WO2023127909A1 - 動脈瘤の治療及び／又は予防のための医薬組成物、動脈瘤の診断補助方法、並びに動脈瘤治療薬の評価方法 - Google Patents

動脈瘤の治療及び／又は予防のための医薬組成物、動脈瘤の診断補助方法、並びに動脈瘤治療薬の評価方法 Download PDF

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ahnak
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Definitions

  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment and/or prevention of aneurysm, a diagnostic aid method for predicting the therapeutic/or preventive effect of an aneurysm using a specific drug, and an aneurysm-preventing method of a drug. It relates to a method for evaluating therapeutic effects in vitro.
  • An aneurysm is a morphologically abnormal sac-like structure in which a blood vessel bulges outward, and occurs at the arterial branch or arterial trunk of a blood vessel.
  • Aneurysms are classified into thoracic aortic aneurysms, abdominal aortic aneurysms, visceral aneurysms, peripheral aneurysms, cerebral aneurysms, coronary aneurysms, and the like, depending on where they occur. Of these, cerebral aneurysms are the leading cause of subarachnoid hemorrhage and the most devastating hemorrhagic stroke.
  • Non-Patent Document 1 the genetic factors of aneurysms have not been clarified. With respect to cerebral aneurysms, recent studies have shown that somatic mutations in PDGFR ⁇ are associated with the development of intracranial fusiform aneurysms (Non-Patent Document 1).
  • An object of the present invention is to provide a therapeutic agent useful for treating aneurysms.
  • Another object of the present invention is to provide a diagnostic aid method capable of predicting the therapeutic effect of a therapeutic drug in a subject having an aneurysm.
  • a further object of the present invention is to provide a determination method capable of evaluating the therapeutic effect of a drug on aneurysm in vitro.
  • the present inventor conducted extensive research and identified specific somatic gene mutations that frequently occur in aneurysm tissues.
  • drugs that target specific genes that mutate in aneurysms, drugs that inhibit the function of the genes, or drugs that inhibit signal transduction that is enhanced by mutations in the genes are useful for treating aneurysms. I found out.
  • a pharmaceutical composition for treatment and/or prevention of aneurysm comprising at least one drug selected from i) to iii) as an active ingredient. i) agents that target platelet-derived growth factor receptor beta (PDGFR ⁇ ); ii) agents that inhibit the function of desmoyokin (AHNAK); and iii) agents that inhibit signal transduction enhanced by mutations in PDGFR ⁇ or AHNAK.
  • PDGFR ⁇ platelet-derived growth factor receptor beta
  • AHNAK desmoyokin
  • the drug is a tyrosine kinase inhibitor, sunitinib, axitinib, dasatinib, gefitinib, erlotinib, lapatinib, pazopanib, vandetanib, afatinib, regorafinib, cabozantinib, osimertinib, dacomitinib, quizartinib, capmatinib, tepotinib, imatinib, so Rafenib, Nilotinib , crizotinib, ponatinib, ceritinib, nintedanib, lorlatinib, entrectinib, pharmaceutically acceptable salts, solvates, and derivatives thereof, which is at least one selected from the group consisting of the pharmaceutical composition according to (3) thing.
  • the drug is an AHNAK-targeting drug.
  • the agent is at least one selected from fibroblast growth factor receptor (FGF-R) inhibitors, protein kinase C (PKC) inhibitors, and phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) inhibitors; The pharmaceutical composition according to (7).
  • FGF-R fibroblast growth factor receptor
  • PLC protein kinase C
  • PI3K phosphatidylinositol 3-kinase
  • a method for assisting diagnosis of an aneurysm comprising the steps of: A step of detecting a mutation in at least one of the PDGFR ⁇ gene and the AHNAK gene in a sample collected from a subject having an aneurysm, and treatment and/or prevention of said subject with the pharmaceutical composition according to claim 1. The process of predicting effects.
  • (11) The method according to (10), wherein the mutation of the PDGFR ⁇ gene in the sample is detected to predict the therapeutic and/or preventive effect of the tyrosine kinase inhibitor on the subject.
  • the mutation of the PDGFR ⁇ gene is p.
  • the mutation of the PDGFR ⁇ gene is p.
  • the mutation of the AHNAK gene is p. D1083Sfs*6, p. A2114T, p.
  • a method for determining an aneurysmal therapeutic effect of a drug comprising the following steps b) to d): b) contacting human cells with an agent in vitro; c) measuring the amount of phosphorylated extracellular signal-regulated kinase (p-ERK) and/or the amount of phosphorylated tyrosine in the cells of step b); predicting therapeutic effect;
  • a method including (19) A method for determining the efficacy of a drug in treating an aneurysm, comprising the following steps a') to d'): a′) preparing human cells into which a PDGFR ⁇ gene with a mutation has been introduced; b') contacting said cell with an agent in vitro; c') measuring the amount of phosphorylated extracellular signal-regulated kinase (p-ERK) and/or the amount of phosphorylated tyrosine in the cells of step b'); Predicting the aneurysm treatment effect of A method, including (20)
  • the present invention it is possible to provide pharmaceuticals useful for the treatment and/or prevention of aneurysms. Moreover, according to the present invention, it is possible to provide a diagnostic aid method that can predict the therapeutic/preventive effect of a drug in a subject with an aneurysm. Furthermore, according to the present invention, it is possible to provide a determination method capable of evaluating the therapeutic/preventive effects of drugs on aneurysms in vitro.
  • FIG. 1 is a schematic showing the location and content of the most frequent somatic mutations in the PDGFR ⁇ gene in cerebral aneurysm tissue.
  • the novel mutations shown in this schematic were identified by whole-exome sequencing.
  • Figure 2 shows non-synonymous somatic mutations affecting 405 genes detected in whole exome sequencing of cerebral aneurysm tissue samples from 69 cases of cerebral aneurysm patients. ) and mutations (fusiform) seen in fusiform aneurysms. 381 mutations were found in saccular aneurysms and 29 in fusiform aneurysms, 5 of which were found in both.
  • FIG. 3 shows the case-by-case distribution of two somatically mutated genes that were mutated in multiple cases.
  • FIG. 4 is a correlation diagram between somatically mutated genes and aneurysms using Inaugural Pathway Analysis (IPA). It was found that PDGFR ⁇ is associated with signal transduction pathways mediated by HOXC6 and NF ⁇ B2, respectively, and AHNAK is associated with signal transduction pathways mediated by U2AF2 and NF ⁇ B2, respectively, forming a signaling network for aneurysm formation.
  • IPA Inaugural Pathway Analysis
  • FIG. 5 shows the distribution of PDGFR ⁇ in the cerebral vascular layer of 5 cases of cerebral aneurysm patients.
  • Case FU3 showing small fusiform dilatation, PDGFR ⁇ mutations were most abundant in the adventitial layer and negligible in the intima layer.
  • B FU2 with focal fusiform expansion of the second smallest size trilobes showed mutations to be most abundant in the adventitial layer, followed by the medial layer.
  • C Moderately sized 7-10 mm case FU6 has a thick circumferential spindle-shaped extension, but the middle layer is most mutated, followed by the adventitial layer, then the inner layer. was the membrane layer.
  • FIG. 6 is a Western blot photograph showing the phosphorylation status of PDGFR ⁇ , ERK1/2, AKT and STAT3 in HEK293T cells overexpressing each PDGFR ⁇ mutant associated with aneurysm. Phosphorylation of PDGFR ⁇ was detected in all mutants tested.
  • FIG. 7 is a Western blot photograph showing the effect of administration of PDGF-BB on HEK293T cells overexpressing each PDGFR ⁇ mutant associated with aneurysm. p.
  • FIG. 8A is a Western blot photograph showing the effect of administration of the tyrosine kinase inhibitor sunitinib in HEK293T cells overexpressing each PDGFR ⁇ mutant associated with aneurysm.
  • FIG. 8B is a Western blot photograph showing the effect of administration of the tyrosine kinase inhibitor axitinib in HEK293T cells overexpressing each PDGFR ⁇ mutant associated with aneurysm.
  • the phosphorylated tyrosine status of PDGFR ⁇ was suppressed by axitinib. three Y562 mutants, p. 559_562del, and p.
  • FIG. 8C is a Western blot photograph showing the effect of administration of the tyrosine kinase inhibitor dasatinib in HEK293T cells overexpressing each PDGFR ⁇ mutant associated with aneurysm. The phosphorylated tyrosine status of PDGFR ⁇ was suppressed by dasatinib. three Y562 mutants, p. 559_562del, and p. ERK phosphorylation of the 563_564del mutant was suppressed by inactivation of PDGFR ⁇ .
  • FIG. 8C is a Western blot photograph showing the effect of administration of the tyrosine kinase inhibitor dasatinib in HEK293T cells overexpressing each PDGFR ⁇ mutant associated with aneurysm. The phosphorylated tyrosine status of PDGFR ⁇ was suppressed by dasatinib. three Y562 mutants, p. 559_562del, and p. ERK
  • FIG. 9 is a graph showing the results of measuring the vascular diameter of the basilar artery of the cerebral aneurysm model mouse. Mice were transfected with the PDGFR ⁇ wt (wild type) gene or the PDGFR ⁇ d (p.559 — 562del) gene together with the GFP gene. Mice transfected with GFP alone were used as controls. Expression of PDGFR ⁇ wild-type GFP and GFP alone did not change the cross-sectional area of blood vessels over time, and the cross-sectional area of blood vessels in mice expressing the above mutants was significantly increased compared to the wild type (*P ⁇ 0 .05). Addition of sunitinib suppressed vasodilation. FIG.
  • FIG. 10 is a graph showing the distribution of the maximum longest diameter of the basilar artery in PDGFR ⁇ mutation-introduced mice under each drug administration condition. The p-values in the figure are values calculated by Bonferroni using one-way analysis of variance.
  • FIG. 11 shows the location and content of somatic mutations in the AHNAK gene observed in whole-exome sequencing.
  • Figure 12 shows wild-type AHNAK and p.
  • Fig. 10 is a graph showing the results of NF ⁇ B luciferase reporter assay in HEK293T cells transfected with G3819A mutant AHNAK in the presence of various inhibitors.
  • FIG. 13 is a schematic diagram showing the structure of AHNAKmini.
  • FIG. 13 is a schematic diagram showing the structure of AHNAKmini.
  • FIG. 14A is a graph showing the maximum length of the internal carotid artery and middle cerebral artery in AHNAK mutation-introduced cerebral aneurysm model mice with and without administration of PD173074. Error bars in the figure indicate standard errors. "*" in the figure indicates p ⁇ 0.05 by unpaired equal variance Student's t-test.
  • FIG. 14B shows carotid arteries and middle cerebral arteries in AHNAK mutation-introduced cerebral aneurysm model mice with and without administration of LY294002. Error bars in the figure indicate standard errors.
  • FIG. 14A shows the maximum length of the internal carotid artery and middle cerebral artery in AHNAK mutation-introduced cerebral aneurysm model mice with and without administration of LY294002. Error bars in the figure indicate standard errors.
  • FIG. 14C shows the carotid artery and middle cerebral artery in an AHNAK mutation-introduced cerebral aneurysm model mouse with and without administration of staurosporine. Error bars in the figure indicate standard errors.
  • FIG. 15 shows the mRNA expression analysis results of PDGFR ⁇ and AHNAK in cryosections of cerebral vascular tissue from 2 cases of CA tissue from cerebral aneurysm (CA) patients and 1 control case using the Visium spatial gene expression analysis system. A darker red portion is a portion with a large amount of mRNA expression. It was confirmed that the expression of all genes was enhanced in a wide range in CA tissues compared to controls.
  • a "pharmaceutically acceptable salt" of a compound includes a cation such as sodium ion, potassium ion, calcium ion, magnesium ion, or substituted or unsubstituted ammonium ion.
  • salts or inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, carbonic acid or phosphoric acid, or formic acid, acetic acid, maleic acid, fumaric acid, benzoic acid, ascorbic acid, lactic acid, succinic acid, bismethylene salicylic acid, Methanesulfonic acid, ethanedisulfonic acid, propionic acid, tartaric acid, malic acid, salicylic acid, citric acid, gluconic acid, aspartic acid, stearic acid, palmitic acid, itaconic acid, glycolic acid, p-aminobenzoic acid, glutamic acid, benzenesulfonic acid , cyclohexylsulfamate, methanesulfonate, ethanesulfonate, isethionate, p-toluenesulfonate, naphthalenesulfonate, mesy
  • a “solvate” of a compound also includes water or a lower alcohol (eg, an alcohol having 1 to 6 carbon atoms such as methanol, ethanol, or 2-propanol (isopropyl alcohol)), unless otherwise specified. , higher alcohols (for example, alcohols having 7 or more carbon atoms such as 1-heptanol or 1-octanol), dimethylsulfoxide (DMSO), acetic acid, ethanolamine or ethyl acetate.
  • a lower alcohol eg, an alcohol having 1 to 6 carbon atoms such as methanol, ethanol, or 2-propanol (isopropyl alcohol)
  • higher alcohols for example, alcohols having 7 or more carbon atoms such as 1-heptanol or 1-octanol
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • acetic acid ethanolamine or ethyl acetate.
  • a "derivative" of a compound means, unless otherwise specified, one or more hydrogen atoms (H) of the compound are replaced by halogen (fluorine, chlorine, bromine or iodine), cyano, nitro, hydroxyl, substituted or unsubstituted C 1 -C5 alkyl, substituted or unsubstituted C2 - C5 alkenyl, substituted or unsubstituted C2 - C5 alkynyl, substituted or unsubstituted C3 - C6 cycloalkyl, substituted or unsubstituted C3- C 6 cycloalkenyl, substituted or unsubstituted C 3 -C 6 cycloalkynyl, substituted or unsubstituted 3-6 membered heterocycloalkyl, substituted or unsubstituted C 7 -C 11 cycloalkylalkyl, substituted or unsubstituted 3-6 membered heterocyclo
  • substituted substituents refer to those in which a portion of the substituent is further substituted with any of the above substituents.
  • derivative in the present invention refers to a compound having any of the above substituents attached to one or more nitrogen atoms (N) or oxygen atoms (O) of the compound, and these It includes pharmaceutically acceptable salts and solvates.
  • aneurysm refers to an expanded portion of an artery that swells like a balloon.
  • Cerebral aneurysm (CA) refers to an aneurysm that occurs in a cerebral artery. Asymptomatic, unruptured cerebral aneurysms are found in 2-6% of adults. Cerebral aneurysms often occur at bifurcations of basilar vessels, such as the middle cerebral artery, internal carotid artery, anterior communicating artery, and basilar artery. Cerebral aneurysms vary in size from 2 mm to 25 mm in diameter, but are often less than 10 mm. Although most are asymptomatic, compression of nerves can contribute to headaches.
  • SCA saccular cerebral aneurysms
  • FCA fusiform cerebral aneurysms
  • tyrosine kinase inhibitor refers to an enzyme inhibitor that blocks the action of one or more tyrosine kinases that phosphorylate tyrosine that constitutes proteins. Tyrosine kinases are important enzymes involved in signal transduction involved in cell growth, differentiation, etc., but their abnormal activation can also be a factor causing canceration and the like of cells. Commercially available tyrosine kinase inhibitors are primarily used as anticancer agents.
  • platelet derived growth factor receptor ⁇ refers to a tyrosine kinase protein belonging to the transmembrane receptor tyrosine kinase (RTK) family.
  • RTK transmembrane receptor tyrosine kinase
  • the PDGFR ⁇ gene is also known as a cancer-associated gene.
  • Human PDGFR ⁇ has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or is 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more of the sequence represented by SEQ ID NO: 2, A protein having an amino acid sequence with 98% or more or 99% or more identity and having tyrosine kinase activity.
  • the PDGFR ⁇ gene encoding human PDGFR ⁇ has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or the sequence represented by SEQ ID NO: 2 and 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97 It has a base sequence encoding a protein having an amino acid sequence with 98% or more, or 99% or more identity.
  • the nucleotide sequence of the PDGFR ⁇ gene is not limited as long as it encodes these proteins. Exon sequences can have 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more identity.
  • PDGFR ⁇ extracellular signal-regulated kinase
  • AKT protein kinase B
  • STAT3 protein kinase B
  • AHNAK hyokin
  • TGF- ⁇ transforming growth factor- ⁇
  • Human AHNAK has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, or is 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more of the sequence represented by SEQ ID NO: 16, A protein having an amino acid sequence with greater than 98% or greater than 99% identity.
  • the AHNAK gene encoding human AHNAK has an exon sequence represented by SEQ ID NO: 15 (NCBI Reference Sequence: NM_001620) or a sequence represented by SEQ ID NO: 15 and 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more , 96% or greater, 97% or greater, 98% or greater, or 99% or greater identity.
  • WES whole exome sequencing
  • DS targeted deep sequencing
  • sample refers to a sample taken from a subject with an aneurysm, including blood (whole blood, plasma, serum and blood cells), lymph, urine, saliva, sweat, semen, interstitial fluid, and body cavity fluid. , body fluids such as cerebrospinal fluid, and tissues such as vascular walls and brain tissue.
  • genetic mutations are expressed as follows.
  • a base substitution is described as "c.1684T>A”.
  • c. is an abbreviation for coding DNA.
  • c.1684T>A indicates a mutation in which thymine at position 1684 is substituted with adenine.
  • a base deletion is described as “c.1675_1686del”.
  • c.1675_1686del indicates a mutation in which the 1675th to 1686th bases are deleted.
  • missense mutations are described as "p.Y562N”.
  • p. is an abbreviation for protein.
  • p.Y562N indicates a mutation in which tyrosine at position 562 is replaced with asparagine.
  • amino acid deletions are described as in “p.559_562del”.
  • p.559_562del shows a mutation in which the 559th to 562nd amino acids are deleted.
  • frameshift mutations are described as “p.D1083Sfs*6”.
  • p.D1083Sfs*6 indicates that a new reading frame starting with serine was formed below the position of the 1083rd aspartic acid, and the 6th reading frame from that position became a termination codon.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is a pharmaceutical composition for the treatment and/or prevention of aneurysm, containing at least one of the following i) to iii) as an active ingredient. i) agents that target platelet-derived growth factor receptor beta (PDGFR ⁇ ); ii) agents that inhibit the function of desmoyokin (AHNAK); and iii) agents that inhibit signal transduction enhanced by mutations in PDGFR ⁇ or AHNAK.
  • PDGFR ⁇ platelet-derived growth factor receptor beta
  • AHNAK desmoyokin
  • any one of the above drugs i) to iii) will also be simply referred to as “PDGFR ⁇ -related drug” or “AHNAK-related drug”.
  • the present inventors obtained basilar artery tissue and blood samples from 69 cases of cerebral aneurysm patients, and by WES and DS, both SCA and FCA basilar artery tissue, platelet-derived growth factor receptor ⁇ (PDGFR ⁇ ), desmoyokin (AHNAK) and other multiple genes were found to mutate at high frequency. Among these, mutations were found in the PDGFR ⁇ gene and the AHNAK gene in the greatest number of patients.
  • DS was performed on cerebral aneurysm tissue samples from CA68 cases for the PDGFR ⁇ gene and AHNAK gene.
  • WES detected 4 types of mutations in 4 cases, and DS detected 5 types of mutations in 5 cases in which 1 mutation was added in 1 case (details will be described later in "Reference Example 1"). checking).
  • PDGFR ⁇ having a mutation was expressed in the vascular wall of the basilar artery of patients with cerebral aneurysm.
  • Figure 1 is a schematic diagram showing the locations and details of the above five types of mutations in PDGFR ⁇ detected in WES and DS. Specifically, two missense mutations (p.Y562N, p.Y562S, p.Y562D), an in-frame deletion of 4 amino acids in exon 12 (p.559_562del) and an in-frame deletion of 2 amino acids (p. .563_564del).
  • FIG. 11 shows the positions of the three types of mutations.
  • the mutations detected in the AHNAK gene are six types of missense mutations (p.A2114T, p.G3819A, p.N3827S, p.E3850K, p.A4046V, and p.D4701E) and two types of Frameshift mutations (p.D1083Sfs*6 and p.H5817Rfs*20).
  • Aneurysms are broadly divided into SCA and FCA, but as a trend, many FCA cases had mutations in PDGFR ⁇ , and many SCA cases had mutations in AHNAK. Interestingly, among SCA, many cases of giant cystic aneurysms had mutations in PDGFR ⁇ .
  • IPA Inaugural Pathway Analysis
  • HEK293T cells human embryonic kidney cells transfected with PDGFR ⁇ genes having each mutation were compared with HEK293T cells transfected with wild-type PDGFR ⁇ genes. Activity was found to be enhanced. Furthermore, it was confirmed that addition of a tyrosine kinase inhibitor suppressed these enhancements to the same level as when the wild-type PDGFR ⁇ gene was introduced.
  • the present inventors introduced an adeno-associated virus (AAV) with a PDGFR ⁇ gene having a mutation that promotes cerebral aneurysm formation (specifically, the p.559_562del mutation) into the brain vessels of mice.
  • AAV adeno-associated virus
  • PDGFR ⁇ gene having a mutation that promotes cerebral aneurysm formation specifically, the p.559_562del mutation
  • a cerebral aneurysm model mouse was constructed from this.
  • Simultaneously with the virus infection described above and starting administration of tyrosine kinase inhibitors (sunitinib, dasatinib, axitinib) to mice from day 7 after virus infection, it was confirmed that expansion of cerebral blood vessels was suppressed.
  • the preventive and therapeutic effects of tyrosine kinase inhibitors on cerebral aneurysms could be confirmed for the first time.
  • NF ⁇ B an inflammatory marker
  • FGF-R fibroblast growth factor receptor
  • PKC protein kinase C
  • PI3K phosphatidylinositol 3-kinase
  • AHNAK is a protein with a large molecular weight, it was difficult to directly introduce it into experimental animals using a viral vector or the like.
  • the present inventors have cloned a gene encoding a region that contains the mutated portion of AHNAK and retains partial function.
  • mice were administered fibroblast growth factor receptor (FGF-R) inhibitors, protein kinase C (PKC) inhibitors, and phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) inhibitors. It was confirmed that the above-mentioned cerebral vasodilation was suppressed by starting.
  • FGF-R fibroblast growth factor receptor
  • PLC protein kinase C
  • PI3K phosphatidylinositol 3-kinase
  • the present inventor found the usefulness of drugs related to PDGFR ⁇ , particularly tyrosine kinase inhibitors, for the treatment and/or prevention of aneurysms. Also, agents related to AHNAK, particularly fibroblast growth factor receptor (FGF-R) inhibitors, protein kinase C (PKC) inhibitors, and phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) inhibitors for treatment of aneurysms and/or have found usefulness in prevention.
  • FGF-R fibroblast growth factor receptor
  • PLC protein kinase C
  • PI3K phosphatidylinositol 3-kinase
  • the pharmaceutical composition of the present invention is used for treating and/or preventing aneurysms.
  • the aneurysm may be either symptomatic or asymptomatic, and the size of the aneurysm is not particularly limited. In particular, it is suitably applicable to subjects with asymptomatic, small, unruptured aneurysms who have been followed up without aggressive surgical operations.
  • prophylactic use it is useful, for example, to prevent recurrence in a subject after surgery.
  • it can be used prophylactically for high-risk (genetic factors, environmental factors, lifestyle habits, etc.) subjects who have not yet developed the disease.
  • the “drug” contained in the pharmaceutical composition of the present invention is a drug capable of suppressing inflammatory reactions and/or abnormal cell proliferation that may be caused by enhanced activity due to PDGFR ⁇ mutation and/or AHNAK mutation. If so, it is not particularly limited.
  • a tyrosine kinase inhibitor can be preferably used as a drug related to PDGFR ⁇ .
  • Such tyrosine kinase inhibitors include sunitinib, axitinib, dasatinib, gefitinib, erlotinib, lapatinib, pazopanib, vandetanib, afatinib, regorafinib, cabozantinib, osimertinib, dacomitinib, quizartinib, capmatinib, tepotinib, imatinib, sorafenib , nilotinib, crizotinib, Ponatinib, ceritinib, nintedanib, lorlatinib, entrectinib, pharmaceutically acceptable salts, solvates and derivatives thereof are known.
  • Agents selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable salts, solvates and derivatives can preferably be used.
  • drugs selected from the group consisting of dasatinib, pharmaceutically acceptable salts, solvates and derivatives thereof can be preferably used.
  • IPA revealed that mutations in the PDGFR ⁇ gene are involved in signal transduction of inflammatory responses via HOXC6 and NF ⁇ B2, respectively.
  • NF ⁇ B2 is one of transcription factors and is known to enhance the expression of inflammatory cytokines and the like.
  • NF ⁇ B2 is also known to act to enhance the expression of prostaglandin E1 (PGE1), which has a vasodilating effect.
  • PGE1 prostaglandin E1
  • the HOXC6 gene is known as a cancer-associated gene that is expressed in prostate cancer and the like, and the HOXC6 protein encoded by the HOXC6 gene is known as a transcription factor. Mutations in the PDGFR ⁇ gene are thought to enhance HOXC6 signaling and NF ⁇ B2 signaling.
  • PDGFR ⁇ -related agents include inhibitors targeting HOXC6 (e.g., anti-human HOXC6 monoclonal antibodies or binding fragments thereof, and antibodies or binding fragments thereof capable of inhibiting the transcriptional activity of HOXC6).
