JP2009534039A - イヌ細胞中でマイナス鎖ウイルスｒｎａを発現させるための方法および組成物 - Google Patents

イヌ細胞中でマイナス鎖ウイルスｒｎａを発現させるための方法および組成物 Download PDF

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Abstract

本発明は、MDCK細胞などのイヌ細胞中での核酸配列の発現にとって有用な新規イヌpol I調節核酸配列を提供する。本発明はさらに、そのような核酸を含む発現ベクターおよび細胞ならびに感染性インフルエンザウイルスなどの、インフルエンザウイルスを作製するためのそのような核酸の使用方法を提供する。
【選択図】 図８

Description

1. 発明の分野
一態様においては、本発明は、イヌRNAポリメラーゼI調節配列を含む単離された核酸を提供する。他の態様においては、本発明は、そのような核酸を含む発現ベクターおよび細胞ならびに感染性インフルエンザウイルスなどのインフルエンザウイルスを作製するためのそのような核酸の使用方法を提供する。
2. 背景
インフルエンザの大流行は、インフルエンザ疾患に起因する罹患率および死亡率の劇的な広範囲の増加により定義される。いくつかの因子が組み合わさって、集団における低い程度の免疫およびウイルスがヒトの間で伝染し得る効率などの流行の重篤度および程度を調節する。後者は一般的には、ウイルス自体だけでなく、集団の密度ならびに地域への、および地域からの移動の容易性によっても影響される。大流行の原因となるウイルスは、一般的には、集団の大多数が以前に経験しておらず、従って、それに対する免疫をほとんど有さないか、または全く有さない、最近出現した抗原変異体である。さらに、効率的なヒトからヒトへの伝染は、ヒト集団に人畜共通伝染性の動物ウイルスを導入する場合、急速な拡散のための必要条件であり、このウイルスはヒトにおける複製に適合し、効率的に伝染することができなければならない。
流行性インフルエンザは非常に素早く拡散し、壊滅的な影響を有し得る。20世紀の最も重篤な大流行である、1918年の大流行は、500,000人を超える米国市民を殺し、世界中で2000万〜4000万人を殺した。この大流行は、数週間から数ヶ月で隔てられた発生のピークで、疾患の波をもたらし得る。流行性インフルエンザの比較的急速な開始および拡散は、この規模の広範囲攻撃に対応するためのいくつかの問題を提供し、救急隊員および医療従事者に対して計り知れない負担を強いる。新たな大流行に対する迅速な同定および応答は、明らかに解決の必須要素である；ヒトにおいて稀に疾患を引き起こす鳥インフルエンザウイルスなどの新たなインフルエンザウイルスをモニターするためのいくつかのプログラムが現在世界中で整っている。これらの監視データを、所定の大流行警告レベルと共に用いて、脅威の可能性を同定し、有効な応答のための指針を提供する。
ワクチン接種は、インフルエンザの毎年の流行により引き起こされる疾患を予防するための最も重要な公衆衛生手段である。潜在的な大流行の同定間の短い間隔および有意に増加した疾患レベルの開始は、大部分の集団を保護するのに十分なワクチンを製造するための有意な挑戦を提供する。ワクチン技術の所有および次の大流行の出現前の整った基盤の製造が、有意な量の病気および死亡を改善するのに重要であろう。「大流行ワクチン」を製造するのに必要とされる短い応答時間は、有効な応答を提供するための長期間の研究またはプロセス開発を行うことを可能にしないであろう。
現在のところ、米国における非大流行株のための全ての市販のインフルエンザワクチンは、孵化鶏卵中で増殖されている。インフルエンザウイルスは鶏卵中で良好に増殖するが、ワクチンの製造は卵の利用可能性に依存する。卵の供給業者を組織化し、ワクチン製造のための株を、次のインフルエンザの流行期より前に選択しなければならないため、この手法の可撓性を制限し、製造および配布における遅延および不足をもたらすことが多い。不幸なことに、2003〜04年の流行期に流通した試作型A/福建(Fujian)/411/02株などのいくつかのインフルエンザワクチン株は、孵化鶏卵中で良好に複製せず、費用が高く、時間を消費する手順において細胞培養物により単離しなければならない。
細胞培養物中でインフルエンザウイルスを製造するための系も、最近開発された(例えば、Furminger.「ワクチンの製造(Vaccine Production)」、Nicholsonら(編) Textbook of Influenza pp. 324-332; Mertenら(1996)、「ワクチン調製のための細胞培養物中でのインフルエンザウイルスの製造(Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation)」、Cohen & Shafferman (編) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines pp. 141-151を参照されたい)。典型的には、これらの方法は、好適な不死化された宿主細胞の、選択されたウイルス株による感染を含む。鶏卵中でのワクチン製造に関連する多くの困難を排除して、インフルエンザの全ての病原性株は良好に増殖するわけではないが、確立された組織培養方法に従って製造することができる。さらに、弱毒化生ワクチンの製造にとって好適な、例えば、弱毒化、温度感受性および低温適応性などの所望の特性を有する多くの株は、確立された方法を用いる場合、組織培養中でうまく増殖しなかった。
生ウイルスによる細胞培養物の感染に依存する細胞培養に基づく方法に加えて、完全に感染性のインフルエンザウイルスが、組換えDNA技術を用いて細胞培養物中で製造されてきた。組換えDNAに由来するインフルエンザウイルスの製造は、インフルエンザワクチン製造のための組織培養方法の可撓性および利用性を有意に増加させる。最近、ウイルスゲノムをコードするcDNAを組み込む組換えプラスミドからA型およびB型インフルエンザウイルスを製造するための系が報告された。例えば、Neumannら(1999)、「クローン化されたcDNAからの完全なA型インフルエンザウイルスの作製(Generation of influenza A virus entirely from cloned cDNAs.)」、Proc Natl Acad Sci USA 96:9345-9350; Fodorら(1999)、「組換えDNAからのA型インフルエンザウイルスのレスキュー(Rescue of influenza A virus from recombinant DNA.)」、J. Virol 73:9679-9682; Hoffmannら(2000)、「8種のプラスミドからのA型インフルエンザウイルスの作製のためのDNAトランスフェクション系(A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids)」、Proc Natl Acad Sci USA 97:6108-6113; WO 01/83794; HoffmannおよびWebster (2000)、「8種のプラスミドからのA型インフルエンザウイルスの作製のための一方向RNAポリメラーゼI-ポリメラーゼII転写系(Unidirectional RNA polymerase I-polymerase II transcription system for the generation of influenza A virus from eight plasmids)」、81:2843-2847; Hoffmannら(2002)、「8種のプラスミドからのB型インフルエンザウイルスのレスキュー(Rescue of influenza B viruses from 8 plasmids)」、99(17): 11411-11416; 米国特許第6,649,372号および第6,951,754号; 米国特許公開第20050003349号および第20050037487号(参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。「プラスミドレスキュー」と呼ばれることが多いこれらの系は、任意の選択された株から免疫原性HAおよびNAタンパク質を発現する組換えウイルスを製造する可能性を提供する。
しかしながら、これらの組換え方法は、ウイルスゲノムrRNAの転写を駆動するRNAポリメラーゼI(RNA pol I)調節エレメントを含む発現ベクターの使用に依存する。そのような調節エレメントは、完全な感染性インフルエンザウイルスを作製することができるような、インフルエンザゲノムRNAの規定の5'および3'末端を作製するのに必要である。上記のものなどの、現在の組換え系は、ウイルスRNAを発現するヒトRNA pol I調節系を使用する。RNA pol Iプロモーターの種特異性のため、これらの調節エレメントは、ヒトまたは霊長類の細胞中でのみ活性である。かくして、インフルエンザウイルスのプラスミドレスキューは現在のところ、好適なプラスミドをヒトまたは霊長類の細胞にトランスフェクトすることによってのみ可能である。
さらに、そのようなヒトまたは霊長類の細胞は、ワクチン製造にとって必要な十分な力価のインフルエンザウイルスをもたらさないことが多い。代わりに、Madin-Darbyイヌ腎臓細胞(MDCK細胞)を用いて、商業用ワクチンを製造するのに十分な力価までワクチン株を複製することができる。かくして、プラスミドレスキューを用いるインフルエンザワクチンの製造は、現在は少なくとも2種の異なる細胞培養物の使用を必要とする。イヌRNA pol I調節配列の同定およびクローニングは、ウイルス複製と同じ細胞培養物中でのプラスミドレスキューの実施を可能にし、別々のレスキュー培養の必要性を排除するであろう。同様に、MDCKおよび他のイヌ細胞中でのプラスミドレスキューのための好適なベクターを構築するのに用いることができるイヌRNA pol I調節エレメントの同定およびクローニングの必要性も残っている。これらの、およびその他の満たされない必要性を、本発明により提供する。
本明細書に記載の参考文献の引用または考察は、そのようなものが本発明にとって従来技術であるという許諾として解釈されるべきではない。さらに、特許の引用は、その正当性の許諾として解釈されるべきではない。
3. 概要
本明細書で開示されるのは、例えば、イヌ細胞中でインフルエンザゲノムRNAを発現させるのに用いることができる調節配列を含む核酸である。本発明のイヌ調節配列を含む単離された核酸、ベクター、および細胞などの組成物、ならびに同じものを用いる方法が、本発明の実施形態である。
従って、特定の態様においては、本発明の単離された核酸は、イヌRNAポリメラーゼI(pol I)調節配列を含む。特定の実施形態においては、この調節配列は、プロモーターを含む。特定の実施形態においては、調節配列は、エンハンサーを含む。特定の実施形態においては、調節配列は、プロモーターとエンハンサーの両方を含む。一実施形態においては、調節配列は、対応する天然のプロモーターまたはその機能的誘導体のヌクレオチド-250〜-1(プロモーターから転写される1個目のヌクレオチドに関する、+1ヌクレオチドとしても知られる)を含む。一実施形態においては、前記調節配列を、ウイルスRNA、例えば、クローン化されたウイルスcDNAに機能し得る形で連結する。一実施形態においては、クローン化されたウイルスcDNAは、マイナスもしくはプラス鎖ウイルスのウイルスRNAまたは対応するcDNAをコードする。特定の実施形態においては、クローン化されたウイルスcDNAは、インフルエンザウイルスのゲノムウイルスRNA(または対応するcRNA)をコードする。
一実施形態においては、本発明の単離された核酸は、イヌRNAポリメラーゼI調節配列および転写終結配列を含む。特定の実施形態においては、転写終結配列は、RNAポリメラーゼI終結配列である。特定の実施形態においては、転写終結配列は、ヒト、サル、またはイヌpol I終結配列である。
特定の態様においては、本発明は、イヌRNA pol Iプロモーターを含む単離された核酸を提供する。好ましくは、イヌRNA pol Iプロモーターを、例えば、インフルエンザゲノムRNAなどの転写させようとする核酸に機能し得る形で連結する。一実施形態においては、イヌ細胞中への前記核酸の導入は、インフルエンザゲノムRNAの転写をもたらし、好適なインフルエンザタンパク質の存在下で、RNA転写物を、感染性インフルエンザウイルス中にパッケージングすることができる。一実施形態においては、本発明のイヌRNA調節配列(例えば、イヌRNA pol Iプロモーター)であって、転写させようとする核酸に機能し得る形で連結され、in vitroまたはin vivoの好適なタンパク質(例えば、インフルエンザvRNA断片をコードする核酸の場合、RNP複合体)の存在下で、転写される前記配列を含む単離された核酸を提供する。一実施形態においては、前記調節配列に機能し得る形で連結された前記核酸は、インフルエンザvRNA断片である。
特定の実施形態においては、本発明の核酸は、ヒト、霊長類、マウスもしくはイヌのpol Iポリペプチドに結合し、配列番号1〜28からなる群より選択される1個以上のヌクレオチド配列と少なくとも100％もしくは約99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、もしくは65％同一である、ポリヌクレオチド配列もしくはその機能的に活性な断片、例えば、イヌRNA pol I調節配列を含む。一実施形態においては、前記ポリヌクレオチド配列またはその機能的に活性な断片はさらに、好適なポリペプチド(例えば、ヒト、霊長類、マウスもしくはイヌpol Iポリメラーゼ)の存在下で、該ヌクレオチド配列に機能し得る形で連結された第2のポリヌクレオチド配列の転写を開始する能力を保持する。一実施形態においては、配列番号1〜28に記載の核酸の「機能的に活性な断片」は、配列番号1〜28の完全長配列の本明細書に記載の1種以上の機能的活性を保持する。例えば、配列番号1に記載の調節配列の機能的に活性な断片であって、転写させようとする核酸に機能し得る形で連結し、in vitroまたはin vivoの好適なタンパク質の存在下で、転写させる前記調節配列断片を提供する。
特定の実施形態においては、本発明の核酸は、ヒト、霊長類、マウスもしくはイヌのpol Iポリペプチドに結合し、および／または配列番号1〜28からなる群より選択される1個以上のヌクレオチド配列と少なくとも100％もしくは少なくとも約99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、もしくは65％同一である、ポリヌクレオチド配列もしくはその断片、例えば、イヌRNA pol I調節配列を含む。一実施形態においては、前記ポリヌクレオチド配列またはその断片はさらに、好適なポリペプチド(例えば、ヒト、霊長類、マウスもしくはイヌpol Iポリペプチド)の存在下で、該ヌクレオチド配列に機能し得る形で連結された第2のポリヌクレオチド配列の転写を開始する能力を保持する。
他の実施形態においては、本発明の単離された核酸は、イヌRNAポリメラーゼI調節配列およびリボザイム配列を含む。これは、例えば、デルタ肝炎ウイルスゲノムリボザイム配列またはその機能的誘導体であってよい。
一実施形態においては、本発明の核酸は、限定されるものではないが、当業者により公知の任意のマイナス鎖RNAウイルスに由来するゲノムウイルスRNAをコードする。特定の実施形態においては、ウイルスRNAは、モノネガウイルス目に由来するウイルスのゲノムウイルスRNAをコードする。特定の実施形態においては、ウイルスRNAは、パラミクソウイルス科、ニューモウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、ボルナウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、またはアレナウイルス科に由来するウイルスのゲノムウイルスRNAをコードする。特定の実施形態においては、ウイルスRNAは、レスピロウイルス属、モルビリウイルス属、ルブラウイルス属、ヘニパウイルス属、アブラウイルス属、ニューモウイルス属、メタニューモウイルス属、ベシキュロウイルス属、リッサウイルス属、エフェメロウイルス属、サイトラブドウイルス属、ヌクレオラブドウイルス属、ノビラブドウイルス属、マルブルグウイルス属、エボラウイルス属、ボルナウイルス属、A型インフルエンザウイルス属、B型インフルエンザウイルス属、C型インフルエンザウイルス属、トゴトウイルス属、イサウイルス属、オルトブニヤウイルス属、ハンタウイルス属、ナイロウイルス属、フレボウイルス属、トスポウイルス属、アレナウイルス属、オフィオウイルス属、テヌイウイルス属、またはデルタウイルス属に由来するウイルスのゲノムウイルスRNAをコードする。特定の実施形態においては、ウイルスRNAは、センダイウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ヘンドラウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、鳥ニューモウイルス、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、ウシ一日熱ウイルス、レタス壊死性黄変病ウイルス、ジャガイモ黄萎病ウイルス、伝染性造血器壊死症ウイルス、ビクトリア湖マルブルグウイルス、ザイールエボラウイルス、ボルナ病ウイルス、A型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルス、C型インフルエンザウイルス、トゴトウイルス、伝染性サケ貧血ウイルス、ブニヤムウェラウイルス、ハンタウイルス、ダグベウイルス、リフトバレー熱ウイルス、トマト黄化壊疽ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、カンキツソローシスウイルス、イネ縞葉枯ウイルス、およびデルタ肝炎ウイルスからなる群より選択されるウイルスのゲノムウイルスRNAをコードする。
別の態様においては、本発明は、本発明の核酸を含むベクターを提供する。特定の実施形態においては、前記ベクターは発現ベクターである。特定の実施形態においては、前記ベクターは、細菌の複製起点を含む。特定の実施形態においては、前記ベクターは、真核生物の複製起点を含む。特定の実施形態においては、前記ベクターは、原核細胞中で選択することができる選択マーカーを含む。特定の実施形態においては、前記ベクターは、真核細胞中で選択することができる選択マーカーを含む。特定の実施形態においては、前記ベクターはマルチクローニング部位を含む。特定の実施形態においては、マルチクローニング部位は、イヌRNAポリメラーゼI調節配列に関して、調節配列からマルチクローニング部位に導入されるポリヌクレオチド配列の転写を可能にする向きにある。特定の実施形態においては、ベクターは、イヌ細胞、例えば、MDCK細胞中で発現することができるポリヌクレオチド配列を含む。
一実施形態においては、本発明は、細胞培養物、例えば、MDCK細胞培養物から、ウイルスを組換え的にレスキューするのに有用な発現ベクターを提供する。一般的には、前記ベクターは、その生活環の間に規定の末端を有するRNAの産生を必要とする当業者には公知の任意のウイルスをレスキューするのに有用である。そのようなウイルスとしては、限定されるものではないが、上記のものなどの、マイナス鎖RNAウイルスが挙げられる。好ましくは、前記ウイルスは、インフルエンザウイルス、例えば、A型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルス、またはC型インフルエンザウイルスである。
特定の実施形態においては、本発明の1種以上のベクターは、RNA転写終結配列をさらに含む。特定の実施形態においては、転写終結配列を、RNAポリメラーゼI転写終結配列、RNAポリメラーゼII転写終結配列、RNAポリメラーゼIII転写終結配列、およびリボザイムからなる群より選択する。
特定の実施形態においては、発現ベクターは、一方向発現ベクターである。他の実施形態においては、発現ベクターは、二方向発現ベクターである。いくつかの実施形態においては、本発明の二方向発現ベクターは、第2のプロモーターと、ポリアデニル化部位、例えば、SV40ポリアデニル化部位との間に挿入された第1のプロモーターを含む。特定の実施形態においては、第1のプロモーターは、イヌRNA pol Iプロモーターである。特定の実施形態においては、第2のプロモーターは、イヌRNA pol Iプロモーターである。一実施形態においては、第1のプロモーターおよび第2のプロモーターを、少なくとも1個のクローニング部位に隣接させて反対の向きに配置することができる。
特定の実施形態においては、発現ベクターは、イヌRNA pol Iプロモーターに対して少なくとも1個のクローニング部位の3'側のリボザイム配列または転写終結配列を含む。特定の実施形態においては、発現ベクターは、vRNAを正確な5'および3'末端を用いて細胞内合成することができるようにイヌRNA pol Iプロモーターに対して、少なくとも1個のクローニング部位の3'側のリボザイム配列または転写終結配列を含む。
一実施形態においては、本発明の二方向発現ベクター中で、遺伝子またはcDNAを、本発明の上流のpol IIプロモーターと下流のイヌpol I調節配列(例えば、pol Iプロモーター)の間に配置する。pol IIプロモーターからの遺伝子またはcDNAの転写は、キャップ付プラス鎖ウイルスmRNAをもたらし、イヌpol I調節配列からの転写は、マイナス鎖のキャップ付でないvRNAをもたらす。あるいは、本発明の一方向ベクター系においては、前記遺伝子またはcDNAを、pol Iおよびpol IIプロモーターの下流に配置する。pol IIプロモーターは、キャップ付プラス鎖mRNAをもたらし、pol Iプロモーターは、キャップ付でないプラス鎖ウイルスcRNAをもたらす。
別の態様においては、本発明は、ウイルスcDNA、例えば、インフルエンザウイルスcDNAに機能し得る形で連結された本発明の1種以上の核酸(例えば、本発明のイヌpol I調節配列)を含む、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、または17種のベクターを含む組成物を提供する。
特定の実施形態においては、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、または13種以上の本発明のベクターが、単一のプラスミド中に存在する。特定の実施形態においては、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12種のベクターが、別々のベクター中に存在する。特定の実施形態においては、それぞれのベクターは、別々のプラスミド上にある。
特定の実施形態においては、本発明のベクターは、二方向発現ベクターである。本発明の二方向発現ベクターは、典型的には、インフルエンザウイルスゲノムの断片などのウイルス核酸をコードする同じ二本鎖cDNAの代替鎖に機能し得る形で連結された、第1のプロモーターおよび第2のプロモーターを含む。一般的には、少なくとも1個のこれらのプロモーターは、イヌRNA pol Iプロモーターである。必要に応じて、二方向発現ベクターは、ポリアデニル化シグナルおよび／または終結配列を含んでもよい。例えば、ポリアデニル化シグナルおよび／または終結配列を、2個のプロモーターに対して内部のインフルエンザウイルスゲノムの断片に隣接して配置することができる。1個の好ましいポリアデニル化シグナルは、SV40ポリアデニル化シグナルである。
一実施形態においては、本発明は、二方向プラスミドに基づく発現系および一方向プラスミドに基づく発現系を含み、ウイルスcDNAを、本発明のイヌpol I調節配列(例えば、pol Iプロモーター)と終結配列(内部転写単位)の間に挿入する。この内部転写単位を、RNAポリメラーゼII(pol II)プロモーターおよびポリアデニル化部位(外部転写単位)によりフランキングさせる。一方向系においては、pol Iおよびpol IIプロモーターは、cDNAの上流にあり、プラス鎖のキャップ付でないcRNA(pol Iプロモーター由来)およびプラス鎖キャップ付mRNA(pol IIプロモーター由来)を産生する。一方向系中のpol Iプロモーター、pol I終結配列、pol IIプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを、「上流から下流の向き」を含むものと呼ぶことができる。二方向系においては、pol Iおよびpol IIプロモーターは、cDNAの反対側にあり、ここで、上流のpol IIプロモーターは、プラス鎖のキャップ付mRNAをもたらし、下流のpol Iプロモーターは、マイナス鎖のキャップ付でないウイルスRNA(vRNA)をもたらす。これらのpol I-pol II系は、おそらく核の異なる区分中での、その自身のプロモーターからの2種の細胞性RNAポリメラーゼ酵素の転写の開始で始まる。二方向系におけるpol Iプロモーターおよびpol I終結配列を、「下流から上流の向き」を含むものと呼ぶことができるが、二方向系におけるpol IIプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを、「上流から下流の向き」を含むものと呼ぶことができる。
他の態様においては、本明細書に開示される本発明は、イヌRNAポリメラーゼIにより転写可能なポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む組成物を含む。特定の実施形態においては、前記ポリヌクレオチドは、インフルエンザvRNAまたはcRNAを産生する。特定の実施形態においては、前記組成物は、それぞれ、イヌRNAポリメラーゼIにより転写可能なポリヌクレオチド配列を含む複数の発現ベクターを含む。特定の実施形態においては、前記ポリヌクレオチドは、複数のインフルエンザvRNAまたはcRNAを産生する。特定の実施形態においては、前記ポリヌクレオチドは、全部で8種のインフルエンザvRNAまたはcRNAを産生する。
他の態様においては、本明細書に開示される本発明は、ヘルパーウイルスの非存在下／存在下でイヌ細胞中に導入された場合、インフルエンザゲノムの産生をもたらす、複数の本発明の発現ベクターを含む組成物を含む。
特定の実施形態においては、本発明の組成物は、ヘルパーウイルスの非存在下／存在下でイヌ細胞中に導入された場合、感染性インフルエンザウイルスの産生をもたらす複数の発現ベクターを含む。特定の実施形態においては、感染性インフルエンザウイルスは、低温感受性インフルエンザウイルスである。特定の実施形態においては、感染性インフルエンザウイルスは、弱毒化インフルエンザウイルスである。特定の実施形態においては、感染性インフルエンザウイルスは、温度感受性インフルエンザウイルスである。特定の実施形態においては、感染性インフルエンザウイルスは、低温適合性インフルエンザウイルスである。特定の実施形態においては、感染性インフルエンザウイルスは、弱毒化、温度感受性、低温適合性インフルエンザウイルスである。
特定の実施形態においては、本発明の組成物は、5'から3'方向に、転写終結配列に連結された3'非コードインフルエンザウイルス配列に連結されたcDNAに連結された5'非コードインフルエンザウイルス配列に機能し得る形で連結されたプロモーターを含むベクターを含む。特定の実施形態においては、前記ベクター中の1個以上のcDNAは、センス方向にある。特定の実施形態においては、該ベクター中の1個以上のcDNAは、アンチセンス方向にある。
特定の実施形態においては、本発明は、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスポリメラーゼ酸性タンパク質 (PA)cDNAに機能し得る形で連結された本発明のイヌ調節配列を含むベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスポリメラーゼ塩基性タンパク質1 (PB1)cDNAに機能し得る形で連結されたイヌ調節配列を含むベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスポリメラーゼ塩基性タンパク質2 (PB2)cDNAに機能し得る形で連結されたイヌ調節配列を含むベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスヘマグルチニン(HA)cDNAに機能し得る形で連結されたイヌ調節配列を含むベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルス核タンパク質(NP)cDNAに機能し得る形で連結されたイヌ調節配列を含むベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ(NA)cDNAに機能し得る形で連結されたイヌ調節配列を含むベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスマトリックスタンパク質cDNAに機能し得る形で連結されたイヌ調節配列を含むベクター、および転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスNS cDNAに機能し得る形で連結されたイヌ調節配列を含むベクターを含む、複数のベクターを含む組成物を提供する。特定の実施形態においては、前記組成物は、PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、マトリックスタンパク質1(M1)、マトリックスタンパク質2(M2)、ならびに非構造タンパク質1および2(NS1およびNS2)からなる群より選択される1種以上のインフルエンザポリペプチドをコードするmRNAを発現する1個以上の発現ベクターをさらに含む。一実施形態においては、イヌ細胞中に導入された場合、前記組成物は、感染性インフルエンザウイルスの産生をもたらす。特定の実施形態においては、感染性インフルエンザウイルスは、低温感受性インフルエンザウイルスである。特定の実施形態においては、感染性インフルエンザウイルスは、弱毒化インフルエンザウイルスである。特定の実施形態においては、感染性インフルエンザウイルスは、温度感受性インフルエンザウイルスである。特定の実施形態においては、感染性インフルエンザウイルスは、低温適合性インフルエンザウイルスである。特定の実施形態においては、感染性インフルエンザウイルスは、弱毒化、温度感受性、低温適合性インフルエンザウイルスである。
特定の実施形態においては、本発明は、各プラスミドが少なくとも1個のウイルスゲノム断片をコードするcDNAを含み、ウイルスゲノム断片に対応するウイルスcDNAを、vRNAまたはcRNAの発現をもたらす、正確な3'末端を有するvRNAまたはcRNAの合成のために、本発明のイヌRNAポリメラーゼI調節配列と調節エレメント(例えば、イヌpol I終結配列)の間に挿入したプラスミドのセットを含む、クローン化されたウイルスcDNAに由来する感染性インフルエンザウイルスを生成する組成物を提供する。
特定の実施形態においては、本発明は、各プラスミドが少なくとも1個のウイルスゲノム断片をコードするcDNAを含み、ウイルスゲノム断片に対応するウイルスcDNAを、vRNAまたはcRNAの発現をもたらす、正確な3'末端を有するvRNAまたはcRNAの合成のために、本発明のイヌRNAポリメラーゼI調節配列と調節エレメント(例えば、イヌpol I終結配列)の間に挿入し、正確な3'末端を有するvRNAまたはcRNAの合成のためのイヌRNAポリメラーゼI調節配列、ウイルスcDNA、および調節エレメントを、順にRNAポリメラーゼII(pol II)プロモーターとポリアデニル化シグナルの間に挿入し、ウイルスmRNAと対応するウイルスタンパク質の発現をもたらし、vRNAまたはcRNAおよびウイルスタンパク質の完全なセットの発現が、感染性インフルエンザウイルスの集合をもたらすプラスミドのセットを含む、クローン化されたウイルスcDNAに由来する感染性インフルエンザウイルスを生成する組成物を提供する。
特定の実施形態においては、正確な3'末端を有するvRNAまたはcRNAの合成のための調節エレメントは、RNAポリメラーゼI(pol I)終結配列である。当業者には知られるように、効率的な複製およびインフルエンザvRNAの転写は、vRNAの5'および3'末端に非常に特異的な配列を必要とする。当業者であれば、RNAポリメラーゼI (pol I)終結配列を用いて、作製されたRNA転写物の3'末端の配列を、このゲノムRNAの効率的な複製および／または転写にとって望ましい正確な末端であると確実に定義することができる。特定の実施形態においては、正確な3'末端を有するvRNAまたはcRNAの合成のための調節エレメントは、リボザイム配列である。特定の実施形態においては、pol Iプロモーターは、ポリアデニル化シグナルに近接しており、pol I終結配列は、pol IIプロモーターに近接している。特定の実施形態においては、pol Iプロモーターはpol IIプロモーターに近接しており、pol I終結配列はポリアデニル化シグナルに近接している。特定の実施形態においては、インフルエンザウイルスは、A型インフルエンザウイルスである。特定の実施形態においては、インフルエンザウイルスは、B型インフルエンザウイルスである。
