WO2013105612A1 - 血中の目的細胞の定量方法および該細胞を定量するシステムの評価方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(B) 赤血球以外の細胞が多く含まれる層を抽出し、該層に含まれる該目的細胞の数および該樹脂粒子の数(P1個)を計測する工程;ならびに
(C) 該目的細胞の数にP0/P1を乗じることによって、該目的細胞の数を校正する工程。
(b) 赤血球以外の細胞が多く含まれる層を抽出し、該層に含まれる該樹脂粒子Pの数(P1個)と該樹脂粒子Nの数(N1個)とを計測する工程;
(c) (P1/P0)×100を算出して、所定の基準値と比較し、該システム全体がどの程度機能しているかを評価する工程;ならびに
(d) N1/P1を算出して、所定の基準値と比較し、該密度勾配遠心法によりどの程度層が分離しているかを評価する工程。
(e) P1個の該樹脂粒子PまたはN1個の該樹脂粒子Nに由来する発光シグナルを測定し、発光シグナル検出機器を校正する工程
をさらに含んでいることが好ましい。
上記樹脂粒子Pを既知数個有することを特徴とし、本発明の定量方法に用いるためのキット、および、
上記樹脂粒子Pと上記樹脂粒子Nとをそれぞれ既知数個ずつ有することを特徴とし、本発明の評価方法に用いるためのキット
が挙げられる。
本発明の定量方法は、血液由来検体に含有されている可能性のある、血漿の比重より大きいが赤血球の比重より小さい比重を有する目的細胞を定量する方法であって、下記(A)~(C)の工程を含むことを特徴とする。
(B) 赤血球以外の細胞が多く含まれる層を抽出し、該層に含まれる該目的細胞の数および該樹脂粒子の数(P1個)を計測する工程;ならびに
(C) 該目的細胞の数にP0/P1を乗じることによって、該目的細胞の数を校正する工程。
工程(A)は、血漿の比重より大きいが赤血球の比重より小さい比重を有する樹脂粒子Pを既知数個(P0個)含有させた血液由来検体を、密度勾配遠心法により、赤血球が多く含まれる層と赤血球以外の細胞が多く含まれる層との少なくとも二層に分離する工程である。ここで、本発明において、樹脂粒子Pは、後記「樹脂粒子P」の項で後述するように、目的細胞の内部標準として機能する。
工程(B)は、赤血球以外の細胞が多く含まれる層を抽出し、この層に含まれる目的細胞の数および樹脂粒子Pの数(P1個)を計測する工程である。
工程(C)は、工程(B)によって計測された目的細胞の数にP0/P1を乗じることによって、該目的細胞の数を校正する工程である。
T1/T0=P1/P0
の関係を満たすと見なすことができる。そうすると、血液由来検体に含有されていた目的細胞の数T0を、
T0=T1×(P0/P1)
と算出することができる。
本発明で用いる血液由来検体としては、例えば、血液そのものやその他の体液もしくはこれらを適切な緩衝液等で希釈したもの(すなわち、体液もしくは希釈体液)、または組織由来の細胞や培養細胞等が懸濁した液などが挙げられる。これらのうち、好ましい「血液由来検体」として、血液、および本発明の分野において常用される適当な希釈液、例えば緩衝液など、によって血液を希釈したもの、すなわち、血液および希釈血液が挙げられる。
本発明で用いる樹脂粒子Pは、目的細胞の内部対照として用いるものであり、血漿の比重より大きいが赤血球の比重より小さい比重、好ましくは1.040以上1.085以下の比重、より好ましくは1.040以上1.077以下の比重を有する。または、望ましくは比重1.040以上、密度勾配遠心法で用いる分離媒体の比重以下を有する。
本発明の密度勾配遠心法は、従来のものを適宜利用することができる。密度勾配遠心法に用いられる分離液または分離媒体としては、例えば、市販のフィコールやパーコール(いずれもGEヘルスケア・ジャパン(株)の登録商標)またはショ糖溶液などが挙げられるが、血液由来検体に含有される赤血球と他の細胞とを分離することができる比重を有し、細胞を破壊することのない浸透圧およびpHに調節できる分離液または分離媒体であれば、本発明はこれらに限定されない。
上記(B)工程において目的細胞数を計測するには、例えば、樹脂粒子Pに標識した光学的に検出可能な色素と異なる発光波長を有する該色素により目的細胞のみを標識し、蛍光顕微鏡下でカウントする方法などが挙げられる。
本発明の評価方法は、血液由来検体に含有されている可能性のある、血漿の比重より大きいが赤血球の比重より小さい比重を有する目的細胞を定量するシステムの信憑性を評価する方法であって、下記(a)~(d)の工程を含むことを特徴とする。
(b) 赤血球以外の細胞が多く含まれる層を抽出し、該層に含まれる該樹脂粒子Pの数(P1個)と該樹脂粒子Nの数(N1個)とを計測する工程;
(c) (P1/P0)×100を算出して、所定の基準値と比較し、該システム全体がどの程度機能しているかを評価する工程;ならびに
(d) N1/P1を算出して、所定の基準値と比較し、該密度勾配遠心法によりどの程度層が分離しているかを評価する工程。
(e) P1個の該樹脂粒子PまたはN1個の該樹脂粒子Nに由来する発光シグナルを測定し、発光シグナル検出機器を校正する工程
をさらに含むことが好ましい。
