JP2010166930A - Ｅｇ５遺伝子発現の抑制のための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

【課題】Ｅｇ５発現により媒介される病理学的プロセスを治療する場合に使用するための標的Ｅｇ５遺伝子の発現を効果的に抑制することができる薬剤を提供する。
【解決手段】本発明は３０ヌクレオチド長未満、一般的に１９〜２５ヌクレオチド長であり、そしてＥｇ５遺伝子の少なくとも一部分に実質的に相補であるヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖を含む、Ｅｇ５遺伝子の発現（Ｅｇ５遺伝子）を抑制するための２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）に関する。本発明は又製薬上許容しうる担体と共にｄｓＲＮＡを含む医薬組成物；医薬組成物を用いたＥｇ５発現及びＥｇ５遺伝子の発現により誘発される疾患を治療するための方法；及び、細胞におけるＥｇ５遺伝子の発現を抑制するための方法に関する。
【選択図】なし

Description

（関連出願）
本願は、２００６年３月３１日に出願された米国仮特許出願第６０／７８７，７６２号および２００６年１２月１５日に出願された米国仮特許出願第６０／８７０，２５９号の利益を主張する。先願は両方とも、本明細書中にその全体が参考として援用される。

（発明の分野）
本発明は２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）及びＥｇ５遺伝子の発現を抑制するためにＲＮＡ干渉を媒介する場合におけるその使用、及び、単独又はｄｓＲＮＡターゲティング血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）と組み合わせた、Ｅｇ５発現により媒介される病理学的プロセス、例えば癌を治療するためのｄｓＲＮＡの使用に関する。

（発明の背景）
生物内部の細胞集団の維持は細胞分裂及びプログラムされた細胞死の細胞プロセスにより支配されている。正常細胞内部では各プロセスの開始及び終了に関連する細胞事象は高度に調節される。癌のような増殖性疾患においては、これらのプロセスの一方又は両方が混乱している場合がある。例えば癌細胞は、正の調節物質の過剰発現、又は恐らくは突然変異による負の調節物質の喪失の何れかを介して細胞分裂周期のその調節（チェックポイント制御）を喪失していると考えられる。

或いは、癌細胞は負の調節物質の過剰発現を介してプログラムされた細胞死を起こす能力を喪失していると考えられる。従って、チェックポイント制御及びプログラムされた細胞死のプロセスを癌細胞に復活させる新しい化学療法剤の開発が必要とされている。

ヒトの癌の治療の１つのアプローチは細胞周期の進行のために必須な蛋白をターゲティングすることである。細胞周期が１つの期から次に進行するためには、特定の要件事象が完了されなければならない。細胞周期には事象及び期の適切な順番を強制させるチェックポイントが存在する。そのようなチェックポイントの１つは有糸分裂の中期の段階に起こる紡錘体チェックポイントである。有糸分裂において必須の機能を有する蛋白をターゲティングする小分子は紡錘体チェックポイントを開始することにより有糸分裂における細胞を停止させる。有糸分裂において細胞を停止させる小分子のうち、臨床において抗腫瘍活性を示すものは、プログラムされた細胞死に関連する形態学的変化であるアポトーシスも誘導する。即ち癌の治療のための有効な化学療法剤はチェックポイント制御及びプログラムされた細胞死を誘導するものであってよい。残念なことに、細胞内でこれらのプロセスを制御するために使用できる化合物はほとんど存在しない。有糸分裂停止およびアポトーシス活性を引き起こすことが知られている大半の化合物は、チューブリン結合剤として作用する。これらの化合物は微小管の動的不安定性を改編し、そして有糸分裂紡錘体の機能／構造を間接的に改変することにより有糸分裂を停止させる。これらの化合物の大部分はすべての微小管の成分であるチューブリン蛋白を特異的にターゲティングするため、それらは又、微小管が役割を果たしている多くの正常な細胞プロセスの１つ以上にも影響する場合がある。従ってまた、増殖中の細胞に関連する蛋白をより特異的にターゲティングする小分子が必要とされている。

Ｅｇ５は有糸分裂紡錘体に局在し、双極性の有糸分裂紡錘体の形成及び／又は機能のために必要であることが分かっている数種のカイネシン様モーター蛋白の１つである。最近、有糸分裂紡錘体の双極性をかく乱する小分子が報告されている（非特許文献１、参照により本明細書に組み込まれる）。より詳細には、小分子は異常な有糸分裂紡錘体の形成を誘導し、その場合、中心体の中央の対から微小管のモノアストラル型のアレイが発生し、染色体は微小管の遠位の末端に連結している。小分子はモノアストラルアレイにちなんで「モナストロール」と称されている。このモノアストラルアレイの表現型はＥｇ５のモーター蛋白が免疫枯渇している有糸分裂細胞において以前に観察されている。この区別可能な固有のモノアストラルアレイの表現型がＥｇ５の潜在的抑制剤としてのモナストロールの同定を促進している。実際、モナストロールは更に、インビトロの試験において微小管のＥｇ５モーター駆動運動性を抑制することが分かっている。Ｅｇ５抑制剤モナストロールは関連するカイネシンモーターに対して、又は、細胞内のゴルジ体の運動を担っているモーターに対しても明らかな作用を有していない。Ｅｇ５の免疫枯渇又はＥｇ５のモナストロール抑制の何れかを介してモノアストラルアレイ表現型を示す細胞は細胞周期のＭ期において停止する。しかしながら、Ｅｇ５の免疫枯渇又は抑制の何れかにより誘導された有糸分裂停止は一過性である（非特許文献２）。モノアストラルアレイ表現型及びモナストロールにより誘導された有糸分裂における細胞周期の停止は共に可逆である。細胞は回復して正常な双極性有糸分裂紡錘体を形成し、有糸分裂を完了し、そして細胞周期を通過して正常な細胞増殖に到る。これらのデータは一過性の有糸分裂停止を誘導したＥｇ５の小分子抑制剤が癌細胞の増殖の治療のために有効ではないかもしれないことを示唆している。しかしなお、モナストロールが有糸分裂停止を誘発するという発見は興味深いものであり、従って、ヒトの癌の治療において有効である態様においてＥｇ５モーター蛋白をモジュレートするために使用できる化合物を更に研究して同定する必要性がある。他の抗新生物剤と組み合わせたこれらの化合物の使用を研究する必要性もある。

ＶＥＧＦ（血管透過性因子ＶＰＦとしても知られている）は血管形成、上皮細胞増殖及び内皮細胞生存を刺激する多機能性サイトカインである。ＶＥＧＦは多くの種類の組織により生産され、そしてその過剰発現又は異常な発現は種々の障害、例えば癌及び網膜障害、例えば加齢関連黄斑変性及び他の血管形成障害をもたらす場合がある。

最近、２本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）がＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている高度に保存された調節機序において遺伝子発現をブロックすることがわかった。ＷＯ９９／３２６１９（Ｆｉｒｅら）はＣ．ｅｌｅｇａｎｓにおける遺伝子発現を抑制するための少なくとも２５ヌクレオチド長のｄｓＲＮＡの使用を開示している。ｄｓＲＮＡは又他の生物、例えば植物（特許文献１、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら；及び特許文献２、Ｈｅｉｆｅｔｚら参照）、ショウジョウバエ（例えば非特許文献３参照）、及び哺乳類（特許文献３、Ｌｉｍｍｅｒ；及び特許文献４、Ｋｒｅｕｔｚｅｒら参照）においても標的ＲＮＡを分解することが分かっている。この天然の機序は現在では遺伝子の異常又は望ましくない調節により誘発される障害を治療するための新しいクラスの医薬品の開発のために注目されている。

ＲＮＡｉの分野における顕著な進歩及びＥｇ５発現により媒介される病理学的プロセスの治療における進歩にもかかわらず、高い生物学的活性及びインビボの安定性の両方を有する細胞自身のＲＮＡｉ機序を用いてＥｇ５遺伝子を選択的及び効率的にサイレント化することができる、そして、Ｅｇ５発現により媒介される病理学的プロセスを治療する場合に使用するための標的Ｅｇ５遺伝子の発現を効果的に抑制することができる薬剤の必要性が残存している。

国際公開第９９／５３０５０号パンフレット 国際公開第９９／６１６３１号パンフレット 国際公開第００／４４８９５号パンフレット 独国特許第１０１００５８６．５号明細書

Ｍａｙｅｒ，Ｔ．Ｕ．ら、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ２８６（５４４１）９７１−４ Ｋａｐｏｏｒ，Ｔ．Ｍ．，２０００、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５０（５）９７５−８０ Ｙａｎｇ，Ｄ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．（２０００）１０：１１９１−１２００

（発明の要旨）
本発明は２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）、並びにそのようなｄｓＲＮＡを単独又はｄｓＲＮＡターゲティングＶＥＧＦと組み合わせて使用することにより細胞又は哺乳類におけるＥｇ５遺伝子の発現を抑制するための組成物及び方法を提供する。本発明は又、癌のようなＥｇ５遺伝子の発現により誘発される病理学的状態および疾患を治療するための組成物及び方法を提供する。本発明のｄｓＲＮＡは３０ヌクレオチド長未満、一般的に１９〜２４ヌクレオチド長であり、そしてＥｇ５遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部分に実質的に相補である領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含む。

１つの実施形態において、本発明はＥｇ５遺伝子の発現を抑制するための２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を提供する。ｄｓＲＮＡは相互に相補である少なくとも２つの配列を含む。ｄｓＲＮＡは第１の配列を含むセンス鎖及び第２の配列を含むアンチセンス鎖を含む。アンチセンス鎖はＥｇ５をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部分に実質的に相補であるヌクレオチド配列を含み、そして相補性の領域は３０ヌクレオチド長未満、一般的に１９〜２４ヌクレオチド長である。ｄｓＲＮＡはＥｇ５を発現する細胞に接触すると少なくとも４０％Ｅｇ５遺伝子の発現を抑制する。

例えば本発明のｄｓＲＮＡ分子は表１〜３のセンス配列よりなる群から選択されるｄｓＲＮＡの第１の配列、及び、表１〜３のアンチセンス配列よりなる群から選択されるｄｓＲＮＡの第２の配列を含むことができる。本発明のｄｓＲＮＡ分子は天然に存在するヌクレオチドを含むことができるか、又は、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド、例えば２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、及びコレステリル誘導体に連結された末端ヌクレオチドを含むことができる。或いは、修飾されたヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、無塩基ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート及び非天然塩基含有ヌクレオチドの群から選択してよい。一般的にそのような修飾配列は表１〜３のセンス配列よりなる群から選択される該ｄｓＲＮＡの第１の配列、及び、表１〜３のアンチセンス配列よりなる群から選択される第２の配列に基づくことになる。

別の実施形態においては、本発明は本発明のｄｓＲＮＡの１つを含む細胞を提供する。細胞は一般的に哺乳類細胞、例えばヒト細胞である。

別の実施形態においては、本発明は本発明のｄｓＲＮＡ１つ以上、及び、製薬上許容しうる担体又は送達ベヒクルを含む、生物、一般的にヒト対象におけるＥｇ５遺伝子の発現を抑制するための医薬組成物を提供する。

別の実施形態において、本発明は下記工程：
（ａ）２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を細胞内に導入すること、ここでｄｓＲＮＡは相互に相補である配列少なくとも２つを含むものであること。ｄｓＲＮＡは第１の配列を含むセンス鎖及び第２の配列を含むアンチセンス鎖を含む。アンチセンス鎖はＥｇ５をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部分に実質的に相補的な相補性領域を含み、そしてここで、相補性領域は３０ヌクレオチド長未満、一般的に１９〜２４ヌクレオチド長であり、そしてここでｄｓＲＮＡは、該Ｅｇ５を発現する細胞に接触すると、Ｅｇ５遺伝子の発現を少なくとも４０％抑制するものであること；そして、
（ｂ）Ｅｇ５遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を達成するために十分な時間、工程（ａ）で生成した細胞を維持することにより、細胞におけるＥｇ５遺伝子の発現を抑制すること、を含む細胞におけるＥｇ５の発現を抑制するための方法を提供する。

別の実施形態においては、本発明はＥｇ５の発現により媒介される病理学的プロセス、例えば癌を治療、予防又は管理する方法であって、本発明のｄｓＲＮＡ１つ以上の治療又は予防有効量をそのような治療、予防又は管理を必要とする患者に投与することを含む上記方法を提供する。

別の実施形態においては、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡ１つの鎖少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節配列を含む、細胞におけるＥｇ５遺伝子の発現を抑制するためのベクターを提供する。

別の実施形態においては、本発明は細胞中のＥｇ５遺伝子の発現を抑制するためのベクターを含む細胞を提供する。ベクターは本発明のｄｓＲＮＡの１つの鎖少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節配列を含む。

別の実施形態においては、本発明はＶＥＧＦｍＲＮＡをターゲティングする第２のｄｓＲＮＡと組み合わせた上記Ｅｇ５ｄｓＲＮＡ及びその使用を提供する。Ｅｇ５をターゲティングするｄｓＲＮＡ及びＶＥＧＦをターゲティングする第２のｄｓＲＮＡの組み合わせは過剰増殖性障害、特に肝臓癌を治療するための補足的及び相乗作用的な活性を提供する。

本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
細胞におけるヒトＥｇ５遺伝子の発現を抑制するための２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、ここで、該ｄｓＲＮＡは相互に相補的な配列少なくとも２つを含み、そしてここでセンス鎖は第１の配列を含み、そしてアンチセンス鎖はＥｇ５をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部分に実質的に相補的な相補性の領域を含む第２の配列を含み、そしてここで該相補性の領域は３０ヌクレオチド長未満であり、そして、該ｄｓＲＮＡは該Ｅｇ５を発現する細胞に接触すると該Ｅｇ５遺伝子の発現を抑制する上記２本鎖リボ核酸。
（項目２）
上記第１の配列が表１〜３のアンチセンス鎖配列よりなる群から選択され、そして上記第２の配列が表１〜３のセンス鎖配列よりなる群から選択される項目１記載のｄｓＲＮＡ。
（項目３）
上記ｄｓＲＮＡが修飾されたヌクレオチド少なくとも１つを含む項目１記載のｄｓＲＮＡ。
（項目４）
上記ｄｓＲＮＡが修飾されたヌクレオチド少なくとも１つを含む項目２記載のｄｓＲＮＡ。
（項目５）
上記修飾されたヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、及びコレステリル誘導体又はドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオチドの群から選択される項目４記載のｄｓＲＮＡ。
（項目６）
上記修飾されたヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、無塩基ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート及び非天然塩基含有ヌクレオチドの群から選択される項目４記載のｄｓＲＮＡ。
（項目７）
上記第１の配列が表１〜３よりなる群から選択され、そして上記第２の配列が表１〜３よりなる群から選択される項目４記載のｄｓＲＮＡ。
（項目８）
項目１記載のｄｓＲＮＡを含む細胞。
（項目９）
項目２記載のｄｓＲＮＡを含むＥｇ５遺伝子の発現を抑制するための医薬組成物。
（項目１０）
上記ｄｓＲＮＡの該第１の配列が表１〜３のセンス鎖配列よりなる群から選択され、そして上記ｄｓＲＮＡの該第２の配列が表１〜３のアンチセンス鎖配列よりなる群から選択される項目９記載の医薬組成物。
（項目１１）
ＶＥＧＦ遺伝子の発現を抑制するｄｓＲＮＡを更に含む項目１０記載の医薬組成物。
（項目１２）
細胞におけるＥｇ５遺伝子の発現を抑制するための方法であって、該方法が下記工程：（ａ）項目２記載のｄｓＲＮＡを該細胞に導入すること；及び、
（ｂ）Ｅｇ５遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を達成するために十分な時間、工程（ａ）で生成した細胞を維持することにより、該細胞におけるＥｇ５遺伝子の発現を抑制すること、
を含む方法。
（項目１３）
ＶＥＧＦの発現を抑制する第２のｄｓＲＮＡが上記細胞に導入される項目１２記載の方法。
（項目１４）
Ｅｇ５の発現により媒介される病理学的プロセスを治療、予防又は管理する方法であって、項目２記載のｄｓＲＮＡの治療又は予防有効量をそのような治療、予防又は管理を必要とする患者に投与することを含む方法。
（項目１５）
ＶＥＧＦの発現を抑制する第２のｄｓＲＮＡを投与することを更に含む項目１４記載の方法。
（項目１６）
細胞におけるＥｇ５遺伝子の発現を抑制するためのベクターであって、該ベクターはｄｓＲＮＡの鎖少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節配列を含み、ここで該ｄｓＲＮＡの鎖の１つはＥｇ５をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部分に実質的に相補的であり、そしてここで該ｄｓＲＮＡは３０塩基対長未満であり、そしてここで該ｄｓＲＮＡは該Ｅｇ５を発現する細胞に接触すると該Ｅｇ５遺伝子の発現を少なくとも４０％抑制する上記ベクター。
（項目１７）
項目１６記載のベクターを含む細胞。

（図面の簡単な説明）
図面なし。

（発明の詳細な説明）
本発明はｄｓＲＮＡを用いた細胞又は哺乳類におけるＥｇ５遺伝子の発現を抑制するための２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）並びに組成物及び方法を提供する。本発明は又ｄｓＲＮＡを使用したＥｇ５遺伝子の発現により誘導される哺乳類における病理学的状態及び疾患を治療するための組成物及び方法を提供する。ｄｓＲＮＡはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られているプロセスを介してｍＲＮＡの配列特異的分解を指向する。本発明は更にＶＥＧＦ遺伝子の発現を抑制する第２のｄｓＲＮＡと組み合わせた本ｄｓＲＮＡを提供する。

本発明のｄｓＲＮＡは３０ヌクレオチド長未満、一般的に１９〜２４ヌクレオチド長であり、Ｅｇ５遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部分に実質的に相補である領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含む。これらのｄｓＲＮＡの使用は哺乳類における癌細胞の複製及び／又は維持において関与が示唆されている遺伝子のｍＲＮＡのターゲティングされた分解を可能とする。細胞系及び動物試験を用いた場合、本発明は、これらのｄｓＲＮＡの極めて低い用量がＲＮＡｉを特異的及び効率的に媒介し、Ｅｇ５遺伝子の発現の顕著な抑制をもたらすことを明らかにしている。即ち、これらのｄｓＲＮＡを含む本発明の方法及び組成物は、有糸分裂に関与する遺伝子をターゲティングすることにより例えば癌のようなＥｇ５発現により媒介される病理学的プロセスを治療するために有用である。

以下の詳細な説明はＥｇ５遺伝子の発現を抑制するためのｄｓＲＮＡ及びｄｓＲＮＡを含有する組成物の作成及び使用の方法、並びに、単独又はＶＥＧＦ遺伝子をターゲティングする第２のｄｓＲＮＡと組み合わせた、癌のようなＥｇ５の発現により誘発される疾患及び障害を治療するための組成物及び方法を開示する。本発明の医薬組成物は、製薬上許容しうる担体と共に、３０ヌクレオチド長未満、一般的に１９〜２４ヌクレオチド長であり、Ｅｇ５遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部分に実質的に相補である相補性領域を含むアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡ、および製薬上許容しうる担体を含む。上記した通り、そのような組成物はさらにＶＥＧＦをターゲティングする第２のｄｓＲＮＡを更に包含することができる。