別の態様においては、本発明は、本発明の核酸を転写させることによって、インフルエンザゲノムRNAを産生させることを含む、インフルエンザゲノムRNAを製造する方法を提供する。特定の実施形態においては、インフルエンザゲノムRNAを、無細胞系において転写させる。特定の実施形態においては、インフルエンザゲノムRNAを、イヌ細胞、例えば、MDCK細胞中で転写させる。
一実施形態においては、前記方法は、複数の本発明の核酸を転写させることによって、複数のRNA分子、例えば、複数のインフルエンザゲノムRNAを産生させることを含む。特定の実施形態においては、1、2、3、4、5、6、7、または8種のインフルエンザゲノムRNAを転写させる。特定の実施形態においては、インフルエンザゲノムRNAは、イヌ細胞、例えば、MDCK細胞中で転写された場合、PA、PB1、PB2およびNPの存在下で、インフルエンザタンパク質を発現する。特定の実施形態においては、前記インフルエンザタンパク質を、PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1、およびNS2からなる群より選択する。特定の実施形態においては、インフルエンザゲノムRNAの完全なセットは、イヌ細胞、例えば、MDCK細胞中で転写された場合、PA、PB1、PB2、およびNPの存在下で、感染性インフルエンザウイルスを発現する。特定の実施形態においては、前記方法は、インフルエンザゲノムRNAと一緒にPA、PB1、PB2およびNPを導入することを含む。特定の実施形態においては、PA、PB1、PB2、およびNPを、ヘルパーウイルスにより提供する。特定の実施形態においては、インフルエンザゲノムRNAの完全なセットは、低温適合性、温度感受性、弱毒化インフルエンザウイルスに由来する。
一実施形態においては、インフルエンザウイルスのvRNA断片を転写させる方法であって、1)該vRNA断片をコードするcDNA分子に機能し得る形で連結された、配列番号1〜28からなる群より選択される核酸(またはその活性な断片)を含むポリヌクレオチドを、1種以上のインフルエンザタンパク質PB1、PB2、NP、およびPAと接触させる工程；ならびに2)転写されたvRNA断片を単離する工程を含む、前記方法を提供する。1つの特定の実施形態においては、ヘルパーウイルスを前記方法において用いる。
一態様においては、本発明は、断片化されたRNAゲノムを含む組換え感染性組換えウイルス(例えば、感染性インフルエンザウイルス)を製造する方法であって、ウイルスゲノム中のそれぞれの遺伝子に対応するウイルスcDNAを含む本発明の1種以上の発現ベクターおよび1種以上のウイルスポリペプチドをコードするウイルスmRNAを発現する1種以上の発現ベクターを含む、イヌ宿主細胞、例えば、MDCK細胞を培養する工程；ならびに感染性ウイルス集団を単離する工程を含む、前記方法を提供する。一実施形態においては、感染性ウイルス集団は、インフルエンザウイルス集団である。一実施形態においては、前記方法はさらに、1種以上の発現ベクターをイヌ宿主細胞中に導入する工程の後、培養する工程を含む。一実施形態においては、前記方法はさらに、1種以上の発現ベクターを作製する工程の後、導入する工程を含む。
一実施形態においては、断片化されたRNAゲノムを含む感染性組換えウイルス(例えば、感染性インフルエンザウイルス)を製造する方法であって、(a)本発明の1種以上の発現ベクターに、ウイルスゲノム中のそれぞれの遺伝子に対応するウイルスcDNAを挿入する工程；(b)該発現ベクターおよび1種以上のウイルスポリペプチドをコードするウイルスmRNAを発現する1種以上の発現ベクターを宿主細胞(例えば、イヌ細胞)または宿主細胞の集団に導入する(例えば、エレクトロポレーションにより)工程；ならびに(c)該宿主細胞をインキュベートする工程；および(d)感染性ウイルス集団を単離する工程を含む前記方法を提供する。一実施形態においては、感染性組換えウイルスは、インフルエンザである。特定の実施形態においては、インフルエンザウイルスは、低温適合性、温度感受性、弱毒化インフルエンザウイルスである。
一実施形態においては、断片化されたRNAゲノムを含む感染性組換えウイルス(例えば、感染性インフルエンザウイルス)を製造する方法であって、(a)本発明の1種以上の発現ベクターに、ウイルスゲノム中のそれぞれの遺伝子に対応するウイルスcDNAを挿入する工程；(b)該発現ベクターを、宿主細胞(例えば、イヌ細胞)または宿主細胞の集団に導入する(例えば、エレクトロポレーションにより)工程；(c)該宿主細胞をインキュベートする工程；ならびに(d)感染性ウイルス集団を単離する工程を含む、前記方法を提供する。一実施形態においては、感染性組換えウイルスは、インフルエンザである。特定の実施形態においては、インフルエンザウイルスは、低温適合性、温度感受性、弱毒化インフルエンザウイルスである。
一実施形態においては、本発明は、本発明の発現ベクターを用いて、宿主細胞中で感染性組換えインフルエンザウイルスを生成させて、vRNA断片または対応するcRNAならびにインフルエンザウイルスタンパク質、特に、PB1、PB2、PAおよびNAを発現させる方法を提供する。この実施形態に従えば、ヘルパーウイルスを用いて、感染性組換えインフルエンザウイルスを生成させてもさせなくてもよい。
別の実施形態においては、本発明は、組換えインフルエンザウイルスを製造する方法であって、それぞれのインフルエンザゲノムRNAをコードする1個以上のcDNAに機能し得る形で連結されたイヌRNAポリメラーゼI調節配列および1種以上のインフルエンザポリペプチド：PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1およびNS2をコードするウイルスmRNAを発現する1個以上の発現ベクターを含む複数の核酸を含むイヌ細胞を培養すること；ならびに該細胞から該組換えインフルエンザウイルスを単離することを含む、前記方法を提供する。
特定の実施形態においては、前記方法は、(a)リボ核タンパク質複合体を形成させ、ウイルス粒子を、ヘルパーウイルスの非存在下で集合させることができるように、イヌ細胞中で、ゲノムもしくは抗ゲノムウイルスRNA断片、核タンパク質、およびRNA依存的ポリメラーゼの発現を指令する発現ベクターを該細胞に導入すること；ならびに(b)該細胞を培養し、ウイルス粒子をパッケージングし、レスキューすることを含む。特定の実施形態においては、組換えマイナス鎖ウイルスは、非断片化ウイルスである。特定の実施形態においては、組換えマイナス鎖RNAウイルスは、断片化されたウイルスである。特定の実施形態においては、マイナス鎖RNAウイルスは、インフルエンザウイルスである。
特定の実施形態においては、前記方法は、断片化されたマイナス鎖RNAウイルス、核タンパク質、およびRNA依存的ポリメラーゼのゲノムまたは抗ゲノムRNA断片の発現を指令する発現ベクターを、ヘルパーウイルスの非存在下で該ウイルスのゲノムRNA断片を含むRNP複合体の形成およびウイルス粒子の集合を許容する条件下で、培養されたイヌ細胞中に導入すること；ならびに該細胞を培養して、ウイルス粒子を産生させることを含む。特定の実施形態においては、発現ベクターは、該ウイルスのゲノムRNA断片の発現を指令する。
特定の実施形態においては、本発明の方法において用いられるイヌ細胞は、核タンパク質およびRNA依存的RNAポリメラーゼのサブユニットから選択される1種以上のタンパク質を発現する1個以上の発現ベクターを含む。特定の実施形態においては、前記発現ベクターは、1種以上の核タンパク質および前記RNA依存的RNAポリメラーゼのサブユニットの発現を指令する。特定の実施形態においては、前記発現ベクターからの1種以上のウイルスタンパク質の発現は、ヒト2型アデノウイルスのスプライスされた三部分リーダー配列に連結された2型アデノウイルス主要後期プロモーターもしくはヒトサイトメガロウイルス極初期プロモーターから選択される調節配列、または該調節配列の機能的誘導体の制御下にある。
特定の実施形態においては、前記ウイルスは、A、BまたはC型のインフルエンザウイルスである。特定の実施形態においては、前記ウイルスは、2種以上の親ウイルスから誘導されたvRNA断片を有する再集合ウイルスである。
特定の実施形態においては、本発明の方法は、それぞれ、インフルエンザウイルスの一部を含む、複数の本発明のベクターを、ウイルス複製を支援することができる宿主細胞の集団に導入することを含む。この宿主細胞を、ウイルス増殖を許容する条件下で培養し、インフルエンザウイルスを回収することができる。いくつかの実施形態においては、前記インフルエンザウイルスは、弱毒化ウイルス、低温適合性ウイルスおよび／または温度感受性ウイルスである。例えば、特定の実施形態においては、ベクター由来組換えインフルエンザウイルスは、弱毒化生ワクチンとしての投与、例えば、鼻内ワクチン製剤中での投与にとって好適なものなどの、弱毒化、低温適合性、温度感受性ウイルスであってよい。例示的な実施形態においては、インフルエンザB/アンアーバー(Ann Arbor)/1/66ウイルスゲノム、例えば、ca B/アンアーバー/1/66ウイルスゲノムの全部または一部を含む複数のベクターを導入することにより、前記ウイルスを製造する。
いくつかの実施形態においては、1種のインフルエンザ株の少なくとも6個の内部ゲノム断片(例えば、HAおよびNA以外の全てのインフルエンザタンパク質をコードするゲノム断片)をコードするcDNAならびに異なるインフルエンザ株の1個以上のゲノム断片(例えば、HAおよびNA vRNA断片)をコードするcDNAを含む複数のベクターを、宿主細胞の集団に導入することができる。例えば、選択された弱毒化、低温適合性および／もしくは温度感受性インフルエンザAもしくはB株、例えば、B/アンアーバー/1/66のca、att、ts株または人工的に操作されたca、att、tsインフルエンザAもしくはB株の少なくとも6個の内部ゲノム断片(「主鎖」)を、別のウイルス株から誘導された免疫原性抗原をコードする1個以上の断片と共に、宿主細胞の集団に導入することができる。典型的には、免疫原性表面抗原は、ヘマグルチニン(HA)および／もしくはノイラミニダーゼ(NA)抗原のいずれか、または両方を含む。免疫原性表面抗原をコードする単一の断片を導入する実施形態においては、選択されたウイルスの7個の相補的断片も、宿主細胞に導入する。
特定の実施形態においては、発現ベクターを、エレクトロポレーションにより細胞中にトランスフェクトする。特定の実施形態においては、リポソームトランスフェクション試薬の存在下での細胞へのトランスフェクションにより、またはリン酸カルシウム沈降法により、発現ベクターを細胞に導入する。特定の実施形態においては、発現ベクターはプラスミドである。特定の実施形態においては、発現ベクターは、前記ウイルスのそれぞれのゲノムRNA断片または対応するコードRNAの発現のための別々の発現ベクターを含む。特定の実施形態においては、それぞれのゲノムRNA断片またはコードRNAの発現は、本明細書に記載のイヌPol Iプロモーターから誘導されたプロモーター配列の制御下にある。
特定の実施形態においては、インフルエンザウイルスゲノム断片を含む複数のプラスミドベクターを、宿主細胞の集団に導入する。例えば、特定の実施形態においては、それぞれ異なるゲノム断片を含む8種のプラスミドを用いて、完全なインフルエンザゲノムを宿主細胞に導入することができる。あるいは、より小さいゲノムサブ配列を含む、より多数のプラスミドを用いることができる。
別の態様においては、本発明は、培養細胞中で、4個以上のゲノムvRNA断片を有する断片化されたマイナス鎖RNAウイルス、例えば、A型インフルエンザウイルスなどのインフルエンザウイルスの感染性ウイルス粒子を作製する方法であって、(a)該ウイルスの増殖を支援することができる細胞の集団中に、該細胞中で、該ウイルスの完全なゲノムvRNA断片を提供するゲノムvRNA断片を発現することができる第1の発現ベクターセットを導入すること；(b)該細胞中に、該ウイルスの1種以上のポリペプチドをコードするmRNAを発現することができる第2の発現ベクターセットを導入すること；および(c)該ウイルス粒子が産生される該細胞を培養すること、を含む前記方法を提供する。特定の実施形態においては、前記細胞は、イヌ細胞である。特定の実施形態においては、前記細胞は、MDCK細胞である。特定の実施形態においては、前記ウイルスは、B型インフルエンザウイルスである。特定の実施形態においては、第1の発現ベクターセットは、1〜8種のプラスミド中に含まれる。特定の実施形態においては、第1の発現ベクターセットは、1種のプラスミド中に含まれる。特定の実施形態においては、第2の発現ベクターセットは、1〜8種のプラスミド中に含まれる。特定の実施形態においては、第2の発現ベクターセットは、1種のプラスミド中に含まれる。特定の実施形態においては、第1、第2、または両方の発現ベクターセットを、エレクトロポレーションにより導入する。特定の実施形態においては、第1の発現ベクターセットは、インフルエンザウイルスの各vRNA断片をコードする。特定の実施形態においては、第2の発現ベクターセットは、1種以上のインフルエンザポリペプチドのmRNAをコードする。特定の実施形態においては、第1のもしくは第2の発現ベクターセット(または両方のセット)は、本発明の核酸、例えば、本発明のイヌ調節配列(例えば、イヌpol I)を含む。特定の実施形態においては、第1のもしくは第2の発現ベクターセット(または両方のセット)は、vRNAまたは第2のウイルスのmRNAをコードする。例えば、ベクターセットは、第2のインフルエンザウイルスのHAおよび／もしくはNAのmRNAならびに／またはvRNAをコードする1個以上のベクターを含む。
本発明はまた、培養細胞中で、4個以上のvRNA断片を有する断片化されたマイナス鎖RNAウイルスの感染性ウイルス粒子、例えば、A型インフルエンザウイルスなどのインフルエンザウイルスを作製する方法であって、(a)該ウイルスの増殖を支援することができる細胞の集団中に、両方とも該細胞中で、該ウイルスの完全なゲノムvRNA断片を提供するゲノムvRNA断片を発現することができる発現ベクター、該ウイルスの1種以上のポリペプチドをコードするmRNAを発現することができる発現ベクターのセットを導入すること；(b)該ウイルス粒子が産生される該細胞を培養することを含む、前記方法を提供する。特定の実施形態においては、前記細胞は、イヌ細胞である。特定の実施形態においては、前記細胞は、MDCK細胞である。特定の実施形態においては、前記ウイルスは、B型インフルエンザウイルスである。特定の実施形態においては、発現ベクターのセットは、1〜17種のプラスミド中に含まれる。特定の実施形態においては、発現ベクターのセットは、1〜8種のプラスミド中に含まれる。特定の実施形態においては、発現ベクターのセットは、1〜3種のプラスミド中に含まれる。特定の実施形態においては、発現ベクターのセットを、エレクトロポレーションにより導入する。特定の実施形態においては、発現ベクターのセットは、インフルエンザウイルスの各vRNA断片をコードする。特定の実施形態においては、発現ベクターのセットは、1種以上のインフルエンザポリペプチドのmRNAをコードする。特定の実施形態においては、発現ベクターのセットは、インフルエンザウイルスの各vRNA断片および1種以上のインフルエンザポリペプチドのmRNAをコードする。特定の実施形態においては、発現ベクターのセットは、本発明の核酸、例えば、本発明のイヌ調節配列(例えば、イヌpol I)を含む。特定の実施形態においては、発現ベクターのセットは、第2のウイルスのvRNAまたはmRNAをコードする。例えば、ベクターのセットは、第2のインフルエンザウイルスのHAおよび／もしくはNAのmRNAならびに／またはvRNAをコードする1個以上のベクターを含む。特定の実施形態においては、第1のもしくは第2の発現ベクターセット(または両方のセット)は、第2のウイルスのvRNAまたはmRNAをコードする。例えば、ベクターのセットは、第2のインフルエンザウイルスのHAおよび／もしくはNAのmRNAならびに／またはvRNAをコードする1個以上のベクターを含む。
特定の実施形態においては、本発明はさらに、イヌ細胞と同じか、または異なる細胞を用いる1つ以上のさらなる細胞感染工程により、イヌ細胞により産生されるウイルス粒子を増幅することを含む。特定の実施形態においては、前記方法はさらに、感染性ウイルス粒子を単離することを含む。特定の実施形態においては、前記方法はさらに、ウイルスの弱毒化または殺傷工程を含む。特定の実施形態においては、前記方法はさらに、弱毒化された、または殺傷されたウイルス粒子を、ワクチン組成物中に組み込むことを含む。
一実施形態においては、本発明のウイルスを製造する方法は、少なくとも0.1 x 103 PFU/ml、もしくは少なくとも0.5 x 103 PFU/ml、もしくは少なくとも1.0 x 103 PFU/ml、もしくは少なくとも2 x 103 PFU/ml、もしくは少なくとも3 x 103 PFU/ml、もしくは少なくとも4 x 103 PFU/ml、もしくは少なくとも5 x 103 PFU/ml、もしくは少なくとも6 x 103 PFU/ml、もしくは少なくとも7 x 103 PFU/ml、もしくは少なくとも8 x 103 PFU/ml、もしくは少なくとも9 x 103 PFU/ml、もしくは少なくとも1 x 104 PFU/ml、もしくは少なくとも5 x 104 PFU/ml、もしくは少なくとも1 x 105 PFU/ml、もしくは少なくとも5 x 105 PFU/ml、もしくは少なくとも1 x 106 PFU/ml、もしくは少なくとも5 x 106 PFU/ml、もしくは少なくとも1 x 107 PFU/ml、もしくは0.1-1 x 103 PFU/mlの範囲、もしくは1 x 103-1 x 104 PFU/mlの範囲、もしくは1 x 104-1x 105 PFU/mlの範囲、もしくは1 x 105-1 x 106 PFU/mlの範囲、もしくは1 x 106-1 x 107 PFU/mlの範囲、もしくは1 x 107 PFU/mlを超えるウイルス力価(本発明のベクターを宿主細胞に導入した後、24時間、もしくは36時間、もしくは48時間、もしくは3日間、もしくは4日間)をもたらす。従って、本発明は、ウイルスをレスキューするための方法であって、24〜36時間または2〜3日でレスキューされたウイルスの力価は、少なくとも0.1 x 103 PFU/ml、もしくは少なくとも0.5 x 103 PFU/ml、もしくは少なくとも1.0 x 103 PFU/ml、もしくは少なくとも2 x 103 PFU/ml、もしくは少なくとも3 x 103 PFU/ml、もしくは少なくとも4 x 103 PFU/ml、もしくは少なくとも5 x 103 PFU/ml、もしくは少なくとも6 x 103 PFU/ml、もしくは少なくとも7 x 103 PFU/ml、もしくは少なくとも8 x 103 PFU/ml、もしくは少なくとも9 x 103 PFU/ml、もしくは少なくとも1 x 104 PFU/ml、もしくは少なくとも5 x 104 PFU/ml、もしくは少なくとも1 x 105 PFU/ml、もしくは少なくとも5 x 105 PFU/ml、もしくは少なくとも1 x 106 PFU/ml、もしくは少なくとも5 x 106 PFU/ml、もしくは少なくとも1 x 107 PFU/ml、もしくは0.1-1 x 103 PFU/mlの範囲、もしくは1 x 103-1 x 104 PFU/mlの範囲、もしくは1 x 104-1x 105 PFU/mlの範囲、もしくは1 x 105-1 x 106 PFU/mlの範囲、もしくは1 x 106-1 x 107 PFU/mlの範囲、または1 x 107 PFU/mlを超える前記方法を提供する。
いくつかの実施形態においては、インフルエンザウイルスは、B型インフルエンザウイルスに対応する。いくつかの実施形態においては、インフルエンザウイルスは、A型インフルエンザウイルスに対応する。特定の実施形態においては、前記方法は、被験体への投与、例えば、鼻内投与の際に免疫応答を引き出すことができる組換えおよび／または再集合インフルエンザウイルスを回収することを含む。いくつかの実施形態においては、前記ウイルスを投与の前に不活化し、他の実施形態においては、弱毒化生ウイルスを投与する。本発明の方法に従って製造された組換えおよび再集合A型インフルエンザおよびB型インフルエンザウイルスも、本発明の特徴である。特定の実施形態においては、前記ウイルスは、弱毒化インフルエンザウイルス、低温適合性インフルエンザウイルス、温度感受性インフルエンザウイルス、またはこれらの所望の特性の任意の組合せを有するウイルスを含む。一実施形態においては、前記インフルエンザウイルスは、インフルエンザB/アンアーバー/1/66株ウイルス、例えば、B/アンアーバー/1/66の低温適合性、温度感受性、弱毒化株を含む。別の実施形態においては、インフルエンザウイルスは、インフルエンザA/アンアーバー/6/60株ウイルス、例えば、A/アンアーバー/6/60の低温適合性、温度感受性、弱毒化株を含む。
必要に応じて、ワクチン製造に関するその好ましい特性のために選択されたウイルス株の6個の内部vRNAをコードするベクターを、選択された、例えば、病原性株の表面抗原(HAおよびNA)のvRNA断片をコードするベクターと組み合わせて導入することにより、再集合ウイルスを製造する。例えば、ワクチン製造のために日常的に実施されるのと同様、HA断片を、病原的に関連するH1、H3またはB株から好ましく選択することができる。同様に、HA断片を、H2株(例えば、H2N2)、H5株(例えば、H5N1)またはH7株(例えば、H7N7)などの新たな病原性株から選択することができる。あるいは、第1の株の7個の相補的遺伝子断片を、HAまたはNAをコードする断片と組み合わせて導入する。特定の実施形態においては、内部遺伝子断片を、インフルエンザB/アンアーバー/1/66またはA/アンアーバー/6/60株から誘導する。さらに、改変されたHA遺伝子を含むインフルエンザウイルス(例えば、H5N1、H9N2、H7N7、またはHxNy(式中、x = 1-9であり、y = 1-15である))を製造することができる。例えば、HA遺伝子を、ポリ塩基切断部位の除去により改変することができる。
別の態様においては、本発明は、本発明の核酸または発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。特定の実施形態においては、前記細胞は、イヌ細胞である。特定の実施形態においては、イヌ細胞は、腎臓細胞である。特定の実施形態においては、イヌ腎臓細胞は、MDCK細胞である。他の実施形態においては、前記細胞を、Vero細胞、Per.C6細胞、BHK細胞、PCK細胞、MDCK細胞、MDBK細胞、293細胞(例えば、293T細胞)、およびCOS細胞からなる群より選択する。いくつかの実施形態においては、少なくとも2種のこれらの細胞系の混合物、例えば、COS細胞とMDCK細胞の組合せまたは293T細胞とMDCK細胞の組合せの同時培養物が、宿主細胞の集団を構成する。
本発明のインフルエンザベクターを含む宿主細胞を、ウイルスの複製および集合を許容する条件下で、培養物中で増殖させることができる。典型的には、インフルエンザプラスミドを含む宿主細胞を、37℃未満の温度、好ましくは、35℃以下の温度で培養することができる。特定の実施形態においては、前記細胞を、32℃〜35℃の温度で培養する。いくつかの実施形態においては、前記細胞を、約32℃〜34℃、例えば、約33℃の温度で培養する。特定の力価までウイルスの複製を可能にする好適な時間培養した後、組換えウイルスを回収することができる。必要に応じて、回収されたウイルスを不活化することができる。
さらに別の態様においては、本発明は、その増殖が、限定されるものではないが、MRC-5、WI-38、FRhL-2、PerC6、293、NIH 3T3、CEF、CEK、DF-1、Vero、MDCK、Mv1Lu、ヒト上皮細胞およびSF9細胞型などの特定の細胞型に限定されるように、インフルエンザウイルスを遺伝子操作する方法を提供する。一実施形態においては、インフルエンザウイルスが、ヒト一次細胞(例えば、PerC6)中で増殖することができないように、増殖を制限する。別の実施形態においては、インフルエンザウイルスがヒト上皮細胞中で増殖することができないように、増殖を制限する。当業者であれば、増殖制限表現型を、低温適合性、温度感受性、弱毒化などの1種以上のさらなる表現型と組み合わせることができることを認識するであろう。また、増殖制限される表現型の原因となる突然変異も、上記に列挙されたものなどのさらなる表現型に寄与する、および／またはそれの原因となることも認識されるであろう。
別に態様においては、本発明は、培養中のMDCK細胞から、組換えまたは再集合インフルエンザAもしくはインフルエンザBウイルス(すなわち、A型インフルエンザウイルスおよび／またはB型インフルエンザウイルスの野生型および変異株)をレスキューするための新規方法を提供する。特定の実施形態においては、転写が本発明のイヌ調節配列により制御されるインフルエンザウイルスゲノムを含む複数のベクターを、MDCK細胞の集団にエレクトロポレーションする。前記細胞を、例えば、低温適合性、弱毒化、温度感受性ウイルス株の場合、ウイルス複製を許容する条件下で増殖させることができ、MDCK細胞を、37℃未満の温度、好ましくは、35℃以下の温度で増殖させる。典型的には、前記細胞を、32℃〜35℃の温度で培養する。いくつかの実施形態においては、前記細胞を、約32℃〜34℃の温度、例えば、約33℃で培養する。必要に応じて(例えば、ワクチン製造のために)、MDCK細胞を、任意の動物由来生成物を含まない無血清培地中で増殖させる。
上記の方法のいくつかの実施形態においては、インフルエンザゲノムプラスミドを含む宿主細胞を培養した後、インフルエンザウイルスを回収することができる。いくつかの実施形態においては、回収されるウイルスは、組換えウイルスである。いくつかの実施形態においては、前記ウイルスは、ウイルスの2個以上の親株からの遺伝的寄与を有する再集合インフルエンザウイルスである。必要に応じて、回収された組換えまたは再集合ウイルスを、培養細胞または鶏卵中での継代によりさらに増幅させる。
必要に応じて、回収されたウイルスを不活化することができる。いくつかの実施形態においては、回収されるウイルスは、インフルエンザワクチンを含む。例えば、回収されるインフルエンザワクチンは、A型インフルエンザまたはB型インフルエンザの選択された株から誘導されたHAおよび／またはNA抗原を有する再集合インフルエンザウイルス(例えば、6:2または7:1の再集合ウイルス)であってよい。一実施形態においては、HAまたはNA抗原を改変する。特定の好ましい実施形態においては、再集合インフルエンザウイルスは、弱毒化表現型を有する。必要に応じて、再集合ウイルスは、低温適合性および／もしくは温度感受性、例えば、弱毒化、低温適合性もしくは温度感受性A型またはB型インフルエンザウイルスである。そのようなインフルエンザウイルスは、例えば、選択された、例えば、病原性インフルエンザ株にとって特異的な免疫応答の予防的産生のための弱毒化生ワクチンとして有用である。本発明の方法に従って製造された、インフルエンザウイルス、例えば、弱毒化再集合ウイルスは、本発明のさらなる特徴である。
別の態様においては、本発明は、転写が本発明のイヌ調節配列(例えば、イヌRNA pol Iプロモーター)により制御されるインフルエンザウイルスゲノムを含む複数のベクターを、インフルエンザウイルスの複製を支援することができる宿主細胞の集団に導入すること、35℃以下の温度で該宿主細胞を培養すること、および被験体への投与の際に免疫応答を引き出すことができるインフルエンザウイルスを回収することを含む、組換えインフルエンザウイルスワクチンを製造するための方法に関する。前記ワクチンは、A型インフルエンザまたはB型インフルエンザウイルスを含んでもよい。
いくつかの実施形態においては、インフルエンザワクチンウイルスは、弱毒化インフルエンザウイルス、低温適合性インフルエンザウイルス、または温度感受性インフルエンザウイルスを含む。特定の実施形態においては、前記ウイルスは、これらの望ましい特性の組合せを有する。一実施形態においては、インフルエンザウイルスは、インフルエンザA/アンアーバー/6/60株ウイルスを含む。別の実施形態においては、インフルエンザウイルスは、インフルエンザB/アンアーバー/1/66株ウイルスを含む。あるいは、前記ワクチンは、これらの株のユニークなアミノ酸などの、ca A/アンアーバー/6/60またはca/B/アンアーバー/1/66の特徴的な生物学的特性に影響する少なくとも1個の置換されたアミノ酸を含む、人工的に操作されたA型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルスを含む。
一実施形態においては、本発明の方法により製造された組換えウイルス(またはそれから誘導されたウイルス)の集団を含むワクチンを提供する。特定の実施形態においては、前記ワクチンは、前記方法により製造された生ウイルスを含む。別の特定の実施形態においては、前記ワクチンは、前記方法により製造された死滅された、または不活化されたウイルスを含む。別の特定の実施形態においては、前記ワクチンは、前記方法により製造された生ウイルス、死滅されたウイルスまたは不活化されたウイルスから調製された免疫原性組成物を含む。別の特定の実施形態においては、前記方法により製造された弱毒化生インフルエンザウイルス、低温適合性インフルエンザウイルス、温度感受性インフルエンザウイルスから調製された免疫原性組成物を含む。別の特定の実施形態においては、前記ワクチンは、前記方法により製造された弱毒化生インフルエンザウイルス、低温適合性インフルエンザウイルス、温度感受性インフルエンザウイルスまたはそれから誘導されたウイルスを含む。
4. 図面の簡単な説明
図面の簡単な説明については別節を参照。
5. 発明の詳細な説明
インフルエンザウイルスのプラスミドレスキューは、一般的には、好適な宿主細胞中で、ウイルスタンパク質を発現させ、ウイルスゲノムRNAを転写させるための発現ベクターの導入を含む。一般的には、RNAポリメラーゼI酵素は、ウイルスゲノムとしての使用にとって好適な末端を有する転写物を産生するため、ウイルスゲノムRNAの転写を、これらの酵素を用いて実施する。かくして、RNA pol Iプロモーターおよび他の調節エレメントを用いて、プラスミドレスキューの間にゲノムRNAの転写を開始させる。不幸なことに、RNA pol Iプロモーターは、高度に種特異的である。すなわち、1つの種に由来するRNA pol Iは、非関連の種に由来するRNA pol Iプロモーターに効率的に結合することができるか、またはできない。従って、RNA pol Iプロモーターの利用可能性は、プラスミドレスキューを実施することができる細胞を制限する。本発明より以前には、イヌ細胞中でのプラスミドレスキューは不可能であった。初めて、以下のような本発明の開示に基づいて、イヌ細胞中でのプラスミドレスキューが可能である。
従って、第1の態様において、イヌRNAポリメラーゼI調節配列を含む本発明の単離された核酸を提供する。特定の実施形態においては、前記調節配列は、プロモーターである。一実施形態においては、前記調節配列は、イヌpol Iプロモーター配列である。別の実施形態においては、前記調節配列を、クローン化されたウイルスcDNAに機能し得る形で連結する。さらに別の実施形態においては、クローン化されたウイルスcDNAは、マイナス鎖もしくはプラス鎖ウイルスのウイルスRNAまたは対応するcRNAをコードする。1つの特定の実施形態においては、クローン化されたウイルスcDNAは、インフルエンザウイルスのゲノムウイルスRNA(または対応するcRNA)をコードする。
1つの特定の実施形態においては、本発明の単離された核酸は、イヌRNAポリメラーゼI調節配列および転写終結配列を含む。特定の実施形態においては、転写終結配列は、pol I終結配列である。特定の実施形態においては、転写終結配列は、ヒト、サル、またはイヌのpol I終結配列である。