本発明で用いる樹脂粒子Nは、赤血球の内部対照として用いるものであり、赤血球と同程度の比重、すなわち1.090以上1.120以下の比重を有する。
工程(a)は、血漿の比重より大きいが赤血球の比重より小さい比重を有する樹脂粒子Pを既知数個(P0個)とともに、1.090以上1.120以下の比重を有する樹脂粒子Nを既知数個(N0個)含有させた血液由来検体を、密度勾配遠心法により、赤血球が多く含まれる層と赤血球以外の細胞が多く含まれる層との少なくとも二層に分離する工程である。
工程(b)は、赤血球以外の細胞が多く含まれる層を抽出し、該層に含まれる該樹脂粒子Pの数(P1個)と該樹脂粒子Nの数(N1個)とを計測する工程である。
工程(c)は、(P1/P0)×100を算出して、所定の基準値と比較し、上記システム全体がどの程度機能しているかを評価する工程である。すなわち、工程(c)は、評価対象とするシステムが、血液由来検体に含まれる目的細胞のうち、どれだけ多くの目的細胞を定量のために抽出することができるかを評価する工程であると見ることもできる。例えば、(P1/P0)×100が100%である場合、すなわち、P1=P0の場合、当該システムによって得られる定量結果は、血液由来検体に含まれる目的細胞の量を完全に反映していると判断することができる。
工程(d)は、N1/P1を算出して、所定の基準値と比較し、密度勾配遠心法によりどの程度層が分離しているかを評価する工程である。
本発明において任意に行うことができる工程(e)は、P1個の樹脂粒子PまたはN1個の樹脂粒子Nに由来する発光シグナルを測定し、発光シグナル検出機器を校正する工程である。
本発明の定量方法に用いるためのキットは、上記樹脂粒子Pを既知数個有することを特徴とし、また本発明の評価方法に用いるためのキットは、上記樹脂粒子Pと上記樹脂粒子Nとをそれぞれ既知数個ずつ有することを特徴とする。
以下の実施例において、「所定の基準値」を以下のように規定した。
90~100%:システムは充分に機能している。
0.005未満:密度勾配遠心法による単離は大きな問題がない。
CTCのモデルとして培養細胞であるMCF7を100個と、フルオレセインイソチオシアネート〔FITC〕により標識された樹脂粒子P(Spherotech社製のFICP-80-2)(比重:1.050)を100個(すなわちP0=100)とを全血2mL中に添加し混合した後、密度勾配遠心法を実施した。具体的には、分離液としてフィコール(比重:1.077)3mLに、当該全血2mLを重層し、400×gで40分間遠心した。
CTCのモデルとして実施例1と同様の培養細胞を100個と、FITC標識された樹脂粒子Pを10,000個(すなわちP0=10,000)とを全血2mL中に添加し混合した後、実施例1と同様にして密度勾配遠心法を実施した。
CTCのモデルとして実施例1と同様の培養細胞を100個と、FITC標識された樹脂粒子Pを10,000個(すなわちP0=10,000)と、赤血球のモデルとしてDMEQ-ヒドラジド標識樹脂粒子N(積水化成品工業(株)製のカルボキシル基が付与されたBM30X-5とDMEQ-ヒドラジド(和光純薬工業(株))とを反応させて作製)(比重:1.10)を10,000個(すなわちN0=10,000)とを全血2mL中に添加し混合した後、実施例1と同様にして密度勾配遠心法を実施した。
比較例1では、樹脂粒子Pに代えて安定化細胞を内部参照として用いてCTCの定量をおこなった。
2・・・血液由来検体
3・・・血漿の比重より大きいが赤血球の比重より小さい比重を有する樹脂粒子P
4・・・赤血球が多く含まれる層
5・・・赤血球以外の細胞が多く含まれる層
Claims (14)
- 血液由来検体に含有されている可能性のある、血漿の比重より大きいが赤血球の比重より小さい比重を有する目的細胞を定量する方法であって、下記(A)~(C)の工程を含むことを特徴とする定量方法:
(A) 血漿の比重より大きいが赤血球の比重より小さい比重を有する樹脂粒子Pを既知数個(P0個)含有させた血液由来検体を、密度勾配遠心法により、赤血球が多く含まれる層と赤血球以外の細胞が多く含まれる層との少なくとも二層に分離する工程;
(B) 赤血球以外の細胞が多く含まれる層を抽出し、該層に含まれる該目的細胞の数および該樹脂粒子の数(P1個)を計測する工程;ならびに
(C) 該目的細胞の数にP0/P1を乗じることによって、該目的細胞の数を校正する工程。 - 上記樹脂粒子Pが、水不溶性の樹脂から形成され、且つ、光学的に検出可能な色素Daによって標識されている、請求項1に記載の定量方法。
- 上記樹脂粒子Pが、1.040以上1.085以下の比重を有する、請求項1または2に記載の定量方法。
- 上記樹脂粒子Pが、1.040以上1.077以下の比重を有する、請求項1または2に記載の定量方法。
- 上記目的細胞が、血中循環腫瘍細胞〔CTC〕,循環幹細胞および循環内皮細胞からなる群から選択される少なくとも一種の希少細胞である、請求項1~4のいずれか一項に記載の定量方法。
- 血液由来検体に含有されている可能性のある、血漿の比重より大きいが赤血球の比重より小さい比重を有する目的細胞を定量するシステムの信憑性を評価する方法であって、下記(a)~(d)の工程を含むことを特徴とする評価方法:
