JP2009523738A - 修飾高分子 - Google Patents
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Abstract
Description
・医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、および
・医薬活性剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基
を含む少なくとも二つの末端基を含む高分子(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)を提供する。
・医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、および
・医薬活性剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基
を含む少なくとも二つの末端基を含む高分子(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)が提供される。
コア[繰り返し単位]m[表面構築単位]n[キャッピング基1]p[キャッピング基2]q
[式中、
コアは、リジン、もしくはその誘導体、ジアミン化合物、トリアミン化合物またはテトラアミン化合物からなる群より選択され;
繰り返し単位は、アミドアミン、リジンまたはリジン類似体からなる群より選択され;
表面構築単位は、構築単位のものと同じであっても異なってもよく、アミドアミン、リジンまたはリジン類似体から選択され;
キャッピング基1は医薬活性剤、その誘導体、その前駆体またはその残基であり;
キャッピング基2は医薬活性剤の薬物動態を修飾するために選択され;
mはデンドリマーの1または複数のサブ表面層の繰り返し単位の和を表し、1〜32の整数であり;
nはデンドリマーの1または複数の表面層の表面構築単位の数を表し、2〜32の整数であり;
pはキャッピング基1基の数を表し、1〜64の整数であり;
qはキャッピング基2基の数を表し、1〜64の整数である]
を持つデンドリマー(この場合、キャッピング基化学量論とは、キャッピング基の数およびタイプを指す)が提供される。
から選択される化合物である。
・異なる医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である少なくとも二つの末端基、および
・医薬活性剤および/またはデンドリマーの薬物動態を修飾するために選択されるさらにもう一つの末端基
を含むデンドリマー(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)を提供する。
・医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、および
・一つ以上の特異的細胞タイプまたは組織タイプに医薬活性剤および/または高分子をターゲティングするためのターゲティング部分である第2末端基
を含む、デンドリマー(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)が提供される。
・医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、および
・細胞受容体リガンドとして機能する能力を持つ第2末端基
を含む少なくとも二つの末端基を含む高分子(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)が提供される。
・医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、および
・細胞受容体として機能する能力を持つ第2末端基
を含む少なくとも二つの末端基を含む高分子(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)が提供される。
・医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、および
・葉酸または葉酸類似体の残基である第2末端基
を含む二つ以上の異なる末端基を有する高分子(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)が提供される。
・一つ以上のリンカー部分、
・医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、および
・医薬活性剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基
を含む二つ以上の異なる末端基を有し、第1および/または第2末端基がリンカー部分によって高分子の骨組みに取付けられる高分子(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)が提供される。
遊離の薬物がコンジュゲートから放出されるかどうかの決定には、アミド結合の性質が重要である。例えば、薬物(すなわちドキソルビシン)をアミド結合を介して担体にコンジュゲートすると、加水分解に対して安定であり、インビトロでは抗がん作用を一切発揮しないコンジュゲートが生成する。また、アミド結合を介fして担体に直接結合された薬物は、遊離の薬物として容易に切断されることはなく、むしろ担体自体が分解性である場合に薬物-アミノ酸として切断される。直接アミドリンカーを介して結合された担体からの遊離薬物の放出は、その薬物自体がペプチド様分子であり、薬物と担体の間の結合が酵素的に切断可能であるという稀な情況でしか達成することはできないだろう。
ヒドラゾン、オキシムおよびイミン結合は、薬物を担体から切断させるのに、酵素の存在を必要としない。これらは、腫瘍血管外腔またはリソソーム内などといった低pH環境では、C=N結合で加水分解的に切断されうる。よく使用されるヒドラゾン、オキシムおよびイミンリンカーは、それぞれ、リンカーのヒドラジン、アルコキシアミンまたはアミン部分と、医薬活性部分のカルボニル(ケトンまたはアルデヒド)との反応によって生じる。この連結は、C=N結合部分を取り囲むアルキル基の数を修飾することによって、または電子吸引部分(酸不安定性を増加させるため)もしくは電子供与部分(酸不安定性を減少させるため)で置換することによって、加水分解の速度が遅くなるように修飾することもできる。
酸不安定性でありかつ代謝可能なエステルリンカーを作成することができる。オルトエステルは、アニオン性膜担体を結合する脂質にPEGをコンジュゲートするために使用されてきた。酸性条件(pH4〜6)におけるこのコンジュゲートの安定性は、エステルまたはオルトエステルリンカーの構造に依存する。一般に、α-メトキシ-ω-{N-(2-オクタデシルオキシ-[1,3]ジオキソラン-4-イル)メチルアミド}-ポリエチレングリコール110はpH4でもpH5でも良好な安定性を示し、α-メトキシ-ω-{N-(2-コレステリルオキシ-[1,3]ジオキソラン-4-イル)メチルアミド}-ポリエチレングリコール110はpH5では非常に安定であるが、pH4ではわずかに不安定であり、α-メトキシ-ω-{N-(2-メチル-s-オクタデシルオキシ-[1,3]ジオキサン-5-イル)-アミド}-ポリエチレングリコール110およびα-メトキシ-ω-{N-2-(3-ヒドロキシプロピル-コレステリルカルバメート)-2-メチル-[1,3]ジオキサン-5-イル-アミド}-ポリエチレングリコール110は安定でない。小分子への単純なエステルコンジュゲーションに関して、ジエステル官能性は、ジスルフィドより安定であるがアミド結合よりは不安定なモノエステルと比較して、より多くの代謝切断部位を与える。
ペプチドリンカーは、切断速度および切断酵素を制御するために多くの異なるアミノ酸の組み合わせを使用できるので、全ての切断可能リンカーのなかで、その用途が格段に最も広い。しかしこれらのリンカーには、薬物と担体のコンジュゲートとしてそれらを使用するにあたって、1)それらは一般に、体中の非特異的ペプチダーゼによって切断可能であり、それゆえに非腫瘍分布部位で、非特異的な薬物毒性をもたらしうること、および2)アミノ酸が薬物分子に結合した状態で残るようなリンカー内の部位で、切断が起こりうることという、二つの問題がある。これは薬物分子の化学療法作用を妨害しうる。あるいは、結合しているアミノ酸は薬物の薬理作用を変化させないが、その薬物動態に影響を及ぼすかもしれない。しかし、これらの切断作用は、薬物分子に直接結合されるペプチドリンカー中のアミノ酸(例えばプロリン)を適切に選択することによって、制御することができる。
グルタルアルデヒドは一般に、通常のリンカーとしては使用されないが、特にゲル製剤において安定化剤として使用されるか、または望ましい吸着表面に薬物を共有結合的に取付けるために使用される。これは非代謝可能スペーサーとしても使用され、薬物分子と大きな担体の間に、架橋反応によって間隙を作り出す。
PEG-ペプチドは、PEG部分によって担体に生体内安定性と質量とが追加される点以外は、通常のペプチドと同じように使用される。典型的には、薬物を抗体担体にコンジュゲートするために使用され、Abと薬物の間の距離を増加させると同時に、酵素切断部位を露出させ、コンジュゲートの免疫原性を低下させ、血中循環時間を増加させ、複合体の溶解性を増加させるという利点を持つ。アドリアマイシンおよびデュオカルマイシン誘導体に関して、コンジュゲートの内在化および活性薬物の酵素的放出(これは必ずしも遊離の薬物として放出されるわけではない)後に、抗増殖作用が観察されている。
ジスルフィドリンカーは、現在使用されているリンカーの中で最も不安定であり、インビトロで迅速な還元的切断を受ける。しかしその生体内安定性は、一般に、そのインビトロ安定性よりも高い。これらは、含硫アミノ酸間のジスルフィド結合によって形成されるか、非ペプチドベースのジスルフィド結合に形成されうる。これらは、体内の他の求核チオールとも高い反応性を示すので、迅速な血漿クリアランスを示す。
循環では、リンカー切断可能性の順序は以下のとおりである:
ジスルフィド>長鎖ペプチド≧エステル>ヒドラゾン≧テトラペプチド(GGGF)=トリペプチド(GFG>GGG=GPG)≒または>ジペプチド(AV、AP、GP、FL、V-Cit)>グルタルアルデヒド=アミド。
さまざまなリンカーの安定性は、それらがコンジュゲートされる基(すなわちそのリンカーへの酵素の接近可能性)、活性が要求される部位におけるコンジュゲートの挙動(すなわち細胞取り込みまたは細胞外蓄積)ならびにコンジュゲートの性質(すなわちエステル対アミド)に基づく。現在の系では、ジスルフィドコンジュゲートの生体内挙動は、予測することが比較的難しいと予想される。長鎖ペプチドは、より容易にプロテアーゼの接近を受けて、迅速に切断されるものの、その切断は迅速すぎる場合があり、また非特異的部位で起こって、生物学的に活性でないかもしれない医薬活性ペプチド/アミノ酸種の放出が起こることもある。
・医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、および
・医薬活性剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基
を含む二つ以上の異なる末端基を有する高分子と、
そのための薬学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤
とを含む医薬組成物が提供される。
・医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、および
・葉酸または葉酸類似体の残基である第2末端基
を含む二つ以上の異なる末端基を有する高分子と、
そのための薬学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤
とを含む医薬組成物(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)が提供される。
・制御された末端基化学量論を持つ高分子(好ましくはデンドリマー)であって、
少なくとも一つの切断可能なまたは非切断可能なリンカー部分;
医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基;
医薬活性剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基
を含む少なくとも二つの末端基を含む高分子と、
・そのための薬学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤
とを含み、この場合、第1および/または第2末端基は、一つ以上のリンカー部分によって高分子の骨組みに取付けられる(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)。
・制御された末端基化学量論を持つ高分子であって、表面層、少なくとも一つのサブ表面層、ならびに
抗腫瘍医薬剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、
抗腫瘍医薬剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基、を含む少なくとも二つの末端基を含む高分子と、
・そのための薬学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤
とを含む医薬組成物の有効量を投与することを含む方法(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)が提供される。
・制御された末端基化学量論を持つ高分子であって、表面層、少なくとも一つのサブ表面層、ならびに
医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、
医薬活性剤および/または高分子のリンパへの取り込みを容易にするために選択される第2末端基
を含む少なくとも二つの末端基を含む高分子の有効量と、
・そのための薬学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤
とを投与することを含む方法が提供される。
さらにもう一つの態様として、本発明は、制御された末端基化学量論を持つ高分子であって、表面層、少なくとも一つのサブ表面層および二つ以上の異なる末端基を持ち、少なくとも一つの末端基が医薬活性剤、その誘導体、その前駆体、またはその残基であり、かつ少なくとも一つの末端基が医薬活性剤の薬物動態を修飾するために選択される高分子(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)を製造する方法を提供する。