特定の実施形態においては、本発明の核酸は、ポリヌクレオチド配列またはその機能的に活性な断片、例えば、ヒト、霊長類、マウスもしくはイヌのpol Iポリペプチドに結合し、配列番号1〜28からなる群より選択される1個以上のヌクレオチド配列と、少なくとも100％または約99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、もしくは65％同一である、イヌRNA pol I調節配列を含む。一実施形態においては、前記ポリヌクレオチド配列またはその機能的に活性な断片はさらに、好適なポリペプチド(例えば、ヒト、霊長類、マウスもしくはイヌpol Iポリペプチド)の存在下で、前記ヌクレオチド配列に機能し得る形で連結された第2のポリヌクレオチド配列の転写を開始する能力を保持する。一実施形態においては、配列番号1〜28に記載の核酸の「機能的に活性な断片」は、配列番号1〜28の完全長配列の本明細書に記載の1個以上の機能的活性を保持する。例えば、調節配列断片を、転写させる核酸に機能し得る形で連結し、in vitroまたはin vivoで好適なタンパク質の存在下で転写させる、配列番号1に記載の調節配列の機能的に活性な断片を提供する。特定の実施形態においては、本発明の核酸は、配列番号26に記載の核酸のポリヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態においては、本発明の核酸は、ポリヌクレオチド配列またはその機能的断片、例えば、ヒト、霊長類、マウスもしくはイヌのpol Iポリペプチドに結合し、および／または配列番号1〜28からなる群より選択される1個以上のヌクレオチド配列と、100％または少なくとも約99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、もしくは65％同一であるイヌRNA pol I調節配列を含む。一実施形態においては、前記ポリヌクレオチド配列またはその断片はさらに、好適なポリペプチド(例えば、ヒト、霊長類、マウスもしくはイヌのpol Iポリペプチド)の存在下で、前記ヌクレオチド配列に機能し得る形で連結された第2のポリヌクレオチド配列の転写を開始する能力を保持する。
特定の態様においては、本発明は、イヌRNA pol Iプロモーターを含む単離された核酸を提供する。好ましくは、イヌRNA pol Iプロモーターを、例えば、インフルエンザゲノムRNAなどの転写させる核酸に機能し得る形で連結する。イヌ細胞への核酸の導入は、インフルエンザゲノムRNAの転写をもたらし、好適なインフルエンザタンパク質の存在下で、RNA転写物を感染性インフルエンザウイルス中にパッケージングすることができる。一実施形態においては、本発明のイヌRNA調節配列(例えば、イヌRNA pol Iプロモーター)を含み、該調節配列を、転写させる核酸に機能し得る形で連結し、in vitroまたはin vivoで好適なタンパク質の存在下で転写させる、単離された核酸を提供する。一実施形態においては、前記調節配列に機能し得る形で連結された核酸は、インフルエンザvRNA断片である。
別の態様においては、本発明は、完全にクローン化されたウイルスDNAに由来するイヌ細胞培養物中で組換えインフルエンザウイルスを製造するためのベクターおよび方法を提供する。例えば、それぞれのウイルスゲノム断片をコードするクローン化されたcDNAを含む複数のベクターを、本発明のイヌRNA調節配列(例えば、イヌpol Iプロモーター)の転写制御下で、イヌ宿主細胞中に導入すること、該イヌ細胞を培養すること、および該細胞培養物から産生された組換えインフルエンザウイルスを単離することにより、インフルエンザウイルスを製造することができる。かくして、インフルエンザウイルスゲノムをコードするベクターをイヌ細胞中に導入する(例えば、エレクトロポレーションによる)場合、ワクチンとして好適な組換えウイルスを、標準的な精製手順により回収することができる。本発明のベクター系および方法を用いて、ワクチン製造に関してその望ましい特性のために選択された株の6個の内部遺伝子断片を組み込む再集合ウイルス、ならびに選択された、例えば、病原性株に由来する免疫原性HAおよびNA断片を、組織培養において迅速かつ効率的に製造することができる。かくして、本明細書に記載の系および方法は、弱毒化生ワクチンなどの、ワクチンとしての使用にとって好適なウイルスなどの組換えおよび再集合インフルエンザAおよびBウイルスのイヌ細胞培養物中での迅速な製造にとって有用である。本発明の方法に従って調製されたワクチンを、鼻内的または筋肉内的に送達することができる。
典型的には、単一のマスタードナーウイルス(MDV)株を、AおよびBサブタイプの各々について選択する。弱毒化生ワクチンの場合、典型的には、マスタードナーウイルス株を、ワクチン製造に関して、その好ましい特性、例えば、温度感受性、低温適合性および／または弱毒化のために選択する。例えば、マスタードナー株の例としては、それぞれ、A/アンアーバー/6/60およびB/アンアーバー/1/66のそのような温度感受性、弱毒化および低温適合性株が挙げられる。
例えば、選択されたマスタードナーA型ウイルス(MDV-A)、またはマスタードナーB型ウイルス(MDV-B)を、ウイルスゲノムを構成する複数のクローン化されたウイルスcDNAから製造することができる。例示的な実施形態においては、組換えウイルスを、8種のクローン化されたウイルスcDNAから製造する。ウイルスゲノムRNAを、一方の鎖に由来するイヌRNAポリメラーゼI(pol I)プロモーターから転写させることができ、ウイルスmRNAを、他方の鎖に由来するRNAポリメラーゼII(pol II)プロモーターから合成することができるように、PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、MおよびNSの選択されたMDV-AまたはMDV-B配列である8種のウイルスcDNAを、発現ベクター、例えば、プラスミド(例えば、pAD3000もしくはpAD4000)などの二方向発現ベクター中にクローニングする。必要に応じて、HA断片などの任意の遺伝子断片を改変することができる(例えば、多塩基切断部位を除去するために)。
次いで、感染性組換えMDV-AまたはMDV-Bウイルスを、好適な宿主細胞、例えば、MDCK細胞中への8種のウイルスcDNAを担持するプラスミドのトランスフェクション後に回収する。本明細書に記載のプラスミドおよび方法を用いて、本発明は、例えば、選択されたウイルス(例えば、MDV-A、MDV-B、PR8)の6個の内部遺伝子(PB1、PB2、PA、NP、MおよびNS)と、異なる対応する型(AまたはB)のインフルエンザウイルスから誘導されたHAおよびNAとの同時トランスフェクションにより、6:2再集合インフルエンザワクチンを作製するのに有用である。例えば、ワクチン製造のために日常的に実施されるのと同様、HA断片を、病原的に関連するH1、H3またはB株から好ましく選択することができる。同様に、HA断片を、H2株(例えば、H2N2)、H5株(例えば、H5N1)またはH7株(例えば、H7N7)などの新たな病原性株から選択することができる。MDVおよび選択された株のHAまたはNA遺伝子の7個のゲノム断片を含む再集合体(7:1再集合体)も製造することができる。さらに、この系は、ワクチン製造に関して、例えば、弱毒化(att)、低温適合性(ca)、および温度感受性(ts)表現型などの表現型特性の分子的基礎を決定するのに有用である。
5.1 定義
特に指摘しない限り、全ての科学用語および技術用語は、それらが属する業界において一般的に用いられるものと同じ意味を有すると理解される。本発明の目的のために、以下の用語を以下に定義する。
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」および「核酸配列」とは、一本鎖もしくは二本鎖デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドポリマー、またはそのキメラもしくは類似体を指す。本明細書で用いられるこの用語は、必要に応じて、それらが天然のヌクレオチドと同様の様式で一本鎖核酸にハイブリダイズする点で、天然のヌクレオチドの必須の性質を有する天然のヌクレオチドの類似体のポリマーを含む(例えば、ペプチド核酸)。特に指摘しない限り、本発明の特定の核酸配列は、明確に示される配列に加えて、相補的配列を包含する。
用語「遺伝子」は、生物学的機能と関連する任意の核酸を指す。かくして、遺伝子は、コード配列および／またはその発現にとって必要な調節配列を含む。用語「遺伝子」は、特異的ゲノム配列、ならびにそのゲノム配列によりコードされるcDNAまたはmRNAに適用される。
また、遺伝子は、例えば、他のタンパク質に対する認識配列を形成する発現されない核酸断片も含む。発現されない調節配列としては、転写因子などの調節タンパク質が結合し、隣接するか、または近隣の配列の転写をもたらす、「プロモーター」および「エンハンサー」が挙げられる。「組織特異的」プロモーターまたはエンハンサーは、特定の組織型もしくは細胞型(複数も可)における転写を調節するものである。
「プロモーター」または「プロモーター配列」は、好適な転写関連酵素、例えば、RNAポリメラーゼが、条件、例えば、培養または生理学的条件下で存在する場合、機能し得る形で結合した核酸配列の転写を開始することができるDNA調節領域であり、それにより該酵素は機能的となる。プロモーターは、転写が開始する核酸配列から上流または下流に存在してもよい。cDNAの上流に位置するプロモーター配列は、転写開始部位によりその3'末端で結合し、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含むように上流(5'方向)に伸長する。cDNAの下流に位置するプロモーター配列((-)RNAを発現する)は、転写開始部位によりその5'末端に結合し、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含むように下流(3'方向)に伸長する。本発明の二方向系は、上流および下流プロモーターの両方を含む；一方向系は、上流プロモーターのみを含む。プロモーター配列内に、またはそれに隣接して、転写開始部位(例えば、ヌクレアーゼS1を用いるマッピングにより都合良く定義される)が見出されるであろうが、そのプロモーター配列は、RNAポリメラーゼの結合を促進し、調節し、増強するか、またはさもなければそれを担うタンパク質結合ドメイン(コンセンサス配列)を含んでもよい。
本明細書で用いられる、「イヌRNAポリメラーゼI調節配列」もしくは「イヌRNAポリメラーゼI調節エレメント」(またはその機能的に活性な断片)は、イヌRNAポリメラーゼIおよび、必要に応じて、結合した転写因子が、条件、例えば、培養または生理学的条件下にある場合、機能し得る形で結合した核酸配列の転写を増加させることができる核酸配列を指し、それによって該酵素は機能的となる。イヌRNAポリメラーゼI調節配列の例としては、バックグラウンドを超えてそれに機能し得る形で連結された核酸の転写を増加させる、イヌRNAポリメラーゼIプロモーター、およびイヌRNAポリメラーゼIエンハンサーの非存在下で観察されるレベルを超えてイヌRNAポリメラーゼIプロモーターに機能し得る形で連結された核酸の転写を増加させる、イヌRNAポリメラーゼIエンハンサーが挙げられる。イヌRNAポリメラーゼI調節エレメントを同定するための1つの試験は、目的の核酸に機能し得る形で連結された、推定イヌRNAポリメラーゼI調節エレメントを、好適なイヌ細胞、例えば、MDCK細胞中に導入し、従来のアッセイ、例えば、ノーザンブロットを用いて、目的の核酸の転写を検出することである。当業者であれば、推定イヌRNAポリメラーゼI調節エレメントの存在下および非存在下での前記核酸の転写レベルの比較により、該核酸エレメントがイヌRNAポリメラーゼI調節エレメントであるかどうかを決定することができるであろう。
用語「ベクター」とは、異種核酸配列を細胞中に導入するのに用いることができる核酸、例えば、プラスミド、ウイルスベクター、組換え核酸またはcDNAを指す。本発明のベクターは、典型的には、本発明の調節配列を含むであろう。このベクターは、自己複製してもよく、または自己複製しなくてもよい。ベクターはまた、自己複製しない、裸のRNAポリヌクレオチド、裸のDNAポリヌクレオチド、同じ鎖内にDNAおよびRNAの両方を含むポリヌクレオチド、ポリリジン結合DNAもしくはRNA、ペプチド結合DNAもしくはRNA、リポソーム結合DNAなどであってもよい。最も一般的には、本発明のベクターは、プラスミドである。
「発現ベクター」は、そこに組み込まれた核酸の発現、例えば、転写を促進することができる、プラスミドなどのベクターである。本発明の発現ベクターは、典型的には、本発明の調節配列を含むであろう。発現ベクターは、自己複製するか、または自己複製しなくてもよい。典型的には、発現させようとする核酸を、プロモーターおよび／またはエンハンサーに「機能し得る形で連結」し、該プロモーターおよび／またはエンハンサーによる転写調節制御にかける。
「二方向発現ベクター」は、典型的には、発現を、両方の向きで開始させ、例えば、プラス(+)もしくはセンス鎖、およびマイナス(-)もしくはアンチセンス鎖RNAの両方の転写をもたらすことができるような、2個のプロモーター間に位置する核酸に関して、反対の向きにある2個の代替プロモーターを特徴とする。あるいは、二方向発現ベクターは、ウイルスmRNAおよびウイルスゲノムRNA(cRNAとして)を同じ鎖から発現させる、両側センス(ambisense)ベクターであってよい。
本発明の文脈においては、用語「単離された」とは、通常はその天然の環境において付随するか、またはそれと相互作用する成分を実質的に含まない、核酸またはタンパク質などの生物学的材料を指す。単離された材料は、必要に応じて、その天然の環境、例えば、細胞中の材料と共に見出されない材料を含む。例えば、材料が、細胞などのその天然の環境にある場合、該材料を、その環境中に見出される材料に対して天然ではない細胞(例えば、ゲノムまたは遺伝子エレメント)中の位置に置く。例えば、天然の核酸(例えば、コード配列、プロモーター、エンハンサーなど)は、それが、その核酸に対して天然ではないゲノムの座(例えば、プラスミドもしくはウイルスベクターなどのベクター、またはアンプリコン)に、非天然の手段により導入された場合、単離されたことになる。そのような核酸を、「異種」核酸とも呼ぶ。
用語「組換え体」は、材料(例えば、核酸またはタンパク質)がヒトの介入により人工的または合成的に(非天然に)変更されたことを示す。この変更を、その天然の環境もしくは状態の中で、またはそこから除去された材料に対して実施することができる。特に、ウイルス、例えば、インフルエンザウイルスに言及する場合、該ウイルスは、それが組換え核酸の発現により産生される場合、組換え体である。
ウイルスに言及する場合、用語「再集合体」は、該ウイルスが、2個以上の親ウイルス株または起源から誘導された遺伝子および／ポリペプチド成分を含むことを示す。例えば、7:1再集合体は、第1の親ウイルスから誘導された7個のウイルスゲノム断片(もしくは遺伝子断片)と、第2の親ウイルスに由来する、例えば、ヘマグルチニンもしくはノイラミニダーゼをコードする1個の相補的ウイルスゲノム断片を含む。6:2再集合体は、6個の遺伝子断片、最も一般的には、第1の親ウイルスに由来する6個の内部遺伝子と、異なる親ウイルスに由来する、2個の相補的断片、例えば、ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼを含む。
異種もしくは単離された核酸に言及する場合、用語「導入された」とは、核酸を、細胞のゲノム(例えば、染色体、プラスミド、プラスチドもしくはミトコンドリアDNA)中に組込み、自律レプリコン中に変換し、または一過的に発現させる(例えば、トランスフェクトされたmRNA)ことができる真核もしくは原核細胞中への組込みを指す。この用語は、「感染」、「トランスフェクション」、「形質転換」および「形質導入」などの方法を含む。本発明の文脈においては、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降法、脂質媒介性トランスフェクション(リポフェクション)などの様々な方法を用いて、核酸を原核細胞に導入することができる。
用語「宿主細胞」は、ベクターなどの核酸を取り込むことができるか、または取り込み、該核酸の複製および／または発現、ならびに必要に応じて、ポリペプチドおよび／またはウイルスなどの1種以上のコードされる産物の産生を支援する細胞を意味する。宿主細胞は、大腸菌などの原核細胞、または酵母、昆虫、両生類、鳥類もしくはヒト細胞などの哺乳動物細胞などの真核細胞であってよい。本発明の文脈における宿主細胞の例としては、Vero (アフリカミドリザル腎臓)細胞、PerC6細胞(ヒト胚性網膜細胞)、BHK(ベビーハムスター腎臓)細胞、一次ニワトリ腎臓(PCK)細胞、Madin-Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞、Madin-Darbyウシ腎臓(MDCK)細胞、293細胞(例えば、293T細胞)、およびCOS細胞(例えば、COS1、COS7細胞)が挙げられる。用語「宿主細胞」は、例えば、異なる細胞型または細胞系(例えば、VeroおよびCEK細胞)の混合培養物などの、細胞の組合せまたは混合物を包含する。エレクトロポレーションされたSF Vero細胞の同時培養は、例えば、2004年12月22日に提出されたPCT/US04/42669(その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)に記載されている。
本明細書で用いられる、「人工的に操作された」発現とは、ウイルス、ウイルス核酸またはウイルスにコードされた産物、例えば、ポリペプチド、ワクチンが、例えば、部位特異的突然変異誘発、PCR突然変異誘発などの組換え方法により導入された少なくとも1個の突然変異を含むことを示す。1個以上のヌクレオチド突然変異および／またはアミノ酸置換を含むウイルス(またはウイルス成分もしくは産物)に言及する場合、「人工的に操作された」発現は、該ウイルス(またはウイルス成分もしくは産物)をコードするウイルスゲノムまたはゲノム断片が、非組換え方法(25℃での進行的継代など)により作製されたウイルスの天然の、もしくは以前から存在する実験室株、例えば、野生型または低温適合性A/アンアーバー/6/60もしくはB/アンアーバー/1/66株などの天然の起源から誘導されたものではないことを示す。
用語「配列同一性(％)」は、本明細書では、用語「同一性(％)」と互換的に用いられ、配列アラインメントプログラムを用いて整列された場合の、2個以上のペプチド配列間のアミノ酸配列同一性のレベルまたは2個以上のヌクレオチド配列間のヌクレオチド配列同一性のレベルを指す。例えば、本明細書で用いられる場合、80％の同一性とは、規定のアルゴリズムにより決定される80％の配列同一性と同じことを意味し、所与の配列が、別の長さの別の配列と少なくとも80％同一であることを意味する。配列同一性のレベルの例としては、限定されるものではないが、所与の配列に対する60、70、80、85、90、95、98％以上の配列同一性が挙げられる。
用語「配列相同性(％)」は、本明細書では用語「相同性(％)」と互換的に用いられ、配列アラインメントプログラムを用いて整列された場合の、2個以上のペプチド配列間のアミノ酸配列相同性のレベルまたは2個以上のヌクレオチド配列間のヌクレオチド配列相同性のレベルを指す。例えば、本明細書で用いられる、80％の相同性は、規定のアルゴリズムにより決定される80％の配列相同性と同じことを意味し、従って、所与の配列の相同体が、所与の配列の長さに渡って80％を超える配列相同性を有する。配列相同性のレベルの例としては、限定されるものではないが、所与の配列に対する60、70、80、85、90、95、98％以上の配列相同性が挙げられる。
2個以上の配列間の同一性を決定するのに用いることができるコンピュータープログラムの例としては、限定されるものではないが、NCBIウェブサイトでインターネット上で公共的に利用可能な、一組のBLASTプログラム、例えば、BLASTN、BLASTX、およびTBLASTX、BLASTPおよびTBLASTNが挙げられる。Altschulら、1990、J. Mol. Biol. 215:403-10(公開されたデフォルト設定、すなわち、パラメーターw=4、t=17を特に参照)およびAltschulら、1997、Nucleic Acids Res., 25:3389-3402も参照されたい。典型的には、配列検索を、GenBank Protein Sequencesおよび他の公共データベース中のアミノ酸配列に関して、所与のアミノ酸配列を評価する場合、BLASTPプログラムを用いて実行する。GenBank Protein Sequencesおよび他の公共データベース中のアミノ酸配列に対して全ての読み枠で翻訳された核酸配列を検索するためには、BLASTXプログラムが好ましい。BLASTPおよびBLASTXの両方を、11.0のオープンギャップペナルティ、および1.0の拡張ギャップペナルティのデフォルトパラメーターを用いて実行し、BLOSUM-62マトリックスを用いる。上記を参照されたい。
2個以上の配列間の「同一性(％)」を決定するための選択された配列の好ましいアラインメントを、例えば、10.0のオープンギャップペナルティ、および0.1の拡張ギャップペナルティなどの、デフォルトパラメーターを用いて操作された、Mac Vectorバージョン6.5におけるCLUSTAL-Wプログラム、ならびにBLOSUM 30類似性マトリックスを用いて実施する。
「特異的にハイブリダイズする」または「特異的ハイブリダイゼーション」または「選択的にハイブリダイズする」とは、特定のヌクレオチド配列が複合混合物(例えば、総細胞)のDNAまたはRNA中に存在する場合、ストリンジェントな条件下で、核酸分子がその配列に優先的に結合し、二本鎖を形成するか、またはハイブリダイズすることを指す。
用語「ストリンジェントな条件」とは、プローブが、その標的サブ配列に優先的にハイブリダイズし、および他の配列に、より少ない程度で、または全くハイブリダイズしない条件を指す。サザンおよびノーザンハイブリダイゼーションなどの核酸ハイブリダイゼーション実験の文脈における「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存的であり、様々な環境パラメーターの下で異なる。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範囲の指針を、Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, part I, chapter 2,「核酸プローブアッセイのハイブリダイゼーションおよび戦略の原理の概要(Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays)」、Elsevier, NY; Sambrookら、2001, Molecular Cloning: A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory, 第3版、NY；およびAusubelら(編)、現行版、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NYに見出すことができる。
一般的には、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を、規定のイオン強度およびpHで特定の配列の融点(Tm)より約5℃低くなるように選択する。Tmは、標的配列の50％が完全に一致したプローブにハイブリダイズする温度(規定のイオン強度およびpHで)である。非常にストリンジェントな条件を、特定のプローブのTmと等しくなるように選択する。
サザンもしくはノーザンブロットにおいてフィルター上に約100個を超える相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションに関するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、42℃の1 mgのヘパリンを含む50％ホルマリンであり、ハイブリダイゼーションを一晩実行する。高度にストリンジェントな洗浄条件の例は、72℃で約15分間の0.15 M NaClである。ストリンジェントな洗浄条件の例は、65℃で15分間の0.2X SSC洗浄である。SSCバッファーの説明については、Sambrookらを参照されたい。高ストリンジェンシー洗浄を、低ストリンジェンシー洗浄の前に行って、バックグラウンドのプローブシグナルを除去することができる。例えば、約100個を超えるヌクレオチドの二本鎖のための例示的な中程度のストリンジェンシーの洗浄は、45℃で15分間の1x SSCである。例えば、約100個を超えるヌクレオチドの二本鎖のための例示的な低ストリンジェンシー洗浄は、40℃で15分間の4〜6x SSCである。一般的には、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおける未関連のプローブについて観察されたものよりも2倍(以上)高いシグナル：ノイズ比は、特異的ハイブリダイゼーションの検出を示唆する。
本明細書で用いられる用語「約」とは、特に指摘しない限り、値が、この用語により改変される値よりも10％以上、上であるか、または下であることを指す。例えば、用語「約5μg/kg」は、4.5μg/kg〜5.5μg/kgの範囲を意味する。別の例として、「約1時間」は、48分〜72分の範囲を意味する。
本明細書で用いられる用語「コードする」とは、ポリペプチドに翻訳することができる核酸などの、相補的核酸を転写する、核酸、例えば、デオキシリボ核酸の特性を指す。例えば、デオキシリボ核酸は、デオキシリボ核酸から転写されるRNAをコードすることができる。同様に、デオキシリボ核酸は、デオキシリボ核酸から転写されるRNAから翻訳されるポリペプチドをコードすることができる。
5.2 イヌRNA Pol I調節エレメントを含む核酸
一実施形態においては、本発明のイヌRNA調節配列(例えば、イヌRNA pol Iプロモーター)を含む単離された核酸を提供する。この調節配列を、例えば、転写させようとする核酸に機能し得る形で連結し、in vitroまたはin vivoで好適なタンパク質の存在下で転写させることができる。一実施形態においては、前記調節配列に機能し得る形で連結された核酸は、インフルエンザvRNA断片である。
特定の態様においては、本発明は、イヌRNA pol Iプロモーターを含む単離された核酸を提供する。好ましくは、イヌRNA pol Iプロモーターを、例えば、インフルエンザゲノムRNAなどの、転写させようとする核酸に機能し得る形で連結する。イヌ細胞への核酸の導入は、インフルエンザゲノムRNAの転写をもたらすことができ、好適なインフルエンザタンパク質の存在下で、RNA転写物(複数も可)を、インフルエンザウイルス、例えば、感染性インフルエンザウイルス中にパッケージングすることができる。
特定の実施形態においては、本発明の核酸は、ヒト、霊長類、マウスもしくはイヌのpol Iポリペプチドに結合し、配列番号1〜28からなる群より選択される1個以上のヌクレオチド配列と少なくとも約99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、もしくは60％同一であるイヌRNA pol I調節配列またはその断片を含む。一実施形態においては、RNA pol I調節配列またはその断片はさらに、ヌクレオチド配列に機能し得る形で連結された遺伝子の転写を開始する能力を保持する。特定の実施形態においては、本発明の核酸は、配列番号29の配列と、少なくとも約99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、もしくは60％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。
さらに、本発明の核酸は、イヌRNA pol Iプロモーターを含む核酸の誘導変異体も包含する。そのような誘導体を、限定されるものではないが、本明細書の以降で同定されるイヌRNA pol I調節配列から、当業者により公知の任意の方法により作製することができる。例えば、誘導体を、核酸の1、2、3、5、10個以上のヌクレオチドの置換、挿入、または欠失などの部位特異的突然変異誘発により作製することができる。あるいは、誘導体を、無作為突然変異誘発により作製することができる。核酸を無作為に突然変異させる1つの方法は、0.1 mM MnCl2および非平衡化ヌクレオチド濃度の存在下でPCR反応中で核酸を増幅させることを含む。これらの条件は、PCR反応中で用いられるポリメラーゼの誤取込み速度を増加させ、増幅された核酸の無作為突然変異誘発をもたらす。好ましくは、誘導体核酸は、ヌクレオチド配列に機能し得る形で連結された遺伝子の転写を開始する能力を保持する。特定の実施形態においては、本発明の核酸は、配列番号1〜28からなる群より選択される1個以上のヌクレオチド配列の少なくとも約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、または1000個の連続するヌクレオチドを含む。好ましくは、前記核酸は、イヌ細胞中で該ヌクレオチド配列に機能し得る形で連結された遺伝子の転写を開始させることができる配列を含み、かくして、機能的誘導体となる。一実施形態においては、前記核酸は、イヌpol Iポリペプチドに結合し、イヌ細胞中でインフルエンザvRNAの転写を開始する(in vitroまたはin vivoで)ことができる配列を含む。一実施形態においては、配列番号26に記載の配列の少なくとも250、もしくは少なくとも350、もしくは少なくとも450個の連続するヌクレオチドを含み、インフルエンザvRNAをコードするcDNAに機能し得る形で連結され、MDCK細胞中に導入された場合、該インフルエンザvRNAの発現を指令することができる、単離された核酸配列を提供する。別の実施形態においては、配列番号26に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも80％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む、インフルエンザvRNAをコードするcDNAに機能し得る形で連結され、MDCK細胞中に導入された場合、該インフルエンザvRNAの発現を指令することができる、単離された核酸配列を提供する。別の実施形態においては、配列番号1〜26からなる群より選択される核酸に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含み、インフルエンザvRNAをコードするcDNAに機能し得る形で連結され、MDCK細胞中に導入された場合、該インフルエンザvRNAの発現を指令することができる、単離された核酸配列を提供する。特定の実施形態においては、本発明の核酸は、配列番号29の少なくとも約400、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、2000、または3000個の連続するヌクレオチドを含む。
特定の実施形態においては、本発明の核酸配列は、配列番号1として提供される配列のヌクレオチド-469〜-1(+1ヌクレオチドとしても知られる、プロモーターから転写される第1のヌクレオチドに関連して)、もしくはその機能的誘導体を含むか、またはあるいは、それからなる。他の実施形態においては、本発明の核酸配列は、配列番号1として提供される配列のヌクレオチド-250〜-1(+1ヌクレオチドとしても知られる、プロモーターから転写される第1のヌクレオチドに関連して)、もしくはその機能的誘導体を含むか、またはあるいは、それからなる。配列番号1に認められるイヌpol I調節配列から発現される18SリボソームRNAの+1ヌクレオチドは、配列番号1の位置1809のヌクレオチドである。一実施形態においては、配列番号26のヌクレオチド1〜469、その相補体、その逆相補体、またはその機能的に活性な断片を含む核酸を提供する。
本発明はまた、配列番号1の機能的に活性な断片(蓄積されたクローンA.T.C.C.受託番号PTA-7540に存在するヌクレオチド配列のサブ配列)も提供する。従って、本発明はさらに、配列番号1のヌクレオチド配列のアミノ末端から欠失された1個以上の核酸残基を有するポリヌクレオチドを提供する。配列番号1のN末端欠失を、一般式m-3537(式中、mは2〜3512の整数であり、mは配列番号1で同定されるヌクレオチド、または蓄積されたクローン(A.T.C.C.受託番号PTA-7540)中に存在するヌクレオチド配列の位置に対応する)により記載することができる。本発明はまた、配列番号1のヌクレオチド配列のカルボキシ末端から欠失された1個以上の核酸残基を有するポリヌクレオチドも提供する。配列番号1のC末端欠失を、一般式1-n(式中、nは2〜3512の整数であり、nは配列番号1で同定されたヌクレオチド、または蓄積されたクローン(A.T.C.C.受託番号PTA-7540)中に存在するヌクレオチド配列の位置に対応する)により記載することができる。
本発明はまた、配列番号26の機能的に活性な断片(蓄積されたクローンA.T.C.C.受託番号PTA-7540中に存在するヌクレオチド配列のサブ配列)も提供する。従って、本発明はさらに、配列番号26のヌクレオチド配列のアミノ末端から欠失された1個以上の核酸残基を有するポリヌクレオチドを提供する。配列番号26のN末端欠失を、一般式m-469(式中、mは2〜450の整数であり、mは配列番号26で同定された核酸残基の位置に対応する)により記載することができる。本発明はまた、配列番号26のヌクレオチド配列のカルボキシ末端から欠失された1個以上の核酸残基を有するポリヌクレオチドも提供する。配列番号26のC末端欠失を、一般式1-n(式中、nは2〜450の整数であり、nは配列番号26で同定された核酸残基の位置に対応する)により記載することができる。