  • HOXC6 e.g., anti-human HOXC6 monoclonal antibodies or binding fragments thereof, and antibodies or binding fragments thereof capable of inhibiting the transcriptional activity of HOXC6.
  • siRNA targeting HOXC6 mRNA, anticancer agents for cancer caused by abnormally enhanced activity of HOXC6 protein, etc. inhibitors targeting NF ⁇ B2 (e.g., TPCA1, BOT-64, BMS345541, Amlexanox, SC -514, IMD0354, IMD0354, IKK-16, Bay 11-7082, MG-115, MG-132, Lactacystin, Epoxomicin, Epoxomicin, Parthenolide, Carfilzomib, MLN-4924, JSH-23, ROLIPRAM, GALLIC, GALLIC Acid, Anacardic Acid, Gyy 4137, P -XSC, LY 294002, Wortmannin, Quinacrine, Mesalamine, CV 3988, Flavopiridol, BAY 11-7082, JSH-23, QNZ, SC75741, Pyrrolidinedithiocarbamate ammonium, etc.).
  • NF ⁇ B2
  • a specific antibody or binding fragment thereof that directly inhibits the tyrosine kinase activity of PDGFR ⁇ can also be used.
  • the drug related to PDGFR ⁇ may be any drug capable of suppressing excessive inflammatory response and/or abnormal cell proliferation caused by mutation of PDGFR ⁇ , and the present invention limits the drugs to be used to the above drugs. is not intended to be
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain an AHNAK-related agent in addition to or instead of the PDGFR ⁇ -related agent described above.
  • Which drug to use may be determined, for example, by predicting effective drugs using the diagnostic aid method described below, or based on clinical findings of the aneurysm (for example, SCA or FCA). may be determined by
  • AHNAK has been reported to be involved in signaling by phosphorylation of Smad2/3 in the transforming growth factor ⁇ (TGF ⁇ )/Smad signaling pathway (Lee I, H., et al., Oncogene, 33 (8), 4675-4684 (2014)). Therefore, in order to suppress the TGF ⁇ signaling pathway, we inhibited fibroblast growth factor receptor (FGF-R), protein kinase C (PKC), and phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) that contribute to the same signaling pathway. is expected to be effective in treating/preventing the onset of aneurysm. was done.
  • FGF-R fibroblast growth factor receptor
  • PKC protein kinase C
  • PI3K phosphatidylinositol 3-kinase
  • said "agents related to AHNAK inhibitors” include FGF-R inhibitors (e.g. futivatinib, pemigatinib, E7090, sorafenib, ponatinib, infigratinib, nintedanib, pazopanib, PD173074, dovitinib, AZD4547, danusertib, lenpatinib (E7080), Burivanib, Mk-2461, Chillhostin AG 1296, SSR128129E, R1530, FIIN-3, Lucitanib, Sulfatinib, ODM-203, ASP5878, Ninta Danib, Ninta Danibu, H3B-6527, Loburitini (FGF) 401), PRN1371, PD166866, Physogatinib, S49076, NSC12, ON123300, SU5402, BLU9931, FIIN-2, Zoligrat
  • FGF-R inhibitors are not limited to the listed compounds, and are compounds known to have the effect of inhibiting FGF-R, PKC, and PI3K, respectively. All are included regardless of whether or not they have other physiological activities.
  • IPA revealed that mutations in the AHNAK gene are involved in signal transduction of inflammatory responses via U2AF2 and NF ⁇ B2 acting downstream thereof.
  • NF ⁇ B2 is one of transcription factors and is known to enhance the expression of inflammatory cytokines and the like.
  • NF ⁇ B2 is also known to act to enhance the expression of prostaglandin E1 (PGE1), which has a vasodilating effect.
  • PGE1 prostaglandin E1
  • the U2AF2 gene is a gene known as a cancer-associated gene that is expressed in breast cancer, colon cancer, lung cancer, prostate cancer, etc. It is known that the U2AF2 protein forms a complex with the U2AF1 protein and is involved in splicing.
  • AHNAK-related agents include, for example, inhibitors targeting U2AF2 (e.g., anti-human U2AF2 monoclonal antibodies or their binding Fragments that reduce binding activity with U2AF1, those that reduce the splice activity of the U2AF1/U2AF2 complex, siRNAs targeting the mRNA sequence of U2AF2, and abnormal enhancement of U2AF2 protein activity anticancer agents against cancers caused by cancer), inhibitors targeting NF ⁇ B2 (e.g., TPCA1, BOT-64, BMS345541, Amlexanox, SC-514, IMD0354, IKK-16, BAY 11-7082, MG-115, MG -132, Lac
  • gene therapy agents such as siRNA can be used that target the AHNAK gene with or without specific mutations.
  • the AHNAK-related drug may be any drug capable of suppressing excessive inflammatory response and/or abnormal cell proliferation caused by AHNAK mutation, and in the present invention, the drug to be used is limited to the above drugs. is not intended to be
  • Subjects to which the pharmaceutical composition of the present invention is administered include humans, primates including chimpanzees, pet animals such as dogs and cats, livestock animals such as cows, horses, sheep and goats, rodents such as mice and rats, It is a mammal, such as an animal kept in a zoo, preferably a human. More preferably, it is a human having an aneurysm (also referred to as an "aneurysm patient”). Most preferred are humans with cerebral aneurysms (also referred to as “cerebral aneurysm patients").
  • PDGFR ⁇ of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, p. 559_562del, p. Y562N, p. Y562S, p. Y562D, and p. 563_564del; and AHNAK: of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, p. D1083Sfs*6, p. A2114T, p. G3819A, p. N3827S, p. E3850K, p. A4046V, p. D4701E and p.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains a PDGFR ⁇ -related drug and/or an AHNAK-related drug (hereinafter also simply referred to as "drug") as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention preferably contains a tyrosine kinase inhibitor as an active ingredient as a drug related to PDGFR ⁇ .
  • the pharmaceutical composition of the present invention preferably contains an FGF-R inhibitor, a PKC inhibitor and/or a PI3K inhibitor as an active ingredient as an AHNAK-related agent.
  • the content of the drug which is an active ingredient in the pharmaceutical composition, is determined by the effect and stability of the drug, the dosage form of the pharmaceutical composition, the type of carrier used, and the method of administration. It varies depending on various conditions such as the state of the object. These may be appropriately selected based on known techniques in the relevant field.
  • composition of the present invention can further contain a pharmaceutically acceptable carrier if necessary.
  • pharmaceutically acceptable carrier refers to excipients commonly used in the field of formulation technology. For example, excipients, binders, disintegrants, fillers, emulsifiers, flow additive modifiers, lubricants and the like can be mentioned.
  • Excipients include sugars such as monosaccharides, disaccharides, cyclodextrins and polysaccharides (more specifically but not limited to glucose, sucrose, lactose, raffinose, mannitol, sorbitol, inositol, dextrin, maltose, etc.). dextrin, starch and cellulose), metal salts (e.g. sodium chloride, sodium or calcium phosphate, calcium sulfate, magnesium sulfate, calcium carbonate), citric acid, tartaric acid, glycine, low, medium and high molecular weight polyethylene glycols (including PEG), Pluronics, kaolin, silicic acid, or combinations thereof.
  • sugars such as monosaccharides, disaccharides, cyclodextrins and polysaccharides (more specifically but not limited to glucose, sucrose, lactose, raffinose, mannitol, sorbito
  • binders include starch paste using corn, wheat, rice, or potato starch, simple syrup, glucose solution, gelatin, tragacanth, methylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, shellac and/or polyvinylpyrrolidone. It is mentioned as.
  • Disintegrants include starch, lactose, carboxymethyl starch, crosslinked polyvinylpyrrolidone, agar, laminaran powder, sodium hydrogen carbonate, calcium carbonate, alginic acid or sodium alginate, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, sodium lauryl sulfate, stearic acid monoglyceride. Or those salts are mentioned as an example.
  • fillers include the above sugars and/or calcium phosphate (eg, tricalcium phosphate or calcium hydrogen phosphate).
  • emulsifiers examples include sorbitan fatty acid esters, glycerin fatty acid esters, sucrose fatty acid esters, and propylene glycol fatty acid esters.
  • flow additives and lubricants examples include silicates, talc, stearates or polyethylene glycol.
  • Such a carrier is mainly used to facilitate the formation of the dosage form and maintain the dosage form and pharmacological effect, and may be used appropriately as necessary.
  • flavoring agents solubilizers, suspending agents, diluents, surfactants, stabilizers, absorption promoters, bulking agents, wetting agents, humectants, adsorbents, Disintegration inhibitors, coating agents, coloring agents, preservatives, antioxidants, flavoring agents, flavoring agents, sweetening agents, buffering agents and the like may also be included.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can also contain other drugs as long as they do not lose their pharmacological effects.
  • it may contain a predetermined amount of an antibiotic.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited as long as it does not inactivate the active ingredient drug and other additional active ingredients.
  • it may be liquid, solid or semi-solid.
  • Specific dosage forms include, for example, oral dosage forms such as liquids, powders, granules, tablets, capsules, sublingual preparations, lozenges, injections, suspensions, emulsions, eye drops, nasal drops, and creams.
  • parenteral dosage forms such as agents, ointments, plasters, patches and suppositories.
  • the dosage form is preferably an oral dosage form.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered by any suitable method that does not deactivate the contained active ingredients.
  • it may be oral or parenteral (eg, injection, aerosol, application, eye drop, nose drop). Oral administration is preferred.
  • the pharmaceutical composition of the present invention preferably contains the drug, which is an active ingredient, in an amount that is effective for treating and/or preventing aneurysms and does not cause serious side effects.
  • the total dose of the active ingredient, ie the drug is 0.0001 to 50 mg/kg body weight/day, which is suitable.
  • the dosage of the active ingredient in existing pharmaceutical compositions of tyrosine kinase inhibitors related to PDGFR ⁇ is about 0.1 to 5 mg/kg body weight/day when administered orally, and the pharmaceutical composition of the present invention also conforms to this. It is also possible to use a different dosage.
  • the method for assisting diagnosis of aneurysm of the present invention is characterized by including the following steps. - detecting mutations in at least one of the PDGFR ⁇ gene and the AHNAK gene in a sample taken from a subject with an aneurysm, and - treating said subject with a PDGFR ⁇ -related drug or an AHNAK-related drug. and/or predicting preventive efficacy.
  • the method for assisting diagnosis of aneurysms of the present invention further includes the following.
  • an agent related to PDGFR ⁇ (particularly a tyrosine kinase inhibitor) is effective in treating an aneurysm in the subject if the PDGFR ⁇ gene with the particular mutation is confirmed to be present at detectable levels in said sample.
  • an agent related to AHNAK is effective in treating an aneurysm in a subject if the presence of detectable levels of the AHNAK gene with the particular mutation is confirmed in said sample. predict there will be.
  • the "detectable level” referred to here can be, for example, a preset threshold value or higher, or a significantly higher level than the negative control, but is not particularly limited.
  • the method for assisting the diagnosis of aneurysms of the present invention is not particularly limited, but free blood DNA such as tumor-derived circulating tumor DNA (ctDNA), which is fine particles that are released from mutation-positive cells and circulate in the blood, (cfDNA), exosomes, microRNAs, proteins, and the like.
  • ctDNA tumor-derived circulating tumor DNA
  • cfDNA tumor-derived circulating tumor DNA
  • somatic mutations in the PDGFR ⁇ gene are associated with the development of aneurysms, and in patients with aneurysms who have somatic mutations in the PDGFR ⁇ gene, tyrosine kinase inhibitors are effective in their treatment and/or prevention. It was also found to be effective. Above all, if a detectable level of somatic mutation in PDGFR ⁇ is present in a sample such as a vascular tissue sample taken from a subject with an aneurysm, it can be predicted that the tyrosine kinase will be particularly effective.
  • somatic mutations in the AHNAK gene are also associated with aneurysms.
  • Aneurysm patients with somatic mutations in the AHNAK gene can be expected to be highly therapeutically effective with AHNAK-related agents, particularly FGF-R inhibitors, PKC inhibitors and/or PI3K inhibitors.
  • the method of assisting diagnosis of the present invention makes it possible to predict the therapeutic effect in patients to be administered prior to non-surgical treatment of aneurysms, more specifically drug therapy.
  • the "subject” includes humans, primates including chimpanzees, pet animals such as dogs and cats, livestock animals such as cattle, horses, sheep and goats, rodents such as mice and rats, It is a mammal, such as an animal kept in a zoo, preferably a human. Most preferred are humans with an aneurysm or after an aneurysm treatment. Specific examples include aneurysm patients prior to non-surgical treatment or patients undergoing follow-up after surgical treatment.
  • the “sample” is a sample taken from a subject with an aneurysm, and includes blood (including plasma and serum), lymph, urine, saliva, sweat, tissue fluid, body cavity fluid, brain It can be appropriately selected from bodily fluids such as spinal fluid and tissues such as cerebrovascular tissue.
  • vascular tissue taken from the subject
  • the method of assisting diagnosis of the present invention is useful in many cases for predicting the effect of preventing recurrence of aneurysm or predicting the effect of treatment at the time of recurrence.
  • a body fluid sample that does not contain normal cells is preferable, and plasma, serum, or cerebrospinal fluid can be preferably used.
  • Plasma or serum is known to contain nucleic acids derived from abnormal cells with somatic mutations. It is possible to predict the therapeutic and/or prophylactic effect of drugs that treat cancer.
  • the method of assisting diagnosis of the present invention is not limited to subjects who have undergone surgical treatment. It can be used not only for effect prediction but also for non-surgical treatment effect prediction.
  • a mutation in the PDGFR ⁇ gene in particular, p. 559_562del, p. Y562N, p. Y562S, p. Y562D, and p.
  • at least one mutation selected from the group consisting of mutations represented by 563_564del is detected.
  • detecting mutations in the AHNAK gene p. D1083Sfs*6, p. A2114T, p. G3819A, p. N3827S, p. E3850K, p. A4046V, p. D4701E and p. It is preferred to detect at least one mutation selected from the group consisting of mutations represented by H5817Rfs*20.
  • the detection of the mutated gene is not particularly limited, but includes, for example, analyzing the mRNA of the PDGFR ⁇ gene or AHNAK gene contained in the sample.
  • cDNA of PDGFR ⁇ gene or AHNAK gene is prepared from TotalRNA in the sample, RFLP method, SSCP method, TaqMan (registered trademark) PCR method, single nucleotide extension method, Invader method, mass spectrometry method, DNA array method, An existing method such as a pyrosequencing method or a next-generation sequencer can be used for analysis. Additionally or alternatively, detection of low frequency mutations may be performed with DS for targeted genetic mutations.
  • the method for assisting diagnosis of the present invention comprises a step of predicting the therapeutic and/or preventive effect of a tyrosine kinase inhibitor based on the gene mutation of interest detected from the sample. For example, qualitatively, if the target gene mutation is detectable, it is predicted that the tyrosine kinase inhibitor will be highly effective. Alternatively, for example, quantitatively, the quantitative ratio between the target gene mutation and the normal gene is calculated, and if the gene mutation exists in a certain ratio or more, it is predicted that the tyrosine kinase inhibitor will be highly effective. Prediction judgment may be performed by setting judgment criteria in advance, but for example, past prediction data and actual treatment result data are used as teacher data, artificial It may be done using artificial intelligence (AI).
  • AI artificial intelligence
  • the method for treating and/or preventing an aneurysm of the present invention is characterized by including administration of any one of the following agents i) to iii) to a subject. i) agents that target platelet growth factor receptor beta (PDGFR ⁇ ); ii) agents that inhibit the function of desmoyokin (AHNAK); and iii) agents that inhibit signal transduction enhanced by mutations in PDGFR ⁇ or AHNAK.
  • PDGFR ⁇ platelet growth factor receptor beta
  • AHNAK desmoyokin
  • Targets for the treatment and/or prevention method of the present invention include humans, primates including chimpanzees, pet animals such as dogs and cats, livestock animals such as cattle, horses, sheep and goats, rodents such as mice and rats, It is a mammal, such as an animal kept in a zoo, preferably a human. Most preferred are humans with aneurysms (also referred to as "aneurysm patients").
  • PDGFR ⁇ of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, p. 559_562del, p. Y562N, p. Y562S, p. Y562D, and p. a mutation represented by 563_564del;
  • AHNAK of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, p. D1083Sfs*6, p. A2114T, p. G3819A, p. N3827S, p. E3850K, p. A4046V, p. D4701E and p.
  • the therapeutic and/or prophylactic method of the present invention includes administering a PDGFR ⁇ -related agent and/or an AHNAK-related agent to a subject.
  • the PDGFR ⁇ related agent is preferably a tyrosine kinase inhibitor.
  • the dosage of the drug varies depending on various conditions such as effects and stability, dosage form, type of carrier used, administration method, and condition of the subject to be administered. These may be appropriately selected based on known techniques in the relevant field.
  • antibiotics may be used in combination.
  • the dosage form for administration of the drug which is the active ingredient
  • the dosage form for administration of the drug is not particularly limited as long as it does not inactivate the drug itself and other additional active ingredients.
  • it may be liquid, solid or semi-solid.
  • Specific dosage forms include, for example, oral dosage forms such as liquids, powders, granules, tablets, capsules, sublingual preparations, lozenges, injections, suspensions, emulsions, eye drops, nasal drops, and creams.
  • parenteral dosage forms such as agents, ointments, plasters, patches and suppositories.
  • the dosage form is preferably an oral dosage form.
  • the administration method in the therapeutic and/or prophylactic method of the present invention can be any suitable method that does not deactivate the active ingredient to be administered.
  • it may be oral or parenteral (eg, injection, aerosol, application, eye drop, nose drop). Oral administration is preferred.
  • the drug which is the active ingredient
  • the total dose of active ingredient, ie drug can be 0.0001-50 mg/kg body weight/day.
  • a more appropriate dosage can be set within the above range.
  • Existing commercial drugs of tyrosine kinase inhibitors targeting PDGFR ⁇ are mainly used for the treatment of malignant tumors, and the dosage of the active ingredient to humans is about 0.1 to 3 mg / kg body weight / day by oral administration. is.
  • FGF-R inhibitors, PKC inhibitors and PI3K inhibitors are mainly marketed and developed as drugs for treating malignant tumors, and the dosage of the active ingredient in commercial drugs and drugs under development is about 0.1. It is in the range of ⁇ 5 mg/kg body weight/day.
  • the total dose of the drug may be the amount according to the drug on the market or the drug under development, but it may be a smaller dose.
  • 0.0001-2.5 mg/kg body weight/day 0.001-2.5 mg/kg body weight/day, 0.01-2.5 mg/kg body weight/day, 0.1-2.5 mg/kg body weight/day, 0.0001-0.5 mg/kg body weight/day, 0.001-0.5 mg/kg body weight/day, 0.01-0.5 mg/kg body weight/day, 0.0001-0.05 mg /kg body weight/day or 0.001-0.05 mg/kg body weight/day.
  • the dose of the active ingredient described above provides at least a sufficient therapeutic/preventive effect than the dose for treating malignant tumors.
  • reduction of treatment/prevention costs, etc. it is a very important advantage that a higher effect can be obtained with a smaller amount.
  • One aspect of the method for determining the aneurysm therapeutic effect of the drug of the present invention is characterized by including the following steps b) to d). b) contacting human cells with an agent in vitro; c) measuring the amount of phosphorylated extracellular signal-regulated kinase (p-ERK) and/or the amount of phosphorylated tyrosine in the cells of step b); predicting therapeutic effect;
  • determining method determining the aneurysm therapeutic effect of the drug of the present invention
  • another aspect of the determination method of the present invention is characterized by including the following steps a') to d').
  • a′ preparing human cells into which a PDGFR ⁇ gene with a mutation has been introduced;
  • b' contacting said cell with an agent in vitro;
  • c' measuring the amount of phosphorylated extracellular signal-regulated kinase (p-ERK) and/or the amount of phosphorylated tyrosine in the cells of step b'); Predicting the aneurysm treatment effect of A method, including
  • the present invention it is possible to determine in vitro the therapeutic effect of a drug whose therapeutic effect on aneurysm is unknown.
  • it can be a useful determination method for screening therapeutic agents for aneurysms.
  • Step a') Preparation of mutated PDGFR ⁇ gene-introduced cells may comprise the step of a') preparing human cells into which a mutated PDGFR ⁇ gene has been introduced.
  • Human cells introduced with a PDGFR ⁇ gene having a mutation (hereinafter also referred to as “PDGFR ⁇ mutant cells”) used in this step are the PDGFR ⁇ gene having a mutation (hereinafter also referred to as "mutant PDGFR ⁇ gene"). It can be prepared by introducing it by any method.
  • the human cells to be used are not particularly limited, and any known human cell lines can be used. In particular, immortalized cells are preferred, and HEK293T cells, NIH3T3 cells, HUVEC cells and the like can be used.
  • the mutation of the PDGFR ⁇ gene is p. 559_562del, p. 563_564del, p. Y562N, p. Y562S, p. and a mutation corresponding to at least one mutation selected from the group consisting of Y562D. That is, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, c. 1684T>A (p.Y562N), c. 1684T>G (p. Y562D), c. 1685A>C (p.Y562S), c. 1675_1686del (p.559_562del), and c.
  • a PDGFR ⁇ gene having at least one mutation among 1687_1692del (p.563_564del) is preferred.
  • Such mutant genes (nucleic acids, preferably DNA) can be prepared using known methods such as chemical synthesis methods and PCR methods.
  • the “PDGFR ⁇ gene” used herein does not need to have a length corresponding to the full length of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, and encodes a protein containing the desired mutated portion and retaining tyrosine kinase activity. It may be a nucleic acid fragment having a part of the base sequence represented by SEQ ID NO:1.
  • DNA encoding the desired mutation can be introduced into human cells using a known gene expression vector.
  • a gene expression vector contains at least a promoter and a desired mutant PDGFR ⁇ gene in its downstream region, and is capable of expressing a PDGFR ⁇ mutant in human cells.
  • state capable of expression refers to placing a gene to be expressed in the downstream region of the promoter under the control of the promoter.
  • a gene expression vector that can be used in this step is a vector that contains the mutant PDGFR ⁇ gene in an expressible state, and can express the mutant PDGFR ⁇ gene in somatic cells.
  • the vector that can be used as the gene expression vector is not particularly limited as long as it can express the PDGFR ⁇ mutant in somatic cells.
  • examples include virus vectors, plasmid vectors, and artificial chromosome vectors.
  • Viral vectors that can be used as gene expression vectors include adenovirus vectors, adeno-associated virus (AAV) vectors, retrovirus vectors, lentivirus vectors, Sendai virus vectors, and the like.
  • Plasmid vectors that can be used as gene expression vectors include, for example, Escherichia coli-derived plasmids (pBR322, pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pBluescript, etc.), Actinomycete-derived plasmids (pIJ486, etc.), Bacillus subtilis-derived plasmids (pUB110 , pSH19, etc.), yeast-derived plasmids (YEp13, YEp24, Ycp50, etc.), and commercially available vectors can be used.
  • Examples of artificial chromosome vectors that can be used as gene expression vectors include human artificial chromosomes (HAC), yeast artificial chromosomes (YAC), bacterial artificial chromosomes (BAC, PAC), and the like.
  • Promoters contained in gene expression vectors include, for example, CMV promoter (CMV-IE promoter), SV40 early promoter, RSV promoter, HSV-TK promoter, EF1 ⁇ promoter, Ub promoter, metallothionein promoter, SR ⁇ promoter, CAG promoter and the like. mentioned. Other examples include heat shock promoters that can be controlled by temperature, and inducible promoters such as tetracycline-responsive promoters that can be controlled by the presence or absence of tetracycline.
  • selection marker genes may be included.
  • Expression control sequences are exemplified by enhancers, ribosome binding sequences, terminators, poly A addition signals and the like.
  • nuclease recognition sequences include restriction enzyme recognition sequences, loxP sequences recognized by Cre recombinase, sequences targeted by artificial nucleases such as ZFN and TALEN, or sequences targeted by the CRISPR/Cas9 system.
  • the replication origin sequence is exemplified by the SV40 replication origin sequence.
  • the selectable marker gene that the gene expression vector can contain is a selectable marker gene that can select somatic cells into which the gene expression vector has been introduced.
  • selectable marker genes include drug resistance genes such as ampicillin resistance gene, kanamycin resistance gene, tetracycline resistance gene, chloramphenicol resistance gene, neomycin resistance gene, puromycin resistance gene, and hygromycin resistance gene. be done.
  • the reporter gene that can be included in the gene expression vector is a gene that encodes a reporter capable of identifying somatic cells into which the gene expression vector has been introduced.
  • reporter genes include genes encoding fluorescent proteins such as GFP and RFP, and luciferase genes.
  • the method for introducing the above gene expression vector into human cells is not particularly limited, and the introduction method can be appropriately selected according to the type of gene introduction vector (plasmid vector, virus vector, etc.).
  • the mutated PDGFR ⁇ gene can be introduced into cells by virus infection, lipofection, liposome, electroporation, calcium phosphate, and DEAE-Dextran.
  • PDGFR ⁇ mutant cells can be cultured in known media suitable for animal cell culture.
