JP2010126473A - Socs活性化剤を有効成分とする抗癌剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】SOCS活性化剤を有効成分とする抗癌剤を用いることによる。かかる抗癌剤は、Jak1を介するがSTAT3非依存的な経路を抑制する物質を含むSOCS活性化剤を有効成分とすることにより、癌細胞の増殖を効果的に抑制し、癌の治療を可能とするものである。特に、Jak1を介するがSTAT3非依存的な経路を抑制する物質が、SOCS-3遺伝子である抗癌剤による。
【選択図】図7
Description
1.Jak1を介するがSTAT3非依存的な経路を抑制する物質を含むSOCS活性化剤。
2.前項1に記載のSOCS活性化剤を有効成分とする、抗癌剤。
3.Jak1を介するがSTAT3非依存的な経路を抑制する物質が、SOCS-3遺伝子である、前項2に記載の抗癌剤。
4.SOCS活性化剤が、SOCS-3遺伝子が組み込まれたアデノウイルスベクターである、前項2または3に記載の抗癌剤。
5.FAKの発現を抑制する、および/または、FAKの活性化を抑制する機能を有する、前項2〜4のいずれか1に記載の抗癌剤。
6.抗アポトーシスタンパク質の発現を抑制する、および/または、細胞周期をG0/G1期で停止させる機能を有する、前項2〜5のいずれか1に記載の抗癌剤。
7.癌が細胞内で、Jak1および/またはSTAT3を持続的に活性化している、前項2〜6のいずれか1に記載の抗癌剤。
8.癌が悪性胸膜中皮腫である、前項2〜7のいずれか1に記載の抗癌剤。
9.被検物質から、SOCSを活性化し、Jak1の活性化を抑制する物質を選択することを含む、抗癌剤のスクリーニング方法。
1)SOCS遺伝子の非翻訳領域に、適当なプロモーター配列を含む発現コンストラクトを構築する工程;
2)上記1)の発現コンストラクトを含むシャトルベクターを構築する工程;
3)アデノウイルスゲノムを準備する工程;
4)アデノウイルスゲノムを制限酵素で切断し、2)で作製した遺伝子発現シャトルベクターをアデノウイルスゲノムにライゲーションする工程。
また、STAT3の活性化はサイトカインによるものであることが知られている。したがって、STAT3の活性化の働きを担うサイトカインの分泌量を、癌由来細胞について確認することによっても、STAT3を持続的に活性化している癌を特定することが可能である。サイトカインの例としては、IL-6または、gp130をコレセプターとするOncostatin M、LIFもしくはLeptinなどが挙げられる。IL-6の濃度を測定する方法としては、ELISA法を用いて測定すればよい。IL-6濃度測定のためのELISA法は、Quantikine colorimetric sandwich ELISA(R&D Systems社)を用いて行うことができる。
(1)IL-6自己分泌
各種細胞株(悪性胸膜中皮腫細胞株H28、H226、H2052、H2452;肺癌細胞株A549)を0.5% FBS含有RPMI培地にて24時間培養し、細胞上清中のIL-6濃度をELISA法にて測定した。ELISA法は、Quantikine colorimetric sandwich ELISA(R&D Systems社)を用いた。
細胞株H226を0.5% FBS含有RPMI培地にて24時間培養した後に、100ng/ml IL-6およびsIL-6R(可溶性IL-6R受容体)を加え、37℃で10分間刺激した。なお、可溶性IL-6受容体は、IL-6刺激を効率よく与えるためのタンパク質であり、特にIL-6受容体の発現の低い細胞に対してIL-6と同時に添加することで効果的にIL-6刺激を与えることができる。細胞からタンパク質を抽出しリン酸化STAT3およびリン酸化Jak1について、抗チロシンリン酸化STAT3抗体(cell signaling technology社製)、抗STAT3抗体(santa cruz biotechnology社製)、抗GAPDH抗体(santa cruz biotechnology社製)を用いてウェスタンブロット法を行った。Jak1については、細胞より抽出したタンパク質に対して抗Jak1抗体(BD Transduction laboratories社製)を用いて免疫沈降法を行い、リン酸化Jak1は抗リン酸化チロシン抗体clone 4G10(Upstate社)を、Jak1は抗Jak1抗体を用いてウェスタンブロット法にて検出した。
アデノウイルスベクターとして、CAGプロモーターにてLacZ、SOCS3を発現するAdLacZ(コントロール)、AdSOCS3を、一般的な方法で作製した。SOCS-3遺伝子として、GenBank Accession No.NM_003955(配列番号5)に記載の配列からなる核酸を使用し、アデノウイルスベクターとしてヒト5型アデノウイルスベクターを使用した。
