JP2010015581A - 定向進化のための交叉点の最適化 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】組換えポリペプチド、および/または、核酸の中へより効率的に多様性を設計するための方法と装置を提供する。例えば、アミノ酸配列、またはヌクレオチド配列中の潜在的交叉部位を選択、および/または、評価する様々な方法、ならびに得られたキメラ産物配列を提供する。これらの方法には、例えば、組換えに用いるための配列および交叉部位の選択および評価における、構造的、機能的、および/または、統計的なデータの考慮が含まれる。
【選択図】図1A
Description
この出願は、米国特許出願第60/363,505号(2002年3月9日出願)および米国特許出願第60/373,591号(2002年4月18日出願)の米国特許法第119条(e)にもとづく利益を求めるもので、これらの出願の全体を本明細書中で援用する。
連邦法施行規則第37巻(37 C.F.R)第1.71条(e)に従い、出願人は、この開示の一部が著作権保護の対象となる材料を含むことを指摘する。著作権の所有者は、特許商標庁のファイルに開示または記録されるとおりに第三者による特許書類または特許開示の複製に対しては、なんら反対するものではないが、そうでなければいかなるものであっても著作権のすべてを留保する。
生体分子の新規の機能または改善された機能の探索は、取り組みし甲斐のある試みである。例えば、所望の特性を現すタンパク質の作製および同定を目的として、改変体タンパク質のライブラリーを生成する方法およびスクリーニングする方法が開発されている(例えば、Stemmer,W.P.(1994)「Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling」Nature 370:389−391を参照せよ)。いくつかの方法では、ほとんど機能性分子を含まないライブラリーが生成される(例えば、Ostermeier(1999)「A combinatorial approach to hybrid enzymes independent of DNA homology」Nature Biotech 17:1205を参照せよ)。スクリーニング能力の限界は、そのような機能性分子の発見を困難なものにする。したがって、機能性生体分子が強化された生体分子ライブラリーを作製する方法の存在が求められている。
本発明は、組換えポリペプチドおよび/または核酸の中に多様性をより効率的に操作するための方法およびデバイスを提供する。例えば、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列での潜在的な組換え交叉部位を選択および/または評価するための種々の方法を提供するとともに、結果として生ずるキメラ産物配列を提供する。これらの方法として、例えば組換えで使用される配列および交叉部位の選択および評価で構造的、機能的、および/または統計学的データを考慮することが挙げられる。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
基準ペプチド配列上の複数の潜在的交叉点の適応度を決定する方法であって、該方法は、以下:
(a)該基準ペプチド配列上の該複数の潜在的交叉点の各々について、検討中の潜在的交叉点を有する複数のキメラの適応度パラメータの複数の個別の値から該適応度パラメータの全体的な値を計算する工程;および
(b)該潜在的交叉点についての該適応度パラメータのそれぞれの該全体的な値に基づき、該基準ペプチド配列の部分的な配列を含むキメラ・ペプチドのための実際の交叉点を選択する工程、
を包含する、方法。
(項目2)
前記交叉点が前記基準ペプチド配列の中間点であり、かつ、前記キメラ・ペプチドは、前記交叉点で終了する前記基準配列の部分的な配列を含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記キメラ・ペプチドをコードする、少なくとも1つのキメラ核酸を産生する工程をさらに包含する、項目1に記載の方法。
(項目4)
少なくとも1つのキメラ核酸の産生が、前記選択された交叉点をコードする少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを組換える工程を包含する、項目3に記載の方法。
(項目5)
前記選択された交叉点をコードする前記少なくとも1つのオリゴヌクレオチドが2つの部分的な配列を含み、1つの部分的な配列が1つの親ペプチドの部分的な配列をコードし、かつ別の部分的な配列が別の親ペプチドの部分的な配列をコードし、該2つの部分的な配列が該選択された交叉に対応する該オリゴヌクレオチド中のある位置で合同する、項目4に記載の方法。
(項目6)
前記親ペプチドの1つが、前記基準ペプチド配列を含む配列を有する、項目5に記載の方法。
(項目7)
他方の親ペプチドが、前記基準ペプチド配列をコードする遺伝子を含む遺伝子ファミリー由来の核酸によってコードされる、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記適応度パラメータが、ペプチドの結合特性を増強するか、または低減させるキメラ対立遺伝子の能力の尺度を含む、項目1に記載の方法。