従って、本発明の特定の特徴は製薬上許容しうる担体と共に本発明のｄｓＲＮＡを含む医薬組成物、Ｅｇ５遺伝子の発現を抑制するための組成物の使用方法、及び、Ｅｇ５遺伝子の発現により誘発される疾患を治療するために医薬組成物を使用する方法を提供する。本発明は更にＶＥＧＦの発現を抑制するように設計された第２のｄｓＲＮＡを更に含有する上記医薬組成物を提供する。

Ｉ．定義
便宜上、本明細書、実施例及び添付の請求項において使用する特定の用語及び表現の意味を以下に提示する。本明細書の他の部分におけるある用語の用法と、本セクションにおいて提示されるその定義の間に明らかな不一致がある場合は、本セクションにおける定義が優先する。

「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」及び「Ｕ」は各々一般的にグアニン、シトシン、アデニン及びウラシルをそれぞれ塩基として含有するヌクレオチドを表す。しかしながら、「リボヌクレオチド」又は「ヌクレオチド」という用語はまた、後に詳述する通り、修飾されたヌクレオチド又は代理置き換え部分を指すこともできる。当業者の知る通り、グアニン、シトシン、アデニン及びウラシルは他の部分で置き換えられてもよく、その際、そのような置き換え部分を担持するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成特性は大きく改変されないものとする。例えば、限定しないが、イノシンを自身の塩基として含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン又はウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対形成してよい。従って、ウラシル、グアニン又はアデニンを含有するヌクレオチドは、例えばイノシンを含有するヌクレオチドにより、本発明のヌクレオチド配列において置き換えられてよい。その様な置き換え部分を含む配列は本発明の実施形態である。

本明細書においては、「Ｅｇ５」とは、ヒトカイネシンのファミリーメンバー１１を指し、これは又ＫＩＦ１１、Ｅｇ５、ＨＫＳＰ、ＫＮＳＬ１又はＴＲＩＰ５としても知られている。Ｅｇ５の配列はＮＣＢＩＧｅｎｅＩＤ：３８３２、ＨＧＮＣＩＤ：ＨＧＮＣ：６３８８及び参考配列ＩＤ番号：ＮＭ＿００４５２３として記載されている。

本明細書においては、「標的配列」とは一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡを包含するＥｇ５遺伝子の転写の間に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の隣接部分を指す。

本明細書においては、血管透過性因子としても知られているＶＥＧＦは血管形成成長因子である。ＶＥＧＦは、少なくとも３つの異なるアイソフォームで存在する、ホモ二量体４５ｋＤａ糖タンパク質である。ＶＥＧＦアイソフォームは内皮細胞中で発現される。ＶＥＧＦ遺伝子は１８９アミノ酸蛋白アイソフォームを発現する８エクソンを含有する。１６５アミノ酸アイソフォームはエクソン６によりコードされる残基を欠いており、１２１アミノ酸アイソフォームはエクソン６及び７によりコードされる残基を欠いている。ＶＥＧＦ１４５は１４５アミノ酸を含有し、エクソン７を欠いていると予測されるアイソフォームである。ＶＥＧＦはＦｌｔ−１（ＶＥＧＦＲ−１）又はＫＤＲ／ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）のような内皮チロシンキナーゼ受容体への結合により内皮細胞に対して作用できる。ＶＥＧＦＲ−２は内皮細胞中で発現され、そして内皮細胞の分化および脈管形成に関与している。第３の受容体ＶＥＧＦＲ−３はリンパ形成に関与しているとされている。

種々のアイソフォームが異なる生物学的活性及び臨床的意義を有している。例えばＶＥＧＦ１４５は血管形成を誘導し、そしてＶＥＧＦ１８９と同様（しかしＶＥＧＦ１６５とは異なり）ＶＥＧＦ１４５は細胞外のマトリックス関連ヘパリンスルフェートに依存しない機序により細胞外マトリックスに効率的に結合する。ＶＥＧＦは内皮細胞有糸分裂及びインビトロの化学誘引剤としての活性を示し、そして血管の透過性及び血管形成をインビボで誘導する。ＶＥＧＦは広範な種類の癌細胞型により分泌され、そして腫瘍関連脈管形成の発生を誘導することにより腫瘍の生育を増進する。ＶＥＧＦ機能の抑制は免疫無防備状態のマウスにおいて原発実験的腫瘍の生育と転移の発生率の両方を制限することが分かっている。ＶＥＧＦに指向された種々のｄｓＲＮＡが参照により本明細書に組み込まれる同時係属中の米国特許出願１１／０７８，０７３及び１１／３４０，０８０に記載されている。

本明細書においては、「配列を含む鎖」という用語は標準的なヌクレオチドの命名法を用いて言及される配列により説明されるヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。

本明細書においては、そして特段の記載が無い限り、「相補」という用語は第１のヌクレオチド配列を第２のヌクレオチド配列との関連において説明するために使用する場合、当業者に知られる通り、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドと、特定の条件下、ハイブリダイズしてデュプレックスを形成する第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの能力を指す。そのような条件は、ストリンジェントな条件であることができ、その場合ストリンジェントな条件は４００ｍＭＮａＣｌ、４０ｍＭＰＩＰＥＳｐＨ６．４、１ｍＭＥＤＴＡ、５０℃又は７０℃１２〜１６時間の後洗浄を包含してよい。他の条件、例えば生物体内で遭遇する場合がある生理学的に該当する条件も適用できる。当業者であれば、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終的用途に従って２つの配列の相補性の試験のために最も適切な条件のセットを決定できる。

これは第１及び第２のヌクレオチド配列の全長に渡る第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドへの第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの塩基対形成を包含する。そのような配列は本明細書においては相互に関して「完全に相補」と称される。しかしながら、本明細書においては第１の配列が第２の配列に関して「実質的に相補」と称される場合、２つの配列は完全に相補であることができるか、又は、それらはハイブリダイズにより１つ以上、一般的には４、３又は２つ以下のミスマッチの塩基対を形成してよいが、それらの最終的な用途に最も該当する条件下ではハイブリダイズする能力を保持している。しかしながら２つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションにより１つ以上の１本鎖オーバーハングを形成するように設計される場合は、そのようなオーバーハングは相補性の決定に関してはミスマッチと見なしてはならない。例えば、２１ヌクレオチド長の１つのオリゴヌクレオチド及び２３ヌクレオチド長の別のオリゴヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡは、より長いオリゴヌクレオチドがより短いオリゴヌクレオチドに対して完全に相補である２１ヌクレオチドの配列を含む場合、本発明の目的のためにはなお「完全に相補」と称してよい。

「相補」な配列は本明細書においては、ハイブリダイズするそれらの能力に関する上記要件が満足される限り、非ワトソンクリック型塩基対及び／又は非天然の修飾されたヌクレオチドから形成された塩基対を包含するか、又はそれから完全に形成されてよい。

「相補」、「完全に相補」及び「実質的に相補」という用語は、本明細書においては、それらの使用の内容から理解される通り、ｄｓＲＮＡのセンス及びアンチセンス鎖の間、又はｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列の間の塩基のマッチングに関して使用してよい。

本明細書においては、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の「少なくとも一部分に対して実質的に相補」であるポリヌクレオチドは、目的の（例えばＥｇ５をコードしている）ｍＲＮＡの隣接部分に対して実質的に相補であるポリヌクレオチドを指す。例えばポリヌクレオチドは、配列がＥｇ５をコードするｍＲＮＡの非中断部分に実質的に相補である場合に、Ｅｇ５ｍＲＮＡの少なくとも一部分に相補となる。

「２本鎖ＲＮＡ」又は「ｄｓＲＮＡ」という用語は本明細書においては、２つの非平行の、上記した通り実質的に相補的な核酸鎖を含むデュプレックス構造を有するリボ核酸分子の複合体を指す。デュプレックス構造を形成する２つの鎖は１つのより大きいＲＮＡ分子の異なる部分であってよく、或いは、それらは別個のＲＮＡ分子であってよい。２つの鎖が１つのより大きい分子の部分であり、そしてそのため、ある鎖の３’末端とデュプレックス構造を形成する対応するもう一方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの非中断鎖により連結されている場合、連結するＲＮＡ鎖は「ヘアピンループ」と称される。２つの鎖が、ある鎖の３’末端とデュプレックス構造を形成する対応するもう一方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの非中断鎖以外の集団により共有結合的に連結されている場合、連結する構造は「リンカー」と称される。ＲＮＡ鎖は同じか又は異なるヌクレオチドの数量を有してよい。塩基対の最大数はｄｓＲＮＡの最も短い鎖中ヌクレオチドの数−デュプレックス中に存在する何れかのオーバーハングである。デュプレックス構造以外に、ｄｓＲＮＡはヌクレオチドオーバーハング１つ以上を含んでよい。

本明細書においては、「ヌクレオチドオーバーハング」とは、ｄｓＲＮＡの一方の鎖の３’末端はもう一方の鎖の５’末端を超えて伸長しているか又はその逆の場合の、未対形成のヌクレオチド又はｄｓＲＮＡのデュプレックス構造から突出しているヌクレオチドを指す。「平滑」又は「平滑末端」とは、ｄｓＲＮＡのその末端において未対形成のヌクレオチドが存在しない、即ちヌクレオチドオーバーハングがないことを意味する。「平滑末端」ｄｓＲＮＡはその完全長に渡って２本鎖である、即ち分子の何れの末端にもヌクレオチドオーバーハングがないｄｓＲＮＡである。

「アンチセンス鎖」という用語は標的配列に実質的に相補である領域を包含するｄｓＲＮＡの鎖を指す。本明細書においては、「相補性の領域」という用語は本明細書において定義するとおり、配列、例えば標的配列に実質的に相補であるアンチセンス鎖上の領域を指す。相補性の領域が標的配列に完全に相補でない場合は、ミスマッチは末端領域において最も耐容され、そして存在する場合は、一般的に、末端領域、又は例えば５’及び／又は３’末端の６、５、４、３又は２ヌクレオチド内の領域にある。

「センス鎖」という用語はアンチセンス鎖の領域に実質的に相補である領域を包含するｄｓＲＮＡの鎖を指す。

「細胞内に導入する」とは、ｄｓＲＮＡに言及している場合、当該分野で知られる通り、細胞内への取り込み又は吸収を促進することを意味する。ｄｓＲＮＡの吸収又は取り込みは未支援の拡散性又は能動性の細胞プロセスを介するか、又は、副次的な薬剤又は装置により生じることができる。この用語の意味はインビトロの細胞に限定されず；ｄｓＲＮＡは、細胞が生体の一部である場合に「細胞内に導入」されてもよい。そのような場合、
細胞内への導入は生物への送達を包含する。例えば、インビボの送達においては、ｄｓＲＮＡは組織部位内に注射されるか、全身投与されることができる。インビトロの細胞内への導入はエレクトロポレーション及びリポフェクションのような当該分野で知られた方法を包含する。

「サイレント化する」及び「発現を抑制する」という用語は、それらがＥｇ５遺伝子に言及している限り、本明細書においては、内部でＥｇ５遺伝子が転写され、そしてＥｇ５遺伝子の発現が抑制されるように処理されている第１の細胞又は細胞群から単離されてよいＥｇ５遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量が、第１の細胞又は細胞群と実質的に同一であるがそのように処理されていない第２の細胞又は細胞群（対照細胞）と比較した場合に低減されていることにより顕在化される、Ｅｇ５遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を指す。抑制の程度は通常は以下：
｛［（対照細胞中のｍＲＮＡ）−（処理細胞中のｍＲＮＡ）］／（対照細胞中のｍＲＮＡ）｝＊１００％
を用いて表される。

或いは、抑制の程度は、Ｅｇ５遺伝子転写に関数として関連付けられているパラメーターの低減に関して、例えば細胞により分泌されたＥｇ５遺伝子によりコードされる蛋白の量、又は、特定の表現型、例えばアポトーシスを呈する細胞の数として示してもよい。原則として、Ｅｇ５遺伝子のサイレント化は、構成的に、又はゲノム操作により標的を発現している何れかの細胞内において、又は何れかの適切な試験により、測定してよい。しかしながら、あるｄｓＲＮＡが特定の程度までＥｇ５遺伝子の発現を抑制しており、そのために本発明の範囲内に包含されるかどうかを決定するためにレファレンスが必要である場合は、後述する実施例に記載する試験をそのようなレファレンスとして使用できる。

例えば、特定の例においては、Ｅｇ５遺伝子（又はＶＥＧＦ遺伝子）の発現は本発明の２本鎖オリゴヌクレオチドの投与により少なくとも約２０％、２５％、３５％、又は５０％抑制される。一部の実施形態においては、Ｅｇ５遺伝子は本発明の２本鎖オリゴヌクレオチドの投与により少なくとも約６０％、７０％、又は８０％抑制される。一部の実施形態においては、Ｅｇ５遺伝子は本発明の２本鎖オリゴヌクレオチドの投与により少なくとも約８５％、９０％、又は９５％抑制される。表１〜３は種々の濃度において種々のＥｇ５ｄｓＲＮＡ分子を用いた場合の発現の抑制に関する数値を示す。

Ｅｇ５の発現に関連して本明細書において用いる場合、「治療する」、「治療」等の用語は、Ｅｇ５発現により媒介される病理学的プロセスからの緩解又は軽減を指す。本発明の関連においては、後に記載する他の状態の何れか（Ｅｇ５発現により媒介される病理学的プロセス以外）に関連する限りにおいて、「治療する」、「治療」等の用語は、そのような状態に関連する症状少なくとも１つを緩解又は軽減すること、又は、そのような状態の進行を緩徐化又は逆行させること、例えば肝臓癌の進行を緩徐化させることを意味する。

本明細書においては、「治療有効量」及び「予防有効量」という表現は、（単独又はＶＥＧＦ発現と組み合わせた）Ｅｇ５発現により媒介される病理学的プロセス、又はＥｇ５発現により媒介される病理学的プロセスの明らかな症状の治療、予防又は管理において治療上の利益をもたらす量を指す。治療上有効な特定の量は通常の医療従事者により容易に決定できるものであり、そして当該分野で知られた要因、例えばＥｇ５発現により媒介される病理学的プロセスの型、患者の病歴及び年齢、Ｅｇ５発現により媒介される病理学的プロセスの段階、及び、他の抗Ｅｇ５発現媒介非病理学的プロセス剤の投与に応じて変動してよい。

本明細書においては、「医薬組成物」はｄｓＲＮＡの薬理学的有効量及び製薬上許容しうる担体を含む。本明細書においては、「薬理学的有効量」、「治療有効量」又は単に「有効量」とは、意図される薬理学的、治療的又は予防的な結果をもたらすために有効なＲＮＡの量を指す。例えば、疾患又は障害に関連する測定可能なパラメーターの少なくとも２５％低減があった場合に所定の臨床的処置が有効とみなされるとすれば、その疾患又は障害の治療のための薬剤の治療有効量はそのパラメーターの少なくとも２５％低減を起こすために必要な量である。

「製薬上許容しうる担体」という用語は治療薬の投与のための担体を指す。そのような担体は限定しないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びこれらの組み合わせを包含する。用語は典型的には細胞培養用の培地は除外する。薬剤を経口投与する場合は、製薬上許容しうる担体は限定しないが、製薬上許容しうる賦形剤、例えば不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、甘味剤、フレーバー剤、着色剤及び保存料を包含する。適当な不活性希釈剤は、ナトリウム及びカルシウムの炭酸塩、ナトリウム及びカルシウムのリン酸塩、及び乳糖を包含し、コーンスターチ及びアルギン酸が適当な崩壊剤である。結合剤は澱粉及びゼラチンを包含し、潤滑剤を存在させる場合は、それは一般的にステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクである。所望により、錠剤は胃腸管における吸収を遅延させるためにグリセリルモノステアレート又はグリセリルジステアレートのような物質でコーティングしてよい。

本明細書においては、「形質転換細胞」とはｄｓＲＮＡ分子の発現元となってよいベクターが導入されている細胞である。

ＩＩ．２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）
１つの実施形態において、本発明は細胞又は哺乳類においてＥｇ５遺伝子の発現を抑制するための２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を（単独又はＶＥＧＦの発現を抑制するための第２のｄｓＲＮＡと組み合わせて）提供し、この場合、ｄｓＲＮＡはＥｇ５遺伝子の発現において形成されたｍＲＮＡの少なくとも一部分に相補である相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含み、そしてここで相補性の領域は３０ヌクレオチド長未満、一般的に１９〜２４ヌクレオチド長であり、そしてここで該ｄｓＲＮＡは該Ｅｇ５遺伝子を発現する細胞と接触すると、該Ｅｇ５遺伝子の発現を少なくとも４０％抑制する。ｄｓＲＮＡはハイブリダイズしてデュプレックス構造を形成するために十分相補である２つのＲＮＡ鎖を含む。ｄｓＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖）はＥｇ５遺伝子の発現の間に形成されたｍＲＮＡの配列から誘導された標的配列に対して実質的に相補、そして一般的に完全に相補である相補性の領域を含み、もう一方の鎖（センス鎖）は、適当な条件下で組み合わせられた場合に２つの鎖がハイブリダイズしてデュプレックス構造を形成するように、アンチセンス鎖に対して相補である領域を含む。一般的にデュプレックス構造は１５〜３０、より一般的には１８〜２５、更に一般的には１９〜２４、そして最も一般的には１９〜２１塩基対長である。同様に、標的配列に対して相補性の領域は１５〜３０、より一般的には１８〜２５、更に一般的には１９〜２４、そして最も一般的には１９〜２１ヌクレオチド長である。本発明のｄｓＲＮＡは更に１つ以上の１本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含んでよい。ｄｓＲＮＡは後述するような当該分野で知られた標準的な方法により、例えば自動ＤＮＡ合成装置、例えばＢｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．より販売されているものを用いることにより合成できる。好ましい実施形態においては、Ｅｇ５遺伝子はヒトＥｇ５遺伝子である。特定の実施形態においては、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は表１〜３のセンス鎖を含み、そして第２の配列は表１〜３のアンチセンス配列よりなる群から選択される。表１〜３に示す標的配列中の何所かをターゲティングする代替のアンチセンス剤は、標的配列及びフランキングしたＥｇ５配列を用いながら容易に決定できる。ＶＥＧＦをターゲティングする第２のｄｓＲＮＡを使用する実施形態においては、そのような薬剤は実施例及び参照により本明細書に組み込まれる同時係属中の米国特許出願１１／０７８，０７３及び１１／３４０，０８０において例示されている。

ｄｓＲＮＡは表１〜３に示した配列の群から選択されるヌクレオチド配列少なくとも２つを含むことになる。２配列の一方は２配列のもう一方に相補的であり、配列の一方はＥｇ５遺伝子の発現において形成されたｍＲＮＡの配列に実質的に相補である。即ち、ｄｓＲＮＡは２オリゴヌクレオチドを含むことになり、その場合、一方のオリゴヌクレオチドは表１〜３においてセンス鎖として記載され、そして第２のオリゴヌクレオチドは表１〜３においてアンチセンス鎖として記載される。