1.表の第1列に挙げた保護基と、表の最上段に挙げた保護基との組み合わせを、「分割可能」(R)または「オルトゴナル」(O)と定義する。ある組み合わせが「分割可能」とみなされる場合、カッコ内の保護基は、最初に除去されるべき基を表す。
2.2-クロロ-Cbzおよび2-ブロモ-Cbzを指す。
3.分割可能でもオルトゴナルでもない組み合わせ。
(i)・官能基および二つ以上の異なる保護基を有する外側層を含む成長中の高分子、
・医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基の前駆体、および
・医薬活性剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基の前駆体
を供給するステップ、
(ii)第1保護基を除去することによって外側層上の官能基を脱保護するステップ、
(iii)第1または第2末端基前駆体の一方を活性化するステップ、
(iv)脱保護された官能基を活性化された末端基前駆体と反応させるステップ、
(v)第2の保護基を除去することによって外側層上の官能基を脱保護するステップ、
(vi)他方の第1または第2末端基前駆体を活性化するステップ、および
(iv)脱保護された官能基を活性化された末端基前駆体と反応させるステップ
を含む、制御された末端基化学量論を持つ高分子を製造するためのプロセス(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)を提供する。
(i)・官能基および二つ以上の異なる保護基を有する外側層を含む成長中の高分子、
・医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基前駆体、および
・医薬活性剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基、ならびに
・カルボキシレート基および保護されたアミン基を含むリンカー部分
を供給するステップ、
(ii)第1保護基を除去することによって外側層上の官能基を脱保護するステップ、
(iii)リンカー部分上のカルボキシレート基を活性化するステップ
(iv)脱保護された官能基をリンカー部分上の活性化されたカルボキシレート基と反応させるステップ、
(v)リンカー部分上のアミン基を脱保護するステップ、
(vi)第1または第2末端基前駆体の一方を活性化するステップ、
(vii)脱保護されたアミン基を活性化された末端基前駆体と反応させるステップ、
(viii)第2の保護基を除去することによって外側層上の官能基を脱保護するステップ、
(ix)他方の第1または第2末端基前駆体を活性化するステップ、および
(x)脱保護された官能基を活性化された末端基と反応させるステップ
を含む、制御された末端基化学量論を持つ高分子を製造するためのプロセス(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)を提供する。
・成長中の高分子へのその修飾化合物の取付けを容易にするためのカルボキシレート基、
・医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、および/または
・医薬活性剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基
を含む。
(i)・二つ以上の異なるアミン保護基およびカルボキシレート基を有するリジンまたはリジン類似体化合物、
・医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基の前駆体、および
・医薬活性剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基の前駆体
を供給するステップ、
(ii)保護されたリジンまたはリジン類似体化合物上の第1アミンを脱保護するステップ、
(iii)第1または第2末端基前駆体を活性化するステップ、
(iv)活性化された末端基前駆体を脱保護されたアミン基と反応させるステップ、
(v)保護されたリジンまたはリジン類似体化合物上の第2アミンを脱保護するステップ、
(vi)他方の第1または第2末端基前駆体を活性化するステップ、および
(vii)前記他方の活性化された末端基前駆体を第2の脱保護されたアミン基と反応させて表面修飾剤化合物を得るステップ
を含むプロセスが提供される。
(i)・官能基および一つ以上の保護基を有する外側層を含む成長中の高分子、ならびに
・カルボキシレート基
医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、および
医薬活性剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基
を含む表面修飾剤化合物
を供給するステップ、
(ii)表面修飾剤化合物上のカルボキシレート基を活性化するステップ、
(iii)保護基を除去することによって、成長中の高分子の外側層上の官能基を脱保護するステップ、
(vii)成長中の高分子上の脱保護された官能基を、表面修飾剤化合物上の活性化されたカルボキシレート基と反応させるステップ
を含む、制御された末端基化学量論を持つ高分子を製造するためのプロセス(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)が提供される。
・ペプチドもしくはタンパク質、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基(この第1末端基は高分子上の単一の選択された取付け部位に取付けられる)、および
・ペプチドもしくはタンパク質および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基
を含む少なくとも二つの末端基を含む高分子(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)が提供される。
コア[最後の完全な層;構築単位]n-[末端基]m[不完全な外側層;構築単位]p[末端基]q
式中、
・コアは、そこに活性化リジン世代構築単位が取付けられる分子であり、リジン構築単位の第1層が付加される少なくとも一つのアミン部分を含むだろう;
・nは、その高分子の最も外側の完全な層上にあるリジン構築単位の数であり、pは、その高分子の不完全な外側層上にあるリジン構築単位の数である:
・mは、最も外側の完全な構築単位層上にある末端基、例えば医薬活性部分または末端アミン保護基の数であり、qは、不完全な外側の構築単位層上にある末端基の数である;
・場合によっては末端基および/または構築単位がコアに付加される場合もあり、その場合、コアは、上記と同じ原則に従って、[末端基]r[構築単位]sと表される。
メトトレキサートはがんおよび自己免疫疾患の処置に用いられる代謝拮抗薬である。これは、ジヒドロ葉酸レダクターゼの競合的かつ可逆的阻害により、葉酸の代謝を阻害することによって作用する。化学的には、メトトレキサートはN-[4-[[(2,4-ジアミノ-6-プテリジニル)メチル]メチルアミノ]-ベンゾイル]-L-グルタミン酸である。分子量:454.45 C20H22N8O5で、構造式は
タキソール(パクリタキセル)は、特に、従来の治療法には応答しなかった乳がんおよび卵巣がんを持つ婦人に処置薬として使用される抗有糸分裂剤である。これは、微小管を安定化し、微小管アセンブリを促進し、その結果として、細胞がその細胞骨格を柔軟に使用することができないようにすることによって作用する。タキソールは三環式ジテルペンであり、構造式は
インドメタシン(indomethacin)(indometacinとも)は、発熱、疼痛、凝り、および腫脹を軽減するためによく用いられる非ステロイド性抗炎症薬である。これは、これらの症状を引き起こすことが知られている分子であるプロスタグランジン類の産生を阻害することによって機能する。
シクロスポリンは、移植における移植片対宿主反応の予防および処置に広く用いられる免疫抑制薬である。これは、免疫学的因子が病原的役割を持ちうる多種多様な他の疾患の治療についても試験されている。
(実施例2)
末端基の約50%および約75%が薬物(具体的にはメトトレキサート)であるリジンデンドリマーを製造した。メトトレキサートは安定な結合によってデンドリマーにコンジュゲートすることができ、この構築物のクリアランスおよび生体内分布が決定される。
BHALys[Lys]16[α-PEG570]16[ε-MTX]16
BHALys[Lys]16[α-PEG1100]16[ε-MTX]16
BHALys[Lys]16[α-PEG1716]16[ε-MTX]16
BHALys[Lys]16[α-PEG2845]16[ε-MTX]16
BHALys[Lys]16[α-PEG3974]16[ε-MTX]16
BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[MTX]16[PEG570]16
BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[MTX]16[PEG1100]16
BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[MTX]16[PEG171616
BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[MTX]16[PEG2845]16
BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[MTX]16[PEG3974]16
式中、MTXはγ-カルボキシレート基を介してコンジュゲートされたメトトレキサート1を表す。このアプローチにおける重要な中間体は、Aust. J. Chem. 2002 55 635-645に記載の方法に従って製造される3である。
タキソール保有デンドリマーの例には以下に挙げるものがある:
BHALys[Lys]16[α-PEG570]16[ε-COCH2CH2CO-タキソール]16
BHALys[Lys]16[α-PEG1100]16[ε-COCH2CH2CO-タキソール]16
BHALys[Lys]16[α-PEG1716]16[ε-COCH2CH2CO-タキソール]16
BHALys[Lys]16[α-PEG2845]16[ε-COCH2CH2CO-タキソール]16
BHALys[Lys]16[α-PEG3974]16[ε-COCH2CH2CO-タキソール]16
BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[PEG570]16[COCH2CH2CO-タキソール]16
BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[PEG1100]16[COCH2CH2CO-タキソール]16
BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[PEG1716]16[COCH2CH2CO-タキソール]16
BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[PEG2845]16[COCH2CH2CO-タキソール]16
BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[PEG3974[COCH2CH2CO-タキソール]16
BHALys[Lys]16[ε,ε-PEG570]8[COCH2CH2CO-タキソール]24
BHALys[Lys]16[ε,ε-PEG1100]8[COCH2CH2CO-タキソール]24
BHALys[Lys]16[ε,ε-PEG1716]8[COCH2CH2CO-タキソール]24
BHALys[Lys]16[ε,ε-PEG2845]8[COCH2CH2CO-タキソール]24
BHALys[Lys]16[ε,ε-PEG3974]8[COCH2CH2CO-タキソール]24
(実施例4)
BHALys[(3H)-Lys]8[NH2.TFA]16(38mg、0.01mmol)の乾燥DMF(3mL)溶液を窒素下で撹拌したものに、D-リジンパラニトロフェノールエステル(181mg、0.38mmol)のDMF(4mL)およびトリエチルアミン(65μL、0.46mmol)溶液を加えた。反応混合物を室温で16時間撹拌した後、アセトニトリル(60mL)に注ぎ込み、6時間撹拌した。得られた微細固体を、0.45μm親水性ポリプロピレンメンブレンフィルターを通した濾過によって集め、減圧乾燥した。生成物BHALys[(3H)-Lys]8[D-Lys]16[Boc]32は微細なクリーム色の固体(40mg、56%)だった。BHALys[(3H)-Lys]8[D-Lys]16[Boc]32(34mg、0.005mmol)をCH2Cl2(1mL)に懸濁し、0℃に冷却した。TFA(398μL、2.58 mol)を滴下し、反応を0℃で10分間撹拌放置してから、室温まで温め、さらに3時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、得られた油状物にエーテルを加え、その溶液を摩砕したところ、白色固体が生じた。エーテルを傾斜し、固体をエーテルですすいだ(3回)。エーテルを除去した後、得られた固体を最少量の水に溶解し、Amberlyst(A-26 OH)イオン交換カラムに適用した。そのカラムから100mLの水を収集し、凍結乾燥によってその水を除去することにより、BHALys[(3H)-Lys]8[D-Lys]16[NH2]32を白色固体(15mg、79%)として得た。LC-MS:(親水性(Philic)TFA、溶媒和温度300℃)Rf(分)8.45。ESI(+ve)m/z=1386.6 (M/3), 1040.3 (M/4), 832.3 (M/5) 694.0 (M/6) 594.9 (M/7)。
(実施例5)
材料
緩衝液試薬はARグレードとした。水はMilliQ水精製システム(Millipore、オーストラリア)から得た。ヘパリン(10,000IU/mL)はFaulding(オーストラリア)から入手した。注射用食塩水は、Baxter Healthcare Pty Ltd(NSW、オーストラリア)から100mLポリエチレンバッグ入りを入手した。トリチウム化L-リジン(1mCi/ml)はMP Biomedicals(米国カリフォルニア州アーバイン)から購入した。非放射標識L-リジンはSigma Chemical Co(米国ミズーリ州セントルイス)から入手した。StarscintシンチレーションカクテルおよびSoluene-350組織可溶化剤はPackard Biosciences(コネティカット州メリデン)から購入した。タンパク質標準にはブルーデキストラン2000(2000kDa)、脂肪酸フリーウシ血清アルブミン(67kDa)、ペプシン(35kDa)、トリプシン(23.8kDa)、ミオグロビン(17.6kDa)、リボヌクレアーゼA(13.7kDa)、シトクロムC(12.4kDa)およびビタミンB12(1.4kDa)を含め、これらは全てSigma Chemical Co(米国ミズーリ州セントルイス)から入手した。より高分子量のタンパク質の溶出時間は、20μlのPrecision Plusタンパク質標準をカラムに注入することによって得た(Bio-Rad、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ)。
