JP2009526779A - コウライシャラノキ抽出物及びその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
1−1:水を用いた熱水抽出
コウライシャラノキ葉を集めて洗浄して乾燥した後、粉砕した。粉砕された葉1kgを10Lの水に添加し、よく攪拌しながら60〜65℃において5時間かけて還流抽出した後、ろ過してろ液を分離した。分離されたろ液を55〜65℃において減圧濃縮した後、凍結乾燥してコウライシャラノキ抽出物乾燥粉末165gを得た。
前記実施例1−1の方法と同様にして粉砕したコウライシャラノキ葉1kgを10Lの30%(v/v)、50%(v/v)、70%(v/v)エタノール水溶液に添加してよく攪拌しながら60〜65℃において5時間かけて還流抽出した後、ろ過してろ液を分離した。前記分離されたろ液を55〜65℃において減圧濃縮した後、凍結乾燥してコウライシャラノキ抽出物乾燥粉末135、154及び178gを得た。
前記実施例1−1の方法と同様にして粉砕したコウライシャラノキ葉1kgを10Lの80%(v/v)メタノール水溶液に添加してよく攪拌しながら常温において24時間かけて浸漬抽出した後、ろ過してろ液を分離した。この過程を2回繰り返し行った後、前記分離されたろ液を55〜65℃において減圧濃縮した後、凍結乾燥してコウライシャラノキ抽出物乾燥粉末1178gを得た。
2−1:クロロホルム可溶性分画分離
前記実施例1−1において得られた熱水抽出物50gを500mLの水に溶かし、クロロホルム500mLと一緒に分液漏斗に入れて強く混ぜた後、水層とクロロホルム可溶性層を分離した。前記水層及びクロロホルム層をそれぞれ70〜75℃及び45〜50℃において減圧濃縮した後、凍結乾燥した。
前記実施例2−1において得られたクロロホルム可溶性層に同じ体積のエチルアセテートを添加した後、分液漏斗に入れて強く混ぜた後、エチルアセテート可溶性分画及び不溶性分画を分離した。前記エチルアセテート可溶性分画を減圧濃縮して凍結乾燥した。
前記実施例1−3において得られたメタノール浸漬抽出物1000gを3000mLの水と3000mLのエチルアセテートと一緒に分液漏斗に入れて強く混ぜた後、水層とエチルアセテート可溶性層を分離した。前記水層及びエチルアセテート層をそれぞれ70〜75℃及び45〜50℃において減圧濃縮した後、凍結乾燥した。
前記実施例2−3において得られたエチルアセテート可溶性分画300gを12:1、10:1、7:1及び5:1のクロロホルム:メタノール溶出溶媒を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィ(Φ12x20cm)により溶出させた後、それぞれをTLC(薄膜クロマトグラフィ)により分離した。
血管内皮細胞の移動は血管新生の必須の過程であり、本発明によるコウライシャラノキ抽出物が血管内皮細胞の移動に及ぼす影響をボイデンチャンバーの方法(Gho, Y.S. et al., Cancer Res., 59:5128, 1999)により確認した。ポリカーボネート膜(米国コスタール社製)に0.1%ゼラチンを10分間塗布した後、室温において1時間かけて乾燥した。ヒト臍帯静脈内皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell、HUVEC)1×106cells/mLをトランスウェル(米国コスタール社製)の下のチャンバーに30μL入れ、前記乾燥させたポリカーボネート膜を載せた後、上チャンバーを載せ、ネジを締め付けた。チャンバーをひっくり返して細胞が膜に向かって付着可能に37℃のCO2培養器において2時間培養した。
本発明によるコウライシャラノキ抽出物を前記製作された上チャンバーに50μLずつ添加して2時間培養した後、ディフクイック(diff-quick)染色試薬を用いてポリカーボネート膜を染色した後、ポリカーボネート膜を通じて移動した血管内皮細胞の数を顕微鏡により計数した(表1)。実施例1及び2において得られたそれぞれの乾燥コウライシャラノキ抽出物粉末を水に100μg/mLにて添加して使用し、陰性対照群として水を使用し、陽性対照群としてVEGF(vascular endothelialgrowth factor、シグマ社製)10ng/mLを使用した。その結果、下記表1に示すように、本発明によるコウライシャラノキ葉抽出物は血管内皮細胞の移動を効果的に誘導し、特に、70%エタノール及び70%エタノール熱水抽出物が最も効果的であった。
