JP2001503432A

JP2001503432A - 創傷治癒の促進方法および移植に関連する血管症の治療方法

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Publication number: JP2001503432A
Application number: JP52181598A
Authority: JP
Inventors: アール．ビリアー、ティモシー; チェン、イーディス; エル．、２世シアーズ、ラリー; エイ．ゲラー、デイヴィッド; デイヴィッドジェイムズエディントン、ハワード
Original assignee: ユニヴァーシティオヴピッツバーグオヴザコモンウェルスシステムオヴハイアーエデュケーション
Priority date: 1996-11-08
Filing date: 1997-11-07
Publication date: 2001-03-13
Also published as: WO1998019701A1; US5830461A; EP0963204A1; US6103230A; AU5199298A; CA2270619A1

Abstract

(57)【要約】本発明は患者の創傷の閉鎖を促進する方法を提供する。この方法は、創傷の領域に外因性ｉＮＯＳを導入し、それによって創傷の領域内でｉＮＯＳの産物が産生して創傷の閉鎖を促進することを含む。本発明はまた、移植片に付随する細胞にｉＮＯＳ発現カセットを含むベクターを導入し、該移植片組織を患者に外科的に組み込むことを含む、患者への移植片の移植方法を提供する。患者の体内でｉＮＯＳが発現した後、該移植片の領域内でｉＮＯＳの産物が産生して該移植片の領域における血管症を軽減する。本発明の方法を実施するために、本発明はまた、創傷または移植片に付随する細胞にｉＮＯＳおよびＢＨ₄を供給するための医薬組成物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】創傷治癒の促進方法および移稙に関連する血管症の治療方法連邦政府助成研究開発の下で成された発明に対する権利に関する陳述本発明は、合衆国国立衛生研究所より授与された助成番号ＧＭ４４１００の政府援助によって成された。合衆国政府は本発明において一定の権利を有するだろう。技術分野本発明は、傷が閉じる（すなわち、治癒する）のを促進する方法および移植に関連して起こる血管症の治療方法に関する。背景一酸化窒素（ＮＯ）はＬ−アルギニンから誘導される生物活性化合物である。ＮＯは、動物体内でのその濃度および位置によって、細胞間シグナル伝達から毒性まで全く異なる生理学的役割を有する（Moncadaら，Pharm．Rev.，43(2)109-4 2(1991)に総説；Morris & Billiar，Am．Phsiol．Soc.，E829-37(1994);Scmidt & Walter，Cell，78，919-25(1994);Fedlmanら，C．& E.N.，71，26-38(1993)) 。一酸化窒素は通常血管内皮により産生されるが、半減期が非常に短い（t¹/₂が秒単位）ために隣接する平滑筋までしか拡散せず、そこで可溶性グアニル酸シクラーゼの活性化を経て血管平滑筋の弛緩を引き起こす(Moncadaら，Pharmacol．R ev.，43(2)109-42(1991))。内腔に向かって放出される一酸化窒素は血小板の接着を防ぐのを助ける。内皮細胞由来の少量の一酸化窒素が、主としてミクロソーム膜および原形質膜上に位置する酵素（ｅＮＯＳ）により、継続的に産生されている(Palmerら，Nature，327，524-26(1987);Ignarroら，Proc．Natl．AcadSci ．USA，84，9265-69(1987))。一酸化窒素は、血管拡張の促進(Palmerら，上述；Ignarroら，上述)、血小板の接着および凝集の阻害(Radomskiら，Br．J．Pharmacol.，92，639-46(1987)) 、血管平滑筋（Nunokawaら，Biochem．Biophys．Res．Com.，188，409-15(1992) ）および線維芽細胞（Werner-Felmayerら，J．Exp．Med.，172，1599-1607(1990 )）の細胞増殖の阻害による血管の保全およびアテローム性動脈硬化病変の予防に重要であることが知られている。いくつかの条件により、結果として個体内のＮＯ産生が減少し得る。例えば、ある特定の形態の糖尿病において患者はＮＯ産生の減少を経験する。さらに、ある態様のステロイド療法がＮＯ産生を阻害する。ＮＯ産生の減少はそれ自体が心配の種ではあるが、このようなＮＯ欠乏は、例えば、傷の治癒における有り難くない合併症に寄与する。一酸化窒素の過剰産生が有害となる例もある。例えば、細菌のエンドトキシン（例えば、細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）等）および敗血症において増加するサイトカインによって血管内での一酸化窒素の合成が誘導されると、敗血症ショックによく見られる血管の過度の拡張および持続性低血圧が起こる(Kilbournら，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA，87，3629-32(1990))。免疫複合体によって刺激された肺における一酸化窒素の過剰産生は直接肺に損傷を与える(Mulliganら，J．Immu nol.，148，3086-92(1992))。膵島における一酸化窒素の過剰産生はインスリンの分泌を弱め、若年性糖尿病の発症の一因となる(Corbettら，J．Biol．Chem.， 266，21351-54(1991))。免疫が介在する関節炎における関節内での一酸化窒素の産生は関節破壊の一因となる(McCartneyら，J．Exp．Med，178，749-54(1993)) 。ＮＯは、Ｌ−アルギニンから、３つのアイソフォームがあることが知られている一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）と呼ばれる酵素によって触媒される反応を通して合成される。２つのアイソフォームは厳密な細胞内カルシウム依存性を示す構成的ＮＯＳであり、ＮＯを構成的に、しかし少量で産生する。これらのアイソフォームのうちの１つ（ｎＮＯＳまたはＮＯＳ−１）は主にＣＮＳ中に局在し、もう１つ（ｅＮＯＳまたはＮＯＳ−３）は主に内皮細胞に見出される膜結合型蛋白である(Morris & Billar，上述)。第３のＮＯＳは、酵素の寿命の間強い触媒活性を示す誘導型一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）であり、細胞内カルシウム濃度の増加を必要とすることなく機能する。アルギニンからのＮＯのＮＯＳ介在性の触媒的生産には、コファクターであるテトラヒドロビオプテリン(ＢＨ₄)が存在する必要がある(Tzengら，Proc．Natl ．Acad．Sci．USA，92，11771-75(1995);Tzengら，Surgery，120(2)，315-21(19 95))。ＢＨ₄は、幾分は該酵素の活性な構造的配置の維持に必要である。ほとんどの細胞はＢＨ₄の新たな（de novo）合成に必要な律速酵素であるＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ（ＧＴＰＣＨ）を発現している。しかしながら、血管平滑筋のように、サイトカインによる誘導の際にしかＧＴＰＣＨを発現しない組織もある(T zengら，Surgery，120(2)，315-21(1995))。ｉＮＯＳの発現は負傷組織において劇的に増加する(Carterら，Biochem J.，3 04，201-04(1994);またShabaniら，Wound Healing Repair and Regeneration，4 (3)，353-62(1996)を参照)。さらに、ｉＮＯＳはサイトカインによる炎症性刺激に応答して種々の組織で発現し、また、ｉＮＯＳはそうして刺激された肝細胞からクローン化され単離されている。1995年11月21日にBilliarらに対して発行された合衆国特許第5,468,630号は、ヒト肝細胞ｉＮＯＳｃＤＮＡ配列を開示している。プラスミドpHINOSはヒトｉＮＯＳコード領域を含み、1992年11月20日付でブダペスト条約の規定に基づいて寄託され、ＡＴＣＣ受託番号７５３５８（pH INOS）およびＡＴＣＣ受託番号６９１２６（大腸菌ＳＯＬＲに形質転換したpHIN OS）を保有している。ｉＮＯＳによる一酸化窒素の持続的産生は抗微生物および抗腫瘍機能を有する (Grangerら，J．Clin．Invest.，81，1129-36(1989)およびHibbsら，Science，2 35，473-76(1987)をそれぞれ参照)。さらに、血管平滑筋細胞が炎症性サイトカインにより刺激されてｉＮＯＳ酵素を発現すると、放出される大量の一酸化窒素が敗血症に見られる血管拡張や低血圧の一因となる(BusseandMulsch，FEBS Lett ers，265，133-36(1990))。「一酸化窒素シンターゼ」と呼ばれているが、ｉＮＯＳが仲介する触媒作用は他の生物活性産物も生成する。例えば、ｉＮＯＳ酵素による中間体副産物であるＮ−ヒドロキシアルギニン（Stuehrら，J．Biol．Chem.，266，6259-63(1991)）は、増殖中の細胞に用量依存的に細胞分裂抑制を誘導することが知られているに、ＮＯ自体が用量依存的に作用し、血管拡張を仲介するのには低濃度で十分であるが、細胞分裂抑制にはより高濃度が要求される。その構成的な活性、その生物活性産物が複雑な混和物であること、およびその産物が増殖中の細胞の中で細胞分裂抑制を促進する能力を考慮すると、外因性ｉＮＯＳの送達は細胞の過形成に伴う障害の魅力的な治療方法のようである。実際、インビトロ（in vitro）およびインビボ（in vivo）でのｉＮＯＳ発現カセットの導入により、血管閉塞に伴う障害の予防および治療的軽減が達成されることが実証されている(Tzengら，Mol．Med，2(2)，211-25(1996);また、国際特許出願WO 96/00006号（Billiarら）を参照)。移植組織片の移植後、患者は該移植片の拒絶の危険がある。一般に、移植片の拒絶は、拒絶のメカニズムに基づいて急性か慢性のいずれかに特徴付けられる。外科技術、臓器の取り扱い、急性移植片拒絶症状の出現の管理および術後感染のコントロールが進歩したので、移植片の急性拒絶の脅威は着実に減少した(Paul &Tilney，「慢性拒絶における同種抗原依存的現象」，Transplantation Biology ，Cellular and Molecular Aspects，Tilneyら編，Raven Pubs.，Philadelphia ，567(1996)中)。しかしながら、慢性移植片拒絶の脅威はあまり変化しておらず、依然として移植片移植手順に重大な危険性を残している。例えば、患者の死のせいではない腎臓移植の失敗のほとんどは慢性拒絶によるものであり、心臓移植全レシピエントのおおよそ６０％および肺移植レシピエントの５０％にそれぞれ、慢性拒絶の徴候が現れる(同上；また、Libbey，「移植に関連する動脈硬化症、考えられるメカニズム」，Transplantation Biology，Cellular and Molecular Aspects ，Tilneyら編，Raven Publishers.，Philadelphia，577(1996)中;Hosenpud，Tra nsplant Immunol.，1，237-49(1993)を参照)。慢性拒絶の顕在化を引き起こすメカニズムは依然としてあまり理解されていないが(Hosenpud，上述，237頁)、病理学的性質はよく明らかにされている。血管平滑筋細胞が静止期の収縮性の表現型から急速に増殖する表現型にトランスフォームする。増殖中の平滑筋細胞は血管内腔を侵襲し、そこで細胞外マトリックス材料を産生する。このように、慢性拒絶は血管組織内での進行性の新脈管内膜過形成によって特徴付けられ、その結果、脈管内膜が肥厚し最終的には移植組織片中の血管内腔の閉塞が起こる(Hosenpud，上述；Venturaら，Curriclum in Cardi ology，129(4)，791-99(1995);Libbey，上述)。このような提示はは移植された心臓、肺および腎臓組織で類似しているようである(Paul & Tilney，上述)。自然に発生する動脈硬化症（それもまた増殖中の血管平滑筋細胞によって作られ、大きな血管における局部的且つしばしば偏心的な狭窄によって特徴付けられる）と比較すると、慢性拒絶は通常、大小両方の貫通する血管の大きな領域にわたって拡がった同心状の動脈硬化症を含む。さらに、慢性拒絶動脈硬化症は極めて急激に現れる(Venturaら，上述)。同種移植片血管症の予防および治療における努力が成功したのはごく限られている。免疫抑制における進歩は慢性拒絶の発症を減じることができていない(Ven turaら，上述，796頁)。カルシウム遮断薬と外科的な介入によりいくらかの成功が報告されているが(同上，796-97頁)、これらの手法が長期的な結果に影響するという証拠はほとんどない(Hosenpud，上述)。現在のところ、再移植が心臓移植片における移植随伴性血管症の治療の主たる方法である。しかしながら、臓器の不足と第二の移植片を受容する患者の減少した（すなわち短期の）生存のせいで、この治療様式は望ましくない。目下、侵襲および利用可能な臓器提供の涸渇を最小限に抑える、慢性移植片拒絶の有効な治療・予防方法が必要とされている。開放創の閉鎖は、一般に、炎症、修復、閉鎖、再構築、および最終的な治癒というプロセスを通じて系統的に進む(Hammar，Int．J．Dermatol.，32(1)，6-15( 1993)に総説)。この連鎖の間中、多様な細胞種間の連続的な相互作用が種々の細胞間分子によって仲介されている。特に、血小板由来増殖因子、トランスフォーミング増殖因子−βおよび線維芽細胞増殖因子等のようなサイトカイン類は、通常の創傷閉鎖（すなわち、治癒）にとって重要である(同上)。さらに、受傷の結果としてアルギニン代謝とＮＯ合成が増大する(Shabaniら，Wound Healing Repa ir and Regeneration，4(3)，353-62(1996))。多くの創傷は治癒プロセスを完遂しない。