デンドリマーの比放射能は、既知質量を含有する原液をPBSに希釈することにより、3重に決定した。次に、一部を1mLのStarscintに加え、Packard Tri-Carb 2000CA Liquid Scintillation Analyser(コネティカット州メリデン)でシンチレーション計数を行った。三重測定値の平均を以降の全ての計算に使用した。
動物実験プロトコールは全て、モナシュ大学(Monash University;オーストラリア・ビクトリア州パークビル)ビクトリアン薬科大学動物倫理委員会(the Victorian College of Pharmacy Animal Ethics Committee)によって承認された。
デンドリマー投与に先だって、Aliら(1999)J. Biol. Chem. 274:24066-24073に記述されているように、ラット(雄、スプレーグ・ドーリー、250〜350g)の頚静脈および頚動脈に、イソフルラン麻酔下で、カニューレ(ポリエチレン管、0.96×0.58mm、Paton Scientific(オーストラリア・ビクターハーバー))を挿入しておいた。これらのカニューレにはヘパリン加食塩水(1mlあたり2I.U.)を流し、溶封してから、回復中は頚の後ろの皮下ポケット中に挿入しておいた。投薬に先だってラットを一晩回復させた。ただし、投薬前の12時間は食物を与えなかった。この回復期間後は、尿および糞を別々に収集できるようにラットを代謝ケージで飼育し、薬物投与および血液収集が容易になるように、カニューレをスイベル/リーシュアセンブリに取付けた。水への自由なアクセスは常に許した。L-リジンのデンドリマーを1mlのリン酸緩衝食塩水(PBS)に溶解し、留置頚静脈カニューレを通して、2分間にわたる静脈内注入により、5mg/kgの用量で投与した。次に、投薬量が確実に全て注入されるように、カニューレに0.25mlのヘパリン加食塩水を流した。その後、以下の名目時点に、頚動脈から血液試料(0.15ml)を採取した:投薬前(-5分)、注入終了時(t=0)、および5、10、20、30、45、60、90、120、180、240、360、480、1440および1800分。血液試料は、10I.U.のヘパリンを含有するチューブに直ちに入れて、3500×gで5分間遠心分離した。次に、血漿(50μl)を1mlのStarscintシンチレーションカクテルに加え、ボルテックスしてからシンチレーション計数を行った。この血漿アッセイに関する定量限界(20dpm)は、スパイクした血漿試料の多重(n=5)解析を使って確認した。確度および精度は±20%以内だった。
生体内でのデンドリマーの運命を理解するために、さまざまな主要臓器への生体内分布を調べた。薬物動態研究(30時間)が完了したら、致死量のペントバルビタールナトリウムを注入することによって動物を屠殺し、解剖により、以下の組織を摘出した:心臓、肺、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓および脳。これらの組織は、組織の処理および分析を行う直前まで、重量計量済みのポリプロピレンチューブ中で凍結保存(-20℃)しておいた。
効率=[(スパイクした組織)DPM−(組織)DPM,未補正]/(スパイクした溶液)DPM (1)
(組織)DPM,補正=(組織)DPM,未補正/効率 (2)
全血薬物動態を決定するために、別個の動物群に同じ量のデンドリマー溶液を投与し、血漿の収集に使用した名目期間と同じ名目期間で、ヘパリン処理したエッペンドルフチューブに、全血試料(150μl)を収集した。各血液試料(50μl)を二つずつ、2本の20mlシンチレーションバイアルに加えた。まず最初に、一方のバイアルは処理せず、他方のバイアルには、(上述のように)全血計数効率データを得るために、既知量(約300〜600壊変毎分(DPM))の研究対象のデンドリマーをスパイクした。次にそれらの試料を、比1:1のSoluene-350およびイソプロピルアルコール4ml中、60℃で終夜可溶化した。次に試料を冷却し、200μlの過酸化水素(30%w/v)で漂白してから、Starscint(12ml)を加えた。次に試料を室温で24時間放置した後、シンチレーション計数を行った。上述のようにスパイクした試料について得られたデータとの比較により、血液試料から得たカウントを効率に関して補正した。
デンドリマーを投与したラットから、投与後0〜8時間、8〜24時間および24〜30時間という三つの時間間隔にわたって、尿を収集した。投薬前の各ラットから得られるブランク尿試料も収集した。各時間間隔から得た尿のうち100μlを1mlのStarscintに加え、その混合物をボルテックスしてから、シンチレーション計数を行った。バックグラウンドを差し引いた後、試料の放射標識含量を、その時間間隔に収集された尿の総体積に関して補正し、投与された総3H用量のパーセンテージに変換した。
血漿/全血試料中の放射標識の濃度を、放射標識デンドリマーの比放射能を使って、ng換算濃度に変換した。これらの濃度はこの報文全体を通してng換算値/mlとして表されているが、これは、このアプローチが、3H放射標識は完全なデンドリマーに付随した状態を保っていると仮定していることに注意して見るべきであり、後述するように、一部にはこれが当てはまらない場合もある。
(実施例6)
いくつかの方法を使って、血漿試料中に存在する分子種のサイズを調べた。まず最初に、血漿試料を重力下でPD10ゲル濾過カラム(Pharmacia)を通して溶出させ、画分を収集することにより、粗いサイズ分離を行った。この方法では、血漿試料(500μl)を2mlのPBSで希釈してから、前もって平衡化しておいたPD10カラムの上にのせた。画分(500μl)を手作業で微量遠心管に収集し、それらを100μlずつ、1mlのStarscintに加えてから、シンチレーション計数を行った。純粋な成分の保持容量を特徴づけるために、そのカラムを通して、PBS中の完全なデンドリマーおよびリジン溶液も溶出させた。
(実施例7)
BHALys[ 3 H-Lys] 16 [CO-3,5-Ph(SO 3 Na) 2 ] 32 の製造
デンドリマー(BHALys[3H-Lys]16[NH2.TFA]32)(2.12g、0.27mmol)のDMF/DMSO(1:1)(200mL)溶液を撹拌したものに、PyBOP(9.56g、18.37mmol)を加えた。3,5-ジスルホ安息香酸(5.39g、19.11mmol)およびジイソプロピルエチルアミン(12.2mL、70.02mmol)のDMF/DMSO(1:1)(150mL)溶液を徐々に加えた。粘着性の沈殿物が生成した。その沈殿物を取り出し、DMSOに再溶解し、反応に戻した。その混合物を室温で16時間撹拌した。反応混合物を水(3.5L)に注ぎ込み、0.45ミクロンフィルターを通して濾過した。
1H nmr (300MHz, D2O) λ(ppm):1.0-2.0 (186H);2.8-3.4 (62H);4.0-4.4 (31H);5.9 (1H);7.0-7.3 (10H);8.1-8.3 (96H)。
LC/MS(イオンペア):ESI(-ve)m/z=740.83 ((M-17H)17-);699.94 ((M-18H)18-);662.83 ((M-19H)19-);629.99 ((M-20H)20-);599.53 ((M-21H)21-)。最大エントロピー法を使ってデータをデコンボリュートすることにより、MW=12614(M-、H型)を得た。計算値(H型)(C423H513N63O255S64)12612(M-)Rf(分)=3.14。
CE(pH3):98.6% Rf(分)=10.97
CE(pH9):97.6% Rf(分)=12.90
デンドリマー(BHALys[3H-Lys]8[NH2.TFA]16)(68mg、17.3μmol)のDMF(5mL)溶液を撹拌したものに、PyBOP(303mg、0.58mmol)を加えた。4-スルホ安息香酸モノナトリウム塩(124mg、0.55mmol)およびジイソプロピルエチルアミン(386μL、2.22mmol)のDMSO/DMF(5mL/10mL)溶液を徐々に加えた。その混合物をアルゴン下、室温で24時間撹拌した後、水(200mL)に注ぎ込み、0.45ミクロンフィルターを通して濾過した。精製は、タンジェンシャルフロー濾過によってMinimate(1Kメンブレン、250mL試料レザバー)で行い、これを水(1.5L)で洗浄した。減圧下で保持液から溶媒を減少させた。生成物を水(5mL)に再溶解し、Sephadexサイズ排除カラム(LH20、溶離液:水)にかけて、画分1〜8を収集した。合わせた画分を減圧下で濃縮し、イオン交換カラム(69F、Na+)に通し、凍結乾燥することにより、所期の生成物BHALys[3H-Lys]8[CO-4-Ph(SO3Na)]16を白色固体(20mg、22%)として得た。
1H nmr (300MHz, D2O) λ(ppm):1.0-1.9 (90H, CH2);2.8-3.3 (30H, CH2);4.0-4.4 (15H, CH);5.9 (1H, CH);7.0-7.2 (10H, Ar-H);7.5-7.8 (64H, Ar-H)。
MS(直接注入):ESI(-ve)m/z=5406 (M-H)-(M-, ナトリウム型)
計算値(ナトリウム型)(C215H257N31O79Na16S16)5404 (M-)。
CE(pH7):91% Rf(分)=10.51
デンドリマー(BHALys[3H-Lys]16[NH2.TFA]32)(100mg、13μmol)のDMSO(8mL)溶液を撹拌したものに、PyBOP(448mg、0.86mmol)を加えた。4-スルホ安息香酸モノカリウム塩(197mg、0.82mmol)およびジイソプロピルエチルアミン(571μL、3.28mmol)のDMSO(12mL)溶液を徐々に加えた。その混合物をアルゴン下、室温で24時間撹拌した。反応混合物を水(200mL)に注ぎ込み、0.45ミクロンフィルターを通して濾過した。精製は、タンジェンシャルフロー濾過により、Stirred Cell(5Kメンブレン、250mL試料レザバー)で行い、これを水(1.5L)で洗浄した。減圧下で保持液から溶媒を減少させた。生成物を水(5mL)に再溶解し、イオン交換カラム(69F、Na+)に通し、凍結乾燥することにより、所期の生成物BHALys[Lys]16[CO-4-Ph(SO3Na)]32を白色固体(89mg、65%)として得た。
1H nmr (300MHz, D2O) λ(ppm):1.0-1.9 (186H, CH2);2.8-3.2 (62H, CH2);4.0-4.4 (31H, CH);5.9 (1H, CH);7.0-7.2 (10H, Ar-H);7.5-7.8 (128H, Ar-H)。
MS(直接注入):ESI(-ve)m/z=10756 (M-H)-(M-, ナトリウム型)
計算値(ナトリウム型)(C423H481N63O159Na32S32)10754 (M-)。
CE(pH9):98% Rf(分)=12.17
デンドリマー(BHALys[3H-Lys]16[NH2.TFA]32)(32mg、4.1μmol)およびトリエチルアミン(36μL、0.26mmol)のDMF(5mL)溶液を撹拌したものに、無水コハク酸(26mg、0.26mmol)を加えた。その混合物をアルゴン下、室温で24時間撹拌した。反応混合物を水(50mL)に注ぎ込み、0.45ミクロンフィルターを通して濾過した。精製はタンジェンシャルフロー濾過により、Minimate(1Kメンブレン、70mL試料レザバー)で行った。NaHCO3(飽和)(100mL)による初期洗浄後に、保持液を水(1.5L)で洗浄した。減圧下で保持液から溶媒を減少させた。生成物を水に再溶解し、イオン交換カラム(69F、Na+)に通し、凍結乾燥することにより、所期の生成物BHALys[3H-Lys]16[COCH2CH2(CO2Na)]32を白色固体(17mg、52%)として得た。
1H nmr (300MHz, D2O) λ(ppm):1.0-1.8 (186H, CH2);2.3-2.7 (128H, CH2);2.9-3.2 (62H, CH2);4.0-4.2 (31H, CH);6.0 (1H, CH);7.1-7.3 (10H, Ar-H)。
MS(直接注入):ESI(-ve)m/z=7360 (M-H)-(M-, H型)
計算値(H型)(C327H513N63O127)7359 (M-)。
CE(pH9):96% Rf(分)=13.02
この研究で使用した方法は実施例5で使用したものと同じである。ラットに5mg/kgをIV投与した後のBHALys[Lys]8[CO-4-Ph(SO3Na)]16(閉じた円形)、BHALys[Lys]16[CO-4-Ph(SO3Na)]32(中空の円形)およびBHALys[Lys]16[CO-3,5-Ph(SO3Na)2]32(三角形)について血漿中濃度-時間プロファイルを、図10に図解する。
(実施例9)
この研究で使用した方法は実施例6の場合と同じである。Superdex 75カラムでの血漿中および尿中のBHALys[Lys]16[CO-4-Ph(SO3Na)]32およびBHALys[Lys]16[CO-3,5-Ph(SO3Na)2]32のサイズ排除プロファイルを図12に図解する。
(実施例10)
BHALys[ 3 H-Lys] 8 [PEG 200 ] 16 の製造
BHALys[3H-Lys]8[NH2.TFA]16(125mg、0.03mmol)のDMF(8mL)溶液を撹拌したものに、PyBOP(556mg、1.0mmol)を加えた後、PEG200(240mg、1.0mmol)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(709μL、4.0mmol)のDMF(16mL)およびDMSO(2mL)溶液を加えた。その溶液を室温で16時間撹拌した。反応混合物を水(180mL)に注ぎ込み、濾過し、水で洗浄した。その水溶液を3K撹拌セルに移し、セルに水を通し、残った水を凍結乾燥で除去することにより、BHALys[3H-Lys]8[PEG200]16を易流動性白色固体(20mg、11%)として得た。
LC/MS(親水性(Philic)TFA):Rf(分)=16.72。ESI(+ve)m/z=5598 (M+H+)。
