ES2834992T3 - Macromoléculas - Google Patents

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Abstract

Una macromolécula que comprende: i) un dendrímero que comprende un núcleo y al menos una generación de unidades de construcción, teniendo la generación más externa de unidades de construcción grupos amino de superficie en donde al menos dos grupos terminales diferentes están unidos covalentemente a los grupos amino de superficie del dendrímero; ii) un primer grupo terminal que es un resto de un agente farmacéuticamente activo que comprende un grupo hidroxilo; iii) un segundo grupo terminal que es un agente modificador de la farmacocinética; en donde el primer grupo terminal está unido covalentemente al grupo amino de superficie del dendrímero a través de un conector diácido, comprendiendo el conector diácido una cadena principal que contiene uno o más átomos de oxígeno, azufre o nitrógeno; en donde el conector diácido forma un enlace éster con el grupo hidroxilo del agente farmacéuticamente activo y un enlace amida con el grupo amino de superficie; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN
Macromoléculas
Campo de la invención
La presente invención se refiere generalmente a una macromolécula que comprende un dendrímero que tiene grupos amina de superficie a los que están unidos al menos dos grupos terminales diferentes que incluyen un agente farmacéuticamente activo y un agente modificador de la farmacocinética, estando unido el agente farmacéuticamente activo covalentemente a través de un conector diácido. También se describen composiciones farmacéuticas y la macromolécula para usar en métodos de tratamiento.
Antecedentes de la invención
Hay una serie de dificultades asociadas con la formulación y administración de agentes farmacéuticamente activos, que incluyen la escasa solubilidad en agua, toxicidad, baja biodisponibilidad, inestabilidad en condiciones biológicas, falta de direccionamiento al sitio de acción y rápida degradación in vivo.
Para combatir algunas de estas dificultades, los agentes farmacéuticamente activos pueden formularse con agentes solubilizantes que por sí mismos pueden causar efectos secundarios tales como hipersensibilidad y pueden requerir premedicación para reducir estos efectos secundarios. Los enfoques alternativos incluyen la encapsulación del agente farmacéuticamente activo en liposomas, micelas o matrices poliméricas o la unión del agente farmacéuticamente activo a liposomas, micelas y matrices poliméricas.
Aunque estos enfoques pueden mejorar algunos de los problemas asociados con la formulación y administración de agentes farmacéuticamente activos, muchos todavía tienen inconvenientes.
Los fármacos oncológicos pueden ser particularmente difíciles de formular y tienen efectos secundarios que pueden limitar la cantidad de dosis y el régimen que se puede usar para el tratamiento. Esto puede dar como resultado una reducción de la eficacia del tratamiento. Por ejemplo, los fármacos taxanos tales como paclitaxel, docetaxel y cabazitaxel tienen baja solubilidad en agua y a menudo se formulan con excipientes de solubilización tales como aceites de ricino polietoxilados (Cremophor EL) o polisorbato 80. Aunque estos excipientes de solubilización permiten mayores cantidades de fármaco en la formulación, se sabe que producen efectos secundarios importantes ellos mismos, incluida la hipersensibilidad. Para reducir la hipersensibilidad, a veces se usa premedicación con esteroides tales como la dexametasona en el régimen de dosificación. Sin embargo, esto también tiene inconvenientes, ya que los corticosteroides tienen efectos secundarios y no se pueden usar en pacientes diabéticos, que forman un subconjunto significativo de pacientes mayores de 50 años con cáncer de mama.
El uso de liposomas, micelas y matrices poliméricas como vehículos encapsulantes o que tienen el agente farmacéutico unido, aunque permite la solubilización del agente farmacéuticamente activo y en algunos casos mejora la biodisponibilidad y el direccionamiento, presenta dificultades en relación con la liberación del agente farmacéuticamente activo. En algunos casos, el vehículo se degrada rápidamente liberando el agente farmacéuticamente activo antes de que alcance el órgano diana. En otros casos, la liberación del agente farmacéuticamente activo del vehículo es variable y, por lo tanto, puede no alcanzar una dosis terapéutica de fármaco en el cuerpo o en el órgano diana.
Otra dificultad con los liposomas, micelas y matrices de polímeros como vehículos es que la carga de fármaco puede ser variable. Esto puede dar como resultado que algunos lotes de una composición particular sean efectivos mientras que otros no lo sean y/o dificultades en el registro de un producto para uso clínico debido a la variabilidad en el producto.
Además, estas moléculas pueden ser materiales inestables o mal caracterizados, pueden sufrir polidispersidad y, debido a su naturaleza, ser difíciles de analizar y caracterizar. También pueden tener vías de fabricación difíciles. Estas dificultades, especialmente con respecto al análisis y la inconsistencia de un lote a otro, obstaculizan significativamente el camino hacia la presentación y aprobación regulatoria.
Con agentes farmacéuticamente activos que tienen escasa solubilidad en agua, a menudo el método de administración se limita, por ejemplo, a la administración parenteral. Esto puede limitar el régimen de dosificación disponible y la dosis que se puede administrar.
El documento WO 2007/082331 describe macromoléculas que tienen una estequiometría de grupo terminal controlada y que incluyen una capa superficial, al menos una capa subsuperficial y al menos dos grupos terminales, que incluyen: un primer grupo terminal que es un resto de un agente farmacéuticamente activo, un derivado del mismo o un precursor del mismo; y un segundo grupo terminal seleccionado para modificar la farmacocinética del agente y/o macromolécula farmacéuticamente activos, en donde la estequiometría terminal se refiere al número y tipo de grupos terminales.
Fox et al., Mol. Pharm. 6 (5):1562-1572 (2009) describen un polímero conjugado de camptotecina y un dendrímero de poli(L-lisina) simétricamente PEGilado funcionalizado en el núcleo, que consiste en un dendrímero de lisina funcionalizado con ácido aspártico, que se usaba como sitio de unión para el poli(etilenglicol) y camptotecina.
Lim et al., Bioconjugate Chem., 2009) 20:2154-2161 describen el diseño, caracterización y evaluación biológica preliminar de tres dendrímeros, todos los cuales presentan 12 grupos paclitaxel unidos por acilación del grupo 2'-hidroxilo y en los que el conector para dos de los dendrímeros incluye un disulfuro.
Existe una necesidad de formulaciones alternativas y medios de administración para administrar fármacos para reducir los efectos secundarios, mejorar los regímenes de dosificación y mejorar la ventana terapéutica que puede conducir a mejoras en el cumplimiento y la eficacia del fármaco en los pacientes.
Sumario de la invención
La invención se basa en parte en el descubrimiento de que las macromoléculas que comprenden un dendrímero con grupos amino de superficie que tienen al menos dos grupos terminales diferentes unidos a los grupos amino de superficie del dendrímero y en donde el primer grupo terminal es un agente farmacéuticamente activo unido covalentemente al grupo amino de superficie a través de un conector diácido y el segundo grupo terminal es un agente modificador de la farmacocinética, pueden permitir una alta carga de fármaco, mejor solubilidad y liberación controlada del agente farmacéuticamente activo. La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas. La materia que no se incluye en las reivindicaciones no forma parte de la presente invención.
En un primer aspecto de la descripción se proporciona una macromolécula que comprende:
i) un dendrímero que comprende un núcleo y al menos una generación de unidades de construcción, teniendo la generación más externa de unidades de construcción grupos amino de superficie, en donde al menos dos grupos terminales diferentes están unidos covalentemente a los grupos amino de superficie del dendrímero;
ii) un primer grupo terminal que es un resto de un agente farmacéuticamente activo que comprende un grupo hidroxilo; iii) un segundo grupo terminal que es un agente modificador de la farmacocinética;
en donde el primer grupo terminal está unido covalentemente al grupo amino de superficie del dendrímero a través de un conector diácido, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En algunas realizaciones, el agente farmacéuticamente activo es un fármaco oncológico, especialmente docetaxel, paclitaxel, cabazitaxel, camptotecina, topotecán, irinotecán o gemcitabina. En otras realizaciones, el agente farmacéuticamente activo es un esteroide, especialmente testosterona. En algunos casos, el agente farmacéuticamente activo es poco soluble o insoluble en solución acuosa.
En algunas realizaciones, el agente modificador de la farmacocinética es polietilenglicol, especialmente polietilenglicol que tiene un peso molecular en el intervalo de 220 a 2500 Da, más especialmente de 570 a 2500 Da. En algunas realizaciones, el polietilenglicol tiene un peso molecular entre 220 y 1100 Da, especialmente 570 y 1100 Da. En otras realizaciones, el polietilenglicol tiene un peso molecular entre 1000 y 5500 Da o 1000 y 2500 Da, especialmente 1000 y 2300 Da.
En algunos casos, el conector diácido tiene la fórmula:
-C(O)-J-C(O)-X-C(O)-
en donde X se selecciona de -alquileno C1-C10-, -(CH2)s-A-(CH2)t- y Q;
-C(O)-J- está ausente, es un resto de aminoácido o un péptido de 2 a 10 restos de aminoácido, en donde -C(O)- deriva del carboxi terminal del aminoácido o péptido;
A se selecciona de -O-, -S-, -NR1-, -N+(R1)2-, -S-S-, -[OCH2CH2]rO-, -Y- y -O-Y-O-;
Q se selecciona de Y o -Z = N-NH-S(O)w-Y-;
Y se selecciona de cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo;
Z se selecciona de -(CH2)x-C(CH3)=, -(CH2)xCH=, cicloalquilo y heterocicloalquilo;
R1 se selecciona de hidrógeno y alquilo C1-C4;
s y t se seleccionan independientemente de 1 y 2;
r se selecciona de 1,2 y 3;
w se selecciona de 0, 1 y 2; y
x se selecciona de 1, 2, 3 y 4.
En algunas realizaciones, el dendrímero tiene de 1 a 8 generaciones de unidades de construcción, especialmente de 3 a 6 generaciones de unidades de construcción. En algunas realizaciones, el dendrímero es un dendrímero que comprende unidades de construcción de lisina o análogos de lisina. En otros casos, el dendrímero comprende unidades de construcción de polieterhidroxilamina.
En algunas realizaciones, el primer grupo terminal y el segundo grupo terminal están presentes en una proporción 1:1. En algunas realizaciones, la macromolécula comprende un tercer grupo terminal que es un grupo de bloqueo, especialmente un grupo acilo tal como el acetato. En algunos casos, la relación entre el primer grupo terminal, el segundo grupo terminal y el tercer grupo terminal es 1:2:1.
En algunos casos, al menos 50% de los grupos terminales comprenden un primer o segundo grupo terminal.
En algunas realizaciones, el dendrímero comprende un agente de direccionamiento unido a un grupo funcional en el núcleo opcionalmente a través de un grupo espaciador, especialmente cuando el agente de direccionamiento se selecciona de hormona liberadora de hormona luteinizante, un análogo de la hormona liberadora de hormona luteinizante tal como deslorelina, LYP-1 y un anticuerpo o fragmento del mismo.
En algunas realizaciones, la macromolécula tiene un tamaño de partículas de menos de 1000 nm, especialmente entre 5 y 1000 nm, más especialmente entre 5 y 400 nm, lo más especialmente entre 5 y 50 nm. En algunas realizaciones, la macromolécula tiene un peso molecular de al menos 30 kDa, especialmente de 40 a 300 kDa, más especialmente de 40 a 150 kDa.
En otro aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende la macromolécula de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunos casos, la composición está sustancialmente exenta de excipientes de solubilización tales como aceites de ricino polietoxilados (p. ej.: Cremphor EL) y polisorbato 80. Al eliminar el excipiente de solubilización, es menos probable que la composición de dendrímero cause efectos secundarios tales como hipersensibilidad aguda o retardada que incluyen anafilaxia potencialmente mortal y/o retención de líquidos grave.
En algunos casos, la macromolécula se formula como una formulación de liberación lenta. En algunos casos, el conector se selecciona para permitir la liberación controlada del agente farmacéuticamente activo. En algunas realizaciones, la macromolécula se formula para liberar más de 50% del agente farmacéuticamente activo entre 5 minutos y 60 minutos. En otros casos, la macromolécula se formula para liberar más de 50% del agente farmacéuticamente activo entre 2 horas y 48 horas. En otros casos más, la macromolécula se formula para liberar más de 50% del agente farmacéuticamente activo entre 5 y 30 días.
En otro aspecto de la invención, se proporciona una macromolécula o composición farmacéutica de la invención para usar en un método de tratamiento o supresión del crecimiento de un cáncer que comprende administrar una cantidad eficaz de la macromolécula o composición farmacéutica de la invención en la que el agente farmacéuticamente activo del primer grupo terminal es un fármaco oncológico.
En algunos casos, los tumores son tumores primarios o metastásicos de próstata, testículos, pulmón, colon, páncreas, riñón, hueso, bazo, cerebro, cabeza y/o cuello, mama, tracto gastrointestinal, piel u ovario.
En algunos casos, el método comprende la administración de una composición de una macromolécula que está sustancialmente exenta de aceites de ricino polietoxilados tales como Cremophor EL o polisorbato 80.
En otro aspecto de la invención, el uso es en un método para reducir la hipersensibilidad tras el tratamiento con un fármaco oncológico y comprende administrar una composición farmacéutica de la presente invención, en donde la composición está sustancialmente exenta de excipientes de solubilización tales como Cremophor EL y polisorbato 80.
En un aspecto adicional de la invención, el uso es en un método para reducir la toxicidad de un fármaco oncológico o formulación de un fármaco oncológico, y comprende administrar una macromolécula de la invención en donde el fármaco oncológico es el agente farmacéuticamente activo del primer grupo terminal.
En algunos casos la toxicidad que se reduce es toxicidad hematológica, toxicidad neurológica, toxicidad gastrointestinal, cardiotoxicidad, hepatotoxicidad, nefrotoxicidad, ototoxicidad o encefalotoxicidad.
En otro aspecto más de la invención, el uso es en un método para reducir los efectos secundarios asociados con un fármaco oncológico o formulación de un fármaco oncológico, y comprende administrar una macromolécula de la invención en la que el fármaco oncológico es el agente farmacéuticamente activo del primer grupo terminal.
En algunos casos, los efectos secundarios que se reducen se seleccionan de neutropenia, leucopenia, trombocitopenia, mielotoxicidad, mielosupresión, neuropatía, fatiga, problemas neurocognitivos inespecíficos, vértigo, encefalopatía, anemia, disgeusia, disnea, estreñimiento, anorexia, trastornos de las uñas, retención de líquidos, astenia, dolor, náuseas, vómitos mucositis, alopecia, reacciones cutáneas, mialgia, hipersensibilidad y anafilaxia,
En algunos casos se reduce o elimina la necesidad de premedicación con agentes tales como corticosteroides y antihistamínicos.
En otro aspecto más de la descripción se proporciona un método para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno relacionado con niveles bajos de testosterona que comprende administrar una macromolécula o composición farmacéutica del presente documento en la que el agente farmacéuticamente activo es testosterona.
En algunos casos, la composición se formula para administración transdérmica, especialmente mediante parche transdérmico que opcionalmente tiene microagujas.
Descripción de la invención
Las formas singulares "un", "una" y "el", "la" incluyen aspectos plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra "comprender" y variaciones tales como "comprende" y "que comprende" implican la inclusión de un número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas establecidos, pero no la exclusión de ningún otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas.
Como se usa en el presente documento, el término "alquilo" se refiere a un grupo hidrocarbonado saturado de cadena lineal o ramificada que tiene de 1 a 10 átomos de carbono. Cuando sea apropiado, el grupo alquilo puede tener un número específico de átomos de carbono, por ejemplo, alquilo C1-4 que incluye grupos alquilo que tienen 1, 2, 3 o 4 átomos de carbono en una disposición lineal o ramificada. Los ejemplos de grupos alquilo adecuados incluyen, pero no se limitan a metilo, etilo, n-propilo, /-propilo, n-butilo, /'-butilo, f-butilo, n-pentilo, 2-metilbutilo, 3-metilbutilo, 4-metilbutilo, n-hexilo, 2-metilpentilo, 3-metilpentilo, 4-metilpentilo, 5-metilpentilo, 2-etilbutilo, 3-etilbutilo, heptilo, octilo, nonilo y decilo.
El término "alquileno", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo divalente de cadena lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono. Cuando sea apropiado, el grupo alquileno puede tener un número específico de átomos de carbono, por ejemplo, alquileno C1-C6 incluye -CH2-, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5 y -(CH2)6-.
Como se usa en el presente documento, el término "cicloalquilo" se refiere a un hidrocarburo cíclico saturado o insaturado. El anillo de cicloalquilo puede incluir un número específico de átomos de carbono. Por ejemplo, un grupo cicloalquilo de 3 a 8 miembros incluye 3, 4, 5, 6, 7 u 8 átomos de carbono. Los ejemplos de grupos cicloalquilo adecuados incluyen, pero no se limitan a ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentanilo, ciclopentenilo, ciclohexanilo, ciclohexenilo, 1,4-ciclohexadienilo, cicloheptanilo y ciclooctanilo.