  • media include DMEM medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium), BME medium, BGJb medium, CMRL1066 medium, Glasgow MEM medium, Improved MEM Zinc Option medium, IMDM medium (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), Medium 199 Medium, Eagle MEM medium, ⁇ MEM medium, Ham's F10 medium, Ham's F12 medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, and mixed medium thereof can be exemplified, but are not particularly limited.
  • Any existing culture vessel such as plates, dishes, and flasks can be used for the culture vessel.
  • Cultivation conditions are not particularly limited, but are usually carried out at 37° C. in a 5% atmosphere.
  • the culture period is not particularly limited, but can be about 10 to 72 hours, particularly about 12 to 24 hours.
  • Step b) or step b') Drug Contacting Step The determination method of the present invention includes a step of contacting the cells with a drug in vitro. In this step, it is necessary to add the target drug to the human cell culture medium or the culture medium of step a'). Medium exchange may be performed at the time of drug addition or just before drug addition.
  • the drug of interest is not particularly limited as long as it is a drug that requires assessment of therapeutic effects on aneurysms. Agents of interest may, for example, be agents known to have some association with PDGFR ⁇ , such as known tyrosine kinase inhibitors.
  • Addition of a drug to a medium can be carried out by, for example, preparing a stock solution in which the drug of interest is dissolved in a solvent such as water or DMSO at a high concentration, and adding this to the medium.
  • concentration of the drug added to the medium can be appropriately determined depending on the solubility of the drug used, effective concentration for treatment, toxicity, etc., and can be, for example, about 1 nM to 1000 nM or 10 nM to 100 nM.
  • cell culture is preferably performed using a plurality of types of media containing drugs at various concentrations, or two types of media containing and not containing drugs.
  • the contact between the cells and the drug is preferably carried out by adding the drug to the medium containing the cells and then allowing the medium to stand under the conditions of 37° C. and 5% CO 2 .
  • the standing time is not particularly limited, but can be, for example, 5 minutes to 4 hours, particularly 1 to 3 hours.
  • This step can take, for example, the following procedures. After removing the medium from the culture solution, the remaining cells are lysed with a lysing solution (eg, RIPA buffer) on ice to obtain a protein solution. p-ERK and/or p-Tyr in the resulting solution are quantified by known protein measurement methods such as Western blotting, immunoassays (such as ELISA) and mass spectroscopy. Western blots, immunoassays can be performed using anti-p-ERK and/or anti-p-Tyr antibodies.
  • ERK is a protein related to the ERK pathway, which is one of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathways, and is known to be involved in cell growth, differentiation, and the like.
  • MAPK mitogen-activated protein kinase
  • ERK phosphorylation is involved in signal transduction, and excessive phosphorylation is known to induce abnormal cell proliferation and the like.
  • the present inventors have confirmed that ERK phosphorylation is enhanced in cells into which the above mutant PDGFR ⁇ gene has been introduced.
  • the amount of p-ERK was remarkably reduced to the same level as in wild-type PDGFR ⁇ gene-introduced cells. Therefore, in this step, it is confirmed whether the amount of p-ERK measured is below a preset value, decreases depending on the drug concentration, or is significantly lower than that of cells cultured without the drug. and predicting that the drug of interest will have an aneurysm therapeutic effect if any of these conditions are satisfied.
  • This step includes measuring p-Tyr levels in conjunction with, or alternatively to, p-ERK levels. In this case, in this step, whether the measured p-Tyr amount falls below a preset value, decreases depending on the drug concentration, or becomes significantly lower than that of the cells cultured without the drug. confirming, and predicting that the drug of interest will have an aneurysm-treating effect if any of these are met.
  • ⁇ Reference Example 1 Analysis of Somatic Mutation in Basilar Artery Tissue of Cerebral Aneurysm> 1. Collection of samples from patients with cerebral aneurysms Diagnosed with a cerebral aneurysm (CA) having either a saccular aneurysm (SCA) or a fusiform aneurysm (FCA) and undergoing arterial clipping and/or reconstruction of the cerebral aneurysm. Blood samples were collected from 69 patients who underwent surgery for obesity. As the basilar artery tissue sample, a piece of tissue excised at the time of surgery was used. Patients had a negative family history of CA and no history of hereditary vascular disease. The collected tissue and blood samples were quickly frozen in liquid nitrogen and then stored at -80°C.
  • CA cerebral aneurysm
  • FCA fusiform aneurysm
  • Targeted Sequencing by Targeted Deep Sequencing For validation and detection of low variant allele frequency (VAF) mutations in CA, genes in which mutations were detected by whole-exome sequencing or associated with CA or cerebrovascular disease.
  • RNA capture probes (SureSelect) targeting the entire coding region were generated for a total of 65 genes.
  • a sequence library was constructed from 50 ng of cDNA using SureSelect XT low input Reagent with molecular barcodes.
  • Target capture was performed by the SureSelect XT Target Enrichment System.
  • Target capture libraries were sequenced on a HiSeq2500 with paired reads of 125 bp. The average depth of the target region was 1500-fold after adjusting the molecular barcodes to remove duplicates.
  • Germline SNVs and indels were called using the Genome Analysis Toolkit version 3.8 (http://software.broadinstitute.org/gatk/). Normal tissue exome and WGS BAM files used for somatic variant calling were used for base quality score recalibration and HaplottypeCaller. Called variants were filtered by recalibrating variant quality scores and leaving either splicing or exonic variants and removing common variants (allele frequency >1%). .
  • IPA Ingenuity Pathway Analysis
  • FIG. 2 is a Venn diagram showing characteristic common somatic mutations.
  • Targeted deep sequencing (DS) analysis was performed on tissue samples from 68 CA tissues for PDGFR ⁇ and CA or other genes associated with cerebrovascular disease, along with 2 normal cortical arteries and 10 blood samples to demonstrate WES.
  • 473 somatic mutations were detected in 40 genes in 62 patients.
  • 16 genes were somatically mutated genes with high reproducibility and were observed in multiple cases.
  • PDGFR ⁇ and AHNAK were extracted by pathway analysis (Figs. 3 and 4).
  • Figures 1 and 11 show the location and content of WES-detected PDGFR ⁇ and AHNAK mutations.
  • PDGFR ⁇ mutations p.Y562N, p.Y562S, p.559_562del, and p.563_564del
  • AHNAK mutations p.G3819A, p.N3827S and p.D4701E were detected in 4 cases.
  • DS of PDGFR ⁇ in 68 cases of aneurysm and arterial wall validation studies revealed 5 mutations in 5 cases: 3 missense mutations (p.Y562N, p.Y562S, p.Y562D). , an in-frame deletion of 4 amino acids in exon 12 (p.559_562del) and an in-frame deletion of 2 amino acids (p.563_564del). That is, 4 mutations (p.Y562N, p.Y562S, p.559_562del and p.563_564del) were detected in 4 cases in both WES and DS, and 1 mutation (p.Y562D) was detected in 1 case only in DS. ) was detected.
  • ⁇ Reference Example 2 Immunohistochemical study of cerebral aneurysm tissue> 1.
  • Samples of cryosectioned cerebral aneurysm tissue (basilar artery wall) were prepared using a Tissue-Tek O.D. C. They were embedded in T compound (Sakura Finetech) and frozen in liquid nitrogen-cooled isopentane.
  • Tissue sections were cut serially at 10 ⁇ m thickness using a cryostat (CM3050S, Leica) set at -20°C. Sections were air-dried overnight at room temperature and then stored at -80°C.
  • Example 1 Test using human cells introduced with PDGFR ⁇ mutation> 1. Plasmid Preparation Human PDGFR ⁇ was amplified by PCR using cDNA from SH-SY-5Y cells and cloned into a PCR-Blunt II TOPO (Thermo Fisher Scientific). To prepare PDGFR ⁇ mutants, c. 1684T>A (p.Y562N), c. 1684T>G (p. Y562D), c. 1685A>C (p.Y562S), c. 1685A>G (p. Y562C), c. 1675_1686del (p.559_562del), and c.
  • PDGFR ⁇ -HA was amplified by PCR using the pAAV-CMV-PDGFR ⁇ -HA plasmid as template.
  • PDGFR ⁇ (BspI-NotI)-HA was subcloned into PCR-Blunt II TOPO. The resulting plasmid was cut with BspEI and EcoRV to remove the HA-encoding fragment.
  • This fragment was cloned into PDGFR ⁇ wild type-IRES2-EGFP or PDGFR ⁇ mutant-IRES2-EGFP cut with BspEI-EcoRV to give PDGFR ⁇ wild type-HA-IRES2-EGFP or PDGFR ⁇ mutant-HA-IRES2-.
  • EGFP was prepared.
  • HEK 293T cells were obtained from RIKEN BioResource Research Center (Japan), 10% fetal bovine serum (FBS, Nichirei Biosciences, Japan), 100U penicillin-streptomycin (Gibco ), and Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, low glucose, Gibco) with non-essential amino acid solution (Gibco) in a humidified incubator at 37° C., 5% CO 2 .
  • Cells were seeded in 24-well plates (2 ⁇ 10 5 cells/well) and incubated at 37° C., 5% CO 2 for 16 hours.
  • 1.0 ⁇ g DNA/well of plasmid DNA was transfected using Lipofectamine 3000 (Thermo). After 5 hours, the medium was replaced with fresh medium and incubated at 37° C., 5% CO 2 for 16 hours.
  • Protein concentration was measured using the BCA protein assay kit (Takara Bio). 10 ⁇ g of cell lysate was subjected to electrophoretic separation using 10% or 5-20% SDS-PAGE gel (Real Gel Plate, BIOCRAFT), and the gel bands were transferred to a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane (Immobilon-P). , 0.45 ⁇ m, Merck). Membranes were incubated in PVDF blocking reagent of can get signal® (Toyobo) or TBS-0.1% Tween 20 (TBST) with 5% bovine serum albumin for 1 hour at room temperature, followed by primary antibody. Membranes were transferred into signal enhancer Can Get signal® Solution 1 containing and incubated at 4° C.
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • the primary antibodies used were as follows: - rabbit anti-PDGFRB monoclonal antibody (Y-92, Abcam) - mouse anti-phosphotyrosine monoclonal antibody (P-Tyr-100, Cell Signaling Technology) - Rabbit anti-phosphorylated ERK (extracellular signal-regulated kinase) 1/2 monoclonal antibody (D13.14., Cell Signaling Technology) - Rabbit anti-GFP (green fluorescent protein) polyclonal antibody (MBL) - mouse anti-ERK1/2 monoclonal antibody (L34F12, Cell Signaling Technology) - rabbit anti-phosphorylated AKT monoclonal antibody (D9E, Cell Signaling Technology) - rabbit anti-AKT monoclonal antibody (C67E7, Cell Signaling Technology) - rabbit anti-phospho-STAT polyclonal antibody (Tyr705, Cell Signaling Technology) - rabbit anti-STAT3 monoclonal antibody (D3Z2, Cell Signaling Technology) - mouse anti- ⁇ -act
  • the membrane was then transferred into signal enhancer Can Get signal (registered trademark) solution 2 containing goat anti-mouse HRP-conjugated antibody (Jackson ImmunoResearch) or donkey anti-rabbit HRP-conjugated antibody (Jackson ImmunoResearch) and incubated for 1 hour at room temperature. Proteins on the membrane were detected with Chemi-Lumi One L (Nacalai Tesque).
  • tyrosine kinase inhibitors As tyrosine kinase inhibitors (TKIs), sunitinib, axitinib, and dasatinib were obtained from CEREC Biotechnology Co., Ltd. (Japan). 10 mM of each TKI was dissolved in DMSO (dimethylsulfoxide), serially diluted with Opti-MEM medium, and added to each well. The final concentration of TKI was 10 nM or 100 nM and the final concentration of DMSO was 0.01%. Plates with added TKIs were incubated at 37° C., 5% CO 2 for 3 hours. At the end of treatment with PDGF-BB or TKIs, plates were removed from the incubator and chilled on ice. Western blotting was performed to detect PDGFR ⁇ in each well.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • Phosphorylation of PDGFR ⁇ was significantly suppressed by administration of any of the tyrosine kinase inhibitors sunitinib (Fig. 8A), axitinib (Fig. 8B) and dasatinib (Fig. 8C). Since little phosphorylation of ERK was observed in normal cerebral arteries (data not shown), elevated/hyperphosphorylation of ERK in aneurysmal tissue may be a suitable marker for detecting mutations. It has been suggested.
  • Example 2 Investigation in an aneurysm onset animal model introduced with PDGFR ⁇ mutation (I)> 1.
  • Construction of an Animal Model A murine CA model was constructed by peri-arterial application of adeno-associated virus (AAV) to unbranched regions of the basilar artery.
  • HEK293T cells were transfected with a pHhelper vector, a pRC vector, and a pAAV vector containing a gene of interest, and cultured, then the AAV produced by the iodixanol step gradient method was recovered. After AAV serotyping, it was mixed with a hydrogel in PBS containing 15% Pluronic F-127.
  • AAV adeno-associated virus
  • concentrations of virus (vg/ml) in the hydrogels of AAV-CMV-EGFP, AAV-CMV-PDGFR ⁇ , and AAVCMV-PDGFR ⁇ p559_562del were 2 ⁇ 10 13 , 1 ⁇ 10 12 , and 1 ⁇ 10 12 , respectively.
  • mice C57BL/6N male 8- to 11-week-old mice (CLEA Japan) were deeply anesthetized by intraperitoneal (ip) injection of 0.3 mg/kg of medetomidine, 4 mg/kg of midazolam, and 5 mg/kg of butorphanol.
  • the basilar artery was exposed as previously reported (Yonekura et al., (2004) J. Cereb. Blood Flow Metab., 24(2):151-8).
  • 3 ⁇ L of hydrogel was applied to the basal artery and removed after 5 minutes. The hydrogel application was repeated two more times. Mice were divided into three subgroups (control, PDGRFB (wt) and PDGRFB (mutant)).
  • Sunitinib, axinitib and dasatinib were dissolved in excipients (2% DMSO, 15% PEG300) and administered daily by intraperitoneal injection at 40, 25 and 10 mg/kg/day, respectively. Mice were deeply anesthetized with isoflurane and then decapitated. Shaved heads were immediately transferred to 0.1 M phosphate buffer containing 4% paraformaldehyde and incubated at 4° C. for at least 24 hours. The hindbrain segment containing the basilar artery was removed from the fixed skull, incubated with fixative for an additional 24 hours at 4°C, and then embedded in paraffin. A brain region 100 mm rostral to 100 mm caudal from a point 1 mm rostral to the cranial junction was cut at a thickness of 4 mm.
  • mice were sacrificed 28 days post-infection and basilar artery size was compared to animals infected with EGFP-expressing AAV alone.
  • Basilar arteries infected with AAV against mutant PDGFR ⁇ were significantly enlarged compared to those infected with eGFP virus alone.
  • arteries infected with AAV against wild-type PDGFR ⁇ showed no such expansion.
  • Example 3 Investigation in an aneurysm onset animal model introduced with PDGFR ⁇ mutation (II)> A cerebral aneurysm-onset animal model was constructed by introducing a PDGFR ⁇ mutation (p.559_562del) in the same manner as in Example 2. From day 7 to day 28 after mutagenesis, 98.81 ⁇ M solutions of axitinib, dasatinib and sunitinib (2% DMSO, 15% PEG300) were administered by intraperitoneal injection at 20 ⁇ L each daily. The dose corresponds to 0.76 mg/kg/day for axitinib, 1.0 mg/kg/day for dasatinib, and 0.78 mg/kg/day for sunitinib. Mice were deeply anesthetized with isoflurane, decapitated, and the cerebral vessels were exposed, and the maximum length of the basilar artery in each brain was measured. Three mice were tested for each drug administration condition.
  • Fig. 10 shows the distribution of the maximum cerebral blood vessel length in mice under each drug administration condition.
  • NF- ⁇ B luciferase reporter assay using AHNAK mutation-introduced human cells ⁇ Example 4: NF- ⁇ B luciferase reporter assay using AHNAK mutation-introduced human cells> 1.
  • AHNAK Expression Plasmids DNAs encoding partial peptides of human AHNAK, specifically, portions corresponding to positions 3801 to 3928 and positions 4649 to 4776 of SEQ ID NO: 16 (having nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 17 and 18, respectively) cDNAs from SH-SY-5Y cells corresponding to were amplified by PCR and cloned into a PCR-Blunt II TOPO (Thermo Fisher Scientific). To prepare variants of AHNAK, p. G3819A, p.
  • the D4710E mutation was introduced into AHNAK-TOPO using PCR-based mutagenesis with PrimeSTAR MAX DNA polymerase (Takara), respectively.
  • AHNAK wild-type-IRES2-eGFP or AHNAK mutant-IRES2-eGFP AHNAK wild-type or AHNAK mutant fragments were obtained by PCR from AHNAK wild-type-TOPO or AHNAK mutant-TOPO, respectively.
  • the IRES2-eGFP fragment was obtained by PCR from the pCAG-Cre-IRES2-GFP plasmid (Addgene, #26646).
  • AHNAK-HA was amplified by PCR using the pAAV-CMV-AHNAK-HA plasmid as template.
  • AHNAK(BspI-NotI)-HA was subcloned into PCR-Blunt II TOPO. The resulting plasmid was cut with BspEI and EcoRV to remove the HA-encoding fragment.
  • This fragment was cloned into BspEI-EcoRV cleaved AHNAK wild-type-IRES2-EGFP or AHNAK mutated-IRES2-EGFP to generate AHNAK wild-type-HA-IRES2-EGFP (AHNAK WT) or AHNAK mutated-HA- IRES2-EGFP (AHNAK G3819A) was prepared.
  • NF ⁇ B Luciferase Reporter Assay Commercially available reporter plasmids (Agilent), pNF- ⁇ B-luciferase and pRL-TK luciferase (Promega) were used. HEK293 cells were seeded in a 24-well plate the day before gene transfer, seeded in a well plate, and prepared each AHNAK expression plasmid (0.5 mg), pNF- ⁇ B luciferase (0.1 mg), pRL-TK-luciferase (0 .02 mg), the reporter plasmid was introduced into the cells at the same time. Wild-type AHNAK and p.
  • Each well of G3819A mutant AHNAK contains 1-(5-isoquinolinesulfonyl)-2-methylpiperazine (H-7) (PKC inhibitor, formula (III) below), LY294012 (PI3K inhibitor, formula (IV )) and PD173074 (FGF-R inhibitor, formula (V) below) were added to the medium at concentrations of 100 ⁇ M, 10 ⁇ M and 10 ⁇ M, respectively.
  • PLC inhibitor 1-(5-isoquinolinesulfonyl)-2-methylpiperazine
  • LY294012 PI3K inhibitor, formula (IV )
  • FGF-R inhibitor, formula (V) FGF-R inhibitor
  • Fig. 12 shows the results of the luciferase assay.
  • the vertical axis indicates the expression level of NF ⁇ B.
  • NF ⁇ B in cells into which G3819A mutant AHNAK was introduced was more enhanced than in wild-type AHNAK. This enhancement is p. It was also observed with N3827S mutant AHNAK and D4710 mutant AHNAK (data not shown). Since NF ⁇ B is a protein involved in inflammation, it was suggested that AHNAK mutation promotes inflammatory response in human cells. In systems to which various inhibitors were added, wild-type and p.
  • AHNAK is a large molecular weight protein with a length of 5890 amino acids, and the full-length gene can be incorporated into a viral vector or the like. was difficult. On the other hand, there was a problem that the phenotype was not sufficiently expressed in the introduced experimental animals only by incorporating an arbitrary fragment containing the mutation.
  • AHNAK has many repeating structures (CRU: Consensus Central Repeat Unit), and AHNAK mutation positions are also present within the CRU.
  • AHNAKmini a low-molecular-weight AHNAK (AHNAKmini) was designed by combining the C-terminal portion containing the PDZ region of AHNAK, two CRUs, and the N-terminal portion in this order.
  • FIG. 13 shows the schematic structure of AHNAKmini.
  • the amino acid sequence of AHNAKmini is shortened to 1943 amino acids with a FLAG tag at the N-terminus.
  • DNA encoding the G3819A mutant AHNAKmini was chemically synthesized and directly subcloned into the pAAV vector to prepare pAAV-CMV-AHNAK (SEQ ID NO: 19). This is further p. It was modified to have a mutation corresponding to G3819A (specifically, guanine (g) at position 3156 of SEQ ID NO: 19 was changed to cytosine (c)), pAAV-CMV-AHNAK p. G3819A was prepared. HEK293T cells were transfected with pHhelper vector, pRC vector, and pAAV-CMV-AHNAK p.
  • AAV-CMV-AHNAK p.G3819A AAV-CMV-AHNAK p.G3819A
  • AAV encoding EGFP AAV-CMV-EGFP
  • PBS containing 15% Pluronic F-127.
  • mice in the control group were examined.
  • Fig. 14A shows the maximum length of cerebral blood vessels with and without administration of PD173074 in AHNAK mutation-introduced cerebral aneurysm model mice. Error bars in the figure indicate standard errors. In addition, "*" in the figure indicates that p ⁇ 0.05 was obtained by unpaired unequal variance Student's t-test. In the group to which PD173074 was administered, the increase in maximum cerebral blood vessel length was significantly suppressed compared to the group to which no administration was performed. This suggests that FGF-R inhibitors have a therapeutic effect on AHNAK mutation-induced cerebral aneurysms.
  • Fig. 14B shows the maximum length of cerebral blood vessels with and without administration of LY294002 in AHNAK mutation-introduced cerebral aneurysm model mice. Error bars in the figure indicate standard errors. In the group to which LY294002 was not administered, variation in the maximum cerebral blood vessel length was observed, whereas in the group to which LY294002 was administered, the increase in the maximum cerebrovascular length was suppressed in all mice. This suggested that PI3K inhibitors have a therapeutic effect on AHNAK mutation-induced cerebral aneurysms.
  • Fig. 14C shows the maximum length of cerebral blood vessels with and without administration of staurosporine in AHNAK mutation-introduced cerebral aneurysm model mice. Error bars in the figure indicate standard errors. Variation in the maximum cerebral blood vessel diameter was observed in the group that did not receive staurosporine administration, whereas in the group that received staurosporine, the increase in the maximum cerebral blood vessel maximum diameter was suppressed in all mice. This suggested that PKC inhibitors have a therapeutic effect on AHNAK mutation-induced cerebral aneurysms.
  • Example 6 Gene expression analysis in tissue samples> The CA tissue extracted from the patient was analyzed for mRNA using a Visium spatial gene expression analysis system (10 ⁇ Genomics) to confirm the expression state of each gene. Sample preparation and gene analysis protocols were performed according to the package insert of the Visium system.
  • the prepared cryosections were set at predetermined positions on the Visium slide, one per area.
  • the slides were immersed in tissue lysis buffer (10% SDS, 10 mM Trizma (registered trademark) hydrochloride, 3.3 mg/mL proteinase (Qiagen)) heated to 50°C and incubated for 1 hour. After the slide was taken out and washed with ultrapure water, it was immersed in a 0.08M KOH solution and incubated at room temperature twice (10 minutes, 5 minutes). The slide was washed with 10 mM Tris buffer (pH 7) to remove surface moisture to obtain a tissue slide.
  • tissue lysis buffer (10% SDS, 10 mM Trizma (registered trademark) hydrochloride, 3.3 mg/mL proteinase (Qiagen)
  • tissue slides were fixed with methanol according to a conventional method, and then H&E stained. After staining, the tissue on the slide was imaged with a fluorescence microscope system (BZ-X800, Keyence).
  • FIG. 15 shows the mRNA expressions of PDGFR ⁇ and AHNAK in cryosections of cerebrovascular tissue from 2 CA patients and 1 control. A darker red portion is a portion with a large amount of mRNA expression. It was confirmed that the expression of all genes was enhanced in a wide range in CA tissues compared to controls. It was suggested that these genes are strongly involved in cerebral aneurysms. All publications, patents and patent applications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.