BHALys[3H-Lys]16[NH2.TFA]32(30mg、0.004mmol)のDMF(3mL)溶液をアルゴン下で撹拌したものにPyBOP(142mg、0.271mmol)を加え、次にPEG200(62mg、0.263mmol)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(182μL、1.04mmol)のDMF(3mL)溶液を加えた。その溶液を室温で16時間撹拌した。減圧下で溶媒を除去し、得られた粗混合物を最少量の水に溶解した。水を溶離液とするSephadexカラム(LH-20)での精製により、凍結乾燥による水の除去後に、所期の生成物BHALys[3H-Lys]16[PEG200]32を白色固体(20mg、44%)として得た。LC/MS(親水性(Philic)TFA):Rf(分)=16.74。ESI(+ve)m/z=11,141 (M+H+)。
BHALys[3H-Lys]16[NH2.TFA]32(20mg、0.003mmol)の乾燥DMF(2mL)溶液を窒素下で撹拌したものに、トリエチルアミン(36μL、0.261mmol)およびPEG685.75,NHSエステル(119mg、0.174mmol)を加えた。反応混合物を室温で16時間撹拌した。その溶液を5K撹拌セルに注ぎ込み、そのセルに水(600mL)を通し、残った水を凍結乾燥(2回)で除去することにより、BHALys[3H-Lys]16[PEG570]32をガラス状の固体(50mg、88%)として得た。LC(親水性(Philic)TFA):Rf(分)12.42。
BHALys[3H-Lys]8[NH2.TFA]16(30mg、0.008mmol)の乾燥DMF(2mL)溶液を窒素下で撹拌したものにPyBOP(141mg、0.271mmol)を加え、次に、PEG2000,NHSエステル(612mg、0.306mmol)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(180μL、1.04mmol)のDMF(1.4mL)およびDMSO(0.6mL)溶液を加えた。その溶液を室温で16時間撹拌した。反応混合物を10K撹拌セルに注ぎ込み、そのセルに水(800mL)を通し、残った水を凍結乾燥で除去することにより、BHALys[3H-Lys]8[PEG2KD]16を易流動性白色固体(149mg、54%)として得た。
BHALys[3H-Lys]16[NH2.TFA]32(30mg、0.004mmol)の乾燥DMF(2mL)溶液をアルゴン下で撹拌したものにPyBOP(142mg、0.272mmol)を加え、次に、PEG2000,NHSエステル(522mg、0.261mmol)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(182μL、1.04mmol)のDMF(3mL)およびDMSO(1mL)溶液を加えた。その溶液を室温で16時間撹拌した。反応混合物を水に注ぎ込み、濾過し、水で洗浄した。精製は、タンジェンシャルフロー濾過により、Mini-mate(10Kメンブレン、水2L)で行った。 凍結乾燥で溶媒を除去することにより、BHALys[3H-Lys]16[PEG2KD]32を易流動性白色固体(210mg、76%)として得た。
LC/MS(親水性(Philic)TFA):Rf(分)=16.29。ESI(+ve)m/z=67,696 (M+H+)
(実施例12)
この研究で使用した方法は実施例6の場合と同じである。5mg/kgをIV投与した後の血漿における3H標識BHALys[Lys]16[PEG200]32(パネルA;t0,中空の四角形、t=1時間,閉じた円形、t=4時間,中空の円形)、BHALys[Lys]16[PEG570]32(パネルB;24時間)、BHALys[Lys]8[PEG2000]16(パネルC;48時間)およびBHALys[Lys]16[PEG2000]32(パネルD;48時間)に関して、Superdex 75カラムでのサイズ排除プロファイルを、図15A〜Dに図解する。
出願人は3H標識ポリ-L-リジンデンドリマーの研究を行った(ここでは、BHALys[Lys]8[NH2]16またはBHALys[Lys]16[NH2]32をどちらも製造し、表面はキャッピングなしにしておいた)。比較のために、第3のデンドリマー、すなわちBHALys[Lys]8[NH2]16コアをD-リジンで完全にキャッピングして、その外側層にD-リジンを持つLys16デンドリマーBHALys[Lys]8[D-Lys]16[NH2]32を形成させたものも調べた。いずれの場合もデンドリマーは生理的pHにおいてカチオン性アミン基で覆われた。これらの物質に関して血漿クリアランスおよび生体内分布を決定した(実施例5)。血漿中に存在する異なる放射標識分子種をサイズ排除クロマトグラフィーで分離することにより、3Hデンドリマーの生体内運命をさらに詳しく調べた(実施例6)。ポリ-L-リジンデンドリマーは静脈内投与後、迅速に血漿から除去されるが、その後、代謝され、遊離したL-リジンが内在性再合成プロセスに再び取り込まれることを、データは示している。
(実施例15)
i.BHALys[Lys] 8 [α-Boc] 8 [ε-CBz] 8 の製造
BHALys[Lys]4[NH2.TFA]8(1.59mmol)、トリエチルアミン(4.50ml、32.30mmol)およびDMF(30ml)の溶液を磁気撹拌したものに、固形のPNPO-α-Boc-ε-CBz-Lys(7.75g、15.45mmol)を室温で一度に加えた。反応懸濁液は直ちに明黄色に変色し、約5分間の撹拌後は、活性エステルが完全に溶解していた。撹拌を室温でさらに22時間続けた。粗反応混合物を、氷水が入っている大きなビーカーに注ぎ込んだところ、微細な黄色沈殿物が生成した。その懸濁液を濾過し、その結果保持された固形物を吸引しながら終夜風乾した。得られた乾燥淡黄色ケーキを微粉末に粉砕し、アセトニトリルに再懸濁した。その懸濁液を室温で30分間撹拌してから濾過した。保持された固形物をもう一度風乾し、再び粉砕し、アセトニトリルに再懸濁した後、濾過し、終夜風乾することにより、BHALys[Lys]8[α-Boc]8[ε-CBz]8t(5.52g、87%)を無色の固体として得た。
LC/MS(疎水性(Phobic)/TFA):ESI(+ve)実測値 [M+H/3]+ m/z=1328;計算値(C207H305N31O47として)3979.9;Rf(分)=20.22分。
BHALys[Lys]8[α-Boc]8[ε-CBz]8(500mg、0.126mmol)を9:1 DMF/H2O(12.5ml)に懸濁し、ギ酸アンモニウム(127mg、2.01mmol)を加え、5分間撹拌した後、Pd/C(10%w/w、266mg)を加え、撹拌を2時間続けた。触媒を濾去することによって反応を停止させ、フィルターを9:1 DMF/H2O(10ml)で洗浄した後、水(2ml)で洗浄した。合わせた濾液を減圧下で濃縮することにより、無色のシロップを得た。それを水(10ml)で処理し、その水を減圧下で除去した後、水から凍結乾燥することにより、BHALys[Lys]8[α-Boc]8[ε-NH2]8を微細な白色凍結乾燥物(155mg、42%)として得た。
LC/MS(親水性/TFA):ESI(+ve)m/z=969.83 [M+3H]/3+, 727.67 [M+4H]/4+, 582.39 [M+5H]/5+;計算値(C143H257N31O31)2906.8g/mol。換算演算を使ってデータをデコンボリュートすることにより、mw=2906.5を得た。Rf(分)=14.7。
(実施例16)
BHALys[Lys]8[α-Boc]8[ε-CBz]8(1000mg、0.251mmol)を酢酸(5.5ml)に懸濁し、0℃で撹拌しつつ、トリフルオロ酢酸(5.5ml)を滴下した。反応混合物を室温まで温めて17時間撹拌放置し、その時点で反応混合物をジエチルエーテル中で摩砕した。得られた懸濁液を10分間撹拌し、液体を遠心分離と傾瀉によって除去した。残った沈殿物を、ジエチルエーテルと共に10分間撹拌することによって洗浄し、そのジエチルエーテルを再び遠心分離と傾瀉によって除去した後、沈殿物を減圧下で乾燥し、水に溶解し、凍結乾燥することにより、BHALys[Lys]8[α-NH2.TFA]8[ε-CBz]8を白色粉末(840mg、105%)として得た。
LC/MS(親水性/TFA):ESI(+ve)m/z=1060.70 [M+3H]/3+, 795.51 [M+4H]/4+, 636.30 [M+5H]/5+;計算値(C167H241N31O31)3178.95g/mol。換算演算を使ってデータをデコンボリュートすることにより、mw=3178.0を得た。Rf(分)=19.1。
(実施例17)
i.BHALys[Lys] 16 [α-Boc] 16 [ε-CBz] 16 の製造
BHALys[Lys]8[NH2.TFA]16(0.81mmol)、トリエチルアミン(4.50ml、32.30mmol)およびDMF(30ml)の溶液を撹拌したものに、固形のPNPO-α-Boc-ε-CBz-Lys(7.94g、15.83mmol)を室温で一度に加えた。反応懸濁液は直ちに明黄色に変色し、約5分間の撹拌後は、活性エステルが完全に溶解していた。撹拌を室温でさらに22時間続けた。粗反応混合物を、氷水が入っている大きなビーカーに注ぎ込んだところ、微細な黄色沈殿物が生成した。その懸濁液を濾過し、その結果保持された固形物を吸引しながら終夜風乾した。得られた乾燥淡黄色ケーキを微粉末に粉砕し、アセトニトリルに再懸濁した。その懸濁液を室温で30分間撹拌してから濾過した。保持された固形物を終夜風乾することにより、BHALys[Lys]16[α-Boc]16[ε-CBz]16(5.79g、91%)を無色の固体として得た。
LC/MS(疎水性(Phobic)/TFA):ESI(+ve)実測値 [M+H/4]+ m/z=1977;[M+H/5]+ m/z=1582;計算値(C407H609N63O95として)7904.9;Rf(分)=23.51分。
BHALys[Lys]16[α-Boc]16[ε-CBz]16(50mg、0.006mmol)、10%Pd/C(53mg)および酢酸(2ml)の懸濁液を水素下、室温で、16時間、激しく撹拌した。その黒い懸濁液を濾過した。濾液を減圧下で濃縮することにより、麦わら色油状の生成物(26mg、71%)を得た。
LC/MS(疎水性(Phobic)/TFA):ESI(+ve)実測値 [M+H/5]+ m/z=1152;[M+H/6]+ m/z=961;[M+H/7]+ m/z=824;[M+H/8]+ m/z=721;[M+H/9]+ m/z=641;計算値(C279H513N63O63として)5758.53;Rf(分)=2.37分。
(実施例18)
BHALys[Lys]16[α-Boc]16[ε-CBz]16(1000mg、0.127mmol)を酢酸(5.5ml)に懸濁し、0℃で撹拌しつつ、トリフルオロ酢酸(5.5ml)を滴下した。反応混合物を周囲温度まで温めて17時間撹拌放置した。反応混合物をジエチルエーテル(150ml)中で摩砕し、得られた懸濁液を10分間撹拌した。遠心分離(4000rpm、10分)と傾瀉によって液体を除去し、残った沈殿物を、ジエチルエーテル(150ml)と共に10分間撹拌することによって洗浄し、そのジエチルエーテルを再び遠心分離と傾瀉によって除去した。沈殿物を減圧下で乾燥し、水(50mL)に溶解し、凍結乾燥することにより、BHALys[Lys]16[α-NH2.TFA]16[ε-CBz]16を白色粉末(832mg、114%)として得た。
LC/MS(親水性/TFA):ESI(+ve)m/z=1576.85 [M+4H]/4+, 1261.34 [M+5H]/5+, 1051.27 [M+6H]/6+, 901.15 [M+7H]/7+;計算値(C327H481N63O63として)6302.83g/mol。換算演算を使ってデータをデコンボリュートすることにより、mw=6301.5を得た。Rf(分)=19.0。
(実施例19)
i.BHALys[Lys] 8 [α-CBz] 8 [ε-Boc] 8 の製造
BHALys[Lys]4[NH2.TFA]8(1.59mmol)、トリエチルアミン(4.40ml、31.57mmol)およびDMF(32ml)の溶液を磁気撹拌したものに、固形のPNPO-α-CBz-ε-Boc-Lys(7.69g、15.33mmol)を室温で一度に加えた。反応懸濁液は直ちに明黄色に変色し、約5分間の撹拌後は、活性エステルが完全に溶解していた。撹拌を室温でさらに19時間続けた。粗反応混合物を、アセトニトリル(約300ml)が入っている大きなビーカーに注ぎ込んだ。その懸濁液を濾過し、その結果保持された固形物を吸引しながら終夜風乾した。得られた乾燥淡黄色ケーキを微粉末に粉砕し(乳鉢と乳棒)、アセトニトリル(400ml)に再懸濁した。その懸濁液を室温で60分間磁気撹拌してから濾過した。保持された固形物を再び風乾し、再度粉砕し、アセトニトリルに再懸濁した後、濾過し、終夜風乾することにより、BHALys[Lys]8[α-CBz]8[ε-Boc]8(5.41g、85%)をオフホワイトの固体として得た。
LC/MS(疎水性(Phobic)/TFA/Speedy Ramp):ESI(+ve)実測値 [M+H/3]+ m/z=1328;計算値(C207H305N31O47として)3979.9;Rf(分)=12.98分。
BHALys[Lys]8[α-CBz]8[ε-Boc]8(5.0mg、1.26μmol)を9:1 DMF/H2O(2ml)に懸濁し、周囲温度で撹拌し、ギ酸アンモニウム(2.5mg、40.2μmol)を加えてから、Pd/C(10%w/w、2.7mg)を加え、撹拌を20時間続けた。触媒を濾去することによって反応を停止させ、フィルターを9:1 DMF/H2O(1ml)ですすいだ。濾液を減圧下で濃縮することにより、無色のシロップを得た。それを水(1ml)で処理し、その水を減圧下で除去した後、水(1ml)から凍結乾燥することにより、BHALys[Lys]8[α-NH2]8[ε-Boc]8を微細な白色凍結乾燥物(2mg、42%)として得た。
LC/MS(親水性/TFA):ESI(+ve)m/z=969.88 [M+3H]/3+, 727.56 [M+4H]/4+;計算値(C143H257N31O31として)2906.8g/mol。換算演算を使ってデータをデコンボリュートすることにより、mw=2906.5を得た。Rf(分)=17.2。
(実施例20)
BHALys[Lys]8[α-CBz]8[ε-Boc]8(20.0mg、0.005mmol)を酢酸(109μl)に懸濁し、水浴中で撹拌した。トリフルオロ酢酸(109μl)を注意深く加えて全ての固形物を溶解させ、撹拌を周囲温度で16時間続けた。減圧下で全ての揮発物を除去することによって反応を停止させたところ、無色透明の油状物を得た。この油状物をジエチルエーテル中で摩砕し、得られた白色沈殿物をジエチルエーテルで洗浄し、減圧下で乾燥することにより、BHALys[Lys]8[α-CBz]8[ε-NH2.TFA]8(12.1mg、76%)を白色固体として得た。
