JP2010019767A - 検出方法、検出装置、検出用試料セルおよび検出用キット - Google Patents

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Abstract

【課題】被検出物質を極めて高感度に検出可能な検出方法および装置を得る。
【解決手段】センサ14部上に、液体試料中の被検出物質Ａの量に応じた量の蛍光標識結合物質BFを結合させ、この蛍光標識結合物質BFの蛍光標識Ｆの励起に起因して生じる光の量に基づいて、被検出物質の量を検出する検出方法において、蛍光標識Fとして、複数の蛍光色素分子を、該蛍光色素分子からの蛍光を透過する材料により包含してなる、液体試料中において該液体試料のｐＨに応じて荷電状態が変化する蛍光物質を用い、センサ部14に蛍光標識結合物質BFを結合させた状態で、液体試料のｐＨを調整して、蛍光物質Ｆの荷電状態を中性化することにより、蛍光物質Ｆをセンサ部14表面に引き寄せ、該蛍光物質Ｆを引き寄せた状態で被検出物質Ａの量を検出する。
【選択図】図１

Description

本発明は、試料中の被検出物質を検出する検出方法、検出用試料セルおよび検出用キットに関するものである。
従来、バイオ測定等において、高感度かつ容易な測定法として蛍光検出法が広く用いられている。この蛍光検出法は、特定波長の光により励起されて蛍光を発する被検出物質を含むと考えられる試料に上記特定波長の励起光を照射し、そのとき蛍光を検出することによって被検出物質の存在を確認する方法である。また、被検出物質が蛍光体ではない場合、蛍光色素で標識されて被検出物質と特異的に結合する物質を試料に接触させ、その後上記と同様にして蛍光を検出することにより、この結合すなわち被検出物質の存在を確認することも広くなされている。
バイオ測定においては、例えば、試料に含まれる被検出物質である抗原を検出するため、基板上に被検出物質と特異的に結合する１次抗体を固定しておき、基板上に試料を供給することにより、１次抗体に被検出物質を特異的に結合させ、次いで、被検出物質と特異的に結合する、蛍光標識が付与された２次抗体を添加し、被検出物質と結合させることにより、１次抗体―被検出物質―２次抗体の、所謂サンドイッチを形成し、２次抗体に付与されている蛍光標識からの蛍光を検出するサンドイッチ法や、被検出物質と競合して１次抗体と特異的に結合する、蛍光標識された競合２次抗体を被検出物質と競合的に１次抗体と結合させ、１次抗体と結合した競合２次抗体からの蛍光を検出する競合法などのアッセイがなされる。
この際、基板上に固定された１次抗体と被検出物質を介して結合した２次抗体、あるいは直接結合した競合２次抗体のみからの蛍光を検出するために、エバネッセント光により蛍光を励起するエバネッセント蛍光法が提案されている。エバネッセント蛍光法は、基板表面で全反射する励起光を基板裏面から入射し、基板表面に染み出すエバネッセント波により蛍光を励起してその蛍光を検出するものである。
特許文献１には、基板上に１次抗体を固定することなく、液相中にて、１次反応体―被検出物質―２次反応体結合物を形成させ、これを、エバネッセント波が染み出す領域に局在化させて蛍光を検出するエバネッセント蛍光法が提案されている。具体的には、１次抗体および磁性体からなる第１反応体と、蛍光物質および２次抗体からなる第２反応体とを被検出物質と結合させ、その結合物を、第１反応体の磁性体を磁石で引き寄せることにより局在化する方法が開示されている。
一方、エバネッセント蛍光法において、感度を向上させるため、プラズモン共鳴による電場増強の効果を利用する方法が特許文献２、非特許文献１などに提案されている。表面プラズモン増強蛍光法は、プラズモン共鳴を生じさせるため、基板上に金属層を設け、基板と金属層との界面に対して基板裏面から、全反射角以上の角度で励起光を入射し、この励起光の照射により金属層に表面プラズモンを生じさせ、その電場増強作用によって、蛍光信号を増大させてＳ／Ｎを向上させるものである。
同様に、エバネッセント蛍光法において、センサ部の電場を増強する効果を有するものとして、導波モードによる電場増強効果を利用する方法が非特許文献２に提案されている。この光導波モード増強蛍光分光法（OWF：Optical waveguide mode enhanced fluorescence spectroscopy)は、基板上に金属層と、誘電体などからなる光導波層とを順次形成し、基板裏面から全反射角以上の角度で励起光を入射し、この励起光の照射により光導波層に光導波モードを生じさせ、その電場増強効果によって、蛍光信号を増強させるものである。
また、特許文献３および非特許文献３には、表面プラズモンによる増強された電場において励起された蛍光標識からの蛍光を検出するのではなく、その蛍光が金属層に新たに表面プラズモンを誘起して生じる放射光（SPCE: Surface Plasmon-Coupled Emission)をプリズム側から取り出す方法が提案されている。
このように、バイオ測定等においては、被測定物質を検出するための方法として、励起光の照射により、プラズモン共鳴や光導波モードを生じさせ、これらによって増強された電場で蛍光標識を励起させ、その蛍光を直接、あるいは間接的に検出する種々の方法が提案されている。
また、表面プラズモン共鳴測定装置においては、センサ部上のエバネッセント波滲み出し領域における被検出物質の濃度を高めるために、試料に対して電圧を印加させて、被検出物質をセンサ部に引き寄せて測定を行う方法が特許文献４や５などに提案されている。このような方法においては、緩衝液のｐＨを調整することにより、蛋白質や核酸などの被検出物質の荷電状態を調整し、被検出物質を正もしくは負に帯電させた状態で、電圧を印加することにより、センサ部に引き寄せている。
特開２００５−７７３３８号公報 特開平１０−３０７１４１号公報 米国特許出願公開第２００５／００５３９７４号明細書 特開平９−２５７７０２号公報 特開２００７−８５７７０号公報 W.Knoll他、Analytical Chemistry 77(2005), p.2426-2431 2007年春季 応用物理学会 予稿集 Ｎo.３,P.1378 Thorsten Liebermann Wolfgang Knoll, "Surface-plasmon field-enhanced fluorescence spectroscopy" Colloids and Surfaces A 171(2000)115-130
電圧印加による被検出物質の局在化方法は、ある程度の効果を得ることができる。表面プラズモン共鳴測定装置においては、エバネッセント波の滲み出し領域となる１００ｎｍ程度まで引き寄せれば信号のばらつきが小さくなると特許文献４には述べられている。
しかしながら、被検出物質の大きさおよび荷電はいずれも小さいことから、電圧印加による引き寄せ効果が、被検出物質のブラウン運動に負けてしまい、被検出物質を効率的にセンサ部表面に引き寄せることは困難である。また、電圧を印加するためには、試料液に電圧を印加するための手段を備える必要があり、装置が複雑になるという問題点もある。
さらに、表面プラズモン共鳴や光導波モードによる電場増強の効果は、金属層や光導波層表面から離れるに従って急激に減衰するため、表面から蛍光標識までの距離が僅かに変化するだけで、信号に差が生じ、信号のばらつきが生じてしまうため、表面から５０ｎｍ程度以下に蛍光標識を引き寄せる必要がある。
例えば、表面プラズモン共鳴による電場増強効果による蛍光を検出する装置のセンサ部近傍の模式図を図２０に示す。プリズム（基板）１０１の表面に金膜１０２が設けられており、この金膜１０２上に１次抗体Ｂ１が固定されている。サンドイッチアッセイを行う場合、１次抗体Ｂ１に対して抗原Ａを介して結合する、蛍光標識（ここでは、蛍光色素分子ｆ）が付与された標識２次抗体Ｂ２の蛍光標識からの蛍光を検出する。プリズム１０１と金膜１０２との界面に全反射角度以上の角度で励起光を入射することにより、金膜表面に表面プラズモンを励起して金膜表面の電場を増強する。蛍光標識ｆは増強された電場において励起され、蛍光を発する。図２０中のグラフは、電場強度のセンサ部表面（金膜表面）からの距離依存性を示している。グラフに示すように、電場強度は表面から離れるにつれ急激に減少する。
このとき、センサ部表面から標識２次抗体の蛍光標識ｆまでの距離は最大で５０ｎｍ程度も離れており、センサ部表面から５０ｎｍ程度離れると、蛍光強度は３０％以上減衰してしまう。また、１次抗体Ｂ１は常にセンサ部表面に直立に固定されるものではなく、液の流れや立体障害等により表面に沿って倒れる場合もあり、これに応じて蛍光標識ｆの表面からの距離にばらつきが生じ、このばらつきが信号強度のばらつきに繋がる。
本発明は上記の事情に鑑みてなされたものであり、装置構成を複雑化することなく、信号強度のばらつきを抑え、かつ増強された電場を効率よく利用することができる、蛍光を直接、あるいは間接的に検出する検出方法および装置を提供することを目的とする。
また、本発明は検出方法に用いられる試料セルおよび検出用キットを提供することを目的とする。
本発明の検出方法は、誘電体プレートと、該誘電体プレートの一面に設けられた少なくとも金属層からなるセンサ部とからなるセンサチップを用意し、
前記センサ部に液体試料を接触させることにより、該センサ部上に、該液体試料中の被検出物質の量に応じた量の蛍光標識結合物質を結合させ、
前記センサ部に励起光を照射することにより、該センサ部上に増強した光電場を生じさせ、該増強した光電場内において前記蛍光標識結合物質の蛍光標識を励起し、該蛍光標識の励起に起因して生じる光の量に基づいて、前記被検出物質の量を検出する検出方法において、
前記蛍光標識として、複数の蛍光色素分子を、該蛍光色素分子からの蛍光を透過する材料により包含してなる、前記液体試料中において該液体試料のｐＨに応じて荷電状態が変化する蛍光物質を用い、
前記センサ部に前記蛍光標識結合物質を結合させた状態で、前記液体試料のｐＨを調整して、前記蛍光物質の荷電状態を中性化することにより、該蛍光物質を前記センサ部表面に引き寄せ、
該蛍光物質を引き寄せた状態で、前記被検出物質の量を検出することを特徴とする。
前記蛍光物質の粒径は、３０ｎｍ以上、さらには７０ｎｍ以上であることが好ましい。
本明細書において、蛍光物質の粒径は、略球状の粒子の場合にはその直径であり、球状でない粒子の場合にはその最大幅と最小幅との平均の長さで定義するものとする。
なお、ここで「蛍光標識結合物質」は被検出物質の量に応じた量だけセンサ部上に結合する蛍光標識された結合物質であり、例えば、サンドイッチ法によるアッセイを行う場合には、被検出物質と特異的に結合する結合物質と蛍光標識とから構成され、競合法によるアッセイを行う場合には、被検出物質と競合する結合物質と蛍光標識とから構成される。
「被検出物質の量を検出する」とは被検出物質の存在の有無を含み、定量的な量のみならず、定性的な量を含むものとする。
本発明の検出方法においては、前記蛍光物質として、前記液体試料のｐＨに応じて荷電状態が変化する官能基が表面修飾された蛍光物質を用い、前記該センサ部に、前記蛍光標識結合物質を結合させる際、前記液体試料を前記官能基がイオン化するｐＨとし、前記蛍光標識結合物質を結合させた後、前記液体試料を前記官能基が中性化するｐＨに調整することにより、前記蛍光物質を前記センサ部表面に引き寄せることが望ましい。
ここで「光電場」とは、励起光の照射により生じるエバネッセント光もしくは近接場光に起因する電場をいうものとする。
また、「増強した光電場を生じさせる」とは、光電場を増強させることによって、増強した光電場を形成することを意味するものであり、光電場を増強させる方法は、プラズモン共鳴によるものであってもよいし、光導波モードの励起によるものであってもよい。
