JP2009532030A - 抗ctla−4抗体の限局性分泌のための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、抗CTLA-4抗体の限局性分泌のための方法および組成物に、ならびに免疫療法におけるそれらの使用に関する。
本発明は、所望のCTLA-4遮断の分布および作用が特定の標的組織に実質的に制限されるよう、in vivoで限局性CTLA-4遮断を達成することにより、当業界におけるこの満たされていない必要性を解決する。さらに特定的には、in vivo修飾内因性細胞、あるいはその後投与されるex-vivo修飾自己由来または同種異系細胞ワクチンからの抗CTLA-4抗体の限局性in vivo分泌のための、細胞、ウイルスベクター、組成物および方法が提供される。
本発明のウイルスベクターおよび形質転換ヒト細胞は、CTLA-4媒介性の負のシグナル伝達を抑制する抗CTLA-4抗体を発現する。好ましい一態様では、抗CTLA-4抗体を発現するウイルスベクターまたはヒト細胞は、腫瘍に近位で抗体を発現し得る。
抗CTLA-4ベクターおよび形質転換方法
一態様では、本発明は、抗CTLA-4 Abウイルスベクターである抗CTLA-4発現ベクターを提供する。遺伝子療法のために有用な多数のウイルスベクターが既知である(例えばLundstrom, Trends Biotechnol., 21: 117, 122, 2003参照)。
抗CTLA-4抗体は、CTLA-4タンパク質の細胞外ドメインと特異的に結合し、そしてそのカウンター受容体CD80およびCD86とのCTLA-4の結合を遮断する分子である。好ましい実施形態では、抗体の結合親和性は、少なくとも約100 uMである。抗体は、CTLA-4と関連する分子、例えばCD28ならびに免疫グロブリン・スーパーファミリーの他の成員と実質的に非反応性である。CTLA-4シグナル伝達を活性化しない抗体を遮断することが好ましい。これは、一価または二価結合分子の使用により達成されるのが便利である。適切な抗CTLA-4抗体は、米国特許第5,855,887号、第5,811,097号、第6,051,227号、第6,984,720号、第6,682,736号、第6,979,442号、第7,109,003号および第7,132,281号(これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される)に開示されたものも包含し得る。
本明細書中に開示されるヒト細胞およびウイルスベクターは、製薬上許容可能な担体と組合せて、製剤組成物を形成し得る。本明細書中で用いる場合、「製薬上許容可能な担体」は、任意のそしてすべての溶媒、分散媒質、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張性および吸収遅延剤等を包含する。薬学的活性物質のためのこのような媒質および作用物質の使用は、当該技術分野で周知である。任意の慣用的媒質または作用物質が活性細胞または組成物と不適合性である限りを除いて、治療用組成物中のその使用が意図される。補足化合物も、組成物中に組入れられ得る。その他の製薬上許容可能なビヒクルとしては、慣用的薬学的溶出物または添加剤が挙げられる。
一実施形態では、ヒト細胞、ウイルスベクターまたはその組成物は、全身的に提供され得る(即ちベクターまたは細胞は循環により患者に提供され得る)。細胞またはウイルスベクターが全身的に提供されると、抗CTLA-4抗体は全組織に提供される。全身投与される細胞またはウイルスベクターは患者中の特定位置に拘束されず、むしろ患者の全身で抗体および任意のその他の発現産物を発現する。単一の理論または作用方式に限定されないが、投与は、投与細胞の寿命の間、抗CTLA-4抗体およびその他の発現産物の一過性または構成性発現を可能にし得る。細胞またはウイルスベクターの全身分布は、したがって、抗体およびその他の発現産物(例えば同時発現免疫エフェクター分子)の時限放出送達として作用し得る。投与細胞は、最終的には死亡し、抗CTLA-4抗体をもはや産生せず、抗CTLA-4抗体の濃度低減および結果的排除を生じる(さらなる細胞投与の非存在下で)。