特定の実施形態においては、本発明のイヌpol I調節配列は、配列番号1〜28からなる群より選択され、イヌ細胞中で該調節配列に機能し得る形で連結された遺伝子の転写を開始することができる核酸を含む核酸に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする単離された核酸(またはその相補配列)を含むか、またはあるいは、それからなる。
一実施形態においては、本発明のイヌpol I調節配列は、イヌRNA pol Iポリペプチドに結合し、一実施形態においては、イヌ細胞中で該ヌクレオチド配列に機能し得る形で連結された遺伝子の転写を開始することができる核酸配列を含む。一実施形態においては、前記核酸は、真核生物のpol Iポリペプチドに結合し、インフルエンザvRNAの転写を開始する(in vitroまたはin vivoで)ことができる配列を含む。特定の実施形態においては、イヌのpol I調節配列へのイヌRNA pol Iポリペプチドの結合を、ヌクレアーゼ保護アッセイを用いてアッセイする。特定の実施形態においては、イヌのpol I調節配列へのイヌRNA pol Iポリペプチドの結合を、タンパク質相互作用を評価するためのBIACORE系(Biacore International AG, Uppsala, Sweden)を用いてアッセイする。
特定の実施形態においては、前記核酸は、イヌRNA pol Iに結合する配列を含む。特定の実施形態においては、この配列は、霊長類RNA pol I、ヒトpol I、およびマウスpol Iからなる群より選択されるRNAポリメラーゼよりも高い親和性でイヌRNA pol Iに結合する。特定の実施形態においては、この配列は、イヌRNA pol IIよりも高い親和性でイヌRNA pol Iに結合する。特定の実施形態においては、前記配列は、イヌRNA pol IIIよりも高い親和性でイヌRNA pol Iに結合する。特定の実施形態においては、イヌpol I調節配列への結合を、タンパク質相互作用を評価するためのBIACORE系(Biacore International AG, Uppsala, Sweden)を用いてアッセイする。
特定の実施形態においては、イヌRNA pol Iプロモーターは、蓄積されたクローンA.T.C.C.受託番号PTA-7540中に存在するヌクレオチド配列のサブ配列である、以下のヌクレオチド配列：
ATTCCCGGTGAGGCTGCCTCTGCCGCGCGTGGCCCTCCACCTCCCCTGGCCCGAGCCGGGGTTGGGGACGGCGGTAGGCACGGGGCGGTCCTGAGGGCCGCGGGGGACGGCCTCCGCACGGTGCCTGCCTCCGGAGAACTTTGATGATTTTTCAAAGTCTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCGCGTATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCCTGGGGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAGATGAACATTTTTTGTTGCCAGGTAGGT(配列番号26)
を含むか、またはあるいは、それからなる。
特定の実施形態においては、イヌRNA pol Iプロモーターは、以下のヌクレオチド配列：
TTGATGATTTTTCAAAGTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCCGTATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCCTGGGGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAGATGAACATTTTTTGTTGCCAGGTAGGTGCTGACA(配列番号2)
を含むか、またはあるいは、それからなる。
特定の実施形態においては、イヌRNA pol Iプロモーターは、以下のヌクレオチド配列：
TTGATGATTTTTCAAAGTCTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCGCGTATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCCTGGGGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAGATGAACATTTTTTGTTGCCAGGTAGGTGCTGACA(配列番号20)
を含むか、またはあるいは、それからなる。
特定の実施形態においては、イヌRNA pol Iプロモーターは、以下のヌクレオチド配列：
GGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAGATGAACATTTTTTGTTGCCAGGTAGGTGCTGACA(配列番号3)
を含むか、またはあるいは、それからなる。
特定の実施形態においては、イヌRNA pol Iプロモーターは、以下のヌクレオチド配列：
GCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAGATGAACATTTTTTGTTGCCAGGTAGGTGCTGACA(配列番号4)
を含むか、またはあるいは、それからなる。
特定の実施形態においては、イヌRNA pol Iプロモーターは、以下のヌクレオチド配列：
TGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAGATGAACATTTTTTGTTGCCAGGTAGGTGCTGACA(配列番号5)
を含むか、またはあるいは、それからなる。
特定の実施形態においては、イヌRNA pol Iプロモーターは、以下のヌクレオチド配列：
GTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAGATGAACATTTTTTGTTGCCAGGTAGGTGCTGACA(配列番号6)
を含むか、またはあるいは、それからなる。
特定の実施形態においては、イヌRNA pol Iプロモーターは、以下のヌクレオチド配列：
AGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAGATGAACATTTTTTGTTGCCAGGTAGGTGCTGACA(配列番号7)
を含むか、またはあるいは、それからなる。
特定の実施形態においては、イヌRNA pol Iプロモーターは、以下のヌクレオチド配列：
TTGATGATTTTTCAAAGTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCCGTATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCCTG(配列番号8)
を含むか、またはあるいは、それからなる。
特定の実施形態においては、イヌRNA pol Iプロモーターは、以下のヌクレオチド配列：
TTGATGATTTTTCAAAGTCTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCGCGTATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCCTG (配列番号21)
を含むか、またはあるいは、それからなる。
特定の実施形態においては、イヌRNA pol Iプロモーターは、以下のヌクレオチド配列：
TTGATGATTTTTCAAAGTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCCGTATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCC (配列番号9)
を含むか、またはあるいは、それからなる。
特定の実施形態においては、イヌRNA pol Iプロモーターは、以下のヌクレオチド配列：
TTGATGATTTTTCAAAGTCTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCGCGTATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCC (配列番号22)
を含むか、またはあるいは、それからなる。
特定の実施形態においては、イヌRNA pol Iプロモーターは、以下のヌクレオチド配列：
TTGATGATTTTTCAAAGTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCCGTATC (配列番号10)
を含むか、またはあるいは、それからなる。
特定の実施形態においては、イヌRNA pol Iプロモーターは、以下のヌクレオチド配列：
TTGATGATTTTTCAAAGTCTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCGCGTATC (配列番号23)
を含むか、またはあるいは、それからなる。
特定の実施形態においては、イヌRNA pol Iプロモーターは、以下のヌクレオチド配列：
TTGATGATTTTTCAAAGTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGCGT (配列番号11)
を含むか、またはあるいは、それからなる。
特定の実施形態においては、イヌRNA pol Iプロモーターは、以下のヌクレオチド配列：
TTGATGATTTTTCAAAGTCTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGCGT (配列番号24)
を含むか、またはあるいは、それからなる。
特定の実施形態においては、イヌRNA pol Iプロモーターは、以下のヌクレオチド配列：
TTGATGATTTTTCAAAGTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCCGTATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCCTGGGGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG (配列番号12)
を含むか、またはあるいは、それからなる。
特定の実施形態においては、イヌRNA pol Iプロモーターは、以下のヌクレオチド配列：
TTGATGATTTTTCAAAGTCTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCGCGTATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCCTGGGGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG (配列番号25)
を含むか、またはあるいは、それからなる。
特定の実施形態においては、イヌRNA pol Iプロモーターは、以下のヌクレオチド配列：
GGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCCGTATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCCTGGGGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG (配列番号13)
を含むか、またはあるいは、それからなる。
特定の実施形態においては、イヌRNA pol Iプロモーターは、以下のヌクレオチド配列：
GGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCGCGTATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCCTGGGGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG (配列番号27)
を含むか、またはあるいは、それからなる。
特定の実施形態においては、イヌRNA pol Iプロモーターは、以下のヌクレオチド配列：
GCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCCTGGGGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG (配列番号14)
を含むか、またはあるいは、それからなる。
特定の実施形態においては、イヌRNA pol Iプロモーターは、以下のヌクレオチド配列：
GGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG (配列番号15)
を含むか、またはあるいは、それからなる。
特定の実施形態においては、イヌRNA pol Iプロモーターは、以下のヌクレオチド配列：
GCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG (配列番号16)
を含むか、またはあるいは、それからなる。
特定の実施形態においては、イヌRNA pol Iプロモーターは、以下のヌクレオチド配列：
TGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG (配列番号17)
を含むか、またはあるいは、それからなる。
特定の実施形態においては、イヌRNA pol Iプロモーターは、以下のヌクレオチド配列：
GGCGTGGCGTCTCCACCGACCCGTATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCCTGGGGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG (配列番号18)
を含むか、またはあるいは、それからなる。
特定の実施形態においては、イヌRNA pol Iプロモーターは、以下のヌクレオチド配列：
GGCGTGGCGTCTCCACCGACCGCGTATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCCTGGGGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG (配列番号28)
を含むか、またはあるいは、それからなる。
特定の実施形態においては、イヌRNA pol Iプロモーターは、以下のヌクレオチド配列：
TCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG (配列番号19)
を含むか、またはあるいは、それからなる。
5.3 ベクターおよび発現ベクター
別の態様においては、本発明は、細胞培養物からウイルスを組換え的にレスキューするのに有用な発現ベクターなどの、本発明の核酸を含むベクターを提供する。一般的には、前記発現ベクターは、その生活環の間に規定の末端を有するRNAの産生を必要とする当業者には公知の任意のウイルスをレスキューするのに有用である。例えば、上記で考察されたように、インフルエンザウイルスゲノムRNAは、効率的に複製され、組換え系中にパッケージングされる規定の5'および3'末端を有するべきである。参照により本明細書に組み入れられるものとする、Neumannら(2002), 83:2635-2662中の概説も参照されたい。以下の考察は、インフルエンザと共に使用するのに好適な発現ベクターに焦点を当てるものである；しかしながら、本発明のベクターを用いて、他のウイルスをレスキューすることもできることに留意すべきである。
本発明に従えば、一実施形態においては、インフルエンザの8種のゲノム断片(断片は異なるインフルエンザウイルスに由来するものであってよく、例えば、X株に由来する6種およびY株に由来する2種であってよい)の各々に対応するウイルスゲノムRNAをコードするcDNAを、インフルエンザウイルスの操作および製造のための組換えベクターに挿入することができる。ウイルスベクター、プラスミド、コスミド、ファージ、および人工染色体などの様々なベクターを、本発明の文脈において用いることができる。典型的には、操作を容易にするために、前記cDNAを、細菌および真核細胞中で機能的である1個以上の複製起点、ならびに、必要に応じて、プラスミド配列を含む細胞をスクリーニングもしくは選択するのに都合の良いマーカーを提供する、プラスミドベクター中に挿入する。例えば、Neumannら、1999, PNAS. USA 96:9345-9350を参照されたい。
一実施形態においては、本発明のベクターは、いずれかの方向で挿入されたcDNAからのウイルスゲノム断片の転写を開始する、すなわち、(+)鎖および(-)鎖の両方のウイルスRNA分子を生じることができる二方向発現ベクターである。二方向転写を行うために、ウイルスゲノム断片の各々を、ウイルスゲノムRNAのコピーが、一方の鎖から、第1のRNAポリメラーゼプロモーター(例えば、イヌRNA pol Iプロモーター)により転写され、ウイルスmRNAが、第2のRNAポリメラーゼプロモーター(例えば、イヌRNA Pol IIプロモーターまたはイヌ細胞中でRNA pol IIによる転写を開始することができる他のプロモーター)から合成されるように、少なくとも2個の独立したプロモーターを有する発現ベクター中に挿入する。従って、この2個のプロモーターを、ウイルスゲノムRNA断片の挿入にとって好適な、少なくとも1個のクローニング部位(すなわち、制限酵素認識配列)、好ましくは、ユニークなクローニング部位にフランキングする反対の方向に配置することができる。あるいは、(+)鎖mRNAおよび(-)鎖ウイルスRNA(cRNAとして)が、ベクターの同じ鎖から転写される「両側センス」発現ベクターを用いることができる。上記で考察されたように、ウイルスゲノムRNAを転写させるためのpol Iプロモーターは、好ましくはイヌpol Iプロモーターである。
それぞれの発現されるvRNAまたはcRNAの正確な3'末端を確保するために、それぞれのvRNAまたはcRNA発現ベクターは、RNAコード配列の下流にリボザイム配列または好適な終結配列(例えば、ヒト、マウス、霊長類、もしくはイヌRNAポリメラーゼI終結配列)を含んでもよい。これは、例えば、デルタ肝炎ウイルスゲノムリボザイム配列もしくはその機能的誘導体、またはマウスrDNA終結配列(Genbank受託番号M12074)であってよい。あるいは、例えば、Pol I終結配列を用いてもよい(Neumannら、1994, Virology 202:477-479)。前記RNA発現ベクターを、Pleschkaら、1996, J. Virol. 70:4188-4192; HoffmannおよびWebster, 2000, J. Gen Virol. 81:2843-2847; Hoffmannら、2002, Vaccine 20:3165-3170; Fodorら、1999, J. Virol. 73:9679-9682; Neumannら、1999, P.N.A.S.USA 96:9345-9350;ならびにHoffmannら、2000, Virology 267:310-317(それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする)に記載のvRNA発現ベクターと同じ様式で構築することができる。
他の系においては、pol Iおよびpol IIプロモーターにより転写されるウイルス配列を、異なる発現ベクターから転写させることができる。これらの実施形態においては、本発明のイヌ調節配列、例えば、イヌpol Iプロモーター(「vRNA発現ベクター」)の制御下のウイルスゲノム断片の各々をコードするベクターならびにpol IIプロモーターの制御下の1個以上のウイルスポリペプチド、例えば、インフルエンザPA、PB1、PB2、およびNPポリペプチド(「タンパク質発現ベクター」)を用いることができる。
いずれの場合でも、pol IIプロモーターに関しては、発現させようとするインフルエンザウイルスゲノム断片を、mRNA合成を指令する好適な転写制御配列(プロモーター)に機能し得る形で連結することができる。様々なプロモーターが、インフルエンザウイルスゲノム断片の転写を調節するための発現ベクターにおける使用にとって好適である。特定の実施形態においては、サイトメガロウイルス(CMV)DNA依存的RNAポリメラーゼII(Pol II)プロモーターを用いる。必要に応じて、例えば、条件的発現を調節するために、特定の条件下で、または特定の組織もしくは細胞中でRNA転写を誘導する他のプロモーターを置換することができる。多くのウイルスおよび哺乳動物、例えば、ヒトプロモーターが利用可能であるか、またはこれを想定される特定の用途に従って単離することができる。例えば、動物およびヒトウイルスのゲノムから得られる代替的なプロモーターとしては、アデノウイルス(2型アデノウイルスなど)、パピローマウイルス、B型肝炎ウイルス、およびポリオーマウイルスなどのプロモーター、ならびに種々のレトロウイルスプロモーターが挙げられる。哺乳動物プロモーターとしては、特に、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターなどが挙げられる。特定の実施形態においては、前記調節配列は、Bergら、Bio Techniques 14:972-978により記載されるような、ヒト2型アデノウイルスのスプライスされた三部分リーダー配列に連結された2型アデノウイルス主要後期プロモーターを含む。さらに、バクテリオファージプロモーターを、同族のRNAポリメラーゼ、例えば、T7プロモーターと共に用いることができる。
ウイルスタンパク質、特に、RNP複合体形成のためのウイルスタンパク質を発現させるのに用いられる発現ベクターは、所望のウイルスと相同なウイルスタンパク質を発現するのが好ましいであろう。これらの発現ベクターによるウイルスタンパク質の発現を、当業者には公知の任意の調節配列により調節することができる。この調節配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーターまたは組織特異的プロモーターであってよい。タンパク質発現ベクターにおいてウイルスタンパク質の発現を制御するのに用いることができるプロモーターのさらなる例としては、限定されるものではないが、SV40初期プロモーター領域(BernoistおよびChambon, 1981, Nature 290: 304-310)、ラウス肉腫ウイルスの3'末端反復配列に含まれるプロモーター(Yamamotoら、1980, Cell 22:787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら、1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列 (Brinsterら、1982, Nature 296:39-42);β-ラクタマーゼプロモーターなどの原核発現ベクター (Villa-Kamaroffら、1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3727-3731)、もしくはtacプロモーター(DeBoerら、1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25);「組換え細菌に由来する有用なタンパク質(Useful proteins from recombinant bacteria)」、Scientific American, 1980, 242:74-94も参照;ノパリン合成酵素プロモーター領域を含む植物発現ベクター(Herrera-Estrellaら、Nature 303:209-213)もしくはカリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター(Gardnerら、1981, Nucl. Acids Res. 9:2871)、および光合成酵素リブロース二リン酸カルボキシラーゼのプロモーター(Herrera-Estrellaら、1984, Nature 310:115-120); Gal 4プロモーター、ADC (アルコールデヒドロゲナーゼ)プロモーター、PGK (ホスホグリセロールキナーゼ)プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーターなどの酵母もしくは他の菌類に由来するプロモーターエレメント、ならびに組織特異性を示し、トランスジェニック動物において用いられてきた以下の動物転写制御領域: 膵腺房細胞において活性であるエステラーゼI遺伝子制御領域(Swiftら、1984, Cell 38:639-646; Omitzら、1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515);膵臓β細胞において活性であるインスリン遺伝子制御領域(Hanahan, 1985, Nature 315:115-122)、リンパ球細胞において活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域(Grosschedlら、1984, Cell 38:647-658; Adamesら、1985, Nature 318:533-538; Alexander ら、1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444)、精巣、乳腺、リンパ球および脂肪細胞において活性であるマウス乳癌ウイルス制御領域(Lederら、1986, Cell 45:485-495)、肝臓において活性であるアルブミン遺伝子制御領域(Pinkertら、1987, GenesおよびDevel. 1:268-276)、肝臓において活性であるα-フェトタンパク質遺伝子制御領域(Krumlaufら、1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammerら、1987, Science 235:53-58);肝臓において活性であるα1-抗トリプシン遺伝子制御領域(Kelseyら、1987, GenesおよびDevel. 1:161-171)、骨髄細胞において活性であるβ-グロビン遺伝子制御領域(Mogramら、1985, Nature 315:338-340; KoIliasら、1986, Cell 46:89-94;脳中のオリゴデンドロサイトにおいて活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域(Readheadら、1987, Cell 48:703-712)、骨格筋において活性であるミオシン軽鎖-2遺伝子制御領域(Sani, 1985, Nature 314:283-286)、ならびに視床下部において活性である性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域(Masonら、1986, Science 234:1372-1378)が挙げられる。
特定の実施形態においては、本発明のタンパク質発現ベクターは、核酸配列に機能し得る形で連結されたプロモーター、1個以上の複製起点、および、必要に応じて、1個以上の選択マーカー(例えば、抗生物質耐性遺伝子)を含む。別の実施形態においては、二シストロン性mRNAを産生することができる本発明のタンパク質発現ベクターを、二シストロン性mRNA配列を挿入することにより作製することができる。特定の内部リボゾーム進入部位(IRES)配列を用いることができる。好ましいIRESエレメントとしては、限定されるものではないが、哺乳動物BiP IRESおよびC型肝炎ウイルスIRESが挙げられる。
一実施形態においては、本発明の核酸を、プラスミドpAD3000またはその誘導体に挿入する。米国特許出願公開第20050266026号および図10を参照されたい。かくして、特定の実施形態においては、前記発現ベクターは、二方向発現ベクターである。特定の実施形態においては、前記発現ベクターは、2個のプロモーターに対して内部のインフルエンザウイルスゲノムの断片にフランキングするSV40ポリアデニル化シグナルを含む。特定の実施形態においては、前記発現ベクターは、サイトメガロウイルス(CMV)DNA依存的RNA Pol IIプロモーターを含む。一実施形態においては、本発明の核酸を、プラスミドpAD4000またはその誘導体に挿入する。一実施形態においては、本発明の核酸は、配列番号29として提供されるpAD4000の配列を含むか、またはあるいは、それからなる。
遺伝子挿入物を含むベクターを、例えば、3つの一般的手法：(a)核酸ハイブリダイゼーション；(b)「マーカー」遺伝子機能の存在もしくは非存在；および発現ベクターの場合、(c)挿入された配列の発現により同定することができる。第1の手法においては、ベクター(複数も可)に挿入されたウイルス遺伝子の存在を、挿入された遺伝子(複数も可)と相同である配列を含むプローブを用いる核酸ハイブリダイゼーションにより検出することができる。第2の手法においては、組換えベクター／宿主系を、ベクター(複数も可)中への遺伝子(複数も可)の挿入により引き起こされる特定の「マーカー」遺伝子機能(例えば、抗生物質に対する耐性もしくは形質転換表現型)の存在または非存在に基づいて同定および選択することができる。第3の手法においては、発現ベクターを、発現される遺伝子産物をアッセイすることにより同定することができる。そのようなアッセイは、例えば、in vitroアッセイ系におけるウイルスタンパク質の物理的もしくは機能的特性、例えば、抗体へのウイルスタンパク質の結合に基づくものであってよい。
特定の実施形態においては、1個以上のタンパク質発現ベクターは、RNP複合体の形成にとって必要なウイルスタンパク質をコードし、発現する。別の実施形態においては、1個以上のタンパク質発現ベクターは、ウイルス粒子を形成するのに必要なウイルスタンパク質をコードし、発現する。さらに別の実施形態においては、1個以上のタンパク質発現ベクターは、特定のマイナス鎖RNAウイルスの全てのウイルスタンパク質をコードし、発現する。
発現ベクターからの転写を、必要に応じて、エンハンサー配列を含有させることにより増加させることができる。典型的には、エンハンサーは、転写を増加させるためのプロモーターと協調して働く、短い、例えば、10〜500 bpのシス作用性DNAエレメントである。多くのエンハンサー配列が、哺乳動物遺伝子(ヘモグロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトタンパク質、およびインスリン)、ならびに真核細胞ウイルスから単離されている。エンハンサーを、異種コード配列に対して5'もしくは3'の位置でベクター中にスプライスすることができるが、典型的には、プロモーターに対して5'の部位に挿入する。典型的には、前記プロモーター、および必要に応じて、さらなる転写増強配列を選択して、異種DNAを導入しようとする宿主細胞型中での発現を最適化する(Scharfら(1994)、「熱ストレスプロモーターおよび転写因子(Heat stress promoters and transcription factors)」、Results Probl Cell Differ 20:125-62; Krieglerら(1990)、「トランスフェクトされた遺伝子の発現を制御するためのエンハンサー、プロモーター、およびスプライスシグナルの集合(Assembly of enhancers, promoters, and splice signals to control expression of transferred genes)」、Methods in Enzymol 185: 512-27)。必要に応じて、アンプリコンは、翻訳開始のためのリボゾーム結合部位または内部リボゾーム進入部位(IRES)を含んでもよい。
本発明の発現ベクターはまた、転写の終結およびmRNAの安定化のための配列、例えば、ポリアデニル化部位または終結配列(例えば、ヒト、マウス、霊長類、もしくはイヌRNAポリメラーゼI終結配列)を含んでもよい。そのような配列は、一般的には、真核またはウイルスDNAもしくはcDNAの5'末端、場合によっては3'、非翻訳領域から入手可能である。
さらに、上記のように、必要に応じて、前記ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型形質を提供する1個以上の選択マーカー遺伝子を含み、以前に列挙された遺伝子に加えて、ジヒドロ葉酸リダクターゼまたはネオマイシン耐性などのマーカーが、真核細胞培養物中での選択にとって好適である。
上記の好適なDNA配列を含む発現ベクター、ならびに好適なプロモーターもしくは制御配列を用いて、前記タンパク質の発現を可能にする宿主細胞を形質転換することができる。本発明の発現ベクターを細菌細胞中で複製することができるが、最も頻繁には、発現の目的のために、それらを哺乳動物細胞、例えば、Vero細胞、BHK細胞、MDCK細胞、293細胞、COS細胞、より好ましくは、MDCK細胞中に導入するのが望ましいであろう。