(項目9)
前記適応度パラメータが、ポリペプチドの折り畳みを保存するかまたは改善する、キメラ対立遺伝子の能力の尺度を含む、項目1に記載の方法。
(項目10)
前記検討中の潜在的交叉点を有するキメラ配列について、前記適応度パラメータの個別の値を計算する工程をさらに包含する、項目1に記載の方法。
(項目11)
前記適応度パラメータの前記個別の値を計算する、項目10に記載の方法であって、該方法は、以下:
(i)前記キメラ配列を前記基準ペプチド配列に整列させる工程;
(ii)接触マップから前記キメラの接触残基を同定する工程;および
(iii)前記キメラの接触残基について、残基間ポテンシャルを合計する工程、
を包含する、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記接触マップが、前記基準ペプチド中の残基の立体配置である、項目11に記載の方法。
(項目13)
前記基準ペプチド配列が、天然に存在するペプチドの配列である、項目1に記載の方法。
(項目14)
前記基準ペプチド配列が、組換えまたは突然変異誘発手順により同定された非天然ペプチドの配列である、項目1に記載の方法。
(項目15)
(b)が、前記基準ペプチド配列の部分的な配列を含む複数のキメラ・ペプチドのための複数の交叉点を選択する工程を包含する、項目1に記載の方法。
(項目16)
前記複数のキメラ・ペプチドを含むペプチドのライブラリーを産生する工程をさらに包含する、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記ライブラリーの1つ以上のペプチドが、1つ以上のペプチドを発現する工程を包含する方法によって産生される、項目16に記載の方法。
(項目18)
項目15に記載の方法であって、該方法は、以下:
(i)前記ペプチドのライブラリーの選択されたメンバーを発現し得る発現系を提供する工程;
(ii)該発現系に、該ペプチドのライブラリーの選択されたメンバーをコードするポリヌクレオチドをクローニングする工程;および
(iii)該ペプチドのライブラリーの選択されたメンバーを発現する工程、
をさらに包含する、項目15に記載の方法。
(項目19)
前記選択された実際の交叉点と、前記交叉点で終了する、前記基準配列の少なくとも1つの部分的な配列とを各々有する複数のキメラ・ペプチドを同定する工程をさらに包含する、項目1に記載の方法。
(項目20)
基準ペプチド配列上の複数の潜在的交叉点の適応度を決定するためのプログラム命令を提供する機械可読媒体を含むコンピューター・プログラム製品であって、
該プログラム命令は、以下:
(a)該基準ペプチド配列上の該複数の潜在的交叉点の各々について、検討中の潜在的交叉点を有する該複数のキメラの適応度パラメータの複数の個別の値から適応度パラメータの全体的な値を計算するためのコード;および
(b)該潜在的交叉点についての該適応度パラメータのそれぞれの該全体的な値に基づき、該基準ペプチド配列の部分的な配列を含むキメラ・ペプチドのための実際の交叉点を選択するためのコード、
を含む、製品。
(項目21)
前記交叉点が前記基準ペプチド配列の中間点であり、かつ、前記キメラ・ペプチドは、前記交叉点で終了する前記基準配列の部分的な配列を含む、項目20に記載のコンピューター・プログラム製品。
(項目22)
前記適応度パラメータが、ペプチドの結合特性を増強するか、または低減させるキメラ対立遺伝子の能力の尺度を含む、項目20に記載のコンピューター・プログラム製品。
(項目23)
前記適応度パラメータが、ポリペプチドの折り畳みを保存するか、または改善するキメラ対立遺伝子の能力の尺度を含む、項目20に記載のコンピューター・プログラム製品。
(項目24)
前記検討中の潜在的交叉点を有するキメラ配列に関して、前記適応度パラメータの個別の値を計算するためのコードをさらに含む、項目20に記載のコンピューター・プログラム製品。
(項目25)
項目24に記載のコンピューター・プログラム製品であって、前記適応度パラメータの前記個別の値を計算するための前記コードが、以下:
(i)前記キメラ配列を前記基準ペプチド配列に整列させるためのコード;
(ii)接触マップから前記キメラの接触残基を同定するためのコード;および
(iii)前記キメラの接触残基に関する、残基間ポテンシャルを合計するためのコードを含むことを特徴とする項目24に記載のコンピューター・プログラム製品。
(項目26)
前記接触マップが前記基準ペプチド中の残基の立体配置であることを特徴とする項目25に記載のコンピューター・プログラム製品。
(項目27)
(b)が、前記基準ペプチド配列の部分的な配列を含む複数のキメラ・ペプチドのための複数の交叉点を選択するためのコードを含むことを特徴とする、項目20に記載のコンピューター・プログラム製品。
(項目28)
前記複数のキメラ・ペプチドを含むペプチドのライブラリーを同定するためのコードをさらに含む、項目27に記載のコンピューター・プログラム製品。
(項目29)
前記選択された実際の交叉点と、前記交叉点で終了する、前記基準配列の少なくとも1つの部分的な配列とを各々有する複数のキメラ・ペプチドを同定するためのコードをさらに含む、項目20のコンピューター・プログラム製品。
(項目30)