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Abstract

動脈瘤の治療に有用な治療薬を提供する。　以下のｉ）～ｉｉｉ）のうち、少なくとも１つの薬剤を有効成分として含む、動脈瘤の治療及び／又は予防のための医薬組成物。　ｉ）血小板由来増殖因子受容体β（ＰＤＧＦＲβ）を標的とする薬剤；　ｉｉ）デスモヨーキン（ＡＨＮＡＫ）の機能を阻害する薬剤；及び　ｉｉｉ）ＰＤＧＦＲβ又はＡＨＮＡＫの変異により亢進されるシグナル伝達を阻害する薬剤。

Description

動脈瘤の治療及び／又は予防のための医薬組成物、動脈瘤の診断補助方法、並びに動脈瘤治療薬の評価方法
　本発明は、動脈瘤の治療及び／又は予防のための医薬組成物、特定の薬剤を用いての動脈瘤の治療／又は予防効果を予測するための診断を補助する方法、並びに薬剤の動脈瘤治療効果をｉｎ　ｖｉｔｒｏで評価する方法に関する。
　動脈瘤は、血管がその外側に膨出した形態学的に異常な嚢状構造であり、血管の動脈分岐部又は動脈幹に発生する。動脈瘤は、発生した箇所により、胸部大動脈瘤、腹部大動脈瘤、内臓動脈瘤、末梢動脈瘤、脳動脈瘤、冠動脈瘤等に分けられる。このうち、脳動脈瘤は、くも膜下出血及び最も破壊的な出血性脳卒中の主な原因である。脳動脈瘤の中でも、巨大・大型血栓化紡錘状脳底動脈瘤の自然暦は極めて予後不良で、一度症候性となった場合は、破裂、脳幹梗塞、脳幹機能不全によって、平均５．５年で９１％が死亡、残る９％にも重度の後遺症が残ることが知られている。脳動脈瘤については確立した治療方法はなく、現状実施されている外科的処置は、手術又は血管内カテーテル治療である。これらの治療後の予後は、良好（日常生活で自立可能）６５～７３％、不良（要介助）３～１５％、死亡２０～２４％であり、治療が困難な疾患であるといえる。
　現在のところ、動脈瘤の遺伝的要因は明らかにされていない。脳動脈瘤に関しては、最近の研究で、頭蓋内紡錘状動脈瘤の発生にＰＤＧＦＲβの体細胞突然変異が関連することが示されている（非特許文献１）。
Karasozen et al. (2019) Somatic PDGFRB Activating Variants in Fusiform Cerebral Aneurysms, Am. J. Human Genet. 104, 968-976
　動脈瘤のより確実な治療を可能とするために、外科的処置に代わる、又は外科的処置と併用可能な治療方法が切望されている。本発明は、動脈瘤の治療に有用な治療薬を提供することを目的とする。また、本発明は、動脈瘤を有する対象における治療薬の治療効果を予測し得る、診断補助方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、薬剤の動脈瘤に対する治療効果をｉｎ　ｖｉｔｒｏで評価することが可能な判定方法を提供することを目的とする。
　上記課題を解決するために、本発明者は鋭意研究を重ね、動脈瘤の組織において高頻度で生じる特定の体細胞遺伝子変異を同定した。また、動脈瘤で変異を生じる特定の遺伝子を標的とする薬剤若しくは該遺伝子の機能を阻害する薬剤、又は該遺伝子の変異により亢進されるシグナル伝達を阻害する薬剤が動脈瘤の治療に有用であることを見出した。
　すなわち、本発明は以下を提供するものである。
（１）ｉ）～ｉｉｉ）のうち、少なくとも１つの薬剤を有効成分として含む、動脈瘤の治療及び／又は予防のための医薬組成物。
　ｉ）血小板由来増殖因子受容体β（ＰＤＧＦＲβ）を標的とする薬剤；
　ｉｉ）デスモヨーキン（ＡＨＮＡＫ）の機能を阻害する薬剤；及び
　ｉｉｉ）ＰＤＧＦＲβ又はＡＨＮＡＫの変異により亢進されるシグナル伝達を阻害する薬剤。
（２）前記薬剤が、ＰＤＧＦＲβを標的とする薬剤である、（１）の医薬組成物。
（３）前記薬剤がチロシンキナーゼの活性を抑制する薬剤である、（２）の医薬組成物。
（４）前記薬剤がチロシンキナーゼ阻害剤であり、スニチニブ、アキシチニブ、ダサチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、パゾパニブ、バンデタニブ、アファチニブ、レゴラフィニブ、カボザンチニブ、オシメルチニブ、ダコミチニブ、キザルチニブ、カプマチニブ、テポチニブ、イマチニブ、ソラフェニブ、ニロチニブ、クリゾチニブ、ポナチニブ、セリチニブ、ニンテダニブ、ロルラチニブ、エヌトレクチニブ、これらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、及び誘導体からなる群から選択される少なくとも１つである、（３）に記載の医薬組成物。
（５）前記薬剤が、アキシチニブ、ダサチニブ、薬学的に許容される塩、溶媒和物、及びこれらの誘導体から選択される少なくとも１つである、（４）に記載の医薬組成物。
（６）前記薬剤が、ダサチニブ及びその薬学的に許容される塩、溶媒和物、及び誘導体から選択される少なくとも1つである、（５）に記載の医薬組成物。
（７）前記薬剤が、ＡＨＮＡＫを標的とする薬剤である、（１）に記載の医薬組成物。
（８）前記薬剤が、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦ－Ｒ）阻害剤、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤、及びホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤から選択される少なくとも１つである、（７）に記載の医薬組成物。
（９）前記動脈瘤が脳動脈瘤である、（１）～（８）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１０）動脈瘤の診断を補助する方法であって、以下の工程を含む方法。
　動脈瘤を有する対象から採取した試料中のＰＤＧＦＲβ遺伝子及びＡＨＮＡＫ遺伝子のうち、少なくとも１つの遺伝子の変異を検出する工程、及び
　前記対象に対する、請求項１に記載の医薬組成物による治療及び／又は予防効果を予測する工程。
（１１）前記試料中のＰＤＧＦＲβ遺伝子の変異を検出し、前記対象に対するチロシンキナーゼ阻害剤の治療及び／又は予防効果を予測する、（１０）に記載の方法。
（１２）前記ＰＤＧＦＲβ遺伝子の変異が、配列番号２で表されるアミノ酸配列のｐ．５５９＿５６２ｄｅｌ、ｐ．５６３＿５６４ｄｅｌ、ｐ．Ｙ５６２Ｎ、ｐ．Ｙ５６２Ｓ、及びｐ．Ｙ５６２Ｄの変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異に対応する、（１１）に記載の方法。
（１３）前記ＰＤＧＦＲβ遺伝子の変異が、配列番号２で表されるアミノ酸配列のｐ．５５９＿５６２ｄｅｌの変異に対応する、（１２）に記載の方法。
（１４）前記試料中のＡＨＮＡＫ遺伝子の変異を検出し、前記対象に対するＦＧＦ－Ｒ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤又はＰＩ３Ｋ阻害剤の治療及び又は予防効果を予測する、（１０）に記載の方法。
（１５）前記ＡＨＮＡＫ遺伝子の変異が、配列番号１６で表されるアミノ酸配列のｐ．Ｄ１０８３Ｓｆｓ＊６、ｐ．Ａ２１１４Ｔ、ｐ．Ｇ３８１９Ａ、ｐ．Ｎ３８２７Ｓ、ｐ．Ｅ３８５０Ｋ、ｐ．Ａ４０４６Ｖ、ｐ．Ｄ４７０１Ｅ及びｐ．Ｈ５８１７Ｒｆｓ＊２０の変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異に対応する、（１４）に記載の方法。
（１６）前記ＡＨＮＡＫ遺伝子の変異が、配列番号１６で表されるアミノ酸配列のｐ．Ｇ３８１９Ａの変異に対応する、（１５）に記載の方法。
（１７）前記試料が血清又は血漿である、（１０）～（１６）のいずれかに記載の方法。
（１８）薬剤の動脈瘤治療効果を判定する方法であって、以下の工程ｂ）～ｄ）を含む、方法：
　ｂ）ヒト細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏで薬剤と接触させる工程；
　ｃ）工程ｂ）の細胞について、のリン酸化細胞外シグナル調節キナーゼ（ｐ－ＥＲＫ）量及び／又はリン酸化チロシン量を測定する工程；及び
　ｄ）工程ｃ）の測定値から前記薬剤の動脈瘤治療効果を予測する工程、
　を含む、方法。
（１９）薬剤の動脈瘤治療効果を判定する方法であって、以下の工程ａ’）～ｄ’）を含む、方法：
　ａ’）変異を有するＰＤＧＦＲβ遺伝子を導入したヒト細胞を調製する工程；
　ｂ’）前記細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏで薬剤と接触させる工程；
　ｃ’）工程ｂ’）の細胞について、リン酸化細胞外シグナル調節キナーゼ（ｐ－ＥＲＫ）量及び／又はリン酸化チロシン量を測定する工程；及び
　ｄ’）工程ｃ’）の測定値から前記薬剤の動脈瘤治療効果を予測する工程、
　を含む、方法。
（２０）前記ＰＤＧＦＲβ遺伝子の変異が、配列番号２で表されるアミノ酸配列のｐ．５５９＿５６２ｄｅｌ、ｐ．５６３＿５６４ｄｅｌ、ｐ．Ｙ５６２Ｎ、ｐ．Ｙ５６２Ｓ、ｐ．及びＹ５６２Ｄの変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異に対応する変異である、（１８）又は（１９）に記載の方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる国際出願番号PCT/JP2021/048561の開示内容を包含する。
　本発明によると、動脈瘤の治療及び／又は予防に有用な医薬品を提供することが可能である。また、本発明によると、動脈瘤を有する対象における医薬品の治療／予防効果を予測し得る、診断補助方法を提供することが可能である。さらに、本発明によると、薬剤の動脈瘤に対する治療／予防効果をｉｎ　ｖｉｔｒｏで評価することが可能な判定方法を提供することが可能である。
図１は、脳動脈瘤組織においてＰＤＧＦＲβ遺伝子で最も頻繁に見られる体細胞変異の位置及び内容を示す概略図である。この概略図に示される新規の変異は、全エクソーム配列決定により特定されたものである。 図２は、脳動脈瘤患者６９症例の脳動脈瘤組織試料の全エクソームシーケンスで検出された４０５遺伝子に影響を与える非同義の体細胞変異について、嚢状動脈瘤にみられる変異（嚢状）と紡錘状動脈瘤でみられる変異（紡錘状）との関係を示すベン図である。３８１の変異が嚢状動脈瘤で見られ、２９が紡錘状動脈瘤で見られ、うち５の変異が両方に見られた。 図３は、複数の症例で変異が見られた２つの体細胞変異遺伝子の症例ごとの分布を示す。４５症例中、これらの２遺伝子のいずれかの変異が見られた６症例について体細胞変異遺伝子の分布を示す。右の棒グラフは、各遺伝子変異を有する症例の数であり、上から頻度の高い順に表示している。ＰＤＧＦＲβ遺伝子変異が４症例で、ＡＨＮＡＫ遺伝子変異が４症例で観察された。 図４は、Inaugural Pathway Analysis（ＩＰＡ）を使用した、体細胞変異遺伝子と動脈瘤の相関図である。ＰＤＧＦＲβは、ＨＯＸＣ６、ＮＦκＢ２をそれぞれ介したシグナル伝達経路に関連し、ＡＨＮＡＫは、Ｕ２ＡＦ２、ＮＦκＢ２をそれぞれ介したシグナル伝達経路に関連し、動脈瘤形成のシグナル伝達ネットワークを形成することが判明した。 図５は、５症例の脳動脈瘤患者の脳血管層におけるＰＤＧＦＲβの分布を示す。（Ａ）は、小規模の紡錘状拡張を示す症例ＦＵ３で、ＰＤＧＦＲβ変異が外膜層で最も多く、内膜層ではごくわずかであった。（Ｂ）２番目に小さいサイズの３葉の限局性紡錘状拡張を伴うＦＵ２は、変異が外膜層で最も豊富であり、続いて中膜層で多いことが示された。（Ｃ）中程度の大きさの７－１０ｍｍの症例ＦＵ６は、円周方向に厚い紡錘状の拡張を有するが、変異が最も多いのが中間層であって、次いで外膜層、次に内膜層であった。（Ｄ）１１ｍｍの破裂した紡錘状動脈瘤を伴う症例ＦＲ１の動脈瘤は、ＰＤＧＦＲβ変異が中膜層、外膜層、内膜層の順に高かったことを示す。（Ｅ）２２ｍｍの破裂していない嚢状の巨大動脈瘤を有する症例ＳＵ５０においては、ＰＤＧＦＲβ変異は、中膜層と内膜層とで同程度見られた。 図６は、動脈瘤に関連する各ＰＤＧＦＲβ変異体を過剰発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＰＤＧＦＲβ、ＥＲＫ１／２、ＡＫＴ及びＳＴＡＴ３のリン酸化の状態を示すウエスタンブロット写真である。試験したすべての突然変異体でＰＤＧＦＲβのリン酸化が検出された。ＥＲＫ１／２のリン酸化は、野生型を除くすべての変異で検出された。ＥＲＫ１／２のリン酸化は、Ｋ５５９＿Ｙ５６２欠失変異体で最も高かった。ＳＴＡＴ３のリン酸化は、全ての変異で増加した。ＡＫＴリン酸化への影響は見られなかった。図中、ＧＦＰは変異の発現を確認するためのコントロールとして、β－アクチン（ＡＫＴ）はウエスタンブロットの各バンド強度を正規化するためのコントロールとして検出した。 図７は、動脈瘤に関連する各ＰＤＧＦＲβ変異体を過剰発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＰＤＧＦ－ＢＢの投与の効果を示すウエスタンブロット写真である。ｐ．５５９＿５６２ｄｅｌ変異体によるＰＤＧＦＲβのリン酸化はわずかに抑制されたが、他のＹ５６２バリアントのリン酸化には抑制は見られなかった。すべてのＰＤＧＦＲβ変異体において、ＥＲＫのリン酸化がＰＤＧＦ－ＢＢ用量依存的に増加することが観察された。図中、ＧＦＰは変異の発現を確認するためのコントロールとして、β－アクチンはウエスタンブロットの各バンド強度を正規化するためのコントロールとして検出した。 図８Ａは、動脈瘤に関連する各ＰＤＧＦＲβ変異体を過剰発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるチロシンキナーゼ阻害剤のスニチニブ投与の効果を示すウエスタンブロット写真である。ＰＤＧＦＲβのリン酸化チロシンの状態は、スニチニブによって抑制された。３つのＹ５６２変異体、ｐ．５５９＿５６２ｄｅｌ、およびｐ．５６３＿５６４ｄｅｌの変異体のＥＲＫリン酸化は、ＰＤＧＦＲβの不活性化により抑制された。 図８Ｂは、動脈瘤に関連する各ＰＤＧＦＲβ変異体を過剰発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるチロシンキナーゼ阻害剤のアキシチニブ投与の効果を示すウエスタンブロット写真である。ＰＤＧＦＲβのリン酸化チロシンの状態は、アキシチニブによって抑制された。３つのＹ５６２変異体、ｐ．５５９＿５６２ｄｅｌ、およｐ．５６３＿５６４ｄｅｌの変異体のＥＲＫリン酸化は、ＰＤＧＦＲβの不活性化により抑制された。 図８Ｃは、動脈瘤に関連する各ＰＤＧＦＲβ変異体を過剰発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるチロシンキナーゼ阻害剤のダサチニブ投与の効果を示すウエスタンブロット写真である。ＰＤＧＦＲβのリン酸化チロシンの状態は、ダサチニブによって抑制された。３つのＹ５６２変異体、ｐ．５５９＿５６２ｄｅｌ、およびｐ．５６３＿５６４ｄｅｌの変異体のＥＲＫリン酸化は、ＰＤＧＦＲβの不活性化により抑制された。 図９は、脳動脈瘤モデルマウスの脳底動脈の血管径を測定した結果を示すグラフである。マウスには、ＰＤＧＦＲβｗｔ（野生型）遺伝子又はＰＤＧＦＲβｄ（ｐ．５５９＿５６２ｄｅｌ）遺伝子をＧＦＰ遺伝子と共に導入した。ＧＦＰのみを導入したマウスをコントロールとして使用した。ＰＤＧＦＲβ野生型ＧＦＰとＧＦＰのみの発現では、血管断面積は経時的に変化せず、上記変異体を発現させたマウスにおいて血管断面積は、野生型よりも大幅に拡大された（＊Ｐ＜０．０５）。スニチニブを添加することで、血管拡大が抑制された。 図１０は、ＰＤＧＦＲβ変異を導入したマウスにおける、各薬剤投与条件での脳底動脈最大長径の分布を示すグラフである。図中のｐ値は、一元配置分散分析を用いたＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉにより算出した値である。 図１１は、全エクソーム配列決定において観察されたＡＨＮＡＫ遺伝子の体細胞変異の位置及び内容を示す。 図１２は、野生型ＡＨＮＡＫ及びｐ．Ｇ３８１９Ａ変異型ＡＨＮＡＫを導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、各種阻害剤存在下でのＮＦκＢルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示すグラフである。 図１３は、ＡＨＮＡＫｍｉｎｉの構造を示す概略図である。 図１４Ａは、ＡＨＮＡＫ変異を導入した脳動脈瘤モデルマウスにおける、ＰＤ１７３０７４の投与あり、投与なしの内頚動脈・中大脳動脈最大長径を示すグラフである。図中のエラーバーは標準誤差を示す。図中の「*」は、対応のない等分散のスチューデントｔ検定でｐ＜０．０５であったことを示す。 図１４Ｂは、ＡＨＮＡＫ変異を導入した脳動脈瘤モデルマウスにおける、ＬＹ２９４００２の投与あり、投与なしの頚動脈・中大脳動脈を示す。図中のエラーバーは標準誤差を示す。 図１４Ｃは、ＡＨＮＡＫ変異を導入した脳動脈瘤モデルマウスにおける、スタウロスポリンの投与あり、投与なしの頚動脈・中大脳動脈を示す。図中のエラーバーは標準誤差を示す。 図１５は、Ｖｉｓｉｕｍ空間的遺伝子発現解析システムを用いた、脳動脈瘤（ＣＡ）患者のＣＡ組織２症例及びコントロール１例の脳血管組織凍結切片におけるＰＤＧＦＲβ及びＡＨＮＡＫのｍＲＮＡ発現解析結果を示す。より赤色の濃い部分がｍＲＮＡ発現量の多い部分となる。いずれの遺伝子もコントロールと比較してＣＡ組織で広い範囲で発現が亢進されていることが確認された。
＜定義＞
　本明細書において記載される化合物は、特に記載のない限り、存在し得る幾何学異性体、光学異性体をいずれも包含する。本明細書において、化合物の「薬学的に許容される塩」は、特に記載のない限り、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、若しくは置換若しくは非置換のアンモニウムイオンのようなカチオンとの塩、又は塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、炭酸若しくはリン酸のような無機酸、又はギ酸、酢酸、マレイン酸、フマル酸、安息香酸、アスコルビン酸、乳酸、コハク酸、ビスメチレンサリチル酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、プロピオン酸、酒石酸、リンゴ酸、サリチル酸、クエン酸、グルコン酸、アスパラギン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、イタコン酸、グリコール酸、p-アミノ安息香酸、グルタミン酸、ベンゼンスルホン酸、シクロヘキシルスルファミン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、イセチオン酸、p-トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、メシル酸、若しくはトシル酸のような有機酸アニオンとの塩を包含する。また、化合物の「溶媒和物」は、特に記載のない限り、水、又は低級アルコール（例えば、メタノール、エタノール若しくは２－プロパノール（イソプロピルアルコール）のような１～６の炭素原子数を有するアルコール）、高級アルコール（例えば、１－ヘプタノール若しくは１－オクタノールのような７以上の炭素原子数を有するアルコール）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、酢酸、エタノールアミン若しくは酢酸エチルのような有機溶媒との溶媒和物を包含する。化合物の「誘導体」は、特に記載のない限り、該化合物の１以上の水素原子（Ｈ）を、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素又はヨウ素）、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、置換若しくは非置換のＣ１～Ｃ５アルキル、置換若しくは非置換のＣ２～Ｃ５アルケニル、置換若しくは非置換のＣ２～Ｃ５アルキニル、置換若しくは非置換のＣ３～Ｃ６シクロアルキル、置換若しくは非置換のＣ３～Ｃ６シクロアルケニル、置換若しくは非置換のＣ３～Ｃ６シクロアルキニル、置換若しくは非置換の３～６員のヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換のＣ７～Ｃ１１シクロアルキルアルキル、置換若しくは非置換の３～６員のヘテロシクロアルキル－Ｃ１～Ｃ５アルキル、置換若しくは非置換のＣ６～Ｃ１５アリール、置換若しくは非置換のＣ７～Ｃ２０アリールアルキル、置換若しくは非置換の５～１５員のヘテロアリール、置換若しくは非置換の５～１５員のヘテロアリール－Ｃ１～Ｃ５アルキル、置換若しくは非置換のＣ１～Ｃ６アルコキシ、置換若しくは非置換のＣ３～Ｃ６シクロアルコキシ、置換若しくは非置換の３～６員ヘテロシクロアルコキシ、置換若しくは非置換のＣ６～Ｃ１５アリールオキシ、置換若しくは非置換のＣ７～Ｃ２０アリールアルキルオキシ、置換若しくは非置換の５～１５員のヘテロアリールオキシ、置換若しくは非置換の５～１５員のヘテロアリール－Ｃ１～Ｃ５アルキルオキシ、置換若しくは非置換のＣ１～Ｃ６アルコキシカルボニル、置換若しくは非置換のＣ３～Ｃ６シクロアルコキシカルボニル、置換若しくは非置換のアミノカルボニル（カルバモイル）、置換若しくは非置換のＣ１～Ｃ２０アシル、置換若しくは非置換のＣ１～Ｃ２０アシルオキシ、置換若しくは非置換のアミノ、置換若しくは非置換のスルホンアミド、置換若しくは非置換のカルボニルジイミノ、カルボキシル、及びオキソからなる群より選択される一価基又は二価基に置換された化合物及びこれらの薬学的に許容される塩及び溶媒和物を包含する。ここでいう「置換若しくは非置換の」置換基のうち、「置換の」置換基は、該置換基の一部がさらに上記置換基のいずれかで置換されているものを指す。さらに／あるいは、本発明において「誘導体」は、特に記載のない限り、該化合物の１以上の窒素原子（Ｎ）又は酸素原子（Ｏ）に前記置換基のいずれかを結合させた化合物及びこれらの薬学的に許容される塩及び溶媒和物を包含する。
　本明細書において、「Ａ～Ｂ」（Ａ、Ｂはともに数値）の表記は、特に記載のない限り、「Ａ以上Ｂ以下」を指す。本明細書において、「％」は、特に記載のない限り、また、特に矛盾のない限り「重量％」を指す。
　本明細書において「動脈瘤」とは、動脈が風船のように膨らんだ膨張部分を指す。また、「脳動脈瘤（cerebral aneurysm：ＣＡ）」とは、脳の動脈に生じた動脈瘤を指す。成人の２～６％に無症候性の未破裂脳動脈瘤が発見されている。脳動脈瘤は、脳底血管の分岐部にできることが多く、中大脳動脈、内頚動脈、前交通動脈、脳底動脈などに多く発生する。脳動脈瘤の大きさは直径２ｍｍ～２５ｍｍと多様であるが、多くは１０ｍｍ未満である。多くが無症候性であるが、神経を圧迫することで頭痛の要因となることがある。また、巨大脳動脈瘤は、破裂によりくも膜下出血を生じるリスクが非常に高い。２５ｍｍを超える巨大脳動脈瘤の破裂の割合は、年間３３％ともいわれる。脳動脈瘤は、その形状により嚢状脳動脈瘤（saccular cerebral aneurysm：ＳＣＡ）と紡錘状脳動脈瘤（fusiform cerebral aneurysm：ＦＣＡ）に分けられる。特にＳＣＡで破裂リスクが高いといわれる。
　本明細書において「チロシンキナーゼ阻害剤（tyrosine kinase inhibitor：ＴＫＩ）」とは、タンパク質を構成するチロシンをリン酸化する１以上のチロシンキナーゼの作用を遮断する酵素阻害剤を指す。チロシンキナーゼは、細胞の増殖、分化等に関わるシグナル伝達に関わる重要な酵素であるが、異常な活性化により細胞の癌化等を引き起こす要因ともなり得る。市販のチロシンキナーゼ阻害剤は、主に抗癌剤として使用される。
　本明細書において「血小板由来増殖因子受容体β（platelet derived growth factor receptor β：ＰＤＧＦＲβ）」とは、膜貫通受容体チロシンキナーゼ（receptor tyrosine kinase：ＲＴＫ）のファミリーに属するチロシンキナーゼタンパク質を指す。胚発生中の様々な種類のシグナル伝達カスケードに関与する高度に保存された膜貫通受容体チロシンキナーゼである。血管平滑筋細胞や周皮細胞を含む少数の細胞型で発現し、血管前駆細胞のシグナル伝達において重要な役割を果たす。また、ＰＤＧＦＲβ遺伝子は、癌関連遺伝子としても知られる。動脈瘤発症において、ＰＤＧＦＲβ遺伝子の変異により、チロシンキナーゼとしての活性が亢進されるものと推測される。ヒトＰＤＧＦＲβは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するか、配列番号２で表される配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつチロシンキナーゼ活性を有するタンパク質である。ヒトＰＤＧＦＲβをコードするＰＤＧＦＲβ遺伝子は、配列番号２で表されるアミノ酸配列、又は配列番号２で表される配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上若しくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する。ＰＤＧＦＲβ遺伝子の塩基配列は、これらのタンパク質をコードする限り限定されないが、例えば、配列番号１で表されるエキソン配列（NCBI Reference sequence NM_002609）又は配列番号１の配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上若しくは９９％以上の同一性を有するエキソン配列とすることができる。
　ＰＤＧＦＲβによりリン酸化されるタンパク質としては、例えば、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）、プロテインキナーゼＢ（ＡＫＴ）、ＳＴＡＴ３等が知られる。