当業者の知る通り、２０〜２３、特に２１塩基対のデュプレックス構造を含むｄｓＲＮＡは、ＲＮＡ干渉の誘導において特に有効であるものとして認められている（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、ＥＭＢＯ２００１，２０：６８７７−６８８８）。しかしながら、より短い、又は長いｄｓＲＮＡも同様に有効であり得ることを発見している者もある。上記した実施形態においては、表１〜３に示したオリゴヌクレオチド配列の性質のために、本発明のｄｓＲＮＡは最低限でも２１ｎｔの長さの鎖少なくとも１つを含むことができる。表１〜３の配列の１つから一端又は両端上のヌクレオチド僅か数個を減らしたものを含むより短いｄｓＲＮＡは、上記したｄｓＲＮＡと比較して同様に有効であると期待することは合理的である。従って、表１〜３の配列の１つに由来する少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０以上の隣接ヌクレオチドの部分配列を含み、そして完全配列を含むｄｓＲＮＡとは、５、１０、１５、２０、２５、又は３０％抑制以下の分だけ、下記のＦＡＣＳ試験においてＥｇ５遺伝子の発現を抑制するその能力において異なっているｄｓＲＮＡは、本発明の意図するものである。表１〜３に示した標的配列内で切断する別のｄｓＲＮＡは、Ｅｇ５配列及び提供された標的配列を用いながら容易に作成できる。

更に又、表１〜３に示したＲＮＡｉ剤はＲＮＡｉ系の切断に感受性のＥｇ５ｍＲＮＡにおける部位を発見する。即ち、本発明は本発明の薬剤の１つによりターゲティングされる配列内でターゲティングするＲＮＡｉ剤を更に包含する。本明細書においては、第２のＲＮＡｉ剤は第２のＲＮＡｉ剤が、第１のＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖に相補であるｍＲＮＡ内の何れかの場所のメッセージを切断する場合に第１のＲＮＡｉ剤の配列内でターゲティングすると言える。そのような第２の薬剤は一般的にＥｇ５遺伝子における選択された配列に隣接する領域から取った、追加的ヌクレオチド配列にカップリングされた表１〜３に示した配列の１つに由来する少なくとも１５隣接ヌクレオチドよりなる。例えば、配列番号：１の最後の１５ヌクレオチドを標的Ｅｇ５遺伝子に由来する次の６ヌクレオチドと組み合わせたものは、表１〜３に示す配列の１つに基づいた２１ヌクレオチドの１本鎖の薬剤を生成する。

本発明のｄｓＲＮＡは標的配列に対してミスマッチ１つ以上を含有できる。好ましい実施形態においては、本発明のｄｓＲＮＡは３つを超えるミスマッチは含有しない。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含有する場合、ミスマッチの区域は相補性の領域の中心には位置しないことが好ましい。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含有する場合、ミスマッチは各末端から５ヌクレオチド、例えば相補性領域の５’又は３’末端の何れかから５、４、３、２、又は１ヌクレオチドに制限されることが好ましい。例えば、Ｅｇ５遺伝子のある領域に相補である２３ヌクレオチドのｄｓＲＮＡ鎖の場合、ｄｓＲＮＡは一般的に中央の１３ヌクレオチド内には如何なるミスマッチも含有しない。本発明に記載した方法は、標的配列に対するミスマッチを含有するｄｓＲＮＡがＥｇ５遺伝子の発現を抑制する場合に有効であるかどうかを調べるために使用できる。Ｅｇ５遺伝子の発現を抑制する場合にミスマッチを有するｄｓＲＮＡの薬効を考慮することは、特にＥｇ５遺伝子の相補性の特定の領域が集団内の多形配列変動を有することが分かっている場合に、重要となる。

１つの実施形態において、ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの末端は１〜４、一般的に１または２ヌクレオチドの１本鎖ヌクレオチドオーバーハングを有する。少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡはその平滑末端の対応物よりも予想外に優れた抑制特性を有する。更に又、本発明者等は、僅か１つのヌクレオチドオーバーハングの存在が、その全体的な安定性に影響することなく、ｄｓＲＮＡの干渉活性を強力化することを発見した。僅か１つのオーバーハングを有するｄｓＲＮＡはインビボにおいて、並びに種々の細胞、細胞培養用培地、血液および血清中において特に安定であり有効であることが明らかにされた。一般的に、１本鎖オーバーハングはアンチセンス鎖の３’末端、或いはセンス鎖の３’末端に位置する。ｄｓＲＮＡは又、一般的にはアンチセンス鎖の５’末端に位置する平滑末端を有してよい。そのようなｄｓＲＮＡは向上した安定性及び抑制活性を有するため、低い用量において、即ち一日当たりレシピエントの体重ｋｇ当たり５ｍｇ未満において、投与可能とする。一般的に、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は３’末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、そして５’末端は平滑である。別の実施形態においては、オーバーハングのヌクレオチド１つ以上がヌクレオシドチオホスフェートにより置き換えられている。

更に別の実施形態においては、ｄｓＲＮＡは安定性を向上させるために化学的に修飾される。本発明の核酸は例えば参照により本明細書に組み込まれる「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｉ．ら（編）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されているもののような、当該分野でよく知られている方法により合成及び／又は修飾してよい。本発明において有用な好ましいｄｓＲＮＡ化合物の特定の例は、修飾された骨格を含有するか、天然のヌクレオシド間連結を有さないｄｓＲＮＡを包含する。本明細書において定義した通り、修飾された骨格を有するｄｓＲＮＡは骨格中にリン原子を保持しているもの、及び、骨格中にリン原子を有さないものを包含する。本明細書の目的のため、そして当該分野で場合により参照される通り、自身のヌクレオシド間骨格にリン原子を有さない修飾されたｄｓＲＮＡも又、オリゴヌクレオシドと見なすことができる。

好ましい修飾されたｄｓＲＮＡ骨格は、例えばホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート、例えば３’−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホロアミデート、例えば３’−アミノホスホロアミデート、及びアミノアルキルホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及び３’−５’通常連結部を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’連結類縁体、及びヌクレオシド単位の隣接対が３’−５’〜５’−３’又は２’−５’〜５’−２’で連結している反転極性を有するものを包含する。種々の塩、混合塩、及び遊離の酸の形態も包含される。

上記したリン含有連結部の製造を教示している代表的な米国特許は、限定しないが、米国特許３，６８７，８０８；４，４６９，８６３；４，４７６，３０１；５，０２３，２４３；５，１７７，１９５；５，１８８，８９７；５，２６４，４２３；５，２７６，０１９；５，２７８，３０２；５，２８６，７１７；５，３２１，１３１；５，３９９，６７６；５，４０５，９３９；５，４５３，４９６；５，４５５，２３３；５，４６６，６７７；５，４７６，９２５；５，５１９，１２６；５，５３６，８２１；５，５４１，３１６；５，５５０，１１１；５，５６３，２５３；５，５７１，７９９；５，５８７，３６１；及び５，６２５，０５０を包含し、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。

リン原子を自身に包含しない好ましい修飾されたｄｓＲＮＡ骨格は、短鎖アルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合型のヘテロ原子及びアルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間連結、又は１つ以上の短鎖ヘテロ原子又は複素環ヌクレオシド間連結により形成された骨格を有する。これらにはモルホリノ連結部を有するもの（ヌクレオシドの糖部分から部分的には形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；及び混合型のＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分の部分を有する他のものが包含される。

上記したオリゴヌクレオシドの製造を教示している代表的な米国特許は、限定しないが、米国特許５，０３４，５０６；５，１６６，３１５；５，１８５，４４４；５，２１４，１３４；５，２１６，１４１；５，２３５，０３３；５，６４，５６２；５，２６４，５６４；５，４０５，９３８；５，４３４，２５７；５，４６６，６７７；５，４７０，９６７；５，４８９，６７７；５，５４１，３０７；５，５６１，２２５；５，５９６，０８６；５，６０２，２４０；５，６０８，０４６；５，６１０，２８９；５，６１８，７０４；５，６２３，０７０；５，６６３，３１２；５，６３３，３６０；５，６７７，４３７；及び５，６７７，４３９を包含し、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。

他の好ましいｄｓＲＮＡミメティックにおいて、ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間連結部の両方、即ち骨格が新しい基により置き換えられる。塩基単位は適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。そのようなオリゴマー化合物の１つである、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが分かっているｄｓＲＮＡミメティックはペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物においては、ｄｓＲＮＡの糖骨格はアミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格により置き換えられる。ヌクレオ塩基は保持されており、そして骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接又は間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の製造を教示している代表的な米国特許は、限定しないが、米国特許５，５３９，０８２；５，７１４，３３１；及び５，７１９，２６２を包含し、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。ＰＮＡ化合物の別の教示はＮｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００に記載されている。

本発明の最も好ましい実施形態はホスホロチオエート骨格を有するｄｓＲＮＡ、及びヘテロ原子骨格、そして特に上記参照した米国特許５，４８９，６７７の−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−Ｏ−ＣＨ_２−［メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ骨格として知られている］、−ＣＨ_２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ_３）−Ｏ−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−、及び−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−ＣＨ_２−［ここでネイティブのホスホジエステル骨格は−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ_２−として示される］、そして上記参照した米国特許５，６０２，２４０のアミド骨格を有するオリゴヌクレオシドである。同様に好ましいものは上気参照した米国特許５，０３４，５０６のモルホリノ骨格構造を有するｄｓＲＮＡである。

修飾されたｄｓＲＮＡは又置換された糖部分１つ以上を含有してよい。好ましいｄｓＲＮＡは２’位に以下のもの：即ち、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルキニル；又はＯ−アルキル−Ｏ−アルキル、ここでアルキル、アルケニル及びアルキニルは置換又は未置換のＣ_１〜Ｃ_１０アルキル、又はＣ_２〜Ｃ_１０アルケニル及びアルキニルであるもの、の１つを含んでいる。特に好ましいものはＯ［（ＣＨ_２）_ｎＯ］_ｍＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＮＨ_２、及びＯ（ＣＨ_２）_ｎＯＮ［（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３）］_２、ここでｎ及びｍは１〜約１０であるもの、である。他の好ましいｄｓＲＮＡは２’位に以下のもの：即ち、Ｃ_１〜Ｃ_１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル又はＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ_３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、ｄｓＲＮＡの薬物動態特性を向上させるための基、又はｄｓＲＮＡの薬力学的特性を向上させる基、及び他の同様の特性を有する置換基の１つを含んでいる。好ましい修飾は２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）又は２’−ＭＯＥとしても知られている）（Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４）、即ちアルコキシ−アルコキシ基を包含する。別の好ましい修飾は２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、即ち後述する実施例に記載の２’−ＤＭＡＯＥとしても知られている即ちＯ（ＣＨ_２）_２ＯＮ（ＣＨ_３）_２基、及び２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該分野では２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル又は２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られている）、即ちやはり後述する実施例に記載の２’−Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_２）_２を包含する。

他の好ましい修飾は２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ_３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２）及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）を包含する。同様の修飾は又ｄｓＲＮＡの他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位上において、又は２’−５’連結ｄｓＲＮＡ及び５’末端ヌクレオチドの５’位において行ってもよい。ｄｓＲＮＡは又ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分のような糖ミメティックを有してもよい。そのような修飾された糖構造の製造を教示している代表的な米国特許は、限定しないが、米国特許４，９８１，９５７；５，１１８，８００；５，３１９，０８０；５，３５９，０４４；５，３９３，８７８；５，４４６，１３７；５，４６６，７８６；５，５１４，７８５；５，５１９，１３４；５，５６７，８１１；５，５７６，４２７；５，５９１，７２２；５，５９７，９０９；５，６１０，３００；５，６２７，０５３；５，６３９，８７３；５，６４６，２６５；５，６５８，８７３；５，６７０，６３３；及び５，７００，９２０を包含し、その特定の者は本出願と共通して保有されており、そしてその各々は参照により全体が本明細書に組み込まれる。

ｄｓＲＮＡは又、ヌクレオ塩基（当該分野では単に「塩基」と称される場合が多い）の修飾又は置換を包含してよい。本明細書においては、「未修飾」又は「天然」のヌクレオ塩基はプリン塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、及びピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を包含する。修飾されたヌクレオ塩基は他の合成及び天然のヌクレオ塩基、例えば５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換されたアデニン及びグアニン、５−ハロ特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換されたウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン及び３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンを包含する。他のヌクレオ塩基は米国特許３，６８７，８０８に開示されているもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐ．８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されているもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３に開示されているもの、及び、Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，ＤｓＲＮＡ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐ．２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３に開示されているものを包含する。これらのヌクレオ塩基の特定のものは本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増大させるために特に有用である。それらは５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン及びＮ−２、Ｎ−６及び０−６置換プリン、例えばアミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンを包含する。５−メチルシトシン置換は０．６〜１．２℃まで核酸デュプレックスの安定性を増大させることが分かっており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄＬｅｂｌｅｕ，Ｂ編，ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｅａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐ．２７６−２７８）、そして現在では、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合に尚更特に好ましい塩基置換である。

上記した修飾されたヌクレオ塩基及び他の修飾されたヌクレオ塩基の製造を教示している代表的な米国特許は、限定しないが、上記した米国特許３，６８７，８０８、並びに各々が参照により本明細書に組み込まれる米国特許４，８４５，２０５；５，１３０，３０；５，１３４，０６６；５，１７５，２７３；５，３６７，０６６；５，４３２，２７２；５，４５７，１８７；５，４５９，２５５；５，４８４，９０８；５，５０２，１７７；５，５２５，７１１；５，５５２，５４０；５，５８７，４６９；５，５９４，１２１，５，５９６，０９１；５，６１４，６１７；及び５，６８１，９４１、及びやはり参照により本明細書に組み込まれる米国特許５，７５０，６９２を包含する。

本発明のｄｓＲＮＡの他の修飾はｄｓＲＮＡの活性、細胞分布又は細胞取り込みを増強する部分又はコンジュゲート１つ以上をｄｓＲＮＡに化学的に連結することを包含する。そのような部分は、限定しないが、脂質部分、例えばコレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９，８６，６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４，１０５３−１０６０）、チオエーテル、例えばベリル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えばドデカンジオール又はウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０，１１１１−１１１８；Ｋａｂａｎｏｖら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９−５４）、リン脂質、例えばジヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチル−アンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホナート（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４；Ｓｈｅａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３７７７−３７８３）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９−９７３）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９−２３７）、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノカルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３−９３７）を包含する。

そのようなｄｓＲＮＡコンジュゲートの製造を教示している代表的な米国特許は、限定しないが、米国特許４，８２８，９７９；４，９４８，８８２；５，２１８，１０５；５，５２５，４６５；５，５４１，３１３；５，５４５，７３０；５，５５２，５３８；５，５７８，７１７，５，５８０，７３１；５，５９１，５８４；５，１０９，１２４；５，１１８，８０２；５，１３８，０４５；５，４１４，０７７；５，４８６，６０３；５，５１２，４３９；５，５７８，７１８；５，６０８，０４６；４，５８７，０４４；４，６０５，７３５；４，６６７，０２５；４，７６２，７７９；４，７８９，７３７；４，８２４，９４１；４，８３５，２６３；４，８７６，３３５；４，９０４，５８２；４，９５８，０１３；５，０８２，８３０；５，１１２，９６３；５，２１４，１３６；５，０８２，８３０；５，１１２，９６３；５，２１４，１３６；５，２４５，０２２；５，２５４，４６９；５，２５８，５０６；５，２６２，５３６；５，２７２，２５０；５，２９２，８７３；５，３１７，０９８；５，３７１，２４１；５，３９１，７２３；５，４１６，２０３；５，４５１，４６３；５，５１０，４７５；５，５１２，６６７；５，５１４，７８５；５，５６５，５５２；５，５６７，８１０；５，５７４，１４２；５，５８５，４８１；５，５８７，３７１；５，５９５，７２６；５，５９７，６９６；５，５９９，９２３；５，５９９，９２８及び５，６８８，９４１を包含し、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。

所定の化合物のすべての位置が均一に修飾される必要はなく、そして実際は、上記した修飾の１つより多くが単一の化合物中に、又はｄｓＲＮＡ内の単一のヌクレオシドにおいてさえも、取り込まれてよい。本発明は又キメラ化合物であるｄｓＲＮＡ化合物も包含する。「キメラ」ｄｓＲＮＡ化合物又は「キメラ」とは、本発明に関する場合、ｄｓＲＮＡ化合物、特に、少なくとも１つの単量体単位、即ちｄｓＲＮＡ化合物の場合はヌクレオチドから各々が形成された化学的に別々の領域２つ以上を含有するｄｓＲＮＡである。これらのｄｓＲＮＡは典型的には、ヌクレアーゼ分解に対する増大した耐性、増大した細胞取り込み、及び／又は標的核酸に対する増大した結合親和性をｄｓＲＮＡに付与できるようにｄｓＲＮＡが修飾されている領域少なくとも１つを含有する。ｄｓＲＮＡの別の領域はＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することが可能な酵素のための基質として作用してよい。例示すればＲＮａｓｅＨはＲＮＡ：ＤＮＡデュプレックスのＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。従ってＲＮａｓｅＨの活性化はＲＮＡ標的の切断をもたらし、これにより遺伝子発現のｄｓＲＮＡ抑制の効率を大きく増大させる。結果として、キメラｄｓＲＮＡを使用する場合は、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較した場合に、より短いｄｓＲＮＡで同等な結果を得ることができる場合が多い。ＲＮＡ標的の切断はゲル電気泳動、及び必要に応じて当該分野で知られた関連の核酸ハイブリダイゼーション手法により定型的に検出することができる。

特定の例においては、ｄｓＲＮＡは非リガンド基により修飾されてよい。多くの非リガンド分子がｄｓＲＮＡの活性、細胞分布又は細胞取り込みを増大させるためにｄｓＲＮＡにコンジュゲートされており、そのようなコンジュゲーションを行うための操作法は学術文献に記載されている。そのような非リガンド部分は脂質部分、例えばコレステロール（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４：１０５３）、チオエーテル、例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３）、脂肪族鎖、例えばドデカンジオール又はウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ等、ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０，１１１；Ｋａｂａｎｏｖら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９）、リン脂質、例えばジヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホナート（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１；Ｓｈｅａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９）、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノカルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ等、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３）を包含する。そのようなｄｓＲＮＡコンジュゲートの製造を教示している代表的な米国特許は上記した通りである。典型的なコンジュゲーションプロトコルでは配列の位置１つ以上においてアミノリンカーを担持しているｄｓＲＮＡの合成を行う。次にアミノ基を適切なカップリング又は活性化試薬を用いてコンジュゲートされた分子と反応させる。コンジュゲーション反応は固体支持体になお結合しているｄｓＲＮＡを用いるか、又は溶液相におけるｄｓＲＮＡの切断の後に実施してよい。ＨＰＬＣによるｄｓＲＮＡコンジュゲートの精製は典型的には純粋なコンジュゲートを与える。