コンピューターで実行する、2つ以上の潜在的交叉点の適応度を決定する方法であって、該方法が、以下:
(a)基準ペプチド配列中に第1の潜在的交叉点を同定する工程;
(b)前記基準ペプチド配列からの1つの部分的な配列と、異なった配列からの別の部分的な配列とを含み、かつそれらによる前記潜在的交叉点を有する第1のキメラ配列を生成する工程;
(c)前記基準ペプチド配列に関する接触マップに、第1のキメラ配列を適用する工程;(d)前記接触マップを用いて選択された、第1のキメラ配列中の残基間相互作用から適応度パラメータの値を計算する工程;
(e)1つ以上の追加キメラ配列に関し(b)〜(d)を反復する工程;
(f)(b)〜(e)で検討したキメラ配列の各々に関して、前記適応度パラメータの値から全体的な適応度の値を計算する工程;
(g)前記基準ペプチド配列中に第2の潜在的交叉を同定する工程;および
(h)前記第2の潜在的交叉点に関して、(b)〜(f)をおこなう工程を包含する方法。
(項目31)
複数の追加潜在的交叉点に関して、(a)〜(f)を反復する工程をさらに包含する、項目30に記載の方法。
(項目32)
1つ以上のペプチドの生産における使用のために、複数の潜在的交叉点から1つ以上の交叉点を、全体的な適応度の値に基づいて、複数の潜在的適応度の値に関して選択する工程をさらに包含する、項目31に記載の方法。
(項目33)
2個以上の生体分子の間の交叉点を選択する方法であって、該方法が、以下:
i)基準生体分子の基準配列を提供する工程;
ii)前記基準配列に関して、接触マップを作成する工程;
iii)第1の生体分子の第1の配列と、第2の生体分子の第2の配列を提供し、それらの間で1つ以上の交叉点が決定される工程;
iv)第1の配列および第2の配列を基準配列と整列する工程;
v)第1の配列からの部分配列を、第2の配列からの部分配列と交換し、前記部分配列が選択された交叉点で終了するようなキメラ生体分子配列を作製する工程;
vi)前記接触マップと前記キメラ生体分子配列を比較し、前記キメラ生体分子配列中に、前記基準生体分子の前記接触マップ中の近位要素に対応する2つ以上の要素を選択する工程;ならびに
vii)選択された要素を得点する工程
を包含し、得点が、前記キメラ生体分子配列が前記基準生体分子と同一、または類似の特性を有する可能性の尺度を提供することを特徴とする、方法。
(項目34)
前記生体分子がポリペプチドまたはタンパク質を含み、かつ前記要素がアミノ酸残基を含むことを特徴とする、項目33に記載の方法。
(項目35)
前記生体分子が核酸を含み、かつ前記要素がヌクレオチドを含むことを特徴とする、項目33に記載の方法。
(項目36)
前記基準配列が前記第1の配列であることを特徴とする、項目33に記載の方法。
(項目37)
前記接触マップを作成する工程が、前記生体分子中の要素の1つ以上の間隔を決定し、相互の有意な距離内に2つ以上の近位要素を同定する工程を包含することを特徴とする、項目33に記載の方法。
(項目38)
前記有意な距離の範囲が約2オングストロームから約6.5オングストロームであることを特徴とする、項目37に記載の方法。
(項目39)
前記有意な距離が約4.5オングストローム未満であることを特徴とする、項目37に記載の方法。
(項目40)
前記第1の配列および前記第2の配列を提供する工程が、BLASTPアルゴリズムおよび初期パラメータを用いて決定されるような、アミノ酸配列、または核酸配列を提供し、約60%以下のアミノ酸配列同一性を有する2つのタンパク質を得る工程を包含することを特徴とする、項目33に記載の方法。
(項目41)
前記基準生体分子と同一、または類似の特性が、酵素活性、またはタンパク質安定性を含むことを特徴とする、項目33に記載の方法。
(項目42)
スコアリングが、前記キメラ生体分子配列中の前記2つ以上の選択された要素の前記接触エネルギーを計算する工程を包含することを特徴とする、項目33に記載の方法。
(項目43)
前記接触エネルギーがMiyazawa−Jerniganエネルギー・マトリックスを用いて計算されることを特徴とする、項目42に記載の方法。
(項目44)
スコアリングが三角形輪郭プロットにおけるスコアの提示が含まれることを特徴とする、項目33に記載の方法。
(項目45)
1つ以上のキメラ生体分子を合成する工程をさらに包含する、項目33に記載の方法。
(項目46)
前記1個以上のキメラ生体分子を合成する工程が、1つ以上の組換え構築物を提供する工程を包含する、項目45に記載の方法。
(項目47)
前記1個以上のキメラ生体分子を合成する工程が、2つ以上の親配列に1つ以上の組換え操作を行い、それによって、前記キメラ生体分子をコードする1つ以上の組換え構築物を作製する工程を包含する、項目45に記載の方法。
(項目48)
1つ以上のキメラ生体分子をアッセイする工程をさらに包含する、項目45に記載の方法。
(項目49)
コンピューター・コードを含むコンピューター読み込み可能な媒体であって、前記コンピューター・コードが、
i)基準生体分子の基準配列を入力し;
ii)前記基準配列に関する接触マップを作成し;
iii)第1の配列および第2の配列を基準配列と整列させ;
iv)第1の配列上の第1の交叉部位および第2の交叉部位を含む部分配列を、第2の配列に由来する対応する部分配列で交換してキメラ配列を作製し;