(a) 血漿の比重より大きいが赤血球の比重より小さい比重を有する樹脂粒子Pを既知数個(P0個)とともに、1.090以上1.120以下の比重を有する樹脂粒子Nを既知数個(N0個)含有させた血液由来検体を、密度勾配遠心法により、赤血球が多く含まれる層と赤血球以外の細胞が多く含まれる層との少なくとも二層に分離する工程;
(b) 赤血球以外の細胞が多く含まれる層を抽出し、該層に含まれる該樹脂粒子Pの数(P1個)と該樹脂粒子Nの数(N1個)とを計測する工程;
(c) (P1/P0)×100を算出して、所定の基準値と比較し、該システム全体がどの程度機能しているかを評価する工程;ならびに、
(d) N1/P1を算出して、所定の基準値と比較し、該密度勾配遠心法によりどの程度層が分離しているかを評価する工程。 - 上記樹脂粒子Pが、水不溶性の樹脂から形成され、光学的に検出可能な色素Daによって標識されている、請求項6に記載の評価方法。
- 上記樹脂粒子Pが、1.040以上1.085以下の比重を有する、請求項6または7に記載の評価方法。
- 上記樹脂粒子Pが、1.040以上1.077以下の比重を有する、請求項6または7に記載の評価方法。
- 該樹脂粒子Nが、水不溶性の樹脂から形成され、且つ、光学的に検出可能な色素Daとは発光波長の異なる光学的に検出可能な色素Dbによって標識されている、請求項6~9のいずれか一項に記載の評価方法。
- 上記目的細胞が、血中循環腫瘍細胞〔CTC〕,循環幹細胞および循環内皮細胞からなる群から選択される少なくとも一種の希少細胞である、請求項6~10のいずれか一項に記載の評価方法。
- 下記(e) の工程をさらに含むことを特徴とする請求項6~11のいずれか一項に記載の評価方法:
(e) P1個の該樹脂粒子PまたはN1個の該樹脂粒子Nに由来する発光シグナルを測定し、発光シグナル検出機器を校正する工程。 - 上記樹脂粒子Pを既知数個有することを特徴とする、請求項1~5のいずれか一項に記載の定量方法に用いるためのキット。
- 上記樹脂粒子Pと上記樹脂粒子Nとをそれぞれ既知数個ずつ有することを特徴とする、請求項6~12のいずれか一項に記載の評価方法に用いるためのキット。
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015046557A1 (ja) * | 2013-09-30 | 2015-04-02 | 積水メディカル株式会社 | 循環腫瘍細胞濃縮分離デバイス及び循環腫瘍細胞の濃縮分離方法 |
WO2016028011A1 (ko) * | 2014-08-22 | 2016-02-25 | 삼성전자 주식회사 | 표적물질 분리장치 및 표적물질 분리방법 |
JP2021006774A (ja) * | 2019-06-28 | 2021-01-21 | 東ソー株式会社 | 試料中に含まれる目的細胞の定量方法 |
Families Citing this family (1)
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---|---|---|---|---|
WO2023003561A1 (en) * | 2021-07-22 | 2023-01-26 | Sartorius Bioanalytical Instruments, Inc. | Method and system for monitoring cell settling |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH04252957A (ja) | 1990-08-07 | 1992-09-08 | Becton Dickinson & Co | 絶対カウントのための一段試験 |
JP2000502892A (ja) * | 1995-12-11 | 2000-03-14 | デンドレオン コーポレイション | 細胞分離の組成物、キット、および方法 |
JP2004534210A (ja) | 2001-03-07 | 2004-11-11 | イムニベスト・コーポレイション | 希少細胞検出アッセイにおける内部機能対照として用いる標識細胞 |
JP2009288254A (ja) * | 2002-10-03 | 2009-12-10 | Battelle Memorial Inst | 抗凝固処理全血試料中の循環目標細胞を検出するための方法 |
JP2010169519A (ja) | 2009-01-22 | 2010-08-05 | Konica Minolta Holdings Inc | プラズモン励起センサおよびそれを用いたアッセイ法 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4774965A (en) * | 1987-07-01 | 1988-10-04 | Becton Dickinson And Co., Inc. | Material layer volume determination with correction band |