Como se usa en el presente documento, el término "arilo" significa cualquier anillo de carbonos estable, monocíclico o bicíclico de hasta 7 átomos en cada anillo, en donde al menos un anillo es aromático. Los ejemplos de dichos grupos arilo incluyen, pero no se limitan a fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, indanilo, bifenilo y binaftilo.
El término "heterocicloalquilo" o "heterociclilo" como se usa en el presente documento, se refiere a un hidrocarburo cíclico en el que de uno a cuatro átomos de carbono se han reemplazado por heteroátomos seleccionados independientemente del grupo que consiste en N, N(R), S, S(O), S(O)2 y O. Un anillo heterocíclico puede ser saturado o insaturado. Los ejemplos de grupos heterociclilo adecuados incluyen tetrahidrofuranilo, tetrahidrotiofenilo, pirrolidinilo, pirrolinilo, piranilo, piperidinilo, pirazolinilo, ditiolilo, oxatiolilo, dioxanilo, dioxinilo, morfolino y oxazinilo.
El término "heteroarilo" como se usa en el presente documento, representa un anillo monocíclico o bicíclico estable de hasta 7 átomos en cada anillo, donde al menos un anillo es aromático y al menos un anillo contiene de 1 a 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S. Los grupos heteroarilo dentro del alcance de esta definición incluyen, pero no se limitan a acridinilo, carbazolilo, cinolinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, pirazolilo, indolilo, benzotriazolilo, furanilo, tienilo, tiofenilo, 3,4-propilendioxitiofenilo, benzotienilo, benzofuranilo, benzodioxano, benzodioxina, quinolinilo, isoquinolinilo, oxazolilo, isoxazolilo, imidazolilo, pirazinilo, piridazinilo, piridinilo, pirimidinilo, pirrolilo, tetrahidroquinolina, tiazolilo, isotiazolilo, 1,2,4-triazolilo, 1,2,3-triazolilo, 1,2,4-oxadiazolilo, 1,2,4-tiadiazolilo, 1,3,5-triazinilo, 1,2,4-triazinilo, 1,2,4,5-tetrazinilo y tetrazolilo.
El término "dendrímero" se refiere a una molécula que contiene un núcleo y al menos un dendrón unido al núcleo. Cada dendrón se compone de al menos una capa o generación de unidades de construcción ramificadas que da como resultado una estructura ramificada con un número creciente de ramas con cada generación de unidades de construcción. El número máximo de dendrones unidos al núcleo está limitado por el número de grupos funcionales en el núcleo. El núcleo puede tener uno o más grupos funcionales adecuados para llevar un dendrón y, opcionalmente, un grupo funcional adicional para la unión de un agente adecuado para dirigirse a un órgano o tejido específico, señalización o formación de imágenes.
La expresión "unidad de construcción" utilizada en el presente documento se refiere a una molécula ramificada que tiene al menos tres grupos funcionales, uno para la unión al núcleo o una generación anterior de unidades de construcción y al menos dos grupos funcionales para la unión a la siguiente generación de unidades de construcción o para formar la superficie de la molécula de dendrímero.
El término "generación" se refiere al número de capas de unidades de construcción que componen un dendrón o dendrímero. Por ejemplo, un dendrímero de una generación tendrá una capa de unidades de construcción ramificadas unidas al núcleo, por ejemplo, Núcleo-[[unidad de construcción]]u donde u es el número de dendrones unidos al núcleo. Un dendrímero de dos generaciones tiene dos capas de unidades de construcción en cada dendrón unido al núcleo, por ejemplo, cuando la unidad de construcción tiene un punto de ramificación, el dendrímero puede ser: Núcleo[[unidad de construcción][unidad de construcción]2]u, un dendrímero de tres generaciones tiene tres capas de unidades de construcción en cada dendrón unido al núcleo, por ejemplo, Núcleo-[[unidad de construcción][unidad de construcción]2[unidad de construcción^, un dendrímero de 6 generaciones tiene seis capas de unidades de construcción unidas al núcleo, por ejemplo, Núcleo-[[unidad de construcción][unidad de construcción]2[unidad de construcción]4[unidad de construcción]8[unidad de construcción]16[unidad de construcción]32]u, y similares. La última generación de unidades de construcción (la generación más externa) proporciona la funcionalización de la superficie del dendrímero y el número de grupos funcionales disponibles para unir grupos terminales. Por ejemplo, en un dendrímero que tiene un núcleo con dos dendrones unidos (u = 2), si cada unidad de construcción tiene un punto de ramificación y hay 6 generaciones, la generación más externa tiene 64 unidades de construcción y 128 grupos funcionales disponibles para unir grupos terminales.
La expresión "escasamente soluble" como se usa en el presente documento se refiere a un fármaco o agente farmacéuticamente activo que tiene una solubilidad entre 1 mg/ml y 10 mg/ml en agua. Los fármacos que tienen una solubilidad en agua inferior a 1 mg/ml se consideran insolubles.
La expresión "agente farmacéuticamente activo" como se usa en el presente documento se refiere a un compuesto que se usa para ejercer un efecto terapéutico in vivo. Esta expresión se usa indistintamente con el término "fármaco". La expresión "resto de un agente farmacéuticamente activo" se refiere a la porción de la macromolécula que es un agente farmacéuticamente activo cuando el agente farmacéuticamente activo se ha modificado por unión a la macromolécula.
La expresión "fármaco oncológico" utilizada en el presente documento se refiere a un agente farmacéuticamente activo utilizado para tratar el cáncer, tal como un fármaco de quimioterapia.
Como se usa en el presente documento, la expresión "excipiente de solubilización" se refiere a un aditivo de formulación que se usa para solubilizar fármacos insolubles o escasamente solubles en una formulación acuosa. Los ejemplos incluyen tensioactivos tales como aceites de ricino polietoxilados que incluyen Cremophor EL, Cremophor RH 40 y Cremophor RH 60, succinato de D-a-tocoferol-polietilenglicol 1000, polisorbato 20, polisorbato 80, soluto1HS 15, monoleato de sorbitán, poloxámero 407, Labrasol y similares.
Las macromoléculas de la descripción pueden estar en forma de sales farmacéuticamente aceptables. Sin embargo, se apreciará que las sales no farmacéuticamente aceptables pueden ser útiles como productos intermedios en la preparación de sales farmacéuticamente aceptables o pueden ser útiles durante el almacenamiento o transporte. Las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen, pero no se limitan a sales de ácidos inorgánicos farmacéuticamente aceptables tales como los ácidos clorhídrico, sulfúrico, fosfórico, nítrico, carbónico, bórico, sulfámico y bromhídrico, o sales de ácidos orgánicos farmacéuticamente aceptables tales como los ácidos acético, propiónico, butírico, tartárico, maleico, hidroximaleico, fumárico, maleico, cítrico, láctico, múcico, glucónico, benzoico, succínico, oxálico, fenilacético, metanosulfónico, toluenosulfónico, benecenosulfónico, salicíclico sulfanílico, aspártico, glutámico, edético, esteárico, palmítico, oleico, láurico, pantoténico, tánico, ascórbico y valérico.
Las sales de bases incluyen, pero no se limitan a las formadas con cationes farmacéuticamente aceptables, tales como sodio, potasio, litio, calcio, magnesio, amonio y alquilamonio.
Los grupos que contienen nitrógeno básico se pueden cuaternizar con agentes tales como haluro de alquilo inferior, tales como cloruros, bromuros y yoduros de metilo, etilo, propilo y butilo; sulfatos de dialquilo como sulfato de dimetilo y dietilo; y otros.
Macromoléculas
Las macromoléculas de la descripción comprenden:
i) un dendrímero que comprende un núcleo y al menos una generación de unidades de construcción, teniendo la generación más externa de unidades de construcción grupos amino de superficie, en donde al menos dos grupos terminales diferentes están unidos covalentemente a los grupos amino de superficie del dendrímero;
ii) un primer grupo terminal que es un resto de un agente farmacéuticamente activo que comprende un grupo hidroxilo;
iii) un segundo grupo terminal que es un agente modificador de la farmacocinética;
en donde el primer grupo terminal está unido covalentemente al grupo amino de superficie del dendrímero a través de un conector diácido, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Los dendrímeros que tienen grupos amino de superficie tienen al menos dos grupos terminales diferentes unidos covalentemente a los grupos amino de superficie.
El primer grupo terminal es un resto de un agente farmacéuticamente activo que comprende un grupo hidroxilo libre. El agente farmacéuticamente activo se une al grupo amino de superficie del dendrímero a través de un conector diácido. El conector diácido forma un enlace éster con el grupo hidroxilo del agente farmacéuticamente activo y un enlace amida con el grupo amino de superficie.
El agente farmacéuticamente activo puede ser cualquier agente farmacéuticamente activo que tenga un grupo hidroxilo disponible para la formación de éster con el conector diácido y se administre a un sujeto para producir un efecto terapéutico.
En algunas realizaciones, el agente farmacéuticamente activo es un fármaco oncológico tal como un taxano, un nucleósido o un inhibidor de quinasa, un esteroide, un analgésico opioide, un fármaco respiratorio, un fármaco del sistema nervioso central (SNC), un fármaco hipercolesterolémico, un fármaco antihipertensivo, un fármaco inmunosupresor, un antibiótico, un agonista de la hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH), un antagonista de la LHRH, un fármaco antiviral, un fármaco antirretroviral, un modulador del receptor de estrógenos, un mimético de la somatostatina, un fármaco antiinflamatorio, un análogo de vitamina D2, una tiroxina sintética, un antihistamínico, un agente antifúngico o un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE).
Los fármacos oncológicos adecuados incluyen taxanos tales como paclitaxel, cabazitaxel y docetaxel, camptotecina y sus análogos tales como irinotecán y topotecán, otros agentes antimicrotúbulos tales como vinflunina, nucleósidos tales como gemcitabina, cladribina, fludarabina capecitabina, decitabina, azacitidina, clofarabina, nelarabina, inhibidores de quinasa tales como sprycel, temisirolimus, dasatinib, AZD6244, AZD1152, PI-103, R-roscovitina, olomucina y purvalanol A, y análogos de epotilona B tales como ixabepilona, antraciclinas tales como amrubicina, doxorubicina, epirubicina y valrubicina, inductores de superóxido tales como trabectecina, inhibidores del proteosoma tales como bortezomib y otros inhibidores de topoisomerasa, agentes intercalantes y agentes alquilantes.
Los esteroides adecuados incluyen esteroides anabólicos tales como testosterona, dihidrotestosterona y etinilestradiol, y corticosteroides tales como cortisona, prednisilona, budesonida, triamcinolona, fluticasona, mometasona, amcinonida, flucinolona, fluocinanida, desonida, halcinonida, prednicarbato, fluocortolona, dexametasona, betametasona y fluprednidina.
Los analgésicos opioides adecuados incluyen morfina, oximorfona, naloxona, codeína, oxicodona, metilnaltrexona, hidromorfona, buprenorfina y etorfina.
Los fármacos respiratorios adecuados incluyen broncodilatadores, esteroides inhalados y descongestionantes y más particularmente salbutamol, bromuro de ipratropio, montelukast y formoterol.
Los fármacos adecuados para el SNC incluyen antipsicóticos tales como quetiapina y antidepresivos tales como venlafaxina.
Los fármacos adecuados para controlar la hipercolesterolemia incluyen ezetimiba y estatinas tales como simvastatina, lovastatina, atorvastatina, fluvastatina, pitavastatina, provastatina y rosuvastatina.
Los fármacos antihipertensivos adecuados incluyen losartán, olmesartán, medoxomil, metrolol, travoprost y bosentano. Los fármacos inmunosupresores adecuados incluyen glucocorticoides, citostáticos, fragmentos de anticuerpos, antiinmunofilinas, interferones, proteínas de unión a TNF y, más particularmente, inhibidores de cacineurina tales como tacrolimus, ácido micofenólico y sus derivados tales como micofenolato de mofetilo y ciclosporina.
Los agentes antibacterianos adecuados incluyen antibióticos tales como amoxicilina, meropenem y ácido clavulánico. Los agonistas de LHRH adecuados incluyen acetato de goserelina, deslorelina y leuprorelina.
Los antagonistas de LHRH adecuados incluyen cetrorelix, ganirelix, abarelix y degarelix.
Los agentes antivirales adecuados incluyen análogos de nucleósidos tales como lamivudina, zidovudina, abacavir y entecavir y los fármacos antirretrovirales adecuados incluyen inhibidores de proteasa tales como atazanavir, lapinavir y ritonavir.
Los moduladores selectivos del receptor de estrógenos adecuados incluyen raloxifeno y fulvestrant.
Los miméticos de somastatina adecuados incluyen octreótido.
Los fármacos antiinflamatorios adecuados incluyen mesalazina y los AINE adecuados incluyen acetaminofén (paracetamol).
Los análogos de vitamina D2 adecuados incluyen paricalcitol.
Las tiroxinas sintéticas adecuadas incluyen levotiroxina.
Los antihistamínicos adecuados incluyen fexofenadina.
Los agentes antifúngicos adecuados incluyen azoles tales como viriconazol.
En algunos casos, el agente farmacéuticamente activo es escasamente soluble o insoluble en solución acuosa. En realizaciones particulares, el agente farmacéuticamente activo se selecciona de docetaxel, paclitaxel, testosterona, gemcitabina, camptotecina, irinotecán y topotecán, especialmente docetaxel, paclitaxel y testosterona.
El conector diácido que conecta el agente farmacéuticamente activo a los grupos amino de superficie del dendrímero tiene la fórmula:
-C(O)-J-C(O)-X-C(O)-en donde X se selecciona de -alquileno C1-C10-, -(CH2)s-A-(CH2)t- y Q;
-C(O)-J- está ausente, es un resto de aminoácido o un péptido de 2 a 10 restos de aminoácido, en donde -C(O)- deriva del carboxi terminal del aminoácido o péptido;
A se selecciona de -O-, -S-, -NR1-, -N+(R1)2-, -S-S-, -[OCH2CH2]r-O-, -Y- y -O-Y-O-;
Q se selecciona de Y o -Z= N-NH-S(O)w-Y-;
Y se selecciona de cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo;
Z se selecciona de -(CH2)x-C(CH3)=, -(CH2)xCH=, cicloalquilo y heterocicloalquilo;
R1 se selecciona de hidrógeno y alquilo C1-C4;
s y t se seleccionan independientemente de 1 y 2;
r se selecciona de 1,2 y 3;
w se selecciona de 0, 1 y 2; y
x se selecciona de 1, 2, 3 y 4.
En algunos casos, se aplica uno o más de los siguientes:
X es -alquileno-C1-C6, -CH2-A-CH2-, -CH2CH2-A-CH2CH2- o heteroarilo;
-C(O)-J está ausente, es un resto de aminoácido o un péptido de 2 a 6 restos de aminoácido, en donde -C(O)- deriva del carboxi terminal del aminoácido o péptido;
A se selecciona de -O-, -S-, -S-S-, -NH-, -N(CH3)-, -N+(CH3)2-, -O-1,2-fenil-O-, -O-1,3-fenil-O-, -O-1,4-fenil-O-, -OCH2CH2O-, -[OCH2CH2]2-O- y -[OCH2CH2]3-O-;
Y es heteroarilo o arilo, especialmente tiofenilo, 3,4-propilendioxitiofenilo o benceno;
Z es -(CH2)xC(CH3)=, -(CH2)xCH= y cicloalquilo, especialmente -CH2CH2C(CH3)=, -CH2CH2CH2C(CH3)=, -CH2CH2CH2CH=, ciclopentilo y ciclohexilo;
R1 es hidrógeno, metilo o etilo, especialmente hidrógeno o metilo, más especialmente metilo;
uno de s y t es 1 y el otro es 1 o 2, especialmente si tanto s como t son 1;
r es 1 o 2, especialmente 2;
w es 1 o 2, especialmente 2; y
x es 2 o 3, especialmente 3.
En algunos casos, -C(O)-J- está ausente. En otros casos, -C(O)-J- es un resto de aminoácido o un péptido que tiene de 2 a 6 restos de aminoácido. En estos casos, el N terminal del aminoácido o péptido forma un enlace amida con el grupo -C(O)-x-C(O)-. En algunos casos, el péptido es un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es reconocida y escindida por una enzima endógena, tal como una proteasa. En algunos casos, la enzima es una enzima intracelular. En otros casos, la enzima es una enzima extracelular. En casos particulares, la enzima es una que está presente en o alrededor de tejido neoplásico, tal como tejido tumoral. En algunos casos, el péptido es reconocido por captesina B o una metaloproteasa tal como una metaloproteinasa neutra (NMP), MMP-2 y MMP-9. Los péptidos de ejemplo incluyen GGG, GFLG y GILGVP.
