が標識された２次抗体をＡＦＰと複合体させたコンジュゲートを用いた以外は実施例１と同様の操作で競合イムノアッセイ法を実施した。得られた結果を表４に示す。

［実施例９］
実施例２で作製したプラズモン励起センサを用いて、作製例２で得られた消光剤が標識された２次抗体をＡＦＰと複合体させたコンジュゲートを用いた以外は実施例２と同様の操作で競合イムノアッセイ法を実施した。得られた結果を表４に示す。

［実施例１０］
実施例３で作製したプラズモン励起センサを用いて、作製例２で得られた消光剤が標識された２次抗体をＡＦＰと複合体させたコンジュゲートを用いた以外は実施例３と同様の操作で競合イムノアッセイ法を実施した。得られた結果を表４に示す。

［実施例１１］
実施例４で作製したプラズモン励起センサを用いて、作製例２で得られた消光剤が標識された２次抗体をＡＦＰと複合体させたコンジュゲートを用いた以外は実施例４と同様の操作で競合イムノアッセイ法を実施した。得られた結果を表４に示す。

［実施例１２］
実施例５で作製したプラズモン励起センサを用いて、作製例２で得られた消光剤が標識された２次抗体をＡＦＰと複合体させたコンジュゲートを用いた以外は実施例５と同様の操作で競合イムノアッセイ法を実施した。得られた結果を表４に示す。

［実施例１３］
実施例６で作製したプラズモン励起センサを用いて、作製例２で得られた消光剤が標識された２次抗体と複合体させたコンジュゲートを用いた以外は実施例６と同様の操作で競合イムノアッセイ法を実施した。得られた結果を表４に示す。

［実施例１４］
実施例7で作製したプラズモン励起センサを用いて、作製例２で得られた消光剤が標識された２次抗体をＡＦＰと複合体させたコンジュゲートを用いた以外は実施例7と同様の操作で競合イムノアッセイ法を実施した。得られた結果を表４に示す。

［比較例３］
比較例１で作製したプラズモン励起センサを用いて、消光剤を標識しない２次抗体をＡＦＰと複合体化させたコンジュゲートを用いた以外は比較例１と同様の操作で競合イムノアッセイ法を実施した。得られた結果を表４に示す。

［比較例４］
比較例２で作製したププラズモン励起センサを用いて、消光剤を標識しない２次抗体をＡＦＰと複合体化させたコンジュゲートを用いた以外は比較例２と同様の操作で競合イムノアッセイ法を実施した。得られた結果を表４に示す。

表４から、本発明の蛍光シグナル数値は充分高い値を示し、抗原の存在量を充分な精度で測定可能なことを示している。また、上述したように、アッセイＳ／Ｎ比も高い値を示し信頼性が高いことが確認できた。一方、比較例の競合アッセイにおいて、競合系なので蛍光シグナル値は高い数値を示し抗原存在量に対して充分な蛍光量があるものの、アッセイＳ／Ｎ比は実施例に比べて数値が低く測定値の信頼精度が低いことが示唆された。この結果から推測すると、蛍光色素単独のアッセイ測定系に比較して実施例の消光剤標識２次抗体測定系の方が蛍光量変化に及ぼすダイナミックレンジが広いことを示している。

本発明のプラズモン励起センサは、高感度および高精度であるから、例えば、がん胎児性抗原や腫瘍マーカーなどの生体分子の分子認識反応を利用した選択的バイオセンサやバイオプローブに直接応用できる。

１・・・基板
２・・・１次抗体
３・・・検体中に含有される標的抗原
４・・・２次抗体
５・・・蛍光色素
６・・・２次抗体に固定化されている消光色素
７・・・検体中に含有される標的抗原３とは異なる抗原であって、該標的抗原３と競合する抗原
１１・・・透明平面基板の一方の表面に形成された金属薄膜
１３・・・表面プラズモンにより励起された蛍光色素が発した蛍光

Claims (13)

1. 透明平面基板と、
   該基板の表面に形成された金属薄膜と、
   該金属薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された、誘電体からなるスペーサ層と、
   該スペーサ層の、該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に固定化された、蛍光色素により標識されたリガンドと
   を含むことを特徴とするプラズモン励起センサ。
2. 上記金属薄膜が、金、銀、アルミニウム、銅および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属から形成されている請求項１に記載のプラズモン励起センサ。
3. 上記金属が、金からなる請求項２に記載のプラズモン励起センサ。
4. 上記誘電体が、二酸化ケイ素（ＳｉＯ₄）または二酸化チタン（ＴｉＯ₂）層を含む請求項１〜３のいずれかに記載のプラズモン励起センサ。
5. 上記リガンドが、シランカップリング剤からなるＳＡＭ（自己組織化単分子膜）を介して上記スペーサ層に固定化されている請求項１〜４のいずれかに記載のプラズモン励起センサ。
6. 上記リガンドが、腫瘍マーカーまたはがん胎児性抗原を認識し結合する１次抗体である請求項１〜５のいずれかに記載のプラズモン励起センサ。
7. 下記工程（ａ）〜（ｄ）を含むことを特徴とするアッセイ法。
   工程（ａ）：請求項１〜６のいずれかに記載のプラズモン励起センサに、検体を接触させる工程、
   工程（ｂ）：該工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサに、さらに、該プラズモン励起センサに含まれるリガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと蛍光を消光または吸収し得る化合物とのコンジュゲートを反応させる工程、
   工程（ｃ）：該工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサに、上記透明平面基板の、上記金属薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程、および
   工程（ｄ）：該工程（ｃ）で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程。
8. 上記アナライトに、上記コンジュゲートが結合する請求項７に記載のアッセイ法。
9. 上記アナライトとは異なるアナライトであって、上記アナライトと競合するアナライトが、上記コンジュゲートと予め結合している請求項７に記載のアッセイ法。
10. 上記検体が、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液および唾液からなる群から選択される少なくとも１種の体液である請求項７〜９のいずれかに記載のアッセイ法。
11. 上記アナライトが、腫瘍マーカーまたはがん胎児性抗原である請求項７〜１０のいずれかに記載のアッセイ法。
12. 請求項７に記載の工程（ｃ）に用いられることを特徴とする装置。
13. 請求項７〜１１のいずれかに記載のアッセイ法に用いられることを特徴とするキット。