　本明細書において「デスモヨーキン（ＡＨＮＡＫ）」とは、大型筋線維生理作用関連構造タンパク質、及びトランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦ－β）／Ｓｍａｄシグナル伝達を介する癌抑制因子として知られるタンパク質である。ヒトＡＨＮＡＫは、配列番号１６で表されるアミノ酸配列を有するか、配列番号１６で表される配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である。ヒトＡＨＮＡＫをコードするＡＨＮＡＫ遺伝子は、配列番号１５で表されるエキソン配列（NCBI Reference Sequence: NM_001620）又は配列番号１５で表される配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上若しくは９９％以上の同一性を有するエキソン配列とすることができる。
　本明細書において「全エクソーム配列決定（whole exome sequencing：ＷＥＳ）」とは、全ゲノムのうちのエキソン配列のみの配列決定を指す。本明細書において、「標的ディープシークエンシング（ＤＳ）」とは、試料ＤＮＡ中の特定領域を高い重複度で塩基配列決定を行うことを指す。組織中の微量の体細胞変異の同定が可能である。
　本明細書において「試料」とは、動脈瘤を有する対象から取り出された試料であって、血液（全血、血漿、血清及び血球）、リンパ液、尿、唾液、汗、精液、組織液、体腔液、脳脊髄液等の体液、及び血管壁、脳組織等の組織から適宜選択することができる。
　本明細書において、遺伝子変異は以下のように表記する。遺伝子変異をＤＮＡレベルで表記する場合、塩基置換は「ｃ．１６８４Ｔ＞Ａ」のように記載する。「ｃ．」は、ｃｏｄｉｎｇＤＮＡの略である。「ｃ．１６８４Ｔ＞Ａ」は、１６８４番目のチミンがアデニンに置換される変異を示す。また、塩基欠失は「ｃ．１６７５＿１６８６ｄｅｌ」のように記載する。「ｃ．１６７５＿１６８６ｄｅｌ」は、１６７５番目から１６８６番目の塩基が欠失する変異を示す。一方、遺伝子変異をタンパク質レベルで表記する場合、ミスセンス変異は、「ｐ．Ｙ５６２Ｎ」のように記載する。「ｐ．」は、ｐｒｏｔｅｉｎの略である。「ｐ．Ｙ５６２Ｎ」は、５６２番目のチロシンがアスパラギンに置換される変異を示す。また、アミノ酸欠失は「ｐ．５５９＿５６２ｄｅｌ」のように記載する。「ｐ．５５９＿５６２ｄｅｌ」は、５５９番目から５６２番目のアミノ酸が欠失する変異を示す。さらに、フレームシフト変異は「ｐ．Ｄ１０８３Ｓｆｓ＊６」のように記載する。「ｐ．Ｄ１０８３Ｓｆｓ＊６」は、１０８３番目のアスパラギン酸の位置以下にセリンで始まる新たなリーディングフレームができ、その位置から６番目のリーディングフレームが終止コドンとなったことを示す。
＜医薬組成物＞
　本発明の医薬組成物は、下記のｉ）～ｉｉｉ）のうち、少なくとも１つの薬剤を有効成分として含む、動脈瘤の治療及び／又は予防のための医薬組成物である。
　ｉ）血小板由来増殖因子受容体β（ＰＤＧＦＲβ）を標的とする薬剤；
　ｉｉ）デスモヨーキン（ＡＨＮＡＫ）の機能を阻害する薬剤；及び
　ｉｉｉ）ＰＤＧＦＲβ又はＡＨＮＡＫの変異により亢進されるシグナル伝達を阻害する薬剤。
　これにより、非侵襲的に動脈瘤を治療及び／又は予防することが可能となる。
　以下、上記ｉ）～ｉｉｉ）のいずれかの薬剤について、単に「ＰＤＧＦＲβに関連する薬剤」又は「ＡＨＮＡＫに関連する薬剤」とも記載する。
　本発明者は、６９症例の脳動脈瘤患者より、脳底動脈組織と血液試料とを取得し、ＷＥＳ及びＤＳにより、ＳＣＡ及びＦＣＡの両方の脳底動脈組織で、血小板由来増殖因子受容体β（ＰＤＧＦＲβ）、デスモヨーキン（ＡＨＮＡＫ）等の複数の遺伝子に高頻度で変異を生じることを明らかにした。これらの中で最も多くの患者で変異が見られたのはＰＤＧＦＲβ遺伝子及びＡＨＮＡＫ遺伝子であった。
　さらに、ＰＤＧＦＲβ遺伝子及びＡＨＮＡＫ遺伝子について、ＣＡ６８症例の脳動脈瘤組織試料のＤＳを実施した。ＰＤＧＦＲβ遺伝子については、ＷＥＳで４症例において４種類の変異を検出し、さらにＤＳにより１症例での１変異を追加した５症例で５種類の変異を検出した（詳細は後述の「参考例１」を参照のこと）。また、脳動脈瘤患者の脳底動脈の血管壁に、変異を有するＰＤＧＦＲβが発現することが確認された。
　図１は、ＷＥＳ及びＤＳで検出された、ＰＤＧＦＲβにおける上記の５種類の変異の位置及び内容を示す概略図である。具体的には、２種類のミスセンス突然変異（ｐ．Ｙ５６２Ｎ、ｐ．Ｙ５６２Ｓ、ｐ．Ｙ５６２Ｄ）、エキソン１２における４アミノ酸のインフレーム欠失（ｐ．５５９＿５６２ｄｅｌ）及び２アミノ酸のインフレーム欠失（ｐ．５６３＿５６４ｄｅｌ）である。
　ＡＨＮＡＫ遺伝子については、ＷＥＳにおいて４症例で３種類の変異が検出された。図１１に３種類の変異の位置を示す。ＤＳにより、さらに８症例で５種類の変異が検出された。ＡＨＮＡＫ遺伝子で検出された変異は、具体的には、６種類のミスセンス突然変異（ｐ．Ａ２１１４Ｔ、ｐ．Ｇ３８１９Ａ、ｐ．Ｎ３８２７Ｓ、ｐ．Ｅ３８５０Ｋ、ｐ．Ａ４０４６Ｖ、及びｐ．Ｄ４７０１Ｅ）及び２種類のフレームシフト突然変異（ｐ．Ｄ１０８３Ｓｆｓ＊６及びｐ．Ｈ５８１７Ｒｆｓ＊２０）であった。
　動脈瘤は、大きくＳＣＡとＦＣＡに分けられるが、傾向として、ＦＣＡの症例にはＰＤＧＦＲβに変異を有する症例が多く、ＳＣＡの症例ではＡＨＮＡＫに変異を有する症例が多かった。興味深いことに、ＳＣＡの中でも巨大嚢胞状動脈瘤では、ＰＤＧＦＲβに変異を有する症例が多かった。
　Inaugural Pathway Analysis（ＩＰＡ）を使用して、ＰＤＧＦＲβ遺伝子及びＡＨＮＡＫ遺伝子について、動脈瘤形成に係るシグナル伝達経路の解析を行ったところ、図４に示す通り、ＰＤＧＦＲβは、ＨＯＸＣ６、ＮＦκＢ２をそれぞれ介したシグナル伝達経路に関連し、ＡＨＮＡＫは、Ｕ２ＡＦ２、ＮＦκＢ２をそれぞれ介したシグナル伝達経路に関連し、動脈瘤形成のシグナル伝達ネットワークを形成することが判明した。いずれの遺伝子も、変異により過剰なシグナル伝達を生じ、動脈瘤形成につながる炎症発生に寄与し得ることが分かった。
　ＰＤＧＦＲβ遺伝子の変異について、各変異を有するＰＤＧＦＲβ遺伝子を導入したヒト胚性腎臓細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）において、野生型ＰＤＧＦＲβ遺伝子を導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞と比較して、５種類の変異遺伝子の導入によりチロシンキナーゼ活性が亢進されることが見いだされた。さらに、これらの亢進が、チロシンキナーゼ阻害剤の添加により、野生型ＰＤＧＦＲβ遺伝子導入時と同レベルまで抑制されることが確認された。
　さらに、本発明者は、脳動脈瘤形成を促進する変異（具体的には、ｐ．５５９＿５６２ｄｅｌ変異）を有するＰＤＧＦＲβ遺伝子を備えたアデノ随伴ウイルス（adeno-associated virus：ＡＡＶ）をマウスの脳血管に感染させることで、脳底動脈の拡大、すなわち脳動脈瘤の徴候が見られることを確認し、これにより脳動脈瘤モデルマウスを構築した。上記のウイルス感染時と同時に、及びウイルス感染後７日目からマウスにチロシンキナーゼ阻害剤（スニチニブ、ダサチニブ、アキシチニブ）の投与を開始することで、脳血管の拡大が抑制されることを確認した。これにより、初めて、チロシンキナーゼ阻害剤の脳動脈瘤の予防効果及び治療効果を確認することができた。
　ＡＨＮＡＫ遺伝子の変異について、変異（ｐ．Ｇ３８１９Ａ）を有するＡＨＮＡＫ部分遺伝子を導入したヒト胚性腎臓細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）において、炎症マーカーであるＮＦκＢの発現が亢進されることが確認された。また、上記細胞によるＮＦκＢの発現は、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦ－Ｒ）阻害剤、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤、及びホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤の存在下で抑制されることを見出した。
　ＡＨＮＡＫは分子量の大きなタンパク質であるため、そのままウイルスベクター等を用いて実験動物に導入することは困難であった。本発明者は、ＡＨＮＡＫの変異部分を含み、かつ一部機能を保持する領域をコードする遺伝子をクローニングした。変異（ｐ．Ｇ３８１９Ａに相当）を有するＡＨＮＡＫ部分遺伝子（ＡＨＮＡＫｍｉｎｉ）を備えたＡＡＶをマウスの脳血管に感染させることで、脳血管の最大長径の拡大、すなわち脳動脈瘤の徴候が見られることを確認した。また、ウイルス感染後７日目からマウスに、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦ－Ｒ）阻害剤、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤、及びホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤の投与を開始することで、上記の脳血管拡大が抑制されることを確認した。
　上記の知見をもとに、本発明者は、ＰＤＧＦＲβに関連する薬剤、特にチロシンキナーゼ阻害剤の動脈瘤の治療及び／又は予防への有用性を見出した。また、ＡＨＮＡＫに関連する薬剤、特に、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦ－Ｒ）阻害剤、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤、及びホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤の動脈瘤の治療及び／又は予防への有用性を見出した。
　本発明の医薬組成物は、動脈瘤の治療及び／又は予防に使用される。動脈瘤は、症候性、無症候性のいずれであってもよく、動脈瘤の大きさについても特に限定されない。特に、従来、積極的な外科的手術を行わず、経過観察を行ってきた無症候性かつ小規模の未破裂動脈瘤を有する対象について、好適に適用可能である。予防的使用としては、例えば、外科的手術後の対象の再発防止に有用である。あるいは、未発症の高リスク（遺伝的要因、環境的要因、生活習慣など）の対象に対して予防的に使用することも可能である。
　本発明の医薬組成物に含まれる「薬剤」は、ＰＤＧＦＲβの変異による活性の亢進、及び／又は、ＡＨＮＡＫの変異による活性の亢進により生じ得る、炎症反応及び／又は細胞の異常増殖を抑制できる薬剤であれば、特に限定されない。
ＰＤＧＦＲβに関連する薬剤としては、チロシンキナーゼ阻害剤を好適に使用できる。このようなチロシンキナーゼ阻害剤としては、スニチニブ、アキシチニブ、ダサチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、パゾパニブ、バンデタニブ、アファチニブ、レゴラフィニブ、カボザンチニブ、オシメルチニブ、ダコミチニブ、キザルチニブ、カプマチニブ、テポチニブ、イマチニブ、ソラフェニブ、ニロチニブ、クリゾチニブ、ポナチニブ、セリチニブ、ニンテダニブ、ロルラチニブ、エヌトレクチニブ、これらの薬学的に許容される塩、溶媒和物及び誘導体が知られる。これらの薬剤のうち、特に、本発明者が構築した動脈瘤モデルマウスで高い治療／予防効果が確認された、アキシチニブ（下記式（Ｉ））及びダサチニブ（下記式（ＩＩ））、これらの薬学的に許容される塩、溶媒和物及び誘導体よりなる群より選択される薬剤を好適に使用できる。特に、ダサチニブ、その薬学的に許容される塩、溶媒和物及び誘導体よりなる群より選択される薬剤を好適に使用できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　図４に示す通り、ＩＰＡにより、ＰＤＧＦＲβ遺伝子の変異が、ＨＯＸＣ６、ＮＦκＢ２をそれぞれ介する炎症反応のシグナル伝達に関与することが明らかとなった。ＮＦκＢ２は、転写因子の１つであり、炎症性サイトカイン等の発現を亢進することが知られる。ＮＦκＢ２は、血管拡張作用を有するプロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）の発現亢進にも作用することが知られている。ＨＯＸＣ６遺伝子は、前立腺癌等で発現する癌関連遺伝子として知られる遺伝子であり、ＨＯＸＣ６遺伝子によりコードされるＨＯＸＣ６タンパク質は転写因子として知られている。ＰＤＧＦＲβ遺伝子の変異により、ＨＯＸＣ６のシグナル伝達が亢進され、ＮＦκＢ２のシグナル伝達が亢進すると考えられる。そのため、ＰＤＧＦＲβに関連する薬剤としては、ＨＯＸＣ６を標的とする阻害剤（例えば、抗ヒトＨＯＸＣ６モノクローナル抗体又はその結合性断片であって、且つ、ＨＯＸＣ６の転写活性を阻害し得る抗体又はその結合性断片、ＨＯＸＣ６のｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ、ＨＯＸＣ６タンパク質の活性の異常な亢進に起因して生じる癌に対する抗癌剤等）、ＮＦκＢ２を標的とする阻害剤（例えば、TPCA1, BOT-64, BMS345541, Amlexanox, SC-514, IMD0354, IKK-16, BAY 11-7082, MG-115, MG-132, Lactacystin, Epoxomicin, Parthenolide, Carfilzomib, MLN-4924, JSH-23, Rolipram, Gallic acid, Anacardic acid, GYY 4137, p-XSC, LY 294002, Wortmannin, Quinacrine, Mesalamine, CV 3988, Flavopiridol, BAY 11-7082, JSH-23, QNZ, SC75741, Pyrrolidinedithiocarbamate ammonium等）も挙げられる。また、ＰＤＧＦＲβのチロシンキナーゼ活性を直接阻害する特異的抗体若しくはその結合性断片を使用することもできる。なお、ＰＤＧＦＲβに関連する薬剤は、ＰＤＧＦＲβの変異に起因する過剰な炎症反応及び／又は細胞の異常増殖を抑制し得る薬剤であればよく、本発明は、使用する薬剤を上記の薬剤に限定することを意図するものではない。
　本発明の医薬組成物は、上記のＰＤＧＦＲβに関連する薬剤に加えて、又はこれに代えて、ＡＨＮＡＫに関連する薬剤が含まれてもよい。いずれの薬剤を使用するかは、例えば、後述する診断補助方法を用いて有効薬剤を予測することで決定してもよく、または、動脈瘤の臨床所見（例えば、ＳＣＡかＦＣＡか等）に基づいて決定してもよい。
　ＡＨＮＡＫは、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）／Ｓｍａｄシグナル伝達経路において、Ｓｍａｄ２／３のリン酸化によるシグナル伝達に関与することが報告されている（Lee I, H., et al., Oncogene, 33(8), 4675-4684 (2014))。そこで、ＴＧＦβのシグナル伝達経路を抑制するために、同シグナル経路に寄与する線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦ－Ｒ）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、及びホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）を阻害することが、動脈瘤の発症の治療／予防に効果があるものと予測し、検討した結果、ＦＧＦ－Ｒ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤及びＰＩ３Ｋ阻害剤による動脈瘤の発症の治療／予防効果が確認された。したがって、前記「ＡＨＮＡＫ阻害剤に関連する薬剤」には、ＦＧＦ－Ｒ阻害剤（例えば、フチバチニブ、ペミガチニブ、E7090、ソラフェニブ、ポナチニブ、インフィグラチニブ、ニンテダニブ、パゾパニブ、PD173074、ドビチニブ、AZD4547、ダヌセルチブ、レンパチニブ(E7080)、ブリバニブ、MK-2461、チルホスチン AG 1296、SSR128129E、R1530、FIIN-3、ルシタニブ、スルファチニブ、ODM-203、ASP5878、デラザンチニブ、ニンテダニブエタン、H3B-6527、ロブリチニブ (FGF401)、PRN1371、PD166866、フィソガチニブ、S49076、NSC12、ON123300、SU5402、BLU9931、FIIN-2、Zoligratinib、LY2874455、フェルラ酸、マシチニブ、BO-264、SKLB 610、アロファニブ、Gambogenic acid、エルダフィチニブ、これらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、及び誘導体等）、ＰＫＣ阻害剤（例えば、H-7、エンザスタウリン、GSK690693、ファスジル、ミトキサントロン、スタウロスポリン、Go 6983、ビシンドリルマレイミド I 、ビシンドリルマレイミドIX、ダフネチン、デカリニウム、A-3、n-デスメチルタモキシフェン、ビシンドリルマレイミドVIII、H-1152、HA-100、Rottlerin、ビシンドリルマレイミドIV、VTX-27、バルルビシン、ML-7、ルボキシスタウリン、ミドスタウリン、Go6976、Chelerythrine、イプシロン-V1-2、N-デスメチルタモキシフェン、ハイポクレリンA、ヒペリシン、オンクラシン-1、Darovasertib、TAS-301、2-メトキシ-1,4-ナフトキノン、ケルセチン、ミリシトリン、メチル－ヘスペリジン、これらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、及び誘導体等）及びＰＩ３Ｋ阻害剤（例えば、LY294002、イデラリシブ、コパンリシブ、アルペリシブ、デュベリシブ、ブパリシブ、ダクトリシブ、レニオリシブ、ネミラリシブ、パルサクリシブ、ピクチリシブ、アピトリシブ、ジェダトリシブ、オミパリシブ、デザペリシブ、ビミラリシブ、サモトリシブ、タセリシブ、エガネリシブ、イナボリシブ、これらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、及び誘導体等）が包含される。ここで、ＦＧＦ－Ｒ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤及びＰＩ３Ｋ阻害剤は、列挙される化合物に限定されず、それぞれＦＧＦ－Ｒ、ＰＫＣ、ＰＩ３Ｋを阻害する作用を有することが知られる化合物であれば、他の生理活性を有するか否かに関わらず、いずれも包含する。
　図４に示す通り、ＩＰＡにより、ＡＨＮＡＫ遺伝子の変異が、Ｕ２ＡＦ２、並びにその下流で作用するＮＦκＢ２を介する炎症反応のシグナル伝達に関与することが明らかとなった。ＮＦκＢ２は、転写因子の１つであり、炎症性サイトカイン等の発現を亢進することが知られる。ＮＦκＢ２は、血管拡張作用を有するプロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）の発現亢進にも作用することが知られている。Ｕ２ＡＦ２遺伝子は、乳癌、大腸がん、肺癌、前立腺癌等で発現する癌関連遺伝子として知られる遺伝子であり、Ｕ２ＡＦ２タンパク質は、Ｕ２ＡＦ１タンパク質と複合体を形成し、スプライシングに関与することが知られている。ＡＨＮＡＫ遺伝子の変異により、Ｕ２ＡＦ２、並びにその下流で作用するＮＦκＢ２を介する相互作用が、炎症反応と細胞の異常増殖を亢進し、動脈瘤を発症させ得るものと推測される。したがって、「ＡＨＮＡＫに関連する薬剤」としては、ＦＧＦ－Ｒ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤及びＰＩ３Ｋ阻害剤の他に、例えば、Ｕ２ＡＦ２を標的とする阻害剤（例えば、抗ヒトＵ２ＡＦ２モノクローナル抗体又はその結合性断片であって、且つ、Ｕ２ＡＦ１との結合活性を低減させるものや、Ｕ２ＡＦ１／Ｕ２ＡＦ２複合体のスプライス活性を低減させるもの、Ｕ２ＡＦ２のｍＲＮＡ配列を標的とするｓｉＲＮＡ、Ｕ２ＡＦ２タンパク質の活性の異常な亢進に起因して生じる癌に対する抗癌剤等）、ＮＦκＢ２を標的とする阻害剤（例えば、TPCA1, BOT-64, BMS345541, Amlexanox, SC-514, IMD0354, IKK-16, BAY 11-7082, MG-115, MG-132, Lactacystin, Epoxomicin, Parthenolide, Carfilzomib, MLN-4924, JSH-23, Rolipram, Gallic acid, Anacardic acid, GYY 4137, p-XSC, LY 294002, Wortmannin, Quinacrine, Mesalamine, CV 3988, Flavopiridol, BAY 11-7082, JSH-23, QNZ, SC75741, Pyrrolidinedithiocarbamate ammonium、これらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、及び誘導体等）が挙げられる。あるいは、特定の変異を有する又は変異を有しないＡＨＮＡＫ遺伝子を標的とする、ｓｉＲＮＡ等の遺伝子治療薬を使用することもできる。なお、ＡＨＮＡＫに関連する薬剤は、ＡＨＮＡＫの変異に起因する過剰な炎症反応及び／又は細胞の異常増殖を抑制し得る薬剤であればよく、本発明は、使用する薬剤を上記の薬剤に限定することを意図するものではない。
　本発明の医薬組成物が投与される対象は、ヒト、チンパンジーを含む霊長類、イヌ、ネコなどのペット動物、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギなどの家畜動物、マウス、ラットなどの齧歯類、動物園で飼育される動物などの哺乳動物であり、好ましくは、ヒトである。より好ましくは、動脈瘤を有するヒト（「動脈瘤患者」とも称する）である。最も好ましくは、脳動脈瘤を有するヒト（「脳動脈瘤患者」とも称する）である。
　投与対象がヒトの場合、特に以下の遺伝子変異のうち、いずれかの変異を有するヒトを対象とすることが好ましい。
　ＰＤＧＦＲβ：配列番号２で表されるアミノ酸配列のうち、ｐ．５５９＿５６２ｄｅｌ、ｐ．Ｙ５６２Ｎ、ｐ．Ｙ５６２Ｓ、ｐ．Ｙ５６２Ｄ、及びｐ．５６３＿５６４ｄｅｌで表される変異；並びに
　ＡＨＮＡＫ：配列番号１６で表されるアミノ酸配列のうち、ｐ．Ｄ１０８３Ｓｆｓ＊６、ｐ．Ａ２１１４Ｔ、ｐ．Ｇ３８１９Ａ、ｐ．Ｎ３８２７Ｓ、ｐ．Ｅ３８５０Ｋ、ｐ．Ａ４０４６Ｖ、ｐ．Ｄ４７０１Ｅ及びｐ．Ｈ５８１７Ｒｆｓ＊２０で表される変異。
　本発明の医薬組成物は、ＰＤＧＦＲβに関連する薬剤、及び／又は、ＡＨＮＡＫに関連する薬剤（以下、単に「薬剤」とも称する）を有効成分として含む。本発明の医薬組成物は、ＰＤＧＦＲβに関連する薬剤として、好適にはチロシンキナーゼ阻害剤を有効成分として含む。あるいは、本発明の医薬組成物は、ＡＨＮＡＫに関連する薬剤として、好適には、ＦＧＦ－Ｒ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤及び／又はＰＩ３Ｋ阻害剤を有効成分として含む。本発明の医薬組成物において、医薬組成物中の有効成分である薬剤の含有量は、薬剤の作用効果及び安定性、医薬組成物の剤形、使用する担体の種類、及び投与方法、投与する対象の状態等の様々な条件によって異なる。これらは、当該分野の公知技術に基づいて適宜選択すればよい。
　本発明の医薬組成物は、必要に応じてさらに製薬上許容可能な担体を含むことができる。「製薬上許容可能な担体」とは、製剤技術分野において通常使用する添加剤をいう。例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、滑沢剤等が挙げられる。
　賦形剤としては、単糖、二糖類、シクロデキストリン及び多糖類のような糖（より具体的には、限定はしないが、グルコース、スクロース、ラクトース、ラフィノース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストリン、マルトデキストリン、デンプン及びセルロースを含む）、金属塩（例えば、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム若しくはリン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム）、クエン酸、酒石酸、グリシン、低、中、高分子量のポリエチレングリコール（PEG）、プルロニック（登録商標）、カオリン、ケイ酸、あるいはそれらの組み合わせが例として挙げられる。
　結合剤としては、トウモロコシ、コムギ、コメ、若しくはジャガイモのデンプンを用いたデンプン糊、単シロップ、グルコース液、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セラック及び／又はポリビニルピロリドン等が例として挙げられる。
　崩壊剤としては、前記デンプンや、乳糖、カルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、アルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド又はそれらの塩が例として挙げられる。
　充填剤としては、前記糖及び／又はリン酸カルシウム（例えば、リン酸三カルシウム、若しくはリン酸水素カルシウム）が例として挙げられる。
　乳化剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルが例として挙げられる。
　流動添加調節剤及び滑沢剤としては、ケイ酸塩、タルク、ステアリン酸塩又はポリエチレングリコールが例として挙げられる。