v)前記接触マップと前記キメラ配列とを比較して、前記接触マップの近位要素に対応する2つ以上の要素を、前記キメラ・アミノ酸配列の中で選択し;そして
vi)選択された要素を得点する
ことを特徴とするコンピューター読み込み可能な媒体。
(項目50)
前記コンピューター・コードがまた、少なくとも1つの追加交叉部位に関してiv)〜vi)を反復することを特徴とする、項目49に記載のコンピューター読み込み可能な媒体。
(項目51)
(i)が、既知の生体分子のアミノ酸配列を提供する工程、または前記既知の生体分子をコードする核酸配列を提供する工程を包含する項目49に記載のコンピューター読み込み可能な媒体。
(項目52)
核酸データベースまたは、生体分子データベースに尋ねる工程が入力に包含されることを特徴とする、項目49に記載のコンピューター読み込み可能な媒体。
(項目53)
接触マップを作成する工程が、前記基準生体分子の結晶モデルまたはNMRモデルからアミノ酸間隔を決定し、相互に有意な距離内にある残基を同定する工程を包含する工程を特徴とする、項目49に記載のコンピューター読み込み可能な媒体。
(項目54)
前記接触マップを作成する工程が、前記基準生体分子のタンパク質折り畳み分析からアミノ酸間隔を決定し、相互に有意な距離内にある残基を同定する工程を包含することを特徴とする、項目49に記載のコンピューター読み込み可能な媒体。
(項目55)
前記有意な距離がアミノ酸間相互作用の特性によって変化することを特徴とする、項目54に記載のコンピューター読み込み可能な媒体。
(項目56)
前記有意な距離が約4.5オングストローム未満であることを特徴とする、項目54に記載のコンピューター読み込み可能な媒体。
(項目57)
前記第1のアミノ酸配列および第2のアミノ酸配列を整列する工程が、核酸データベースまたはタンパク質データベースに尋ねる工程を包含することを特徴とする、項目49に
記載のコンピューター読み込み可能な媒体。
(項目58)
前記スコアリングに、キメラ・アミノ酸配列中の1対のアミノ酸の接触エネルギーを計算する工程を包含し、その対の残基が、前記接触マップで接触している残基に対応することを特徴とする、項目49に記載のコンピューター読み込み可能な媒体。
(項目59)
スコアリングが、前記接触マップで接触している残基に対応する、前記キメラ・アミノ酸配列中の全残基の接触エネルギーを合計する工程を包含することを特徴とする項目49に記載のコンピューター読み込み可能な媒体。
(項目60)
スコアリングが、Miyazawaエネルギー・マトリックスを用いて、相互作用する残基の接触エネルギーを計算する工程を包含することを特徴とする、項目49に記載のコンピューター読み込み可能な媒体。
(項目61)
スコアリングが、グラフィカル・ユーザー・インターフェースでユーザーに得点を提示する工程を包含することを特徴とする、項目49に記載の任意の1つのコンピューター読み込み可能な媒体。
(項目62)
スコアリングが、三角プロットで得点を提示する工程を包含することを特徴とする、項目49の任意の1つのコンピューター読み込み可能な媒体。
(項目63)
交叉部位を査定するための融合システムであって、該融合システムが、以下:
項目49に記載のコンピューター読み込み可能な媒体;および
グラフィック・インターフェース
を含む、融合システム。
本発明のこれらの特徴および他の特徴を、以下の図面と共に発明の詳細な説明において、より詳細に説明する。
本発明を詳細に説明する前に、本発明が、特定の組成物または生物学的システムに限定されるものではなく、これらは無論変化し得ることが、理解されるべきである。本明細書で用いられる専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としたものであって、限定することを意図したものではないこともまた、理解されるべきである。この明細書および添付した特許請求の範囲で使用されるように、単数形(「a」、「an」、および「the」)は、内容が明らかにそれを示していない限り、複数の指示されるものも含まれる。したがって、例えば、「核酸配列(a nucleic acid sequence)」は、そのような配列が2つ以上組み合わさったものも含み、「ポリペプチド(a polypeptide)」に対する言及は、複数のポリペプチドからなる複数の混合物が含まれる、などである。
本発明の記載および権利主張において、後述する定義に関して以下の専門用語を用いた。
一実施形態において、図1Aでフローチャートとして示した3通りの操作のうちの2つ以上を用いた一般的プロセスとして、本発明を見ることもできる。その図に示すように、基準ペプチド配列上の種々の潜在的交叉点の関数として適応度パラメータを計算することで、一般的プロセスがブロック01で開始される。適応度パラメータは、交叉点を生成する異なる配列由来の対応アミノ酸によって基準配列の1つ以上のアミノ酸を置換した場合、該基準配列に関する適応度の変化として計算され得る。ブロック01の動作が完了すると、一連の潜在的交叉点(ペプチド配列内の特定の残基位置の前または後に認められる)の各々について別々に算出された適応度の値を有するものとなる。適応度パラメータが最大化すると思われる(または少なくとも特定の閾値に達する)交叉点が、それに続く合成、例えば組換え手順による合成に対して、選択される。これらの交叉点を用いることで、意図された目的にキメラ・ペプチドが「適合」する可能性が高まる。