また、「前記蛍光標識結合物質の蛍光標識の励起に起因して生じる光の量に基づいて、前記被検出物質の量を検出する」方法としては、蛍光標識からの蛍光を直接検出するものであってもよいし、間接的に検出するものであってもよい。
具体的には、以下の態様（１）〜（４）が挙げられる。
（１）前記励起光の照射により前記金属層にプラズモンを励起し、該プラズモンにより前記増強した光電場を生じさせ、前記蛍光標識の励起に起因して生じる前記光として、該励起によって該蛍光標識から生じる蛍光を検出することにより前記被検出物質の量を検出する。
（２）前記励起光の照射により前記金属層にプラズモンを励起し、該プラズモンにより前記増強した光電場を生じさせ、前記蛍光標識の励起に起因して生じる前記光として、該励起によって該蛍光標識から生じる蛍光が前記金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、前記誘電体プレートの前記他面から放射される放射光を検出することにより前記被検出物質の量を検出する。
（３）前記センサチップとして、前記金属層上に光導波層を備えたものを用い、前記励起光の照射により前記光導波層に光導波モードを励起し、該光導波モードにより前記増強した光電場を生じさせ、前記蛍光標識の励起に起因して生じる前記光として、該励起によって該蛍光標識から生じる蛍光を検出することにより前記被検出物質の量を検出する。
（４）前記センサチップとして、前記金属層上に光導波層を備えたものを用い、前記励起光の照射により前記光導波層に光導波モードを励起し、該光導波モードにより前記増強した光電場を生じさせ、前記蛍光標識の励起に起因して生じる前記光として、該励起によって該蛍光標識から生じる蛍光が前記金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、前記誘電体プレートの前記他面から放射される放射光を検出することにより前記被検出物質の量を検出する。
（１）および（２）においては、前記金属層を金属膜とし、金属膜と基板との界面に基板裏面から全反射角度以上の角度で励起光を入射させ、金属膜表面に表面プラズモンを励起するものであってもよいし、前記金属層を、励起光の波長よりも小さい周期の凹凸を表面に有する金属微細構造体あるいは、励起光の波長よりも小さいサイズの複数の金属ナノロッドにより構成し、励起光の照射により、金属微細構造体あるいは金属ナノロッドに局在プラズモンを励起するものであってもよい。
本発明の検出装置は、上述の本発明の検出方法に用いられる検出装置であって、
前記センサチップを収容する収容部と、
前記センサ部に前記励起光を照射する励起光照射光学系と、
該励起光の照射により該センサ部上に生じた前記増強した光電場における、前記蛍光標識の励起に起因して生じる光を検出する光検出手段と、
前記センサチップに、ｐＨ調整液を注入して前記液体試料のｐＨを調整するｐＨ調整手段とを備えたことを特徴とするものである。
本発明の検出用試料セルは、上述の本発明の検出方法に使用される検出用試料セルであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、
前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、
前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、
前記流路の、前記注入口と前記空気孔との間に設けられたセンサチップ部であって、前記流路の内壁面の少なくとも一部として設けられた誘電体プレートと、該プレートの試料接触面に設けられた少なくとも金属層を含むセンサ部とからなるセンサチップ部とを備えてなることを特徴とするものである。
検出用試料セルにおいては、前記センサ部に、前記蛍光標識結合物質と結合する固定層を備えていることが望ましい。
さらに、複数の蛍光色素分子を、該蛍光色素分子からの蛍光を透過する材料により包含してなる、前記液体試料中において該液体試料のｐＨに応じて荷電状態が変化する蛍光物質を、前記蛍光標識として含む前記蛍光標識結合物質が、前記流路内の、前記センサ部より上流側に固定されていることが望ましい。
本発明の試料セルは、前記固定層が、前記被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質が固定されてなる層であり、前記蛍光標識結合物質が、前記被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質を含み、前記被検出物質を介して前記第１の結合物質と結合するものであれば、サンドイッチ法によるアッセイを行うのに好適なものとなる。
また、本発明の試料セルは、前記固定層が、前記被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質が固定されてなる層であり、前記蛍光標識結合物質は、前記第１の結合物質と特異的に結合する第３の結合物質を含み、前記被検出物質と競合して前記第１の結合物質と結合するものであれば、競合法によるアッセイを行うのに好適なものとなる。
さらに、前記センサ部において、前記金属層上に光導波層が備えられていてもよい。
本発明の検出用キットは、上述の本発明の検出方法に使用される検出用キットであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、前記流路の、前記注入口と前記空気孔との間に設けられたセンサチップ部であって、前記流路の内壁面の少なくとも一部として設けられた誘電体プレートと、該プレートの試料接触面に設けられた少なくとも金属層を含むセンサ部とからなるセンサチップ部と、該センサ部上に固定された、前記蛍光標識結合物質と結合する固定層とを備えた試料セル、および
前記液体試料と同時もしくは前記液体試料の流下後に、前記流路内に流下される、複数の蛍光色素分子を、該蛍光色素分子からの蛍光を透過する材料により包含してなる、前記液体試料中において該液体試料のｐＨに応じて荷電状態が変化する蛍光物質を、前記蛍光標識として含む前記蛍光標識結合物質を含んだ標識用溶液を備えてなることを特徴とするものである。
さらに、前記試料セルは、前記センサ部において、前記金属層上に光導波層が備えられていでもよい。
本発明の検出用キットは、前記試料セルの前記固定層が、前記被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質が固定されてなる層であり、前記標識用溶液が、前記蛍光標識結合物質として、前記被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質を含む、前記被検出物質を介して前記第１の結合物質と結合するものを備えている場合には、サンドイッチ法によるアッセイを行うのに好適なものとなる。また、前記試料セルの前記固定層が、前記被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質が固定されてなる層であり、前記標識用溶液が、前記蛍光標識結合物質として、前記第１の結合物質と特異的に結合する第３の結合物質を含む、前記被検出物質と競合して前記第１の結合物質と結合するものを備えている場合には、競合法によるアッセイを行うのに好適なものとなる。
なお、前記金属層の材料としては、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とすることが望ましい。なおここで、「主成分」は、含量９０質量％以上の成分と定義する。
本発明の検出方法および装置によれば、センサ部上に、試料に含有される被検出物質の量に応じて結合される蛍光標識結合物質の蛍光標識として、複数の蛍光色素分子を、該蛍光色素分子からの蛍光を透過する材料により包含してなる、液体試料中において該液体試料のｐＨに応じて荷電状態が変化する蛍光物質を用い、センサ部に蛍光標識結合物質を結合させた状態で、液体試料のｐＨを調整することにより、光電場増強効果の高いセンサ部表面に蛍光物質を引き寄せ、その引き寄せた状態で、その蛍光標識結合物質の蛍光標識の励起に起因して生じる光の量を検出するので、センサ部表面の増強度の大きい光電場を効率よく利用することができ、かつ蛍光標識の表面からの距離を一様にすることができるため、信号強度のばらつきを抑制することができる。液体試料のｐＨを調整するのみで、センサ部への蛍光物質の引き寄せ効果を得ることができ、装置の複雑化を要することなく、Ｓ／Ｎのよい安定した信号を検出することができ、被検出物質の有無および／または量を精度よく検出することができる。
本発明の検出用試料セルあるいは検出用キットを用いれば、本発明の検出方法を容易に実施することができ、増強された光電場を有効に利用し、かつ信号強度のばらつきを抑制し、被検出物質の有無および／または量を精度よく検出することができる。
以下、図面を参照して本発明の実施形態について説明する。なお、各図において説明の便宜上、各部の寸法は実際のものとは異ならせている。
「検出方法および装置」
本発明の検出方法は、例えば図１に示すように、誘電体プレート１１と、該プレート１１の一面に設けられた少なくとも金属層１２を含むセンサ部１４とからなるセンサチップ１０を用い、センサ部１４に試料を接触させることにより、該センサ部１４上に、該試料に含有される被検出物質Ａの量に応じた量の蛍光標識結合物質ＢＦを結合させ、センサ部１４に励起光Ｌ０を照射することにより、センサ部１４上に増強した光電場Ｄを生じさせ、該増強した光電場Ｄ内において、蛍光標識結合物質ＢＦの蛍光標識Ｆの励起し、該蛍光標識の励起に起因して生じる光の量に基づいて、被検出物質Ａの量を検出する検出方法であって、蛍光標識として、複数の蛍光色素分子ｆを、該蛍光色素分子ｆからの蛍光を透過する材料により包含してなる、液体試料中において該液体試料のｐＨに応じて荷電状態が変化する蛍光物質Ｆを用い、センサ部１４に蛍光標識結合物質ＢＦを結合させた状態で、液体試料のｐＨを調整して、蛍光物質の荷電状態を中性化することにより、該蛍光物質をセンサ部表面に引き寄せ、該蛍光物質Ｆを引き寄せた状態で被検出物質Ａの量を検出することを特徴とする。
液体試料中において該液体試料のｐＨに応じて荷電状態が変化する蛍光物質としては、例えば、液体試料のｐＨに応じて荷電状態が変化する官能基が表面修飾された蛍光物質を用いればよい。このとき、センサ部に、蛍光標識結合物質を結合させる際、液体試料を官能基がイオン化するｐＨとし、蛍光標識結合物質を結合させた後、液体試料を官能基が中性化するｐＨに調整することにより、蛍光物質をセンサ部表面に引き寄せることができる。
なお、ここで、センサ部に結合するとは、センサ部に対して特異的に結合することを意味し、具体的には、蛍光標識結合物質が特異的に結合する物質が固定層としてセンサ部に設けられており、この固定層に結合する形態が挙げられる。
本発明の検出装置は、上記検出方法を実施するためのものであって、センサチップ１０を収容する収容部１９と、センサ部１４に励起光Ｌ０を照射する励起光照射光学系２０と、励起光Ｌ０の照射により生じる、被検出物質Ａに応じた量の光を検出する光検出手段３０と、センサチップにｐＨ調整液を注入して液体試料のｐＨを調整するｐＨ調整手段３５とを備えている。図中において、ｐＨ調整手段３５は、ｐＨ調整液を注入するためのノズル部分のみを図示している。
蛍光標識は、図１の一部に拡大して示すように、複数の蛍光色素分子ｆを、該複数の蛍光色素分子ｆから生じる蛍光を透過する材料１６により包含してなる蛍光物質を用いることが好ましい。複数の蛍光色素分子ｆを含む蛍光物質Ｆを用いれば、蛍光量を増加させることができるからである。また、蛍光Ｌｆを透過する材料１６により蛍光色素分子ｆが内包されていることにより、金属層と所定以上の距離を保つことができ、蛍光色素分子ｆが金属層１２に近接した場合に生じる金属消光を防止することができる。