好ましい実施形態では、抗CTLA-4産生細胞または抗CTLA-4コードベクターが、例えば腫瘍組織で、例えば腫瘍組織内にまたはそれに接触して、あるいは腫瘍の位置の近位に、提供され得る。「〜の近位」とは、本発明の発現ベクターおよび/または形質転換細胞抗CTLA-4抗体に起因する抗CTLA-4抗体が腫瘍組織に直接到達するような、腫瘍細胞の有効距離内を意味する。腫瘍部位で修飾細胞またはウイルスベクターを提供するかまたは作製する本発明の方法は、したがって、周囲非腫瘍細胞への抗CTLA-4抗体の曝露を最小限にしながら、修飾細胞またはウイルスベクターにより発現される抗CTLA-4抗体を、腫瘍に局所的に提供する。活性の特定の方式に限定されることなく、細胞、ウイルスベクターまたは組成物の腫瘍への直接投与は、全身投与で観察され得る自己免疫および免疫抑制的副作用を低減しながら、腫瘍に直接的且つ持続的利益を提供する。
さらにその他の実施形態では、細胞は、腫瘍に直接的にまたは腫瘍近くのリンパ節の近位に投与され得る。細胞および組織は、本明細書中に開示される任意の手段により、リンパ節に投与され得る。
実施例の以下の説明は純粋に例示的であり、本発明の態様を例証するに過ぎない。
Roche diagnosticsからのIsoStripキットを用いて、9D9マウス抗マウスCTLA4抗体を類型分けした。9D9抗体を、IgG2b-κであると確定した(データは示されていない)。
9D9抗体を、Igにクローン化した:図1は、クローニング戦略を示す。
9D9軽鎖および重鎖に関する多重複プライマーを、Wang, Z and Ratner, D (J Immunol Methods, 2000 Jan 13; 233(1-2): 167-77)に基づいて設計して、軽鎖(VL)および重鎖(VH)可変領域を増幅した。Advantage 2PCRキット(Clonetech)を用いてPCRを実施して、T-A末端を有する産物を生成し、そしてVent(NEB)およびPfu(Stratagene)ポリメラーゼの3:1混合物を用いて、平滑末端断片を生成した。図2は、軽鎖および重鎖プライマーの配列を示す。
9D9 scFvのMyc-HISを尾方に有するおよびIgG1を尾方に有するバージョンを発現するMLVベースのレトロウイルスベクターを用いて、scFv分子の各々を安定的に発現する293T細胞を作製した。図5はmyc-HISを尾方に有する9D9 scFv分子の産生のために用いられる発現ベクターを示し、そして図6はIgG1を尾方に有するバージョンの9D9 scFv分子の産生のために用いられる発現ベクターを示す。
GMVax-9D9scFv細胞株を作製した。
各形態の9D9scFvおよび切頭化霊長類NGFp75表面マーカーを発現するMLVベースのレトロウイルスベクターを用いて、B16-GMCSF細胞を形質導入した。
各形態の9D9scFvおよび切頭化霊長類NGFp75表面マーカーを発現するMLVベースのレトロウイルスベクターを用いて、B16-GMCSF細胞を形質導入した。
図10は、B16-GM-9D9scFv形質導入細胞株のCDスペクトルを示す。
抗CTLA-4 scFv分子およびモノクローナル抗体をB16細胞中に形質導入して、腫瘍を治療するために用いた。動物を群分けして、以下のように処置した:
表1
群1:PBS
群2:B16-GMCSF-tNGFr
群3:B16-GM+9D9mAb
群4:B16-GM+9D9mAb+PC61
群5:B16-GM-9D9scFv-MycHis
群6:B16-GM-9D9scFv-Ig
群7:B16-GM-9D9scFv-MycHis+PC61
群8:B16-GM-9D9scFv-Ig+PC61