LC/MS(親水性/TFA):ESI(+ve)m/z=1060.43 [M+3H]/3+, 795.63 [M+4H]/4+, 636.79 [M+5H]/5+;計算値(C167H241N31O31として)3178.95g/mol。換算演算を使ってデータをデコンボリュートすることにより、mw=3179.25を得た。Rf(分)=16.6。
(実施例21)
i.BHALys[Lys] 16 [α-Fmoc] 16 [ε-Boc] 16 の製造
BHALys[Lys]8[NH2.TFA]16(0.54mmol)、DIPEA(3.0ml、17.22mmol)およびDMF(11ml)の溶液を撹拌したものに、固形のペンタフルオロフェニルオキシ-α-Fmoc-ε-Boc-Lys(6.58g、10.36mmol)を室温で一度に加えた。反応懸濁液は直ちに明黄色に変色し、約10分間の撹拌後は、活性エステルが完全に溶解していた。撹拌を室温でさらに18時間続けた。その後は粗反応混合物が濃厚になりすぎて磁気撹拌をもはや続けることができなくなった。アセトニトリル(約300ml)を反応フラスコに加え、撹拌を再開させるのに十分になるまで、固形物の塊をスパチュラで砕いた(1時間)。その懸濁液を濾過し、減圧下で終夜風乾した。得られたほぼ無色のケーキを乳鉢と乳棒で粉砕し、その微細な固形物をアセトニトリル(500ml)に2時間再懸濁した。その後、懸濁液を濾過し、無色の固体を集め、室温で終夜風乾した。所期の生成物をオフホワイトの固体(4.72g、94%)として得た。この生成物をFmoc脱保護誘導体BHALys[Lys]16[α-NH2]16[ε-Boc]16として特徴づけた(ii参照)。
BHALys[Lys]16[α-Fmoc]16[ε-Boc]16(1.0g、0.108mmol)およびDMF(10ml)の懸濁液を磁気撹拌したものに、ニートのピペリジン(1ml、10.11mmol)を室温で一度に加えた。その懸濁液をさらに17時間撹拌したところ、粗反応混合物は淡黄色溶液になった。その混合物を減圧下で濃縮することにより、オフホワイトの固体を得て、その固体を次いでジエチルエーテル(約100ml)に懸濁した。室温で30分間撹拌した後、懸濁液を濾過し、集めた固形物を終夜風乾した。所期の生成物を無色の固体(0.60g、97%)として得た。
LC/MS(疎水性(Phobic)/TFA):ESI(+ve)実測値 [M+H/4]+ m/z=1441;[M+H/5]+ m/z=1153;[M+H/6]+ m/z=961;計算値(C279H513N63O63として)5758.5;Rf(分)=2.95分。
(実施例22)
BHALys[Lys] 16 [α-Boc] 16 [ε-Fmoc] 16 の製造およびBHALys[Lys] 16 [α-Boc] 16 [ε-Fmoc] 16 の製造
BHALys[Lys]16[α-CBz]16[ε-Boc]16(0.01mmol)およびジクロロメタン(0.5ml)の混合物を撹拌したものに、窒素下で、ニートのTFA(0.5ml)を滴下した。撹拌を室温で18時間続けた。揮発性反応成分を減圧下で除去し、得られたゴム状残渣をジエチルエーテルで処理することにより、塩生成物の沈殿を誘発した。その懸濁液を濾過し、集めた固形物をジエチルエーテルで洗浄した。得られた固形物を水に溶解し、凍結乾燥により、終夜、濃縮乾固した。生成物を綿毛状無色の固体として得た。
LC/MS(親水性/TFA):ESI(+ve)実測値 [M+H/4]+ m/z=1577;[M+H/5]+ m/z=1262。計算値(C327H481N63O63として)6302.8。
(実施例23)
BHALys[Lys]16[α-CBz]16[ε-Boc]16(0.01mmol)およびジクロロメタン(0.5ml)の混合物を撹拌したものに、窒素下で、ニートのTFA(0.5ml)を滴下した。撹拌を室温で18時間続けた。揮発性反応成分を減圧下で除去し、得られたゴム状残渣をジエチルエーテルで処理することにより、塩生成物の沈殿を誘発した。その懸濁液を濾過し、集めた固形物をジエチルエーテルで洗浄した。得られた固形物を水に溶解し、凍結乾燥により、終夜、濃縮乾固した。生成物を綿毛状無色の固体として得た。
LC/MS(親水性/TFA):ESI(+ve)実測値 [M+H/4]+ m/z=1577;[M+H/5]+ m/z=1262。計算値(C327H481N63O63として)6302.8。
(実施例24)
i.BHALys[Lys] 8 [ε-CBz] 8 [α-Lys] 8 [Boc] 16 の製造
BHALys[Lys]8[ε-CBz]8[α-NH2.TFA]8(3g、0.75mmol)のDMF(30mL)溶液を撹拌したものに、DBL-OPNP(3.6g、7.2mmol)およびトリエチルアミン(2.1mL、15mmol)を加えた。得られた黄色溶液を室温で16時間撹拌した。反応混合物を撹拌したアセトニトリル(300mL)に加えたところ、黄色溶液中に白色沈殿が生じた。この沈殿物を濾過によって集め、残存着色物質を除去するためにアセトニトリルで洗浄した。次に沈殿物を減圧下、室温で乾燥することにより、BHALys[Lys]8[ε-CBz]8[α-Lys]8[Boc]16を白色粉末(4.2g、98%)として得た。
LC/MS(ファスト疎水性(Fast Hydrophobic)/TFA):Rf(分)=13.70;ESI(+ve)m/z=1936 ([M+3]/3), 1452 ([M+4]/4), 1062 ([M+5-Boc]/5);計算値 C295H465N47O71. M+1. 5083.4。
BHALys[Lys]8[ε-CBz]8[α-Lys]8[Boc]16(2.2g、0.38mmol)の酢酸(30mL)溶液を撹拌したものに、10%Pd/C(101mg、0.095mmol)を加えた。得られた均一混合物を室温で16時間、水素下に置いた。その溶液を濾過し、減圧下で濃縮した。得られた粘稠な残渣を水に再溶解し、凍結乾燥することにより、BHALys[Lys]8[ε-NH2]8[α-Lys]8[Boc]16(1.97g、0.38mmol)を得た。この物質は多少の酢酸残渣を含有していた。
LC/MS(親水性/TFA):Rf(分)=18.53;ESI(+ve)m/z=1184 ([M+4]/4), 947 ([M+5]/5), 790 ([M+6]/6);計算値. C231H417N47O55. M+1. 4731.1。
BHALys[Lys]8[ε-NH2]8[α-Lys]8[Boc]16(90mg、0.019mmol)のDMF(10mL)溶液を撹拌したものに、PNPO-α-Boc-ε-CBz-Lys(90mg、0.18mmol)およびトリエチルアミン(0.05mL、0.35mmol)を加えた。得られた黄色溶液を室温で16時間撹拌した。次に反応混合物を撹拌したアセトニトリル(100mL)に加えたところ、黄色溶液中に白色沈殿物が生じた。この沈殿物を濾過によって集め、残存着色物質を除去するためにアセトニトリルで洗浄した。沈殿物を減圧下、室温で乾燥することにより、BHALys[Lys]16[α,α-Boc]8[α,ε-Boc]8[ε,α-Boc]8[ε,ε-CBz]8(51mg、35%)を得た。
LC/MS(疎水性 TFA Speedy Rp):Rf(分)=14.32;ESI(+ve)m/z=2544 ([M+3]/3), 1909 ([M+4]/4), 1527 ([M+5]/5);計算値. C383H625N63O95. M+1. 7629。
(実施例25)
BHALys[Lys]8[ε-NH2]s[α-Lys]8[Boc]16(100mg、0.017mmol)のDMF(10mL)溶液を撹拌したものに、PFP-Lys-α-Boc-ε-Fmoc(96mg、0.15mmol)およびトリエチルアミン(0.04mL、0.27mmol)を加えた。その溶液を室温で16時間撹拌した。次に反応混合物をアセトニトリル(100ml)に加えたところ、透明なゼラチン状の沈殿物が生じた。この沈殿物を濾過によって集め、アセトニトリルで洗浄した。沈殿物を室温で乾燥することにより、BHALys[Lys]16[α,α-Boc]8[α,ε-Boc]8[ε,α-Boc]8[ε,ε-Fmoc]8(30mg、21%)を得た。
LC/MS(疎水性/TFA):Rf(分)=7.72;ESI(+ve)m/z=1667 ([M+5]/5), 1389 ([M+6]/6), 1191([M+7]/7);計算値. C439H657N63O95. M+1 8332。
HO2C-PEG1146-NH2(245mg、0.21mmol、1.07等量)およびPEG570-NHS(136mg、0.2mmol)のDMF(6mL)溶液を撹拌したものに、2mLの緩衝液(pH8.5、Na2HPO4の溶液(100mL)を撹拌したものに2.5mLの0.1M HCl溶液を加え、添加完了後、5分間撹拌することによって調製)を加えた。反応混合物を室温で終夜撹拌した。溶媒をロータバップで除去することにより、PEG1716-CO2Hを残渣として得た。それをLCで精製することにより、所期の生成物を得た(収率80%)。
(実施例26)
i.BHALys[Lys] 8 (α-Boc) 8 (ε-PEG 571 ) 8 の製造
BHALys[Lys]8(α-Boc)8(ε-NH2.TFA)8(9.2mg、0.003mmol)の乾燥DMF(1mL)およびDMSO(1mL)溶液を窒素下で撹拌したものに、NHS-PEG685.75(26mg、0.45mmol)およびトリエチルアミン(10μL、0.108mmol)を加えた。反応混合物を室温で16時間撹拌した後、減圧下で濃縮することにより、粗油状物を得て、それを分取HPLC[C18分取用カラム:Waters Xterra Prep RP18、10μm、19×250mm.周囲温度.勾配:80分で10-45%MeCN.Rf(分)85]で精製することにより、BHALys[Lys]8(α-Boc)8(ε-PEG571)8を無色の油状物(18mg、75%)として得た。
LC-MS:(疎水性(Phobic), TFA)Rf(分)12.81。ESI(+ve)m/z=1246.3 (M/6), 1068.2 (M/7), 934.8 (M/8) 831.2 (M/9)。
BHALys[Lys]8(α-Boc)8(ε-PEG571)8(18mg、0.002mmol)のCH2Cl2(3mL)溶液を0℃で撹拌したものに、TFA(45μL、0.58mmol)を加え、0℃での撹拌を20分間続けた後、室温で2時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去することにより、BHALys[Lys]8(α-NH2.TFA)8(ε-PEG571)8を油状物(16mg、88%)として得た。
LC-MS:(親水性(Philic), TFA)Rf(分)10.36。ESI(+ve)m/z=954 (M/7), 834 (M/8), 742 (M/9)。
(実施例27)
反応スキーム3(図17)を参照して標題化合物の製造を例示する。この反応スキームは以下のとおりである。BHALys[Lys]16[α-Fmoc]16[ε-Boc]16(図17の構造2;R1=Fmoc、R2=Boc)をDMF中でピペリジンと反応させて、BHALys[Lys]16[α-NH2]16[ε-Boc]16(構造3f;R1=H、R2=Boc)を得る。次に、構造3fをDIPEAを使って過剰量のPEG570-NHSとDMF中で反応させることにより、BHALys[Lys]16[α-PEG570]16[ε-Boc]16(構造3g;R1=PEG570、R2=Boc)を得る。次に、構造3gをDCM中でTFA(20%)と反応させ、次いでイオン交換樹脂(OH-型)と反応させることにより、BHALys[Lys]16[α-PEG570]16[ε-NH2]16(構造3h;R1=PEG570、R2=NH2)を得る。次に、構造3hを過剰量のα-tBu-γ-MTX-OH、EDC、HOBtおよびDIPEAとDMSO中で反応させて、BHALys[Lys]16[α-PEG570]16[ε-(α-tBu-MTX)]16(構造3i;R1=PEG570、R2=α-tBu-MTX)を得る。次に、構造3iをTFAと反応させて、BHALys[Lys]16[α-PEG570]16[ε-MTX]16(構造3j;R1=PEG570、R2=MTX)を得る。
(実施例28)
反応スキーム5(図18)を参照して標題化合物の製造を例示する。この反応スキームは以下のとおりである。BHALys[Lys]16[α-PEG570]16[ε-NH2]16(構造3h;R1=PEG570、R2=H)とTFA(16等量)とを過剰量のHO2CCH2CH2CO-タキソール、EDC、HOBtおよびDIPEAとDMF中で反応させて、BHALys[Lys]16[α-PEG570]16[ε-COCH2CH2CO-タキソール]16(構造3l;R1=PEG570、R2=COCH2CH2CO-タキソール)を得る。
(実施例29)
i.BHALys[Lys] 8 [α-NH 2 ] 8 [ε-CBz] 8 の製造
反応スキーム6(パート1)(図19A)を参照して中間体化合物の製造を例示する。この反応スキームは以下のとおりである。BHALys[Lys]4[NH2-TFA]8(構造4;R1=H.TFA)を過剰量のPNPO-α-Boc-ε-CBz-LysおよびDIPEAとDMF中で反応させて、BHALys[Lys]8[α-Boc]8[ε-CBz]8(構造5a;R1=Boc、R2=CBz)を得る。構造5aをTFA/酢酸と反応させた後、イオン交換樹脂(0H-型)と反応させることにより、BHALys[Lys]8[α-NH2]8[ε-CBz]8(構造5b;R1=H、R2=CBz)を得る。