　このような担体は、主として前記剤形形成を容易にし、また剤形及び薬理効果を維持するために用いられるものであり、必要に応じて適宜使用すればよい。上記の添加剤の他、必要であれば矯味矯臭剤、可溶化剤、懸濁剤、希釈剤、界面活性剤、安定剤、吸収促進剤、増量剤、付湿剤、保湿剤、吸着剤、崩壊抑制剤、コーティング剤、着色剤、保存剤、抗酸化剤、香料、風味剤、甘味剤、緩衝剤等を含むこともできる。
　本発明の医薬組成物は、薬剤の薬理効果を失わない範囲において、他の薬剤を含有することもできる。例えば、注射剤の場合であれば、抗生物質を所定量含有していても良い。
　本発明の医薬組成物の剤形は、有効成分である薬剤、及び他の付加的な有効成分を不活化させない形態であれば特に限定しない。例えば、液体、固体又は半固体のいずれであってもよい。具体的な剤形としては、例えば、液剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、舌下剤、トローチ剤等の経口剤形又は注射剤、懸濁剤、乳剤、点眼剤、点鼻剤、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、シップ剤及び座剤等の非経口剤形が挙げられる。チロシンキナーゼ阻害剤を含む場合、剤形は経口剤形であることが好ましい。
　本発明の医薬組成物は、含有される有効成分が失活しないあらゆる適当な方法で投与することができる。例えば、経口又は非経口（例えば、注射、エアロゾル、塗布、点眼、点鼻）のいずれであってもよい。好ましくは、経口投与である。
　本発明の医薬組成物は、有効成分である薬剤を、動脈瘤の治療及び／又は予防に効果的で、かつ、重篤な副作用が生じない量で含むことが好ましい。例えば、有効成分、すなわち薬剤の投与量の合計０．０００１～５０ｍｇ／ｋｇ体重／日のうち、適切な投与量となるように構成されることが好ましい。ＰＤＧＦＲβに関連するチロシンキナーゼ阻害剤の既存の医薬組成物における有効成分の投与量は、経口投与で約０．１～５ｍｇ／ｋｇ体重／日であるが、本発明の医薬組成物もこれに準じた投与量としてもよい。
＜診断補助方法＞
　本発明の動脈瘤の診断補助方法は、以下の工程を含むことを特徴とする。
－動脈瘤を有する対象から採取した試料中のＰＤＧＦＲβ遺伝子及びＡＨＮＡＫ遺伝子のうち、少なくとも１つの遺伝子の変異を検出する工程、及び
－前記対象に対する、ＰＤＧＦＲβに関連する薬剤又はＡＨＮＡＫに関連する薬剤による治療及び／又は予防効果を予測する工程。
　より具体的には、本発明の動脈瘤の診断補助方法は、さらに以下を含む。
　－前記試料中に特定の変異を有するＰＤＧＦＲβ遺伝子が検出可能なレベルで存在することが確認された場合に、ＰＤＧＦＲβに関連する薬剤（特にチロシンキナーゼ阻害剤）が対象の動脈瘤の治療に有効であると予測すること、又は
　－前記試料中に特定の変異を有するＡＨＮＡＫ遺伝子が検出可能なレベルで存在することが確認された場合に、ＡＨＮＡＫに関連する薬剤が対象の動脈瘤の治療に有効であると予測すること。
　ここでいう「検出可能なレベル」は、例えば、予め設定された閾値以上、あるいは、ネガティブコントロールと比較して有意に高いレベルとすることができるが、特に限定されない。
　本発明の動脈瘤の診断補助方法は、特に限定されないが、変異陽性細胞から遊離して血液中を循環する微粒子である、腫瘍由来循環ＤＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　ｔｕｍｏｒ　ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ））等の血中遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、エクソソーム、マイクロＲＮＡ、タンパク質等を測定する方法を含むことができる。
　上記の通り、動脈瘤の発症にはＰＤＧＦＲβ遺伝子の体細胞変異が関連することが明らかとなり、ＰＤＧＦＲβ遺伝子の体細胞変異を有する動脈瘤患者においては、チロシンキナーゼ阻害剤がその治療及び／又は予防に有効であることも明らかとなった。中でも、動脈瘤を有する対象から取り出した血管組織検体等の試料において、検出可能なレベルでＰＤＧＦＲβの体細胞変異が存在する場合、特にチロシンキナーゼの効果が高いことが予測できる。
　動脈瘤には、ＡＨＮＡＫ遺伝子の体細胞変異も関連することが明らかとなった。ＡＨＮＡＫ遺伝子の体細胞変異を有する動脈瘤患者は、ＡＨＮＡＫに関連する薬剤、特にＦＧＦ－Ｒ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤及び／又はＰＩ３Ｋ阻害剤の治療効果が高いことが予測できる。
　上記の通り、本発明の診断補助方法は、動脈瘤の非外科的治療、より具体的には薬物療法の前に、投与対象の患者における治療効果を予測することを可能とする。
　本発明の診断補助方法において、「対象」は、ヒト、チンパンジーを含む霊長類、イヌ、ネコなどのペット動物、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギなどの家畜動物、マウス、ラットなどの齧歯類、動物園で飼育される動物などの哺乳動物であり、好ましくは、ヒトである。最も好ましくは、動脈瘤を有する、又は動脈瘤治療後のヒトである。具体的な例としては、非外科的治療前の動脈瘤患者又は外科的治療後の経過観察中の患者が挙げられる。
　本発明の診断補助方法において、「試料」は、動脈瘤を有する対象から取り出された試料であって、血液（血漿及び血清を含む）、リンパ液、尿、唾液、汗、組織液、体腔液、脳脊髄液等の体液及び脳血管組織等の組織から適宜選択することができる。
　上記試料の中でも、感度よく目的とする体細胞変異を検出するために、動脈瘤を罹患した部分の血管組織（対象から取り出したもの）を使用することもできる。血管組織を試料とする場合、本発明の診断補助方法は、多くは動脈瘤の再発予防効果予測、又は再発時の治療効果予測に有用である。
　体液試料としては、正常細胞を含まないものが好ましく、血漿、血清又は脳脊髄液を好適に使用できる。血漿又は血清には、体細胞変異を有する異常細胞由来の核酸が含まれることが知られ、血漿又は血清中より目的とする体細胞変異を検出することで、ＰＤＧＦＲβに関連する薬剤又はＡＨＮＡＫに関連する薬剤による、治療及び／又は予防の効果を予測することが可能である。体液試料を使用する場合、本発明の診断補助方法は、外科的処置を受けた対象に限られず、例えば、経過観察中の無症候の対象についても適用でき、再発予防効果予測、再発時の治療効果予測に限られず、非外科的治療の効果予測に使用することができる。
　本発明の診断補助方法において、ＰＤＧＦＲβ遺伝子の変異を検出する場合、特に、配列番号２で表されるアミノ酸配列のｐ．５５９＿５６２ｄｅｌ、ｐ．Ｙ５６２Ｎ、ｐ．Ｙ５６２Ｓ、ｐ．Ｙ５６２Ｄ、及びｐ．５６３＿５６４ｄｅｌで表される変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を検出することが好ましい。ＡＨＮＡＫ遺伝子の変異を検出する場合は、配列番号１６で表されるアミノ酸配列のｐ．Ｄ１０８３Ｓｆｓ＊６、ｐ．Ａ２１１４Ｔ、ｐ．Ｇ３８１９Ａ、ｐ．Ｎ３８２７Ｓ、ｐ．Ｅ３８５０Ｋ、ｐ．Ａ４０４６Ｖ、ｐ．Ｄ４７０１Ｅ及びｐ．Ｈ５８１７Ｒｆｓ＊２０で表される変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を検出することが好ましい。
　変異遺伝子の検出は、特に限定されないが、例えば、試料に含まれるＰＤＧＦＲβ遺伝子又はＡＨＮＡＫ遺伝子のｍＲＮＡを解析することを含む。この場合、試料中のＴｏｔａｌＲＮＡから、ＰＤＧＦＲβ遺伝子又はＡＨＮＡＫ遺伝子のｃＤＮＡを調製し、ＲＦＬＰ法、ＳＳＣＰ法、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ法、一塩基伸長法、Ｉｎｖａｄｅｒ法、質量分析法、ＤＮＡアレイ法、パイロシーケンス法、次世代シーケンサー等の既存の方法で解析する方法をとり得る。これらに加えて、またはこれらに代えて、標的となる遺伝子変異に対するＤＳで、低頻度変異の検出を行ってもよい。
　本発明の診断補助方法は、試料から検出された目的の遺伝子変異に基づいて、チロシンキナーゼ阻害剤の治療及び／又は予防効果の予測を行う工程を備える。例えば、定性的には、目的とする遺伝子変異が検出可能であった場合は、チロシンキナーゼ阻害剤の効果が高い、と予測する。また、例えば、定量的には、目的とする遺伝子変異と正常遺伝子の量比を算出し、遺伝子変異が一定以上の割合で存在する場合は、チロシンキナーゼ阻害剤の効果が高い、と予測する。予測判定は、予め判断基準を設定して行ってもよいが、例えば、過去の予測データと実際の治療成績データとを教師データとして、既存のニューラルネットワークを用いた機械学習を経て構築された人工知能（artificial intelligence：ＡＩ）を用いて行ってもよい。
＜治療及び／又は予防方法＞
　本発明の動脈瘤の治療及び／又は予防方法は、以下のｉ）～ｉｉｉ）のいずれかの薬剤の対象への投与を含むことを特徴とする。
　ｉ）血小板増殖因子受容体β（ＰＤＧＦＲβ）を標的とする薬剤；
　ｉｉ）デスモヨーキン（ＡＨＮＡＫ）の機能を阻害する薬剤；及び
　ｉｉｉ）ＰＤＧＦＲβ又はＡＨＮＡＫの変異により亢進されるシグナル伝達を阻害する薬剤。
　本発明の治療及び／又は予防方法の対象は、ヒト、チンパンジーを含む霊長類、イヌ、ネコなどのペット動物、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギなどの家畜動物、マウス、ラットなどの齧歯類、動物園で飼育される動物などの哺乳動物であり、好ましくは、ヒトである。最も好ましくは、動脈瘤を有するヒト（「動脈瘤患者」とも称する）である。
　投与対象がヒトの場合、特に以下の遺伝子変異のうち、いずれかの変異を有するヒトを対象とすることが好ましい。
　ＰＤＧＦＲβ：配列番号２で表されるアミノ酸配列のうち、ｐ．５５９＿５６２ｄｅｌ、ｐ．Ｙ５６２Ｎ、ｐ．Ｙ５６２Ｓ、ｐ．Ｙ５６２Ｄ、及びｐ．５６３＿５６４ｄｅｌで表される変異；
　ＡＨＮＡＫ：配列番号１６で表されるアミノ酸配列のうち、ｐ．Ｄ１０８３Ｓｆｓ＊６、ｐ．Ａ２１１４Ｔ、ｐ．Ｇ３８１９Ａ、ｐ．Ｎ３８２７Ｓ、ｐ．Ｅ３８５０Ｋ、ｐ．Ａ４０４６Ｖ、ｐ．Ｄ４７０１Ｅ及びｐ．Ｈ５８１７Ｒｆｓ＊２０で表される変異； 
　本発明の治療及び／又は予防方法は、ＰＤＧＦＲβに関連する薬剤及び／又はＡＨＮＡＫに関連する薬剤の対象への投与を含む。ＰＤＧＦＲβに関連する薬剤は、好適にはチロシンキナーゼ阻害剤である。本発明の治療及び／又は予防方法において、薬剤の投与量は、作用効果及び安定性、剤形、使用する担体の種類、及び投与方法、投与する対象の状態等の様々な条件によって異なる。これらは、当該分野の公知技術に基づいて適宜選択すればよい。
　本発明の治療及び／又は予防方法において、上記の薬剤に加えて他の薬剤を併用してもよい。例えば、抗生物質を併用してもよい。
　本発明の治療及び／又は予防方法において、有効成分である薬剤投与時の剤形は、薬剤自体及び他の付加的な有効成分を不活化させない形態であれば特に限定しない。例えば、液体、固体又は半固体のいずれであってもよい。具体的な剤形としては、例えば、液剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、舌下剤、トローチ剤等の経口剤形又は注射剤、懸濁剤、乳剤、点眼剤、点鼻剤、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、シップ剤及び座剤等の非経口剤形が挙げられる。チロシンキナーゼ阻害剤を投与する場合、剤形は経口剤形とすることが好ましい。
　本発明の治療及び／又は予防方法における投与方法は、投与する有効成分が失活しないあらゆる適当な方法をとりうる。例えば、経口又は非経口（例えば、注射、エアロゾル、塗布、点眼、点鼻）のいずれであってもよい。好ましくは、経口投与である。
　本発明の治療及び／又は予防方法は、有効成分である薬剤を、動脈瘤の治療及び／又は予防に効果的で、かつ、重篤な副作用が生じない量で投与することが好ましい。例えば、有効成分、すなわち薬剤の投与量の合計は、０．０００１～５０ｍｇ／ｋｇ体重／日とすることができる。さらに、上記範囲内でより適切な投与量とすることができる。ＰＤＧＦＲβを標的とするチロシンキナーゼ阻害剤の既存の市販医薬品は、主に悪性腫瘍の治療に使用され、有効成分のヒトへの投与量は、経口投与で約０．１～３ｍｇ／ｋｇ体重／日である。また、ＦＧＦ－Ｒ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤及びＰＩ３Ｋ阻害剤は、主に悪性腫瘍治療薬として市販・開発されており、市販医薬品及び開発中の医薬品の有効成分の投与量は、約０．１～５ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲内にある。本発明の治療及び／又は予防方法において、薬剤の合計投与量は、市販医薬品又は開発中の医薬品に準じた量としてもよいが、より少ない投与量としてもよい。例えば、０．０００１～２．５ｍｇ／ｋｇ体重／日、０．００１～２．５ｍｇ／ｋｇ体重／日、０．０１～２．５ｍｇ／ｋｇ体重／日、０．１～２．５ｍｇ／ｋｇ体重／日、０．０００１～０．５ｍｇ／ｋｇ体重／日、０．００１～０．５ｍｇ／ｋｇ体重／日、０．０１～０．５ｍｇ／ｋｇ体重／日、０．０００１～０．０５ｍｇ／ｋｇ体重／日又は０．００１～０．０５ｍｇ／ｋｇ体重／日とすることができる。動脈瘤の治療及び／又は予防においては、上記の有効成分の投与量について、悪性腫瘍治療のための投与量よりも少なくとも十分な治療／予防効果が得られることが想定される。薬剤の副作用の低減、治療／予防コストの低減等の点から、より少ない量で高い効果が得られることは、非常に重要な利点である。
＜薬剤の動脈瘤治療効果の判定方法＞
　本発明の薬剤の動脈瘤治療効果の判定方法（以下、単に「判定方法」とも称する）の一態様は、以下の工程ｂ）～ｄ）を含む、ことを特徴とする。
　ｂ）ヒト細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏで薬剤と接触させる工程；
　ｃ）工程ｂ）の細胞について、のリン酸化細胞外シグナル調節キナーゼ（ｐ－ＥＲＫ）量及び／又はリン酸化チロシン量を測定する工程；及び
　ｄ）工程ｃ）の測定値から前記薬剤の動脈瘤治療効果を予測する工程、
　を含む、方法。
　あるいは、本発明の判定方法の他の態様は、以下の工程ａ’）～ｄ’）を含む、ことを特徴とする。
　ａ’）変異を有するＰＤＧＦＲβ遺伝子を導入したヒト細胞を調製する工程；
　ｂ’）前記細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏで薬剤と接触させる工程；
　ｃ’）工程ｂ’）の細胞について、リン酸化細胞外シグナル調節キナーゼ（ｐ－ＥＲＫ）量及び／又はリン酸化チロシン量を測定する工程；及び
　ｄ’）工程ｃ’）の測定値から前記薬剤の動脈瘤治療効果を予測する工程、
　を含む、方法。
　本発明によれば、動脈瘤治療効果が不明な薬剤について、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでその治療効果を判定することが可能である。特に、動脈瘤治療薬のスクリーニングに有用な判定方法となり得る。
　工程ａ’）　変異ＰＤＧＦＲβ遺伝子導入細胞の調製
　本発明の判定方法は、ａ’）変異を有するＰＤＧＦＲβ遺伝子を導入したヒト細胞を調製する工程を含んでもよい。本工程で使用する、「変異を有するＰＤＧＦＲβ遺伝子を導入したヒト細胞」（以下、「ＰＤＧＦＲβ変異細胞」とも称する）は、変異を有するＰＤＧＦＲβ遺伝子（以下「変異ＰＤＧＦＲβ遺伝子」とも称する）を、公知の任意の方法で導入することで調製することができる。使用するヒト細胞としては、特に限定されず公知のヒト細胞株をいずれも使用可能である。特に、不死化細胞であることが好ましく、例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＵＶＥＣ細胞等を使用することができる。
　前記ＰＤＧＦＲβ遺伝子の変異は、配列番号２で表されるアミノ酸配列のｐ．５５９＿５６２ｄｅｌ、ｐ．５６３＿５６４ｄｅｌ、ｐ．Ｙ５６２Ｎ、ｐ．Ｙ５６２Ｓ、ｐ．及びＹ５６２Ｄの変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異に対応する変異であることが好ましい。すなわち、配列番号１で表される塩基配列において、ｃ．１６８４Ｔ＞Ａ（ｐ．Ｙ５６２Ｎ）、ｃ．１６８４Ｔ＞Ｇ（ｐ．Ｙ５６２Ｄ）、ｃ．１６８５Ａ＞Ｃ（ｐ．Ｙ５６２Ｓ）、ｃ．１６７５＿１６８６ｄｅｌ（ｐ．５５９＿５６２ｄｅｌ）、及びｃ．１６８７＿１６９２ｄｅｌ（ｐ．５６３＿５６４ｄｅｌ）のうち、少なくとも１つの変異を有するＰＤＧＦＲβ遺伝子であることが好ましい。このような変異遺伝子（核酸、好ましくはＤＮＡ）は、化学合成法、ＰＣＲ法等の公知の方法を用いて調製することができる。なお、ここでいう「ＰＤＧＦＲβ遺伝子」は、配列番号１で表される塩基配列全長に相当する長さを有する必要はなく、目的の変異部分を含み、かつ、チロシンキナーゼ活性を保持するタンパク質をコードしていれば、配列番号１で表される塩基配列の一部を有する核酸断片であってもよい。
　目的の変異をコードするＤＮＡは、公知の遺伝子発現ベクターを用いてヒト細胞に導入することができる。遺伝子発現ベクターは、少なくとも、プロモーターと、その下流域に目的とする変異ＰＤＧＦＲβ遺伝子を含み、ヒト細胞において、ＰＤＧＦＲβ変異体を発現することができる。本明細書において「発現可能な状態」とは、プロモーターの制御下にあるプロモーター下流域に、発現すべき遺伝子を配置していることをいう。本工程に使用可能な遺伝子発現ベクターは、変異ＰＤＧＦＲβ遺伝子を発現可能な状態で含むベクターであり、体細胞において変異ＰＤＧＦＲβ遺伝子を発現することができる。
　前記遺伝子発現ベクターとして使用可能なベクターは、体細胞においてＰＤＧＦＲβ変異体を発現し得るものであれば、特に限定しない。例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター、及び人工染色体ベクターが例示される。遺伝子発現ベクターとして使用可能なウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター等が例示される。遺伝子発現ベクターとして使用可能なプラスミドベクターとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）、放線菌由来のプラスミド（ｐＩＪ４８６等）、枯草菌由来のプラスミド（ｐＵＢ１１０、ｐＳＨ１９等）、酵母由来のプラスミド（ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、Ｙｃｐ５０等）の他、市販のベクターを利用することができる。遺伝子発現ベクターとして使用可能な人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ、ＰＡＣ）等が例示される。
　遺伝子発現ベクターが包含するプロモーターとしては、例えば、ＣＭＶプロモーター（ＣＭＶ－ＩＥプロモーター）、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＨＳＶ－ＴＫプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、Ｕｂプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ＳＲαプロモーター、又はＣＡＧプロモーター等が挙げられる。この他、温度によって制御可能なヒートショックプロモーターや、テトラサイクリンの有無によって制御可能なテトラサイクリン応答性プロモーター等の誘導性プロモーターも例示される。
　その他、選択マーカー遺伝子、レポーター遺伝子、制御配列（発現制御配列、イントロン配列、ヌクレアーゼ認識配列、複製起点配列）等が含まれていてもよい。発現制御配列としては、エンハンサー、リボソーム結合配列、ターミネーター、ポリＡ付加シグナル等の発現制御配列が例示される。ヌクレアーゼ認識配列としては、制限酵素認識配列、Ｃｒｅ組換え酵素によって認識されるｌｏｘＰ配列、ＺＦＮやＴＡＬＥＮ等の人工ヌクレアーゼの標的となる配列、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの標的となる配列が例示される。複製起点配列としては、ＳＶ４０複製起点配列が例示される。
　遺伝子発現ベクターが包含し得る選択マーカー遺伝子は、前記遺伝子発現ベクターが導入された体細胞を選択することができる選択マーカー遺伝子である。選択マーカー遺伝子の具体例としては、例えばアンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、又はハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。
　本工程において、遺伝子発現ベクターが包含し得るレポーター遺伝子は、遺伝子発現ベクターが導入された体細胞を識別可能なレポーターをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子としては、例えば、ＧＦＰやＲＦＰ等の蛍光タンパク質をコードする遺伝子や、ルシフェラーゼ遺伝子等が例示される。
　上記の遺伝子発現ベクターをヒト細胞に導入する手法としては、特に限定されず、遺伝子導入ベクターの種類（プラスミドベクター、ウイルスベクター等）に応じて、導入方法を適宜選択することができる。例えば、ウイルス感染、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ法によって、変異ＰＤＧＦＲβ遺伝子を細胞に導入することができる。
　ＰＤＧＦＲβ変異細胞は、動物細胞培養に適した公知の培地で培養することが可能である。このような培地としては、ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、グラスゴーＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ　Ｚｉｎｃ　Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’Ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’Ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、Ｅａｇｌｅ　ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ハムＦ１０培地、ハムＦ１２培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの混合培地を例示できるが、特に限定されない。
　培養容器は、プレート、ディッシュ、フラスコ等の既存の培養容器をいずれも使用できる。培養条件は、特に限定しないが、通常、３７℃、５％雰囲気下で実施される。培養期間は、特に限定されないが、１０～７２時間程度、特に、１２～２４時間程度とすることができる。
　工程ｂ）又は工程ｂ’）　薬剤接触工程
　本発明の判定方法は、前記細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏで薬剤と接触させる工程を含む。本工程においては、ヒト細胞培養液又は工程ａ’）の培養液に目的の薬剤を添加することを要する。薬剤添加時あるいは薬剤添加直前に培地交換を行ってもよい。目的の薬剤は、動脈瘤への治療効果判定を要する薬剤であれば、特に限定されない。目的の薬剤は、例えば、ＰＤＧＦＲβと何らかの関連があることが知られる薬剤であってもよく、例えば、既知のチロシンキナーゼ阻害剤であってもよい。培地への薬剤の添加は、例えば、目的の薬剤を水又はＤＭＳＯ等の溶媒に高濃度で溶解したストック溶液を調製してこれを培地に添加することで実施できる。培地に添加する薬剤の濃度は、使用する薬剤の溶解度、治療等に有効な濃度、毒性等によって適宜決定できるが、例えば、１ｎＭ～１０００ｎＭ又は１０ｎＭ～１００ｎＭ程度とすることができる。本工程においては、薬剤を多様な濃度で含む複数種の培地、又は薬剤を含む、及び含まない２種類の培地を用いて細胞培養を行うことが好ましい。
　細胞と薬剤との接触は、細胞を含む培地に薬剤を添加した後、好適には３７℃、５％ＣＯ２条件下で静置することで行われる。静置時間は特に限定されないが、例えば、５分間～４時間、特に１～３時間程度とすることができる。
　工程ｃ）及び工程ｃ’）　リン酸化ＥＲＫ量及び／又はリン酸化チロシン量測定工程
　本発明の判定方法は、工程ｂ）又は工程ｂ’）の細胞中のリン酸化ＥＲＫ（ｐ－ＥＲＫ）量及び／又はリン酸化チロシン（ｐ－Ｔｙｒ）量を測定する工程を含む。本工程は、たとえは、以下の手順をとり得る。培養液から培地を除き残存する細胞について、氷冷上で溶解液（例えば、ＲＩＰＡバッファー）による溶解処理を行い、タンパク質溶液を得る。得られた溶液中のｐ－ＥＲＫ及び／又はｐ－Ｔｙｒを、ウエスタンブロット、イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ等）、質量スペクトル等の既知のタンパク質測定法で定量する。ウエスタンブロット、イムノアッセイは、抗ｐ－ＥＲＫ抗体及び／又は抗ｐ－Ｔｙｒ抗体を使用して実施することができる。
　工程ｄ）又は工程ｄ’）　動脈瘤治療効果予測工程
　本発明は、工程ｃ）又は工程ｃ’）で得られたｐ－ＥＲＫ量及び／又はｐ－Ｔｙｒ量の測定値から前記薬剤の動脈瘤治療効果を予測する工程を含む。ＥＲＫは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達経路の１つであるＥＲＫ経路に関連するタンパク質であり、細胞の増殖や分化等に関与することが知られる。ＥＲＫ経路において、シグナル伝達にはＥＲＫのリン酸化が関与するが、このリン酸化が過剰となると、細胞の異常増殖等が誘発されることが知られる。本発明者は、上記の変異ＰＤＧＦＲβ遺伝子を導入した細胞において、ＥＲＫのリン酸化が亢進することを確認した。さらに、複数の薬剤の存在下で、ｐ－ＥＲＫの量が野生型ＰＤＧＦＲβ遺伝子を導入した細胞と同レベルまで顕著に低下することを確認した。したがって、本工程は、測定したｐ－ＥＲＫ量が予め設定した値を下回るか、薬剤濃度依存的に低下するか、あるいは薬剤なしの条件で培養した細胞よりも顕著に低い値となるかを確認し、これらのいずれかを満たす場合に、目的の薬剤が動脈瘤治療効果を有すると予測することを含む。
