CN104524596A - 经修饰的大分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有受控的末端基团化学计量的大分子，所述大分子包括表面层、至少一个次表面层和至少2种末端基团，所述末端基团包括：其为药学活性剂的残基、其衍生物或为此的前体的第一种末端基团；和选择用于修饰所述药学活性剂和/或大分子的药代动力学的第二种末端基团，其中末端基团化学计量指所述末端基团的数目和类型。

Description

经修饰的大分子
本申请是申请号为200680053811.1的中国发明专利申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及其表面结构可以受到控制以生产富集比例的拓扑异构体的大分子、其生产及其用途，特别是树枝聚体(dendrimers，也称为“树型化合物”)。特别地，大分子可以具有2种或更多表面基团，其中至少一种表面基团是药学活性的。
发明背景
用于在药物制备中使用的新化合物的鉴定是寻找更可靠和有效的疗法的重要方面。然而，正如重要的是已知化合物的发展和修饰，减少与新药物候选物相关的危险以及显著减少使药物达到临床发展的开发和成本。
许多药物在临床试验中因为其物理性质(特别是溶解性)使得其难以配制，或由于紧在给药后发生的高药物浓度期间导致毒性效应的弱治疗指数而失败。其他缺点包括弱吸收、弱生物利用度、不稳定性、由于无法靶向药物的全身性副作用、以及在施用后无法控制其生物分布、代谢和肾或肝清除。类似地，市场上的某些当前产品可以就此类问题而言进行改善。
许多方法已设法改善药物化合物的特征，包括在脂质体、胶束或聚合胶束制剂中配制药物试剂，以及将药物试剂共价附着至亲水聚合物主链。
理想的特征改良剂的特性包括良好限定的结构，允许精确控制所述化合物的吸收、分布、代谢与排泄(ADME)特性(也称为药代动力学)和能够有利地携带多种化合物/试剂或构建体。所述化合物的毒性可以通过其从所述试剂或构建体中的受控释放得到改善，机体仅暴露于治疗血浆浓度的化合物。
近年来，已发现树枝状大分子在生物技术和药物应用中具有增加的应用。树枝状大分子是具有密集分支结构的特定种类的聚合物，其特征在于比普通聚合物更高浓度的官能团/单位分子体积。存在大分子的4个亚类：随机高分支的聚合物；树枝状接枝物(dendrigraft)聚合物；树枝状基序；和树枝聚体，其是基于每种树枝状结构中存在的结构控制的相对程度进行分类的。特别地树枝聚体的独特性质，例如其高分支程度、多价、球形结构和良好确定的分子量，使得其给予用于药物递送的新支架的希望。在过去十年中，关于生物相容性树枝聚体的设计和合成及其对生物科学的许多领域包括药物递送的应用的研究已增加。
树枝状聚合物作为药物递送载体和药学活性物的潜在效用近年来已受到越来越多的关注1，18。然而，尽管文献充满例如用于树枝聚体装配的合成方案、树枝聚体-药物相互作用和药物装载效率的描述、以及逐渐增加地树枝聚体与细胞系的相互作用的体外评估的报告2，3，但描述树枝聚体的基础药代动力学和代谢归宿的信息极少。
树枝聚体与肠组织的相互作用也已是几个研究的主题4-11，并且同时渗透性和细胞毒性与表面电荷和表面功能性的趋势已得到确定，相对少的研究已描述树枝聚体吸入体循环内后的命运。这些少量研究中，Gillies等人已检查了PEG化的‘蝶形(bow-tie)’聚酯树枝聚体的药代动力学，并显示树枝聚体清除机制高度依赖复合物的分子量和弹性，12Kobayashi等人已检查了结构改变对设计为促进重金属或抗体络合作用的树枝聚体的生物分布的影响(和因此在生物成像中的应用)13-17。然而，迄今为止聚赖氨酸树枝聚体的固有系统药代动力学在任何细节中仍未得到描述。
此外，制备这样的树枝聚体仍是挑战，所述树枝聚体在血液中循环足够长的时间以在靶位点上积聚，但仍可以以合理速率从体内清除以避免长期积累。此外，树枝聚体的组织定位仍难以事先预测，并需要更多的研究以确定外周树枝状基团对这些性质的影响。需要研究的另外领域是药物从树枝聚体中的释放。与密集的球形树枝状结构相关的空间阻碍使得可酶促切割的键的改造变得困难。
因此，本发明的目的是克服或至少减轻与现有技术相关的一个或多个困难和/或缺陷。
发明概述
在第一个方面，本发明提供了具有受控的末端基团化学计量的大分子，所述大分子包括表面层、至少一个次表面层和至少2种末端基团，所述末端基团包括：
其为药学活性剂的残基、其衍生物或为此的前体的第一种末端基团；和
选择用于修饰药学活性剂和/或大分子的药代动力学的第二种末端基团，
其中末端基团化学计量指末端基团的数目和类型。
在一个进一步的实施方案中，所述大分子进一步显示出受控的拓扑学，其中拓扑学描述了一种末端基团和另一种之间就其与大分子的表面或次表面层的连接而言的关系。
在一个优选实施方案中，第二种末端基团可以包括聚乙二醇(PEG)或聚乙基噁唑啉(例如PEOX)。
在一个进一步的实施方案中，第二种末端基团选自下述中的一种或多种：修饰药学活性剂和/或大分子的血浆半衰期的部分；促进药学活性剂和/或大分子靶向一种或多种细胞或组织类型的部分；和促进药学活性剂和/或大分子摄入一种或多种细胞或组织类型内的部分。
在一个优选实施方案中，第二种末端基团选择用于延长药学活性剂和/或大分子的血浆半衰期。
大分子优选是树枝聚体，更优选地赖氨酸树枝聚体。
如下所述，根据本发明的这个方面的大分子可以在各种应用中使用，其中控制末端基团化学计量和/或拓扑学的能力在提供关于药学活性剂的一致药代动力学特征方面是有利的。
发明详述
如本说明书和权利要求中此处所使用的，除非上下文另有明确指示，单数形式“一个”、“一种”、“该”和“所述”包括复数的所指对象。因此，例如提及“大分子”包括一种或多种此类大分子。
如本说明书和权利要求中此处所使用的，术语“包含”(或其语法变体)等价于术语“包括”，并且不应视为排除其他元素或特征的存在。
如本说明书和权利要求中此处所使用的，术语“拓扑学”意指一种末端基团和另一种之间就其与表面或次表面层的连接而言的关系。
如本说明书和权利要求中此处所使用的，术语“拓扑异构体”意指具有特定拓扑学的大分子。
如本说明书和权利要求中此处所使用的，术语“表面”意指具有可与“末端基团”或“封端”基团反应的表面胺的代构建单位的层。
如本说明书和权利要求中此处所使用的，术语“次表面”意指表面层下方的一层或多层。
如本说明书和权利要求中此处所使用的，术语“表面胺”意指树枝聚体的任何表面可反应的胺基。
如本说明书和权利要求中此处所使用的，术语“末端基团化学计量”意指在大分子表面上的末端基团的组成(数目和类型)。
如本说明书和权利要求中此处所使用的，术语“代构建单位”意指形成树枝聚体的构架的重复单位，例如在赖氨酸树枝聚体的情况下是赖氨酸或赖氨酸类似物。
如本说明书和权利要求中此处所使用的，术语“树枝状基序”意指大分子的不连续区段。当大分子分支之一在这样的键上进行切割时，所述键使代构建单位或核的可反应胺之一与附着的代构建单位的羧基连接，树枝状基序将被释放。树枝状基序的羧基表示独特的点或顶点，在合成本发明的大分子的过程中树枝状基序将在其上附着至增长性大分子核。
任何大分子可以适合于在本发明中使用。大分子可以选自一种或多种树枝状聚合物，包括树枝醇(arborols)、树枝状接枝物、PAMAM树枝聚体、赖氨酸树枝聚体等。
树枝聚体聚合物的制备是众所周知的，并且例如在美国专利号4,289,872和4,410,688(描述基于赖氨酸单位的层的树枝聚体聚合物)，以及美国专利号4,507,466、4,558,120、4,568,737和4,587,329(描述基于其他单位包括聚酰胺胺或PAMAM树枝聚体聚合物的树枝聚体聚合物)中得到描述。这些美国专利中公开的树枝聚体聚合物描述为适合于下述用途：例如表面改良剂、金属螯合剂、反乳化剂或油/水乳状液、在纸制备中的湿强度剂、和在水制剂例如涂剂中用于改变粘性的试剂。在美国专利号4,289,872和4,410,688中还提出基于赖氨酸单位的树枝聚体聚合物可以用作基质用于制备药物剂量。
本发明现在将针对树枝聚体，特别是基于聚赖氨酸的那些更详细地进行描述。
树枝聚体在任何给定应用中的效力的一个关键决定因素是大分子表面的性质。申请人已意外地开发了通过使其在良好确定和控制的过程中与树枝聚体缀合来修饰某些药物化合物的吸收、分布、代谢与排泄(ADME)特征的技术。更具体而言，树枝聚体大小和/或表面功能性可以进行修饰，以调整药物的排泄(清除)、分布和代谢(吸收和重吸收)特征。本发明的过程可以允许生产精确结构，其可以进行改变以满足药物的特殊需要。此外，存在以受控方式使多种分子与树枝聚体附着的能力，允许更高的药物装载和更通用的疗法。药物装载可以通过改变树枝聚体的代数进行进一步修饰。
先前研究已暗示在静脉内施用后，未封端的3H标记的聚L-赖氨酸树枝聚体进行快速代谢以释放赖氨酸。然而，已惊讶地确定树枝聚体的PEG化减少树枝聚体被蛋白水解酶以及血清蛋白质识别并抑制吞噬性细胞清除，由此延长血浆循环时间。此外，PEG化可以增加树枝聚体的流体力学体积，从而减少肾清除率。
例如，本发明人已发现3H标记的PEG化的赖氨酸树枝聚体的血浆半衰期和尿清除程度依赖分子量。与更小的树枝聚体(即<20kD)比较，更大的PEG化的树枝聚体(即>30kD)从血浆中相对缓慢地清除到尿内。这与下述事实无关：更小的树枝聚体复合物显示与血浆组分相互作用的迹象，导致产生更高分子量的种类。这些复合物的清除是快速的并且只有完整的树枝聚体在尿中进行回收。此外，本发明人已观察到当药学活性组分和PEG基团附着至树枝聚体的表面时，附着至树枝聚体表面的PEG基团的大小可以决定树枝聚体是否能够避免被网状内皮系统摄取。因此显而易见的是通过任何方式增加大小不一定导致树枝聚体延长的血浆寿命。较大的树枝聚体发现在肝和脾中积聚。然而，这经过延长的时间段发生并且积聚的量小于10％的剂量。
在一个进一步优选的实施方案中，PEG或聚乙基噁唑啉末端基团可以构成树枝聚体上约25％－75％的末端基团，更优选地约25％－50％。可以增加单个PEG或聚乙基噁唑啉基团的相对大小，以维持所需血浆寿命和避免肝摄取。PEG或聚乙基噁唑啉基团的百分比和/或PEG或聚乙基噁唑啉基团的大小可以进行修改和修剪，以适合不同的药学活性剂。
在一个优选实施方案中，PEG基团是相对单分散的，并选自200－10,000道尔顿的分子量范围，更优选地PEG基团选自500－5,000道尔顿的分子量范围。
PEG化还可以改善化合物的溶解性，并因此可以帮助与树枝聚体表面缀合的以其他方式不能溶解的药物的溶解。
本发明因此提供了通过其具有高毒性或弱溶解性或两者的药物可以进行改造的方法，以提供这样的媒介物，所述媒介物将提供药物的受控释放以维持在治疗而不是有毒的血浆水平上的长期药物浓度。
携带2种不同末端基团的树枝聚体可以制备为不同拓扑异构体，其中拓扑学描述了一种末端基团和另一种之间就其与大分子的表面和次表面层的连接而言的关系。携带2种或更多不同的末端基团的树枝聚体在AU 2005905908中得到描述，所述专利的完整公开内容通过引用方式合并。其中每种拓扑异构体与复合物系统相互作用的方式可以是不同的。因此，能够针对不同应用控制不同末端基团的表面分布可能是有利的。
在相同拓扑学的分子中富集树枝状大分子样品的能力可能是希望的，同样地其已显示的是在特定立体异构体中富集有机材料是希望的，特别是用于生物学应用。因此大分子中的一种拓扑异构体可能在给定应用中比另一种拓扑异构体更有效。
用于生产具有2种或更多不同的末端基团的树枝聚体的现有技术方法涉及使用随机表面官能化法的合成。
在第一种现有技术方法中，第一种活性末端基团的亚化学计量的量尝试用于对在大分子表面上的仅一半活性末端胺部分(表面胺)封端。其余的表面胺随后可以进行反应，并且在这个二次反应中，过量的第二种活性末端基团可以用于迫使反应完成。在这个方法中，存在产生于反应第一个阶段的具有不同末端基团化学计量的产物的统计分布，和此外对2种不同末端基团的拓扑学存在很少的控制或无控制。
类似地，在第二种现有技术方法，2种末端基团可以同时与反应表面胺部分反应。在此类方法中，可能可以调整每个末端基团的化学计量以补偿其不同的反应性，但分子与分子变异性仍将出现，因为超过一种类型的代构建单位或超过一种的末端基团可用于与脱保护的氮基反应，且因此每次反应的可能结果仅可能通过统计分布得到描述，而且再次不存在对反应的拓扑学结果的控制。
与现有技术的随机表面官能化比较，如果具有精确指定的末端基团的树枝状部分的丰度分数比其在随机表面官能化的材料中的丰度分数大至少2倍(2倍单分散性)和优选地4倍(4倍单分散性)，那么大分子视为“富集的”。已针对末端基团举例说明的富集概念也可以应用于表面偶联体、四集体和八隅体等，这在AU2005905908中得到详细描述，所述专利的完整内容通过引用方式而合并入本文。大分子可以就特定末端基团化学计量和/或拓扑学进行富集。
在末端基团化学计量的富集的极端水平上，每个大分子将具有相同组成(数目和类型)的末端基团。在富集的较中等水平上，例如在20％时的富集，这视为意指20％的大分子将具有相同组成(数目和类型)的末端基团。
备选地，这种富集可以通过使组成与随机官能化的大分子组成比较进行指定。例如，如果随机法提供了在5％的大分子中的特定表面组成，那么富集将构成具有特定末端基团组成(数目和类型)的大分子中超过这个5％水平的增加。因此，2倍富集将意指10％的大分子显示出特定的末端基团组成。
最简单类型的拓扑学富集是在偶联体水平上的富集。树枝聚体组成可以在末端基团的水平上完全富集，但在偶联体水平上无法完全富集。这是因为相同的末端基团可以以许多方式聚合成偶联体。例如在所有图9.1到9.5中，树枝聚体包含16个末端A基团和16个末端B基团。然而，在图9.1到9.4中，存在8个(AA)偶联体和8个(BB)偶联体，而在图9.5中，存在16个(AB)偶联体。更高级别的拓扑学富集是在四集体、八隅体和16聚体(16-tet)水平上的富集，并且在AU2005905908中得到详细解释。
在另一个方面，提供了包括至少一个赖氨酸或赖氨酸类似物树枝状基序具有表面层和至少一个次表面层的大分子，所述大分子包括至少2种末端基团，其包括：
其为药学活性剂的残基、其衍生物或为此的前体的第一种末端基团；和
选择用于修饰所述药学活性剂和/或大分子的药代动力学的第二种末端基团，
其中末端基团化学计量指末端基团的数目和类型。
在本发明的这个方面的一个进一步的实施方案中，大分子进一步显示出受控的拓扑学，其中拓扑学描述了一种末端基团和另一种之间就其与大分子的表面或次表面层的连接而言的关系。
在一个优选实施方案中，第二种末端基团可以包括聚乙二醇(PEG)或聚乙基噁唑啉(例如PEOX)基序。
在一个进一步的实施方案中，第二种末端基团选择用于修饰药学活性剂的血浆半衰期。在一个优选实施方案中，第二种末端基团选择用于延长药学活性剂的半衰期。
在一个进一步的实施方案中，第二种末端基团选择用于促进药学活性剂靶向和/或摄入一种或多种细胞或组织类型。
在本发明的另一个方面，提供了具有受控的封端基团化学计量且具有下式的树枝聚体：
核[重复单位]m[表面构建单位]n[封端基团1]p[封端基团2]q
其中：
核选自赖氨酸或其衍生物、二胺化合物、三胺化合物或四胺化合物；
重复单位选自酰胺胺、赖氨酸或赖氨酸类似物；
表面构建单位可以与构建单位的那种相同或不同，并选自酰胺胺、赖氨酸或赖氨酸类似物；
封端基团1是药学活性剂、其衍生物或为此的前体或其残基；
封端基团2选择用于修饰药学活性剂的药代动力学；
m表示树枝聚体的一个或多个次表面层的重复单位的总和并且是1－32的整数；
n表示树枝聚体的一个或多个表面层的表面构建单位的数目并且是2－32的整数；
p表示封端基团1基团的数目并且是1－64的整数；和
q表示封端基团2基团的数目并且是1－64的整数；
其中封端基团化学计量指封端基团的数目和类型。
树枝聚体聚合物的核可以选自任何合适的化合物。优选地，核选自赖氨酸或其衍生物、二胺化合物、三胺化合物或四胺化合物。最优选地，核是二苯甲基氨基-赖氨酸(BHALys)，或选自下述的化合物：
其中a、b和c各是0－5的整数，更优选地1－3。
根据本发明的这个实施方案的重复单位可以优选地选自下述中的一种或多种
其中a是0或1，优选地1。
在本发明的一个优选方面，树枝聚体具有赖氨酸或赖氨酸类似物核。赖氨酸树枝状核可以选自BHALys、DAH、EDA和TETA，如下文表示的：
树枝聚体可以是PAMAM聚合物例如PAMAM32，赖氨酸或赖氨酸类似物聚合物，其中重复单位是[Lys]Q或[Su(NPN)2]Q，其中Q在二价核上是2、6、14、30或62的整数或在三价核上是3、9、21或45的整数。
根据本发明的树枝聚体可以通过和需要的一样多的代延伸。优选地，树枝聚体通过1－5，更优选地1－3代延伸
根据本发明的大分子(特别地树枝聚体)的药学活性剂可以包括水不溶性药物、水溶性药物、亲脂药物、或其混合物。
药学活性剂可以由但不限于选自表1中的基团中的一种或多种进行例示。
表1
本发明特别适合于这样的药物，其即使以极小量也非常活跃及其持续的长期施用是寻找的，特别用于克服伴随标准剂量的毒性问题。非限制性例子包括氨甲蝶呤、抗代谢物、泰素、抗有丝分裂物、zenical、肥胖疗法、环孢菌素、免疫抑制剂和消炎痛、抗炎治疗。
在一个实施方案中，根据本发明的大分子包括2种或更多不同的药学活性剂、其衍生物、为此的前体、或其残基作为末端基团。
在一个进一步的方面，本发明提供了具有受控的末端基团化学计量并包括下述的树枝聚体：
其为不同的药学活性剂的残基、其衍生物或为此的前体的至少2种末端基团；和
选择用于修饰药学活性剂和/或大分子的药代动力学的进一步的末端基团，
其中末端基团化学计量指末端基团的数目和类型。
根据本发明的这个方面的树枝聚体可以具有在组合疗法中的应用。
药学活性剂可以是表1中例示的任何2种或更多类别的组合。示例性组合包括，但不限于，下述组合：化学疗法药物；消炎药和抗关节炎药；肥胖疗法和糖尿病疗法；生长激素和生长促进剂；肌肉松弛药和消炎药；呼吸药物和支气管扩张药或抗微生物剂；化学疗法和维生素等。更具体的组合在实施例中进行描述。
根据本发明的大分子，特别是树枝聚体可以在促进药物被动靶向实体瘤和炎症位点方面特别有用。这种靶向是可能的，由于与肿瘤和炎症相关的针对大分子的增加的脉管系统渗透性，和由于有限的淋巴引流。
根据本发明的大分子还可以使用树枝聚体上存在的靶向部分来靶向特定的细胞类型或组织类型。
因此，在本发明的一个进一步的方面，提供了具有受控的末端基团化学计量并包括下述的树枝聚体：
其为药学活性剂的残基、其衍生物或为此的前体的第一种末端基团；和
其为用于使药学活性剂和/或大分子靶向一种或多种特定细胞或组织类型的靶向部分的第二种末端基团，
其中末端基团化学计量指末端基团的数目和类型。
合适的靶向部分的例子包括凝集素、抗体和抗体的功能片段。靶向部分还可以包括关于细胞表面受体的配体。
许多不同的细胞表面受体可用作用于大分子的结合和/或摄取的靶。特别地，在本发明中有用的受体及其相关配体包括但不限于，叶酸盐受体、肾上腺素受体、生长激素受体、黄体生成素受体、雌激素受体、表皮生长因子受体、成纤维细胞生长因子受体(例如FGR2)、IL-2受体、CFTR和血管上皮生长因子受体。
在本发明的一个进一步的方面，提供了具有受控的末端基团化学计量的大分子，所述大分子包括表面层、至少一个次表面层和至少2种末端基团，所述末端基团包括：
其为药学活性剂的残基、其衍生物或为此的前体的第一种末端基团；和
能够充当细胞受体配体的第二种末端基团，
其中末端基团化学计量指末端基团的数目和类型。
在本发明的一个进一步的方面，提供了具有受控的末端基团化学计量的大分子，所述大分子包括表面层、至少一个次表面层和至少2种末端基团，所述末端基团包括：
其为药学活性剂的残基、其衍生物或为此的前体的第一种末端基团；和
能够充当细胞受体的第二种末端基团，
其中末端基团化学计量指末端基团的数目和类型。
叶酸盐是核苷酸碱基的生物合成所需的维生素，并因此在增殖细胞中需要很高的量。在癌细胞中，叶酸的这种增加的需要通常在过量表达的叶酸盐受体中反映，所述叶酸盐受体负责将叶酸盐转运通过细胞膜。与之对比，叶酸盐摄入正常细胞内由还原型叶酸盐载体而不是叶酸盐受体促进。叶酸盐受体在许多人癌症中是上调的，包括卵巢、脑、肾、乳腺、髓样细胞和肺的恶性肿瘤中，并且细胞表面上的叶酸盐受体的密度看起来随着癌症发展而增加。
叶酸盐受体对肿瘤细胞，和特别地对晚期肿瘤细胞的相对特异性，意指叶酸盐受体配体——叶酸盐可以是用于使化学治疗药靶向肿瘤的有用候选物。特异性是叶酸盐受体与叶酸盐受体配体-化学治疗药缀合物的相互作用的特异性，其通过某些非转化的和恶性转化的上皮细胞之间叶酸盐受体的细胞表面表达模式中的差异得到进一步增强。在非转化的细胞中，叶酸盐受体在细胞的顶端膜表面上优先表达，其面对体腔并且难以接近血液中存在的反应物。然而，在转化后，细胞失去其极性和受体变得可接近循环系统中靶向叶酸盐受体的药物。因此，叶酸盐或叶酸盐衍生物可以是本发明的大分子的有用的靶向部分。
在本发明的进一步方面，提供了具有受控的末端基团化学计量的大分子，所述大分子具有2种或更多不同的末端基团，所述末端基团包括：
其为药学活性剂的残基、其衍生物或为此的前体的第一种末端基团；和
其为叶酸盐的残基或叶酸盐类似物的第二种末端基团，
其中末端基团化学计量指末端基团的数目和类型。
在本发明的这个方面的一个优选实施方案中，药学活性剂是抗肿瘤药物试剂。可以使用细胞毒性剂、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂等，或其任何组合。
在一个优选实施方案中，药学活性剂选自氨甲蝶呤、泰素、顺铂、卡铂、和多柔比星中的一种或多种。
连接体部分可以掺入根据本发明的树枝聚体的合成内，例如通过替换代构建单位或介导末端基团附着至代构建单位。
因此，在本发明的一个进一步的方面，提供了具有受控的末端基团化学计量的大分子，优选地树枝聚体，所述大分子具有2种或更多不同的末端基团，所述末端基团包括：
一种或多种连接体部分；
其为药学活性剂的残基、其衍生物或为此的前体的第一种末端基团；和
选择用于修饰药学活性剂和/或大分子的药代动力学的第二种末端基团；
其中第一种和/或第二种末端基团通过连接体部分附着至大分子构架；和
其中末端基团化学计量指末端基团的数目和类型。
在一个进一步的实施方案中，第二种末端基团选自促进药学活性剂和/或大分子靶向一种或多种细胞或组织类型的部分，和促进药学活性剂和/或大分子摄入一种或多种细胞或组织类型内的部分，和一种或多种连接体部分包括PEG。
连接体可以是可切割的或不可切割的，依赖于附着至表面的基团的需要。可切割的连接体可以设计为酶促切割的，并且可以例如用于靶向表达那些酶的组织的树枝聚体。备选地，对酸敏感的连接体可以是优选的，从而使得与之附着的化合物在酸条件下被释放，例如在含氧量低的组织中。
各种连接体的概述
连接体部分可以选自下述中的一种或多种：
酰胺连接体(19-21):
酰胺键的性质在确定游离药物是否将从缀合物中释放方面是重要的。例如，药物(即多柔比星)经由酰胺键与载体的缀合产生水解稳定并且在体外不发挥任何抗癌效应的缀合物。经由酰胺键直接与载体结合的药物也将不能作为游离药物，而是作为药物-氨基酸容易地切割，如果载体其自身是可降解的。游离药物从经由直接的酰胺连接体结合的载体中的释放将仅在罕见情况下可达到，其中药物其自身是肽样分子并且药物和载体之间的键是可酶促切割的。
腙、肟和亚胺连接体(21-25):
腙、肟和亚胺键不需要酶的存在以允许药物与载体的切割。它们在低pH环境中能够在C＝N键上进行水解切割，所述低pH环境例如肿瘤血管外空间或溶酶体内。常用的腙、肟和亚胺连接体分别产生于连接体的肼、烷氧基胺或胺部分与药学活性部分的羰基(酮或醛)的反应。连接体还可以进行修饰以减慢水解速率，通过修饰C＝N键部分周围的烷基的数目，或通过用吸电子(以增加酸不稳定性)或供电子(以减少酸不稳定性)部分置换。
酯连接体(19，26):
可以制备对酸敏感和可代谢的酯连接体。原酸酯已用于使PEG与结合阴离子膜载体的脂质缀合。缀合物在酸性条件下(pH 4－6)的稳定性依赖酯或原酸酯连接体的结构。一般而言，α-甲氧基-ω-{N-(2-十八烷氧基-[1,3]二氧戊环-4-基)甲基酰胺基}-聚乙二醇110显示在pH 4和5下良好的稳定性，α-甲氧基-ω-{N-(2-胆甾醇氧基-[1,3]二氧戊环-4-基)甲基酰胺基}-聚乙二醇110在pH 5下非常稳定但在pH4下适度地较不稳定，α-甲氧基-ω-{N-(2-甲基-s-十八烷氧基-[1,3]二氧戊环-5-基)酰胺基}-聚乙二醇110和α-甲氧基-ω-{N-2-(3-羟丙基-胆甾醇氨基甲酸酯)-2-甲基-[1,3]二氧戊环-5-基-酰胺基}-聚乙二醇110都不稳定。在简单酯与小分子缀合的方面，与比二硫化物更稳定但不如酰胺键稳定的单酯比较，二酯官能化提供了用于代谢切割的更多位点。