(1)AdSOCS3による細胞増殖抑制効果
細胞株H226を10% FBS含有RPMI培地にて24時間培養した後にJak inhibitor1(低分子JAK2阻害剤)(Calbiochem社製)、DMSO、AdSOCS3、AdLacZを加え、72時間後にMTTアッセイを行った。Jak inhibitor1(低分子JAK2阻害剤)を0.25、1、4μM、DMSOは0.1%で、AdSOCS3、AdLacZは、MOI 10、40、160で添加した。MTTアッセイは、生細胞数測定のため生細胞数測定試薬(nacalai tesque社)を用いた。
細胞株H226を10% FBS含有RPMI培地にて24時間培養した後にMOI 40のAdSOCS3、AdLacZを加え、72時間後にAnnexin V-PE Apoptosis Detection Kit I(BD Biosciences社)を用いてFACS解析を行った。また、細胞から抽出したタンパク質に対してcleaved caspase-3およびSOCS-3の発現を、抗cleaved caspase-3抗体(cell signaling technology 社製)および抗SOCS-3抗体(IBL社製)を用いてウェスタンブロット法で調べた。
細胞株H226を10% FBS含有RPMI培地にて24時間培養した後にMOI 40のAdSOCS3、AdLacZを加え、24時間後にCycle TESTTM PLUS DNA Reagent Kit (Becton Dickinson社)を用いてFACS解析を行った。
細胞株H226を0.5% FBS含有RPMI培地にて24時間培養した後に、Jak inhibitor1(低分子JAK2阻害剤)、DMSO、AdSOCS3、AdLacZを加えた。Jak inhibitor1(低分子JAK2阻害剤)1μM、DMSOは0.1%で、AdSOCS3、AdLacZは、MOI 40で添加した。37℃、24時間後に、細胞より抽出したタンパク質に対してリン酸化STAT3、SOCS-3の発現をウェスタンブロット法で調べた。また、膜画分を抗Jak1抗体にて免疫沈降した後に、抗リン酸化チロシン抗体clone 4G10(Upstate社)を用いてウェスタンブロット法を行った。
細胞株H226を0.5% FBS含有RPMI培地にて24時間培養した後に、AdLacZ+Jak inhibitor1(低分子JAK2阻害剤)、AdLacZ+DMSO、AdLacZ+抗IL-6R抗体、AdSOCS3、AdLacZを加えた。Jak inhibitor1(低分子JAK2阻害剤)1μM、DMSOは0.1%で、抗IL-6R抗体は100μg/mlで、AdSOCS3、AdLacZは、MOI 40で添加した。37℃、72時間後に、細胞より抽出したタンパク質に対して、SOCS-3、リン酸化FAKとFAKを、それぞれ、抗SCOS-3抗体、抗リン酸化FAK抗体と抗FAK抗体を用いてウェスタンブロット法で調べた。
細胞株H226 1×106 cellsを、PBS 75μlおよびマトリゲル(BD Biosciences社)75μlに懸濁し、ICR nu/nuマウスの右胸腔内に注入し、悪性胸膜中皮腫xenograftモデルを作製した。細胞投与後、7日、14日、21日目に、実施例2にて作製したAdSOCS3、AdLacZを5×107 pfuで胸腔内投与し、28日後に胸腔内腫瘍を採取し、総重量を測定した。
Claims (9)
- Jak1を介するがSTAT3非依存的な経路を抑制する物質を含むSOCS活性化剤。
- 請求項1に記載のSOCS活性化剤を有効成分とする、抗癌剤。
- Jak1を介するがSTAT3非依存的な経路を抑制する物質が、SOCS-3遺伝子である、請求項2に記載の抗癌剤。
- SOCS活性化剤が、SOCS-3遺伝子が組み込まれたアデノウイルスベクターである、請求項2または3に記載の抗癌剤。
- FAKの発現を抑制する、および/または、FAKの活性化を抑制する機能を有する、請求項2〜4のいずれか1に記載の抗癌剤。
- 抗アポトーシスタンパク質の発現を抑制する、および/または、細胞周期をG0/G1期で停止させる機能を有する、請求項2〜5のいずれか1に記載の抗癌剤。
- 癌が細胞内で、Jak1および/またはSTAT3を持続的に活性化している、請求項2〜6のいずれか1に記載の抗癌剤。
- 癌が悪性胸膜中皮腫である、請求項2〜7のいずれか1に記載の抗癌剤。
- 被検物質から、SOCSを活性化し、かつJak1の活性化を抑制する物質を選択することを含む、抗癌剤のスクリーニング方法。
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