本発明の発現ベクターを用いて、1個以上の突然変異(例えば、H5N1などの特定のインフルエンザ大流行株のHA遺伝子中の多塩基切断部位の除去もしくは不活化)を有するゲノムvRNA(複数も可)または対応するcRNA(複数も可)の発現を指令することができる。これらの突然変異は、前記ウイルスの弱毒化をもたらし得る。例えば、vRNA断片は、パンハンドル二本鎖プロモーター領域における弱毒化塩基対置換、特に、例えば、NA-特異的vRNAの二本鎖領域中の位置11-12での、AからCおよびUからGへの公知の弱毒化塩基対置換(Fodorら、1998, J. Virol. 6923-6290)を有するA型インフルエンザウイルスのvRNA断片であってよい。組換えマイナス鎖RNAウイルスを作製するために本発明の方法を用いることにより、新しい弱毒化突然変異を同定することができる。
さらに、米国特許第6,951,754号、第6,887,699号、第6,649,372号、第6,544,785号、第6,001,634号、第5,854,037号、第5,824,536号、第5,840,520号、第5,820,871号、第5,786,199号、および第5,166,057号、ならびに米国特許出願公開第20060019350号、第20050158342号、第20050037487号、第20050266026号、第20050186563号、第20050221489号、第20050032043号、第20040142003号、第20030035814号、および第20020164770号に記載の発現ベクターのいずれかを、本発明に従って用いることができる。一般的には、これらの刊行物に記載のベクターを、本明細書に記載の本発明の核酸(例えば、イヌpol IIプロモーター配列などの本発明のイヌ調節配列)を、ウイルスvRNAもしくはcRNAの合成を指令する発現ベクター中に導入することにより、本発明に従う使用のために適合させることができる。
5.3.1 さらなる発現エレメント
最も一般的には、インフルエンザウイルスタンパク質をコードするゲノム断片は、機能的ウイルスタンパク質への翻訳などの、その発現にとって必要な任意のさらなる配列を含む。他の状況においては、ミニ遺伝子、またはウイルスタンパク質をコードする他の人工構築物、例えば、HAもしくはNAタンパク質を用いることができる。この場合、異種コード配列の効率的な翻訳を助ける特異的開始シグナルを含むことが望ましいことが多い。これらのシグナルは、例えば、ATG開始コドンおよび隣接配列を含んでもよい。挿入物全体の翻訳を保証するために、開始コドンを、ウイルスタンパク質に関して正確な読み枠で挿入する。外因性転写エレメントおよび開始コドンは、天然および合成の両方の、様々な起源のものであってよい。発現の効率を、使用する細胞系にとって好適なエンハンサーの含有により増強することができる。
必要に応じて、シグナル配列、分泌もしくは局在化配列などのさらなる発現されるエレメントをコードするポリヌクレオチド配列を、通常は、例えば、所望の細胞成分、膜、もしくは器官、または細胞培養培地へのポリペプチド発現を標的化するために、目的のポリヌクレオチド配列と読み枠を合わせて前記ベクター中に組み込むことができる。そのような配列は当業者には公知であり、分泌リーダーペプチド、オルガネラ標的化配列(例えば、核局在化配列、ER保持シグナル、ミトコンドリア輸送配列)、膜局在化／アンカー配列(例えば、停止転送配列、GPIアンカー配列)などが挙げられる。
5.4 キメラウイルスを作製するための発現ベクター
本発明の発現ベクターを用いて、ウイルスゲノムに対して異種である配列を発現するキメラウイルスを作製することもできる。vRNA(複数も可)または対応するcRNA(複数も可)の発現を指令する発現ベクターを、新規な感染性組換えマイナス鎖RNAウイルスもしくはキメラウイルスを生成するウイルスタンパク質の発現を指令する発現ベクターと共に宿主細胞中に導入する。例えば、米国特許出願公開第US20040002061号を参照されたい。これらのウイルス中で操作することができる異種配列としては、アンチセンス核酸およびリボザイムなどの核酸が挙げられる。あるいは、ペプチドまたはポリペプチドを発現する異種配列を、これらのウイルス中に操作することができる。これらのウイルス中に操作することができる以下のペプチドまたはポリペプチドをコードする異種配列は、1)病原体に特徴的である抗原；2)自己免疫疾患に特徴的である抗原；3)アレルゲンに特徴的である抗原；および4)腫瘍に特徴的である抗原を含む。例えば、本発明のキメラウイルス中に操作することができる異種遺伝子配列としては、限定されるものではないが、ほんの数例を挙げれば、gp160などのヒト免疫不全ウイルス(HIV)のエピトープ；B型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)；ヘルペスウイルスの糖タンパク質(例えば、gD、gE)；ポリオウイルスのVP1；ならびに細菌および寄生虫などの非ウイルス病原体の抗原決定基が挙げられる。
自己免疫疾患に特徴的である抗原は、典型的には、糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、悪性貧血、アジソン病、硬皮症、自己免疫性萎縮性胃炎、若年性糖尿病、および円板状エリテマトーデスに特徴的な抗原を含む哺乳動物組織の細胞表面、細胞質、核、ミトコンドリアなどから誘導されたものであろう。
アレルゲンである抗原は、一般的には、花粉、塵、カビ、胞子、フケ、昆虫および食品から誘導された抗原などのタンパク質または糖タンパク質である。
腫瘍抗原に特徴的である抗原は、典型的には、腫瘍組織の細胞表面、細胞質、核、器官などから誘導されたものであろう。例としては、突然変異された癌遺伝子によりコードされたタンパク質などの腫瘍タンパク質に特徴的な抗原；腫瘍に関連するウイルスタンパク質；および糖タンパク質が挙げられる。腫瘍としては、限定されるものではないが、癌の型から誘導されたもの：唇、鼻咽頭、咽頭および口腔、食道、胃、結腸、直腸、肝臓、胆嚢、膵臓、喉頭、肺および気管支、皮膚のメラノーマ、乳房、頸部、子宮、卵巣、膀胱、腎臓、子宮、脳および他の部分の神経系、甲状腺、前立腺、精巣、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および白血病が挙げられる。
本発明の1つの特定の実施形態においては、異種配列を、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、好ましくは、ヒト免疫不全ウイルス-1またはヒト免疫不全ウイルス-2のゲノムから誘導する。本発明の別の実施形態においては、異種コード配列を、ウイルスタンパク質内に異種ペプチド配列を含むキメラ遺伝子産物が発現されるように、マイナス鎖RNAウイルス遺伝子コード配列内に挿入することができる。本発明のそのような実施形態においては、異種配列を、ヒト免疫不全ウイルス、好ましくは、ヒト免疫不全ウイルス-1またはヒト免疫不全ウイルス-2のゲノムから誘導することもできる。
異種配列がHIV由来のものである例においては、そのような配列としては、限定されるものではないが、env遺伝子(すなわち、gp160、gp120、および／もしくはgp41の全部または一部をコードする配列)、pol遺伝子(すなわち、逆転写酵素、エンドヌクレアーゼ、プロテアーゼ、および／もしくはインテグラーゼの全部または一部をコードする配列)、gag遺伝子(すなわち、p7、p6、p55、p17/18、p24/25の全部または一部をコードする配列)、tat、rev、nef、vif、vpu、vpr、および／またはvpxから誘導された配列が挙げられる。
これらのハイブリッド分子を構築するための1つの手法は、異種配列が、ウイルスポリメラーゼ活性にとって必要なウイルス配列、例えば、イヌRNA pol Iプロモーターおよびポリアデニル化部位によりフランキングするように、マイナス鎖RNAウイルス遺伝子のDNA相補体中に異種コード配列を挿入することである。代替的な手法においては、イヌRNA pol Iプロモーターをコードするオリゴヌクレオチド、例えば、ウイルスゲノム断片の3'末端または両末端の相補体を、異種コード配列に連結して、ハイブリッド分子を構築することができる。標的配列内での外来遺伝子または外来遺伝子の断片の配置を、標的配列内の好適な制限酵素部位の存在により形式的に指令した。しかしながら、分子生物学における最近の進歩は、この問題を大きく減少させた。制限酵素部位を、部位特異的突然変異誘発の使用を介して、標的配列内のどこにでも容易に配置することができる(例えば、Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:488により記載された技術を参照)。記載された、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術における変更も、配列(すなわち、制限酵素部位)の特異的挿入を可能にし、ハイブリッド分子の容易な構築を可能にする。あるいは、PCR反応を用いて、クローニングの必要性なしに組換え鋳型を調製することができる。例えば、PCR反応を用いて、DNAにより指令されるRNAポリメラーゼプロモーター(例えば、バクテリオファージT3、T7またはSP6)を含む二本鎖DNA分子ならびに異種遺伝子およびイヌRNA pol Iプロモーターを含むハイブリッド配列を調製することができる。次いで、RNA鋳型を、この組換えDNAから直接転写させることができる。さらに別の実施形態においては、組換えvRNAまたは対応するcRNAを、RNAリガーゼを用いて、マイナス極性の異種配列およびイヌRNA pol Iプロモーターを特定するRNAを連結することにより調製することができる。
二シストロン性mRNAを構築して、ウイルス配列の翻訳の内部的開始を可能にし、正規の末端開始部位からの外来タンパク質コード配列の発現を可能にすることができる。あるいは、外来配列を内部部位から開始させながら、ウイルス配列を正規の末端オープンリーディングフレームから翻訳させる、二シストロン性mRNA配列を構築することができる。特定の内部リボゾーム進入部位(IRES)配列を用いることができる。選択されるIRES配列は、ウイルスパッケージング制限を妨害しないように十分に短いものであるべきである。かくして、そのような二シストロン手法のために選択されるIRESは、長さ500ヌクレオチド以下であるのが好ましいが、250ヌクレオチド未満が好ましい。さらに、用いられるIRESは、ピコルナウイルスエレメントと配列相同性または構造相同性を共有しないのが好ましい。好ましいIRESエレメントとしては、限定されるものではないが、哺乳動物BiP FRESおよびC型肝炎ウイルスのIRESが挙げられる。
あるいは、外来タンパク質を、転写単位が開始部位およびポリアデニル化部位を有する、内部転写単位から発現させることができる。別の実施形態においては、外来遺伝子を、得られる発現されたタンパク質が融合タンパク質であるように、マイナス鎖RNAウイルス遺伝子中に挿入する。
5.5 組換えウイルスを作製する方法
本発明は、ヘルパーウイルスの非存在下で、タンパク質発現ベクターおよび本発明の発現ベクターを発現するvRNAまたは対応するcRNAを宿主細胞中に導入することにより、感染性組換えマイナス鎖RNAウイルスを作製する方法を提供する。好ましくは、前記宿主細胞は、イヌ細胞、例えば、MDCK細胞である。本発明はまた、ヘルパーウイルスの存在下で、タンパク質発現ベクターおよび本発明の発現ベクターを発現するvRNAまたは対応するcRNAを宿主細胞中に導入することにより、感染性組換えマイナス鎖RNAウイルスを作製する方法を提供する。前記宿主細胞は、例えば、イヌ細胞(MDCK細胞など)、Vero細胞、Per.C6細胞、BHK細胞、PCK細胞、MDCK細胞、MDBK細胞、293細胞(例えば、293T細胞)、およびCOS細胞であってよい。
タンパク質発現ベクターおよびvRNAまたは対応するcRNAの発現を指令する発現ベクターを、限定されるものではないが、当業者には公知の任意の技術を用いて宿主細胞中に導入することができる。例えば、本発明の発現ベクターを、エレクトロポレーション、DEAE-デキストラン、リン酸カルシウム沈降法、リポソーム、マイクロインジェクション、および微粒子ボンバードメントを用いることにより宿主細胞中に導入することができる(例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、1989, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照)。本発明の発現ベクターを、宿主細胞に同時に、または連続的に導入することができる。
一実施形態においては、vRNA(複数も可)または対応するcRNA(複数も可)の発現を指令する1個以上の発現ベクターを、宿主細胞中に導入した後、ウイルスタンパク質の発現を指令する発現ベクターを導入する。別の実施形態においては、ウイルスタンパク質の発現を指令する1個以上の発現ベクターを、宿主細胞中に導入した後、vRNA(複数も可)または対応するcRNA(複数も可)の発現を指令する1個以上の発現ベクターを導入する。これらの実施形態に従って、vRNA(複数も可)または対応するcRNA(複数も可)の発現を指令する発現ベクターを、異なるトランスフェクションにおいて一緒に、または別々に導入することができる。さらに、これらの実施形態に従って、ウイルスタンパク質の発現を指令する発現ベクターを、異なるトランスフェクションにおいて一緒に、または別々に導入することができる。
別の実施形態においては、vRNA(複数も可)または対応するcRNA(複数も可)の発現を指令する1個以上の発現ベクターおよびウイルスタンパク質の発現を指令する1個以上の発現ベクターを、宿主細胞中に同時に導入する。特定の実施形態においては、全ての発現ベクターを、リポソームを用いて宿主細胞中に導入する。
一実施形態においては、組換えインフルエンザウイルスを製造する方法であって、(a)イヌ細胞の集団中に、該細胞中で、該ウイルスの完全なゲノムvRNA断片を提供するゲノムvRNA断片を発現することができる発現ベクターであって、配列番号26のヌクレオチド1〜469、またはその機能的に活性な断片を含む前記発現ベクターを導入すること；(b)該細胞中に、該ウイルスの1種以上のポリペプチドをコードするmRNAを発現することができる発現ベクターを導入すること；ならびに(c)該細胞を培養することによって、インフルエンザウイルス粒子を製造することを含む、前記方法を提供する。一実施形態においては、前記細胞を48〜72時間培養する際に産生されるインフルエンザウイルス粒子の力価は、少なくとも1.0 x 104 PFU/mlまたは少なくとも1.0 x 105 PFU/mlである。
一実施形態においては、組換えインフルエンザウイルスを製造する方法であって、(a)イヌ細胞の集団中に、該細胞中で、該ウイルスの完全なゲノムvRNA断片を提供するゲノムvRNA断片を発現することができる発現ベクターであって、配列番号26のヌクレオチド1〜469、またはその機能的に活性な断片を含む前記発現ベクターを導入すること；(b)該細胞中に、該ウイルスの1種以上のポリペプチドをコードするmRNAを発現することができる発現ベクターを導入すること；ならびに(c)該細胞を培養することによって、インフルエンザウイルス粒子を製造することを含む、前記方法を提供する。一実施形態においては、前記細胞を48〜72時間培養する際に産生されるインフルエンザウイルス粒子の力価は、少なくとも1.0 x 104 PFU/mlまたは少なくとも1.0 x 105 PFU/mlである。
本発明の方法を実行するための前記発現ベクターの好適な量および比率を、日常的な実験により決定することができる。指針として、宿主細胞中へのプラスミドのリポソームトランスフェクションまたはカルシウム沈降の場合、それぞれのプラスミドを、数μg、例えば、1〜10μgで用いて、例えば、約0.1μg/mlの最終総DNA濃度に希釈した後、従来の様式でトランスフェクション試薬と混合することができる。vRNA断片を発現するものよりも高い濃度で、NPおよび／またはRNA依存的RNAポリメラーゼサブユニットを発現するベクターを使用するのが好ましい。当業者であれば、発現ベクターの量および比率は、宿主細胞に応じて変化してもよいことを理解できるであろう。
一実施形態においては、少なくとも0.5μg、好ましくは、少なくとも1μg、少なくとも2.5μg、少なくとも5μg、少なくとも8μg、少なくとも10μg、少なくとも15μg、少なくとも20μg、少なくとも25μg、または少なくとも50μgの本発明の1種以上の発現ベクターを、宿主細胞中に導入して、感染性組換えマイナス鎖RNAウイルスを作製する。別の実施形態においては、vRNAまたはcRNAの発現を指令する、少なくとも0.5μg、好ましくは、少なくとも1μg、少なくとも2.5μg、少なくとも5μg、少なくとも8μg、少なくとも10μg、少なくとも15μg、少なくとも20μg、少なくとも25μg、または少なくとも50μgの本発明の1種以上の発現ベクターを宿主細胞中に導入して、感染性組換えマイナス鎖RNAウイルスを作製する。
本発明のマイナス鎖RNAウイルスを作製するのに用いることができる宿主細胞としては、一次細胞、培養細胞もしくは二次細胞、および形質転換されたか、または不死化された細胞(例えば、293細胞、293T細胞、CHO細胞、Vero細胞、PK、MDBK、OMKおよびMDCK細胞)が挙げられる。宿主細胞は、好ましくは、動物細胞、より好ましくは、哺乳動物細胞、および最も好ましくは、イヌ細胞である。好ましい実施形態においては、本発明の感染性組換えマイナス鎖RNAウイルスを、MDCK細胞中で生成させる。
本発明は、安定に形質導入された宿主細胞系中で感染性組換えマイナス鎖RNAウイルスを生成させる方法を提供する。本発明の安定に形質導入された宿主細胞を、好適な発現制御エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写終結配列、ポリアデニル化部位など)により制御されるcDNA、ならびに選択マーカーを宿主細胞に導入することにより作製することができる。外来DNAの導入後、形質導入された細胞を富化された培地中で1〜2日間増殖させた後、選択培地に切り替える。選択マーカーは、細胞に対する耐性を付与し、細胞はその染色体中にDNAを安定に組み込むことができる。安定に組み込まれたDNAを有する形質導入された宿主細胞をクローニングし、細胞系中で増殖させることができる。
限定されるものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wiglerら、1977, Cell 11:223)、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026)、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowyら、1980, Cell 22:817)遺伝子などのいくつかの選択系を、それぞれtk-、hgprt-またはaprt-細胞中で用いることができる。また、代謝拮抗物質耐性を、メトトレキサートに対する耐性を付与するdhfr(Wiglerら、1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567; O'Hareら、1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); ミコフェノール酸に対する耐性を付与するgpt(Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); アミノグリコシドG-418に対する耐性を付与するneo (Colberre-Garapinら、1981, J. Mol. Biol. 150:1); およびヒグロマイシンに対する耐性を付与するhygro (Santerreら、1984, Gene 30:147)遺伝子のための選択の基礎として用いることができる。
弱毒化されていない本発明の方法により作製された感染性組換えマイナス鎖RNAウイルスを、例えば、古典的方法により弱毒化するか、または死滅することができる。例えば、本発明の組換えマイナス鎖RNAウイルスを、該ウイルスが複製することができないように、熱処理もしくはホルマリン処理により死滅することができる。弱毒化されていない本発明の組換えマイナス鎖RNAウイルスを、例えば、非天然の宿主を介する継代により弱毒化して、免疫原性であるが、病原性ではない子孫ウイルスを製造することができる。
続いて、本発明に従って製造された弱毒化された、生ウイルスまたは死滅されたウイルスを、従来の様式でワクチン組成物中に組み込むか、または例えば、卵中でさらなるウイルスを製造するのに用いることができる。そのようなウイルスが、外来抗原をコードする上記で考察されたキメラvRNA断片を有する場合、それを製剤化して、2種以上の病原体に対するワクチン接種を同時に達成することができる。キメラvRNA断片を有する本発明に従って製造された弱毒化組換えウイルスを、他の治療的使用、例えば、抗腫瘍剤もしくは遺伝子治療道具のために設計し、その場合、ウイルスの製造を行った後、それを製薬上許容し得る担体もしくは希釈剤と共に好適な医薬組成物中に組み込むことができる。
本発明に従うヘルパーウイルスを用いないレスキューは、特に、選択方法がヘルパーウイルスの培養を取り除く必要はないため、再集合ウイルス、特に、ワクチン使用にとって望ましい再集合インフルエンザウイルスの作製にとって特に好ましい。
本発明の方法を、当業者には公知の方法の態様を含むように改変して、感染性ウイルス粒子のレスキューの効率を改善することができる。例えば、逆遺伝学技術は、ウイルスポリメラーゼによる認識および成熟ビリオンを生成するのに必要なパッケージングシグナルにとって必須であるマイナス鎖ウイルスRNAの非コード領域を含む合成組換えウイルスRNAの調製を含む。組換えRNAを、組換えDNA鋳型から合成し、精製されたウイルスポリメラーゼ複合体を用いてin vitroで再構成させて、細胞をトランスフェクトすることができる組換えリボ核タンパク質(RNP)を形成する。ウイルスポリメラーゼタンパク質が、in vitroまたはin vivoで合成RNAの転写の間に存在する場合、より効率的なトランスフェクションが達成される。合成組換えRNPを、感染性ウイルス粒子中でレスキューすることができる。前記技術は、1992年11月24日に発行された米国特許第5,166,057号; 1998年12月29日に発行された米国特許第5,854,037号；1998年8月4日に発行された米国特許第5,789,229号; 1996年2月20日に公開された欧州特許公開第EP 0702085A1号；米国特許出願第09/152,845号; 1997年4月3日に公開された国際特許出願公開PCT WO97/12032; 1996年11月7日に公開されたWO96/34625; 欧州特許公開第EP-A780475号; 1999年1月21日に公開されたWO99/02657; 1998年11月26日に公開されたWO98/53078; 1998年1月22日に公開されたWO98/02530; 1999年4月1日に公開されたWO99/15672; 1998年4月2日に公開されたWO98/13501; 1997年2月20日に公開されたWO97/06720; および1997年1月25日に公開されたEPO 780 47SA1(それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)に記載されている。
5.5.1 特異的に断片化されたマイナス鎖RNAウイルスの実施形態
本発明は、4個以上のvRNA断片を有する断片化されたマイナス鎖RNAウイルス、例えば、A型インフルエンザウイルスなどのインフルエンザウイルスの感染性組換えウイルス粒子を、培養細胞中で生成させる方法であって、(a)該ウイルスの増殖を支援することができる細胞の集団中に、該細胞中で、該ウイルスの完全なゲノムvRNA断片を提供するゲノムvRNA断片を発現することができる第1の発現ベクターセットを導入すること；(b)該細胞中に、該ウイルスの1種以上のポリペプチドをコードするmRNAを発現することができる第2の発現ベクターセットを導入すること；ならびに(c)該細胞を培養することによって、該ウイルス粒子を製造することを含む、前記方法を提供する。特定の実施形態においては、前記細胞はイヌ細胞である。特定の実施形態においては、前記細胞はMDCK細胞である。特定の実施形態においては、組換えウイルスは、AまたはB型インフルエンザウイルスである。特定の実施形態においては、第1の発現ベクターセットを、1〜8種のプラスミド中に含有させる。特定の実施形態においては、第1の発現ベクターセットを、1種のプラスミド中に含有させる。特定の実施形態においては、第2の発現ベクターセットを、1〜8種のプラスミド中に含有させる。特定の実施形態においては、第2の発現ベクターセットを、1種のプラスミド中に含有させる。特定の実施形態においては、第1、第2、または両方の発現ベクターセットを、エレクトロポレーションにより導入する。特定の実施形態においては、第1の発現ベクターセットは、インフルエンザウイルスのそれぞれのvRNA断片をコードする。特定の実施形態においては、第2の発現ベクターセットは、1種以上または全部のインフルエンザポリペプチドのmRNAをコードする。特定の実施形態においては、第1のもしくは第2の発現ベクターセット(または両方のセット)は、本発明の核酸、例えば、本発明のイヌRNA pol I調節配列(例えば、イヌRNA pol Iプロモーター)を含む。特定の実施形態においては、第1のもしくは第2の発現ベクターセット(または両方のセット)は、第2のウイルスのvRNAまたはmRNAをコードする。例えば、ベクターのセットは、第2のインフルエンザウイルスのHAおよび／またはNA mRNAおよび／またはvRNAをコードする1個以上のベクターを含む。一実施形態においては、ヘルパーウイルスを前記方法において用いる。一実施形態においては、前記方法において用いられる培養細胞は、イヌ細胞である。
本発明は、4個以上のゲノムvRNA断片を有する断片化されたマイナス鎖RNAウイルス、例えば、A型インフルエンザウイルスなどのインフルエンザウイルスの感染性組換えウイルス粒子を、培養細胞中で生成させる方法であって、(a)該ウイルスの増殖を支援することができる細胞の集団中に、両方とも、該細胞中で、該ウイルスの完全なゲノムvRNA断片を提供するゲノムvRNA断片を発現することができる発現ベクターおよび該ウイルスの1種以上のポリペプチドをコードするmRNAを発現することができる発現ベクターのセットを導入すること；(b)該細胞を培養することによって、該ウイルス粒子を製造することを含む、前記方法を提供する。特定の実施形態においては、前記細胞はイヌ細胞である。特定の実施形態においては、前記細胞はMDCK細胞である。特定の実施形態においては、前記ウイルスはAまたはB型インフルエンザウイルスである。特定の実施形態においては、発現ベクターのセットを、1〜17種のプラスミド中に含有させる。特定の実施形態においては、発現ベクターのセットを、1〜8種のプラスミド中に含有させる。特定の実施形態においては、発現ベクターのセットを、1〜3種のプラスミド中に含有させる。特定の実施形態においては、発現ベクターのセットを、1種のプラスミド中に含有させる。特定の実施形態においては、発現ベクターのセットを、エレクトロポレーションにより導入する。特定の実施形態においては、発現ベクターのセットは、インフルエンザウイルスのそれぞれのvRNA断片をコードする。特定の実施形態においては、発現ベクターのセットは、1種以上のインフルエンザポリペプチドのmRNAをコードする。特定の実施形態においては、発現ベクターのセットは、インフルエンザウイルスのそれぞれのvRNA断片および1種以上のインフルエンザポリペプチドのmRNAをコードする。特定の実施形態においては、発現ベクターのセットは、本発明の核酸、例えば、本発明のイヌRNA pol I調節配列(例えば、イヌRNA pol Iプロモーター)を含む。特定の実施形態においては、発現ベクターのセットは、第2のウイルスのvRNAまたはmRNAをコードする。例えば、ベクターのセットは、第2のインフルエンザウイルスのHAおよび／またはNA mRNAおよび／またはvRNAをコードする1種以上のベクターを含む。特定の実施形態においては、第1のもしくは第2の発現ベクターセット(または両方のセット)は、第2のウイルスのvRNAまたはmRNAをコードする。例えば、ベクターのセットは、第2のインフルエンザウイルスのHAおよび／またはNA mRNAおよび／またはvRNAをコードする1種以上のベクターを含む。一実施形態においては、ヘルパーウイルスを前記方法において用いる。一実施形態においては、前記方法において用いられる培養細胞は、イヌ細胞である。
本発明は、培養細胞中で、マイナス鎖RNAウイルスの感染性組換えウイルス粒子を生成させる方法であって、(a)該ウイルスの増殖を支援することができる細胞の集団中に、該細胞中で、該ウイルスの完全なゲノムvRNAを提供するゲノムvRNAを発現することができる第1の発現ベクターセットを導入すること；(b)該細胞中に、該ウイルスの1種以上のポリペプチドをコードするmRNAを発現することができる第2の発現ベクターセットを導入すること；ならびに(c)該細胞を培養することによって、該ウイルス粒子を製造することを含む、前記方法を提供する。特定の実施形態においては、前記細胞は、イヌ細胞である。特定の実施形態においては、前記細胞は、MDCK細胞である。特定の実施形態においては、前記ウイルスは、B型インフルエンザウイルスである。特定の実施形態においては、第1の発現ベクターセットを、1〜8種のプラスミド中に含有させる。特定の実施形態においては、第1の発現ベクターセットを、1種のプラスミド中に含有させる。特定の実施形態においては、第2の発現ベクターセットを、1〜8種のプラスミド中に含有させる。特定の実施形態においては、第2の発現ベクターセットを、1種のプラスミド中に含有させる。特定の実施形態においては、第1、第2、または両方の発現ベクターセットを、エレクトロポレーションにより導入する。特定の実施形態においては、第1の発現ベクターセットは、インフルエンザウイルスのそれぞれのvRNA断片をコードする。特定の実施形態においては、第2の発現ベクターセットは、1種以上のインフルエンザポリペプチドのmRNAをコードする。特定の実施形態においては、第1もしくは第2の発現ベクターセット(または両方のセット)は、本発明の核酸、例えば、本発明のイヌRNA pol I調節配列(例えば、イヌRNA pol Iプロモーター)を含む。一実施形態においては、ヘルパーウイルスを、前記方法において用いる。一実施形態においては、前記方法において用いられる培養細胞は、イヌ細胞である。
本発明は、培養細胞中で、マイナス鎖RNAウイルスの感染性ウイルス粒子を生成させる方法であって、(a)該ウイルスの増殖を支援することができる細胞の集団中に、両方とも、該細胞中で、該ウイルスの完全なゲノムvRNAを提供するゲノムvRNAを発現することができる発現ベクターと、該ウイルスの1種以上のポリペプチドをコードするmRNAを発現することができる発現ベクターのセットを導入すること；(b)該細胞を培養することによって、該ウイルス粒子を製造することを含む、前記方法を提供する。特定の実施形態においては、前記細胞は、イヌ細胞である。特定の実施形態においては、前記細胞はMDCK細胞である。特定の実施形態においては、前記ウイルスは、B型インフルエンザウイルスである。特定の実施形態においては、発現ベクターのセットを、1〜17種のプラスミド中に含有させる。特定の実施形態においては、発現ベクターのセットを、1〜8種のプラスミド中に含有させる。特定の実施形態においては、発現ベクターのセットを、1〜3種のプラスミド中に含有させる。特定の実施形態においては、発現ベクターのセットを、エレクトロポレーションにより導入する。特定の実施形態においては、発現ベクターのセットは、インフルエンザウイルスのそれぞれのvRNA断片をコードする。特定の実施形態においては、発現ベクターのセットは、1種以上のインフルエンザポリペプチドのmRNAをコードする。特定の実施形態においては、発現ベクターのセットは、インフルエンザウイルスのそれぞれのvRNA断片および1種以上のインフルエンザポリペプチドのmRNAをコードする。特定の実施形態においては、発現ベクターのセットは、本発明の核酸、例えば、本発明のイヌRNA pol I調節配列(例えば、イヌRNA pol Iプロモーター)を含む。特定の実施形態においては、発現ベクターのセットは、第2のウイルスのvRNAまたはmRNAをコードする。例えば、発現ベクターのセットは、第2のインフルエンザウイルスのHAおよび／またはNA mRNAおよび／またはvRNAをコードする1個以上のベクターを含む。一実施形態においては、ヘルパーウイルスを、前記方法において用いる。一実施形態においては、前記方法において用いられる培養細胞は、イヌ細胞である。