肽连接体(27-33):
肽连接体是迄今为止所有可切割连接体中最通用的，因为许多不同的氨基酸组合可以用于控制切割的速率和切割酶。然而，这些连接体具有与其作为用于药物和载体的缀合物的用途相关的2个问题，1)它们一般可通过遍及机体的非特异性肽酶切割，并且因此可能导致在非肿瘤分布位点上的非特异性药物毒性，和2)切割可以在连接体内的位点上发生，这导致保持与药物分子结合的氨基酸。这可能阻碍药物分子的化学治疗效应。备选地，结合的氨基酸可能不改变药物的药理学效应但可能影响其药代动力学。然而，这些切割效应可以通过选择肽连接体中合适的氨基酸得到控制，所述氨基酸直接与药物分子结合，例如，脯氨酸。
一般地，组织蛋白酶B可切割的连接体已设计为在药物缀合物经由溶酶体系统的胞吞作用后进行切割，因为组织蛋白酶位于溶酶体中并且不释放在细胞溶质中。胞吞作用一般在载体(这通常是针对癌症特异性细胞表面受体的抗体或针对癌症特异性细胞表面受体的配体)与细胞膜结合后起始。
非特异性蛋白酶(即对特定肽序列非特异性的蛋白酶)在其在肿瘤组织中已经历足够的外渗和积聚后可以从PEG化的树枝聚体切割药物。
应用关于肽切割的速率的下述指导方针，其中a>b指示a的切割速率大于关于b的切割速率。对于用作活性药物和树枝聚体末端氮之间的连接体的肽序列：末端CG>无末端CG>末端G＝末端GFG>末端GGG和末端GGGF＝末端GPG。
注：CG键由GSH还原。GGG键相对于其他肽键一般是非常稳定的。二肽的切割一般对特定蛋白酶特异，并可以基于肿瘤细胞内包含的各种蛋白酶的表达加以控制。
戊二醛(34，35):
戊二醛一般不用作常规连接体，而用作稳定剂特别是在凝胶制剂中，或使药物与所需吸收表面共价附着。它还用作不可代谢的间隔物，经由交联反应在药物分子和大载体之间产生间隙。
PEG-肽(2，36):
PEG-肽以与常规肽类似的方式使用，除了PEG部分提供了对于载体另外的体内稳定性和质量。一般地，它用于使药物与抗体载体缀合并具有下述优点：增加Ab和药物之间的距离同时暴露酶促切割的位点、减少缀合物的免疫原性、增加血液循环时间和增加复合物的溶解性。缀合物的内在化和活性药物(它不一定作为游离药物释放)的酶促释放后，已针对阿霉素和多卡米星衍生物观察到抗增殖效应。
二硫化物连接体(1，37，38):
二硫化物连接体是目前使用的最不稳定的连接体并在体外经历快速的还原切割。然而，它们的体内稳定性一般高于其体外稳定性。它们可以经由含硫氨基酸之间的二硫键或在基于非肽的二硫键上形成。它们还显示在体内与其他亲核硫醇更大的反应性并因此显示快速的血浆清除。
连接体可切割性的一般概述
在循环中，连接体可切割性的顺序如下：
二硫化物>长链肽≥酯>腙≥四肽(GGGF)＝三肽(GFG>GGG＝GPG)≈或>二肽(AV，AP，GP，FL，V-Cit)>戊二醛＝酰胺。
连接体建议
各种连接体的稳定性基于其与之缀合的基团(即酶与连接体的可接近性)、缀合物在所需活性位点上的行为(即细胞摄取或细胞外积聚)和缀合物的性质(即酯对酰胺)。预期二硫化物缀合物与目前系统的体内行为是相对无法预测的。尽管长链肽更容易由蛋白酶接近用于快速切割，但它们可能太快速地和在非特定位点上进行切割，导致可能不是生物学活性的药物活性肽/氨基酸种类的释放。
基于C＝N的连接体(腙、肟或亚胺)、酯或肽缀合物的切割将经过至少数天发生，这允许缀合物在肿瘤组织中积聚。各自具有其优点，但酯或腙连接体可能是优选的。使药学活性物与树枝聚体连接的酯键提供了快速切割的键，并且尽管这对于靶位点可能不是特异性的，但切割导致游离药学活性物的释放。腙键产生的缀合物在一般循环中比酯更稳定，并且经由在C＝N键上的水解在肿瘤位点上以更大的特异性进行切割。然而，药物活性分子可能需要进行修饰以允许通过掺入羰基或肼部分来形成腙。
在一个优选实施方案中，连接体部分可能包括2种反应官能团——F和Y，它们通过一个或多个碳或杂原子，优选地通过烃主链进行连接。官能团F可以进行激活，以与反应胺部分如树枝聚体的表面上的那些反应。一般地官能团F是羧化物基团或其残基。另一种官能团Y是包含保护基团的胺，或它这样进行选择使得它具有与所需有机基的反应基团互补的特定反应性，所述所需有机基附着至树枝状基序的表面。Y的一般例子包括胺、羟基、巯基、烯基或炔基、腈、卤化物、羧化物或叠氮基。
当连接体部分用于使末端基团与树枝聚体的表面胺基连接时，连接体和有机基之间的反应可以在连接体部分与树枝状基序的表面胺反应之前或之后进行。进行用于向树枝状基序引入一个或多个连接体部分的反应，以确保树枝聚体的所有脱保护的表面胺与连接体部分的完全反应。一般地这通过使用过量的所选择的连接体部分来完成。
除了上文描述的连接体外，本发明可以使用光可切割的连接体。例如，可以使用异双功能的、光可切割的连接体。异双功能的、光可切割的连接体可以是水或有机可溶的。它们包含可以与胺或醇反应的活化酯和可以与巯基反应的环氧化物。在酯和环氧化物基团之间的是3,4-二甲氧基-6-硝基苯基光异构化基团，当暴露于近紫外线(365nm)时，其释放完整形式的胺或醇。因此，当使用此类连接体与树枝聚体连接时，药学活性组分可以通过使靶区域暴露于近紫外线以生物学活性或可激活形式释放。
例如，泰素的醇基可以与有机可溶性的连接体活化酯反应。这种产物依次与树枝聚体的部分硫醇化的表面反应。在顺铂的情况下，药物的氨基可以与连接体的水溶性形式反应。如果氨基不具有所需反应性，那么可以使用顺铂的含伯氨的活性类似物，例如Pt(II)磺胺嘧啶二氯化物。因此缀合时，该药物是无活性的并因此不损害正常细胞。当缀合物在肿瘤细胞内定位时，它暴露于适当的近UV波长的激光，引起药学活性物释放到细胞内。
在本发明的一个进一步的方面，提供了包括具有受控的末端基团化学计量的大分子的药物组合物，所述大分子具有表面层、至少一个次表面层和至少2种或更多不同的末端基团并包括
其为药学活性剂的残基；其衍生物或为此的前体的第一种末端基团；
选择用于修饰药学活性剂和/或大分子的药代动力学的第二种末端基团；和
为此的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
大分子组分可以是树枝聚体，优选地赖氨酸树枝聚体。
药学活性剂可以选自上文描述的一种或多种类别的药学活性剂。优选地药学活性剂是癌症疗法或相关药物，包括抗有丝分裂物或抗代谢物试剂；肥胖疗法试剂；消炎药；或免疫抑制剂。
第二种末端基团可以选择用于延长药学活性剂的血浆半衰期。在一个进一步的实施方案中，第二种末端基团选择用于促进药学活性剂靶向和/或摄入一种或多种细胞或组织类型。
第二种末端基团可以包括聚乙二醇(PEG)或聚乙基噁唑啉(例如PEOX)基序。
在本发明的一个进一步的方面，提供了包括具有受控的末端基团化学计量的大分子的药物组合物，所述大分子具有表面层、至少一个次表面层和至少2种或更多不同的末端基团，所述末端基团包括：
其为药学活性剂的残基；其衍生物或为此的前体的第一种末端基团；
其为叶酸盐的残基或叶酸盐类似物的第二种末端基团；和
为此的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，
其中末端基团化学计量指末端基团的数目和类型。
在本发明的这个方面的一个优选实施方案中，药学活性剂是抗肿瘤药物试剂。可以使用细胞毒性剂、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂等，或其任何组合。
抗肿瘤药物试剂可以选自下述中的一种或多种：利妥昔单抗(rituximab)、奥沙利铂(oxaliplatin)、多西他赛(docetaxel)、吉西他滨(gemcitabine)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、依立替康(irinotecan)、紫杉醇(pactitaxel)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、卡铂(carboplatin)、西妥昔单抗(cetuximab)、多柔比星(doxorubicin)、培美曲塞(pemetrexed)、表柔比星(epirubicin)、硼替佐米(bortezomib)、托泊替康(topotecan)、阿扎胞苷(azacitidine)、长春瑞滨(vinorelbine)、米托蒽醌(mitoxantrone)、氟达拉滨(fludarabine)、多柔比星(doxorubicin)、阿仑珠单抗(alemtuzumab)、卡莫司汀(carmustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、依达比星(idarubicin)、丝裂霉素(mitomycin)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、顺铂(cisplatin)、氨甲蝶呤(methotrexate)、美法仑(meiphalan)、砒霜(arsenic)、地尼白介素(denileukindiftitox)、阿糖胞苷(cytarabine)、左亚叶酸钙(calciumlevofolinate)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、依托泊苷(etoposide)、槲寄生(viscum album)、美司钠(mesna)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、奥佐米星(ozogamicin)、白消安(busulfan)、喷司他丁(pentostatin)、克拉屈滨(cladribine)、博来霉素(bleomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、苯达莫司汀(bendamustine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、雷替曲塞(raltitrexed)、长春新碱(vincristine)、福莫司汀(fotemustine)、磷酸依托泊苷(etoposide phosphate)、卟吩姆钠(porfimer sodium)和长春碱(vinbiastine)。
在一个优选实施方案中，药学活性剂选自氨甲蝶呤、泰素、顺铂、卡铂、和多柔比星中的一种或多种。
药学上可接受的载体或赋形剂可以选自任何已知的载体或赋形剂，依赖选择用于活性物的递送途径。
药物组合物可以配制用于口部、注射、直肠、肠胃外、皮下、静脉内、肌内或其他递送。药物组合物可以配制在片剂、胶囊、囊片(caplet)、可注射的安瓿瓶、或即用型溶液、冻干的材料、栓剂、大丸剂或植入物形式中。
此类组合物的配制是本领域技术人员众所周知的。合适的药学上可接受的载体和/或稀释剂包括任何和所有常规溶剂、分散介质、填充剂、固体载体、水溶液、涂层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。用于药学活性物质的此类介质和试剂的使用是本领域众所周知的，并且例如在Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Company，Pennsylvania，USA中得到描述。除非任何常规介质或试剂与本文描述的树枝聚体聚合物的末端基团不相容，考虑其在本发明的药物组合物中的使用。补充性活性成分也可以掺入组合物内。
为了容易施用和剂量的一致性以剂量单位形式配制组合物是特别有利的。如本文所使用的，“剂量单位形式”指适合作为用于待治疗的人患者的单元剂量的物理不连续单位；每个单位包含为产生与所需药学载体和/或稀释剂结合的所需疗效而计算的预定量的活性成分。关于本发明的新型剂量单位形式的规格由下述指示并直接依赖下述：(a)活性成分的独特性质和待达到的特定疗效，和(b)在配药法中固有的限制例如用于特定治疗的活性成分。
在本发明的另外一个方面，提供了如上文描述的有效量的大分子在人或非人动物患者的预防或治疗性疗法中，或在用于治疗人或非人的动物患者的药物制备中的用途。
在本发明的另外一个进一步的方面，提供了用于治疗哺乳动物包括人患者中的疾病指标或生理学缺陷的方法，所述方法包括给有此疗法需要的患者施用预防或治疗有效量的如上所述的药物组合物。
各种施用途径是可用的。当然，选择的具体方式将依赖于待治疗的具体病状和对于疗效所需的剂量。一般而言，本发明的方法可以使用医学上可接受的任何施用方式来实践，意指产生本发明的活性组分的治疗水平而不引起临床上不可接受的副作用的任何方式。此类施用方式包括口部、直肠、局部、鼻、吸入、经皮或肠胃外(例如皮下、肌内和静脉内)、眼内和玻璃体内(即进入眼的玻璃质内)途径。用于口部施用的制剂包括不连续的单位例如胶囊、片剂、锭剂等。其他途径包括直接鞘内施用到脊髓液内、例如通过本领域普通技术人员众所周知的各种导管和气囊血管成形术装置直接引入，和实质内注射到靶区域内。
组合物可以方便地以单位剂型呈现，并且可以通过药学领域众所周知的任何方法进行制备。此类方法包括使活性化合物与载体结合的步骤，所述载体构成一种或多种助剂。一般而言，组合物通过下述制备：使活性化合物与液体载体、细碎的固体载体或两者均匀和密切地结合，和随后必要时使产物成形。
适合于口部施用的本发明的组合物可以作为不连续的单位呈现，例如在脂质体中各自包含预定量的大分子的胶囊、扁囊剂、片剂或锭剂，或作为在水溶液或非水液体中的悬浮液呈现，例如糖浆剂、酏剂或乳状液。
适合于肠胃外施用的组合物方便地包含活性组分的无菌含水制剂，其优选与接受者的血液等渗。这种含水制剂可以根据已知方法使用那些合适的扩散或湿润剂和悬浮剂进行配制。无菌可注射的制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如作为在聚乙二醇中的溶液。在可以使用的可接受的媒介物和溶剂中是水、和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的、不挥发性油方便地用作溶剂或悬浮介质。为了这个目的，可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单或二酯。此外，脂肪酸例如油酸可用于注射剂的制备。
本发明的大分子还可以配制用于在设计为鼻内或通过吸入施用树枝聚体聚合物的系统中递送，例如作为包含活性组分的精细分散的气雾喷雾器。
其他递送系统可以包括持续释放递送系统。优选的持续释放递送系统是可以提供本发明的大分子在持续释放的小丸剂或胶囊中的释放的那些递送系统。许多类型的持续释放递送系统是可用的。这些包括但不限于：(a)其中活性组分包含在基质内的侵蚀系统，和(b)其中活性组分以受控速率渗透通过聚合物的扩散系统。此外，可以使用基于泵的金属制品递送系统，其中某些适合于移植。
本发明的大分子以预防或治疗有效量进行施用。预防或治疗有效量意指至少部分达到需要的效应、或延迟发作、抑制进展、或完全停止待治疗的具体病状的发作或进展所需的量。当然，此类量将依赖待治疗的具体病状、病状的严重度和个体患者参数，包括年龄、身体健康状况、大小、重量和同时的治疗。这些因素是本领域普通技术人员众所周知的并且可以使用仅仅常规实验而解决。一般优选使用最大剂量，即根据合理的医学判断的最高安全剂量。然而，本领域普通技术人员应当理解，由于医学原因、心理原因或由于事实上的任何其他原因可以施用较低的剂量或可耐受的剂量。
一般地，大分子的日剂量将为约0.01mg/kg/天－1000mg/kg/天。最初可以施用小剂量(0.01－1mg)，随后逐渐增加剂量直至约1000mg/kg/天。在受试者中的应答在此类剂量下不够的情况下，可以使用甚至更高的剂量(或通过不同、更局限性的递送途径的有效更高剂量)至患者耐受允许的程度。考虑多次剂量/天以达到化合物合适的系统水平。
在一个进一步的优选实施方案中，药学上可接受的载体或赋形剂可以选自一种或多种无菌含水盐溶液、悬浮液和乳状液，包括盐水和缓冲介质、林格氏(Ringer's)葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、和乳酸盐林格氏溶液。静脉内媒介物包括流体和营养素补充物、电解液补充物，例如基于林格氏葡萄糖的那些等。对于通过非静脉内途径的施用，载体可以是凝固血浆的形式，优选地患者的凝固血浆。备选地，载体可以是无血浆的、生理学相容的、生物可降解的固体或半固体，例如凝胶、悬浮液或水溶性胶冻。阿拉伯树胶、甲基纤维素和其他纤维素衍生物、海藻酸钠和黄蓍胶悬浮液或凝胶适合于用作本发明实践中的载体，例如羧甲基纤维素钠2.5％、黄蓍胶1.25％和瓜尔胶0.5％。
在一个进一步优选的实施方案中，药物组合物中的大分子可以包括药学活性的至少2种不同的末端基团。
此类实施方案可以与各种类型的治疗组合使用。
在一个进一步优选的实施方案中，药物组合物包括具有受控的末端基团化学计量的大分子，优选地树枝聚体，所述大分子包括至少2种末端基团，所述末端基团包括：
至少一种可切割的或不可切割的连接体部分；
其为药学活性剂的残基；其衍生物或为此的前体的第一种末端基团；
选择用于修饰所述药学活性剂和/或大分子的药代动力学的第二种末端基团；和
为此的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，
其中第一种和/或第二种末端基团通过一种或多种连接体部分附着至大分子构架；和
其中末端基团化学计量指末端基团的数目和类型。
在缺乏对肿瘤内部的有效营养素供应限制进一步的细胞复制前，癌性肿瘤将快速和不受控制地生长至约2mm的直径(1)。肿瘤可以保持这个大小多年，直至血管发生开始给肿瘤提供其自身的血液供应。这可以通过其发生的一种机制是经由低氧诱导因子-1α的活化，所述低氧诱导因子-1α是在受限的氧和葡萄糖供应的位点处(例如肿瘤团块的内部)上调的转录因子并负责涉及血管生成的基因的上调(2)。然而，肿瘤内的快速血管化产生在血管内皮细胞之间具有大间隙的缺陷结构，这允许通常无法透过正常脉管系统的大颗粒积聚。此外，在肿瘤团块内不产生淋巴引流以去除积聚的颗粒，因此存在肿瘤EPR效应(1)。
肿瘤内的不规则代谢和血管供应产生与正常细胞比较不同的pH梯度。肿瘤内增加的乳酸盐和碳酸积聚导致微酸性的细胞外环境(pH～6.5)，而由于缺陷的Na/H交换子，细胞内环境是中性或微碱性的(pH7.0-7.4)。这种差异pH梯度阻碍其为弱碱的某些化疗药物例如多柔比星的积聚。酸性细胞外环境也已与癌症转移联系，由于间质基质和细胞间间隙连接的降解。
可以利用这种细胞外酸性以使得能够pH介导地释放来自载体分子的抗癌药物，所述药物已经由对酸敏感的连接体结合。释放可以在细胞外间隙(pH～6.5)中或溶酶体隔室(pH～4-5)中发生。抗癌药物已与肿瘤靶向基团例如转铁蛋白进行连接，关于转铁蛋白的受体由大多数肿瘤细胞过量表达。已使用可由在肿瘤溶酶体中过量表达的组织蛋白酶B或D切割的其他连接体。
因此在本发明的一个进一步的方面，提供了用于治疗有此疗法需要的哺乳动物包括人患者中的肿瘤，包括恶性肿瘤的方法，所述方法包括
给患者施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包括具有受控的末端基团化学计量的大分子，所述大分子具有表面层、至少一个次表面层和至少2种末端基团，所述末端基团包括：
其为抗肿瘤药物试剂的残基；其衍生物或为此的前体的第一种末端基团；
选择用于修饰抗肿瘤药物试剂和/或大分子的药代动力学的第二种末端基团；和
为此的药学上可接受的载体；稀释剂或赋形剂，
其中末端基团化学计量指末端基团的数目和类型。
在一个实施方案中，大分子进一步包括一种或多种连接体部分，其中一种或多种连接体部分使第一种和/或第二种末端基团附着至大分子构架。
抗肿瘤药物试剂可以是任何合适的类型。可以使用细胞毒性剂、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂等，或其任何组合。
抗肿瘤试剂可以选自下述中的一种或多种：
利妥昔单抗、奥沙利铂、多西他赛、吉西他滨、曲妥珠单抗、依立替康、紫杉醇、贝伐珠单抗、卡铂、西妥昔单抗、多柔比星、培美曲塞、表柔比星、硼替佐米、托泊替康、阿扎胞苷、长春瑞滨、米托蒽醌、氟达拉滨、多柔比星、阿仑珠单抗、卡莫司汀、异环磷酰胺、依达比星、丝裂霉素、氟尿嘧啶、顺铂、氨甲蝶呤、美法仑、砒霜、地尼白介素、阿糖胞苷、左亚叶酸钙、环磷酰胺、依托泊苷、槲寄生、美司钠、吉妥珠单抗、奥佐米星、白消安、喷司他丁、克拉屈滨、博来霉素、柔红霉素、苯达莫司汀、达卡巴嗪、雷替曲塞、长春新碱、福莫司汀、磷酸依托泊苷、卟吩姆钠和长春碱。
在一个优选实施方案中，抗肿瘤药物试剂选自氨甲蝶呤、泰素、顺铂、卡铂、和多柔比星中的一种或多种。
第二种末端基团可以选择用于延长药学活性物的血浆半衰期。第二种末端基团可以选择用于促进抗肿瘤药物试剂靶向和/或摄入一种或多种特定细胞或组织类型。在一个优选实施方案中，第二种末端基团包括聚乙二醇(PEG)或聚乙基噁唑啉。
药学上可接受的载体或赋形剂可以选自任何已知的载体或赋形剂，依赖于所选择用于活性物的递送途径。
本发明的大分子特别是树枝聚体可以用于使药学活性剂靶向淋巴系统。
淋巴系统由遍及机体的脉管区域分布的专门脉管、结和聚集的淋巴样组织的区域的精细网络组成。淋巴管主要负责体液平衡的维持，并且在肠吸收和中性脂肪转运中以及在有效的免疫防御机制的维持中起作用。在大多数毛细血管床中，血管内皮是连续的并与不间断的基底膜结合。因为此类血管毛细管对于注入间质间隙内(例如在皮下或肌内注射)的大分子和小颗粒是相对难以渗透的。与之对比，淋巴毛细管由具有不完全的基底层的单层重叠的内皮细胞组成。这导致具有比毛细血管中的那些更‘开放’的细胞间连接的内皮层。细胞间连接距离的估计量为数微米(3－5)至15－20nm(6－10)。这些大的细胞间连接因此可以促进大分子、胶体和可能地树枝聚体从间质间隙到淋巴管内的优先转运或引流。
就对淋巴管的定向或靶向递送而言，淋巴还充当用于散播肿瘤转移灶的主要管道，并且已广泛地用作针对细胞毒性剂的靶，所述细胞毒性剂设计为对抗来自实体瘤的转移灶的传播。一般而言淋巴中的B和T淋巴细胞的相对高浓度还提供了针对细胞因子例如干扰素和免疫调节剂的有吸引力的靶。此外，在淋巴样组织中增加病毒负荷和增加病毒繁殖的人免疫缺陷病毒(HIV)阳性患者中的近期发现已提高淋巴作为在HIV和AIDS的治疗中的治疗靶的兴趣。迄今为止，提供药物至淋巴结的靶向递送的几种脂质体制剂已得到开发，特别是对于抗癌药物多柔比星(Doxil/Caelyx)(16－21)。
因此，在本发明的一个进一步的方面，提供了用于使药学活性剂靶向递送给动物的淋巴系统的方法，所述方法包括给动物施用有效量的具有受控的末端基团化学计量的大分子，所述大分子包括表面层、至少一个次表面层和至少2种末端基团，所述末端基团包括：
其为药学活性剂的残基；其衍生物或为此的前体的第一种末端基团；
选择用于促进药学活性剂和/或大分子摄入淋巴的第二种末端基团；和
为此的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在一个优选实施方案中，第二种末端基团是PEG或聚乙基噁唑啉。在一个优选实施方案中，PEG基团是相对单分散的，并选自200－10,000道尔顿的分子量范围，更优选地PEG基团选自500－5,000道尔顿的分子量范围。在一个进一步优选的实施方案中，第二种末端基团是具有超过约1000道尔顿的分子量的PEG。在一个进一步优选的实施方案中，第二种末端基团是具有超过约1500道尔顿的分子量的PEG基序。
在一个优选实施方案中，树枝聚体具有超过约20kDa的分子量，优选地超过约30kDa，更优选地超过约50kDa。
在一个优选实施方案中，树枝聚体包括可切割的或不可切割的连接体部分，其使第一种末端基团附着至树枝聚体构架。
在一个优选实施方案中，树枝聚体通过皮下注射施用于动物，包括人。
大分子的合成
在一个进一步的方面，本发明提供了制备具有受控的末端基团化学计量的大分子的方法，所述大分子包括表面层、至少一个次表面层和2种或更多不同的末端基团，其中至少一种末端基团是药学活性剂、其衍生物、为此的前体、或其残基，和至少一种末端基团选择用于修饰药学活性剂的药代动力学，其中末端基团化学计量指末端基团的数目和类型。
用于合成本发明的树枝聚体的过程涉及增长性树枝聚体的核部分和作为代构建化合物的一层或多层赖氨酸或赖氨酸类似物的顺次反应。赖氨酸类似物的顶端羧化物F(其代表在合成过程中树枝状基序将在其上附着至增长性大分子核的独特的位点)，将必须在与无保护的胺部分反应前激活。赖氨酸类似物的胺基A和B各自进行保护以防止自身缩合。当代构建化合物的羧化物F与增长性树枝聚体的无保护的氮反应时，代构建化合物的胺A和B总是被保护的。此外，无保护的胺和激活的赖氨酸类似物之间的反应以这样的方式进行，以便确保无保护的胺与所选择的赖氨酸类似物完全反应。这通过使用化学计量过量的激活的赖氨酸类似物最简单地完成。