いくつかのケースでは、適応度パラメータまたは図1Aのブロック01で計算された適応度パラメータでの変化は、ポリペプチドの安定性の尺度である。ポリペプチド適応度パラメータの例として、(1)ポリペプチドの折り畳みの保存または改善、ならびに(2)必要に応じたポリペプチドの結合特異性の増加または減少をおこなうキメラ対立遺伝子の能力の尺度が含まれる。
一実施形態では、本発明の方法は、基準生体分子または生体分子構造の基準配列を提供することが含まれる。別の実施形態では、上記方法は、基準配列と基準生体分子の三次構造を提供することを含み、該基準配列は、モノマー単位(例えば、アミノ酸またはヌクレオチド)等の複数の要素を含む。これらのアプローチの両方とも、比較目的のための塩基配列を提供することが含まれる。任意に、親配列の1つは、基準配列として用いることができる。基準配列は、複数の要素(例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸)から構成され、所定の(または特定)の三次元構造を有する。基準配列を、当業者に周知のいくつかの方法で提供することができる。例えば、基準タンパク質のアミノ酸配列または該基準タンパク質をコードする核酸配列のいずれかを提供することができる。タンパク質をコードする核酸配列は、限定されるものではないが、cDNA、mRNA、ゲノムDNA等のいくつかの形態のいずれかで提供され得る。
本発明の方法は、基準生体分子の三次構造を記述する1つ以上のパラメータを予測パラメータまたは1つ以上のキメラ組換え産物の構造と比較することを含む。これらのパラメータは、マッビングされた生体分子の構成要素間の相互作用が描かれた「接触マップ」のかたちで提供され(一般に二次元グラフまたはデータ・マトリックスの形で)、それによって、簡略化され、かつ簡約表示された生体分子の三次元構造が提供される。近位生体分子構成要素間の対相互作用(pairwise interaction)が概して調べられる一方で、3つ以上の近位要素の相互作用もまた本発明の接触マップで用いることができる。
本発明の方法は、2つ以上の親配列(例えば、第1の配列、第2の配列、さらに必要に怖じて第3または追加の配列)内での潜在的交叉位置を同定および/または比較するために使用することができる。任意に、基準生体分子の配列は、第1の配列または第2の配列のいずれかとして用いることができる。基準分子について既に説明したように、親配列は、いくつかのメカニズムのいずれかによって提供することができる。該メカニズムとして、限定されるものではないが、一方または両方の配列の配列決定、転写または翻訳のための核酸配列の提供、あるいは核酸またはタンパク質データベースへの問い合わせが挙げられる。また、目的とする配列が物理的な意味で提供可能である(例えば、単離または合成分子)。好ましくはそれらをコンピュータ内(in silico)で提供する(例えば、代表的配列ストリング、例えば、SelifonovらによるPCT公報WO 01/75767(PCT/USO1/10231「METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS,POLYNUCLEOTIDES AND POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS」を参照せよ)。
親配列(例えば、第1の配列、第2の配列、および任意に加えた配列)を提供した後、親配列の一部分を置換、スワッピング、または交換する。各交換は、所定の交換の要素(アミノ酸またはヌクレオチドの準配列)の選択された領域を包含する2つの親配列上の第1の交叉点と第2の交叉点とのあいだで行われる。任意に、複数の準配列を所定の親配列内の複数の交叉点でスワッピングすることができ、それによって2つ以上の挿入準配列(1つ以上の親配列由来)を持つキメラ生体分子が生成される。核酸に関して、交叉部位は交換されたオリゴヌクレオチド領域の5’および3’末端(例えば、組換えが生ずる位置)を定義する。タンパク質配列について、交叉部位は、交換されたアミノ酸残基の始点(N−末端)および終点(C−末端)によって定まる。いくつかの実施形態では、第1の交叉部位は核酸の5’末端、またはアミノ酸配列のN−末端に一致する。他の実施形態では、第2の交叉部位は核酸の3’末端、またはアミノ酸配列のC−末端に一致する。
本発明の方法は、基準生体分子と比較したキメラ配列の1つ以上のパラメータに基づいて、親配列内の潜在的交叉位置を評価するためのメカニズムを提供する。本発明の方法は、適応度交叉位置を評価するための接触マップおよび接触エネルギー算出を使用することが可能である。本発明の方法では、接触マップを用いてキメラ分子の要素を位置合わせし、基準配列およびキメラ配列間の比較をおこなう。本方法の一実施形態では、キメラ配列を接触マップと比較して、接触している要素のセットを選択する。その後、キメラ分子中の要素の選択されたセットを基準分子中の対応する要素と比較してスコアリングする。このスコアは、キメラ分子が基準生体分子と類似のコンフォメーションを達成する可能性、および推論により類似のコンフォメーション安定性または所望の活性を実現する可能性の尺度を提供する。