En casos particulares, el conector diácido se selecciona de:
-C(O)-CH2CH2-C(O)-, -C(O)-CH2CH2CH2-C(O)-, -C(O)-CH2OCH2-C(O)-, -C(O)-CH2SCH2-C(O)-, -C(O)CH2NHCH2-C(O)-, -C(O)-CH2N(CH3)CH2-C(O)-, -C(O)-CH2N+(CHs)2CH2-C(O)-, -C(O)-CH2-S-S-CH2-C(O)-, -C(O)-OCH2CH2OCH2CH2OC(O)-,
Figure imgf000009_0001
En otros casos, el conector diácido también comprende un péptido. Los conectores diácidos de ejemplo incluyen:
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000011_0001
En algunos casos, el conector diácido se selecciona para proporcionar una velocidad de liberación deseada del fármaco. Por ejemplo, puede ser necesaria una liberación rápida cuando se requiere la carga completa de agente farmacéutico en un corto espacio de tiempo, mientras que una liberación lenta puede ser más adecuada cuando se requiere una dosis terapéutica constante baja de agente farmacéuticamente activo.
En algunos casos, la velocidad de liberación es más rápida que la del fármaco administrado independiente de la macromolécula, especialmente al menos dos veces más rápido. En algunos casos, el fármaco se libera más lentamente que el fármaco independiente de la macromolécula, especialmente cuando el fármaco se libera al menos dos veces más lento, más especialmente el fármaco se libera al menos 10 veces más lento. En algunos casos, el fármaco se libera al menos 30 veces más lento como se describe en el Ejemplo 39. Las velocidades de liberación bajas pueden ser particularmente adecuadas cuando la macromolécula incluye un grupo de direccionamiento, para permitir la liberación del fármaco en el sitio activo, pero no en el plasma. Las velocidades de liberación bajas también pueden ser adecuadas para fármacos formulados para permitir la administración de liberación lenta controlada durante períodos de tiempo largos, tales como entre 1 semana y 6 meses. El fármaco puede liberarse de la macromolécula durante un período de tiempo prolongado, tal como días, semanas o meses. La liberación rápida es preferiblemente una liberación superior a 50% en el espacio de 0 a 480 minutos, especialmente en el espacio de 0 a 120 minutos, y más especialmente en el espacio de 5 a 60 minutos. La liberación media preferiblemente es una liberación superior a 50% en el espacio de 1 a 72 horas, especialmente en el espacio de 2 a 48 horas. La liberación lenta es preferiblemente una liberación superior a 50% en más de 2 días, especialmente de 2 días a 6 meses, y más especialmente en el espacio de 5 días a 30 días.
La velocidad de liberación del fármaco se puede controlar mediante la selección del conector diácido. Los conectores diácidos que contienen uno o más átomos de oxígeno en sus cadenas principales, tales como el ácido diglicólico, ácido fenilendioxidiacético y polietilenglicol, o con un átomo de nitrógeno catiónico, tienden a liberar el fármaco a una velocidad rápida, los conectores diácidos que tienen un átomo de azufre en su cadena principal, tales como el ácido tiodiacético, tienen una velocidad de liberación media y los conectores diácidos que tienen uno o más átomos de nitrógeno, dos o más átomos de azufre, cadenas de alquilo o grupos heterocíclicos o heteroarilo liberan el fármaco a una velocidad lenta. La velocidad de liberación se puede resumir en uno o más -O- > -N+(R1)2- > un -S- > un -NR-> -N-NH-SO2- > -S-S- > -alquilo- > -heterociclilo-.
Puede verse en la Tabla 2, que en los estudios de macromoléculas en muestras de plasma el ácido diglicólico (Experimento 3 (b)) liberaba docetaxel a una velocidad rápida, con una semivida de menos de 22 horas, el conector ácido tiodiacético (Experimento 8 (c)) liberaba docetaxel a una velocidad media, con una semivida de poco más de 22 horas, extrapolada a aproximadamente de 24 a 30 horas y el conector ácido glutárico (Experimento 5 (b)) liberaba docetaxel a una velocidad lenta con una semivida mucho mayor de 22 horas y se prevé que sea de más de 2 días. Los experimentos 16 y 17 no liberan sustancialmente docetaxel en el plasma, pero permiten que la macromolécula se dirija a un tumor en el que las proteasas pueden escindir la secuencia del péptido para proporcionar el docetaxel en el sitio de acción.
La velocidad de liberación también puede depender de la identidad del agente farmacéuticamente activo.
En algunos casos, cada agente farmacéuticamente activo se une al dendrímero con el mismo conector diácido. En otros casos, se utilizan dos o más conectores diácidos diferentes que permiten que el agente farmacéuticamente activo se libere de la macromolécula a velocidades diferentes.
El segundo grupo terminal es un agente modificador de la farmacocinética, que puede ser cualquier molécula o resto del mismo que modifique o modula el perfil farmacocinético del agente farmacéuticamente activo o la macromolécula, incluyendo absorción, distribución, metabolismo y/o excreción. En un caso particular, el agente modificador de la farmacocinética es un agente seleccionado para prolongar la semivida plasmática del agente farmacéuticamente activo, de tal manera que la macromolécula tiene una semivida mayor que la semivida del agente farmacéuticamente activo nativo, o el agente farmacéuticamente activo comercializado en una formulación sin dendrímero. Preferiblemente, la semivida de la macromolécula o composición es al menos 2 veces y más preferiblemente 10 veces mayor que la del agente farmacéuticamente activo nativo, o el agente farmacéuticamente activo comercializado en una formulación sin dendrímero.
En algunos casos, el segundo grupo terminal es polietilenglicol (PEG), una polialquiloxazolina tal como la polietiloxazolina (PEOX), polivinilpirrolidona y polipropilenglicol, especialmente PEG. En otros casos, el segundo grupo terminal es un dendrímero poliéter.
En algunas realizaciones, el PEG tiene un peso molecular de entre 220 y 5500 Da. En algunas realizaciones, el PEG tiene un peso molecular de 220 a 1100 Da, especialmente 570 y 1100 Da. En otras realizaciones, el PEG tiene un peso molecular de 1000 a 5500 Da, especialmente de 1000 a 2500 Da o de 1000 a 2300.
En algunas realizaciones, la macromolécula comprende un tercer grupo terminal. El tercer grupo terminal es un grupo de bloqueo que sirve para bloquear la reactividad de un grupo amino de superficie del dendrímero. En realizaciones particulares, el grupo de bloqueo es un grupo acilo tal como un grupo acilo C2-C10, especialmente acetilo. En otras realizaciones, el tercer grupo terminal es un segundo agente farmacéuticamente activo o un agente de direccionamiento.
En algunos casos donde hay un primer grupo terminal y un segundo grupo terminal, la relación entre el primer grupo terminal y el segundo grupo terminal es entre 1:2 y 2:1, especialmente 1:1.
En algunos casos donde hay un primer grupo terminal, un segundo grupo terminal y un tercer grupo terminal, la relación es de 1:1:1 a 1:2:2, especialmente 1:2:1.
En algunos casos, no todos los grupos amino de superficie del dendrímero están unidos a un primer grupo terminal, un segundo grupo terminal o un tercer grupo terminal. En algunos casos, algunos de los grupos amino de superficie siguen siendo grupos amino libres. En algunos casos, al menos 50% de los grupos terminales totales comprenden uno de un agente modificador de la farmacocinética o un agente farmacéuticamente activo, especialmente al menos 75% o al menos 80% de los grupos terminales comprenden uno de un agente modificador de la farmacocinética o un agente farmacéuticamente activo. En casos particulares, un agente farmacéuticamente activo está unido a más de 14%, 25%, 27%, 30% 39%, 44% o 48% del número total de grupos amino de superficie. Cuando el dendrímero es un dendrímero de polilisina G5, el número total de agentes farmacéuticamente activos es preferiblemente mayor que 15, y especialmente mayor que 23 y más especialmente mayor que 27. En algunos casos, el agente modificador de la farmacocinética está unido a más de 15%, 25%, 30%, 33% o 46% del número total de grupos amino de superficie. Cuando el dendrímero es un dendrímero de polilisina G5, el número total de agentes modificadores de la farmacocinética es preferiblemente mayor de 25, y especialmente mayor de 30.
La macromolécula de la descripción comprende un dendrímero en el que la generación más externa de unidades de construcción tiene grupos amino de superficie. La identidad del dendrímero de la macromolécula no es particularmente importante, con la condición de que tenga grupos amino en la superficie. Por ejemplo, el dendrímero puede ser un dendrímero de polilisina, análogo de polilisina, poliamidoamina (PAMAM), polietilenimina (PEI) o dendrímero de poliéter-hidroxilamina (PEHAM).
El dendrímero comprende un núcleo y uno o más dendrones compuestos de una o más unidades de construcción. Las unidades de construcción se construyen en capas denominadas generaciones.
En algunos casos, la unidad de construcción es una poliamina, más preferiblemente un di o tri-amino con un solo ácido carboxílico. Preferiblemente, el peso molecular de la unidad de construcción es de 110 Da a 1 KDa. En algunas realizaciones, la unidad de construcción es lisina o un análogo de lisina seleccionado de:
Lisina 1: que tiene la estructura:
Figure imgf000013_0001
Glicil-lisina 2 teniendo la estructura:
Figure imgf000013_0002
Análogo 3, que tiene la estructura siguiente, donde a es un número entero de 1 o 2; b y c son iguales o diferentes y son números enteros de 1 a 4:
Figure imgf000013_0003
Análogo 4, que tiene la estructura siguiente, donde a es un número entero de 0 a 2; b y c son iguales o diferentes y son números enteros de 2 a 6:
Figure imgf000013_0004
Análogo 5, que tiene la estructura siguiente, donde a es un número entero de 0 a 5; b y c son iguales o diferentes y son números enteros de 1 a 5:
Figure imgf000013_0005
Análogo 6, que tiene la estructura siguiente, donde a es un número entero de 0 a 5; b y c son iguales o diferentes y son números enteros de 0 a 5:
Figure imgf000014_0001
Análogo 7, que tiene la estructura siguiente, donde a es un número entero de 0 a 5; b y c son iguales o diferentes y son números enteros de 1 a 5:
Figure imgf000014_0002
Análogo 8, que tiene la estructura siguiente, donde a es un número entero de 0 a 5; b, c y d son iguales o diferentes y son números enteros de 1 a 5:
y además, se puede entender que los motivos de cadena de alquilo (p. ej.: -C-C-C-) de las unidades de construcción incluyen fragmentos alcoxi tales como C-O-C o C-C-O-C-C donde uno o más átomos de carbono no adyacentes se reemplazan por un átomo de oxígeno, siempre que dicha sustitución no forme un grupo O-C-X donde X es O o N. En algunos casos, la unidad de construcción es una unidad de construcción de amidoamina con la estructura 10:
Figure imgf000015_0001
una unidad de construcción de eterhidroxiamina con la estructura 11:
Figure imgf000015_0002
o una unidad de construcción de propilenimina con la estructura 12:
Figure imgf000015_0003
En un aspecto preferido de la invención, las unidades de construcción se seleccionan de lisina 1, glicil-lisina 2 o análogo de lisina 5:
Figure imgf000015_0004
donde a es un número entero de 0 a 2 o la conexión alquilo es C-O-C; b y c son iguales o diferentes y son números enteros de 1 a 2; especialmente cuando las unidades de construcción son lisina.
En algunos casos, el núcleo es un compuesto de monoamina, compuesto de diamina, compuesto de triamina, compuesto de tetraamina o compuesto de pentaamina, teniendo uno o más de los grupos amina un dendrón que comprende unidades de construcción unidas a los mismos. En realizaciones particulares, el peso molecular de la unidad de construcción es de 110 Da a 1 KDa.
Los núcleos adecuados incluyen bencidrilamina (BHA), una bencidrilamida de lisina (BHALys) o un análogo de lisina, o:
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donde a es un número entero de 1 a 9, preferiblemente de 1 a 5;
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donde a, b y c, que pueden ser iguales o diferentes, y son números enteros de 1-5, y d es un número entero de 0-100, preferiblemente 1-30;
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donde a y b pueden ser iguales o diferentes y son números enteros de 0 a 5;
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donde a y c, que pueden ser iguales o diferentes, son números enteros de 1 a 6 y donde c es un número entero de 0 a 6;
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donde a y d, que pueden ser iguales o diferentes, son números enteros de 1 a 6 y donde b y c, que pueden ser iguales o diferentes, son números enteros de 0 a 6;
Figure imgf000016_0005
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donde a y b son iguales o diferentes y son números enteros de 1 a 5, especialmente de 1 a 3, más especialmente 1; un compuesto de triamina seleccionado de:
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donde a, b y c, que pueden ser iguales o diferentes, son números enteros de 0 a 6;
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donde a, b y c, que pueden ser iguales o diferentes, son números enteros de 0 a 6; y d, e y f, que pueden ser iguales o diferentes, son números enteros de 1 a 6;
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donde a, b y c, que pueden ser iguales o diferentes, son números enteros de 1 a 6;
Figure imgf000018_0003
donde a, b y c, que pueden ser iguales o diferentes, son números enteros de 1 a 5, d es un número entero de 1 a 100, preferiblemente de 1 a 30, e es un número entero de 0 a 5 y f y g son iguales o diferentes y son números enteros de 1 a 5; o un compuesto de tetraamina seleccionado de
Figure imgf000018_0004
Figure imgf000019_0001
donde a, b, c y d, que pueden ser iguales o diferentes, son números enteros de 1 a 6;
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donde a, b, c y d, que pueden ser iguales o diferentes, son números enteros de 0 a 6; y e, f, g y h, que pueden ser iguales o diferentes, son números enteros de 1 a 6;
y además, se puede entender que los motivos de cadena alquilo (p. ej.: -C-C-C-) de las unidades de construcción incluyen fragmentos alcoxi tales como C-O-C o C-C-O-C-C donde uno o más átomos de carbono no adyacentes se reemplazan por un átomo de oxígeno, con la condición de que dicha sustitución no forme un grupo O-C-X donde X es O o N.
En algunos casos, el núcleo tiene al menos dos grupos funcionales amino, uno de los cuales tiene unido un resto de direccionamiento directamente o mediante un grupo espaciador. Al menos uno de los grupos funcionales restantes del núcleo tiene un dendrón unido como se describe en el documento WO 2008/017125.
El agente de direccionamiento es un agente que se une a una célula, órgano o tejido diana biológica con cierta selectividad, ayudando así a dirigir la macromolécula hacia una diana particular en el cuerpo y permitiendo su acumulación en esa célula, órgano o tejido diana. El grupo de direccionamiento puede además proporcionar un mecanismo para que la macromolécula sea absorbida activamente en la célula o tejido por endocitosis mediada por receptor.
Los ejemplos particulares incluyen lectinas y anticuerpos y otros ligandos (incluidas moléculas pequeñas) para receptores de superficie celular. La interacción puede ocurrir a través de cualquier tipo de enlace o asociación, incluyendo enlaces covalentes, iónicos y de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals.
Los grupos de direccionamiento adecuados incluyen aquellos que se unen a receptores de la superficie celular, por ejemplo, el receptor de folato, receptor adrenérgico, receptor de hormona del crecimiento, receptor de hormona luteinizante, receptor de estrógeno, receptor del factor de crecimiento epidérmico, receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (p. ej., FGFR2), receptor de IL-2, CFTR y receptor del factor de crecimiento epitelial vascular (VEGF).
En algunas realizaciones, el agente de direccionamiento es la hormona liberadora de hormona luteinizante (LHRH) o un derivado de la misma que se une al receptor de la hormona liberadora de hormona luteinizante. La LHRH tiene la secuencia: piroGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2. Los derivados adecuados de LHRH incluyen aquellos en los que uno de los restos 4-7 se reemplaza por otro aminoácido, especialmente el resto 6 (Gly). En algunos casos, el resto de aminoácido de reemplazo es adecuadamente uno que tiene una cadena lateral capaz de formar un enlace con el núcleo o con el espaciador. En algunos casos, el derivado es LHRH Gly6Lys, LHRH Gly6Asp o LHRH Gly6Glu, especialmente LHRH Gly6Lys. En otros casos, el derivado es LHRH Gly6Trp (deslorelina). Este receptor a menudo se encuentra o se sobreexpresa en las células cancerosas, especialmente en los cánceres de mama, próstata, ovario o endometrio.
En algunas realizaciones, el agente de direccionamiento es LYP-1, un péptido que se dirige al sistema linfático de los tumores pero no al sistema linfático del tejido normal. LYP-1 es un péptido que tiene la secuencia H-Cys-Gly-Asn-Lys-Arg-Thr-Arg-Gly-Cys-OH y en el que el péptido está en forma cíclica debido a un enlace disulfuro entre los átomos de azufre del dos restos de cisteína.