用于合成本发明的树枝聚体的过程可以包括使增长性树枝聚体的无保护的胺与连接基团或末端基团，例如药学活性物、细胞表面配体和PEG反应。在每种情况下，连接体或末端基团的羧化物基团在反应前或在原位被激活用于酰胺键形成。连接基团的胺是被保护的或已与末端基团反应。此外，增长性树枝聚体的无保护的胺与激活的连接体或末端基团之间的反应以这样的方式进行，以便确保无保护的胺与激活的基团完全反应，一般通过使用过量的激活的基团。
保护基团的去除顺序可能是确定反应顺序中的重要因素，所述反应顺序可以用于制备包含不同胺保护基团的树枝聚体，特别是在一种胺保护基团的切割条件可能导致旁观的胺保护基团丧失的情况下。下列的保护基团表提供了可分解的和正交的胺保护基团的优选组。
可分解的胺保护基团组定义为关于其存在这样的去除顺序，使得不意欲切割的那些基团对于切割条件是惰性的那些。当保护基团定义为正交的时，这意指每个基团对于去除正交组的其他基团中的每一个所需的切割条件是惰性的。举例说明性的胺保护基团可以在下列参考文献中找到来源：Protective groups in Organic Synthesis，第3版，John Wiley and Sons，New York 1999，Greene，T.W.and Wuts，P.G.M.，Protecting Groups第3版，Thieme Stuttgart 2004，Kocienski，P.J。优选的胺保护基团可以选自表2。
表2：优选的胺保护基团
注：
1.该表的第一列中列出的保护基团与该表的首行交叉列出的保护基团的组合定义为“可分解的”(R)或“正交的”(O)。当组合视为“可分解的”，那么圆括号中的保护基团指示应首先被去除的基团。
2.指2-氯-Cbz和2-溴-Cbz。
3.既不是可分解的也不是正交的组合。
在一个进一步的方面，本发明提供了用于制备具有受控的末端基团化学计量的大分子的过程，其包括下述步骤：
(i)提供
包括具有官能团和2种或更多不同保护基团的外层的增长性大分子；
其为药学活性剂的残基、其衍生物或为此的前体的第一种末端基团的前体；和
选择用于修饰药学活性剂和/或大分子的药代动力学的第二种末端基团的前体，
(ii)通过去除第一种保护基团使外层上的官能团脱保护；
(iii)激活第一种或第二种末端基团前体之一；
(iv)使脱保护的官能团与激活的末端基团前体反应；
(v)通过去除第二种保护基团使外层上的官能团脱保护；
(vi)激活第一种或第二种末端基团前体中的另一种；和
(iv)使脱保护的官能团与激活的末端基团前体反应；
其中末端基团化学计量指末端基团的数目和类型。
在一个进一步的方面，本发明提供了用于制备具有受控的末端基团化学计量的大分子的过程，其包括下述步骤：
(i)提供
包括具有官能团和2种或更多不同保护基团的外层的增长性大分子；
其为药学活性剂的残基、其衍生物或为此的前体的第一种末端基团前体；和
选择用于修饰药学活性剂和/或大分子的药代动力学的第二种末端基团，
和包括羧化物基团和受保护的胺基的连接体部分
(ii)通过去除第一种保护基团使外层上的官能团脱保护；
(iii)激活连接体部分上的羧化物基团；
(iv)使脱保护的官能团与连接体部分上激活的羧化物基团反应；
(v)使连接体部分上的胺基脱保护；
(vi)激活第一种或第二种末端基团前体之一；
(vii)使脱保护的胺基与激活的末端基团前体反应；
(viii)通过去除第二种保护基团使外层上的官能团脱保护；
(ix)激活第一种或第二种末端基团前体中的另一种；和
(x)使脱保护的官能团与激活的末端基团前体反应；
其中末端基团化学计量指末端基团的数目和类型。
用于合成本发明的大分子的优选过程包括提供附着至增长性大分子的表面改性剂化合物的预备步骤。表面改性剂化合物包括：
羧化物基团，以促进改性剂化合物附着至增长性大分子；
其为药学活性剂的残基、其衍生物或为此的前体的第一种末端基团；和/或
选择用于修饰药学活性剂和/或大分子的药代动力学的第二种末端基团。
末端基团的表面基团化学计量(数目和类型)可以通过使用树枝状基序得到控制，在所述树枝状基序中末端胺保护基团表面基团化学计量和拓扑学已确定。已观察到此类方法可以提供具有高纯度的本发明的树枝聚体。
表面改性剂化合物可以以任何合适的方式进行制备。在一个实施方案中，提供了用于制备表面改性剂化合物的过程，所述过程包括：
(i)提供
具有2种或更多不同的胺保护基团和羧化物基团的赖氨酸或赖氨酸类似物化合物；
其为药学活性剂的残基、其衍生物或为此的前体的第一种末端基团的前体；和
选择用于修饰所述药学活性剂和/或大分子的药代动力学的第二种末端基团的前体；
(ii)使受保护的赖氨酸或赖氨酸类似物化合物上的第一种胺脱保护；
(iii)激活第一种或第二种末端基团前体；
(iv)使激活的末端基团前体与脱保护的胺基反应；
(v)使保护的赖氨酸或赖氨酸类似物化合物上的第二种胺脱保护；
(vi)激活第一种或第二种末端基团前体中的另一种；和
(vii)使另一种激活的末端基团前体与第二种脱保护的胺基反应，以提供表面改性剂化合物。
表面改性剂化合物优选地包括赖氨酸或赖氨酸类似物主链。表面改性剂化合物在其主链中可以包含多个赖氨酸或赖氨酸类似物基序。
用于合成根据本发明的表面改性剂化合物的过程可以包括去除一种或多种末端胺保护基团，以提供一种或多种反应胺基。这些反应胺基随后与第一种或第二种末端基团的前体反应。末端基团前体的羧化物部分将在反应前或在原位被激活用于酰胺键形成。此外，赖氨酸或赖氨酸类似物主链的无保护的胺与激活的末端基团之间的反应可以以这样的方式进行，以便确保无保护的胺与激活的末端基团完全反应，一般通过使用化学计量过量的激活的基团。
在一个实施方案中，用于制备表面改性剂化合物的过程可以任选包括在去除赖氨酸或赖氨酸类似物主链上存在的末端胺上的保护基团前保护所选择的羧化物基团。用于受保护的羧化物基团的保护基团优选对于去除末端胺上存在的保护基团所需的条件是稳定的。羧化物保护基团例如甲酯或更优选地乙酯是合适的。举例说明性的羧化物保护基团可以在下列参考文献中找到来源：Protective groups in OrganicSynthesis，第3版，John Wiley and Sons，New York 1999，Greene，T.W.and Wuts，P.G.M.，Protecting Groups第3版，Thieme Stuttgart2004，Kocienski，P.J。
当表面改性剂化合物的合成在添加末端基团后需要进一步的脱保护步骤时，重要的是考虑这种末端基团对于后续反应的稳定性。在末端基团添加的优选顺序中，选择用于修饰药学活性剂和/或大分子的药代动力学的第二种末端基团首先添加至赖氨酸或赖氨酸类似物主链中。此外，在其中药学活性剂经由不稳定的连接体附着至赖氨酸或赖氨酸类似物主链的情况下，可能必须在赖氨酸或赖氨酸类似物主链的无保护的末端胺基反应前使树枝状基序核的所选择的羧化物脱保护，并且此外当赖氨酸或赖氨酸类似物主链所选择的羧化物无保护时，将必须使药学活性剂-连接体部分的羧化物基团在无保护的末端胺基的出现前激活。
用于合成表面改性剂化合物的过程随后可以包括末端胺保护基团的进一步去除和与另外的末端基团的反应，以完成表面改性剂化合物的表面修饰。当表面改性剂化合物所选择的羧化物具有保护基团时，受保护的羧化物将在末端基团已全部安置后进行脱保护，或它将在不稳定的连接体安置前进行脱保护。表面改性剂化合物所选择的羧化物已脱保护后，在无保护的末端胺基和末端基团的羧化物之间形成酰胺键的所有后续反应将要求末端基团的羧化物在引入表面改性剂化合物前激活。
用于合成本发明的大分子的过程随后通过使增长性大分子的无保护的胺与表面改性剂化合物反应来继续。树枝状基序的羧化物部分将在反应前或在原位被激活用于酰胺键形成。在优选方法中，表面改性剂化合物的羧化物部分在原位激活。这种方法是优选的并且通过包括水或其他羟基供体，它可以限制酯键与大分子的偶然形成，其中暴露的羟基部分存在于增长性大分子核或表面改性剂化合物上。在一个实施方案中，表面改性剂化合物经由连接体部分附着至增长性大分子。
因此，在本发明的一个备选实施方案中，提供了用于制备具有受控的末端基团化学计量的大分子的过程，其包括下述步骤：
(i)提供
包括具有官能团和1种或更多保护基团的外层的增长性大分子；和
表面改性剂化合物，其包括：
羧化物基团
其为药学活性剂的残基、其衍生物或为此的前体的第一种末端基团；和
选择用于修饰药学活性剂和/或大分子的药代动力学的第二种末端基团；
(ii)激活表面改性剂化合物上的羧化物基团；
(iii)通过去除保护基团使增长性大分子的外层上的官能团脱保护；和
(vii)使增长性大分子上脱保护的官能团与表面改性剂化合物上的激活的羧化物基团反应，
其中末端基团化学计量指末端基团的数目和类型。
本发明的大分子可以包括用于第一种或第二种末端基团独特的附着点。以这种方式，大分子可以用单一的第一种或第二种末端基团进行合成。优选地，附着至独特的附着点的末端基团是选择用于修饰药学活性剂和/或大分子的药代动力学的第二种末端基团。更优选地，附着至独特的附着点的第二种末端基团选择用于促进药学活性剂和/或大分子靶向和/或摄入一种或多种细胞或组织类型。
在一个备选实施方案中，本发明的大分子可以包括用于第一种或第二种末端基团的所选择的单个附着点。
存在在用于选择性单一保护聚胺分子的领域中描述的一般方法。此类方法在Krapcho和Kuell Synthetic Commun.1990 20 2559中得到描述。在优选方法中，具有独特的附着点的树枝聚体由其中仅有1种反应胺部分是受保护的二或三价核进行制备，并使用对在构建赖氨酸树枝聚体的过程中用于去除其他胺保护基团的条件是惰性或正交的保护基团。随后可以进行赖氨酸缩合和胺脱保护的迭代循环(iterative cycle)，以构建1－6代，更优选地3－5代的树枝聚体，并且在所述树枝聚体中存在通过其独特的胺保护基团与其他末端胺部分区别的单个末端胺部分。这种独特的末端胺代表单个所选择的分子例如蛋白质或肽，或靶向分子可以在其上附着至树枝聚体的位点。
在这个实施方案的优选形式中，提供了具有受控的末端基团化学计量的大分子，所述大分子包括表面层、至少一个次表面层和至少2种末端基团，所述末端基团包括：
其为肽或蛋白质的残基、其衍生物或为此的前体的第一种末端基团，所述第一种末端基团附着至大分子上的单个所选择的附着点；和
选择用于修饰肽或蛋白质和/或大分子的药代动力学的第二种末端基团；
其中末端基团化学计量指末端基团的数目和类型。
在优选方法中，独特的末端胺部分的保护基团被去除，并且末端胺部分在其中形成酰胺键的条件下与卤乙酸衍生物、或马来酰亚胺衍生物例如3-马来酰亚胺丙酸或4-马来酰亚胺丁酸反应。用于使含巯基的肽和蛋白质与此类巯基活性基团偶联的一般方法在Pierce 1989Handbook and General Catalog和其中引用的参考文献中得到描述。
本发明现在将根据伴随的实施例更充分地进行描述。然而，应当理解下述描述仅是举例说明性的且不应以任何方式视为对上文描述的本发明的一般性的限制。
在附图中：
图1A－Lys8(NH2)16树枝聚体BHALys[Lys]8[NH2]16的化学结构。8个L-Lys8末端赖氨酸基团中的每一个在生理学pH下贡献2个正电荷。附着至Lys8核的D-Lys基团不是放射标记的，且因此3H放射性标记的位点位于Lys16树枝聚体的Lys8层上。
图1B－L-Lys16(NH2)32树枝聚体BHALys[Lys]16[NH2]32的化学结构。16个L-Lys16末端赖氨酸基团中的每一个在生理学pH下贡献2个正电荷。末端赖氨酸上和插入片段中的的星号突出表面赖氨酸基团上的3H放射性标记的位置。R指示表面赖氨酸与树枝聚体核的附着。
图2－以5mg/kg的剂量给大鼠静脉内施用后的阳离子3H-树枝聚体的血浆浓度(均值±S.D.，n＝3)。实心标记表示BHALys[Lys]8[NH2]16的施用，空心标记表示BHALys[Lys]16[NH2]32的施用。数据显示为ng当量/ml施用的树枝聚体。
图3－在初步研究中以更高的剂量给大鼠静脉内施用后的阳离子3H-树枝聚体的血浆浓度(n＝1)。实心标记显示在施用24.3mg/kgBHALys[Lys]8[NH2]16后获得的数据，空心标记表示在施用22.3mg/kgBHALys[Lys]16[NH2]32后获得的数据。数据显示为ng当量/ml施用的树枝聚体。
图4－以5mg/kg的剂量给大鼠静脉内施用后的阳离子3H-树枝聚体的全血浓度(均值±S.D.，n＝3)。实心标记表示BHALys[Lys]8[NH2]16的施用，空心标记表示BHALys[Lys]16[NH2]32的施用。数据显示为ng当量/ml施用的树枝聚体。
图5－以5mg/kg给大鼠静脉内施用后的BHALys[Lys]16[NH2]32、BHALys[Lys]8[D-Lys]16[NH2]32和L-赖氨酸的血浆浓度(均值±S.D.，n＝3)。实心圆圈表示BHALys[Lys]16[NH2]32的施用，空心圆圈表示BHALys[Lys]8[D-Lys]16[NH2]32的施用，和实心三角表示L-赖氨酸的施用。数据显示为ng当量/ml施用的树枝聚体或赖氨酸。
图6－使用Superdex Peptide 10/300GL尺寸排阻柱获得的尺寸排阻层析(SEC)谱。小图A－在肝素化的空白血浆中在室温下温育1小时后的BHALys[Lys]16[NH2]32和赖氨酸。洗脱体积和谱与对于BHALys[Lys]16[NH2]32和赖氨酸获得的那些相同(谱未显示)。小图B－紧在BHALys[Lys]16[NH2]32静脉内施用后(t＝0)获取的血浆样品。小图C－在BHALys[Lys]16[NH2]32静脉内施用后3小时(空心标记)和6小时(实心标记)获取的血浆样品。小图D－在L-赖氨酸静脉内施用后30小时获取的血浆样品。
图7－来自Superdex 75HR 10/30尺寸排阻柱的血浆放射性标记(作为洗脱的DPM)的洗脱谱。实心标记表示关于BHALys[Lys]16[NH2]32静脉内施用后6小时获取的血浆样品的洗脱谱(左手Y轴上的比例尺)。空心标记表示关于L-赖氨酸静脉内输注后30小时获取的血浆样品的洗脱谱(右手Y轴上的比例尺)。关于各种MW蛋白质标准、BHALys[Lys]16[NH2]32和赖氨酸的洗脱时间显示于图的顶部。柱的空体积通过注入葡聚糖蓝2000(MW 2000kDa)进行测定并在图下方指出(Vo)。
图8－在以5mg/kg给大鼠静脉内施用阳离子3H-树枝聚体后30小时时主要器官中残留的3H的分布。小图A是呈现为注入的放射性标记％的数据，而对于小图B数据呈现为注入的放射性标记％/克组织(均值±S.D.，n＝3)。实心标记表示关于BHALys[Lys]8[NH2]16的组织生物分布，而空心标记表示关于BHALys[Lys]16[NH2]32的组织生物分布。阴影(灰色)标记表示BHALys[Lys]8[D-Lys]16[NH2]32的组织生物分布。
图9.1至9.5－根据本发明的一个优选实施方案赖氨酸树枝状基序的所选择的拓扑异构体的图示，所述拓扑异构体具有从顶点F起5层的代构建单位具有以1：1表面比的末端基团A和B。A，B表示2种不同的保护基团或有机基，和F表示在顶点上的不完全的羧化物。
图10－对大鼠5mg/kg IV给药后的BHALys[Lys]8[CO-4-Ph(SO3Na)]16(实心圆圈)、BHALys[Lys]16[CO-4-Ph(SO3Na)]32(空心圆圈)和BHALys[Lys]16[CO-3,5-Ph(SO3Na)2]32(三角)的血浆浓度-时间谱。
图11－BHALys[Lys]8[CO-4-Ph(SO3Na)]16(黑色)、BHALys[Lys]16[CO-4-Ph(SO3Na)]32(淡灰色)、BHALys[Lys]16[CO-3,5-Ph(SO3Na)2]32(深灰色)或BHALys[Lys]16[CO-CH2CH2(CO2Na)]32(白色)对大鼠IV给药后30小时注入的3H的生物分布。小图A－呈现的注入的3H％/器官。小图B－呈现的注入的3H％/克组织。
图12－在superdex 75柱上在血浆和尿中的BHALys[Lys]16[CO-4-Ph(SO3Na)]32和BHALys[Lys]16[CO-3，5-Ph(SO3Na)2]32的尺寸排阻谱。小图A－在PBS(实心圆圈)或新鲜血浆(空心圆圈)中温育1小时的BHALys[Lys]16[CO-4-Ph(SO3Na)]32的SEC谱。小图B－在PBS(实心圆圈)或新鲜血浆(空心圆圈)中温育1小时的BHALys[Lys]16[CO-3，5-Ph(SO3Na)2]32的SEC谱。小图C－在血浆中t0(实心圆圈)和2小时(空心圆圈)时的BHALys[Lys]16[CO-4-Ph(SO3Na)]32的SEC谱。小图D－在血浆中t0(实心圆圈)或2小时(空心圆圈)时的BHALys[Lys]16[CO-3,5-Ph(SO3Na)2]32的SEC谱。小图E－在0－8小时尿(实心圆圈)和8－24小时尿(空心圆圈)中的BHALys[Lys]16[CO-4-Ph(SO3Na)]32的SEC谱。
图13－关于BHALys[Lys]16[PEG200]32(实心圆圈)、BHALys[Lys]16[PEG570]32(空心圆圈)、BHALys[Lys]8[PEG2000]16(实心三角)和BHALys[Lys]16[PEG2000]32(空心三角)的血浆浓度-时间谱。关于BHALys[Lys]8[PEG200]16的数据未显示，因为清除是非常快速的并被关于BHALys[Lys]16[PEG200]32的数据弄混。
图14－IV给药后的BHALys[Lys]16[PEG2000]32(黑色柱，7天)、BHALys[Lys]8[PEG2000]16(灰色柱，5天)和BHALys[Lys]16[PEG570]32(白色柱，30小时)的生物分布。上图显示在每种器官中回收的注入的3H％，而下图显示回收的注入的3H％/克每种组织。在IV给药后30小时在肾中仅回收到0.1％的BHALys[Lys]16[PEG200]32，而在用BHALys[Lys]8[PEG200]16给药的大鼠的任何器官中未检测到3H(数据未显示)。
图15A－D－在Superdex 75柱上5mg/kg IV给药后在血浆中关于3H标记的BHALys[Lys]16[PEG200]32(小图A；t0，空心方块，t＝1小时，实心圆圈，t＝4小时，空心圆圈)、BHALys[Lys]16[PEG570]32(小图B；24小时)、BHALys[Lys]8[PEG2000]16(小图C；48小时)、和BHALys[Lys]16[PEG2000]32(小图D；48小时)的尺寸排阻谱。箭头指示完整的树枝聚体的保留时间。
图16A和B－在BHALys[Lys]16[PEG200]32(小图A；0－4小时尿，实心圆圈，8－24小时尿，空心圆圈)和BHALys[Lys]16[PEG570]32(小图B；8－24小时尿)IV给药后在尿中排泄的3H的尺寸排阻谱。箭头指示完整的树枝聚体的保留时间。
图17－用于制备BHALys[Lys]16[α-PEG570]16[ε-MTX]16的反应方案3。
图18－用于制备BHALys[Lys]16[α-PEG570]16[ε-COCH2CH2CO-泰素]的反应方案5。
图19A－用于制备BHALys[Lys]16[ε,ε-PEG570]8[COCH2CH2CO-泰素]24的反应方案6(部分1)。
图19B－用于制备BHALys[Lys]16[ε,ε-PEG570]8[COCH2CH2CO-泰素]24的反应方案6(部分2)。
图20－用于制备PEG1716-CO2H、PEG2645-CO2H、PEG3974-CO2H的反应方案7。
图21举例说明了实施例36的合成，包括下述步骤：
i.MeOGly[NH2.HCl]与PNPO-Lys-α-Boc-ε-CBz和三乙胺在DMF中的反应；ii.MeOGlyLys[α-Boc][ε-CBz]与1:1TFA/AcOH的反应；iii.MeOGlyLys[α-NH2.TFA][ε-CBz]与DBL-OPNP和三乙胺在DMF中的反应；iv.MeOGlyLys[α-Lys][Boc]2[ε-CBz]与碳上的催化的钯和1当量TFA在甲醇中的反应；v.MeOGlyLys[α-Lys][Boc]2[ε-NH2.TFA]与PNPO-Lys-α-Boc-ε-CBz和三乙胺在DMF中的反应；vi.MeOGlyLys[Lys]2[Boc]3[ε,ε-CBz]与氢氧化钠在MeOH/H2O随后为含水硫酸氢钾中的反应。
图22举例说明了实施例37的合成，包括下述步骤：
i.BHALys[NH2.TFA]2与HOGlyLys[Lys]2[Boc]3[ε,ε-CBz]、过量EDCI和HOBt在DMF中的反应；ii.BHALys BHALys[GlyLys]2[Lys]4[Boc]6[ε,ε-CBz]2与1:1TFA/AcOH的反应。
图23－皮下给药的PEG化的树枝聚体(黑色标记)或非PEG化的苯磺酸盐树枝聚体(白色标记)在胸导管淋巴中随时间的累积回收。结果为均值±sd(n＝1-3)。
图24－PEG化和未封端的Lys16的树枝聚体的血浆浓度-时间谱。小图A显示在全PEG化的、未封端的和半PEG化的树枝聚体的血浆浓度中的初始下降。数据表示为均值±sd(N＝2-3)。
图25－从用5mg/kg氘标记的(G3层)Lys16(PEG570)16(NH2)16给药的大鼠收集的血浆(A)和尿(B)的SEC谱。完整的树枝聚体的保留时间由箭头指出。在18和21分钟时洗脱的产物是赖氨酸重掺入产物。在43分钟时的峰是标记的赖氨酸。
图26－从用Lys16(NH2)32(6小时样品)和L-赖氨酸(30小时)给药的大鼠收集的血浆的SEC谱。在17和20分钟时的峰是赖氨酸重掺入产物。在41分钟时洗脱的峰是氘标记的赖氨酸。
图27－从用5mg/kg氘标记的(G3层)Lys16(PEG570)16(CH3)16给药的大鼠收集的血浆和尿的SEC谱。完整的树枝聚体的保留时间由箭头指出。在18分钟时洗脱的产物是赖氨酸重掺入产物。在20分钟时洗脱的峰可能是与完整的树枝聚体相关的反常峰，这在完全封端的种类中可见。在43分钟时洗脱的峰是标记的赖氨酸。在30－40分钟之间洗脱的峰可能是核分解产物。
实施例
下述实施例中的树枝聚体命名法利用下式：
核[最后一个完整层；构建单位]n[末端基团]m[不完整的外层；构建单位]p[末端基团]q
其中：
·核是激活的赖氨酸代构建单位与之附着的分子并将包括加入第一层赖氨酸构建单位中的至少一个胺部分，
·n是大分子的最外面的完整层的赖氨酸构建单位数目，p是在大分子的不完整的外层上的赖氨酸构建单位数目，
·m是构建单位的最外面的完整层上的末端基团例如药物活性部分或末端胺保护基团数目；q是构建单位的不完整的外层上的末端基团数目，
·任选地，末端基团和/或构建单位可以与核附着；这些随后根据如上的相同原则表示为[末端基团]r[构建单位]s。
命名法通过提供核和外层能够完整描述大分子的大小，因为在这些大分子结构的构建中只使用赖氨酸构建单位并且核的效价是已知的，并且进一步因为每个大分子层的所有表面胺基在新赖氨酸层的添加期间与赖氨酸完全反应。
表3：大分子命名法缩写和结构
1星号指示与赖氨酸分支单位的羧基结合为酰胺的胺基。杂乱信号指示与核或赖氨酸分支单位的胺结合为酰胺的羧基
进一步的化学缩写在表4中列出。
表4：化学名和缩写。
实施例1
可以在本发明中使用的药学活性剂的例子包括下述：
氨甲蝶呤
氨甲蝶呤是癌症和自身免疫疾病治疗中使用的抗代谢药。它通过完全和可逆地抑制二氢叶酸还原酶来抑制叶酸代谢而起作用。
氨甲蝶呤在化学上是N-[4-[[(2,4-二氨基-6-蝶啶基)甲基]甲基氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸。
分子量：454.45C20H22N8O5和结构式为：
癌症化学疗法中使用的较高剂量的氨甲蝶呤可以引起毒性副作用，以使骨和胃肠粘膜的细胞快速分裂。
泰素
泰素(紫杉醇)是特别在具有对先前疗法无应答的乳腺和卵巢癌的女性中用作治疗的抗有丝分裂剂。它通过使微管稳定和促进微管组装而起作用，从而破坏细胞以灵活方式使用其细胞骨架的能力。泰素是三环二萜和结构式为：
Zenical(也称为赛尼可、Xenecal和Zencal)是用于肥胖管理的重量控制药物。它通过与胃和胰脂肪酶的活性丝氨酸残基位点形成共价键在胃和小肠的腔内发挥其治疗活性。灭活的酶因此无法使饮食脂肪以从甘油三酯到可吸收的游离脂肪酸和甘油单酯的形式水解。
Zenical在化学上具有下述结构式