本発明のいくつかの実施形態では、キメラ分子中の推定接触アミノ酸に対して生じたスコアを進化の前に正規化する。大部分の使用では、キメラ配列は、基準配列に対して、配列アイデンティティの範囲を有している。基準配列により近いそれらのキメラは、基準配列に対する配列アイデンティティでより遠いものより優れた接触スコアを有している。このことは、基準タンパク質と比較して、より大きい、例えば約50%同一、約60%同一、約70%同一、またはそれ以上であるものに対して、交叉部位を決定するために用いられるキメラを制限することによって、あるいは接触エネルギーを正規化することを介して説明され得る。基準配列対算出された接触スコアに対するキメラの配列アイデンティティの直線状回帰を介して、この正規化を実行することができる。その後、この回帰からの剰余を用いて、最適交叉位置を決定する。別の手法では、2つ以上の以下のものの複数の回帰を利用できる。すなわち、2つの交叉位置間の長さ、第2の交叉の第1の交叉位置の位置、およびキメラ産物配列および基準配列対算出された接触スコア間の配列アイデンティティである。また、回帰からの剰余を用いて、最適交叉位置を決定することができる。
本発明の方法は、キメラ産物合成前に潜在的交叉部位の可能性を評価するために、事前選別技術として利用することができる。任意で、その後、有効であると評価された(またはこの計算的事前選別に「合格した(pass)」)それらのキメラ産物を実験室で合成および試験する。従って、本発明の方法は、任意で、1つ以上のキメラ生体分子配列を合成するステップをさらに含む。当業者には公知である任意の種々の技術を用いて、キメラ産物を合成することができる。例えば、一実施形態では、キメラ生体分子を新規に合成する(例えば合成化学技術を用いて)。別の実施形態では、本方法は、細胞ベースまたは細胞を含まない発現系でキメラ生体分子を発現させる任意のステップを含む。任意で、キメラ生体分子を合成するステップは、適当な親拡散を提供することと、1つ以上の組換えプロセスを実行することとを含む。合成ステップを実行するための方法論は、本明細書に組み込まれる参考文献中に詳述されている。
スクリーニングと組み合わせた反復方法(本明細書中別の箇所でより詳細に記載される)で、1つ以上の多様性生成方法を実施して、組換え核酸の次のセットを生成することによって、定向進化(または「人工進化」)を実行することができる。従って、突然変異および/または組換えおよびスクリーニングの繰り返しサイクルによって、定向進化または人工進化を実行することができる。例えば、親ポリヌクレオチド(所望の交叉点を提供するために選択される)上で、突然変異および/または組換えを実行し、改変体ポリヌクレオチドのライブラリーを生成することができ、その後、これを発現させて、所望の活性に対してスクリーニングされる交叉点を有するタンパク質を生成する。所望の活性での改善を示すとして、1つ以上の改変体タンパク質がこれらのタンパク質から同定され得る。同定されたタンパク質を逆翻訳して、同定されたタンパク質改変体をコードする1つ以上のポリヌクレオチド配列を確認し、今度は、この配列を、多様性生成およびスクリーニングの次のラウンドで突然変異または組換えをすることができる。
任意で、本発明の方法と組み合わせて生成されたポリヌクレオチドを活性スクリーニングのために細胞中にクローニングする(または、インビトロ転写反応で用いて、スクリーニングされる産物を作製する)。さらに、核酸を、インビトロで、濃縮、シーケンシング、発現、増殖させるか、または任意の他の通常の組換え方法で処理する。
明らかであるように、本発明の実施形態は、1個以上のコンピューター・システムに保存されているか、またはそのようなコンピューター・システムを通して転送されるインストラクション、および/またはデータの制御の下に機能するプロセスを使用する。本発明の実施形態は、これらの操作をおこなう装置にも関する。そのような装置は、必要な目的のために特に、設計、および/または構築されたものでもよい。または、それはコンピューターに保存されたコンピューター・プログラム、および/または、データ構造によって選択的に可動、または再構成された汎用計算機であってもよい。本明細書に提示されたプロセスは、いかなる特定のコンピューター、または他の装置に本質的に関わるものではない。特に、本明細書での教示にしたがって書かれたプログラムを用いて、様々な汎用機械が使用可能である。しかしながら、ある場合には、必要な方法操作をおこなうために専門化した装置を構築することが、より好都合であるかもしれない。さまざまなこれらの機械のための特定の構造は、以下に与えられた説明から明らかになるだろう。
本発明の様々な実施形態は、キメラ・データ配列、または対象とする生体分子(例えば、RNA、DNA、タンパク質など)から得られた情報を、使用、および/または判定する方法、および/またはシステムに関する。特定の実施形態では、本発明はさらに、キメラ配列データのライブラリーを提供し、1セット以上のキメラ配列、構造、および/または、接触マップをクライアントが作成、または分析することを可能にする方法、および/またはシステムを含む。