ベクターコードＲＮＡｉ剤
本発明のｄｓＲＮＡは又インビボの細胞内で組み換えウィルスベクターから発現させることができる。本発明の組み換えウィルスベクターは本発明のｄｓＲＮＡをコードする配列及びｄｓＲＮＡ配列を発現するための何れかの適当なプロモーターを含む。適当なプロモーターは例えばＵ６又はＨ１ＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーター配列及びサイトメガロウィルスプロモーターを包含する。他の適当なプロモーターの選択は当該分野の技術の範囲内である。本発明の組み換えウィルスベクターは又特定の組織において、又は特定の細胞内環境においてｄｓＲＮＡの発現のための誘導又は調節可能なプロモーターを含むことができる。インビボで細胞に本発明のｄｓＲＮＡを送達するための組み換えウィルスベクターの使用は後により詳細に考察する。

本発明のｄｓＲＮＡは２つの別個の相補のＲＮＡ分子として、又は、２つの相補領域を有する単一のＲＮＡ分子として、組み換えウィルスベクターから発現させることができる。

発現すべきｄｓＲＮＡ分子のためのコーディング配列を受容することができる何れかのウィルスベクターを使用することができ、例えば、アデノウィルス（ＡＶ）、アデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）；レトロウィルス（例えばレンチウィルス（ＬＶ）、ラブドウィルス、ネズミ白血病ウィルス）；ヘルペスウィルス等から誘導したベクターが挙げられる。ウィルスベクターの向性は、エンベロープ蛋白又は他のウィルス由来の他の表面抗原を用いてベクターを偽型化することにより、又は、異なるウィルスキャプシド蛋白で適切に置換することにより、修飾できる。

例えば本発明のレンチウィルスベクターは水疱性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラなどに由来する表面蛋白を用いて偽型化できる。本発明のＡＡＶベクターは異なるキャプシド蛋白血清型を発現するようにベクターを操作することにより異なる細胞をターゲティングするように作成できる。例えば血清型２ゲノム上に血清型２キャプシドを発現するＡＡＶベクターはＡＡＶ２／２と称される。ＡＡＶ２／２ベクターにおけるこの血清型２キャプシド遺伝子を血清型５キャプシド遺伝子で置き換えることによりＡＡＶ２／５ベクターを作成できる。異なるキャプシド蛋白血清型を発現するＡＡＶベクターを構築するための手法は当該分野の技術の範囲内であり；例えば参照により全体が本明細書に組み込まれる（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ Ｊ Ｅら（２００２）、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：７９１−８０１）を参照されたい。

本発明における使用に適する組み換えウィルスベクターの選択、ベクター内にｄｓＲＮＡを発現させるための核酸配列を挿入するための方法、及び目的の細胞にウィルスベクターを送達する方法は当該分野の技術の範囲内である。例えば参照により開示全体が本明細書に組み込まれる、Ｄｏｍｂｕｒｇ Ｒ（１９９５），Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．２：３０１−３１０；Ｅｇｌｉｔｉｓ Ｍ Ａ（１９８８），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６０８−６１４；Ｍｉｌｌｅｒ Ａ Ｄ（１９９０），Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．１：５−１４；Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｗ Ｆ（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ３９２：２５−３０；及びＲｕｂｉｎｓｏｎ Ｄ Ａら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３３：４０１−４０６を参照されたい。

好ましいウィルスベクターはＡＶおよびＡＡＶから誘導されたものである。特に好ましい実施形態においては、本発明のｄｓＲＮＡは、例えばＵ６又はＨ１ＲＮＡプロモーター又はサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーターのいずれかを含む組み換えＡＡＶベクターから２つの別個の相補の１本鎖ＲＮＡ分子として発現される。

本発明のｄｓＲＮＡを発現するための適当なＡＶベクター、組み換えＡＶベクターを構築するための方法、及び標的細胞内にベクターを送達するための方法は、Ｘｉａ Ｈら（２００２）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６−１０１０に記載されている。

本発明のｄｓＲＮＡを発現するための適当なＡＡＶベクター、組み換えＡＶベクターを構築するための方法、及び標的細胞内にベクターを送達するための方法は、参照により開示全体が本明細書に組み込まれるＳａｍｕｌｓｋｉ Ｒら、（１９８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１；Ｆｉｓｈｅｒ Ｋ Ｊら、（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０−５３２；Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒら、（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２６；米国特許５，２５２，４７９；米国特許５，１３９，９４１；国際特許出願ＷＯ９４／１３７８８；及び国際特許出願ＷＯ ９３／２４６４１に記載されている。

ＩＩＩ．ｄｓＲＮＡを含む医薬組成物
１つの実施形態において、本発明は本明細書に記載したｄｓＲＮＡ及び製薬上許容しうる担体を含む医薬組成物を提供する。ｄｓＲＮＡを含む医薬組成物はＥｇ５遺伝子の発現又は活性の関連する疾患又は障害、例えばＥｇ５発現により媒介される病理学的プロセスを治療するために有用である。そのような医薬組成物は送達の様式に基づいて製剤する。一例は非経口送達を介した全身投与のために製剤される組成物である。

別の実施形態においては、そのような組成物は更にＶＥＧＦ発現を抑制する第２のｄｓＲＮＡを含む。ＶＥＧＦに指向されたｄｓＲＮＡは実施例及び同時係属中の米国特許出願１１／０７８，０７３及び１１／３４０，０８０に記載されている。

本発明の医薬組成物はＥｇ５遺伝子の発現（及び第２のｄｓＲＮＡを包含させる場合はＶＥＧＦ発現）を抑制するために十分な用量で投与される。一般的に、ｄｓＲＮＡの適当な用量は一日当たりレシピエントの体重キログラム当たり０．０１〜５．０ミリグラムの範囲、一般的に一日当たり体重キログラム当たり１マイクログラム〜１ｍｇの範囲となる。医薬組成物は１日１回投与してよく、或いは、ｄｓＲＮＡは一日に渡って適切な間隔において２、３又はそれより多いサブ用量として、更には、連続注入又は制御放出製剤を介した送達を用いながら、投与してよい。そのような場合、各サブ用量に含有されるｄｓＲＮＡは総量の一日当たり投薬量を達成するためには相応により少量となるはずである。投薬単位は、例えば数日間の期間に渡ってｄｓＲＮＡの持続放出をもたらす従来の持続放出製剤を用いながら、数日間に渡る送達のために調整することができる。持続放出製剤は当該分野でよく知られており、そして、例えば本発明の薬剤と共に使用される場合のように、特定の部位における薬剤の送達のために特に有用である。本実施形態においては、投薬単位は一日当たり用量の相当する倍数量を含有する。

当業者の知る通り、特定の要因、例えば限定しないが、疾患又は障害の重症度、以前の治療、対象の全身健康状態及び／又は年齢、及び存在する他の疾患が、対象を効果的に治療するために必要な用量及び時期に影響する。更に又、組成物の治療有効量を用いた対象の治療は単回の治療又は一連の治療を包含できる。本発明に含まれる個々のｄｓＲＮＡに関する有効用量及びインビボの半減期の推定は、従来の方法を用いて、又は、適切な動物モデルを用いたインビボの試験に基づいて、本明細書の何れかの個所に記載した通り行うことができる。

マウス遺伝子学の進歩は種々のヒトの疾患、例えばＥｇ５発現により媒介される病理学的プロセスの研究のための多くのマウスモデルを発生させている。そのようなモデルはｄｓＲＮＡのインビボの試験のため、並びに、治療有効量を決定するために使用される。

本発明は又本発明のｄｓＲＮＡ化合物を包含する医薬組成物及び製剤を包含する。本発明の医薬組成物は局所又は全身治療の何れが望まれるかに応じて、そして治療すべき箇所に応じて、多くの態様において投与してよい。投与は局所、肺、例えば粉末又はエアロゾルの吸入又は通気により、例えばネブライザーにより；気管内、鼻内、上皮及び経皮、経口又は非経口であってよい。非経口投与は静脈内、動脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内注射又は注入；又は頭蓋内、例えば髄腔内又は脳室内投与を包含する。

局所投与用の医薬組成物及び製剤は経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、座薬、スプレー、液体及び粉末を包含してよい。従来の薬学的担体、水性、粉末又は油性の基剤、増粘剤等が必要又は望ましい場合がある。コーティングされたコンドーム剤、グローブ剤等も有用である。好ましい局所用製剤は本発明のｄｓＲＮＡが局所用送達剤、例えば脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート形成剤および界面活性剤との添加混合物となっているものを包含する。好ましい脂質及びリポソームは中性（例えばジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロリルホスファチジルコリン）陰性（例えばジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＣ）及びカチオン性（例えばジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰ及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）を包含する。本発明のｄｓＲＮＡはリポソーム内にカプセル化してよく、或いは、それとの、特にカチオン性リポソームとの複合体を形成してよい。或いはｄｓＲＮＡは脂質、特にカチオン性脂質との複合体を形成してよい。好ましい脂肪酸及びエステルは限定しないが、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセロール１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、又はＣ_１−１０アルキルエステル（例えばイソプロピルミリステートＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド又はその製薬上許容しうる塩を包含する。局所用製剤は、参照により全体が本明細書に組み込まれる１９９９年５月２０日出願の米国特許出願０９／３１５，２９８において詳細に説明されている。

経口投与のための組成物及び製剤は粉末又は顆粒、微粒子、ナノ粒子、水又は非水性の媒体中の懸濁液又は溶液、カプセル、ゲルカプセル、サシェ剤、錠剤又はミニ錠剤を包含する。増粘剤、フレーバー剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤又は結合剤が望ましい場合がある。好ましい経口用製剤は、浸透性増強界面活性剤及びキレート形成剤の１つ以上と組み合わせて本発明のｄｓＲＮＡを投与するものである。好ましい界面活性剤は脂肪酸及び／又はそのエステル又は塩、胆汁酸及び／又はその塩を包含する。好ましい胆汁酸／塩はケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）及びウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、ナトリウムタウロ−２４，２５−ジヒドロフシデート、及びナトリウムグリコジヒドロフシデートを包含する。好ましい脂肪酸はアラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、モノグリセリド、ジグリセリド又はその製薬上許容しうる塩（例えば、ナトリウム）を包含する。同様に好ましいものは浸透性増強剤の組み合わせ、例えば胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩である。特に好ましい組み合わせはラウリン酸のナトリウム塩、カプリン酸、及びＵＤＣＡである。その他の浸透性増強剤はポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルを包含する。本発明のｄｓＲＮＡは顆粒形態、例えば噴霧乾燥粒子中で経口送達してよく、或いは、複合体化してマイクロ又はナノ粒子を形成してよい。ｄｓＲＮＡ複合体化剤はポリアミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；ポリアルキルアクリレート、ポリオキセタン、ポリアルキルシアノアクリレート；カチオン化ゼラチン、アルブミン、澱粉、アクリレート、ポリエチレングリコール類（ＰＥＧ）及び澱粉；ポリアルキルシアノアクリレート；ＤＥＡＥ誘導ポリイミン、プルラン、セルロース及び澱粉を包含する。特に好ましい複合体化剤は、キトサン、Ｎ−トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えばｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、ＤＥＡＥ−メタクリレート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミン及びＤＥＡＥ−デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクト酸）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクト−コグリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギネート、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を包含する。ｄｓＲＮＡの経口用製剤及びその製造は、各々が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願０８／８８６，８２９（１９９７年７月１日出願）、０９／１０８，６７３（１９９８年７月１日出願）、０９／２５６，５１５（１９９９年２月２３日出願）、０９／０８２，６２４（１９９８年５月２１日出願）、及び０９／３１５，２９８（１９９９年５月２０日出願）に詳細に記載されている。

非経口、髄腔内、脳室内又は肝臓内の投与のための組成物及び製剤は、緩衝剤、希釈剤および他の適当な添加剤、例えば限定しないが、透過性増強剤、担体化合物及び他の製薬上許容しうる担体又は賦形剤も含有してよい滅菌された水溶液を包含してよい。

本発明の医薬組成物は限定しないが、溶液、乳液及びリポソーム含有製剤を包含する。これらの組成物は種々の成分、例えば限定しないが、予め作成された液体、自己乳化型固体及び自己乳化型半固体から形成してよい。特に好ましいものは肝臓癌のような肝臓障害を治療する場合に肝臓をターゲティングする製剤である。

単位剤型で好都合に提示してよい本発明の医薬品製剤は医薬品産業においてよく知られた従来の手法に従って製造してよい。そのような手法は製薬上許容しうる担体又は賦形剤と活性成分を会合させる工程を包含する。一般的に製剤は、液体担体又は微細分割固体担体又は両方を活性成分と均一及び緊密に会合させること、そして次に必要に応じて製品を形状化することにより製造される。

本発明の組成物は多くの可能な剤型の何れか、例えば限定しないが、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、ソフトジェル、座薬及び浣腸剤に製剤してよい。本発明の組成物は又、水性、非水性又は混合媒体中の懸濁液として製剤してよい。水性懸濁液は更に、懸濁液の粘度を増大させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランを含有してよい。懸濁液は又安定化剤を含有してよい。

乳液
本発明の組成物は乳液として調製及び製剤してよい。乳液は典型的には１つの液体がもう１つの中に、通常は直径０．１μｍ超の液滴の形態において分散した不均質な系である（Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ１，ｐ．１９９；Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌｕｍｅ１，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｐ．３３５；Ｈｉｇｕｃｈｉら、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．３０１）。乳液は相互に緊密に混合され分散し合った２つの非混和性の液相を含む二相系である場合が多い。一般的に乳液は油中水（ｗ／ｏ）又は水中油（ｏ／ｗ）の種類の何れかであってよい。塊状の油相内に微小な液滴として水相を細密分割して分散させる場合、得られる組成物は油中水（ｗ／ｏ）乳液と称される。或いは塊状の水相内に微小な液滴として油相を細密分割して分散させる場合、得られる組成物は水中油（ｏ／ｗ）乳液と称される。乳液は分散相、及び水相、油相の何れかの溶液として、又は自身別個の相として存在してよい活性薬に加えて、追加的な成分を含有してよい。乳化剤、安定化剤、染料及び抗酸化剤のような医薬品賦形剤も又、必要に応じて乳液中に存在してよい。医薬品乳液は例えば油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）及び水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）乳液の場合のように２相より多くを含む多重乳液であってもよい。そのような複雑な製剤は単なる二元の乳液が与えない特定の利点を与える場合が多い。ｏ／ｗ乳液の個々の油液滴が小水滴を封入している多重乳液はｗ／ｏ／ｗ乳液を構成する。同様に、油性の連続相中に安定化された水の小球内に封入された油液滴の系はｏ／ｗ／ｏ乳液を与える。

乳液は熱力学的安定性が殆ど又は全くないことを特徴とする。頻繁には乳液の分散又は不連続の相は外部又は連続相の内部に十分分散され、そして乳化剤又は製剤の粘度という手段を介してその形態に維持される。乳液の相の何れかは乳液型の軟膏基剤及びクリームの場合のように、半固体又は固体であってよい。乳液を安定化するための他の手段は乳液の何れかの相内に取り込まれてよい乳化剤の使用を包含する。乳化剤は大きくは以下の４カテゴリー、即ち合成界面活性剤、天然に存在する乳化剤、吸収基剤、及び微細分散固体に分類してよい（Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ１，ｐ．１９９）。

表面活性物質としても知られている合成の界面活性剤は乳液製剤において広範な用途を有しており、そして文献でも考察されている（Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ１，ｐ．２８５；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（編），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｖｏｌｕｍｅ１，ｐ．１９９）。界面活性剤は典型的には両親媒性であり、親水性及び疎水性の部分を含む。界面活性剤の親水性の疎水性に対する比は親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と称されており、そして製剤の製造における界面活性剤を分類及び選択する場合の価値ある手段となっている。界面活性剤は親水性の基の性質に基づいて異なるクラス：即ちノニオン性、アニオン性、カチオン性及び両性に分類される（Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ１，ｐ．２８５）。

乳液製剤中で使用される天然に存在する乳化剤はラノリン、蜜蝋、ホスファチド、レシチン及びアカシアを包含する。吸収基剤は、それらが水を吸収してｗ／ｏ乳液を形成することができるが、なお半固体のコンシステンシーを保持するような親水性を保有しており、例えば無水ラノリン及び親水性のワセリンが挙げられる。微細分割固体も又、良好な乳化剤として、特に界面活性剤と組み合わせて、そして粘稠な調製品中において使用されている。これらには極性の無機固体、例えば重金属の水酸化物、非膨潤性の粘土、例えばベントナイト、アタプルガイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状ケイ酸アルミニウム、及びコロイド状ケイ酸アルミニウムマグネシウム、顔料及び非極性の固体、例えば炭素又はトリステアリン酸グリセリルが包含される。

広範な種類の非乳化性物質も又、乳液製剤中に包含され、乳液の性質に寄与する。これらには脂肪、油脂、ワックス、脂肪酸、脂肪族アルコール、脂肪族エステル、湿潤剤、親水性コロイド、保存料及び抗酸化剤が包含される（Ｂｌｏｃｋ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ１，ｐ．３３５；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ１，ｐ．１９９）。

親水性コロイド、即ちヒドロコロイドは天然に存在するガム類、及び合成の重合体、例えば多糖類（例えばアカシア、寒天、アルギン酸、カラギーナン、グアガム、カラヤガム、及びトラガカント）、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロース、及びカルボキシプロピルセルロース）、及び合成重合体（例えばカーボマー、セルロースエーテル及びカルボキシビニル重合体）を包含する。これらが水中で分散又は膨潤することによりコロイド状溶液を形成し、これは分散相の液滴の周囲に強力な界面フィルムを形成することにより、そして、外部の相の粘度を増大させることにより、乳液を安定化させる。

乳液は頻繁には微生物の生育を容易に支援し得る炭水化物、蛋白、ステロール及びホスファチドのような多くの成分を含有するため、これらの製剤には保存料を配合する場合が多い。乳液製剤中に一般的に使用されている保存料はメチルパラベン、プロピルパラベン、第４級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル、及びホウ酸を包含する。抗酸化剤も又、乳液製剤の劣化を防止するために製剤中に一般的に添加される。使用される抗酸化剤はフリーラジカルスカベンジャー、例えばトコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、又は還元剤、例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、及び抗酸化剤相乗作用物質、例えばクエン酸、酒石酸及びレシチンであってよい。

皮膚科用、口腔及び非経口の経路を介した乳液製剤の適用及びそれらの製造方法は文献において考察されている（Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ１，ｐ．１９９）。経口送達用の乳液製剤は製剤が容易であること、並びに吸収及び生体利用性の見地からの効能のために、極めて広範に使用されている（Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌｕｍｅ１，ｐ．２４５；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ１，ｐ．１９９）。鉱物油の緩下剤、脂溶性ビタミン、及び高脂肪栄養調製品が、一般的にｏ／ｗ乳液として経口投与される物質として挙げられる。