蛍光色素分子が金属層に接近しすぎた場合に生じる消光は、金属へのエネルギー移動に伴うものであり、このエネルギー移動の程度は、金属が半無限の厚さを持つ平面なら距離の３乗に反比例して、金属が無限に薄い平板なら距離の４乗に反比例して、また、金属が微粒子なら距離の６乗に反比例して小さくなる。従って、金属層１２と蛍光色素分子ｆとの間の距離は少なくとも数ｎｍ以上、より好ましくは１０ｎｍ以上確保しておくことが望ましい。
従来金属消光を防止する方法としては、金属層１２上に自己組織化膜（ＳＡＭ）を形成し、さらにカルボキシメチルデキストラン(ＣＭＤ)膜を作製して金属膜と蛍光色素分子との距離を離す方法が知られている。しかしながら、金属膜上にこれらの金属消光を防止するための膜を設けるのは、センサチップ作製工程を複雑なものとし、非常に手間がかかる。一方、蛍光物質Ｆを用いれば、上述のような金属消光防止のための膜を設けることなく、非常に簡便な方法で効果的に金属消光を防止することができる。
材料１６としては、具体的には、ポリスチレンやＳｉＯ2などが挙げられるが、蛍光色素分子ｆを内包でき、かつ、該蛍光色素分子ｆからの蛍光を透過させて外部に放出できるものであれば特に制限されない。
なお、蛍光物質は、蛍光物質の電荷が中性化されて親水性が低下した場合に、蛍光標識結合物質の液体試料中におけるブラウン運動よりも、蛍光物質の親水性の低下による壁への凝集効果が大きくなるサイズであることが望ましい。被検出物質となりうるタンパク、生体分子のうちでサイズが大きいものとしては、抗体（〜１５ｎｍ）、アルブミン（〜２０ｎｍ）などがあるが、被検出物質を帯電させるだけでは引き寄せ効果は不十分である。したがって、蛍光物質としては、粒径が３０ｎｍ程度以上の大きさであることが好ましい。粒径が３０ｎｍ未満であると、物質のブラウン運動により、十分な引き寄せ効果が得られない場合が生じる恐れがある。なお、蛍光物質の粒径が７０ｎｍ以上、さらには、１００ｎｍ以上であれば、より効果的な引き寄せが期待できる。
また、拡散時間の点から粒径が５３００ｎｍ以下のものが好ましい。また、蛍光量およびセンサ部上への最密充填密度の観点および、表面プラズモンの擾乱の観点から７０ｎｍ〜９００ｎｍのものがさらに好ましく、１３０ｎｍ〜５００ｎｍのものが特に好ましい。
蛍光物質Ｆは、例えば、以下のようにして作製することができる。
まず、ポリスチレン粒子（Ｅｓｔａｐｏｒ社、φ５００ｎｍ、１０％ｓｏｌｉｄ、カルボキシル基、製品番号Ｋ１―０５０）を調液して０．１％ｓｏｌｉｄ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ポリスチレン溶液：ｐＨ７．０）を作製する。
次に、蛍光色素（林原生物化学研究所 ＮＫ−2014（励起 〜７８０ｎｍ））０．３ｍｇの酢酸エチル溶液（１ｍＬ）を作製する。
上記ポリスチレン溶液と蛍光色素溶液を混合し、エバポレートしながら含浸を行った後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分を２回）を行い、上清を除去する。以上の工程により、ポリスチレンにより蛍光色素を内包してなる蛍光物質Ｆを得ることができる。このような手順で、ポリスチレン粒子に蛍光色素を含浸させて作製された蛍光物質Ｆの粒径はポリスチレン粒子の粒径と同一（上記例ではφ５００ｎｍ）となる。なお、上記において用いるポリスチレン粒子は表面にｐＨに応じて荷電状態が変化する官能基であるカルボキシル基が修飾されており、蛍光物質Ｆは表面にカルボキシル基が修飾された、蛍光ｐＨに応じて荷電状態が変化する蛍光物質である。
蛍光標識結合物質ＢＦは、被検出物質Ａの量に応じた量だけセンサ部１４上に結合する蛍光標識された結合物質であり、図１で示すように、サンドイッチ法によるアッセイを行う場合には、被検出物質と特異的に結合する結合物質と上述の蛍光物質Ｆとから構成されるものであり、後記する競合法によるアッセイを行う場合には、被検出物質と競合する結合物質と蛍光物質Ｆとから構成されるものである。より具体的には、センサチップ１０として、センサ部１４に被検出物質Ａと特異的に結合する第１の結合物質Ｂ１が固定層として固定されたものを用いた場合、サンドイッチ法では、蛍光標識結合物質ＢＦとして、被検出物質Ａと特異的に結合する第２の結合物質Ｂ２と、この結合物質Ｂ２が修飾された蛍光物質Ｆとからなるものを用い、競合法では、蛍光標識結合物質として、被検出物質Ａと競合して第１の結合物質と特異的に結合する第３の結合物質と、この結合物質が修飾された蛍光物質Ｆとからなるものを用いる。被検出物質Ａが抗原である場合、第１の結合物質Ｂ１として所謂１次抗体を用い、蛍光標識結合物質として所謂標識２次抗体を用いればよい。
蛍光物質に表面修飾される、液体試料中において該液体試料のｐＨに応じて荷電状態が変化する官能基としては、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基、アミノ基、４級アンモニウム基、イミダゾール基、及びグアニジニウム基などを用いることができる。例えば、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）は、血清、血漿などの液体試料中、もしくはリン酸緩衝生理食塩水（Phosphate buffered saline, ＰＢＳ）中などｐＨ7.4近傍において、ＣＯＯ−にイオン化した状態となり、ｐＨを５程度まで下げる（具体的には、酢酸バッファ溶液を用いる）ことによりＣＯＯ−がプロトン化してＣＯＯＨとなり電気的に中性化する。また、アミノ基（−ＮＨ2）は、血清、血漿などの液体試料中、もしくはＰＢＳ中などｐＨ7.4近傍において、ＮＨ3 ＋にイオン化した状態となり、ｐＨを９付近まで上げる（具体的には、ボレートバッファ溶液を用いる）ことにより、ＮＨ3 ＋が脱プロトン化してＮＨ2となり電気的に中性化する。
図２に液体試料のｐＨを調整した際の蛍光物質の表面電荷と液体試料中における分散性についての模式図を示す。ここでは、官能基としてＣＯＯＨが蛍光物質に表面修飾されている例を示す。ｐＨ７近傍で官能基はＣＯＯ−にイオン化しており、蛍光物質同士は同じ電荷に帯電しているためにお互いに反発し、また、イオン化しているために親水性が高く、液体試料中における分散性が高い。他方、ｐＨを４．５まで下げて官能基を中性化させると、蛍光物質の親水性が低下して疎水的となり、液体試料中における分散性が低くなり、蛍光物質が壁側に寄る現象が生じる。すなわち、蛍光標識結合物質がセンサ部に結合している状態で、官能基が中性化した場合、最も近い壁側となるセンサ部表面に蛍光物質は引き寄せられることとなる。
既述の図２０の例では、蛍光標識が十分に金属層上に引き寄せられず、また、結合体の直立、横臥により蛍光標識のセンサ面からの距離にばらつきが生じていたが、液体試料のｐＨに応じて荷電状態が変化する蛍光物質を用いることにより、液体資料のｐＨを制御するのみで、蛍光物質を効率的に、かつ一様にセンサ部表面に引き寄せることができる。これにより、Ｓ／Ｎよく安定した信号を検出することが可能となる。
本発明は、励起光の照射によりセンサ部上に増強した光電場を生じさせ、その増強した光電場において蛍光標識が励起されることによって生じる光を検出するものであるが、光電場を増強させる方法は、表面プラズモン共鳴あるいは局在プラズモン共鳴によるものであってもよいし、光導波モードの励起によるものであってもよい。また、蛍光標識から生じる蛍光を直接検出してもよいし、間接的に検出してもよい。具体的な態様については、以下の各実施形態で説明する。
＜第１の実施形態＞
第１実施形態の検出方法および装置について図１を参照して説明する。図１は第１の実施形態の検出装置の概略構成を示す全体図である。本実施形態の検出方法および装置は、表面プラズモン共鳴により光電場を増強させ、増強された光電場において励起された蛍光を検出する蛍光検出方法および装置である。
本実施形態の本蛍光検出方法では、誘電体プレート１１およびその一面の所定領域に少なくとも金属層１２として金属膜が設けられてなるセンサ部１４を備えたセンサチップ１０を用い、このセンサチップ１０上に液体試料Ｓを保持する試料保持部１３が備えられ、センサチップ１０と液体試料を保持可能な試料保持部１３による箱状の試料セルを用いている。
金属膜１２は、所定領域に開口を有するマスクをプレート１１の一表面に形成し、既知の蒸着法で成膜形成することができる。金属膜１２の厚みは、金属膜１２の材料と、励起光の波長により表面プラズモンが強く励起されるように適宜定めることが望ましい。例えば、励起光として７８０ｎｍに中心波長を有するレーザ光を用い、金属膜として金（Ａｕ）膜を用いる場合、金属膜の厚みは５０ｎｍ±２０ｎｍが好適である。さらに好ましくは、４７ｎｍ±１０ｎｍである。なお、金属膜は、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とするものが好ましい。
本蛍光検出装置１は、センサチップ１０を収容する収容部１９と、収容部１９に収容されたセンサチップ１０の誘電体プレート１１と金属膜１２との界面に励起光Ｌｏを全反射角以上の入射角度で、センサチップ１０の金属膜形成面とは反対の他面側から入射させる励起光照射光学系２０と、励起光の照射により生じる蛍光Ｌｆを検出する光検出器３０と、収容部１９にセンサチップ１０が収容された際に、センサチップにｐＨ調整液を注入して液体試料のｐＨを調整するｐＨ調整手段３５とを備えている。
励起光照射光学系２０は、励起光Ｌｏを出力する半導体レーザ（ＬＤ）等からなる光源２１と、誘電体プレート１１に一面が接触するように配置されたプリズム２２とを備えている。プリズム２２は、誘電体プレート１１と金属膜１２との界面で励起光Ｌｏが全反射するように誘電体プレート１１内に励起光Ｌｏを導光するものである。なお、プリズム２２と誘電体プレート１１とは、屈折率マッチングオイルを介して接触されている。光源２１は、プリズム２２の他の一面からセンサチップ１０の試料接触面１０ａで励起光Ｌｏが全反射角以上で、かつ金属膜で表面プラズモン共鳴する特定の角度で入射するように配置されている。さらに、光源２１とプリズム２２との間に必要に応じて導光部材を配置してもよい。なお、励起光Ｌｏは、表面プラズモンを誘起するようにｐ偏光で界面に対して入射させる。
光検出器３０としては、ＣＣＤ、ＰＤ（フォトダイオード）、フォトマルチプライア、ｃ−ＭＯＳ等を適宜用いることができる。
収容部１９は、センサチップ１０を収容する際に、センサチップのセンサ部１４がプリズム２２上に配置され、光検出器３０で蛍光が検出できるよう構成されている。収容部１９に対しセル（センサチップ１０）を、図中矢印Ｘ方向に出し入れすることができる。
ｐＨ調整手段３５は、図１中においては、ｐＨ調整液を注入するためのノズル部分のみ示しているが、ｐＨ調整液を貯留する貯留室を備え、必要に応じてｐＨ調整液をノズルから滴下できるよう構成されている。なお、本実施形態では、ｐＨ調整手段は、センサチップを収容部に収容した状態で、ｐＨ調整液をセンサチップに注入する構成としたが、ｐＨ調整は、収容部にセンサチップを収容する前の工程で行ってもよく、ｐＨ調整手段がそのように構成されていてもよい。
蛍光検出装置１を用いた本実施形態の蛍光検出方法について説明する。
ここでは、一例として、試料Ｓに含まれる被測定物質として抗原Ａを検出する場合について説明する。
センサチップ１０として、センサチップ１０の金属膜１２上に、抗原Ａと特異的に結合する第１の結合物質として１次抗体Ｂ１が固定層として修飾されているものを用意する。