かなり年輩の患者(Kirkら，Surgery ，114(2)，155-60(1993))や他の合併症に苦しむ患者などの多くの患者においては、創傷は慢性的に残る場合があり、あるいは完全に治癒しない場合もある(Ham mar，上述,６頁)。これらの患者は二次感染あるいは他の合併症をより起こしやすい。ステロイド治療を受けている患者や糖尿病患者におけるような、これら他の合併症のいくつかにおいては、ＮＯ産生が減少している。実際、動物実験で、ＮＯＳ酵素が触媒する基質である外因性アルギニンの供給によって創傷治癒が促進されることが実証されている(Seiferら，Surgery，84 ，224-30(１９７８)；Barbulら，Am．J．Clin．Nutr.，37，786-94(1983))。アルギニンはかなり年輩のヒト患者において創傷治癒を刺激するが(Kirkら，上述) 、いくぶんはＮＯ合成を刺激することによって作用するだろう(Barbulら，Surge ry，108(2)，331-37(1990)(付録の対話形式の章参照))。さらに、外因性ＮＯの直接的な局所投与により慢性および通常の創傷の治癒が促進される(Shabaniら，上述)。治癒促進のためにＮＯを創傷に送達するために、いくつかの可能性のあるビヒクルが考えられている(Shabani，上述，にて考察)。これらのいくつかはプロドラッグとして送達されるので、電子伝達による酵素の活性化を必要とする。さらに、これらのプロドラッグはその溶解度のせいで、全身的な影響を及ぼさずに慎重にターゲッティングするための候補にはなりそうにない。問題の部位へＮＯを送達するための合成ビヒクル（「ＮＯＮＯａｔｅ」）を用いる方法もある。これらの多くは水溶性なので、創傷部位内にとどめることが難しい。治癒プロセスはＮＯＮＯａｔｅと創傷との間に新しい組織を作るので、水溶性でないものは創傷へのＮＯの導入の効率が漸次低くなるだろう(Shabani，上述，360頁)。さらに、内部の創傷にＮＯの局所送達を使用すると、その後にこの合成ＮＯ源を除去するための外科的侵襲を必要とするだろう。加えて、このような治療は１つの化合物しか創傷に送達しないが、ＮＯ産生に至る天然の合成経路は他の生物活性化合物をも産生している。最後に、ＮＯは過剰濃度では実質的な組織損傷を引き起こすことが知られているので、構成的な外因性ＮＯ源はいくつかの適用においては反治療的となるだろう。したがって、慢性的な創傷の閉鎖または治癒を促進する方法が必要である。加えて、ＮＯ産生の減少を伴う患者における内部および外部の創傷の閉鎖または治癒を促進する方法が必要である。さらに、侵襲が最小限で且つ外来の合成ポリマーの適用を必要とすることなく、患者の内部および外部の創傷の閉鎖および治癒を促進する必要がある。最後に、ＮＯおよび創傷の治療上活性のある他の化合物のソースを、ＮＯの過剰供給を防ぐようなやり方で使用する必要がある。発明の開示本発明は、患者における創傷の閉鎖（すなわち、治癒）を促進する方法およびそのための医薬組成物を提供する。この方法は、外因性のｉＮＯＳを創傷領域に導入し、それによりｉＮＯＳの産物が創傷領域内で産生されて創傷の閉鎖（すなわち、治癒）を促進することを含む。本発明の方法は内部および外部の創傷に適用でき、好ましくは、侵襲を最小限にしつつ問題の部位に限って生物活性産物の産生を提供する。本発明はまた、患者に移植片を移植する方法およびそのための医薬組成物を提供する。該方法はｉＮＯＳ発現カセットを含むベクターを移植片に付随する細胞に導入し、患者にその移植片組織を外科的に組み込むことを含む。患者体内でのｉＮＯＳの発現によってｉＮＯＳの産物が該移植片の領域内で産生され、移植片領域内での血管症を減ずる。本発明の方法は最小限の侵襲をもって移植片血管症を減じ、入手可能な臓器をより効率的に利用する。ここに添付した請求の範囲を含めて、以下の用語は、ここで使用される場合：ＢＨ₄は、ｉＮＯＳ酵素活性に必須のコファクターであるテトラヒドロビオプテリンを示す。核酸は、もしそれがＲＮＡ転写産物に転写されれば発現される。発現カセットはプロモーターに機能的に連結した発現のためのポリヌクレオチドを含む。ここで使用する場合、発現カセットが特定の翻訳産物により同定されるとき、そのカセットの発現のためのポリヌクレオチドはその関連する翻訳産物をコードする。すなわち、例えば、「ｉＮＯＳ発現カセット」はプロモーターに機能的に連結した、ｉＮＯＳをコードする発現用ポリヌクレオチドを含む。移植片は移植用のあらゆる組織または臓器である。ＧＴＰＣＨは、ＢＨ₄合成に必要な律速酵素であるＧＴＰシクロヒドロラーゼＩを示す。ｉＮＯＳは、誘導型一酸化窒素シンターゼ、またはアルギニンを基質として利用し、細胞内カルシウム濃度の上昇を必要とせずにＮＯの形成を触媒する点において天然のｉＮＯＳと実質的に同じカイネティックプロファイルを有するいかなる他の蛋白質をも包含する。ポリヌクレオチドは特定のヌクレオチド配列によって同定される核酸分子のいかなる部分をも包含する。患者は創傷を有するかあるいは移植片の移植を必要とするあらゆる動物である。ｉＮＯＳの産物は、ＮＯおよびＮ−ヒドロキシアルギニンのような他のあらゆるｉＮＯＳ触媒反応の最終産物または中間体産物をいう。プロモーターは、それが機能的に連結する第二のポリヌクレオチドを容易に感知できるレベルで転写するのに必要なポリヌクレオチドである。ベクターは、１または２以上の外因性核酸配列を細胞環境内に導入する能力のあるあらゆるポリヌクレオチドである。創傷は、結果として組織内の連続性を中断させる、患者の組織に対するあらゆる傷（キズ）である。ｉＮＯＳ治療の方法本発明の方法は、目的の領域、すなわち、移植片または創傷の領域に付随する細胞に外因性ｉＮＯＳを供給することを含む。ｉＮＯＳは、ｉＮＯＳが介在する触媒反応の生物活性産物を目的の領域内で産生するのに十分な、いかなる様式で供給してもよい。多くの適当な方法が国際特許出願第WO 96/00006号(Billiarら) ）に開示されている。本発明の方法のいくつかの適用は、患者の表面の治療、すなわち表面の創傷の治療に関する。いくつかの態様においては、ｉＮＯＳは単離されたｉＮＯＳ蛋白の形態で目的の組織に投与される。単離されたｉＮＯＳは組織または培養細胞からそれを精製することにより取得することができる。さらに、単離されたｉＮＯＳは適切な細胞内で組換えｉＮＯＳ発現カセットを発現させることから取得することができる。ｉＮＯＳは、ｉＮＯＳ触媒反応の生物活性産物の濃度を増加させるのに適当ないかなるやり方でも表面組織に外用することができる。すなわち、例えば、単離または精製されたｉＮＯＳ蛋白を、組織に適用する溶液またはゲルまたは軟膏中に含ませることができる。好適な溶液は中性の生理食塩水溶液であり、他の薬理学的に活性な薬剤をさらに含んでもよい。好ましくは、該溶液はフラビンアデニンジヌクレオチド(ＦＡＤ)、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＰＨ）等のｉＮＯＳの機能に必須の因子を含み、最も好ましくは、該溶液はアルギニンおよびＢＨ₄を含む。ｉＮＯＳを含む溶液は、所望の治療効果を与えるのに適当な時間、組織と接触してとどまることができる。すなわち、例えば、大きな創傷の治療については、該溶液は創傷が実質的に閉鎖するまで該創傷と接触してとどまることができる。溶液が組織と接触している時間の望ましい長さは、組織のサイズや位置に大いに依存する。外因性ｉＮＯＳを目的の組織に導入することにより、結果としてｉＮＯＳ触媒反応が生じ、ＮＯやＮ−ヒドロキシアルギニン等の生物活性化合物の産生が得られる。ＢＨ₄をともに導入することにより、目的の領域におけるｉＮＯＳ活性が最適化される。そこでは、該方法は組織へのＢＨ₄の投与をさらに含み、このコファクターもまた類似の様式で局所的に供給することができる。ここでｉＮＯＳとＢＨ₄は局所的に供給され、好ましくはどちらも同じ溶液中にある。ＢＨ₄は約１μ Ｍから約１０ｍＭまで、好ましくは約１０μＭから約１ｍＭまで、より好ましくは約１００μＭから約９００μＭまでの範囲の濃度（例えば、約２５０μＭから約７５０μＭ、または約４００μＭから約６００μＭ、すなわち約５００μＭ等）で適切に適用される。さらに、ＢＨ₄はプロドラッグ（すなわち、局所でＢＨ₄ に変換される化合物として供給することもできる。例えば、前駆体または分解産物(例えば、ジヒドロビオプテリン(ＢＨ₂))を局所に供給することができ、該前駆体または分解産物は細胞内でＢＨ₄に変換され得る(例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の作用を通じて)。外因性ｉＮＯＳまたはＢＨ₄の好適な供給方法は、発現カセットを含むベクターを目的の領域に付随する細胞に導入することにより、該細胞がｉＮＯＳを発現して該領域内でｉＮＯＳ触媒反応の生物活性産物を産生する、および／またはＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ（ＧＴＰＣＨ）を発現してＢＨ₄を産生するようにすることである。ｉＮＯＳ発現カセットやＧＴＰＣＨ発現カセット等の、本発明の方法に使用される発現カセットは、該カセットを含む細胞が目的の蛋白質を発現するのに適当なあらゆる種類のものである。すなわち、例えば、発現カセットはプロモーターに機能的に連結したｉＮＯＳまたはＧＴＰＣＨをコードするポリヌクレオチドを含む。ベクター由来のポリヌクレオチドの発現を制御するのに適当ないかなるプロモーターおよび／またはエンハンサー配列も、本発明の方法の発現カセットを構築するのに使用することができる。このようなプロモーター／エンハンサー要素は当該技術分野において周知であるが、適切なプロモーターの例としては原核プロモーターまたはウイルスプロモーター（例えば、レトロウイルスＩＴＲまたはＬＴＲ；ヘルペスウイルスＩＥプロモーターやサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーター等の前初期ウイルスプロモーター；あるいはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターやマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）プロモーター等の他のウイルスプロモーター）が挙げられる。他の適切なプロモーターは、構成的に活性なプロモーター(例えば、β−アクチンプロモーター)、シグナル特異的プロモーター(例えば、ＴＮＦ応答性プロモーター等の誘導プロモーター)、あるいは組織特異的プロモーター（例えば、表皮組織、真皮組織、消化器の組織(例えば、食道、胃、腸、結腸などの細胞あるいはそれらに関連する腺)、血管平滑筋などの平滑筋、心筋、骨格筋、肺組織、肝細胞、リンパ球、内皮細胞、強皮細胞、腎細胞、腺様細胞(例えば、胸腺、卵巣、睾丸、膵臓、副腎、下垂体などの中の細胞)、腫瘍細胞、結合組織内の細胞、中枢神経系内の細胞（例えば、ニューロン、神経痛など）末梢神経系内の細胞、または他の目的の細胞内で活性なプロモーター）等の真核プロモーターである。所定の発現カセット中にどのプロモーターを使用するかは、ある程度はベクターの選択によるであろう。すなわち、例えば、ベクターがレトロウイルスベクターの場合、発現カセットはコードポリヌクレオチドに機能的に連結した天然の（ native）レトロウイルスＬＴＲプロモーターを含むことができる。プロモーターに加えて、本発明の方法に使用するための発現カセットは、目的の蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含む。好ましくは、該ポリヌクレオチドは機能的なｉＮＯＳ触媒活性を示す蛋白質をコードする合成ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノミックＤＮＡ断片である。より好ましくは、該ポリヌクレオチドはｉＮＯＳ、例えばヒト肝細胞ｉＮＯＳや他のｉＮＯＳなどをコードする。他の態様においては、発現カセットは、例えば、機能的なＧＴＰＣＨ触媒活性を示す蛋白質をコードする合成ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノミックＤＮＡ断片などのポリヌクレオチドを含む。より好ましくは、該ポリヌクレオチドはＧＴＰＣＨをコードし、その配列は公知である(例えば、Togariら，Biochem．BioPhys．Res．Comm. ，187，359-65(1992))。発現カセットは、ポリアデニル化配列などの他のポリヌクレオチドを含むことができる。また、発現カセットは２以上の蛋白質をコードすることもできる。ＢＨ₄をｉＮＯＳとともに目的の細胞に導入する場合、２つの化合物は同様のもしくは異なる適用様式で提供することができる。すなわち、例えば、ｉＮＯＳを局所に供給する一方、ＢＨ₄はＧＴＰＣＨ発現カセットを導入することにより供給したり、反対に外因性ｉＮＯＳをｉＮＯＳ発現カセットの導入によって供給し、ＢＨ₄を局所に供給することができる。外因性ｉＮＯＳおよびＢＨ₄をどちらも局所に供給してもよいし、あるいはどちらも発現カセットの導入により供給してもよい。好ましくは、ｉＮＯＳとＢＨ₄の両方を適当な発現カセットの導入により目的の細胞に提供する。例えば、一態様においては、ｉＮＯＳ発現カセットとＧＴＰＣＨ発現カセットを共導入するが、その場合それらは別個のベクター内にあってもよい。しかしながら、好ましくは共導入されるｉＮＯＳ発現カセットとＧＴＰＣＨ発現カセットは同一ベクター内に存在する。最も好ましくは、共導入されるｉＮＯＳ発現カセットとＧＴＰＣＨ発現カセットは、そのそれぞれのコードポリヌクレオチドがリボソームエントリー部位によって隔てられた発現カセットのような、単一の発現カセットを含む。このような共導入はｉＮＯＳとＢＨ₄の両方が類似のカイネティックスで発現することおよび同一の組織に分布することを保証するだろう。あるいは、発現カセットは異なるベクター内にあってもよく、一緒に細胞に導入しても、あるいは別々に（すなわち、別個の時に、あるいは目的の集団内の異なる細胞に）導入してもよい上述したもののような、本発明の方法に使用するための発現カセットは、ベクター内に含まれる。もちろん、ｉＮＯＳ発現カセットおよびＧＴＰＣＨ発現カセットに加えて、ベクターはまた、例えば、選択マーカー(例えば、β−ｇａｌまたは毒素抵抗性を付与するマーカー)、薬理学上有効な蛋白質、転写因子または他の生物活性物質を発現するカセットなどの、他の発現カセットを含んでいてもよい。