本発明の１つの実施形態において、ｄｓＲＮＡ及び核酸の組成物はマイクロエマルジョンとして製剤される。マイクロエマルジョンは単光学的等方性であり熱力学的に安定な液体溶液である水、油及び両親媒性の系として定義される場合がある（Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌｕｍｅ１，ｐ．２４５）。典型的には、マイクロエマルジョンは、先ず水性の界面活性剤溶液中に油脂を分散させ、そして次に第４の成分、一般的には中鎖長のアルコールの十分な量を添加して透明な系を形成することにより製造される。従って、マイクロエマルジョンは表面活性の分子の界面フィルムにより安定化されている２つの非混和性の液体の熱力学的に安定で、等方性的には透明な分散体としても説明されている（Ｌｅｕｎｇ ａｎｄ Ｓｈａｈ，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．，編，１９８９，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ１８５−２１５）。マイクロエマルジョンは一般的に油脂、水、界面活性剤、共界面活性剤及び電解質を包含する３〜５種の成分の組み合わせを介して製造される。マイクロエマルジョンが油中水（ｗ／ｏ）又は水中油（ｗ／ｏ）の型の何れであるかは、使用される油脂及び界面活性剤の特性に応じて、そして、界面活性剤分子の極性のヘッド部及び炭化水素のテール部の構造及び幾何学的充填状態に応じて決定される（Ｓｃｈｏｔｔ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．２７１）。

相ダイアグラムを利用した現象学的なアプローチが広汎に研究されており、そしてどのようにしてマイクロエマルジョンを製剤するかに関する当該分野の包括的知見が得られている（Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ
Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ１，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ１，ｐ．３３５）。従来の乳液と比較して、マイクロエマルジョンは自発的に形成される熱力学的に安定な液滴の製剤において水不溶性の薬剤を可溶化することの利点を与えるものである。

マイクロエマルジョンの調製品において使用される界面活性剤は、限定しないが、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリコール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレエート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレエート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレエート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセキオレエート（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレエート（ＤＡＯ７５０）を包含し、単独又は共界面活性剤と組み合わせて使用される。共界面活性剤、通常は短鎖アルコール、例えばエタノール、１−プロパノール、及び１−ブタノール等は界面活性剤のフィルムを貫通して結果的には界面活性剤分子内に形成された空隙により無秩序化されたフィルムを生じさせることにより、界面の流動性を増大させる作用を有する。しかしながらマイクロエマルジョンは共界面活性剤を使用することなく製造してよく、そしてアルコール非含有自己乳化型マイクロエマルジョン系は当該分野で知られている。水相は典型的には、限定しないが、水、薬剤の水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール及びエチレングリコールの誘導体であってよい。油相は、限定しないが、Ｃａｐｔｅｘ３００、Ｃａｐｔｅｘ３５５、ＣａｐｍｕｌＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８−Ｃ１２）モノ、ジ、及びトリグリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪族アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８−Ｃ１０グリセリド、植物油及びシリコーンオイルを包含してよい。

マイクロエマルジョンは薬剤可溶化及び薬剤の増強された吸収の観点から特に有利である。脂質系のマイクロエマルジョン（ｏ／ｗ及びｗ／ｏの両方）がペプチドを包含する薬剤の経口生体利用性を増強することが提案されている（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５−１３９０；Ｒｉｔｓｃｈｅｌ，Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９３，１３，２０５）。マイクロエマルジョンは進歩した薬剤の可溶化、酵素的加水分解からの薬剤の保護、膜の流動性及び透過性における界面活性剤誘導改編に起因する薬剤吸収の増強の可能性、製造の容易さ、固体剤型よりも経口投与が容易であること、向上した臨床的効能、及び低下した毒性という利点を与える（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５；Ｈｏら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９６，８５，１３８−１４３）。マイクロエマルジョンはその成分が周囲温度において混合された場合に自発的に形成される場合が多い。このことは熱不安定性の薬剤、ペプチド又はｄｓＲＮＡを製剤する場合に特に好都合となる。マイクロエマルジョンは又化粧品及び医薬品の用途の両方において活性化合物の経皮送達において有効とされている。本発明のマイクロエマルジョン組成物及び製剤は胃腸管からのｄｓＲＮＡ及び核酸の増大した全身吸収を促進し、同時に、ｄｓＲＮＡ及び核酸の局所的細胞取り込みも向上させることが期待される。

本発明のマイクロエマルジョンは又、追加的な成分及び添加剤、例えばソルビタンモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ３）、Ｌａｂｒａｓｏｌ及び浸透性増強剤を含有することにより製剤の特性を向上させたり、本発明のｄｓＲＮＡ及び核酸の吸収を増強してよい。本発明のマイクロエマルジョンにおいて使用される浸透性増強剤は５種の広範なカテゴリー：即ち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート形成剤、及び非キレート形成性非界面活性剤のうちの１つに属するものとして分類してよい（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。これらのクラスの各々は上記考察した通りである。

リポソーム
薬剤の製剤のために研究及び使用されているマイクロエマルジョン以外の多くの組織化された界面活性剤の構造が存在する。これらには単層、ミセル、２相及び小胞が包含される。小胞、例えばリポソームは薬剤送達の見地から、それらの特異性及びそれらが示す作用持続時間のために、多大な関心を持たれている。本発明において使用する場合は、「リポソーム」という用語は球状の２相内に配置された両親媒性の脂質を含む小胞を意味する。

リポソームは単層又は多層の小胞であり、親油性物質から形成された膜及び水性の内部を有する。水性の部分は送達すべき組成物を含有する。カチオン性リポソームは細胞壁に融合することができるという利点を保有している。非カチオン性リポソームは細胞壁に効率的に融合できないがインビボでマクロファージにより取り込まれる。

未損傷の哺乳類の皮膚を通過するためには、脂質小胞は適当な経皮勾配の影響下に各々５０ｎｍ未満の直径の一連の微小な細孔を通過することが必要である。従って、高度に変形可能であり、このような微小な細孔を通過できるリポソームを使用することが望ましい。

リポソームの他の利点として、天然のリン脂質から得られたリポソームは生体適合性及び生体分解性であり；リポソームは広範な種類の水溶性及び脂溶性薬剤を取り込むことができ；リポソームはその内部のコンパートメント中にカプセル化された薬剤を代謝及び分解から保護することができる（Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ１，ｐ．２４５）。リポソーム製剤の製造における注意事項は脂質表面の電荷、小胞の大きさ及びリポソームの水性の容量である。

リポソームは作用部位への活性成分の転移及び送達のために有用である。リポソーム膜は構造的に生体膜と同様であるため、リポソームを組織に適用すると、リポソームは細胞膜に併合し始め、そしてリポソームと細胞の併合が進行するに従って、リポソームの内容物は細胞内に吐出され、そこで活性剤が作用できるようになる。

リポソーム製剤は多くの薬剤の送達の様式として広範な研究の対象となっている。局所投与の場合、リポソームは他の製剤よりも有利な点を幾つか呈することを示す証拠が増えつつある。そのような利点は、投与された薬剤の高い全身吸収に関連する副作用の低減、所望の標的における投与された薬剤の蓄積の増大、及び皮膚内に親水性及び疎水性の両方の種々の薬剤を投与する能力を包含する。

数文献が皮膚内に高分子量ＤＮＡを包含する薬剤を送達するリポソームの能力を詳述している。鎮痛剤、抗体、ホルモン及び高分子量ＤＮＡを包含する化合物が皮膚に投与されている。適用の大多数は上部表皮のターゲティングをもたらしている。

リポソームは概ね２種類に分類される。カチオン性リポソームは負荷電のＤＮＡ分子と相互作用して安定な複合体を形成する正荷電のリポソームである。正荷電ＤＮＡ／リポソーム複合体は負荷電の細胞表面に結合し、エンドソーム内に内在化される。エンドソーム内は酸性ｐＨであるため、リポソームは破壊され、その内容物を細胞の細胞質内に放出する（Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８７，１４７，９８０−９８５）。

ｐＨ感受性又は負荷電のリポソームはＤＮＡと複合体形成するよりもむしろＤＮＡを捕獲する。ＤＮＡ及び脂質の両方が同様に荷電するため、複合体形成よりもむしろ反発が生じる。しかしなお一部のＤＮＡはこれらのリポソームの水性の内部に捕獲される。ｐＨ感受性リポソームは培養物中の細胞単層にチミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを送達するために使用されている。外因性遺伝子の発現が標的細胞において検出されている（Ｚｈｏｕら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１９９２，１９，２６９−２７４）。

他の主要なリポソーム組成物は天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質を包含する。例えば中性のリポソーム組成物はジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）又はジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成することができる。アニオン性リポソーム組成物は一般的に、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるが、アニオン性融合誘導性リポソームは主にジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別の型のリポソーム組成物はホスファチジルコリン（ＰＣ）、例えば大豆ＰＣ及び卵ＰＣから形成される。別の型はリン脂質及び／又はホスファチジルコリン及び／又はコレステロールの混合物から形成される。

いくつかの試験が皮膚へのリポソーム薬剤製剤の局所送達を評価している。モルモット皮膚へのインターフェロン含有リポソームの適用は皮膚ヘルペスの炎症を低減させたのに対し、他の手段（例えば溶液又は乳液）を介したインターフェロンの送達は無効であった（Ｗｅｉｎｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９２，２，４０５−４１０）。更に又、別の試験が水性の系を用いたインターフェロンの投与に対して、リポソーム製剤の部分として投与されるインターフェロンの効果を試験しており、その結果、リポソーム製剤は水性の投与より優れていた（ｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９２，１８，２５９−２６５）。

非イオン性リポソーム系は又、特に非イオン性界面活性剤及びコレステロールを含む系において、皮膚への薬剤の送達におけるそれらの有用性を測定するために検討されている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ^ＴＭＩ（グリセリルジラウレート／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）及びＮｏｖａｓｏｍｅ^ＴＭＩＩ（グリセリルジステアレート／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤はマウス皮膚の真皮にシクロスポリンＡを送達するために使用されている。結果によれば、このような非イオン性リポソーム系は皮膚の種々の層内へのシクロスポリンＡの付着を促進する場合に有効であることがわかった（Ｈｕら、Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，１９９４，４，６，４６６）。

リポソームは又本明細書においてはリポソーム内に取り込まれた場合に特殊化された脂質を欠いているリポソームと相対比較して増強された循環系中寿命を与えるそのような特殊化された脂質１つ以上を含むリポソームを指す用語である、「立体的に安定化された」リポソームも包含する。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞形成性脂質部分の一部が（Ａ）モノシアロガングリオシドＧ_Ｍ１のような糖脂質１つ以上を含む、又は（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分のような親水性重合体１つ以上で誘導体化されているものである。如何なる特定の理論にも制約されないが、当該分野においては、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリン又はＰＥＧ誘導体化脂質を含有する立体的に安定化されたリポソームのためには、これらの立体的に安定化されたリポソームの増強された循環系中半減期は網内皮細胞系（ＲＥＳ）の細胞への低減された取り込みに起因していると考えられている（Ａｌｌｅｎら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８７，２２３，４２；Ｗｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９３，５３，３７６５）。

糖脂質１つ以上を含む種々のリポソームが当該分野で知られている。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８７，５０７，６４）はリポソームの血中半減期を向上させるモノシアロガングリオシドＧ_Ｍ１、ガラクトセレブロシドスルフェート及びホスファチジルイノシトールの能力を報告している。これらの発見は、Ｇａｂｉｚｏｎらによって詳説されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９８８，８５，６９４９）。ともにＡｌｌｅｎらへの米国特許４，８３７，０２８及びＷＯ８８／０４９２４は（１）スフィンゴミエリン及び（２）ガングリオシドＧ_Ｍ１又はガラクトセレブロシドスルフェートエステルを含むリポソームを開示している。米国特許５，５４３，１５２（Ｗｅｂｂら）はスフィンゴミエリンを含むリポソームを開示している。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームがＷＯ９７／１３４９９（Ｌｉｍら）において開示されている。

親水性重合体１つ以上で誘導体化された脂質を含む多くのリポソーム及びその製造方法が当該分野で知られている。Ｓｕｎａｍｏｔｏら（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，１９８０，５３，２７７８）はＰＥＧ部分を含有する非イオン性洗剤２Ｃ_{１２１５Ｇ}を含むリポソームを記載している。Ｉｌｌｕｍら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９８４，１６７，７９）は重合体グリコールによるポリスチレン粒子の親水性コーティングが有意に増強された血中半減期をもたらすことを記載している。ポリアルキレングリコール（例えばＰＥＧ）のカルボキシル基の結合により修飾された合成リン脂質がＳｅａｒｓ（米国特許４，４２６，３３０及び４，５３４，８９９）により記載されている。Ｋｌｉｂａｎｏｖら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２６８，２３５）はＰＥＧ又はＰＥＧステアレートで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームが血中循環系半減期の有意な増大を有することを示す実験を記載している。Ｂｌｕｍｅら（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１９９０，１０２９，９１）はそのような観察結果を他のＰＥＧ誘導体化リン脂質、例えばジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）及びＰＥＧの組み合わせから形成したＤＳＰＥ−ＰＥＧに延長している。自身の外部表面に共有結合ＰＥＧ部分を有するリポソームがＦｉｓｈｅｒへの欧州特許ＥＰ０４４５１３１Ｂ１及びＷＯ９０／０４３８４に記載されている。ＰＥＧにより誘導体化されたＰＥ１〜２０モルパーセントを含有するリポソーム組成物及びその使用方法がＷｏｏｄｌｅら（米国特許５，０１３，５５６及び５，３５６，６３３）及びＭａｒｔｉｎら（米国特許５，２１３，８０４及び欧州特許ＥＰ０４９６８１３Ｂ１）に記載されている。他の脂質重合体コンジュゲートの多くを含むリポソームはＷＯ９１／０５５４５及び米国特許５，２２５，２１２（共にＭａｒｔｉｎら）及びＷＯ９４／２００７３（Ｚａｌｉｐｓｋｙら）に開示されている。ＰＥＧ修飾セラミド脂質を含むリポソームがＷＯ９６／１０３９１（Ｃｈｏｉら）に記載されている。米国特許５，５４０，９３５（Ｍｉｙａｚａｋｉら）及び５，５５６，９４８（Ｔａｇａｗａら）は自身の表面上の機能的部分で更に誘導体化することができるＰＥＧ含有リポソームを記載している。

核酸を含むリポソームの限定された数は当該分野で周知である。ＴｈｉｅｒｒｙらへのＷＯ９６／４００６２はリポソーム内に高分子量核酸をカプセル化するための方法を開示している。ＴａｇａｗａらへのＵＳ５，２６４，２２１は蛋白結合リポソームを開示しており、そしてそのようなリポソームの内容物はｄｓＲＮＡＲＮＡを包含してよいことを明示している。Ｒａｈｍａｎらへの米国特許５，６６５，７１０はリポソーム内にオリゴデオキシヌクレオチドをカプセル化する特定の方法を記載している。ＬｏｖｅらへのＷＯ９７／０４７８７はｒａｆ遺伝子にターゲティングされたｄｓＲＮＡｄｓＲＮＡを含むリポソームを開示している。

トランスフェルソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ）は別の型のリポソームであり、そして薬剤送達ビヒクルの興味深い候補である高度に変形可能な脂質凝集塊である。トランスフェルソームは液滴よりも小型である細孔を容易に通過できるほど高度に変形可能な脂質液滴として説明することができる。トランスフェルソームはそれらが使用される環境に適合することができ、例えばそれらは自己最適化（皮膚中の細孔の形状に適合できる）、自己修復性であり、頻繁にはフラグメント化することなくその標的に到達し、そして自己積載性である場合が多い。トランスファソー無を作成するためには標準的なリポソーム組成物に通常は界面活性剤である表面端部活性化剤を添加することが可能である。トランスフェルソームは皮膚への血清アルブミンの送達のために使用されている。血清アルブミンのトランスフェルソーム媒介送達は血清アルブミンを含有する溶液の皮下注射として有効であることがわかっている。

界面活性剤は乳液（マイクロエマルジョンを含む）及びリポソームのような製剤において広範な用途を有する。天然及び合成の両方の界面活性剤の多くの異なる型の特性を分類及び順位付けする最も一般的な方法は親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用による。親水性の基（「ヘッド部」としても知られている）の性質は製剤中に使用される種々の界面活性剤を分類するもっとも有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。

界面活性剤分子をイオン化しない場合は、それは非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は医薬品及び化粧品中に広範な用途を有し、そして広範な範囲のｐＨ値に渡って使用可能である。一般的に、それらのＨＬＢ値はそれらの構造に従って２〜約１８の範囲となる。非イオン性界面活性剤は非イオン性エステル、例えばエチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、及びエトキシル化エステルを包含する。非イオン性のアルカノールアミド及びエーテル、例えば脂肪族アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコール、及びエトキシル化／プロポキシル化ブロック重合体も又、このクラスに包含される。ポリオキシエチレン界面活性剤は非イオン性界面活性剤クラスの最も良く知られたメンバーである。

界面活性剤分子が水中に溶解又は分散されると負電荷を担持する場合、界面活性剤はアニオン性と分類される。アニオン性界面活性剤は、カルボキシレート、例えば石鹸、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、硫酸のエステル、例えばアルキルスルフェートおよびエトキシル化アルキルスルフェート、スルホネート、例えばアルキルベンゼンスルホネート、アシルイセチオネート、アシルタウレートおよびスルホスクシネート及びホスフェートを包含する。アニオン性界面活性剤クラスの最も重要なメンバーはアルキルスルフェート及び石鹸である。

界面活性剤分子が水中に溶解又は分散されると正電荷を担持する場合、界面活性剤はカチオン性と分類される。カチオン性界面活性剤は、第４級アンモニウム塩及びエトキシル化アミンを包含する。第４級アンモニウム塩はこのクラスの最も使用されているメンバーである。

界面活性剤分子が正電荷又は負電荷の何れかを担持する能力を有する場合、界面活性剤は両親媒性に分類される。両親媒性界面活性剤はアクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタイン及びホスファチドを包含する。

薬剤製品、製剤中、及び乳液中の界面活性剤の使用は検討されている（Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。

浸透性増強剤
１つの実施形態において、本発明は動物の皮膚への核酸、特にｄｓＲＮＡの効率的送達を行うために種々の浸透性増強剤を使用する。大部分の薬剤はイオン化又は非イオン化の形態の両方において溶液中に存在する。しかしながら、通常は脂溶性又は親油性の薬剤のみが容易に細胞膜を通過できる。非親油性の薬剤であっても、通過すべき膜が浸透性増強剤で処理されていれば、細胞膜を通過する場合があることがわかっている。細胞膜を通過する非親油性薬剤の拡散を支援することに加えて、浸透性増強剤は親油性薬剤の透過性も増強する。

浸透性増強剤は５種の広範なカテゴリー、即ち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート形成剤、及び非キレート形成性非界面活性剤のうちの１つに属するものとして分類してよい（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。浸透性増強剤の上記クラスの各々は以下により詳細に考察する。

界面活性剤：本発明との関連においては、界面活性剤（又は「表面活性剤」）は水溶液中に溶解した場合溶液の表面張力又は水溶液と他の液体との間の界面の張力を低減し、これにより粘膜を通過するｄｓＲＮＡの吸収を増強する化学的実体である。胆汁酸塩及び脂肪酸のほかに、これらの浸透性増強剤は例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル及びポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）；及びパーフルオロ化学乳液、例えばＦＣ−４３（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，４０，２５２）を包含する。