まず、試料保持部１３中に検査対象である液体試料Ｓを流し、センサチップ１０の金属膜１２上に試料Ｓを接触させる。次いで同様に抗原Ａと特異的に結合する第２の結合物質である２次抗体Ｂ２と蛍光標識Ｆとからなる蛍光標識結合物質（標識２次抗体）ＢＦを含む溶液を流す。この場合、金属膜１２に表面修飾される１次抗体Ｂ１と蛍光標識結合物質ＢＦの２次抗体Ｂ２として、被検出物質である抗原Ａに対して互いに別の部位に結合するものを用いる。なお、ここでは、蛍光標識として、蛍光色素分子ｆを内包する、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）が表面に修飾されてなる蛍光物質Ｆを用いている。カルボキシル基は生理食塩水等のｐＨ7.4近傍の液体試料中においてＣＯＯ−にイオン化し、ｐＨを下げるとプロトン化してＣＯＯＨとなり電気的に中性化する。
試料Ｓ中に抗原Ａが存在すれば、１次抗体Ｂ１に抗原Ａが特異的に結合し、さらに抗原Ａに蛍光標識結合物質ＢＦの２次抗体Ｂ２が結合して、１次抗体Ｂ１−抗原Ａ−２次抗体Ｂ２結合体（以下、サンドイッチ結合体という。）が形成される。
その後、サンドイッチ結合体と、未反応の蛍光標識結合物質ＢＦを分離するため、緩衝液を流し、未反応の蛍光標識結合物質を排除する。
被検出物質（抗原Ａ）への標識のタイミングは特に制限されず、被検出物質（抗原Ａ）を第１の結合物質（１次抗体Ｂ１）に結合させる前に、予め試料に蛍光標識を添加しておいてもよい。
その後、センサチップ１０を収容部１９にセットした状態で、ｐＨ調整手段３５により、試料セル中にｐＨ調整液を分注して液体試料のｐＨを調整する。具体的には、酢酸バッファ溶液を注入することにより、ｐＨを５付近まで、好ましくはｐＨ4.5程度まで下げる。これにより、センサ部上に結合している蛍光標識結合物質ＢＦの蛍光物質Ｆ表面のＣＯＯ−がプロトン化してＣＯＯＨとなり、電気的に中性化して、蛍光物質Ｆがセンサ部１４に引き寄せられる。このように、蛍光物質Ｆをセンサ部１４に引き寄せた状態で、センサチップ１０の誘電体プレート１１の所定領域に向けて励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏを照射する。励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏが誘電体プレート１１と金属膜１２との界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、金属膜上１２の試料Ｓ中にエバネッセント波が滲み出し、このエバネッセント波によって金属膜１２中に表面プラズモンが励起される。励起光の入射により金属層上に生じている光電場（エバネッセント波に起因する電場）が、この表面プラズモンにより増強され、金属層上に光電場増強領域Ｄが形成される。電場増強領域の金属膜表面には、蛍光物質Ｆが引き寄せられており、蛍光物質Ｆが励起されて（実質的にはその蛍光物質中の蛍光色素分子ｆが励起されて）蛍光Ｌｆが発生する。表面プラズモンによる光電場増強の効果により蛍光は増強されたものとなる。光検出器３０によりこの蛍光Ｌｆを検出することにより、蛍光標識結合物質と結合した被検出物質の有無および／または量を検出することができる。
このように、液体試料のｐＨを調整して、蛍光物質の荷電状態（蛍光物質に表面修飾されている官能基の荷電状態）を中性化することにより、蛍光物質をセンサ部に引き寄せた状態で蛍光を検出することにより、安定したＳ／Ｎよい信号を得ることができ、検査の信頼性を向上させることができる。
＜第１の実施形態の設計変更例＞
上述の各実施形態においては励起光Ｌｏとして、界面に所定の角度θで入射する平行光を入射するものとしたが、励起光としては、図３に模式的に示すような、角度θを中心に角度幅Δθを持つファンビーム（集束光）を用いてもよい。ファンビームの場合、プリズム１２２とプリズム上の金属膜１１２との界面に対して、角度θ―Δθ／２〜θ＋Δθ／２の範囲の入射角度で入射することになり、この角度範囲内に共鳴角があれば、金属膜１１２に表面プラズモンを励起することができる。金属膜上への試料供給の前後において、金属膜上の媒質の屈折率が変化し、そのために表面プラズモンが生じる共鳴角が変化する。上述の実施形態のように平行光を励起光として用いる場合、共鳴角が変化するたびに平行光の入射角度を調整する必要がある。しかし、図３に示すような、界面に入射する入射角度に幅を持たせたファンビームを用いることにより、入射角度の調整をすることなく、共鳴角の変化に対応することができる。なお、ファンビームは入射角度による強度変化が少ないフラットな分布を持つものであることがより好ましい。
＜第２の実施形態＞
第２の実施形態である検出方法および装置について図４を参照して説明する。図４は第２の実施形態の検出装置の概略構成を示す全体図である。本実施形態の検出方法および装置は、局在プラズモン共鳴により光電場を増強させ、増強された光電場において励起された蛍光を検出する蛍光検出方法および装置である。なお、以下においては、第１実施形態と同じ構成要素には同じ参照符号を付してある。
図４に示す蛍光検出装置２は、用いられるセンサチップ１０’と、励起光照射光学系２０’とが上述の第１の実施形態の蛍光検出装置１とは異なる。
センサチップ１０’は誘電体プレート１１上に設けられる金属層１２’として、励起光の照射を受けて、所謂局在プラズモンを生じる、表面に励起光Ｌｏの波長よりも小さい凹凸構造を有する金属微細構造体、あるいは、励起光の波長よりも小さいサイズの複数の金属ナノロッドを備えている。このような局在プラズモンを生じさせる金属層１２’を備えた場合には、励起光を金属層１２’と誘電体プレート１１との界面に全反射するように入射させる必要はなく、ここでは、励起光照射光学系２０’は、誘電体プレート上方から励起光Ｌｏを照射するよう構成されている。
励起光照射光学系２０’は、励起光Ｌｏを出力する半導体レーザ（ＬＤ）等からなる光源２１と、励起光Ｌｏを反射してセンサチップ１０’へ導光するハーフミラー２３とを備えている。ハーフミラー２３は、励起光Ｌｏを反射し、蛍光Ｌｆを透過するものである。
センサチップ１０’の具体例を図５Ａ〜図５Ｃに斜視図で示し説明する。
図５Ａに示すセンサチップ１０Ａは、誘電体プレート１１と、該プレート１１の所定領域上にアレイ状に固着された複数の金属粒子７３ａからなる金属微細構造体７３で構成されている。金属粒子７３ａの配列パターンは適宜設計できるが、略規則的であることが好ましい。かかる構成では、金属粒子７３ａの平均的な径及びピッチが励起光Ｌｏの波長よりも小さく設計される。
図５Ｂに示すセンサチップ１０Ｂは、誘電体プレート１１と、該プレートの上の所定領域に設けられた、金属細線７４ａが格子状にパターン形成された金属パターン層からなる金属微細構造体７４で構成されている。金属パターン層のパターンは適宜設計でき、略規則的であることが好ましい。かかる構成では、金属細線７４ａの平均的な線幅及びピッチが励起光Ｌｏの波長よりも小さく設計される。
図５Ｃに示すセンサチップ１０Ｃは特開２００７−１７１００３号公報に記載のような、Ａｌなどの金属７６の陽極酸化の過程で形成される金属酸化物体７７の複数の微細孔７７ａ内に成長させた複数のマッシュルーム状の金属７５ａからなる金属微細構造体７５により構成されている。ここでは金属酸化物体７７が誘電体プレートに相当する。この金属微細構造体７５は、金属体（Ａｌ等）の一部を陽極酸化して金属酸化物体（Ａｌ２Ｏ３等）とし、陽極酸化の過程で形成される金属酸化物体７７の複数の微細孔７７ａ内に各々金属７５ａをメッキ等により成長させて得ることができる。
図５Ｃに示す例では、マッシュルーム状の金属７５ａの頭部が粒子状であり、サンプルプレート表面から見れば、金属微粒子が配列されたような構造になっている。かかる構成では、マッシュルーム状の金属７５ａの頭部が凸部であり、その平均的な径およびピッチが測定光Ｌの波長よりも小さく設計される。
なお、励起光の照射を受けて局在プラズモンを生じる金属層１２’としては、その他、特開２００６−３２２０６７号公報、特開２００６-２５０９２４号公報などに記載の金属体を陽極酸化して得られる微細構造体を利用した種々の形態の金属微細構造体を用いることができる。
さらには、局在プラズモンを生じさせる金属層は、表面が粗面化された金属膜により構成されていてもよい。粗面化方法としては、酸化還元等を利用した電気化学的な方法等が挙げられる。また、金属層を、サンプルプレート上に配置された複数の金属ナノロッドにより構成してもよい。金属ナノロッドのサイズは、短軸長さが３ｎｍ〜５０ｎｍ程度、長軸長さが２５ｎｍ〜１０００ｎｍ程度であり、長軸長さを励起光の波長よりも小さいサイズとする。金属ナノロッドについては、例えば特開２００７-１３９６１２号公報に記載されている。
なお、金属層１２’として用いられる、金属微細構造体あるいは金属ナノロッドとしては、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とするものが好ましい。
蛍光検出装置２を用いた本実施形態の蛍光検出方法について説明する。
センサチップを用意し、抗原―抗体反応をさせ、蛍光物質をセンサ部上に引き寄せる工程は、第１の実施形態と同様であるため、説明を省略する。以下の実施形態において同様とする。
蛍光物質Ｆをセンサ部１４に引き寄せた状態で、センサチップ１０の誘電体プレート１１の所定領域に向けて励起光照射光学系２０’により励起光Ｌｏを照射する。光源２１から出射された励起光Ｌｏはハーフミラー２３により反射されてセンサチップ１０’の試料接触面上に入射される。この励起光Ｌｏの照射により、金属層１２’の表面で局在プラズモンが励起される。励起光の入射により金属層上に生じている光電場（近接場光に起因する電場）が、この局在プラズモンにより増強され、金属層上に光電場増強領域Ｄが形成される。光電場増強領域の金属膜表面には、蛍光物質Ｆが引き寄せられており、蛍光物質Ｆが励起されて（実質的にはその蛍光物質中の蛍光色素分子ｆが励起されて）蛍光Ｌｆが発生する。局在プラズモンによる光電場増強の効果により蛍光は増強されたものとなる。この蛍光Ｌｆを光検出器３０により検出することにより、蛍光標識結合物質と結合した被検出物質の有無および／または量を検出することができる。
本実施形態においても、液体試料のｐＨを調整して、蛍光物質の荷電状態（蛍光物質に表面修飾されている官能基の荷電状態）を中性化することにより、蛍光物質をセンサ部に引き寄せた状態で蛍光を検出するので、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
＜第３の実施形態＞
第３の実施形態の検出方法および装置について図６を参照して説明する。図６は第３の実施形態の検出装置の概略構成を示す全体図である。本実施形態の検出方法および装置は、表面プラズモン共鳴により電場を増強させ、増強された電場において励起された蛍光が金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、誘電体プレートの金属層形成面と反対の面側から放射される、新たに誘起されたプラズモンからの放射光を検出する放射光検出方法および装置である。
図６に示す放射光検出装置３は、第１の実施形態の蛍光検出装置と光検出器の配置が異なる。本放射光検出装置３においては、光検出器３０が、蛍光が金属層に新たに表面プラズモンを誘起することによって誘電体プレートの金属層形成面と反対の面側から放射される、新たに誘起されたプラズモンからの放射光Ｌｐを検出するように配置されている。
放射光検出装置３を用いた本実施形態の放射光検出方法について説明する。
