JP2009536821A5

JP2009536821A5 -

Info

Publication number: JP2009536821A5
Application number: JP2009508677A
Authority: JP
Filing date: 2007-05-11
Publication date: 2010-06-24

Claims

タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）で改変されたスタフィロキナーゼ又はその変異体からなる血栓溶解タンパク分子であって、細胞膜を通過して前記スタフィロキナーゼ又はその変異体を導入することができるＰＴＤが前記スタフィロキナーゼ又はその変異体のＮ末端において融合されている組換えタンパク質であることを特徴とする血栓溶解タンパク分子。
スタフィロキナーゼが、配列番号１のアミノ酸配列からなる成熟スタフィロキナーゼ（ＳＡＫ）であることを特徴とする請求項１に記載の血栓溶解タンパク分子。
タンパク質導入ドメインが、アミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ又はＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲからなる、請求項１又は２に記載の血栓溶解タンパク分子。
組換えタンパク質が、スタフィロキナーゼ又はその変異体と、タンパク質導入ドメインとの間にアミノ酸のリンカー配列を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の血栓溶解タンパク分子。
リンカー配列が、スタフィロキナーゼ又はその変異体、及びタンパク質導入ドメインの適正なフォールディングをさせるように付加された任意の配列のアミノ酸からなることを特徴とする請求項４に記載の血栓溶解タンパク分子。
リンカー配列が、グリシン及びセリンアミノ酸残基からなることを特徴とする請求項４又は５記載の血栓溶解タンパク分子。
リンカー配列が、配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒからなることを特徴とする請求項６記載の血栓溶解タンパク分子。
原核生物又は真核生物発現系のいずれかにおいて発現する組換えタンパク質であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の血栓溶解タンパク分子。
（ｉ）ベクターと（ii）請求項１〜８のいずれか記載の血栓溶解タンパク分子をコードする核酸フラグメントとを含む組換えＤＮＡコンストラクト。
ベクターが、大腸菌でクローン化された原核生物プラスミド発現ベクターであることを特徴とする請求項９記載の組換えＤＮＡコンストラクト。
タンパク質導入ドメインとリンカー配列とを、スタフィロキナーゼ又はその変異体に、化学合成、化学接合、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるヌクレオチドレベルでの配列の付加のいずれかによって付加する方法。
請求項１〜８のいずれか記載の血栓溶解タンパク分子の発現を最適化する方法であって、ヌクレオチド配列全体又は組換えタンパク質をコードするＮ末端領域が、大腸菌宿主中における発現のために最適化されたコドンである方法。
以下のステップを含む請求項１〜８のいずれか記載の血栓溶解タンパク分子を製造する方法：
（ａ）請求項９又は１０記載の組換えＤＮＡコンストラクトでクローン化された宿主細胞を培養するステップ；
（ｂ）細胞を採取して、そこから組換えタンパク質を分離するステップ；
（ｃ）少なくとも以下の１つの方法によって前記タンパク質を精製するステップ：イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過、親和性クロマトグラフィー、塩分画、有機溶媒、遠心分離、電気泳動等による分画。
可溶性画分から又は変性状態下での封入体のいずれかから、請求項１〜８のいずれか記載の精製した血栓溶解タンパク分子を製造する方法であって、タンパク質可溶化が、尿素、塩酸グアニジン、又は他の任意の適切な変性剤のうち少なくとも１つを使用して実施される方法。
リン酸緩衝液、クエン酸リン酸塩緩衝液、又は他の任意の薬学的及び生理学的に許容される緩衝液のいずれかを含む緩衝液と、請求項１〜８のいずれか記載の血栓溶解タンパク分子とを含む医薬組成物。
血管系及び組織における血塊の溶解に有用である、請求項１５記載の医薬組成物。
脳出血及び脳卒中を含む脳血栓症及び任意の脳血管障害の治療に有用である、請求項１５又は１６記載の医薬組成物。