本発明は、培養イヌ細胞中で、4個以上のvRNA断片を有する断片化されたマイナス鎖RNAウイルス、例えば、A型インフルエンザウイルスなどのインフルエンザウイルスの感染性ウイルス粒子を生成させる方法であって、(a)該ウイルスの増殖を支援することができ、該イヌ細胞中で、該ウイルスの完全なゲノムvRNA断片、または対応するcRNAを提供する、ヘルパーウイルスの非存在下で、ゲノムvRNA断片を直接発現して、任意のそのようなRNA断片を提供することができる第1の発現ベクターセットを導入した、イヌ細胞の第1の集団であって、該イヌ細胞も、該ウイルスのゲノムvRNA断片を含むRNP複合体を形成させ、該ウイルス粒子を該イヌ細胞内で集合させることができる核タンパク質およびRNA依存的RNAポリメラーゼを提供することができる、前記集団を提供すること；ならびに(b)該イヌ細胞を培養することによって、該ウイルス粒子を製造することを含む、前記方法を提供する。特定の実施形態においては、前記イヌ細胞は、MDCK細胞である。
本発明はまた、培養されたイヌ細胞中で、断片化されたマイナス鎖RNAウイルスの感染性ウイルス粒子を生成させる方法であって、(i)該ウイルスの増殖を支援することができ、(a)ヘルパーウイルスの非存在下での該ウイルスのゲノムvRNAならびに(b)イヌRNA Pol I調節配列、またはその機能的誘導体の制御下で該細胞中で直接発現される該ゲノムvRNAを含むRNA複合体を形成し、該ウイルス粒子を集合させることができる核タンパク質およびRNA依存的RNAポリメラーゼを提供することができるように改変されるイヌ細胞の第1の集団を提供すること；ならびに(ii)該イヌ細胞を培養することによって、該ウイルス粒子を製造する、前記方法も提供する。
本明細書はまた、培養細胞中で、断片化されたマイナス鎖RNAウイルスの感染性ウイルス粒子を生成させる方法であって、(i)該ウイルスの増殖を支援することができ、(a)ヘルパーウイルスの非存在下での該ウイルスのゲノムvRNAならびに(b)イヌRNA Pol I調節配列またはその機能的誘導体、例えば、上記のイヌRNA Pol Iプロモーターの制御下で、該イヌ細胞中で直接発現される該ゲノムvRNAを含むRNP複合体(複数も可)を形成させ、該ウイルス粒子を集合させることができる核タンパク質およびRNA依存的RNAポリメラーゼを提供することができるように改変されるイヌ細胞の集団を提供すること；ならびに(ii)該イヌ細胞を培養することによって、該ウイルス粒子を製造する、前記方法も提供する。
特定の実施形態においては、イヌ宿主細胞中に、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、少なくとも7種、または少なくとも8種のゲノムvRNA断片を有する、感染性組換えマイナス鎖RNAウイルスを、本明細書に記載の方法を用いて作製する。
特定の実施形態においては、本発明は、vRNA断片または対応するcRNAおよびインフルエンザウイルスタンパク質、特に、PB1、PB2、PAおよびNAを発現する発現ベクターを用いて、宿主細胞中で感染性組換えインフルエンザウイルスを生成させる方法を提供する。この実施形態に従って、ヘルパーウイルスを含有させるか、または含有させずに、感染性組換えインフルエンザウイルスを作製することができる。
本発明の感染性組換えインフルエンザウイルスは、子孫を複製および産生してもしなくてもよい。好ましくは、本発明の感染性組換えインフルエンザウイルスを弱毒化する。弱毒化された感染性組換えインフルエンザウイルスは、例えば、NS1遺伝子中に突然変異を有してもよい。
特定の実施形態においては、本発明の感染性組換えウイルスを用いて、本発明のワクチン組成物を調製するのに有用な他のウイルスを作製することができる。一実施形態においては、本発明の方法により作製された組換えまたは再集合ウイルスを、ワクチンとしての使用のためのさらなるウイルスの製造のために用いる。例えば、本発明の方法により作製された組換えまたは再集合ウイルスの集団は、本発明のイヌRNA pol I調節配列(例えば、イヌRNA pol Iプロモーター)を含む。続いて、ウイルスの集団を、さらなるウイルスがワクチンまたは免疫原性組成物の調製のために産生されるように、卵または別の培養物中で増殖させる。
特定の実施形態においては、本発明の感染性組換えインフルエンザウイルスは、異種(すなわち、非インフルエンザウイルス)配列を発現する。別の実施形態においては、本発明の感染性組換えインフルエンザウイルスは、異なるインフルエンザ株に由来するインフルエンザウイルスタンパク質を発現する。さらに別の好ましい実施形態においては、本発明の感染性組換えインフルエンザウイルスは、融合タンパク質を発現する。
5.5.2 宿主細胞中へのベクターの導入
インフルエンザゲノム断片を含むベクターを、例えば、リン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、およびポリアミントランスフェクション試薬を用いるトランスフェクションなどの、異種核酸を真核細胞中に導入するための当業界で公知の方法(例えば、米国特許出願公開第US20050266026号および第20050158342号)に従って宿主細胞中に導入することができる。例えば、ベクター、例えば、プラスミドを、製造業者の説明書に従って、ポリアミントランスフェクション試薬TransIT-LT1 (Mirus)を用いて、例えば、MDCK細胞、COS細胞、293T細胞、またはその組合せなどの宿主細胞中にトランスフェクトすることができる。宿主細胞の集団に導入しようとする約1μgの各ベクターを、総量200μl中、160μmの培地、好ましくは無血清培地中に希釈された約2μlのTransIT-LT1と混合することができる。DNA：トランスフェクション試薬混合物を、室温で45分間インキュベートした後、800μlの培地を添加することができる。次いで、トランスフェクション混合物を宿主細胞に添加し、細胞を上記のように培養する。従って、細胞培養物中での組換えまたは再集合ウイルスの産生のために、それぞれ8種のゲノム断片(PB2、PB1、PA、NP、M、NS、HAおよびNA)を含むベクターを、約20μlのTransIT-LT1と混合し、宿主細胞中にトランスフェクトする。必要に応じて、血清を含む培地を交換した後、無血清培地、例えば、Opti-MEM 1を用いてトランスフェクトし、4〜6時間インキュベートする。
あるいは、エレクトロポレーションを用いて、宿主細胞中にインフルエンザゲノム断片を含むベクターを導入することができる。例えば、参照により本明細書に組み入れられるものとする、米国特許出願公開第US20050266026号および第20050158342号を参照されたい。例えば、A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルスを含むプラスミドベクターを、以下の手順に従うエレクトロポレーションを用いて、MDCK細胞中に導入する。簡単に述べると、例えば、10％ウシ胎仔血清(FBS)を補給した改変イーグル培地(MEM)中で増殖させた、5 x 106個のMDCK細胞を、0.3 mlのOptiMEM中に再懸濁し、エレクトロポレーションキュベット中に置く。最大25μlの容量中20μgのDNAを、キュベット中の細胞に添加した後、タッピングにより緩やかに混合する。300ボルト、950マイクロファラッドで、35〜45ミリ秒の時間定数を用いて、製造業者の説明書(例えば、Capacitance Extender Plusを接続したBioRad Gene Pulser II)に従って、エレクトロポレーションを実施する。細胞を、緩やかにタッピングすることにより再混合し、エレクトロポレーションの約1〜2分後、0.7 mlのOPTI-MEMをキュベットに直接添加する。次いで、細胞を、血清を含まない2 mlのOPTI-MEMを含む標準的な6穴組織培養皿の2個のウェルに移す。キュベットを洗浄して、残存する細胞を回収し、洗浄懸濁液を2個のウェルに分割する。最終容量は約3.5 mlである。次いで、細胞を、ウイルス増殖を可能にする条件下、例えば、低温適合性株については33℃で、インキュベートする。
宿主細胞中へのベクターの導入に関するさらなる指針を、例えば、米国特許第6,951,754号、第6,887,699号、第6,649,372号、第6,544,785号、第6,001,634号、第5,854,037号、第5,824,536号、第5,840,520号、第5,820,871号、第5,786,199号、および第5,166,057号ならびに米国特許出願公開第20060019350号、第20050158342号、第20050037487号、第20050266026号、第20050186563号、第20050221489号、第20050032043号、第20040142003号、第20030035814号、および第20020164770号に見出すことができる。
5.6 細胞培養
典型的には、前記ウイルスの増殖を、一般的には、宿主細胞を培養する培地成分中で達成する。インフルエンザウイルスの複製にとって好適な宿主細胞としては、例えば、Vero細胞、Per.C6細胞、BHK細胞、MDCK細胞、293細胞およびCOS細胞、例えば、293T細胞、COS7細胞が挙げられる。本発明の文脈においては、MDCK細胞が好ましい。宿主細胞としての非腫瘍原性MDCK細胞の使用も、本発明の実施形態である。上記細胞系のうちの2種、例えば、MDCK細胞および293TまたはCOS細胞を含む同時培養物を、例えば、1:1の比率で用いて、複製効率を改善することもできる。例えば、20050158342を参照されたい。典型的には、細胞を、血清(例えば、10％ウシ胎仔血清)を補給したダルベッコの改変イーグル培地などの標準的な市販の培養培地中、または無血清培地中、中性に緩衝化されたpH(例えば、7.0〜7.2のpH)を維持するのに好適な、制御された湿度およびCO2濃度下で培養する。必要に応じて、前記培地は、細菌の増殖を防止するための抗生物質、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシンなど、および／またはL-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸などの追加の栄養素、好ましい増殖特性を促進する追加の補給物質、例えば、トリプシン、β-メルカプトエタノールなどを含む。
培養物中で哺乳動物細胞を維持するための手順は幅広く報告されており、当業者には公知である。一般的なプロトコルは、例えば、Freshney (1983) 「動物細胞の培養：基礎的技術のマニュアル(Culture of Animal Cells: Manual of Basic Technique)」、Alan R. Liss, New York; Paul (1975) Cell and Tissue Culture、第5版、Livingston, Edinburgh; Adams (1980) 「生化学および分子生物学における研究室技術-生化学者のための細胞培養(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Cell Culture for Biochemists)」、WorkおよびBurdon (編) Elsevier, Amsterdamに提供されている。in vitroでのインフルエンザウイルスの製造における特定の目的の組織培養手順に関するさらなる詳細としては、例えば、Mertenら(1996) 「ワクチン調製のための細胞培養物中でのインフルエンザウイルスの製造(Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation)」、CohenおよびShafferman (編)「ワクチンの設計および製造における新しい戦略(Novel Strategies in Design and Production of Vaccines)」(その全体が本明細書に組み入れられるものとする)が挙げられる。さらに、本発明に適合させたそのような手順における変更は、日常的な実験を介して容易に決定される。
インフルエンザウイルスの製造のための細胞を、血清を含有する培地または無血清培地中で培養することができる。いくつかの場合、例えば、精製されたウイルスの調製のためには、宿主細胞を無血清条件で増殖させるのが望ましい。細胞を、小規模で、例えば、25 ml未満の培地、培養チューブもしくはフラスコ中、または大きいフラスコ中で、回転式ボトル中、またはフラスコ、ボトルもしくはリアクター培養中の微小担体ビーズ上(例えば、Dormacell、Pfeifer & Langen; Superbead, Flow LaboratoriesなどのDEAE-デキストラン微小担体ビーズ; Hellex, SoloHill, Ann Arborなどのスチレンコポリマー-トリ-メチルアミンビーズ)で培養することができる。微小担体ビーズは、細胞培養物の容量あたり、接着細胞増殖に関する大きい表面積を提供する小さい球体(直径100〜200ミクロンの範囲)である。例えば、1リットルの培地は、8000cm2を超える増殖面積を提供する2000万個を超える微小担体を含んでもよい。ウイルスの商業生産、例えば、ワクチン製造のためには、バイオリアクターまたは発酵器中で前記細胞を培養することが望ましいことが多い。バイオリアクターは、1リットル以下から100リットル以上の容量で利用可能であり、例えば、Cyto3バイオリアクター(Osmonics, Minnetonka, MN)；NBSバイオリアクター(New Brunswick Scientific, Edison, N.J.)；B. Braun Biotech International社製の研究室および商業規模のバイオリアクター (B. Braun Biotech, Melsungen, Germany)が挙げられる。
培養容量に関わらず、本発明の文脈においては、培養物を35℃以下の温度に維持して、組換えおよび／または再集合インフルエンザウイルス、特に、低温適合性、温度感受性、弱毒化組換えおよび／または再集合インフルエンザウイルスの効率的回収を確保することができる。例えば、前記細胞を、約32℃〜35℃の温度、典型的には、約32℃〜約34℃の温度、通常は、約33℃で培養する。
典型的には、調節器、例えば、温度自動調節器、または細胞培養系の温度を検知し、維持するための他の装置を用いて、温度がウイルス複製の間に35℃を超えないことを確保する。
5.7 ウイルスの回収
典型的には、ウイルスを、感染させた(トランスフェクトした)細胞を増殖させた培養培地から回収する。典型的には、粗培地を清澄化した後、インフルエンザウイルスを濃縮する。一般的な方法としては、濾過、限外濾過、硫酸バリウム上への吸着および溶出、ならびに遠心分離が挙げられる。例えば、感染した培養物に由来する粗培地を、最初に、例えば、1000〜2000 x gで、細胞破片および他の大きい粒子状物質を除去するのに十分な時間、例えば、10〜30分間遠心分離することにより清澄化することができる。あるいは、前記培地を、0.8μmの酢酸セルロースフィルターを介して濾過して、無傷の細胞および他の大きい粒子状物質を除去する。次いで、必要に応じて、清澄化された培地上清を遠心分離して、例えば、15,000 x gで約3〜5時間、インフルエンザウイルスを沈降させる。ウイルスペレットを、STE(0.01 M Tris-HCl; 0.15 M NaCl; 0.0001 M EDTA)またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH 7.4などの好適なバッファー中に再懸濁した後、ウイルスをスクロース(60％〜12％)または酒石酸カリウム(50％〜10％)上での密度勾配遠心により濃縮する。連続勾配または段階勾配、例えば、4種の12％段階中、12％〜60％のスクロース勾配が好適である。この勾配を、ウイルスを回収するための可視的バンドに濃縮するのに十分な速度、および時間で遠心分離する。あるいは、および最大規模の商業用途のために、連続モードで運転するゾーン遠心分離ローターを用いて密度勾配からウイルスを浄化する。組織培養物からのインフルエンザウイルスの調製を介して当業者を誘導するのに十分なさらなる詳細は、例えば、Furminger.「ワクチン製造(Vaccine Production)」、Nicholsonら(編) Textbook of Influenza pp. 324-332; Mertenら(1996)「ワクチン調製のための細胞培養物中でのインフルエンザウイルスの製造(Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation)」、Cohen & Shafferman (編) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines pp. 141-151、ならびに米国特許第5,690,937号、米国特許出願公開第20040265987号、第20050266026号および第20050158342号(参照により本明細書に組み入れられるものとする)に提供されている。必要に応じて、回収されたウイルスを、安定化剤としてのスクロース-リン酸-グルタミン酸(SPG)の存在下、-80℃で保存することができる。
5.8 インフルエンザウイルス
インフルエンザウイルスのゲノムは、免疫原性ヘマグルチニン(HA)およびノイラミニダーゼ(NA)タンパク質ならびに6個の内部核ポリペプチド：ヌクレオキャプシド核タンパク質(NP)；マトリックスタンパク質(M)；非構造タンパク質(NS)；および3種のRNAポリメラーゼ(PA、PB1、PB2)タンパク質をコードする、8個の断片の線状マイナス鎖リボ核酸(RNA)から構成される。複製の間に、ゲノムウイルスRNAは、宿主細胞の核中でプラス鎖メッセンジャーRNAおよびマイナス鎖ゲノムcRNAに転写される。8個のゲノム断片の各々は、RNAに加えて、NPおよびポリメラーゼ複合体(PB1、PB2およびPA)を含むリボ核タンパク質複合体中にパッケージングされる。
本発明のMDCK細胞中で本発明のプロセスにより製造することができるインフルエンザウイルスとしては、限定されるものではないが、認可された弱毒化、温度感受性マスター株の文脈において選択されたヘマグルチニンおよび／またはノイラミニダーゼ抗原を含む再集合ウイルスが挙げられる。例えば、ウイルスは、例えば、温度感受性(ts)、低温適合性(ca)、または弱毒化(att)(例えば、A/アンアーバー/6/60、B/アンアーバー/1/66、PR8、B/レニングラード(Leningrad)/14/17/55、B/14/5/1、B/USSR/60/69、B/レニングラード/179/86、B/レニングラード/14/55、B/イングランド(England)/2608/76、A/プエルトリコ(Puerto Rico)/8/34(すなわち、PR8)など、またはその抗原変異体もしくは誘導体)の1種以上であるマスター株を含んでもよい。
5.9 インフルエンザウイルスワクチン
歴史的には、インフルエンザウイルスワクチンは、関連する株の経験的予測に基づいて選択されたウイルス株を用いて孵化鶏卵中で製造されてきた。より最近では、認可された弱毒化、温度感受性マスター株の文脈において選択されたヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼ抗原を含む再集合ウイルスが製造されてきた。鶏卵中での複数回の継代を介するウイルスの培養後、インフルエンザウイルスを回収し、必要に応じて、例えば、ホルムアルデヒドおよび／またはβ-プロピオラクトンを用いて不活化する。しかしながら、この様式でのインフルエンザワクチンの製造は、いくつかの有意な欠点を有する。鶏卵から残存する夾雑物は高度に抗原性、発熱源性であり、投与の際に有意な副作用をもたらすことが多い。より重要なことに、製造のために指定された株を、典型的には、次の流行期の数ヶ月前に選択および分布して、インフルエンザワクチンの製造および不活化のための時間を可能にしなければならない。ワクチン製造にとって認可された株のいずれかが標準的な細胞培養条件下で効率的に増殖することができないことによって、細胞培養物中で組換えおよび再集合ワクチンを製造する試みが妨害された。
本発明は、ウイルスの1種以上の選択された抗原性株に対応するワクチンを迅速に製造することができる培養物中で組換えおよび再集合ウイルスを製造するためのベクター系、組成物、および方法を提供する。特に、細胞培養物中で多プラスミド系からのウイルスの効率的産生をもたらす条件および株を提供する。必要に応じて、望ましい場合、ウイルスをレスキューするのに用いられる培養物とは異なるウイルスを、鶏卵または細胞培養物中でさらに増幅することができる。
例えば、標準的な細胞培養条件下、例えば、37℃でB型インフルエンザマスター株B/アンアーバー/1/66を増殖させることはできなかった。本発明の方法においては、それぞれ、インフルエンザウイルスゲノムの断片を含む複数のプラスミドを、好適な細胞中に導入し、35℃以下の温度の培養物中で維持する。典型的には、この培養物を、約32℃〜35℃、好ましくは、約32℃〜約34℃、例えば、約33℃で維持する。
典型的には、前記培養物を、細胞培養インキュベーターなどの系中、制御された湿度およびCO2下で、温度が35℃を超えないことを確保するための温度自動調節器などの温度調節器を用いて一定の温度で維持する。
再集合インフルエンザウイルスを、マスターインフルエンザウイルスのゲノム断片をコードするcDNAを含むベクターのサブセットを、目的の株に由来する相補的断片(例えば、目的の抗原性変異体)と共に導入することにより容易に取得することができる。典型的には、このマスター株を、ワクチン投与に関して望ましい特性に基づいて選択する。例えば、ワクチン製造のために、例えば、弱毒化生ワクチンの製造のために、マスタードナーウイルス株を、弱毒化表現型、低温適合性および／または温度感受性について選択することができる。本文脈においては、A型インフルエンザ株ca A/アンアーバー/6/60；B型インフルエンザ株ca B/アンアーバー/1/66；またはその望ましい表現型特性について選択された別の株、例えば、弱毒化、低温適合性、および／または温度感受性株が、マスタードナー株として好ましく選択される。
一実施形態においては、インフルエンザマスターウイルス株の6個の内部vRNA断片(すなわち、PB1、PB2、PA、NP、NB、M1、BM2、NS1およびNS2)をコードするcDNAを含むプラスミドを、抗原的に望ましい株、例えば、有意な局所もしくは全身的インフルエンザ感染を引き起こすと予測される株に由来するヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼvRNA断片をコードするcDNAと共に、好適な宿主細胞中に導入する。効率的な回収にとって好適な温度、例えば、35℃以下、例えば、約32℃〜35℃、例えば、約32℃〜約34℃、または約33℃で、細胞培養物中で再集合ウイルスを複製した後、再集合ウイルスを回収する。必要に応じて、回収されたウイルスを、ホルムアルデヒドまたはβ-プロピオラクトンなどの変性剤を用いて不活化してもよい。
5.10 ワクチンの予防的投与のための方法および組成物
本発明の組換えおよび再集合ウイルスを、好適な担体または賦形剤中で予防的に投与して、1種以上のインフルエンザウイルス株に特異的な免疫応答を刺激することができる。典型的には、前記担体または賦形剤は、滅菌水、水性塩水溶液、水性緩衝塩水溶液、水性デキストロース溶液、水性グリセロール溶液、エタノール、未感染鶏卵に由来する尿膜腔液(すなわち、正常な尿膜腔液「NAF」)またはその組合せなどの製薬上許容し得る担体または賦形剤である。無菌性、pH、等張性、および安定性を保証するそのような溶液の調製を、当業界で確立されたプロトコルに従って行う。一般的には、担体または賦形剤を、アレルギー作用および他の望ましくない作用を最小化するように、ならびに投与の特定の経路、例えば、皮下、筋肉内、鼻内などに適合するように選択する。
一般的には、本発明のインフルエンザウイルスを、1種以上のインフルエンザウイルス株に特異的な免疫応答を刺激するのに十分な量で投与する。好ましくは、インフルエンザウイルスの投与は、保護的免疫応答を引き出す。1種以上のインフルエンザ株に対する保護的免疫応答を引き出すための用量および方法は、当業者には公知である。例えば、不活化インフルエンザウイルスを、投与される用量あたり、約1〜1000 HID50(ヒト感染用量)、すなわち、約105〜108pfu (プラーク形成単位)の範囲で提供する。あるいは、約10〜50μg、例えば、約15μgのHAを、アジュバントを用いずに投与し、より少量であれば、アジュバントと共に投与する。典型的には、この用量を、例えば、年齢、身体条件、体重、性別、食事、投与時間、および他の臨床因子に基づいて、この範囲内で調整することができる。予防用ワクチン製剤を、例えば、針およびシリンジ、または針を用いない注入装置を用いる皮下または筋肉内注入により全身投与する。あるいは、ワクチン製剤を、液滴、大粒子エアロゾル(約10ミクロン超)、または上気道への噴霧により、鼻内投与する。上記送達経路はいずれも保護的全身性免疫応答をもたらすが、鼻内投与はインフルエンザウイルスの侵入部位に粘膜免疫を引き出す追加の利益を与える。鼻内投与のためには、弱毒化生ウイルス、例えば、弱毒化、低温適合性および／または温度感受性組換えもしくは再集合インフルエンザウイルスが好ましいことが多い。単回投与による保護的免疫応答の刺激が好ましいが、同じか、または異なる経路によるさらなる用量を投与して、所望の予防効果を達成することができる。
あるいは、免疫応答を、インフルエンザウイルスによる樹状細胞のex vivoまたはin vivoでの標的化により刺激することができる。例えば、増殖している樹状細胞を、樹状細胞によるインフルエンザ抗原の捕捉を許容するのに十分な量および十分な期間、ウイルスに曝露する。次いで、この細胞を、標準的な静脈内移植方法により、ワクチン接種しようとする被験体に移す。
必要に応じて、インフルエンザウイルス、またはそのサブユニットの予防的投与のための製剤はまた、インフルエンザ抗原に対する免疫応答を増強するための1種以上のアジュバントを含んでもよい。好適なアジュバントとしては、サポニン、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油もしくは炭化水素乳濁液、カルメット・ゲラン桿菌(BCG)、コリネバクテリウム・パルバム(Corynebacterium parvum)、ならびに合成アジュバントQS-21およびMF59が挙げられる。
必要に応じて、インフルエンザウイルスの予防的ワクチン投与を、1種以上の免疫刺激分子の投与と共に実施することができる。免疫刺激分子としては、種々のサイトカイン、免疫刺激活性、免疫促進活性、および前炎症活性を有するリンホカインおよびケモカイン、例えば、インターロイキン(例えば、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13)；増殖因子(例えば、顆粒球-マクロファージ(GM)-コロニー刺激因子(CSF)；ならびに他の免疫刺激分子、例えば、マクロファージ炎症因子、Flt3リガンド、B7.1；B7.2などが挙げられる。免疫刺激分子を、インフルエンザウイルスと同じ製剤中で投与するか、または別々に投与することができる。タンパク質または該タンパク質をコードする発現ベクターを投与して、免疫刺激作用をもたらすことができる。
別の実施形態においては、インフルエンザゲノム断片を含む本発明のベクターを用いて、異種核酸を、宿主生物または宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト被験者から誘導された細胞中に、上記のような好適な製薬上の担体または賦形剤と共に導入することができる。典型的には、異種核酸を、遺伝子または遺伝子断片の非必須領域、例えば、断片7のM遺伝子中に挿入する。異種ポリヌクレオチド配列は、ポリペプチドもしくはペプチド、またはアンチセンスRNAもしくはリボザイムなどのRNAをコードしてもよい。次いで、異種核酸を、該異種核酸を含む組換えウイルスを作製することにより宿主または宿主細胞中に導入し、該ウイルスを上記のように投与する。一実施形態においては、異種ポリヌクレオチド配列は、インフルエンザウイルスから誘導されたものではない。
あるいは、異種核酸を含む本発明のベクターを、該ベクターをインフルエンザウイルスに感染した細胞に同時トランスフェクトすることにより宿主細胞中に導入し、発現させることができる。必要に応じて、次いで、細胞を被験体、典型的には、それらが得られた部位に戻すか、または送達する。いくつかの用途においては、前記細胞を、確立された細胞導入または移植手順を用いて、目的の組織、器官、または全身部位に移植する(上記のように)。例えば、骨髄、臍帯血、または末梢血由来造血幹細胞などの、造血系列の幹細胞を、標準的な送達または輸血技術を用いて被験体に送達することができる。
あるいは、異種核酸を含むウイルスを、被験体の細胞にin vivoで送達することができる。典型的には、そのような方法は、ベクター粒子の標的細胞集団(例えば、血液細胞、皮膚細胞、肝臓細胞、神経(脳など)細胞、腎臓細胞、子宮細胞、筋肉細胞、小腸細胞、頸部細胞、膣細胞、前立腺細胞など)、ならびに様々な細胞、組織および／もしくは器官に由来する腫瘍細胞への投与を含む。投与は、例えば、ウイルス粒子の静脈内投与によるか、または注入(例えば、針もしくはシリンジを用いる)、針を用いないワクチン送達、局所投与、または組織、器官、もしくは皮膚部位への押し付けなどの様々な方法により目的の部位に直接的にウイルス粒子を送達することによる、全身的なものであってよい。例えば、ウイルスベクター粒子を、吸入、経口、静脈内、皮下、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内、鞘内により、膣もしくは直腸投与により、または例えば、外科手術の間に、体腔もしくは身体の他の部位内にウイルス粒子を置くことにより送達することができる。
上記方法は、治療上もしくは予防上有効なポリペプチド(もしくはペプチド)またはRNA(例えば、アンチセンスRNAもしくはリボザイム)をコードする異種ポリヌクレオチドを含む本発明のベクターを、in vitro、ex vivoまたはin vivoで標的細胞の集団に導入することによる疾患もしくは障害を治療的および／または予防的に治療するのに有用である。典型的には、目的のポリペプチド(もしくはペプチド)、またはRNAをコードするポリヌクレオチドを、「発現ベクター」および「さらなる発現エレメント」の表題の節で上記された好適な調節配列に機能し得る形で連結する。必要に応じて、2個以上の異種コード配列を、1個のベクターまたはウイルスに組み込む。例えば、治療上もしくは予防上活性なポリペプチドまたはRNAをコードするポリヌクレオチドに加えて、前記ベクターはさらなる治療用もしくは予防用ポリペプチド、例えば、抗原、共刺激分子、サイトカイン、抗体など、および／またはマーカーなどを含んでもよい。
一実施形態においては、本発明は、潜在的な癌遺伝子を排除するための、ベンゾナーゼなどの薬剤で処理した本発明の再集合および組換えウイルス(またはその一部)を含む組成物を提供する。従って、癌遺伝子を含まないワクチン組成物は、本発明の実施形態内に具体的に含まれる。
本発明の方法およびベクターを、例えば、ウイルス、細菌などに起因する感染症のためのワクチンとして用いて、遺伝的障害および後天的障害などの様々な障害を治療的または予防的に治療することができる。
5.11 キット
本発明のベクターおよびベクター系の使用を容易にするために、前記ベクターのいずれか、例えば、共通インフルエンザウイルスプラスミド、変異体インフルエンザポリペプチドプラスミド、インフルエンザポリペプチドライブラリープラスミドなど、ならびに実験目的または治療目的のためのインフルエンザウイルスのパッケージングおよび感染にとって有用な、バッファー、細胞、培養培地などのさらなる成分を、キットの形態で包装することができる。典型的には、前記キットは、上記成分に加えて、例えば、本発明の方法を実施するための説明書、包装材料、および容器などを含んでもよいさらなる材料を含む。
5.12 ウイルス核酸およびタンパク質の操作
本発明の文脈においては、イヌRNA pol I調節配列を含む核酸もしくは本発明の他の核酸、発現ベクター、インフルエンザウイルス核酸および／またはタンパク質などを、よく知られた分子生物学技術に従って操作する。増幅、クローニング、突然変異誘発、形質転換などの多くのそのような手順に関する詳細なプロトコルは、例えば、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology (supplemented through 2000) John Wiley & Sons, New York (「Ausubel」); Sambrookら、Molecular Cloning - A Laboratory Manual (第2版), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 (「Sambrook」)、ならびにBergerおよびKimmel、Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (「Berger」)に記載されている。