蛍光物質Ｆをセンサ部１４に引き寄せた状態で、第１の実施形態と同様に、励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏを照射する。励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏが誘電体プレート１１と金属膜１２との界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、金属膜上１２の試料Ｓ中にエバネッセント波が滲み出し、このエバネッセント波によって金属膜１２中に表面プラズモンが励起される。励起光の入射により金属層上に生じている光電場（エバネッセント波に起因する電場）が、この表面プラズモンにより増強され、金属層上に光電場増強領域Ｄが形成される。光電場増強領域の金属膜表面には、蛍光物質Ｆが引き寄せられており、蛍光物質Ｆが励起されて（実質的にはその蛍光物質中の蛍光色素分子ｆが励起されて）蛍光Ｌｆが発生する。このとき、表面プラズモンによる光電場増強の効果により蛍光は増強されたものとなる。金属膜１２上で生じたこの蛍光Ｌｆが、金属膜１２に表面プラズモンを新たに誘起し、この表面プラズモンによりセンサチップ１０の金属膜形成面と反対側から特定の角度で放射光Ｌｐが射出される。光検出器３０によって、この放射光Ｌｐを検出することにより、蛍光標識結合物質と結合した被検出物質の有無および／または量を検出することができる。
放射光Ｌｐは蛍光が金属膜の特定の波数の表面プラズモンと結合する際に生じるものであり、蛍光の波長に応じてその結合する波数は定まり、その波数に応じて放射光の出射角度が定まる。通常励起光Ｌｏの波長と蛍光の波長とは異なることから、蛍光により励起される表面プラズモンは、励起光Ｌｏにより生じた表面プラズモンとは異なる波数のものとなり、励起光Ｌｏの入射角度とは異なる角度で放射光Ｌｐは放射される。
本実施形態においても、液体試料のｐＨを調整して、蛍光物質の荷電状態（蛍光物質に表面修飾されている官能基の荷電状態）を中性化することにより、蛍光物質をセンサ部に引き寄せた状態で蛍光を生じさせ、この増強された蛍光に起因する放射光を検出するので、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
さらに、本実施形態では、センサ表面で生じる蛍光に起因する光をセンサ裏面側から検出するので、蛍光Ｌｆが光吸収の大きい溶媒を通過する距離を数十ｎｍ程度と削減することができる。したがって、例えば血液における光吸収をほぼ無視することができ、血液を遠心分離し赤血球などの着色成分を除去したり、血球フィルタを通して血清あるいは血漿状態にしたりするという前処理を行うことなく測定が可能となる。
＜第４の実施形態＞
第４の実施形態の検出方法および装置について図７を参照して説明する。図７は第４の実施形態の検出装置の概略構成を示す全体図である。本実施形態の検出方法および装置は、金属層上に光導波層を備えたセンサチップを用い、励起光の照射により光導波層に光導波モードを励起し、光導波モードにより光電場を増強させ、増強された光電場において励起された蛍光を検出する蛍光検出方法および装置である。
図７に示す蛍光検出装置４の構成は、第１の実施形態の蛍光検出装置の構成と同じであるが、用いられるセンサチップが異なり、このセンサチップの違いにより、光電場増強のメカニズムが異なる。
センサチップ１０”は金属層１２ａ上に光導波層１２ｂを備えている。光導波層１２ｂの層厚は、特に制限されることはなく、光導波モードが誘起されるように、励起光Ｌｏの波長、入射角度および光導波層１２ｂの屈折率等を考慮して定めることができる。例えば、上記と同様に励起光Ｌｏとして７８０ｎｍに中心波長を有するレーザ光を用い、光導波層１２ｂとして１層のシリコン酸化膜からなるものを用いる場合には、５００〜６００ｎｍ程度が好ましい。なお、光導波層１２ｂは、１層以上の誘電体等の光導波材料からなる内部光導波層を含む積層構造であってもよく、この積層構造は、金属層側から順に内部光導波層および内部金属層の交互積層構造であることが好ましい。
蛍光検出装置４を用いた本実施形態の蛍光検出方法について説明する。
蛍光物質Ｆをセンサ部１４に引き寄せた状態で、第１の実施形態と同様に、励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏを照射する。励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏが誘電体プレート１１と金属層１２ａとの界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、金属層１２ａ上にエバネッセント波が滲み出し、このエバネッセント波が光導波層１２ｂの光導波モードと結合し、光導波モードが励起される。励起光の入射により光導波層上に生じている光電場（エバネッセント波に起因する電場）が、この光導波モードにより増強され、光導波層上に光電場増強領域Ｄが形成される。光電場増強領域の金属膜表面には、蛍光物質Ｆが引き寄せられており、蛍光物質Ｆが励起されて（実質的にはその蛍光物質中の蛍光色素分子ｆが励起されて）蛍光Ｌｆが発生する。このとき、光導波モードによる光電場増強の効果により蛍光は増強されたものとなる。光検出器３０によって、この蛍光Ｌｆを検出することにより、蛍光標識結合物質と結合した被検出物質の有無および／または量を検出することができる。
本実施形態においても、液体試料のｐＨを調整して、蛍光物質の荷電状態（蛍光物質に表面修飾されている官能基の荷電状態）を中性化することにより、蛍光物質をセンサ部に引き寄せた状態で蛍光を生じさせ、この増強された蛍光に起因する放射光を検出するので、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
さらに、光導波モードの励起により生じる光増強電場分布は、表面プラズモンにより生じる光増強電場分布と比較して表面からの距離に伴う電場減衰の程度が緩やかであることから、蛍光標識として、複数の蛍光色素分子を内包する径の大きな蛍光物質を用いた場合、表面プラズモンによる光電場増強を用いるよりも大きな蛍光量増加効果を得ることができる。
＜第５の実施形態＞
第５の実施形態の検出方法および装置について図８を参照して説明する。図８は第５の実施形態の検出装置の概略構成示す全体図である。本実施形態の検出方法および装置は、金属層上に光導波層を備えたセンサチップを用い、励起光の照射により光導波層に光導波モードを励起し、光導波モードにより光電場を増強させ、増強された光電場において励起された蛍光が金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、誘電体プレートの金属層形成面と反対の面側から放射される、新たに誘起されたプラズモンからの放射光を検出する放射光検出方法および装置である。
図８に示す本実施形態の放射光検出装置５は、第３の実施形態の放射光検出装置と同様の構成であり、本実施形態の検出方法において用いられるセンサチップは第４の実施形態の蛍光検出方法で用いられるセンサチップと同様である。
放射光検出装置５を用いた本実施形態の蛍光検出方法について説明する。
蛍光物質Ｆをセンサ部１４に引き寄せた状態で、第１の実施形態と同様に、励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏを照射する。励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏが誘電体プレート１１と金属層１２ａとの界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、金属層１２ａ上にエバネッセント波が滲み出し、このエバネッセント波が光導波層１２ｂの光導波モードと結合し、光導波モードが励起される。励起光の入射により光導波層上に生じている光電場（エバネッセント波に起因する電場）が、この光導波モードにより増強され、光導波層上に光電場増強領域Ｄが形成される。光電場増強領域の金属膜表面には、蛍光物質Ｆが引き寄せられており、蛍光物質Ｆが励起されて（実質的にはその蛍光物質中の蛍光色素分子ｆが励起されて）蛍光Ｌｆが発生する。このとき、このとき、光導波モードによる光電場増強の効果により蛍光は増強されたものとなる。光導波層１２ｂ上で生じたこの蛍光Ｌｆが、金属層１２ａに表面プラズモンを新たに誘起し、この表面プラズモンによりセンサチップ１０の金属層形成面と反対側から特定の角度で放射光Ｌｐが射出される。光検出器３０によって、この放射光Ｌｐを検出することにより、蛍光標識Ｆが標識された被検出物質の有無および／または量を検出することができる。
本実施形態においても、液体試料のｐＨを調整して、蛍光物質の荷電状態（蛍光物質に表面修飾されている官能基の荷電状態）を中性化することにより、蛍光物質をセンサ部に引き寄せた状態で蛍光を生じさせ、この増強された蛍光に起因する放射光を検出するので、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
また、本実施形態では、センサ表面で生じる蛍光に起因する光をセンサ裏面側から検出するので、蛍光Ｌｆが光吸収の大きい溶媒を通過する距離を数十ｎｍ程度と削減することができ、第２の実施形態と同様の効果を得ることができる。
さらに、光導波モードの励起による電場増強を用いていることから、第４の実施形態と同様に蛍光量増加効果を得ることができる。
なお、本発明の方法においては、蛍光標識として、図９に示すように、さらに、材料１６の表面に蛍光を透過する厚みの金属皮膜１９が設けられたものを用いてもよい。金属被膜１９は、材料１６の全表面を覆うものであってもよいし、全表面を覆うものでなく、一部表面が露出するように設けられたものであってもよい。金属被膜１９の材料としては、上述の金属層と同様の金属材料を用いることができる。
蛍光物質の表面に金属被膜１９を備えた場合、センサチップ１０、１０’の金属層１２、１２’に発生した表面プラズモンあるいは局在プラズモンが蛍光物質Ｆの金属被膜１９のウィスパリング・ギャラリー・モードにカップリングし、蛍光物質Ｆ内の蛍光色素分子ｆをさらに高効率に励起できる。なお、ウィスパリング・ギャラリー・モードとは、ここで用いられるφ５３００ｎｍ以下程度の蛍光物質のような微小球の球表面に局在し、周回する電磁波モードである。
蛍光物質への金属被膜方法の一例を挙げる。
まず、前述手順により蛍光物質を作製し、その表面にポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（エポミン、日本触媒社）を修飾する。
次に、粒子表面のＰＥＩに粒径１５ｎｍのＰｄナノ粒子(平均粒径１９ｎｍ、徳力本社)を吸着させる。
Ｐｄナノ粒子が吸着したポリスチレン粒子を無電解金メッキ液(ＨＡｕＣｌ４、小島化学薬品社)に浸漬させることで、Ｐｄナノ粒子を触媒とする無電界メッキを利用して、ポリスチレン粒子表面に金膜を作製する。
「検出用試料セル」
本発明の検出方法のセンサチップとして使用される検出用試料セルについて説明する。
＜第１の実施形態の試料セル＞
図１０Ａは、第１の実施形態の試料セル５０の構成を示す平面図、図１０Ｂは試料セル５０の側断面図である。
検出用試料セル５０は、誘電体プレートからなる基台５１と、該基台５１上に液体試料Ｓを保持し、液体試料Ｓの流路５２を形成するスペーサ５３と、試料Ｓを注入する注入口５４ａおよび流路５２を流下した試料を排出する排出口となる空気孔５４ｂを備えたガラス板からなる上板５４とから構成され、流路５２の注入口５４ａと空気孔５４ｂとの間の試料接触面となる基台５１の所定領域上に設けられた金属層５８ａ、５９ａからなるセンサ部５８、５９が備えられている。また、注入口５４ａから流路５２に至る箇所にはメンブレンフィルター５５が備えられ、流路５２下流の空気孔５４ｂに接続する部分には廃液だめ５６が形成されている。
本実施形態においては、基台５１が誘電体プレートから構成され、センサ部の誘電体プレートを兼ねているが、基台としては、センサ部が構成される部分のみ誘電体プレートで構成されたものを用いてもよい。