脂肪酸：浸透性増強剤として作用する種々の脂肪酸及びその誘導体は、例えばオレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ_１−１０アルキルエステル（例えばメチル、イソプロピル、及びｔ−ブチル）及びそのモノ及びジグリセリド（即ちオレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノリエート等）を包含する（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｅｌ Ｈａｒｉｒｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，６５１−６５４）。

胆汁酸塩：胆汁の生理学的役割は脂質及び脂溶性ビタミンの分散及び吸収の促進を包含する（Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３８：Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎら編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９６，ｐｐ．９３４−９３５）。種々の天然の胆汁酸塩及びその合成誘導体が浸透性増強剤として作用する。即ち、「胆汁酸塩」という用語は胆汁の天然に存在する成分並びにそれらの合成誘導体の何れも包含する。本発明の胆汁酸塩は例えばコール酸（又は製薬上許容しうるナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリコール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、ナトリウムタウロ−２４，２５−ジヒドロフシデート（ＳＴＤＨＦ）、ナトリウムグリコジヒドロフシデート及びポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）を包含する（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２；Ｓｗｉｎｙａｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３９，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０，ｐ．７８２−７８３；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９２，２６３，２５；Ｙａｍａｓｈｉｔａら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９０，７９，５７９−５８３）。

キレート形成剤：キレート形成剤は、本発明との関連において使用する場合、金属イオンを溶液からそれとの複合体形成により除去し、これにより粘膜を通過するｄｓＲＮＡの吸収を増強する化合物として定義される。本発明における浸透性増強剤としてのそれらの使用に関しては、キレート形成剤はＤＮａｓｅ阻害剤としても作用するという追加的利点を有しているが、その理由は大部分の特性化されたＤＮＡヌクレアーゼは触媒作用のために２価の金属イオンを必要とし、このため、キレート形成剤により阻害されるためである（Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９３，６１８，３１５−３３９）。本発明のキレート形成剤は限定しないが、エチレンジアミン４酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリシレート（例えばナトリウムサリシレート、５−メトキシサリシレート及びホモバニレート）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９及びベータ−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）を包含する（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｂｕｕｒら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．，１９９０，１４，４３−５１）。

非キレート形成性非界面活性剤：本明細書においては、非キレート形成性非界面活性剤の浸透性増強化合物はキレート形成剤として、又は界面活性剤としては僅かな活性しか示さないが、しかしなお、栄養粘膜を通過するｄｓＲＮＡの吸収を増強する化合物として定義できる（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３）。浸透性増強剤のこのクラスは例えば不飽和環状尿素、１−アルキル−及び１−アルケニルアザシクロアルカノン誘導体（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）；及び非ステロイド抗炎症剤、例えばジクロフェナックナトリウム、インドメタシン及びフェニルブタゾン（Ｙａｍａｓｈｉｔａら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９，６２１−６２６）を包含する。

細胞レベルにおいてｄｓＲＮＡの取り込みを増強する薬剤も又、本発明の医薬組成物又は他の組成物に添加してよい。例えばカチオン性脂質、例えばリポフェクチン（Ｊｕｎｉｃｈｉら、米国特許５，７０５，１８８）、カチオン性グリセロール誘導体、及びポリカチオン性分子、例えばポリリジン（Ｌｏｌｌｏら、ＰＣＴ出願ＷＯ９７／３０７３１）も又、ｄｓＲＮＡの細胞取り込みを増強することが分かっている。

他の薬剤、例えばグリコール類、例えばエチレングリコール及びプロピレングリコール、ピロール類、例えば２−ピロール、アゾン類及びテルペン類、例えばリモネン及びメントンも投与された核酸の浸透性を増強するために利用してよい。

担体
本発明の特定の組成物はまた製剤中に担体化合物を配合する。本明細書においては、「担体化合物」又は「担体」とは、不活性である（即ち自体生物学的活性を有さない）が例えば生物学的に活性な核酸を分解するか、又は循環系からのその除去を増進することにより生物学的活性を有する核酸の生体利用性を低減するインビボのプロセスにより核酸として認識される核酸又はその類縁体を指す場合がある。核酸および担体化合物、典型的には後者の物質を過剰量とする同時投与は、恐らくは共通の受容体に対する担体化合物及び核酸の間の競合のため、肝臓、腎臓又は他の循環系外の貯留場所において回収される核酸の量を実質的に低減することができる。例えば、肝臓組織中の部分的にホスホロチオエートのｄｓＲＮＡの回収はそれがポリイノシン酸、デキストランスルフェート、ポリシチジン酸、又は４−アセトアミド−４’イソチオシアノスチルベン−２，２’−ジスルホン酸と同時投与されれば低減することができる（Ｍｉｙａｏら、ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，１９９５，５，１１５−１２１；Ｔａｋａｋｕｒａら、ＤｓＲＮＡ ＆ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，１９９６，６，１７７−１８３）。

賦形剤
担体化合物とは対照的に、「医薬品用担体」又は「賦形剤」とは製薬上許容しうる溶媒、懸濁剤又は動物に核酸１個以上を送達するための何れかの他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は液体又は固体であってよく、そして所定の医薬組成物の核酸及び他の成分と組み合わせた場合に所望の嵩、コンシステンシー等を与えるように、予定される投与様式のものを選択する。典型的な医薬品用担体は限定しないが、結合剤（例えば予備ゼラチン化されたトウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドン又はヒトドキシプロピルメチルセルロース等）；充填剤（例えば乳糖及び他の糖類、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、又はリン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、水素化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等）；崩壊剤（例えば澱粉、ナトリウム澱粉グリコレート等）；及び水和剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム等）を包含する。

核酸と望ましくない反応を起こさない非経口投与以外に適する製薬上許容しうる有機又は無機の賦形剤も又、本発明の組成物を製剤するために使用してよい。適当な製薬上許容しうる担体は限定しないが、水、塩溶液、アルコール類、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等を包含する。

核酸の局所投与のための製剤は、滅菌及び非滅菌の水溶液、アルコールのような一般的溶媒中の非水溶液、又は液体又は固体の油脂基剤中の核酸の溶液を包含してよい。溶液は又緩衝液、希釈剤及び他の適当な添加剤を含有してよい。核酸と望ましくない反応を起こさない非経口投与以外に適する製薬上許容しうる有機又は無機の賦形剤も使用できる。

適当な製薬上許容しうる賦形剤は限定しないが、水、塩溶液、アルコール類、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等を包含する。

他の成分
本発明の組成物は更に医薬組成物中従来存在している他の副次的成分を、それらの当該分野で確立されている使用レベルにおいて含有してよい。即ち、組成物は追加的な、適合性のある、薬学的に活性な物質、例えば痒み止め、収斂剤、局所麻酔剤又は抗炎症剤を含有してよく、或いは、本発明の組成物の種々の剤型を物理的に製剤する場合に有用な他の物質、例えば染料、フレーバー剤、保存料、抗酸化剤、不透明化剤、増粘剤及び安定化剤を含有してよい。しかしながらこれらの物質を添加する場合は、本発明の組成物の成分の生物学的活性を不用意に妨害してはならない。製剤は滅菌することができ、そして所望により、補助剤、例えば潤滑剤、保存料、安定化剤、水和剤、乳化剤、浸透圧調整のための塩、緩衝液、着色料、フレーバー剤、及び／又は芳香性物質等、製剤の核酸と有害な相互作用を示さないものと混合することができる。

水性懸濁液は懸濁液の粘度を増大させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランを含有してよい。懸濁液は安定化剤も含有してよい。

本発明の特定の実施形態は（ａ）アンチセンス化合物１つ以上、及び（ｂ）非アンチセンス機序により機能する他の化学療法剤１つ以上を含有する医薬組成物を提供する。そのような化学療法剤の例は限定しないが、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マホスファミド、イホスファミド、シトシンアラビノシド、ビスクロロエチルニトロソ尿素、ブスルファン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、プレドニソン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、デカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、マイトキサントロン、アムサクリン、クロランブシル、メチルシクロヘキシルニトロソ尿素、窒素マスタード、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−アザシチジン、ヒドロキシ尿素、デオキシコホルマイシン、４−ヒドロキシパーオキシシクロホスファミド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、５−フルオロデオキシウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキセート（ＭＴＸ）、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド（ＶＰ−１６）、トリメトレキセート、イリノテカン、トポテカン、ゲムシタビン、テニポシド、シスプラチン及びジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）を包含する。一般的にＴｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，１５ｔｈ Ｅｄ．，１９８７，ｐｐ．１２０６−１２２８，Ｂｅｒｋｏｗら編、Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．を参照されたい。本発明の化合物と共に使用する場合、そのような化学療法剤は個々に（例えば５−ＦＵ及びオリゴヌクレオチド）、逐次的に（例えば５−ＦＵ及びオリゴヌクレオチドをある期間、その後、ＭＴＸ及びオリゴヌクレオチド）、又は別のそのような化学療法剤１つ以上と組み合わせて（例えば５−ＦＵ、ＭＴＸ及びオリゴヌクレオチド、又は５−ＦＵ、放射線療法及びオリゴヌクレオチド）使用してよい。抗炎症剤、例えば限定しないが、非ステロイド抗炎症剤及びコルチコステロイド、及び抗ウィルス剤、例えば限定しないが、リビビリン、ビダラビン、アシクロビル及びゲンシクロビルも又、本発明の組成物中に組み合わせてよい。一般的にそれぞれＴｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，１５ｔｈ Ｅｄ．，Ｂｅｒｋｏｗら編、１９８７，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，ｐ．２４９９−２５０６及び４６−４９を参照されたい。他の非アンチセンス化学療法剤も又本発明の範囲に包含される。２つ以上の組み合わせられる化合物は共に、又は逐次的に使用してよい。

そのような化合物の毒性及び治療効果は例えばＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％に対して治療上有効な用量）を測定するための細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的操作法により測定することができる。毒性及び治療効果の間の用量比は治療指数であり、そしてそれは比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表示できる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。

細胞培養試験及び動物実験から得られたデータを人における使用のための用量の範囲として製剤中で使用できる。本発明の組成物の用量は一般的に毒性が殆ど、又は全くないＥＤ５０を包含する循環系中濃度の範囲内にある。投薬量は使用する投薬形態及び使用する投与経路に応じてこの範囲内で変動してよい。本発明の方法において使用される何れの化合物に関しても、治療有効用量は細胞培養試験から最初は推定できる。用量は、細胞培養において決定されたＩＣ５０（即ち症状の半最大抑制を達成するための被験化合物の濃度）を包含する化合物の、或いは、適宜、標的配列のポリペプチド産物（例えばポリペプチドの低下した濃度を達成する）の循環血漿中濃度範囲を達成するために動物モデルにおいて製剤してよい。そのような情報を使用して更に正確にヒトにおける有用用量を決定することができる。血漿中のレベルは例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定してよい。

上記した個別又は複数で投与することの他に、本発明のｄｓＲＮＡはＥｇ５発現により媒介される病理学的プロセスの治療において効果的な他の知られた薬剤と組み合わせて投与できる。何れの場合も、担当医は、当該分野で知られた、又は本明細書に記載した薬効の標準的尺度を用いながら観察された結果に基づいてｄｓＲＮＡ投与の量及び時期を調節することができる。

Ｅｇ５の発現により誘発される疾患を治療するための方法
本発明は特に癌の治療のため、例えば腫瘍の生育及び腫瘍の転移を抑制するための、ｄｓＲＮＡ又はそれから製造した医薬組成物の使用に関する。例えば、ｄｓＲＮＡ又はそれから製造した医薬組成物は固形腫瘍、例えば乳癌、肺癌、頭部頚部癌、脳の癌、腹部の癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃腸の癌、神経膠腫、肝臓癌、舌癌、神経芽腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽腫、ウイルムス腫瘍、多発性骨髄腫の治療のため、及び、皮膚癌、例えば黒色腫の治療のため、リンパ腫及び血液の癌の治療のために使用してよい。本発明は更に、Ｅｇ５発現を抑制するため、及び／又は種々の癌、例えば乳癌、肺癌、頭部の癌、頚部の癌、脳の癌、腹部の癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃腸の癌、神経膠腫、肝臓癌、舌癌、神経芽腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽腫、ウイルムス腫瘍、多発性骨髄腫、皮膚癌、黒色腫、リンパ腫及び血液の癌において腹水及び胸水の蓄積を抑制するための本発明のｄｓＲＮＡ又はそれから製造した医薬組成物の使用に関する。Ｅｇ５発現に対する抑制作用のために、本発明のｄｓＲＮＡ又はそれから製造した医薬組成物はクオリティーオブライフを向上させることができる。

本発明は更に、他の医薬品及び／又は治療方法と、例えば知られた医薬品及び／又は知られた治療方法、例えば癌を治療するため、及び／又は腫瘍転移を予防するために現在使用されているものと組み合わせた、例えば癌の治療のため、又は腫瘍転移を予防するためのｄｓＲＮＡ又はその医薬組成物の使用に関する。放射線療法と化学療法剤、例えばシスプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシン又はタモキシフェンとの組み合わせが好ましい。他の実施形態はＶＥＧＦの発現を抑制するために使用される第２のｄｓＲＮＡの使用を包含する。

本発明は又、別の抗癌化学療法剤、例えば何れかの従来の化学療法剤又はＶＥＧＦ発現を抑制するために使用される別のｄｓＲＮＡと組み合わせて、特定のＲＮＡｉ剤と共に包含することにより実施することができる。そのような他の薬剤との特定の結合剤の組み合わせは化学療法プロトコルを強化することができる。多くの化学療法プロトコルは本発明の方法に組み込むことができるものとして当業者が想到するものである。何れかの化学療法剤、例えばアルキル化剤、代謝拮抗剤、ホルモン及び拮抗剤、放射性同位体並びに天然産物を使用することができる。例えば、本発明の化合物は抗生物質、例えばドキソルビシン、及び他のアントラサイクリン類縁体、窒素マスタード、例えばシクロホスファミド、ピリミジン類縁体、例えば５−フルオロウラシル、シスプラチン、ヒドロキシ尿素、タキソール及びその天然および合成の誘導体等と共に投与することができる。別の例として、腫瘍がゴナドトロピン依存性及びゴナドトロピン非依存性の細胞を包含する乳房の腺癌のような混合型の腫瘍の場合は、化合物はロイプロリド又はゴセレリン（ＬＨ−ＲＨの合成ペプチド類縁体）と組み合わせて投与することができる。他の抗新生物剤のプロトコルはテトラサイクリン化合物を他の治療モダリティ、例えば手術、放射線等と共に使用することを包含し、これは本明細書においては「付随的抗新生物モダリティ」とも称する。即ち、本発明の方法は副作用を低減し、薬効を増強するという利点を有するこのような従来の治療法と共に使用できる。

Ｅｇ５遺伝子の発現を抑制するための方法
別の特徴において、本発明は哺乳類におけるＥｇ５遺伝子の発現を抑制するための方法を提供する。方法は標的Ｅｇ５遺伝子の発現がサイレント化されるように哺乳類に本発明の組成物を投与することを含む。その高い特異性のため、本発明のｄｓＲＮＡは標的Ｅｇ５遺伝子のＲＮＡ（一次又はプロセシング後）を特異的にターゲティングする。ｄｓＲＮＡを用いたこれらのＥｇ５遺伝子の発現を抑制するための組成物及び方法は本明細書に記載の通り実施できる。

１つの実施形態において、方法はｄｓＲＮＡを含む組成物を投与することを含み、ここでｄｓＲＮＡは治療すべき哺乳類のＥｇ５遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部分に相補であるヌクレオチド配列を含む。治療すべき生物が哺乳類、例えばヒトである場合、組成物は当該分野で知られた何れかの手段により、例えば限定しないが、経口又は非経口の経路、例えば静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、経鼻、直腸及び局所（口内及び舌下を包含）の投与により投与してよい。好ましい実施形態において、組成物は静脈内の注入又は注射により投与される。

特段の記載が無い限り、本明細書において使用する全ての専門技術用語は本発明が属する分野の当業者により共通に理解されているものと同様の意味を有する。本明細書に記載した方法及び材料と同様又は等価であるものを本発明の実施及び試験において使用できるが、適当な方法及び材料を以下に記載する。本明細書において言及した全ての出版物、特許出願、特許及び他の参考文献は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。矛盾が生じる場合は、定義を含む本明細書が優先する。更に又、材料、方法及び実施例は説明目的のみであり、限定する意図はない。

Ｅｇ５遺伝子の遺伝子ウォーキング
初期スクリーニングセット
ｓｉＲＮＡ設計はＥｇ５をターゲティングするｓｉＲＮＡを同定するために実施した（ＫＩＦ１１、ＨＳＫＰ、ＫＮＳＬ１及びＴＲＩＰ５としても知られている）。Ｅｇ５に対するヒトｍＲＮＡ配列、参考配列番号：ＮＭ＿００４５２３を使用した。

ヒト及びマウスのＥｇ５に対して交差反応性のｓｉＲＮＡデュプレックスを設計した。２４デュプレックスをスクリーニング用に合成した（表１）。

増殖スクリーニングセット
第２のスクリーニングセットはヒトＥＧ５をターゲティングする２６６ｓｉＲＮＡ並びにそのアカゲザルオーソログを用いて定義した（表２）。増殖させたスクリーニングセットはヒトＥＧ５をターゲティングする３２８ｓｉＲＮＡを用いて選択し、他の種の何れかのＥＧ５ｍＲＮＡをヒットする必要はないものとした（表３）。

ヒト及び部分的アカゲザルのＥＧ５ｍＲＮＡの配列をＮＣＢＩヌクレオチドデータベースからダウンロードし、ヒト配列は更にレファレンス配列として使用した（ヒトＥＧ５：ＮＭ＿００４５２３．２、４９０８ｂｐ及びアカゲザルＥＧ５：ＸＭ＿００１０８７６４４．１、８７８ｂｐ（ヒトＥＧ５の５’部分のみ））。

別のアカゲザルＥＧ５配列の同定のために、ヒト配列のメガブラスト検索をアガゲザルのレファレンスゲノムに対してＮＣＢＩにおいて実施した。ダウンロードしたアガゲザルの配列及びブラストヒットのヒット領域を組み立てて完全長に渡ってヒトＥＧ５に対して〜９２％の同一性を有するアガゲザルコンセンサス配列とした。

全ての可能な１９量体をヒトｍＲＮＡ配列から抽出し、ヒト反応性ＥＧ５ｓｉＲＮＡの４８９０（センス鎖）配列に相当する候補標的部位のプールを得た。

ヒト−アカゲザルの交差反応性は本候補プールから生じる最初のスクリーニングセットに関するｓｉＲＮＡのインシリコの選択のための前提条件とした。アカゲザル反応性ｓｉＲＮＡを調べるために、各候補のｓｉＲＮＡ標的部位を組み立てられたアカゲザル配列内の存在に関して検索した。更に又、ｓｉＲＮＡの予測された特異性を、他のヒトｍＲＮＡではなくヒトＥＧ５ｍＲＮＡ配列をターゲティングすることにより顕在化するヒト−アカゲザル交差反応性ｓｉＲＮＡのプールからの選択基準とした。