反応スキーム6(パート2)(図19B)を参照して標題化合物の製造を例示する。この反応スキームは以下のとおりである。BHALys[Lys]8[α-NH2]8[ε-CBz]8(構造5b;R1=H、R2=CBz)とTFA(8等量)とを、過剰量のDBL-OPNPおよびDIPEAとDMF中で反応させて、BHALys[Lys]8[ε-CBz]8[Lys]8[α,α-Boc]8[α,ε-Boc]8(構造6a;R1=Boc、R2=CBz)を得る。構造6aをH2およびPd(10%)炭と酢酸中で反応させた後、イオン交換樹脂(OH-型)と反応させることにより、BHALys[Lys]8[ε-NH2]8[Lys]8[α,α-Boc]8[α,ε-Boc]8(構造6b;R1=Boc、R2=H)を得る。構造6bとTFA(8等量)とを過剰量のPNPO-α-Boc-ε-CBz-LysおよびDIPEAとDMF中で反応させて、BHALys[Lys]16[ε,ε-CBz]8[Boc]24(構造7a;R1=Boc、R2=CBz)を得る。構造7aをH2およびPd(10%)炭と酢酸中で反応させ、次にイオン交換樹脂(OH-型)と反応させることにより、BHALys[Lys]16[ε,ε-NH2]8[Boc]24(構造7b;R1=Boc、R2=H)を得る。構造7bを過剰量のPEG570-NHSとDMF中でDIPEAを使って反応させることにより、BHALys[Lys]16[ε,ε-PEG570]8[Boc]24(構造7c;R1=Boc、R2=PEG570)を得る。構造7cをTFAと反応させてBHALys[Lys]16[ε,ε-PEG570]8[NH2-TFA]24(構造7d;R1=H.TFA、R2=PEG570)を得る。構造7dIを過剰量のHO2CCH2CH2CO-タキソール、EDC、HOBtおよびDIPEAとDMF中で反応させて、BHALys[Lys]16[ε,ε-PEG570]8[COCH2CH2CO-タキソール]24(構造7e;R1=COCH2CH2CO-タキソール、R2=PEG570)を得る。
(実施例30)
上記の反応スキームにおいて代用するための上記代替PEG部分の製造を、反応スキーム7(図20)を使って例示する。この反応スキームは以下のとおりである。i.HO2C-PEG1146-NH2をPEG570-NHSとDMF-緩衝液pH8.5中で反応させてPEG1716-CO2Hを得る。ii.PEG1716-CO2HをDCCおよびNHSと反応させ、次にHO2C-PEG1146-NH2とDMF-緩衝液pH8.5中で反応させることにより、PEG2845-CO2Hを得る。iii.PEG2845-CO2HをDCCおよびNHSと反応させた後、HO2C-PEG1146-NH2とDMF-緩衝液pH8.5中で反応させることにより、PEG3974-CO2Hを得る。
(実施例31)
i.N-(ベンジルオキシカルボニル)-3-ブロモプロピルアミンの製造
LCMS(LC:親水性(philic), ホルメート、RT=9.3分;MS(M(計算値) C25H39N3O7=493.61):511 ([M+NH4]+, 13%)、494([M+H]+, 100%)、438 ([M-t-Bu+H]+, 15%)、394 ([M-BOC+H]+, 13%)。
1H (CDCl3):δ 7.30-7.38 (m, 5H), 5.70(br s, 0.5H), 5.25 (br s, 0.5H), 5.10(br s, 0.5H), 5.10, 5.08 (2s, 2H), 4.70(br s, 0.5H), 4.12 (q, J=9.0Hz, 2H), 2.95-3.45 (m, 8H), 2.52-2.70(m, 4H), 1.73-1.90(m, 2H), 1.60-1.70(m, 2H), 1.42, 1.44 (2s, 9H), 1.25 (t, J=9.0Hz, 3H)。
LCMS(LC:親水性(philic), TFA、RT=6.2分;MS(M(計算値) C17H33N3O5=359.47):360 ([M+H]+, 100%)。
1H (CDCl3):δ 5.30(br s, 1H), 4.80(br s, 1H), 4.12 (q, J=9.0Hz, 2H), 3.29-3.46 (m, 4H), 3.14 (m, 1H), 3.07 (m, 1H), 2.56-2.80(m, 6H), 1.60-1.90(m, 4H), 1.42, 1.43 (2s, 9H), 1.25 (t, J=9.0Hz, 3H)。
vii.[BOC][PEG 570 ][NPN] 2 SuOEtの製造
LCMS(LC:親水性(philic), TFA、RT=8.2分;MS(M(計算値) C43H83N3O18=930.15):948 ([M+NH4]+, 12%)、931 ([M+H]+, 2%)、416 (1/2[M-BOC+2H+], 100%)。
1H (CDCl3):δ 7.10(br s, 1H), 7.03 (br s, 1H), 4.16 (q, J=9.0Hz, 2H), 3.72 (m, 2H), 3.58-3.66 (m, 36H), 3.52-3.56 (m, 2H), 3.47 (s, 2H), 2.96-3.42 (m, 7H), 3.37 (s, 4H), 2.70(s, 4H), 2.60(m, 4H), 2.47 (m, 2H), 1.60-1.90(m, 4H), 1.41, 1.43 (2s, 9H), 1.24 (t, J=9.0Hz, 3H)。
LCMS(LC:親水性(philic), TFA、RT=5.9分;MS(M(計算値) C38H75N3O16=830.03):831 ([M+H]+, 7%)、425 (1/2[M+Na++H+], 30%)、416 (1/2[M+2H+], 100%)。
1H (D2O):δ 4.17 (q, J=9.0Hz, 2H), 3.80(t, J=6.0Hz, 2H), 3.62-3.75 (m, 43H), 3.38-3.53 (m, 4H), 3.40(s, 3H), 2.90-3.31 (m, 4H), 2.77 (s, 4H), 2.64-2.89 (m, 4H), 2.52-2.58 (m, 2H), 1.72-2.11 (m, 4H), 1.13 (t, J=9.0Hz, 3H)。
LCMS(LC:親水性(philic), TFA、RT=8.0分;MS(M(計算値) C62H103N11O20=1322.57):1323 ([M+H]+, 2%)、662 (1/2[M+2H+], 17%)、634 (1/2[M-tBu+2H+], 82%)。
LCMS(LC:親水性(philic), TFA、RT=6.8分;MS(M(計算値) C60H99N11O2O=1294.52):1317 ([M+Na]+, 3%)、1295 ([M+H]+, 2%)、648 (1/2[M+2H+], 10%)、620 (1/2[M-tBu+2H+], 74%)、419 (100%)。
DMF(1.2mL)中の[α-tBu-MTX][PEG570][NPN]2SuOH(10mg、7.7μmol)とBHALys[Lys]2[NH2.TFA]4(1.43mg、1.4μmol)の混合物を0℃で撹拌したものに、PyBOP(4.0mg、7.7μmol)およびDIPEA(3.9μL、22.4μmol)を加えた。その混合物を0℃で30分間撹拌した後、室温で3時間撹拌した。DMFを除去し、残渣を分取HPLC(Waters Xterra MS C18、10μm、19×250mm、30-60%ACN, 0.1%TFA、8mL/分、RT=34分)で精製することにより、2mg(25%{大半がボイドに溶出}のBHALys[Lys]2[Su(NPN)2]4[α-tBu-MTX]4[PEG570]4を得た。
LCMS(LC:親水性(philic), TFA、RT=8.0分;MS:1136 (1/5[M+5H+], 18%)、946 (1/6[M+6H+], 100%)、812 (1/7[M+7H+], 22%)。換算値5,673.34(M(計算値) C271H437N51O79=5,673.80)。
(実施例32)
実施例31に記載したものと同様の手法を使ってBHALys[Lys]4[NH2.TFA]8を[α-tBu-MTX][PEG570][NPN]2SuOHと反応させることにより、BHALys[Lys]4[Su(NPN)2]8[α-tBu-MTX]8[PEG570]8(10mg)(51%)を得た。分取HPLC(5-60%ACN、90分、RT54分)。
LCMS(LC:親水性(philic), TFA、RT=9.0分;MS:1614 (1/7[M+7H+], 26%)、1413 (1/8[M+8H+], 73%)、1256 (1/9[M+9H+], 100%)。換算値11,294.54(M(計算値) C535H873N103O159=11,292.52)。
(実施例33)
実施例31に記載したものと同様の手法を使ってBHALys[Lys]8[NH2.TFA]16を[α-tBu-MTX][PEG570][NPN]2SuOHと反応させることにより、BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[α-tBu-MTX]16[PEG570]16(6mg)(46%)を得た。分取HPLC(5-60%ACN、90分、RT66分)。
LCMS(LC:親水性(philic), TFA、RT=9.0分;MS:2254 (1/10[M+10H+], 24%)、2049 (1/11[M+11H+], 56%)、1879 (1/12[M+12H+], 100%)、1734 (1/13[M+13H+], 55%)。換算値22,531.91(M(計算値) C1063H1745N207O319=22,529.73)。
(実施例34)
実施例31に記載したものと同様の手法を使ってBHALys[Lys]16[NH2.TFA]32を[α-tBu-MTX][PEG570][NPN]2SuOHと反応させることにより、BHALys[Lys]16[Su(NPN)2]32[α-tBu-MTX]32[PEG570]32(7mg)(44%)を得た。分取HPLC(5-60%ACN、90分、RT71分)。LCMS(LC:親水性(philic), TFA、RT=9.2分;MS:(M(計算値) C2119H3489N415O639=45,004.27)。
(実施例35)
DMF(1.2mL)中の[α-tBu-MTX][PEG1100][NPN]2SuOH(NH2あたり1.1等量)とBHALys[Lys]8[NH2.TFA]16の混合物を0℃で撹拌したものに、PyBOP(NH2あたり1.2等量)およびDIPEA(NH2あたり3等量)を加えた。その混合物を0℃で30分間撹拌してから、室温で3時間撹拌した。DMFを除去し、残渣を分取HPLC(Waters Xterra MS C18、10μm、19×250mm)で精製することにより、BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[α-tBu-MTX]16[PEG1100]16を得た。
(実施例36)
この合成を図21に図解する。
i.MeOGlyLys[α-Boc][ε-CBz]の製造
トリエチルアミン(30.36g、0.300mol)とジメチルホルムアミド(200ml)の混合物に懸濁したメチルグリシネート塩酸塩(12.56g、0.110 mol)を撹拌したものに、PNPO-α-Boc-ε-CBz-Lys(50.15g、0.100mol)を加えた。周囲温度で16時間撹拌した後、揮発成分を減圧下で蒸発させ、残渣を酢酸エチル(200ml)と5%炭酸ナトリウム水溶液(175ml)とに分配した。水相を捨て、酢酸エチル相を、新たな5%炭酸ナトリウム水溶液(200ml×4)で洗浄し、次に0.25M塩酸(50ml×2)で洗浄してから、飽和塩化ナトリウム水溶液(50ml)で洗浄した。酢酸エチル溶液を乾燥(硫酸マグネシウム)し、濾過し、溶媒を減圧下で蒸発させることにより、MeOGlyLys[α-Boc][ε-CBz](44.39g、98%)を無色の油状物として得た。
1H nmr (300MHz, CD3OD) δ(ppm):1.3-1.8 (m, 6H);1.44 (s, 9H);3.13 (t, J 6.6Hz, 2H);3.70(s, 3H);3.88 (d, J 17.7Hz, 1H);3.99 (d, J 17.7Hz, 1H);4.04 (m, 1H);5.06 (s, 2H);7.2-7.4 (m, 5H)。
LC/MS(疎水性/ホルメート):ESI(+ve)実測値 [M+H]+ m/z=452.0;計算値(C22H34N3O7として)452.2。Rf(分)=5.2。
MeOGlyLys[α-Boc][ε-CBz](43.36g、96.0mmol)を酢酸(150ml)に溶解し、その溶液を氷浴温度で、酢酸が凍結しはじめるまで撹拌した。氷浴を除去し、酢酸の結晶が溶解するまで、トリフルオロ酢酸を撹拌しながらゆっくり加えた。その溶液をもう一度氷浴に入れ、トリフルオロ酢酸の残り(計150ml)をゆっくり加えた。酢酸の凍結が再び起こることはなかった。氷浴を取り除き、溶液を周囲温度で5時間撹拌した後、揮発成分を減圧下で可能な限り完全に蒸発させた。残った粘性油状物をメタノール(200ml)に溶解し、再び減圧下でロータリーエバポレーターにかけて、油状物を得た。この工程を、さらに5回、各200mlのメタノールを使って繰り返した後、0.1トルの減圧下で、残存メタノールを可能な限り除去した。生成物MeOGlyLys[α-NH2.TFA][ε-CBz]を淡黄色油状物として得た(46.04g、多少のメタノールがまだ存在するため理論値の103%)。
1H nmr (300MHz, CD3OD) δ(ppm):1.5-1.6 (m, 4H);1.8-2.0(m, 2H);1.44 (s, 9H);3.15 (t, J 6.8Hz, 2H);3.71 (s, 3H);3.88 (t, J 6.4Hz, 1H);3.94 (d, J 17.6Hz, 1H);4.08 (d, J 17.6Hz, 1H);5.07 (s, 2H);7.2-7.4 (m, 5H)。
LC/MS(親水性/ホルメート):ESI(+ve)実測値 [M+H]+ m/z=352.1 ;計算値(C17H26N3O5として)352.2。Rf(分)=12.3。
MeOGlyLys[α-NH2.TFA][ε-CBz](46.0g、96.0mmol)およびトリエチルアミン(24.3g、0.240mol)のジメチルホルムアミド(200ml)溶液を撹拌したものに、DBL-OPNP(49.37g、0.106mol)を加えた。周囲温度で17時間撹拌した後、グリシン(3.98g、53.0mmol)の水(50ml)溶液を加え、その濁った溶液を24時間撹拌した。よく撹拌した混合物に水(150ml)を加えたところ、白色の固形物が沈殿しはじめた。次に薄片状の氷(200g)を加え、氷が溶けてしまうまで、撹拌を続けた。固形物を濾過によって集め、5%炭酸ナトリウム水溶液に懸濁し、0.5時間超音波処理した。吸引によって半乾燥した後、5%炭酸ナトリウム水溶液(200ml×2)で洗浄し、次に水(200ml×3)で洗浄した。次に、その明黄色固形物を、新たな200mlの5%炭酸ナトリウム水溶液中で撹拌し、濾過することにより、淡黄色粉末を得た。その固体を水(200ml×2)で洗浄した後、新たな水(200ml)に懸濁し、1.5時間超音波処理した。濾過および吸引乾燥後に、減圧下で乾燥することにより、61.0gの黄褐色粉末を得た。酢酸エチルからの再結晶により、MeOGlyLys[ε-CBz][α-Lys][Boc]2(50.05g、77%)を白色固体として得た。