En algunos casos, el agente de direccionamiento puede ser un péptido RGD. Los péptidos RGD son péptidos que contienen la secuencia -Arg-Gly-Asp-. Esta secuencia es el sitio principal de reconocimiento de la integrina en las proteínas de la matriz extracelular.
Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos tales como scFv y diacuerpos que se sabe que interaccionan con receptores o factores celulares incluyen CD20, CD52, MUC1, tenascina, c D44, Tn F-R, especialmente CD30, HER2, VEGF, EGF, EFGR y TNF-a.
En algunos casos, el agente de direccionamiento puede ser folato. El folato es una vitamina que es esencial para la biosíntesis de bases nucleotídicas y, por tanto, se requiere en grandes cantidades en las células en proliferación. En las células cancerosas, este mayor requisito de ácido fólico se refleja frecuentemente en una sobreexpresión del receptor de folato que es responsable del transporte de folato a través de la membrana celular. Por el contrario, la absorción de folato en las células normales es facilitada por el transportador de folato reducido, en lugar del receptor de folato. El receptor de folato está regulado por aumento en muchos cánceres humanos, que incluyen neoplasias malignas de ovario, cerebro, riñón, mama, células mieloides y pulmón, y la densidad de los receptores de folato en la superficie celular parece aumentar a medida que se desarrolla el cáncer.
Los estrógenos también se pueden usar para dirigirse a células que expresan el receptor de estrógenos.
El agente de direccionamiento puede unirse al núcleo del dendrímero directamente o preferiblemente a través de un espaciador. El grupo espaciador puede ser cualquier grupo divalente capaz de unirse tanto al grupo funcional del núcleo como al grupo funcional del agente de direccionamiento. El tamaño del grupo espaciador es preferiblemente suficiente para evitar cualquier aglomeración estérica. Los ejemplos de grupos espaciadores adecuados incluyen cadenas de alquileno y cadenas de alquileno en las que uno o más átomos de carbono se reemplazan por un heteroátomo seleccionado de -O-, -S- o Nh . La cadena de alquileno termina con grupos funcionales adecuados para la unión tanto al grupo funcional del núcleo como al agente de direccionamiento. Los grupos espaciadores de ejemplo incluyen X-(CH2)p-Y, X-(CH2O)p-CH2-Y, X-(CH2CH2O)p-CH2CH2-Y y X-(CH2CH2CH2O)pCH2CH2CH2-Y, donde X e Y son grupos funcionales para unirse con o unidos al núcleo y al agente de direccionamiento respectivamente, y p es un número entero de 1 a 100, especialmente de 1 a 50 o de 1 a 25.
En algunos casos, el grupo de direccionamiento puede unirse a los grupos amino de la superficie como tercer grupo funcional. En algunos casos, de 1 a 32 grupos de direccionamiento están unidos a la superficie, especialmente están unidos de 1 a 10, más especialmente están unidos de 1 a 4.
En algunos casos, el agente de direccionamiento y el grupo espaciador se modifican para facilitar la reacción. Por ejemplo, el grupo espaciador puede incluir un grupo funcional azida y el agente de direccionamiento puede incluir un grupo alquino o el grupo espaciador se modifica con un alquino y el agente de direccionamiento se modifica con una azida y los dos grupos se conjugan usando una reacción de click.
En algunos casos, el grupo funcional del núcleo que no lleva un dendrón puede unirse a biotina, opcionalmente a través de un grupo espaciador descrito anteriormente, y hacer reaccionar la macromolécula con un complejo de avidina-anticuerpo o avidina-biotina-anticuerpo. Cada complejo de avidina puede unir hasta 4 conjugados de macromolécula-biotina o una combinación de conjugados de macromolécula-biotina y conjugados anticuerpo-biotina.
En realizaciones particulares, el núcleo es BHA o BHALys o NEOEOEN[SuN(PN)2].
En algunos casos, el dendrímero tiene de 1 a 5 dendrones unidos al núcleo, especialmente de 2 a 4 dendrones, más especialmente 2 o 3 dendrones.
En algunas realizaciones, el dendrímero tiene de 1 a 8 generaciones de unidades de construcción, especialmente de 2 a 7 generaciones, de 3 a 6 generaciones, más especialmente de 4 a 6 generaciones.
La macromolécula de la descripción puede ser nanopartícula con un diámetro de partículas por debajo de 1000 nm, por ejemplo, entre 5 y 1000 nm, especialmente 5 y 500 nm, más especialmente de 5 a 400 nm, tal como de 5 a 50 nm, especialmente entre 5 y 20 nm. En casos particulares, la composición contiene macromoléculas con un tamaño medio de entre 5 y 20 nm. En algunos casos, la macromolécula tiene un peso molecular de al menos 30 kDa, por ejemplo, de 40 a 150 kDa o de 40 a 300 kDa.
En algunos casos, las macromoléculas de la invención tienen un tamaño de partículas que es adecuado para aprovechar el efecto de permeabilidad y retención aumentada (efecto EPR) en tumores y tejido inflamatorio. Los vasos sanguíneos formados en los tumores se forman rápidamente y son anormales debido a células endoteliales defectuosas mal alineadas, la falta de capa de músculo liso y/o inervación con un lumen más ancho. Esto hace que los vasos tumorales sean permeables a partículas de un tamaño que normalmente no saldrían de la vasculatura y permite que las macromoléculas se acumulen en el tejido tumoral. Además, los tejidos tumorales carecen de un drenaje linfático eficaz, por lo que una vez que las macromoléculas han entrado en el tejido tumoral, quedan retenidas allí. Se encuentra una acumulación y retención similares en los sitios de inflamación.
La macromolécula de la descripción puede tener una carga de agente farmacéuticamente activo de 2, 4, 8, 16, 32, 64 o 120 restos, especialmente 16, 32 o 64 restos por macromolécula.
Se conocen en la técnica métodos para preparar dendrímeros. Por ejemplo, los dendrímeros de la macromolécula se pueden hacer por un método divergente o un método convergente o una mezcla de los mismos.
En el método divergente cada generación de unidades de construcción se añade secuencialmente al núcleo o a una generación anterior. La generación de la superficie tiene uno o ambos grupos amino de la superficie protegidos. Si uno de los grupos amino está protegido, el grupo amino libre se hace reaccionar con uno del conector, el conector- agente farmacéuticamente activo o el agente modificador de la farmacocinética. Si ambos grupos amino están protegidos, están protegidos con diferentes grupos protectores, uno de los cuales puede eliminarse sin eliminar el otro. Uno de los grupos protectores de amino se elimina y se hace reaccionar con uno del conector, el conector-agente farmacéuticamente activo o el agente modificador de la farmacocinética. Una vez que el grupo terminal inicial se ha unido al dendrímero, se elimina el otro grupo protector de amino y se añade el otro del primer y segundo grupos terminales. Estos grupos se unen a los grupos amino de superficie por formación de amida como se conoce en la técnica.
En el método convergente, cada generación de unidades de construcción se construye sobre la generación previa para formar un dendrón. El primer y segundo grupos terminales se pueden unir a los grupos amino de la superficie como se ha descrito anteriormente antes o después de la unión del dendrón al núcleo.
En un enfoque mixto, cada generación de unidades de construcción se añade al núcleo o una generación previa de unidades de construcción. Sin embargo, antes de que se añada la última generación al dendrímero, los grupos amino de superficie se funcionalizan con grupos terminales, por ejemplo, un primer y segundo grupo terminal, un primer y tercer grupo terminal o un segundo y tercer grupo terminal. Después se añade la generación final funcionalizada a la capa subyacente de las unidades de construcción y el dendrón se une al núcleo.
El agente farmacéuticamente activo se hace reaccionar con uno de los ácidos carboxílicos del conector por formación de un éster como se conoce en la técnica. Por ejemplo, se forma un ácido carboxílico activado, de modo que se usa un cloruro de ácido o un anhídrido y se hace reaccionar con el grupo hidroxi del agente farmacéuticamente activo. Si el agente farmacéuticamente activo tiene más de un grupo hidroxi, se pueden proteger más grupos hidroxi.
En el caso de que se una un agente de direccionamiento al núcleo, se puede proteger un grupo funcional en el núcleo durante la formación del dendrímero y luego desproteger y hacer reaccionar con el agente de direccionamiento, el grupo espaciador o el agente de direccionamiento-grupo espaciador. Alternativamente, el núcleo se puede hacer reaccionar con el grupo espaciador o el grupo espaciador-agente de direccionamiento antes de la formación del dendrímero.
Los grupos protectores adecuados, métodos para su introducción y eliminación se describen en Greene & Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, Tercera edición, 1999.
Composiciones que comprenden la macromolécula
Si bien es posible que las macromoléculas se puedan administrar como un producto químico puro, en casos particulares, la macromolécula se presenta como una composición farmacéutica.
La invención proporciona formulaciones o composiciones farmacéuticas, tanto para uso veterinario como para uso médico humano, que comprenden una o más macromoléculas del presente documento o una sal farmacéuticamente aceptable de las mismas, con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, cualquier otro ingrediente terapéutico, estabilizante o similares. El(los) vehículo(s) deben ser farmacéuticamente aceptables en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación y no excesivamente perjudiciales para el receptor de los mismos. Las composiciones también pueden incluir excipientes/aditivos o vehículos poliméricos, p. ej., polivinilpirrolidonas, celulosas derivatizadas tales como hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa e hidroxipropilmetilcelulosa, Ficolls (un azúcar polimérico), hidroxietilalmidón (HES), dextratos (p. ej., ciclodextrinas, tales como 2-hidroxipropil-p-ciclodextrina y sulfobutiléter-p-ciclodextrina), polietilenglicoles y pectina. Las composiciones pueden incluir además diluyentes, tampones, aglutinantes, disgregantes, espesantes, lubricantes, conservantes (incluidos antioxidantes), agentes aromatizantes, agentes de enmascaramiento del sabor, sales inorgánicas (p. ej., cloruro de sodio), agentes antimicrobianos (p. ej., cloruro de benzalconio), edulcorantes, agentes antiestáticos, ésteres de sorbitán, lípidos (p. ej., fosfolípidos tales como lecitina y otras fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas, ácidos grasos y ésteres grasos, esteroides (p. ej., colesterol)) y agentes quelantes (p. ej., EDTA, zinc y otros cationes adecuados). Otros excipientes y/o aditivos farmacéuticos adecuados para su uso en las composiciones según la invención se citan en "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19a ed., Williams & Williams, (1995), y en el "Physician's Desk Reference", 52a ed., Medical Economics, Montvale, N.J. (1998), y en "Handbook of Pharmaceutical Excipients", tercera edición, Ed. A. H. Kibbe, Pharmaceutical Press, 2000.
La macromolécula también se puede formular en presencia de una proteína de albúmina apropiada tal como seroalbúmina humana. La albúmina transporta nutrientes por todo el cuerpo y puede unirse a la macromolécula y llevarla a su sitio de acción.
Las macromoléculas se pueden formular en composiciones que incluyen las adecuadas para administración oral, rectal, tópica, nasal, inhalada al pulmón, por aerosol, oftálmica o parenteral (incluyendo inyección intraperitoneal, intravenosa, subcutánea o intramuscular). Las composiciones pueden presentarse convenientemente en forma farmacéutica unitaria y pueden prepararse por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de la farmacia. Todos los métodos incluyen la etapa de asociar la macromolécula con un vehículo que constituye uno o más ingredientes auxiliares. En general, las composiciones se preparan asociando la macromolécula con un vehículo líquido para formar una solución o una suspensión, o alternativamente, asociando la macromolécula con componentes de la formulación adecuados para formar un sólido, opcionalmente un producto en partículas, y luego, si está justificado, dar forma al producto en la forma de administración deseada. Las formulaciones sólidas, cuando están formadas por partículas, comprenderán típicamente partículas con tamaños en el intervalo de aproximadamente 1 nanómetro a aproximadamente 500 micrómetros. En general, para las formulaciones sólidas destinadas a la administración intravenosa, las partículas estarán típicamente en el intervalo de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 10 micrómetros de diámetro. La composición puede contener macromoléculas que son nanopartículas que tienen un diámetro de partículas inferior a 1000 nm, por ejemplo, entre 5 y 1000 nm, especialmente entre 5 y 500 nm, más especialmente entre 5 y 400 nm, tal como entre 5 y 50 nm y especialmente entre 5 y 20 nm. En casos particulares, la composición contiene macromoléculas con un tamaño medio de entre 5 y 20 nm. En algunos casos, la macromolécula está polidispersa en la composición, con un PDI de entre 1.01 y 1.8, especialmente entre 1.01 y 1.5, y más especialmente entre 1.01 y 1.2. En casos particulares, la macromolécula está monodispersa en la composición. Son particularmente preferidas las composiciones liofilizadas estériles que se reconstituyen en un vehículo acuoso antes de la inyección.
Las composiciones adecuadas para la administración oral se pueden presentar como unidades discretas tales como cápsulas, sellos, comprimidos, pastillas para chupar y similares, cada una de las cuales contiene una cantidad predeterminada del agente activo en forma de polvo o gránulos; o una suspensión en un líquido acuoso o líquido no acuoso tal como un jarabe, un elixir, una emulsión, una dosis y similares.
Un comprimido puede prepararse por compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes auxiliares. Los comprimidos por compresión se pueden preparar por compresión en una máquina adecuada, con el compuesto activo en una forma fluida tal como un polvo o gránulos que se mezcla opcionalmente con un aglutinante, disgregante, lubricante, diluyente inerte, agente tensioactivo o agente dispersante. Los comprimidos moldeados compuestos con un vehículo adecuado se pueden preparar por moldeo en una máquina adecuada.
Se puede preparar un jarabe añadiendo el compuesto activo a una solución acuosa concentrada de un azúcar, por ejemplo sacarosa, a la que también se puede añadir cualquier ingrediente o ingredientes auxiliares. Dichos ingredientes auxiliares pueden incluir aromatizantes, conservantes adecuados, un agente para retardar la cristalización del azúcar y un agente para aumentar la solubilidad de cualquier otro ingrediente, tal como alcohol polihídrico, por ejemplo, glicerol o sorbitol.
Las formulaciones adecuadas para administración parenteral comprenden convenientemente una preparación acuosa estéril de la macromolécula, que se puede formular para que sea isotónica con la sangre del receptor.
Las formulaciones de pulverización nasal comprenden soluciones acuosas purificadas del agente activo con agentes conservantes y agentes isotónicos. Preferiblemente, dichas formulaciones se ajustan a un pH y un estado isotónico compatibles con las membranas mucosas nasales.
Las formulaciones para administración rectal pueden presentarse como un supositorio con un vehículo adecuado tal como manteca de cacao o grasas hidrogenadas o ácidos carboxílicos grasos hidrogenados.
Las formulaciones oftálmicas se preparan por un método similar a la pulverización nasal, excepto que el pH y los factores isotónicos se ajustan preferiblemente para que coincidan con los del ojo.
Las formulaciones tópicas comprenden el compuesto activo disuelto o suspendido en uno o más medios tales como aceite mineral, vaselina, alcoholes polihidroxílicos u otras bases utilizadas para formulaciones tópicas. Puede ser deseable la adición de otros ingredientes auxiliares como se indicó anteriormente.
También se proporcionan formulaciones farmacéuticas que son adecuadas para la administración en forma de aerosol, por inhalación. Estas formulaciones comprenden una solución o suspensión de la macromolécula deseada o una sal de la misma. La formulación deseada se puede poner en una cámara pequeña y nebulizar. La nebulización puede realizarse mediante aire comprimido o mediante energía ultrasónica para formar una pluralidad de gotitas de líquido o partículas sólidas que comprenden las macromoléculas o sales de las mismas.
A menudo, los fármacos se administran conjuntamente con otros fármacos en terapia de combinación, especialmente durante la quimioterapia. Por tanto, las macromoléculas de la invención pueden administrarse como terapias de combinación. Por ejemplo, cuando el agente farmacéuticamente activo es docetaxel, la macromolécula se puede administrar con doxorubicina, ciclofosfamida o capecitabina. Las macromoléculas no solo se pueden administrar con otros fármacos de quimioterapia, sino que también se pueden administrar en combinación con otros fármacos tales como corticosteroides, antihistamínicos, analgésicos y fármacos que ayudan en la recuperación o protegen de la hematotoxicidad, por ejemplo, citoquinas.
En algunos casos, particularmente con fármacos oncológicos, la composición se formula para infusión parenteral como parte de un régimen de quimioterapia. En estos casos, las composiciones están sustancialmente exentas o completamente exentas de excipientes de solubilización, especialmente excipientes de solubilización tales como Cremophor y polisorbato 80. En casos particulares, el agente farmacéuticamente activo se selecciona de docetaxel o paclitaxel y la formulación está sustancialmente exenta o completamente exenta de excipientes de solubilización tales como Cremophor y polisorbato 80. Al eliminar el excipiente de solubilización, es menos probable que la composición de dendrímero cause efectos secundarios tales como hipersensibilidad aguda o retardada, incluida anafilaxia potencialmente mortal y/o retención de líquidos grave.