試料セル５０は、上述した第１〜第５のいずれの実施形態の検出装置および方法において使用することができる。
本検出用試料セル５０は、被検出物質に応じて、該被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質をセンサ部に適宜固定して使用することができる。
さらに、流路内の、センサ部より上流側に、被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質および被検出物質と競合して第１の結合物質と特異的に結合する第３の結合物質のうちのいずれか一方の結合物質とその結合物質および、液体試料中で極性を示す官能基が表面に修飾された蛍光物質とからなる蛍光標識結合物質を適宜固定して使用することができる。
＜第２実施形態の試料セル＞
図１１は、サンドイッチ法によるアッセイに適した第２の実施形態の試料セルの側断面を示すものである。本実施形態の試料セル５０Ａにおいては、基台５１上に流路５２上流側から、被検出物質である抗原と特異的に結合する２次抗体（第２の結合物質）Ｂ２と該２次抗体Ｂ２および液体試料のｐＨにより荷電状態が変化する官能基（例えば、−ＣＯＯＨや−ＮＨ2等、図示せず。）が表面修飾された蛍光物質Ｆとからなる蛍光標識結合物質ＢＦ（以下、「標識２次抗体ＢＦ」という。）が物理吸着させてある標識２次抗体吸着エリア５７、被検出物質である抗原と特異的に結合する１次抗体（第１の結合物質）Ｂ１が固定された第１の測定エリア５８、被検出物質である抗原Ａとは結合せず標識２次抗体ＢＦと特異的に結合する１次抗体Ｂ０が固定された第２の測定エリア５９が順に設けられている。この第１および第２の測定エリア５８，５９がセンサ部に相当する。本例では、センサ部に２つの測定エリアを設けた例を挙げているが、測定エリアは１つのみであってもよい。
基台５１上の第１の測定エリア５８および第２の測定エリア５９にはそれぞれ金属層として、金（Ａｕ）膜５８ａおよび５９ａが形成されている。第１の測定エリア５８のＡｕ膜５８ａ上にはさらに１次抗体Ｂ１が固定され、第２の測定エリア５９のＡｕ膜５９ａ上にはさらに１次抗体Ｂ１とは異なる１次抗体Ｂ０が固定されている。互いに異なる１次抗体が設けられている点以外は第１の測定エリア５８と第２の測定エリア５９は同一の構成である。第２の測定エリア５９に固定されている１次抗体Ｂ０は抗原Ａとは結合せず、２次抗体Ｂ２と直接結合するものである。これにより、流路を流れた標識２次抗体の量、活性など反応に関する変動要因と励起光照射光学系２０、金（Ａｕ）膜５８ａおよび５９ａ、液体試料Ｓなど光電場増強度に関する変動要因を検出し、較正に利用することができる。なお、第２の測定エリアには１次抗体Ｂ０ではなく、既知量の標識物質が予め固定されていてもよい。標識物質は標識２次抗体ＢＦの蛍光物質Ｆと同種のものであってもよいし、波長、サイズの異なる蛍光物質であってもよい。さらには金属微粒子などであってもよい。この場合、励起光照射光学系２０、金膜５８ａ、５９ａ、液体試料Ｓなど光電場増強度に関する変動要因のみを検出し、較正に利用することができる。第２の測定エリア５９に標識２次抗体ＢＦ、あるいは標識２次抗体ＢＦとは異なる既知量の標識物質のどちらを固定するかは、較正目的および方法によって適宜定めればよい。
試料セル５０Ａは、上述した第１〜第５のいずれの実施形態の検出装置および方法においてもセンサチップに代えて同様に使用することができる。試料セル５０は、収容部１９において、励起光照射光学系２０および検出器３０に相対的にＸ方向に移動可能とされており、第１の測定エリア５８からの蛍光もしくは放射光の検出測定の後、第２の測定エリア５９を検出位置に移動させて第２の測定エリア５９からの蛍光もしくは放射光の検出を行うように構成されている。
本発明の検出方法において、本実施形態の検出用試料セル５０Ａを用い、血液（全血）中に被検出物質である抗原を含むか否について、サンドイッチ法によるアッセイを行う手順について図１２を参照して説明する。
ｓｔｅｐ１：注入口５４ａから検査対象である血液（全血）Ｓoを注入する。ここでは、この血液Ｓo中に被検出物質である抗原が含まれている場合について説明する。図１２中において全血Ｓoは網掛け領域で示している。
ｓｔｅｐ２：全血Ｓoはメンブレンフィルター５５により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。
ｓｔｅｐ３：メンブレンフィルター５５で血球分離された血液（血漿）Ｓが毛細管現象で流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔５４ｂにポンプを接続し、メンブレンフィルター５５で血球分離された血液をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図１２中において血漿Ｓは斜線領域で示している。
ｓｔｅｐ４：流路５２に染み出した血漿Ｓと標識２次抗体ＢＦとが混ぜ合わされ、血漿中の抗原Ａが標識２次抗体ＢＦの２次抗体Ｂ２と結合する。
ｓｔｅｐ５：血漿Ｓは流路５２に沿って空気孔５４ｂ側へと徐々に流れ、２次抗体Ｂ2と結合した抗原Ａが、第１の測定エリア５８上に固定されている１次抗体Ｂ１と結合し、抗原Ａが１次抗体Ｂ１と２次抗体Ｂ２（標識２次抗体ＢＦ）で挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。
ｓｔｅｐ６：抗原Ａと結合しなかった標識２次抗体ＢＦの一部は第２の測定エリア５９上に固定されている１次抗体Ｂ０と結合する。さらに抗原Ａまたは１次抗体Ｂ０と結合しなかった標識２次抗体ＢＦが測定エリア上に残っている場合があっても、後続の血漿が洗浄の役割を担い、プレート上に浮遊および非特異吸着していた標識２次抗体を洗い流す。
このように、血液を注入口から注入し、測定エリア５８上に抗原Ａが１次抗体Ｂ１と標識２次抗体ＢFで挟まれたサンドイッチが形成されるまでのｓｔｅｐ１からＳｔｅｐ６の後、注入口からｐＨ調整液を注入して試料セル中の溶液を蛍光物質に表面修飾されている官能基が中性化するｐＨとすることにより、蛍光物質をセンサ部に引き寄せ、蛍光物質をセンサ部に引き寄せた状態で、第１の測定エリア５８からの蛍光もしくは放射光強度（以下、「信号」という。）を検出する。その後、第２の測定エリア５９からの信号を検出できるように試料セル５０をＸ方向に移動させ、第２の測定エリア５９からの信号を検出する。標識２次抗体ＢＦと結合する１次抗体Ｂ０を固定している第２の測定エリア５９からの信号は標識２次抗体の流下した量、活性などの反応条件を反映した信号であると考えられ、この信号をリファレンスとして、第１の測定エリアからの信号を補正することにより、より精度の高い検出結果（抗原の有無および／またはその濃度）を得ることができる。また、既述の通り、第２の測定エリア５９に既知量の標識物質（蛍光物質、金属微粒子）をあらかじめ固定した場合であっても、同様に、第２の測定エリア５９からの信号をリファレンスとして第１の測定エリアからの信号を補正することができる。
＜第３実施形態の試料セル＞
図１３は、競合法によるアッセイに適した第３の実施形態の試料セルの側断面を示すものである。本実施形態の試料セル５０Ｂにおいては、基台５１上には流路５２上流側から、被検出物質である抗原Ａとは結合せず、後述の１次抗体と特異的に結合する２次抗体Ｃ３（第３の結合物質）と該２次抗体Ｃ３および液体試料のｐＨにより荷電状態が変化する官能基（例えば、−ＣＯＯＨや−ＮＨ2等、図示せず。）が表面修飾された蛍光物質Ｆとからなる蛍光標識結合物質ＣＦ（以下、「標識２次抗体ＣＦ」という。）を物理吸着させてある標識２次抗体吸着エリア５７’、被検出物質である抗原Ａおよび２次抗体Ｃ３と特異的に結合する１次抗体Ｃ１（第１の結合物質）が固定された第１の測定エリア５８’、被検出物質である抗原Ａとは結合せず標識２次抗体ＣＦの２次抗体Ｃ３と特異的に結合する１次抗体Ｃ０が固定された第２の測定エリア５９’が順に設けられている。
基台５１上の第１の測定エリア５８および第２の測定エリア５９にはそれぞれ金属層として、金（Ａｕ）膜５８ａおよび５９ａが形成されている。第１の測定エリア５８’のＡｕ膜５８ａ上にさらに１次抗体Ｃ１が固定され、第２の測定エリア５９’のＡｕ膜５９ａ上にさらに１次抗体Ｃ１とは異なる１次抗体Ｃ０が固定されている。互いに異なる１次抗体が設けられている点以外は第１の測定エリア５８’と第２の測定エリア５９’は同一の構成である。抗原Ａと２次抗体Ｃ３とは、第１の測定エリア５８’に固定されている１次抗体Ｃ１に競合的に結合するものである。第２の測定エリア５９’に固定されている１次抗体Ｃ０は抗原Ａとは結合せず、２次抗体Ｃ３と直接結合するものである。これにより、流路を流れた標識２次抗体の量、活性など反応に関する変動要因と励起光照射光学２０、金（Ａｕ）膜５８ａおよび５９ａ、液体試料Ｓなど光電場増強度に関する変動要因を検出し、較正に利用することができる。なお、第２の測定エリアには１次抗体Ｃ０ではなく、既知量の標識物質が予め固定されていてもよい。標識物質は標識２次抗体ＣＦの蛍光物質Ｆと同種のものであってもよいし、波長、サイズの異なる蛍光物質であってもよい。さらには金属微粒子などであってもよい。この場合、励起光照射光学系２０、金（Ａｕ）膜５８ａおよび５９ａ、液体試料Ｓなど光電場増強度に関する変動要因のみを検出し、較正に利用することができる。第２の測定エリア５９に標識２次抗体ＣF、あるいは標識２次抗体ＣＦとは異なる既知量の標識物質のどちらを固定するかは較正目的および方法によって適宜定めればよい。
試料セル５０Ｂは、既述の試料セル５０Ａと同様に、上述した第１〜第５のいずれの実施形態の検出装置および方法においてセンサチップに代えて同様に使用することができる。
本発明の検出方法において、本実施形態の検出用試料セル５０Ｂを用い、血液（全血）中に被検出物質である抗原を含むか否について、サンドイッチ法によるアッセイを行う手順について図１４を参照して説明する。
ｓｔｅｐ１：注入口５４ａから検査対象である血液（全血）Ｓoを注入する。ここでは、この血液Ｓｏ中に被検出物質である抗原が含まれている場合について説明する。図１４中において全血Ｓoは網掛け領域で示している。
ｓｔｅｐ２：全血Ｓoはメンブレンフィルター５５により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。
ｓｔｅｐ３：メンブレンフィルター５５で血球分離された血液（血漿）Ｓが毛細管現象で流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔５４ｂにポンプを接続し、メンブレンフィルター５５で血球分離された血液をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図１４中において血漿Ｓは斜線領域で示している。
ｓｔｅｐ４：流路５２に染み出した血漿Ｓと標識２次抗体ＣＦとが混ぜ合わされる。
ｓｔｅｐ５：血漿Ｓは流路５２に沿って空気孔５４ｂ側へと徐々に流れ、抗原Ａと標識２次抗体ＣＦの２次抗体Ｃ3とが競合して、第１の測定エリア５８’上に固定されている１次抗体Ｃ１と結合する。
ｓｔｅｐ６：第１の測定エリア５８’上の１次抗体Ｃ１と結合しなかった標識２次抗体ＣＦの一部は、第２の測定エリア５９’上に固定されている１次抗体Ｃ０と結合する。さらに１次抗体Ｃ１またはＣ０と結合していない標識２次抗体ＣＦが測定エリア上に残っている場合があっても、後続の血漿が洗浄の役割を担い、プレート上に浮遊および非特異吸着していた標識２次抗体ＣＦを洗い流す。