本発明者らは、キメラ・タンパク質の安定性を、コンピューター内で評価するアルゴリズムを設計した。このアルゴリズムは、既知の基準配列と構造(この実施例では、P.putida由来のMLE I)を用いて、どのアミノ酸が相互に接触しているかを決定する(例えば、接触マップ)。また、このアルゴリズムは、すべての親配列を相互に整列させ、そのアラインメントを用いて、完全長のキメラ配列をコンピューター内で生成する。これは、最も単純な場合には、1つの親タンパク質の1セクションを第2の親からの対応するセグメントで置換することに相当する。アミノ酸置換の影響を、基準配列と比較して評価するため、標準配列とキメラ配列とを比較し、Miyazawaらの記述のように導かれる接触エネルギー関数を用いて、接触エネルギーの変化(ΔEc)を計算した、(Miyazawa,S.,およびJernigan,R.L.(1996年)「Residue−residue potentials with a favorable contact pair team and an unfavorable high packing density term,for simulation and threading.」J.Mol.Biol.256:623−464、ならびに上記の追加参考文献を参照)。
このアルゴリズムを開発する際の本発明者らの目的は、単一交叉としてより、多数の交叉の1つとして、よく機能するであろう可能性に基づいて、交叉位置を選択するキメラ・ライブラリーを設計することであった。このことを達成するため、本発明者らは、異なった長さ(1〜80アミノ酸類)のドナー・タンパク質セグメントを、基準タンパク質の特定位置で開始、または終了するように挿入するときの、平均ΔEcを計算した。図2Bは、P.putidaMLE II由来の1〜80アミノ酸によって、基準タンパク質であるP.putidaMLE Iの対応するセグメントを置換したときの平均接触エネルギー変化を示す。P.putidaMLE IIの代わりに、A.calcoaceticusMLE Iをドナーとして用いたときの結果は、きわめて類似したものであった(データは示されていない)。
本発明者らは、標準的なシャフリング反応で相互に組換えをおこなうのに十分な配列同一性をもたないMLE親配列を選択した(例えば、Moore,G.L.,Maranas,C.D.,Lutz,S.,およびBenkovic,S.J.(2001年)「Predicting crossover generation in DNA shuffling.」Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:3226−3231を参照)。これにより、特定の予測を徹底的にテストすることが可能となった。少数の位置でのみ組換えを可能にすることによって、比較的少数の変種を分析することで、統計的に重要なデータが得られるようになるだろう。
キメラ酵素ライブラリーを、アシネトバクターへのMLE欠失株に形質転換し、実験プロトコル(下記)の記載に従って、相補的な(complementing)クローンを選択した。細菌コロニーは、1日目と6日目の間に現れた。本発明者らは、その中から332個の独立したMLE遺伝子を回収し、配列決定した。選択されたものと、選択されなかったもの両方の配列決定を行った403個の変種の中では、親配列間の組換えは、交叉オリゴヌクレオチドによって媒介されたもののみが観察された。
本発明者らは、活性なキメラに見出された交叉位置に、強い偏向があるのをみた。本発明者らは、これらの偏向に関し、71個の選ばれなかったキメラの中のそれぞれの交叉の頻度を、33個の独自の活性なキメラに見られた交叉の頻度と比較することによって、これらの偏りを測定した。本発明者らは、交叉のモデル化されたエネルギー優先傾向(modeled energetic favorability)を、活性な変種における、その表出(representation)と相関させることによって、接触エネルギー曲線の予測的価値を評価した。α/βバレル中に位置する7つの交叉に関する相関係数は0.94であり、これは、本発明者らのアルゴリズムが、この領域中の生産的な交叉部位に関する有効なプレ・スクリーニング(pre−screen)であることを示している。
本発明者らは、キメラMLEの発現によって、形質転換体の成長率が広い範囲に与えられ、コロニーが形質転換の1〜6日後に選択プレートの上に現れるのをみた。これは、3つの親酵素では2〜4日後であるのと比較される。2個の子孫クローンは、親に比べてかなり急速に成長し、1日かからずにコロニーを形成した。これらの1つは、主にP.putidaMLE IIから成り、A.calcoaceticusMLE Iのセクション(172〜201)と、P.putidaMLE Iのセクション(201〜228)とをもつキメラ・タンパク質を発現した。得られたキメラ活性部位は、3つの親すべてからの残基を含み、機能上重要な残基として、P.putidaMLE IIの寄与によるLys167、Lys169、およびAsp249;A.calcoaceticusMLE IによるAsp198;ならびに、P.putidaMLE IによるG1u224を含んでいる。もう片方の急速増殖形質転換体から得られたキメラ酵素の配列は、大部分がP.putidaMLE Iに由来するものであったが、これにも、A.calcoaceticusMLE Iの残基172と残基201との間が含まれていた。それらは両方とも、コンピューター内アルゴリズムによって、とても好適な交叉位置であると予測されていた。