上記参考文献に加えて、例えば、本発明のcDNAプローブを増幅するのに有用な、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、Qβ-レプリカーゼ増幅、および他のRNAポリメラーゼを介する技術(例えば、NASBA)などのin vitro増幅技術のためのプロトコルは、Mullisら(1987)、米国特許第4,683,202号; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innisら(編)) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (「Innis」); ArnheimおよびLevinson (1990) C&EN 36; The Journal Of NIH Research (1991) 3:81; Kwohら(1989) Proc Natl Acad Sci USA 86, 1173; Guatelliら(1990) Proc Natl Acad Sci USA 87:1874; Lomellら(1989) J Clin Chem 35:1826; Landegrenら(1988) Science 241:1077; Van Brunt (1990) Biotechnology 8:291; WuおよびWallace (1989) Gene 4: 560; Barringerら(1990) Gene 89:117、ならびにSooknananおよびMalek (1995) Biotechnology 13:563に見出される。本発明の文脈における核酸をクローニングするのに有用なさらなる方法としては、Wallaceら、米国特許第5,426,039号が挙げられる。PCRにより大きい核酸を増幅する改良された方法は、Chengら(1994)Nature 369:684およびその中の参考文献にまとめられている。
本発明の特定のポリヌクレオチド、例えば、オリゴヌクレオチドを、モノヌクレオチド-および／またはトリヌクレオチドに基づくホスホルアミダイトカップリング化学などの種々の固相戦略を用いて合成することができる。例えば、核酸配列を、活性化されたモノマーおよび／またはトリマーの伸長しているポリヌクレオチド鎖への連続的付加により合成することができる。例えば、Caruthers, M.H.ら(1992) Meth Enzymol 211:3を参照されたい。
所望の配列を合成する代わりに、本質的に任意の核酸を、Midland Certified Reagent Company (mcrc@oligo.com)、The Great American Gene Company (www.genco.com)、ExpressGen, Inc. (www.expressgen.com)、Operon Technologies, Inc. (www.operon.com)、および多くのその他などの様々な商業的供給源のいずれかから特注することができる。
さらに、ウイルスポリペプチド中での選択されたアミノ酸残基の置換を、例えば、部位特異的突然変異誘発により達成することができる。例えば、所望の表現型特性、例えば、弱毒化表現型、低温適合性、温度感受性と機能的に相関するアミノ酸置換を有するウイルスポリペプチドを、該ポリペプチドをコードするウイルス核酸断片中に特定の突然変異を導入することにより製造することができる。部位特異的突然変異誘発のための方法は、当業界でよく知られており、例えば、Ausubel、Sambrook、およびBerger、上掲に記載されている。部位特異的突然変異誘発を実施するための多くのキット、例えば、Chameleon Site Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla)が市販されており、製造業者の説明書に従って使用して、例えば、1個以上のアミノ酸置換を、それぞれA型またはB型インフルエンザポリペプチドをコードするゲノム断片中に導入することができる。
5.13 他のウイルス
本発明の核酸、ベクター、および方法を、他の組換えウイルスの発現および精製に用いることもできる。以下の考察は、他のそのようなウイルスと共に使用するためのベクターを適合させるのに重要な考慮のための指針を提供する。
標的ウイルスがプラス鎖の断片化されたRNAゲノムを含む場合、イヌRNA pol Iプロモーターを、内部転写単位(一方向系)でcDNAの上流に配置するのが好ましい。この実施形態においては、プラス鎖RNAを、新しいウイルス中への直接的組込みのために作製する。しかしながら、マイナス鎖の断片化されたRNAゲノムを含む標的ウイルスを、一方向系を用いて作製する実施形態は、本発明の範囲内にある。
標的ウイルスがマイナス鎖の断片化されたRNAゲノムを含む場合、イヌRNA pol Iプロモーターを、好ましくは内部転写単位(二方向系)でcDNAの下流に配置するのが好ましい。この実施形態においては、マイナス鎖RNAを、新しいウイルス中への直接的取込みのために作製する。プラス鎖の断片化されたRNAゲノムを含む標的ウイルスを、二方向系を用いて作製する実施形態は、本発明の範囲内にある。
また、本発明を用いて、感染性または非感染性非断片化RNAゲノム(一本鎖もしくは二本鎖)を含むウイルスを製造することもできる。一般的には、感染性ウイルスゲノムRNAの宿主細胞への単純な導入は、細胞内でのウイルスの生活環の開始および完全なウイルスの最終的な産生を引き起こすのに十分である。例えば、ピコルナウイルスのゲノムRNAの宿主細胞への単純な導入は、完全なピコルナウイルスの生成を引き起こすのに十分である。非感染性ゲノムRNAを含むウイルスの生活環の開始は、典型的には、通常は該ゲノムと共にウイルス粒子内に担持される他のウイルスタンパク質のさらなる導入を必要とする。例えば、パラインフルエンザウイルスIIIは、その存在がウイルスゲノムRNA複製の開始およびウイルスmRNAの転写にとって新しく感染した宿主細胞内で必要とされるRNA依存的RNAポリメラーゼを担持するが、該ポリメラーゼの存在下では、パラインフルエンザIIIゲノムRNAは感染性ではない。感染性の非断片化ゲノムRNAを含むウイルスが生成される本発明の実施形態においては、ウイルスゲノムを含む核酸を担持する、本発明の二重発現プラスミドの、好適な宿主細胞への単純な導入は、完全なウイルスの生成を引き起こすのに十分である。非感染性の非断片化ゲノムRNAを含むウイルスが生成される実施形態においては、さらなる発現プラスミドを、ウイルスゲノムを担持する二重発現プラスミドと共に宿主細胞中に導入する必要もある。さらなるプラスミドは、通常は感染の際に宿主細胞中に導入されるウイルスの生活環の開始にとって必要なタンパク質(例えば、RNA依存的RNAポリメラーゼ)を発現すべきである。
感染性の非断片化RNAゲノムを含むピコルナウイルスを製造する実施形態においては、完全なウイルスゲノムを含むcDNAを、本発明の二重プロモーター発現プラスミド中に挿入する。外部転写単位中の上流のプロモーター、好ましくは、pol IIプロモーターは、完全なウイルスゲノムを含むプラス鎖mRNAの産生を指令し、ポリタンパク質がmRNAから翻訳され、個々のタンパク質が該ポリタンパク質から切断および放出される(例えば、該ポリタンパク質内のプロテアーゼにより)。ウイルスゲノムはプラス鎖RNAを含むため、内部転写単位(一方向系)中の第2の上流プロモーター、好ましくは、イヌRNA pol Iは、該ゲノムのプラス鎖コピーの産生を指令する。ウイルスゲノムがマイナス鎖RNAを含む場合、内部転写単位(二方向系)中の、第2の下流プロモーター、好ましくは、イヌRNA pol Iは、該ゲノムのマイナス鎖コピーの産生を指令するであろう。マイナス鎖の非断片化RNAウイルスを一方向系を用いて産生させる実施形態は、本発明の範囲内にある。同様に、プラス鎖の非断片化RNAウイルスを二方向系を用いて産生させる実施形態は、本発明の範囲内にある。
ポリタンパク質が産生されない非感染性の非断片化RNAゲノムを含むウイルスを、本発明を用いて作製することもできる。例えば、本発明の系を用いて、その生活環が通常は、ウイルス由来RNA依存的RNAポリメラーゼによるゲノムマイナス鎖RNAからの複数のモノシストロン性mRNAの産生を含み、個々のタンパク質が該モノシストロン性mRNAから発現される、ラブドウイルスまたはパラミクソウイルス、好ましくは、パラインフルエンザウイルスIIIを製造することができる。これらの実施形態においては、プロモーター、好ましくは、pol IIプロモーターを含む外部転写単位は、一般的には、第1の遺伝子(NP)のみが翻訳されるウイルスゲノムのプラス鎖のポリシストロン性コピーの産生を指令する。さらに、プロモーター、好ましくは、イヌpol Iプロモーターを含む内部転写単位は、新しいウイルスへの取込みのためのゲノムのRNAコピーの発現を指令する。パラインフルエンザIIIウイルスゲノムはマイナス鎖RNAを含むため、内部転写単位のプロモーターを、cDNAの下流に配置するのが好ましい(二方向系)。ウイルスゲノムがプラス鎖RNAを含む場合、内部転写単位のプロモーターを、cDNAの上流に配置するのが好ましい(一方向系)。プラス鎖RNAゲノムを含むウイルスを二方向系を用いて産生させる実施形態およびマイナス鎖RNAゲノムを含むウイルスを一方向系を用いて産生させる実施形態は、本発明の範囲内にある。さらなるウイルスタンパク質(ポリシストロン性mRNAから発現されるタンパク質以外)が、ウイルスの転写および複製(LおよびP)にとって必要であり、これらのタンパク質を別々の発現プラスミド上で個々に提供する。
本発明はまた、二本鎖の断片化されたRNAゲノムを含むウイルスを作製する実施形態も含んでもよい。これらの実施形態においては、標的ウイルスゲノム中にそれぞれの遺伝子を含むプラスミドを、本発明の二重プロモーター発現プラスミド中に挿入することができる。このプラスミドは、一方向プラスミドまたは二方向プラスミドであってよい。外部転写単位中のプロモーター、好ましくは、pol IIプロモーターは、コードされるタンパク質に翻訳されるそれぞれの遺伝子のmRNA転写物の発現を指令する。内部転写単位中のプロモーター、好ましくは、イヌpol Iプロモーターは、プラス鎖(一方向系)またはマイナス鎖(二方向系)の転写を指令する。続いて、産生される第1鎖は、ウイルスRNAポリメラーゼによる相補鎖の産生のための鋳型として働くことができる。得られる二本鎖RNA産物を、新しいウイルス中に組み込む。
6. 特定の実施形態
1. イヌRNAポリメラーゼI調節配列を含む単離された核酸。
2. 調節配列がプロモーターである、実施形態1に記載の核酸。
3. 調節配列がエンハンサーである、実施形態1に記載の核酸。
4. 調節配列がエンハンサーおよびプロモーターの両方である、実施形態1に記載の核酸。
5. RNAポリメラーゼ調節配列が、配列番号1のヌクレオチド1〜1808またはその機能的に活性な断片を含む、実施形態1に記載の核酸。
6. 調節配列が、マイナス鎖ウイルスゲノムRNAまたは対応するcRNAをコードするcDNAに機能し得る形で連結されている、実施形態1、2、3、4、または5に記載の核酸。
7. マイナス鎖ウイルスゲノムRNAがインフルエンザゲノムRNAである、実施形態6に記載の核酸。
8. 前記核酸が転写終結配列をさらに含む、実施形態6または7に記載の核酸。
9. 実施形態1、2、3、4、5、6、7、または8に記載の核酸を含む発現ベクター。
10. 発現ベクターが細菌の複製起点を含む、実施形態9に記載の発現ベクター。
11. 発現ベクターが原核細胞中で選択することができる選択マーカーを含む、実施形態9に記載の発現ベクター。
12. 発現ベクターが真核細胞中で選択することができる選択マーカーを含む、実施形態9に記載の発現ベクター。
13. 発現ベクターがマルチクローニング部位を含む、実施形態9に記載の発現ベクター。
14. マルチクローニング部位を、前記調節配列からの該マルチクローニング部位に導入されるコード配列の発現を可能にするイヌRNAポリメラーゼI調節配列に関して方向を合わせる、実施形態13に記載の発現ベクター。
15. 実施形態7に記載の核酸を転写させることによって、インフルエンザゲノムRNAを産生させることを含む、インフルエンザゲノムRNAを製造する方法。
16. 実施形態9、10、11、12、13、もしくは14に記載の発現ベクターならびにPB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1、およびNS2からなる群より選択される1種以上のインフルエンザポリペプチドをコードするmRNAを発現する1個以上の発現ベクターを含むイヌ細胞を培養すること、ならびに組換えインフルエンザウイルスを単離することを含む、組換えインフルエンザウイルスを製造する方法。
17. ヘルパーウイルスを用いる、実施形態16に記載の方法。
18. 産生されるインフルエンザウイルスが感染性である、実施形態16に記載の方法。
19. 前記方法が、少なくとも1 x 103PFU/mlのインフルエンザウイルスの産生をもたらす、実施形態16、17または18に記載の方法。
20. 実施形態1、2、3、4、5、6、7または8に記載の核酸を含む細胞。
21. 実施形態9、10、11、12、13または14に記載の発現ベクターを含む細胞。
22. 前記細胞がイヌ細胞である、実施形態20または21に記載の細胞。
23. イヌ細胞が腎臓細胞である、実施形態22に記載のイヌ細胞。
24. イヌ腎臓細胞がMDCK細胞である、実施形態23に記載のイヌ腎臓細胞。
25. 培養されたイヌ細胞中で、4個以上のゲノムvRNA断片を有する組換え断片化マイナス鎖RNAウイルスを生成させる方法であって、(a)イヌ細胞の集団中に、該細胞中で、該ウイルスの完全なゲノムvRNA断片を提供するゲノムvRNA断片を発現することができる第1の発現ベクターセットを導入すること；(b)該細胞中に、該ウイルスの1種以上のポリペプチドをコードするmRNAを発現することができる第2の発現ベクターセットを導入すること；ならびに(c)該細胞を培養することにより、ウイルス粒子を産生させることを含む、前記方法。
26. 感染性インフルエンザウイルス粒子を産生させる、実施形態25に記載の方法。
27. ヘルパーウイルスを用いる、実施形態25または26に記載の方法。
28. 培養されたイヌ細胞中で、感染性インフルエンザウイルス粒子を生成させる方法であって、(a)イヌ細胞の集団中に、該細胞中で、i)該ウイルスの完全なゲノムvRNA断片を提供するゲノムvRNA断片およびii)該ウイルスの1個以上のポリペプチドをコードするmRNAを発現することができる発現ベクターのセットを導入すること；(b)該細胞を培養することによって、該ウイルス粒子を産生させることを含む、前記方法。
29. インフルエンザウイルスのvRNA断片を転写させる方法であって、イヌpol Iポリメラーゼポリペプチドと、該マイナス鎖ウイルスの該vRNA断片をコードするcDNA分子に機能し得る形で連結された、配列番号1〜28からなる群より選択される核酸を含むポリヌクレオチドとを接触させること；および転写されたvRNA断片を単離することを含む、前記方法。
30. vRNAを宿主細胞中で転写させる、実施形態29に記載の方法。
31. それぞれの発現ベクターが別々のプラスミド上にある、実施形態16、17、18、19、25、26、27または28に記載の方法。
32. 複数のベクターを含む組成物であって、該複数のベクターが、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスPA cDNAに機能し得る形で連結されたイヌpol Iプロモーターを含むベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスPB1 cDNAに機能し得る形で連結されたイヌpol Iプロモーターを含むベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスPB2 cDNAに機能し得る形で連結されたイヌpol Iプロモーターを含むベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスHA cDNAに機能し得る形で連結されたイヌpol Iプロモーターを含むベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスNP cDNAに機能し得る形で連結されたイヌpol Iプロモーターを含むベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスNA cDNAに機能し得る形で連結されたイヌpol Iプロモーターを含むベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスM cDNAに機能し得る形で連結されたイヌpol Iプロモーターを含むベクター、および転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスNS cDNAに機能し得る形で連結されたイヌpol Iプロモーターを含むベクターを含む、前記組成物。
33. PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1、およびNS2からなる群より選択される1個以上のインフルエンザポリペプチドをコードするmRNAを発現する1個以上の発現ベクターをさらに含む、実施形態32に記載の組成物。
34. 実施形態32または33に記載の組成物を含む宿主細胞。
35. 実施形態16、17、18、19、25、26、27または28に記載の方法により製造されたウイルスを含むワクチン。
36. 実施形態16、17、18、19、25、26、27または28に記載の方法により製造されたウイルスから調製された免疫原性組成物を含むワクチン。
37. それぞれの発現ベクターが、別々のプラスミド上にある、実施形態35または36に記載の組成物。
7. 実施例
以下の実施例は、単に本発明を例示するのに役立つものであり、いかなる方法においても本発明を限定することを意図するものではない。
7.1 実施例1：MDCK細胞中でのインフルエンザ株の増殖
本実施例は、インフルエンザを培養するためのいくつかの細胞系の特性評価を記載する。MRC-5、WI-38、FRhL-2、PerC6、293、NIH3T3、CEF、CEK、DF-1、Vero、およびMDCKなどの、いくつかの異なる細胞系および一次細胞を、野生型(wt)および実験室に適合させた、例えば、低温適合性(ca)のA型およびB型インフルエンザ株から誘導された遺伝子再集合体の両方の産生について評価した。多くの細胞型が、限定された程度で、いくつかの低温適合性インフルエンザ株の複製を支援したが、MDCKのみが、一貫して高力価のA型およびB型の両方のウイルスを産生した。例えば、PerC6細胞は、MDCK細胞中に認められるのと同様のレベルまで、特定のwtおよびcaのB型ウイルスの複製を支援することが見出されたが、増殖動力学は異なる(図1を参照)。対照的に、PerC6は、いくつかのcaのA型ウイルスの複製を支援することができなかった。図2は、wtならびにca A/シドニー(Sydney)/05/97およびA/北京(Beijing)/262/95ウイルスに関する増殖曲線を示す。両方の場合において、ca株はPerC6細胞中であまり複製しない。同様に、図3は、wtならびにca A/アンアーバー/6/60の増殖曲線を示し、これはca株がPerC6細胞中で効率的に複製せず、wt A/アンアーバー/6/60の複製はMDCK細胞中と同じほど強固ではない。PerC6細胞中でのインフルエンザウイルス複製のリアルタイムPCR分析により、caおよびwt Aインフルエンザウイルス株の両方のウイルスRNA(vRNA)が、感染後最初の24時間の間に増加するが、wt株のみが120時間まで増加し続け、ca株は増加しないことが示された。対照的に、wtおよびcaの両方のvRNAは、MDCK細胞中で増加し、3日目にプラトーに達した。図4を参照されたい。
また、潜在的な大流行ワクチンca A/ベトナム(Vietnam)/1203/2004の複製を支援するその能力について、MDCK細胞を試験した。MDCK細胞を、低い感染多重度でca A/ベトナム/1203/2004に感染させ、上清中のウイルスを感染後の様々な時点で定量した。感染後48時間までに、ca A/ベトナム/1203/2004の力価は、約8log10TCID50/mLに達し、次の3〜4日間は安定なままであった。図5を参照されたい。
この実験においては、ATCCから取得したMDCK細胞(受託番号CCL-34)を、合衆国から調達された10％ウシ胎仔血清を含む培地または好適な無血清培地(例えば、SFMV 100)中で限定された時間数、増殖させ、最初の特性評価試験のためのプレマスター細胞保存液を作製した。好適な無血清培地は、2004年12月23日に提出された米国特許仮出願第60/638,166号; 2005年1月5日に提出された米国特許仮出願第60/641,139号; および2005年12月16日に提出された米国特許出願第11/304,589号(それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする)に記載されている。細胞は両方の型の培地中で容易に増殖し、両方の細胞保存液は、それぞれ、以下の表1および図5に示されるような低温適合性ワクチン株および大流行株の複製を支援した。
Figure 2009534039
PerC6細胞中での制限された増殖の原因となる遺伝子断片を調査するために、8プラスミドレスキュー技術を用いて、インフルエンザA/AA/6/60株のそれぞれの遺伝子断片に関する7:1再集合体を作製した。8プラスミドインフルエンザレスキュー系の代表的な記載については、例えば、米国特許第6,951,754号を参照されたい。図6は、それぞれの7:1再集合体に関する模式図および命名戦略を示す。次いで、得られた再集合体を、PerC6細胞中で複製する能力についてアッセイした。図7を参照されたい。増殖制限表現型は、PB2およびPB1遺伝子断片にマッピングされるようである。この表現型の原因となる正確な位置の詳細なマッピングを、当業界でよく知られた方法を用いて実施することができる。例えば、同定された遺伝子断片におけるwtおよびca株の配列比較により、特異的差異の同定が可能になり、次いで、wtまたはca株に戻し突然変異させることができる。次いで、そのような突然変異体を、PerC6細胞中で増殖する能力について分析する。wt株の増殖を阻害するか、またはca株の増殖を可能にする任意の突然変異を、増殖制限表現型に寄与するものとして同定する。
7.2 実施例2：MDCK細胞系の腫瘍原性
一方は血清を含む培地中で増殖させ、他方は無血清培地中で増殖させた、MDCK細胞の2種のプレマスター細胞保存液の潜在的な腫瘍原性を、ワクチン製造に用いられると期待された後5回の細胞継代を行った段階で、無胸腺ヌードマウスモデルにおいて評価した。腫瘍原性を評価するために、10匹のマウス群に107個の細胞を皮下注入し、84日後、動物を犠牲にし、試験した。無血清培地中で継代された細胞を接種した10匹の動物のうちの6匹において、新生物が観察された。対照的に、10％ウシ胎仔血清を補給した培地中で継代された細胞を接種された動物のいずれにおいても、新生物の証拠はなかった；いくらかの線維肉腫が接種部位で観察されたが、血清中で継代された細胞は、表2に示されるように腫瘍原性ではなかった。
Figure 2009534039
また、表2に示されるように、それぞれの培地中での4回および20回の継代の両方でこれらの2種のプレマスター細胞保存液に対して、核型分析を行った。10％FCS中で継代された非腫瘍原性細胞は、他の染色体数(70〜82)を有する細胞の比較的制限された分布を有する78個の中期染色体の中央数を有していた。無血清培地中で継代された細胞も、78個の中期染色体の中央数を有していたが、有意により多い細胞が、52〜82個の中期染色体の異数性染色体数を有することが観察された。両事例において、核学は継代後に変化しなかった。
7.3 実施例3：無血清培地中で増殖させるためのMDCK細胞の適合化
ATCCから入手したMDCK細胞を、γ照射されたFBSを含む培地中で継代する。次いで、これらの細胞を、細胞バンク作製を支援するために選択された無血清培地製剤中、限定回数継代する。無血清培地は、米国特許仮出願第60/638,166号および第60/641,139号、ならびに米国特許出願第11/304,589号に記載されている。これらの追加の継代を、37℃または33℃で実施することができる。血清よりもむしろ植物由来補給物質を含む3種の培地中でのMDCK細胞の継代により、FCSを含有する培地中で継代されたMDCK細胞のものと同様の核型を有する細胞が得られた(データは示さない)。
7.4 実施例4：MDCK細胞のクローニング
細胞を、限界希釈を介して生物学的にクローニングして、産生細胞がユニークな遺伝子群から誘導されることを確保した。クローンを、分裂時間および相対腫瘍原性、ならびにウイルス産生などの様々な表現型特性についてスクリーニングした。概念実験の最初の証拠においては、54個のMDCKクローンが、FCSを含有する培地中で得られた。これらのクローンを継代し、それぞれを低い感染多重度でca A/ニューカレドニア(New Caledonia)/20/99に感染させた。感染の数日後、上清を除去し、上清中のウイルス量をTCID50により測定した。少数のクローンは比較的高力価のウイルスを産生し、非クローン化親細胞における産生より多かった。優れた生物学的および生理学的特性を有するクローンを用いて、以下に記載のようなマスター細胞バンク(MCB)を確立する。
7.5 実施例5：マスター細胞バンクの試験および特性評価
外来因子の証拠がないことを確保するために、MCBを幅広く試験する。例えば、利用可能なウイルス剤について、以下の表3に示されるような、1種以上のいくつかのPCRおよび／または抗体特異的試験を行う。
Figure 2009534039
7.6 実施例6：細胞培養物由来インフルエンザウイルスの前臨床特性評価
本実施例は、細胞培養物ならびに卵から製造されたインフルエンザ株の特性評価を記載し、前記系から製造されたウイルスを比較する。一般的には、インフルエンザウイルスは、ヒトにおけるワクチンとしての使用にとって好適であり、該ウイルスをそのような使用にとって好適にする生物学的特性を有する。本実施例においては、インフルエンザウイルスは、低温適合性(ca；低い温度で効率的に複製する能力を有する)、温度感受性(ts；より高い温度ではin vitroで複製が制限される)、および弱毒化(att；フェレットの肺組織において検出可能な複製を示さない)であり、本明細書ではcatsatt株と呼ぶ。この比較は、ウイルス産物の生化学、抗原、および遺伝的評価(配列決定)；ヒト細胞中での複製後のウイルスの生物学的および生化学的特性評価；許容可能な動物モデルにおける複製；ならびに許容可能な動物モデルにおける免疫原性を含む。
7.6.1 遺伝的、生化学的および抗原的比較可能性
A/H1N1、A/H5N1、A/H3N2およびB型のca ts att株は、MDCK細胞において比較的高い力価で複製した。さらに、MDCK細胞中でこれらのca ts att株を継代することにより、それらの遺伝子配列は変化しなかった。3種のca ts att株、ca A/シドニー/05/97、ca A/北京/262/95、およびca B/アンアーバー/1/94を、MDCK細胞中で1回また2回継代し、全部で6個の内部遺伝子のコード領域全体を配列決定し、出発材料と比較した。ヌクレオチド変化は観察されなかったが、これは、この基質を介するこの継代がこれらの株の遺伝子組成を変化させなかったことを示している。培地組成、入力用量(moi)、インキュベーションの温度および収穫の時間などの製造プロセスを模倣すると予想される条件下で、MDCK細胞中で産生された様々なワクチン株に対して、さらなる配列特性評価を行った。予備データに基づけば、MDCKにより産生されたウイルスのゲノム配列における変化はないであろうと予想される。
このゲノムはMDCK細胞中での継代後にも遺伝的に安定であったため、卵またはMDCK細胞中で産生されたワクチンの生物学的形質は識別不可能であると予想される。しかしながら、細胞培養物に由来する一次ウイルス産物は、特に、HAおよびNAなどのウイルスタンパク質の翻訳後修飾、またはウイルス膜における脂質の組成に関して、卵に基づく産物と比較していくつかの微妙な差異を有してもよい；両方とも、ビリオンの全体の生理学的特性を潜在的に変化させることはできなかった。細胞培養物により産生されたワクチンおよび卵により産生されたワクチンの抗原性に関する予備前臨床データにより、この重要なパラメーターにおいて検出可能な差異が存在しないことが示された。いくつかのワクチン株の卵保存液を、MDCK細胞を介して継代し、両産物の抗原性を、参照抗血清を用いてHAI力価を測定することにより決定した。表4に示されるように、HAI力価は全部、互いに2倍の範囲内にあり、これは、細胞中でのワクチンの複製が、卵に由来する材料と比較して、ワクチンの抗原性を変化させないことを示している。
Figure 2009534039
7.7 実施例7：培養物中でのヒト上皮細胞の感染
一実施形態においては、ヒト起源の細胞中でのMDCKおよび卵により産生されたワクチンの複製後の生化学的、生物学的、および構造的類似性を評価するために、ワクチンを、正常なヒト気管支上皮細胞(NHBE)などの関連する2倍体ヒト細胞中で1回継代することができる。この継代は、ヒト気道において1回の感染事象を模倣し、次いで、究極的には有効な免疫応答を引き出す原因となる子孫ウイルスの比較を可能にするのに役立つであろう。ワクチンのヘマグルチニン(結合および融合)ならびにノイラミニダーゼ活性の試験を、これらの材料上で測定し、ならびに電子顕微鏡、感染性粒子と全粒子の比、およびウイルスゲノム等価物などの他の生物学的および構造的試験を評価することができる。全体として、これらの比較は、細胞に由来するワクチンと、有効かつ安全な卵により産生されたワクチンとの比較可能性を証明するのに役立つであろう。分析試験の概要を、表5にまとめる。
Figure 2009534039
7.8 実施例8：前臨床動物モデル
フェレットは、弱毒化インフルエンザワクチンおよび成分ワクチン株の弱毒化および免疫原性を評価するのに用いられる強固な動物モデルである。MCBから産生された細胞由来インフルエンザ株の性能を、卵中で産生された同じ株と比較する。制御された試験におけるこれらの材料の面と向かった比較により、これらのウイルス産物の比較可能性の高レベルの保証が可能になる。
フェレットに感染するか、または「取込み」を達成する2種のワクチンの能力を評価するために、動物を軽く麻酔し、細胞または卵により産生されたウイルス調製物を鼻内接種する。鼻洗浄材料を、接種後の数個の時点で回収し、ウイルス量をいくつかの利用可能な方法の1つにより評価して、動物の上気道におけるウイルス複製の動力学および程度を評価する。実験を、様々な用量を用いて行い、この実験は、複数の株と、卵により産生された株に対する細胞培養物により増殖させた株の相対感染性を一般化するための異なる三価混合物とを含む。また、これらの同じ試験を用いて、感染を開始するウイルスの能力に本質的に関連する特性である、インフルエンザ株の免疫原性を評価することもできる。動物を出血させ、鼻洗浄液を接種後の様々な時点(週)で収穫する；これらの標本を用いて、血清抗体および感染に対する鼻IgA応答を評価する。これらのデータの最高点、感染性、血清抗体および粘膜抗体応答を用いて、卵により産生されたワクチンに対する細胞により産生されたワクチンの相対感染性を比較および評価することができる。最も可能性の高い結果は、細胞および卵により産生されたワクチン株が、類似する感染性および免疫原性を有すると予測されることである。細胞に由来するワクチンが、卵に由来する産物よりも感染性が高いか、または免疫原性が高いようであった場合、より低い用量の可能性を評価するさらなる試験を実施する。
いくつかの免疫原性および複製試験を、フェレットモデルにおいて実施して、単一単位ヒト用量を有する細胞培養物由来ワクチンを評価する。ca ts att株による感染は、一般的には、フェレットにおける強力かつ迅速な抗体応答を引き出す。さらに、個々のca ts att株を日常的に試験するが、これらの株は、鼻咽頭においては比較的高力価で複製するが、これらの動物の肺においては検出不可能なレベルで複製することにより、弱毒化(att)表現型を発現することが示される。これらの生物学的形質に対する細胞培養増殖の影響も評価する。しかしながら、att表現型はこれらの株の遺伝子組成の不可欠の部分であるため、いかなる差異も認められない可能性が高い。これらの株の増殖動力学および交叉反応性を、これらの動物における単一のヒト用量の投与後に評価する。これは、遺伝子系列内の複数の株と交叉反応する血清抗体を引き出す；および細胞に由来するワクチンは同じ能力を有するであろうと予想される。
これらの比較可能性評価は、一次ウイルス産物の潜在的な生化学的および／または生物物理学的差異における有意な見識を提供し、ヒト細胞または動物試験においてウイルスを最初に継代することにより測定されたca ts att株の性能に対するこれらの非遺伝的差異の影響を証明するべきである。現在までの配列情報に基づけば、MDCK細胞上での産生から得られるca ts att株の免疫原性性能に対する影響はないと予想される。