コウライシャラノキ70%エタノール熱水抽出物及び複合マデカソル(Centella asiatica extract、韓国ドングク製薬社製)を前記製作された上チャンバーに50μLずつ添加して2時間培養した後、ディフクイック染色試薬によりポリカーボネート膜を染色した後、ポリカーボネート膜を通じて移動した血管内皮細胞の数を顕微鏡によりそれぞれ計数した(図1)。図1において、C及びVEGFはそれぞれ陰性対照群(水)及び陽性対照群(VEGF10ng/mL)を示し、SKE及びCAEはそれぞれ乾燥コウライシャラノキエタノール抽出物粉末及び複合マデカソルを示す。乾燥コウライシャラノキエタノール抽出物粉末及び複合マデカソルは水に12.5〜100μg/mLにて添加して使用した。その結果、図1に示すように、本発明によるコウライシャラノキ葉エタノール抽出物は市販中の複合マデカソルに比べて、遥かに効果的に血管内皮細胞の移動を誘導することが分かった。特に、コウライシャラノキ70%エタノール熱水抽出物は100μg/mL濃度にて添加した場合には強力な血管新生誘導因子として知られているVEGFよりも血管内皮細胞の移動をさらに促進することが分かった。
コウライシャラノキ抽出物が血管新生過程において血管内皮細胞の増殖に及ぼす影響をボイデンチャンバーの方法を用いて調べた。マトリゲル(BDバイオサイエンス)と無血清RPMI1640倍地(ハイクローン社製)との1:1(v:v)混合液を0.3mLずつ24ウェルプレートに添加した後、37℃培養器において1時間かけて固形化した。次に、臍帯血管内皮細胞(4×104/ウェル)と70%エタノール熱水抽出物乾燥粉末を濃度別に各ウェルに添加し、37℃のCO2培養器において48時間培養した後、増殖された細胞の数を測定した(図2)。図2において、C及びVEGFはそれぞれ陰性対照群(水)及び陽性対照群(VEGF10ng/mL)を示す。
コウライシャラノキ70%エタノール熱水抽出物の血管新生促進作用をCAM(絨毛尿膜)試験方法(Gho, Y.S. et al., Cancer Res., 59:5128, 1999)により測定した。有精卵を37℃において2日間培養した後、4mLのアルブミンを除去し、4日後に3cm×3cm程度の卵の外皮を除去して窓を作った後、培養し続けた。タイプIコラーゲン(Rat tail, Becton Dickinson、米国)とコウライシャラノキ70%エタノール熱水抽出物混合18μLを点滴して乾燥させたテルマノックスカバーを10日胚卵のCAMに載せて3日間培養し、点滴されたコウライシャラノキ抽出物により新生される血管を計数した(図3及び図4)。図4において、C及びVEGFはそれぞれ陰性対照群(水)及び陽性対照群(VEGF10ng/mL)を示す。
コウライシャラノキ70%エタノール熱水抽出物による創傷回復能力を測定するために、マウス真皮部位に6mmの傷をつけ、創傷回復実験を行った。実験は先行文献(Repertinger, S.K. et al., J. Invest. Dermatol., 982(123), 2004)により行い、9日間観察した。マウス1匹当たりに2箇所に傷をつけ、それぞれマウス別の特徴を比較実験した。陰性対照群としてはPBSを使用し、陽性対照群としてはEGF(50ng/mice)を使用した。コウライシャラノキ抽出物は200μg/miceになるように処理した。試料は毎日同じ時間に9日間繰り返し処理した。傷の面積はシオンイメージ(scion image)解析を通じて治療部位の面積を計算した(図5及び図6)。
コウライシャラノキ70%エタノール熱水抽出物による創傷組織の組織再生効果を確認するために、組織染色確認実験を行った。実験は先行文献(Repertinger, S.K. et al., J. Invest. Dermatol., 982(123), 2004)によるH.E染色方法を用いて染色した。創傷治癒が80%以上回復されたマウスの創傷部位を切開して得た組織を4%PFA溶液に12時間かけて固定した後、脱水反応を誘導し、これを24時間かけて常温において固めた。作成された試料を10μmに切った後、スライドの上に載せて、H.E溶液を用いて染色させた後に観察した。この場合、細胞外組織は赤色に染色され、細胞は青色に染色される。その結果、図7に示すように、70%エタノール熱水抽出物により処理した場合(サンプル処理)、血管の形成が活発になされるということが分かる。
以下、前記実施例のように血管形成及び創傷回復効果に優れたコウライシャラノキ抽出物を用いた薬学的な剤形の例を説明するが、これは本発明を限定するものではなく、具体的に説明するためである。
実施例1−2の70%エタノール熱水抽出物100mgと、ピロ亜硫酸ナトリウム3.0mgと、メチルパラベン0.8mg及びプロピルパラベン0.1mgに注射用の滅菌蒸留水を混合して2mLにした後、アンプルに充填し滅菌して製造する。
実施例1−2の70%エタノール熱水抽出物300mgと、乳糖100mgと、澱粉100mg及びステアリン酸マグネシウム適量を混合し、通常の錠剤の製造方法により打錠して製造する。
実施例1−2の70%エタノール熱水抽出物300mgと、乳糖50mgと、澱粉50mgと、タルク2mg及びステアリン酸マグネシウム適量を混合し、通常のカプセル剤の製造方法によりゼラチンカプセルに充填して製造する。
実施例1−2の70%エタノール熱水抽出物500mgと、砂糖5gと、異性化糖10g及びレモン香適量に精製水を加えて100mLにした後、100mLの褐色瓶に充填し、滅菌して製造する。
実施例1−2の70%エタノール熱水抽出物100mgと、軽質流動パラフィン100mgと、ステアリルアルコール80mgと、セトステアリルアルコール13mgと、プロピレングリコール50mgと、モノステアリン酸ソルビタン30mgと、モノステアリン酸ポリオキシエチルソルビタン40mgと、ブチル化ヒドロキシトルエン0.4mgと、パラオキシベンゾ酸メチルエステル0.9mgと、パラオキシベンゾ酸ブチルエステル0.9mg及び精製水の適量を通常の軟膏剤の製造方法により混合して1g当たりに実施例1−2の70%エタノール熱水抽出物100mgを含有する軟膏剤を製造する。
実施例1−2のコウライシャラノキ葉70%エタノール抽出物100mgと、グリセリン250mgと、1、3−ブチレングリコール150mgと、PEG1500 50mgと、アラントイン5mgと、DL−パンテノール1.5mgと、EDTA1mgと、ベンゾフェノン−92mgと、ヒアルロン酸ナトリウム250mgと、エタノール500mgと、オクチルドデセス−16 10mgと、ポリソルベート−20 10mgと、防腐剤、香、色素2mg及び蒸留水を適量混合して通常の方法により化粧水を剤形する。
実施例1−2コウライシャラノキ葉70%エタノール抽出物75mgと、親油性モノステアリングリセリン100mgと、ステアリルアルコール110mgと、ステアリン酸75mgと、蜜蝋50mgと、ポリソルベート−60 75mgと、ソルビタンステアレート30mgと、硬化植物油50mgと、スクアラン150mgと、鉱物油250mgと、トリオクタノイル250mgと、ジメチコン50mgと、ソジウムマグネシウムシリケート5mgと、グリセリン250mgと、ベタイン150mgと、トリエタノールアミン50mgと、ヒアルロン酸ナトリウム200mgと、防腐剤、香、色素2mg及び蒸留水の適量を混合して通常の方法によりクリームを剤形する。
本発明によるコウライシャラノキ葉抽出物の優れた血管形成効果がシワ改善用の化粧品に適用されるかどうかを調べるために、前記剤形例6の化粧水を用いてシワ改善効果及び安定性テストを実施した。
1−1:皮膚シワ変化の測定
前記剤形例6の化粧水をガーゼに浸して、被検者(30才以上の女性10名)の左側及び右側の腕の上膊に2×2cm2の面積にて6週間(2回/日)塗布した後、皮膚シワ変化を透明なシリコン材質の溶液を用いてレプリカを作って皮膚シワ測定器(SKIN VISOMETER SV400、C+K Electronics、Germany)により測定した。レプリカの像をCCDカメラにより3次元的に分析し、皮膚シワ改善効果は、下記式1に示すように、それぞれのシワの粗さ(Rm:mは1以上の整数)の合計をシワの数で除算した値、すなわち、平均シワ粗さ(Rz)により分析した(表2)。
正常人の線維芽細胞を24ウェルプレートに3×105/ウェル接種し、サブコンフルエント(subconfluent)まで培養した後、PBSにより洗浄し、その後、実施例1−3において得られたSKMを5、10及び50μg/μLにて処理し、24時間培養した。前記培養された細胞をPBSバッファーにより洗浄し、各ウェル当たりにRNABee(TEL−TESTInc)1mLを用いてトータルRNAを分離した。前記分離されたトータルRNA(1μg)からImProm-II Reverse Transcription System(Promega)を用いてcDNAを合成した。
配列番号2:3’−TGT CCC TGA ACA GCC CAG TA
正常人の線維芽細胞を24ウェルプレートに3×105/ウェル接種してサブコンフルエント(subconfluent)まで培養し、PBSにより洗浄した後、実施例2−3において得られたSKEA25μg/μL、レチノールl2.5μM及び実施例2−4において分離された1〜7番分画物をそれぞれ5μg/μLにより処理し、24時間培養した。前記培養された細胞をPBSバッファーにより洗浄し、各ウェル当たりにRNABee(TEL−TEST Inc)1mLを用いてトータルRNAを分離した。分離されたトータルRNA(1μg)からImProm-II Reverse Transcription System(Promega)を用いてcDNAを合成した。
剤形例6の化粧水に対する人体安全性テストを実施した。前記剤形例6の化粧水を男性10名と女性20名を対象として使用性試験及び皮膚貼付試験を行った結果、平均刺激の度合いがそれぞれ0.1及び0.15であり、被検者全員において刺激を示さなかった。
Claims (8)
- 血管新生促進効果を示すコウライシャラノキ抽出物。
- 水、C1〜C4低級アルコール、極性溶媒、非極性溶媒及びこれらの混合溶媒からなる群から選ばれたいずれか1種の抽出溶媒により抽出することを特徴とする請求項1に記載のコウライシャラノキ抽出物。
- (a)水、C1〜C4低級アルコール、非極性溶媒及びこれらの混合溶媒よりなる群から選ばれたいずれか1種の抽出溶媒にコウライシャラノキの葉を添加した後、攪拌しながら40〜80℃において還流抽出するステップ;
(b)抽出物をろ過してろ液を分離するステップ;及び
(c)ろ液を減圧濃縮して乾燥粉末を得るステップ;
により製造されたものであることを特徴とする請求項1に記載のコウライシャラノキ抽出物。 - 前記混合溶媒は、30〜99%エタノール水溶液または30〜99%メタノール水溶液であることを特徴とする請求項1に記載のコウライシャラノキ抽出物。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のコウライシャラノキ抽出物を有効成分として含有する血管新生促進用の医薬組成物。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のコウライシャラノキ抽出物を有効成分として含有する創傷部位の組織再生促進用の医薬組成物。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のコウライシャラノキ抽出物を有効成分として含有するシワ改善用の化粧品。
- 化粧水、クリーム、ローション、スキンローション、パック、ファウンデーション、液状石鹸、固形石鹸及び洗顔フォームよりなる群から選ばれた剤形を有することを特徴とする請求項7に記載の化粧品。
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