外因性発現カセットを細胞に導入するのに適当ないかなるベクターも本発明の方法の範囲に包含される。好ましくは、該ベクターはウイルスベクターである。本発明の方法に従って使用されるウイルスベクターの例としてはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ＳＶ４０ウイルスベクター、ポリオーマウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、ピクノラウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターまたは他の適切なベクターが挙げられるが、それらに限定されない。好適なレトロウイルスベクターはモロニーマウス白血病ウイルス(ＭｏＭＬＶ) の誘導体である。本発明の方法に使用するための好適なレトロウイルスベクターは、実施例１.Ｃおよび１.Ｄにそれぞれ記載されるMFG-iNOSまたはDFG-iNOS-neo 等のMFGである。本発明の方法に使用するための好適なアデノウイルスは、実施例１.Ｅおよび１.Ｆに記載されるようなAd-iNOSまたはAd-GTPCHである。ウイルスベクターに加えて、標的細胞の感染により発現し得るいかなる非ウイルスベクターも、本発明の方法に使用することができる。好ましくは、非ウイルスベクターはプラスミドである。本発明の方法に使用するための好適なプラスミドベクターは、例えば、実施例１.Ａおよび１.Ｂにそれぞれ記載されるpCIS-iNO SまたはpCIS-GTPCH等のpCISである。当業者はベクターの核酸配列中に発現カセットを組み込むことができるだろう。ウイルスベクター中に発現カセットを組み込む方法は当該技術分野においてよく知られており（例えば、Sambrookら，「モレキュラークローニング：ア・ラボラトリーマニュアル」，第２版，コールドスプリングハーバー出版(１９８９)を参照)、ダイレクトクローニング、flpリコンビナーゼやcre-loxリコンビナーゼ系(Kilbyら，Trends in Genetics，9，413-21(1993)に総説）等のリコンビナーゼを用いた部位特異的組換え、相同組換えおよび他の適切な組換えベクター構築方法が挙げられる。本発明の方法は、目的の領域（すなわち、創傷または移植片）に付随する細胞に発現カセットを導入することを含む。該カセットのコードポリヌクレオチドの発現を助け得る、目的領域に付随するいかなる適切な細胞も、本発明の方法に包含される。そのような細胞は移植片組織の細胞や創傷組織の細胞のようなin sit uの細胞であってもよいし、あるいはin vitroの細胞であってもよい。好ましくは、目的の領域に付随する細胞はin situの細胞である。すなわち、ｉＮＯＳまたはＢＨ₄はその組織生来の細胞によって目的の領域に外因的に供給することができる。ｉＮＯＳ発現カセットが目的の組織の細胞に導入されると、結果としてそれらの細胞はｉＮＯＳを発現する。目的の領域におけるｉＮＯＳ活性はｉＮＯＳ触媒反応産物の局所的濃度を増加させる。ＧＴＰＣＨ発現カセットの導入の結果、細胞内でＧＴＰＣＨが発現し、目的の領域にＢＨ₄の産生が起こって該領域内のｉＮＯＳ活性を最適化する。他の態様においては、目的の領域に付随する細胞は、初代培養中の細胞のようなin vitroの細胞である。好ましくは、該細胞は目的の組織タイプにとって適当な細胞である。例えば、血管内腔に生着するには、該細胞は内皮細胞または血管平滑筋細胞であることが好ましい。これらの血管細胞の直接のソースは、例えば、患者から伏在静脈または他のあらゆるアクセスしやすい静脈もしくは動脈の一部を集めることによって、取得することができる。初代細胞培養の方法は当該技術分野でよく知られている。発現カセットを含むベクターをin vitroで細胞に導入した後、領域に付随した細胞を目的の領域に移す。in vitroの細胞を目的の領域に移すのは公知の手段によって達成される。例えば、本明細書に記載される方法により患者の内部組織に移すことができる。発現カセットを含む細胞を移すさらなる方法は国際特許出願第WO 96/00006号（Billiarら）に記載されている。このようにして、その組織生来のものではない細胞によってｉＮＯＳまたはＢＨ₄を外因的に供給することができる。それによって外因性ｉＮＯＳ産生細胞が該領域に生着し、ｉＮＯＳを産生する。目的の領域におけるｉＮＯＳ活性はｉＮＯＳ触媒反応産物の局所的濃度を増加させる。同様に、外因性ＧＴＰＣＨ産生細胞が該領域に生着してＢＨ₄を産生する。本発明の方法は、本明細書に記載する方法のように、発現カセットを含むベクターを目的の領域（すなわち、創傷または移植片）に付随する細胞に導入することを含む。細胞に発現カセットを導入するいかなる方法も、該発現カセットの産物が該細胞内で産生される限り適当である。これらの方法はｉＮＯＳ発現カセットおよびＧＴＰＣＨ発現カセットを含むベクターの導入に等しく適用される。直接ＤＮＡインジェクション、エレクトロポレーション、カルシウム−リン酸介在の細胞トランスフェクション、リポフェクタミン、ＤＥＡＥ−デキストラン介在の細胞トランスフェクション、ポリブレン介在の送達、宿主細胞融合、マイクロインジェクション、およびポリリジン介在の細胞トランスフェクションによる等の、非ウイルスベクターの標的細胞へのいかなる導入手段も本発明において適当である。そのような方法は当該技術分野でよく知られており、いくつかは国際特許出願第WO 96/00006号(Billiarら)）に記載されている。プラスミドのような非ウイルスベクター内の発現カセットを導入する好適な方法は、内皮細胞のような標的細胞のin vitroまたはin situでのリポソームを介したトランスフェクションによる。もし該ベクターをin vitroで導入するならば、次いで目的の領域に付随する細胞を患者に移す。目的の領域に付随する細胞への発現カセットの導入−ここで該カセットはウイルスベクター中にある−は、該細胞を該ウイルスに感染させることによって達成される。該ウイルスが、実施例１.Ｃおよび１.Ｄに記載されるMFG-iNOSやDFG-iN OS-Neoのようなレトロウイルスの場合、例えば実施例１.Ｈに記載されるように、感染力のあるウイルスの産生のためにウイルスをまず適当なパッケージング細胞株にトランスフェクトすることができる。目的の領域に付随する細胞はin vit roまたはin situで感染させることができる。さらに、発現カセットの導入様式はコードポリヌクレオチドが何であるかに依存しない。感染力のあるウイルスがin vitroで細胞を感染させるのに使用される。標的細胞をin vitroで感染させる正確な方法は使用するウイルスベクターによるが、そのような方法は当該技術分野でよく知られている。いくつかの適切な方法が国際特許出願第WO 96/00006号(Billiarら)）に記載されている。本発明の方法のいくつかの適用は、発現カセットをin situで導入することに関する。in situ導入はin vivo（すなわち、創傷または移植後の移植片に）かex vivo（すなわち、移植前の移植片に）のいずれであってもよい。発現カセットを含むベクターを目的の領域に付随する細胞に送達するいかなる方法も本発明の方法の範囲内であり、そのような送達方法はまた外因性細胞（例えば、トランスフェクトされた細胞）の目的の領域への送達にも適用される。好ましくは、ベクター（または外因性細胞）は、該ベクターを導入するのに適当な担体、例えば、軟膏、クリーム、ローション、ゲルやマグマ等のコロイド分散剤または他のあらゆる許容される担体中で、目的の領域に適用することが好ましい。好適な担体は中性の生理食塩水溶液で、他の薬理学上有効な薬剤をさらに含んでもよい。すなわち、例えば、ベクターを導入するための溶液は、栄養分の豊富な培地（例えば、培養培地）または中性食塩水または他の適当な組成物を含むことができる。ウイルスベクターについては、担体はウイルス力価を安定化する薬剤（例えば、グリセロール）を含むことができる。ベクターまたは外因性細胞を含む担体は、その導入を促進するのに十分な期間創傷または組織と接触したままとどまっていることが好ましい。例えば、ベクターを含む担体は、約１分間から約２時間、より好ましくは１０分から１時間、最も好ましくは約２０分間から約４０分間、創傷またはex vivo組織と接触したままとどめられるだろう。多くの適用において、担体を約３０分間創傷または組織と接触したままにしておくのが最適である。好ましくは、ベクターのin situ送達方法は、該ベクターを目的の領域に正しくターゲッティングし、該ベクターをその中にとどまらせるために、該領域を患者の組織の残りの部分から物理的に隔離することを含む。隔離した後、目的の領域に付随する細胞内に発現カセットを導入するのに適当なやり方で、該ベクターを該目的領域に適用する。例えば、移植片等のex vivoの組織は、患者から完全に隔離される。したがって、ex vivoベクター導入については、ベクターはいかなる適切なやり方で、例えば、該ベクターの導入に適当な担体中で、組織に適用してもよい。例えば、該組織をいかなる適切なインキュベーション方法によってもベクター粒子を含む担体中でインキュベートすることができる。他の組織に該ベクターを含む溶液を灌流してもよい。外部創傷は、その解剖学によって患者の組織の残りの部分から部分的に隔離されている。したがって、患者の外部（すなわち、外部創傷）への送達については、ベクターを含む担体は、創傷に関連する場所に、創傷を覆うプラスチックフィルムのような適当な創傷用医療用具により保持されることによって、さらに隔離される。内部へのベクターのin situ送達については、目的の領域を患者の組織の残りの部分からさらに隔離することが望ましい。目的の領域を物理的に隔離するための種々の公知の外科的手順が適当である。標的の位置によって、目的の領域を隔離するのに適当な様々な血管内の外科的技法が利用できる。血管内の外科的技法としては、バルーン血管形成術、血管内ステント、レーザー補助バルーン血管形成術、二重バルーンカテーテル法、物理的動脈内膜切除術および血管内視鏡が挙げられるが、それらに限定されない。血管内の代替方法の総説としては、一般に、Ahnの「血管内外科」(Vascular Surgery，A Comprehensiv e Review，W.S．Moore編，W.B．Saunders & Co.，フィラデルフィア(1993)中）を参照されたい。いくつかのカテーテルデザインをｉＮＯＳまたはｉＮＯＳ／ＧＴＰＣＨ含有物の患者への局所送達に利用することができる。あるカテーテルデザインは、１つは血管の送達部位の近位に、１つは遠位にある、独立して膨張する２つのバルーンからなる。これらのバルーンが膨張することにより、発現カセット送達用ベクターが注入され得る、内容物を取り除かれた隔離された動脈セグメントが提供される。しかしながら、この系は遠位の動脈灌流を提供できないことにより制限される。Wolinskyによって開発された第二のカテーテルデザインでは、５気圧までの加圧下に２５〜１００μＭの孔を通じてｉＮＯＳ含有担体を注入することができる。この灌流圧はｉＮＯＳベクターによる貫通深度を増大させ、さらに発現カセットの導入効率を増大させる。さらに別のカテーテルデザインは、動脈壁に押しつけられたバルーンを捕捉する膨張可能なステントを利用しており、該ステント材料中の空間を通じて発現カセットの壁内送達を可能にする。さらに、血管壁により深い孔を創り、該血管壁全体により均一に発現カセットを送達することができるようにこれらの部位へ発現カセット送達剤が流れ得るようにする鋳ばりで、これらのステントを改変することができる。別の送達メカニズムは、カテーテルを薬剤吸収性スポンジとして働く親水性ポリアクリル酸ポリマーでコーティングすることである。血管形成術の手順の間に血管を破壊することにより、ヒドロゲルが血管壁内に沈澱し、動脈の創傷部位でのベクターの持続的送達が可能となるだろう。さらに、イオントフォーレーシス式バルーンカテーテルは、低電流を使用して細胞膜の極性を変化させ、荷電したＤＮＡ粒子の細胞内への拡散を可能にするカテーテルデザインである。これはプラスミドＤＮＡ発現カセット構築物用に使う可能性のある送達メカニズムである。また、エチレン−ビニル酢酸共重合体のような薬剤から形成される生分解性ステントも、血管組織への局在化された送達に適当である。あるいは、血管セグメントのターゲッティングされた部分への送達用のｉＮＯＳ含有物（またはＧＴＰＣＨ含有物）を含む、軟膏、クリーム、ローション、ゲルやマグマなどのコロイド分散剤または他のあらゆる許容される担体中にステントの血管内の骨組みが浸された血管内ステントを利用することもできる。この溶液は、in situまたはex vivoのいずれに基づく血管送達にも適用できる。限定のためではなく、例示のために示される別の特殊な適用は、自己膨張性性ステントの使用である。この血管内ステントは、ｉＮＯＳおよび／またはＧＴＰＣＨ含有組換えウイルス上清を含むゲル溶液に浸し、標的血管部位に経皮的に送達することができる。必要であれば、最初の血管形成術の後に、浸した骨組みを標的血管部位に送達する。送達カテーテルは除去され、骨組みは慣用のバルーンで膨張させる。バルーン膨張性ステントや熱膨張性ステント等の他の種類の血管内ステントの使用は熟練した外科医のよく知るところである。さらに、ｉＮＯＳまたはｉＮＯＳ／ＧＴＰＣＨ組成物の血管内送達のために、熟練した外科医はサイズ、形状および種類の異なる数多くのバルーンカテーテルを利用することができる。本発明の方法は、血管閉塞をバイパスする外科的手順と結びつけて行うことができる。そのような手順は通常、動脈もしくは静脈を含む同種移植片もしくは異種移植片、またはその一部分または人工導管を含む。血管バイパス手順は、移植片の導管と血管の間に近位および遠位の吻合を形成させることを含む。２つの導管の間の外科的創傷の正しい治癒を促進するために、ｉＮＯＳ発現カセットを吻合の領域内の細胞に導入することができる。移植片の導管が人工でない（例えば、動脈、静脈もしくはそれらの一セグメント）場合、ｉＮＯＳ発現カセットを移植片内腔の細胞に導入することができる。ｉＮＯＳはまた、ｉＮＯＳ発現カセットをin vitroで導入した細胞を移植片に接種することによって該移植片領域に導入することができる。発現カセットをin vivoまたはex vivoで血管に送達するさらなる好適な方法は、国際特許出願第WO 96/00006号（Billiarら）において特徴付けられる外科的手順のような血管外科術を含む。創傷治癒を促進するためのｉＮＯＳ治療一態様においては、本発明は患者における創傷の閉鎖（すなわち、治癒）の促進方法を提供する。この方法は創傷の領域に外因性ＩＮＯＳを導入することを含む。導入後、ｉＮＯＳの産物が創傷の領域内で産生されて創傷の閉鎖（すなわち、治癒）を促進する。本発明の方法を実施するために、本発明は創傷の領域内の細胞に外因性ｉＮＯＳを導入するための医薬組成物を提供する。該医薬組成物はｉＮＯＳのソース(例えば、ｉＮＯＳ蛋白、トランスフェクトもしくは感染した細胞内でｉＮＯＳを産生するのに適切なｉＮＯＳ発現カセットを有するベクター、またはそのようなｉＮＯＳ発現ベクターを含む細胞のいずれか)、並びにその適切な担体を含むことができ、それらの多くは上述され、また他のものは当該技術分野において公知である。本発明の方法および医薬組成物は、外部（例えば、表面）および内部の創傷の両方の閉鎖（すなわち、治癒）を促進する。本発明の方法が閉鎖（すなわち、治癒）に有用な創傷としては、擦過傷、剥皮創、殴打傷、火傷、挫傷、射創、切創、開放創、貫通創、穿孔創、穿刺創、排液線創、刺創、外科創、皮下創傷、接線創傷または外傷性開口性気胸創傷が挙げられるが、それらに限定されない。好ましくは、本発明の方法は、治癒しない外部潰瘍等のような慢性の開放創を閉鎖するのに使用される。外因性ｉＮＯＳは、例えば本明細書に記載される手段などの、いかなる適当な手段によって創傷領域に導入してもよい。好ましくは、外因性ｉＮＯＳは、ｉＮＯＳ発現カセットを含むベクターを該創傷に付随する細胞に導入することによって提供される。創傷領域内の細胞内でｉＮＯＳが発現した後、ｉＮＯＳの産物が産生されて創傷の閉鎖（すなわち、治癒）を促進する。ｉＮＯＳ発現カセットを含むベクターを創傷に付随する細胞に導入することは、そのような手順が侵襲を最小限にし、創傷領域内に局所的にｉＮＯＳの産物を供給し、軟膏、溶液もしくは他の外因性媒体の再適用を必要としないので好ましい。さらに、ｉＮＯＳ活性は創傷閉鎖の間発現し続け、治癒後に不活性化するだろう。上述のように、ベクターが導入される創傷に付随する細胞は、例えば、創傷内の細胞や他のソースからの細胞などの、その細胞内でのｉＮＯＳ発現が創傷閉鎖（すなわち、治癒）を促進するように創傷と十分結びついたいかなる細胞であってもよい。一態様においては細胞は創傷の細胞であり、本発明の方法はin situ の細胞へのベクターの導入を含む。他の態様においては、細胞は創傷の細胞ではなく、移植片のような外因性の組織であってよく、あるいはin vitroの細胞であってよい。例えば、ある種の創傷の治癒を促進するには、創傷に付随する細胞は皮膚移植片のような移植片内の細胞であってよい。したがって、創傷に付随する細胞へのベクターの導入は、移植片内の細胞にex vivoでベクターを導入することを含む。他の創傷については、創傷に付随する細胞はin vitroの細胞であり、該細胞はｉＮＯＳ発現カセットを含むベクターを導入した後で創傷領域に導入する。本発明の方法は、創傷を有するいかなる患者にも適用される。例えば、患者は哺乳動物などのいかなる動物であってもよい。好ましくは、患者はヒトである。本発明の創傷の閉鎖（すなわち、治癒）の促進方法は、最も好ましくは、上述のタイプの疾患または病態に苦しむ患者等の、ＮＯ産生が不足する患者に使用される。すなわち、例えば実施例３で実証するように、例えばＮＯ産生が不足する患者の創傷領域にｉＮＯＳを導入することにより、ＮＯ不足に苦しんでいない患者において観察されるのと少なくとも同程度のペースで創傷が閉鎖すなわち治癒するようになる。多くの適用において、創傷に付随する細胞へのｉＮＯＳの導入は十分であるが、他の態様においては、ｉＮＯＳ酵素活性をさらに増大させることが望ましい。ｉＮＯＳ活性を増進させる好適な手段は、上述のように外因性ＢＨ₄を共導入することによる。したがって、本発明はさらに、外因性ＢＨ₄を創傷に付随する細胞に導入するための医薬組成物を提供する。該医薬組成物はＢＨ₄のソース(例えば、ＢＨ₄自体、ＢＨ₄のプロドラッグ、トランスフェクトまたは感染した細胞内でＢＨ₄を産生するのに適切なＧＴＰＣＨ発現カセットを有するベクター、またはそのようなＧＴＰＣＨ発現ベクターを含む細胞)、並びにその適切な担体を含むことができ、それらの多くは上述され、また他のものは当該技術分野において公知である。もちろん、ｉＮＯＳとＢＨ₄を同時に送達するために、該医薬組成物は外因性のｉＮＯＳとＢＨ₄の両方を導入するのに適切になることができる。すなわち、該医薬組成物はｉＮＯＳのソース(例えば、ｉＮＯＳ蛋白、トランスフェクトもしくは感染した細胞内でｉＮＯＳを産生するのに適切なｉＮＯＳ発現カセットを有するベクター、またはそのようなｉＮＯＳ発現ベクターを含む細胞 )、ＢＨ₄のソース(例えば、ＢＨ₄自体、ＢＨ₄のプロドラッグ、トランスフェクトまたは感染した細胞内でＢＨ₄を産生するのに適切なＧＴＰＣＨ発現カセットを有するベクター、またはそのようなＧＴＰＣＨ発現ベクターを含む細胞)、並びにその適切な担体を含むことができ、それらの多くは上述され、また他のものは当該技術分野において公知である。移植片拒絶を軽減するためのｉＮＯＳ治療別の態様においては、本発明は患者への移植片の移植方法を提供する。該方法は、移植片に付随する細胞にｉＮＯＳを導入し、該移植片組織を外科的に患者に組み込むことを含む。導入後、ｉＮＯＳの産物が産生されて移植片の領域内での血管症を軽減する。本発明の方法を実施するために、本発明は、移植片の領域内の細胞に外因性ｉＮＯＳを導入するための医薬組成物を提供する。該医薬組成物はｉＮＯＳのソース(例えば、ｉＮＯＳ蛋白、トランスフェクトもしくは感染した細胞内でｉＮＯＳを産生するのに適切なｉＮＯＳ発現カセットを有するベクター、またはそのようなｉＮＯＳ発現ベクターを含む細胞)、並びにその適切な担体を含むことができ、それらの多くは上述され、また他のものは当該技術分野において公知である。患者の内部に移植片を移植する外科的手順は当該技術分野における通常の技術の範疇である。そのような手順は組織の種類や他のパラメーターによって幅広く変化する。好ましくは、そのような手順は、移植片組織と患者の脈管構造との間に少なくとも１つの吻合を形成することを含む。本発明は、移植片が患者の体内で生存するのに適当な、患者への移植片の移植のためのいかなる様式の外科的手順も包含する。本発明の方法に従えば、ｉＮＯＳは移植片の移植（implantationまたはtransp lantation）に付随する血管症を軽減または排除すべく作用する。好ましくは、ｉＮＯＳ触媒活性の産物が新生脈管内膜の過形成および／または瘢痕化を阻害することによって血管症を軽減する。すなわち、例えば、ＮＯ、Ｎ−ヒドロキシアルギニンおよび他のｉＮＯＳ酵素活性の副産物が、例えば実施例４に記載されるように、血管内腔内の平滑筋細胞の増殖を阻害することによって血管閉塞を防ぐように作用する。ｉＮＯＳはいかなる適切な方法で提供されてもよいが、好ましくは、本発明の方法は、本明細書に記載されるようなｉＮＯＳ発現カセットを移植片に付随する細胞に導入することを含む。上に示したように、移植片に付随するいかなる細胞もｉＮＯＳ発現カセットを導入するための適当な標的である。一態様においては、移植片に付随する細胞は該移植片を含む組織内の細胞である。第二の態様においては、移植片に付随する細胞は移植片の領域内（例えば、吻合領域内）の患者の細胞である。さらに別の態様においては、移植片に付随する細胞は移植片自体の細胞でも患者の細胞でもない。すなわち、例えば、移植片に付随する細胞は、上に示したように、ｉＮＯＳ発現カセットを含むベクターを導入した後に移植片の領域に導入するin vitroの細胞であってよい。本発明の方法は、いかなる種類の組織移植片にも適当である。移植片は、自己移植片または異系同種移植片のような同種移植片であってもよいし、あるいは移植片は外来移植片（xenograft）のような異種組織片であってもよい。好適な態様においては、移植片は、例えば動脈組織、静脈組織または心臓組織を含む移植片などの脈管構造を含む。すなわち、例えば、大動脈移植片に付随する細胞へのｉＮＯＳ発現カセットの導入は、該移植片の領域における血管症を軽減することにより大動脈またはその切片の患者への移植を容易にする。同様に、例えば心臓移植手順と結びつけての、あるいは心臓弁の移植手順に結びつけての心臓移植片に付随する細胞へのｉＮＯＳ発現カセットの導入は、該移植片の領域における脈管内膜の過形成および／または瘢痕化を軽減することにより患者への該移植片の移植を容易にする。他の好適な態様においては、移植片は血管組織ではなく血管新生される。例えば、移植片は、完全な肝臓または肝臓の一部等の肝組織、腎組織、肺組織、あるいは他のそのような組織であってよい。さらに、本発明の方法に従って使用される移植片は組織タイプの組み合わせであってもよい。すなわち、例えば、本発明の方法の移植片は、完全な心臓−肺の組み合わせを含むことができる。さらなる態様においては、移植片は皮膚移植片のような真皮組織を含む。多くの適用においては、移植片に付随する細胞へのｉＮＯＳの導入は十分であるが、他の態様においては、ｉＮＯＳ酵素活性をさらに増大させることが望ましい。ｉＮＯＳ活性を増進させる好適な手段は、上述のように外因性ＢＨ₄を共導入することによる。したがって、好ましくは、移植片の移植方法は、本明細書に記載するようにＧＴＰＣＨ発現カセットの導入をさらに含むことが好ましい。本発明はさらに、外因性ＢＨ₄を移植片に付随する細胞に導入するための医薬組成物を提供する。該医薬組成物はＢＨ₄のソース(例えば、ＢＨ₄自体、ＢＨ₄のプロドラッグ、トランスフェクトまたは感染した細胞内でＢＨ₄を産生するのに適切なＧＴＰＣＨ発現カセットを有するベクター、またはそのようなＧＴＰＣＨ発現ベクターを含む細胞)、並びにその適切な担体を含むことができ、それらの多くは上述され、また他のものは当該技術分野において公知である。もちろん、ｉＮＯＳとＢＨ₄を同時に送達するために、該医薬組成物は外因性のｉＮＯＳとＢＨ₄ の両方を導入するのに適切になることができる。すなわち、該医薬組成物はｉＮＯＳのソース(例えば、ｉＮＯＳ蛋白、トランスフェクトもしくは感染した細胞内でｉＮＯＳを産生するのに適切なｉＮＯＳ発現カセットを有するベクター、またはそのようなｉＮＯＳ発現ベクターを含む細胞)、ＢＨ₄のソース(例えば、ＢＨ₄自体、ＢＨ₄のプロドラッグ、トランスフェクトまたは感染した細胞内でＢＨ₄ を産生するのに適切なＧＴＰＣＨ発現カセットを有するベクター、またはそのようなＧＴＰＣＨ発現ベクターを含む細胞)、並びにその適切な担体を含むことができ、それらの多くは上述され、また他のものは当該技術分野において公知である。ｉＮＯＳおよび／またはＧＴＰＣＨ発現カセットを含むベクターは移植に関連するいかなる時点で移植片組織に導入されてもよい。すなわち、一態様においては、ベクターは移植片組織の患者への外科的組み込みに先立って移植片の領域に導入される。例えば、患者への移植片の外科的組み込みに先立って、該移植片組織をベクターを含む溶液中でインキュベートするか、該移植片組織に該溶液を灌流させることができる。上述したもののように、インキュベーションまたは潅灌の期間および溶液の組成は、それらが発現カセットを含むベクターの細胞への導入に影響するようにする。他の態様においては、ベクターは移植片組織の患者への外科的組み込みの後に移植片の領域に導入される。すなわち、患者に移植片組織を組み込んだ後で植え付けられた組織をターゲッティングしてベクターを送達することができる。ベクターのin situ送達のための、上述したいかなる方法も、発現カセットを含むベクターの送達に適当である。本発明の方法は移植片が組み込まれる予定のいかなる患者にも適用される。例えば、患者は哺乳動物などのいかなる動物であってもよい。好ましくは、患者はヒトである。組合わさった効果好適な適用において、ｉＮＯＳおよび／またはＢＨ₄の導入は、複合的且つ相乗の可能性がある効果を生み出すだろう。すなわち、例えば、移植手術を受けている患者または移植片にｉＮＯＳ発現カセットを含むベクターを導入すると、結果として移植片の領域の細胞内でｉＮＯＳが発現する。ｉＮＯＳ発現の結果、ｉＮＯＳの触媒反応産物の濃度が局所的に増加する。これらの触媒反応産物は種々の治療効果を促進する。例えば、ｉＮＯＳの触媒反応産物は、移植片と移植片の領域内の患者の組織との間の外科的創傷（例えば、縫合線）の治癒を促進する。さらに、ｉＮＯＳの触媒反応産物は、新生脈管内膜の過形成および／または瘢痕化を軽減することにより移植片自体の拒絶の可能性を減少させ、それによって移植片組織の血管症および慢性拒絶を軽減する。実施例以下の実施例は、実験手順および本発明を実証する結果を示すものである。これらは単なる例示の目的で挙げたものであり、したがって、もちろん、上に詳細に示したような本発明の範囲を制限するためのものと解されるべきではない。図面の簡単な説明実施例は以下に示すいくつかの図を参照する。図１Ａ−Ｂは、発現カセットを導入するための適切な非ウイルスベクターの例として使用されたpCIS-iNOSベクター（図１Ａ）およびpCIS-GTPCHベクター（図１Ｂ）の模式図である。CMVはサイトメガロウイルスのエンハンサー／プロモーターポリヌクレオチドを示す。intronはＣＭＶ由来の配列を示す。iNOSはヒトｉＮＯＳをコードするｃＤＮＡを示す。GTPCHはＧＴＰシクロヒドロラーゼＩをコードするｃＤＮＡを示し、SV40pAはＳＶ４０由来のポリアデニル化配列を示し、 SV40oriはＳＶ４０由来の複製ポリヌクレオチド起点を示す。DHFRはジヒドロ葉酸還元酵素をコードするポリヌクレオチドを示し、amp^rはβ−ラクタマーゼをコードするポリヌクレオチドを示す。図２は、ｉＮＯＳ発現カセットを導入するのに適切なレトロウイルスベクターの例として使用されたMFG-iNOS組換えレトロウイルスベクターの模式図である。 IRES断片はポリシストロニックｍＲＮＡの翻訳を可能にする。LTRはＭｏＭＬＶウイルスのロングターミナルリピートを示す。iNOSはヒトｉＮＯＳをコードするｃＤＮＡを示す。図３は、MFG-iNOS組換えレトロウイルスベクターを構築するのに使用された方法を示す流れ図である。図４は、ｉＮＯＳ発現カセットを導入するのに適切なレトロウイルスベクターの例として使用されたDFG-iNOS-neo組換レトロウイルスベクターの模式図である。Neo^rはネオマイシン耐性をコードする。IRES断片はポリシストロニックｍＲＮＡの翻訳を可能にする。LTRはＭｏＭＬＶウイルスのロングターミナルリピートを示す。iNOSはヒトｉＮＯＳをコードするｃＤＮＡを示す。図５は、DFG-iNOS-neo組換えレトロウイルスベクターを構築するのに使用された方法を示す流れ図である。図６Ａ−Ｃは、非感染の、または動脈の傷に曝露してDFG-iNOS-neoまたは MFG-lacZのいずれかで感染させた培養ブタ大腿動脈におけるＮＯ₂ ^-＋ＮＯ₃ ^-の産生(図６Ａ)、ｃＧＭＰの産生（図６Ｂ）および筋脈管内膜の厚さ（図６Ｃ）を示すチャートである。図７Ａ−Ｃは、非感染の、または動脈の傷に曝露してDFG-iNOS-neoまたはMFG- lacZのいずれかで感染させた培養ヒト脛骨および冠状動脈におけるＮＯ₂ ^-＋ＮＯ₃ ^- の産生(図７Ａ)、ｃＧＭＰの産生（図７Ｂ）および筋脈管内膜の厚さ（図７Ｃ）を示すグラフである。図８は、非感染の、またはAd-iNOSもしくはAd-lacZで感染させたラット大動脈移植片における同種移植片血管症に及ぼす発現カセット導入の効果を示すグラフである。実施例１全ＲＮＡ抽出、ノーザンブロット、サザンブロット、ウェスタンブロット、ＰＣＲ(ＲＴ−ＰＣＲを含む)、ベクター構築、ダイレクトクローニング技術等の、多くの手順は、当業者が日常的に実施している技術である(例えば、一般に、Sam brookら，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Labo ratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)；Gellerら，Proc．Natl．Acad.Sci．US A，90，522-26(1993)；Towbinら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，76，4350(1979 )；Brennerら，BioTechniques，7，1096-1103(1989)を参照)。したがって、それらについてはここでは示さない。しかしながら、本発明の方法を実施するためのベクターの例、並びにより詳細な研究に使用されるモデルの創製に関する除法を以下に示す。発現カセットを含む以下のベクターを、実施例２−４に記載される実験に使用した。それらは、本発明の方法に使用するのに適当なベクターのほんの一例を示しているにすぎない。さらに、ベクター中に使用された発現カセット自体、上でより詳細に述べたような、プロモーターおよびコード配列の多くの可能性のある組み合わせのわずかいくつかを示しているにすぎない。Ａ．pCIS-iNOS 例示の非ウイルスベクターは図１Ａに示すpCIS-iNOSである。おおよそ４．１ｋｂ（すなわち、bp 47-4145）のXbaI-XbaI ｉＮＯＳポリヌクレオチドを、ｐＣＩＳベクターのＣＭＶエンハンサー／プロモーター配列およびＳＶ４０ポリアデニル化配列に機能的に連結するように、ｐＣＩＳポリリンカー内のXbaI部位にクローニングした。さらなるポリヌクレオチドとして、５’から３’方向に、ＣＭＶイントロン、ＤＮＡ断片の連結のためのポリリンカー配列、ＳＶ４０複製起点、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）ｃＤＮＡおよびアンピシリン耐性を付与するためのβ−ラクタマーゼ発現カセットを含む。したがって、ｉＮＯＳ発現カセットは、ｉＮＯＳポリヌクレオチドに機能的に連結したｐＣＩＳのＣＭＶエンハンサー／プロモーターを含む。この発現カセットは、結果として一時的トランスフェクションアッセイにおいて高いｉＮＯＳ活性を生じる。Ｂ．pCIS-GTPCH ＧＴＰＣＨ発現カセットを含むベクターは図１Ｂに示すpCIS-GTPCHである。ヒトＧＴＰＣＨｃＤＮＡを、ヒトＧＣＨ−１の配列（Togariら，Biochem.，Biop hys．Res．Comm.，187，359-65(1992)）に基づいて設計したプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。ＧＴＰＣＨをコードするXbaI-NotI断片をｐＣＩＳポリリンカーにサブクローニングした。得られたプラスミドpCIS-GTPCHは機能的な発現プラスミドであることが分かった。コントロール発現プラスミドpIEP-lacZはβ−ガラクトシダーゼのｃＤＮＡを含む(ピッツバーグ大学のP.Robbinsより供与された )。したがって、ＧＴＰＣＨ発現カセットはＧＴＰＣＨポリヌクレオチドに機能的に連結したｐＣＩＳのＣＭＶエンハンサー／プロモーターを含む。この発現カセットは、結果として一時的トランスフェクションアッセイにおいて高いＧＴＰＣＨ活性を生じる。Ｃ．MFG-iNOS 例示のレトロウイルスベクターは図２に示すMFG-iNOSである。このベクター中の発現カセットはｉＮＯＳをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したウイルスＬＴＲプロモーターを含む。図３に示すように、MFG-iNOSは、ヒト肝細胞ｉＮＯＳｃＤＮＡ構築物と、複製欠損となるようにpolおよびenv蛋白をコードするＤＮＡ配列を欠失させた単純化したＭｏＭＬＶベクターであるＭＦＧとを出発材料として構築された。gag配列の大部分も欠失している。したがって、このベクター中の発現カセットは、ｉＮＯＳをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したウイルスＬＴＲプロモーターを含む。ヒト肝細胞ｉＮＯＳｃＤＮＡをレトロウイルスベクターＭＦＧのNcoIおよび BamHIクローニング部位に挿入した。簡単に言えば、ＭＦＧベクターは、５’Nco I部位および３’BamHI部位からなるユニークなクローニング領域を有する。ＰＣＲプライマーを用いてｉＮＯＳｃＤＮＡのbp205に点変異を生じさせ、ＡＴＧ開始コドンを組み込んだNcoI部位を作製した。bp205のNcoI部位からbp105 9のEcoRI部位にわたるｉＮＯＳｃＤＮＡのＰＣＲ産物の５’断片を単離した。ｉＮＯＳｃＤＮＡをbp3705でユニークに切断するAfiIIを用いて、pBScript-iN OSを線状化することにより、３’BamHI部位を生じさせた。この制限部位はｉＮＯＳ終止コドンから約４０ｂｐ下流に位置する。次いで、BclIリンカーを線状化したプラスミドに連結した。EcoRIおよびBamHIで二重消化することにより、bp 1 060（EcoRI）からbp 3710（BclI）までのｉＮＯＳｃＤＮＡの３’断片を単離した。BclIの突出はBamHIによって生じる突出と相補的である。次いで、MFG、５，NcoI部位を有する５，ＰＣＲ産物および３’BclＩリンカーを有する３’断片の間で３つの部分のライゲーションを行った。該ライゲーション混合物で大腸菌を形質転換し、アンピシリン選択培地上で育てた。形質転換体を単離し、正しく再構成されたMFG-iNOS構築物をスクリーニングした。１つの正しい形質転換体を単離し、、ラージスケールのプラスミドＤＮＡ調製を行った。 MFG-iNOSのウイルス上清を用いてin vitroで内皮細胞を感染させ、感染後４８〜７２時間にｉＮＯＳ活性を調べて、このウイルスによる発現カセットの導入により外因性の生物活性ｉＮＯＳの産物を送達できることを実証した。Ｄ．DFG-iNOS-neo このMFG-iNOS含有レトロウイルス構築物は、ネオマイシン耐性選択マーカーを含む(図４参照)。したがって、このベクター中の発現カセットはｉＮＯＳをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したウイルスＬＴＲプロモーターを含む。ＭＦＧレトロウイルスベクターは、先に内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）を含むように工作された後、ＭＦＧの３’BamHIクローニング部位にネオマイシン耐性発現カセット（Ｎｅｏ^r）が挿入されている。ＩＲＥＳ配列は、単一のポリシストロニックｍＲＮＡからの複数の蛋白産物の翻訳を可能にする。図５に示すように、このMFGIRES-Neo^rプラスミドを制限酵素 SalI（ＭＦＧのNcoIクローニング部位の約３０００ｂｐ上流を切断する）および BamHIで消化した。ＩＲＥＳとＮｅｏ^rに付着したＭＦＧバックボーンの大部分を含む大きい方の断片を精製した。先に構築したMFG-iNOSベクターもSalIとEcoRI で消化し、ｉＮＯＳｃＤＮＡの５’部分を含む３．７ｋｂ断片を単離した。ｉＮＯＳｃＤＮＡの３’末端はMFG-iNOSを構築するのに使用したBclIリンカーを有する同一の３’断片であった。MFG-IRES-Neo^r、ｉＮＯＳｃＤＮＡの５’末端を含む５’SalI-EcoRI断片およびBclIリンカーを有する３’ｉＮＯＳｃＤＮＡの３つの部分のライゲーションを行った。次いで、ライゲーション混合物を大腸菌に形質転換し、アンピシリン耐性の形質転換体を選択した。正しく配向した構築物（DFG-iNOS-Neo）を有するそのような形質転換体を単離し、ラージスケールのプラスミド調製を行った。 DFG-iNOS-Neoのウイルス上清を用いてin vitroで内皮細胞を感染させ、感染後４８〜７２時間にｉＮＯＳ活性を調べて、このウイルスによる発現カセットの導入により外因性の生物活性ｉＮＯＳの産物を送達できることを実証した。Ｅ．Ad-iNOS ｉＮＯＳ発現カセットを含む例示のアデノウイルスベクターはAd-iNOSである。Ad-iNOS中の発現カセットはｉＮＯＳをコードするポリヌクレオチドおよびＳＶ４０ポリA配列に機能的に連結したＣＭＶプロモーター／エンハンサーを含む。アデノウイルスゲノムはサイズが大きいので、組換え操作の前に２つの別個のプラスミドに分割する必要がある。該ゲノムの５’部分を担持するプラスミドを、ｉＮＯＳｃＤＮＡを担持するアデノウイルスプラスミドの構築に使用した。アデノウイルスゲノムのＥ１領域を先にこのプラスミドから欠失させ、その位置に全長ｉＮＯＳｃＤＮＡをＣＭＶエンハンサー／プロモーター複合体と一緒に挿入した。このプラスミドを作製後、アデノウイルスゲノムの残りの部分を担持するプラスミドとともに２９３細胞に共トランスフェクトした。これら細胞は構成的にＥ１発現カセット産物を発現し、したがってＥ１を欠失した構築物から感染力のあるアデノウイルス粒子をパッケージングすることができる。トランスフェクションの後、細胞内組換えが起こってｉＮＯＳｃＤＮＡを含む全長アデノウイルスゲノムが生じる。次いで、感染力のあるAd-iNOS粒子が作られ、溶菌プロセスを通じて２９３細胞から放出されるので、培養上清を回収する。この上清をショ糖密度勾配（sucrose banding）にかけて精製し、Ad-iNOSウイルス粒子を濃縮する。ウイルスは長期間−８０℃で保存することが出来る。実験を受けたことがない細胞を感染させ、ｉＮＯＳ発現を導入し得るかどうかについて、Ad-iNOS上清を種々の細胞種で試験した。これらの細胞には、ヒトの平滑筋細胞、内皮細胞、および肝細胞の細胞株、並びにラットの平滑筋細胞（ＲＳＭＣ）および初代肝細胞が含まれる。すべての細胞が、効率のレベルは異なるが、首尾良くAd-iNOSに感染した。高レベルのｉＮＯＳ発現と一酸化窒素合成が試験したすべての細胞について検出され、最大の一酸化窒素合成は肝細胞において起こった。これらの結果は、Ad-iNOSが、機能的なｉＮＯＳ発現カセットを首尾良く導入する機能的なウイルスベクターであることを実証した。Ｆ．Ad-GTPCH ＧＴＰＣＨ発現カセットを含む例示のアデノウイルスベクターはAd-GTPCHである。Ad-GTPCH中の発現カセットは、ＧＴＰＣＨをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したＣＭＶプロモーター／エンハンサーを含む。該ベクターはAd-i NOSと同様にして構築された。実験を受けたことがない細胞を感染させ、ＧＴＰＣＨ発現を導入し得るかどうかについて、Ad-GTPCH上清を種々の細胞種で試験した。すべての細胞が、効率のレベルは異なるが、首尾良くAd-GTPCHに感染し、高レベルのＧＴＰＣＨ発現とＢＨ₄が試験したすべての細胞について検出された。これらの結果は、Ad-GTPCHが、機能的なＧＴＰＣＨ発現を首尾良く導入する機能的なウイルスベクターであることを実証した。Ｇ．コントロールベクターコントロールレトロウイルスベクター、MFG-lacZおよびBag-lacZは以前に記載されている（Zitvogelら，Human Gene Ther.，5，1493-1506(1994)；Priceら，P roc．Natl．Acad．Sci．USA，84，156-60(1987))。どちらの構築物もβ− ガラクトシダーゼ発現カセットを担持するが、Bag-lacZはさらにＮｅｏ発現カセットを担持する。コントロールアデノウイルスベクタ−Ad-lacZは、Ad-lacZがｌａｃＺ発現カセットを含むことを除いて、Ad-iNOSおよびAd-GTPCHベクターと同様である。Ｈ．複製欠損レトロウイルス保存株の製造実施例１．Ｃおよび１．Ｄのレトロウイルス構築物を、標準のリン酸カルシウムによるトランスフェクション手順を用いて、ＣＲＩＰ細胞パッケージング株（ Danos and Mulligan，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85，6460-64(1988)）にトランスフェクトした。ウイルスベクターDFG-iNOS-Neoは合成抗生物質Ｇ４１８に対する抵抗性を付与し得る。したがって、DFG-iNOS-NeoでトランスフェクトされたＣＲＩＰ細胞をＧ４１８耐性に基づいて選択した。 DFG-iNOS-Neoプラスミドを、一時的エコトロピックパッケージング細胞株ＢＯＳＣ２３（Pearら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90，8392-96(1993)）に、リン酸カルシウムトランスフェクションした。トランスフェクションから７２時間後にウイルス上清を回収してＣＲＩＰ細胞（Danos and Mulligan，上述）を感染させるのに用い、安定なアンホトロピック産生細胞株を作製した。ＣＲＩＰ細胞を８μｇ／ｍｌポリブレンを含むＢＯＳＣ２３ウイルス上清とインキュベートし、次いでＧ４１８（７５０μｇ／ｍｌジェネティシン）を用いて選択した。ＢＯＳＣウイルス上清は１０⁵ＰＦＵ／ｍｌの計算力価を有していた。個々のＧ４１８耐性ＣＲＩＰコロニーを単離し、ｉＮＯＳ発現の間接的尺度として亜硝酸塩（ＮＯ₂ ^-）産生をスクリーニングした。最高レベルのＮＯ₂ ^-を生成するコロニーでのウイルス産生を、ＣＲＩＰ−DFG-iNOS-Neo上清の系列希釈で感染させた後のＧ４１８耐性ＮＩＨ３Ｔ３コロニー数により試験した。複製能力のあるヘルパーウイルスについてＢＡＧ流動化アッセイを、以前に記載されたようにして実施した (Danos，「レトロウイルスパッケージング細胞株の構築」，Collins,M.（編）， Methods in Molecular Biology，Vol．5，Practical Molecular Virology，Vira lVectors for Gene Expression，Humana Press Inc.，Clifton，N.J.pp．17-27( 1991))。Ｉ．ＮＯ₂ ^-／ＮＯ₃ ^-産生の測定直接的ｉＮＯＳ酵素アッセイは、記載されるように(Bredtら，Nature，351，7 14-18(1991))、［³Ｈ］−アルギニンの［³Ｈ］−シトルリンへの変換を測定する。ＮＯ₂ ^-＋ＮＯ₃ ^-レベルは、Griess反応（Greenら，Anal．Biochem.，126，131- 37(1982)）に基づいて自動化された手順を用いて培養上清中で測定する。Ｊ．ｉＮＯＳ発現の検出ｉＮＯＳ発現カセットが、導入された細胞内で機能するかどうかを調べるために、単離した全ＲＮＡについてＲＴ−ＰＣＲを実施する。５０ｍＭトリス塩酸(ｐＨ８．３)、７５ｍＭＫＣｌ、３ｍＭＭｇＣｌ₂ 、１．０ｍＭｄＮＴＰｓ、１０ｍＭＤＬ−ジチスレイトール、１０単位ヒト胎盤ＲＮＡａｓｅインヒビターおよび２００単位ＭｏＭＬＶ逆転写酵素を含む１０μｌ容量の全ＲＮＡ３００ｎｇについて、３７℃で６０分間、第一のｃＤＮＡ鎖合成を行う。１０ｍＭトリス塩酸(ｐＨ８．３)、５０ｍＭＫＣｌ、２００μＭｄＮＴＰ、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、各１００ｐＭＰＣＲプライマーおよび１．２５単位ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ中にｃＤＮＡ（１００ｎｇ）を合わせて５０μｌとし、変性９４℃、１分、アニーリング５７℃、２分および伸長７２℃、３分、４０サイクルでＰＣＲ増幅を行った。ｉＮＯＳオリゴヌクレオチドプライマーはヒト肝細胞ｉＮＯＳｃＤＮＡ配列を特異的に認識し、齧歯類の配列は検出しない。1995年11月21日付でBilliarらに発行された合衆国特許第5,468,630号に示されるように、１８ｂｐの５’プライマーはｉＮＯＳｃＤＮＡのbp 3376-3393にわたり、１８ｂｐの３’プライマーはｉＮＯＳｃＤＮＡのbp 3674-3691にわたる。予測されるＰＣＲ産物は３１６ｂｐである。β−アクチンメッセージについてのＲＴ−ＰＣＲはコントロールとしての役割を果たす。β−アクチンＰＣＲ産物は６５２ｂｐの長さがある。Ｋ．ノックアウトマウスのソース機能的なｉＮＯＳ遺伝子を欠くマウス系統（ｉＮＯＳノックアウトマウスまたはＫＯマウス）マウスが記載されている（MacMickingら，Cell，81，641-50(199 5))。この系統を実施例４に記載される実験に使用した。Ｌ．統計学的解析表１におけるＮＯ₂ ^-、ＮＯ₂ ^-＋ＮＯ₃ ^-およびｃＧＭＰ、並びに筋肉脈管内膜の厚さに関する数値は平均値±標準偏差（ＳＤ）で表している。差の有意性はＡＮＯＶＡ検定を用いて決定した。ｐ値＜０．０１のとき統計学的に有意であると確定した。表２におけるＧＴＰＣＨ活性、細胞内ビオプテリンレベルおよびＮＯ₂ ^-に関する数値は平均値±ＳＥＭで表している。ＧＴＰＣＨ活性および細胞内ビオプテリンレベルについての差の有意性は対ｔ検定を用いて決定し、ｐ値＜０．０５のとき統計学的に有意であるとした。ＮＯ₂ ^-レベルの統計学的解析は標準的ＡＮＯＶＡ検定を用いて決定した。ｐ値＜０．０１のとき統計学的に有意であると確定した。表３における創傷閉鎖速度に関する数値は平均値±ＳＥＭで表している。ＷＴ群およびＫＯ＋Ad-iNOSに対するＫＯマウスの創傷閉鎖の差の有意性はＡＮＯＶＡ検定を用いて決定し、ｐ値＜０．００１のとき統計学的に有意であるとした。ＫＯ＋Ad-lacZマウスの統計学的解析はＡＮＯＶＡ検定を用いて決定し、ｐ値＜０．０１のとき統計学的に有意であるとした。実施例２本実施例に記載される実験は、ｉＮＯＳ活性が外因性ＢＨ₄の供給により増進することを実証する。最初の実験では、ＧＴＰＣＨ発現カセットをin vitroで細胞に導入し発現させ得ることが示された。さらに、ｉＮＯＳ活性には外因性ＢＨ₄のソースが必要であることが観察され、ＧＴＰＣＨ発現カセットの導入は、低効率であっても、精製したＢＨ₄を導入するのと同じぐらい有効であった。細胞培養への外因性ＢＨ₄ の供給には、すべての細胞に発現カセットを導入したり、トランスフェクトされた細胞とトランスフェクトされていない細胞とが直接接触したりする必要がないことが実証された。すなわち、ＧＴＰＣＨを発現し、該コファクターを合成するほんのわずかな細胞が、大きな細胞集団の中でｉＮＯＳ活性を最適に維持することができる。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞の培養ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、記載されるように（Tzengら，Sugery，120(2)，315-21( 1996)）培養した。ラット大動脈平滑筋細胞を記載されるように（Davisら，JCel l．Physiol.，159，399-406(1994)）胸部大動脈外植片から培養し、記載されるように（Tzengら，Sugery，12O(2)，315-21(1996)）第２〜８継代の間で使用した。３Ｔ３−ｉＮＯＳは、以前に記載されるように（Tzengら，Proc．Natl．Acad ．Sci．USA，92，11771-75(1995)）ヒトｉＮＯＳを安定に発現するように工作されたＮＩＨ３Ｔ３である。ＮＩＨ３Ｔ３細胞をDFG-iNOSレトロウイルスに感染させ、次いで合成ネオマイシンＧ４１８中で選択してヒトｉＮＯＳを発現する細胞集団を得た。３Ｔ３細胞はＧＴＰＣＨ活性を欠き、ＢＨ₄欠損である。これらの細胞では豊富なレベルのｉＮＯＳ蛋白が発現するが、ＮＯ合成はＢＨ₄が培養培地に供給されて初めて検出され得る。リポソームトランスフェクショントランスフェクションの２４時間前に、細胞を６ウェルプレートに１×１０⁵ 細胞／ウェルの密度で継代した。３Ｔ３細胞については、各ウェルの細胞をOPTI MEM-I^TM培地中の１μｇプラスミドＤＮＡおよび６μｇリポフェクタミン^TMの混合物で５時間トランスフェクトした。ラット平滑筋細胞（ＲＳＭＣ）については、７μｇのリポフェクタミン^TMに対して１μｇのＤＮＡを用いた。インキュベーション期間の後、トランスフェクション溶液を除去して通常の増殖培地に置換した。トランスフェクション効率はpIEP-lacZでトランスフェクトした細胞のＸ− ｇａｌ染色により計算した。すべての研究はトランスフェクション後２４〜７２時間に実施した。ＲＮＡの単離およびノーザンブロット分析 pCIS-GTPCHまたはpIEP-lacZでトランスフェクトした３Ｔ３−ｉＮＯＳおよびＲＳＭＣから、ＲＮＡｚｏｌＢを用いてトランスフェクション７２時間後に細胞の全ＲＮＡを回収した。ＲＮＡサンプル（２０μｇ）を０．９％アガロースゲル上で電気泳動し、GeneScreen^TMにブロッティングした。プレハイブリダイゼーション後、メンブランを記載されるように（Gellerら，Proc．Natl．Acad．Sci ．USA，90，522-26(1993))ＤＮＡプローブにハイブリダイズさせた。８００ｂｐのヒトＧＴＰＣＨｃＤＮＡ断片をプローブとして使用した。ＧＴＰＣＨを構成的に発現するヒト肝細胞がら単離したＲＮＡをヒトＧＴＰＣＨのポジティブコントロールとした。１８ＳｒＲＮＡを相対的ＲＮＡローディングのコントロールとして用いた。ＧＴＰＣＨ酵素活性と細胞内ビオプテリンの測定トランスフェクションの４８時間後、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞をトリプシン処理してＧＴＰＣＨ酵素活性測定のために回収した。トリプシンを胎仔ウシ血清により不活性化し、細胞をHanks緩衝液で洗浄した。次いで、細胞を溶解して細胞質のＧＴＰＣＨ活性を以前に記載されたようにして測定した(Hatakeyamaら，J．Biol ．Chem.，264，21660-64(1989))。細胞内の全ビオプテリン測定については、細胞を０℃、暗所で６０分間０．２Ｎ過塩素酸で処理した。上清を集めて、以前に記載されたように（Fukushiamら，Anal．Biochem.，132，6-13(1983)）全ビオプテリン（ＢＨ₄＋ＢＨ₂,＋ビオプテリン）を試験した。細胞を０．１ＮＮａＯＨで溶解して蛋白質濃度をＢＣＡ蛋白アッセイ（Pierce）を用いて測定した。ウシ血清アルブミンの系列希釈をスタンダードとした。ＮＯ₂ ^-およびＮＯ₃ ^-産生のアッセイトランスフェクションの２４時間後、培養培地を新鮮培地に置換し、細胞をさらに２４時間培養してその上清をアッセイした。測定はまた、Ｌ−ＮＭＡ(１ｍＭ)、ＢＨ₄（１００ｍＭ）およびメトトレキサート（ＭＴＸ１２．５ｍＭ）の存在下で行った。次いで、各ウェル中の細胞を０．１ＭＮａＯＨで溶解した。蛋白質濃度はＢＣＡ蛋白アッセイを用いて定量した。同一細胞におけるＧＴＰＣＨとｉＮＯＳの共発現の必要性を調べるために、３Ｔ３細胞をpIEP-lacZまたはpCIS-GTPCHのいずれかでトランスフェクトした。５時間のトランスフェクション期間の後、培地交換して該細胞に１×１０⁵細胞／ウェルの３Ｔ３または３Ｔ３−ｉＮＯＳを重層した。細胞を一夜接着させて２４時間後にＮＯ₂ ^-レベルを測定した。ＧＴＰＣＨ発現カセットの導入効率３Ｔ３細胞をＲＳＭＣと一緒に用いてＧＴＰＣＨ発現カセットの導入効率を試験した。３Ｔ３、３Ｔ３−ｉＮＯＳおよびＲＳＭＣをリポフェクタミントランスフェクションすると、pIEP-lacZでトランスフェクトした細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ活性についてのＸ−ｇａｌ染色により測定すると、およそ１％の導入効率であった。齧歯類ＧＴＰＣＨと交叉ハイブリダイズするヒトＧＴＰＣＨｃＤＮＡプローブを使用したノーザンブロット分析により、３Ｔ３−ｉＮＯＳおよびＲＳＭＣのいずれの群にも内在性ＧＴＰＣＨの発現がないことが明らかとなった。内在性ＧＴＰＣＨ転写産物は、ＧＴＰＣＨの豊富なソースであるヒト肝細胞において見られるように３ｋｂを越える長さがある。しかしながら、組換えＧＴＰＣＨｍＲＮＡはサイズにしておよそ９００ｂｐの長さであり、pCIS-GTPCHでトランスフェクトした細胞にのみ検出された。ラットＧＴＰＣＨｃＤＮＡプローブを用いては検出できないより大きな１．２ｋｂｍＲＮＡシグナルは、すべての群で検出された。これらのデータは導入されたＧＴＰＣＨ発現カセットが首尾よく転写されることを示している。機能的なＧＴＰＣＨ酵素が生成され得ることを確認するために、ＧＴＰＣＨ酵素活性の測定を行い、表１にまとめている。コントロールでトランスフェクトした３Ｔ３細胞は均一にＧＴＰＣＨ活性を欠くが、pCIS-GTPCHでトランスフェクトした細胞は３０〜１７０ｐｍｏｌ／時間／ｍｇ蛋白の間で変動する活性レベルを示し、これらは構成的にＧＴＰＣＨを発現する肝細胞で測定されるのに匹敵する強さである。３Ｔ３タイプの細胞およびＲＳＭＣへのＧＴＰＣＨ発現カセット導入により生じた細胞内ビオプテリン（ＢＨ₄＋ＢＨ₂＋ビオプテリン）も表１にまとめている。細胞種にかかわらず、PCIS-GTPCHでトランスフェクトした細胞において、細胞内の全ビオプテリン濃度に劇的な増加が測定された。これらのデータは低効率のＧＴＰＣＨ発現カセットの導入の結果、高レベルの機能的ＧＴＰＣＨの発現が起こり、ＲＳＭＣおよび３Ｔ３細胞において、結果として顕著な細胞内ビオプテリンの生成を伴う新たな（de novo）ＢＨ₄生合成経路を完成させることを示している。表１ＧＴＰＣＨおよび全ビオプテリントランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３およびＲＳＭＣ ^＊数値は平均値±標準誤差である，n=3，３回の別個の実験を表す^† pIEP-lacZでトランスフェクトしたコントロール細胞に対して^‡ pIEP-lacZでトランスフェクトしたコントロール細胞に対してＢＨ₄はＧＴＰＣＨ発現カセットの導入により供給することができるＧＴＰＣＨ発現カセットの導入がｉＮＯＳ活性を再構成する能力を３Ｔ３ｉＮＯＳ細胞において調べた。３Ｔ３−ｉＮＯＳ細胞をpIEP-lacZまたはpCIS-GTPCH のいずれかでトランスフェクトし、その後のＮＯ合成を培養上清中のＮＯ₂ ^-の蓄積によって測定した。ＧＴＰＣＨの発現がこれらの細胞においてｉＮＯＳ活性を維持する効率を、外因性ＢＨ₄の補充により達成される最大のＮＯ合成と比較した。３Ｔ３−ｉＮＯＳをpIEP-lacZでトランスフェクトした結果、ほとんどＮＯ₂ ^- の蓄積は起こらず(３．９＋０．４ｎｍｏｌ／ｍｇ蛋白／24時間)、外因性ＢＨ₄ に対する応答（２２３．６＋１８．９）を減じなかった。対照的に、pCIS-GTPCH でトランスフェクトした細胞は、外因性ＢＨ₄により達成されるのに匹敵するレベルのＮＯ₂ ^-を生成した(それぞれ、１７６．１±３．８対２１０．２±１０．０)。トランスフェクションの効率が低いので、この結果は驚くべきことであった。低効率のＧＴＰＣＨ発現カセット導入が細胞集団内のｉＮＯＳ活性を持続させるＭＴＸは、ＢＨ₄の分解産物であるジヒドロビオプテリン（ＢＨ₂）を活性型のコファクターに変換し直すことができるジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）を阻害する。低効率のＧＴＰＣＨ発現カセット導入が細胞集団全体におけるｉＮＯＳ活性を持続させ得るメカニズムを示すために、ＭＴＸを増殖培地に添加した。ＭＴＸは、ＢＨ₄の補充により回復するｉＮＯＳ活性の量を５倍よりも大きく減少させ、外因性ＢＨ₄の大部分がＤＨＦＲによる代謝を必要とする形態で細胞に入ることを示した。pCIS-GTPCHでトランスフェクトした３Ｔ３ｉＮＯＳ細胞においては、ＭＴＸの効果はそれほど明白ではなく、ｉＮＯＳ活性を５０％減少させたにすぎず、細胞内で合成されたＢＨ₄はＢＨ₄として他の細胞に到達し得ることを示唆した。放出されたビオプテリンを含んでいるはずの、ＧＴＰＣＨ発現３Ｔ３細胞から回収した条件付き培地で３Ｔ３−ｉＮＯＳ細胞を培養すると、最大のｉＮＯＳ活性の２５％しか再構成されなかった。直接的な細胞と細胞の接触は必要ではない３Ｔ３ｉＮＯＳ細胞をpIEP-lacZまたはpCIS-GTPCHプラスミドのいずれかでトランスフェクトした３Ｔ３とともに培養することにより、ＢＨ₄の導入に直接的な細胞と細胞の接触が必要かどうかを調べた。３Ｔ３−ｉＮＯＳ細胞をpIEP-lac Zでトランスフェクトした３Ｔ３細胞と共培養すると、ＮＯ₂ ^-の蓄積は最小であり、共培養プロセスは内因性のＧＴＰＣＨ活性を刺激しないことを示唆した。しかしながら、３Ｔ３−ｉＮＯＳ細胞をpCIS-GTPCHでトランスフェクトした３Ｔ３細胞と共培養すると、最大のｉＮＯＳ活性を回復し、この活性は外因性ＢＨ₄によってさらに増大することはなかった。これらの観察は、ＢＨ₄の生合成の実現のためにｉＮＯＳと同一細胞内に存在する必要がないことを示す。ＧＴＰＣＨを発現し該コファクターを合成するほんのわずかな細胞が、大きな細胞集団内のｉＮＯＳ活性を最適に維持することができる。Ｂ．ｉＮＯＳが介在するin vivoでの血管閉塞軽減の増進 in vivoでＢＨ₄を補充することによってｉＮＯＳ発現カセット送達後に合成される一酸化窒素量を最大にするために、ｉＮＯＳ送達部位にin vivoでAd-GTPCH をトランスフェクトする。実施例３に記載されるように、受傷したラット頸動脈にｉＮＯＳ発現カセットを送達するのと同時に、Ad-GTPCHを１０⁷ｐｆｕ／ｍｌの力価で外頸動脈を通じて総頸動脈に注入し、６０分間放置してインキュベートさせる。インキュベーション期間の後、ウイルスを取り除き、外頸動脈を繋いで、総頸動脈を通じての血流を回復させる。色輪の切開を閉じて動物を蘇生させる。１４日間インキュベートした後、ラットを殺して両方の頸動脈を分子的および組織学的研究のために採取する。 AD-GTPCHが感染部位におけるＧＴＰＣＨの外因性の発現を妥当に促進することを実証するために、採取した動脈をｉＮＯＳ、ＧＴＰＣＨおよびＬａｃ−Ｚの発現についてアッセイする。さらに、外因性ＧＴＰＣＨが外因性ｉＮＯＳの治療効果を最適化することを実証するために、ｉＮＯＳのみとAd-lacZについての筋肉脈管内膜の厚さに関するデータを、共トランスフェクトした動脈についてのデータと比較する。実施例３本実施例に記載される実験では、創傷の領域への外因性ｉＮＯＳの導入が創傷の閉鎖すなわち治癒を促進することを実証する。該実験は、創傷に付随する細胞にｉＮＯＳ発現を含むベクターを導入することにより、内部創傷および表面創傷の両方の治癒が促進されることを実証する。Ａ．Ex vivoモデル化創傷に付随する細胞にin situで導入された外因性発現カセット由来のｉＮＯＳ発現を調べるためのモデルとして、受傷した外植片を使用した。さらに、これらの実験ではｉＮＯＳ発現カセットの導入が内部創傷の治癒を促進する能力について検討した。ブタ大腿動脈麻酔した（ペントバルビタールナトリウム，４ｍｇ／ｋｇ）家畜のブタから、両側の鼠径部の切開を通じて大腿動脈を採取し、直ちに無菌のリン酸緩衝生理食塩水に浸漬した。動脈血管外膜をゆっくりと解剖して遊離し、いくつかの血管を、4-フレンチ（4-French）バルーンカテーテルを３０秒間１０気圧に膨らませることにより均一に傷つけた。すべての動脈を長軸に沿って開き、１ｃｍ長の切片に分割し、以前に記載されたように(Takeshitaら，J．Clin．Invest.，93，652- 61(1994))、ＤＭＥＭ、２０％ＦＣＳ、１００単位／ｍｌペニシリン、１００ μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび４ｍＭＬ−グルタミン酸塩中、３７℃ で培養した。培養日に、いくつかの動脈切片を、ポリブレン（８μｇ／ｍｌ）を添加したDF G-iNOS-NeoまたはMFG-lacZのいずれかのウイルス上清（どちらも、力価１０⁶ＰＦＵ／ｍｌ）２ｍｌと６時間インキュベートした。感染後、血管を新鮮な培養皿に移してあらゆる外植された細胞を除去し、毎日培地交換をしながら計１４日間器官培養で維持した。DFG-iNOS-Neoでトランスフェクトした血管からのＮＯ₂ ^-＋ＮＯ₃ ^-の放出がＢＨ₄依存的であることを最初に観察した後、ＢＨ₄（１００μＭ）をすべての培養に毎日を基準にして添加した。いくつかの血管プレパラートにはＬ−ＮＭＡ（０．５ｍＭ）を添加した。１４日目にＮＯ₂ ^-＋ＮＯ₃ ^-およびｃＧＭＰ測定のために培養上清を回収した。ｃＧＭＰレベルは市販のラジオイムノアッセイで測定した。 MFG-lacZの感染効率を評価するために、血管切片を０．５％グルタルアルデヒドで３０分間固定し、β−ガラクトシダーゼ活性についてＸ−ｇａｌで染色した。DFG-iNOS-Neo切片を４℃で１時間、２％パラホルムアルデヒドで固定し、４℃ で一夜、３０％ショ糖中で凍結保護した。次いで、血管をHistoFreeze^TM２０００で急速凍結して５μＭ凍結切片を切り出した。切片をスライドガラス上にマウントし、２％パラホルムアルデヒド／０．１％Triton-X100で透過性を増し、５％ヤギ血清でブロッキングした後、先にウェスタンブロット分析に使用した抗マウスｉＮＯＳモノクローナル一次抗体とインキュベートした。イムノペルオキダーゼで抗体染色を可視化した。筋肉脈管内膜の厚さを測定するために、半連続切片をアクチンに結合するローダミンファーロイダンと６０分間インキュベートした。これらのプレパラートを間接蛍光顕微鏡法で可視化し、コンピューターに接続したソニーＤＸＣ９３０により記録した。Optimas^TMプログラム（Optimal Cor p.；Seattle，WA）を用いて、各血管切片の長さに沿って２５のランダムな部位での新生脈管内膜の厚さを定量し、全測定の平均を計算した。いくつかの血管をポリトロンでホモジナイズし、実施例２に記載されるように、ＲＮＡｚｏｌを用いてＲＮＡを抽出した。実施例１．Ｊに記載されるように、ヒトｉＮＯＳのＰＣＲ増幅を実施した。DFG-iNOS-Neoウイルスに特有のＮｅｏｍＲＮＡについてのＰＣＲ増幅を、ｉＮＯＳ導入遺伝子の発現の別のマーカーとして実施した(ＮｅｏＰＣＲ産物＝７２８ｂｐ)。ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル上で可視化した。ヒト動脈心臓移植を受けている患者の摘出された心臓からヒト冠状動脈を抜き取った。摘出直後に、左前方の下行冠状動脈を左心室から鋭く切り裂いた。下肢切断術を受けている患者から切断直後に前方および後方の脛骨動脈を得た。すべての血管を直ちに通常の食塩水溶液中においた。２または４フレンチカテーテルを血管切片中に入れ、１ｃｃシリンジから食塩水で膨らませ、３０秒間バルーンを膨らんだ状態に保った。無菌条件下で動脈血管外膜を血管切片から鋭く切り裂いた。次いで、血管を１ｃｍの切片に分け、器官培養系に置床した。該器官培養系は２０％胎仔ウシ血清、２ｍＭＬ−グルタミン、１００単位／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭを含んでいた。いったん器官培養系に置床すると、培地は毎日交換した。５日目に、血管を DFG-iNOS-Neoで感染させた。１０⁶ＣＦＵ／ｍｌを含むウイルス上清１ｍｌをトランスフェクトする各血管に加えた。翌日、ウイルス上清を除去し、基本培地溶液を器官浴に加えた。各ウェルに１００μＭＢＨ₄を添加して毎日培地交換を繰り返し実施した。１４日目に培地を回収して全亜硝酸塩および硝酸塩、並びにｃＧＭＰのアッセイを行った。次いで、血管を組織学的分析のために凍結する。動脈の受傷後および続く１４日間の培養後の中間層の厚さを調べるために、血管を５μｍの切片に細分した。血管を１％ＰＢＳで２回洗浄し、ローダミンファーロイダンで６０分間染色した。切片を１％ＰＢＳで再度洗浄し、カバーガラスで覆った。上述のように切片を調製し調べた。培養血管におけるｉＮＯＳの発現バルーンカテーテルで血管の受傷を誘発し、受傷５日後にウイルスに感染させた後、培養１４日目に測定すると、DFG-iNOS-Neoに感染した動脈切片は受傷していない血管またはMFG-lacZに感染した切片に対して３〜４倍多いＮＯ₂ ^-＋ＮＯ₃ ^- を放出した(表２)。より劇的なことには、DFG-iNOS-Neoに感染した動脈によるｃＧＭＰの放出は、受傷していない血管切片または受傷したコントロールの血管切片において測定されるよりも１５倍を超える増大を示した。培養培地にＬ-ＮＭＡが含まれると、ＮＯ₂ ^-＋ＮＯ₃ ^-とｃＧＭＰの放出はどちらも阻害された。感染した動脈切片におけるβ−ガラクトシダーゼまたはｉＮＯＳについての染色から、計算上０．５〜１％の感染効率であることがわかった。いずれかの酵素を発現する細胞の大多数は、表面の新生脈管内膜領域に位置することが分かった。導入遺伝子の発現をヒトｉＮＯＳメッセージについてのＲＴ−ＰＣＲ増幅によりさらに確認した。予測される３１６ｂｐのｉＮＯＳＰＣＲ産物は、DFG-iNOS- Neoに感染した血管切片においてのみ強く検出された。MFG-lacZに感染した血管では、非常に低レベルのｉＮＯＳｍＲＮＡが検出された。コントロール血管におけるＰＣＲ増幅による検出可能なｉＮＯＳ発現は、バルーンカテーテル受傷に派生的な低レベルの誘導を反映しているのかもしれない。しかしながら、DFG-iNOS -Neoレトロウイルスに特有のＮｅｏ配列の増幅は、DFG-iNOS-Neoに感染した血管にのみ、予測された７２８ｂｐ断片が発現することを明らかにし、したがって、導入された遺伝子の発現に追認を与えた。図６Ａ−Ｃおよび図７Ａ−Ｃは、in vitroで培養したDFG-iNOS-Neoに感染したブタ動脈（図６Ａ−Ｃ）並びにDFG-iNOS-Neoに感染した罹病ヒト冠状および頸骨動脈（図７Ａ−Ｃ）から得られたデータを示す。図６Ａ−Ｃおよび図７Ａ−Ｃにおけるコントロール構築物はMFG-lacZであった。図６Ａおよび図７Ａは、血管形成術を受けただけか、あるいはMFG-lacZに感染した血管と比較すると、DFG-iNOS -Neoに感染した血管において全亜硝酸塩産生が顕著に上昇したことを示している。ＮＯ阻害剤であるＬＮＭＡの添加により全ＮＯ産生の上昇は排除された。同様に、非感染切片およびコントロールレトロウイルスMFG-lacZに感染した切片と比べると、サイクリックＧＭＰレベルは感染した動脈切片において顕著に上昇した。表２ブタ動脈切片による全一酸化窒素およびｃＧＭＰの産生 ^＊数値は平均値±標準偏差である，n=4，３回の別個の実験を表す^† 受傷していないコントロール動脈切片に対して脈管内膜過形成に及ぼす効果図６Ｃに示すように、ラット動脈の動脈受傷の結果、中間層全体の厚さに顕著な増加が起こった。DFG-iNOS-Neoベクターで感染させると、この増殖プロセスの阻害が生じた。DFG-iNOS-Neoに感染しＬ−ＮＭＡ中で生育させた血管またはMFG- lacZに感染した血管の中間の厚さは、血管形成術コントロール切片と類似していた。傷つけただけのものと傷つけた後にMFG-lacZで感染させたもの（図７Ｃ）の両方においてローダミンファーロイダン染色により測定すると、ヒト冠状または頸骨動脈切片をバルーンカテーテルで傷つけると、結果として筋肉脈管内膜の厚さがかなり増加した。対照的に、その後にDFG-iNOS-Neoで感染させた動脈におけるバルーン受傷に対する増殖応答は顕著に軽減され、受傷していない血管と実質的に区別できなかった。脈管内膜の肥厚に及ぼすDFG-iNOS-Neo感染の阻害効果はＬ −ＮＭＡの投与により完全に排除され、該効果がＮＯ合成によるものであることが示された。考察これらのデータは、ｉＮＯＳ発現カセットが外植された動脈切片に付随するヒトまたはブタ細胞においてｉＮＯＳを産生し得ることを実証している。さらに、これらのデータは、ｉＮＯＳ発現カセットの導入により該外植片の領域内の細胞にｉＮＯＳ活性が効率よく移送されることを示している。最後に、これらのデータは、外部から供給されたｉＮＯＳの産物が受傷した血管領域内の組織の正しい再構築を促進し、血管の受傷に付随する創傷の治癒を促進することを実証している。Ｂ．内部創傷の治癒動物モデルにおける血管の受傷部位に付随する創傷にｉＮＯＳ発現カセットを導入することにより、外因性ｉＮＯＳが内部創傷の治癒を促進し得るかどうかを調べた。これらの実験では、受傷した血管組織の正しい再成長の促進におけるｉＮＯＳの有効性をモニタリングした。内部創傷の治癒の促進ラットをネンブタールで麻酔し、左総頸動脈を色輪の切開を通じて露出させた。２フレンチフォガーティー（2 French Fogarty）カテーテルを左外頸動脈を通じて総頸動脈に導入し、バルーンを膨らませて血管に傷を創った。同様に、家畜ブタをペントバルビタールナトリウムで麻酔し、両側の腸骨にある動脈を低中線腹部切開を通じて露出させた。小さな動脈切開を創りそれを通じて４フレンチフォガーティーカテーテルを導入した。フォガーティーの膨張を用いて血管に傷を創った。ｉＮＯＳのin vivo導入ｉＮＯＳ発現カセットのin vivo導入をAd-iNOSを用いて行った。コントロール動物としては、動脈を傷つけただけの動物または受傷後Ad-lacZコントロールウイルスで感染させた動物が含まれる。ラット動脈をバルーンで傷つけた後、Ad-iNOSまたはAd-lacZを１０⁷ｐｆｕ／ｍｌの力価で、外頸動脈を通じて総頸動脈に注入し、６０分間放置してインキュベートした。インキュベーション期間の後、ウイルスを取り除き、外頸動脈を繋いで総頸動脈を通じる血流を回復させた。色輪の切開を閉じて動物を蘇生させた。該ラットを計１４日間収容した時点で殺し、両方の頸動脈を分子的および組織学的研究のために採取した。ブタ腸骨動脈の単離切片にAd-iNOSまたはAd-lacZ（１０⁷ｐｆｕ／ｍｌ）を滴下して６０分間放置してインキュベートした。インキュベーション期間の後、ウイルスを取り除き、動脈切開を修復して血流を回復させた。一方の側の腸骨の血管を実験側として用い、他方、反対側をコントロールとして用いた。ブタを１、３および６週間の間で期間を変動させて収容した。これらの期間の最後にブタを殺して、両側の腸骨の動脈を分子的および組織学的研究のために採取した。組織学的評価のために、血管をパラホルムアルデヒドおよびショ糖で固定し、次いで凍結保護した。細分した後、組織をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。脈管内膜および中膜の厚さをコンピューター画像プログラムを用いて定量した。β−ガラクトシダーゼ活性を検出するためにＸ−ｇａｌを用いてｌａｃＺ染色を行った。ヒトｉＮＯＳを検出するマウスｉＮＯＳに対するポリクローナルｉＮＯＳ抗体を用い、その後に酉洋ワサビペルオキシダーゼと複合体形成した二次抗体で処理してｉＮＯＳの免疫染色を行った。細胞増殖はブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を用いて、あるいは増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）指向性抗体を用いた免疫染色により定量した。感染した血管におけるｉＮＯＳの発現感染１４日後に、受傷部位の血管組織から単離したＲＮＡから行ったＲＴ−ＰＣＲは、Ad-iNOSベクターに感染した血管からはヒトｉＮＯＳが発現するが、コントロールの血管からは発現しないことを実証した。さらに、ｉＮＯＳの発現は Ad-iNOSが導入された血管の領域に限定された。ｉＮＯＳが介在する受傷血管の治癒受傷および発現カセット導入の１４日後に実験的頸動脈を組織学的に調べたところ、動脈を傷つけた結果、中膜層の約２倍の幅のある新生脈管内膜を有する著しい脈管内膜の過形成が起こることが明らかとなった。コントロールのAd-lacZ ウイルスで処理した動物もやはり動脈の受傷に応答し、受傷しただけの動物と類似した厚い新生脈管内膜を形成した。しかしながら、Ad-iNOSで処理した頸動脈はこの増殖プロセスが完全に阻害され、新生脈管内膜形成の形跡がなかった。これらの頸動脈は受傷していない動脈と類似していた。同様の結果が、Ad-iNOSおよびAd-lacZによるブタ動脈血管細胞の直接的in sit u感染により得られた。ブタ動脈切片を物理的に傷つけた後、カテーテル処理した部位の脈管内膜の血管細胞にAd-iNOSまたはAd-lacZのいずれかを導入した。これらの結果は、in situ感染Ad-iNOS動脈切片では、in situ感染Ad-lacZ動脈切片に比べて筋肉脈管内膜の過形成が著しく減少することを示している。考察これらのデータは、ｉＮＯＳ発現カセットが創傷、特に血管の受傷に付随する創傷の領域で、in vivoでiNOSを産生し得ることを実証している。さらに、これらの結果は、バルーンカテーテルにより誘発される動脈の損傷の後の筋肉脈管内膜の肥厚または瘢痕化が、導入効率が低いにもかかわらずヒトｉＮＯＳ発現カセットの導入により首尾よく軽減されることを示している。これらのデータは、外部から供給されたｉＮＯＳが受傷した血管組織の正しい再形成を促し、これが内部創傷の治癒を促進することを示している。Ｃ．外部創傷の治癒の促進方法ｉＮＯＳＫＯマウスまたはコントロールマウスの背中に、２ｃｍ×２ｃｍの十分な厚さの創傷をつけた。その後、Ad-iNOSベクターまたはコントロールベクター（Ad-lacZ）のいずれかを２×１０⁷ｐｆｕで含む滅菌食塩水溶液を、該創傷の領域に局所的に外用した。次いで、動物に全く同じように包帯をあて、創傷の閉鎖をモニタリングし、ｉＮＯＳの発現について組織をアッセイした。創傷治癒の促進をｉＮＯＳ発現と関連づけるために、ｉＮＯＳの時間依存的発現をモニタリングした。２日間隔ですべての実験群から創傷組織を採取した。これらの細胞から細胞の全ＲＮＡを回収し、実施例１で上述したように、ヒトｉＮＯＳ、マウスｉＮＯＳおよびβ−アクチンに特異的なプライマーを用いて、ＲＴ −ＰＣＲにかけた。創傷におけるｉＮＯＳの発現発表された結果（Carterら，Biochem．J.，304，201-04(1994)）と一致して、受傷は野生型（ＷＴ）動物における天然のｉＮＯＳ発現の著しい増加を伴った。最大レベルの天然ｉＮＯＳ発現は受傷４〜６日後に観察され、ｉＮＯＳ発現は受傷後１０日に達するまで検出された。ＫＯマウスは検出可能なｉＮＯＳシグナルを発現しなかった。ヒトｉＮ０Ｓシグナルは、ｉＮＯＳ発現カセットを導入されたＫＯおよびＷＴマウスの両方から検出された。ヒトｉＮＯＳの発現のピークは受傷２〜４日後に観察され、１４日間に達するまで検出可能であった。非処理のＷＴマウスの細胞およびコントロールカセットを導入された細胞からはヒトｉＮＯＳの発現は検出されなかった。創傷閉鎖までの時間創傷閉鎖までの時間に関するデータを表３に示す。コントロールマウスは完全に創傷が閉鎖するのに１７．００日を要したのに対し、ＫＯマウスは２２．３３日を要した。創傷に付随する細胞にｌａｃＺ発現カセットを導入した結果、創傷閉鎖に有意な効果はなかった。対照的に、創傷に付随する細胞にｉＮＯＳ発現カセットを導入された後のＫＯマウスは、完全に創傷が閉鎖するのに１５．６０日を要したのに対し、同様に処理したコントロールマウスは、完全に創傷が閉鎖するのに１５．７７日を要した。表３マウスにおける創傷閉鎖までの日数とｉＮＯＳ発現カセット導入の効果数値＝平均値±ＳＥＭ，n=各群毎に９^＊ WT群およびKO+Ad-iNOSに対してp〈0.001^† WT群およびKO+Ad-iNOSに対してp〈0.01 考察これらのデータは、外因性ｉＮＯＳの外部創傷への導入が治癒を促進することを実証している。当該結果は内因性ｉＮＯＳの産生が減少している患者において最も顕著である。これらのデータは、さらに、外因性ｉＮＯＳを供給する有効な態様は創傷に付随する細胞にｉＮＯＳ発現カセットを導入することによることを示している。これらのデータは、さらに、創傷治癒が創傷に付随する細胞内でのｉＮＯＳ発現誘導と積極的に相関していることを示している。実施例４本実施例に記載される実験は、移植片に付随する細胞にｉＮＯＳ発現カセットを含むベクターを導入することにより、(そうしなければ起こるだろう)外科的移植後の血管症が排除されることを実証している。ドナーのラットから、下行胸部大動脈の３ｃｍ切片を切り出し、滅菌食塩水溶液を灌流させた。この移植片大動脈を、連続的９−０ナイロン縫合糸を用いて端と端をつなぐ様式でレシピエントの小帯内動脈に移植した。雄性ラット（１〜３月齢，２００〜３００グラム）を移植片のドナーおよびレシピエントとして使用した。異系移植については、Wistar Furth（ＷＦ）ラットを移植片のドナーとして使用し、ＡＣＩラットをレシピエントとして使用した。異系同種移植片にはＡＣＩ−ＷＲ移植片を、同系コントロールにはＡＣＩ−ＡＣＩ移植を使用した。移植に先立って、２×１０⁷ｐｆｕのアデノウイルスベクターを含む食塩水溶液中で、移植片を１時間インキュベートした。実験群については、ベクターはｉＮＯＳ発現カセットを含むAd-iNOSであった。コントロールについては、ベクターはAd-lacZであった。移植４週間後に移植片を除去し、同種移植片血管症の発症を組織学的に調べた。これはVerhoff/van Geison染料で血管を染色し、次いで脈管内膜および中膜層の厚さを測定することによりなされた。これらの測定から内膜／中膜（Ｉ／Ｍ）比を計算した。同種移植片血管症に及ぼすｉＮＯＳ導入の効果に関するデータを図８にグラフで示す。同系コントロールは新生内膜が0.036±0.005μｍを示したのに対し、異系同種コントロールおよびAd-LacZで処理した移植片は、それぞれ脈管内膜の厚さが0.6 6±0.029μｍおよび0.63±0.031μｍを示した。Ad-iNOSで処理した異系同種移植片は、0.029±0.002μｍの平均内膜厚を示した。すなわち、未処理の異系同種移植片群およびAd-lacZで処理した群は、移植後４週間で著しい新生内膜過形成を示した(Ｉ／Ｍ比＞０．６)。対照的に、同系コントロールは同じ期間においてごくわずかな内膜過形成を示した(Ｉ／Ｍ比＞０．０５)。印象的なことに、Ad-iNO Sで処理した異系同種移植片は容易に感知できる程度の新生内膜過形成を示さず( Ｉ／Ｍ比＞０．０５)、同系移植片で見られた結果と同等であった。これらのデータは、移植片に付随する細胞にｉＮＯＳ発現カセットを含むベクターを導入することにより、移植片領域における血管症が実質的に軽減または排除されることを示している。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年１月２５日（１９９９．１．２５）【補正内容】請求の範囲１．創傷の領域に外因性ｉＮＯＳを導入し、それによって該創傷の領域内でｉＮＯＳの産物が産生して創傷の閉鎖を促進することを含む、患者の創傷閉鎖の促進方法。２．外因性ｉＮＯＳが、該創傷の領域へのｉＮＯＳの局所投与により該創傷の領域に導入される請求の範囲１の方法。３．外因性ｉＮＯＳが、該創傷に付随する細胞にベクターを導入することにより該創傷の領域に導入されるものであって、該ベクターがｉＮＯＳ発現カセットを含み、それによってｉＮＯＳが該創傷の領域内の細胞で発現するものである、請求の範囲１の方法。４．患者への移植片の移植方法であって、該移植片（該移植片は非血管組織を含む）の領域内に外因性ｉＮＯＳを導入し、該移植片組織を該患者に外科的に組み込み、それによって該移植片の領域内でｉＮＯＳの産物が産生し、それによって該移植片が該患者の体内で生存することを含む方法。５．外因性ｉＮＯＳが、ベクター（該べクターはｉＮＯＳ発現カセットを含む）を該移植片に付随する細胞に導入することによって、該移植片の領域に導入され、それによって該移植片の領域内の細胞でｉＮＯＳが発現する、請求の範囲４の方法。６．該移植片に付随する該細胞が、該移植片を含む組織内の細胞である請求の範囲４または５の方法。７．該移植片に付随する該細胞が、該移植片の領域内の患者の細胞である請求の範囲４または５の方法。８．該移植片の領域に導入される該細胞がインビトロの細胞である請求の範囲４または５の方法。９．該患者がヒトである請求の範囲１〜８のいずれかの方法。１０．ｉＮＯＳ酵素活性が増進するように外因性ＢＨ₄を導入することをさらに含む請求の範囲１〜９のいずれかの方法。１１．該ＢＨ₄がＢＨ₄の局所投与により導入される請求の範囲１０の方法。１２．該ＢＨ₄が、細胞がＢＨ₄を産生するように該細胞にＧＴＰＣＨ発現カセットを含むベクターを導入することにより導入される請求の範囲１０の方法。１３．ｉＮＯＳのソース、ＢＨ₄のソースおよび薬理学上許容される担体を含む、移植片または創傷に付随する細胞に外因性ｉＮＯＳおよび外因性ＢＨ₄を導入するための医薬組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者チェン、イーディスアメリカ合衆国、ペンシルヴァニア州 15211、ピッツバーグ、ワントライアモントレイン、アパートメント 502ピー (72)発明者シアーズ、ラリーエル．、２世アメリカ合衆国、ペンシルヴァニア州 15102、ベセルパーク、シャーリードライヴ 5800 (72)発明者ゲラー、デイヴィッドエイ. アメリカ合衆国、ペンシルヴァニア州 15234、ピッツバーグ、ハリウッドドライヴ 2329 (72)発明者エディントン、ハワードデイヴィッドジェイムズアメリカ合衆国、ペンシルヴァニア州 15241、ピッツバーグ、ランデスドライヴ 2306

Claims

【特許請求の範囲】１．創傷の領域に外因性ｉＮＯＳを導入し、それによって該創傷の領域内でｉＮＯＳの産物が産生して該創傷の閉鎖を促進することを含む、患者の創傷閉鎖の促進方法。２．外因性ｉＮＯＳが、創傷の領域へのｉＮＯＳの局所投与により該創傷の領域に導入される請求の範囲１の方法。３．外因性ｉＮＯＳが、該創傷に付随する細胞にベクターを導入することにより導入されるものであって、該ベクターがｉＮＯＳ発現カセットを含み、それによってｉＮＯＳが該創傷の領域内の該細胞で発現するものである、請求の範囲の方法。４．患者への移植片の移植方法であって、該移植片（該移植片はｉＮＯＳ発現カセットを含む）に付随する細胞にベクターを導入し、該移植片が該患者内で生存するように該患者に該移植片組織を外科的に組み込み、それによって該患者内の該移植片の領域内の該細胞内でｉＮＯＳの産物が産生して該移植片の領域における血管症を軽減することを含む方法。５．該移植片に付随する該細胞が、該移植片を含む組織内の細胞である請求の範囲４の方法。６．該移植片に付随する該細胞が、該移植片の領域内の患者の細胞である請求の範囲４の方法。７．該移植片の領域に導入される該細胞がインビトロの細胞である請求の範囲４の方法。８．該移植片が脈管構造を含む請求の範囲４〜７のいずれかの方法。９．該ベクターが、該患者への該移植片組織の外科的組み込みの後に、該移植片の領域に導入される請求の範囲４〜８のいずれかの方法。１０．該ベクターが、該患者への該移植片組織の外科的組み込みの前に、該移植片の領域に導入される請求の範囲４〜８のいずれかの方法。１１．該患者がヒトである請求の範囲１〜１０のいずれかの方法。１２．ｉＮＯＳ酵素活性が増進するように外因性ＢＨ₄を導入することをさらに含む請求の範囲１〜１１のいずれかの方法。１３．該ＢＨ₄がＢＨ₄の局所投与により導入される請求の範囲１２の方法。１４．該ＢＨ₄が、細胞がＢＨ₄を産生するように該細胞にＧＴＰＣＨ発現カセットを含むベクターを導入することにより導入される請求の範囲１２の方法。１５．該ｉＮＯＳ発現カセットと該ＧＴＰＣＨ発現カセットを共導入する請求の範囲１４および請求の範囲３または４〜１０のいずれかの方法。１６．該ｉＮＯＳ発現カセットと該ＧＴＰＣＨ発現カセットを共導入しない請求の範囲１４および請求の範囲３または４〜１０のいずれかの方法。１７．創傷の領域内でｉＮＯＳの産物が産生して該創傷の閉鎖を促進するように該創傷の領域内の細胞に外因性ｉＮＯＳを導入するための医薬組成物であって、ｉＮＯＳのソースおよび薬理学上許容される担体を含む医薬組成物。１８．ｉＮＯＳの産物が産生して移植片の領域における血管症を軽減するように該移植片に付随する細胞に外因性ｉＮＯＳを導入するための医薬組成物であって、ｉＮＯＳのソースおよび薬理学上許容される担体を含む医薬組成物。１９．ｉＮＯＳ発現カセットを有するベクターを含有する請求の範囲１７または１８の医薬組成物。２０．ＢＨ₄のソースおよび薬理学上許容される担体を含む、移植片または創傷に付随する細胞に外因性ＢＨ₄を導入するための医薬組成物。２１．ＧＴＰＣＨ発現カセットを有するベクターを含有する請求の範囲２０の医薬組成物。２２．ｉＮＯＳのソース、ＢＨ₄のソースおよび薬理学上許容される担体を含む、移植片または創傷に付随する細胞に外因性ｉＮＯＳおよび外因性ＢＨ₄を導入するための医薬組成物。