En algunos casos, la macromolécula se formula para administración transdérmica, tal como un ungüento, una loción o en un parche transdérmico o se usa tecnología de microagujas. La alta carga de fármaco y la solubilidad acuosa permiten que pequeños volúmenes transporten suficiente fármaco para que las tecnologías de parche y microagujas proporcionen una cantidad terapéuticamente eficaz. Tales formulaciones son particularmente adecuadas para el suministro de testosterona.
Las macromoléculas también se pueden usar para proporcionar liberación controlada de los agentes farmacéuticamente activos y/o formulaciones de liberación lenta.
En formulaciones de liberación lenta, los ingredientes de la formulación se seleccionan para liberar la macromolécula de la formulación durante un período de tiempo prolongado, tal como días, semanas o meses. Este tipo de formulación incluye parches transdérmicos o en dispositivos implantables que pueden depositarse por vía subcutánea o por inyección intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraepidural o intracraneal.
En formulaciones de liberación controlada, el conector diácido se selecciona para liberar la mayor parte de su agente farmacéuticamente activo en una ventana de tiempo determinada. Por ejemplo, cuando se conoce el tiempo que tarda la mayor parte de la macromolécula en acumularse en un órgano, tejido o tumor diana, el conector puede seleccionarse para liberar la mayor parte de su agente farmacéuticamente activo una vez transcurrido el tiempo de acumulación. Esto puede permitir que se administre una alta carga de fármaco en un momento dado en el sitio donde se requiere su acción. Alternativamente, el conector se selecciona para liberar el agente farmacéuticamente activo a un nivel terapéutico durante un período de tiempo prolongado.
En algunas realizaciones, la formulación puede tener múltiples características de liberación controlada. Por ejemplo, la formulación comprende macromoléculas en las que el fármaco está unido a través de diferentes conectores que permiten una descarga inicial de fármaco de liberación rápida seguida de una liberación más lenta a niveles terapéuticos bajos pero constantes a lo largo de un período de tiempo prolongado.
En algunos casos, la formulación puede tener características tanto de liberación lenta como de liberación controlada. Por ejemplo, los ingredientes de la formulación pueden seleccionarse para liberar la macromolécula durante un período de tiempo prolongado y el conector se selecciona para suministrar un nivel terapéutico bajo constante de agente farmacéuticamente activo.
En algunos casos, el agente farmacéuticamente activo está unido a la misma molécula a través de diferentes conectores. En otros casos, cada combinación de fármaco-conector está unida a diferentes macromoléculas en la misma formulación.
Métodos de uso
La macromolécula de la invención se puede usar para tratar o prevenir cualquier enfermedad, trastorno o síntoma para el que se puede usar el agente farmacéuticamente activo no modificado para tratar o prevenir.
En algunas realizaciones, donde el agente farmacéuticamente activo es un fármaco oncológico, la macromolécula se usa en un método para tratar o prevenir el cáncer, o suprimir el crecimiento de un tumor. En realizaciones particulares, el fármaco se selecciona de docetaxel, camptotecina, topotecán, irinotecán y gemcitabina, especialmente docetaxel.
En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer en la sangre, como leucemia o linfoma. En otras realizaciones, el cáncer es un tumor sólido. El tumor sólido puede ser primario o metastásico. Los tumores sólidos de ejemplo incluyen tumores de mama, pulmón, especialmente cáncer de pulmón no microcítico, colon, estómago, riñón, cerebro, cabeza y cuello, especialmente carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, tiroides, ovario, testículos, hígado, melanoma, próstata, especialmente cáncer de próstata independiente de andrógenos (hormono-refractario), neuroblastoma y adenocarcinoma gástrico, incluido el adenocarcinoma de la unión gastroesofágica.
Los fármacos oncológicos a menudo tienen efectos secundarios importantes que se deben a la toxicidad fuera del objetivo, tal como toxicidad hematológica, toxicidad neurológica, cardiotoxicidad, hepatotoxicidad, nefrotoxicidad, ototoxicidad y encefalotoxicidad. Por ejemplo, los taxanos tales como docetaxel pueden causar los siguientes efectos adversos: infecciones, neutropenia, anemia, neutropenia febril, hipersensibilidad, trombocitopenia, mielotoxicidad, mielosupresión, neuropatía, disgeusia, disnea, estreñimiento, anorexia, trastornos de las uñas, retención de líquidos, astenia, dolor, náuseas, diarreas, vómitos, fatiga, problemas neurocognitivos inespecíficos, vértigo, encefalopatía, mucositis, alopecia, reacciones cutáneas y mialgias.
Además, los excipientes de solubilización necesarios para formular los fármacos oncológicos pueden provocar anafilaxia, retención de líquidos e hipersensibilidad. También puede ser necesaria la premedicación con corticosteroides, antihistamínicos, citoquinas y/o analgésicos, cada uno con sus propios efectos secundarios. Las macromoléculas tienen una alta carga de fármaco, liberación controlada, pueden dirigirse pasivamente a un tejido particular y mejorar la solubilidad permitiendo una reducción de los efectos secundarios asociados con el fármaco oncológico, la formulación del fármaco sin excipientes de solubilización y la administración sin o con premedicación reducida.
En otro aspecto de la descripción, se proporciona un método para reducir los efectos secundarios de un fármaco oncológico o los efectos secundarios relacionados con la formulación de un fármaco oncológico que comprende administrar una cantidad eficaz de la macromolécula del presente documento a un sujeto, en donde el fármaco oncológico es el agente farmacéuticamente activo del primer grupo terminal.
En otro aspecto más de la descripción se proporciona un método para reducir la hipersensibilidad durante la quimioterapia que comprende administrar una cantidad eficaz de la macromolécula del presente documento a un sujeto.
Los regímenes terapéuticos para el tratamiento del cáncer a menudo implican una terapia cíclica donde se administra un fármaco oncológico una vez cada dos a cuatro semanas. A menudo, el fármaco se administra por infusión durante 3 a 24 horas. En algunos casos para reducir los efectos secundarios de los fármacos o el riesgo de hipersensibilidad, especialmente anafilaxia por la formulación del fármaco; se requiere premedicación y su administración puede ser necesaria hasta 6 horas antes del tratamiento con el fármaco oncológico. Estos regímenes terapéuticos complejos necesitan mucho tiempo y requieren que el paciente permanezca en el hospital desde varias horas a 2 días. Los efectos secundarios graves también pueden limitar la dosis de fármaco oncológico utilizado y/o el número de ciclos de terapia que se pueden administrar y, por lo tanto, en algunos casos la eficacia de la terapia disminuye.
En la presente descripción, la macromolécula que comprende el fármaco oncológico reduce los efectos secundarios asociados con el fármaco ya que se acumula pasivamente en el sitio del tumor o es dirigido al sitio del tumor por un agente de direccionamiento apropiado y se controla la liberación del fármaco del dendrímero.
La solubilidad de las macromoléculas en solución acuosa permite que se formulen sin excipientes de solubilización dañinos, reduciendo así los efectos secundarios de la formulación y, en algunos casos, eliminando la necesidad de premedicación.
Además, no es necesario administrar las macromoléculas mediante infusión prolongada. En algunas realizaciones, pueden administrarse mediante infusión rápida, por ejemplo, en menos de 3 horas, incluyendo 2.5 horas, 2 horas, 1.5 horas, 1 hora o 30 minutos. En algunas realizaciones, la macromolécula o formulación de la macromolécula se puede administrar como un bolo, por ejemplo, en 5 segundos a 5 minutos.
Las macromoléculas también pueden permitir que la dosis del agente farmacéuticamente activo se incremente en comparación con el agente farmacéuticamente activo que se administra solo. En otro aspecto de la descripción se proporciona un método para aumentar la dosis de un agente farmacéuticamente activo que comprende administrar la macromolécula del presente documento en donde el primer grupo terminal es el agente farmacéuticamente activo. En casos particulares, la dosis máxima tolerada se incrementa al menos dos veces en comparación con el agente farmacéuticamente activo cuando se administra solo.
En casos particulares de estos aspectos, la formulación de la macromolécula utilizada en la administración está sustancialmente exenta de excipientes de solubilización tales como aceite de ricino polietoxilado (Cremophor EL) y polisorbato 80.
En algunos casos en los que el agente farmacéuticamente activo es testosterona o dihidrotestosterona y la macromolécula se usa en un método para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno asociado con niveles bajos de testosterona.
Los niveles bajos de testosterona pueden ser resultado de una serie de afecciones. Por ejemplo, los órganos que producen testosterona (testículos, ovarios) no producen suficiente testosterona (hipogonadismo primario), la glándula pituitaria y su capacidad para regular la producción de testosterona no funcionan correctamente (hipogonadismo secundario) o el hipotálamo puede no estar regulando la producción de hormonas correctamente (hipogonadismo terciario).
Las causas comunes de hipogonadismo primario incluyen testículos no descendidos, lesión del escroto, terapia contra el cáncer, envejecimiento, orquitis por paperas, anomalías cromosómicas, afecciones de los ovarios tales como insuficiencia ovárica prematura o extirpación de ambos ovarios. Las causas del hipogonadismo secundario y terciario incluyen daño a la glándula pituitaria por tumores o tratamiento de tumores cercanos, malformaciones del hipotálamo tales como en el síndrome de Kellman, flujo sanguíneo comprometido a la glándula pituitaria o al hipotálamo, inflamación causada por VIH/SIDA, inflamación por tuberculosis o sarcoidosis y el uso ilegal de esteroides anabólicos en culturismo.
También debe tenerse en cuenta que la obesidad también puede ser una causa de niveles bajos de testosterona, ya que la obesidad aumenta significativamente la conversión de testosterona en estrógeno, un proceso que ocurre predominantemente en las células grasas.
Los síntomas de niveles bajos de testosterona incluyen cambios en el estado de ánimo (depresión, fatiga, ira), disminución del vello corporal, disminución de la densidad mineral ósea (mayor riesgo de osteoporosis), disminución de la masa corporal magra y fuerza muscular, disminución de la libido y disfunción eréctil, aumento de la grasa abdominal, desarrollo de mamas rudimentarias en hombres y esperma bajo o nulo en el semen.
Una "cantidad eficaz" significa una cantidad necesaria para lograr al menos parcialmente la respuesta deseada, o para retrasar el inicio o inhibir la progresión o detener por completo, la aparición o progresión de una afección particular que se está tratando. La cantidad varía dependiendo de la enfermedad que se esté tratando, la salud y la condición física del individuo a tratar, el grupo taxonómico del individuo a tratar, el grado de protección deseado, la formulación de la composición, la evaluación de la situación médica, y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad caiga en un intervalo relativamente amplio que se puede determinar mediante ensayos de rutina. Una cantidad eficaz en relación con un paciente humano, por ejemplo, puede estar en el intervalo de aproximadamente 0.1 ng por kg de peso corporal a 1 g por kg de peso corporal por dosis. En un caso particular, la dosis está en el intervalo de 1 pg a 1 g por kg de peso corporal por dosis, tal como está en el intervalo de 1 mg a 1 g por kg de peso corporal por dosis. En un caso, la dosis está en el intervalo de 1 mg a 500 mg por kg de peso corporal por dosis. En otro caso, la dosis está en el intervalo de 1 mg a 250 mg por kg de peso corporal por dosis. En otro caso más, la dosis está en el intervalo de 1 mg a 100 mg por kg de peso corporal por dosis, tal como hasta 50 mg por kg de peso corporal por dosis. En otro caso más, la dosis está en el intervalo de 1 pg a 1 mg por kg de peso corporal por dosis. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, pueden administrarse varias dosis divididas a diario, semanalmente, mensualmente o en otros intervalos de tiempo adecuados, o la dosis puede reducirse proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación.
En algunos casos, la macromolécula se administra por vía intravenosa, intraarterial, intrapulmonar, oral, por inhalación, intravesicular, intramuscular, intratraqueal, subcutánea, intraocular, intratecal o transdérmica.
En algunas realizaciones, la macromolécula se administra como un bolo o por infusión rápida, especialmente como un bolo.
En otro aspecto de la descripción se proporciona el uso de una macromolécula de la invención en la fabricación de un fármaco para tratar o suprimir el crecimiento del cáncer, reduciendo la toxicidad de un fármaco oncológico o una formulación de un fármaco oncológico, reduciendo los efectos secundarios asociados con un fármaco oncológico o una formulación de un fármaco oncológico o reduciendo la hipersensibilidad tras el tratamiento con un fármaco oncológico; en donde el agente farmacéuticamente activo del primer grupo terminal es un fármaco oncológico.
En otro aspecto más de la descripción se proporciona el uso de una macromolécula de la invención en la fabricación de un fármaco para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno relacionado con niveles bajos de testosterona; en donde el agente farmacéuticamente activo del primer grupo terminal es testosterona.
La invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplos que ilustran algunos aspectos particulares de la presente invención. Sin embargo, debe entenderse que la particularidad de la siguiente descripción de la invención no reemplaza la generalidad de la descripción anterior de la invención.
Abreviaturas:
Figure imgf000026_0001
Ejemplos
Los dendrímeros representados en los ejemplos siguientes incluyen referencias al núcleo y las unidades de construcción en la generación más externa del dendrímero. De la 1a generación a la inferior a la de superficie no se representan. El dendrímero BHALys[Lys]32 es representativo de un dendrímero de 5 generaciones que tiene la fórmula BHALys[Lys]2[Lys]4[Lys]8[Lys]i6[Lys]32, estando disponibles los 64 grupos amino de superficie para unirse a grupos terminales.
La preparación de los armazones de los dendrímeros BHALys[Lys]32[a-NH2.TFA]32[£-PEG57o]32, BHALys[Lys]32[a-NH2.TFA]32[£-PEGiioo]32, BHALys[Lys]32[a-NH2.TFA]32[£-f-PEG23oo]32 BHALys[Lys]32[a-4-HsBA]32[£-PEGiioo]32, BHALys[Lys]32[a-GILGVP-NH2.TFA]32[£-PEGiioo]32 y BHALys[Lys]32[a-GILGVP-NH2.TFA]32[£-f-PEG23oo]32 se puede encontrar en Kaminskas et al., J Control. Release (20 ii) doi i0. i0 i6 / j.jconrel.20ii.02.005. La preparación de los armazones del dendrímero 4-azidobenzamida-PEGi2-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]i6 [NH2.TFA]32 se puede encontrar en el documento W O08/0i7i22.
Procedimientos generales
Procedimiento general A. Instalación de conectores para fármacos A
A una solución con agitación magnética de conector ácido carboxílico (0.2 - 0.5 mmol) en disolvente DMF o acetonitrilo (i - 5 ml) a 0°C se añadió el agente de acoplamiento EDC o DCC (i .2 equivalentes). La mezcla se dejó agitar durante 5 min, luego se añadió gota a gota una solución de disolvente (i ml) que contenía una mezcla de fármaco (0.4 - i equivalentes) y DMAP (0.4 - i equivalentes). La mezcla se mantuvo a 0°C durante i hora y luego se dejó calentar a temperatura ambiente. Después se separaron a vacío los compuesto volátiles y el residuo se purificó por HPLC preparativa (BEH 300 Waters XBridge C i8, 5 pM, 30 x 150 mm, ACN/agua al 40-80% (5-40 min), sin tampón) para producir el producto deseado.
Procedimiento general B. Instalación de conectores para fármacos B.
A una solución con agitación magnética de fármaco (0.3 - 1.0 mmol) y anhídrido (2 equivalentes) en DMF (3 - 5 ml) se añadió DIPEA (3 equivalentes). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Después se separaron a vacío los compuestos volátiles y el residuo se purificó por HPLC preparativa (BEH 300 Waters XBridge C18, 5 pM, 30 x 150 mm, ACN/agua al 40-70% (5-40 min), sin tampón, RT = 34 min). Las fracciones apropiadas se concentraron a vacío proporcionando el objetivo deseado.
Procedimiento general C. Carga del dendrímero con fármaco-conector.
A una mezcla con agitación magnética de BHALys[Lys]32[a-NH2.TFA]32[£-PEGii0ü]32 (0.5 - 1.0 pmol) y DIPEA (1.2 equivalentes por amina) en DMF a temperatura ambiente se añadió conector - fármaco (1.2 equivalentes por grupo amina) y PyBOP (1.2 equivalentes por grupo amina). Después de 1.5 horas a temperatura ambiente, se separaron los compuestos volátiles y el residuo se purificó por SEC (Sephadex, LH20, MeOH). Las fracciones apropiadas, evaluadas por HPLC, se combinaron y concentraron para proporcionar el material deseado.