1H nmr(300MHz, CD3OD)δ(ppm):1.2-2.0(m, 30H);3.03 (t, J 6.6Hz, 2H);3.12 (t, J 6.8Hz, 2H);3.69 (s, 3H);3.87 (d, J 17.6Hz, 1H);4.00(d, J 17.6Hz, 1H);4.01 (dd, J 3.3, 7.4Hz, 1H);4.38 (dd, J 5.4, 8.4Hz, 1H);5.06 (s, 2H);7.2-7.4 (m, 5H)。
LC/MS(親水性/ホルメート):ESI(+ve)実測値 [M+H]+ m/z=680.0;計算値(C33H54N5O10として)680.4;実測値 [M+NH4]+ m/z=697.0;計算値(C33H57N6O10として)697.4。Rf(分)=8.0。
MeOGlyLys[ε-CBz][α-Lys][Boc]2(680mg、1.00mmol)およびトリフルオロ酢酸(77μl、1.0mmol)のメタノール(10ml)溶液を、大気圧の水素下で、10%w/wパラジウム炭(106mg、0.10 mmol Pd)の懸濁液に加えた。その混合物を周囲温度で1時間撹拌した後、セライトのベッドを通して濾過した。メタノールを減圧下で蒸発させ、残渣をメタノール(5ml)に再溶解し、その溶液を0.2μmフィルターに通した。メタノールを減圧下で蒸発させることにより、MeOGlyLys[ε-NH2.TFA][α-Lys][Boc]2(640mg、97%)を脆い白色泡状物として得た。
1H nmr (300MHz, CD3OD) δ(ppm):1.2-2.0(m, 30H);2.93 (t, J 7.5Hz, 2H);3.03 (t, J 6.6Hz, 2H);3.72 (s, 3H);3.89 (d, J 17.7Hz, 1H);3.98 (dd, J 5.4, 9.0Hz, 1H);4.02 (d, J 17.7Hz, 1H);4.42 (dd, J 5.7, 8.4Hz, 1H)。
LC/MS(親水性/ホルメート):ESI(+ve)実測値 [M+H]+ m/z=546.2;計算値(C25H48N5O8として)546.3。Rf(分)=14.2。
MeOGlyLys[ε-NH2.TFA][α-Lys][Boc]2(640mg、0.97mmol)のジメチルホルムアミド(10ml)溶液を撹拌したものに、PNPO-α-Boc-ε-CBz-Lys(535mg、1.07mmol)を加えた。トリエチルアミン(340μl、2.43mmol)を加え、その溶液を周囲温度で20時間撹拌した。グリシン(40mg、0.54mmol)の水(5ml)溶液を加え、その濁った溶液を2時間撹拌した。ジメチルホルムアミドを減圧下で蒸発させ、残った油状物を、酢酸エチル(20ml)と、5%炭酸ナトリウム水溶液および飽和塩化ナトリウム水溶液の3:1混合物(20ml)とに分配した。水相を捨て、酢酸エチル相を、新たな上記炭酸ナトリウム/塩化ナトリウム混合物(20ml×3)で洗浄した後、0.20M 塩酸(20ml×2)で洗浄し、次に飽和塩化ナトリウム水溶液(20ml)で洗浄した。その酢酸エチル溶液を乾燥(硫酸ナトリウム)し、濾過し、溶媒を減圧下で蒸発させることにより、MeOGlyLys[Lys]2[Boc]3[ε,ε-CBz](818mg、93%)を脆い白色泡状物として得た。
1H nmr (300MHz, CD3OD) δ(ppm):1.2-2.0(m, 45H);3.03 (t, J 6.6Hz, 2H);3.12 (t, J 6.6Hz, 2H);3.19 (m, 2H);3.71 (s, 3H);3.88 (d, J 17.4Hz, 1H);3.93-4.06 (m, 2H);4.00(d, J 17.7Hz, 1H);4.38 (dd, J 5.4, 8.4Hz, 1H) ;5.07 (s, 2H);7.25-7.45 (m, 5H)。
LC/MS(疎水性/ホルメート):ESI(+ve)実測値 [M+H]+ m/z=908.4;計算値(C44H74N7O13として)908.5;実測値 [M+NH4]+ m/z=925.4;計算値(C44H77N8O13として)925.5。Rf(分)=9.5。
MeOGlyLys[Lys]2[Boc]3[ε,ε-CBz](500mg、0.55mmol)を水酸化ナトリウム(44mg、1.10mmol)のメタノール(8ml)および水(4ml)溶液に溶解した。その溶液を周囲温度で4時間撹拌し、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣を水(10ml)に溶解し、1M硫酸水素カリウム(2ml)を加えた。得られた白色沈殿物を酢酸エチル(10ml)に抽出し、水相を捨てた。酢酸エチル相を飽和塩化ナトリウム水溶液(10ml)で洗浄し、乾燥(硫酸ナトリウム)し、濾過し、溶媒を減圧下で蒸発させることにより、HOGlyLys[Lys]2[Boc]3[ε,ε-CBz](481mg、96%)を無定形白色固体として得た。
1H nmr (300MHz, CD3OD) δ(ppm):1.2-2.0(m, 45H);3.03 (t, J 6.6Hz, 2H);3.12 (t, J 6.6Hz, 2H);3.19 (m, 2H);3.84 (d, J 18.0Hz, 1H);3.95-4.07 (m, 2H);3.97 (d, J 17.7Hz, 1H);4.39 (dd, J 5.4, 8.4Hz, 1H);5.07 (s, 2H);7.25-7.38 (m, 5H)。
LC/MS(疎水性/TFA):ESI(+ve)実測値 [M+H]+ m/z=894.3;計算値(C43H72N7O13として)894.5。Rf(分)=8.4。
(実施例37)
図22に合成を図解する。HOGlyLys[Lys]2[Boc]3[ε,ε-CBz](536mg、0.60mmol)、BHALys[NH2.TFA]2(135mg、0.250mmol)、4,4-ジメチルアミノピリジン(7.3mg、60μmol)およびトリエチルアミン(210μl、1.50mmol)のジメチルホルムアミド(10ml)溶液に、EDCI(0.90mmol)を加えた。その溶液を周囲温度で15時間撹拌し、次に揮発成分を減圧下で除去した。シリカゲルクロマトグラフィー(メタノール/ジクロロメタン勾配)により、BHALys[GlyLys]2[Lys]4[Boc]6[ε,ε-CBz]2(245mg、47%)を得た。少量の試料(20mg)を常法により酢酸/TFAで処理して、分析データを得た。
LC/MS(親水性(philic)/TFA):ESI(+ve)実測値 [M+H]+ m/z=1463.2;計算値(C75H116N17O13として)1462.9。
(実施例38)
BHALys[Lys]16[α-PEG570]16[NH2.TFA]16のDMF溶液およびTEA(NH2あたり3等量)を撹拌したものに、無水酢酸(NH2あたり1.5等量)を加え、反応を終夜撹拌した。反応を濃縮し、残渣を、水を溶離液とするSephadex G-25でのサイズ排除クロマトグラフィーで精製することにより、BHALys[Lys]16[α-PEG570]16[COCH3]16を得た。
(実施例39)
ラットの胸管(M Boydら (2003) Journal of Pharmacology and Toxicology Methods 49:115-120に記載の手法を使用)および右頚静脈(食塩水注入用)にカニューレを挿入した。ラットを一晩回復させ、食物と水を常時供給した。動物に5mg/kg用量(10mg/ml、体重100gにつき50μl)のデンドリマー(Lys16(PEG200)32、Lys16(PEG570)32、Lys16(PEG2000)32またはLys16(BS)32)を、右踵上への注射によって、皮下投与した。Lys16(BS)32を非PEG化対照デンドリマーとした。胸管へのリンパ排液を30〜48時間にわたって収集し、トリチウム放射標識についてシンチレーション計数を行った。
(実施例40)
以下の研究は、1)部分表面PEG化および2)PEGと薬物/アセチル基の組み合わせによるデンドリマー表面の完全キャッピングが、ラットへの5mg/kg IV投与後のデンドリマー薬物動態にどのように影響するかを決定するために行った。
Lys16(NH2)32(MW 4.1kDa)、BHALys[3H-Lys]16[NH2]32、文中ではアンキャップトデンドリマーともいう;
Lys16(PEG570)32(MW 23kDa)、BHALys[3H-Lys]16[PEG570]32、文中では完全PEG化デンドリマーともいう;
Lys16(PEG570)16(NH2)16(MW 13.3kDa)、BHALys[3H-Lys]16[α-PEG570]16[ε-NH2]16、文中では半PEG化デンドリマーともいう;
Lys16(PEG570)16(CH3)16(MW 14kDa)、BHALys[3H-Lys]16[α-PEG570]16[ε-COCH3]16、文中では半アセチル化デンドリマーともいう;
Lys16(PEG570)16(MTXアミド)16 *(MW 22.5kDa)、BHALys[3H-Lys]8[Su(NPN)2]16[PEG570]16[α-tBu-MTX]16、文中ではMTXデンドリマーともいい、この場合、MTXはメトトレキサートである。
*メトトレキサートは非PEG化部位に安定なアミドリンカーを介してコンジュゲートした。
SDラット(約300g)に、5mg/kg用量のトリチウム化デンドリマー(食塩水1ml中)を、
右頚静脈中の留置カニューレを通して、2分間の直接静脈内注入によって投与した。その後、Cp0(静脈内注入終了時点の血漿におけるデンドリマーの濃度)を評価するために、t0血液試料を右頚動脈の留置カニューレから収集した(0.2ml)。その後、5、10、20、30、45、60、90、120、180、240、360、480、1440および1800分時点に、血液試料をヘパリン処理チューブ中に収集した。血液試料を遠心分離した後、6mlシンチレーション管中で血漿100μlを1〜2mlのStarscintと混合し、トリチウム放射能について計数した。尿をデンドリマーの投与後0〜8時間、8〜24時間および24〜30時間の時間間隔で収集した。尿の一部(各100μl)を、同様に、トリチウム放射能について計数した。50mM PBS+0.3M NaCl(pH3.5)を溶離液とするSuperdex 75 SECカラムでのサイズ排除クロマトグラフィーによって、尿および血漿試料を分析した。カラムから溶出する画分を1分(0.5ml)間隔で収集し、6mlシンチレーション管中で2mlのStarscintと混合し、トリチウム放射能についてシンチレーション計数を行った。
Lys 16 (PEG 570 ) 16 (NH 2 ) 16
半PEGデンドリマーの投与後は、血漿中放射標識が、最初の1時間にわたって、8.6±0.3分の半減期で、迅速に減少した(図24B)。比較のために、完全アンキャップト(Lys16(NH2)32)デンドリマーの血漿プロファイルを図24Aに示す。完全アンキャップトデンドリマーと半PEG化デンドリマーの間の初期血漿/分布動態の相違の理由は、組織結合データから明らかだろう(表13)。すなわち、アンキャップトデンドリマーは、組織または脈管構造に迅速に結合し(代用物として肝ホモジネートを使って試験した)、その結果、血漿からはほとんど直ちに除去されると考えられる。対照的に、部分的にPEG化された物質でさえ、組織または血管結合活性は、はるかに低い。
半アセチル化デンドリマーに由来する放射標識の初期血漿プロファイルは、半PEG化デンドリマーのものと類似していた(半減期=9.3±0.42分)(図24)。しかし、半PEG化デンドリマーとは異なり、半アセチル化デンドリマーの終末相半減期は、より短く、完全PEG化分子種の終末相半減期に、より近かった(半アセチル化デンドリマーの13.9±0.3時間に対して完全PEG化デンドリマーは9.45±0.42時間)。これはおそらく、半PEG化デンドリマーよりも、半アセチル化デンドリマーの方が、コア代謝の速度が遅いためだろう(図27A)。血漿SECプロファイルは、t0において、血漿中放射標識の全てが完全なデンドリマーに起因すると考えられることを示している。投与の2時間後に収集した血漿は、完全なデンドリマーに帰される小さなピークと、20分の幅広いピーク(このピークは完全なデンドリマーの2分前に溶出した)とを示したが、遊離のリジンは目につかなかった。半PEG化デンドリマーの場合、注射された放射標識の大半が、30時間尿中に排泄され(72.3±1.2%)、その大半は変化せずに排泄された。デンドリマー代謝の産物に起因すると考えられる数個の小分子量種が8〜24時間尿に同定された(図27B、8〜24時間については目盛りが異なることに注意)。
MTXデンドリマーの分子量は完全PEG化デンドリマーと類似しているが、その血漿プロファイルは、むしろ半アセチル化デンドリマーのプロファイルの方に似ていた。初期血漿半減期は15.4±2.4分で、これは他方の半キャップトデンドリマーよりわずかに遅かった。終末相消失半減期は完全PEG化デンドリマーと基本的に同じ(9±0.2時間)であり、これはおそらく、終末相血漿クリアランスが総分子量に依存することを反映しているのだろう。
1)PEG570による50%表面キャッピングを有する(が、表面部位の50%はアンキャップトのままである)リジンデンドリマーは、比較的迅速に血漿から排除され、分解を受けて遊離のリジンを放出するようである。しかしこれらは、完全アンキャップト分子種ほどの血管結合は示さないようである。
2)50%表面PEG化を有するデンドリマー上のアンキャップト部位をアセチル化すると、表面アミンの50%がアンキャップトのままであるデンドリマーと比較して、デンドリマーの生分解が減少するが、血漿からの初期クリアランス/分布速度は、基本的に同じである。
3)表面に50%PEGキャッピング基および50%MTXキャッピング基を有するリジンデンドリマーは、半アセチル化デンドリマーと類似する初期血漿プロファイルを示す。
4)表面に50%PEGキャッピング基および50%MTXキャッピング基を有するリジンデンドリマーは、類似するサイズの完全PEG化デンドリマー、または50%アセチル化系と比較して、IV投与後に尿中に回収される用量の割合が少ない。これはおそらく、MTXがRES中の食細胞または葉酸受容体と相互作用することによって起こるRESによる取り込み量の増加を反映しているのだろう。
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Claims (49)
- 制御された末端基化学量論を持つ高分子であって、表面層、少なくとも一つのサブ表面層、ならびに
・医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、および
・医薬活性剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基,
