WO2009122748A1 - 呼吸器系疾患又はアレルギー性疾患の治療剤 - Google Patents

呼吸器系疾患又はアレルギー性疾患の治療剤 Download PDF

Info

Publication number
WO2009122748A1
WO2009122748A1 PCT/JP2009/001545 JP2009001545W WO2009122748A1 WO 2009122748 A1 WO2009122748 A1 WO 2009122748A1 JP 2009001545 W JP2009001545 W JP 2009001545W WO 2009122748 A1 WO2009122748 A1 WO 2009122748A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
socs1
socs3
therapeutic agent
sirna
seq
Prior art date
Application number
PCT/JP2009/001545
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
井上博雅
吉村昭彦
中西洋一
Original Assignee
国立大学法人九州大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人九州大学 filed Critical 国立大学法人九州大学
Priority to JP2010505403A priority Critical patent/JPWO2009122748A1/ja
Publication of WO2009122748A1 publication Critical patent/WO2009122748A1/ja

Links

Images

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00Drugs for disorders of the respiratory system
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02Nasal agents, e.g. decongestants
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06Antiasthmatics
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00Drugs for dermatological disorders
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04Antipruritics
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02Ophthalmic agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02Ophthalmic agents
    • A61P27/14Decongestants or antiallergics
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08Antiallergic agents
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703Inhibitors; Suppressors
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10Type of nucleic acid
    • C12N2310/14Type of nucleic acid interfering N.A.

Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent for respiratory diseases or allergic diseases containing an IL-13 inhibitor or an IL-17 production promoter as an active ingredient.
  • Bronchial asthma is caused by chronic inflammation with eosinophil infiltration, reversible airway obstruction, airway hyperresponsiveness (AHR), goblet cell hyperplasia / dysplasia, and subepithelial fibrosis Characterized (references 1 and 2). Bronchial asthma is an important disease that is clinically prevalent throughout the world. Although inhaled antigens for bronchial asthma are well understood, little is known about the mechanism by which bronchial asthma develops and the mechanism by which bronchial asthma persists. Airway inflammation and airway structural changes are now considered to be important features of bronchial asthma.
  • Th2 cytokine cytokine products including interleukin (IL) -4, IL-5, IL-9 and IL-13
  • IL interleukin
  • Th2 cytokine cytokine products
  • IL-4, IL-5, IL-9 and IL-13 Th2 cytokine
  • the cytokine signaling suppressor (SOCS) protein family is one of the negative feedback regulators for the JAK / STAT signaling pathway, and eight members have been identified.
  • the members that have been identified are cytokine-inducible SH2-containing protein (CIS) and SOCS 1-7. These are characterized by the presence of a C-terminal conserved region called SH2 domain and SOCS box (references 6 and 7).
  • SOCS proteins are essential for the control of immune responses (Refs. 8-10). Particularly in allergic inflammation, these are thought to be important for helper T cell differentiation.
  • SOCS5 and SOCS3 are selectively expressed in Th1 and Th2 cells, respectively (references 11 and 12).
  • SOCS3 Overexpression of SOCS3 in T cells suppresses the activation of genes regulated by IL-12 such as IL-12 receptor ⁇ 2 and T-bet, causing Th1 differentiation disorder (Ref. 12). SOCS3 also regulates Th3 or Th17 differentiation (Refs. 13 and 14). On the other hand, SOCS5-overexpressing T cells show reduced IL-2 mediated Th2 development (Reference 15). In addition to these effects on T cells in allergic reactions, SOCS proteins may serve a regulatory function in the local structural cells of the target organ. However, the details of these local functions and molecular mechanisms in the Th2 reaction have not been elucidated.
  • IL-13 is currently considered particularly important. IL-13 was shown to induce allergen-induced AHR, eosinophilia, and mucus overproduction by in vivo experiments (References 16 and 17). Furthermore, local administration of recombinant IL-13 to nonimmune mice induces an asthma phenotype (Refs. 17 and 18). The IL-13 signal has been shown to be a complex. Tissue and molecular responses triggered by IL-13 depend on STAT6 and ERK1 / 2 signaling (refs. 19-22). IL-13 signaling via cell surface IL-13 ⁇ 2 receptor, the AP-1 dependent induces TGF-beta 1 production (ref. 23).
  • STAT6 is an important signaling molecule that is activated by IL-13 and is essential for the progression of allergen-induced experimental asthma (Refs. 19, 24, and 25). It is also known to induce the SOCS family by activating JAK / STAT (reference documents 26 to 28).
  • IL-13 interleukin-13
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • Pulmonary fibrosis is a disease in which the alveolar wall thickens and falls into a respiratory failure state, and there is no effective treatment yet. Therefore, development of therapeutic agents for chronic obstructive pulmonary disease and pulmonary fibrosis is desired.
  • IL-13 interleukin-13
  • MMP matrix metalloprotease
  • emphysema asthma Zheng T, J. Clin. Invest 2000, 106 (9): 1081 (Non-Patent Document 2)
  • it is considered to be involved in pulmonary fibrosis by activating lung fibroblasts and inducing inflammatory cytokines such as IL-6 and MCP1 (for example, Doucet).
  • Patent Document 1 JP-A-2001-231558 discloses that IL-13 is involved in asthma and allergic diseases.
  • Patent Document 2 JP 2003-513637 A discloses an assay system based on the JAK-STAT-SOCS pathway. That is, in this document, based on the knowledge that the JAK-STAT-SOCS pathway is highly sensitive to chemicals that cause cellular stress, it causes cellular stress using an assay system based on the JAK-STAT-SOCS pathway. Methods for monitoring compounds have been disclosed (paragraphs [0004] and [0005] of the same document). Also, in this document, SOCS1 is cited as an example of SOCS (suppressors of cytokine signaling) (paragraph [0003] of the document). *
  • Patent Document 3 JP 2007-507438 A discloses a drug for chronic inflammatory disease or autoimmune disease using specific DNAzyme or siRNA for SOCS1, although there is no specific example. Yes.
  • An object of the present invention is to provide a therapeutic agent for respiratory diseases such as asthma, chronic obstructive pulmonary disease or inflammatory lung disease.
  • the object of the present invention is to provide a therapeutic agent for allergic diseases such as bronchial asthma, atopic dermatitis, allergic conjunctivitis or allergic rhinitis.
  • An object of the present invention is to provide a novel inhibitor of IL-13-induced reaction and a novel eotaxin production inhibitor.
  • the object of the present invention is to provide a novel therapeutic or preventive agent for IL-13-induced interstitial lung lesions.
  • the object of the present invention is to provide a novel tumor therapeutic agent.
  • An object of the present invention is to provide an IL-17 production promoter, a Th2 differentiation inhibitor, and a therapeutic agent for asthma that contain siRNA as an active ingredient and induce RNA interference.
  • the present invention causes allergic diseases and inflammation (such as inflammatory pneumonia) when the expression of SOCS1 decreases, particularly in local organs such as the respiratory tract and skin, while introducing SOCS1 into these constituent cells.
  • allergic diseases and inflammation such as inflammatory pneumonia
  • SOCS1 inhibits the function of IL-13.
  • the 1st aspect of this invention is related with the therapeutic agent of the respiratory system disease which contains SOCS proteins, such as SOCS1, SOCS3, as an active ingredient.
  • SOCS1 inhibits the function of IL-13. Therefore, the therapeutic agent according to the first aspect of the present invention contains SOCS as an active ingredient, so that the respiratory system such as asthma, chronic obstructive pulmonary disease, or inflammatory lung disease involving IL-13. It is effective for diseases. Moreover, respiratory disease etc. can be effectively treated by locally administering SOCS1 to the respiratory epithelium. Therefore, a preferred embodiment of the first aspect of the present invention is the therapeutic agent according to any one of the above, wherein the dosage form is an inhalant, a nasal drop, or a coating agent.
  • the agent of the present invention can also be treated systemically by oral administration. Therefore, the therapeutic agent according to the first aspect of the present invention may be an oral agent.
  • the second aspect of the present invention relates to a therapeutic agent for allergic diseases containing SOCS proteins such as SOCS1 and SOCS3 as active ingredients.
  • SOCS proteins such as SOCS1 and SOCS3 as active ingredients.
  • IL-13 is known to be involved in allergic diseases, and SOCS1 inhibits IL-13 as demonstrated by the examples described below. Therefore, a therapeutic agent containing SOCS protein such as SOCS1 as an active ingredient is effective for treating allergic diseases.
  • Allergic diseases include bronchial asthma, atopic dermatitis, allergic conjunctivitis or allergic rhinitis.
  • the third aspect of the present invention relates to an inhibitor of an IL-13-induced reaction containing SOCS proteins such as SOCS1 and SOCS3 as active ingredients. It has been demonstrated for the first time by Examples that SOCS1 inhibits IL-13. Therefore, the agent of the present invention is effective for the treatment of diseases involving IL-13.
  • a preferred embodiment of the third aspect of the present invention relates to an eotaxin production inhibitor containing an SOCS protein such as SOCS1 or SOCS3 as an active ingredient.
  • an SOCS protein such as SOCS1 or SOCS3
  • the production of eotaxin can be effectively inhibited by using SOCS1.
  • the agent of the present invention is effective as a therapeutic agent for eosinophilia. This is considered to be an effect brought about by SOCS1 inhibiting IL-13.
  • the fourth aspect of the present invention relates to a therapeutic or prophylactic agent for IL-13-induced interstitial lung lesions containing SOCS proteins such as SOCS1 and SOCS3 as active ingredients.
  • SOCS proteins such as SOCS1 and SOCS3 as active ingredients.
  • the therapeutic agent or preventive agent of pulmonary fibrosis is mentioned. Since SOCS1 inhibits the IL-13-induced reaction, an agent containing a SOCS protein such as SOCS1 as an active ingredient is effective as a therapeutic or preventive agent for IL-13-induced interstitial lung lesions.
  • the fifth aspect of the present invention relates to a tumor therapeutic agent containing an SOCS protein such as SOCS1, SOCS3 or the like as an active ingredient.
  • an SOCS protein such as SOCS1, SOCS3 or the like
  • Inhibition of IL-13 has been reported to exhibit antitumor activity (Kawakami K, Cancer Res. 2006 Apr 15; 66 (8): 4434-42).
  • SOCS such as SOCS1 inhibits the IL-13 induction reaction. Therefore, it is considered that an agent containing a SOCS protein such as SOCS1 as an active ingredient functions effectively as a tumor therapeutic agent.
  • the sixth aspect of the present invention relates to a therapeutic agent for respiratory system diseases or allergic diseases containing DNA encoding SOCS1 (DNA represented by SEQ ID NO: 2).
  • SOCS1 since SOCS1 is effective as a therapeutic agent for respiratory diseases or allergic diseases, an agent containing DNA encoding SOCS1 is effective for the treatment of these diseases.
  • a preferred embodiment of the invention of this embodiment is the agent described above, which contains the DNA encoding SOCS1 as an expression vector. That is, since the DNA encoding SOCS1 is contained as an expression vector, for example, SOCS1 can be expressed specifically in the affected area (airways, lungs, skin, etc.), and can be effectively used for local treatment or the like. it can.
  • the present invention relates to a therapeutic agent for the above respiratory diseases, a therapeutic agent for allergic diseases, an inhibitor of IL-13-induced reaction, an inhibitor of eotaxin production, a therapeutic agent for IL-13-induced interstitial lung lesions, Also provided is the use of SOCS1 for the manufacture of a prophylactic or tumor therapeutic agent.
  • the present invention relates to a method for treating respiratory diseases, allergic diseases, IL-13-induced interstitial lung lesions or tumors, comprising the step of administering an effective amount of SOCS1 to a target human or non-human mammal. Also provide.
  • the seventh aspect of the present invention relates to an IL-17 production promoter comprising SOCS3 siRNA as an active ingredient.
  • SOCS3 siRNA either the RNA described in SEQ ID NO: 11 and / or the RNA described in SEQ ID NO: 12
  • an agent containing SOCS3 siRNA as an active ingredient is effective as an IL-17 production promoter.
  • promoting IL-17 production is effective for the treatment of asthma, for example.
  • IL-17 is known to have a function of increasing the number of neutrophils, etc. Therefore, the above-mentioned IL-17 production promoter can treat various diseases or the like through an increase in the number of neutrophils. Effective for prevention.
  • the eighth aspect of the present invention relates to a Th2 differentiation inhibitor containing an SOCS3 siRNA as an active ingredient.
  • Th2 differentiation was inhibited when SOCS3 siRNA (either or both of RNA shown in SEQ ID NO: 11 and RNA shown in SEQ ID NO: 12) was introduced into T cells. This is a result found for the first time by this example. Therefore, an agent containing SOCS3 siRNA as an active ingredient is effective as a Th2 differentiation inhibitor. And as shown by the Example mentioned later, inhibiting Th2 differentiation is considered effective for the treatment of asthma, for example.
  • the ninth aspect of the present invention relates to a therapeutic agent for asthma comprising an SOCS3 siRNA as an active ingredient.
  • an SOCS3 siRNA as an active ingredient.
  • the present invention also provides the use of SOCS3 siRNA for producing an IL-17 production promoter, a Th2 differentiation inhibitor, or a therapeutic agent for asthma.
  • the present invention also provides a method for promoting IL-17 production, a method for inhibiting Th2 differentiation, or a method for treating asthma using SOCS3 siRNA.
  • a therapeutic agent for respiratory diseases such as asthma, chronic obstructive pulmonary disease or inflammatory lung disease can be provided.
  • a therapeutic agent for allergic diseases such as bronchial asthma, atopic dermatitis, allergic conjunctivitis, or allergic rhinitis can be provided.
  • a novel inhibitor of IL-13-induced reaction and a novel eotaxin production inhibitor can be provided.
  • a novel therapeutic or preventive agent for IL-13-induced interstitial lung lesions can be provided.
  • a novel tumor therapeutic agent can be provided.
  • an IL-17 production promoter a Th2 differentiation inhibitor, and an asthma therapeutic agent that contain siRNA as an active ingredient and induce RNA interference.
  • FIG. 1 shows the effect of IL-13 on SOCS1 expression.
  • Fig.1 (a) is the photograph replaced with drawing which shows a western blotting result.
  • FIG. 1 (b) is a graph instead of a drawing showing the results of real-time RT-PCR analysis of SOCS1 mRNA in mouse lung.
  • FIG.1 (c) is the photograph replaced with drawing which shows the western blotting result regarding SOCS1 expression.
  • FIG. 2 shows the relationship between SOCS1-deficient mice and IL-13-induced asthma.
  • FIG. 2 (a) shows the number of eosinophils.
  • FIG. 2 (b) shows the eotaxin concentration.
  • FIG. 1 shows the effect of IL-13 on SOCS1 expression.
  • FIG. 1 (a) is the photograph replaced with drawing which shows a western blotting result.
  • FIG. 1 (b) is a graph instead of a drawing showing the results of real-time RT-PCR analysis of SOCS1 mRNA in mouse lung.
  • FIG. 3 shows that regulation of SOCS1 regulates eotaxin expression after STAT6 activation and IL-13 treatment.
  • FIG. 3 (a) is a photograph replacing a drawing showing the expression of ethaoxin in a strain prepared by adjusting wild type and SOCS1.
  • FIG. 3 (b) is a photograph of Western blotting replacing the drawing showing the influence of a retroviral vector having a SOCS1 gene.
  • FIG. 3 (c) is a graph replaced with a drawing showing the eotaxin level in the cell supernatant.
  • FIG. 3 (d) is a photograph replacing a drawing which shows the effect of SOCS1 inactivation on IL-13 receptor.
  • FIG. 4 shows suppression of asthma phenotype by SOCS1 overexpression.
  • FIG. 4 (a) is a graph instead of a drawing showing SOCS1 expression in lungs of BALB / c mice 3 days after infection with AD-LacZ or Ad-SOCS1 and Ad-CRe measured by real-time RT-PCR.
  • FIG. 4 (b) is a graph instead of a drawing showing the number of eosinophils in the BAL fluid after IL-13 treatment was performed on BALB / c mice transformed with the SOCS1 gene by adenovirus.
  • FIG. 4 (c) is a photograph (upper panel) and a graph (lower panel) in place of the drawing showing SOCS1 expression in OVA-induced asthma.
  • FIG. 4 (d) is a graph instead of a drawing showing the effect of IL-13 inhibition on SOCS1 expression after OVA exposure.
  • BALB / c mouse groups were treated daily with soluble IL-13R ⁇ 2-Fc (sIL-13R ⁇ 2-Fc) or control protein. The treatment was started one day before the OVA exposure.
  • FIG. 4 (e) is a graph replaced with a drawing showing the change in tracheal pressure dependent on acetylcholine.
  • FIG. 4F is a graph replaced with a drawing showing the calculation result of PC200-ACh.
  • FIG.4 (g) is a graph replaced with drawing which shows the measurement result of an eosinophil count.
  • FIG. 5 shows Th2 cytokines (IL-4, IL-5, IL-13), IFN ⁇ , TGF ⁇ , and IL in CD4 + T cells from SOCS3 + / + XDO11.10 and SOCS3 +/ ⁇ XDO11.10 mice. -10 measured by ELISA.
  • FIG. 5 shows Th2 cytokines (IL-4, IL-5, IL-13), IFN ⁇ , TGF ⁇ , and IL in CD4 + T cells from SOCS3 + / + XDO11.10 and SOCS3 +/ ⁇ XDO11.10 mice. -10 measured by ELISA.
  • FIG. 5 shows Th2 cytokines
  • FIG. 6 (a) is a graph instead of a drawing in which the effect of SOCS3 downregulation in T cells on the reaction of the respiratory tract inhaled with acetylcholine was measured.
  • FIG. 6B is a graph instead of a drawing showing the induced concentration 200 (PC 200 ) for each mouse.
  • FIG. 6 (c) is a graph replacing a drawing in which the effect of down-regulation of SOCS3 in T cells on eosinophils in BAL fluid of recipient mice was measured.
  • FIG. 7 shows the effect of SOCS3-specific siRNA treatment analyzed by RT-PCR and real-time PCR on SOCS3 expression in CD4 + T cells.
  • FIG. 7 (a) is an electrophoretogram showing RT-PCR analysis of mSOCS3 in CD4 + T cells of naive BALB / c 72 hours after control siRNA treatment and SOCS3-specific siRNA treatment.
  • FIG. 7 (b) is a drawing showing real-time PCR analysis of mSOCS3 in naive BALB / c CD4 + T cells 24 hours, 48 hours, and 72 hours after control siRNA treatment and SOCS3-specific siRNA treatment. It is a graph which changes.
  • FIG. 8 shows Th2 cytokines (IL-4, IL-5, IL-13), IFN ⁇ , TGF ⁇ , IL in the cell culture supernatant of CD4 + T cells treated with SOCS3-specific siRNA or control siRNA.
  • FIG. 9 (a) is a graph instead of a drawing showing the effect of SOCS3 down-regulation in T cells on airway responsiveness to acetylcholine inhalation.
  • FIG. 9B is a graph instead of a drawing showing the induced concentration (PC 200 ) for each mouse.
  • FIG. 9 (c) shows the effect of SOCS3 down-regulation in T cells on the number of eosinophils in the BAL fluid of recipient mice.
  • FIG. 10 is a graph instead of a drawing showing the effect of administration of a pan-JAK inhibitor on allergic airway inflammation.
  • the first aspect of the present invention relates to a therapeutic agent for respiratory diseases containing SOCS such as SOCS1 and SOCS3 as an active ingredient.
  • SOCS1 suppressor of cytokining signaling 1
  • the therapeutic agent according to the first aspect of the present invention contains SOCS1 as an active ingredient, so that the respiratory system such as asthma, chronic obstructive pulmonary disease, or inflammatory pulmonary disease involving IL-13. It is effective for diseases.
  • SOCS1 is a known protein discovered by the present inventors as described in a reference document described later.
  • the base sequence of DNA encoding SOCS1 is introduced as ID.U88326 in NCBI GenBank. According to the site, it is described that SOCS1 was published in Nature 387 (6666), 917-921 (1997).
  • SOCS1 is a known protein as described above, and can be isolated and purified by a known method. Specifically, the amino acid residue sequence of SOCS1 is represented by SEQ ID NO: 1, and the base sequence of DNA encoding SOCS1 is represented by SEQ ID NO: 2.
  • SOCS1 may not include a part related to other domains as long as the domain governing the mechanism of action is included.
  • Examples of the domain that controls the mechanism of action of SOCS1 include the amino acid sequence at positions 52 to 67 of SEQ ID NO: 1 (kinase inhibitory region (KIR)).
  • SOCS1 is a domain containing a partial peptide containing an amino acid residue having 90% or more (preferably 95% or more, more preferably 98% or more) of homology with a domain that controls its mechanism of action or full-length SOCS1.
  • It may be a peptide or protein, or a polypeptide or protein containing a partial peptide having homology with a kinase inhibitory region consisting of 12 amino acids at the N-terminus (eg, SEQ ID NO: 17).
  • the SOCS family is a factor that controls the JAK / STAT signal transduction pathway.
  • the SOCS protein binds to the phosphorylated site of JAK (1007th amino acid of SEQ ID NO: 18). Therefore, as the protein or peptide of the present invention, a peptide that binds to the phosphorylated binding site of JAK that is phosphorylated may be used.
  • a peptide that binds to the amino acid sequence of 993 to 1015 of SEQ ID NO: 18 that forms the activation loop (A-loop) of JAK is preferable, and binds to the amino acid sequence of 1001 to 1013 of SEQ ID NO: 18. Peptides are more preferred.
  • the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 binds to the amino acid sequence of positions 1001 to 1013 of SEQ ID NO: 18 (J Immunol .; 2004, vol 172, 7510-7518). Therefore, a peptide consisting of an amino acid sequence containing SEQ ID NO: 17 can be preferably used as the peptide of the present invention.
  • the protein substantially the same as SOCS1 it is also referred to as the protein of the present invention.
  • introducing a predetermined modification into SOCS1 or finding a pharmacophore may be performed according to a known method.
  • active ingredient means a main component for obtaining a predetermined therapeutic effect.
  • an effective amount of SOCS1 needs to be contained in the drug.
  • effective amount means an amount necessary to obtain a predetermined medicinal effect.
  • the second aspect of the present invention relates to a therapeutic agent for allergic diseases containing SOCS proteins such as SOCS1 and SOCS3 as active ingredients.
  • SOCS proteins such as SOCS1 and SOCS3 as active ingredients.
  • IL-13 is known to be involved in allergic diseases, and SOCS1 inhibits IL-13 as demonstrated by the examples described below. Therefore, a therapeutic agent containing SOCS1 as an active ingredient is effective for the treatment of allergic diseases.
  • Allergic diseases include bronchial asthma, atopic dermatitis, allergic conjunctivitis or allergic rhinitis.
  • the third aspect of the present invention relates to an inhibitor of an IL-13-induced reaction containing SOCS proteins such as SOCS1 and SOCS3 as active ingredients. It has been demonstrated for the first time by Examples that SOCS1 inhibits the activity of IL-13. Therefore, the agent of the present invention is effective for the treatment of diseases involving IL-13.
  • a preferred embodiment of the third aspect of the present invention relates to an eotaxin production inhibitor containing an SOCS protein such as SOCS1 or SOCS3 as an active ingredient.
  • an SOCS protein such as SOCS1 or SOCS3
  • the production of eotaxin can be effectively inhibited by using SOCS1. Since eotaxin is thought to cause eosinophilia, the agent of the present invention is effective as a therapeutic agent for eosinophilia.
  • the fourth aspect of the present invention relates to a therapeutic or prophylactic agent for IL-13-induced interstitial lung lesions containing SOCS proteins such as SOCS1 and SOCS3 as active ingredients.
  • SOCS proteins such as SOCS1 and SOCS3 as active ingredients.
  • Specific examples include therapeutic agents or preventive agents for pulmonary fibrosis or chronic emphysema (chronic obstructive pulmonary disease, COPD). Since SOCS1 inhibits the IL-13-induced reaction, an agent containing a SOCS protein such as SOCS1 as an active ingredient is effective as a therapeutic or preventive agent for IL-13-induced interstitial lung lesions.
  • the fifth aspect of the present invention relates to a tumor therapeutic agent containing an SOCS protein such as SOCS1, SOCS3 or the like as an active ingredient.
  • an SOCS protein such as SOCS1, SOCS3 or the like
  • Inhibition of IL-13 has been reported to exhibit antitumor activity (Kawakami K, Cancer Res. 2006 Apr 15; 66 (8): 4434-42).
  • SOCS such as SOCS1 inhibits the IL-13 induction reaction. Therefore, it is considered that an agent containing a SOCS protein such as SOCS1 as an active ingredient functions effectively as a tumor therapeutic agent.
  • the sixth aspect of the present invention relates to a therapeutic agent for respiratory diseases or allergic diseases containing DNA encoding SOCS1.
  • SOCS1 is effective for treating respiratory diseases or allergic diseases
  • an agent containing DNA encoding SOCS1 is effective for treating these diseases.
  • a preferred embodiment of the invention of this embodiment is the agent described above, which contains the DNA encoding SOCS1 as an expression vector. That is, since the DNA encoding SOCS1 is contained as an expression vector, for example, SOCS1 can be expressed specifically in the affected area (airways, lungs, skin, etc.), and can be effectively used for local treatment or the like. it can.
  • the present invention relates to a therapeutic agent for the above respiratory diseases, a therapeutic agent for allergic diseases, an inhibitor of IL-13 induced reaction, an inhibitor of eotaxin production, a therapeutic agent / preventive agent for IL-13 induced lung lesions. Or the use of SOCS1 for the manufacture of a tumor therapeutic agent.
  • the present invention also provides a method for treating respiratory diseases, allergic diseases, IL-13-induced lung lesions or tumors, comprising the step of administering an effective amount of SOCS1 to a target human or non-human mammal. To do.
  • the present invention also provides a therapeutic method for treatment of respiratory diseases or allergic diseases, comprising the step of administering an expression vector that controls the expression of SOCS1 to a target human or non-human mammal.
  • the present invention further provides a method for treating respiratory diseases such as asthma and allergic diseases such as atopic dermatitis, which control T cell responses by introducing SOCS and dominant negative SOCS.
  • the active ingredient of the drug of the present invention is a SOCS protein such as SOCS1 or SOCS3.
  • the SOCS protein may be a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, formic acid, acetic acid, propionic acid, oxalic acid, malonic acid, succinic acid, fumaric acid, maleic acid, lactic acid
  • Acid addition salts with organic acids such as malic acid, tartaric acid, citric acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, aspartic acid, glutamic acid, inorganic bases such as sodium, potassium, magnesium, calcium, aluminum, methylamine, ethylamine, Examples include salts with organic bases such as ethanolamine, lysine, ornithine, and ammonium salts.
  • a potassium salt is particularly preferable.
  • the active ingredient of the present invention includes
  • the protein of the present invention, a partial peptide thereof, or a salt thereof can be produced according to a known peptide synthesis method or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptidase.
  • the peptide synthesis method include a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method.
  • the target protein can be purified.
  • the partial peptide of the present invention can be purified and isolated by combining ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization and the like.
  • the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted into an appropriate salt by a known method or a method similar thereto, and conversely, when obtained as a salt, the known method or a method equivalent thereto It can be converted to the free form or other salts by methods.
  • the DNA encoding the protein of the present invention may be any DNA as long as it contains the above-described base sequence encoding the protein of the present invention.
  • a means for cloning of the DNA encoding the protein of the present invention amplification by a PCR method using a synthetic DNA primer containing a part of the DNA encoding the protein of the present invention of the present invention, or incorporation into an appropriate vector.
  • DNA can be selected by hybridization with a DNA fragment encoding a part or the entire region of the protein of the present invention or labeled with synthetic DNA.
  • the hybridization method can be performed, for example, according to the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989).
  • a commercially available library it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • the DNA base sequence can be converted using a known kit or a known method or a method analogous thereto.
  • the expression vector of the protein of the present invention can be produced, for example, by excising the target DNA fragment from the DNA encoding the protein of the present invention and ligating the DNA fragment downstream of the promoter in an appropriate expression vector.
  • vectors include E. coli-derived plasmids (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, pC194), yeast-derived plasmids (eg, pSH19, pSH15), ⁇ phage, and the like.
  • the promoter may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • SR ⁇ promoter SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned.
  • the SOCS protein such as SOCS1, which is an active ingredient of the therapeutic agent in the present invention, can achieve a therapeutic effect by introducing a gene encoding SOCS into a living body using a gene therapy technique.
  • an expression vector that expresses SOCS in vivo is introduced into the living body by genetic recombination and transformed.
  • a technique for treating a disease by introducing and expressing a gene encoding a protein that provides a therapeutic effect in a living body is known.
  • a polynucleotide that suppresses the expression of the IL-13 gene by decoy, dominant negative, antisense nucleic acid, ribozyme, or RNAi is incorporated downstream of an appropriate promoter sequence, and decoy, dominant negative, antisense RNA, It can be administered as a ribozyme or RNA expression vector that provides RNAi.
  • this expression vector is introduced into tracheal cells, T cells, etc.
  • a polynucleotide that suppresses the expression of the gene is expressed by decoy, dominant negative, antisense nucleic acid, ribozyme, or RNAi of these genes, and the gene
  • the therapeutic effect can be achieved for respiratory related diseases and allergic diseases by lowering the expression level.
  • a decoy is a compound containing a DNA sequence on a chromosome to which a transcription factor binds, and refers to a compound that inhibits the transcription factor from binding to DNA on a chromosome.
  • Compounds used in typical decoys are nucleic acids and their analogs. Decoys can be made from DNA sequences to which transcription factors bind, oligonucleotides containing their complements, or variants thereof.
  • Dominant negative is a mutant that works quantitatively and qualitatively over the wild type and inhibits the function of the wild type.
  • a dominant negative can be generated by deleting, substituting, adding or inserting a part of a wild-type amino acid. That is, the dominant negative SOCS1 can be created according to a known method.
  • Antisense RNA is RNA having a base sequence complementary to the sense sequence of a gene.
  • RNA having a continuous base sequence of usually 15 bases or more, for example, 20 bases or more, or 30 bases or more is used.
  • an antisense nucleic acid that can hybridize to a region including the initiation codon is said to have a large effect of suppressing the expression of the gene.
  • Ribozyme is RNA with a catalytic action that cleaves RNA in a base sequence-specific manner.
  • ribozymes hammerhead and hairpin ribozymes are known.
  • Each ribozyme is composed of a base sequence portion complementary to the region to be cleaved and a base sequence portion for retaining a structure necessary for the expression of catalytic activity.
  • the base sequence complementary to the region to be cleaved can be arbitrary.
  • the seventh aspect of the present invention relates to an IL-17 production promoter comprising SOCS3 siRNA as an active ingredient.
  • SOCS3 siRNA either the RNA described in SEQ ID NO: 11 and / or the RNA described in SEQ ID NO: 12
  • an agent containing SOCS3 siRNA as an active ingredient is effective as an IL-17 production promoter.
  • asthmatic reaction was suppressed by introduce
  • IL-17 is known to have functions such as increasing the number of neutrophils. Therefore, the above-mentioned IL-17 production promoter is effective for the treatment or prevention of various diseases through an increase in the number of neutrophils.
  • the eighth aspect of the present invention relates to a Th2 differentiation inhibitor containing an SOCS3 siRNA as an active ingredient.
  • Th2 differentiation was inhibited when SOCS3 siRNA (either or both of RNA shown in SEQ ID NO: 11 and RNA shown in SEQ ID NO: 12) was introduced into T cells. Therefore, an agent containing SOCS3 siRNA as an active ingredient is effective as a Th2 differentiation inhibitor.
  • Th2 cells produce Th2 cytokines (IL-4, IL-5, IL-13, etc.). Since Th2 cytokine is not produced by inhibiting Th2 differentiation, allergic diseases involving Th2 cytokine can be prevented or treated. And as shown by the Example mentioned later, inhibiting Th2 differentiation is considered effective for the treatment of asthma, for example.
  • the ninth aspect of the present invention relates to a therapeutic agent for asthma comprising an SOCS3 siRNA as an active ingredient.
  • an SOCS3 siRNA as an active ingredient.
  • the present invention also provides the use of SOCS3 siRNA for producing an IL-17 production promoter, a Th2 differentiation inhibitor, or a therapeutic agent for asthma.
  • the present invention also provides a method for promoting IL-17 production, a method for inhibiting Th2 differentiation, or a method for treating asthma using SOCS3 siRNA.
  • the SOCS3 siRNA of the present invention is not limited to the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 11 or 12 as long as it can specifically suppress the expression of SOCS3.
  • the siRNA used in the present invention has a base sequence number of 15 to 40 bases, preferably 17 to 30 bases, and more preferably 19 to 25 bases. If the number of base sequences is too short, expression of genes other than SOCS3 is likely to be suppressed, so 19 to 25 bases are desirable.
  • the synthesis of siRNA is not particularly limited, and may be performed by a known method. Specific examples include a solid phase method and a liquid phase method.
  • the synthesized siRNA may be purified by a known method, and examples thereof include reverse phase column chromatography, gel filtration, and HPLC.
  • the infection with siRNA is not particularly limited, and may be performed by a known method. Specifically, the electroporation method, lipofection method, calcium phosphate method, DEAE-dextran method, virus vector method, microinjection method and the like can be used. Conditions such as the amount of siRNA at the time of infection and the method of siRNA infection may be appropriately adjusted according to the tissues or cells to be infected. Since siRNA is easily decomposed when used in a single strand state (single strand RNA (ssRNA)), it is preferable to infect in a double strand state (double strand RNA (dsRNA)) having a complementary strand.
  • ssRNA single strand RNA
  • dsRNA double strand RNA
  • the method for producing dsRNA is not particularly limited, and two complementary siRNAs may be annealed by a known method.
  • the presence or absence of siRNA infection can be examined by a known method such as PCR, real-time PCR, or Northern blotting by extracting total RNA from a part of the infected tissue or cell by a known method.
  • the drug of the present invention is an oral solid preparation, an oral liquid preparation, an injection, an injectable preparation, an oral preparation, using an organic or inorganic carrier, excipient, or other additive suitable for oral or parenteral administration, according to a conventional method. It can be prepared as a parenteral preparation such as a nasal or inhalant. Specific examples of the dosage form include inhalants, nasal drops, and coating agents.
  • transmucosal agents such as inhalants and nasal agents
  • solid, liquid, and semi-solid agents are used and can be produced according to known methods.
  • excipients such as lactose and starch, and pH adjusters, preservatives, surfactants, lubricants, stabilizers, thickeners and the like may be added as appropriate.
  • an appropriate device for inhalation or insufflation can be used.
  • the compound may be administered alone or as a powder in a formulated mixture, or as a solution or suspension in combination with a medically acceptable carrier. Can do.
  • the dry powder inhaler or the like may be for single or multiple administration, and a dry powder or a powder-containing capsule can be used. Alternatively, it may be in the form of a pressurized aerosol spray using a suitable gas such as a suitable propellant such as chlorofluoroalkane, hydrofluoroalkane or carbon dioxide.
  • a suitable gas such as a suitable propellant such as chlorofluoroalkane, hydrofluoroalkane or carbon dioxide.
  • Injections such as intravenous, intramuscular, and subcutaneous injections include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, and emulsions.
  • aqueous solution and suspension diluent include distilled water for injection and physiological saline.
  • diluents for water-insoluble solutions and suspensions include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol, polysorbate 80, and the like.
  • Such a composition may further contain adjuvants such as preservatives, wetting agents, emulsifiers, dispersants, stabilizers (for example, lactose), and solubilizing agents (for example, glutamic acid and aspartic acid).
  • These are sterilized, for example, by filtration through a bacteria storage filter, blending with a bactericide or irradiation. These can also be used by producing a sterile solid composition and dissolving it in sterile water or a sterile solvent for injection before use.
  • Oral solid preparations include tablets, powders, fine granules, granules, capsules, pills, sustained-release preparations and the like.
  • one or more active substances are at least one inert diluent such as lactose, mannitol, glucose, microcrystalline cellulose, starch, corn starch, polyvinylpyrrolidone, magnesium aluminate metasilicate. Mixed with.
  • composition is prepared according to conventional methods with additives other than inert diluents, for example, binders such as hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose (HPMC); lubricants such as magnesium stearate, polyethylene glycol, starch, talc; Disintegrants such as calcium calcium glycolate and carmellose calcium; stabilizers such as lactose; solubilizers such as glutamic acid or aspartic acid; plasticizers such as polyethylene glycol; titanium oxide, talc, yellow iron oxide A colorant such as If necessary, tablets or pills may be coated with a sugar coating such as sucrose, gelatin, agar, pectin, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose phthalate, or a film of a gastric or enteric substance.
  • binders such as hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose (HPMC); lubricants such as magnesium stearate, polyethylene glycol, starch, talc; Disintegrants
  • Oral liquid preparations include pharmaceutically acceptable emulsions, solutions, suspensions, syrups, elixirs, etc., and include commonly used inert diluents such as purified water and ethanol. .
  • the composition may contain adjuvants such as wetting agents and suspending agents, sweeteners, flavors, fragrances and preservatives.
  • the dose of the active ingredient of the present invention is appropriately determined depending on the individual case in consideration of the administration route, the symptoms of the disease, the age, sex, etc. of the administration subject. About 0.1 to 500 mg / day, preferably 1 to 250 mg / day, which are administered in 1 to 2 divided doses.
  • the drug of the present invention can be used together with other drugs used for the treatment of, for example, asthma (eg bronchial asthma), chronic obstructive pulmonary disease, pulmonary fibrosis, or allergic rhinitis or in combination with time. .
  • asthma eg bronchial asthma
  • chronic obstructive pulmonary disease e.g pulmonary fibrosis
  • allergic rhinitis e.g rhinitis
  • drugs examples include epinephrine, ephedrine hydrochloride, isopreterenol, trimethquinol hydrochloride, salbutamol sulfate, terbutaline sulfate, tubuterol hydrochloride, fenoterol, procaterol hydrochloride and other ⁇ -stimulants, Anticholinergic drugs such as ipratropium bromide, flutropium, oxitropium, xanthine derivatives such as theophylline, choline theophylline, aminophylline, diprofylline, proxyphylline, proxyphylline combination drug, diprofiline combination drug, peripheral respiratory stimulant such as doxapram hydrochloride, Inhalation of central respiratory stimulants such as dimeferrin, acetazolamide, medroxyprogesterone, surfactene, and aluminitin, cortisone, prednis
  • Anticholinergic drugs such as ipratrop
  • WT SOCS1 + / +
  • SOCS1 ⁇ / ⁇ mouse embryonic fibroblasts MEFs
  • All experiments using these mice were approved by the guidelines of the Kyushu University Animal Ethics Committee and conducted according to these guidelines.
  • adenovirus vectors Due to the toxic effect of 293 cells used for adenovirus vector and adenovirus administration recombinant virus production, the Cre-LoxP conditional expression system was utilized to construct adenovirus vectors.
  • Recombinant adenoviral vectors containing LacZ (Ad-LacZ), SOCS1 (Ad-SOCS1), and Cre recombinase (AD-Cre) were prepared in 293 cells according to a known method (58). After 1 ⁇ 10 8 pfu of Ad-SOCS1 and Ad-CRe were administered into the trachea under anesthesia, the SOCS1 expression level by RT-PCR was observed as a peak 3-5 days later. To express with SOCS1 adenovirus, mice were administered adenoviral vector (1 ⁇ 10 8 pfu) intratracheally 3 days before the first IL-13 or OVA treatment.
  • IL-13-treated IL-13 administration in vivo was performed according to known literature (Reference 18). Recombinant mouse IL-13 solution (0.5 mg) or vehicle solution was injected into the trachea on days 1, 3, and 5. BAL was performed on day 6, 24 hours after the last dose, and BAL cell differences were measured.
  • mice Sensitization and exposure 8 week old BALB / c mice were sensitized by intraperitoneal administration on days 1 and 14 of 20 ⁇ g OVA (Grade V; Sigma) and 2.25 mg aluminum hydroxide (Pierce, Rockford, Illinois). . On day 23, an adenoviral vector (1 ⁇ 10 8 pfu) was injected into the mouse trachea. On days 26-28, mice were exposed to aerosols containing saline or 1% OVA for 20 minutes per day according to known methods (ref. 12).
  • soluble IL-13R ⁇ 2-Fc fusion or control fusion protein 400 ⁇ g was intraperitoneally administered to experimental animals every day from day 25 (Reference 17).
  • 100 ⁇ g of IL-13 antagonist (soluble IL-13R ⁇ 2-Fc fusion protein) or control fusion protein was intraperitoneally administered to mice every other day from day 25 (Reference 59).
  • Eotaxin measurement Mouse eotaxin in BAL fluid supernatant and cultured cell supernatant was measured using ELISA kit (BioSource International, Camelillo, CA).
  • Reverse transcription (RT) polymerase chain reaction (PCR) was performed on 1.0 ⁇ g of total RNA.
  • Oligo (dT) primers were used for RT and cDNA was amplified by PCR using specific primers. The following mSOCSs-specific primer pairs were used for PCR.
  • mSOCS1 5′-CTCGGATAGGATGGGTAGCACGCAA-3 ′ (SEQ ID NO: 3) and 5′-CATCTTCACGCTGGAGCGCGAAGAA-3 ′ (SEQ ID NO: 4);
  • mSOCS2 5'-GACCAGCTGTCTGGGACGTGTTGA-3 '(SEQ ID NO: 5) and 5'-GAGAGAGAAATACTTATACCTGGGAAT-3' (SEQ ID NO: 6);
  • mSOCS3 5′-TGCGCCATGGTCACCCACACACAAGTTT-3 ′ (SEQ ID NO: 7) and 5′-GCTCCTTAAAGTGGAGCATCATACTGA-3 ′ (SEQ ID NO: 8).
  • the primers used for ⁇ -actin internal control were 5′-TCCTGTGGCATCCATGAAACT-3 ′ (SEQ ID NO: 9) and 5′-GAAGCACTTGCGGTGCACGAT-3 ′ (SEQ ID NO: 10), respectively.
  • PCR The specific conditions for PCR were performed according to a known method (reference document 18). Each of mSOCS1, mSOCS2, and mSOCS3 was performed by thermal denaturation (95 ° C., 30 seconds), annealing (60 ° C., 30 seconds), and extension reaction (72 ° C., 30 seconds). The number of cycles was 42 cycles, 33 cycles, and 38 cycles, respectively.
  • Mouse SOCS1 (ID: Mm00782550_s1) was detected by quantitative real-time RT-PCR using TaqMan Gene Expression Assays on the ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems).
  • a comparative threshold cycle method and internal control ( ⁇ -actin, 4352341E) were used to normalize target gene expression.
  • Mouse SOCS1 containing the retroviral production and infection IRES-GFP cassette or control pGCDNsamml / E vector was transfected into 293GPG packaging cells according to known methods (reference 60).
  • Mouse embryo fibroblasts (MEF) were transduced by retrovirus from the viral supernatant. After 48 hours, GFP positive cells were separated by FACS ARia (BD Biosciences) and used for experiments.
  • CD4 + T cells were isolated by magnetic cell sorting (MACS) from spleen cells of DO11.10XSOCS3 + / + and DO11.10XSOCS3 +/ ⁇ mice to create Th2 cells .
  • MCS magnetic cell sorting
  • Purified cells (5 ⁇ 10 5 cells / ml) were transformed into naive BALB / c irradiated splenocytes as antigen presenting cells (APCS) (4 ⁇ 10 6 cells / ml), pOVA (323-339) (1 ⁇ g / ml; BACHEM ), Recombinant IL-4 (100 ng / ml; PEPRO TECH, Inc.), anti-IL-12 antibody (10 ⁇ g / ml; R & D Systems, Inc.) and anti-CD28 (1 ⁇ g / ml; BD Farmingen Inc.). Activated with.
  • APCS antigen presenting cells
  • CD4 + T cells were collected from DO11.10XSOCS3 + / + and DO11.10XSOCS3 +/ ⁇ mice and maintained for restimulation.
  • CD4 + T cells (1 ⁇ 10 6 cells / ml) and newly isolated APCs (2 ⁇ 10 6 cells / ml) were cultured with pOVA (323-339) (1 ⁇ g / ml). After 48 hours, the culture supernatant was collected, and the cytokine profile, INF ⁇ , TGF ⁇ , IL-10, and IL-17 of the Th2 strain were measured using ELISA.
  • CD4 + T cells were collected from DO11.10XSOCS3 + / + mice and DO11.10XSOCS3 +/ ⁇ mice on day 8 of matched transplantation and loading and injected into the veins of naive BALB / c mice. Mice were given aerosolized OVA (5%) 1 to 5 days after matched transplantation of the cells.
  • SOCS3 siRNA Infected siRNA was purchased from Applied Biosystems for SOCS3 (# 160219) and FAM-labeled negative control (# 4620) siRNA.
  • the sequences of SOCS3 siRNA (# 160219) are as follows: SOCS3, 5′-CCUACGCAUCCAGUGUGAGtt-3 ′ (SEQ ID NO: 11) and 5′-CUCACAUGGAUGCGUAGGTt-3 ′ (SEQ ID NO: 12).
  • CD4 + T cells were isolated from DO11.10XSOCS3 + / + mice and these siRNAs were infected by electroporation with CD4 + T cells according to the manufacturer's instructions (Amaxan nucleofector system II and 96 well shuttle system). . After purification, CD4 + T cells were infected with 3 ⁇ g of control or SOCS3 siRNA. After electroporation, CD4 + T cells were induced into Th2 cells and used for matched transplants as described above.
  • naive BALB / c splenic CD4 + T cells were incubated and harvested 24, 48 and 72 hours after electroporation.
  • RNA of CD4 + T cells was isolated from naive BALB / c infected with SOCS3-specific siRNA or negative control siRNA by the guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform method.
  • Reverse transcription (RT) -polymerase chain reaction (PCR) was performed on 1.0 ⁇ g of total RNA.
  • Oligo (dT) primers were used for RT and cDNA was amplified by PCR using specific primers. The following primer pairs were used for PCR.
  • Real-time PCR primers were purchased from Applied Biosystems for mSOCS3 (Mm00545913-sl). PCR uses ABI7500 sequence detection system (Applied Biosystems, Foster City, CA), 12.5 ⁇ l Tasman universal PCR mix, 1.25 ⁇ l 20X assay on-demand gene expression assay mix and 11.25 ⁇ l RNase-free Performed in a 25 ⁇ l reaction mixture containing cDNA diluted in H 2 O. The sample was subjected to 40 cycles of amplification at 95 ° C. for 10 minutes and then at 95 ° C. for 15 seconds for denaturation and at 60 ° C. for 1 minute for annealing extension. Then, after completion of the PCR cycle, a dissociation curve was generated to confirm the amplification of a single product, and the threshold cycle number (Ct value) was determined. Absolute quantification (Qt value) was performed by Ct value and standard curve.
  • Ct value threshold cycle number
  • mice On day 14 of airway reactivity , 24 hours after the last aerosol challenge, mice were first anesthetized intraperitoneally with a mixture of ketamine and sodium pentobarbital to measure AHR for acetylcholine aerosol, and after tracheotomy, cannulae Inserted. Mice were mechanically ventilated (tidal volume, 0.3 ml; frequency, 120 breaths / min). Mice were administered muscle relaxants. Airway pressure was measured using a pressure transducer and recorded continuously. Acetylcholine was inhaled by an ultrasonic inhaler, and the concentration was increased stepwise (0.6 to 20 mg / ml). Data were expressed as an induced concentration of 200 (PC200) where the airway pressure is a concentration of 200% of its baseline value. A low PC200 value indicates a high AHR.
  • PC200 induced concentration of 200
  • bronchoalveolar lavage BAL
  • cytokine measurement AHR measurements the lungs were lavaged once with 1 ml of physiological saline using a tracheal cannula. Total cell counts and differentiated cell counts were performed as described above.
  • FIG. 1 shows the effect of IL-13 on SOCS1 expression.
  • FIG. 1 (b) is a graph instead of a drawing showing the results of real-time RT-PCR analysis of SOCS1 mRNA in mouse lung.
  • FIG. 1 (b) shows the average value of three independent experiments.
  • FIG. 1 (c) is a photograph replacing a drawing showing the RT-PCR result concerning SOCS1 expression.
  • SOCS1 expressed in a mouse tracheal epithelial cell line (TGMBE-02-3 cell, upper panel) or mouse embryo fibroblast (lower panel) was amplified by gel RT-PCR.
  • the RT-PCR product for ⁇ -actin is shown for comparison.
  • IL-13 induces the expression of SOCS family molecules by in vivo experiments in the examples described below. That is, as shown in FIGS. 1 (a) and 1 (b), when IL-13 is administered intratracheally to an unimmunized mouse, SOCS1 expression in the airway is promoted. In contrast, SOCS2 and SOCS3 expression was not affected by IL-13. There was no difference in SOCS gene expression after vehicle (IL-13) injection compared to untreated animals.
  • IL-13 was detected in TGMBE-02-3 cells (mouse tracheal epithelial cell line) and mouse embryo fibroblasts (MEF) by in vitro experiments. SOCS1 expression was also increased. In vivo experiments have shown that IL-13 activates STAT6 in the lung (refs. 17, 18, and 24). A common element in STAT6 binding is found in the mouse SOCS1 promoter (references 29, 30). These data suggest that in addition to STAT6, the expression of the endogenous regulator SOCS1 is activated by IL-13 in local structural cells of the airways.
  • IL-13 as wild-type (WT) C57BL / 6, SOCS1 + / + IFN- ⁇ ⁇ / ⁇ (IFN- ⁇ KO), and SOCS1 ⁇ / ⁇ IFN- ⁇ ⁇ / ⁇ (SOCS1 / IFN - ⁇ DKO) injected into the trachea of mice.
  • FIG. 2 (a) shows the number of eosinophils.
  • FIG. 2 (b) shows the eotaxin concentration.
  • IL-13 was administered three times into the trachea of unimmunized mice.
  • the number of eosinophils and eotaxin concentration in FIGS. 2 (a) and 2 (b) were determined by comparing the wild type (WT) C57BL / 6, IFN- ⁇ ⁇ / ⁇ (IFN ⁇ -KO), and IFN- ⁇ ⁇ / ⁇ SOCS1.
  • WT wild type
  • IFN ⁇ ⁇ / SOCS1-DKO mice were measured for BAL fluid 24 hours after the final administration of IL-13.
  • FIG. 2 (c) is a graph replaced with a drawing showing the airway contraction response to inhaled acetylcholine as a change in airway pressure.
  • the present inventors measured the value of eotaxin in the BAL fluid of mice.
  • the eotaxin concentration in SOCS1 / IFN- ⁇ DKO mice was significantly increased compared to WT mice or IFN- ⁇ KO mice, while SOC1 / Supported the increase in eosinophils in the respiratory tract of IFN- ⁇ DKO mice.
  • SOC1 / Supported the increase in eosinophils in the respiratory tract of IFN- ⁇ DKO mice.
  • IL-13 activates intracellular signals mainly through the JAK-STAT pathway, particularly STAT6 (reference documents 19, 21, 22, and 24).
  • STAT6 reference documents 19, 21, 22, and 24.
  • the present inventors analyzed STAT activation using mouse embryo fibroblasts (MEF).
  • FIG. 3 is a diagram showing regulation of SOCS1 to control STAT6 activation and eotaxin expression after IL-13 treatment.
  • FIG. 3 (a) is a photograph replacing a drawing showing STAT6 activation of a strain deficient in wild type and SOCS1.
  • FIG. 3 (a) mouse embryonic fibroblasts (MEFs) derived from wild type (WT) C57BL / 6 or SOCS1 ⁇ / ⁇ (SOCS1-KO) mice are shown in the figure as IL-13 at 10 ng / ml. I was stimulated. The cell extract was subjected to Western blotting with the antibody shown in the figure.
  • FIG. 3 (b) is a photograph of Western blotting replacing the drawing showing the influence of the retroviral vector having the SOCS1 gene.
  • WT MEFs were infected with a retroviral vector (control-RV) or a retroviral vector (SOCS1-RV) having a SOCS-1 gene.
  • Cells infected with retrovirus and positive for SOCS1 introduction using GFP as an indicator were cultured in 10 ng / ml of IL-13 for the period shown in the figure, and the cell extract was Western blotted with phosphorylated STAT6 and total STAT6 antibody.
  • FIG. 3 (c) is a graph replaced with a drawing showing the eotaxin level in the cell supernatant.
  • WT or SOCS1-KO mouse-derived cells left
  • control RV or SOCS1-RV-infected WT MEFs right
  • Eotaxin levels in the cell supernatant were measured by ELISA.
  • FIG. 3 (d) is a photograph replacing a drawing which shows the effect of SOCS1 inactivation on the IL-13 receptor.
  • total RNA was isolated from MEFs derived from WT or SOCS1-KO mice.
  • IL-13 receptor (IL-13R ⁇ 1 receptor, IL-4 receptor, ⁇ 2 chain of IL-13 receptor) was amplified by RT-PCR, and the gel was photographed.
  • ⁇ -actin RT-PCR products are shown for comparison.
  • SOCS1-deficient MEF increased STAT6 phosphorylation induced by IL-13 as compared to control WT MEF.
  • SOCS1 was forcibly expressed in WT MEF, STAT6 phosphate after IL-13 administration was not recognized, and STAT6 activation decreased.
  • the present inventors examined the effect of SOCS1 on IL-13-dependent eotaxin production from MEF. As shown in FIG. 3 (c), eotaxin production from SOCS1-deficient MEF was increased compared to control MEF. On the other hand, the production from MEF that forcedly expressed SOCS1 decreased. These results indicate that inactivation of SOCS1 promotes the IL-13 response through increased STAT6 activity.
  • IL-13 is known to transmit signals to cells by binding to IL-13R ⁇ 1 receptor. After IL-13 binding, this receptor forms a heterodimer with the IL-4 receptor (IL-4R ⁇ ) (Ref. 37). IL-13 exhibits a high binding affinity due to the ⁇ 2 chain of the IL-13 receptor (IL-13R ⁇ 2), and as a result, IL-13R ⁇ 2 activates AP-1 and secretes not only the decoy receptor but also TGF- ⁇ . It is thought to induce (reference document 23). To verify whether SOCS1 regulates IL-13 receptor expression, we measured IL-13 receptor mRNA expression for SOCS1 deficiency and control MEF. As shown in FIG. 3 (d), SOCS1 did not affect the expression of soluble IL-4R, membrane IL-4R, IL-13R ⁇ 1, and IL-13R ⁇ 2.
  • FIG. 4 shows suppression of asthma phenotype by SOCS1 overexpression.
  • FIG. 4 (a) is a graph instead of a drawing showing SOCS1 expression in lungs of BALB / c mice 3 days after infection with Ad-LacZ or Ad-SOCS1 and Ad-Cre measured by real-time RT-PCR.
  • FIG. 4 (b) is a graph instead of a drawing showing the number of eosinophils in the BAL fluid after IL-13 treatment was performed on BALB / c mice in which the SOCS1 gene was overexpressed in the respiratory tract by adenovirus. .
  • Ad-LacZ or Ad-SOCS1 and Ad-Cre were injected into the mouse trachea 3 days before the first IL-13 treatment.
  • BAL fluid was collected 24 hours after the last IL-13 treatment.
  • FIG. 4 (c) is a graph replaced with a drawing showing SOCS1 expression in OVA-induced asthma.
  • total RNA was isolated from the whole lung after the indicated time from OVA sensitization and exposure.
  • FIG. 5 is a graph instead of a drawing showing the results of real-time RT-PCR analysis of SOCS1 mRNA in mouse lung. Average values of three independent experiments are shown.
  • FIG. 4 (d) is a graph instead of a drawing showing the effect of IL-13 inhibition on SOCS1 expression after OVA exposure.
  • BALB / c mouse groups were treated daily with soluble IL-13R ⁇ 2-Fc (sIL-13R ⁇ 2-Fc) or control protein (IgG). The treatment was started one day before the OVA exposure.
  • RNA was isolated 3 hours after OVA exposure and SOCS1 expression was analyzed by real-time RT-PCR.
  • FIG. 4 (e), Fig. 4 (f) and Fig. 4 (g) show the effect of SOCS1 gene transfer on allergen-induced asthma.
  • FIG. 4 (e) is a graph replaced with a drawing showing changes in airway pressure caused by acetylcholine.
  • FIG. 4F is a graph replaced with a drawing showing the calculation result of PC200-ACh.
  • FIG.4 (g) is a graph replaced with drawing which shows the measurement result of an eosinophil count. Mice sensitized with OVA received AD-LacZ or Ad-SOCS1, and Ad-Cre intratracheally 3 days before the first OVA exposure. Airway hypersensitivity measurements and bronchoalveolar lavage were performed 36 hours after the final OVA exposure.
  • Airway hypersensitivity was measured by the change in airway pressure due to acetylcholine shown in FIG. 4 (e), and PC200-ACh was calculated as shown in FIG. 4 (f), as shown in FIG. 4 (g).
  • the number of eosinophils was measured in BAL solution. The number of samples was 6, * p ⁇ 0.05.
  • the present inventors examined the effect of SOCS overexpression on bronchial asthmatic response induced by IL-13 injection or allergen sensitization and exposure in the mouse body. As shown in FIGS. 4 (a) and 4 (b), SOCS1 is overexpressed using an adenovirus expression vector in the mouse respiratory tract and the expression of SOCS1 by adenovirus is not immunized BALB / c mice Inhibited IL-13-induced airway eosinophil infiltration.
  • the present inventors analyzed SOCS1 expression in mouse airways using an ovalbumin (OVA) -induced asthma model.
  • OVA ovalbumin
  • FIG. 4 (c) after systemic OVA sensitization and aerosolized OVA exposure, SOCS1 expression in the respiratory tract increased and peaked 3-6 hours after the final OVA exposure.
  • the present inventors conducted an experiment on whether an IL-13 inhibitor suppresses SOCS1 expression induced by OVA exposure.
  • SOCS1 expression induced by administration of allergen was decreased in mouse lungs to which soluble IL-13R ⁇ 2-Fc, an IL-13 inhibitor, was administered.
  • IL-13 contributes to SOCS1 induction in the asthmatic airways.
  • SOCS1 expression is induced by many stimuli (references 6, 9, and 38).
  • SOCS1 is considered to be an important inhibitor of IFN- ⁇ (31, 32).
  • IL-13 has a variety of pro-inflammatory effects associated with asthma and other Th2-dominated inflammatory diseases. These effects are mediated by the signaling protein STAT6.
  • signaling protein STAT6 Several signaling pathways associated with IL-13-induced asthma-like phenotypes include adenosine (references 39 and 40), arginase (references 41 and 42), and lipoxygenase products (reference reference 43).
  • Chlorine channel (reference 36) and mammalian acid chitinase (reference 44) have been reported.
  • SOCS1 A common element that binds to STAT6 is found in the mouse SOCS1 promoter (references 30, 45, and 46).
  • SOCS1 was shown to inhibit IL-4 and IL-13-induced eotaxin-3 / CCL26 gene expression activation in vitro (Reference Document 47).
  • Airway epithelium is an important site where contact with allergen occurs.
  • the interaction caused by this contact causes various signal transduction phenomena that cause production of a catalytic factor that contributes to the development or perpetuation of inflammation and a factor that enhances the development of asthma (Reference Documents 48 and 49).
  • the importance of direct action of IL-13 on epithelial cells has been shown in AHR induction (Ref. 24). It is known that intra-tracheal administration of a recombinant adenovirus vector mainly targets the respiratory epithelium (References 50 and 51).
  • IL-13 expression is elevated in the airways of asthmatic patients (Refs. 52, 53), and natural differences in the IL-13 coding region are important genetic determinants of allergic susceptibility (Ref. 54 ) Was reported. Many of the new treatments for asthma are aimed at inhibiting the positive signal of Th2 inflammation (Ref. 55).
  • the present inventors have proposed the development of a drug that promotes a negative regulator, which is an alternative method. This example shows that the abnormal activity of SOCS1 in the target organ may contribute to allergic disease through an enhanced Th2 cytokine response.
  • ovalbumin peptide (pOVA) -specific T cell receptor (TCR) transformed mice DO11.10XSOCS3 +/-
  • SOCS3 gene DO11.10XSOCS3 + / -
  • CD4 + T cells were purified from their spleen using mice with a heterodeletion of-). These mice include K. Murphy (University of Washington) and J. N. Offered courtesy of Eale (St. Jude Children's Research Hospital).
  • the expression of SOCS3 protein in pre-activated T cells from DO11.10XSOCS3 +/ ⁇ mice was 3-fold lower than that from DO11.10XSOCS3 + / + mice.
  • APC antigen presenting cells
  • naive BALB / c mice were used, and intravenous injection of CD4 + T cells was performed.
  • naive BALB / c mice were used to isolate CD4 + T cells from their spleens and analyze the degree of CD4 + T cell inhibitory effect of siRNA infection.
  • DO11.10XSOCS3 + / + mice were used, and this CD4 + T cells were used to confirm the effect of SOCS3-specific siRNA on the asthmatic response.
  • Th2 cytokines IL-4, IL-5, IL-13
  • IFN ⁇ TGF ⁇
  • TGF ⁇ TGF ⁇
  • CD4 + T cells derived from SOCS3 + / + XDO11.10 and SOCS3 +/ ⁇ XDO11.10 mice were differentiated into Th2 cells by culturing with pOVA. After 48 hours, the cell culture supernatant was collected and cytokines were measured by EILSA.
  • IL-4 and IL-13 from SOCS3 +/ ⁇ XDO11.10 mice were significantly reduced compared to those of SOCS3 + / + XDO11.10 mice.
  • N 4.p ⁇ 0.05
  • IL-4 and IL-13 are cytokines produced from Th2 cells. Therefore, it was shown that SOCS3 deficiency inhibits the differentiation from CD4 + T cells to Th2 cells.
  • PC200 induced concentration 200 in which the airway pressure is 200% of the baseline value
  • a low logarithmic PC200 value represents a high AHR.
  • the PC200 of mice transplanted with CD4 + T cells derived from SOCS3 + / + XDO11.10 was significantly reduced compared to that of naive BALB / c mice.
  • FIG. 7 shows the effect of SOCS3-specific siRNA treatment analyzed by RT-PCR and real-time PCR on SOCS3 expression in CD4 + T cells.
  • CD4 + T cells were isolated from naive BALB / c mice, cultured after infection with control siRNA or SOCS3-specific siRNA by electroporation, and collected after 24, 48 and 72 hours.
  • FIG. 7 (a) shows RT-PCR analysis of mSOCS3 in native BALB / c CD4 + T cells 72 hours after control siRNA treatment and SOCS3-specific siRNA treatment. The amplified DNA was separated by electrophoresis on an agarose gel containing ethidium bromide, irradiated with ultraviolet light, and photographed.
  • FIG. 7 shows the effect of SOCS3-specific siRNA treatment analyzed by RT-PCR and real-time PCR on SOCS3 expression in CD4 + T cells.
  • CD4 + T cells were isolated from naive BALB / c mice, cultured after infection with control
  • FIG. 7 (b) is a diagram showing real-time PCR analysis of mSOCS3 in naive BALB / c CD4 + T cells 24 hours, 48 hours and 72 hours after control siRNA treatment and SOCS3-specific siRNA treatment. is there.
  • the inhibition rate of SOCS3-specific siRNA treatment on SOCS3 expression was 11%, 28% and 35% compared to the effect of control siRNA treatment.
  • FIG. 8 shows Th2 cytokines (IL-4, IL-5, IL-13), IFN ⁇ , TGF ⁇ , IL in the cell culture supernatant of CD4 + T cells treated with SOCS3-specific siRNA or control siRNA.
  • -10 and IL-17 measured by ELISA are shown.
  • CD4 + T cells were isolated from SOCS3 + / + XDO11.10 and cultured with pOVA to differentiate into Th2 cells. After 48 hours, cell culture supernatant was collected and cytokines were measured by ELISA.
  • IL-4, IL-5 and IL-13 from cell culture supernatants of CD4 + T cells treated with SOCS3-specific siRNA were significantly reduced compared to those treated with control siRNA.
  • IL-17 derived from the cell culture supernatant of CD4 + T cells treated with SOCS3-specific siRNA was significantly increased compared to that treated with control siRNA.
  • n 8. * P ⁇ 0.05.
  • IL-4, IL-5 and IL-13 are cytokines produced from Th2 cells. The decrease in these cytokines indicates that the differentiation of CD4 + T cells into Th2 cells was inhibited. Therefore, it was shown that Th2 cell differentiation was inhibited by SOCS3-specific siRNA treatment.
  • FIG. 9 (a) shows the effect of SOCS3 down-regulation in T cells on airway responsiveness to inhaled acetylcholine.
  • CD4 + T cells were isolated from SOCS3 + / + XDO11.10 and infected with SOCS3 siRNA or control siRNA by electroporation.
  • CD4 + T cells were differentiated into Th2 cells, and transplanted in conformity with naive BALB / c mice as recipients. One to five days after matched cell transplantation, recipient BALB / c mice were exposed to aerosolized OVA (5%). Airway reactivity to inhaled acetylcholine in each mouse was measured 24 hours after the last antigen exposure. As shown in FIG.
  • PC200 induced concentration of 200
  • a concentration at which the airway pressure is 200% of the baseline value were calculated for each mouse.
  • a lower PC200 value represents a higher AHR.
  • PC200 of mice transplanted with CD4 + T cells from SOCS3 + / + XDO11.10 treated with control siRNA was significantly reduced compared to that from naive BALB / c mice.
  • PC200 of mice transplanted with CD4 + T cells derived from SOCS3 + / + XDO11.10 treated with SOCS3 siRNA was markedly increased compared to those treated with control siRNA.
  • n 5 to 11. * P ⁇ 0.05.
  • FIG. 10 is a graph instead of a drawing showing the effect of pan-JAK inhibitor administration on allergic airway inflammation.
  • OVA-sensitized mice were injected intraperitoneally on days 26-28 with pyridone 6 (10 ⁇ g / body weight, dissolved in 0.2% DMSO) or vehicle DMSO one hour prior to OVA ingestion.
  • BAL was performed 30 hours after the final OVA administration.
  • JAKi itself did not affect airway eosinophilia, but JAKi decreased eosinophilia in BAL fluid compared to vehicle treatment. These results suggest that JAKi may have therapeutic effects for asthma.
  • SOCS3 and STAT3 regulate TGF-beta production in CD4 helper T cell differentiation. J Exp Med: in press. 15. Seki, Y., Hayashi, K., Matsumoto, A., Seki, N., Tsukada, J., Ransom, J., Naka, T., Kishimoto, T., Yoshimura, A., and Kubo, M. 2002. Expression of the suppressor of cytokine signaling-5 (SOCS5) negatively regulates IL-4-dependent STAT6 activation and Th2 differentiation. Proc Natl Acad Sci USA 99: 13003-13008. 16.
  • Kibe A., Inoue, H., Fukuyama, S., Machida, K., Matsumoto, K., Koto, H., Ikegami, T., Aizawa, H., and Hara, N. 2003. Differential regulation by glucocorticoid of interleukin-13-induced eosinophilia, hyperresponsiveness, and goblet cell hyperplasia in mouse airways. Am J Respir Crit Care Med 167: 50-56. 19. Kuperman, D., Schofield, B., Wills-Karp, M., and Grusby, MJ 1998. Signal transducer and activator of transcription factor 6 (Stat6) -deficient mice are protected from antigen-induced airway hyperresponsiveness and mucus production J Exp Med 187: 939-948.
  • Stat6 transcription factor 6
  • IL-13 induces airways hyperreactivity independently of the IL-4R alpha chain in the allergic lung.
  • Interleukin-13 mediates airways hyperreactivity through the IL-4 receptor- alpha chain and STAT-6 independently of IL-5 and eotaxin.
  • IL-13 signaling through the IL-13alpha2 receptor is involved in induction of TGF-beta1 production and fibrosis.
  • Direct effects of interleukin-13 on epithelial cells cause airway hyperreactivity and mucus overproduction in asthma.
  • the IL-4 receptor signaling mechanisms and biologic functions.
  • SOCS1 is a critical inhibitor of interferon gamma signaling and prevents the potentially fatal neonatal actions of this cytokine.
  • SOCS1 deficiency causes a lymphocyte-dependent perinatal lethality Cell 98: 609-616.
  • 33. De Sanctis, GT, Merchant, M., Beier, DR, Dredge, RD, Grobholz, JK, Martin, TR, Lander, ES, and Drazen, JM 1995. Quantitative locus analysis of airway hyperresponsiveness in A / J and C57BL / 6J mice. Nat Genet 11: 150-154.
  • Suppressor of cytokine signaling-3 is a biomechanical stress-inducible gene that suppresses gp130-mediated cardiac myocyte hypertrophy and survival pathways.
  • IL-4 induces IL-13-independent allergic airway inflammation. J Allergy Clin Immunol 118: 410-419.
  • the present invention can be used in the pharmaceutical industry as a therapeutic agent for respiratory diseases such as asthma drugs.
  • SEQ ID NO: 1 SOC1 amino acid residue sequence
  • SEQ ID NO: 2 SOC1 DNA base sequence (GenBank ID. U88326)
  • SEQ ID NO: 3 Primer for mSOCS1 SEQ ID NO: 4
  • Primer for mSOCS1 SEQ ID NO: 5 Primer for mSOCS2
  • SEQ ID NO: 6 Primer for mSOCS2
  • SEQ ID NO: 7 Primer for mSOCS3 SEQ ID NO: 8: Primer for mSOCS3 SEQ ID NO: 9:

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

 【課題】 本発明は,喘息,慢性閉塞性肺疾患又は肺線維症などの呼吸器系疾患の治療剤,気管支喘息,アトピー性皮膚炎又はアレルギー性鼻炎などのアレルギー性疾患の治療剤,新規なIL-13誘導性反応の阻害剤,及び新規なエオタキシンの産生阻害剤,新規なIL-13誘導性間質性肺病変の治療剤又は予防剤,新規な腫瘍治療剤を提供することを目的とする。また本発明は,siRNAを有効成分とし,RNA干渉を惹起する,IL-17産生促進剤,Th2分化阻害剤,及び喘息の治療剤を提供することを目的とする。  【解決手段】 上記課題は,SOCS1を有効成分として含有する呼吸器系疾患の治療剤などにより解決される。また,SOCS3のsiRNAを有効成分として含有する剤などにより解決される。  

Description

呼吸器系疾患又はアレルギー性疾患の治療剤
 本発明は,IL-13阻害剤又はIL-17産生促進剤を有効成分として含有する呼吸器系疾患,又はアレルギー性疾患の治療剤などに関する。
 気管支喘息は,好酸球浸潤をともなう慢性炎症,可逆性気道閉塞,非特異的刺激に対する気道過敏症(AHR:airway hyperresponsiveness),杯状細胞の過形成/異形成,及び上皮下の線維症によって特徴づけられる(参考文献1,及び2)。気管支喘息は,世界中で臨床的に蔓延している重要な疾患である。気管支喘息の吸入抗原はよく理解されているものの,気管支喘息が発症する機構や,気管支喘息が持続する機構についてはほとんど知られていない。現在では気道炎症及び気道の構造変化が,気管支喘息の重要な特徴であると考えられている。
 最近の研究により,T細胞が喘息患者の気道に浸潤する主なリンパ細胞集団であること,及びインタ-ロイキン(IL)-4,IL-5,IL-9及びIL-13を含むサイトカイン産物(Th2サイトカイン)が,喘息の病態生理を引き起こすために必須であることが示された。これらTh2サイトカインは,細胞表面においてレセプターに結合し,ヤヌスキナ-ゼ(JAK)/シグナル伝達性転写因子(STAT)経路を含むシグナル伝達経路を活性化する(参考文献5)。
 サイトカインシグナリングのサプレッサー(SOCS)タンパク質ファミリーは,JAK/STATシグナル伝達経路に対する負のフィードバック制御因子の一つであり,8つのメンバーが同定されている。同定されているメンバーは,サイトカイン誘導性SH2含有タンパク(CIS)及びSOCS1~7である。これらは,SH2ドメイン及びSOCSボックスといわれるC末端保存領域が存在するという特徴がある(参考文献6及び7)。いくつかの報告により,SOCSタンパクが免疫反応の制御に必須であることが示唆されている(参考文献8~10)。特にアレルギー性炎症では,これらはヘルパーT細胞分化に重要であると考えられる。SOCS5及びSOCS3は,それぞれTh1及びTh2細胞において選択的に発現される(参考文献11,及び12)。T細胞におけるSOCS3の過剰発現は,IL-12レセプターβ2及びT-betのようなIL-12によって制御される遺伝子の活性化を抑制し,Th1分化障害を引き起こす(参考文献12)。SOCS3は,Th3あるいはTh17の分化をも調節する(参考文献13,及び14)。一方,SOCS5過剰発現T細胞は,IL-4を介したTh2発達の減少を示す(参考文献15)。アレルギー反応におけるT細胞に対するこれらの効果に加え,SOCSタンパク質は標的器官の局所的構造細胞において制御的機能を果たす可能性がある。しかしながら,Th2反応におけるこれらの局所的機能及び分子機構の詳細は,解明されていない。
 Th2サイトカインのうち,IL-13は現在特に重要であると考えられている。IL-13は,ビボ実験(in vivo)により,アレルゲンにより誘導されるAHR,好酸球増加,粘液の過剰生産を惹起することが示された(参考文献16,及び17)。さらに,免疫性の無いマウスに対するリコンビナントIL-13の局所的投与は,喘息表現型を誘導する(参考文献17,及び18)。IL-13シグナルは,複合体であることが明らかとなっている。IL-13により引き起こされる組織及び分子反応は,STAT6及びERK1/2シグナリングに依存する(参考文献19~22)。細胞表面IL-13αレセプターを介したIL-13シグナリングは,AP-1依存的にTGF-β産生を誘導する(参考文献23)。STAT6は,IL-13によって活性化される重要なシグナル伝達分子であり,アレルゲン誘導性実験的喘息の進行に必須である(参考文献19,24,及び25)。また,JAK/STATを活性化することにより,SOCSファミリーを誘導することが知られている(参考文献26~28)。
 一方,アトピー性皮膚炎,アレルギー性鼻炎などのアレルギー性疾患に罹患した患者は増えている。よって,アレルギー性疾患の治療剤の開発が望まれる。さらに,IL-13(インターロイキン-13)は,気道のリモデリングの原因となり,また肺では気腫性病変や線維化病変を誘導する(Zhu Z, J. Clin. Invest1999,103: 779(非特許文献1))。慢性閉塞性肺疾患(Chronic Obstructive Pulmonary Disease:COPD)は,主に喫煙により発症する閉塞性肺疾患であり,罹患率が急増している。肺線維症は,肺胞の壁が厚くなり,呼吸不全状態に陥る疾患であり,未だ有効な治療法が存在しない。よって,慢性閉塞性肺疾患および肺線維症及びに関する治療剤の開発が望まれる。IL-13(インターロイキン-13)は,MMP(マトリックス メタロプロテアーゼ)などの蛋白分解酵素を誘導し,肺気腫喘息の病態形成を惹起する(Zheng T, J. Clin. Invest 2000,106(9):1081(非特許文献2))とともに,肺の線維芽細胞を活性化し,IL-6やMCP1などの炎症性サイトカインを誘導することにより,肺線維症に関与していると考えられる(たとえば,Doucet,C.ら:J.Clin.Invest.,No.101:pp.2129-2139,1998(非特許文献3))。
 特開2001-231558号公報(特許文献1)には,IL-13が喘息及びアレルギー疾患に関与することが開示されている。
 特表2003-513637号公報(特許文献2)には,JAK-STAT-SOCS経路に基づくアッセイ系が開示されている。すなわち,同文献では,JAK-STAT-SOCS経路が細胞性ストレスを引き起こす化学物質に対して感受性が高いという知見に基づき,JAK-STAT-SOCS経路に基づくアッセイ系を用いて,細胞性ストレスを引き起こす化合物をモニターする方法が開示されている(同文献の段落[0004]及び[0005])。また,同文献には,SOCS(Suppressors of Cytokine Signaling)の例として,SOCS1があげられている(同文献の段落[0003])。 
 特表2007-507438号公報(特許文献3)には,具体的な実施例はないものの,SOCS1に対する特異的なDNAzyme又はsiRNAを用いた,慢性炎症性疾患又は自己免疫疾患に対する薬剤が開示されている。
特開2001-231558号公報 特表2003-513637号公報 特表2007-507438号公報
Zhu Z, J. Clin. Invest1999,103: 779 Zheng T, J. Clin. Invest 2000,106(9):1081 J.Clin.Invest.,No.101:pp.2129-2139,1998
 本発明は,喘息,慢性閉塞性肺疾患又は炎症性肺疾患などの呼吸器系疾患の治療剤を提供することを目的とする。
 本発明は,気管支喘息,アトピー性皮膚炎,アレルギー性結膜炎又はアレルギー性鼻炎などのアレルギー性疾患の治療剤を提供することを目的とする。
 本発明は,新規なIL-13誘導性反応の阻害剤,及び新規なエオタキシンの産生阻害剤を提供することを目的とする。
 本発明は,新規なIL-13誘導性間質性肺病変の治療剤又は予防剤を提供することを目的とする。
 本発明は,新規な腫瘍治療剤を提供することを目的とする。
 本発明は,siRNAを有効成分とし,RNA干渉を惹起する,IL-17産生促進剤,Th2分化抑制剤,及び喘息の治療剤を提供することを目的とする。
 本発明は,基本的には,特に気道や皮膚などの局所臓器において,SOCS1の発現が低下すると,アレルギー疾患や炎症(炎症性肺炎など)が惹起され,一方,これらの構成細胞にSOCS1を導入することで,病態を制御できるという知見や,SOCS1がIL-13の機能を阻害するという知見に基づくものである。
 本発明の第1の側面は,SOCS1,SOCS3などのSOCSタンパク質を有効成分として含有する呼吸器系疾患の治療剤に関する。後述する実施例により示されたとおり,SOCS1がIL-13の機能を阻害する。よって,本発明の第1の側面に係る治療剤は,SOCSを有効成分として含有することで,IL-13が関与する喘息,慢性閉塞性肺疾患,又は炎症性肺疾患などの,呼吸器系疾患に有効である。また,SOCS1を気道上皮などへ局所的に投与することで,呼吸器系疾患などを効果的に治療できる。よって,本発明の第1の側面の好ましい態様は,剤型が,吸入剤,点鼻剤,又は塗布剤である上記いずれかに記載の治療剤である。
 一方,本発明の剤はまた経口投与により全身に渡って治療を行うこともできる。よって,本発明の第1の側面に係る治療剤は,経口剤であってもよい。
 本発明の第2の側面は,SOCS1,SOCS3などのSOCSタンパク質を有効成分として含有するアレルギー性疾患の治療剤に関する。IL-13は,アレルギー性疾患に関与することが知られており,後述する実施例により示されたとおり,SOCS1は,IL-13を阻害する。よって,SOCS1などのSOCSタンパク質を有効成分として含有する治療剤は,アレルギー性疾患の治療に有効である。アレルギー性疾患として,気管支喘息,アトピー性皮膚炎,アレルギー性結膜炎又はアレルギー性鼻炎があげられる。
 本発明の第3の側面は,SOCS1,SOCS3などのSOCSタンパク質を有効成分として含有するIL-13誘導性反応の阻害剤に関する。SOCS1が,IL-13を阻害することは,実施例により初めて実証されたものである。よって,本発明の剤によれば,IL-13が関与する疾患の治療に有効である。
 本発明の第3の側面の好ましい態様は,SOCS1,SOCS3などのSOCSタンパク質を有効成分として含有するエオタキシンの産生阻害剤に関する。後述する実施例により実証されたとおり,SOCS1を用いることで,エオタキシンの産生を効果的に阻害できる。エオタキシンは,好酸球性炎症を惹起すると考えられるから,本発明の剤は,好酸球増多疾患の治療剤として有効である。これは,SOCS1がIL-13を阻害することによりもたらされる効果であると考えられる。
 本発明の第4の側面は,SOCS1,SOCS3などのSOCSタンパク質を有効成分として含有するIL-13誘導性間質性肺病変の治療剤又は予防剤に関する。具体的には,肺線維症の治療剤又は予防剤があげられる。SOCS1は,IL-13誘導反応を阻害するので,SOCS1などのSOCSタンパク質を有効成分として含有する剤は,IL-13誘導性間質性肺病変の治療剤又は予防剤などとして有効である。
 本発明の第5の側面は,SOCS1,SOCS3などのSOCSタンパク質を有効成分として含有する腫瘍治療剤に関する。IL-13を阻害すると,抗腫瘍活性を呈することが報告されている(Kawakami K, Cancer Res. 2006 Apr 15;66(8):4434-42)。一方,実施例によりSOCS1などのSOCSがIL-13の誘導反応を阻害することが示された。よって,SOCS1などのSOCSタンパク質を有効成分として含有する剤は,腫瘍治療剤として有効に機能するものと考えられる。
 本発明の第6の側面は,SOCS1をコードするDNA(配列番号2で示されるDNA)を含有する呼吸器系疾患又はアレルギー性疾患の治療剤に関する。先に説明したとおり,SOCS1は,呼吸器系疾患又はアレルギー性疾患の治療剤に有効であるから,SOCS1をコードするDNAを含有する剤は,それらの疾患の治療に有効である。この態様の発明の好ましい態様は,前記SOCS1をコードするDNAを,発現ベクターとして含有する,上記に記載の剤である。すなわち,SOCS1をコードするDNAを,発現ベクターとして含有するので,たとえば,患部(気道,肺,皮膚など)において,特異的にSOCS1を発現させることができ,局部治療などに有効に利用することができる。
 本発明は,上記した呼吸器系疾患の治療剤,アレルギー性疾患の治療剤,IL-13誘導性反応の阻害剤,エオタキシンの産生阻害剤,IL-13誘導性間質肺病変の治療剤・予防剤,又は腫瘍治療剤を製造するための,SOCS1の使用をも提供する。
 本発明は,対象であるヒト又は非ヒト哺乳動物に,有効量のSOCS1を投与する工程を含む,呼吸器系疾患,アレルギー性疾患,IL-13誘導性間質肺病変又は腫瘍の治療方法をも提供する。
 本発明の第7の側面は,SOCS3のsiRNAを有効成分とする,IL-17産生促進剤に関する。後述する実施例により実証されたとおり,SOCS3のsiRNA(配列番号11に記載のRNA及び配列番号12に記載のRNAのいずれか又は両方)をT細胞に導入すると,IL-17の産生が増加した。これは,本実施例により始めて見出された結果である。よって,SOCS3のsiRNAを有効成分とする剤は,IL-17産生促進剤として有効である。そして,後述する実施例によって示されたとおり,IL-17の産生を促進することは,たとえば喘息の治療に有効であると考えられる。勿論,IL-17は,好中球数増加などの機能があることが知られているので,上記のIL-17産生促進剤は,好中球数増加などを介して様々な疾患の治療又は予防に有効である。
 本発明の第8の側面は,SOCS3のsiRNAを有効成分とする,Th2分化阻害剤に関する。後述する実施例により実証されたとおり,SOCS3のsiRNA(配列番号11に記載のRNA及び配列番号12に記載のRNAのいずれか又は両方)をT細胞に導入すると,Th2の分化が抑制された。これは,本実施例により始めて見出された結果である。よって,SOCS3のsiRNAを有効成分とする剤は,Th2分化阻害剤として有効である。そして,後述する実施例によって示されたとおり,Th2分化を阻害することは,たとえば喘息の治療に有効であると考えられる。
 本発明の第9の側面は,SOCS3のsiRNAを有効成分とする,喘息の治療剤に関する。後述する実施例により実証されたとおり,SOCS3のsiRNA(配列番号11に記載のRNA及び配列番号12に記載のRNA)をT細胞に導入すると,喘息反応を抑制した。これは,本実施例により初めて見出された結果である。よって,SOCS3のsiRNAを有効成分とする剤は,喘息の治療剤として有効である。
 本発明は,IL-17産生促進剤,Th2分化阻害剤,又は喘息の治療剤を製造するためのSOCS3のsiRNAの使用をも提供する。本発明は,SOCS3のsiRNAを用いた,IL-17産生促進方法,Th2分化阻害方法,又は喘息の治療方法をも提供する。
 本発明によれば,喘息,慢性閉塞性肺疾患又は炎症性肺疾患などの呼吸器系疾患の治療剤を提供することができる。
 本発明によれば,気管支喘息,アトピー性皮膚炎,アレルギー性結膜炎,又はアレルギー性鼻炎などのアレルギー性疾患の治療剤を提供することができる。
 本発明によれば,新規なIL-13誘導性反応の阻害剤,及び新規なエオタキシンの産生阻害剤を提供することができる。
 本発明によれば,新規なIL-13誘導性間質性肺病変の治療剤又は予防剤を提供することができる。
 本発明によれば,新規な腫瘍治療剤を提供することができる。
 本発明によれば,siRNAを有効成分とし,RNA干渉を惹起する,IL-17産生促進剤,Th2分化抑制剤,及び喘息の治療剤を提供することができる。
図1は,SOCS1発現に対するIL-13の効果を示す図である。図1(a)は,ウェスタンブロッティング結果を示す図面に替わる写真である。図1(b)は,マウス肺中のSOCS1mRNAのリアルタイムRT-PCR解析結果を示す図面に替わるグラフである。図1(c)は,SOCS1発現に関するウェスタンブロッティング結果を示す図面に替わる写真である。 図2は,SOCS1欠損マウスとIL-13誘導性喘息との関係を示す図である。図2(a)は,好酸球数を示す。図2(b)は,エオタキシン濃度を示す。図2(c)は,吸入したアセチルコリンに対する気道収縮反応を気道内圧で表した図面に替わるグラフである。図2(d)は,吸入したアセチルコリンに対する気道過敏性を誘発濃度200(PC200-ACh)として表した図面に替わるグラフである。 図3は,SOCS1の調節はSTAT6活性化及びIL-13処理後のエオタキシン発現を制御することを示す図である。図3(a)は,野生型とSOCS1を調整した株のエタオキシン発現を示す図面に替わる写真である。図3(b)は,SOCS1遺伝子を持つレトロウイルスベクターの影響を示す図面に替わるウエスタンブロッティングの写真である。 図3(c)は,細胞上清中のエオタキシンレベルを示す図面に替わるグラフである。図3(d)は,IL-13レセプターに対するSOCS1不活性化の影響を示す図面に替わる写真である。 図4は,SOCS1過剰発現による喘息表現型の抑制を示す。図4(a)は,リアルタイムRT-PCRによって測定されたAD-LacZあるいはAd-SOCS1とAd-CReの感染から3日後におけるBALB/cマウス肺中のSOCS1発現を示す図面に替わるグラフである。図4(b)は,アデノウイルスによりSOCS1遺伝子を形質転換されたBALB/cマウスに対しIL-13処理を行った後のBAL液中の好酸球数を示す図面に替わるグラフである。図4(c)は,OVA誘導性喘息におけるSOCS1発現を示す図面に替わる写真(上段パネル)及びグラフ(下段パネル)である。図4(d)は,OVA曝露後のSOCS1発現に対するIL-13阻害の効果を示す図面に替わるグラフである。BALB/cマウスのグル-プを可溶性IL-13Rα2-Fc(sIL-13Rα2-Fc)又はコントロールタンパク質で毎日処理した。処理はOVA曝露より一日前から開始した。OVA曝露より3時間後RNAを単離し,SOCS1発現をRT-PCRによって解析した。図4(e)は,アセチルコリン依存の気管圧力の変化を示す図面に替わるグラフである。図4(f)は,PC200-AChの算出結果を示す図面に替わるグラフである。図4(g)は,好酸球数の計測結果を示す図面に替わるグラフである。 図5は,SOCS3+/+XDO11.10およびSOCS3+/-XDO11.10マウス由来のCD4T細胞中のTh2サイトカイン(IL-4,IL-5,IL-13),IFNγ,TGFβ,及びIL-10をELISAにより測定したものを示す。 図6(a)は,T細胞中のSOCS3のダウンレギュレーションが,アセチルコリンを吸入した気道の反応に与える効果を測定した図面に替わるグラフである。図6(b)は,各々のマウスについての誘発濃度200(PC200)を示す図面に替わるグラフである。図6(c)は,T細胞中のSOCS3のダウンレギュレーションが,レシピエントマウスのBAL液体中の好酸球に与える効果を測定した図面に替わるグラフである。 図7は,RT-PCRおよびリアルタイムPCRにより分析されたSOCS3-特異的siRNA処理がCD4T細胞中のSOCS3発現に与える影響を示す。図7(a)は,対照のsiRNA処理およびSOCS3特異的siRNA処理の72時間後のnaiveBALB/cのCD4T細胞中のmSOCS3のRT-PCR分析を示す電気泳動写真である。図7(b)は,対照のsiRNA処理およびSOCS3-特異的siRNA処理の24時間後,48時間後,72時間後のnaiveBALB/cのCD4T細胞中のmSOCS3のリアルタイムPCR分析を示す図面に替わるグラフである。 図8は,SOCS3-特異的siRNA処理または対照のsiRNA処理を受けたCD4T細胞の細胞培養上清中のTh2サイトカイン(IL-4,IL-5,IL-13),IFNγ,TGFβ,IL-10およびIL-17をELISAにより測定したものを示した図面にかわるグラフである。 図9(a)は,T細胞中のSOCS3のダウンレギュレーションが,アセチルコリン吸入への気道反応性に与える効果をしめす図面に替わるグラフであるである。図9(b)は,各々のマウスについての誘発濃度(PC200)を示す図面に替わるグラフである。図9(c)は,T細胞中のSOCS3のダウンレギュレーションが,受け手マウスのBAL液体中の好酸球数に与える効果を示す図である。 図10は,アレルギー性気道炎症におけるpan-JAK阻害剤投与の影響を示す図面に替わるグラフである。
 呼吸器系疾患の治療剤
 本発明の第1の側面は,SOCS1,SOCS3などのSOCSを有効成分として含有する呼吸器系疾患の治療剤に関する。後述する実施例により示されたとおり,SOCS1(suppressor of cytokine signaling 1)は,IL-13の機能を阻害する。よって,本発明の第1の側面に係る治療剤は,SOCS1を有効成分として含有することで,IL-13が関与する喘息,慢性閉塞性肺疾患,又は炎症性肺疾患などの,呼吸器系疾患に有効である。
 SOCS1は,後述する参考文献に記載されているとおり,本発明者らが発見した公知のタンパク質である。また,SOCS1をコードするDNAの塩基配列は,NCBI GenBankにおいてID.U88326として紹介されている。そのサイトによれば,SOCS1は,Nature 387 (6636), 917-921 (1997)に掲載されたことが記載されている。SOCS1は,上記のとおり公知のタンパク質であり,公知の方法によって単離することができ,精製することができる。具体的には,SOCS1のアミノ酸残基配列は,配列番号1で表され,SOCS1をコードするDNAの塩基配列は,配列番号2で表される。
 一方,本明細書において,SOCS1は,その作用機序を司るドメインが含まれていれば,それ以外のドメインに関する部分が含まれていなくてもよい。SOCS1の作用機序を司るドメインとして,配列番号1の52番目~67番目のアミノ酸配列(キナーゼ抑制領域(KIR))があげられる。また,SOCS1は,その作用機序を司るドメイン,又は全長のSOCS1と90%以上(好ましくは95%以上より好ましくは98%以上)の相同性を有するアミノ酸残基を含有する部分ペプチドを含むポリペプチド又はタンパク質、又はN末端の12個のアミノ酸からなるキナーゼ抑制領域と相同性を有する部分ペプチド(例えば,配列番号17)を含むポリペプチド又はタンパク質であってもよい。
 上記したとおり,SOCSファミリーはJAK/STATシグナル伝達経路を制御する因子である。その制御機構のとして,SOCSタンパク質がリン酸化されたJAKのリン酸化部位(配列番号18の1007番目のアミノ酸)に結合することが考えられている。よって,本発明のタンパク質又はペプチドとして,上記リン酸化されるJAKのリン酸化結合部位に結合するペプチドを用いてもよい。具体的には,JAKの活性化ループ(A-loop)を形成する配列番号18の993~1015番目のアミノ酸配列に結合するペプチドが好ましく,配列番号18の1001~1013番目のアミノ酸配列に結合するペプチドがより好ましい。上記した配列番号17のアミノ酸配列からなるペプチドは,配列番号18の1001~1013番目のアミノ酸配列に結合する(J Immunol.;2004,vol172,7510-7518)。よって,本発明のペプチドとして,配列番号17を含むアミノ酸配列からなるペプチドを好ましく用いることができる。
 これらSOCS1と実質的に同一のタンパク質を含めて,以下では,本発明のタンパク質ともよぶ。このようにSOCS1に所定の改変を導入することや,ファーマコフォアを見出すことは,公知の方法に従って行えばよい。アミノ酸配列の相同性は,相同性計算アルゴリズムであるNCBI BLASTを用い,以下の条件(期待値=10;ギャップを許す;マトリクス=BLOSUM62;フィルタリング=OFF)にて計算することができる。なお,本明細書におけるSOCS1と実質的に同一のタンパク質として,SOCS1と同様の作用を有するものがあげられる。
 本明細書において「有効成分」とは,所定の治療効果を得るための主成分を意味する。たとえば,SOCS1が有効成分となるためには,薬剤においてSOCS1が有効量含まれている必要がある。ここで「有効量」とは,所定の薬効を得るために必要な量を意味する。
 本発明の第2の側面は,SOCS1,SOCS3などのSOCSタンパク質を有効成分として含有するアレルギー性疾患の治療剤に関する。IL-13は,アレルギー性疾患に関与することが知られており,後述する実施例により示されたとおり,SOCS1は,IL-13を阻害する。よって,SOCS1を有効成分として含有する治療剤は,アレルギー性疾患の治療に有効である。アレルギー性疾患として,気管支喘息,アトピー性皮膚炎,アレルギー性結膜炎又はアレルギー性鼻炎があげられる。
 本発明の第3の側面は,SOCS1,SOCS3などのSOCSタンパク質を有効成分として含有するIL-13誘導性反応の阻害剤に関する。SOCS1が,IL-13の活性を阻害することは,実施例により始めて実証されたものである。よって,本発明の剤によれば,IL-13が関与する疾患の治療に有効である。
 本発明の第3の側面の好ましい態様は,SOCS1,SOCS3などのSOCSタンパク質を有効成分として含有するエオタキシンの産生阻害剤に関する。後述する実施例により実証されたとおり,SOCS1を用いることで,エオタキシンの産生を効果的に阻害できる。エオタキシンは,好酸球増多を惹起すると考えられるから,本発明の剤は,好酸球増多疾患の治療剤として有効である。
 本発明の第4の側面は,SOCS1,SOCS3などのSOCSタンパク質を有効成分として含有するIL-13誘導性間質性肺病変の治療剤又は予防剤に関する。具体的には,肺線維症,または慢性肺気腫(慢性閉塞性肺疾患,COPD)の治療剤又は予防剤があげられる。SOCS1は,IL-13誘導反応を阻害するので,SOCS1などのSOCSタンパク質を有効成分として含有する剤は,IL-13誘導性間質性肺病変の治療剤又は予防剤などとして有効である。
 本発明の第5の側面は,SOCS1,SOCS3などのSOCSタンパク質を有効成分として含有する腫瘍治療剤に関する。IL-13を阻害すると,抗腫瘍活性を呈することが報告されている(Kawakami K, Cancer Res. 2006 Apr 15;66(8):4434-42)。一方,実施例によりSOCS1などのSOCSがIL-13の誘導反応を阻害することが示された。よって,SOCS1などのSOCSタンパク質を有効成分として含有する剤は,腫瘍治療剤として有効に機能するものと考えられる。
 本発明の第6の側面は,SOCS1をコードするDNAを含有する呼吸器系疾患又はアレルギー性疾患の治療剤に関する。先に説明したとおり,SOCS1は,呼吸器系疾患又はアレルギー性疾患の治療に有効であるから,SOCS1をコードするDNAを含有する剤は,それらの疾患の治療に有効である。この態様の発明の好ましい態様は,前記SOCS1をコードするDNAを,発現ベクターとして含有する,上記に記載の剤である。すなわち,SOCS1をコードするDNAを,発現ベクターとして含有するので,たとえば,患部(気道,肺,皮膚など)において,特異的にSOCS1を発現させることができ,局部治療などに有効に利用することができる。
 本発明は,上記した呼吸器系疾患の治療剤,アレルギー性疾患の治療剤,IL-13誘導性反応の阻害剤,エオタキシンの産生阻害剤,IL-13誘導性肺病変の治療剤・予防剤,又は腫瘍治療剤を製造するための,SOCS1の使用をも提供する。
 本発明は,対象であるヒト又は非ヒト哺乳動物に,有効量のSOCS1を投与する工程を含む,呼吸器系疾患,アレルギー性疾患,IL-13誘導性肺病変又は腫瘍の治療方法をも提供する。なお,本発明は,対象であるヒト又は非ヒト哺乳動物に,SOCS1の発現を制御する発現ベクターを投与する工程を含む,呼吸器系疾患又はアレルギー性疾患の治療の治療方法をも提供する。本発明は,さらに,SOCSやドミナントネガティブSOCSを導入することにより,T細胞反応を制御する,喘息などの呼吸器系疾患や,アトピー性皮膚炎などのアレルギー疾患の治療方法をも提供する。
 本発明の薬剤の有効成分は,SOCS1,SOCS3などのSOCSタンパク質である。SOCSタンパク質は,その薬学的に許容される塩であってもよい。具体的には塩酸,臭化水素酸,ヨウ化水素酸,硫酸,硝酸,リン酸等の無機酸,ギ酸,酢酸,プロピオン酸,シュウ酸,マロン酸,コハク酸,フマール酸,マイレン酸,乳酸,リンゴ酸,酒石酸,クエン酸,メタンスルホン酸,エタンスルホン酸,アスパラギン酸,グルタミン酸等の有機酸との酸付加塩,ナトリウム,カリウム,マグネシウム,カルシウム,アルミニウム等の無機塩基,メチルアミン,エチルアミン,エタノールアミン,リジン,オルニチン等の有機塩基との塩やアンモニウム塩等が挙げられる。特に好ましいものとしてカリウム塩が挙げられる。また,本発明の有効成分には,水和物,溶媒和物の全てが含まれる。
 本発明のタンパク質,その部分ペプチド,またはそれらの塩は,公知のペプチドの合成法に従って,又は本発明のタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては,例えば,固相合成法又は液相合成法があげられる。本発明のタンパク質,又は部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させることで,目的とするタンパク質を精製できる。また,反応後は通常の精製法,例えば,溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は,公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし,逆に塩で得られた場合は,公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
 本発明のタンパク質をコードするDNAとしては,前述した本発明のタンパク質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。本発明のタンパク質をコードするDNAのクローニングの手段としては,本発明の本発明のタンパク質をコードするDNAの一部分を含有する合成DNAプライマーを用いたPCR法によって増幅するか,または適当なベクターに組み込んだDNAを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードするDNA断片もしくは合成DNAを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は,例えば,Molecular Cloning 2nd(J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)に記載の方法などに従って行なうことができる。また,市販のライブラリーを使用する場合,添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。DNAの塩基配列の変換は,公知のキットを用いて公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
 本発明のタンパク質の発現ベクターは,例えば,本発明のタンパク質をコードするDNAから目的とするDNA断片を切り出し,そのDNA断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。ベクターとしては,大腸菌由来のプラスミド(例,pBR322,pBR325,pUC12,pUC13),枯草菌由来のプラスミド(例,pUB110,pTP5,pC194),酵母由来プラスミド(例,pSH19,pSH15),λファージなどのバクテリオファージ,レトロウィルス,ワクシニアウィルス,バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他,pA1-11,pXT1,pRc/CMV,pRc/RSV,pcDNAI/Neoなどが用いられる。また,プロモーターとしては,遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば,動物細胞を宿主として用いる場合は,SRαプロモーター,SV40プロモーター,LTRプロモーター,CMVプロモーター,HSV-TKプロモーターなどが挙げられる。
 本発明における治療剤の有効成分はであるSOCS1などのSOCSタンパク質は,SOCSをコードする遺伝子を遺伝子治療の手法を用いて生体に導入することにより,治療効果を達成することができる。具体的には,生体内においてSOCSを発現する発現ベクターを遺伝子組み換えにより生体内に導入し,形質転換を行うものがあげられる。治療効果をもたらすタンパク質をコードする遺伝子を生体に導入し,発現させることによって,疾患を治療する手法は公知である。
 あるいは,デコイ,ドミナントナガティブ,アンチセンス核酸,リボザイム,またはRNAiによって,IL-13遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドを,適当なプロモーター配列の下流に組込み,デコイ,ドミナントナガティブ,アンチセンスRNA,リボザイム,あるいはRNAiをもたらすRNAの発現ベクターとして投与することができる。この発現ベクターを気管細胞,又はT細胞などに導入すれば,これらの遺伝子のデコイ,ドミナントナガティブ,アンチセンス核酸,リボザイム,またはRNAiによって当該遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドを発現し,当該遺伝子の発現レベルの低下によって呼吸器関連疾患やアレルギー性疾患に対し,治療効果を達成できる。
 デコイとは,転写因子が結合する染色体上のDNA配列を含む化合物であり,転写因子
が染色体上のDNAに結合することを阻害する化合物をいう。代表的なデコイに用いられる化合物は,核酸及びその類縁体である。デコイは転写因子が結合するDNA配列,またはこれらの相補体を含むオリゴヌクレオチド,あるいはこれらの変異体により作製できる。
 ドミナントネガティブとは,野生型に対して量的及び質的に優位に働いて,野生型の機能を阻害する変異体である。ドミナントネガティブは,野生型のアミノ酸の一部を欠損,置換,付加又は挿入することによりを作製できる。すなわち,ドミナントネガティブSOCS1は,公知の方法に従って作成することができる。
 アンチセンスRNAとは,遺伝子のセンス配列に相補的な塩基配列を有するRNAである。アンチセンスRNAによって遺伝子発現を抑制するには,通常15塩基以上,たとえば20塩基以上,又は30塩基以上の連続した塩基配列を有するRNAが用いられる。たとえば開始コドンを含む領域にハイブリダイズすることができるアンチセンス核酸は,当該遺伝子の発現抑制効果が大きいとされている。
 リボザイムは,塩基配列特異的にRNAを切断する触媒作用を備えたRNAである。リボザイムとして,ハンマーヘッド型やヘアピン型のリボザイムが知られている。いずれのリボザイムも,切断すべき領域に相補的な塩基配列部分と触媒活性の発現に必要な構造を保持するための塩基配列部分とで構成されている。切断すべき領域に相補的な塩基配列は任意とすることができる。
 本発明の第7の側面は,SOCS3のsiRNAを有効成分とする,IL-17産生促進剤に関する。後述する実施例により実証されたとおり,SOCS3のsiRNA(配列番号11に記載のRNA及び配列番号12に記載のRNAのいずれか又は両方)をT細胞に導入すると,IL-17の産生が増加する。よって,SOCS3のsiRNAを有効成分とする剤は,IL-17産生促進剤として有効である。そして,後述する実施例によって示されたとおり,SOCS3のsiRNAを導入することで,喘息反応が抑制された。よって,IL-17の産生を促進することが,たとえば喘息の治療に有効であると考えられる。勿論,IL-17は,好中球数増加などの機能があることが知られている。よって,上記のIL-17産生促進剤は,好中球数増加などを介して様々な疾患の治療又は予防に有効である。
 本発明の第8の側面は,SOCS3のsiRNAを有効成分とする,Th2分化阻害剤に関する。後述する実施例により実証されたとおり,SOCS3のsiRNA(配列番号11に記載のRNA及び配列番号12に記載のRNAのいずれか又は両方)をT細胞に導入すると,Th2の分化が抑制された。よって,SOCS3のsiRNAを有効成分とする剤は,Th2分化阻害剤として有効である。Th2細胞は,Th2サイトカイン(IL-4,IL-5,IL-13など)を産出する。Th2分化が阻害されることによって,Th2サイトカインが産出されなくなるので,Th2サイトカインが関与するアレルギー性疾患を予防、又は治療することができる。そして,後述する実施例によって示されたとおり,Th2分化を阻害することは,たとえば喘息の治療に有効であると考えられる。
 本発明の第9の側面は,SOCS3のsiRNAを有効成分とする,喘息の治療剤に関する。後述する実施例により実証されたとおり,SOCS3のsiRNA(配列番号11に記載のRNA及び配列番号12に記載のRNA)をT細胞に導入すると,喘息反応を抑制した。よって,SOCS3のsiRNAを有効成分とする剤は,喘息の治療剤として有効である。
 本発明は,IL-17産生促進剤,Th2分化阻害剤,又は喘息の治療剤を製造するためのSOCS3のsiRNAの使用をも提供する。本発明は,SOCS3のsiRNAを用いた,IL-17産生促進方法,Th2分化阻害方法,又は喘息の治療方法をも提供する。
 本発明のSOCS3のsiRNAは,SOCS3の発現を特異的に抑制できるものであればよく,配列番号11又は配列番号12に記載の塩基配列に限定されるものではない。本発明で用いるsiRNAとしては,塩基配列数が15~40塩基があげられ、17~30塩基が好ましく,19~25塩基がより好ましい。塩基配列数が短すぎると,SOCS3以外の遺伝子発現を抑制しやすくなるため,19~25塩基が望ましい。siRNAの合成は,特に限定されず,公知の方法で行えばよい。具体的には,固相法,液相法などがあげられる。合成したsiRNAは公知の方法で精製すればよく,例えば,逆相カラムクロマトグラフィー,ゲル濾過,HPLCなどがあげられる。
 siRNAの感染は,特に限定されず,公知の方法で行えばよい。具体的には,電気穿孔法,リポフェクション法,リン酸カルシウム法,DEAE-デキストラン法,ウイルスベクター法,マイクロインジェクション法などで行うことができる。感染時のsiRNA量やsiRNAの感染方法などの条件は,感染させる組織、又は細胞に応じて適宜調整すればよい。siRNAは,一本鎖の状態(single strand RNA(ssRNA))で用いると分解されやすいので,相補鎖を有する二本鎖(double strand RNA(dsRNA))の状態で感染させるのが好ましい。dsRNAを作製する方法は,特に限定されず,相補的な2種類のsiRNAを公知の方法でアニーリングさせればよい。siRNAの感染の有無は,感染させた組織又は細胞の一部から,全RNAを公知の方法で抽出し,PCR,リアルタイムPCR,ノーザンブロッティングなどの公知の方法で調べることができる。
 本発明の薬剤は,経口または非経口投与に適した有機又は無機の担体,賦形剤,その他の添加剤を用いて,常法に従って,経口固形製剤,経口液状製剤,または,注射剤,経鼻剤,吸入剤等の非経口製剤として調製することができる。具体的な剤型として,吸入剤,点鼻剤,又は塗布剤があげられる。
 吸入剤や経鼻剤等の経粘膜剤は,固体,液体,半固体状のものが用いられ,公知の方法に従って製造することができる。例えば,ラクトースや澱粉のような賦形剤や,更に,pH調整剤,防腐剤,界面活性剤,滑沢剤,安定剤や増粘剤等が適宜添加されていてもよい。投与は,適当な吸入又は吹送のためのデバイスを使用することができる。例えば,計量投与吸入デバイス等の公知デバイスや噴霧器を使用して,化合物を単独で又は処方された混合物の粉末として,若しくは医学的に許容しうる担体と組み合わせて溶液又は懸濁液として投与することができる。乾燥粉末吸入器等は,単回又は多数回の投与用のものであってもよく,乾燥粉末又は粉末含有カプセルを利用することができる。或いは,適当な駆出剤,例えばクロロフルオロアルカン,ヒドロフルオロアルカン又は二酸化炭素等の好適な気体を使用した加圧エアゾールスプレー等の形態であってもよい。
 静注,筋注,皮下注などの注射剤としては,無菌の水性又は非水性の溶液剤,懸濁剤,乳濁剤を包含する。水性の溶液剤,懸濁剤の希釈剤としては,例えば注射用蒸留水及び生理食塩水が含まれる。非水溶性の溶液剤,懸濁剤の希釈剤としては,例えばプロピレングリコール,ポリエチレングリコール,オリーブ油のような植物油,エタノールのようなアルコール類,ポリソルベート80等がある。このような組成物は,さらに防腐剤,湿潤剤,乳化剤,分散剤,安定化剤(例えばラクトース),溶解補助剤(例えば,グルタミン酸,アスパラギン酸)などの補助剤を含んでもよい。これらは例えばバクテリア保管フィルターを通す濾過,殺菌剤の配合又は照射によって無菌化される。これらはまた無菌の固体組成物を製造し,使用前に無菌水又は無菌の注射用溶媒に溶解して使用することもできる。
 経口固形製剤としては,錠剤,散剤,細粒剤,顆粒剤,カプセル剤,丸剤,徐放剤等が用いられる。このような固形製剤においては,一つ又はそれ以上の活性物質が,少なくとも一つの不活性な希釈剤,例えば乳糖,マンニトール,ブドウ糖,微結晶セルロース,デンプン,コーンスターチ,ポリビニルピロリドン,メタケイ酸アルミン酸マグネシウムと混合される。組成物は常法に従って,不活性な希釈剤以外の添加剤,例えばヒドロキシプロピルセルロース,ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)のような結合剤;ステアリン酸マグネシウム,ポリエチレングリコール,スターチ,タルクのような潤滑剤;繊維素グリコール酸カルシウム,カルメロースカルシウムのような崩壊剤;ラクトースのような安定化剤;グルタミン酸又はアスパラギン酸のような溶解補助剤;ポリエチレングリコールのような可塑剤;酸化チタン,タルク,黄色酸化鉄のような着色剤;を含有していてもよい。錠剤又は丸剤は必要によりショ糖,ゼラチン,寒天,ペクチン,ヒドロキシプロピルセルロース,ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートなどの糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質のフィルムで被膜してもよい。
 経口液状製剤は,製薬学的に許容される乳濁剤,溶液剤,懸濁剤,シロップ剤,エリキシル剤等を含み,一般的に用いられる不活性な希釈剤,例えば精製水,エタノールを含む。この組成物は不活性な希釈剤以外に湿潤剤,懸濁剤のような補助剤,甘味剤,風味剤,芳香剤,防腐剤を含有していてもよい。
 本発明の有効成分の投与量は,投与ルート,疾患の症状,投与対象の年齢,性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定されるが,通常経口投与の場合成人1人当たり有効成分約0.1乃至500mg/日,好ましくは1乃至250mg/日であり,これを1回~2回に分けて投与される。
 本発明の薬剤は,たとえば,喘息(気管支喘息など),慢性閉塞性肺疾患,肺線維症,又はアレルギー性鼻炎などの治療に用いられる他の薬剤と同時にまたは時間をおいて併用することができる。本発明の薬剤と併用することが可能である薬剤として,例えば,エピネフリン,塩酸エフェドリン,イソプレテレノール,塩酸トリメトキノール,硫酸サルブタモール,硫酸テルブタリン,塩酸ツロブテロール,フェノテロール,塩酸プロカテロール等のβ刺激薬,臭化イプラトロピウム,フルトロピウム,オキシトロピウム等の抗コリン薬,テオフィリン,コリンテオフィリン,アミノフィリン,ジプロフィリン,プロキシフィリン等のキサンチン誘導体,プロキシフィリン配合剤,ジプロフィリン配合剤,塩酸ドキサプラム等の末梢性呼吸刺激薬,ジメフェリン,アセタゾラミド,メドロキシプロゲステロン,サーファクテン,アルミトリン等の中枢性呼吸刺激薬,コルチゾン,プレドニゾン,プレドニゾロン,デキサメタゾン等の吸入ステロイド剤,リン酸コデイン,リン酸ベンプロペリン等の鎮咳薬,サポニン,塩酸ブロムヘキシン,カルボシステイン,塩酸アンブロキソール等の去痰薬,その他の生薬,漢方薬などが挙げられる。
 以下,実施例を用いて本発明を具体的に説明する。本発明は,以下の実施例に限定されるものではなく,当業者に自明な範囲で,適宜調整することができ,そのようなものも本発明に含まれる。
 製造例1 マウスの作出
 C57BL/6バックグラウンドのSOCS1-KOマウス(SOCS1-/-)は,公知の方法(参考文献32)により得た。C57BL/6バックグラウンドのIFNγ-KOマウス,及びBALB/cマウスを,ジャクソンラボラトリ(Jackson Laboratory)(Bar Harbor, ME)より入手した。SOCS1/IFNγDKOマウス(SOCS1-/-IFN-γ-/-)を,SOCS1+/-IFN-γ-/-繁殖ペアから得た(参考文献56)。WT(SOCS1+/+)及びSOCS1-/-マウス胚繊維芽細胞(MEFs)を,SOCS1+/-の雌雄を交配させて得られた胎児齢15日胚を由来として標準的プロトコールにより得た(参考文献57)。これらのマウスを用いたすべての実験を,九州大学動物倫理委員会のガイドラインに認可され,このガイドラインに従って行った。
 アデノウイルスベクター及びアデノウイルスの投与
 リコンビナントウイルス産生に用いた293細胞の毒性効果のため,Cre-LoxPコンディショナル発現系を,アデノウイルスベクターを作製するために利用した。LacZ(Ad-LacZ),SOCS1(Ad-SOCS1),及びCreリコンビナーゼ(AD-Cre)を含むリコンビナントアデノウイルスベクターを,293細胞にて公知の方法(58)にしたがって調整した。1×10pfuのAd-SOCS1及びAd-CReを麻酔下で気管内に投与した後,RT-PCRによるSOCS1発現量が,3-5日後をピ-クとして観察された。SOCS1のアデノウイルスにより発現させるため,マウスに最初のIL-13あるいはOVA処理の3日前に気管内へアデノウイルスベクター(1×10pfu)投与した。
 生体内でのIL-13処理
 IL-13投与を,公知の文献(参考文献18)に従って行った。リコンビナントマウスIL-13溶液(0.5mg)あるいはビ-クル溶液を1,3,及び5日目に気管内へ注入した。BALを,6日目であって,最後の投与の24時間後に行い,BAL細胞の差異を測定した。
 感作及び曝露
 8週齢BALB/cマウスを20μgOVA(Grade V;Sigma)及び2.25mg水酸化アルミニウム(Pierce,Rockford,Illinois)の1日目及び14日目における腹腔内投与により感作させた。23日目において,アデノウイルスベクター(1×10pfu)をマウス気管内へ注入した。26-28日目において,マウスを,生理食塩水または1%OVAを含むエアロゾルに,一日20分間,公知の方法(参考文献12)にしたがって曝露した。
 IL-13阻害実験において,実験動物に,25日目から毎日,400μgの可溶性IL-13Rα2-Fc融合あるいはコントロ-ル融合タンパク質を腹腔内投与した(参考文献17)。また,マウスに25日目から一日おきに100μgのIL-13アンタゴニスト(可溶性IL-13Rα2-Fc融合タンパク質)あるいはコントロ-ル融合タンパク質の腹腔内投与した(参考文献59)。
 気道過敏性(AHR)の測定
 30日目において,最後のエアロゾル曝露の36時間後,マウスを麻酔し,頸部気管を切開しカニュ-レを挿入した。アセチルコリンエアロゾルについての気道反応性を測定するため,公知の方法(参考文献18)にしたがって,マウスに対し人工換気下に,気道内圧を,差圧変換機を用いて測定し,継続的に記録した。アセチルコリン濃度を段階的に増加させ,超音波噴霧器を用いて吸入させた。デ-タは誘発性濃度200(PC200),気道内圧が基準値の200%となる濃度として表され,PC200は個々のマウスについて算出した。LogPC200の値が低いほど,より気道反応性が亢進している(気道過敏性亢進状態である)ことを表す。
 気管支肺胞洗浄(BAL)
 マウスに致死量のペントバルビタールを投与し,気管カニューレを通して肺を1.0mLの0.9%生理食塩水で穏やかに洗浄した。総合及び分画のBAL細胞数計測を公知の方法(18)にしたがって行った。サンプルを2000rpmで10分間遠心し,上清を-80℃で保存した。
 エオタキシン測定
 BAL液上清中及び培養細胞上清中のマウスエオタキシンを,ELISAキット(BioSource International, Camerillo, CA)を用いて測定した。
 SOCSmRNA発現の測定
 全RNAを,チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法によって単離した。逆転写(RT)ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を1.0μgの全RNAについて行った。オリゴ(dT)プライマーをRTに用い,cDNAを,特異的プライマーを用いてPCRによって増幅した。PCRには,下記のmSOCSs特異的プライマー対を用いた。
mSOCS1:
5´-CTCGAGTAGGATGGTAGCACGCAA-3´(配列番号3)及び
5´-CATCTTCACGCTGAGCGCGAAGAA-3´(配列番号4);
mSOCS2:
5´-GACCAGCTGTCTGGGACGTGTTGA-3´(配列番号5)及び
5´-GAGAGAGAAATACTTATACCTGGAAT-3´(配列番号6);
mSOCS3:
5´-TGCGCCATGGTCACCCACAGCAAGTTT-3´(配列番号7)及び
5´-GCTCCTTAAAGTGGAGCATCATACTGA-3´(配列番号8)であった。
β-アクチンのインターナルコントロールに用いられたプライマーは,それぞれ
5´-TCCTGTGGCATCCATGAAACT-3´(配列番号9)及び
5´-GAAGCACTTGCGGTGCACGAT-3´(配列番号10)であった。
 PCRの具体的な条件は,公知の方法(参考文献18)にしたがって行った。mSOCS1,mSOCS2,mSOCS3それぞれ,熱変性(95℃,30秒)・アニーリング(60℃,30秒)・伸張反応(72℃,30秒)で行った。サイクル数は,それぞれ42サイクル,33サイクル,38サイクルでおこなった。
 TaqMan Gene Expression Assays on the ABI PRISM 7500(Applied Biosystems)を用い,定量的リアルタイムRT-PCRによって,マウスSOCS1(ID:Mm00782550_s1)を検出した。比較による閾値サイクル法及びインターナルコントロール(βアクチン,4352341E)を標的遺伝子の発現を規格化するために用いた。
 ウェスタンブロッティング
 免疫ブロット法は,抗リン酸化STAT6(New England Biolabs,Beverly,MA)あるいは抗STAT6(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)抗体を用いて,公知の方法(参考文献12)に従って行った。
 レトロウイルス産生及び感染
 IRES-GFPカセットを含むマウスSOCS1あるいはコントロ-ルのpGCDNsaml/Eベクターを,293GPGパッケ-ジング細胞に,公知の方法(参考文献60)に従って,トランスフェクトさせた。マウス胚繊維芽細胞(MEF)にウィルス上清からレトロウイルスによって形質導入した。48時間後,GFP陽性の細胞を,FACS ARia(BD Biosciences)によって分離し,実験に用いた。
 統計的解析
 値を,平均値±(プラスマイナス)標準誤差として表した。グル-プ内の差異は対応の無いt検定あるいは偏差解析とともにボンフェローニの事後解析を用いて解析した。ノンパラメトリックなデータは,マン・ホイットニーのU検定の後クラスカル・ワリス検定によって解析した。0.05より小さいP値を有意とした。(実施例1~4に適用)
 細胞精製とヘルパーT細胞の誘導
 Th2細胞を作り出すために,DO11.10XSOCS3+/+マウスとDO11.10XSOCS3+/-マウスの脾細胞から磁気的細胞ソーティング(MACS)によりCD4T細胞を単離した。精製された細胞(5x10細胞/ml)を,抗原提示細胞(APCS)(4x10細胞/ml)としてのnaiveBALB/cの照射された脾細胞,pOVA(323-339)(1μg/ml;BACHEM),組み換えIL-4(100ng/ml;PEPRO TECH,Inc.),アンチIL-12抗体(10μg/ml;R&Dシステムズ,Inc.)およびアンチCD28(1μg/ml;BDファーミンゲンInc.)の存在下で活性化した。これらの細胞を,10%子牛胎児血清(シグマ),ペニシリン(100U/ml)およびストレプトマイシン(100U/ml)を含むRPMI1640(GIBCO)中で培養し,維持した。細胞を増幅するため,3日目および5日目に,組み換えIL-2(2ng/ml;PEPRO TECH Inc.)を投与した。これらの方法は以前に報告された方法に従って行った。
 In vitro CD4 T細胞培養とサイトカイン測定
 8日目に,DO11.10XSOCS3+/+マウスとDO11.10XSOCS3+/-マウスからCD4T細胞を回収し,再刺激のために維持した。CD4T細胞(1X106細胞/ml)と新規に単離されたAPCs(2X10細胞/ml)を,pOVA(323-339)(1μg/ml)とともに培養した。48時間後,培養上清を回収し,Th2株のサイトカインプロファイル,INFγ,TGFβ,IL-10およびIL-17を,ELISAを用いて測定した。
 適合移植と負荷
 8日目にDO11.10XSOCS3+/+マウスとDO11.10XSOCS3+/-マウスからCD4T細胞を回収し,naiveBALB/cマウスの静脈に注入した。この細胞の適合移植後1から5日後に,マウスにエアロゾル化OVA(5%)を施した。
 SOCS3 siRNAの感染
 siRNAを行うために,SOCS3(#160219)とFAMで標識されたネガティブコントロール(#4620)のsiRNAを,アプライドバイオシステムズから購入した。SOCS3siRNA(#160219)の配列は以下のとおりである: SOCS3,5’-CCUACGCAUCCAGUGUGAGtt-3’(配列番号11)および 5’―CUCACACUGGAUGCGUAGGtt-3’(配列番号12)。CD4T細胞をDO11.10XSOCS3+/+マウスから単離し,これらのsiRNAを製造者の指示(アマクサヌクレオフェクターシステムIIおよび96ウェルシャトルシステム)にしたがってCD4T細胞に電気穿孔法により感染させた。精製後,CD4T細胞を3μgのコントロールまたはSOCS3siRNAで感染した。電気穿孔法後,CD4T細胞をTh2細胞に誘導し,前述のように適合移植のために用いた。
 SOCS3mRNAの発現を決定するために,naiveBALB/cの脾臓CD4T細胞を,電気穿孔法後,24時間,48時間,72時間インキュベーションし,回収した。
 mRNA発現の決定とリアルタイムPCR
 SOCS3特異的siRNAまたはネガティヴコントロールのsiRNAを感染させたnaiveBALB/cからCD4T細胞の全RNAを,グアニジニウムチオシアネートーフェノールークロロフォルム法により単離した。逆転写(RT)-ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を,1.0μgの全RNAについて行った。オリゴ(dT)プライマーをRTのために用い,cDNAを,特異的プライマーを用いてPCRにより増幅した。PCRには,以下のプライマー対をそれぞれ使用した。:mβ―アクチン,5’-TCCTGTGGCATCCATGAAACT-3’(配列番号13)および 5’-GAAGCACTTGCGGTGCACGAT-3’(配列番号14);mSOCS3, 5’-TGCGCCATGGTCACCCACAGCAAGTTT-3’(配列番号15)および 5’-GCTCCTTAAAGTGGAGCATCATACTGA-3’(配列番号16)。増幅は,以前の報告に従って行った。
 リアルタイムPCRのプライマーは,アプライドバイオシステムズからmSOCS3(Mm00545913-sl)用に購入した。PCRはABI7500シークエンス検出システム(アプライドバイオシステムズ,フォスターシティ,CA)を用い,12.5μlのTasmanユニバーサルPCR混合物,1.25μlの20Xアッセイーオンーデマンド遺伝子発現アッセイ混合液および11.25μlのRNaseフリーのH2Oに希釈したcDNAを含む25μl反応混合液中で行った。試料は95℃で10分プレインキュベーション後,デネイチャーのために95℃15秒,アニーリング伸長のために60℃1分で40サイクルの増幅に供した。そしてPCRサイクルの終了後,単一の産物の増幅を確認するために解離曲線を生成し,閾値サイクル回数(Ct値)を決定した。Ct値と標準曲線により絶対的定量(Qt値)を行った。
 気道の反応性
14日目,最後のエアロゾル負荷の24時間後,アセチルコリンエアロゾルに対するAHRを測定するために,最初にマウスに,ケタミンとペントバルビタールナトリウムの混合物によって腹腔内麻酔し,気管切開後に,カニューレを挿入した。マウスには,機械的人工呼吸を行った(1回換気量,0.3ml;頻度,120呼吸/分)。マウスには,筋弛緩薬を投与した。気道内圧を,圧力変換器を用いて測定し,連続的に記録した。超音波吸入器により,アセチルコリン吸入させ、濃度を段階的に増加させた(0.6から20mg/ml)。データを,気道圧力がそのベースライン値の200%の濃度である誘発濃度200(PC200)として表した。低いPC200値は高いAHRを示す。
 気管支肺胞の洗浄(BAL)とサイトカイン測定
AHRの測定後,肺を気管カニューレにより,1mlの生理的食塩水を用いて1度洗浄した。全細胞の計数と分化細胞の計数を,前述のように行った。
 統計解析
平均値±SEMとして値を表現した。グループ間の違いは,独立t検定またはポストーホックボンフェローリ分析とともに分散分析を用いて分析した。非母数のデータはKruskal-Wallis検定を用いて分析し,続いてマン・ホイットニーU-検定を行った。0.05以下のP値を有為とみなした。(実施例5~9に適用)
 SOCS1発現に対するIL-13の効果
 図1は,SOCS1発現に対するIL-13の効果を示す図である。図1(a)は,RT-PCR結果を示す図面に替わる写真である。ケタミン及びキシラジン混合物の腹腔内投与による麻酔下で,免疫されていないC57BL/6マウスの気管内にビ-クル(PBS;コントロ-ル,C)又はIL-13溶液を0.1ml投与した。最後の投与より図に示した時間の後,肺の全RNAを単離した。発現したSOCS1,SOCS2,及びSOCS3を,RT-PCRによって増幅し,ゲルを写真撮影した。なお図1(a)では,βアクチンのRT-PCR産物を比較のため示した。デ-タは両方のグル-プのそれぞれの時点における標本数nの代表値(n=3)である。
 図1(b)は,マウス肺中のSOCS1mRNAのリアルタイムRT-PCR解析結果を示す図面に替わるグラフである。図1(b)では,3回の独立した実験の平均値を示した。
 図1(c)は,SOCS1発現に関するRT-PCR結果を示す図面に替わる写真である。図1(c)では,マウス気管上皮細胞株(TGMBE-02-3細胞,上方パネル)又はマウス胚線維芽細胞(下方パネル)において発現したSOCS1をゲル性RT-PCRによって増幅した。図1(c)では,βアクチンに対するRT-PCR産物を比較のため示した。
 SOCS発現に対するIL-13の効果
 本発明者らは,後述する実施例におけるビボ実験(in vivo)により,IL-13がSOCSファミリー分子の発現を誘導することを見出した。すなわち,図1(a)及び図1(b)に示されるように,免疫されていないマウスへIL-13を気管内投与すると,気道におけるSOCS1発現が促進される。それに対し,SOCS2及びSOCS3の発現はIL-13による影響を受けなかった。未処理の動物と比較して,媒体物(IL-13)注入後のSOCS遺伝子の発現に違いはなかった。
 また,図1(c)に示されるように,IL-13は,ビトロ実験(in vitro)により,TGMBE-02-3細胞(マウス気管上皮細胞株),及びマウス胚線維芽細胞(MEF)におけるSOCS1発現をも増加させた。ビボ実験(in vivo)により,IL-13が,肺でのSTAT6を活性化することが明らかにされている(参考文献17,18,及び24)。STAT6結合における共通のエレメントは,マウスSOCS1プロモーターに認められる(参考文献29,30)。これらのデ-タは,STAT6に加え,内在性制御因子SOCS1の発現が,気道の局所構造細胞においてIL-13により活性化されることを示唆する。
 SOCS阻害によるIL-13誘導性喘息の促進
 本発明者らは,過剰発現したSOCS1が,IL-13により誘導される喘息の発症に重要な役割を果たすと仮定した。この仮定を検証するため,後述する実施例によりIL-13により誘導される反応を,SOCS1欠損マウスにおいて解析した。SOCS1欠損は,IFN-γ過剰産生及びTh1型自己免疫に対して過剰反応し,その結果,多臓器不全となる。この疾患の症状は,これらの動物とIFN-γKOバックグラウンドとを交配し,SOCS1/IFN-γ二重欠損(DKO)マウスを作製することにより,大きく回復する(参考文献31,32)。そのため,本発明者らは,IL-13を野生型(WT)C57BL/6,SOCS1+/+IFN-γ-/-(IFN-γKO),及びSOCS1-/-IFN-γ-/-(SOCS1/IFN-γ DKO)マウスの気管に注入した。
 SOCS1欠損マウスにおけるIL-13誘導性喘息
 図2は,SOCS1欠損マウスとIL-13誘導性喘息との関係を示す図である。図2(a)は,好酸球数を示す。図2(b)は,エオタキシン濃度を示す。IL-13を免疫されていないマウスの気管内に3回投与した。図2(a)及び図2(b)の好酸球数及びエオタキシン濃度は,野生型(WT)C57BL/6,IFN-γ-/-(IFNγ-KO),及びIFN-γ-/-SOCS1-/-(IFNγ/SOCS1-DKO)マウスにおいてIL-13最終投与から24時間後のBAL液について測定したものである。
 図2(c)は,吸入したアセチルコリンに対する気道収縮反応を気道内圧の変化で表した図面に替わるグラフである。
 図2(d)は,吸入したアセチルコリンに対する気道過敏性を閾値濃度(PC200-ACh)として表した図面に替わるグラフである。標本数n=6である。*p<0.05
 図2(a)に示されるとおり,IL-13を注入すると,免疫されていないWTマウスでは,BAL液中の好酸球数が増加した。一方,WT及びIFN-γKOマウスにおいては,好酸球の数に差は見られなかった。IL-13を注入した後のSOCS1/IFN-γDKOマウスは,WTマウスあるいはIFN-γKOマウスと比較して,リンパ球及び好中球の数には有意差が無いにもかかわらず(データは示さず),気管支肺胞洗浄液(BAL)中の好酸球の更なる増加を示した。未処理(ビークル)のWT,未処理(ビークル)のIFN-γKO,及び未処理(ビークル)のSOCS1/IFN-γDKOマウスの間に好酸球数の差は見られなかった。
 次に,本発明者らは,マウスのBAL液中のエオタキシンの値を測定した。図2(b)に示されるように,IL-13を注入することで,SOCS1/IFN-γ DKOマウスのエオタキシン濃度は,WTマウスあるいはIFN-γ KOマウスよりも有意に増加し,一方SOCS1/IFN-γ DKOマウスの気道の好酸球増加を支持した。IFN-γ KOマウスとWTマウス間ではIL-13注入後のBAL液中におけるエオタキシン濃度に差異はなかった。
 マウス系統の間で,A/Jマウスはアセチルコリンに対する気道収縮反応が過敏であり,一方,C57BL/6マウスは,気道収縮反応が鈍いことがよく知られている(参考文献33~35)。IL-13を気管内注入しても,免疫されていないC57BL/6WTマウス及びIFN-γKOマウスにおいては,吸入したアセチルコリンに対する気道反応性は影響を受けない。しかしながら,未処理のA/Jマウスにおいては,気道過敏性亢進を誘導する(参考文献17,18,及び36)。図2(c)に示されるように,未処理(ビークル)のC57BL/6バックグラウンドSOCS1/IFN-γ DKOマウスは,未処理(ビークル)のC57BL/6 WTマウスと気道過敏性に差が見られないが,IL-13処理後のSOCS1/IFN-γ DKOマウスは気道過敏性が亢進し,図2(d)に示されるように気道過敏性閾値であるPC200値の低下を示した。これらのデ-タはIL-13による誘導性喘息の特性が,SOCS1/IFN-γ DKOマウスにおいて促進されること,及びそれがIFN-γ欠損には起因しないことを示唆している。
 IL-13は,主にJAK-STAT経路,特にSTAT6を介して細胞内シグナルを活性化する(参考文献19,21,22,及び24)。SOCS1の不活性化がIL-13反応を促進する分子機構を解明するため,本発明者らはSTAT活性化を,マウス胚線維芽細胞(MEF)を用いて解析した。
 SOCS1の調節とエオタキシン発現
 図3は,SOCS1を調節することで,IL-13処理後のSTAT6活性化及びエオタキシン発現を制御することを示す図である。図3(a)は,野生型とSOCS1を欠損した株のSTAT6活性化を示す図面に替わる写真である。図3(a)において,野生型(WT)C57BL/6又はSOCS1-/-(SOCS1-KO)マウス由来のマウス胚線維芽細胞(MEFs)を10ng/mlのIL-13で図に示した期間刺激した。細胞抽出物について図に示した抗体でウエスタンブロッティングを行った。
 図3(b)は,SOCS1遺伝子を持つレトロウイルスベクターの影響を示す図面に替わるウエスタンブロッティングの写真である。図3(b)では,WT MEFsをレトロウイルスベクター(コントロール-RV)あるいはSOCS-1遺伝子を持つレトロウイルスベクター(SOCS1-RV)に感染させた。レトロウイルスに感染し,GFPを指標としたSOCS1導入陽性の細胞を10ng/mlのIL-13中で図に示した期間培養し,細胞抽出物をリン酸化STAT6及び総STAT6抗体でウエスタンブロッティングした。
 図3(c)は,細胞上清中のエオタキシンレベルを示す図面に替わるグラフである。図3(c)では,WTあるいはSOCS1-KOマウス由来の細胞(左),及びコントロ-ルRVあるいはSOCS1-RV感染WT MEFs(右)を10ng/mlのIL-13存在下,あるいは非存在下で24時間刺激した。細胞上清中のエオタキシンレベルをELISAで測定した。
 図3(d)は,IL-13レセプターに対するSOCS1不活性化の影響を示す図面に替わる写真である。図3(d)では,WTあるいはSOCS1-KOマウス由来のMEFから全RNAを単離した。IL-13レセプター(IL-13Rα1レセプター,IL-4レセプター,IL-13レセプターのα2鎖)を,RT-PCRによって増幅し,ゲルを写真撮影した。なお図3(d)では,βアクチンのRT-PCR産物を比較のため示した。
 図3(a)及び図3(b)に示されるように,SOCS1欠損MEFでは,コントロ-ルWT MEFと比較して,IL-13によって誘導されるSTAT6リン酸化が増大した。一方,WT MEFにおいてSOCS1を強制発現すると,IL-13投与後のSTAT6リン酸かは認められず,STAT6活性化が減少した。
 本発明者らは,MEFからのIL-13依存的エオタキシン産生に対するSOCS1の効果を調べた。図3(c)に示されるように,SOCS1欠損MEFからのエオタキシン産生は,コントロ-ルMEFと比較して増加していた。一方,SOCS1を強制発現したMEFからの産生は減少した。これらの結果から,SOCS1の不活性化により,増加したSTAT6活性を通してIL-13反応を促進することがわかる。
 IL-13は,IL-13Rα1レセプターに結合することによって,細胞にシグナルを伝達することが知られている。IL-13結合後,このレセプターはIL-4レセプター(IL-4Rα)とヘテロ二量体を形成する(参考文献37)。IL-13は,IL-13レセプターのα2鎖(IL-13Rα2)により高い結合親和性を示し,その結果,IL-13Rα2がAP-1を活性化し,デコイレセプターだけでなくTGF-βの分泌を誘導すると考えられる(参考文献23)。SOCS1がIL-13レセプターの発現を調節するかを検証するため,本発明者らはIL-13レセプターのmRNAの発現をSOCS1欠損及びコントロ-ルMEFについて測定した。図3(d)に示されるように,SOCS1は,可溶性IL-4R,膜IL-4R,IL-13Rα1,及びIL-13Rα2の発現に影響しなかった。
 SOCS1過剰発現による喘息表現型の抑制
 図4は,SOCS1過剰発現による喘息表現型の抑制を示す。図4(a)は,リアルタイムRT-PCRによって測定されたAd-LacZあるいはAd-SOCS1とAd-Creの感染から3日後におけるBALB/cマウス肺中のSOCS1発現を示す図面に替わるグラフである。
 図4(b)は,アデノウイルスによりSOCS1遺伝子を気道で過剰発現されたBALB/cマウスに対しIL-13処理を行った後のBAL液中の好酸球数を示す図面に替わるグラフである。図4(b)では,Ad-LacZあるいはAd-SOCS1とAd-Creを最初のIL-13処理の3日前にマウス気管内へと注入した。BAL液は最後のIL-13処理から24時間後に回収した。
 図4(c)は,OVA誘導性喘息におけるSOCS1発現を示す図面に替わるグラフである。図4(c)では,全RNAを肺全体からOVA感作及び曝露より図に示した時間の後単離した。マウス肺中のSOCS1mRNAのリアルタイムRT-PCR解析結果を示す図面に替わるグラフである。3回の独立した実験の平均値を示した。
 図4(d)は,OVA曝露後のSOCS1発現に対するIL-13阻害の効果を示す図面に替わるグラフである。BALB/cマウスのグル-プを可溶性IL-13Rα2-Fc(sIL-13Rα2-Fc)又はコントロールタンパク質(IgG)で毎日処理した。処理はOVA曝露より一日前から開始した。OVA曝露より3時間後RNAを単離し,SOCS1発現をリアルタイムRT-PCRによって解析した。
 図4(e),図4(f)および図4(g)は,アレルゲン誘導性の喘息に対するSOCS1遺伝子導入の効果を示す。図4(e)は,アセチルコリンによる気道内圧の変化を示す図面に替わるグラフである。図4(f)は,PC200-AChの算出結果を示す図面に替わるグラフである。図4(g)は,好酸球数の計測結果を示す図面に替わるグラフである。OVAに感作されたマウスにAD-LacZあるいはAd-SOCS1,さらにAd-Creを最初のOVA曝露の3日前に気管内投与した。気道過敏性測定及び気管支肺胞洗浄を最終OVA曝露から36時間後に行った。気道過敏性を,図4(e)に示されるアセチルコリンによる気道内圧の変化によって測定し,図4(f)に示されるようにPC200-AChを算出し,図4(g)に示されるように好酸球数の計測をBAL液中で行った。標本数は6,*p<0.05であった。
 本発明者らは,マウス体内でのIL-13注入,又はアレルゲン感作及び曝露によって誘導される気管支喘息反応に対するSOCS過剰発現の効果について検討した。図4(a)及び図4(b)に示されるように,SOCS1は,マウス気道内でアデノウイルス発現ベクターを用いて過剰発現され,アデノウイルスによるSOCS1の発現は免疫されていないBALB/cマウスにおいて,IL-13誘導性の気道好酸球浸潤を阻害した。
 本発明者らは,マウス気道中のSOCS1発現を,卵白アルブミン(OVA)誘導性喘息モデルを用いて解析した。図4(c)に示されるように,全身的なOVA感作及びエアロゾル化したOVA曝露後,気道中のSOCS1発現は増加し,最終OVA曝露から3~6時間後に最大値をとった。さらに本発明者らは,OVA曝露により誘導されるSOCS1発現を,IL-13阻害剤が抑制するかについて実験を行った。図4(d)に示されるように,アレルゲンを投与することにより誘導されるSOCS1発現が,IL-13阻害剤である可溶性IL-13Rα2-Fcを投与されたマウス肺においては減少した。このように,IL-13は,喘息の気道においてSOCS1誘導に寄与することがわかる。
 OVA感作及び曝露の結果,コントロ-ルマウスにおいてBAL液中の好酸球増加及び気道過敏性亢進が見られた。図4(e),図4(f)及び図4(g)に示されるように,アデノウイルスによるSOCS1過剰発現は,コントロ-ルアデノウイルス処理と比較して,著しくOVA曝露後の気道好酸球浸潤及び過敏症を抑制した。一方,リンパ球及び好中球の数に有意な差は見られなかった(データは示さず)。感作及び曝露の無い場合,SOCS1-アデノウイルス及びコントロ-ルアデノウイルス処理の間に,アセチルコリンに対する気道過敏性及びBAL液中の炎症細胞に実質的な差は無かった。
 考察
 上記の実施例により,IL-13を局所投与することで,SOCSタンパク質のうち選択的に気道中のSOCS1発現を誘導し,SOCS1過剰発現がIL-13誘導性喘息反応を阻害することが示された。また,SOCS1はIL-13依存的STAT6活性化及びエオタキシン発現を抑制することが示された。SOCS1欠損マウスでは,免疫されていない低応答性のC57BL/6バックグラウンドのマウスにおいてさえも,IL-13処理後の気道過敏性が見られる。実験的なOVAによって誘導されるアレルギー性気道炎症モデルでは,アレルゲン曝露はSOCS1の気道における上方制御を誘導し,SOCS1の局所的誘導が喘息反応を減弱させる。これらの発見はTh2サイトカインによって気道中に誘導されるSOCS1発現がアレルギー性喘息を負に制御すること示す。これは標的器官においてSOCSタンパク質がアレルギー性炎症を阻害することを初めて証明したものである。
 SOCS1発現は多くの刺激によって誘導される(参考文献6,9,及び38)。一方,SOCS1は,IFN-γの重要な阻害因子であると考えられる(31,32)。IL-13は,喘息及びその他のTh2に支配される炎症性疾患に関連する,様々な炎症促進効果を持つ。これらの効果は,シグナル伝達タンパク質STAT6によって媒介される。IL-13誘導性喘息様の表現型に関連するいくつかのシグナル伝達経路として,アデノシン(参考文献39,40),アルギナ-ゼ(参考文献41,42),リポキシゲナ-ゼ産物(参考文献43),塩素チャネル(参考文献36),及び哺乳類酸性キチナ-ゼ(参考文献44)等が報告されている。STAT6に結合する共通エレメントが,マウスSOCS1プロモーターに見られる(参考文献30,45,及び46)。また,SOCS1は,IL-4及びIL-13誘導性のエオタキシン-3/CCL26遺伝子発現活性化をin vitroにおいて阻害することが示された(参考文献47)。これらの結果はSOCS1が,IL-13シグナリングを自己制御し,アレルギー性炎症における負のフィードバック機構を提供しているという本発明者らによるビボ実験を支持するものである。
 気道上皮は,アレルゲンとの接触が起こる重要な部位である。この接触により引き起こされる相互作用が,炎症の発生あるいは永続化に寄与する触媒因子,及び喘息発症を亢進する因子の産生を引き起こす様々なシグナル伝達現象を惹起する(参考文献48,49)。IL-13の上皮細胞に対する直接的作用の重要性は,AHR誘発において示されている(参考文献24)。リコンビナントアデノウイルスベクターを気管内投与することが,気道上皮を主に標的とすることは知られている(参考文献50,51)。これらの知見及び本実施例により,気道上皮細胞がIL-13及びアレルゲン刺激に応答するSOCS1発現の原因であることを示唆している。
 また,喘息患者の気道においてIL-13発現が上昇すること(参考文献52,53),及びIL-13コーディング領域の自然な差異がアレルギー感受性の重要な遺伝的決定因子であること(参考文献54)が報告されていた。喘息の新規治療法の多くは,Th2炎症の正のシグナルを阻害することを目的としている(参考文献55)。本発明者らは,それらとは別の方法である,負の制御因子を促進する薬剤の開発を提案した。本実施例は,標的器官におけるSOCS1の異常な活性が,促進されたTh2サイトカイン反応を通じてアレルギー性疾患に寄与する可能性があることを示す。
 Th2の分化と喘息との関係を解明するために,卵白アルブミンペプチド(pOVA)-特異的T細胞受容体(TCR)形質転換マウス(DO11.10XSOCS3+/-)とSOCS3遺伝子(DO11.10XSOCS3+/-)のヘテロ欠失を持つマウスを用いそれらの脾臓からCD4T細胞を精製した。これらのマウスは,K.マーフィー(ワシントン大学)とJ.N.イール(St.ジュード小児研究病院)の好意によりそれぞれ提供された。DO11.10XSOCS3+/-マウス由来の予め活性化されたT細胞中のSOCS3タンパク質の発現は,DO11.10XSOCS3+/+マウス由来のそれよりも3倍低かった。抗原提示細胞(APC)を単離するためにnaiveBALB/cマウスを用い,CD4T細胞の静脈注射を行った。
 siRNA研究において,naiveBALB/cマウスを用いて,その脾臓からCD4T細胞を単離し,siRNA感染によるCD4T細胞の抑制効果の程度を分析した。CD4T細胞を精製するために,DO11.10XSOCS3+/+マウスを用い,SOCS3-特異的なsiRNAの喘息反応に関する効果を確認するためにこのCD4T細胞を用いた。
 図5に示すように,SOCS3+/+XDO11.10およびSOCS3+/-XDO11.10マウス由来のCD4T細胞中のTh2サイトカイン(IL-4,IL-5,IL-13),IFNγ,TGFβ,及びIL-10をELISAにより測定した。SOCS3+/+XDO11.10およびSOCS3+/-XDO11.10マウス由来のCD4T細胞は,pOVAとともに培養することで,Th2細胞に分化させた。48時間後,細胞培養上清を回収し,サイトカイン類をEILSAにより測定した。SOCS3+/-XDO11.10マウス由来のIL-4とIL-13は,SOCS3+/+XDO11.10マウスのそれに比べて顕著に減少していた。(n=4.p<0.05) IL-4及びIL-13は,Th2細胞から産出されるサイトカインである。よって,SOCS3欠損によって,CD4T細胞からTh2細胞への分化が阻害されることが示された。
 図6(a)に示すように,T細胞中のSOCS3のダウンレギュレーションが,アセチルコリンを吸入した気道の反応に与える効果を測定した。SOCS3+/-DO 11.10間がSOCS3+/+DO11.10から単離されたCD4T細胞を,Th2細胞に分化し,naiveBALB/cマウスをレシピエントとして適合移植した。細胞の適合移植の1から5日後にレシピエントのBALB/cマウスを,エアロゾル化したOVA(5%)で曝露した。最後の抗原負荷の24時間後,おのおののマウスの吸入アセチルコリンに対する気道反応性を調べた。図6(b)に示すように,気道内圧がベースライン値の200%の濃度である誘発濃度200(PC200)を算出した。低い対数PC200値は,高いAHRを表している。SOCS3+/+XDO11.10由来のCD4T細胞を移植したマウスのPC200はnaiveBALB/cマウスのそれに比べ顕著に減少した。SOCS3+/―XDO11.10由来のCD4T細胞を移植したマウスのPC200は,SOCS3+/+XDO11.10由来のそれに比べ顕著に増加した(n=4から10で,p<0.05)。図6(c)に示すように,T細胞中のSOCS3のダウンレギュレーションが,レシピエントマウスのBAL液中の好酸球に与える効果を測定した。SOCS3+/+XDO11.10由来のCD4T細胞を移植したマウスのBAL液体中の好酸球はnaiveBALB/cマウスのそれに比べ顕著に増加していた。SOCS3+/―XDO11.10由来のCD4T細胞を移植したマウスのBAL液中の好酸球はSOCS3+/+XDO11.10由来のそれに比べ顕著に減少していた(n=4から10.p<0.05)。
 図7は,RT-PCRおよびリアルタイムPCRにより分析されたSOCS3-特異的siRNA処理がCD4T細胞中のSOCS3発現に与える影響を示す。naiveBALB/cマウスからCD4T細胞を単離し,電気穿孔法により対照のsiRNAまたはSOCS3-特異的siRNAを感染させた後培養し、24時間後,48時間後,72時間後に回収した。図7(a)は,対照のsiRNA処理およびSOCS3特異的siRNA処理の72時間後のnaiveBALB/cのCD4T細胞中のmSOCS3のRT-PCR分析を示す。増幅されたDNAは臭化エチジウムを含むアガロースゲル上で電気泳動により分離され,紫外線照射され,写真を撮影された。 図7(b)は,対照のsiRNA処理およびSOCS3-特異的siRNA処理の24時間後,48時間後,72時間後のnaiveBALB/cのCD4T細胞中のmSOCS3のリアルタイムPCR分析を示す図である。SOCS3発現に関するSOCS3-特異的なsiRNA処理の抑制率は,対照のsiRNA処理の効果に比べて11%,28%および35%であった。
 図8は,SOCS3-特異的siRNA処理または対照のsiRNA処理を受けたCD4T細胞の細胞培養上清中のTh2サイトカイン(IL-4,IL-5,IL-13),IFNγ,TGFβ,IL-10およびIL-17をELISAにより測定したものを示す。CD4T細胞をSOCS3+/+XDO11.10から単離し,pOVAとともに培養することで,Th2細胞へ分化させた。48時間後,細胞培養上清が回収され,サイトカインをELISAにより測定した。SOCS3-特異的siRNA処理を受けたCD4T細胞の細胞培養上清由来のIL-4,IL-5およびIL-13は対照のsiRNA処理を受けたそれに比べ顕著に減少していた。SOCS3-特異的siRNA処理を受けたCD4T細胞の細胞培養上清由来のIL-17は対照のsiRNA処理を受けたそれに比べ顕著に増加していた。n=8.★p<0.05。IL-4,IL-5およびIL-13は,Th2細胞から産出されるサイトカインである。これらのサイトカインの減少は,CD4T細胞のTh2細胞への分化が阻害されたことを示す。よって,SOCS3-特異的siRNA処理によって,Th2細胞分化が阻害されたことが示された。
 図9(a)は,T細胞中のSOCS3のダウンレギュレーションが,吸入アセチルコリンに対する気道反応性に与える効果をしめす。CD4T細胞はSOCS3+/+XDO11.10から単離され,SOCS3siRNAまたは対照のsiRNAを電気穿孔法により感染させた。CD4T細胞はTh2細胞に分化され,naiveBALB/cマウスを受け手として適合移植された。細胞の適合移植の1から5日後に,レシピエントBALB/cマウスはエアロゾル化したOVA(5%)による曝露を受けた。最後の抗原曝露の24時間後,おのおののマウスの吸入アセチルコリンに対する気道反応性が測定された。図9(b)に示すように,誘発濃度200(PC200),気道内圧がベースライン値の200%である濃度,がおのおののマウスについて算出された。より低いPC200値はより高いAHRを表す。対照のsiRNA処理を受けたSOCS3+/+XDO11.10由来のCD4T細胞を移植されたマウスのPC200はnaiveBALB/cマウス由来のそれと比べて顕著に減少していた。SOCS3siRNA処理を受けたSOCS3+/+XDO11.10由来のCD4T細胞を移植されたマウスのPC200は対照のsiRNA処理を受けたものと比べて顕著に増加していた。n=5から11.★p<0.05.図9(c)は,T細胞中のSOCS3のダウンレギュレーションが,レシピエントマウスのBAL液中の好酸球数に与える効果を示す図である。対照のsiRNA処理を受けたSOCS3+/+XDO11.10由来のCD4T細胞を移植されたマウスのBAL液中の好酸球は,naiveBALB/cマウスのそれに比べて顕著に増加していた。SOCS3―特異的siRNA処理を受けたSOCS3+/+XDO11.10由来のCD4T細胞を移植されたマウスのBAL液中の好酸球は,対照のsiRNA処理由来のものと比べて顕著に減少していた。n=5から11.★p<0.05
 考察
 SOCS3の発現抑制されたマウス(SOCS+/-xDO11.10)のCD4T細胞では,Th2分化の抑制が認められた。SOCS3-siRNAのCD4T細胞への導入により,コントロールsiRNAと比較してSOCS3 mRNA発現が約40%抑制された。SOCS3-siRNAを導入したDO11.10CD4T細胞では,in vitroでのTh2分化抑制とともにIL-17産生増加が認められたが,TGFβやIL-10産生の変化は認められなかった。in vitroでTh2分化させたDO11.10CD4T細胞を,naiveBALB/cマウスへ移入後OVAを曝露すると,喘息反応の抑制を認めた。T細胞へのSOCS3-siRNAを導入による喘息反応の抑制は,Th2分化の抑制とともに,IL-17発現上昇によるものと考えられた。
アレルギー性気道炎症におけるpan-JAK阻害剤投与の影響
 OVA誘導喘息のモデルマウスの気道炎症における,pan-JAK阻害剤(JAKi)であるピロドン6(メクル社製)の影響を調べた。JAKiは,エアロゾル化したOVAで曝露する前に,腹腔内に注射した。その結果を図10に示した。
 図10は,アレルギー性気道炎症における,pan-JAK阻害剤投与の影響を示す図面に替わるグラフである。OVA感作マウスは,26~28日目に,OVA摂取の1時間前に,ピリドン6(10μg/体重,0.2%DMSOに溶解),又はビークルのDMSOを腹腔内に注入された。BALは最終OVA投与後30時間で行った。細胞計数は,BAL液中で行った(n=6,*P<0.05)。JAKi自体は,気道の好酸球増加に影響を与えなかったが,ビークル処理と比較して,JAKiはBAL液中の好酸球増加を減少させた。これらの結果は,JAKiが喘息の治療効果を有する可能性があることを示唆している。
 参考文献
 以下の参考文献は,引用文献として参照する事により,本明細書に取り込まれるものである。
1. Bousquet, J., Chanez, P., Lacoste, J.Y., Barneon, G., Ghavanian, N., Enander, I., Venge, P., Ahlstedt, S., Simony-Lafontaine, J., Godard, P., et al. 1990. Eosinophilic inflammation in asthma. N Engl J Med 323:1033-1039. 
2. Roche, W.R., Beasley, R., Williams, J.H., and Holgate, S.T. 1989. Subepithelial fibrosis in the bronchi of asthmatics. Lancet 1:520-524. 
3. Cohn, L., Elias, J.A., and Chupp, G.L. 2004. Asthma: mechanisms of disease persistence and progression. Annu Rev Immunol 22:789-815.
4. Wills-Karp, M. 1999. Immunologic basis of antigen-induced airway hyperresponsiveness. Annu Rev Immunol 17:255-281.
5. Georas, S.N., Guo, J., De Fanis, U., and Casolaro, V. 2005. T-helper cell type-2 regulation in allergic disease. Eur Respir J 26:1119-1137.
6. Fujimoto, M., and Naka, T. 2003. Regulation of cytokine signaling by SOCS family molecules. Trends Immunol 24:659-666.
7. Krebs, D.L., and Hilton, D.J. 2000. SOCS: physiological suppressors of cytokine signaling. J Cell Sci 113 ( Pt 16):2813-2819.
8. Ilangumaran, S., Ramanathan, S., and Rottapel, R. 2004. Regulation of the immune system by SOCS family adaptor proteins. Semin Immunol 16:351-365.
9. Kubo, M., Hanada, T., and Yoshimura, A. 2003. Suppressors of cytokine signaling and immunity. Nat Immunol 4:1169-1176.
10. Yoshimura, A., Mori, H., Ohishi, M., Aki, D., and Hanada, T. 2003. Negative regulation of cytokine signaling influences inflammation. Curr Opin Immunol 15:704-708.
11. Egwuagu, C.E., Yu, C.R., Zhang, M., Mahdi, R.M., Kim, S.J., and Gery, I. 2002. Suppressors of cytokine signaling proteins are differentially expressed in Th1 and Th2 cells: implications for Th cell lineage commitment and maintenance. J Immunol 168:3181-3187.
12. Seki, Y., Inoue, H., Nagata, N., Hayashi, K., Fukuyama, S., Matsumoto, K., Komine, O., Hamano, S., Himeno, K., Inagaki-Ohara, K., et al. 2003. SOCS3 regulates onset and maintenance of T(H)2-mediated allergic responses. Nat Med 9:1047-1054.
13. Chen, Z., Laurence, A., Kanno, Y., Pacher-Zavisin, M., Zhu, B.M., Tato, C., Yoshimura, A., Hennighausen, L., and O'Shea, J.J. 2006. Selective regulatory function of SOCS3 in the formation of IL-17-secreting T cells. Proc Natl Acad Sci U S A 103:8137-8142.
14. Kinjyo, I., Inoue, H., Hamano, S., Fukuyama, S., Yoshimura, T., Yamauchi, M., Himeno, K., Kobayashi, T., and Yoshimura, A. 2006. SOCS3 and STAT3 regulate TGF-beta production in CD4 helper T cell differentiation. J Exp Med:in press.
15. Seki, Y., Hayashi, K., Matsumoto, A., Seki, N., Tsukada, J., Ransom, J., Naka, T., Kishimoto, T., Yoshimura, A., and Kubo, M. 2002. Expression of the suppressor of cytokine signaling-5 (SOCS5) negatively regulates IL-4-dependent STAT6 activation and Th2 differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A 99:13003-13008.
16. Grunig, G., Warnock, M., Wakil, A.E., Venkayya, R., Brombacher, F., Rennick, D.M., Sheppard, D., Mohrs, M., Donaldson, D.D., Locksley, R.M., et al. 1998. Requirement for IL-13 independently of IL-4 in experimental asthma. Science 282:2261-2263.
17. Wills-Karp, M., Luyimbazi, J., Xu, X., Schofield, B., Neben, T.Y., Karp, C.L., and Donaldson, D.D. 1998. Interleukin-13: central mediator of allergic asthma. Science 282:2258-2261.
18. Kibe, A., Inoue, H., Fukuyama, S., Machida, K., Matsumoto, K., Koto, H., Ikegami, T., Aizawa, H., and Hara, N. 2003. Differential regulation by glucocorticoid of interleukin-13-induced eosinophilia, hyperresponsiveness, and goblet cell hyperplasia in mouse airways. Am J Respir Crit Care Med 167:50-56.
19. Kuperman, D., Schofield, B., Wills-Karp, M., and Grusby, M.J. 1998. Signal transducer and activator of transcription factor 6 (Stat6)-deficient mice are protected from antigen-induced airway hyperresponsiveness and mucus production. J Exp Med 187:939-948.
20. Lee, P.J., Zhang, X., Shan, P., Ma, B., Lee, C.G., Homer, R.J., Zhu, Z., Rincon, M., Mossman, B.T., and Elias, J.A. 2006. ERK1/2 mitogen-activated protein kinase selectively mediates IL-13-induced lung inflammation and remodeling in vivo. J Clin Invest 116:163-173.
21. Mattes, J., Yang, M., Siqueira, A., Clark, K., MacKenzie, J., McKenzie, A.N., Webb, D.C., Matthaei, K.I., and Foster, P.S. 2001. IL-13 induces airways hyperreactivity independently of the IL-4R alpha chain in the allergic lung. J Immunol 167:1683-1692.
22. Yang, M., Hogan, S.P., Henry, P.J., Matthaei, K.I., McKenzie, A.N., Young, I.G., Rothenberg, M.E., and Foster, P.S. 2001. Interleukin-13 mediates airways hyperreactivity through the IL-4 receptor-alpha chain and STAT-6 independently of IL-5 and eotaxin. Am J Respir Cell Mol Biol 25:522-530.
23. Fichtner-Feigl, S., Strober, W., Kawakami, K., Puri, R.K., and Kitani, A. 2006. IL-13 signaling through the IL-13alpha2 receptor is involved in induction of TGF-beta1 production and fibrosis. Nat Med 12:99-106. 
24. Kuperman, D.A., Huang, X., Koth, L.L., Chang, G.H., Dolganov, G.M., Zhu, Z., Elias, J.A., Sheppard, D., and Erle, D.J. 2002. Direct effects of interleukin-13 on epithelial cells cause airway hyperreactivity and mucus overproduction in asthma. Nat Med 8:885-889.
25. Nelms, K., Keegan, A.D., Zamorano, J., Ryan, J.J., and Paul, W.E. 1999. The IL-4 receptor: signaling mechanisms and biologic functions. Annu Rev Immunol 17:701-738.
26. O'Shea, J.J., Gadina, M., and Schreiber, R.D. 2002. Cytokine signaling in 2002: new surprises in the Jak/Stat pathway. Cell 109 Suppl:S121-131.
27. Wormald, S., and Hilton, D.J. 2004. Inhibitors of cytokine signal transduction. J Biol Chem 279:821-824. 
28. Yasukawa, H., Sasaki, A., and Yoshimura, A. 2000. Negative regulation of cytokine signaling pathways. Annu Rev Immunol 18:143-164.
29. Naka, T., Narazaki, M., Hirata, M., Matsumoto, T., Minamoto, S., Aono, A., Nishimoto, N., Kajita, T., Taga, T., Yoshizaki, K., et al. 1997. Structure and function of a new STAT-induced STAT inhibitor. Nature 387:924-929.
30. Schluter, G., Boinska, D., and Nieman-Seyde, S.C. 2000. Evidence for translational repression of the SOCS-1 major open reading frame by an upstream open reading frame. Biochem Biophys Res Commun 268:255-261.
31. Alexander, W.S., Starr, R., Fenner, J.E., Scott, C.L., Handman, E., Sprigg, N.S., Corbin, J.E., Cornish, A.L., Darwiche, R., Owczarek, C.M., et al. 1999. SOCS1 is a critical inhibitor of interferon gamma signaling and prevents the potentially fatal neonatal actions of this cytokine. Cell 98:597-608.
32. Marine, J.C., Topham, D.J., McKay, C., Wang, D., Parganas, E., Stravopodis, D., Yoshimura, A., and Ihle, J.N. 1999. SOCS1 deficiency causes a lymphocyte-dependent perinatal lethality. Cell 98:609-616.
33. De Sanctis, G.T., Merchant, M., Beier, D.R., Dredge, R.D., Grobholz, J.K., Martin, T.R., Lander, E.S., and Drazen, J.M. 1995. Quantitative locus analysis of airway hyperresponsiveness in A/J and C57BL/6J mice. Nat Genet 11:150-154.
34. Duguet, A., Biyah, K., Minshall, E., Gomes, R., Wang, C.G., Taoudi-Benchekroun, M., Bates, J.H., and Eidelman, D.H. 2000. Bronchial responsiveness among inbred mouse strains. Role of airway smooth-muscle shortening velocity. Am J Respir Crit Care Med 161:839-848.
35. Ewart, S.L., Kuperman, D., Schadt, E., Tankersley, C., Grupe, A., Shubitowski, D.M., Peltz, G., and Wills-Karp, M. 2000. Quantitative trait loci controlling allergen-induced airway hyperresponsiveness in inbred mice. Am J Respir Cell Mol Biol 23:537-545.
36. Nakano, T., Inoue, H., Fukuyama, S., Matsumoto, K., Matsumura, M., Tsuda, M., Matsumoto, T., Aizawa, H., and Nakanishi, Y. 2006. Niflumic Acid Suppresses Interleukin-13-induced Asthma Phenotypes. Am J Respir Crit Care Med 173:1216-1221.
37. Kelly-Welch, A.E., Hanson, E.M., Boothby, M.R., and Keegan, A.D. 2003. Interleukin-4 and interleukin-13 signaling connections maps. Science 300:1527-1528.
38. Alexander, W.S. 2002. Suppressors of cytokine signalling (SOCS) in the immune system. Nat Rev Immunol 2:410-416.
39. Blackburn, M.R., Lee, C.G., Young, H.W., Zhu, Z., Chunn, J.L., Kang, M.J., Banerjee, S.K., and Elias, J.A. 2003. Adenosine mediates IL-13-induced
inflammation and remodeling in the lung and interacts in an IL-13-adenosine amplification pathway. J Clin Invest 112:332-344.
40. Chunn, J.L., Young, H.W., Banerjee, S.K., Colasurdo, G.N., and Blackburn, M.R. 2001. Adenosine-dependent airway inflammation and hyperresponsiveness in partially adenosine deaminase-deficient mice. J Immunol 167:4676-4685.
41. Hesse, M., Modolell, M., La Flamme, A.C., Schito, M., Fuentes, J.M., Cheever, A.W., Pearce, E.J., and Wynn, T.A. 2001. Differential regulation of nitric oxide synthase-2 and arginase-1 by type 1/type 2 cytokines in vivo: granulomatous pathology is shaped by the pattern of L-arginine metabolism. J Immunol 167:6533-6544.
42. Zimmermann, N., King, N.E., Laporte, J., Yang, M., Mishra, A., Pope, S.M., Muntel, E.E., Witte, D.P., Pegg, A.A., Foster, P.S., et al. 2003. Dissection of experimental asthma with DNA microarray analysis identifies arginase in asthma pathogenesis. J Clin Invest 111:1863-1874.
43. Vargaftig, B.B., and Singer, M. 2003. Leukotrienes mediate murine bronchopulmonary hyperreactivity, inflammation, and part of mucosal metaplasia and tissue injury induced by recombinant murine interleukin-13. Am J Respir Cell Mol Biol 28:410-419.
44. Zhu, Z., Zheng, T., Homer, R.J., Kim, Y.K., Chen, N.Y., Cohn, L., Hamid, Q., and Elias, J.A. 2004. Acidic mammalian chitinase in asthmatic Th2 inflammation and IL-13 pathway activation. Science 304:1678-1682.
45. Hebenstreit, D., Luft, P., Schmiedlechner, A., Regl, G., Frischauf, A.M., Aberger, F., Duschl, A., and Horejs-Hoeck, J. 2003. IL-4 and IL-13 induce SOCS-1 gene expression in A549 cells by three functional STAT6-binding motifs located upstream of the transcription initiation site. J Immunol 171:5901-5907.
46. Saito, H., Morita, Y., Fujimoto, M., Narazaki, M., Naka, T., and Kishimoto, T. 2000. IFN regulatory factor-1-mediated transcriptional activation of mouse STAT-induced STAT inhibitor-1 gene promoter by IFN-gamma. J Immunol 164:5833-5843.
47. Hebenstreit, D., Luft, P., Schmiedlechner, A., Duschl, A., and Horejs-Hoeck, J. 2005. SOCS-1 and SOCS3 inhibit IL-4 and IL-13 induced activation of Eotaxin-3/CCL26 gene expression in HEK293 cells. Mol Immunol 42:295-303.
48. Knight, D.A., and Holgate, S.T. 2003. The airway epithelium: structural and functional properties in health and disease. Respirology 8:432-446.
49. Polito, A.J., and Proud, D. 1998. Epithelia cells as regulators of airway inflammation. J Allergy Clin Immunol 102:714-718.
50. El Bakkouri, K., Wullaert, A., Haegman, M., Heyninck, K., and Beyaert, R. 2005. Adenoviral gene transfer of the NF-kappa B inhibitory protein ABIN-1 decreases allergic airway inflammation in a murine asthma model. J Biol Chem 280:17938-17944.
51. Sadikot, R.T., Han, W., Everhart, M.B., Zoia, O., Peebles, R.S., Jansen, E.D., Yull, F.E., Christman, J.W., and Blackwell, T.S. 2003. Selective I kappa B kinase expression in airway epithelium generates neutrophilic lung inflammation. J Immunol 170:1091-1098.
52. Huang, S.K., Xiao, H.Q., Kleine-Tebbe, J., Paciotti, G., Marsh, D.G., Lichtenstein, L.M., and Liu, M.C. 1995. IL-13 expression at the sites of allergen challenge in patients with asthma. J Immunol 155:2688-2694.
53. Humbert, M., Durham, S.R., Kimmitt, P., Powell, N., Assoufi, B., Pfister, R., Menz, G., Kay, A.B., and Corrigan, C.J. 1997. Elevated expression of messenger ribonucleic acid encoding IL-13 in the bronchial mucosa of atopic and nonatopic subjects with asthma. J Allergy Clin Immunol 99:657-665.
54. Vladich, F.D., Brazille, S.M., Stern, D., Peck, M.L., Ghittoni, R., and Vercelli, D. 2005. IL-13 R130Q, a common variant associated with allergy and asthma, enhances effector mechanisms essential for human allergic inflammation. J Clin Invest 115:747-754.
55. Barnes, P.J. 2004. New drugs for asthma. Nat Rev Drug Discov 3:831-844. 56. Kinjyo, I., Hanada, T., Inagaki-Ohara, K., Mori, H., Aki, D., Ohishi, M., Yoshida, H., Kubo, M., and Yoshimura, A. 2002. SOCS1/JAB is a negative regulator of LPS-induced macrophage activation. Immunity 17:583-591.
57. Taketomi, T., Yoshiga, D., Taniguchi, K., Kobayashi, T., Nonami, A., Kato, R., Sasaki, M., Sasaki, A., Ishibashi, H., Moriyama, M., et al. 2005. Loss of mammalian Sprouty2 leads to enteric neuronal hyperplasia and esophageal achalasia. Nat Neurosci 8:855-857. 
58. Yasukawa, H., Hoshijima, M., Gu, Y., Nakamura, T., Pradervand, S., Hanada, T., Hanakawa, Y., Yoshimura, A., Ross, J., Jr., and Chien, K.R. 2001. Suppressor of cytokine signaling-3 is a biomechanical stress-inducible gene that suppresses gp130-mediated cardiac myocyte hypertrophy and survival pathways. J Clin Invest 108:1459-1467. 
59. Perkins, C., Wills-Karp, M., and Finkelman, F.D. 2006. IL-4 induces IL-13-independent allergic airway inflammation. J Allergy Clin Immunol 118:410-419.
60. Suzuki, A., Obi, K., Urabe, T., Hayakawa, H., Yamada, M., Kaneko, S., Onodera, M., Mizuno, Y., and Mochizuki, H. 2002. Feasibility of ex vivo gene therapy for neurological disorders using the new retroviral vector GCDNsap packaged in the vesicular stomatitis virus G protein. J Neurochem 82:953-960.
 本発明は喘息治療薬など呼吸器系疾患の治療剤などとして,製薬産業において利用されうる。
配列番号1:SOC1アミノ酸残基配列
配列番号2:SOC1 DNA塩基配列(GenBank ID.U88326)
配列番号3:mSOCS1用プライマー
配列番号4:mSOCS1用プライマー
配列番号5:mSOCS2用プライマー
配列番号6:mSOCS2用プライマー
配列番号7:mSOCS3用プライマー
配列番号8:mSOCS3用プライマー
配列番号9:β-アクチン用プライマー
配列番号10:β-アクチン用プライマー
配列番号11:SOCS3 siRNA
配列番号12:SOCS3 siRNA
配列番号13:mβ-アクチン用プライマー
配列番号14:mβ-アクチン用プライマー
配列番号15:mSOCS3用プライマー
配列番号16:mSOCS3用プライマー
配列番号17:JAK2チロシンキナーゼ阻害ペプチド
配列番号18:JAK2アミノ酸残基配列

Claims (19)

  1.  SOCSタンパク質を有効成分として含有する呼吸器系疾患の治療剤。
  2.  前記呼吸器系疾患が,喘息,慢性閉塞性肺疾患,又は炎症性肺疾患である請求項1に記載の治療剤。
  3.  吸入剤,点鼻剤,又は塗布剤である請求項1又は請求項2に記載の治療剤。
  4.  経口剤である請求項1又は請求項2に記載の治療剤。
  5.  SOCSタンパク質を有効成分として含有するアレルギー性疾患の治療剤。
  6.  前記アレルギー性疾患が,気管支喘息,アトピー性皮膚炎,アレルギー性結膜炎,又はアレルギー性鼻炎である請求項5に記載の治療剤。
  7.  SOCSタンパク質を有効成分として含有するIL-13誘導性反応の阻害剤。
  8.  エオタキシンの産生阻害剤である請求項7に記載の剤。
  9.  SOCSタンパク質を有効成分として含有するIL-13誘導性間質性肺病変の治療剤又は予防剤。
  10.  肺線維症の治療剤又は予防剤である請求項9に記載の剤。
  11.  SOCSタンパク質を有効成分として含有する腫瘍治療剤。
  12.  配列番号2で示される塩基配列を有するペプチドを含有する呼吸器系疾患又はアレルギー性疾患の治療剤。
  13.  配列番号2で示される塩基配列を有するペプチドを含有するベクターを,発現ベクターとして含有する,請求項12に記載の剤。
  14.  SOCS3のsiRNAを有効成分とする,IL-17産生促進剤。
  15.  前記SOCS3のsiRNAが,配列番号11に記載のRNA及び配列番号12に記載のRNAのいずれか又は両方である,請求項14に記載のIL-17産生促進剤。
  16.  SOCS3のsiRNAを有効成分とする,Th2分化阻害剤。
  17.  前記SOCS3のsiRNAが,配列番号11に記載のRNA及び配列番号12に記載のRNAのいずれか又は両方である,請求項16に記載のTh2分化阻害剤。
  18.  SOCS3のsiRNAを有効成分とする,喘息の治療剤。
  19.  前記SOCS3のsiRNAが,配列番号11に記載のRNA及び配列番号12に記載のRNAのいずれか又は両方である,請求項18に記載の喘息の治療剤。
     
PCT/JP2009/001545 2008-04-04 2009-04-02 呼吸器系疾患又はアレルギー性疾患の治療剤 WO2009122748A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010505403A JPWO2009122748A1 (ja) 2008-04-04 2009-04-02 呼吸器系疾患又はアレルギー性疾患の治療剤

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008097890 2008-04-04
JP2008-097890 2008-04-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2009122748A1 true WO2009122748A1 (ja) 2009-10-08

Family

ID=41135148

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2009/001545 WO2009122748A1 (ja) 2008-04-04 2009-04-02 呼吸器系疾患又はアレルギー性疾患の治療剤

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPWO2009122748A1 (ja)
WO (1) WO2009122748A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010126473A (ja) * 2008-11-27 2010-06-10 Japan Health Science Foundation Socs活性化剤を有効成分とする抗癌剤
CN108135913A (zh) * 2015-10-05 2018-06-08 莫佛塞斯公司 治疗和/或预防特应性皮炎的il-17c拮抗剂
WO2023021171A1 (en) * 2021-08-20 2023-02-23 Intervet International B.V. Homodimer fusion proteins for treating atopic dermatitis

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001508312A (ja) * 1997-11-03 2001-06-26 インサイト・ファーマスーティカルズ・インコーポレイテッド サイトカインシグナリングのサプレッサ

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001508312A (ja) * 1997-11-03 2001-06-26 インサイト・ファーマスーティカルズ・インコーポレイテッド サイトカインシグナリングのサプレッサ

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ATSUSHI MORIWAKI ET AL.: "T-Saibo deno SOCS3 Hatsugen Yokusei ni yoru Mouse Zensoku Byotai no Seigyo", THE JOURNAL OF THE JAPANESE RESPIRATORY SOCIETY, vol. 45, 2007, pages 165 *
CUI, Q. ET AL.: "Transfer of suppressor of cytokine signaling 3 by an oncolytic adenovirus induces potential antitumor activities in hepatocellular carcinoma", HEPATOLOGY, vol. 47, no. 1, January 2008 (2008-01-01), pages 105 - 112 *
HIROMASA INOUE ET AL.: "Kokyukikei no Seibutsugaku 2. Allergy-sei Ensho to Naiinsei Seigyo Bunshi", ANNUAL REVIEW KOKYUKI, vol. 2008, 30 January 2008 (2008-01-30), pages 10 - 16 *
HIROYASU SHODA ET AL.: "SOCS-1 Knockout Mouse", RESPIRATORY MOLECULAR MEDICINE, vol. 8, no. 6, 2004, pages 503 - 508 *
INOUE, H. ET AL.: "Kido Kyokusho no SOCS1 ni yoru Allergy-sei Zensoku Hanno no Seigyo/Airway SOCS1 as a Critical Endogenous Inhibitor of Allergic Asthma", PROCEEDINGS OF THE JAPANESE SOCIETY FOR IMMUNOLOGY, vol. 37, 25 October 2007 (2007-10-25), pages 104 *
KNISZ, J. ET AL.: "Suppressor of cytokine signaling in allergic inflammation", THE JOURNAL OF ALLERGY AND CLINICAL IMMUNOLOGY, vol. 119, no. 3, 2007, pages 739 - 45 *
MASATO KUBO: "SOCS-3 to Allergy Shikkan Hassho", IGAKU NO AYUMI, vol. 2006, no. 13, 2003, pages 995 - 1000 *
MORIWAKI, A. ET AL.: "T-Saibo deno SOCS3 Hatsugen Seigyo ni yoru Mouse Zensoku Hanno no Seigyo/Modulation of SOCS3 expression in T cell suppresses murine model of allergic asthma", PROCEEDINGS OF THE JAPANESE SOCIETY FOR IMMUNOLOGY, vol. 37, 25 October 2007 (2007-10-25), pages 103 *
OZAKI A. ET AL.: "The control of allergic conjunctivitis by suppressor of cytokine signaling (SOCS)3 and SOCS5 in a murine model.", JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 175, 2005, pages 5489 - 5497 *
SHODA, H. ET AL.: "Overproduction of collagen and diminished SOCS1 expression are causally linked in fibroblasts from idiopathic pulmonary fibrosis", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 353, no. 4, 2007, pages 1004 - 10 *
YAMAMOTO, M. ET AL.: "Suppressor of cytokine signaling-1 expression by infectivity-enhanced adenoviral vector inhibits IL-6-dependent proliferation of multiple myeloma cells", CANCER GENE THERAPY, vol. 13, no. 2, 2006, pages 194 - 202 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010126473A (ja) * 2008-11-27 2010-06-10 Japan Health Science Foundation Socs活性化剤を有効成分とする抗癌剤
CN108135913A (zh) * 2015-10-05 2018-06-08 莫佛塞斯公司 治疗和/或预防特应性皮炎的il-17c拮抗剂
WO2023021171A1 (en) * 2021-08-20 2023-02-23 Intervet International B.V. Homodimer fusion proteins for treating atopic dermatitis

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2009122748A1 (ja) 2011-07-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hur et al. Genes and pathways regulating decline in lung function and airway remodeling in asthma
Ng et al. Fibroblast‐specific IL11 signaling drives chronic inflammation in murine fibrotic lung disease
Bosnjak et al. Treatment of allergic asthma: modulation of Th2 cells and their responses
Yang et al. Inhibition of arginase I activity by RNA interference attenuates IL-13-induced airways hyperresponsiveness
Perkins et al. The receptor for advanced glycation end products is a critical mediator of type 2 cytokine signaling in the lungs
US20050249712A1 (en) Methods for use of TSLP and agonists and antagonists thereof
RU2704826C2 (ru) НОВЫЙ ПЕПТИД-ИНГИБИТОР PI3Kγ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ ОРГАНОВ ДЫХАНИЯ
WO2007139178A1 (ja) アルツハイマー病治療薬
WO2009122748A1 (ja) 呼吸器系疾患又はアレルギー性疾患の治療剤
JP2003532370A (ja) 新規なTh2特異的分子およびその使用方法
EP1735444A2 (en) Methods and compositions for the treatment of obesity
EP2412811B1 (en) Dna vaccine for alzheimer's disease
US5958891A (en) Recombinant eukaryotic plasmids containing allergen-gene and use thereof for the prevention and/or treatment of allergic diseases
Robinson The Th1 and Th2 concept in atopic allergic disease
EP1587534A1 (en) Use of tff2, or agents inducing tff2, in the therapy of allergies
KR101785155B1 (ko) Tim-3을 표적으로 하는 뇌손상 질환 치료용 조성물 및 이의 스크리닝 방법
WO2009058014A2 (en) Polypeptides involved in neuronal regeneration-associated gene expression
US20130122026A1 (en) Dna vaccine for alzheimer's disease
JP2022508619A (ja) ニューロメジンペプチドを使用して2型サイトカイン媒介性炎症を低減させる方法
US20040198686A1 (en) Regulation of allergen induced gene
WO2013070563A1 (en) Treatment of autoimmune and inflammatory disorders by inhibition of blimp-1
WO2023104199A1 (zh) 可溶性晚期糖基化终末产物受体蛋白用于预防或治疗肺部感染疾病的用途
EP2913060A1 (en) Inhibition of the fractalkine-receptor interaction for the treatment of atopic dermatitis
Hur GyuYoung et al. Genes and pathways regulating decline in lung function and airway remodeling in asthma.
REGULATION POSTER FREE COMMUNICATIONS.

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09728305

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010505403

Country of ref document: JP

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 09728305

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1