Procedimiento general D. Reacción de click
A una solución con agitación magnética de dendrímero (0.5 - 1.0 mmol) en H2O/t-BuOH 1:1 (aproximadamente 0.5 ml) se añadió reactivo de alquino (2 equivalentes), solución de ascorbato de sodio (2 equivalentes) y solución de CuSO4 (20% en moles). La solución se calentó a 80°C y se controló por HPLC. Se añadieron cargas adicionales de ascorbato de sodio y CuSO4 según fuera necesario para llevar la reacción hasta su finalización. Después de que la reacción se consideró finalizada, la reacción se concentró a vacío y después se purificó.
Ejemplo 1
(a) Preparación de 4-Aba-DTX:
Figure imgf000027_0001
Preparado usando el Procedimiento A anterior, usando DTX (200 mg, 0.25 mmol) y ácido 4-acetilbutírico (42 mg, 0.32 mmol) como conector. La HPLC preparativa (RT = 32 min) proporcionó 73 mg (32%) de producto como un sólido blanco. LCMS (C8, gradiente: 40-90% de ACN/H2O (1-7 min), 90% de ACN (7-9 min), 90-40% de ACN (9-11 min), 40% de ACN (11-15 min), TFA al 0.1%) Rt (min) = 7.60. ESI (+va) observado [M H]+ = 920. Calculado para C49H61NO16 = 919.40 Da. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 1.09 (s, 3H), 1.13 (s, 3H), 1.38 (s, 9H), 1.66 (s, 3H), 1.74-1.97 (m, 7H), 2.10 (s, 3H), 2.12-2.36 (m, 1H), 2.29-2.58 (m, 8H), 3.83 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 4.14-4.26 (m, 3H), 4.95­ 5.05 (m, 2H), 5.18 -5.35 (m, 3H), 5.61 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 6.05 (m, 1H), 7.17-7.20 (m, 1H), 7.23-7.45 (m, 4H), 7.52­ 7.62 (m, 2H), 7.63-7.72 (m, 1 H), 8.10 (d, J = 7.2 Hz, 2H).
(b) Preparación de BHALys[Lys]32[a-4-HSBA-4Aba-DTX]32[£-PEGn00]32
Figure imgf000027_0002
Preparado utilizando el Procedimiento C anterior. A una solución con agitación magnética de 4-Aba-DTX (15 mg, 16.3 pmol) en MeOH seco (1 ml) se le añadió TFA (50 pl) y BHALys[Lys]32[a-4-HSBA]32[£-PEGn00]32 (20 mg, 0.43 pmol). La mezcla se dejó agitar durante la noche a temperatura ambiente y luego se añadió directamente a una columna de Sephadex (LH20, MeOH) para purificación. Las fracciones apropiadas, evaluado por HPLC, se combinaron y concentraron para proporcionar 25 mg (78%) del material deseado como un sólido blanco. HPLC (C8, gradiente: 40­ 80% de ACN/H2O (1-7 min), 80% de a Cn (7-9 min), 80-40% de ACN (9-11 min), 40% de ACN (11-15 min), formiato de amonio 10 mM) Rt (min) = 6.77. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 0.6-2.2 (m, 812H), 2.2-2.5 (m, 115H), 2.9­ 3.2 (m, 78H), 3.26 (s, 79H), 3.3-3.8 (m, 2824H), 5.1-53 (m, 31H), 5.5-5.6 (m, 10H), 5.9-6.1 (m, 9H), 6.9-8.2 (m, 329H). Peso molecular teórico del conjugado: 78.6 kDa. La RMN 1H indica 9 DTX/dendrímero. El peso molecular real es de aproximadamente 56.4 kDa (13% de DTX en peso).
Ejemplo 2
(a) Preparación de PSSP-DTX:
Figure imgf000028_0001
En este ejemplo (Ri = R2 = H) podría preverse que la velocidad de liberación de docetaxel se podía aumentar o disminuir aumentando o disminuyendo el grado de impedimento estérico alrededor del enlace disulfuro (Worrell N. R., Cumber A. J., Parnell G. D., Mirza A., Forrester J. A., Ross W. C. J.: "Effect of linkage variation on pharmacokinetics of ricin-A-chainantibody conjugates in normal rats". Anti-Cancer Drug Design 1, 179, 1986). Esto podría lograrse mediante la adición de sustituyentes, entre otros, a y o p al enlace disulfuro. Este tipo de estrategia de ajuste se usa a menudo en estrategias de diseño de profármacos y aprovecha el conocido efecto Thorpe-Ingold o gem-dimetilo ("The gem-Dimethyl Effect Revisited" Steven M. Bachrach, J. Org. Chem. 2008, 73, 2466-2468).
Preparado usando el Procedimiento A anterior, usando DTX (500 mg, 0.62 mmol) y ácido 3,3'-ditiopropanoico (130 mg, 0.62 mmol) como conector. La HPLC preparativa (RT = 32 min) proporcionó 179 mg (29%) de producto como un sólido blanco. LCMS (C8, gradiente: 40-90% de ACN/H2O (1-7 min), 90% de ACN (7-9 min), 90-40% de ACN (9-11 min), 40% de ACN (11-15 min), TFA al 0.1%) Rf (min) = 7.57. ESI (+va) observado [M H]+ = 1000. Calculado para C49H61NO17S2 = 999.34 Da. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 1.13 (s, 3H), 1.17 (s, 3H), 1.43 (s, 9H), 1.70 (s, 3H), 1.72-1.99 (m, 6H), 2.13-2.32 (m, 1 H), 2.37-2.55 (m, 4H), 2.66-2.76 (m, 2H), 2.76-3.02 (m, 6H), 3.87 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 4.18-4.31 (m, 3H), 5.00-5.06 (m, 3H), 5.24-5.42 (m, 3H), 5.64 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 6.10 (m, 1 H), 7.23-7.33 (m, 1 H), 7.36 -7.48 (m, 4H), 7.53-7.65 (m, 2H), 7.66-7.76 (m, 1 H), 8.13 (d, J = 7.2 Hz, 2H).
(b) Preparación de BHALys[Lys]32[a-PSSP-DTX]32[£-PEGn00]32
Figure imgf000028_0002
R1 = R2 = H
Preparado usando el Procedimiento C anterior, usando BHALys[Lys]32[a-NH2.TFA]32[£-PEG1100]32 (34 mg, 0.78 pmol) y PSSP-DTX (30 mg, 30 pmol). La purificación por SEC proporcionó 50 mg (89%) del material deseado como un sólido blanco. HPLC (C8, gradiente: 40-80% de ACN/H2O (1-7 min), 80% de a Cn (7-9 min), 80-40% de ACN (9-11 min), 40% de ACN (11-15 min), formiato de amonio 10 mM) Rf (min) = 7.96 min. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 0.7­ 2.0 (m, 1041H), 2.0-2.2 (m, 15H), 2.2-2.5 (m, 119H), 2.5-2.7 (m, 31H), 2.7-3.0 (m, 119H), 3.0-3.2 (m, 68H), 3.26 (s, 132H), 3.3-3.8 (m, 2806H), 3.9-4.3 (m, 76H), 5.1-5.3 (m, 55H), 5.5-5.6 (m, 17H), 5,9-6,1 (m, 17H), 7,1-8,1 (m, 243H). Peso molecular teórico del conjugado: 74.9 kDa. La RMN 1H indica 17 DTX/dendrímero. El peso molecular real es de aproximadamente 56.1 kDa (24% de DTX en peso).
Ejemplo 3
(a) Preparación de DGA-DTX:
Figure imgf000029_0001
Preparado usando el Procedimiento B anterior, usando DTX (300 mg, 371 pmol) y anhídrido diglicólico (86 mg, 742 pmol) como conector. La HPLC preparativa (RT = 34 min) proporcionó 85 mg (25%) de DGA-DTX como un sólido blanco. LCMS (C8, gradiente: 40-90% de ACN/H2O (1-7 min), 90% de ACN (7-9 min), 90-40% de ACN (9-11 min), 40% de ACN (11-15 min), ácido fórmico al 0.1%) Rt (min) = 5.90. ESI (+va) observado [M H]+ = 924.10. Calculado para C47H57NO18 = 923.36 Da. RMN 1H (300 MHz, CDCta) 5 (ppm): 1.11 (s, 3H), 1.21 (s, 3H), 1.33 (s, 9H), 1.58-2.66 (m, 7H), 1.73 (s, 3H), 1.93 (s, 3H), 2.67-3.67 (s ancho, 5H), 3.73-3.97 (s ancho, 1H), 4.02-4.68 (m, 7H), 4.96 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.24 (s, 1H), 5.35-5.55 (m, 1H), 5.50 (s, 1H), 5.66 (d, J = 6.7 Hz, 1H), 5.95-6.30 (m, 1H), 7.24-7.68 (m, 7H), 8.08 (d, J = 6.9 Hz, 2H).
(b) Preparación de BHALys[Lys]32[a-DGA-DTX]32[£-PEG1100]32
Figure imgf000029_0002
Preparado usando el Procedimiento C anterior, usando BHALys[Lys]32[a-NH2.TFA]32[£-PEG1100]32 (36 mg, 0.84 pmol) y DGA-DTX (30 mg, 33 pmol). La purificación por SEC proporcionó 45 mg (79%) del material deseado como un sólido blanco. HPLC (C8, gradiente: 40-80% de ACN/H2O (1-7 min), 80% de a Cn (7-9 min), 80-40% de ACN (9-11 min), 40% de ACN (11-15 min), formiato de amonio 10 mM) Rt (min) = 7.69. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 1.0-2.1 (m, 833H), 2.3-2.6 (m, 125H), 3.0-3.3 (m, 68H), 3.5-4.0 (m, 2803H), 4.0-4.7 (m, 214H), 5.0-5.1 (m, 23H), 5.3-5.5 (m, 54H), 5.6-5.8 (m, 19h), 6.0-6.3 (m, 18H), 7.2-7.8 (m, 203H), 8.1-8.2 (m, 46H). Peso molecular teórico del conjugado: 72.4 kDa. La RMN 1H indica 18 DTX/dendrímero. El peso molecular real es de aproximadamente 55.7 kDa (26% de DTX en peso).
Ejemplo 4
(a) Preparación de Cp-DTX:
Figure imgf000029_0003
Preparado usando el Procedimiento A anterior, usando DTX (500 mg, 619 pmol) y ácido 3-oxo-1-ciclopentanocarboxílico (79 mg, 619 pmol) como conector. La HPLC preparativa (RT = 33.5 min) proporcionó Cp-DTX (401 mg, 71%) como un sólido blanco. LCMS (C8, gradiente: 40-90% de ACN/H2O (1-7 min), 90% de ACN (7-9 min), 90-40% de ACN (9-11 min), 40% de ACN (11-15 min), ácido fórmico al 0.1%) Rt (min) = 6.61. ESI (+va) observado [M H]+ = 918.54. Calculado para C49H59NO16 = 917.38 Da. RMN 1H (300 MHz, CDCh) 5 (ppm): 1.13 (s, 3H), 1.24 (s, 3H), 1.33 (s, 9H), 1.76 (s, 3H), 1.77-2.01 (m, 3H), 1.95 (s, 3H), 2.11 -2.49 (m, 6H), 2.46 (s, 3H), 2.60 (ddd, J = 16.2, 9.9 y 6.9 Hz, 1H), 3.10-3.24 (m, 1H), 3.94 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 4.20 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 4.27 (dd, J = 11.1 y 6.6 Hz, 1 H), 4.33 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 4.97 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 5.21 (s, 1H), 5.33 (d, J = 9.9 Hz, 1 H), 5.42 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 5.48­ 5.58 (d ancho, J = 9 Hz, 1 H), 5.69 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 6.27 (t, J = 8.7 Hz, 1 H), 7.25-7.45 (m, 5H), 7.47-7.53 (m, 2H), 7.57-7.64 (m, 1H), 8.09-8.14 (m, 2H).
(b) Preparación de 4-HSBA-Cp-DTX:
Figure imgf000030_0001
Se añadió una solución de DTX-Cp (30 mg, 32.7 pmol) en TFA/MeOH (5% v/v, 1 ml) a ácido 4-hidrazinosulfonilbenzoico (6 mg, 27.8 pmol). La mezcla se dejó reaccionar a 38°C durante 1.5 h después de lo cual se evaporó el disolvente a vacío. El semisólido blanco obtenido se utilizó directamente en la siguiente etapa.
(c) Preparación de BHALys[Lys]32[a-4-HSBA-Cp-DTX]32[£-PEGm0]32
Figure imgf000030_0002
Método A: A una solución con agitación magnética de Cp-DTX (7.5 mg, 8.15 pmol) en MeOH seco (1 ml) se le añadió TFA (50 pl). Esta solución se añadió a BHALys[Lys]32[a-4-HSBA]32[a-PEGmo]32 (10 mg, 0.215 pmol). La mezcla se dejó reaccionar durante la noche a temperatura ambiente y luego se añadió directamente a una columna de Sephadex (LH20, MeOH) para su purificación. Las fracciones apropiadas, evaluado por HPLC, se combinaron, concentraron y liofilizaron del agua para proporcionar 18 mg (70%) del material deseado como un sólido blanco.
Método B: A 4-HSBA-Cp-DTX (31 mg, 27.8 pmol) y PyBOP (14.5 mg, 27.8 pmol) se añadió una solución de BHALys[Lys]32[a-NH2TFA]32[£-PEGn00]32 (31.5 mg, 0.7 pmol) y DIPEA (15 pl, 89.0 pmol) en DMF (1 ml). La mezcla resultante se agitó durante la noche a temperatura ambiente, después de lo cual se evaporó el disolvente a vacío. El aceite amarillo restante se añadió a una columna Sephadex (LH20, MeOH) para su purificación. Las fracciones apropiadas, evaluado por HPLC, se combinaron, concentraron y liofilizaron en agua para proporcionar 34 mg (81% en dos etapas) del material deseado como un sólido blanco. HPLC (C8, gradiente: 40-80% de ACN/H2O (1-7 min), 80% de ACN (7-9 min), 80-40% de ACN (9-11 min), 40% de ACN (11-15 min), formiato de amonio 10 mM) Rt (min) = 7.65. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 1.12 (s, 44H), 1.16 (s, 44H), 1.21-2.29 (m, 688H), 2.32-2.53 (m, 113H), 2.80-3.25 (m, 64H), 3.35 (s, 85H), 3.36-3.90 (m, 2815H), 4.17-4.28 (m, 77H), 4.45-4.65 (m, 50H), 4.97-5.04 (m, 23H), 5.22-5.44 (m, 40H), 5.63 (d, J = 6.9 Hz, 16H), 6.00-6.20 (m, 15H), 7.2-8.25 (m, 308H). Peso molecular teórico del conjugado: 78.8 kDa. La RMN 1H indica 15 DTX/dendrímero en cada caso. El peso molecular real es de aproximadamente 60.0 kDa (20% de DTX en peso).
Ejemplo 5
(a) Preparación de Glu-DTX:
Figure imgf000031_0001
Preparado usando el Procedimiento B anterior, usando DTX (300 mg, 371 pmol) y anhídrido glutárico (85 mg, 742 pmol) en DMF (3.7 ml) como conector. La HPLC preparativa (Rt = 33 min) proporcionó 106 mg (31%) de Glu-DTX como un sólido blanco. LCMS (C8, gradiente: 40-90% de ACN/H2O (1 -7 min), 90% de ACN (7-9 min), 90-40% de ACN (9-11 min), 40% de ACN (11-15 min), ácido fórmico al 0.1%) Rt (min) = 6.12. ESI (+va) observado [M H]+ = 922.13. Calculado para C48H59NO17 = 921.38 Da. RMN 1H (300 MHz, CDCh) 5 (ppm): 1.11 (s, 3H), 1.22 (s, 3H), 1.33 (s, 9H), 1.74 (s, 3H), 1.79-2.65 (m, 14H), 1.93 (s, 3H), 3.91 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 4.19 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.26 (dd, J = 11.1 y 6.9 Hz, 1 H), 4.31 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.96 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 5.23 (s, 1H), 5.38 (s ancho, 1H), 5.35-5.65 (d ancho, 1H), 5.67 (d, J = 6.5 Hz, 1 H), 6.10-6.30 (s, 1 H), 7.26-7.34 (m, 3H), 7.34-7.43 (m, 2H), 7.46-7.55 (m, 2H), 7.57-7.65 (m, 1H), 8.10 (d, J = 7.4 Hz, 2H).