を含む少なくとも二つの末端基を含む高分子(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)。 - 制御されたトポロジーをさらに示す請求項1に記載の高分子(この場合、トポロジーは、高分子の表面層またはサブ表面層へのその接続という観点から見た、ある末端基ともう一つの末端基との関係を表す)。
- 第2末端基が以下の一つ以上から選択される、請求項1に記載の高分子:医薬活性剤および/または高分子の血漿中半減期を修飾する部分;一つ以上の細胞タイプまたは組織タイプへの医薬活性剤および/または高分子のターゲティングを容易にする部分;ならびに一つ以上の細胞タイプまたは組織タイプへの医薬活性剤および/または高分子の取り込みを容易にする部分。
- 第2末端基が、医薬活性剤の血漿中半減期を延ばすために選択される、請求項3に記載の高分子。
- 第2末端基が細胞表面受容体のリガンドである、請求項3に記載の高分子。
- 第2末端基がポリエチレングリコール(PEG)またはポリエチルオキサゾリンである、請求項3に記載の高分子。
- 第2末端基が葉酸または葉酸誘導体の残基である、請求項3に記載の高分子。
- 一つ以上のリンカー部分をさらに含み、第1および/または第2末端基がそのリンカー部分を介して高分子の骨組みに取付けられる、請求項1に記載の高分子。
- リンカー部分が切断可能である、請求項8に記載の高分子。
- リンカー部分が、アミドリンカー、ヒドラゾン、オキシムおよびイミンリンカー、エステルリンカー、ペプチドリンカー、グルタルアルデヒドリンカー、PEG-ペプチドリンカー、ジスルフィドリンカーおよびチミジンリンカーからなる群より選択される、請求項8に記載の高分子。
- 第2末端基が、一つ以上の細胞タイプまたは組織タイプへの医薬活性剤および/または高分子のターゲティングを容易にする部分ならびに一つ以上の細胞タイプまたは組織タイプへの医薬活性剤および/または高分子の取り込みを容易にする部分から選択され、一つ以上のリンカー部分がPEGを含む、請求項1に記載の高分子。
- 医薬活性剤が、アセトン血症製剤;麻酔薬、制酸剤;抗体;抗真菌薬;抗感染薬;代謝拮抗物質;抗有糸分裂薬;抗原虫薬;抗ウイルス医薬;生物学的製剤;気管支拡張薬および去痰薬;心血管医薬;造影剤;利尿薬;成長ホルモン;造血薬;ホルモン補充療法薬;免疫抑制薬;ホルモンおよびホルモン類似体;ミネラル;栄養補助食品および栄養素;眼科医薬;疼痛治療薬;呼吸器医薬;移植関連製品;ワクチンおよびアジュバント;同化剤;鎮痛薬;抗関節炎剤;抗痙攣薬;抗ヒスタミン薬;抗炎症薬;抗微生物薬;抗寄生虫薬;抗潰瘍剤;行動修正薬;血液および代用血液;がん治療薬およびがん関連医薬;中枢神経系医薬;避妊薬;糖尿病治療薬;不妊治療医薬;成長促進薬;止血薬;免疫賦活薬;筋弛緩薬;天然物;肥満治療薬;骨粗鬆症薬;ペプチドおよびポリペプチド;鎮静薬および精神安定薬;尿酸性化薬;ならびにビタミンからなる群より選択される、請求項1に記載の高分子。
- 医薬活性剤が、代謝拮抗物質;抗有糸分裂薬;抗炎症薬;肥満治療薬;および免疫抑制薬からなる群より選択される、請求項12に記載の高分子。
- 医薬活性剤が、メトトレキサート;タキソール;インドメタシン;ゼニカル;およびシクロスポリンからなる群より選択される、請求項13に記載の高分子。
- 制御された末端基化学量論を持つ高分子であって、表面層、少なくとも一つのサブ表面層、ならびに
・ペプチドもしくはタンパク質、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基(この第1末端基は高分子上の選択された単一の取付け点に取付けられる)、および
・ペプチドもしくはタンパク質および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基
を含む少なくとも二つの末端基を含む高分子(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)。 - 制御された末端基化学量論を有し、表面層および少なくとも一つのサブ表面層を持つ少なくとも一つのリジンまたはリジン類似体デンドリティックモチーフを含む高分子であって、
・医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、および
・医薬活性剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基
を含む少なくとも二つの末端基を含む高分子(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)。 - リジンデンドリマー高分子が制御されたトポロジーをさらに示す、請求項16に記載の高分子(この場合、トポロジーは、高分子の表面層またはサブ表面層へのその接続という観点から見た、ある末端基ともう一つの末端基との関係を表す)。
- 第2末端基がポリエチレングリコール(PEG)またはポリエチルオキサゾリンである、請求項16に記載の高分子。
- 第2末端基が葉酸または葉酸誘導体の残基である、請求項16に記載の高分子。
- 医薬活性剤がメトトレキサート;タキソール;インドメタシン;ゼニカル;およびシクロスポリンからなる群より選択される、請求項16に記載の高分子。
- 制御されたキャッピング基化学量論を持ち、式:
コア[繰り返し単位]m[表面構築単位]n[キャッピング基1]p[キャッピング基2]q
[式中、
コアは、リジン、もしくはその誘導体、ジアミン化合物、トリアミン化合物またはテトラアミン化合物からなる群より選択され;
繰り返し単位は、アミドアミン、リジンまたはリジン類似体からなる群より選択され;
表面構築単位は、構築単位のものと同じであっても異なってもよく、アミドアミン、リジンまたはリジン類似体から選択され;
キャッピング基1は医薬活性剤、その誘導体、またはその前駆体の残基であり;
キャッピング基2は医薬活性剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択され;
mはデンドリマーの1または複数のサブ表面層の繰り返し単位の和を表し、1〜32の整数であり;
nはデンドリマーの1または複数の表面層の表面構築単位の数を表し、2〜32の整数であり;
pはキャッピング基1基の数を表し、1〜64の整数であり;
qはキャッピング基2基の数を表し、1〜64の整数である]
を持つ、リジンデンドリマーポリマー(この場合、キャッピング基化学量論とは、キャッピング基の数およびタイプを指す)。 - 高分子が制御されたトポロジーをさらに示す、請求項21に記載のデンドリマー(この場合、トポロジーは、高分子の表面構築単位または繰り返し単位へのその接続という観点から見た、あるキャッピング基ともう一つのキャッピング基との関係を表す)。
- キャッピング基2がポリエチレングリコール(PEG)またはポリエチルオキサゾリンである、請求項22に記載のデンドリマー。
- キャッピング基2が葉酸または葉酸誘導体の残基である、請求項22に記載の高分子。
- 医薬活性剤がメトトレキサート;タキソール;インドメタシン;ゼニカル;およびシクロスポリンからなる群より選択される、請求項22に記載のデンドリマー。
- (i)・官能基および二つ以上の異なる保護基を有する外側層を含む成長中の高分子、
・医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基の前駆体、および
・医薬活性剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基の前駆体
を供給するステップ、
(ii)第1保護基を除去することによって外側層上の官能基を脱保護するステップ、
(iii)第1または第2末端基前駆体の一方を活性化するステップ、
(iv)脱保護された官能基を活性化された末端基前駆体と反応させるステップ、
(v)第2の保護基を除去することによって外側層上の官能基を脱保護するステップ、
(vi)他方の第1または第2末端基前駆体を活性化するステップ、および
(iv)脱保護された官能基を活性化された末端基前駆体と反応させるステップ
を含む、制御された末端基化学量論を持つ高分子を製造するための方法(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)。 - 成長中の高分子が少なくとも一つのリジンまたはリジン類似体モチーフを含む、請求項26に記載の方法。
- 第2末端基がポリエチレングリコール(PEG)またはポリエチルオキサゾリンである、請求項26に記載の方法。
- 第2末端基が葉酸または葉酸誘導体の残基である、請求項26に記載の方法。
- 医薬活性剤がメトトレキサート;タキソール;インドメタシン;ゼニカル;およびシクロスポリンからなる群より選択される、請求項26に記載の方法。
- (i)・官能基および一つ以上の保護基を有する外側層を含む成長中の高分子、ならびに
・カルボキシレート基、
医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、および
医薬活性剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基
を含む表面修飾剤化合物
を供給するステップ、
(ii)表面修飾剤化合物上のカルボキシレート基を活性化するステップ、
(iii)保護基を除去することによって、成長中の高分子の外側層上の官能基を脱保護するステップ、ならびに
(vii)成長中の高分子上の脱保護された官能基を、表面修飾剤化合物上の活性化されたカルボキシレート基と反応させるステップ
を含む、制御された末端基化学量論を持つ高分子を製造するための方法(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)。 - 成長中の高分子が少なくとも一つのリジンまたはリジン類似体モチーフを含む、請求項31に記載の方法。
- 表面修飾剤化合物がリジンまたはリジン類似体バックボーンを含む、請求項30に記載の方法。
- 表面修飾剤化合物を製造するための方法であって、
(i)・二つ以上の異なるアミン保護基およびカルボキシレート基を有するリジンまたはリジン類似体化合物、
・医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基の前駆体、および
・医薬活性剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基の前駆体
を供給するステップ、
(ii)保護されたリジンまたはリジン類似体化合物上の第1アミンを脱保護するステップ、
(iii)第1または第2末端基前駆体を活性化するステップ、
(iv)活性化された末端基前駆体を脱保護されたアミン基と反応させるステップ、
(v)保護されたリジンまたはリジン類似体化合物上の第2アミンを脱保護するステップ、
(vi)他方の第1または第2末端基前駆体を活性化するステップ、および
(vii)前記他方の活性化された末端基前駆体を第2の脱保護されたアミン基と反応させて表面修飾剤化合物を得るステップ
を含む方法。 - 第2末端基がポリエチレングリコール(PEG)またはポリエチルオキサゾリンである、請求項34に記載の方法。
- 第2末端基が葉酸または葉酸誘導体の残基である、請求項34に記載の方法。
- 医薬活性剤がメトトレキサート;タキソール;ゼニカル;およびシクロスポリンからなる群より選択される、請求項34に記載の方法。
- 表面層、少なくとも一つのサブ表面層、ならびに
・医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、および
・医薬活性剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基
を含む少なくとも二つの末端基を含む、制御された末端基化学量論を持つ高分子と、
そのための薬学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)。 - 高分子が制御されたトポロジーをさらに示す、請求項38に記載の医薬組成物(この場合、トポロジーは、高分子の表面層またはサブ表面層へのその接続という観点から見た、ある末端基ともう一つの末端基との関係を表す)。
- 第2末端基がポリエチレングリコール(PEG)またはポリエチルオキサゾリンである、請求項38に記載の医薬組成物。
- 第2末端基が葉酸または葉酸誘導体の残基である、請求項38に記載の医薬組成物。
- 医薬活性剤がメトトレキサート;タキソール;ゼニカル;およびシクロスポリンからなる群より選択される、請求項38に記載の医薬組成物。
- 腫瘍の処置を必要としている患者における腫瘍を処置するための方法であって、その患者に、
表面層および少なくとも一つのサブ表面層、ならびに
・抗腫瘍医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、
・抗腫瘍医薬剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基、を含む、制御された末端基化学量論を持つ高分子と、
そのための薬学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤
とを含む医薬組成物の有効量を投与することを含む方法(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)。 - 抗腫瘍医薬活性剤がメトトレキサート;タキソール;シスプラチン;カルボプラチン;およびドキソルビシンからなる群より選択される、請求項43に記載の方法。
- 第2末端基がポリエチレングリコール(PEG)またはポリエチルオキサゾリンである、請求項43に記載の方法。
- 第2末端基が葉酸または葉酸誘導体の残基である、請求項43に記載の方法。
- 動物のリンパ系に医薬活性剤を標的送達するための方法であって、その動物に、
表面層、少なくとも一つのサブ表面層、ならびに
・医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、
・医薬活性高分子のリンパへの取り込みを容易にするために選択される第2末端基
を含む、制御された末端基化学量論を持つ高分子の有効量と、
そのための薬学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤
とを投与することを含む方法(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)。 - 第2末端基がポリエチレングリコール(PEG)またはポリエチルオキサゾリンである、請求項47に記載の方法。
- 第2末端基が約1000ダルトンより大きい平均分子量を持つPEGである、請求項48に記載の方法。
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