US5840502A (en) * | 1994-08-31 | 1998-11-24 | Activated Cell Therapy, Inc. | Methods for enriching specific cell-types by density gradient centrifugation |
WO1997038313A1 (en) * | 1996-04-05 | 1997-10-16 | The Johns Hopkins University | A method of enriching rare cells |
US7205157B2 (en) * | 2001-01-08 | 2007-04-17 | Becton, Dickinson And Company | Method of separating cells from a sample |
EP2167536A1 (en) * | 2007-07-03 | 2010-03-31 | Dako Denmark A/S | Mhc multimers, methods for their generation, labeling and use |
US20120142089A1 (en) * | 2010-12-01 | 2012-06-07 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Method of separating target cell in biological sample |
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Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH04252957A (ja) | 1990-08-07 | 1992-09-08 | Becton Dickinson & Co | 絶対カウントのための一段試験 |
JP2000502892A (ja) * | 1995-12-11 | 2000-03-14 | デンドレオン コーポレイション | 細胞分離の組成物、キット、および方法 |
JP2004534210A (ja) | 2001-03-07 | 2004-11-11 | イムニベスト・コーポレイション | 希少細胞検出アッセイにおける内部機能対照として用いる標識細胞 |
JP2009288254A (ja) * | 2002-10-03 | 2009-12-10 | Battelle Memorial Inst | 抗凝固処理全血試料中の循環目標細胞を検出するための方法 |
JP2010169519A (ja) | 2009-01-22 | 2010-08-05 | Konica Minolta Holdings Inc | プラズモン励起センサおよびそれを用いたアッセイ法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
See also references of EP2803998A4 |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015046557A1 (ja) * | 2013-09-30 | 2015-04-02 | 積水メディカル株式会社 | 循環腫瘍細胞濃縮分離デバイス及び循環腫瘍細胞の濃縮分離方法 |
CN105683353A (zh) * | 2013-09-30 | 2016-06-15 | 积水医疗株式会社 | 循环肿瘤细胞浓缩分离设备及循环肿瘤细胞的浓缩分离方法 |
US11221325B2 (en) | 2013-09-30 | 2022-01-11 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Device for concentration and separation of circulating tumor cells, and method for concentration and separation of circulating tumor cells |
WO2016028011A1 (ko) * | 2014-08-22 | 2016-02-25 | 삼성전자 주식회사 | 표적물질 분리장치 및 표적물질 분리방법 |
US10203332B2 (en) | 2014-08-22 | 2019-02-12 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Apparatus for and method of separating target matter |
JP2021006774A (ja) * | 2019-06-28 | 2021-01-21 | 東ソー株式会社 | 試料中に含まれる目的細胞の定量方法 |
JP7279542B2 (ja) | 2019-06-28 | 2023-05-23 | 東ソー株式会社 | 試料中に含まれる目的細胞の定量方法 |
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