(b) Preparación de BHALys[Lys]32[a-Glu-DTX]32[£-PEGn00]32
Figure imgf000031_0002
Preparado usando el Procedimiento C anterior, usando BHALys[Lys]32[a-NH2TFA]32[£-PEG1100]32 (50 mg, 1.1 pmol) y Glu-DTX (39 mg, 42.3 pmol). La purificación mediante columna Sephadex (LH20, MeOH) proporcionó 49.5 mg (78%) del material deseado en forma de un sólido blanco. HPLC (C8, gradiente: 40-80% de ACN/H2O (1-7 min), 80% de ACN (7-9 min), 80-40% de ACN (9-11 min), 40% de ACN (11-15 min), formiato de amonio 10 mM) Rt (min) = 7.78. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 1.00-2.10 (m, 1037H), 2.10-2.74 (m, 296H), 3.05-3.27 (s ancho, 88H), 3.35 (s, 96H), 3.36­ 3.78 (m, 2800H), 3.80-3.93 (m, 42H), 4.01-4.47 (m, 125H), 4.47-4.60 (s ancho, 23H), 4.92-5.08 (s ancho, 30H), 5.18­ 5.45 (m, 70H), 5.54-5.74 (s ancho, 22H), 6.00-6.23 (s ancho, 20H), 7.15-7.75 (m, 414H), 8.05-8.20 (d ancho, J = 6.4 Hz, 49H). Peso molecular teórico del conjugado: 72.6 kDa. La RMN 1H indica 20 DTX/dendrímero. El peso molecular real es de aproximadamente 57.5 kDa (28% de DTX en peso).
Ejemplo 6
(a) Preparación de MIDA-DTX:
Figure imgf000031_0003
Preparado usando el Procedimiento A anterior, usando DTX (100 mg, 124 pmol) y ácido metiliminodiacético (91 mg, 620 pmol) como conector. La HPLC preparativa (RT = 22.5 min) proporcionó 29 mg (25%) de producto como un sólido blanco. LCMS (C8, gradiente: 40-90% de ACN/H2O (1-7 min), 90% de ACN (7-9 min), 90-40% de ACN (9-11 min), 40% de ACN (11-15 min), ácido fórmico al 0.1%) Rt (min) = 4.62. ESI (+va) observado [M H]+ = 937.34. Calculado para C48H60N2O17 = 936.39 Da. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 1.13 (s, 3H), 1.17 (s, 3H), 1.40 (s, 9H), 1.70 (s, 3H), 1.84 (ddd, J = 14.1, 11.4 y 1.8 Hz, 1H), 1.93 (s, 3H), 2.04 (dd, J = 15.0 y 8.7 Hz, 1H), 2.30 (dd, J = 15.0 y 8.7 Hz, 1H), 2.43 (s, 3H), 2.46 (ddd, J = 14.1,9.5 y 6.6 Hz, 1 H), 2.61 (s, 3H), 3.49 (s, 2H), 3.81 -3.94 (m, 3H), 4.21 (s, 2H), 4.24 (dd, J = 11.4 y 6.6 Hz, 1 H), 5.01 (dd, J = 9.5 y 1.8 Hz, 1H), 5.29 (s, 1H), 5.43 (s, 2H), 5.65 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 6.16 (t, J = 8.7 Hz, 1H), 7.21-7.34 (m, 1H), 7.35-7.50 (m, 4H), 7.51-7.79 (m, 3H), 8.13 (d, J = 7.2 Hz, 2H).
(b) Preparación de BHALys[Lys]32[a-MIDA-DTX]32[£-PEGm0]32
Figure imgf000032_0001
Preparado usando el Procedimiento C anterior, usando BHALys[Lys]32[a-NH2.TFA]32[£-PEGm0]32 (31.5 mg, 0.7 pmol) y MIDA-DTX (26 mg, 27.8 pmol). La purificación por SEC proporcionó 41.6 mg (93%) del producto deseado como un sólido blanco. HPLC (C8, gradiente: 40-80% de ACN/H2O (1-7 min), 80% de ACN (7-9 min), 80-40% de ACN (9-11 min), 40% de ACN (11-15 min), formiato de amonio 10 mM) Rt (min) = 7.78. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 1.00-2.10 (m, 1186H), 2.12-2.68 (m, 283H), 3.06-3.27 (m, 77H), 3.35 (s, 101H), 3.36-3.96 (m, 2842H), 4.07-4.61 (m, 143H), 4.93-5.10 (s ancho, 31H), 5.19-5.48 (m, 77H), 5.55-5.75 (m, 27H), 5.97-6.29 (m, 27H), 7.10-7.84 (m, 258H), 8.03-8.23 (m, 60H). Peso molecular teórico del conjugado: 73.1 kDa. La Rm N 1H indica 27 DTx/dendrímero. El peso molecular real es de aproximadamente 64.2 kDa (34% de DTX en peso).
Ejemplo 7
(a) Preparación de o-PDA-DTX:
Figure imgf000032_0002
Preparado usando el Procedimiento A anterior, usando DTX (300 mg, 0.37 mmol) y ácido o-fenilendioxidiacético (419 mg, 1.85 mmol) como conector. La HPLC preparativa (RT = 26 min) proporcionó 21 mg (11%) de producto como un sólido blanco. LCMS (C8, gradiente: 40-90% de ACN/H2O (1-7 min), 90% de ACN (7-9 min), 90-40% de ACN (9-11 min), 40% de ACN (11-15 min), ácido fórmico al 0.1%) Rt (min) = 7.27. ESI (+va) observado [M H]+ = 1016.29. Calculado para C53H61NO19 = 1015.38 Da. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 1.13 (s, 3H), 1.17 (s, 3H), 1.40 (s, 9H), 1.69 (s, 3H), 1.82 (ddd, J = 13.5, 11.4 y 2.1 Hz, 1H), 1.89 (s, 3H), 1.94-2.07 (m, 1H), 2.00-2.33 (m, 1H), 2.40 (s, 3H), 2.45 (ddd, J = 15.9, 9.6 y 6.6 Hz, 1 H), 3.87 (d, J = 6.9 Hz, 1 H), 4.18-4.27 (m, 3H), 4.68 (s, 2H), 4.87 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 5.00 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 5.27 (s, 1H), 5.36-5.43 (m, 2H), 5.64 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 6.13 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 6.86-6.98 (m, 4H), 7.23-7.32 (m, 1H), 7.35-7.43 (m, 4H), 7.52-7.60 (m, 2H), 7.62-7.70 (m, 1H), 8.07-8.15 (m, 2H).
(b) Preparación de BHALys[Lys]32[a-o-PDA-DTX]32[£-PEGm0]32
Figure imgf000033_0001
Preparado usando el Procedimiento C anterior, usando BHALys[Lys]32[a-NH2.TFA]32[£-PEGiioo]32 (22.5 mg, 0.5 pmol) y o-PDA-DTX (21 mg, 20.7 pmol). La purificación por SEC (sephadex, LH20, MeOH) proporcionó 30 mg (95%) del producto deseado como un semisólido ligeramente beige. HPLC (C8, gradiente: 40-80% de ACN/H2O (1-7 min), 80% de ACN (7-9 min), 80-40% de ACN (9-11 min), 40% de ACN (11-15 min), formiato de amonio 10 mM) Rt (min) = 9.80. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 0.95-2.12 (m, 1058H), 2.12-2.66 (m, 205H), 2.89-3.29 (m, 125H), 3.35 (s, 85H), 3.36-3.93 (m, 2822H), 3.98-4.75 (m, 212H), 4.83-5.08 (m, 89H), 5.18-5.34 (m, 17H), 5.34-5.54 (m, 38H), 5.54­ 5.79 (m, 22H), 6.01-6.26 (m, 22H), 6.68-7.13 (m, 98H), 7.13-7.78 (m, 214H), 8.02-8.22 (m, 50H). Peso molecular teórico del conjugado: 75.6 kDa. La RMN 1H indica 22 DTX/dendrímero. El peso molecular real es de aproximadamente 63.2 kDa (28% de DTX en peso).
Ejemplo 8
(a) Preparación de TDA-DTX por el Procedimiento A:
Figure imgf000033_0002
Preparado usando el Procedimiento A anterior, usando DTX (500 mg, 0.62 mmol) y ácido 2,2'-tiodiacético (370 mg, 2.5 mmol) como conector. La HPLC preparativa (RT = 33 min) proporcionó 240 mg (41%) de producto como un sólido blanco. LCMS (C8, gradiente: 40-90% de ACN/H2O (1-7 min), 90% de ACN (7-9 min), 90-40% de ACN (9-11 min), 40% de ACN (11-15 min), TFA al 0.1%) Rt (min) = 10.60. ESI (+va) observado [M H]+ = 940. Calculado para C47H57NO17S = 939.33 Da. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 1.15 (s, 3H), 1.19 (s, 3H), 1.43 (s, 9H), 1.72 (s, 3H), 1.78-2.05 (m, 2H), 1.93 (s, 3H), 2.16-2.57 (m, 2H), 2.43 (s, 3H), 3.36-3.63 (m, 2H), 3.89 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 4.18-4.34 (m, 3H), 5.03 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 5.28-5.44 (m, 3H), 5.66 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 6.11 (m, 1H), 7.24-7.35 (m, 1H), 7.38­ 7.50 (m, 4H), 7.52-7.65 (m, 2H), 7.66-7.76 (m, 1H), 8.14 (d, J = 7.2 Hz, 2H).
(b) Preparación de TDA-DTX por el Procedimiento B:
Preparado usando el Procedimiento B anterior, usando DTX (400 mg, 0.50 mmol) y anhídrido tiodiacético (66 mg, 0.50 mmol) como conector. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche y luego se eliminó el disolvente a presión reducida para dar un residuo bruto. El residuo se volvió a disolver en EtOAc (250 ml) y se lavó con tampón PBS (ajustado a pH 4.0). La capa orgánica separada se secó sobre MgSO4 y se concentró a presión reducida para dar 445 mg (95%) del producto deseado como un sólido blanco. LCMS (columna Waters XBridge C8 (3.0 x 100 mm), 3.5 micrómetros, 214, 243 nm, 0.4 ml/min, gradiente: 40-90% de ACN/H2O (1-7 min), 90% de ACN (7-9 min), 90-40% de ACN (9-11 min), 40% de ACN 11-15 min), TFA al 0.1%) Rt (min) = 10.60. ESI (+va) observado [M H]+ = 940. Calculado para C47H57NO17S = 939.33 Da.
(c) Preparación de BHALys[Lys]32[a-TDA-DTX]32[£-PEGm0]32
Figure imgf000034_0001
Preparado usando el Procedimiento C anterior, usando BHALys[Lys]32[a-NH2.TFA]32[£-PEGiioo]32 (46 mg, 1.08 pmol) y TDA-DTX (44 mg, 47 pmol). La purificación por SEC (Sephadex, LH20, MeOH) proporcionó 65 mg (87%) del material deseado como un sólido blanco. HPLC (C8, gradiente: 40-80% de ACN/H2O (l-7 min), 80% de ACN (7-9 min), 80­ 40% de ACN (9-11 min), 40% de ACN (11-15 min), formiato de amonio 10 mM) Rt (min) = 9.68. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 0.78-2.02 (m, 809H), 2.27-2.58 (m, 114H), 3.03-3.24 (m, 43H), 3.34 (s, 73H), 3.37-3.96 (m, 2800H), 4.01-4.39 (m, 27H), 5.20-5.48 (m, 75H), 5.54-5.74 (m, 23H), 5.98-6.25 (m, 20H), 7.12-7.84 (m, 202H), 8.01-8.22 (m, 46H). Peso molecular teórico del conjugado: 68.9 kDa. La RMN 1H indica 23 DTX/dendrímero. El peso molecular real es de aproximadamente 60.6 kDa (31% de DTX en peso). El tamaño de las partículas mediante dispersión dinámica de luz muestra un intervalo de promedios dependientes de la concentración de 8.9 - 10.1 nm.
Ejemplo 9
(a) Preparación de PDT-DTX:
Figure imgf000034_0002
Preparado usando el Procedimiento A anterior, usando DTX (250 mg, 0.31 mmol) y ácido 3,4-propilendioxitiofeno-2,5-dicarboxílico (PDT, 75 mg, 0.31 mmol) como conector. La purificación por HPLC preparativa (RT = 28 min) proporcionó 30 mg (9%) de producto como un sólido blanco. LCMS (C8, gradiente: 40-90% de ACN/H2O (1-7 min), 90% de ACN (7-9 min), 90-40% de ACN (9-11 min), 40% de ACN (11-15 min), TFA al 0.1%) Rt (min) = 7.24. ESI (+va) observado [M H]+ = 1034. Calculado para C52H59NO19S = 1033.34 Da. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 1.14 (s, 3H), 1.18 (s, 3H), 1.45 (s, 9H), 1.71 (s, 3H), 1.78-1.91 (m, 2H), 1.94 (s, 3H), 2.09-2.27 (m, 1H), 2.29-2.58 (m, 3H), 2.41 (s, 3H), 3.88 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 4.20-4.30 (m, 3H), 4.31 -4.43 (m, 4H), 4.94-5.16 (m, 1 H), 5.30 (s, 1H), 5.36-5.42 (m, 2H), 5.65 (d, J = 6.9 Hz, 1 H), 6.02-6.22 (m, 1H), 7.23-7.34 (m, 1H), 7.36-7.53 (m, 4H), 7.56-7.65 (m, 2H), 7.66-7.77 (m, 1 H), 8.11 (d, J = 7.2 Hz, 2H).
(b) Preparación de BHALys[Lys]32[a-PDT-DTX]32[£-PEGm0]32
Figure imgf000034_0003
Preparado usando el Procedimiento C anterior, usando BHALys[Lys]32[a-NH2.TFA]32[£-PEGn00]32 (29 mg, 0.67 pmol) y PDT-DTX (30 mg, 29 pmol). La purificación por SEC (Sephadex, LH20, MeOH) proporcionó 42 mg (88%) del material deseado como un sólido blanco. HPLC (C8, gradiente: 40-80% de ACN/H2O (1-7 min), 80% de ACN (7-9 min), 80 40% de ACN (9-11 min), 40% de ACN (11-15 min), formiato de amonio 10 mM) Rt (min) = 9.03. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 0.76-2.10 (m, 974H), 2.23-2.66 (m, 210H), 3.08-3.30 (m, 74H), 3.40-3.98 (m, 2804H), 4.02-4.76 (m, 249H), 4.96-5.12 (m, 33H), 5.22-5.34 (m, 25H), 5.36-5.52 (m, 47H), 5.56-5.80 (m, 27H), 5.88-6.30 (m, 24H), 7.08-7.94 (m, 213H), 7.99-8.31 (m, 50h ). Peso molecular teórico del conjugado: 71.9 kDa. La RMN 1H indica 26 DTX/dendrímero. El peso molecular real es aproximadamente 66.3 kDa (32% de DTX en peso).
Ejemplo 10
(a) Preparación de PEG2-DTX:
Figure imgf000035_0001
Preparado usando el Procedimiento A anterior, usando DTX (200 mg, 0.25 mmol) y ácido 3,6,9-trioxaundecanodioico (220 mg, 1.0 mmol). La HPLC preparativa (RT = 30.5 min) proporcionó 70 mg (28%) de producto como un sólido blanco. LCMS (C8, gradiente: 40-90% de ACN/H2O (1-7 min), 90% de ACN (7-9 min), 90-40% de ACN (9-11 min), 40% de ACN (11-15 min), ácido fórmico al 0.1%) Rt (min) = 6.48. ESI (+va) observado [M H]+ = 1012.15. Calculado para C51H65NO20 = 1011.41 Da. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 1.13 (s, 3H), 1.17 (s, 3H), 1.40 (s, 9H), 1.70 (s, 3H), 1.83 (ddd, J = 13.8, 11.1 y 2.1 Hz, 1H), 1.93 (s, 3H), 1.92-2.12 (m, 1H), 2.17-2.38 (m, 1H), 2.42 (s, 3H), 2.46 (ddd, J = 14.7, 9.9 y 6.6 Hz, 1 H), 3.56-3.82 (m, 8H), 3.88 (d, J = 7.0 Hz, 1 H), 4.06 (s, 2H), 4.16-4.39 (m, 5H), 5.01 (d, J = 9.3 Hz, 1 H), 5.29 (s, 1H), 5.38 (s, 2H), 5.65 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 6.13 (t, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.22-7.33 (m, 1H), 7.35-7.47 (m, 4H), 7.51-7.62 (m, 2H), 7.62-7.72 (m, 1H), 8.13 (d, J = 7.2 Hz, 2H).