フェレットは、インフルエンザのための良好に文書化された動物モデルであり、ca ts att株の弱毒化表現型および免疫原性を評価するために日常的に用いられている。一般的には、8〜10週齢の動物を用いて、弱毒化を評価する；典型的には、試験設計は、試験あたりn=3-5匹の動物および対照群を評価する。免疫原性試験を、8週齢から6ヶ月齢の動物において評価し、一般的には、試験項目あたりn=3-5匹の動物または対照群を必要とする。これらの数は、統計学的に有効であるか、または観察的に重要な群間比較を得るための十分な情報を提供する。多くの試験の間に、インフルエンザ様兆候に気付くかもしれないが、その可能性は低い。フェレットは、食欲または体重の減少の兆候、鼻または眼の分泌物を示さない；インフルエンザ様疾患の兆候の観察は、試験の必須部分であり、鎮痛剤などの介入は正当ではない。宿弊または有意な体重減少などの不快症状の他の兆候は、担当獣医との議論後に動物の好適な性質(disposition)をもたらすであろう。
7.9 実施例9：マスターウイルス種(MVS)の開発
現在のインフルエンザワクチン株は、鳥細胞を、野生型ウイルスおよびA型もしくはB型MDVと同時感染させ、所望の6:2遺伝子群のための子孫を単離およびスクリーニングすることにより作製されている。このプロセスには、鳥細胞培養物および／またはSPF卵を介するウイルスの数回の継代が必要である。最近、インフルエンザウイルス調製物を製造するためにプラスミドレスキューが導入された。このプロセスにおいては、幅広く試験され、特性評価された細胞バンクから得たVero(アフリカミドリザル)細胞に、例えば、それぞれ8種のインフルエンザRNA断片の1つのcDNAコピーを含む、8種のDNAプラスミドをエレクトロポレーションする。エレクトロポレーションの数日後、これらのエレクトロポレーションされた細胞の上清は、インフルエンザウイルスを含む。次いで、この上清をSPF卵中に接種して、ワクチン株を増幅し、生物学的にクローニングする。これらの手順は両方とも、MVSを製造するためにSPF卵に接種されるワクチン株をもたらす。プラスミドレスキューは、より信頼性の高いタイミング、より遺伝的に正確な遺伝子断片および野生型単離物に由来する外来因子の夾雑の低い可能性などいくつかの利点を有したが、これらの2つの方法により作製された個々のMVSは、互いに識別不可能であり、これを用いて、バルクワクチン製造を開始することができる。本発明の方法および組成物を用いて、この方法を適合させて、プラスミドレスキューのためにVero細胞の代わりにMDCK細胞を用いる。
ワクチン株の最終的な増幅を、MDCK細胞バンクから誘導された細胞において行う。この最終的な増幅は、MDCK細胞の小規模培養(20μL未満)を用いて達成可能であり得る。これらの細胞に由来する上清を回収し、濃縮し、および特性評価／試験して、MVSを作製する。
7.10 実施例10：イヌRNA Pol I調節配列のクローニング
本実施例は、イヌ18SリボソームRNA遺伝子およびこの遺伝子の5'側の核酸配列のクローニングを記載する。
最初に、MDCK細胞(受託番号CCL-34、ATCC)に由来するゲノムDNAを、MasterPure DNA精製キット(EPICENTRE Biotechnologies; Madison, WI)を用いて単離した。配列アラインメントは、18S rRNA遺伝子が、イヌ、ヒト、マウス、ラット、およびニワトリにおいては約90％同一であることを示している。一対のプライマーを、サザンハイブリダイゼーションを介して、相補的配列を有する膜上での消化断片を検出するためのプローブとして、MDCKゲノムDNAに由来する約500 bpの領域を増幅するPCRのために、18S rRNA遺伝子の5'末端近くの保存された領域中の配列に基づいて設計した。1個の制限断片を、BamH I(約2.2 kb)およびEcoR I(約7.4 kb)で別々に消化されたゲノムDNA中で同定した。さらなる分析のために、両断片をpGEM 7ベクター(Promega Corp.; Madison, WI)中にクローニングした。EcoR I断片を含むプラスミドは、2006年4月19日にAmerican Type Culture Collectionによる寄託のために提出されたものであり、A.T.C.C.受託番号PTA-7540および2006年4月20日の受託日を割り当てられた。
制限消化分析により得られた2個のクローンを整列させ、この2個のクローンの向きを、2個のクローンの両末端を配列決定することにより確認した。Eco RI断片の制限マップを、図8として提供する。次に、5'のEcoRI部位と、3'方向の次のBamHI部位の間の該断片の完全な核酸配列を決定し、約3536塩基を含むヌクレオチド配列中に集合させた。この配列を、図9A-C(配列番号1)として提供する。
次に、プライマー伸長実験を実施して、イヌRNA pol I調節エレメントから発現される転写物の最初のヌクレオチドを同定した。簡単に述べると、総RNAをMDCK細胞から単離した。標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを、該RNAにアニーリングさせ、これを用いて18s rRNAの5'末端に向かうDNA合成をプライミングした。転写物中の1番目のヌクレオチドを同定するために、同じプライマーを用いて、従来のジデオキシヌクレオチドに基づくプロトコルを用いてrRNAを配列決定した。プライマー伸長において得られた核酸の長さを、配列決定反応において得られた種々の核酸と比較することにより、18s rRNAの1番目の塩基を同定することができる。1番目に転写されたヌクレオチド(+1位置)は、図9A-Cとして提供されたヌクレオチド配列の塩基1809にある。
このヌクレオチドから上流の配列が、下流の遺伝子の転写を指令するのに十分な調節エレメントを含むことを確認するために、該調節配列の制御下にあるEGFP遺伝子を含む構築物を、標準的な技術を用いて構築した。この構築物中で用いられるEGFP遺伝子は、Hoffmannら(2000)「A型インフルエンザウイルスの作製のためのアンビセンス手法：1つの鋳型からのvRNAおよびmRNAの合成(Ambisense approach for the generation of influenza A virus: vRNA and mRNA synthesis from one template)」、Virology 15:267(2):310-7に記載のEGFP遺伝子である。次いで、この構築物を、従来の技術を用いてMDCK細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、トランスフェクトされた細胞からRNAを単離し、EGFP遺伝子をコードする標識されたDNAを用いてノーザンブロット分析に供した。好適なサイズの転写物の検出により、MDCK細胞中にトランスフェクトされたプラスミドが、調節エレメントの3'側の配列の転写を指令する調節配列を含むことが確認された。
7.11 実施例11：イヌRNAポリメラーゼI調節エレメントの同定
本実施例は、イヌRNAポリメラーゼI調節エレメントであるイヌRNAポリメラーゼIプロモーターの同定および特性評価を記載する。
イヌRNA pol Iプロモーターおよび他の調節領域を、イヌプロモーター配列のための18s rRNAの転写の開始部位に対して5'側の配列を検査することにより同定する。さらに、単純な欠失実験を実施して、効率的な転写開始にとって必要な配列を同定する。1つのそのような欠失実験においては、制限部位を、部位特異的突然変異誘発により図9A-Cのヌクレオチド配列をコードするプラスミド中に導入するか、またはその中で同定する。この制限部位を、図9A-Cとして提供される配列における上記で同定された+1ヌクレオチド(ヌクレオチド1809)から約50ヌクレオチド3'側に導入する。+1位置に対して図9A-Cのヌクレオチド配列の5'側の別の制限部位を、部位特異的突然変異誘発により同定または導入する。
次いで、これらの制限部位を含むベクターを、好適な制限酵素を用いる消化により線状化する。次に、好適なヌクレアーゼ(例えば、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼIIIなど)を用いて、線状核酸を消化する。様々な時点で反応を停止させることにより、転写物の開始部の5'側領域中に様々なサイズの欠失を得ることができる。次に、線状プラスミドを再環状化し、好適な宿主細胞中に形質転換した後、スクリーニングして、所望の欠失を含むプラスミドを同定する。あるいは、導入しようとする欠失にフランキングする配列を含む好適なオリゴヌクレオチドを合成することができる。次いで、そのようなオリゴヌクレオチドを用いて、標準的な技術を用いてループアウト欠失を含む誘導体を作製する。また、オリゴヌクレオチドを用いて、標準的な技術を用いて部位特異的置換を作製することもできる。
転写を開始する様々な欠失または置換突然変異体の能力を、前記プラスミドをMDCK細胞にトランスフェクトし、上記のようなノーザンブロットにより、該プラスミドから転写されたRNAを検出することにより決定する。転写を許容するプラスミドの配列を、転写を許容しないものと比較することにより、イヌRNAポリメラーゼIプロモーターの配列を同定する。次いで、従来の技術を用いて、この配列をコードする核酸をクローニングする。
あるいは、イヌRNA pol Iプロモーターを、当業界で公知の他の方法により、例えば、ミニゲノム手法を用いることにより、配列番号1として提供される核酸からマッピングすることができる。例えば、pol Iプロモーターの制御下でクローニングされたマイナス鎖CAT遺伝子を含む、pFlu-CATと命名されたインフルエンザミニゲノムリポーターの使用について公開された米国特許出願第20050266026号を参照されたい。また、Hoffmannら(2000)「A型インフルエンザウイルスの作製のためのアンビセンス手法：1つの鋳型からのvRNAおよびmRNAの合成(Ambisense approach for the generation of influenza A virus: vRNA and mRNA synthesis from one template)」、Virology 15:267(2):310-7に記載のEGFPミニゲノム；およびPleschkaら(1996) J. Virol. 70(6):4188-4192に記載のCATミニゲノム系pPOLI-CAT-RTも参照されたい。
これらの系を用いて、効率的な転写開始にとって必要な配列を同定および特性評価するために、上記の様々な欠失／置換突然変異体または配列番号1の他のサブ配列を、リポーター遺伝子のマイナス鎖コピーの転写が、該欠失または置換突然変異体による転写の開始に依存するように、選択されたリポータープラスミド(例えば、PFlu-CAT、EGFPミニゲノム)に導入する。上記のEGFPを含む構築物を都合良く用いて、そのような欠失または置換突然変異体を作製することができる。次に、ウイルスRNA依存的RNAポリメラーゼは、リポータープラスミドから転写されたマイナス鎖RNAからプラス鎖mRNAを合成する。次いで、このプラス鎖mRNAは、リポータータンパク質(EGFPまたはCAT)活性を検出することができるように、細胞機構によって翻訳される。
前記アッセイにおいては、PB1、PB2、PAおよびNPまたはPB1、PA、NP(陰性対照として-PB2)のcDNAを含む発現プラスミドのセットを、推定イヌPol I調節配列の制御下で、A型インフルエンザウイルスのEGFPミニゲノムまたはpFlu-CATリポーターを含むプラスミドと共にMDCK細胞中にトランスフェクトする。次いで、この細胞を、該リポーター配列の転写および翻訳を許容する条件下で培養する。
前記リポータータンパク質の活性を、従来の技術を用いて検出する。EGFPの場合、トランスフェクトされた細胞を、トランスフェクションの48時間後に位相差顕微鏡または蛍光顕微鏡下で観察する。あるいは、フローサイトメトリーを用いて、EGFP発現を検出する。CAT遺伝子を含むミニゲノムを用いるアッセイにおいては、命名されたpFlu-CATを用いて、ポリメラーゼ活性を測定する。そのようなアッセイにおいては、CATタンパク質を直接検出することにより(例えば、ELISAにより)、CATをコードするmRNAを検出することにより(例えば、ノーザンブロットにより)、またはリポーター活性の指示因子としてCAT活性を検出することにより(例えば、好適な基質への放射標識されたアセチル基の導入を検出すること)、CAT発現を測定する。
例えば、プロモーター活性を示したMDCKクローンに由来するDNA断片(上記のプライマー伸長および転写アッセイを参照)を、マイナス鎖EGFP遺伝子、次いでマウスPol Iターミネーターの、それぞれ、5'および3'末端に融合されたインフルエンザ5'および3'非翻訳領域を含む挿入物の上流にクローニングした(図11を参照)。挿入されたMDCK配列：配列番号1のMDCK配列1〜1807(-1)、1〜1808(+1)および1〜1809(+2)において異なるこれらの個別の構築物を作製した。これらの構築物の各々を、インフルエンザ複製タンパク質(PB1、PB2、PAおよびNP)のための発現プラスミドと別々に混合し、MDCK細胞中にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの24時間後、細胞を蛍光顕微鏡により試験した。図12に示されるように、3種全部のMDCK断片、-1、+1および+2(それぞれ、左上、中央上および右上)は、EGFP蛍光をもたらしたが、プロモーター活性を欠く構築物はバックグラウンド蛍光(左下)のみを示した。1〜1808(+1)断片は、最も高いレベルの蛍光をもたらした。EGFPの発現を駆動するCMVプロモーターを含むプラスミドを、陽性対照(右下)として用いる。
インフルエンザ複製タンパク質は、真性のインフルエンザvRNA末端のみを複製するであろう。MDCK pol I配列を含むプラスミドの各々に由来するEGFPシグナルは、イヌ調節配列断片が、インフルエンザ複製を支援することができる正確なインフルエンザvRNA末端を有するRNAを産生するプロモーター活性を含んでいたことを示している。
イヌRNA pol I調節配列を同定および特性評価するのに有用な他のアッセイとしては、RNAフットプリンティング実験が挙げられる。そのような手順においては、例えば、図9A-Cに提供された配列を含むRNA分子を、イヌRNAポリメラーゼIの1個以上のサブユニットと接触させる。イヌRNA pol Iの1個以上のサブユニットは、その特定の親和性に従って好適なRNA配列に結合する。次に、RNAse、例えば、RNAse Iを用いて、イヌRNAポリメラーゼの1個以上のサブユニットにより保護されていないRNAを分解する。次いで、RNAseを不活性化し、RNAポリメラーゼIの保護している1個以上のサブユニットから単離されたRNA断片を保護する。この単離された断片は、RNAポリメラーゼIの1個以上のサブユニットにより結合した配列を含み、プロモーター／エンハンサー活性を有する配列の優れた候補である。さらに、これらのフットプリンティング実験を、イヌRNAポリメラーゼIの様々なサブユニットの存在下で実施して、RNA配列に結合するサブユニットを同定することができる。これらの実験は、例えば、様々なイヌPol Iポリメラーゼサブユニットの配列を、公知の配列および結合特異性を有する他の種に由来するRNAポリメラーゼIサブユニットと比較することにより、種々の結合した配列の活性を決定するのに役立ち得る。
in vitro技術を用いて、推定イヌpol I調節配列からの転写をモニターすることもできる。これらの技術においては、上記の様々な欠失／置換突然変異体または配列番号1もしくは26の他のサブ配列を、目的の転写物に機能し得る形で連結する。次いで、転写に必要なイヌRNAポリメラーゼIタンパク質のセットを、該転写物に付加する。例えば、ノーザンブロッティングにより、イヌRNAポリメラーゼIタンパク質により作製されたRNA転写物を検出することにより、効率的な転写を検出する。
同様のアッセイを用いて、他のイヌRNA pol I調節エレメント、例えば、エンハンサー、リプレッサー、またはRNA pol Iにより転写に影響する他のエレメントを同定することができる。一般的には、そのようなアッセイにおいては、配列番号1の欠失、置換、またはサブ配列を含むリポーター構築物からの発現レベルを、上記のように同定された最小のRNA pol Iプロモーターからの発現レベルと比較する。発現レベルを比較することにより、転写の増強または減少と関連するエレメントの存在を同定することができる。
7.12 実施例12：MDCK細胞中でのインフルエンザレスキュー
本実施例は、MDCK細胞培養物中でインフルエンザウイルスをレスキューするための実施例10でクローニングされたイヌRNA pol I調節エレメントの使用を記載する。
イヌRNA pol Iプロモーターの制御下でウイルスゲノムRNAをコードする8種の発現ベクターを、従来の分子生物学技術を用いて構築した。特に、プラスミド発現ベクターpAD4000 (配列番号29、図13)を、pAD3000中の213 bpのヒトPol Iプロモーター配列を、MDCK EcoRI-BamHIサブクローン(配列番号1の塩基1808〜1340)に由来する469 bpの断片(pAD4000中の塩基1〜469)と置換することにより、pAD3000ベクター(Hoffmanら、PNAS (2002), 99(17): 11411-11416、図10)から構築した。注記：図13中の469 bpの断片を、逆相補方向であるが、塩基1〜469として示す。469 bpのMDCK断片は、機能的イヌPol Iプロモーターを含む。さらに、pAD3000中の18 bpのリンカー配列AGGAGACGGTACCGTCTC(配列番号30)を、pAD4000中の24 bpのリンカー配列AGAGTCTTCTCGAGTAGAAGACCG(配列番号31)と置換した。
そのうちの2種(NS、配列番号32およびPB1、配列番号40)が、サイレント突然変異(それぞれ、配列番号33および41、ならびに図16)を含むMDV Bゲノムをコードする8種のインフルエンザ断片を、8種の別々のpAD4000発現ベクター中にクローニングした(機能的イヌPol Iプロモーターの制御下)。次いで、8種の発現ベクターを、無血清Opti-MEM(登録商標)I培地(Invitrogen)中のMDCK細胞中にエレクトロポレーションし、細胞に由来する上清を用いて卵に接種した。33℃で72時間インキュベートした後、ウイルスをHA陽性卵から収穫した。ウイルスから抽出されたRNAに対して、RT-PCR反応(プライマー配列(配列番号34〜39)ならびに図14および15中のアニーリング位置を参照)を実施した後、PCR産物のヌクレオチド配列分析を行った。サイレント突然変異を含むPB1およびNS断片の存在に基づいて、生きた感染性インフルエンザウイルスがMDCK細胞中でレスキューされたかどうかを決定した。
驚くべき事に、高力価のレスキューされたウイルス(MDV-BおよびMDV-Bm[サイレント突然変異を有するMDV-B]の両方)が、上清中に見出された。表6を参照されたい。例えば、4〜5 log10PFU/mlのウイルスが、3日目に測定された。典型的には、Vero細胞に基づくヒトpol IIプロモーター系を用いてレスキューされたウイルスの力価は、2〜3日目にわずかに≦100 pfuである。従って、本明細書に記載のイヌpol Iプラスミドレスキュー系は、他者により記載された既存のプラスミドレスキュー技術より非常に効率的であるようである。
Figure 2009534039
イヌpol Iプラスミドレスキュー系の強固性を、B株およびA株caマスタードナーウイルス(MDV)の両方、ならびに多くのAおよびB株再集合体のレスキューにより証明した。再集合体については、好適なMDV(AまたはB株)に由来する6個の内部遺伝子断片を、以下のサブタイプ：H1N1、H2N2、H3N2、H5N1のA株または山形(Yamagata)もしくはB/ビクトリア(Victoria)系列に由来するB株に由来するHAおよびNA断片と混合した。レスキューされたMDV株および再集合体を、表7にまとめる。これらのウイルスを、本質的には上記のようにレスキューした。AまたはB株ゲノムをコードするインフルエンザ断片を、別々のpAD4000発現ベクター(上記の機能的イヌPol Iプロモーターを含む)中にクローニングした。次いで、レスキューしようとする株の8種全部のインフルエンザ断片をコードする8種の発現ベクターを、無血清Opti-MEM(登録商標)I培地(Invitrogen)中のMDCK細胞中にトランスフェクトし、細胞に由来する上清を用いて卵に接種した。これらの実験においては、トランスフェクションを、製造業者により提供された説明書に従って、非リポソームトランスフェクション試薬(PromoFectinカタログ番号PK-CT-2000, PromoKine, Germany)を用いて実施した。33℃で72時間インキュベートした後、ウイルスをHA陽性卵から収穫した。
Figure 2009534039
前述の発明を、明確性および理解の目的のためにいくつかの詳細において説明してきたが、形態および詳細における様々な変更を、本発明の範囲を逸脱することなく行うことができることが、本開示を読むことから当業者には明らかであろう。例えば、上記の技術および装置の全部を、様々な組合せにおいて用いることができる。本明細書で引用された全ての刊行物、特許、特許出願、または他の書類は、それぞれ個々の刊行物、特許、特許出願、または他の書類があらゆる目的で参照により組み入れられるように個別に指示されるのと同じ程度まで、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。さらに、2006年6月20日に出願されたPCT特許出願第PCT/US2006/023867号；2006年6月20日に出願された米国特許出願第11/455,734号; 2006年8月9日に出願された米国特許出願第11/501,067号; 2006年4月19日に出願された米国特許仮出願第60/ 793,522号; 2006年4月19日に出願された米国特許仮出願第60/ 793,525号; 2005年7月22日に出願された米国特許仮出願第60/702,006号; 2005年7月15日に出願された米国特許仮出願第60/699,556号; 2005年7月15日に出願された米国特許仮出願第60/699,555号; 2005年6月21日に提出された米国特許仮出願第60/692,965号；および2005年6月21日に出願された米国特許仮出願第60/692,978号は、あらゆる目的で参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする。
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図1は、PerC6およびMDCK細胞の両方におけるwtおよびca B株(B/北京(Beijing)/243/97)の増殖曲線を示す；各時点についてのウイルス力価を、TCID50アッセイにより決定した。 図2は、PerC6およびMDCK細胞の両方におけるwtおよびca A株(A/シドニー(Sydney)/05/97およびA/北京/262/95)の増殖曲線を示す；各時点についてのウイルス力価を、TCID50アッセイにより決定した。 図3は、PerC6およびMDCK細胞の両方におけるwtおよびca A株(A/アンアーバー(Ann Arbor)/6/60)の増殖曲線を示す；各時点についてのウイルス力価を、TCID50アッセイにより決定した。 図4は、ウイルスRNAのM断片に特異的なTaqman(登録商標)(Roche Molecular Systems; Palo Alto, CA)プローブを用いる、PerC6およびMDCK細胞中でのA/シドニーのウイルスRNAのリアルタイム分析を示す。 図5は、MDCK細胞におけるca A/ベトナム(Vietnam)/1203/2004 (H5N1)の増殖曲線を示す；各時点についてのウイルス力価を、TCID50アッセイにより決定した。 図6は、8種のプラスミドレスキュー技術により作製された7:1再集合体としてのそれぞれのインフルエンザ遺伝子断片のレスキューを示す図である。 図7は、PerC6細胞におけるそれぞれの7:1再集合体の増殖曲線を示す；各時点についてのウイルス力価を、TCID50アッセイにより決定した。 図8は、イヌRNA pol I調節配列を含むEco RI断片の制限マップを示す。 図9A-Cは、提供される配列中でヌクレオチド1809(+1)で始まる、18s rRNA遺伝子の少なくとも一部をコードする、イヌゲノムDNAからクローニングされた約3.5 kBの核酸のヌクレオチド配列(配列番号1)を示す。 図9Aの続きである。 図9Bの続きである。 図10は、本発明の発現ベクターを作製するために容易に適合させることができるプラスミドpAD3000のマップを示す。 図11は、ミニゲノムアッセイにおいて用いられるMDCK pol Iプロモーター構築物の図を示す。 図12は、ミニゲノムアッセイの結果を示す。-1、+1および+2 MDCK pol Iプロモーター構築物から作製されたEGFPシグナルを、それぞれ、左上、中央上および右上のパネルに示す。マイナスプロモーター対照は、バックグラウンド蛍光(左下)のみを示す。また、陽性対照として、細胞をCMV-EGFP構築物(右下)を用いてトランスフェクトした。 図13A-Bは、MDCK Eco RI-Bam HIサブクローン(配列番号1の塩基1340〜1808)に由来する469 bpの断片(pAD4000中の塩基1〜469)を含むプラスミド発現ベクターpAD4000 (配列番号29)の配列を示す。注記：469 bpの断片を、逆相補方向で示し、リンカー配列に下線を付し、太字で示す。 図13Aの続きである。 図14は、レスキューされたウイルスのRNA上でRT-PCR反応を行うのに用いられるプライマーのアニーリング位置を示す。 図15は、レスキューされたウイルスのRNA上でRT-PCR反応を行うのに用いられるプライマーの配列を示す。 図16A-Bは、NSおよびPB1断片の部分配列ならびに導入されたサイレント突然変異の位置を示す。 図16Aの続きである。

Claims (31)

  1. イヌRNAポリメラーゼI調節配列を含む単離された核酸。
  2. 前記調節配列がプロモーターである、請求項１に記載の核酸。
  3. 前記RNAポリメラーゼI調節配列が、配列番号26のヌクレオチド1〜469、その相補体、その逆相補体、またはその機能的に活性な断片を含む、請求項１に記載の核酸。
  4. 前記調節配列が、マイナス鎖ウイルスゲノムRNAまたは対応するcRNAをコードするcDNAに機能し得る形で連結されている、請求項１、２または３に記載の核酸。
  5. 前記核酸が、転写終結配列をさらに含む、請求項４に記載の核酸。
  6. 前記マイナス鎖ウイルスゲノムRNAがインフルエンザゲノムRNAである、請求項５に記載の核酸。
  7. 請求項６に記載の核酸を含む発現ベクター。
  8. 細胞中で請求項６に記載の核酸を転写させることによって、インフルエンザゲノムRNAを製造することを含む、インフルエンザゲノムRNAの製造方法。
  9. 請求項７に記載の発現ベクターならびにPB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1、およびNS2からなる群より選択される1種以上のインフルエンザポリペプチドをコードするmRNAを発現する1個以上の発現ベクターを含むイヌ細胞を培養すること；ならびに組換えインフルエンザウイルスを単離することを含む、組換えインフルエンザウイルスの製造方法。
  10. (a)イヌ細胞の集団中に、該細胞中でインフルエンザウイルスの完全なゲノムvRNA断片を提供するゲノムvRNA断片を発現することができる発現ベクターであって、配列番号２６のヌクレオチド1〜469、またはその機能的に活性な断片を含む前記ベクターを導入すること；(b)該細胞中に、該ウイルスの1種以上のポリペプチドをコードするmRNAを発現することができる発現ベクターを導入すること；ならびに(c)該細胞を培養することによって、インフルエンザウイルス粒子を産生させることを含む、組換えインフルエンザウイルスの製造方法。
  11. 48〜72時間、前記細胞を培養する際に産生されたインフルエンザウイルス粒子の力価が、少なくとも1.0 x 104PFU/mlである、請求項１０に記載の方法。
  12. 48〜72時間、前記細胞を培養する際に産生されたインフルエンザウイルス粒子の力価が、少なくとも1.0 x 105PFU/mlである、請求項１０に記載の方法。
  13. 産生されるインフルエンザウイルス粒子が感染性である、請求項９に記載の方法。
  14. 産生されるインフルエンザウイルス粒子が感染性である、請求項１０に記載の方法。
  15. 請求項７に記載の発現ベクターを含む細胞。
  16. 前記細胞はイヌ細胞である、請求項１５に記載の細胞。
  17. 前記イヌ細胞が腎臓細胞である、請求項１６に記載のイヌ細胞。
  18. 前記イヌ腎臓細胞がMDCK細胞である、請求項１７に記載のイヌ腎臓細胞。
  19. 培養されたイヌ細胞中で、4個以上のゲノムvRNA断片を有する組換え断片化されたマイナス鎖RNAウイルスを生成させる方法であって、(a)イヌ細胞の集団中に、該細胞中で該ウイルスの完全なゲノムvRNA断片を提供するゲノムvRNA断片を発現することができる第1の発現ベクターセットを導入すること；(b)該細胞中に、該ウイルスの1種以上のポリペプチドをコードするmRNAを発現することができる第2の発現ベクターセットを導入すること；ならびに(c)該細胞を培養することによって、ウイルス粒子を産生させることを含む、前記方法。
  20. 組換えインフルエンザウイルスを製造する方法であって、
    i)イヌ細胞の集団中に、
    a)該細胞中で、該ウイルスの完全なゲノムvRNA断片を提供するゲノムvRNA断片を発現することができる発現ベクターであって、1個以上の該発現ベクターが配列番号26のヌクレオチド1〜469、もしくはその機能的に活性な断片を含む、前記発現ベクター、ならびに、
    b)該細胞中で、PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1、およびNS2からなる群より選択される1種以上のインフルエンザポリペプチドをコードするmRNAを発現することもできる発現ベクター、
    を導入すること；ならびに、
    ii)該細胞を培養することによって、インフルエンザウイルス粒子を産生させること、
    を含む、前記方法。
  21. 前記細胞を48〜72時間培養する際に産生されるインフルエンザウイルス粒子の力価が、少なくとも1.0 x 104PFU/mlである、請求項１９または２０に記載の方法。
  22. 前記細胞を48〜72時間培養する際に産生されるインフルエンザウイルス粒子の力価が、少なくとも1.0 x 105PFU/mlである、請求項１９または２０に記載の方法。
  23. 請求項２０に記載の方法により製造されたインフルエンザウイルス。
  24. ヘルパーウイルスを用いる、請求項１０、１９または２０に記載の方法。
  25. 配列番号２９に記載の発現ベクターpAD4000。
  26. 配列番号２６に記載の配列の少なくとも250、または少なくとも350、または少なくとも450個の連続するヌクレオチドを含む単離された核酸配列であって、該核酸配列が、インフルエンザvRNAをコードするcDNAに機能し得る形で連結され、MDCK細胞中に導入された場合、該インフルエンザvRNAの発現を指令することができる、前記核酸配列。
  27. 配列番号２６に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも80％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸配列であって、該核酸配列が、インフルエンザvRNAをコードするcDNAに機能し得る形で連結され、MDCK細胞中に導入された場合、該インフルエンザvRNAの発現を指令することができる、前記核酸配列。
  28. 配列番号１〜２６からなる群より選択される核酸に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離された核酸配列であって、該核酸配列が、インフルエンザvRNAをコードするcDNAに機能し得る形で連結され、MDCK細胞中に導入された場合、該インフルエンザvRNAの発現を指令することができる、前記核酸配列。
  29. 請求項２６、２７または２８に記載の核酸を含む発現ベクター。
  30. 細胞中に請求項２９に記載の発現ベクターを導入することによって、インフルエンザゲノムRNAを産生させることを含む、インフルエンザゲノムRNAの製造方法。
  31. 細胞中に請求項７に記載の発現ベクターを導入することによって、インフルエンザゲノムRNAを産生させることを含む、インフルエンザゲノムRNAの製造方法。
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