ここに提示された結果において、本発明者らは、遺伝子またはライブラリーの物理的構築の前に、組換え部位をプレ・スクリーニングすることを可能にするアルゴリズムを記述した。このアルゴリズムは、コンピューター内組換体タンパク質を作製し、構造的に特徴付けられた基準タンパク質からの偏位に基づいて、得られたキメラ分子中のエネルギー変化を予測し、さらに、パッキング相互作用の破壊を最小にする可能性の高い交叉部位を選択する。
この実施例において、本発明者らは、指向性進化技術の一般的適用性を、コンピューター分析のスピードおよび威力と結合する方法を記載した。本発明者らのコンピューター内組換えおよびプレ・スクリーニングに必要な唯一の構造情報は、親タンパク質の結晶構造、NMR構造、構造相同性モデル情報または、当業者に公知の他の構造決定法などの立体的構造情報である。したがって、このアプローチは、一般的であり、かつ高度に自動化可能なものである。場合により、この初期スクリーニングを通過するキメラは、物理的に合成され、試験される。この研究において、本発明者らは交叉オリゴヌクレオチドを用いてキメラ・ライブラリーを合成したが、プレ・スクリーニング・データの取りこみを可能にするいかなる形式(例えば、Nessら(2002年)Nature Biotechnology 20:1251−1255,PCT公報WO 00/42561、およびWO 00/42560に記載される合成組換え)も使用され得る。不十分に折りたたまれた(poorly−folded)変種を取り除くことによって、物理的にスクリーニングしなければならないタンパク質の数を減少させ、特にスクリーニングが困難かつ複雑で、時間がかかる時、成功の可能性を大きくし得る。構造と機能との間の相関の本発明者らの理解が向上するにしたがい、コンピューターのアプローチで評価し得る特性の範囲が拡大され、それによってコンピューター内のプレ・スクリーニング・アルゴリズムの価値が高まると、本発明者らは考える。
P.putida由来のMLE I、およびMLE 2、ならびにA.calcoaceticus由来のMLE Iの野生型遺伝子は、上述のように、増幅し、断片化した(Crameriら、1998年)。3’末端で1つの親に、かつ5’末端で別の親に相補的なオリゴヌクレオチドは、QUIAGENオペロン(QUIAGEN Operon(Alameda,CA))から取り寄せた。これらは、テキスト中で同定された位置に対応するブレーク・ポイント(break point)をもつ。フラグメントおよびオリゴの混合物は、例えば、Nessら、「Synthetic shuffling expands functional protein diversity by allowing amino acids to recombine independently」(2002年)Nature Biotechnology 20:1251−1255、およびPCT公報W098/27230に記載されるように組み合わせた。得られたキメラ配列を、以下で記載するようにベクターにクローニングした。選択されなかったキメラ分子、および選択されたキメラ配列の配列決定は、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems(Foster City,CA))3700型シーケンサーを用いて行った。
A.calcoaceticusのMLE Iノック・アウトを、自然形質転換能と、catB遺伝子をカナマイシン耐性カセットに置換する相同組換えとを用いて構築した。簡潔には、フォワード・プライマー、およびリバース・プライマーを用いて、pACYC177のカナマイシン耐性カセット(プロモーターと共に)をPCR増幅した。PAGE精製された両プライマーは、100のヌクレオチド長であった。そのうち、3’末端の20ヌクレオチドは、カナマイシン耐性カセットのちょうど上流(フォワード・プライマー)か、またはちょうど下流(リバース・プライマー)と同一であり、80ヌクレオチドのテール部分(tail)は、アシネトバクターADP1のcatB遺伝子(Genebank AF009224)のちょうど上流(フォワード・プライマー)か、またはちょうど下流(リバース・プライマー)の領域と同一である。catB遺伝子は、ムコン酸ラクトン化酵素MLE Iをコードする。
MLE 1p構造である1MUCにおける相互作用残基を用い、ケミカル・コンピューティング・グループ社(Chemical Computing Group(Montreal,Quebec,Canada))のMOEソフトウェアを使用して、酵素の接触マップを定義した。接触マップは、結晶構造中の相互作用を記述するマトリックス(C)であって、残基iおよび残基jに関して、2残基間の距離4.5Å内に潜在的水素結合パートナー、または疎水性相互作用がある場合に、Cij=1となり、ない場合には、Cij=0となるように得点するようなマトリックスである。
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