ｓｉＲＮＡの特異性は「オフターゲット遺伝子」と称される他の遺伝子をターゲティングするその潜在性を介して表示することができる。

ｓｉＲＮＡのオフターゲット潜在性を予測するために、以下の仮定を立てた。
１）鎖のオフターゲット潜在性はオフターゲットに対するミスマッチの数及び分布から推定することができる。
２）最も関連するオフターゲット、すなわちミスマッチの耐容性のためにサイレント化される可能性が最も高いと予測される遺伝子が、鎖のオフターゲット潜在性を決定する。
３）鎖の２〜９位（５’から３’の方向に数える）（シード領域）は残りの配列（即ちノンシード及び切断部位の領域）よりもオフターゲット潜在性により高度に寄与する場合がある。
４）鎖の１０及び１１位（５’から３’の方向に数える）（切断部位領域）はノンシード領域（即ち５’から３’の方向に数えて１２〜１８位）よりもオフターゲット潜在性により高度に寄与する場合がある。
５）各鎖の１〜１９位はオフターゲット相互作用に関連しない。
６）オフターゲット潜在性は仮定３）〜５）を考慮しながらオフターゲット遺伝子における最も相同である領域に対する鎖のミスマッチの数及び位置に基づいて計算された最も関連するオフターゲットのオフターゲット評点により表示することができる。
７）アンチセンス及びセンス鎖のオフターゲット潜在性は関連することになるが、導入された内部の修飾によるセンス鎖活性の潜在的削減があり得る。

低いオフターゲット潜在性を有するｓｉＲＮＡが好ましいものとして定義され、そしてより特異的であるものと仮定される。

ヒトＥＧ５特異的ｓｉＲＮＡを発見するために、全て潜在的オフターゲットであるとみなされた全ての他のヒト転写物を、ヒト−アカゲザル交差反応性１９量体センス鎖配列並びに相補のアンチセンス鎖に関する潜在的標的領域があるものを得るべく検索した。このために、ファーストＡアルゴリズムを用いてヒト参照配列データベースの各配列における最も相同なヒット領域を決定し、これを本発明者等は包括的ヒトトランスクリプトームを表すものと仮定した。

仮定３）〜５）に従って全ての潜在的オフターゲットを順位付けするために、そしてこれにより最も関連するオフターゲット遺伝子及びそのオフターゲット評点を同定するために、ファーストＡアウトプットファイルをパールスクリプトにより更に分析した。

スクリプトは各１９量体のインプット配列及び各オフターゲット遺伝子について以下のオフターゲット特性を抽出することによりオフターゲット評点を計算した。

ノンシード領域におけるミスマッチの数。

シード領域におけるミスマッチの数。

切断部位の領域におけるミスマッチの数。

オフターゲット評点は以下の通り仮定３）〜５）を考慮することにより計算した。

オフターゲット評点＝シードミスマッチ数＊１０
＋切断部位ミスマッチ数＊１．２
＋ノンシードミスマッチ数＊１
各１９量体の配列に関する最も関連するオフターゲット遺伝子は最低オフターゲット評点を有する遺伝子として定義した。従って、最低オフターゲット評点は鎖のオフターゲット潜在性を代表するものとして定義した。

表２に示すスクリーニングセットについて、アンチセンス鎖に対する３以上、及び、センス鎖に対する２以上のオフターゲット評点をｓｉＲＮＡの選択のための前提条件として選択し、４つ以上の連続するＧを含有する配列（ポリＧ配列）の全てを除外した。特異性の基準をパスした２６６ヒト−アカゲザル交差反応性配列をこのカットオフに基づいて選択した（表２参照）。

増殖したスクリーニングセットの定義に関しては、アカゲザルに対する交差反応性を無視し、新しく入手するヒト参照配列データベースに基づいて予測される特異性を再計算し、そして、アンチセンス及びセンス鎖に対して２．２以上のオフターゲット評点を有する３２８非ポリＧｓｉＲＮＡのみを選択した（表３参照）。

表について：符号：Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ−リボヌクレオチド：Ｔ−デオキシチミジン：ｕ，ｃ−２’−Ｏ−メチルヌクレオチド：ｓ−ホスホロチオエート連結部。

ｄｓＲＮＡ合成
試薬入手元
本明細書において試薬の入手元を特定しない場合は、その試薬は分子生物学における用途のための標準的な品質／純度における分子生物学のための試薬の何れかの供給元から入手してよい。

ｓｉＲＮＡ合成
１本鎖ＲＮＡはＥｘｐｅｄｉｔｅ８９０９合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｐｐｌｅｒａ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及び固体支持体としてのコントロールされた細孔のガラス（ＣＰＧ、５００Å、Ｐｒｏｌｉｇｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて１μモルのスケールにおける固相合成により製造した。ＲＮＡ及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含有するＲＮＡは、相当するホスホロアミダイト及び２’−Ｏ−メチルホスホロアミダイトをそれぞれ用いながら固相合成により形成した（Ｐｒｏｌｉｇｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。これらのビルディングブロックを、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ら（編），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載のもののような標準的なヌクレオシドホスホロアミダイト化学を用いてオリゴヌクレオチド鎖の配列内の選択された部位に取り込んだ。ホスホロチオエート連結部はアセトニトリル中のＢｅａｕｃａｇｅ試薬（Ｃｈｒｕａｃｈｅｍ，Ｌｔｄ，Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ）の溶液（１％）でヨウ素酸化剤溶液を置き換えることにより導入した。その他の副次的試薬はＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｂａｋｅｒ（Ｇｒｉｅｓｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）より入手した。

アニオン交換ＨＰＬＣによる粗製オリゴリボヌクレオチドの脱保護及び精製は確立された操作法に従って実施した。収率及び濃度は分光光度計（ＤＵ６４０Ｂ，Ｂｅｃｋｍａｎ
Ｃｏｕｌｔｅｒ ＧｍｂＨ，Ｕｎｔｅｒｓｃｈｌｅｉｓｓｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２６０ｎｍの波長においてそれぞれのＲＮＡの溶液のＵＶ吸光度により測定した。２本鎖ＲＮＡはアニーリング緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８；１００ｍＭ塩化ナトリウム）中の相補鎖の等モル溶液を混合することにより形成し、これは３分間８５〜９０℃のウォーターバス中で加熱し、そして３〜４時間かけて室温に冷却した。アニーリングされたＲＮＡ溶液は使用時まで−２０℃で保存した。

３’−コレステロールコンジュゲートｓｉＲＮＡ（本明細書においてはＣｈｏｌ−３’と称する）の合成のためには、適切に修飾された固体支持体をＲＮＡ合成のために使用した。修飾された固体支持体は以下の通り製造した。

ジエチル−２−アザブタン−１，４−ジカルボキシレートＡＡ

水酸化ナトリウムの４．７Ｍ水溶液（５０ｍＬ）を水（５０ｍｌ）中の塩酸エチルグリシネート（３２．１９ｇ、０．２３モル）の攪拌氷冷溶液内に添加した。次に、エチルアクリレート（２３．１ｇ、０．２３モル）を添加し、反応終了がＴＬＣにより確認されるまで混合物を室温で攪拌した。１９時間後、溶液をジクロロメタン（３×１００ｍｌ）とに分配した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発させた。残留物を蒸留してＡＡ（２８．８ｇ，６１％）を得た。

３−｛エトキシカルボニルメチル−［６−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−ヘキサノイル］−アミノ｝−プロピオン酸エチルエステルＡＢ

Ｆｍｏｃ−６−アミノヘキサン酸（９．１２ｇ、２５．８３ミリモル）をジクロロメタン（５０ｍＬ）中に溶解し、氷冷した。ジイソプロピルカルボジイミド（３．２５ｇ、３９９ｍＬ、２５．８３ミリモル）を０℃で溶液に添加した。次にジエチル−アザブタン−１，４−ジカルボキシレート（５ｇ、２４．６ミリモル）及びジメチルアミノピリジン（０．３０５ｇｍ、２．５ミリモル）を添加した。溶液を室温とし、更に６時間攪拌した。反応終了はＴＬＣにより確認した。反応混合物を真空下に濃縮し、酢酸エチルを添加することによりジイソプロピル尿素を沈殿させた。懸濁液を濾過した。濾液を５％水性塩酸、５％重炭酸ナトリウム及び水で洗浄した。合わせた有機層を硫酸ナトリウム上に乾燥し、濃縮して得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製し、ＡＢ１１．８７ｇ（８８％）を得た。

３−［（６−アミノヘキサノイル）−エトキシカルボニルメチルアミノ］−プロピオン酸エチルエステルＡＣ

３−｛エトキシカルボニルメチル−［６−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−ヘキサノイル］−アミノ｝−プロピオン酸エチルエステルＡＢ（１１．５ｇ、２１．３ミリモル）を０℃でジメチルホルムミド中２０％ピペリジンに溶解した。溶液を１時間攪拌した。反応混合物を真空下に濃縮し、水を残留物に添加し、そして生成物を酢酸エチルで抽出した。粗生成物をその塩酸塩に変換することにより精製した。
３−（｛６−［１７−（１，５−ジメチルヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝エトキシカルボニルメチル−アミノ）−プロピオン酸エチルエステルＡＤ

３−［（６−アミノヘキサノイル）−エトキシカルボニルメチルアミノ］−プロピオン酸エチルエステルＡＣ（４．７ｇ、１４．８ミリモル）の塩酸塩をジクロロメタン中に取り上げた。懸濁液を氷上で０℃まで冷却した。懸濁液にジイソプロピルエチルアミン（３．８７ｇ、５．２ｍＬ，３０ミリモル）を添加した。得られた溶液にコレステリルクロロホルメート（６．６７５ｇ、１４．８ミリモル）を添加した。反応混合物を一夜攪拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、１０％塩酸で洗浄した。生成物をフラッシュクロマトグラフィーで精製した（１０．３ｇ、９２％）。
１−｛６−［１７−（１，５−ジメチルヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝−４−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸エチルエステルＡＥ

カリウムｔ−ブトキシド（１．１ｇ、９．８ミリモル）を乾燥トルエン３０ｍＬ中にスラリー化した。混合物を氷上で０℃に冷却し、そしてジエステルＡＤ５ｇ（６．６ミリモル）を２０分以内に攪拌しながら緩徐に添加した。添加中の温度は５℃未満に維持した。攪拌を０℃で３０分間継続し、そして氷酢酸１ｍｌを添加し、その直後に水４０ｍｌ中のＮａＨ_２ＰＯ_４・Ｈ_２Ｏ４ｇを添加した。得られた混合物を各々ジクロロメタン１００ｍｌで２回抽出し、そして合わせた有機抽出液を各々リン酸塩緩衝液１０ｍＬで２回洗浄し、乾燥し、蒸発乾固させた。残留物をトルエン６０ｍＬに溶解し、０℃に冷却し、各５０ｍＬの冷ｐＨ９．５炭酸塩緩衝液で３回抽出した。水性抽出液をリン酸でｐＨ３に調節し、各４０ｍｌのクロロホルムで５回抽出し、これらを合わせ、乾燥し、蒸発乾固させた。残留物を２５％酢酸エチル／ヘキサンを用いたカラムクロマトグラフィーにより精製し、ｂ−ケトエステル１．９ｇを得た（３９％）。
［６−（３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン−１−イル）−６−オキソヘキシル］−カルバミン酸１７−（１，５−ジメチルヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステルＡＦ

メタノール（２ｍｌ）をテトラヒドロフラン（１０ｍｌ）中のｂ−ケトエステルＡＥ（１．５ｇ、２．２ミリモル）及びナトリウムボロハイドライド（０．２２６ｇ、６ミリモル）の還流混合物に１時間かけて滴下した。攪拌を１時間還流温度で継続した。室温に冷却したのち、１ＮＨＣｌ（１２．５ｍｌ）を添加し、混合物を酢酸エチル（３×４０ｍｌ）で抽出した。合わせた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウム上に乾燥し、真空下に濃縮し、得られた生成物をカラムクロマトグラフィーで精製した（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ_３）（８９％）。
（６−｛３−［ビス−（４−メトキシフェニル）−フェニルメトキシメチル］−４−ヒドロキシピロリジン−１−イル｝−６−オキソヘキシル）−カルバミン酸１７−（１，５−ジメチルヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステルＡＧ

ジオールＡＦ（１．２５ｇｍ、１．９９４ミリモル）を真空下にピリジン（２×５ｍＬ）と共に蒸発させることにより乾燥させた。無水ピリジン（１０ｍＬ）及び４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（０．７２４ｇ、２．１３ミリモル）を攪拌しながら添加した。反応は一夜室温で実施した。メタノールを添加することにより反応をクエンチングした。反応混合物を真空下に濃縮し、残留物にジクロロメタン（５０ｍＬ）を添加した。有機層を１Ｍ水性重炭酸ナトリウムで洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上に乾燥し、濾過し、濃縮した。残留物のピリジンをトルエンと共に蒸発させることにより回収した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（２％ＭｅＯＨ／クロロホルム、５％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ_３中でＲｆ＝０．５）で精製した（１．７５ｇ、９５％）。

コハク酸モノ−（４−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−１−｛６−［１７−（１，５−ジメチルヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝−ピロリジン−３−イル）エステルＡＨ

化合物ＡＧ（１．０ｇ、１．０５ミリモル）を無水コハク酸（０．１５０ｇ、１．５ミリモル）及びＤＭＡＰ（０．０７３ｇ、０．６ミリモル）と混合し、一夜４０℃で真空下に乾燥した。混合物を無水ジクロロエタン（３ｍＬ）中に溶解し、トリエチルアミン（０．３１８ｇ、０．４４０ｍＬ、３．１５ミリモル）を添加し、そして溶液を１６時間アルゴン雰囲気下室温で攪拌した。次にこれをジクロロメタン（４０ｍＬ）で希釈し、氷冷水性クエン酸（５ｗｔ％、３０ｍＬ）及び水（２×２０ｍＬ）で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウム上に乾燥し、濃縮乾固した。残留物をそのまま次の工程に使用した。
コレステロール誘導体化ＣＰＧＡＩ

スクシネートＡＨ（０．２５４ｇ、０．２４２ミリモル）をジクロロメタン／アセトニトリル（３：２、３ｍｌ）の混合物中に溶解した。この溶液に、アセトニトリル（１．２５ｍＬ）中のＤＭＡＰ（０．０２９６ｇ，０．２４２ミリモル）、アセトニトリル／ジクロロエタン（３：１、１．２５ｍＬ）中の２，２’−ジチオ−ビス（５−ニトロピリジン）（０．０７５ｇ、０．２４２ミリモル）を順次添加した。得られた溶液に、アセトニトリル（０．６ｍｌ）中のトリフェニルホスフィン（０．０６４ｇ、０．２４２ミリモル）を添加した。反応混合物は明橙色に変色した。溶液は手首動作型振とう器を用いて短時間攪拌した（５分）。長鎖アルキルアミン−ＣＰＧ（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）（１．５ｇ、６１ｍＭ）を添加した。懸濁液を２時間攪拌した。ＣＰＧを焼結漏斗を通して濾過し、アセトニトリル、ジクロロメタン及びエーテルで順次洗浄した。未反応のアミノ基を無水酢酸／ピリジンを用いてマスキングした。達成されたＣＰＧ負荷はＵＶ測定により測定した（３７ｍＭ／ｇ）。

５’−１２−ドデカン酸ビスデシルアミド基（本明細書においては５’−Ｃ３２−と称する）又は５’−コレステリル誘導体基（本明細書においては５’−Ｃｈｏｌ−と称する）を担持したｓｉＲＮＡの合成は、コレステリル誘導体に関して酸化工程をＢｅａｕｃａｇｅ試薬を用いながら実施することにより核酸オリゴマーの５’末端においてホスホロチオエート連結部を導入した以外は、ＷＯ２００４／０６５６０１に記載の通り実施した。

核酸配列は標準的命名法及び特に表４の略記法を用いて以下の通り示した。

ｄｓＲＮＡ発現ベクター
本発明の別の特徴において、Ｅｇ５遺伝子発現活性をモジュレートするＥｇ５特異的ｄｓＲＮＡ分子はＤＮＡ又はＲＮＡベクター内に挿入された転写ユニットから発現される（例えばＣｏｕｔｕｒｅ，Ａ，ら、ＴＩＧ．（１９９６），１２：５−１０；Ｓｋｉｌｌｅｒｎ，Ａ．，ら、国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／２２１１３，Ｃｏｎｒａｄ，国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／２２１１４及びＣｏｎｒａｄ，米国特許６，０５４，２９９参照）。これらのトランスジーンは宿主ゲノム内に取り込まれ、そして組み込まれたトランスジーンとして受け継がれることができる線状コンストラクト、環状プラスミド、又はウィルスベクターとして導入することができる。トランスジーンは又それが染色体外プラスミドとして受け継がれることができるように構築することもできる（Ｇａｓｓｍａｎｎ，ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：１２９２）。

ｄｓＲＮＡの個々の鎖は２つの別個の発現ベクター上のプロモーターにより転写され、そして標的細胞内に同時トランスフェクトされることができる。或いはｄｓＲＮＡの各々個々の鎖は同じ発現プラスミド上に両方が位置するプロモーターにより転写されることができる。好ましい実施形態においては、ｄｓＲＮＡはｄｓＲＮＡがステムアンドループ構造を有するようにリンカーポリヌクレオチド配列により連結された反転リピートとして発現される。

組み換えｄｓＲＮＡ発現ベクターは一般的にはＤＮＡプラスミド又はウィルスベクターである。ｄｓＲＮＡ発現ウィルスベクターは、限定しないが、アデノ関連ウィルス（参照文献はＭｕｚｙｃｚｋａ，ら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７−１２９））；アデノウィルス（例えばＢｅｒｋｎｅｒ，ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９８）６：６１６，Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４），及びＲｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２），Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５）参照）；又はアルファウィルス並びに当該分野で知られる他のものに基づいて構築することができる。レトロウィルスはインビトロ及び／又はインビボで上皮細胞を包含する多種の異なる細胞型内に種々の遺伝子を導入するために使用されている（例えばＥｇｌｉｔｉｓ，ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０：１３９５−１３９８；Ｄａｎｏｓ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９８）８５：６４６０−６４６４；Ｗｉｌｓｏｎら、１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：３０１４−３０１８；Ａｒｍｅｎｔａｎｏら、１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：６１４１６１４５；Ｈｕｂｅｒら、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：８０３９−８０４３；Ｆｅｒｒｙら、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：８３７７−８３８１；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１８０２−１８０５；ｖａｎ Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ．ら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：７６４０−１９；Ｋａｙら、１９９２，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：６４１−６４７；Ｄａｉら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０８９２−１０８９５；Ｈｗｕら、１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４−４１１５；米国特許４，８６８，１１６；米国特許４，９８０，２８６；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０７１３６；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０２４６８；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０５３４５；及びＰＣＴ出願ＷＯ９２／０７５７３参照）。細胞のゲノムに挿入された遺伝子を形質導入して発現できる組み換えレトロウィルスベクターはＰＡ３１７及びＰｓｉ−ＣＲＩＰのような適当なパッケージング細胞系統内に組み換えレトロウィルスゲノムをトランスフェクトすることにより製造できる（Ｃｏｍｅｔｔｅら、１９９１，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：５−１０；Ｃｏｎｅら、１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：６３４９）。組み換えアデノウィルスベクターは感受性宿主（例えばラット、ハムスター、イヌ、及びチンパンジー）における広範な種類の細胞及び組織を感染させるために使用でき（Ｈｓｕら、１９９２，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ，１６６：７６９）、そして又感染のために有糸分裂的に活動性の細胞を必要としないという利点も有する。