　本発明者は、上記の変異ＰＤＧＦＲβ遺伝子を導入した細胞において、チロシンのリン酸化が亢進すること、すなわち、当該変異がチロシンキナーゼ活性そのものを顕著に亢進することを確認した。本工程は、ｐ－ＥＲＫ量と共に、あるいはこれに代えて、ｐ-Ｔｙｒ量を測定することを含む。この場合、本工程は、測定したｐ－Ｔｙｒ量が予め設定した値を下回るか、薬剤濃度依存的に低下するか、あるいは薬剤なしの条件で培養した細胞よりも顕著に低い値となるかを確認し、これらのいずれかを満たす場合に、目的の薬剤が動脈瘤治療効果を有すると予測することを含む。
　以下、実施例を提示して、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明を実施例の範囲に限定することを意図するものではない。
＜参考例１：脳動脈瘤の脳底動脈組織における体細胞変異の解析＞
１．脳動脈瘤患者由来試料の採取
　嚢状動脈瘤（ＳＣＡ）又は紡錘状動脈瘤（ＦＣＡ）のいずれかを有する脳動脈瘤（ＣＡ）と診断され、脳動脈瘤の動脈のクリッピング及び／又は再建のための外科的手術を受けた患者６９症例から、血液試料を採取した。脳底動脈組織試料は、手術時に摘出した組織片を使用した。患者は、ＣＡの家族歴が陰性で、かつ、遺伝性の血管性疾患の既往歴がない者とした。採取した組織試料及び血液試料は、液体窒素で急速冷凍した後、－８０℃で保存した。
２．全エクソーム解析
　各症例の脳底動脈組織試料と血液試料よりＤＮＡを精製した。Ｃｏｖａｌｉｓで断片化した後、リンパ球正常ＤＮＡ３０～５０ｎｇを用いて、ＫＡＰＡ　ＨｙｐｅｒＰｒｅｐ　Ｋｉｔ（Ｋａｐａ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でライブラリを作成した。エクソームの捕捉はＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ　Ｈｕｍａｎ　Ａｌｌ　Ｅｘｏｎ　Ｖ６（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行った。配列決定は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ　ＨｉＳｅｑ２５００　ＳＢＳ　Ｖ４を用いて、１２５ｂｐの対の読み取り値で実施した。シーケンスの平均の深さは、ＣＡで１２６倍、正常リンパ球ＤＮＡで１００倍とした。
３．標的ディープシーケンシングによる標的配列決定
　ＣＡにおける低変異型対立遺伝子頻度（ＶＡＦ）変異の検証と検出のために、全エクソーム配列決定により変異が検出された遺伝子、又は、ＣＡ又は脳血管疾患と関連がある遺伝子の計６５遺伝子について、全コード領域を標的とするＲＮＡ捕捉プローブ（ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ）を作成した。分子バーコードを備えたＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ　ＸＴ　ｌｏｗ　ｉｎｐｕｔ　Ｒｅａｇｅｎｔを使用して、５０ｎｇのｃＤＮＡから配列ライブラリを構築した。ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ　ＸＴ　Ｔａｒｇｅｔ　Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　Ｓｙｓｔｅｍによって標的捕捉を行った。標的捕捉ライブラリについて、ＨｉＳｅｑ２５００を用いて、１２５ｂｐの対の読み取り値で配列決定した。分子バーコードを調整して重複を除去した後の標的領域の平均の深さは１５００倍であった。
４．ＷＥＳデータとＤＳデータを用いた変異コール
　ＷＥＳデータについて、Ｇｅｎｏｍｏｎパイプライン（https://Genomon-project.github.io/GenomonPages/）を用いて体細胞変異を抽出した。ＢＷＡ－ＭＥＭを用いて、参照ヒトゲノムＧＲＣｈ３７上にペアエンド読み取りをマッピングし、ＰＣＲ複製物を、ｂｉｏｂａｍｂａｍを用いてマーキングした。体細胞性ＳＮＶ及びインデルを、ＣＡ及び血液組織のペアを比較してコールした。フィッシャーの直接確率検定を用いて、以下の指標でデータのフィルタリングを行った：ＣＡ組織及び血液試料の両方における読み取り深さ、８以上；塩基クオリティスコア、１５以上；マッピングクオリティスコア、２０以上；ＣＡ組織における変異体サポート読み取り数、４以上；ＣＡ組織における変異体対立遺伝子頻度、２％以上；血液試料における変異体対立遺伝子頻度、１０％以下；及び、フィッシャーの直接確率検定のｐ値、０．１以下。ＥＢＣａｌｌ（ｒｅｆ）の正常組織パネルの配列データを用いて変異体をさらにフィルタリングし、ＡＮＮＯＶＡＲを用いてアノテーションを行った。
　標的配列決定のために、得られたｆａｓｔｑファイルについて、編集設定（対立遺伝子頻度：０．５％以上、バーコード当たりの読み取り対の数：１以上）を用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ　ＳｕｒｅＣａｌｌ　３．５（Ａｇｉｌｅｎｔ）で解析した。クリーンなｆａｓｔｑファイルについて、ＢＷＡ－ＭＥＭを用いてヒト参照ゲノム版ＧＲＣｈ３７（ｈｇ１９）にマッピングした。ＳＮＰＰＥＴ　ＳＮＰ　ｃａｌｌｅｒを用いてＳＮＶをコールした。２５０個以上の総読み取り数及び５個以上のＳＮＶ読み取り数を有する、信頼性の高い領域を解析に使用した。変異体の生―データは、ＳｕｒｅＣａｌｌのデフォルト設定でアノテーションし、１２の血液サンプル及び２つの血管コントロールのプールされた標的配列決定データ中の共通の変異体を除去することによってフィルタリングした。さらに、これらの変異体から、同一患者における血液ＤＮＡの全エクソーム配列決定により検出された生殖細胞変異体を除去した。これらのデータを可視化し、Ｒ　ｐａｃｋａｇｅ　Ｍａｆｔｏｏｌｓを用いて解析した。
５．生殖細胞変異体のコール
　Ｇｅｎｏｍｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｔｏｏｌｋｉｔ　ｖｅｒｓｉｏｎ　３．８（http://software.broadinstitute.org/gatk/）を使用して、生殖細胞ＳＮＶ及びインデルをコールした。体細胞変異体コールに使用したｅｘｏｍｅ及びＷＧＳ　ＢＡＭファイルのうち、正常組織のものを、塩基クオリティスコアの再キャリブレーション及びＨａｐｌｏｔｙｐｅＣａｌｌｅｒに使用した。コールされた変異体について、変異体クオリティスコアの再キャリブレーションを行い、スプライシング変異体又はエキソン変異体のいずれかを残し、共通変異体（対立遺伝子頻度＞１％）を削除することで、フィルタリングした。
６．ＣＡにおける突然変異遺伝子の経路解析
重複する遺伝子と脳動脈瘤の関係を調べるために、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ　Ｐａｔｈｗａｙ　Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｒｅｄｗｏｏｄ　Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いてネットワーク検索を行った。ＷＥＳによって同定された１３遺伝子のリストをＩＰＡにアップロードし、デフォルトのフィルタリング及び選択された種（ヒト、マウス、ラット）を用いて、キーワード「Ａｎｅｕｒｙｓｍ」を有するネットワークの解析を行った。
７．結果
全６９症例のＣＡ及び血液サンプルのＷＥＳについて、それぞれ平均深度１１７倍及び９２倍までシークエンシングした。フィルタリング後の４５症例について、１７６１の非同義置換ＳＮＶと、４０５遺伝子における３８のインデルを検出した。突然変異コールにより、ＷＥＳにおける有意な変異遺伝子を同定した結果、嚢状動脈瘤（ＳＣＡ）では体細胞変異を有する遺伝子が３８１個、紡錘状動脈瘤（ＦＣＡ）では体細胞変異を有する遺伝子が２９個認められた。図２は、特徴的な共通の体細胞突然変異を示すベン図である。血小板由来増殖因子受容体β（ＰＤＧＦＲβ）、ＡＨＮＡＫ核蛋白質（ＡＨＮＡＫ）の遺伝子が、ＦＣＡ及びＳＣＡの両方で体細胞突然変異を有することが判明した。このうち、ＰＤＧＦＲβについて、最も多く突然変異が検出された。
　２つの正常皮質動脈と１０の血液サンプルと共に、ＰＤＧＦＲβとＣＡ又は脳血液疾患と関連する他の遺伝子について６８のＣＡ組織から得た組織サンプルについて、標的ディープシークエンシング（ＤＳ）解析を行い、ＷＥＳの結果を検証し、また、試料中の低頻度の標的対立遺伝子を検出した。生殖細胞突然変異を除去し、フィルタリングを行ったところ、６２人の患者の４０の遺伝子で４７３の体細胞突然変異が検出された。中でも、１６の遺伝子は、高い再現性を有する体細胞突然変異遺伝子であり、複数症例で観察された。１６遺伝子のうち、Ｐａｔｈｗａｙ解析により、ＰＤＧＦＲβ及びＡＨＮＡＫが抽出された（図３、図４）。図１及び図１１に、ＷＥＳで検出されたＰＤＧＦＲβ及びＡＨＮＡＫ変異位置及び内容を示す。ＰＤＧＦＲβの変異は、４症例で４種類（ｐ．Ｙ５６２Ｎ、ｐ．Ｙ５６２Ｓ、ｐ．５５９＿５６２ｄｅｌ、及びｐ．５６３＿５６４ｄｅｌ）検出された。ＡＨＮＡＫの変異は、４症例で３種類（ｐ．Ｇ３８１９Ａ、ｐ．Ｎ３８２７Ｓ及びｐ．Ｄ４７０１Ｅ)検出された。
　６８症例の動脈瘤及び動脈壁の検証試験における、ＰＤＧＦＲβのＤＳにより、５症例において５つの突然変異が明らかになった：３種類のミスセンス突然変異（ｐ．Ｙ５６２Ｎ、ｐ．Ｙ５６２Ｓ、ｐ．Ｙ５６２Ｄ）、エキソン１２における４アミノ酸のインフレーム欠失（ｐ．５５９＿５６２ｄｅｌ）及び２アミノ酸のインフレーム欠失（ｐ．５６３＿５６４ｄｅｌ）。つまり、ＷＥＳとＤＳの両方で４症例において４つの突然変異（ｐ．Ｙ５６２Ｎ、ｐ．Ｙ５６２Ｓ、ｐ．５５９＿５６２ｄｅｌ及びｐ．５６３＿５６４ｄｅｌ）が検出され、ＤＳでのみ１症例で１つの突然変異（ｐ．Ｙ５６２Ｄ）が検出された。
　同様に、ＡＨＮＡＫについてもＤＳを実施した。ＡＨＮＡＫについては、８症例において５つの突然変異が明らかになった：３種類のミスセンス突然変異（ｐ．Ｅ３８５０Ｋ、ｐ．Ａ２１１４Ｔ及びｐ．Ａ４０４６Ｖ）及び２種類のフレームシフト変異（ｐ．Ｄ１０８６Ｓｆｓ＊６及びｐ．Ｈ５８１７Ｒｆｓ＊２０）。
上記の通り、脳動脈瘤及び正常組織ＤＮＡのＷＥＳ及びＤＳにより、ＰＤＧＦＲβ突然変異の発生頻度が最も高いことが実証され、この遺伝子が大脳の紡錘状及び嚢状動脈瘤の形成において相乗的に原因的役割を果たすことが示唆された。
＜参考例２：脳動脈瘤組織の免疫組織化学的検討＞
１．凍結切片
脳動脈瘤組織（脳底動脈壁）の試料をＴｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ　Ｏ．Ｃ．Ｔ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ（サクラファインテック）に包埋し、液体窒素冷却イソペンタン中で凍結した。組織切片を、－２０℃に設定したクライオスタット（ＣＭ３０５０Ｓ、Ｌｅｉｃａ）を用いて、厚さ１０μｍで連続的に切断した。切片を室温で一晩風乾した後、－８０℃で保存した。
２．脳動脈瘤及び血管構造における遺伝子突然変異の局在の確認
　レーザー支援マイクロダイセクションシステム（ＬＭＤ７０００、Ｌｅｉｃａ）によって、又は顕微鏡下の手動で、５症例（ＦＵ２、ＦＵ３、ＦＵ６、ＦＲ１、ＳＵ５０）の血管層（内膜、中膜及び外膜）のマイクロダイセクションを行った。各症例の脳動脈瘤のサイズを表１に示す。レーザー支援マイクロダイセクションは、５０μｍ凍結切片を０．１％ポリ－Ｌ－リジン溶液（富士フイルム和光純薬、日本）で予めコーティングしたＰＥＮ膜スライド（２．０μｍ、Ｌｅｉｃａ）上に載せ、エタノールで固定した後、０．０５％トルイジンブルーで染色した。倍率６．３、パワー２８、開口１６、速度９、試料バランス３、ヘッド電流１００％、パルス周波数８００の条件下で、レーザービームにより所望の領域をそれぞれ切離した。手動切離の場合、１０μｍの凍結切片をトルイジンブルーで染色し、実体顕微鏡下（１０倍、ＭＺ－９５、Ｌｅｉｃａ）でブレードを用いて手動で切除した。処理された切片を、血管層毎にチューブに回収した。切離した切片は、０．２ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ（Ｑｉａｇｅｎ）を含む１８０μＬのＡＴＬ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）に懸濁した。５６℃で１８時間インキュベートした後、ＱＩＡａｍｐ　ＤＮＡマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。Ｑｕｂｉｔ蛍光光度計（Ｑｕｂｉｔ２．０、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、二本鎖ＤＮＡ濃度を測定した。抽出後のＤＮＡについて、参考例１の記載と同様の方法で全エクソーム配列決定を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
３．結果
　本発明者は組織試料を除核して、各試料の３つの層（内膜、中膜及び外膜）のそれぞれから得られたＤＮＡより、どの血管層において６つのＰＤＧＦＲβ変異体ＤＮＡが発現するかを検討した。その結果、小規模の紡錘状動脈瘤では外膜層に、中規模及び大規模の紡錘状動脈瘤では中膜層に、変異が最も多く見られた（図５）。巨大な動脈瘤の試料では、中膜層及び内膜層で同程度のＰＤＧＦＲβの変異が見られた。遺伝子突然変異によって引き起こされる脳動脈瘤の形成は、正常な血管の外膜層内の細胞の１つに突然変異が導入されたことに起因することが示唆された。病理学的プロセスの進行に従って、最初の小さな紡錘形動脈瘤が、外膜層内に形成されたと考えられた。
＜実施例１：ＰＤＧＦＲβ変異を導入したヒト細胞による試験＞
１．プラスミド調製
　ヒトＰＤＧＦＲβを、ＳＨ－ＳＹ－５Ｙ細胞由来のｃＤＮＡを使用したＰＣＲで増幅し、ＰＣＲ－Ｂｌｕｎｔ　ＩＩ　ＴＯＰＯ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にクローニングした。ＰＤＧＦＲβ変異体を調製するために、ＰＤＧＦＲβのｃ．１６８４Ｔ＞Ａ（ｐ．Ｙ５６２Ｎ）、ｃ．１６８４Ｔ＞Ｇ（ｐ．Ｙ５６２Ｄ）、ｃ．１６８５Ａ＞Ｃ（ｐ．Ｙ５６２Ｓ）、ｃ．１６８５Ａ＞Ｇ（ｐ．Ｙ５６２Ｃ）、ｃ．１６７５＿１６８６ｄｅｌ（ｐ．５５９＿５６２ｄｅｌ）、及びｃ．１６８７＿１６９２ｄｅｌ（ｐ．５６３＿５６４ｄｅｌ）６つの変異を、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＭＡＸ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）によるＰＣＲベースの突然変異誘発を用いてＰＤＧＦＲβ‐ＴＯＰＯに別々に導入した。ＰＤＧＦＲβ野生型－ＩＲＥＳ２－ｅＧＦＰ又はＰＤＧＦＲβ突然変異体－ＩＲＥＳ２－ｅＧＦＰを調製するために、ＰＤＧＦＢ野生型又はＰＤＧＦＲβ突然変異体の断片を、それぞれＰＤＧＦＲβ野生型－ＴＯＰＯ又はＰＤＧＦＲβ突然変異体－ＴＯＰＯからＰＣＲにより得た。ＩＲＥＳ２－ｅＧＦＰ断片を、ｐＣＡＧ－Ｃｒｅ－ＩＲＥＳ２－ＧＦＰプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ、＃２６６４６）からＰＣＲにより得た。ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ　ＨｉＦｉ　ＤＮＡ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ）を使用して、これらの断片をｐＣＡＧＧＳベクター（ＲＤＢ０８９３８、理化学研究所バイオリソースセンター）に組み入れた。突然変異誘発及びアセンブリのプライマーを表２に示す。ＰＤＧＦＲβ－ＨＡを、ｐＡＡＶ－ＣＭＶ－ＰＤＧＦＲβ－ＨＡプラスミドを鋳型として用いて、ＰＣＲにより増幅した。ＰＤＧＦＲβ（ＢｓｐＩ－ＮｏｔＩ）－ＨＡをＰＣＲ－Ｂｌｕｎｔ　ＩＩ　ＴＯＰＯにサブクローニングした。得られたプラスミドをＢｓｐＥＩ及びＥｃｏＲＶで切断して、ＨＡをコードする断片を除去した。この断片をＢｓｐＥＩ－ＥｃｏＲＶで切断されたＰＤＧＦＲβ野生型－ＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰ又はＰＤＧＦＲβ突然変異体－ＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰにクローニングして、ＰＤＧＦＲβ野生型－ＨＡ－ＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰ又はＰＤＧＦＲβ突然変異体－ＨＡ－ＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰを調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
２．細胞培養及び遺伝子変異導入
　ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞を理化学研究所バイオリソース研究センター（日本）から入手し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ニチレイバイオサイエンス、日本）、１００Ｕペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、及び非必須アミノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、低グルコース、Ｇｉｂｃｏ）で、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベータ中で培養した。細胞を２４ウェルプレートに播種し（２×１０５細胞／ウェル）、３７℃、５％　ＣＯ２で１６時間インキュベートした。リポフェクタミン３０００（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて、１．０μｇ　ＤＮＡ／ウェルのプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。５時間後、培地を新鮮培地に入れ替え、３７℃、５％ＣＯ２で１６時間インキュベートした。
３．ウエスタンブロット法
　培養後の細胞培養培地をウェルから除去し、ｃＯｍｐｌｅｔｅＴＭ、ＵＬＴＲプロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ）及びＰｈｏｓＳＴＯＰＴＭホスファターゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ）ならびに０．０１６Ｕ／μＬベンゾナーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を含有する、氷冷のＲＩＰＡバッファー（２５ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、Ｈ７．６、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１％ＮＰ－４０、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ）を添加してウェル内で溶解させ、次いでウェルごと、氷上で１５分間インキュベートした。溶解物を１５，０００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離して、クリアな上清を得た。ＢＣＡタンパク質アッセイキット（タカラバイオ）を使用して、タンパク質濃度を測定した。１０μｇの細胞溶解物について、１０％又は５～２０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Ｒｅａｌ　Ｇｅｌ　Ｐｌａｔｅ、ＢＩＯＣＲＡＦＴ）を用いて電気泳動による分離を行い、ゲルのバンドをポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ、０．４５μｍ、Ｍｅｒｃｋ）に移した。膜を、ｃａｎ　ｇｅｔ　ｓｉｇｎａｌ（登録商標）（東洋紡）、又は５％ウシ血清アルブミンを含むＴＢＳ－０．１％　Ｔｗｅｅｎ　２０（ＴＢＳＴ）のＰＶＤＦブロッキング試薬中で室温で１時間インキュベートし、次いで、一次抗体を含むシグナルエンハンサーＣａｎ　Ｇｅｔ　ｓｉｇｎａｌ（登録商標）溶液１中に膜を移し、４℃で１４～１８時間インキュベートした。使用した一次抗体は、下記の通りである：
　－ウサギ抗ＰＤＧＦＲＢモノクローナル抗体（Ｙ－９２、Ａｂｃａｍ）
　－マウス抗リン酸化チロシンモノクローナル抗体（Ｐ－Ｔｙｒ－１００、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
　－ウサギ抗リン酸化ＥＲＫ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｓｉｇｎａｌ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｋｉｎａｓｅ）１／２モノクローナル抗体（Ｄ１３．１４．、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
　－ウサギ抗ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ）ポリクローナル抗体（ＭＢＬ）
　－マウス抗ＥＲＫ１／２モノクローナル抗体（Ｌ３４Ｆ１２、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
　－ウサギ抗リン酸化ＡＫＴモノクローナル抗体（Ｄ９Ｅ、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
　－ウサギ抗ＡＫＴモノクローナル抗体（Ｃ６７Ｅ７、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
　－ウサギ抗リン酸化ＳＴＡＴポリクローナル抗体（Ｔｙｒ７０５、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
　－ウサギ抗ＳＴＡＴ３モノクローナル抗体（Ｄ３Ｚ２、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
　－マウス抗β－アクチンモノクローナル抗体（８Ｈ１０Ｄ１０、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
　次いで、ヤギ抗マウスＨＲＰ結合抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）又はロバ抗ウサギＨＲＰ結合抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を含むシグナルエンハンサーＣａｎ　Ｇｅｔ　ｓｉｇｎａｌ（登録商標）溶液２中に膜を移し、室温で１時間インキュベートした。Ｃｈｅｍｉ－Ｌｕｍｉ　Ｏｎｅ　Ｌ（ナカライテスク）で膜上のタンパク質を検出した。
４．２９３Ｔ細胞培養におけるチロシンキナーゼ阻害剤の効果検討
　トランスフェクトした２９３Ｔ細胞を無血清培地中で１６時間インキュベートした後の各ウェルに、組み換えヒトＰＤＧＦ－ＢＢを添加し、３７℃、５％ＣＯ２で１５分間インキュベートした。組換えヒトＰＤＧＦ－ＢＢ（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は、２０ｍＭ、ｐＨ３．０４で５０ｇ／ｍｌのものを溶解した後、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ媒体（Ｇｉｂｃｏ）で系列希釈し、各ウェルに添加した。ＰＤＧＦ－ＢＢの最終濃度は２５～６．２５ｎｇ／ｍｌとした。
　チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）として、スニチニブ、アキシチニブ、ダサチニブをセレックバイオテクノロジー株式会社（日本）から入手した。各ＴＫＩは１０ｍＭのものをＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解した後、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ媒体で系列希釈し、各ウェルに添加した。ＴＫＩの最終濃度は、１０ｎＭ又は１００ｎＭとし、ＤＭＳＯの最終濃度は０．０１％とした。ＴＫＩを添加したプレートを３７℃、５％ＣＯ２で３時間インキュベートした。ＰＤＧＦ－ＢＢ又はＴＫＩによる処理の終了時に、プレートをインキュベータから取り出し、氷冷した。各ウェル中のＰＤＧＦＲβを検出するために、ウェスタンブロッティングを行った。
５．結果
　変異体及び野生型構築物をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、それらに由来するリン酸化シグナルを検証した。野生型構築物を導入した細胞では、抗ＰＤＧＦＲβ抗体を用いたＷＢで検出可能な約１８０ｋＤａ、１６０ｋＤａ、及び１３０ｋＤａの３つのタンパク質が確認された（図６）。総ＰＤＧＦＲβ量は、～１８０、～１６０、及び～１３０ｋＤａのバンドの強度を加算して算出し、さらに、β－アクチン（ＡＫＴ）に対して正規化した。変異体構築物を用いた場合は、１８０ｋＤａのタンパク質は少量であったが、１６０ｋＤａ及び１３０ｋＤａのタンパク質量は野生型構築物と大きな差異はなかった。変異体構築物を導入した細胞において、下流のシグナル伝達タンパク質におけるリン酸化の活性化は、ＥＲＫで顕著に増加していた。