(b) Preparación de BHALys[Lys]32[a-PEG2-DTX]32[£-PEG1100]32
Figure imgf000035_0002
Preparado usando el Procedimiento C anterior, usando BHALys[Lys]32[a-NH2.TFA]32[£-PEG1100]32 (55.8 mg, 1.24 |jmol) y PEG2-DTX (50 mg, 49.5 ^ o l ) . La purificación por SEC (Sephadex, LH20, MeOH) proporcionó 79 mg (>90%) del producto deseado como un sólido blanco. HPLC (C8, gradiente: 40-80% de ACN/H2O (1-7 min), 80% de ACN (7-9 min), 80-40% de ACN (9-11 min), 40% de ACN (11-15 min), formiato de amonio 10 mM) Rf (min) = 8.65. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 0.91-2.14 (m, 968H), 2.14-2.64 (m, 185H), 2.88-3.29 (m, 109H), 3.35 (s, 89H), 3.36-3.95 (m, 3016H), 3.95-4.65 (m, 251 H), 5.00 (s ancho, 32H), 5.20-5.49 (m, 72H), 5.55-5.75 (m, 25H), 6.13 (s ancho, 25H), 7.12­ 7.81 (m, 213H), 8.13 (d, J = 7.2 Hz, 50H). Peso molecular teórico del conjugado: 75.5 kDa. La RMN 1H indica 24 DTX/dendrímero. El peso molecular real es de aproximadamente 63.2 kDa (31% en peso de DTX).
Ejemplo 11
Preparación de BHALys[Lys]32[a-Lys(a-Ac)(£-DGA-DTX)]32[£-Lys(PEG570)2]32
(a) Preparación de HO-Lys(NH2.TFA)2
Figure imgf000036_0001
A una suspensión con agitación magnética de L-lisina (500 mg, 3.42 mmol) en CH2CI2 (21 ml) se añadió una solución de TFA en CH2Cl2 (21 ml, 1:1 v/v). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas y luego se concentró a vacío. El residuo se disolvió en agua (30 ml) y se concentró a vacío. Este procedimiento se repitió una vez más. A continuación, el aceite restante se liofilizó del agua, proporcionando 1.33 g del producto deseado en forma de aceite amarillento que se utilizó directamente en la siguiente etapa.
(b) Preparación de HO-Lys(PEG570)2
Figure imgf000036_0002
A una solución con agitación magnética de PEG570-NHS (1.06 g, 1.55 mmol) en DMF (5 ml) se añadió DIPEA (806 pl, 4.64 mmol), seguido de una solución de HO-Lys(NH2-TFA)2 (300 mg) en DMF (4 ml). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Luego se eliminaron los compuestos volátiles a vacío y el residuo se purificó por HPLC preparativa (BEH 300 Waters XBridge C18, 5 pM, 30 x 150 mm, gradiente: 5% de ACN/H2O (1-5 min), 5-60% de a Cn (5-35 min), 60-80% de ACN (35-40 min), 80% de ACN (40-45 min), 80-5% de ACN (45-50 min), 5% de ACN (50-60 min), sin tampón, Rt = 29.3 min). Las fracciones apropiadas se concentraron a vacío y se liofilizaron del agua, proporcionando 481 mg (48% en dos etapas) del producto deseado como un semisólido blanco. HPLC (C18, gradiente: 5-60% de ACN/H2O (1-10 min), 60% de ACN (10-11 min), 60-5% de ACN (11-13 min), 5% de ACN (13-15 min), formiato de amonio 10 mM) Rt (min) = 8.68. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 1.33-1.62 (m, 4H), 1.62-1.95 (m, 2H), 2.43 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 2.52 (dt, J = 6.2 y 3.6 Hz, 2H), 3.16-3.24 (m, 2H), 3.36 (s, 6H), 3.36-3.90 (m, 95H), 4.39 (dd, J = 8.7 y 5.1 Hz, 1H).
(c) Preparación de BHALys[Lys]16[Lys(a-Boc)(£-NH2]32
A una suspensión con agitación magnética de BHALys[Lys]16[Lys(a-Boc)(£-Fmoc)]32 (500 mg, 26.9 pmol) en DMF (3.4 ml) se añadió piperidina (849 pl, al 20% v/v en DMF). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche y luego se vertió en éter dietílico (65 ml). El precipitado blanco que se formó se separó por filtración y se lavó con éter dietílico (100 ml). La torta de filtración se transfirió a un vial y se secó al aire durante 3 días, proporcionando 281 mg (91%) de producto en forma de un sólido blanco. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 1.00-2.10 (m, 680H), 2.65-2.88 (s ancho, 48H), 2.91-2.98 (m, 11H), 2.99-3.28 (m, 78H), 3.81-4.21 (m, 33H), 4.21-4.55 (m, 32H), 6.21 (s, 1H), 7.20­ 7.41 (m, 10H).
(d) Preparación de BHALys[Lys]32[a-Boc]32[£-Lys(PEG570)2]32
A una solución con agitación magnética de BHALys[Lys]16[Lys(a-Boc)(£-NH2)]32 (49 mg, 4.33 pmol) en DMF y DMSO (3 ml, 5:1 v/v) se añadió DIPEA (96 pl, 554.2 pmol). La solución resultante se añadió a una solución de HO-Lys(PEG570)2 (223 mg, 173.3 pmol) y PyBOP (90 mg, 173.3 pmol) en DMF (5.5 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Luego se eliminaron los compuestos volátiles a vacío y el residuo se purificó por ultrafiltración (cápsulas de filtración de flujo tangencial Pall Minimate™, membrana Omega™ 10K, agua). La solución acuosa restante se liofilizó, proporcionando 120 mg (53%) del producto deseado en forma de un aceite amarillento. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 1.18-1.98 (m, 863H), 2.38-2.63 (m, 123H), 3.04-3.30 (m, 194H), 3.36 (s, 172H), 3.38-3.91 (m, 2816H), 3.93-4.18 (s ancho, 35H), 4.18-4.47 (m, 63H), 4.47-4.60 (m, 12H), 6.18 (s, 1H), 7.19­ 7.43 (m, 10H).
e) Preparación de BHALys[Lys]32[a-NH2.TFA]32[£-Lys(PEG570)2]32
A una solución con agitación magnética de BHALys[Lys]32[a-Boc]32[£-Lys(PEG570)2]32 (120 mg, 2.3 pmol) en CH2G2 (2 ml) se añadió una solución de TFA en CH2G2 (2 ml, 1:1 v/v). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3.5 h, tras lo cual se evaporaron los disolventes a vacío. El aceite restante se disolvió en agua (5 ml) y la solución resultante se concentró a vacío. Este procedimiento se repitió una vez más y el aceite que quedaba se recogió en agua y se purificó por SEC (columnas de desalación PD-10, GE Healthcare, 17-0851 -01, medio Sephadex G-25). Las fracciones recogidas se combinaron y se liofilizaron del agua para proporcionar 93 mg (77%) del material deseado en forma de aceite amarillento. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 1.18-2.01 (m, 556H), 2.38-2.65 (m, 118H), 3.02-3.30 (m, 181H), 3.36 (s, 178H), 3.38-3.94 (m, 2816H), 4.09-4.55 (m, 63H), 6.13-6.22 (m, 1H), 7.19-7.45 (m, 10H).
(f) Preparación de BHALys[Lys]32[a-Lys(a-Ac)(£-Boc)]32[£-Lys(PEG570)2]32
A una solución de BHALys [Lys]37[a-NH2.TFA]37[£-Lys (PEG570)2]32 (93 mg, 1.8 pmol) en DMF (3.6 ml) se añadió DIPEA (40 pl, 230.4 pmol). La solución resultante se añadió a HO-Lys(a-Ac)(£-Boc) (21 mg, 72 pmol) y PyBOP (37 mg, 72 pmol) sólidos contenidos en un segundo matraz. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Luego se eliminaron los compuestos volátiles a vacío y el residuo se purificó por SEC (Sephadex, LH20, MeOH). Las fracciones apropiadas, según se juzgó por HPLC, se combinaron y concentraron. El aceite amarillento así obtenido se liofilizó del agua para dar 97 mg (94%) del producto deseado como un semisólido ligeramente amarillento. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 1.10-2.15 (m, 1139H), 2.36-2.63 (m, 120H), 2.93-3.30 (m, 251H), 3.36 (s, 195H), 3.37­ 3.91 (m, 2816H), 4.16-4.51 (s ancho, 122H), 6.15-6.21 (m, 1H), 7.18-7.43 (m, 10H).
(g) Preparación de BH4Lys[Lys]32[a-Lys(a-Ac)(£-NH2.TFA)]32[£-Lys(PEG570)2]32
A una solución con agitación magnética de BHALys[Lys]32[a-Lys(a-Ac)(£-Boc)]32[£-Lys(PEG570)2]32 (97 mg, 1.69 pmol) en CH2Cl2 (1 ml) se añadió una solución de TFA en CH2G2 (2 ml, 1:1 v/v). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche y luego se evaporaron los disolventes a vacío. El aceite que quedaba se disolvió en agua (4 ml) y la solución resultante se concentró a vacío. Este procedimiento se repitió una vez más y el aceite que quedaba se recogió en agua y se purificó por SEC (columnas de desalación PD-10, GE Healthcare, 17-0851 -01, medio Sephadex G-25). Las fracciones recogidas se combinaron y se liofilizaron del agua para proporcionar 104 mg (>90%) del material deseado en forma de un aceite amarillento. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 1.13-2.20 (m, 843H), 2.37-2.65 (m, 122H), 2.89-3.06 (m, 70H), 3.06-3.30 (m, 180H), 3.36 (s, 182H), 3.39-3.92 (m, 2816H), 4.08-4.47 (s ancho, 126H), 6.13-6.20 (m, 1H), 7.20-7.45 (m, 10H).
(h) Preparación de BHALys[Lys]32[a-Lys(a-Ac)(£-DGA-DTX)]32[£-Lys(PEG570)2]32
Figure imgf000037_0001
Preparado usando el Procedimiento C anterior, usando BHALys[Lys]32[a-Lys(a-Ac)(£-NH2.TFA)]32[£-Lys(PEG570)2]32 (49 mg, 0.85 pmol) y DGA-DTX (31 mg, 34 pmol). La purificación por SEC (Sephadex, LH20, MeOH) proporcionó 57 mg (80%) del producto deseado como un sólido blanco. HPLC (C8, gradiente: 40-80% de ACN/H2O (1-7 min), 80% de ACN (7-9 min), 80-40% de ACN (9-11 min), 40% de ACN (11-15 min), formiato de amonio 10 mM) Rt (min) = 8.85. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 0.79-2.73 (m, 1698H), 3.06-3.29 (m, 179H), 3.35 (s, 184H), 3.36­ 3.92 (m, 2848H), 3.95-4.60 (m, 332H), 5.01 (s ancho, 32H), 5.20-5.52 (m, 77H), 5.64 (s ancho, 30H), 6.13 (s ancho, 27H), 7.14-7.34 (m, 39H), 7.34-7.52 (m, 104H), 7.52-7.76 (m, 87H), 8.02-8.24 (m, 57H). Peso molecular teórico del conjugado: 83.3 kDa. La RMN 1H indica 27 DTX/dendrímero. El peso molecular real es de aproximadamente 78.8 kDa (28% en peso de DTX).
Ejemplo 12
Preparación de BHALys[Lys]32[a-Glu-PTX]32[£-PEG2300]32 PTX = Paclitaxel
Figure imgf000038_0001
Preparado usando el Procedimiento C anterior, usando Glu-PTX (300 mg, 371 pmol) y BHALys[Lys]i6[Lys(a-NH2.TFA)(£-PEG23oo)]32 (22.0 mg, 0.26 pmol). La purificación por HPLC preparativa (Rt = 28 min) proporcionó 12 mg (41%) del dendrímero deseado. RMN 1H (CD3OD): 50.78-2.80 (m, 1785H), 2.96-3.23 (m, 120H), 3.35-3.45 (m, 567H), 3.46-3.94 (m, 5610H), 4.04-4.47 (m, 167H), 4.48-4.65 (m, 88H), 5.50 (m, 29H), 5.64 (m, 24H), 5.85 (m, 27H), 6.10 (m, 26H), 6.46 (m, 20H), 7.26 (m, 66H), 7.36-8.o0 (m, 407H), 8.12 (s, 53H). Peso molecular teórico del conjugado: 112.4 kDa. La r Mn 1H indica 25 PTX/dendrímero. El peso molecular real es de aproximadamente 105 kDa (20% de PTX en peso).
Ejemplo 13
Preparación de BHALys[Lys]32[a-Glu-GEM]32[£-PEGmo]32 GEM = gemcitabina
(a) Preparación de N,O-di-BOC-GEM-Glu
Figure imgf000038_0002
A una mezcla agitada de N,O-diBoc-gemicitabina (Guo, Z.; Gallo, J. M. "Selective Protection of 2' 2'Difluorodeoxycytidine" J. Org. Chem, 1999, 64, 8319-8322) (200 mg, 0.43 mmol) en DMF (2 ml) a 0°C se añadió DIPEA (0.4 ml, 2.15 mmol) y anhídrido glutárico (100 mg, 0.86 mmol). La reacción se dejó calentar a temperatura ambiente durante 1 hora y luego se agitó durante 3 horas más. Después, la DMF se separó a vacío y el residuo se recogió en acetato de etilo (20 ml). Esta mezcla se lavó luego con NaHCO3 (10%, 2 x 10 ml), agua (2 x 20 ml) y salmuera (20 ml). Luego se secó la fase orgánica (Na2SO4), se filtró y se concentró a presión reducida. Después, el producto bruto se purificó por cromatografía en gel de sílice (DCM/Metanol) proporcionando 130 mg (54%) del producto deseado en forma de un sólido blanco. LCMS (C18, gradiente: 20-60% de ACN/H2O (1 -7 min), 60% de ACN (7-9 min), 60-20% de ACN (9-11 min), 20% de ACN (11-15 min), TFA al 0.1%, Rt (min) = 10.8 min. ESI (+va) observado [M H]+ = 578. Calculado para C24H32N3F2O11 = 576.20 Da. RMN 1H (CDCh): 51.51 (s, 18H), 2.01-1.88 (m, 2H), 2.55-2.4 (m, 2H), 2.75-2.64 (m, 2H), 4.46-4.38 (m, 3H), 5.15-5.10 (m, 1 H), 6.46-6.30 (m, 1H), 7.36-7.50 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.6­ 7.79 (d, J = 7.8 Hz, 1 H).
(b) Preparación de BHALys[Lys]32[a-Glu-GEM]32[£-PEGmo]32
Figure imgf000039_0001
Preparado usando el Procedimiento C anterior, usando BHALys[Lys]i6[Lys(a-NH2.TFA)(£-PEG)iioo]32 (40 mg, 1.03 mmol) y N,O-di-Boc-GEM-Glu (28 mg, 49 pmol). La purificación por Se C (columna de desalación PD-10, GE Healthcare, 17-0851-01, medio Sephadex G-25) proporcionó 20 mg de material. El sólido se recogió en TFA/DCM (1:1, 2 ml) y se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente. Se eliminaron los compuestos volátiles a vacío y el residuo se recogió en agua y se liofilizó, proporcionando 18 mg (47%) de polvo blanco. HPLC (C8, gradiente: 40-80% de ACN/H2O (1-7 min), 80% de ACN (7-9 min), 80-40% de ACN (9-11 min), 40% de ACN (11-15 min), TFA al 0.1%), Rt (min) = 6.06. RMN 1H (CD3OD): 50.89-2.1 (m, 456H), 2.1-2.7 (m, 185H), 2.9-3.2 (m, 90H), 3.2-3.3 (m, 191H), 3.44­ 4.12 (m, 2650H), 4.14-4.70 (m, 160H), 5.8-6.0 (m, 28H), 6.2-6.4 (m, 28H), 7.05-7.15 (s, 11H), 7.5-7.7 (m, 24H). Peso molecular teórico del conjugado: 59.2 kDa. La RMN 1H indica 26 GEM/dendrímero. El peso molecular real es aproximadamente 52.3 kDa (15% de GEM en peso).
Ejemplo 14
(a) Preparación de BHALys[Lys]32[a-GGG-Boc]32[£-PEGm0]32
Figure imgf000039_0002
A una solución con agitación magnética de Boc-GGG-OH (28 mg, 93.2 pmol) y PyBOP (48 mg, 93.2 pmol) en DMF (1 ml) a temperatura ambiente se le añadió una solución de BHALys[Lys]32[a-NH2-TFA]32[£-PEGm0]32 (100 mg, 2.33 pmol) y DIPEA (51 pl, 298.24 pmol) en DMF (2.6 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas y luego se concentró a presión reducida. El residuo se disolvió en MeOH (1 ml) y se purificó por SEC (Sephadex, LH-20, MeOH). Las fracciones apropiadas, según se juzgó por HPLC, se combinaron y concentraron para proporcionar 98 mg de producto como un aceite transparente e incoloro. Este último se disolvió en agua MQ y se liofilizó para dar 98 mg (87%) de producto en forma de una resina incolora. LCMS (C8, gradiente: 5-80% de ACN/H2O (1-7 min), 80% de ACN (7-12 min), 80-5% de ACN (12-13 min), 5% de ACN (13-15 min), TFA al 0.1%) