JP2010048619A - 観察装置および観察方法 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞等の対象物の詳細な情報を得ることができる観察装置および観察方法を提供する。
【解決手段】観察装置１は、観察対象物９の表面または内部を観察するものであって、光源１１，１２、レンズ２１〜２５、アパーチャ３１、光合波器４１、光分波器４２、ハーフミラー４３、撮像部５１、解析部５２、表示部５３、受光部６１、変位検出部６２、ピエゾアクチュエータ７１、駆動部７２、ミラー７３、ステージ８１、駆動部８２および制御部９０を備える。解析部５２は、位相シフト法により光路長差が各目標値に順次に設定されて撮像部５１により撮像された干渉光像の複素振幅を求め、この求めた複素振幅の一定時間当りの変化量の絶対値と該複素振幅の絶対値とに基づいて、観察対象物９の表面または内部で生じた反射光の位相成分の一定時間当りの変化量を求める。
【選択図】図１

Description

本発明は、観察対象物を観察する方法および装置に関するものである。

干渉光学系を用いて対象物を観察または測定する装置として、特許文献１に開示されたものが知られている。この文献に開示された装置は、対象物からの反射光とミラーからの反射光とによる干渉縞の振幅ピークが両反射光の光路長差に依存することを利用して、干渉縞の振幅ピークに基づいて対象物を観察または測定する。
特開平９−２１８０１６号公報

しかしながら、特許文献１に開示された装置は、細胞等の対象物の詳細な情報を得ることができない。本発明は、上記問題点を解消する為になされたものであり、細胞等の対象物の詳細な情報を得ることができる観察装置および観察方法を提供することを目的とする。

本発明に係る観察装置は、(1) 光を出力する光源と、(2) 該光源から出力された光を２分岐して第１分岐光および第２分岐光として出力し、第１分岐光がミラーにより反射されて生じる第１反射光を入力するとともに、第２分岐光が観察対象物の表面または内部で反射されて生じる第２反射光を入力して、これら第１反射光と第２反射光とを干渉させて当該干渉光を出力する干渉光学系と、(3) 干渉光学系から出力される干渉光を結像する結像光学系と、(4) 結像光学系により結像された干渉光像を撮像する撮像部と、(5) 光源から観察対象物の基準位置を経て撮像部に到るまでの光路長と、光源からミラーを経て撮像部に到るまでの光路長との、光路長差を調整する光路長差調整手段と、(6) 光路長差が各目標値に順次になるように光路長差調整手段による光路長差調整動作を制御する制御部と、を備える。

本発明に係る観察装置は、更に、位相シフト法により光路長差調整手段により光路長差が各目標値に順次に設定されて撮像部により撮像された干渉光像の複素振幅を求め、この求めた複素振幅の一定時間当りの変化量の絶対値と該複素振幅の絶対値とに基づいて、観察対象物の表面または内部で生じた第２反射光の位相成分の一定時間当りの変化量を求める解析部を備えることを特徴とする。

本発明に係る観察方法は、上記のような光源，干渉光学系，結像光学系，撮像部，光路長差調整手段および制御部を用い、位相シフト法により光路長差調整手段により光路長差が各目標値に順次に設定されて撮像部により撮像された干渉光像の複素振幅を求め、この求めた複素振幅の一定時間当りの変化量の絶対値と該複素振幅の絶対値とに基づいて、観察対象物の表面または内部で生じた第２反射光の位相成分の一定時間当りの変化量を求めることを特徴とする。

本発明に係る観察装置は、解析部により求められた第２反射光の位相成分の一定時間当りの変化量の空間的分布を画像表示する表示部を更に備えるのが好適である。本発明に係る観察方法は、第２反射光の位相成分の一定時間当りの変化量の空間的分布を表示部により画像表示するのが好適である。

本発明に係る観察装置は、解析部が観察対象物の複数のスライス面それぞれについて第２反射光の位相成分の一定時間当りの変化量を求めるのが好適である。本発明に係る観察方法は、観察対象物の複数のスライス面それぞれについて第２反射光の位相成分の一定時間当りの変化量を求めるのが好適である。

本発明に係る観察装置は、光路長差を検出する光路長差検出手段を更に備え、光路長差検出手段による検出結果に基づいて光路長差調整手段が光路長差を調整するのが好適である。本発明に係る観察方法は、光路長差を検出する光路長差検出手段を更に用い、光路長差検出手段による検出結果に基づいて光路長差調整手段により光路長差を調整するのが好適である。

本発明に係る観察装置または本発明に係る観察方法では、(a) 光路長差調整手段が、観察対象物およびミラーのうち一方の第１対象物を移動させる第１移動手段と、観察対象物およびミラーのうち他方の第２対象物を移動させる第２移動手段とを含み、第１移動手段または第２移動手段による移動動作により光路長差を調整し、(b) 第１移動手段が、第２移動手段の作動範囲より狭い作動範囲を有するとともに、第２移動手段の位置精度より高い位置精度を有し、(c) 第２移動手段が、干渉光学系と第２対象物との間の光学系を維持したまま第２対象物を移動させ、(d) 制御部が、光路長差の各目標値において第１移動手段による移動量が作動範囲内の所定範囲内となるように第２移動手段による移動動作を連続的または断続的に行わせ、第２移動手段による移動動作の際にも光路長差が各目標値になるように第１移動手段による移動動作をフィードバック制御するのが好適である。

本発明に係る観察装置または本発明に係る観察方法では、観察対象物が細胞を含むのが好適である。

本発明によれば、細胞等の対象物の詳細な情報を得ることができる。

以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための最良の形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。

図１は、本実施形態に係る観察装置１の構成図である。この図に示される観察装置１は、観察対象物９の表面または内部を観察するものであって、光源１１，１２、レンズ２１〜２５、アパーチャ３１、光合波器４１、光分波器４２、ハーフミラー４３、撮像部５１、解析部５２、表示部５３、受光部６１、変位検出部６２、ピエゾアクチュエータ７１、駆動部７２、ミラー７３、ステージ８１、駆動部８２および制御部９０を備える。

光源１１は、コヒーレント長が比較的短い光λ_１を出力するものであり、例えば波長帯域６００ｎｍ〜９００ｎｍの広帯域光を出力することができるタングステンランプである。光源１１から出力される光λ_１のコヒーレンス長は５μｍ以下であるのが好ましい。一方、光源１２は、コヒーレント長が比較的長い光λ_２を出力するものであり、例えば波長１.３１μｍのレーザ光を出力する半導体レーザ光源である。光合波器４１は、光源１１から出力されてレンズ２１およびアパーチャ３１を経て到達した光λ_１を反射させるとともに、光源１２から出力されて到達した光λ_２を透過させて、これらの光を合波してレンズ２２へ出力する。

ハーフミラー４３は、光合波器４１により合波されてレンズ２２を経て到達した光λ_１，λ_２を２分岐して第１分岐光および第２分岐光とし、第１分岐光をレンズ２３へ出力し、第２分岐光をレンズ２４へ出力する。また、ハーフミラー４３は、第１分岐光がレンズ２３を経てミラー７３により反射されて生じる第１反射光を再びレンズ２３を経て入力するとともに、第２分岐光がレンズ２４を経て観察対象物９の表面または内部で反射されて生じる第２反射光を再びレンズ２４を経て入力して、これら第１反射光と第２反射光とを干渉させて当該干渉光をレンズ２５へ出力する。すなわち、ハーフミラー４３は、干渉光学系を構成する要素である。

光分波器４２は、ハーフミラー４３から出力されてレンズ２５を経た光を入力し、そのうち光λ_１を反射させて撮像部５１へ出力し、光λ_２を透過させて受光部６１へ出力する。レンズ２３〜２５は、ハーフミラー４３から出力されて光分波器４２により分波された干渉光λ_１を撮像部５１の撮像面上に結像する結像光学系を構成する要素である。撮像部５１は、その結像された干渉光λ_１の像を撮像するものであり、例えばＣＣＤカメラである。受光部６１は、ハーフミラー４３から出力されて光分波器４２により分波された光λ_２の強度を検出するものであり、例えばフォトダイオードである。

ここで、ハーフミラー４３からミラー７３により反射されて再びハーフミラー４３に到るまでの光路長と、ハーフミラー４３から観察対象物９の基準位置により反射されて再びハーフミラー４３に到るまでの光路長との光路長差をΔＬとする。なお、観察対象物９の基準位置は、観察対象物９の最も高い位置（レンズ２４に最も近い位置）であってもよいし、観察対象物９を載せる台であってもよし、これらの中間の位置であってもよし、また、その他の位置であってもよい。

前述したように、光源１２から出力され受光部６１に到達する光λ_２のコヒーレント長は比較的長いので、図２（ａ）に示されるように、受光部５１に到達する光λ_２の強度は、比較的広い光路長差ΔＬの範囲において周期的に変化する。これに対して、光源１１から出力され撮像部５１に到達する光λ_１のコヒーレント長は比較的短いので、図２（ｂ）に示されるように、撮像部６１に到達する光λ_１の強度は、比較的狭い光路長差ΔＬの範囲において周期的に変化し、しかも、光路長差ΔＬが値０に近いほど干渉の振幅が大きい。

このことを利用して、解析部５２は、光路長差が複数の目標値それぞれに設定されたときに撮像部５１により撮像された光λ_１の干渉光像を取得する。この干渉光像は、ハーフミラー４３からミラー７３までの光路長と、ハーフミラー４３から観察対象物９の或るスライス面までの光路長とが互いに略等しいときに、ミラー７３で生じた第１反射光と該スライス面（および、該スライス面を中心とする光λ_１のコヒーレンス長程度の範囲）で生じた第２反射光との干渉による像である。さらに、解析部５２は、取得した干渉光像に基づいて所定の解析を行う。表示部５３は、解析部５２による解析の結果を画像表示する。解析部５２による解析および表示部５３による画像表示については後述する。

観察対象物９は、好適には例えば図３に示されるように、略平坦な基板９１の主面に形成された薄膜９２の上に置かれた半透明の細胞９３である。薄膜９２は、光λ_２を高い反射率で反射させることで、後述するフィードバック制御の際の基準面として好適に用いられる。観察対象物９としての細胞９３の断面としてスライス面Ｓが設定される。このスライス面Ｓは、レンズ２４の光軸に垂直な面であり、また、その光軸方向に関して位置が可変である。

変位検出部６２は、受光部６１により検出された光λ_２の強度の変化から、光路長差（または、或る基準値に対する相対的な光路長差の変化量）を求める。すなわち、光源１２、受光部６１および変位検出部６２は、光路長差を検出する光路長差検出手段を構成する要素である。なお、ピエゾアクチュエータ７１によりミラー７３に微小振動を与えて、或る光路長差を中心にして変調を与えることで、より正確に光路長差を検出することができる。

ピエゾアクチュエータ７１，駆動部７２，ステージ８１および駆動部８２は、光路長差を調整する光路長差調整手段を構成する要素である。ピエゾアクチュエータ７１は、駆動部７２により駆動されて、ハーフミラー４３とミラー７３との間の光学系の光軸に平行な方向に、ミラー７３を移動させる。このとき、レンズ２３を移動させることなく、ハーフミラー４３とミラー７３との間の光学系を維持したままとする。レンズ２３のフォーカス面は、焦点深度（例えば０.５μｍ）の精度でミラー７３の反射面に一致している。

ステージ８１は、駆動部８２により駆動されて、ハーフミラー４３と観察対象物９との間の光学系の光軸に平行な方向に観察対象物９を移動させる。このとき、レンズ２４を移動させることなく、ハーフミラー４３と観察対象物９との間の光学系を維持したままとする。すなわち、ハーフミラー４３から測った観察対象物９側のフォーカス面までの距離を維持したままとする。

ピエゾアクチュエータ７１（第１移動手段）の作動範囲は、ステージ８１（第２移動手段）の作動範囲より狭い。また、ピエゾアクチュエータ７１の位置精度は、ステージ８１の位置精度より高い。なお、ステージ８１を移動させるための駆動部８２としては、例えば長距離移動型のピエゾアクチュエータや、ステッピングモータによる回転機構を用いることが可能である。

制御部９０は、変位検出部６２による光路長差検出結果に基づいて、光路長差が複数の目標値に順次になるように、駆動部７２，８２を介してピエゾアクチュエータ７１およびステージ８１による光路長差調整動作を制御する。特に、制御部９０は、複数の目標値それぞれにおいて、ピエゾアクチュエータ７１による移動量が作動範囲内の所定範囲内となるように、ステージ８１による移動動作を連続的または断続的に行わせる。また、制御部９０は、ステージ８１による移動動作の際にも、変位検出部６２による光路長差検出結果に基づいて、光路長差が各目標値になるようにピエゾアクチュエータ７１による移動動作をフィードバック制御する。

図４は、ピエゾアクチュエータ７１およびステージ８１による光路長差調整動作について説明する図である。この図には、ハーフミラー４３とミラー７３との間の光学系が示され、ハーフミラー４３と観察対象物９との間の光学系が示され、また、光路長差を調整するピエゾアクチュエータ７１およびステージ８１が示されている。ここで、ハーフミラー４３とレンズ２３との間の間隔をｘ_１とし、レンズ２３とミラー７３との間の間隔をｘ_２とする。また、ハーフミラー４３とレンズ２４との間の間隔をｙ_１とし、レンズ２４と観察対象物９との間の間隔をｙ_２とする。なお、観察対象物９が図３に示される構成である場合には、ｙ_２はレンズ２４から観察対象物９の或るスライス面までの間隔とする。間隔ｘ_２は、ピエゾアクチュエータ７１による移動動作により調整される。間隔ｙ_２は、ステージ８１による移動動作により調整される。ピエゾアクチュエータ７１またはステージ８１により、間隔（ｘ_１＋ｘ_２）又は間隔（ｙ_１＋ｙ_２）を変更することで、光路長差ΔＬを調整することができる。

仮に、ステージ８１による移動動作により間隔ｙ_２のみを調整する場合、ステージ８１の作動範囲が比較的広いことから、広いダイナミックレンジで光路長差を調整することができる。しかし、この場合、ステージ８１の位置精度が比較的低いことから、高精度で光路長差を調整することができず、したがって、高精度に観察対象物９の形状等を測定することができない。

一方、仮に、ピエゾアクチュエータ７１による移動動作により間隔ｘ_２のみを調整する場合、ピエゾアクチュエータ７１の位置精度が比較的高いことから、高精度で光路長差を調整することができる。しかし、この場合、ピエゾアクチュエータ７１の作動範囲が比較的狭いことから、広いダイナミックレンジで光路長差を調整することができず、したがって、広いダイナミックレンジで観察対象物９の形状等を測定することができない。

また、仮に、ピエゾアクチュエータ７１の作動範囲内であっても広い範囲に亘って移動動作を行わせると、レンズ２３の焦点距離と間隔ｘ_２との差が大きくなる場合があり、その場合には、結像光学系による干渉光の結像面と撮像部５１の撮像面とが互いに大きくずれてしまい、撮像部５１により撮像される干渉光像が不鮮明となって、観察対象物９の形状等の測定を高精度に行うことができない。

そこで、本実施形態では、高精度かつ広ダイナミックレンジで観察対象物の表面または内部を測定する為に、制御部９０は、複数の目標値それぞれにおいて、ピエゾアクチュエータ７１による移動量が作動範囲内の所定範囲内となるように、ステージ８１による移動動作を連続的または断続的に行わせる。また、制御部９０は、ステージ８１による移動動作の際にも、変位検出部６２による光路長差検出結果に基づいて、光路長差が各目標値になるようにピエゾアクチュエータ７１による移動動作をフィードバック制御する、以下では、ピエゾアクチュエータ７１およびステージ８１それぞれの好適な２つの動作態様について説明する。

図５は、本実施形態に係る観察装置１の第１動作態様を説明するフローチャートである。また、図６は、この第１動作態様における間隔ｘ_２，間隔ｙ_２および光路長差｛(ｙ_１＋ｙ_２)−(ｘ_１＋ｘ_２)｝それぞれの時間的変化を示す図である。この第１動作態様では、制御部９０は、駆動部８２を介して、ステージ８１による移動動作を連続的に行わせる。

初めに、ステップＳ１１では、制御部９０は、駆動部８２を介してステージ８１による移動動作を開始させる。光路長差を或る目標値から次の目標値に一定時間間隔Δｔで移行させるとし、その移行の際の間隔ｙ_２の変化量をΔｙとしたときに、ステージ８１の移動速度は「Δｙ／Δｔ」に設定される。これにより、レンズ２４と観察対象物９との間の間隔ｙ_２は、時間の経過とともに略リニアに変化していく。しかし、ステージ８１の位置精度が比較的低いことから、間隔ｙ_２の時間的変動は比較的大きい。

そこで、ステップＳ１２では、制御部９０は、光路長差が該目標値になるように、駆動部７２を介してピエゾアクチュエータ７１による移動動作をフィードバック制御する。このとき、ピエゾアクチュエータ７１により間隔ｘ_２が調整されて、光路長差｛(ｙ_１＋ｙ_２)−(ｘ_１＋ｘ_２)｝が高精度に設定される。

ステップＳ１３では、制御部９０は、光路長差が或る目標値に設定されてから一定時間Δｔが経過したか否かを判断し、一定時間Δｔが経過したら次のステップＳ１４の処理に進む。ステップＳ１４では、制御部９０は、次の目標値が有るか否かを判断し、次の目標値が有れば次のステップＳ１５の処理に進み、次の目標値が無ければステップＳ１８の処理に進む。

ステップＳ１５では、制御部９０は、光路長差が次の目標値に移行される前に、その移行後の目標値においてピエゾアクチュエータ７１による移動量ｘ_２が所定範囲から外れるか否かを判断する。そして、制御部９０は、その移動量ｘ_２が所定範囲から外れると判断した場合にはステップＳ１６を経てステップＳ１７の処理に進み、また、その移動量ｘ_２が所定範囲内にあると判断した場合には直ちにステップＳ１７の処理に進む。ステップＳ１６では、制御部９０は、次の目標値に移行した後にピエゾアクチュエータ７１による移動量ｘ_２が所定範囲内に入るようにステージ８１による移動動作の速さを調整する。

ステップＳ１７では、制御部９０は、光路長差を次の目標値に設定し、駆動部７２を介してピエゾアクチュエータ７１をΔｘだけステップ的に移動させる。その後、ステップＳ１２の処理に戻って、制御部９０は、光路長差が新たな目標値になるように、駆動部７２を介してピエゾアクチュエータ７１による移動動作をフィードバック制御する。ステップＳ１８では、制御部９０は、駆動部８２を介してステージ８１による移動動作を終了させる。

このように第１動作態様では、制御部９０は、ステージ８１による移動動作を連続的に行わせ、光路長差が或る目標値から次の目標値に移行される際に、ピエゾアクチュエータ７１による移動動作をステップ的に行わせ、また、光路長差が或る目標値に設定されている期間には、光路長差が該目標値になるようにピエゾアクチュエータ７１による移動動作をフィードバック制御する。このように制御部９０がピエゾアクチュエータ７１およびステージ８１それぞれの移動動作を制御することにより、ステージ８１の移動動作の広いダイナミックレンジと、ピエゾアクチュエータ７１の移動動作の高い位置精度とを、共に活かすことができて、高精度かつ広ダイナミックレンジで観察対象物９の表面形状等を測定することができる。

また、第１動作態様では、制御部９０は、光路長差が或る目標値から次の目標値に移行される前に、その移行後の目標値においてピエゾアクチュエータ７１による移動量が所定範囲から外れる場合に、該移動量が該所定範囲内に入るようにステージ８１による移動動作の速さを調整する（ステップＳ１５，Ｓ１６）。このように制御部９０がステージ８１の移動速度を調整することにより、ステージ８１の移動速度や目標値変更の時間間隔Δｔの精度が不充分である場合であっても、ピエゾアクチュエータ７１による移動量を所定範囲内に維持することができるので、観察対象物９の表面形状等の高精度測定を維持することができる。なお、光路長差の目標値の個数をＮとしたときに、Ｎ・Δｔの時間内にステージ８１を速度「Δｙ／Δｔ」で等速移動させたときの移動距離が充分な精度（例えば誤差が±１μｍ以下）であれば、ステップＳ１５，１６は不要であり、ステップＳ１４の後に直ちにステップＳ１７の処理に進めばよい。

図７は、本実施形態に係る観察装置１の第２動作態様を説明するフローチャートである。また、図８は、この第２動作態様における間隔ｘ_２，間隔ｙ_２および光路長差｛(ｙ_１＋ｙ_２)−(ｘ_１＋ｘ_２)｝それぞれの時間的変化を示す図である。この第２動作態様では、制御部９０は、駆動部８２を介して、ステージ８１による移動動作を断続的に行わせる。

ステップＳ２１では、制御部９０は、光路長差が目標値になるように、駆動部７２を介してピエゾアクチュエータ７１による移動動作をフィードバック制御する。このとき、ステージ８１は移動していないが、ステージ８１の位置精度が比較的低いことから、間隔ｙ_２の時間的変動は比較的大きい。しかし、ピエゾアクチュエータ７１により間隔ｘ_２が調整されて、光路長差｛(ｙ_１＋ｙ_２)−(ｘ_１＋ｘ_２)｝が高精度に設定される。

ステップＳ２２では、制御部９０は、光路長差が或る目標値に設定されてから一定時間Δｔが経過したか否かを判断し、一定時間Δｔが経過したら次のステップＳ２３の処理に進む。ステップＳ２３では、制御部９０は、次の目標値が有るか否かを判断し、次の目標値が有れば次のステップＳ２４の処理に進み、次の目標値が無ければ終了する。

ステップＳ２４では、制御部９０は、光路長差が次の目標値に移行される前に、その移行後の目標値においてピエゾアクチュエータ７１による移動量ｘ_２が所定範囲から外れるか否かを判断する。そして、制御部９０は、その移動量ｘ_２が所定範囲から外れると判断した場合にはステップＳ２５を経てステップＳ２６の処理に進み、また、その移動量ｘ_２が所定範囲内にあると判断した場合には直ちにステップＳ２６の処理に進む。

ステップＳ２５では、制御部９０は、次の目標値に移行した後にピエゾアクチュエータ７１による移動量ｘ_２が所定範囲内に入るようにステージ８１を移動させた後に停止させ、また、そのステージ８１が移動している期間にも、そのときの光路長差が各目標値になるようにピエゾアクチュエータ７１による移動動作を制御する。なお、このときのステージ８１の移動に際しては、次の目標値においてピエゾアクチュエータ７１による移動量ｘ_２が所定範囲の上限を超える場合には、ピエゾアクチュエータ７１による移動量ｘ_２が所定範囲の下限の近くになるようにする。逆に、次の目標値においてピエゾアクチュエータ７１による移動量ｘ_２が所定範囲の下限を超える場合には、ピエゾアクチュエータ７１による移動量ｘ_２が所定範囲の上限の近くになるようにする。

ステップＳ２６では、制御部９０は、光路長差を次の目標値に設定し、駆動部７２を介してピエゾアクチュエータ７１をΔｘだけステップ的に移動させる。その後、ステップＳ２１の処理に戻って、制御部９０は、光路長差が新たな目標値になるように、駆動部７２を介してピエゾアクチュエータ７１による移動動作をフィードバック制御する。

このように第２動作態様では、制御部９０は、光路長差が各目標値になるようにピエゾアクチュエータ７１による移動動作をフィードバック制御する。このように制御部９０がピエゾアクチュエータ７１およびステージ８１それぞれの移動動作を制御することにより、ステージ８１の移動動作の広いダイナミックレンジと、ピエゾアクチュエータ７１の移動動作の高い位置精度とを、共に活かすことができて、高精度かつ広ダイナミックレンジで観察対象物９の表面形状等を測定することができる。なお、ステージ８１の位置精度が悪い場合には、第１動作態様より第２動作態様の方が有効である。

次に、本実施形態に係る観察装置１および本実施形態に係る観察方法における観察対象物９の観察（特に解析部５２による解析）について更に詳細に説明する。

観察対象物９の表面または内部で反射されて撮像部５１の撮像面に到達する第２反射光Ｅ(x,y)は、強度成分Ｒ(x,y)および位相成分φ(x,y)を含んでいて、下記（１）式で表される。撮像部５１により撮像される干渉像は、光λ_１のコヒーレンス長の程度で第１反射光および第２反射光それぞれの光路長が一致するような該第２反射光が生じる観察対象物９のスライス面（および、該スライス面を中心とする光λ_１のコヒーレンス長程度の範囲）の情報を反映したものである。なお、ｘ，ｙは、該スライス面における直交２軸の座標値を表す。

第２反射光Ｅ(x,y)の強度成分Ｒ(x,y)は、該スライス面における光λ_１の反射率、すなわち、反射体の有無の情報を表す。また、第２反射光Ｅ(x,y)の位相成分φ(x,y)は、該スライス面における反射体のｚ方向（光軸に平行な方向）の位置の情報を表す。例えば、観察対象物９の該スライス面に存在する反射体（例えば、細胞膜、核小体の膜、リソソームの膜、等）がｚ方向にΔｚだけ移動した場合、撮像部５１の撮像面に到達する第２反射光Ｅ(x,y)の位相成分φ(x,y)は ４πｎ_１Δｚ／λ_１ だけ変化する。ここで、ｎ_１は観察対象物９の屈折率である。すなわち、位相成分φ(x,y)の変化量は、スライス面における反射体のｚ方向の位置変化量を表す。

このような第２反射光Ｅ(x,y)の強度成分Ｒ(x,y)および位相成分φ(x,y)は位相シフト法により求められる。位相シフト法では、制御部９０および駆動部７２による制御によりピエゾアクチュエータ７１が駆動されて光路長差ΔＬがλ_１／４ずつシフトされ、順に撮像部５１により４枚の干渉光像Ｉ_１(x,y)，Ｉ_２(x,y)，Ｉ_３(x,y)，Ｉ_４(x,y)が撮像される。ここで、λ_１は、光源１１から出力される低コヒーレント光の中心波長である。これら４枚の干渉光像から、下記（２）式に従って、干渉光像の正弦成分Ａ(x,y)および余弦成分Ｂ(x,y)が得られる。

そして、これら干渉光像の正弦成分Ａ(x,y)および余弦成分Ｂ(x,y)から、下記（３）式に従って、第２反射光Ｅ(x,y)の強度成分Ｒ(x,y)および位相成分φ(x,y)が得られる。なお、正弦成分Ａ(x,y)および余弦成分Ｂ(x,y)は、第２反射光Ｅ(x,y)の強度成分Ｒ(x,y)および位相成分φ(x,y)を用いて、下記（４）式のように表される。また、干渉光像の複素振幅Ｃ(x,y)は、下記（５）式または（６）式で表される。解析部５２は、このような干渉光像の複素振幅Ｃ(x,y)を求める。

図９は、干渉光像の正弦成分Ａ(x,y)を示す図である。図１０は、干渉光像の余弦成分Ｂ(x,y)を示す図である。図１１は、干渉光像の強度成分Ｒ(x,y)を示す図である。また、図１２は、干渉光像の位相成分φ(x,y)を示す図である。これらは何れも、観察対象物９としてのＨｅＬａ細胞について位相シフト法により求められた４枚の干渉光像Ｉ_１(x,y)，Ｉ_２(x,y)，Ｉ_３(x,y)，Ｉ_４(x,y)に基づくものである。図１１に示される干渉光像の強度成分Ｒ(x,y)を見ると、ＨｅＬａ細胞には、細胞膜付近および細胞内に様々な反射体が存在することが見て取れる。これらの反射体とＨｅＬａ細胞の器官との関係は図１３に示されるとおりであると考えられる。

位相シフト法には様々な改良アルゴリズムが存在するが、何れのアルゴリズムが用いられてもよい。例えば、Schwider-Hariharan Algorithm として知られるアルゴリズムに従って、５枚の干渉光像に基づいて、下記（７）式に従って、干渉光像の正弦成分Ａ(x,y)および余弦成分Ｂ(x,y) が求められてもよく、さらに、これらから、第２反射光Ｅ(x,y)の強度成分Ｒ(x,y)および位相成分φ(x,y) が求められてもよい。

本実施形態では任意の位相シフト法のアルゴリズムが用いられ得る。ただし、上記（２）式に従う位相シフト法の基本アルゴリズムと比べると、上記（７）式に従う位相シフト法の改良アルゴリズムは、位相シフト量の誤差に対してロバストである等の利点があり、本実施形態のように光λ_１のコヒーレンス長が比較的短い場合に好適に用いられる。

図１４は、複数組の正弦成分Ａ(x,y)および余弦成分Ｂ(x,y) を時系列で取得する場合の位相シフト量の時間的変化の様子を示す図である。この図に示されるように、制御部９０および駆動部７２による制御によりピエゾアクチュエータ７１が駆動されて光路長差ΔＬが一定時間毎にλ_１／４ずつシフトされて、位相シフト量が０と３λ_１／４との間で増減が繰り返される。これにより、順次に干渉光学像Ｉ_１，Ｉ_２，Ｉ_３，Ｉ_４，Ｉ_３，Ｉ_２，Ｉ_１，Ｉ_２，Ｉ_３，Ｉ_４，…が得られる。そして、第１の干渉光学像Ｉ_１から第４の干渉光学像Ｉ_４までが用いられて、１番目のＡ_１，Ｂ_１，Ｒ_１およびφ_１が得られる。また、第４の干渉光学像Ｉ_４から第７の干渉光学像Ｉ_１までが用いられて、２番目のＡ_２，Ｂ_２，Ｒ_２およびφ_２が得られる。さらに、第７の干渉光学像Ｉ_１から第１０の干渉光学像Ｉ_４までが用いられて、３番目のＡ_３，Ｂ_３，Ｒ_３およびφ_３が得られる。

このようにして、干渉光像の正弦成分Ａ_ｎおよび余弦成分Ｂ_ｎならびに 第２反射光の強度成分Ｒ_ｎおよび位相成分φ_ｎが一定時間間隔で順次に得られる。以降では、これらは、正弦成分Ａ(x,y,n)、余弦成分Ｂ(x,y,n)、強度成分Ｒ(x,y,n)および位相成分φ(x,y,n) と表記される場合がある。ここで、各成分の表記におけるｎは、その成分がｎ番目に得られたものであることを示すものであり、時間変数に相当するものである。

前述したとおり、位相成分φ(x,y,n)は、ハーフミラー４３からミラー７３までの光路長と、ハーフミラー４３から観察対象物９の或るスライス面までの光路長とが互いに略等しいときに、該スライス面における反射体のｚ方向（光軸に平行な方向）の位置の情報を表す。また、位相成分φ(x,y,n)の変化量は、該スライス面における反射体のｚ方向の位置変化量を表す。そこで、図１５に示されるように、解析部５２により、一定時間間隔で複数枚の位相成分φ(x,y,n)が得られると、これらが表示部５３により時系列に画像表示（動画表示）されることで、観察対処物９のスライス面における反射体のｚ方向の位置変化の様子が観察され得る。

観察対処物９のスライス面における反射体のｚ方向の位置変化の様子の観察は、一定時間間隔で取得された複数枚の位相成分φ(x,y,n)に基づいて以下のような数理処理手法によることが可能である。各位置(x,y)について、通常は２πの幅の範囲でしか値を有しない位相成分φ(x,y,n)は、このままでは定量的な評価には不適当であるので、先ず、図１６に示されるように、時系列に見たときに位相が不連続になっている箇所を繋ぎ合わせる処理（すなわち、位相アンラッピング）が行われる。

位相アンラッピング前の位相成分を小文字でφ(x,y,n)と表し、位相アンラッピング後の位相成分を大文字でΦ(x,y,n)と表すことにする。図１６（ａ）は、位相アンラッピング前の位相成分φ(x,y,n)の時間変化の様子を示す。同図（ｂ）は、位相アンラッピング後の位相成分Φ(x,y,n)の時間変化の様子を示す。以下では、一定時間間隔で順にＮ枚の位相アンラッピング後の位相成分Φ(x,y,1)〜Φ(x,y,N)が得られたとする。

解析部５２により、Ｎ枚の位相アンラッピング後の位相成分Φ(x,y,1)〜Φ(x,y,N)に基づいて、下記（８）式〜（１１）式の何れかの処理により、観察対処物９のスライス面における反射体のｚ方向の位置変化の様子が各位置(x,y)について解析される。

下記（８）式は、Ｎ枚の位相成分Φ(x,y,n)が取得される時間内において各位置(x,y)における反射体のｚ方向の位置変化の幅（最大値−最小値）を表すものである。

下記（９）式は、Ｎ枚の位相成分Φ(x,y,n)が取得される時間内において各位置(x,y)における反射体のｚ方向の位置変化の大きさの標準偏差を表すものである。

下記（１０）式および（１１）式それぞれは、所定時間（Δｎ・ｔ_０）当りの各位置(x,y)における反射体のｚ方向の位置変化の大きさを表すものである。ｔ_０は各位相成分Φ(x,y,n)の取得時間間隔を表す。

或いは、各位置(x,y)について、Ｎ枚の位相アンラッピング後の位相成分Φ(x,y,1)〜Φ(x,y,N)がフーリエ変換されて、反射体のｚ方向の位置変化の周波数解析が行われてもよい。

以上のようにして、観察対処物９のスライス面における反射体のｚ方向の位置変化の様子が各位置(x,y)について解析物５２により得られると、その結果は表示部５３により画像表示される。表示部５３では、解析部５２による解析結果がグレイスケールまたは擬似カラー等により画像表示されるのが好ましい。このように表示されることにより、観察対処物９のスライス面における反射体のｚ方向の位置変化の様子の観察が容易である。

これらの信号処理手法が優れている点は、観察対象物９である細胞の表面の膜からの反射光の信号と、細胞内の膜からの反射光の信号とを互いに区別することなく、その水平切断面（スライス面）に存在する運動性の高い膜（反射体）を抽出することができるという点である。膜の運動性は細胞の活性に強く係わっており、膜の運動性の高い細胞を抽出し、二次元的に表示できるということには、細胞診断における実用上多くの利点がある。

観察対処物９のスライス面における反射体のｚ方向の位置変化の様子の観察は、一定時間間隔で取得された複数枚の干渉光像の複素振幅Ｃ(x,y,n)に基づいて以下のような数理処理手法によることも可能である。ｎ番目に得られた複素振幅Ｃ(x,y,n)は、下記（１２）式または（１３）式により表される。そして、解析部５２により、Ｎ枚の複素振幅像Ｃ(x,y,1)〜Ｃ(x,y,N)に基づいて、下記（１４）式の処理により、観察対処物９のスライス面における反射体のｚ方向の位置変化の様子が各位置(x,y)について解析される。

この（１４）式の分子にある｜Ｃ(x,y,n)−Ｃ(x,y,n-Δn)｜なる因子は図１７により説明される。図１７は、複素平面において複素振幅Ｃ(x,y,n)を表す図である。同図の複素平面上において、複素振幅Ｃ(x,y,n)および複素振幅Ｃ(x,y,n-Δn)それぞれは、原点を始点とするベクトルの終点として示されている。｜Ｃ(x,y,n)−Ｃ(x,y,n-Δn)｜は、同図の複素平面上において複素振幅Ｃ(x,y,n)および複素振幅Ｃ(x,y,n-Δn)それぞれを表す点を互いに結ぶ線分の長さである。

ここで、ｎ番目から(ｎ−Δｎ)番目までの間で、各位置(x,y)について、強度成分Ｒ(x,y,n)の変化量は無視し得る程度に小さいとし、位相成分φ(x,y,n)の変化量は僅かであるとする。この場合、下記（１５）式の近似式が成り立つ。すなわち、上記（１４）式の分子にある｜Ｃ(x,y,n)−Ｃ(x,y,n-Δn)｜なる因子は、所定時間（Δｎ・ｔ_０）当りの位相成分φ(x,y,n)の変化量に強度成分Ｒ(x,y,n)を乗じたものである。

一方、上記（１４）式の分母は、強度成分Ｒ(x,y,n)の平均値を表す。したがって、上記（１４）式の指標φ_dev(x,y)は、所定時間（Δｎ・ｔ_０）当りの位相成分φ(x,y,n)の変化量の平均値を表す。すなわち、指標φ_dev(x,y)の値が大きい位置には運動性が高い反射体が存在することが示唆される。このようにして、解析部５２により、複素振幅Ｃ(x,y,n)の一定時間当りの変化量の絶対値と該複素振幅Ｃ(x,y,n)の絶対値（すなわち、強度成分Ｒ(x,y,n)）とに基づいて、観察対象物９のスライス面で生じた第２反射光の位相成分φ(x,y,n)の一定時間当りの変化量が求められ、ひいては、観察対処物９のスライス面における反射体のｚ方向の位置変化の様子が各位置(x,y)について得られる。

なお、干渉像に重畳するノイズが干渉成分に比して大きい場合、強度成分Ｒの変化量が無視できなくなる。ノイズの寄与は、複素平面状で実軸成分と虚軸成分ともにガウシアン型に現れるため、統計的な手法によってノイズによる寄与を補正することが可能である。（１４）式に代えて下記（１６）式を用いることで、干渉信号にランダムなノイズが重畳している場合のφ_dev(x,y)を与えることができる。

ここで、Ｒ_noは、ノイズの大きさを示す座標によらない定数であり、下記（１７）式によって与えられる。ただし、(x₀,y₀)は、画像内で有意な干渉信号が存在しないとみなせる地点の座標である。例えば(x₀,y₀)は、コヒーレンス長に比して基板から十分に遠いとみなせるスライス面における、細胞の存在しない位置として選ぶことができる。

（１６）式の有効性を示すため、モンテカルロ法によるシミュレーションを行った。シミュレーションは、Ｒ_no＝１となるようなガウシアン型のノイズを、Ｒ＝４でありかつ偏角がφ_devずつ変化していくようなＣ(n)に重畳させて行った。シミュレーションに用いたＣ(n)は下記（１８）式によって与えられる。ここで、Noiseは実軸成分と虚軸成分がともに標準偏差１／２^0.5となるような、原点を中心とする複素ガウシアンノイズであり、Ｒ_no＝１を満たす。

Δｎ＝１の条件で計算すると、Noiseの項が存在しないときは、（１４）式はφ_devの真値を常に与える。一方、Noiseの項が存在する場合、（１４）式は特にφ_devの値の小さい領域においてφ_devの真値から外れていくこととなるが、（１６）式を用いることでNoiseの項の寄与を補正することが可能となる。Noiseの項が存在する場合において、（１４）式、（１６）式それぞれによって計算したφ_devを図１８に示す。

なお、干渉信号の強度成分Ｒが小さい場合すなわち見かけの干渉信号に寄与するノイズの割合が大きい場合、（１６）式の分母が極めて小さいかゼロになってしまい、正確なφ_devの定量ができなくなる。そのため、例えば下記（１９）式に示すような条件を用いて、この条件を満たすほどに信号のＲが小さい座標(x,y)のデータについては、後段の処理に使用しないようにするのが望ましい。

解析部５２による解析の結果は表示部５３により画像表示される。表示部５３では、解析部５２による解析結果がグレイスケールまたは擬似カラー等により画像表示されるのが好ましい。このように表示されることにより、観察対処物９のスライス面における反射体のｚ方向の位置変化の様子の観察が容易である。

図１９〜図２０それぞれは、表示部５３における画像表示例を示す図である。図１９および図２０それぞれに示される画像は、上記（１６）式に従って求められたものである。図１９は、生きたＨｅＬａ細胞を観察対象物９として用いて、これのスライス面における反射体のｚ方向の位置変化の様子をグレイスケールで表した画像を示す図である。図２０は、固定されたＨｅＬａ細胞を観察対象物９として用いて、これのスライス面における反射体のｚ方向の位置変化の様子をグレイスケールで表した画像を示す図である。ここで、Ｎを６６とし、Δｎを２とし、ｔ_０を１.２秒とした。ＨｅＬａ細胞は、パラホルムアルデヒド処理されることで細胞膜や内容物が固定された。図２１は、図２０に示された固定されたＨｅＬａ細胞の強度成分Ｒ(x,y,n)の画像を示す図である。

図１９および図２０それぞれにおいて、濃度が高いほど、その位置の反射体の運動性が高いことが示されている。図２０に示されるように、固定されたＨｅＬａ細胞では、細胞膜も内容物も動きが止まるので、反射体のｚ方向の位置変化は認められなかった。これに対して、図１９に示されるように、生きたＨｅＬａ細胞では、細胞膜も内容物も動いており、反射体のｚ方向の位置変化が認められた。

上記（１６）式に従って反射体のｚ方向の位置変化を観察する手法の利点は、位相アンラッピング処理を用いる必要がないという点である。位相アンラッピングは、位相の不連続点を連続的にする数値処理であるが、処理にあたってアーチファクトを発生する可能性がある、上記の指標φ_devを用いる手法では、位相アンラッピングを用いる必要がないので、アーチファクトの発生も抑えられる。

以上のように、本実施形態に係る観察装置１または本実施形態に係る観察方法によれば、細胞等の観察対象物９の詳細な情報が得られ得る。これにより、細胞内の活性のイメージングが可能となって、細胞研究，創薬および再生医療などへの応用が期待される。

また、解析部５２により、上記と同様にして、観察対象物９の複数のスライス面それぞれについて、第２反射光の位相成分φ(x,y,n)の一定時間当りの変化量が求められ、ひいては、反射体のｚ方向の位置変化の様子が各位置(x,y)について得られるのが好適である。この場合、ピエゾアクチュエータ７１だけでなくステージ８１も用いられて、図６または図８に示されるように光路長差｛(ｙ_１＋ｙ_２)−(ｘ_１＋ｘ_２)｝がステップ的に調整された上で、その各ステップにおいて図１４に示されるように位相シフト量が時間的に変化するようにして複数枚の複素振幅Ｃ(x,y,n)が獲得されるようにすればよい。このようにすることにより、観察対象物９のトモグラフィ観察が可能となる。

本実施形態に係る観察装置１の構成図である。 撮像部５１または受光部５１に到達する光の強度と光路長差との関係を示す図である。 観察対象物９の構成例を示す図である。 ピエゾアクチュエータ７１およびステージ８１による光路長差調整動作について説明する図である。 本実施形態に係る観察装置１の第１動作態様を説明するフローチャートである。 本実施形態に係る観察装置１の第１動作態様における間隔ｘ_２，間隔ｙ_２および光路長差｛(ｙ_１＋ｙ_２)−(ｘ_１＋ｘ_２)｝それぞれの時間的変化を示す図である。 本実施形態に係る観察装置１の第２動作態様を説明するフローチャートである。 本実施形態に係る観察装置１の第２動作態様における間隔ｘ_２，間隔ｙ_２および光路長差｛(ｙ_１＋ｙ_２)−(ｘ_１＋ｘ_２)｝それぞれの時間的変化を示す図である。 干渉光像の正弦成分Ａ(x,y)を示す図である。 干渉光像の余弦成分Ｂ(x,y)を示す図である。 干渉光像の強度成分Ｒ(x,y)を示す図である。 干渉光像の位相成分φ(x,y)を示す図である。 ＨｅＬａ細胞の器官と反射体との関係を示す図である。 複数組の正弦成分Ａ(x,y)および余弦成分Ｂ(x,y) を時系列で取得する場合の位相シフト量の時間的変化の様子を示す図である。 複数枚の位相成分φ(x,y,n) の取得の様子を示す図である。 位相アンラッピングを説明する図である。 複素平面において複素振幅Ｃ(x,y,n)を表す図である。 （１４）式および（１６）式それぞれによるφ_devの計算機シミュレーション結果を示す図である。 表示部５３における画像表示例を示す図である。 表示部５３における画像表示例を示す図である。 干渉光像の強度成分Ｒ(x,y)を示す図である。

符号の説明

１…観察装置、９…観察対象物、１１，１２…光源、２１〜２５…レンズ、３１…アパーチャ、４１…光合波器、４２…光分波器、４３…ハーフミラー、５１…撮像部、５２…解析部、５３…表示部、６１…受光部、６２…変位検出部、７１…ピエゾアクチュエータ、７２…駆動部、７３…ミラー、８１…ステージ、８２…駆動部、９０…制御部。

Claims (11)

1. 光を出力する光源と、
   該光源から出力された光を２分岐して第１分岐光および第２分岐光として出力し、前記第１分岐光がミラーにより反射されて生じる第１反射光を入力するとともに、前記第２分岐光が観察対象物の表面または内部で反射されて生じる第２反射光を入力して、これら第１反射光と第２反射光とを干渉させて当該干渉光を出力する干渉光学系と、
   前記干渉光学系から出力される干渉光を結像する結像光学系と、
   前記結像光学系により結像された干渉光像を撮像する撮像部と、
   前記光源から前記観察対象物の基準位置を経て前記撮像部に到るまでの光路長と、前記光源から前記ミラーを経て前記撮像部に到るまでの光路長との、光路長差を調整する光路長差調整手段と、
   前記光路長差が各目標値に順次になるように前記光路長差調整手段による光路長差調整動作を制御する制御部と、
   位相シフト法により前記光路長差調整手段により前記光路長差が各目標値に順次に設定されて前記撮像部により撮像された干渉光像の複素振幅を求め、この求めた複素振幅の一定時間当りの変化量の絶対値と該複素振幅の絶対値とに基づいて、前記観察対象物の表面または内部で生じた前記第２反射光の位相成分の一定時間当りの変化量を求める解析部と、
   を備えることを特徴とする観察装置。
2. 前記解析部により求められた前記第２反射光の位相成分の一定時間当りの変化量の空間的分布を画像表示する表示部を更に備えることを特徴とする請求項１に記載の観察装置。
3. 前記解析部が前記観察対象物の複数のスライス面それぞれについて前記第２反射光の位相成分の一定時間当りの変化量を求めることを特徴とする請求項１に記載の観察装置。
4. 前記光路長差を検出する光路長差検出手段を更に備え、
   前記光路長差検出手段による検出結果に基づいて前記光路長差調整手段が前記光路長差を調整する、
   ことを特徴とする請求項１に記載の観察装置。
5. 前記光路長差調整手段が、前記観察対象物および前記ミラーのうち一方の第１対象物を移動させる第１移動手段と、前記観察対象物および前記ミラーのうち他方の第２対象物を移動させる第２移動手段とを含み、前記第１移動手段または前記第２移動手段による移動動作により前記光路長差を調整し、
   前記第１移動手段が、前記第２移動手段の作動範囲より狭い作動範囲を有するとともに、前記第２移動手段の位置精度より高い位置精度を有し、
   前記第２移動手段が、前記干渉光学系と前記第２対象物との間の光学系を維持したまま前記第２対象物を移動させ、
   前記制御部が、前記光路長差の各目標値において前記第１移動手段による移動量が前記作動範囲内の所定範囲内となるように前記第２移動手段による移動動作を連続的または断続的に行わせ、前記第２移動手段による移動動作の際にも前記光路長差が各目標値になるように前記第１移動手段による移動動作をフィードバック制御する、
   ことを特徴とする請求項１に記載の観察装置。
6. 光を出力する光源と、
   該光源から出力された光を２分岐して第１分岐光および第２分岐光として出力し、前記第１分岐光が観察対象物の表面または内部で反射されて生じる第１反射光を入力するとともに、前記第２分岐光がミラーにより反射されて生じる第２反射光を入力して、これら第１反射光と第２反射光とを干渉させて当該干渉光を出力する干渉光学系と、
   前記干渉光学系から出力される干渉光を結像する結像光学系と、
   前記結像光学系により結像された干渉光像を撮像する撮像部と、
   前記光源から前記観察対象物の基準位置を経て前記撮像部に到るまでの光路長と、前記光源から前記ミラーを経て前記撮像部に到るまでの光路長との、光路長差を調整する光路長差調整手段と、
   前記光路長差が各目標値に順次になるように前記光路長差調整手段による光路長差調整動作を制御する制御部と、
   を用い、
   位相シフト法により前記光路長差調整手段により前記光路長差が各目標値に順次に設定されて前記撮像部により撮像された干渉光像の複素振幅を求め、この求めた複素振幅の一定時間当りの変化量の絶対値と該複素振幅の絶対値とに基づいて、前記観察対象物の表面または内部で生じた前記第２反射光の位相成分の一定時間当りの変化量を求める、
   ことを特徴とする観察方法。
7. 前記第２反射光の位相成分の一定時間当りの変化量の空間的分布を表示部により画像表示することを特徴とする請求項６に記載の観察方法。
8. 前記観察対象物の複数のスライス面それぞれについて前記第２反射光の位相成分の一定時間当りの変化量を求めることを特徴とする請求項６に記載の観察方法。
9. 前記光路長差を検出する光路長差検出手段を更に用い、
   前記光路長差検出手段による検出結果に基づいて前記光路長差調整手段により前記光路長差を調整する、
   ことを特徴とする請求項６に記載の観察方法。
10. 前記光路長差調整手段が、前記観察対象物および前記ミラーのうち一方の第１対象物を移動させる第１移動手段と、前記観察対象物および前記ミラーのうち他方の第２対象物を移動させる第２移動手段とを含み、前記第１移動手段または前記第２移動手段による移動動作により前記光路長差を調整し、
    前記第１移動手段が、前記第２移動手段の作動範囲より狭い作動範囲を有するとともに、前記第２移動手段の位置精度より高い位置精度を有し、
    前記第２移動手段が、前記干渉光学系と前記第２対象物との間の光学系を維持したまま前記第２対象物を移動させ、
    前記制御部が、前記光路長差の各目標値において前記第１移動手段による移動量が前記作動範囲内の所定範囲内となるように前記第２移動手段による移動動作を連続的または断続的に行わせ、前記第２移動手段による移動動作の際にも前記光路長差が各目標値になるように前記第１移動手段による移動動作をフィードバック制御する、
    ことを特徴とする請求項６に記載の観察方法。
11. 前記観察対象物が細胞を含むことを特徴とする請求項６に記載の観察方法。