このように、血液を注入口から注入し、測定エリア５８’上の１次抗体Ｃ１に抗原Ａおよび２次抗体Ｃ３が競合結合するまでのｓｔｅｐ１からＳｔｅｐ６の後、注入口からｐＨ調整液を注入して試料セル中の溶液を蛍光物質に表面修飾されている官能基が中性化するｐＨとすることにより、蛍光物質をセンサ部に引き寄せ、蛍光物質をセンサ部に引き寄せた状態で、第１の測定エリア５８’および第２の測定エリア５９’からの蛍光もしくは放射光強度などの信号を検出する。その後、第２の測定エリア５９からの信号を検出できるように試料セル５０をＸ方向に移動させ、第２の測定エリア５９からの信号を検出し、この信号をリファレンスとして、第１の測定エリアからの信号を補正することにより、より精度の高い検出結果（抗原の有無および／またはその濃度）を得ることができる。
競合法においては、被検出物質Ａの濃度が高ければ、第１の結合物質Ｃ１と結合する第３の結合物質Ｃ３の量が少なく、すなわち金属層上の蛍光物質Ｆの数が少なくなるため蛍光強度が小さくなり、一方、被検出物質Ａの濃度が低ければ、第１の結合物質Ｃ１と結合する第３の結合物質Ｃ３の量が多く、すなわち金属膜上の蛍光物質Ｆの数が多くなるため蛍光強度が大きくなる。競合法は被検出物質にエピトープが一つあれば測定が可能であることから、低分子量の物質の検出に適している。
＜第４実施形態の試料セル＞
図１５は、第４の実施形態の試料セル７０の構成を示す平面図である。
検出用試料セル７０は、誘電体プレートからなる図示しない基台と、該基台上に液体試料Ｓを保持し、液体試料Ｓの流路７２および該流路から分岐した枝路８０を形成するスペーサと、試料Ｓを注入する注入口７４ａ、流路７２を流下した試料を排出する排出口となる空気孔７４ｂ、および枝路８０にｐＨ調整液を注入するためのｐＨ調整液注入口７９を備えたガラス板からなる上板とから構成され、流路７２の注入口７４ａと空気孔７４ｂとの間の試料接触面となる基台の所定領域上に設けられた金属層からなるセンサ部７８が備えられている。また、注入口７４ａから流路７２に至る箇所にはメンブレンフィルターが備えられ、流路７２下流の空気孔７４ｂに接続する部分には廃液だめ７６が形成されている。また、流路７２と枝路８０の分岐部分には切り替えバルブ８１が設けられており、試料とｐＨ調整液とのセンサ部７８に送液する順序を制御可能となっている。また、センサ部下流側にもバルブ８２が設けられており、センサ部に蛍光標識結合物質を結合させる（抗原―抗体反応をさせる）際に一旦試料液をセンサ部に溜めるためにバルブを閉じ、センサ部への蛍光標識結合物質の結合反応の後、未反応の蛍光標識結合物質を洗い流す際、及びｐＨ調整液によりセンサ部上に溶液のｐＨを調整する際などには、バルブを開き、試料液を廃液だめ７６へと流下可能に構成されている。
このようにｐＨ調整液を注入するための注入口７９および枝路８０、送液の順序や流量を調整するためのバルブ８１、８２を備えたセンサチップを用いればセンサ部上の液体試料のｐＨの調整を簡便に行うことができる。
試料セル７０は、上述した第１〜第５のいずれの実施形態の検出装置および方法においても使用することができる。
本検出用試料セル７０は、被検出物質に応じて、該被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質をセンサ部に適宜固定して使用することができる。
さらに、流路内の、センサ部より上流側に、具体的には、本試料セル７０は流路８１の、注入口７４ａからセンサ部７８に至る箇所に、標識２次抗体吸着エリア７５を備え、被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質および被検出物質と競合して第１の結合物質と特異的に結合する第３の結合物質のうちのいずれか一方の結合物質とその結合物質および、液体試料中で極性を示す官能基が表面に修飾された蛍光物質とからなる蛍光標識結合物質を適宜固定して使用することができる。
（試料セルの設計変更例）
光導波モードによる光電場増強を利用する検出方法および装置に用いる試料セルの断面図を図１６に示す。図１０Ａおよび図１０Ｂに示した第１の実施形態の試料セルの構成と略同一であるが、センサ部の金属層５８ａ、５９ａ上にさらに光導波層５８ｂ、５９ｂを備えている。
この試料セルも適宜、センサ部に第１の結合物質を、センサ部上流側に蛍光標識結合物質を固定し使用することができる。
「検出用キット」
本発明の検出方法に使用される検出用キットについて説明する。
図１６は蛍光検出用キット６０の構成を示す模式図である。
検出用キット６０は、試料セル６１と、蛍光検出測定を行うにあたり、液体試料と同時もしくは液体試料の流下後に、試料セル６１の流路内に流下される、抗原Ａと特異的に結合する２次抗体（第２の結合物質）Ｂ２と、該２次抗体Ｂ２および液体試料のｐＨにより荷電状態が変化する官能基（例えば、−ＣＯＯＨや−ＮＨ2等、図示せず。）が表面修飾された蛍光物質Ｆとからなる蛍光標識結合物質ＢＦ（以下、「標識２次抗体ＢＦ」という。）を含む標識用溶液６３とを備えている。
試料セル６１は、試料セル内に、蛍光標識結合物質ＢＦを物理吸着した物理吸着エリアを備えていない点でのみ上述の第２の実施形態の試料セル５０Ａと異なり、その他は試料セル５０Ａと略同一の構成である。
本発明の検出方法において、本実施形態の検出用キット６０を用い、血液（全血）中に被検出物質である抗原を含むか否について、サンドイッチ法によるアッセイを行う手順について図１７を参照して説明する。
ｓｔｅｐ１：注入口５４ａから検査対象である血液（全血）Ｓoを注入する。ここでは、この血液Ｓo中に被検出物質である抗原が含まれている場合について説明する。図１７中において全血Ｓoは網掛け領域で示している。
ｓｔｅｐ２：全血Ｓoはメンブレンフィルター５５により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。引き続き、メンブレンフィルター５５で血球分離された血液（血漿）Ｓが毛細管現象で流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔にポンプを接続し、メンブレンフィルター５５で血球分離された血液をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図１７中において血漿Ｓは斜線領域で示している。
ｓｔｅｐ３：血漿Ｓは流路５２に沿って空気孔５４ｂ側へと徐々に流れ、血漿Ｓ中の抗原Ａが、第１の測定エリア５８上に固定されている１次抗体Ｂ１と結合する。
ｓｔｅｐ４：標識２次抗体ＢＦを含む標識用溶液６３を供給口５４ａから注入する。
ｓｔｅｐ５：標識２次抗体ＢＦが毛細管現象により流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔にポンプを接続し、メンブレンフィルター５５で血球分離された血液をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。
ｓｔｅｐ６：標識２次抗体ＢＦは徐々に下流側に流れ、該標識２次抗体ＢＦの２次抗体Ｂ２が抗原Ａと結合し、抗原Ａが１次抗体Ｂ１と２次抗体Ｂ２で挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。抗原Ａと結合しなかった２次抗体Ｂ２の一部は第２の測定エリア５９上に固定されている１次抗体Ｂ０と結合する。さらに抗原Ａまたは１次抗体Ｂ０と結合しなかった標識２次抗体ＢＦが測定エリア上に残っている場合があっても、後続の血漿が洗浄の役割を担い、プレート上に浮遊および非特異吸着していた標識２次抗体ＢＦを洗い流す。
このように、血液を注入口から注入し、抗原が１次抗体および２次抗体と結合するまでのｓｔｅｐ１からＳｔｅｐ６の後、検出装置において、注入口からｐＨ調整液を注入して試料セル中の溶液を蛍光物質に表面修飾されている官能基が中性化するｐＨとすることにより、蛍光物質をセンサ部に引き寄せ、蛍光物質をセンサ部に引き寄せた状態で、第１の測定エリア５８からの信号を検出する。その後、第２の測定エリア５９からの信号を検出できるように試料セル６１をＸ方向に移動させ、同様に、センサ部上に蛍光標識結合物質を引き寄せ、第２の測定エリア５９からの信号を検出する。標識２次抗体ＢＦの２次抗体Ｂ２と結合する１次抗体Ｂ０を固定している第２の測定エリア５９からの信号は標識２次抗体の流下した量、活性などの反応条件を反映した信号であると考えられ、この信号をリファレンスとして、第１の測定エリアからの信号を補正することにより、より精度の高い検出結果（抗原の有無および／またはその濃度）を得ることができる。また、第２の測定エリア５９に既知量の標識物質（蛍光物質、金属微粒子）をあらかじめ固定しておき、第２の測定エリア５９からの蛍光信号をリファレンスとして第１の測定エリアからの信号を補正してもよい。
蛍光物質への２次抗体修飾方法および標識用溶液の作製方法の一例を説明する。
前述の手順で作製した蛍光物質溶液（蛍光物質の直径５００ｎｍ、励起波長７８０ｎｍ)に５０ｍＭ ＭＥＳバッファーおよび、５．０ｍｇ／ｍＬの抗ｈＣＧモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ ５００８ ＳＰ−５、Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社）溶液を加えて撹拌する。これにより蛍光物質への抗体の修飾がなされる。
次に、４００ｍｇ／ｍＬのＷＳＣ（品番０１−６２−００１１、和光純薬）水溶液を加え室温で攪拌する。
さらに、２ｍｏｌ／Ｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ水溶液を添加し撹拌した後、遠心分離にて、粒子を沈降させる。
最後に、上清を取り除き、ＰＢＳ(ｐＨ７．４)を加え、超音波洗浄機により、表面修飾された蛍光物質を再分散させる。さらに遠心分離を行い、上清を除いた後、１％ＢＳＡのＰＢＳ(ｐＨ７．４)溶液５００μＬ加え、表面修飾された蛍光物質を再分散させて標識用溶液とする。
（検査用キットの設計変更例）
光導波モードによる光電場増強を利用する検出方法および装置に用いる試料セルとしては、図１５に示す、センサ部の金属層５８ａ、５９ａ上にさらに光導波層５８ｂ、５９ｂを備え試料セルの光導波層５８ｂ、５９ｂ上に、それぞれ１次抗体Ｂ１、１次抗体Ｂ１とは異なる１次抗体Ｂ０を固定したものを用いればよい。
また、さらに、競合法によるアッセイを行う場合には、試料セルとして、１次抗体Ｂ１、１次抗体Ｂ２に代えて、被検出物質である抗原Ａおよび２次抗体Ｃ３と特異的に結合する１次抗体Ｃ１（第１の結合物質）、被検出物質である抗原Ａとは結合せず２次抗体Ｃ３と特異的に結合する１次抗体Ｃ０をセンサ部上に固定したものを用い、標識用溶液として、被検出物質である抗原Ａとは結合せず、後述の１次抗体と特異的に結合する２次抗体Ｃ３（第３の結合物質）と該２次抗体Ｃ３および液体試料のｐＨにより荷電状態が変化する官能基が表面修飾された蛍光物質とからなる蛍光標識結合物質ＣＦを含むものを用いればよい。
生理食塩水（ＮａＣｌ、150ｍＭ（mmol/L)含有、ｐＨ７．４）中に、抗ｈＣＧモノクロナール抗体からなる２次抗体とカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）とが表面修飾された蛍光物質からなる標識２次抗体、および被検出物質としてｈＣＧを含む試料液を用意し、センサ部の金属膜上に抗体が認識する抗原の部位（エピトープ）が２次抗体とは異なる抗ｈＣＧモノクロナール抗体からなる１次抗体が固定層として固定されてなる試料セルを用意した。
試料セルに試料液を流し、抗原―抗体反応により、固定層にサンドイッチ結合体を形成させ、緩衝液により未反応の標識２次抗体を洗い流した。ここまでの工程はすべての試料セルについて共通とした。