本発明のＤＮＡプラスミド又はウィルスベクターの何れかにおけるｄｓＲＮＡ発現を駆動するプロモーターは真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（例えばリボソームＲＮＡプロモーター）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（例えばＣＭＶ初期プロモーター又はアクチンプロモーター又はＵ１ｓｎＲＮＡプロモーター）又は一般的にはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えばＵ６ｓｎＲＮＡ又は７ＳＫＲＮＡプロモーター）又は原核生物プロモーター、例えばＴ７プロモーターであってよいが、ただし発現プラスミドはＴ７プロモーターからの転写に必要なＴ７ＲＮＡポリメラーゼもコードするものとする。プロモーターは又トランスジーン発現を膵臓に指向させることができる（例えば膵臓に関するインスリン調節配列参照（Ｂｕｃｃｈｉｎｉら、１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：２５１１−２５１５）））。

更に又、トランスジーンの発現は例えば誘導調節配列及び発現系、例えば特定の生理学的調節物質、例えば循環系中グルコース濃度又はホルモンに対して感受性の調節配列を用いることにより厳密に調節できる（Ｄｏｃｈｅｒｔｙら、１９９４，ＦＡＳＥＢＪ．８：２０−２４）。細胞における、又は哺乳類におけるトランスジーン発現の制御のために適するそのような誘導発現系は、エクジソンによる、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、２量化の化学的誘導物質、及びイソプロピル−ベータ−Ｄ１−チオガラクトピラノシド（ＥＰＴＧ）による調節を包含する。当業者はｄｓＲＮＡトランスジーンの意図する使用に基づいて適切な調節／プロモーター配列を選択することができる。

一般的に、ｄｓＲＮＡ分子を発現することができる組み換えベクターは後述する通り送達され、そして標的細胞内に定着する。或いは、ｄｓＲＮＡ分子の一過性発現をもたらすウィルスベクターを使用できる。そのようなベクターは必要に応じて反復して投与できる。発現後、ｄｓＲＮＡは標的ＲＮＡに結合し、そしてその機能又は発現を調節する。ｄｓＲＮＡ発現ベクターの送達は、全身、例えば静脈内又は筋肉内投与によるか、患者から移出した標的細胞への投与とその後の患者内への再導入によるか、又は所望の標的細胞内への導入を可能にする何れかの他の手段により行うことができる。

ｄｓＲＮＡ発現ＤＮＡプラスミドは典型的にはカチオン性脂質担体（例えばオリゴフェクタミン）又は非カチオン性脂質系担体（例えばＴｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯ^ＴＭ）との複合体として標的細胞内にトランスフェクトされる。１週間以上の期間に渡る単一のＥｇ５遺伝子の異なる領域又は多数のＥｇ５遺伝子をターゲティングするｄｓＲＮＡ媒介ノックダウンのための多重脂質トランスフェクションも又、本発明の意図するものである。宿主細胞内への本発明のベクターの良好な導入は種々の周知の方法を用いてモニタリングできる。例えば一過性のトランスフェクションは緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）のような蛍光マーカーのようなレポーターを用いてシグナル化できる。エクスビボの細胞の安定なトランスフェクションは特定の環境因子（例えば抗生物質及び薬剤）に対する耐性、例えばハイグロマイシンＢ耐性を有するトランスフェクトされた細胞を与えるマーカーを使用しながら確保することができる。

Ｅｇ５特異的ｄｓＲＮＡ分子はまたベクター内に挿入してヒト患者のための遺伝子療法ベクターとして使用することもできる。遺伝子療法ベクターは例えば静脈内注射、局所投与により（米国特許５，３２８，４７０参照）、或いは定位注射により（例えばＣｈｅｎら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：３０５４−３０５７参照）対象に送達することができる。遺伝子療法ベクターの薬学的調製品は許容される希釈剤中に遺伝子療法ベクターを包含することができ、或いは、遺伝子送達ビヒクルが包埋された緩徐放出マトリックスを含むことができる。或いは、完全遺伝子送達ベクターを組み換え細胞から未損傷で製造できる場合、例えばレトロウィルスベクターの場合は、薬学的調製品は遺伝子送達系を生産する細胞１個以上を包含できる。

細胞増殖を介したＥｇ５ｓｉＲＮＡインビトロスクリーニング
Ｅｇ５のサイレント化は有糸分裂停止を誘発することがわかっている（Ｗｅｉｌ，Ｄ．ら、［２００２］Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ３３：１２４４−８）ため、細胞生存性試験をｓｉＲＮＡ活性スクリーニングのために使用した。ＨｅＬａ細胞（ウェル当たり１４０００［スクリーン１及び３］又はウェル当たり１００００［スクリーン２］）を９６穴プレートに播種し、そして３０ｎＭのウェル中最終ｓｉＲＮＡ濃度において、そして５０ｎＭ（第１スクリーン）及び２５ｎＭ（第２スクリーン）の終濃度において、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で同時トランスフェクトした。デュプレックスのサブセットを第３のスクリーン中２５ｎＭで試験した（表５）。

トランスフェクション後７２時間において、培地にＷＳＴ−１試薬（Ｒｏｃｈｅ）を添加し、その後４５０ｎｍにおける吸光度を測定することにより細胞増殖を試験した。対照（非トランスフェクト）細胞に関する吸光度値を１００パーセントとみなし、ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたウェルの吸光度を対照値と比較した。試験は３スクリーンの各々について６連で実施した。ｓｉＲＮＡのサブセットを更に、所定の範囲のｓｉＲＮＡ濃度において試験した。試験はＨｅＬａ細胞において実施した（ウェル当たり１４０００；方法は上記と同様、表５）。

表５において最大の生育抑制を示した９種のｓｉＲＮＡデュプレックスをＨｅＬａ細胞においてある範囲のｓｉＲＮＡ濃度において再試験した。試験したｓｉＲＮＡ濃度は１００ｎＭ、３３．３ｎＭ、１１．１ｎＭ、３．７０ｎＭ、１．２３ｎＭ、０．４１ｎＭ、０．１４ｎＭ及び０．０４６ｎＭであった。試験は６連で実施し、細胞増殖の５０％抑制をもたらす各ｓｉＲＮＡ濃度（ＩＣ_５０）を計算した。この用量応答分析は各デュプレックスに関して２〜４回実施した。平均のＩＣ_５０値（ｎＭ）を表６に示す。

細胞増殖を介したＥｇ５ｓｉＲＮＡインビトロスクリーニング
トランスフェクションの直前において、ＨｅｌａＳ３（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２．２，ＬＣＧ Ｐｒｏｍｏｃｈｅｍ ＧｍｂＨ，Ｗｅｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）細胞を生育培地（Ｈａｍ’ｓＦ１２、１０％ウシ胎児血清、１００ｕペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、全てＢｉｏｃｈｅｍ ＡＧ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙより入手）７５μｌ中、９６穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ ＧｍｂＨ，Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上において１．５×１０^４個／ウェルの細胞密度で播種した。トランスフェクションは４連で実施した。各ウェルにつき、０．５μｌリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＧｍｂＨ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を１２μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、室温で１５分間インキュベートした。ｓｉＲＮＡ濃度が１００μｌのトランスフェクション容量中５０ｎＭとなるために、５μＭｓｉＲＮＡ１μｌをウェル当たりＯｐｔｉ−ＭＥＭ１１．５μｌと混合し、リポフェクタミン２０００−Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ混合物と合わせ、そして再度室温で１５分間インキュベートした。ｓｉＲＮＡ−リポフェクタミン２０００複合物を完全に（ウェル当たり２５μｌ）細胞に適用し、そして細胞を湿潤インキュベーター中３７℃及び５％ＣＯ_２において２４時間インキュベートした（Ｈｅｒａｃｕｓ ＧｍｂＨ，Ｈａｎａｕ）。単用量スクリーンをそれぞれ５０ｎＭ及び２５ｎＭにおいて実施した。

細胞は溶解混合物（Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＵＳＡより入手したＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ ｂＤＮＡキットの内容物）５０μｌを生育培地１００μｌの入った各ウェルに適用することにより採取し、そして３０分間５３℃において溶解した。その後、溶解物５０μｌをヒトＥｇ５及びヒトＧＡＰＤＨに特異的なプローブセットと共にインキュベートし、そしてＱｕａｎｔｉＧｅｎｅに関する製造元のプロトコルに従って処理した。終了時において、ケミルミネセンスをＶｉｃｔｏｒ２−Ｌｉｇｈｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中でＲＬＵ（相対光単位）として測定し、そしてｈＥｇ５プローブセットを用いて得られた値を各ウェルにつき対応するＧＡＰＤＨ値に対して規格化した。Ｅｇ５に対して指向されたｓｉＲＮＡを用いて得られた値を１００％に設定した非特異的ｓｉＲＮＡ（ＨＣＶに対して指向）を用いて得られた値と関連付けた（表１、２及び３）。

スクリーンに由来する有効なｓｉＲＮＡを用量応答曲線により更に特性化した。用量応答曲線のトランスフェクションは以下の濃度：即ち、１００ｎＭ、１６．７ｎＭ、２．８ｎＭ、０．４６ｎＭ、７７ピコＭ、１２．８ピコＭ、２．１ピコＭ、０．３５ピコＭ、５９．５ｆＭ、９．９ｆＭ及びブランク（ｓｉＲＮＡ非含有）において実施し、そして上記プロトコルに従ってＯｐｔｉ−ＭＥＭで終濃度１２．５μｌに希釈した。データ分析はマイクロソフトエクセルアドインソフトウエアＸＬ−フィット４．２（ＩＤＢＳ，Ｇｕｉｌｄｆｏｒｄ，ｓｕｒｒｅｙ，ＵＫ）を用いながら、そして用量応答モデル２０５番を適用しながら実施した（表１、２及び３）。

主要なｓｉＲＮＡであるＡＤ１２１１５を更にＲｏｃｈｅのＷＳＴ増殖試験を適用しながら分析した（前述）。

最大活性を示した表２の３４デュプレックスのサブセットを１００ｎＭ〜１０ｆＭの範囲の終濃度におけるＨｅＬａ細胞におけるトランスフェクションにより試験した。トランスフェクションは４連で実施した。２つの用量応答試験を各デュプレックスについて実施した。ＫＳＰｍＲＮＡの２０％（ＩＣ２０）、５０％（ＩＣ５０）及び８０％（ＩＣ８０）低下を与える濃度を各デュプレックスについて計算した（表７）。

ＬＮＰ０１製剤ｓｉＲＮＡの単回瞬時投与後の幼若ラットにおける肝Ｅｇ５／ＫＳＰのサイレント化
出生時〜約２３日齢において、成長中のラット肝臓においてＥｇ５／ＫＳＰ発現を検出することができる。製剤化されたＥｇ５／ＫＳＰｓｉＲＮＡを用いた標的のサイレント化を幼若ラットにおいて評価した。

試験したＫＳＰデュプレックス

方法
動物の投薬：雄性幼若Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（１９日齢）に尾静脈注射によりリピドイド（ＬＮＰ０１）製剤化ｓｉＲＮＡの単回用量を投与した。１０匹の群にＡＤ６２４８又は非特異的ｓｉＲＮＡの何れかを体重キログラム当たり１０ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）の用量で投与した。用量レベルは製剤中において投与されたｓｉＲＮＡデュプレックスの量を指す。第３の群にはリン酸塩緩衝食塩水を投与した。ｓｉＲＮＡ投与後２日に動物を屠殺した。肝臓を摘出し、液体窒素中に急速冷凍し、粉砕して粉末とした。

ｍＲＮＡ測定。Ｅｇ５／ＫＳＰｍＲＮＡのレベルを全治療群由来の肝臓において測定した。各肝臓粉末の試料（約１０ミリグラム）を、プロテイナーゼＫを含有する組織溶解緩衝液中でホモゲナイズした。Ｅｇ５／ＫＳＰ及びＧＡＰＤＨｍＲＮＡのレベルはＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ分枝鎖ＤＮＡ試験（ＧｅｎｏＳｐｅｃｔｒａ）を用いて各試料について３連で測定した。Ｅｇ５／ＫＳＰの平均値を各試料について平均のＧＡＰＤＨ値に対して規格化した。群平均を求め、各実験についてＰＢＳ群に対して規格化した。

統計学的分析。ＡＮＯＶＡ、次いでＴｕｋｅｙ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ試験により有意性を求めた。

結果
データのまとめ
Ｅｇ５／ＫＳＰｍＲＮＡに関する平均値（±標準偏差）を示す。ＰＢＳ群に対する統計学的有意性（ｐ値）を示す（ｎｓ、有意差無し［ｐ＞０．０５］）。

肝臓Ｅｇ５／ＫＳＰｍＲＮＡの統計学的に有意な低減は１０ｍｇ／ｋｇの用量における製剤化ＡＤ６２４８での治療後に観察された。
ＬＮＰ０１製剤化ｓｉＲＮＡデュプレックスの静脈内注入後のラット肝ＶＥＧＦのサイレント化
２種のｓｉＲＮＡの等モル量混合物を含む「リピドイド」製剤をラットに投与した。１つのｓｉＲＮＡ（ＡＤ３１３３）はＶＥＧＦに対して指向させた。もう一方のｓｉＲＮＡ（ＡＤ１２１１５）はＥｇ５／ＫＳＰに対して指向させた。Ｅｇ５／ＫＳＰ発現は成熟ラット肝臓では殆ど検出できないため、ＶＥＧＦレベルのみがｓｉＲＮＡ治療後に測定された。

投与したｓｉＲＮＡデュプレックス

符号：Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ−リボヌクレオチド；ｃ、ｕ−２’−Ｏ−Ｍｅリボヌクレオチド；ｓ−ホスホロチオエート
方法
動物の投薬。成熟雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの大腿動脈内への２時間の注入によりリピドイド（ＬＮＰ０１）製剤化ｓｉＲＮＡを投与した。４匹の群に製剤化ｓｉＲＮＡの体重キログラム当たり５、１０及び１５ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）の用量を投与した。用量レベルは製剤中において投与されたｓｉＲＮＡデュプレックスの総量を指す。第４の群にはリン酸塩緩衝食塩水を投与した。ｓｉＲＮＡ注入終了後７２時間に動物を屠殺した。肝臓を摘出し、液体窒素中に急速冷凍し、粉砕して粉末とした。
製剤手順
リピドイドＮＤ９８：４ＨＣｌ（ＭＷ１４８７）（式１）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＰＥＧ−セラミドＣ１６（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）を用いて脂質ｓｉＲＮＡナノ粒子を製造した。エタノール中の各々の保存溶液をＮＤ９８、１３３ｍｇ／ｍＬ；コレステロール、２５ｍｇ／ｍＬ、ＰＥＧ−セラミドＣ１６、１００ｍｇ／ｍＬとなるように製造した。次にＮＤ９８、コレステロール及びＰＥＧセラミドＣ１６保存溶液を４２：４８：１０モルの比において合わせた。合わせた脂質溶液は、最終エタノール濃度３５〜４５％、最終酢酸ナトリウム濃度１００〜３００ｍＭとなるように、水性ｓｉＲＮＡ（酢酸ナトリウムｐＨ５中）と急速混合した。形成された脂質−ｓｉＲＮＡナノ粒子は混合により自発的に形成された。所望の粒径分布に応じて、得られたナノ粒子混合物を場合によりサーモバレル押出器を用いてポリカーボネート膜（１００ｎｍカットオフ）を通して押し出した（Ｌｉｐｅｘ，Ｅｘｔｒｕｄｅｒ，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ）。他の場合においては、押し出し工程を省略した。エタノール除去及び同時緩衝液交換を透析又は接線流動濾過の何れかにより行った。緩衝液はリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．２に交換した。

製剤の特性化
標準的又は押し出しを行わない方法の何れかにより製造された製剤を同様の態様において特性化した。製剤はまず目視による検査により特性化した。凝集塊又は沈降物質を含有しない白色系の透明溶液であるべきとした。脂質ナノ粒子の粒径及び粒径分布はＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＮａｎｏＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＳＡ）を用いた動的光散乱法により測定した。粒子は２０〜３００ｎｍ、理想的には４０〜１００ｎｍのサイズであるべきとした。粒径分布は単モードであるべきとした。製剤中の総ｓｉＲＮＡ濃度、並びに捕獲された画分は染料排出試験を用いて推定される。製剤化されたｓｉＲＮＡの試料をＲＮＡ結合染料リボグリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と共に製剤崩壊性界面活性剤０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の存在下及び非存在下においてインキュベートする。製剤中の総ｓｉＲＮＡは標準曲線と相対比較した場合の界面活性剤含有試料からのシグナルにより測定される。捕獲された画分は総ｓｉＲＮＡ含有量から「遊離の」ｓｉＲＮＡ含有量（界面活性剤非存在下におけるシグナルにより測定される）を差し引くことにより求められる。パーセント捕獲ｓｉＲＮＡは典型的には＞８５％である。

ｍＲＮＡ測定。各肝臓粉末の試料（約１０ミリグラム）をプロテイナーゼＫを含有する組織溶解緩衝液中でホモゲナイズした。ＶＥＧＦ及びＧＡＰＤＨｍＲＮＡのレベルはＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ分枝鎖ＤＮＡ試験（ＧｅｎｏＳｐｅｃｔｒａ）を用いて各試料について３連で測定した。ＶＥＧＦの平均値を各試料について平均のＧＡＰＤＨ値に対して規格化した。群平均を求め、各実験についてＰＢＳ群に対して規格化した。

蛋白の測定。各肝臓粉末の試料（約６０ミリグラム）を１ｍｌのＲＩＰＡ緩衝液中でホモゲナイズした。ＭｉｃｒｏＢＣＡ蛋白試験キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いながら総蛋白濃度を測定した。各動物の総蛋白の試料を用いながら、ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡ試験（Ｒ＆Ｄシステムズ）を使用してＶＥＧＦ蛋白レベルを測定した。群平均を求め、各実験についてＰＢＳ群に対して規格化した。
統計学的分析。ＡＮＯＶＡ、次いでＴｕｋｅｙ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ試験により有意性を求めた。

結果
データのまとめ
ｍＲＮＡ（ＶＥＧＦ／ＧＡＰＤＨ）及び蛋白（ｒｅｌ．ＶＥＧＦ）に関する平均値（±標準偏差）を各治療群について示す。各実験に関するＰＢＳ群に対する統計学的有意性（ｐ値）を示す）。

肝ＶＥＧＦｍＲＮＡ及び蛋白の統計学的に有意な低減が全３段階のｓｉＲＮＡ用量レベルにおいて測定された。

Claims (1)

1. 明細書中に記載の発明。