9D9 scFv-IgG1(Cys→Ser)を、pSFV1ベクターまたは増強SFVベクターpSFVC2A中でクローン化した。SP6Message Machineキット(Ambion)を用いて、全長ベクターRNAをin vitroで産生した。Amaxa Cell Line TransfectionキットL(Amaxa)を用いて、SFV-9D9scFvIg RNAをBHK細胞中に電気穿孔した。Tri-Reagent(Sigma)を用いて、BHK細胞から24時間トランスフェクション後RNAを精製した。Superscript IIRT-PCRキット(Invitrogen)を用いて、このRNAからcDNAを産生した。次に、PCRを用いて、9D9 scFvの発現に関して、このcDNAを分析した。
実施例6に記載したのと同様に、マウスに9D9scFv抗CTLA-4抗体を投与した。
図14は、腫瘍細胞ワクチンの部位でのscFv抗CTLA-4抗体の送達後の時間の一関数としての平均腫瘍増殖を示す。腫瘍増殖は、3〜6日遅延された。これらのデータは、ヒト細胞の全身投与(限局性投与とは対照的に)が抗体の徐放性投与として作用する、ということを示唆する。抗体は、細胞が未だ生きている間、細胞により産生されるが、その後、抗体の産生が遅くなり、そして細胞が死亡し始める。
Claims (23)
- CTLA-4の細胞外ドメインと結合し、CTLA-4シグナル伝達を抑制する抗CTLA-4抗体をコードする核酸を含むウイルスベクター。
- サイトカインをコードする核酸をさらに含む、請求項1記載のベクター。
- 前記サイトカインがGM-CSFである、請求項2記載のベクター。
- 前記抗CTLA-4抗体がscFv断片である、請求項1記載のベクター。
- 前記抗CTLA-4抗体がエフェクター機能低減を示す、請求項1記載のベクター。
- 前記抗CTLA-4抗体がFc受容体との結合低減を明示する、請求項5記載のベクター。
- 前記ウイルスベクターがヒト細胞中にトランスフェクトされた場合に構成的発現を提供し得る組込みウイルスベクターである、請求項1〜6のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターおよびレンチウイルスベクターから成る群から選択される、請求項7記載のベクター。
- 前記ウイルスベクターがヒト細胞中にトランスフェクトされた場合に一過性発現を提供し得る非組込みウイルスベクターである、請求項1〜6のいずれか一項に記載のベクター。
- アデノウイルスベクターおよびアルファウイルスベクターから成る群から選択されるアルファベクターである、請求項9記載のベクター。
- 前記アルファウイルスベクターがSFVベクターまたはVEEベクターである、請求項10記載のベクター。
- CTLA-4の細胞外ドメインと結合し、CTLA-4シグナル伝達を抑制する抗CTLA-4抗体を発現するヒト細胞。
- 前記細胞が請求項1〜11のいずれか一項に記載のウイルスベクターでトランスフェクトされる、請求項12記載のヒト細胞。
- 抗原提示細胞、T細胞および腫瘍細胞から成る群から選択される、請求項12記載のヒト細胞。
- 照射自己由来腫瘍細胞である、請求項14記載のヒト細胞。
- 患者における腫瘍細胞に近位の抗CTLA-4抗体の発現方法であって、抗CTLA-4抗体をコードする発現ベクターを前記患者に投与する方法であり、前記CTLA-4抗体の発現が前記腫瘍細胞に近位のT細胞におけるCTLA-4媒介性の負のシグナル伝達を抑制する方法。
- 前記ベクターが請求項9〜11のいずれか一項に記載のウイルスベクターである、請求項16記載の方法。
- 前記ベクターが前記腫瘍細胞に近位で投与される、請求項17記載の方法。
- 前記ベクターが前記腫瘍細胞に近位の前記患者のリンパ節に投与される、請求項17記載の方法。
- 請求項12記載の形質転換ヒト細胞を患者に投与することを包含する腫瘍細胞を有する患者の治療方法であって、前記細胞による前記抗CTLA-4抗体の発現が前記腫瘍細胞に近位のT細胞におけるCTLA-4シグナル伝達を抑制する方法。
- 前記ヒト細胞が請求項7または8記載のウイルスベクターでex-vivoに形質転換される、請求項20記載の方法。
- 前記ヒト細胞が前記腫瘍細胞に近位で投与される、請求項20記載の方法。
- 前記形質転換ヒト細胞が前記腫瘍細胞に近位の患者のリンパ節に投与される、請求項20記載の方法。
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