その後、ｐＨ調整液を注入して試料セル中の試料液のｐＨを調整した。具体的には、ｐＨ3.0に調整するためには、10ｍＭ（m mol/L)のグリシン−塩酸緩衝液（10 mM glycine-HCl）を用い、ｐＨ4.5、5.0、5.5に調整するためには、10ｍＭ酢酸緩衝液（10 mM sodium acetate）を用い、ｐＨ8.5に調整するためには、10ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（10 mM disodium tetraborate）を用い、ｐＨ10.0に調整するためには、１Ｍ塩化ナトリウム-50ｍＭ水酸化ナトリウム緩衝液（1M NaCl 50mM NaOH）を用いた。
ｐＨ３．５からｐＨ１０の異なる１０のｐＨ毎に６個の試料セルについて蛍光信号量の測定を行った。測定結果として得られた、信号強度のバッファｐＨ依存性を図１９に示す。なお、図１９においては、蛍光信号量はｐＨ7.4の値で規格化している。
図１９に示すように、蛍光信号量は、バッファのｐＨが４．５のとき、ｐＨ７．４の時の蛍光信号量と比較して１．２倍以上となり、またエラーバーで示される、信号のバラツキも半分以下と小さくなるという結果が得られた。
上述の実施例のものと同様の表面修飾がなされた蛍光物質を含む、上記実施例の測定ポイントとなる各ｐＨ値の溶液中における、蛍光物質の表面電位（ゼータ（ζ）電位）をゼータ電位計（シスメックス株式会社製 ゼータサイザーナノ（商品名））により測定した。図１９のグラフ中に、蛍光信号測定を行った各ｐＨにおける蛍光物質のζ電位を併せて示した。
図１９に示すように、ＣＯＯＨが表面修飾された蛍光物質は、バッファｐＨが４に近づくにつれて電荷が小さくなっており、また、ｐＨが８に近づくにつれ電荷が大きくなっていることが確認できた。
図１９に示す、蛍光信号量および蛍光物質の表面電位のｐＨ依存性から、蛍光物質表面の電荷が小さいほど蛍光信号量が大きくなり、信号が大きいほど信号のばらつきも小さくなることが明らかである。このように、ｐＨを調整することにより、蛍光信号の増加および信号ばらつきの抑制効果が得られることが確認できた。
なお、電荷が小さいほど（電気的に中性であるほど）蛍光物質の親水性が低くなり疎水的になり、よりセンサ表面に蛍光物質が近づく（センサ表面に引き寄せられる）ために蛍光信号が増加し、かつ信号のばらつきが小さくなるものと考えられる。また、バッファのｐＨが４を過ぎると蛍光信号が急激に低下するのは、酸性が強すぎ、抗原―抗体反応の結合力が低下し、結合が解消されてしまっていると考えられる。
本発明の第１実施形態による蛍光検出装置を示す概略構成図 液体試料のｐＨ、蛍光物質の表面電荷および液体試料中における蛍光物質の分散性について説明するための模式図 励起光照射光学系の設計変更例を示す図 本発明の第２実施形態による蛍光検出装置を示す概略構成図 蛍光検出装置２に用いられるセンサチップのセンサ部を示す概略構成図（その１） 蛍光検出装置２に用いられるセンサチップのセンサ部を示す概略構成図（その２） 蛍光検出装置２に用いられるセンサチップのセンサ部を示す概略構成図（その３） 本発明の第３実施形態による検出装置を示す概略構成図 本発明の第４実施形態による検出装置を示す概略構成図 本発明の第５実施形態による検出装置を示す概略構成図 金属被膜を有する蛍光物質を示す模式図 本発明の第１の実施形態の試料セルを示す平面図 本発明の第１の実施形態の試料セルを示す側断面図 本発明の第２の実施形態の試料セルを示す側断面図 第２の実施形態の試料セルを用いたサンドイッチ法によるアッセイ手順を示す図 本発明の第３の実施形態の試料セルを示す側断面図 第３の実施形態の試料セルを用いた競合法によるアッセイ手順を示す図 第４の実施形態の試料セルを示す平面図 試料セルの設計変更例を示す側断面図 本発明の１実施形態の蛍光検出用キットの構成を示す模式図 蛍光検出用キットを用いたサンドイッチ法によるアッセイ手順を示す図 蛍光信号量のバッファｐＨ依存性を示すグラフ 従来例を示す図
符号の説明
１、２、３、４、５ 検出装置
１０、１０’、１０” センサチップ
１１ 誘電体プレート
１２ 金属層（金属膜）
１２’ 金属層（金属微細構造体）
１４ センサ部
１６ 材料
１９ 金属被膜
２０、２０’ 励起光照射光学系
２１ 光源
２２ プリズム
３０ 光検出器
３５ ｐＨ調整手段
５０、５０Ａ、５０Ｂ、６１、７０ 試料セル
５１ 誘電体プレート
５２ 流路
５３ スペーサ
５４ 上板
５７ 標識２次抗体吸着エリア
５８、５９ 検出エリア
６０ 検出用キット
６３ 検出用標識溶液
Ａ 抗原（被検出物質）
Ｂ１、Ｃ１ １次抗体（第１の結合物質）
Ｂ２ ２次抗体（第２の結合物質）
ＢＦ、ＣＦ 標識２次抗体（蛍光標識結合物質）
Ｃ３ ２次抗体（第３の結合物質）
Ｆ 蛍光物質
ｆ 蛍光色素分子
Ｌｏ 励起光
Ｌｆ 蛍光
Ｌｐ 放射光

Claims (14)

  1. 誘電体プレートと、該プレートの一面に設けられた少なくとも金属層からなるセンサ部とからなるセンサチップを用意し、
    前記センサ部に液体試料を接触させることにより、該センサ部上に、該液体試料中の被検出物質の量に応じた量の蛍光標識結合物質を結合させ、
    前記センサ部に励起光を照射することにより、該センサ部上に増強した光電場を生じさせ、該増強した光電場内において前記蛍光標識結合物質の蛍光標識を励起し、該蛍光標識の励起に起因して生じる光の量に基づいて、前記被検出物質の量を検出する検出方法において、
    前記蛍光標識として、複数の蛍光色素分子を、該蛍光色素分子からの蛍光を透過する材料により包含してなる、前記液体試料中において該液体試料のｐＨに応じて荷電状態が変化する蛍光物質を用い、
    前記センサ部に前記蛍光標識結合物質を結合させた状態で、前記液体試料のｐＨを調整して、前記蛍光物質の荷電状態を中性化することにより、該蛍光物質を前記センサ部表面に引き寄せ、
    該蛍光物質を引き寄せた状態で、前記被検出物質の量を検出することを特徴とする検出方法。
  2. 前記蛍光物質の粒径が３０ｎｍ以上であることを特徴とする請求項１記載の検出方法。
  3. 前記蛍光物質として、前記液体試料のｐＨに応じて荷電状態が変化する官能基が表面修飾された蛍光物質を用い、
    前記該センサ部に、前記蛍光標識結合物質を結合させる際、前記液体試料を前記官能基がイオン化するｐＨとし、
    前記蛍光標識結合物質を結合させた後、前記液体試料を前記官能基が中性化するｐＨに調整することにより、前記蛍光物質を前記センサ部表面に引き寄せることを特徴とする請求項１または２記載の検出方法。
  4. 前記励起光の照射により前記金属層にプラズモンを励起し、該プラズモンにより前記増強した光電場を生じさせ、
    前記蛍光標識の励起に起因して生じる前記光として、該励起によって該蛍光標識から生じる蛍光を検出することにより前記被検出物質の量を検出することを特徴とする請求項１から３いずれか１項記載の検出方法。
  5. 前記励起光の照射により前記金属層にプラズモンを励起し、該プラズモンにより前記増強した光電場を生じさせ、
    前記蛍光標識の励起に起因して生じる前記光として、該励起によって該蛍光標識から生じる蛍光が前記金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、前記誘電体プレートの前記他面から放射される放射光を検出することにより前記被検出物質の量を検出することを特徴とする請求項１から３いずれか１項記載の検出方法。
  6. 前記センサチップとして、前記金属層上に光導波層を備えたものを用い、
    前記励起光の照射により前記光導波層に光導波モードを励起し、該光導波モードにより前記増強した光電場を生じさせ、
    前記蛍光標識の励起に起因して生じる前記光として、該励起によって該蛍光標識から生じる蛍光を検出することにより前記被検出物質の量を検出することを特徴とする請求項１から３いずれか１項記載の検出方法。
  7. 前記センサチップとして、前記金属層上に光導波層を備えたものを用い、
    前記励起光の照射により前記光導波層に光導波モードを励起し、該光導波モードにより前記増強した光電場を生じさせ、
    前記蛍光標識の励起に起因して生じる前記光として、該励起によって該蛍光標識から生じる蛍光が前記金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、前記誘電体プレートの前記他面から放射される放射光を検出することにより前記被検出物質の量を検出することを特徴とする請求項１から３いずれか１項記載の検出方法。
  8. 請求項１から７いずれか１項に記載の検出方法に用いられる検出装置であって、
    前記センサチップを収容する収容部と、
    前記センサ部に前記励起光を照射する励起光照射光学系と、
    該励起光の照射により該センサ部上に生じた前記増強した光電場における、前記蛍光標識の励起に起因して生じる光を検出する光検出手段と、
    前記センサチップに、ｐＨ調整液を注入して前記液体試料のｐＨを調整するｐＨ調整手段とを備えたことを特徴とする検出装置。
  9. 請求項１から７いずれか１項に記載の検出方法において使用される検出用試料セルであって、
    液体試料が流下される流路を有する基台と、
    前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、
    前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、
    前記流路の、前記注入口と前記空気孔との間に設けられたセンサチップ部であって、前記流路の内壁面の少なくとも一部に設けられた誘電体プレートと、該プレートの試料接触面に設けられた少なくとも金属層を含むセンサ部とからなるセンサチップ部とを備えてなることを特徴とする検出用試料セル。
  10. 前記センサ部に、前記蛍光標識結合物質と結合する固定層を備えていることを特徴とする請求項９記載の検出用試料セル。
  11. 複数の蛍光色素分子を、該蛍光色素分子からの蛍光を透過する材料により包含してなる、前記液体試料中において該液体試料のｐＨに応じて荷電状態が変化する蛍光物質を、前記蛍光標識として含む前記蛍光標識結合物質が、前記流路内の、前記センサ部より上流側に固定されていることを特徴とする請求１０記載の検出用試料セル。
  12. 前記センサ部において、前記金属層上に光導波層が備えられていることを特徴とする請求項９から１１いずれか１項記載の検出用試料セル。
  13. 請求項１から７のいずれか１項に記載の検出方法に使用される検出用キットであって、
    液体試料が流下される流路を有する基台と、前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、前記流路の、前記注入口と前記空気孔との間に設けられたセンサチップ部であって、前記流路の内壁面の少なくとも一部に設けられた誘電体プレートと、該プレートの試料接触面に設けられた少なくとも金属層を含むセンサ部とからなるセンサチップ部と、該センサ部上に固定された、前記蛍光標識結合物質と結合する固定層とを備えた試料セル、および
    前記液体試料と同時もしくは前記液体試料の流下後に、前記流路内に流下される、複数の蛍光色素分子を、該蛍光色素分子からの蛍光を透過する材料により包含してなる、前記液体試料中において該液体試料のｐＨに応じて荷電状態が変化する蛍光物質を、前記蛍光標識として含む前記蛍光標識結合物質を含んだ標識用溶液を備えてなることを特徴とする検出用キット。
  14. 前記センサ部において、前記金属層上に光導波層が備えられていることを特徴とする請求項１２記載の検出用キット。
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