　野生型構築物の場合、ＰＤＧＦＲβのリン酸化は添加したＰＤＧＦ－ＢＢ量に応じて亢進したが、変異体構築物の場合は反応しなかった（図７）。ＰＤＧＦＲβ変異体は、ＥＲＫ活性化リガンドに依存しないことが示唆された。
　ＰＤＧＦＲβのリン酸化は、チロシンキナーゼ阻害剤スニチニブ（図８Ａ）、アキシチニブ（図８Ｂ）及びダサチニブ（図８Ｃ）のいずれを投与しても顕著に抑制されていた。正常な脳動脈内では、ＥＲＫのリン酸化がほとんど観察されなかったため（データ示さず）、動脈瘤組織内のＥＲＫの亢進／過剰なリン酸化は、変異を検出するための適切なマーカーになり得ることが示唆された。
＜実施例２：ＰＤＧＦＲβ変異を導入した動脈瘤発症動物モデルでの検討（Ｉ）＞
１．動物モデルの構築
　アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を脳底動脈の非分枝領域に動脈周囲に適用することにより、マウスＣＡモデルを構築した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｐＨｅｌｐｅｒベクター、ｐＲＣベクター、及び目的遺伝子を組み込んだｐＡＡＶベクターをトランスフェクトして、培養した後、イオジキサノール段階勾配法で産生されたＡＡＶを回収した。ＡＡＶの血清型を決定した後、１５％プルロニックＦ－１２７を含むＰＢＳのヒドロゲルと混合した。ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＰＤＧＦＲβ、及びＡＡＶＣＭＶ－ＰＤＧＦＲβ　ｐ５５９＿５６２ｄｅｌのヒドロゲル中のウイルスの濃度（ｖｇ／ｍｌ）は、それぞれ２×１０１３、１×１０１２、及び１×１０１２とした。
　Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ雄８～１１週齢マウス（ＣＬＥＡ　Ｊａｐａｎ）にメデトミジン０．３ｍｇ／ｋｇ、ミダゾラム４ｍｇ／ｋｇ、ブトルファノール５ｍｇ／ｋｇを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射して深麻酔した。脳底動脈を、既報の通りに露出した（Yonekura et al., (2004) J. Cereb. Blood Flow Metab., 24(2):151－8）。３μＬのヒドロゲルを基底動脈に塗布し、５分後に除去した。ヒドロゲル塗布をさらに２回繰り返した。マウスを３つのサブグループ（対照、ＰＤＧＲＦＢ(ｗｔ)及びＰＤＧＲＦＢ(変異）)に分けた。スニチニブ、アキシニチブ及びダサチニブを賦形剤（２％　ＤＭＳＯ、１５％　ＰＥＧ３００）に溶解し、それぞれ４０、２５、１０ｍｇ／ｋｇ／日で腹腔内注射により毎日投与した。マウスをイソフルランで深く麻酔した後、断頭した。剃毛した頭部を、４％パラホルムアルデヒドを含む０．１Ｍリン酸緩衝液に直ちに移し、４℃で少なくとも２４時間インキュベートした。脳底動脈を含む後脳部位を固定した頭蓋から取り出し、４℃でさらに２４時間固定液と共にインキュベートし、次いでパラフィンに包埋した。吻側１ｍｍの点から頭蓋骨接合部までの吻側１００ｍｍから尾側１００ｍｍまでの脳領域を厚さ４ｍｍで切断した。
２．組織病理学及び免疫組織化学的検討
　ウイルスの効果を評価するために、切片をＥｌａｓｔｉｃａ　Ｖａｎ　Ｇｉｅｓｏｎ法で染色し、各脳試料から最大の動脈切片を選択し、測定した。ニワトリ抗ＧＦＰ抗体（Ａｖｅｓ　ＧＦＰ－１０１０）、ヤギ抗αＳＭＡ抗体（ａｂｃａｍ　ａｂ２１０２７）、及び抗ＰＤＧＦＲβ抗体（ａｂｃａｍ　ａｂ３２５７０）を使用し、血管断面の内弾性膜をＥＶＧ染色（暗紫色に染色）で調べた。染色部位の面積また周囲長を、ＦＵＪＩ－ＩｍａｇｅＪソフトウェア（J. Schindelin et al., Nature Methods, 2012）で算出した。
３．結果
　ＰＤＧＦＲβシグナル伝達経路の活性化が実際に動脈瘤を誘導できることを証明するために、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を用いてマウス脳底動脈組織に変異遺伝子を導入し、動脈瘤の動物モデルを開発した。野生型又は突然変異体（ｐ．５５９－５６２ｄｅｌ）のＰＤＧＦＲβのいずれかをコードするＡＡＶを、ｅＧＦＰをコードするＡＡＶと混合し、マウスの脳底動脈に適用した。感染１週間後に、ＡＡＶの遺伝子に由来するタンパク質が、脳底動脈を取り囲む血管層に発現していた。また、脳幹腹側面、くも膜、硬膜など近傍の組織にもウイルス感染が認められた。感染２８日後にマウスをと殺し、脳底動脈の大きさをＥＧＦＰ発現ＡＡＶのみに感染した動物と比較した。変異型ＰＤＧＦＲβに対するＡＡＶに感染した脳底動脈は、ｅＧＦＰウイルスのみに感染したものと比較して顕著に拡大していた。一方で、野生型ＰＤＧＦＲβに対するＡＡＶに感染した動脈には、そのような拡大は見られなかった。これらの結果は、脳底動脈の拡張の主要な要因が、ＰＤＧＦＲβの過剰発現でなはなく酵素活性であることを示唆した。
　変異ＰＤＧＦＲβのチロシンキナーゼ活性が脳底動脈の拡張に果たす役割を調べるために、変異ＰＤＧＦＲβのためにＡＡＶに感染したマウスにチロシンキナーゼ阻害剤を投与した。スニチニブを投与したマウスは、賦形剤のみを投与したマウスよりも脳底動脈が小さかった（図９）。スニチニブによる拡大の抑制は統計的に有意であった（対応のないノンパラメトリックＭａｎｎ-Ｗｈｉｔｎｅｙ　Ｕ検定　ｐ＜０．０５）。他のチロシンキナーゼ阻害剤である、アキシチニブ、ダサチニブについても同様の結果が見られた。
＜実施例３：ＰＤＧＦＲβ変異を導入した動脈瘤発症動物モデルでの検討（ＩＩ）＞
　実施例２と同様の手法で、ＰＤＧＦＲβ変異（ｐ．５５９＿５６２ｄｅｌ）を導入した脳動脈瘤発症動物モデルを構築した。変異導入後７日目から２８日目にかけて、アキシチニブ、ダサチニブ、スニチニブの９８．８１μＭ溶液（２％　ＤＭＳＯ、１５％　ＰＥＧ３００）を、腹腔内注射により、それぞれ毎日２０μＬ投与した。投与量は、アキシチニブは０．７６ｍｇ／ｋｇ／日、ダサチニブは１．０ｍｇ／ｋｇ／日、スニチニブは０．７８ｍｇ／ｋｇ／日に相当する。マウスをイソフルランで深く麻酔した後、断頭して脳血管を露出させた後、それぞれの脳の脳底動脈の最大長径を測定した。各薬剤投与条件について、３匹のマウスで検討を行った。
　各薬剤投与条件でのマウスの脳血管最大長径の分布を図１０に示す。図中のｐ値は、一元配置分散分析を用いたＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉにより算出した値である。遺伝子変異導入後７日目、すなわち脳動脈拡張の発症開始後に薬剤を投与したため、図１０の結果は、脳動脈拡張の治療効果を示す。スニチニブと比較して、ダサチニブは脳血管拡張を有意に抑制することが示された（ｐ＝０．０４０）。アキシチニブは、バラつきはあるものの、全体としてスニチニブよりも脳血管最大長径が低かった。以上より、低濃度域での脳動脈拡張治療効果について、ダサチニブ、アキシチニブ、スニチニブの順に高いことが示された。
＜実施例４：ＡＨＮＡＫ変異を導入したヒト細胞を用いたＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーターアッセイ＞
１．ＡＨＮＡＫ発現プラスミドの調製
　ヒトＡＨＮＡＫの部分ペプチド、具体的には配列番号１６の３８０１～３９２８番目、及び４６４９～４７７６番目に相当する部分をコードするＤＮＡ（それぞれ配列番号１７、１８の塩基配列を有する）に相当する、ＳＨ－ＳＹ－５Ｙ細胞由来のｃＤＮＡをそれぞれＰＣＲで増幅して、ＰＣＲ－Ｂｌｕｎｔ　ＩＩ　ＴＯＰＯ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にクローニングした。ＡＨＮＡＫの変異型を調製するために、ＡＨＮＡＫのｐ．Ｇ３８１９Ａ、ｐ．Ｎ３８２７Ｓ、及びｐ．Ｄ４７１０Ｅの変異を、それぞれＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＭＡＸ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）によるＰＣＲベースの突然変異誘発を用いてＡＨＮＡＫ－ＴＯＰＯに導入した。ＡＨＮＡＫ野生型－ＩＲＥＳ２－ｅＧＦＰ又はＡＨＮＡＫ変異型－ＩＲＥＳ２－ｅＧＦＰを調製するために、ＡＨＮＡＫ野生型又はＡＨＮＡＫ変異型の断片を、それぞれＡＨＮＡＫ野生型－ＴＯＰＯ又はＡＨＮＡＫ変異型－ＴＯＰＯからＰＣＲにより得た。ＩＲＥＳ２－ｅＧＦＰ断片を、ｐＣＡＧ－Ｃｒｅ－ＩＲＥＳ２－ＧＦＰプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ、＃２６６４６）からＰＣＲにより得た。ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ　ＨｉＦｉ　ＤＮＡ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ）を使用して、これらの断片をｐＣＡＧＧＳベクター（ＲＤＢ０８９３８、理化学研究所バイオリソースセンター）に組み入れた。ＡＨＮＡＫ－ＨＡを、ｐＡＡＶ－ＣＭＶ－ＡＨＮＡＫ－ＨＡプラスミドを鋳型として用いて、ＰＣＲにより増幅した。ＡＨＮＡＫ（ＢｓｐＩ－ＮｏｔＩ）－ＨＡをＰＣＲ－Ｂｌｕｎｔ　ＩＩ　ＴＯＰＯにサブクローニングした。得られたプラスミドをＢｓｐＥＩ及びＥｃｏＲＶで切断して、ＨＡをコードする断片を除去した。この断片をＢｓｐＥＩ－ＥｃｏＲＶで切断されたＡＨＮＡＫ野生型－ＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰ又はＡＨＮＡＫ変異型－ＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰにクローニングして、ＡＨＮＡＫ野生型－ＨＡ－ＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰ（ＡＨＮＡＫ　ＷＴ）又はＡＨＮＡＫ変異型－ＨＡ－ＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰ（ＡＨＮＡＫ　Ｇ３８１９Ａ）を調製した。
２．ＮＦκＢルシフェラーゼレポーターアッセイ
　レポータープラスミド（Ａｇｉｌｅｎｔ）、ｐＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼおよびｐＲＬ－ＴＫルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）は、市販のものを使用した。ＨＥＫ２９３細胞を遺伝子導入の前日に２４ウェルプレートに播種し、ウェルプレートに播種し、調製した各ＡＨＮＡＫ発現プラスミド（０．５ｍｇ）、ｐＮＦ－κＢルシフェラーゼ（０．１ｍｇ）、ｐＲＬ－ＴＫ－ルシフェラーゼ（０．０２ｍｇ）、レポータープラスミドを同時に細胞に導入した。野生型ＡＨＮＡＫ及びｐ．Ｇ３８１９Ａ変異型ＡＨＮＡＫの各ウェルには、１－（５－イソキノリンスルフォニル）－２－メチルピペラジン（Ｈ－７）（ＰＫＣ阻害剤、下記式（ＩＩＩ））、ＬＹ２９４０１２（ＰＩ３Ｋ阻害剤、下記式（ＩＶ））及びＰＤ１７３０７４（ＦＧＦ－Ｒ阻害剤、下記式（Ｖ））をそれぞれ１００μＭ、１０μＭ及び１０μＭとなるように培地に添加した。阻害剤を添加していないウェルを陰性対照とした。４ウェルを各阻害剤添加条件とし、７ウェルを陰性対照とした。各遺伝子導入の１日後、ＡＨＮＡＫ発現プラスミドでトランスフェクトした細胞を、Ｇｌｏ溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解し、Ｄｕａｌ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびＩｎｆｉｎｉｔｅ　２００　Ｐｒｏマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ）を用いてルシフェラーゼアッセイを実施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　ルシフェラーゼアッセイの結果を図１２に示す。図中、縦軸はＮＦκＢの発現量を示す。陰性対照において、ｐ．Ｇ３８１９Ａ変異型ＡＨＮＡＫを導入した細胞のＮＦκＢが、野生型ＡＨＮＡＫよりも亢進していることが確認された。この亢進は、ｐ．Ｎ３８２７Ｓ変異型ＡＨＮＡＫ及びＤ４７１０変異型ＡＨＮＡＫでも観察された（データ示さず）。ＮＦκＢは炎症に関与するタンパク質であることから、ＡＨＮＡＫの変異がヒト細胞の炎症反応を促進することが示唆された。各種阻害剤を添加した系では、野生型とｐ．Ｇ３８１９Ａ変異型とでＮＦκＢの発現量の差異がほとんど見られず、また、陰性対照と比較して、全体的にＮＦκＢの発現が低く抑えられていた。これにより、ＡＨＮＡＫの変異で促進され得る炎症反応が、ＰＫＣ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤及びＦＧＦ－Ｒ阻害剤の投与により低減可能であることが示唆された。
＜実施例５：ＡＨＮＡＫ変異を導入した脳動脈瘤発症動物モデルでの検討＞
　ＡＨＮＡＫ変異を実験動物に導入するためには、ウイルスベクター等に遺伝子を組み込む必要があるが、ＡＨＮＡＫは５８９０アミノ酸の長さを有する分子量の大きなタンパク質であり、その全長遺伝子をウイルスベクター等に組み込むことは困難であった。一方で、変異を含む任意の断片を組み込むのみでは、導入した実験動物において十分にその表現型が現れないという課題があった。ＡＨＮＡＫは、多くの繰り返し構造（ＣＲＵ：Consensus Central Repeat Unit）を有し、ＡＨＮＡＫ変異位置もＣＲＵ内に存在する。そこで、ＡＨＮＡＫのＰＤＺ領域を含むＣ末端部、２つのＣＲＵ及びＮ末端部をこの順で組合せて低分子型ＡＨＮＡＫ（ＡＨＮＡＫｍｉｎｉ）を設計した。図１３にＡＨＮＡＫｍｉｎｉの構造概略を示す。ＡＨＮＡＫｍｉｎｉのアミノ酸配列は、Ｎ末端にＦＬＡＧタグをつけた状態で１９４３アミノ酸まで短縮される。
　ｐ．Ｇ３８１９Ａ変異型のＡＨＮＡＫｍｉｎｉをコードするＤＮＡを化学合成し、ｐＡＡＶベクターに直接サブクローニングし、ｐＡＡＶ－ＣＭＶ－ＡＨＮＡＫを調製した（配列番号１９）。これを、さらにｐ．Ｇ３８１９Ａに相当する変異を有するよう改変（具体的には配列番号１９の３１５６番目のグアニン（ｇ)をシトシン（ｃ）に変更）して、ｐＡＡＶ－ＣＭＶ－ＡＨＮＡＫ　ｐ．Ｇ３８１９Ａを調製した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｐＨｅｌｐｅｒベクター、ｐＲＣベクター、及びｐＡＡＶ－ＣＭＶ－ＡＨＮＡＫ　ｐ．Ｇ３８１９Ａをトランスフェクトして、培養した後、イオジキサノール段階勾配法で産生されたＡＡＶを回収した（ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＡＨＮＡＫ　ｐ．Ｇ３８１９Ａ）。コントロールとして、ＥＧＦＰをコードするＡＡＶ（ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ）を同様に調製した。ＡＡＶの血清型を決定した後、１５％プルロニックＦ－１２７を含むＰＢＳのヒドロゲルと混合した。
　Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ雄８～１１週齢マウス（ＣＬＥＡ　Ｊａｐａｎ）について、A. Tamura et al., Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism, 1: 53-60 (1981)に記載に準じたプロトコールで中大脳動脈を露出し、ＡＡＶを含むヒドロゲルを５分間隔で複数回に分けて塗布した後、頭蓋を側頭筋膜で覆い、軟部組織を元の位置に戻し、皮膚を縫合した。ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＡＨＮＡＫ　ｐ．Ｇ３８１９Ａの合計塗布量は、２．４×１０１０ｖｇ、３．３×１０１１ｖｇとした。
　感染後（手術後）７日目より、ＰＤ１７３０７４を賦形剤（２％　ＤＭＳＯ、１５％　ＰＥＧ３００）で０．１ｍｇ／ｍｌとなるように溶解した溶液を、２０μＬ／ｇ／日の投与量で２８日目まで投与した。ＬＹ２９４００２の０．０２ｍｇ／ｍｌ溶液、スタウロスポリン（ＰＫＣ阻害剤、下記式（ＶＩ））の０．０２ｍｇ／ｍｌ溶液についても同様に投与を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　マウスをイソフルランで深く麻酔した後、断頭した。４℃で少なくとも２４時間インキュベートした。断頭して脳を露出させた後、それぞれの脳の脳血管最大長径を測定した。各薬剤について、薬剤投与群として３匹、コントロールとして４匹のマウスで検討を行った。
　図１４Ａは、ＡＨＮＡＫ変異を導入した脳動脈瘤モデルマウスにおける、ＰＤ１７３０７４の投与あり、投与なしの脳血管最大長径を示す。図中のエラーバーは標準誤差を示す。また、図中の「*」、対応のない非等分散のスチューデントｔ検定で、ｐ＜０．０５であったことを示す。ＰＤ１７３０７４投与を行った群で、投与を行わなかった群と比較して、脳血管最大長径の増大が有意に抑制された。これにより、ＡＨＮＡＫの変異で誘発される脳動脈瘤について、ＦＧＦ－Ｒ阻害剤が治療効果を有することが示唆された。
　図１４Ｂは、ＡＨＮＡＫ変異を導入した脳動脈瘤モデルマウスにおける、ＬＹ２９４００２の投与あり、投与なしの脳血管最大長径を示す。図中のエラーバーは標準誤差を示す。ＬＹ２９４００２投与を行わなかった群で脳血管最大長径にバラつきが見られたのに対して、投与を行った群では、全てのマウスで脳血管最大長径の増大が抑制されていた。これにより、ＡＨＮＡＫの変異で誘発される脳動脈瘤について、ＰＩ３Ｋ阻害剤が治療効果を有することが示唆された。
　図１４Ｃは、ＡＨＮＡＫ変異を導入した脳動脈瘤モデルマウスにおける、スタウロスポリンの投与あり、投与なしの脳血管最大長径を示す。図中のエラーバーは標準誤差を示す。スタウロスポリン投与を行わなかった群で脳血管最大長径にバラつきが見られたのに対して、投与を行った群では、全てのマウスで脳血管最大長径の増大が抑制されていた。これにより、ＡＨＮＡＫの変異で誘発される脳動脈瘤について、ＰＫＣ阻害剤が治療効果を有することが示唆された。
＜実施例６：組織サンプルにおける遺伝子発現解析＞
　患者より摘出したＣＡ組織について、Ｖｉｓｉｕｍ空間的遺伝子発現解析システム（１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を用いたｍＲＮＡの解析により、各遺伝子の発現状態を確認した。試料の調製、遺伝子解析のプロトコールは、Ｖｉｓｉｕｍシステムの添付文書に従って行った。
１．ＣＡ組織スライドの調製
　参考例２で調製した凍結切片のうち、２症例（ＦＵ３及びＳＵ５０）のＣＡ組織を用いた。対照として、同様の方法で調製された正常な脳血管組織１例の凍結切片についても同様の条件での検討を行った。
　Ｖｉｓｉｕｍスライド上の１つのエリア（６．５ｍｍ×６．５ｍｍ）には、空間バーコード配列を有する数千のＤＮＡが固定されたスポットが５０００個存在する。空間バーコードの配列はスポットごとに異なり、Ｖｉｓｉｕｍシステム上で、バーコード配列情報からスポット位置をトレースすることが可能である。
　調製した凍結切片を、Ｖｉｓｉｕｍスライドの所定位置に１エリアに１つずつセットした。スライドを５０℃に加温した組織溶解バッファー（１０％ＳＤＳ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩酸塩、３．３ｍｇ／ｍＬ　プロテイナーゼ（Ｑｉａｇｅｎ））中に浸漬して、１時間インキュベートした。スライドを取り出し、超純水で洗浄した後、０．０８Ｍ　ＫＯＨ溶液中に浸漬して室温で２回（１０分、５分）インキュベートした。スライドを１０ｍＭ　Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７）で洗浄し、表面の水分を除去して、組織スライドを得た。
２．染色とイメージング
　得られた組織スライドを、常法に従ってメタノール固定した後、Ｈ＆Ｅ染色を行った。染色後のスライド上の組織を蛍光顕微鏡システム（ＢＺ－Ｘ８００、キーエンス）で撮像した。
３．透過処理、逆転写及びｃＤＮＡライブラリの構築
　以下の操作は、Ｖｉｓｉｕｍ　Ｓｐａｔｉａｌ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を用いて行った。２．のスライドを専用スライドカセットにセットし、透過酵素を添加した。スライドをスライド用サーマルサイクラ―上で３７℃でインキュベートすることで、細胞を透過させ、露出したポリＡを有するｍＲＮＡをスライド上のポリｄＴで捕捉した。逆転写（ＲＴ）マスターミックスを各ウェルに添加して、サーマルサイクラ―にセットし、所定の逆転写反応を行うことで、スライド上に第１鎖ｃＤＮＡを形成させた。第１鎖ｃＤＮＡを鋳型として、常法に従って配列決定用のｃＤＮＡライブラリを構築した。ｃＤＮＡは、第１鎖由来のバーコード配列を有する。
４．ｃＤＮＡの解析
　作成したｃＤＮＡライブラリの配列決定を行った。配列決定は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ　ＨｉＳｅｑ２５００　ＳＢＳ　Ｖ４を用いて、１２５ｂｐの対の読み取り値で実施した。各ｃＤＮＡには、空間バーコード配列とｍＲＮＡ配列とを有することから、空間バーコードで組織切片上の位置（スポット）を特定し、当該スポットにどの遺伝子がどれだけ発現したかを解析することが可能である。Ｖｉｓｉｕｍ空間的遺伝子発現解析システムの解析ソフトを用いて、特定遺伝子の発現強度を組織切片を撮像した画像上に二次元的に表示した。各症例について、組織切片上のＰＤＧＦＲβ及びＡＨＮＡＫの遺伝子発現の分布及び強度を解析した。
５．結果
　図１５に、ＣＡ患者２症例及びコントロール１例の脳血管組織凍結切片におけるＰＤＧＦＲβ及びＡＨＮＡＫのｍＲＮＡ発現の状態を示す。より赤色の濃い部分がｍＲＮＡ発現量の多い部分となる。いずれの遺伝子も対照と比較してＣＡ組織で広い範囲で発現が亢進されていることが確認された。脳動脈瘤において、これらの遺伝子が強く関与していることが示唆された。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (9)

  1. 　以下のｉ）～ｉｉｉ）のうち、少なくとも１つの薬剤を有効成分として含む、動脈瘤の治療及び／又は予防のための医薬組成物。
    　ｉ）血小板由来増殖因子受容体β（ＰＤＧＦＲβ）を標的とする薬剤；
    　ｉｉ）デスモヨーキン（ＡＨＮＡＫ）の機能を阻害する薬剤；及び
    　ｉｉｉ）ＰＤＧＦＲβ又はＡＨＮＡＫの変異により亢進されるシグナル伝達を阻害する薬剤。
  2. 　前記薬剤がチロシンキナーゼ阻害剤であり、スニチニブ、アキシチニブ、ダサチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、パゾパニブ、バンデタニブ、アファチニブ、レゴラフィニブ、カボザンチニブ、オシメルチニブ、ダコミチニブ、キザルチニブ、カプマチニブ、テポチニブ、イマチニブ、ソラフェニブ、ニロチニブ、クリゾチニブ、ポナチニブ、セリチニブ、ニンテダニブ、ロルラチニブ、エヌトレクチニブ、これらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、及び誘導体からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項1に記載の医薬組成物。
  3. 　前記薬剤が、アキシチニブ、ダサチニブ、これらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、及び誘導体から選択される少なくとも１つである、請求項２に記載の医薬組成物。
  4. 　前記薬剤が、ＡＨＮＡＫを標的とする薬剤である、請求項１に記載の医薬組成物。
  5. 　前記薬剤が、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦ－Ｒ）阻害剤、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤、及びホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤から選択される少なくとも１つである、請求項４に記載の医薬組成物。
  6. 　動脈瘤の診断を補助する方法であって、以下の工程を含む方法。
    　動脈瘤を有する対象から採取した試料中のＰＤＧＦＲβ遺伝子及びＡＨＮＡＫ遺伝子のうち、少なくとも１つの遺伝子の変異を検出する工程、及び
    　前記対象に対する、請求項１に記載の医薬組成物による治療及び／又は予防効果を予測する工程。
  7. 　前記ＰＤＧＦＲβ遺伝子の変異が、配列番号２で表されるアミノ酸配列のｐ．５５９＿５６２ｄｅｌ、ｐ．５６３＿５６４ｄｅｌ、ｐ．Ｙ５６２Ｎ、ｐ．Ｙ５６２Ｓ、及びｐ．Ｙ５６２Ｄの変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異に対応する、請求項６に記載の方法。
  8. 　前記試料中のＡＨＮＡＫ遺伝子の変異を検出し、前記対象に対するＦＧＦ－Ｒ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤又はＰＩ３Ｋ阻害剤の治療及び又は予防効果を予測する、請求項６に記載の方法。
  9. 　薬剤の動脈瘤治療効果を判定する方法であって、以下の工程ｂ）～ｄ）を含む、方法：
    　ｂ）ヒト細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏで薬剤と接触させる工程；
    　ｃ）工程ｂ）の細胞について、のリン酸化細胞外シグナル調節キナーゼ（ｐ－ＥＲＫ）量及び／又はリン酸化チロシン量を測定する工程；及び
    　ｄ）工程ｃ）の測定値から前記薬剤の動脈瘤治療効果を予測する工程、
    　を含む、方法。
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