Zenical的化学名为(S)-2-甲酰氨基-4-甲基-戊酸(S)-1[[(2S，3S)-3-己基-4-氧-2-氧杂环丁基]甲基]十二烷基酯。分子式为C29H53NO5。Zenical具有495.7的分子量。
存在许多不期望的胃肠道副作用，包括肠胃气胀、排泄紧急、脂肪/油性大便和稀便。
消炎痛
消炎痛(也称为吲哚美辛)是通常用于减少发烧、疼痛、僵硬和肿胀的非甾体抗炎药。它通过抑制已知引起这些症状的分子前列腺素的产生而发挥作用。
环孢菌素是在移植中的移植物抗宿主反应的预防和治疗中广泛使用的免疫抑制剂。它已就其中免疫因子可能具有致病作用的大量各种其他疾病的治疗进行测试。
实施例2
具有氨甲蝶呤的树枝聚体
制备其中约50％－约75％的末端基团是药物(具体地氨甲蝶呤)的赖氨酸树枝聚体。氨甲蝶呤可以通过稳定的键与树枝聚体缀合，并测定这种构建体的清除和生物分布。
随着它们的相对丰度减少，可能希望增加单个PEG基团的大小，以便维持所需的血浆寿命和避免肝摄取。氨甲蝶呤的“不可切割的”性质维持构建体在血浆暴露期间的完整性。
化合物的详述：
BHALys[Lys]16[α-PEG570]16[ε-MTX]16
BHALys[Lys]16[α-PEG1100]16[ε-MTX]16
BHALys[Lys]16[α-PEG1716]16[ε-MTX]16
BHALys[Lys]16[α-PEG2845]16[ε-MTX]16
BHALys[Lys]16[α-PEG3974]16[ε-MTX]16
BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[MTX]16[PEG570]16
BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[MTX]16[PEG1100]16
BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[MTX]16[PEG1716]16
BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[MTX]16[PEG2845]16
BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[MTX]16[PEG3974]16
其中MTX表示通过γ-羧化物基团缀合的氨甲蝶呤1。这种方法的关键中间产物是根据Aust.J.Chem.200255635-645中描述的方法制备的3。
实施例3
具有泰素的树枝聚体
具有泰素的树枝聚体的例子包括下述：
BHALys[Lys]16[α-PEG570]16[ε-COCH2CH2CO-泰素]16
BHALys[Lys]16[α-PEG1100]16[ε-COCH2CH2CO-泰素]16
BHALys[Lys]16[α-PEG1716]16[B-COCH2CH2CO-泰素]16
BHALys[Lys]16[α-PEG2845]16[ε-COCH2CH2CO-泰素]16
BHALys[Lys]16[α-PEG3974]16[ε-COCH2CH2CO-泰素]16
BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[PEG570]16[COCH2CH2CO-泰素]16
BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[PEG1100]16[COCH2CH2CO-泰素]16
BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[PEG1716]16[COCH2CH2CO-泰素]16
BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[PEG2845]16[COCH2CH2CO-泰素]16
BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[PEG3974[COCH2CH2CO-泰素]16
BHALys[Lys]16[ε,ε-PEG570]8[COCH2CH2CO-泰素]24
BHALys[Lys]16[ε,ε-PEG1100]8[COCH2CH2CO-泰素]24
BHALys[Lys]16[ε,ε-PEG1716]8[COCH2CH2CO-泰素]24
BHALys[Lys]16[ε,ε-PEG2845]8[COCH2CH2CO-泰素]24
BHALys[Lys]16[ε,ε-PEG3974]8[COCH2CH2CO-泰素]24
泰素的缀合可以使用2种不同衍生物；2和4来进行(参见下文)。2的制备在J.Med.Chem.198932788-792中得到描述。
赖氨酸树枝聚体可以包括约50％－75％的泰素末端基团，其通过各种“可切割的”连接体进行附着。
制备为完全Boc保护形式的所有赖氨酸树枝聚体根据国际专利申请WO95/34595中描述的操作来合成和纯化，所述专利的完整内容通过引用方式而合并入本文。Boc保护基团的去除根据WO95/34595中描述的操作来进行。
当赖氨酸树枝聚体需要包含氚以便树枝聚体材料可以使用闪烁计数技术在生物基质中进行检测时，这些材料通过用非放射性的L-赖氨酸稀释(4,5-3H)-L-赖氨酸来制备，以提供具有5uCi－15uCi/mg范围中的比活性的材料。这种氚标记的赖氨酸随后用于制备di-Boc-赖氨酸的对硝基苯酚活性酯，使用WO95/34595中描述的方法将其掺入靶赖氨酸树枝聚体的外部赖氨酸层内。
实施例4
BHALys[(3H)-Lys]8[D-Lys]16[NH2]32的合成
在氮下向溶于干DMF(3mL)中的BHALys[(3H)-Lys]8[NH2.TFA]16(38mg，0.01mmol)的搅拌溶液中，加入溶于DMF(4mL)和三乙胺(65μL，0.46mmol)中的D-赖氨酸对硝基苯酚酯(181mg，0.38mmol)溶液。允许反应混合物在rt下搅拌16小时，这之后将其倾入乙腈(60mL)内并搅拌6小时。所得到的精细固体通过经由0.45μm亲水聚丙烯膜滤器过滤进行收集，并且在真空中进行干燥。产物BHALys[(3H)-Lys]8[D-Lys]16[Boc]32是精细乳膏有色固体(40mg，56％)。使BHALys[(3H)-Lys]8[D-Lys]16[Boc]32(34mg，0.005mmol)悬浮于CH2Cl2(1mL)中，并冷却至0℃。逐滴加入TFA(398μL，2.58mol)并使反应于0℃搅拌10分钟，并且随后加温至rt并再搅拌3小时。溶剂在真空下去除，并且将乙醚加入至所得到的油中，研磨溶液导致粉碎掉白色固体。倾析掉乙醚并用乙醚(x3)冲洗固体。乙醚被去除后，将所得到的固体溶解于最小量的水中，并施加到Amberlyst(A-26OH)离子交换柱上。从柱中收集100mL水并且通过冷冻干燥去除，以产生作为白色固体(15mg，79％)的BHALys[(3H)-Lys]8[D-Lys]16[NH2]32。
LC-MS:(Philic TFA，去溶剂化temp.300C)Rf(分钟)8.45.ESI(+ve)m/z＝1386.6(M/3)，1040.3(M/4)，832.3(M/5)694.0(M/6)594.9(M/7)。
实施例5
阳离子树枝聚体材料的血浆清除率和生物分布研究
缓冲试剂是AR等级的。水得自MilliQ纯水系统(Millipore，Australia)。肝素(10,000IU/mL)得自Faulding，Australia。注射盐水在来自Baxter Healthcare Pty Ltd(NSW，Australia)的100mL聚乙烯袋中获得。氚标记的L-赖氨酸(1mCi/ml)购自MPBiomedicals(Irvine，CA，USA)。非放射性标记的L-赖氨酸得自SigmaChemical Co(St Louis，MO，USA)。Starscint闪烁混合物和Soluene-350组织增溶剂购自Packard Biosciences(Meriden，CT)。蛋白质标准包括葡聚糖蓝2000(2000kDa)、无脂肪酸牛血清白蛋白(67kDa)、胃蛋白酶(35kDa)、胰蛋白酶(23.8kDa)、肌红蛋白(17.6kDa)、核糖核酸酶A(13.7kDa)、细胞色素C(12.4kDa)和维生素B12(1.4kDa)，并且全部购自Sigma Chemical Co(St Louis，MO，USA)。关于更高分子量蛋白质的洗脱时间通过将20μl PrecisionPlus蛋白质标准注入柱(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)上来获得。
制备3H标记的树枝聚体并作为冷冻干燥的粉末提供。供应前的纯化经由超滤和尺寸排阻层析法(Sephadex LH20，用水洗脱)，其中离子交换用于提供游离碱形式的未封端的、胺结尾的树枝聚体。纯度通过毛细管电泳法、NMR和质谱法进行确定。树枝聚体的比活性和分子量在表5中列出。
表5－这项研究中使用的树枝聚体的所选择的性质
3H-L-赖氨酸(25μCi)用在磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)中的非放射性标记的赖氨酸新鲜稀释至20μCi/mg的最终比活性用于IV给药。
所有树枝聚体在PBS中进行稀释并冷冻于-20℃直至使用。
活性测定和闪烁计数
树枝聚体的比活性通过将包含已知质量的母液稀释到PBS内一式三份地进行测定。随后将等分试样加入至1mL Starscint中，并在Packard Tri-Carb 2000CA Liquid Scintillation Analyser(Meriden，CT)上进行闪烁计数。一式三份的测定的平均值用于所有后续计算。
体内方法
所有动物实验方案得到Victorian College of Pharmacy AnimalEthics Committee，Monash University，Parkville，VIC，Australia批准。
静脉内药代动力学研究
在树枝聚体施用前，大鼠(雄性，Sprague Dawley，250-350g)具有插入颈静脉和颈动脉内的插管(聚乙烯管0.96x 0.58mm，PatonScientific，Victor Harbour，Australia)，在如Ali等人(1999)J.Biol.Chem.274：24066-24073中描述的异氟烷麻醉下。插管用肝素化盐水(2I.U./ml)进行冲洗，并在回收过程中在插入颈背部处皮下袋内之前进行火焰密封。允许大鼠在给药前恢复过夜，尽管食物在给药前停止12小时。恢复期后，大鼠在代谢笼中进行饲养以允许分类收集尿和粪便，并且插管附着至转环/皮带装置以便于药物施用和采血。随时允许自由接近水。将树枝聚体或L-赖氨酸溶解于1ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)内，并以5mg/kg的剂量经由留置的颈静脉插管通过静脉内输注经过2分钟施用。插管随后用0.25ml肝素化的盐水进行冲洗以确保剂量的完全输注。血液样品(0.15ml)随后在下述指定时间点上从颈动脉获得：给药前(-5分钟)，在输注结束瞬间时(t＝0)以及在5、10、20、30、45、60、90、120、180、240、360、480、1440和1800分钟时。血液样品立即置于包含10I.U.肝素的管内并在3500xg下离心5分钟。随后将血浆(50μl)加入至1ml Starscint闪烁混合物中，并在闪烁计数前进行涡旋。关于血浆测定法的定量极限(20dpm)使用强化血浆样品的重复(n＝5)分析进行验证。准确性和精确度在±20％内。
生物分布研究
为了了解树枝聚体在体内的命运，研究对各种主要器官的生物分布。药代动力学研究(30小时)完成后，通过注射致死剂量的戊巴比妥钠处死动物并且通过解剖取出下述组织：心、肺、肝、脾、胰腺、肾和脑。将组织冷冻(-20℃)贮藏于预称重的聚丙烯管中直至紧在组织处理和分析前。
组织通过用5－10ml MilliQ水使样品在Waring微型混合器(Extech Equipment Pty.Ltd.，Boronia，Australia)中匀化进行起始处理，共5x 10秒的间隔。在开发用于测量组织样品中相对低水平的放射性的方法中，遇到与化学发光反应和颜色猝灭相关的问题，导致在闪烁计数中高度可变的本底计数。这些问题还似乎通过温度中的增加、暴露于光和样品的搅拌恶化。为了克服这些问题，组织的后续处理作为2阶段过程来进行。
起始‘筛选’阶段用于确定样品中的放射性的近似水平。对于这个阶段，将来自每种组织匀浆的单一样品(一般为40－100mg组织)置于包含2ml Soluene的20ml聚丙烯闪烁瓶内，允许组织消化于60℃发生过夜，随后加入异丙醇(2ml)并使溶液于60℃再加热2小时。冷却至室温后，向样品中顺次加入2x 100μl等分试样的过氧化氢(30％w/v)，随后允许其在室温下静置直至起泡已停止。随后加入Starscint(12ml)并使混合物涡旋，之后将样品于4℃在黑暗中贮藏96小时不伴随搅拌。样品随后进行闪烁计数，在这期间计数器使用冷却的样品托盘维持于12℃。样品还以6－12个的组进行计数以使计数过程中的加温降到最低。单一样品还从来自未处理大鼠的器官中获取并以相似方式进行处理，以获得由于单独的处理方法预期的用于本底计数的值。这些值从在筛选阶段期间获得的值中减去。得自这个筛选阶段的数据提供在每种样品中预期的活性量的广泛指示。这种信息是最终分析运行所需的。
在组织计数过程的第二个‘分析’阶段中，组织样品一式三份地进行分析。来自未处理的大鼠的空白对照组织也如上所述进行处理(尽管一式三份)以提供本底校正。一般而言，来自树枝聚体给药的大鼠的均质化处理的组织以与上文筛选阶段中描述的那种相同的方式进行处理，除了采取另外的步骤以校正由于来自组织的“提取”过程在放射性计数效率(猝灭)中的任何减少。为了允许校正计数效率，来自处理大鼠的相同的第二组组织以相同方式进行处理，但在添加Soluene前最初用已知量的放射性标记的树枝聚体进行强化。组织用近似等价于在筛选样品中测量的那种(因此需要筛选数据)的水平的活性进行强化。处理效率随后如下进行计算，其中
效率＝(强化的组织DPM-组织DPM，uncorr)/强化的solnDPM  (1)
强化的组织DPM是在强化的样品中测量的质量校正的放射性，组织DPM，uncorr是在未添加另外的放射性强化的组织样品中质量校正的放射性，和强化的solnDPM是加入强化的样品中已知量的另外放射性。有效地，该计算提供了计数效率的指示，使用在每种组织中已知(强化的)量的放射性作为参考。
关于效率的这个值随后用于校正处理样品中的3H含量，其中
组织DPM，corr＝组织DPM，uncorr/效率  (2)
已知处理样品中存在的完整器官的质量分数，随后计算整个器官中的活性。结果表示为在处死时器官中的注射剂量的百分比，或注射剂量百分比/克组织。由于过程的变异性，可能不容易确定关于每种组织的LOQ。相反，导致超过20％的％CV的一式三份样品进行重复，或者当重现性数据无法获得时，分类为在可计量的水平下。
全血药代动力学
为了确定全血药代动力学，分别组的动物施用等量的树枝聚体溶液，并在与用于收集血浆相同的指定时间期限时将全血样品(150μl)收集到肝素化的Eppendorf管内。将每种血液样品的一式两份的等分试样(50μl)加入至2x 20ml闪烁瓶内。最初，1个小瓶未加处理，同时另一个用已知量(～300－600衰变数/分钟(DPM)待研究的树枝聚体)进行强化以提供全血计数效率数据(如上)。样品随后在4ml 1：1比率的Soluene-350和异丙醇中于60℃溶解过夜。随后使样品冷却，并在添加Starscint(12ml)前用200μl过氧化氢(30％w/v)进行漂白。样品随后在闪烁计数前在室温下放置24小时。得自血液样品的计数通过与如上所述对于强化的样品获得的数据比较就效率进行校正。
静脉内施用后血浆和全血中的3H-树枝聚体的药代动力学参数显示于表6中。
表6-以5mg/kg静脉内施用3H-树枝聚体后血浆和全血的药代动力学参数(均值±s.d.，n＝3)
树枝聚体 cp o(μg/ml) 起始k(h-1) 起始t1/2(分钟-1) Vc(ml)
血浆
BHALys[Lys]8[NH2]18 24.7±6.5 12.1±1.0 3.5±0.2 55.9±11.8
BHALys[Lys]16[NH2]32 8.4±2.2 9.5±0.1 4.4±0.4 163±34.6
BHALys[Lys]8[D-Lys]16[NH2]32 12.4±1.1 14.4±0.5 3.0±0.0 99.4±10.1
全血
BHALys[Lys]8[NH2]16 15.0±1.1 13.9±2.1 3.0±0.5 96.1±13.2
BHALys[Lys]16[NH2]32 8.8±3.4 11.7±2.5 3.7±0.7 190.4±82.2
尿和粪便
来自树枝聚体给药大鼠的尿经过3个时间间隔进行收集：给药后0-8小时，8-24小时和24-30小时。还收集得自给药前的每只大鼠的空白对照尿样品。将来自每个时间间隔的100μl等分试样的尿加入至1ml Starscint中，并使混合物在闪烁计数前进行涡旋。本底扣除后，样品的放射性标记含量就经过那个时间间隔收集的尿的总体积进行校正，并且转变成总施用的3H剂量百分比。
将粪便收集到预称重的小瓶内，并且在于60℃干燥前通过在MilliQ水中浸泡使样品均质化处理成浆。干燥粪便的6个重复样品(20mg)随后分成n＝3样品的2个组。一组样品无需进一步添加进行处理，和一组3个样品用已知量的放射性树枝聚体(约500DPM)进行强化，以提供粪便计数效率数据(如上)。样品随后使用由Lyons等人(2000)描述的方法进行溶解。简言之，将2ml Soluene加入至重新弄湿的粪便中，并且于60℃加热过夜。随后再加入2ml异丙醇并使样品再加热2小时。在添加12ml Starscint前，溶解的样品随后用400μl过氧化氢(30％w/v)进行漂白。样品随后在室温下放置4天，之后于4℃冷却24小时并于12℃后续闪烁计数。粪便中排泄的3H总量使用收集的粪便的总干重进行计算。关于测定法的LOQ假定为空白对照粪便中平均计数的3倍，因为产生的粪便团块广泛不同，并因此最小的可计量数目的计数的测定在某些样品团块中是不可能的。这些结果概括于表7中。
表7－在阳离子3H树枝聚体以5mg/kg静脉内施用后从大鼠中经过30小时的3H排泄(均值±s.d，n＝3)。
药代动力学计算
血浆/全血样品中的放射性标记的浓度使用放射性标记的树枝聚体的比活性转变成ng当量浓度。这些浓度在本文件自始至终已表示为ng当量/ml，然而，应说明的是这种方法假定3H放射性标记保持与完整的树枝聚体结合，这如下所述在某些情况下并非如此。
血浆浓度-时间曲线中的初始下降的速率通过在对数线性血浆浓度对时间点的起始相中至少3个点的线性回归进行估计。得自这些数据的速率常数已描述为‘消除’速率常数(K)，但可能不表示真实的终末消除速率常数，因为消除的迅速使得难以精确描述分布和消除事件。这个初始下降的半衰期由t1/2＝0.693/K进行估计。就一切情况而言，初始分布体积(VC)的评估由剂量/Cp°进行计算，其中Cp°是在t＝0时，即在2分钟输注完成时血浆中的浓度。数据的更详细的药代动力学评估，包括真实的清除速率常数和清除半衰期的鉴定是不可能的，由于来自血浆的非常快速的起始去除和在随后时间点上的不寻常的谱。
实施例6
关于来自实施例5的生物样品的尺寸排阻层析
几种方法用于研究血浆样品中存在的种类的大小。首先，粗尺寸分离通过从PD10凝胶过滤柱(Pharmacia)洗脱血浆样品和在重力下收集流分来执行。在这种方法中，在施加到预平衡的PD10柱顶端之前，血浆样品(500μl)用2ml PBS进行稀释。流分(500μl)人工收集到微量离心管，并在闪烁计数前将100μL等分试样加入至1mlStarscint中。溶于PBS的完整的树枝聚体和赖氨酸溶液也通过柱进行洗脱以表征纯组分的保留体积。
为了提供关于血浆中包含放射性标记的种类的大小的更多信息，与Waters 590HPLC泵(Millipore Corporation，Milford，MA，USA)偶联的分析型尺寸排阻柱(Superdex Peptide 10/300GL，AmershamBioscience)随后用于产生更精确的分离。血浆样品再次在等体积的PBS中进行稀释并将100μl混合物注入柱上。样品用包含0.3M NaCl的PBS(pH 3.5)以0.5ml/分钟进行洗脱，并且等分试样以1分钟间隔使用Gilson FC10流分收集器(John Morris Scientific Pty.Ltd.VIC，Australia)进行收集。等分试样随后与Starscint(3ml)混合，并通过液体闪烁进行分析以测定每种流分中的放射性。溶于PBS的完整的树枝聚体和赖氨酸溶液再次通过柱分开洗脱以表征其保留体积。树枝聚体和赖氨酸也在新鲜的肝素化血浆中温育1小时，并且树枝聚体或赖氨酸-血浆混合物通过SEC进行分析。进行这种分析以提供树枝聚体或赖氨酸与血浆组分的物理相互作用可能导致在血浆中产生高MW种类的可能性的指示。
为了获得存在于血浆中的高MW放射性标记种类的更佳分辨，样品还使用Superdex 75HR 10/30尺寸排阻柱进行分析。等分试样(0.5ml)再次以1分钟间隔进行收集，在Starscint(3ml)中进行稀释，并通过液体闪烁计数进行分析，以测定每种流分中的放射性。蛋白质标准用于组成标准曲线(线性R2＝0.9915)，这用于评估洗脱蛋白质的分子量。蛋白质洗脱在280nm处使用Waters 486UV检测器(MilliporeCorporation，Milford，MA，USA)进行监控。柱的空体积使用葡聚糖蓝2000进行测定。
实施例7
氚标记的阴离子树枝聚体的合成
BHALys[3H-Lys]16[CO-3,5-Ph(SO3Na)2]32的制备
将PyBOP(9.56g，18.37mmol)加入至溶于DMF/DMSO(1:1)(200mL)中的树枝聚体(BHALys[3H-Lys]16[NH2.TFA]32)(2.12g，0.27mmol)的搅拌溶液中。逐步加入溶于DMF/DMSO(1:1)(150mL)中的3,5-二磺基苯甲酸(5.39g，19.11mmol)和二异丙基乙胺(12.2mL，70.02mmol)溶液。形成粘性ppt。ppt被取出，再溶解于DMSO中，并送回反应中。混合物在rt下搅拌16小时。将反应混合物倾入水(3.5L)内并通过0.45微米滤器进行过滤。
纯化通过切向流过滤在Centramate(3K膜，2L样品库)上进行。用Milli-Q水(18L)初始洗涤后，渗余物用3等分试样的1M碳酸钠(100mL)进行洗涤，通过Milli-Q水洗涤(1L)分开，随后过滤继续直至滤液pH为中性(约20L)。渗余物在真空中进行浓缩并冷冻干燥，以产生作为灰白色固体(2.34g，61％)的所需产物。
1H nmr(300MHz，D2O)λ(ppm)：1.0-2.0(186H)；2.8-3.4(62H)；4.0-4.4(31H)；5.9(1H)；7.0-7.3(10H)；8.1-8.3(96H)。
LC/MS(离子配对)：ESI(-ve)m/z＝740.83((M-17H)17-)；699.94((M-18H)18-)；662.83((M-19H)19-)；629.99((M-20H)20-)；599.53((M-21H)21-)。数据使用最大熵计算进行解卷以产生MW＝12614(M-，以H形式)计算的(H形式)(C423H513N63O255S64)12612(M-)。Rf(分钟)＝3.14
CE(pH 3):98.6％Rf(分钟)＝10.97
CE(pH 9)：97.6％Rf(分钟)＝12.90
BHALys[3H-Lys]8[CO-4-Ph(SO3Na)]16的制备
将PyBOP(303mg，0.58mmol)加入至溶于DMF(5mL)中的树枝聚体(BHALys[3H-Lys]8[NH2.TFA]16)(68mg，17.3μmol)的搅拌溶液中。逐步加入溶于DMSO/DMF(5mL/10mL)中的4-磺基苯甲酸单钠盐(124mg，0.55mmol)和二异丙基乙胺(386μL，2.22mmol)溶液。混合物在rt下在氩下搅拌24小时，这之后倾入水(200mL)内并通过0.45微米滤器进行过滤。纯化通过切向流过滤在Minimate(1K膜，250mL样品库)上进行，其用水(1.5L)进行洗涤。来自渗余物的溶剂在压力下减少。将产物再溶解于水(5mL)中并使其经历尺寸排阻柱(LH20，洗脱剂：水)并收集1至8的流分。组合的流分在真空中进行浓缩，经过离子交换柱(69F，Na+)并冷冻干燥，以产生作为白色固体(20mg，22％)的所需产物BHALys[3H-Lys]8[CO-4-Ph(SO3Na)]16。
1H nmr(300MHz，D2O)λ(ppm)：1.0-1.9(90H，CH2)；2.8-3.3(30H，CH2)；4.0-4.4(15H，CH)；5.9(1H，CH)；7.0-7.2(10H，Ar-H)；7.5-7.8(64H，Ar-H)。
MS(直接输注)：ESI(-ve)m/z＝5406(M-H)-(M-，以钠的形式)
计算的(钠形式)(C215H257N31O79Na16S16)5404(M-)。
CE(pH 7)：91％Rf(分钟)＝10.51
BHALys[3H-Lys]16[CO-4-Ph(SO3Na)]32的制备
将PyBOP(448mg，0.86mmol)加入至溶于DMSO(8mL)中的树枝聚体(BHALys[3H-Lys]16[NH2.TFA]32)(100mg，13μmol)的搅拌溶液中。逐步加入溶于DMSO(12mL)中的4-磺基苯甲酸单钠盐(197mg，0.82mmol)和二异丙基乙胺(571μL，3.28mmol)溶液。混合物在rt下在氩下搅拌24小时。将反应混合物倾入水(200mL)内并通过0.45微米滤器进行过滤。纯化通过切向流过滤在搅拌池(5K膜，250mL样品库)上进行，其用水(1.5L)进行洗涤。来自渗余物的溶剂在压力下减少。将产物再溶解于水(5mL)中，经过离子交换柱(69F，Na+)并冷冻干燥，以产生作为白色固体(89mg，65％)的所需产物BHALys[Lys]16[CO-4-Ph(SO3Na)]32。
1H nmr(300MHz，D2O)λ(ppm)：1.0-1.9(186H，CH2)；2.8-3.2(62H，CH2)；4.0-4.4(31H，CH)；5.9(1H，CH)；7.0-7.2(10H，Ar-H)；7.5-7.8(128H，Ar-H)。
MS(直接输注)：ESI(-ve)m/z＝10756(M-H)-(M-，以钠的形式)
计算的(钠形式)(C423H481N63O159Na32S32)10754(M-)。
CE(pH 9)：98％Rf(分钟)＝12.17
BHALys[3H-Lys]16[COCH2CH2(CO2Na)]32的制备
将琥珀酐(26mg，0.26mmol)加入至溶于DMF(5mL)中的树枝聚体(BHALys[3H-Lys]16[NH2.TFA]32)(32mg，4.1umol)和三乙胺(36uL，0.26mmol)的搅拌溶液中。混合物在rt下在氩下搅拌24小时。将反应混合物倾入水(50mL)内并通过0.45微米滤器进行过滤。纯化通过切向流过滤在Minimate(1K膜，70mL样品库)上进行。用NaHCO3(sat)(100mL)初始洗涤后，渗余物用水(1.5L)进行洗涤。来自渗余物的溶剂在压力下减少。将产物再溶解于水(2mL)中，经过离子交换柱(69F，Na+)并冷冻干燥，以产生作为白色固体(17mg，52％)的所需产物BHALys[3H-Lys]16[COCH2CH2(CO2Na)]32。
1H nmr(300MHz，D2O)λ(ppm)：1.0-1.8(186H，CH2)；2.3-2.7(128H，CH2)；2.9-3.2(62H，CH2)；4.0-4.2(31H，CH)；6.0(1H，CH)；7.1-7.3(10H，Ar-H)。
MS(直接输注)：ESI(-ve)m/z＝7360(M-H)-(M-，以H的形式)
计算的(H形式)(C327H513N63O127)7359(M-)。
CE(pH 9)：96％Rf(分钟)＝13.02
表8－树枝聚体性质
实施例8
阴离子树枝聚体的血浆清除率和生物分布研究
这项研究中使用的方法与实施例5中使用的那些相同。
对大鼠5mg/kg IV给药后BHALys[Lys]8[CO-4-Ph(SO3Na)]16(实心圆圈)、BHALys[Lys]16[CO-4-Ph(SO3Na)]32(空心圆圈)和BHALys[Lys]16[CO-3,5-Ph(SO3Na)2]32(三角)的血浆浓度-时间谱在图10中图解说明。
表9－关于阴离子树枝聚体在IV给药后的血浆药代动力学参数
表10－阴离子树枝聚体对大鼠IV给药后根据时间在尿中排泄的注入的3H％
BHALys[Lys]8[CO-4-Ph(SO3Na)]16(黑色)，BHALys[Lys]16[CO-4-Ph(SO3Na)]32(浅灰)，BHALys[Lys]16[CO-3,5-Ph(SO3Na)2]32(深灰色)或BHALys[Lys]16[CO-CH2CH2(CO2Na)]32(白色)对大鼠IV给药后30小时注入的3H的生物分布在图11中图解说明。小图A－呈现的注入的3H％/器官。小图B－呈现的注入的3H％/克组织。
实施例9
关于来自实施例8的生物样品的尺寸排阻层析
这项研究中使用的方法与用于实施例6的相同。
在血浆和尿中的BHALys[Lys]16[CO-4-Ph(SO3Na)]32和BHALys[Lys]16[CO-3,5-Ph(SO3Na)2]32在superdex 75柱上的尺寸排阻谱在图12中图解说明。
实施例10
氚标记的PEG树枝聚体的合成
BHALys[3H-Lys]8[PEG200]16的制备
向溶于DMF(8mL)的BHALys[3H-Lys]8[NH2.TFA]16(125mg，0.03mmol)的搅拌溶液中加入PyBOP(556mg，1.0mmol)，随后加入溶于DMF(16mL)和DMSO(2mL)的PEG 200(240mg，1.0mmol)、N,N-二异丙基乙胺(709μL，4.0mmol)溶液。混合物在室温下搅拌16小时。将反应混合物倾入水(180mL)内，并且进行过滤并用水进行洗涤。将水溶液转移至3K搅拌池并使水经过池，剩余水通过冷冻干燥去除，以产生作为自由流动的白色固体(20mg，11％)的BHALys[3H-Lys]8[PEG200]16。
LC/MS(Philic TFA)：Rf(分钟)＝16.72.ESI(+ve)m/z＝5598(M+H+)。
BHALys[3H-Lys]16[PEG200]32的制备
在氩下向溶于DMF(3mL)的BHALys[3H-Lys]16[NH2.TFA]32(30mg，0.004mmol)的搅拌溶液中加入PyBOP(142mg，0.271mmol)，随后加入溶于DMF(3mL)的PEG 200(62mg，0.263mmol)、N,N-二异丙基乙胺(182μL，1.04mmol)溶液。混合物在室温下搅拌16小时。溶剂在减压下去除，并将所得到的粗混合物溶解于最小体积的水中。使用水作为洗脱剂通过sephadex柱(LH-20)纯化产生在通过冷冻干燥去除水后作为白色固体(20mg，44％)的所需产物BHALys[3H-Lys]16[PEG200]32。
LC/MS(Philic TFA)：Rf(分钟)＝16.74ESI(+ve)m/z＝11,141(M+H+)。
BHALys[3H-Lys]16[PEG570]32的制备
在氮下向溶于干DMF(2mL)的BHALys[3H-Lys]16[NH2.TFA]32(20mg，0.003mmol)的搅拌溶液中加入三乙胺(36μL，0.261mmol)和PEG 685.75、NHS酯(119mg，0.174mmol)。混合物在室温下搅拌16小时。将溶液倾入5K搅拌池内并使水(600mL)经过池，剩余水通过冷冻干燥(x2)去除，以产生作为玻璃状固体(50mg，88％)的BHALys[3H-Lys]16[PEG570]32。LC(Philic TFA)：Rf(分钟)12.42。
BHALys[3H-Lys]8[PEG2KD]16的制备
在氮下向溶于干DMF(2mL)的BHALys[3H-Lys]8[NH2.TFA]16(30mg，0.008mmol)的搅拌溶液中加入PyBOP(141mg，0.271mmol)，随后加入溶于DMF(1.4mL)和DMSO(0.6mL)的PEG 2000、NHS酯(612mg，0.306mmol)、N,N-二异丙基乙胺(182μL，1.04mmol)溶液。混合物在室温下搅拌16小时。将反应混合物倾入10K搅拌池内并使水(800mL)经过池，剩余水通过冷冻干燥去除，以产生作为自由流动的白色固体(149mg，54％)的BHALys[3H-Lys]8[PEG2KD]16。
BHALys[3H-Lys]16[PEG2KD]32的制备
在氮下向溶于干DMF(2mL)的BHALys[3H-Lys]16[NH2.TFA]32(30mg，0.004mmol)的搅拌溶液中加入PyBOP(142mg，0.272mmol)，随后加入溶于DMF(3mL)和DMSO(1mL)的PEG 2000、NHS酯(522mg，0.261mmol)、N,N-二异丙基乙胺(182μL，1.04mmol)溶液。溶液在室温下搅拌16小时。将反应混合物倾入水内，并且进行过滤并用水进行洗涤。纯化通过切向流过滤在Mini-mate(10K膜，2L水)上进行。溶剂通过冷冻干燥去除，以产生作为自由流动的白色固体(210mg，76％)的BHALys[3H-Lys]16[PEG2KD]32。
LC/MS(Philic TFA)：Rf(分钟)＝16.29ESI(+ve)m/z＝67,696(M+H+)
表11－树枝聚体性质
实施例11
PEG树枝聚体的血浆清除率和生物分布研究
这项研究中使用的方法与实施例5中使用的那些相同。
表12－树枝聚体药代动力学参数
关于BHALys[Lys]16[PEG200]32(实心圆圈)、BHALys[Lys]16[PEG570]32(空心圆圈)、BHALys[Lys]8[PEG2000]16(实心三角)和BHALys[Lys]16[PEG2000]32(空心三角)的血浆浓度-时间谱在图13中图解说明。关于BHALys[Lys]8[PEG200]16的数据未显示，因为清除是非常快速的并被关于BHALys[Lys]16[PEG200]32的数据弄混。
IV给药后的BHALys[Lys]16[PEG2000]32(黑色柱，7天)、BHALys[Lys]8[PEG2000]16(灰色柱，5天)和BHALys[Lys]16[PEG570]32(白色柱，30小时)的生物分布在图14中图解说明。
实施例12
关于来自实施例11的生物样品的尺寸排阻层析
这项研究中使用的方法与用于实施例6的相同。
在Superdex 75柱上5mg/kg IV给药后在血浆中关于3H标记的BHALys[Lys]16[PEG200]32(小图A；t0，空心方块，t＝1小时，实心圆圈，t＝4小时，空心圆圈)、BHALys[Lys]16[PEG570]32(小图B；24小时)、BHALys[Lys]8[PEG2000]16(小图C；48小时)、和BHALys[Lys]16[PEG2000]32(小图D；48小时)的尺寸排阻谱在图15A－D中图解说明。
在BHALys[Lys]16[PEG200]32(小图A；0－4小时尿，实心圆圈，8－24小时尿，空心圆圈)和BHALys[Lys]16[PEG570]32(小图B；8－24小时尿)IV给药后在尿中排泄的3H的尺寸排阻谱在图16A和B中图解说明。箭头指示完整的树枝聚体的保留时间。
概述
本申请人已进行了3H标记的聚L-赖氨酸树枝聚体(其中BHALys[Lys]8[NH2]16或BHALys[Lys]16[NH2]32已进行制备和表面未被封端)的研究。通过比较，还已检查了第三种树枝聚体，其由用D-赖氨酸完全封端的BHALys[Lys]8[NH2]16核组成，在其外层上与D-赖氨酸形成Lys16树枝聚体BHALys[Lys]8[D-Lys]16[NH2]32。
就一切情况而言，树枝聚体在生理学pH下用阳离子胺基进行覆盖。测定关于这些材料的血浆清除率和生物分布(实施例5)。3H树枝聚体的体内命运通过使用尺寸排阻层析法分开血浆中存在的不同放射性标记的种类进行进一步研究(实施例6)。数据暗示聚L赖氨酸树枝聚体在静脉内施用后从血浆中快速去除，但随后进行代谢和释放的L-赖氨酸重新掺入内源性再合成过程内。
静脉内施用后，BHALys[Lys]8[NH2]16和BHALys[Lys]16[NH2]32从血浆中非常快速地被去除，显示小于10分钟的起始血浆半衰期(图2)。这种起始的快速丧失不显著依赖剂量(图3)，并且当检查全血(与血浆相反)谱时(图4)，以及当L-赖氨酸表面基团变成D-赖氨酸时(图5)，同样很明显。对于这些相对高分子量的种类，初始分布体积(Vc)令人惊讶地很高，和更高分子量的第4代树枝聚体BHALys[Lys]16[NH2]32和BHALys[Lys]8[D-Lys]16[NH2]32的Vc高于更小的第3代比较物。因此，关于第3和4代树枝聚体的Vc值看起来与表面电荷，而不是分子量更加高度相关。数据与初始‘分布’过程一致，反映聚阳离子树枝聚体在由静电相互作用驱动的过程中与血管内皮的快速结合，导致从循环血浆中丧失。与之对比，一般的外渗过程看起来不太可能，因为快速穿过血管内皮对于此类高度带电的大分子将是很难的，并且将预期伴随分子量和表面电荷中的减少而增加－而事实上观察到的正好相反。这些趋势在全血药代动力学中也很明显，尽管在更小的树枝聚体的情况下，Cp°值低约2倍(和相应的Vc值高2倍)，暗示树枝聚体与红血细胞的结合对于较不高度带电的第3代树枝聚体更低。
总之，目前数据已显示未封端的聚L-赖氨酸树枝聚体在静脉内注射后从血浆中快速去除，并且在随后的时间点上，与完整的树枝聚体初始结合的放射性标记与种类结合再出现在血浆中，所述种类在SEC上与游离赖氨酸和许多较大分子量(可能是类似蛋白质的)的材料包括白蛋白共洗脱。数据还指出高度带电的阳离子树枝聚体在注射后立刻与内皮细胞表面快速结合，并且随后进行水解以产生循环游离赖氨酸，其自身最终重新掺入蛋白质生物合成途径内。据我们所知，这些数据首次描述了聚L-赖氨酸树枝聚体的体内生物降解和再吸收。因此聚L-赖氨酸树枝聚体的表面性质的合适处理可以增强在血浆中的初始停留时间。未封端的聚L-赖氨酸树枝聚体表面因此可以提供基于生物可降解的和生物可吸收的树枝聚体的药物递送系统。
分开的研究已调查了用阴离子芳基磺酸盐基团或烷基羧化物基团对聚L-赖氨酸树枝聚体核的表面封端在给大鼠静脉内施用后对树枝聚体药代动力学和生物分布模式的影响。
在外层分别用苯磺酸盐(CO-4-Ph(SO3Na))或苯二磺酸盐(CO-3,5-Ph(SO3Na)2)末端基团封闭顶端的、具有8和16个赖氨酸基团的2种不同大小的树枝聚体核BHALys[Lys]8[NH2]16和BHALys[Lys]16[NH2]32用于促进树枝聚体大小和表面电荷的影响的区别(合成实施例7)。4种氚标记的赖氨酸树枝聚体BHALys[Lys]8[CO-4-Ph(SO3Na)]16；BHALys[Lys]16[CO-4-Ph(SO3Na)]32；BHALys[Lys]16[CO-3,5-Ph(SO3Na)2]32和BHALys[Lys]16[CO-CH2CH2(CO2Na)]32进行静脉内施用(5mg/kg)，并且在血浆、尿和粪便中的放射性经过30小时的监控(实施例8)。动物在给药后30小时被处死，并且取出主要器官、均质化处理并就放射性标记进行测定。
血浆浓度-时间谱表明BHALys[Lys]8[CO-4-Ph(SO3Na)]16的血浆清除率和分布体积高于Lys16树枝聚体的血浆清除率和分布体积，尽管关于所有4种树枝聚体的清除半衰期是基本上相同的(约1小时)。约30％注入的与BHALys[Lys]8[CO-4-Ph(SO3Na)]16和BHALys[Lys]16[CO-4-Ph(SO3Na)]32树枝聚体结合的放射性标记在给药后30小时的时期中被排泄到尿中，而经过相同时间段仅3％剂量的高度带电的BHALys[Lys]16[CO-3,5-Ph(SO3Na)2]32被清除到尿内。
关于琥珀酸盐树枝聚体的清除谱明显不同于其他阴离子树枝聚体的清除谱，并且琥珀酸盐树枝聚体在静脉内注射后从血浆中非常快速地被去除。初始分布体积(Vc)也高于其他阴离子树枝聚体的初始分布体积，并且接近阳离子树枝聚体的初始分布体积，暗示与血液组分或内皮表面的初始相互作用，该相互作用从血浆中快速清除放射性标记(图4)。在血浆中经过前20分钟的初始丧失速率也是非常快速的，并再次经过与阳离子树枝聚体可见的那种相似的时间尺度发生。初始快速下降后，放射性标记似乎更慢地被清除，在给药后30小时仍存在可计量的放射性标记量。第二种较慢的清除速率是否反映标记重新分布到血浆内(如先前用阳离子系统可见的)是未知的。阴离子树枝聚体似乎从红细胞中几乎被完全排除。与其他阴离子树枝聚体形成对比，大多数注入的与琥珀酸盐树枝聚体结合的放射性标记被排泄到尿中(63.71±8.98％)，而非常小但可计量的放射性标记量在合并的粪便中被回收(1.21±0.97％)(表3)。
来自BHALys[Lys]16[CO-4-Ph(SO3Na)]32和BHALys[Lys]16[CO-3,5-Ph(SO3Na)2]32给药的大鼠的血浆样品的尺寸排阻层析揭示2种阴离子树枝聚体都与血浆组分快速结合，形成高分子量种类(<67kDa)。尽管在血浆中未鉴定到分解产物，但在尿中的放射性标记主要与具有近似于Lys-芳基磺酸盐单体的分子量的种类结合。有趣的是在尿中的放射性标记经过其间血浆放射性水平极低的时间尺度(给药后8－24小时)被大部分排泄。器官沉积模式揭示在每种树枝聚体给药后30小时存在的残留的放射性主要集中在肝、脾和肾中。对于BHALys[Lys]16[CO-3,5-Ph(SO3Na)2]32回收的放射性在肝中特别高(剂量的～50％)。数据表明在苯磺酸盐树枝聚体从血浆中清除后，代谢发生，其随后促进分解产物的尿清除。与之对比，在尿中源自BHALys[Lys]16[CO-3,5-Ph(SO3Na)2]32的放射性的低回收可能反映对代谢减少的敏感性，可能是由树枝聚体增加的表面电荷密度造成的，这依次导致在肝中较高的回收。
因此，阴离子树枝聚体的血浆清除率比先前对于未封端的阳离子聚L-赖氨酸树枝聚体见到的血浆清除率慢。其次，在阴离子系列内，血浆清除率主要由树枝聚体大小而不是表面电荷指示。然而，最后，表面电荷的确指示肾清除和生物分布的模式，并且可能起因于苯磺酸盐对苯二磺酸盐封端的树枝聚体的代谢敏感性中的差异。
PEG化已知减少蛋白质被蛋白水解酶识别并抑制蛋白质和胶体的吞噬细胞性清除，由此延长血浆循环时间。像这样在本申请中，PEG化(合成实施例10)对3H标记的聚L-赖氨酸树枝聚体的血浆谱、生物分布模式和尿清除的影响已在静脉内施用5mg/kg树枝聚体后在大鼠中进行研究(PK和生物分布实施例11)。一般而言，PEG化的树枝聚体的血浆半衰期和尿清除程度依赖于分子量，并且较大的PEG化的树枝聚体(即>30kDa)相对较慢地从血浆中清除(t1/21－3天)，而较小的种类(即<20kDa)从血浆中快速地清除到尿内(t1/21－10小时)。较大的树枝聚体似乎最终集中在网状内皮系统的器官(肝和脾)中，然而，这经过延长的时间段发生，且积聚的绝对程度很低(<10％的剂量)。通过SEC，用最小的(200Da)PEG链衍生的树枝聚体显示与血浆组分相互作用的某些迹象，导致明显更高的分子量种类的产生，然而，清除到尿内是非常迅速的并且在尿中仅回收到完整的树枝聚体。用较大的PEG化的种类(即2000Da)衍生的树枝聚体作为亲本(未改变的)树枝聚体存在于血浆和尿中。因此PEG化的聚L-赖氨酸树枝聚体复合物的大小可以进行处理，以最佳地适合其药代动力学。
有差别地受保护的中间产物和部分PEG结构的例子
实施例15
BHALys[Lys]8[α-Boc]8[ε-NH2]8的制备
i.BHALys[Lys]8[α-Boc]8[ε-CBz]8的制备
向BHALys[Lys]4[NH2.TFA]8(1.59mmol)、三乙胺(4.50ml，32.30mmol)和DMF(30ml)的磁力搅拌溶液中加入作为固体的PNPO-α-Boc-ε-CBz-Lys(7.75g，15.45mmol)，并且以一份在室温下。反应悬浮液在颜色方面立刻变成亮黄色，并且在搅拌ca.5分钟后活性酯已完全溶解。搅拌在室温下再继续22小时。将粗反应混合物倾入包含冰水的大烧瓶内，并形成精细的黄沉淀物。悬浮液进行过滤并且因此保留的固体在抽吸下过夜风干。将产生的干燥的、淡黄色的有色团块粉碎成细碎粉末并重悬于乙腈中。悬浮液在室温下搅拌30分钟随后进行过滤。保留的固体再次进行风干，再次粉碎并重悬于乙腈中，之后进行过滤和过夜风干，以产生作为无色固体(5.52g，87％)的BHALys[Lys]8[α-Boc]8[ε-CBz]8t。
LC/MS(Phobic/TFA)：观察到的ESI(+ve)[M+H/3]+m/z＝1328；对于C207H305N31O47计算的3979.9；Rf(分钟)＝20.22分钟。
ii.BHALys[Lys]8[α-Boc]8[ε-NH2]8的制备
将BHALys[Lys]8[α-Boc]8[ε-CBz]8(500mg，0.126mmol)悬浮于9:1DMF/H2O(12.5ml)中，并加入甲酸铵(127mg，2.01mmol)，并且在搅拌5分钟后，加入Pd/C(10％w/w，266mg)并继续搅拌2小时。反应通过过滤掉催化剂而终止，并且滤器用9:1DMF/H2O(10ml)随后为水(2ml)进行冲洗。组合的滤液在真空中进行浓缩以产生无色糖浆，其用水(10ml)进行处理，所述水在真空中被去除，随后在水中冷冻干燥，以产生作为精细白色亲液胶体盐(lyophilate)(155mg，42％)的BHALys[Lys]8[α-Boc]8[ε-NH2]8。
LC/MS(亲水的/TFA)：ESI(+ve)m/z＝969.83[M+3H]/3+，727.67[M+4H]/4+，582.39[M+5H]/5+；计算的(C143H257N31O31)2906.8g/mol。数据使用转化计算进行解卷以产生mw＝2906.5。Rf(分钟)＝14.7。
实施例16
BHALys[Lys]8[α-NH2.TFA]8[ε-NH2]8的制备
将BHALys[Lys]8[α-Boc]8[ε-CBz]8(1000mg，0.251mmol)悬浮于乙酸(5.5ml)中，并在0℃下进行搅拌，同时逐滴加入三氟乙酸(5.5ml)。允许反应化合物加温至室温并搅拌17小时，在这时在二乙醚中对反应化合物进行研磨。所得到的悬浮液搅拌10分钟，并且通过离心和倾析去除液体。剩余的沉淀物通过与二乙醚一起搅拌10分钟进行洗涤，其再次通过离心和倾析来去除，随后使沉淀物在真空中进行干燥，溶解于水中并冷冻干燥，以产生作为白色粉末(840mg，105％)的BHALys[Lys]8[α-NH2.TFA]8[ε-CBz]8。
LC/MS(亲水的/TFA)：ESI(+ve)m/z＝1060.70[M+3H]/3+，795.51[M+4H]/4+，636.30[M+5H]/5+；计算的(C167H241N31O31)3178.95g/mol。数据使用转化计算进行解卷以产生mw＝3178.0。Rf(分钟)＝19.1。
实施例17
BHALys[Lys]16[α-Boc]16[ε-NH2]16的制备
i.BHALys[Lys]16[α-Boc]16[ε-CBz]16的制备
向BHALys[Lys]4[NH2.TFA]16(0.81mmol)、三乙胺(4.50ml，32.30mmol)和DMF(30ml)的搅拌溶液中加入作为固体的PNPO-α-Boc-ε-CBz-Lys(7.94g，15.83mmol)，并且以一份在室温下。反应悬浮液在颜色方面立刻变成亮黄色，并且在搅拌ca.5分钟后活性酯已完全溶解。搅拌在室温下再继续22小时。将粗反应混合物倾入包含冰水的大烧瓶内，并形成精细的黄沉淀物。悬浮液进行过滤并且因此保留的固体在抽吸下过夜风干。将产生的干燥的、淡黄色的有色团块粉碎成细碎粉末并重悬于乙腈中。悬浮液在室温下搅拌30分钟随后进行过滤。保留的固体过夜风干，以产生作为无色固体的BHALys[Lys]16[α-Boc]16[ε-CBz]16(5.79g，91％)。
LC/MS(Phobic/TFA)：观察到的ESI(+ve)[M+H/4]+m/z＝1977；对于C407H609N63O95计算的7904.9[M+H/5]+m/z＝1582；Rf(分钟)＝23.51分钟。
ii.BHALys[Lys]16[α-Boc]16[ε-NH2]16的制备
BHALys[Lys]16[α-Boc]16[ε-CBz]16(50mg，0.006mmol)、10％Pd/C(53mg)和乙酸(2ml)的悬浮液在氮下在室温下剧烈搅拌16小时。黑色悬浮液进行过滤。滤液在真空中浓缩提供作为淡黄色油的产物(26mg，71％)。
LC/MS(Phobic/TFA)：观察到的ESI(+ve)[M+H/5]+m/z＝1152；[M+H/6]+m/z＝961；[M+H/7]+m/z＝824；[M+H/8]+m/z＝721；对于C279H513N63O63计算的5758.53[M+H/9]+m/z＝641；Rf(分钟)＝2.37分钟。
实施例18
BHALys[Lys]16[α-NH2.TFA]16[ε-CBz]16的制备
将BHALys[Lys]16[α-Boc]16[ε-CBz]16(1000mg，0.127mmol)悬浮于乙酸(5.5ml)中，并在0℃下进行搅拌，同时逐滴加入三氟乙酸(5.5ml)。允许反应化合物加温至室温并搅拌17小时。在二乙醚(150ml)中对反应化合物进行研磨，并将所得到的悬浮液搅拌10分钟。通过离心(4000rpm，10分钟)和倾析去除液体，并且剩余的沉淀物通过与二乙醚(150ml)一起搅拌10分钟进行洗涤，其再次通过离心和倾析来去除。随后使沉淀物在真空中进行干燥，溶解于水(50ml)中并冷冻干燥，以产生作为白色粉末(832mg，114％)的BHALys[Lys]16[α-NH2.TFA]16[ε-CBz]16。
LC/MS(亲水的/TFA)：ESI(+ve)m/z＝1576.85[M+4H]/4+，1261.34[M+5H]/5+，1051.27[M+6H]/6+,901.15[M+7H]/7+；计算的(C327H481N63O63)6302.83g/mol。数据使用转化计算进行解卷以产生mw＝6301.5。Rf(分钟)＝19.0。
实施例19
BHALys[Lys]8[α-NH2]8[ε-Boc]8的制备
i.BHALys[Lys]8[α-CBz]8[ε-Boc]8的制备
向BHALys[Lys]4[NH2.TFA]8(1.59mmol)、三乙胺(4.40ml，31.57mmol)和DMF(32ml)的磁力搅拌溶液中加入作为固体的PNPO-α-CBz-ε-Boc-Lys(7.69g，15.33mmol)，并且以一份在室温下。反应悬浮液在颜色方面立刻变成亮黄色，并且在搅拌ca.5分钟后活性酯已完全溶解。搅拌在室温下再继续19小时。将粗反应混合物倾入包含乙腈(ca.300ml)的大烧瓶内。悬浮液进行过滤并且因此保留的固体在抽吸下过夜风干。将产生的干燥的、淡黄色的有色团块粉碎成细碎粉末(研钵和研棒)并重悬浮于乙腈(400ml)中。悬浮液在室温下磁力搅拌60分钟随后进行过滤。保留的固体再次进行风干，再次粉碎并重悬浮于乙腈中，之后进行过滤和过夜风干，以产生作为灰白色固体的BHALys[Lys]8[α-CBz]8[ε-Boc]8(5.41g，85％)。
LC/MS(Phobic/TFA/Speedy Ramp)：观察到的ESI(+ve)[M+H/3]+m/z＝1328；对于C207H305N31O47计算的3979.9；Rf(分钟)＝12.98分钟
ii.BHALys[Lys]8[α-NH2]8[ε-Boc]8的制备
将BHALys[Lys]8[α-CBz]8[ε-Boc]8(5.0mg，1.26μmol)悬浮于9:1DMF/H2O(2ml)中，在环境温度下搅拌，并加入甲酸铵(2.5mg，40.2μmol)，随后加入Pd/C(10％w/w，2.7mg)并继续搅拌20小时。反应通过过滤掉催化剂而终止，并且滤器用9:1DMF/H2O(1ml)进行冲洗。滤液在真空中进行浓缩以产生无色糖浆，其用水(1ml)进行处理，所述水在真空中被去除，随后在水(1ml)中冷冻干燥，以产生作为精细白色lyophilate(2mg，42％)的BHALys[Lys]8[α-NH2]8[ε-Boc]8。
LC/MS(亲水的/TFA)：ESI(+ve)m/z＝969.88[M+3H]/3+，727.56[M+4H]/4+；计算的(C143H257N31O31)2906.8g/mol。数据使用转化计算进行解卷以产生mw＝2906.5。Rf(分钟)＝17.2。
实施例20
BHALys[Lys]8[α-CBz]8[ε-NH2.TFA]8的制备
将BHALys[Lys]8[α-CBz]8[ε-Boc]8(20.0mg，0.005mmol)悬浮于乙酸(109μl)中并在水浴中进行搅拌。小心地加入三氟乙酸(109μl)，以溶解所有固体材料，并继续在环境温度下搅拌16小时。反应通过在真空中去除所有挥发物而终止，产生澄清的、无色油。在二乙醚中对这种油进行研磨，并且所得到的白色沉淀物用二乙醚进行洗涤，并在真空中干燥，以产生作为白色固体的BHALys[Lys]8[α-CBz]8[ε-NH2.TFA]8(12.1mg，76％)。
LC/MS(亲水的/TFA)：ESI(+ve)m/z＝1060.43[M+3H]/3+，795.63[M+4H]/4+，636.79[M+5H]/5+；计算的(C167H241N31O31)3178.95g/mol。数据使用转化计算进行解卷以产生mw＝3179.25。Rf(分钟)＝16.6。
实施例21
BHALys[Lys]16[α-NH2]16[ε-Boc]16的制备
i.BHALys[Lys]16[α-Fmoc]16[ε-Boc]16的制备
向BHALys[Lys]8[NH2.TFA]16(0.54mmol)、DIPEA(3.0ml，17.22mmol)和DMF(11ml)的搅拌溶液中加入作为固体的五氟苯氧基-α-Fmoc-ε-Boc-Lys(6.58g，10.36mmol)，并且以一份在室温下。反应悬浮液在颜色方面立刻变成亮黄色，并且在搅拌ca.10分钟后活性酯已完全溶解。搅拌在室温下再继续18小时。这之后，粗反应混合物已变得如此粘稠使得磁力搅拌无法再继续。向反应烧瓶中加入乙腈(ca.300ml)，并借助于抹刀将固体团块充分打碎以便允许搅拌继续(1小时)。将悬浮液过滤并允许在真空下过夜风干。所得到的接近无色的团块用研钵和研棒粉碎，并将精细固体并重悬于乙腈(500ml)中2小时。这之后将悬浮液过滤并且收集无色固体并在rt下过夜风干。所需产物作为灰白色固体(4.72g，94％)获得。这种产物表征为Fmoc脱保护的衍生物BHALys[Lys]16[α-NH2]16[ε-Boc]16(参见ii)。
ii.BHALys[Lys]16[α-NH2]16[ε-Boc]16的制备
以一份在室温下向BHALys[Lys]16[α-Fmoc]16[ε-Boc]16(1.0g，0.108mmol)和DMF(10ml)的磁力搅拌悬浮液中加入纯哌啶(1ml，10.11mmol)。悬浮液再搅拌17小时，这之后，粗反应混合物变成淡黄色溶液。混合物在减压下进行浓缩，以提供灰白色固体，所述灰白色固体随后悬浮于二乙醚(ca.100ml)中。在室温下搅拌30分钟后，悬浮液进行过滤，并且收集的固体进行过夜风干。所需产物作为无色固体(0.60g，97％)获得。
LC/MS(Phobic/TFA)：观察到的ESI(+ve)[M+H/4]+m/z＝1441；[M+H/5]+m/z＝1153；
[M+H/6]+m/z＝961；对于C279H513N63O63计算的5758.5；Rf(分钟)＝2.95分钟。
实施例22
BHALys[Lys]16[α-Boc]16[ε-NH2Boc]16的制备
BHALys[Lys]16[α-Boc]16[ε-Fmoc]16的制备和BHALys[Lys]16[α-Boc]16[ε-Fmoc]16的制备
在氮下以逐滴的方式向BHALys[Lys]16[α-CBz]16[ε-Boc]16(0.01mmol)和二氯甲烷(0.5ml)的搅拌混合物中加入纯TFA(0.5ml)。搅拌在室温下继续18小时。挥发性反应组分在真空中去除，并且获得的粘性残渣用二乙醚进行处理以诱导盐产物的沉淀。悬浮液进行过滤并且收集的固体用二乙醚进行洗涤。将获得的固体溶解于水中并通过冷冻干燥过夜浓缩至干燥。产物作为絮状、无色固体获得。
LC/MS(亲水的/TFA)：观察到的ESI(+ve)[M+H/4]+m/z＝1577；[M+H/5]+m/z＝1262对于C327H481N63O63计算的6302.8
实施例23
BHALys[Lys]16[α-CBz]16[ε-NH2.TFA]16的制备
在氮下以逐滴的方式向BHALys[Lys]16[α-CBz]16[ε-Boc]16(0.01mmol)和二氯甲烷(0.5ml)的搅拌混合物中加入纯TFA(0.5ml)。搅拌在室温下继续18小时。挥发性反应组分在真空中去除，并且获得的粘性残渣用二乙醚进行处理以诱导盐产物的沉淀。悬浮液进行过滤并且收集的固体用二乙醚进行洗涤。将获得的固体溶解于水中并通过冷冻干燥过夜浓缩至干燥。产物作为絮状、无色固体获得。
LC/MS(亲水的/TFA)：观察到的ESI(+ve)[M+H/4]+m/z＝1577；[M+H/5]+m/z＝1262对于C327H481N63O63计算的6302.8
实施例24
BHALys[Lys]16[α,α-Boc]8[α,ε-Boc]8[ε,α-Boc]8[ε,ε-CBz]8的制备
i.BHALys[Lys]8[ε-CBz]8[α-Lys]8[Boc]16的制备
将DBL-OPNP(3.6g，7.2mmol)和三乙胺(2.1mL，15mmol)加入至溶于DMF(30mL)的BHALys[Lys]8[ε-CBz]8[α-NH2.TFA]8(3g，0.75mmol)的搅拌溶液中。所得到的黄色溶液在室温下搅拌16小时。将反应混合物加入至搅拌的乙腈(300mL)中，产生在黄色溶液中的白色沉淀物。这种沉淀物通过过滤进行收集，并用乙腈进行洗涤以去除残留的有色材料。沉淀物随后在真空下在室温下进行干燥，以提供作为白色固体(4.2g，98％)的BHALys[Lys]8[ε-CBz]8[α-Lys]8[Boc]16。
LC/MS(快速疏水的/TFA)：Rf(分钟)＝13.70；ESI(+ve)m/z＝1936([M+3]/3)，1452([M+4]/4)，1062([M+5-Boc]/5).；Calc.C295H465N47O71.M+1.5083.4
ii.BHALys[Lys]8[ε-NH2]8[α-Lys]8[Boc]16的制备
向溶于乙酸(30mL)的BHALys[Lys]8[ε-CBz]8[α-Lys]8[Boc]16(2.2g，0.38mmol)的搅拌溶液中加入10％Pd/C(101mg，0.095mmol)。所得到的均质混合物在室温下在氮下16小时。溶液进行过滤并且在真空中进行浓缩。将所得到的粘性残渣重溶解于水中并冷冻干燥，以通过包含少许乙酸残渣的BHALys[Lys]8[ε-NH2]8[α-Lys]8[Boc]16(1.97g，0.38mmol)。
LC/MS(亲水的/TFA)：Rf(分钟)＝18.53；ESI(+ve)m/z＝1184([M+4]/4)，947([M+5]/5)，790([M+6]/6).；Calc.C231H417N47O55.M+1.4731.1
iii.BHALys[Lys]16[α,α-Boc]8[α,ε-Boc]8[ε,α-Boc]8[ε,ε-CBz]8的制备
将PNPO-α-Boc-ε-CBz-Lys(90mg，0.18mmol)和三乙胺(0.05mL，0.35mmol)加入至溶于DMF(10mL)的BHALys[Lys]8[ε-NH2]8[α-Lys]8[Boc]16(90mg，0.019mmol)的搅拌溶液中。所得到的黄色溶液在室温下搅拌16小时。将反应混合物加入至搅拌的乙腈(100mL)中，产生在黄色溶液中的白色沉淀物。这种沉淀物通过过滤进行收集，并用乙腈进行洗涤以去除残留的有色材料。沉淀物随后在真空下在室温下进行干燥，以提供BHALys[Lys]16[α,α-Boc]8[α,ε-Boc]8[ε,α-Boc]8[ε,ε-CBz]8(51mg，35％)。
LC/MS(Phobic TFA Speedy Rp)：Rf(分钟)＝14.32；ESI(+ve)m/z＝2544([M+3]/3)，1909([M+4]/4)，1527([M+5]/5).；Calc.C383H625N63O95.M+1.7629
实施例25
BHALys[Lys]16[α,α-Boc]8[α,ε-Boc]8[ε,α-Boc]8[ε,ε-Fmoc]8的制备
将PFP-Lys-α-Boc-ε-Fmoc(96mg，0.15mmol)和三乙胺(0.04mL，0.27mmol)加入至溶于DMF(10mL)的BHALys[Lys]8[ε-NH2]8[α-Lys]8[Boc]16(100mg，0.017mmol)的搅拌溶液中。溶液在室温下搅拌16小时。然后将反应混合物加入搅拌的乙腈(100mL)中，产生澄清的凝胶状沉淀。这种沉淀物通过过滤进行收集并用乙腈进行洗涤。沉淀物随后在室温下进行干燥，以提供BHALys[Lys]16[α,α-Boc]8[α,ε-Boc]8[ε,α-Boc]8[ε,ε-Fmoc]8(30mg，21％)。
LC/MS(疏水的/TFA)：Rf(分钟)＝7.72；ESI(+ve)m/z＝1667([M+5]/5)，1389([M+6]/6)，1191([M+7]/7).；Calc.C439H657N63O95.M+18332
限定的PEG 1.7KD的制备
向溶于DMF(6mL)的HO2C-PEG1146-NH2(245mg，0.21mmol，1.07eq)和PEG570-NHS(136mg，0.2mmol)的搅拌溶液中加入2mL缓冲液(pH 8.5，通过将2.5mL 0.1M HCl溶液加入Na2HPO4(100mL)的搅拌溶液内进行制备，并在添加完成后搅拌5分钟)。允许反应混合物在rt下搅拌过夜。溶剂在旋转蒸发器上去除以产生作为残渣的PEG1716-CO2H，所述残渣通过LC进行纯化以产生所需产物(产量80％)。
实施例26
BHALys[Lys]8(α-NH2.TFA)8(ε-PEG571)8的制备
i.BHALys[Lys]8(α-Boc)8(ε-PEG571)8的制备
在氮下向溶于干DMF(1mL)和DMSO(1mL)的BHALys[Lys]8(α-Boc)8(ε-NH2.TFA)8(9.2mg，0.003mmol)的搅拌溶液中加入NHS-PEG 685.75(26mg，0.45mmol)和三乙胺(10μL，0.108mmol)。允许反应混合物在rt下搅拌16小时，并随后在减压下进行浓缩以产生粗制油，所述粗制油通过prep.HPLC[C18prep.柱：Waters XterraPrep RP18，10μm，19x250mm。环境温度。梯度：10-45％MeCN经过80分钟。Rf(分钟)85]进行纯化，以产生作为澄清油(18mg，75％)的BHALys[Lys]8(α-Boc)8(ε-PEG571)8。
LC-MS:(Phobic，TFA)Rf(分钟)12.81.ESI(+ve)m/z＝1246.3(M/6)，1068.2(M/7)，934.8(M/8)831.2(M/9)。
ii.BHALys[Lys]8(α-NH2.TFA)8(ε-PEG571)8的制备
在0℃下向溶于CH2Cl2(3mL)的BHALys[Lys]8(α-Boc)8(ε-PEG571)8(18mg，0.002mmol)的搅拌溶液中加入TFA(45μL，0.58mmol)，搅拌在0℃下继续20分钟随后在rt下继续2小时。溶剂在减压下被去除以产生作为油(16mg，88％)的BHALys[Lys]8(α-NH2.TFA)8(ε-PEG571)8。
LC-MS:(Philic，TFA)Rf(分钟)10.36.ESI(+ve)m/z＝954(M/7)，834(M/8)，742(M/9)。
实施例27
BHALys[Lys]16[α-PEG570]16[ε-MTX]16的制备
标题化合物的制备由反应方案3(图17)图解说明。反应方案如下：
使BHALys[Lys]16[α-Fmoc]16[ε-Boc]16，结构2，图17(R1＝Fmoc，R2＝Boc)与哌啶在DMF中反应以产生BHALys[Lys]16[α-NH2]16[ε-Boc]16，结构3f(R1＝H，R2＝Boc)；随后使结构3f与过量PEG570-NHS在DMF和DIPEA中反应以产生BHALys[Lys]16[α-PEG570]16[ε-Boc]16，结构3g(R1＝PEG570，R2＝Boc)；随后使结构3g与溶于DCM的TFA(20％)反应，随后与离子交换树脂((OH-)形式)反应，以产生BHALys[Lys]16[α-PEG570]16[ε-NH2]16，结构3h(R1＝PEG570，R2＝NH2)，随后使结构3h与过量α-tBu-γ-MTX-OH、EDC、HOBt和DIPEA在DMSO中反应以产生BHALys[Lys]16[α-PEG570]16[ε-(α-tBu-MTX)]16，结构3i(R1＝PEG570，R2＝α-tBu-MTX)，随后使结构3i与TFA反应以产生BHALys[Lys]16[α-PEG570]16[ε-MTX]16，结构3j(R1＝PEG570，R2＝MTX)。
用PEG1716、PEG2645和PEG3974取代PEG570-NHS提供了具有增加的PEG大小的树枝聚体构建体，并需要备选反应条件，由此结构3f与过量PEGMW-CO2H、HOBt和EDC在DMF和DIPEA中反应以产生结构3g(R1＝PEGMWR2＝CBz)BHALys[Lys]16[α-PEGMW]16[ε-CBz]16。
实施例28
BHALys[Lys]16[α-PEG570]16[ε-COCH2CH2CO-泰素]16的制备
标题化合物的制备由反应方案5(图18)图解说明。反应方案如下：
使BHALys[Lys]16[α-PEG570]16[ε-NH2]16，结构3h(R1＝PEG570，R2＝H)和TFA(16当量)与过量HO2CCH2CH2CO-泰素、EDC、HOBt和DIPEA在DMF中反应以产生BHALys[Lys]16[α-PEG570]16[ε-COCH2CH2CO-泰素]16，结构3I(R1＝PEG570，R2＝COCH2CH2CO-泰素)。
在结构3h中用PEG1716、PEG2645和PEG3974取代PEG570提供具有增加的PEG大小的树枝聚体构建体。
实施例29
BHALys[Lys]16[ε,ε-PEG570]8[COCH2CH2CO-泰素]24的制备
i.BHALys[Lys]8[α-NH2]8[ε-CBz]8的制备
中间化合物的制备由反应方案6(部分1)(图19A)图解说明。反应方案如下：
使BHALys[Lys]4[NH2.TFA]8，结构4(R1＝H.TFA)与过量PNPO-α-Boc-ε-CBz-Lys和DIPEA在DMF中反应以产生BHALys[Lys]8[α-Boc]8[ε-CBz]8，结构5a(R1＝Boc R2＝CBz)；使结构5a与TFA/乙酸随后与离子交换树脂((OH-)形式)反应，以产生BHALys[Lys]8[α-NH2]8[ε-CBz]8，结构5b(R1＝H R2＝CBz)。
ii.BHALys[Lys]16[ε,ε-PEG570]8[COCH2CH2CO-泰素]24的制备
标题化合物的制备由反应方案6(部分2)(图19B)图解说明。反应方案如下：
使BHALys[Lys]8[α-NH2]8[ε-CBz]8，结构5b(R1＝H R2＝CBz)和TFA(8当量)与过量DBL-OPNP和DIPEA在DMF中反应以产生BHALys[Lys]8[S-CBz]8[Lys]8[α,α-Boc]8[α,ε-Boc]8，结构6a(R1＝BocR2＝CBz)；使结构6a与H2和Pd(10％)在碳上在乙酸中随后与离子交换树脂((OH-)形式)反应，以产生BHALys[Lys]8[ε-NH2]8[Lys]8[α,α-Boc]8[α,ε-Boc]8，结构6b(R1＝Boc R2＝H)；使结构6b和TFA(8当量)与过量PNPO-α-Boc-ε-CBz-Lys和DIPEA在DMF中反应以产生BHALys[Lys]16[ε,ε-CBz]8[Boc]24，结构7a(R1＝BocR2＝CBz)；使结构7a与H2和Pd(10％)在碳上在乙酸中随后与离子交换树脂((OH-)形式)反应，以产生BHALys[Lys]16[ε,ε-NH2]8[Boc]24，结构7b(R1＝Boc R2＝H)；使结构7b与过量PEG570-NHS在DMF和DIPEA中反应以产生BHALys[Lys]16[ε,ε-PEG570]8[Boc]24，结构7c(R1＝Boc R2＝PEG570)；使结构7c与TFA反应以产生BHALys[Lys]16[ε,ε-PEG570]8[NH2.TFA]24，结构7d(R1＝H.TFA R2＝PEG570)；使结构7d I与过量HO2CCH2CH2CO-泰素、EDC、HOBt和DIPEA在DMF中反应以产生BHALys[Lys]16[ε,ε-PEG570]8[COCH2CH2CO-泰素]24，结构7e(R1＝COCH2CH2CO-泰素R2＝PEG570)。
用PEG1716、PEG2645和PEG3974取代PEG570-NHS提供了具有增加的PEG大小的树枝聚体构建体，并需要备选反应条件，由此结构7b与过量PEGMW-CO2H、HOBt和EDC在DMF和DIPEA中反应以产生BHALys[Lys]16[ε,ε-PEGMW]8[Boc]24，结构7c(R1＝Boc R2＝PEGMW)。
实施例30
限定的PEG部分：PEG1716、PEG2645、PEG3974的制备
在上文反应方案中用于取代的上述备选PEG部分的制备由反应方案7(图20)图解说明。反应方案如下：
i.使HO2C-PEG1146-NH2与PEG570-NHS在DMF缓冲液pH 8.5中反应以产生PEG1716-CO2H；ii.使PEG1716-CO2H与DCC和NHS随后与HO2C-PEG1146-NH2在DMF缓冲液pH8.5中反应以产生PEG2845-CO2H；iii.使PEG2845-CO2H与DCC和NHS随后与HO2C-PEG1146-NH2在DMF缓冲液pH 8.5中反应以产生PEG3974-CO2H。
实施例31
BHALys[Lys]2[Su(NPN)2]4[α-tBu-MTX]4[PEG570]4的制备
i.N-(苄氧羰基)-3-溴丙胺的制备
将TEA(6.91g，68.5mmol)逐滴加入至溶于DCM(200mL)的3-溴丙胺氢溴酸盐(10.0g，45.6mmol)和N-(苄氧羰酰氧基)-琥珀酰亚胺(11.22g，47.9mmol)的冰冷混合物中。允许搅拌混合物加温至室温过夜，随后用水(3x)、卤水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤和浓缩，提供作为淡黄色油的11.43g(92％)N-(苄氧羰基)-3-溴丙胺。
ii.[BOC][Cbz][NPN]2的制备
在室温下将TEA(17.1mLs，123.5mmol)逐滴加入至溶于DMF(150mLs)的N-(苄氧羰基)-3-溴丙胺(11.20g，41.2mmol)和N-BOC丙二胺(7.16g，41.2mmol)的搅拌混合物中。使混合物加热至70℃并持续1小时，随后ca.三分之二的溶剂在真空中被去除。随后用水(400mL)稀释浓缩的DMF混合物并用乙醚(3x 200mLs)进行洗涤，以去除大多数过烷基化的副产品。DMF/水混合物随后进行碱化(1.0M NaOH)，并用乙醚(5x 200mL)萃取。组合的乙醚萃取物随后用水(3x 200mL)进行洗涤，以去除任何未反应的N-BOC丙二胺，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩，以提供作为澄清的无色油的7.13g(47％)[BOC][Cbz][NPN]2。
iii.[BOC][Cbz][NPN]2SuOH的制备
在室温下向溶于甲苯(60mL)的[BOC][Cbz][NPN]2(6.55g，17.9mmol)的搅拌混合物中加入琥珀酐(1.79g，17.9mmol)。使混合物加热至70℃并持续1小时，随后进行浓缩。然后将残渣溶解于EA/乙醚(5:1)中并用NaOH(1.0M，2x 100mL)进行洗涤。碱洗涤物随后用乙醚进行洗涤，随后进行中和(HCl，1.0M，2x 100mL)。含水混合物随后用EA(3x 250mL)进行洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩，以提供作为无色粘性油的6.97g(84％)[BOC][Cbz][NPN]2SuOH。
iv.[BOC][Cbz][NPN]2SuOPNP的制备
在室温下向溶于EA(150mL)的4-硝基苯酚(1.91g，13.7mmol)和[BOC][Cbz][NPN]2SuOH(6.39g，13.7mmol)的搅拌混合物中加入溶解于EA(50mL)中的DCC(2.97g，14.4mmol)。使混合物在室温下搅拌过夜，随后进行过滤(以去除DCU)。混合物随后用K2CO3(1.0M)/卤水1:1(3x 300mL)、卤水进行洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩，以提供作为粗制材料的[BOC][Cbz][NPN]2SuOPNP(7.80g)。
v.[BOC][Cbz][NPN]2SuOEt的制备
使溶于EtOH(100mL)的[BOC][Cbz][NPN]2SuOPNP(1.16g，1.98mmol)和TEA(2.0mL，14.4mmol)的搅拌混合物于70℃加热2天，浓缩，并吸收到乙酸乙酯(120mL)中。混合物随后用K2CO3溶液(5％，4x 200mL)、卤水进行洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩，以提供作为无色粘性油的0.87g(90％)[BOC][Cbz][NPN]2SuOEt。
LCMS(LC：philic，甲酸盐，RT＝9.3分钟.；MS(Mcalc.C25H39N3O7＝493.61)：511([M+NH4]+，13％)，494([M+H]+，100％)，438([M-t-Bu+H]+，15％)，394([M-BOC+H]+，13％)。
1H(CDCl3)：δ7.30-7.38(m，5H)，5.70(br s，0.5H)，5.25(br s，0.5H)，5.10(br s，0.5H)，5.10，5.08(2s，2H)，4.70(br s，0.5H)，4.12(q，J＝9.0Hz，2H)，2.95-3.45(m，8H)，2.52-2.70(m，4H)，1.73-1.90(m，2H)，1.60-1.70(m，2H)，1.42,1.44(2s，9H)，1.25(t，J＝9.0Hz，3H)。
vi.[BOC][NH2][NPN]2SuOEt的制备
向溶于DMF/H2O(9:1，20mL)的[BOC][Cbz][NPN]2SuOEt(0.88g，1.77mmol)的搅拌混合物中加入甲酸铵(224mg，3.55mmol)和Pd/C(10％，470mg)。使混合物在rt下搅拌2小时，随后进行过滤(0.2μm PALL滤片)和浓缩。将残渣吸收到水中并进行浓缩(2x)。这随后用MeOH和DCM进行重复，提供作为澄清的无色油的0.54g(84％)[BOC][NH2][NPN]2SuOEt。
LCMS(LC：philic，TFA，RT＝6.2分钟；MS(Mcalc C17H33N3O5＝359.47)：360([M+H]+，100％)。
1H(CDCl3)：δ5.30(br s，1H)，4.80(br s，1H)，4.12(q，J＝9.0Hz，2H)，3.29-3.46(m，4H)，3.14(m，1H)，3.07(m，1H)，2.56-2.80(m，6H)，1.60-1.90(m，4H)，1.42,1.43(2s，9H)，1.25(f，J＝9.0Hz，3H)。
vii.[BOC][PEG570][NPN]2SuOEt的制备
向溶于DCM(2mL)的[BOC][NH2][NPN]2SuOEt(157mg，0.44mmol)的搅拌混合物中加入作为DCM(2mL)溶液的TEA(121μl，0.87mmol)和PEG570-NHS(300mg，0.44mmol)。混合物在rt o/n下进行搅拌，浓缩，然后通过fcc(2－10％MeOH/DCM)进行纯化，提供作为澄清的无色油的331mg(82％)[BOC][PEG570][NPN]2SuOEt。
LCMS(LC：philic，TFA，RT＝8.2分钟；MS(Mcalc C43H83N3O18＝930.15)：948([M+NH4]+，12％)，931([M+H]+，2％)，416(1/2[M-BOC+2H+]，100％)。
1H(CDCl3)：δ7.10(br s，1H)，7.03(br s，1H)，4.16(q，J＝9.0Hz，2H)，3.72(m，2H)，3.58-3.66(m，36H)，3.52-3.56(m，2H)，3.47(s，2H)，2.96-3.42(m，7H)，3.37(s，4H)，2.70(s，4H)，2.60(m，4H)，2.47(m，2H)，1.60-1.90(m,4H)，1.41,1.43(2s，9H)，1.24(t，J＝9.0Hz，3H)。
viii.[NH2.TFA][PEG570][NPN]2SuOEt的制备
向溶于DCM(2mL)的[BOC][PEG570][NPN]2SuOEt(180mg，0.19mmol)的搅拌混合物中加入TFA(0.50mL)。使混合物在rt下搅拌6小时，浓缩，加入H2O并浓缩(2x)。然后将残渣再次吸收到H2O(20mL)中，过滤(0.2μm PALL滤片)随后冷冻干燥，提供作为澄清的无色油的0.17g(93％)[NH2.TFA][PEG570][NPN]2SuOEt。
LCMS(LC：philic，TFA，RT＝5.9分钟；MS(Mcalc C38H75N3O16＝830.03)：831([M+H]+，7％)，425(1/2[M+Na++H+]，30％)，416(1/2[M+2H+]，100％)。
1H(D2O)：δ4.17(q，J＝9.0Hz，2H)，3.80(t，J＝6.0Hz，2H)，3.62-3.75(m，43H)，3.38-3.53(m，4H)，3.40(s，3H)，2.90-3.31(m，4H)，2.77(s，4H)，2.64-2.89(m，4H)，2.52-2.58(m，2H)，1.72-2.11(m，4H)，1.13(t，J＝9.0Hz，3H)。
ix.[α-tBu-MTX][PEG570][NPN]2SuOEt的制备
在0℃下向溶于DMF(0.5mL)的[NH2.TFA][PEG570][NPN]2SuOEt(30mg，31.7μmol)和α-tBu-γ-MTX-OH(16.2mg，31.7μmol){C.L.Francis，Q.Yang，N.K.Hart，F.Widmer，M.K.Manthey和H.Ming He-Williams，Aust.J.Chem.2002，55，635}的搅拌混合物中加入PyBOP(18mg，34.8μmol)和DIPEA(23μL，0.127mmol)。使混合物在0℃下搅拌30分钟，随后在rt下搅拌3小时。去除DMF，并且通过PTLC(7％MeOH，93％DCM，Rf＝0.3)纯化残渣，提供作为橙色油的23mgs(55％)[α-tBu-MTX][PEG1570][NPN]2SuOEt。
LCMS(LC：philic，TFA，RT＝8.0分钟；MS(Mcalc C62H103N11O20＝1322.57)：1323([M+H]+，2％)，662(1/2[M+2H+]，17％)，634(1/2[M-tBu+2H+]，82％)。
x.[α-tBu-MTX][PEG570][NPN]2SuOH的制备
向溶于THF/H2O(2:1，9ml)的[α-tBu-MTX][PEG1570][NPN]2SuOEt(109mg，82.4μmol)的搅拌混合物中加入NaOH(0.16mL，1.0M)。使反应在rt下搅拌16小时，并且需要时添加另外的NaOH(反应通过tlc判断)。反应完全后，用HCl(1.0M)将pH调整至中性。然后去除溶剂，将残渣吸收在MeOH中，并过滤以去除盐。残渣随后通过PTLC(18％MeOH，82％DCM，Rf＝0.4)进行纯化，提供作为橙色油的52mgs(49％)[α-tBu-MTX][PEG570][NPN]2SuOH。
LCMS(LC：philic，TFA，RT＝6.8分钟；MS(Mcalc C60H99N11O20＝1294.52)：1317([M+Na]+，3％)，1295([M+H]+，2％)，648(1/2[M+2H+]，10％)，620(1/2[M-tBu+2H+]，74％)，419(100％)。
xi.BHALys[Lys]2[Su(NPN)2]4[α-tBu-MTX]4[PEG570]4的制备
在0℃下向溶于DMF(1.2mL)的[α-tBu-MTX][PEG570][NPN]2SuOH(10mg，7.7μmol)和BHALys[Lys]2[NH2.TFA]4(1.43mg，1.4μmol)的搅拌混合物中加入PyBOP(4.0mg，7.7μmol)和DIPEA(3.9μL，22.4μmol)。使混合物在0℃下搅拌30分钟，随后在rt下搅拌3小时。去除DMF，并且通过PREP HPLC(Waters Xterra MS C18，10μm，19x 250mm，30-60％ACN，0.1％TFA，8mL/分钟，RT＝34分钟)纯化残渣，提供2mg(25％{大部分在空隙中出现})BHALys[Lys]2[Su(NPN)2]4[α-tBu-MTX]4[PEG570]4。
LCMS(LC：philic，TFA，RT＝8.0分钟；MS：1136(1/5[M+5H+]，18％)，946(1/6[M+6H+]，100％)，812(1/7[M+7H+]，22％)转化成5,673.34。(Mcalc C271H437N51O79＝5,673.80)。
实施例32
BHALys[Lys]4[Su(NPN)2]8[α-tBu-MTX]8[PEG570]8的制备
BHALys[Lys]4[NH2.TFA]8与[α-tBu-MTX][PEG570][NPN]2SuOH的反应使用与实施例31中描述的那种相似的方法提供BHALys[Lys]4[Su(NPN)2]8[α-tBu-MTX]8[PEG570]8(10mg)(51％)PREP HPLC(5-60％ACN，90分钟，RT 54分钟)。
LCMS(LC：philic，TFA，RT＝9.0分钟；MS：1614(1/7[M+7H+]，26％)，1413(1/8[M+8H+]，73％)，1256(1/9[M+9H+]，100％)转化成11,294.54。(Mcalc C535H873N103O159＝11,292.52)。
实施例33
BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[α-tBu-MTX]16[PEG570]16的制备
BHALys[Lys]8[NH2.TFA]16与[α-tBu-MTX][PEG570][NPN]2SuOH的反应使用与实施例31中描述的那种相似的方法提供BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[α-tBu-MTX]16[PEG570]16(6mg)(46％)PREP HPLC(5-60％ACN，90分钟，RT 66分钟)。
LCMS(LC：philic，TFA，RT＝9.0分钟；MS：2254(1/10[M+10H+]，24％)，2049(1/11[M+11H+]，56％)，1879(1/12[M+12H+]，100％)，1734(1/13[M+13H+]，55％)转化成22,531.91(McalcC1063H1745N207O319＝22,529.73)。
BHALys[3H-Lys]8[Su(NPN)2]16[α-tBu-MTX]16[PEG570]16以相似方式进行制备，15mg(65％)，1.27mCi/g
实施例34
BHALys[Lys]16[Su(NPN)2]32[α-tBu-MTX]32[PEG570]32
BHALys[Lys]16[NH2.TFA]32与[α-tBu-MTX][PEG570][NPN]2SuOH的反应使用与实施例31中描述的那种相似的方法提供BHALys[Lys]16[Su(NPN)2]32[α-tBu-MTX]32[PEG570]32(7mg)(44％)PREP HPLC(5-60％ACN，90分钟，RT 71分钟)。LCMS(LC：philic，TFA，RT＝9.2分钟；MS:(Mcalc C2119H3489N415O639＝45,004.27)
实施例35
i.[BOC][PEG1100][NPN]2SuOEt的制备
向溶于DMF(2mL)的[BOC][NH2][NPN]2SuOEt的搅拌混合物中加入作为DMF/DCM(2mL)溶液的TEA(2eq)和PEG1100NHS(1eq)。混合物在rt o/n下进行搅拌，浓缩，然后通过fcc进行纯化，提供作为澄清的无色油的[BOC][PEG1100][NPN]2SuOEt。
ii.[NH2.TFA][PEG1100][NPN]2SuOEt的制备
向溶于DCM(2mL)的[BOC][PEG1100][NPN]2SuOEt(180mg)的搅拌混合物中加入TFA(0.50mL)。使混合物在rt下搅拌6小时，浓缩，加入H2O并浓缩(2x)。然后将残渣再次吸收到H2O(20mL)中，过滤(0.2μm PALL滤片)随后冷冻干燥，提供作为澄清的无色油的[NH2.TFA][PEG1100][NPN]2SuOEt。
iii.[α-tBu-MTX][PEG1100][NPN]2SuOEt的制备
在0℃向溶于DMF(0.5mL)的[NH2.TFA][PEG1100][NPN]2SuOEt和α-tBu-γ-MTX-OH(1eq){C.L.Francis，Q.Yang，N.K.Hart，F.Widmer，M.K.Manthey和H.Ming He-Williams，Aust.J.Chem.2002，55，635}的搅拌混合物中加入PyBOP(1.2eq)和DIPEA(3eq)。使混合物在0℃下搅拌30分钟，随后在rt下搅拌3小时。去除DMF，并且通过PTLC纯化残渣，提供作为橙色油的[α-tBu-MTX][PEG1100][NPN]2SuOEt。
iv.[α-tBu-MTX][PEG1100][NPN]2SuOH的制备
向溶于THF/H2O(2:1，9ml)的[α-tBu-MTX][PEG1100][NPN]2SuOEt的搅拌混合物中加入NaOH(2eq，1.0M)。使反应在rt下搅拌16小时，并且需要时添加另外的NaOH(反应通过tlc判断)。反应完全后，用HCl(1.0M)将pH调整至中性。然后去除溶剂，将残渣吸收在MeOH中，并过滤以去除盐。残渣随后通过PTLC进行纯化，提供作为橙色油的[α-tBu-MTX][PEG1100][NPN]2SuOH。
v.BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[α-tBu-MTX]16[PEG1100]16的制备
在0℃下向溶于DMF(1.2mL)的[α-tBu-MTX][PEG1100][NPN]2SuOH(1.1eq/NH2)和BHALys[Lys]8[NH2.TFA]16的搅拌混合物中加入PyBOP(1.2eq/NH2)和DIPEA(3eq/NH2)。使混合物在0℃下搅拌30分钟，随后在rt下搅拌3小时。去除DMF，并且通过PREP HPLC(WatersXterra MS C18，10μm，19x 250mm)纯化残渣，提供BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[α-tBu-MTX]16[PEG1100]16。
实施例36
HOGlyLys[Lys]2[Boc]3[ε,ε-CBz]的制备
该合成在图21中示意性图解说明。
i.MeOGlyLys[α-Boc][ε-CBz]的制备
将PNPO-α-Boc-ε-CBz-Lys(50.15g，0.100mol)加入至溶于三乙胺(30.36g，0.300mol)和二甲基甲酰胺(200ml)混合物的甘氨酸甲酯盐酸盐(12.56g，0.110mol)的搅拌悬浮液中。在环境温度下搅拌16小时后，挥发性组分在真空中蒸发，并且残渣在乙酸乙酯(200ml)和5％含水碳酸钠(175ml)之间分开。水相被弃去，并且乙酸乙酯相用更多的5％含水碳酸钠(4x200ml)进行洗涤，随后用0.25M盐酸(2x50ml)，再随后用饱和的含水氯化钠(50ml)洗涤。乙酸乙酯溶液进行干燥(硫酸镁)、过滤并在真空中蒸发溶剂，以产生作为无色油的MeOGlyLys[α-Boc][ε-CBz](44.39g，98％)。
1H nmr(300MHz，CD3OD)δ(ppm)：1.3-1.8(m，6H)；1.44(s，9H)；3.13(t，J 6.6Hz，2H)；3.70(s，3H)；3.88(d，J 17.7Hz，1H)；3.99(d，J 17.7Hz，1H)；4.04(m，1H)；5.06(s，2H)；7.2-7.4(m，5H)。
LC/MS(疏水的/甲酸盐)：观察到的ESI(+ve)[M+H]+m/z＝452.0；对于C22H34N3O7计算的452.2。Rf(分钟)＝5.2。
ii.MeOGlyLys[α-NH2.TFA][ε-CBz]的制备
将MeOGlyLys[α-Boc][ε-CBz](43.36g，96.0mmol)溶解于乙酸(150ml)中，并使溶液在冰浴温度下搅拌直至乙酸开始冷冻。去除冰浴，并伴随搅拌缓慢加入三氟乙酸直至乙酸结晶溶解。将溶液再次置于冰浴中，并且缓慢加入剩余的三氟乙酸(总共150ml)；乙酸的冷冻不再发生。去除冰浴，并使溶液在环境温度下搅拌5小时，随后在真空中尽可能充分地蒸发挥发性组分。将残留的粘性油溶解于甲醇(200ml)中，并再次在真空中旋转蒸发至油。这个过程用甲醇的5个另外200ml等分试样进行重复，之后在真空中在0.1Torr下尽可能多地去除的残留甲醇。产物MeOGlyLys[α-NH2.TFA][ε-CBz]作为淡黄色油(46.04g，由于仍存在某些甲醇所以理论上为103％)获得。
1H nmr(300MHz，CD3OD)δ(ppm)：1.5-1.6(m，4H)；1.8-2.0(m，2H)；1.44(s，9H)；3.15(t，J 6.8Hz，2H)；3.71(s，3H)；3.88(t，J 6.4Hz，1H)；3.94(d，J 17.6Hz，1H)；4.08(d，J 17.6Hz，1H)；5.07(s，2H)；7.2-7.4(m，5H)。
LC/MS(亲水的/甲酸盐)：观察到的ESI(+ve)[M+H]+m/z＝352.1；对于C17H26N3O5计算的352.2。Rf(分钟)＝12.3。
iii.MeOGlyLys[ε-CBz][α-Lys][Boc]2的制备
将DBL-OPNP(49.37g，0.106mol)加入至溶于二甲基甲酰胺(200ml)的MeOGlyLys[α-NH2.TFA][ε-CBz](46.0g，96.0mmol)和三乙胺(24.3g，0.240mol)的搅拌溶液中。在环境温度下搅拌17小时后，加入溶于水(50ml)的甘氨酸溶液(3.98g，53.0mmol)，并将浑浊溶液搅拌24小时。向充分搅拌的混合物中加入水(150ml)，并且白色固体开始沉淀。随后加入片冰(200g)并继续搅拌直至冰已融化。固体通过过滤进行收集，悬浮于5％含水碳酸钠中，并超声处理0.5小时，用抽吸变得半干，并随后用更多的5％含水碳酸钠(2x200ml)进行洗涤，随后用水(3x200ml)洗涤。亮黄色固体随后在另外200ml 5％含水碳酸钠中进行搅拌，并进行过滤以产生淡黄色粉末。固体用水(2x200ml)进行洗涤，随后悬浮于更多的水(200ml)中，并超声处理1.5小时。过滤和抽吸干燥以及随后在真空中干燥产生61.0g茶色粉末。从乙酸乙酯中再结晶产生作为白色固体的MeOGlyLys[ε-CBz][α-Lys][Boc]2(50.05g，77％)。
1H nmr(300MHz，CD3OD)δ(ppm)：1.2-2.0(m，30H)；3.03(t，J 6.6Hz，2H)；3.12(t，J 6.8Hz，2H)；3.69(s，3H)；3.87(d，J 17.6Hz，1H)；4.00(d，J 17.6Hz，1H)；4.01(dd，J 3.3，7.4Hz，1H)；4.38(dd，J 5.4，8.4Hz，1H)；5.06(s，2H)；7.2-7.4(m，5H)。
LC/MS(亲水的/甲酸盐)：观察到的ESI(+ve)[M+H]+m/z＝680.0；对于C33H54N5O10计算的680.4；观察到的[M+NH4]+m/z＝697.0；对于C33H57N6O10计算的697.4。Rf(分钟)＝8.0。
iv.MeOGlyLys[ε-NH2.TFA][α-Lys][Boc]2的制备
在氢和大气压下将溶于甲醇(10ml)的MeOGlyLys[ε-CBz][α-Lys][Boc]2(680mg，1.00mmol)和三氟乙酸(77μl，1.0mmol)溶液加入至在碳上的10％w/w钯的悬浮液(106mg,0.10mmol Pd)。混合物在环境温度下搅拌1小时，并随后通过硅藻土床进行过滤。甲醇在真空中蒸发，将残渣再溶解于甲醇(5ml)中，并使溶液经过0.2μm滤器。甲醇在真空中的蒸发产生作为脆性白色泡沫的MeOGlyLys[ε-NH2.TFA][α-Lys][Boc]2(640mg，97％)。
1H nmr(300MHz，CD3OD)δ(ppm)：1.2-2.0(m，30H)；2.93(t，J 7.5Hz，2H)；3.03(t，J 6.6Hz，2H)；3.72(s，3H)；3.89(d，J 17.7Hz，1H)；3.98(dd，J 5.4，9.0Hz，1H)；4.02(d，J 17.7Hz，1H)；4.42(dd，J 5.7，8.4Hz，1H)。
LC/MS(亲水的/甲酸盐)：观察到的ESI(+ve)[M+H]+m/z＝546.2；对于C25H48N5O8计算的546.3。Rf(分钟)＝14.2。
v.MeOGlyLys[Lys]2[Boc]3[ε,ε-CBz]的制备
将PNPO-α-Boc-ε-CBz-Lys(535mg，1.07mmol)加入至溶于二甲基甲酰胺(10ml)的MeOGlyLys[ε-NH2.TFA][α-Lys][Boc]2(640mg，0.97mmol)的搅拌溶液中。加入三乙胺(340μl，2.43mmol)，并使溶液在环境温度下搅拌20小时。加入溶于水(5ml)的甘氨酸溶液(40mg，0.54mmol)，并将浑浊溶液搅拌2小时。二甲基甲酰胺在真空中蒸发，并且残留的油在乙酸乙酯(20ml)以及5％含水碳酸钠和饱和含水氯化钠的3：1混合物(20ml)之间分开。水相被弃去，并且乙酸乙酯相用更多的碳酸钠/氯化钠混合物(3x20ml)进行洗涤，随后用0.20M盐酸(2x20ml)，再随后用饱和的含水氯化钠(20ml)洗涤。将乙酸乙酯溶液进行干燥(硫酸镁)、过滤并在真空中蒸发溶剂，以产生作为脆性白色泡沫的MeOGlyLys[Lys]2[Boc]3[ε,ε-CBz](818mg，93％)。
1H nmr(300MHz，CD3OD)δ(ppm)：1.2-2.0(m，45H)；3.03(t，J 6.6Hz，2H)；3.12(t，J 6.6Hz，2H)；3.19(m，2H)；3.71(s，3H)；3.88(d，J 17.4Hz，1H)；3.93-4.06(m，2H)；4.00(d，J 17.7Hz，1H)；4.38(dd，J 5.4，8.4Hz，1H)；5.07(s，2H)；7.25-7.45(m，5H)。
LC/MS(疏水的/甲酸盐)：观察到的ESI(+ve)[M+H]+m/z＝908.4；对于C44H74N7O13计算的908.5；观察到的[M+NH4]+m/z＝925.4；对于C44H77N8O13计算的925.5。Rf(分钟)＝9.5。
vi.HOGlyLys[Lys]2[Boc]3[ε,ε-CBz]的制备
将MeOGlyLys[Lys]2[Boc]3[ε,ε-CBz](500mg，0.55mmol)溶解于溶于甲醇(8ml)和水(4ml)的氢氧化钠溶液(44mg，1.10mmol)中。使溶液在环境温度下搅拌4小时，并且在真空中蒸发溶剂。将残渣溶解于水(10ml)并加入1M硫酸氢钾(2ml)。将所得到的白色沉淀物萃取到乙酸乙酯(10ml)内，并弃去水相。乙酸乙酯相用饱和的含水氯化钠(10ml)进行洗涤、干燥(硫酸镁)、过滤并在真空中蒸发溶剂，以产生作为无定形白色固体的HOGlyLys[Lys]2[Boc]3[ε,ε-CBz](481mg，96％)。
1H nmr(300MHz，CD3OD)δ(ppm)：1.2-2.0(m，45H)；3.03(t，J 6.6Hz，2H)；3.12(t，J 6.6Hz，2H)；3.19(m，2H)；3.84(d，J 18.0Hz，1H)；3.95-4.07(m，2H)；3.97(d，J 17.7Hz，1H)；4.39(dd，J 5.4，8.4Hz，1H)；5.07(s，2H)；7.25-7.38(m，5H)。
LC/MS(疏水的/TFA)：观察到的ESI(+ve)[M+H]+m/z＝894.3；对于C43H72N7O13计算的894.5。Rf(分钟)＝8.4。
实施例37
BHALys[GlyLys]2[Lys]4[Boc]6[ε,ε-CBz]2(C105H163N17O25MW2063.5)的制备
该合成在图22中示意性图解说明。
将EDCI(0.90mmol)加入至溶于二甲基甲酰胺(10ml)的HOGlyLys[Lys]2[Boc]3[ε,ε-CBz](536mg，0.60mmol)、BHALys[NH2.TFA]2(135mg，0.250mmol)、4,4-二甲氨基吡啶(7.3mg，60umol)和三乙胺(210ul，1.50mmol)的溶液中。溶液在环境温度下搅拌15小时，并随后在真空中去除挥发性组分。硅胶层析法(甲醇/二氯甲烷梯度)产生BHALys[GlyLys]2[Lys]4[Boc]6[ε,ε-CBz]2(245mg，47％)。少量样品(20mg)用乙酸/TFA以通常方式进行处理以提供分析数据。
LC/MS(Philic/TFA)：观察到的ESI(+ve)[M+H]+m/z＝1463.2；对于C75H116N17O13计算的1462.9。
实施例38
BHALys[Lys]16[α-PEG570]16[COCH3]16的制备
将乙酸酐(1.5eq/NH2)加入至溶于DMF和TEA(3eq/NH2)的BHALys[Lys] 16 [α-PEG 570 ] 16 [NH 2 .TFA] 16 的搅拌溶液中，并允许反应搅拌过夜。将反应浓缩，并且残渣通过尺寸排阻层析法在Sephadex G-25上进行纯化，用水作为洗脱剂以提供BHALys[Lys] 16 [α-PEG 570 ] 16 [COCH 3 ] 16 。
实施例39
树枝聚体的淋巴靶向：
大鼠经由胸淋巴导管(使用M Boyd等人(2003)Journal ofPharmacology and Toxicology Methods 49：115-120中描述的方法)和右颈静脉(用于输注盐水)进行插管。允许大鼠恢复过夜，并随时供应食物和水。动物经由在右足跟上方注射皮下施用5mg/kg剂量的(10mg/ml，50μl/100g体重)树枝聚体(Lys16(PEG200)32、Lys16(PEG570)32、Lys16(PEG2000)32或Lys16(BS)32)。Lys16(BS)32充当非PEG化的对照树枝聚体。引流到胸淋巴导管内的淋巴经过30－48小时进行收集并且就氚放射性标记进行闪烁计数。
这项研究的结果证实高达40％皮下剂量的PEG化的聚L-赖氨酸树枝聚体可以在注射剂量的48小时内由淋巴吸收(图23)。这依赖于树枝聚体的大小，其中38.5+0.7％(均值±SD，n＝3)的Lys16(PEG2000)32(68kDa)在48小时中吸收到淋巴内，和28.8±6.6％的Lys16(PEG570)32(22kDa)经过30小时回收到淋巴内，而仅3.8％(n＝1)的Lys16(PEG200)32(11kDa)在胸淋巴中回收。PEG化用于使树枝聚体增加摄入淋巴内，因为仅1.7±1.5％(均值±SD，n＝3)的非PEG化的苯磺酸盐树枝聚体(11kDa)在30小时(均值±SD，n＝3)中进入淋巴内。约0.3％剂量的Lys16(PEG570)32和Lys16(PEG2000)32树枝聚体在处死时在右腿弯部的结和髂骨的结中共同回收。这代表在淋巴结中回收的约2－3％剂量/g，其显著高于在IV给药后30－168小时在主要器官中一般回收的放射性标记的浓度(高达1.5％剂量/g组织)。
总之，显著量的更大(>20kDa)PEG化的树枝聚体在皮下给药后吸收到局部淋巴管内，而少得多的量的更小(11kDa)PEG化或非PEG化的树枝聚体在淋巴结中回收。在非PEG化的材料的情况下，这还可能反映来自注射位点减少的引流。小百分比的剂量在皮下给药后30－48小时在局部淋巴结中回收，尽管考虑到它们的小质量(约0.1－0.2g)，但这代表在淋巴结中相对高浓度的树枝聚体。PLL树枝聚体的PEG化与更大的PEG基团可以进一步增加淋巴回收。这些结果突出PEG化增加药物-树枝聚体复合物在皮下给药后摄入淋巴内的潜能。
实施例40
50％-PEG570封端的聚L-赖氨酸树枝聚体的药代动力学
进行下述研究以确定1)部分表面PEG化和2)用PEG和药物/乙酰基团的组合完全封闭树枝聚体的表面如何影响在对大鼠5mg/kg IV给药后的树枝聚体药代动力学。
下述氚标记(G3)的树枝聚体在这项研究中使用：
Lys16(NH2)32(MW 4.1kDa)，BHALys[3H-Lys]16[NH2]32，在本文中也称为未封端的树枝聚体
Lys16(PEG570)32(MW 23kDa)，BHALys[3H-Lys]16[PEG570]32，在本文中也称为完全PEG化的树枝聚体
Lys16(PEG570)16(NH2)16(MW 13.3kDa)，BHALys[3H-Lys]16[α-PEG570]16[ε-NH2]16，在本文中也称为半PEG化的树枝聚体)
Lys16(PEG570)16(CH3)16(MW 14kDa)，BHALys[3H-Lys]16[α-PEG570]16[ε-COCH3]16，在本文中也称为半乙酰化的树枝聚体)
Lys16(PEG570)16(MTX酰胺)16 *(MW 22.5kDa)，BHALys[3H-Lys]8[Su(NPN)2]16[PEG570]16[α-tBu-MTX]16，在本文中也称为MTX树枝聚体，其中MTX是氨甲蝶呤)
*氨甲蝶呤经由稳定的酰胺连接体与未PEG化的位点缀合。
方法
SD大鼠(约300g)经由留置在右颈静脉中的插管通过直接静脉内输注经过2分钟施用5mg/kg剂量的氚标记的树枝聚体(溶于1ml盐水)。这之后，收集来自右颈动脉中(0.2ml)的留置插管的t0血液样品用于评估Cp0(在静脉内输注结束时血浆中的树枝聚体浓度)。其后在5、10、20、30、45、60、90、120、180、240、360、480、1440和1800分钟时将血液收集到肝素化的管内。血液样品离心后，使100μl等分试样的血浆与1－2ml Starscint在6ml闪烁管中混合，并就氚放射性进行计数。尿在树枝聚体施用后以0－8小时，8－24小时和24－30小时的间隔进行收集。等分试样(100μl)的尿就氚放射性类似地进行计数。尿和血浆样品通过尺寸排阻层析法在Superdex 75SEC柱上进行分析，用50mM PBS+0.3M NaCl(pH 3.5)进行洗脱。从柱中洗脱的流分以1分钟(0.5ml)间隔进行收集，与2ml Starscint在6ml闪烁瓶中混合，并就氚放射性进行闪烁计数。
关于树枝聚体与血管或组织表面结合的潜力通过测量与作为替代物的肝匀浆的结合如下进行评估：
来自麻醉大鼠的肝用盐水进行灌注以去除脉管系统中的大部分血液。肝随后进行分离并在玻璃匀浆器中在1:1w/v盐水中磨碎。大鼠用致死剂量的Lethabarb经由心脏穿刺来杀死。肝明显均质化后，将约1ml肝匀浆加入微量离心管中并在3500rpm下离心5分钟。去除上清液并将另外500μl盐水加入每个管中。每个管短暂涡旋并再次离心。这个过程确保可溶性蛋白从匀浆中尽可能多地去除以使蛋白质的量降到最低，所述蛋白质可能潜在地与树枝聚体结合并作为未结合的树枝聚体计数。向每个管中加入另外500μl盐水，并向每个管中加入50μg Lys16(PEG570)16(CH3)16、Lys16(PEG570)16(NH2)16或Lys8(D-lys)16。D-lys树枝聚体用作阳离子、未封端的树枝聚体对照，因为它不经历可能影响结合实验结果的快速代谢。每个管在37℃下在旋转混合器上温育30分钟，这之后将管再次离心。收集上清液并就‘未结合的’树枝聚体进行分析。剩余的肝匀浆如其他地方所述进行溶解以确保剩余的树枝聚体与肝组织结合。
结果:
Lys16(PEG570)16(NH2)16
施用半PEG化的树枝聚体后，血浆放射性标记经过第一个小时的具有8.6±0.3分钟的半衰期的快速下降(图24B)。为了比较，完全未封端的(Lys16(NH2)32)树枝聚体的血浆谱显示于图24A中。关于完全未封端的和半PEG化的树枝聚体之间的初始血浆/分布动力学中的差异的解释可能在组织结合数据中是显而易见的(表13)。因此，未封端的树枝聚体被认为与组织或脉管系统快速结合(使用肝匀浆作为替代物进行测试)，导致从血浆中几乎立即去除。与之对比，即使部分PEG化的材料也具有低得多的组织或血管结合活性。
1小时后，血浆放射性标记中的下降明显减慢，具有22.1±2.1小时的终末半衰期(经过6－30小时的时间段计算)。尺寸排阻层析法(图25A)暗示在给药后2小时时血浆中氚标记的赖氨酸的存在，并进一步表明血浆中存在的主要种类明显大于树枝聚体。约1天的终末半衰期因此可能反映由释放的氚标记的赖氨酸重新掺入产生的血浆蛋白质的清除。
关于完全未封端的种类的血浆药代动力学和SEC谱暗示，在30分钟后连续‘供应’的赖氨酸可用于驱动血浆蛋白质的合成(即在给药后6－30小时在血浆放射性标记中没有明显的下降，延长的血浆谱在本文中未显示)。然而，来自半PEG化的树枝聚体的血浆药代动力学和SEC谱暗示，尽管可能发生类似的降解和重新掺入过程，但它似乎经过更短的时间段而发生，因为重新掺入产物伴随反映白蛋白周转率(约24小时)的半衰期而清除。这个相对短暂的驱动蛋白质生物合成的氚标记的赖氨酸供应期与观察到的相对温和的肾清除率一致，其中经过30小时取样期后，73.5±2.8％施用的与半PEG化的树枝聚体结合的氚在尿中得到回收。这与来自Lys16(NH2)32和Lys16(PEG570)32(分别为约5和40％)的注射的放射性标记的回收形成鲜明对比。通过SEC在尿中鉴定的种类与完整的树枝聚体共洗脱(图25B)。
表13：在于37℃温育30分钟后不与肝匀浆结合的树枝聚体的百分比
Lys16(PEG570)16(CH3)16
来自半乙酰化的树枝聚体的放射性标记的初始血浆谱类似于半PEG化的树枝聚体的放射性标记的初始血浆谱(半衰期＝9.3±0.42分钟)(图24)。然而，与半PEG化的树枝聚体不同，半乙酰化的树枝聚体的终末半衰期很短，并且与完全PEG化的种类的终末半衰期更一致(关于半乙酰化的树枝聚体的13.9±0.3小时对关于完全PEG化的树枝聚体的9.45±0.42小时)。这可能是由于与半PEG化的树枝聚体相比，关于半乙酰化的树枝聚体的较慢的核代谢速率(图27A)。血浆SEC谱显示在t0时血浆放射性标记完全归于完整的树枝聚体。在给药后2小时收集的血浆显示出归于完整的树枝聚体的小峰，和在20分钟时的宽峰(这个峰在完整的树枝聚体前2分钟洗脱)，然而，游离赖氨酸并不明显。如同半PEG化的树枝聚体一样，大多数注入的放射性标记被排泄到30小时尿中(72.3±1.2％)，并且其大部分未改变地被排泄。归于树枝聚体代谢的产物的几种小MW种类在8－24小时尿中得到鉴定(图27B，注意关于8－24小时的不同的比例尺)。
Lys16(PEG570)16(MTX酰胺)16
尽管MTX树枝聚体的分子量类似于全PEG化的树枝聚体，但血浆谱更紧密地模拟半乙酰化的树枝聚体的谱。初始血浆半衰期为15.4±2.4分钟，这比其他半封端的树枝聚体略微更慢。终末清除半衰期与完全PEG化的树枝聚体(9±0.2小时)基本上相同，可能反映终末血浆清除对总体分子量的依赖性。
小于三分之一的施用剂量的氚标记的树枝聚体经由尿经过30小时(29±3.4)被清除。其大部分在IV给药后经过前8小时被排泄。尿中排泄的MTX树枝聚体的量比1)其他半封端的树枝聚体和2)完全PEG化的树枝聚体低得多(42.9+2.7％)。尽管这种少量的肾清除无法得到充分解释，但可能是1)树枝聚体的大尺寸在某种程度上阻碍肾清除，2)其余剂量集中于网状内皮系统(RES)的器官中，和3)某些树枝聚体可能已通过与叶酸盐结合位点相互作用由器官保留(因为MTX是关于叶酸盐在叶酸盐受体上的竞争性拮抗剂)。
结论：
1)具有50％表面用PEG570封端(但剩下50％表面位点不封端)的赖氨酸树枝聚体相对快速地从血浆中被清除，并且似乎进行分解以释放游离赖氨酸。然而，它们似乎不显示与完全未封端的种类相同程度的血管结合。
2)当与其中50％的表面胺未被封端的树枝聚体比较时，在具有50％表面PEG化的树枝聚体上未封端的位点的乙酰化减少树枝聚体的生物降解，然而，血浆的最初清除率/分布基本上相同。
3)在表面上具有50％PEG封端基团和50％MTX封端基团的赖氨酸树枝聚体显示出与半乙酰化的树枝聚体相似的初始血浆谱。
4)与类似大小的完全PEG化的树枝聚体，或50％乙酰化的系统相比，在表面上具有50％PEG封端基团和50％MTX封端基团的赖氨酸树枝聚体的更小比例剂量在IV施用后在尿中得到回收。这可能反映由MTX与RES中的吞噬细胞或叶酸盐受体的相互作用引起的经由RES增加的摄入。
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应当理解本说明书中公开和限定的本发明扩展至由正文或附图中提及或显而易见的2个或更多单独特征的所有备选组合。所有这些不同组合构成本发明的各种备选方面。

Claims (46)

1.具有受控的末端基团化学计量和拓扑学的大分子，所述大分子包括：
(i)具有表面层和至少一个且小于6个次表面层的能生物降解的树枝聚体或树枝状基序，其中所述表面层携带表面胺；
(ii)其为药学活性剂的残基的第一种末端基团，其中所述第一种末端基团连接至表面胺，任选地通过连接体部分连接至表面胺；
(iii)第二种末端基团，其中所述第二种末端基团选自聚乙二醇、聚乙基噁唑啉和叶酸盐或关于细胞表面受体的配体的叶酸盐衍生物，其中所述第二种末端基团连接至表面胺，任选地通过连接体部分连接至表面胺，
其中受控的末端基团化学计量指每种类型的末端基团的预定的数目，和其中受控的末端基团拓扑学指树枝聚体的表面层上的第一种和第二种末端基团的非随机的预定位置。
2.根据权利要求1的大分子，其中每种类型的末端基团的预定数目和位置的受控的末端基团化学计量和拓扑学是通过包含可分解的或正交的保护基团的过程获得的。
3.根据权利要求1的大分子，其中所述第二种末端基团是聚乙二醇(PEG)或聚乙基噁唑啉(PEO)。
4.根据权利要求3的大分子，其中PEG或PEO末端基团构成末端基团总数目的25％-50％。
5.根据权利要求3的大分子，其中PEG或PEO末端基团构成末端基团总数目的约50％。
6.根据权利要求3的大分子，其中PEG或PEO各自具有500至5000道尔顿的分子量。
7.根据权利要求1的大分子，其进一步包括一种或多种连接体部分，其中所述第一种和/或第二种末端基团经由所述连接体部分附着至所述树枝聚体。
8.根据权利要求7的大分子，其中所述连接体部分是可切割的。
9.根据权利要求7的大分子，其中所述连接体部分选自酰胺连接体，腙、肟和亚胺连接体、酯连接体，肽连接体，戊二醛连接体，聚乙二醇-肽连接体，二硫化物连接体和胸苷连接体。
10.根据权利要求7的大分子，其中一种或多种连接体部分包括PEG。
11.根据权利要求1的大分子，其中所述药学活性剂选自：麻醉剂，抗酸剂；抗体；抗真菌剂；抗感染药；抗代谢物；抗有丝分裂物；抗原生动物药；抗病毒药物；生物制品；支气管扩张药和祛痰药；心血管药物；造影剂；利尿剂；生长激素；补血药；激素替代疗法；免疫抑制剂；激素和类似物；营养制品；眼科药物；疼痛治疗剂；呼吸药物；移植产物；佐剂；同化剂；镇痛药；抗关节炎药；抗惊厥药；抗组胺药；消炎药；抗微生物剂；抗寄生虫药；抗溃疡病药；行为矫正药物；癌症疗法和相关药物；中枢神经系统药物；避孕药；糖尿病疗法；生育药物；生长促进剂；止血药；免疫刺激剂；肌肉松弛药；自然产物；肥胖治疗剂；骨质疏松症药物；肽和多肽；镇静剂和安定药；尿道酸化剂和维生素。
12.根据权利要求1的大分子，其中所述药学活性剂选自：抗肿瘤剂、抗代谢物；抗有丝分裂物；消炎药；和免疫抑制剂。
13.根据权利要求1的大分子，其中所述药学活性剂选自：利妥昔单抗、奥沙利铂、多西他赛、吉西他滨、曲妥珠单抗、依立替康、紫杉醇、贝伐珠单抗、卡铂、西妥昔单抗、多柔比星、培美曲塞、表柔比星、硼替佐米、托泊替康、阿扎胞苷、长春瑞滨、米托蒽醌、氟达拉滨、阿仑珠单抗、卡莫司汀、异环磷酰胺、依达比星、丝裂霉素、氟尿嘧啶、顺铂、美法仑、砒霜、地尼白介素、阿糖胞苷、左亚叶酸钙、环磷酰胺、依托泊苷、槲寄生、美司钠、吉妥珠单抗、奥佐米星、白消安、喷司他丁、克拉屈滨、博来霉素、柔红霉素、苯达莫司汀、达卡巴嗪、雷替曲塞、长春新碱、福莫司汀、磷酸依托泊苷、卟吩姆钠、长春碱、氨甲蝶呤；泰素；消炎痛；赛尼可和环孢菌素。
14.根据权利要求1的大分子，其中所述药学活性剂是紫杉烷。
15.根据权利要求1的大分子，其中所述药学活性剂具有附着至表面胺或连接体部分的反应基团，所述反应基团选自羟基、氨基、羧酸、羰基或肼基团。
16.根据权利要求1的大分子，其中药学活性剂构成末端基团总数目的25％-50％。
17.根据权利要求1的大分子，其中药学活性剂构成末端基团总数目的约50％。
18.根据权利要求1的大分子，其中表面层和/或次表面层包括选自下来的构建单位：赖氨酸、赖氨酸类似物、酰胺胺或
其中a是0或1，优选为1。
19.根据权利要求1的大分子，其中第一种和第二种末端基团附着至表面层的构建单位以形成偶联体。
20.根据权利要求1的大分子，其中树枝聚体具有二胺或三胺核。
21.根据权利要求1的大分子，其中树枝聚体具有包括下列的核：赖氨酸、二苯甲胺、二苯甲基氨基-赖氨酸、二氨基己烷、乙二胺、三乙基四胺、NEOEOENLys，或任意下列基团：
其中a、b和c各自是0至5的整数，更优选地1至3的整数。
22.组合物，其包含根据权利要求1-21任一项的多个大分子，其中第一种和第二种末端基团附着至表面层，从而具有确定的化学计量和拓扑学的所述多个大分子中的特定大分子的丰度相对于随机表面官能化的多个大分子中产生的所述特定大分子的丰度被富集。
23.根据权利要求22的组合物，其中具有确定的化学计量和拓扑学的大分子被富集至少2倍。
24.根据权利要求22的组合物，其中具有确定的化学计量和拓扑学的大分子包含至少20％的多个树枝聚体。
25.权利要求1-21任一项的大分子或权利要求22-24任一项的药物组合物在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途，其中第一种末端基团是抗肿瘤药学活性剂的残基。
26.权利要求1-21任一项的大分子或权利要求22-24任一项的药物组合物在制备用于将药学活性剂靶向递送至动物的淋巴系统的药物中的用途，其中第二种末端基团选自聚乙二醇(PEG)和聚乙基噁唑啉(PEO)。
27.赖氨酸树枝聚体聚合物，其具有受控的封端基团化学计量和拓扑学并具有下式：
核[构建单位]m[表面构建单位]n[封端基团1]p[封端基团2]q
其中：
所述核选自赖氨酸或其衍生物，二胺化合物或三胺化合物；
所述构建单位为树枝聚体提供一个或多个次表面层，并且选自赖氨酸或赖氨酸类似物；
所述表面构建单位为树枝聚体提供一个或多个表面层，并且与所述构建单位的那种相同或不同，并选自赖氨酸或赖氨酸类似物；
封端基团1附着于表面构建单位并且是第一种末端基团，其选自药学活性剂的残基、其衍生物或其前体；
封端基团2附着于表面构建单位并且是第二种末端基团，其被选择用于修饰药学活性剂和/或大分子的药代动力学，其中所述第二种末端基团选自聚乙二醇(PEG)、聚乙基噁唑啉(PEO)和叶酸盐或关于细胞表面受体的配体的叶酸盐衍生物；
m表示所述树枝聚体的所述一个或多个次表面层的所述构建单位的总和,并且是1－32的整数；
n表示所述树枝聚体的所述一个或多个表面层的所述表面构建单位的数目,并且是2－32的整数；
p表示所述封端基团1基团的数目并且是1－64的整数；和
q表示所述封端基团2基团的数目并且是1－64的整数；和
其中受控的封端或末端基团化学计量指每种类型的末端基团的预定的数目，受控的封端或末端基团拓扑学指树枝聚体的表面层上的第一种和第二种末端基团的非随机的预定位置。
28.根据权利要求27的树枝聚体，其中每种类型的封端或末端基团的预定数目和位置的受控的封端或末端基团化学计量和拓扑学是通过包含可分解的或正交的保护基团的过程获得的。
29.根据权利要求27的树枝聚体，其中所述封端基团2是聚乙二醇(PEG)或聚乙基噁唑啉(PEO)。
30.根据权利要求27的树枝聚体，其中药学活性剂选自：抗肿瘤剂、抗代谢物；抗有丝分裂物；消炎药；和免疫抑制剂。
31.根据权利要求27的树枝聚体，其中所述药学活性剂选自：利妥昔单抗、奥沙利铂、多西他赛、吉西他滨、曲妥珠单抗、依立替康、紫杉醇、贝伐珠单抗、卡铂、西妥昔单抗、多柔比星、培美曲塞、表柔比星、硼替佐米、托泊替康、阿扎胞苷、长春瑞滨、米托蒽醌、氟达拉滨、阿仑珠单抗、卡莫司汀、异环磷酰胺、依达比星、丝裂霉素、氟尿嘧啶、顺铂、美法仑、砒霜、地尼白介素、阿糖胞苷、左亚叶酸钙、环磷酰胺、依托泊苷、槲寄生、美司钠、吉妥珠单抗、奥佐米星、白消安、喷司他丁、克拉屈滨、博来霉素、柔红霉素、苯达莫司汀、达卡巴嗪、雷替曲塞、长春新碱、福莫司汀、磷酸依托泊苷、卟吩姆钠、长春碱、氨甲蝶呤；泰素；消炎痛；赛尼可和环孢菌素。
32.根据权利要求27的树枝聚体，其中药学活性剂是紫杉烷。
33.根据权利要求27的树枝聚体，其中所述核是二胺核。
34.根据权利要求27的树枝聚体，其中构建单位是赖氨酸，表面构建单位是赖氨酸，核是二胺核，封端基团1是抗代谢物或抗有丝分裂物，并且封端基团2是PEG。
35.包含根据权利要求27-34任一项的树枝聚体的组合物，其中封端基团1和封端基团2附着于具有非随机的化学计量和拓扑学的表面构建单位，从而具有特定的化学计量和拓扑学的所述多个树枝聚体中的特定树枝聚体的丰度相对于随机表面官能化的多个封端基团中产生的所述特定树枝聚体的丰度被富集至少2倍。
36.用于制备具有受控的末端基团化学计量和拓扑学的大分子的方法，其包括下述步骤：
(i)提供
包括具有官能团和2种或更多种不同的可分解的或正交的保护基团的外层的增长性大分子；
其为药学活性剂的残基的第一种末端基团的前体；和
选择用于修饰所述药学活性剂和/或大分子的药代动力学的第二种末端基团的前体，
(ii)通过去除第一种保护基团使所述外层上的官能团脱保护；
(iii)激活所述第一种或第二种末端基团前体之一；
(iv)使所述脱保护的官能团与所述激活的末端基团前体反应；
(v)通过去除第二种保护基团使所述外层上的官能团脱保护；
(vi)激活所述第一种或第二种末端基团前体中的另一种；和
(iv)使所述脱保护的官能团与所述激活的末端基团前体反应；
其中受控的封端或末端基团化学计量指每种类型的末端基团的预定的数目，受控的封端或末端基团拓扑学指树枝聚体的表面层上的第一种和第二种末端基团的非随机的预定位置。
37.用于制备具有受控的末端基团化学计量和拓扑学的大分子的方法，其包括下述步骤：
(i)提供
包括具有官能团和1种或更多种不同的可分解的或正交的保护基团的外层的增长性大分子；和
表面改性剂化合物，其包括：
羧化物基团
其为药学活性剂的残基的第一种末端基团；和
选择用于修饰所述药学活性剂和/或大分子的药代动力学的第二种末端基团；
(ii)激活所述表面改性剂化合物上的所述羧化物基团；
(iii)通过去除保护基团使所述增长性大分子的所述外层上的官能团脱保护；和
(vii)使所述增长性大分子上所述脱保护的官能团与所述表面改性剂化合物上的所述激活的羧化物基团反应，
其中受控的封端或末端基团化学计量指每种类型的末端基团的预定的数目，受控的封端或末端基团拓扑学指树枝聚体的表面层上的第一种和第二种末端基团的非随机的预定位置。
38.根据权利要求36或37的方法，其中所述增长性大分子包括至少一个赖氨酸或赖氨酸类似物基序。
39.根据权利要求36或37的方法，其中所述所述表面改性剂化合物包括赖氨酸或赖氨酸类似物主链。
40.根据权利要求36或37的方法，其中所述第二种末端基团是聚乙二醇(PEG)或聚乙基噁唑啉(PEO)。
41.根据权利要求36或37的方法，其中所述药学活性剂是抗肿瘤剂。
42.通过权利要求36或37的方法制备的大分子。
43.用于制备表面改性剂化合物的方法，所述方法包括：
(i)提供
具有2种或更多种不同的可分解的或正交的胺保护基团和羧化物基团的赖氨酸或赖氨酸类似物化合物；
其为药学活性剂的残基的第一种末端基团的前体；和
选择用于修饰所述药学活性剂和/或大分子的药代动力学的第二种末端基团的前体；
(ii)使所述受保护的赖氨酸或赖氨酸类似物化合物上的第一种胺脱保护；
(iii)激活所述第一种或第二种末端基团前体；
(iv)使所述激活的末端基团前体与所述脱保护的胺基反应；
(v)使所述受保护的赖氨酸或赖氨酸类似物化合物上的第二种胺脱保护；
(vi)激活所述第一种或第二种末端基团前体中的另一种；和
(vii)使所述另一种激活的末端基团前体与所述第二种脱保护的胺基反应，以提供表面改性剂化合物。
44.根据权利要求43的方法，其中所述第二种末端基团是聚乙二醇(PEG)或聚乙基噁唑啉(PEO)。
45.根据权利要求43的方法，其中所述药学活性剂是抗肿瘤剂。
46.通过权利要求43-45任一项的方法制备的表面改性剂化合物。
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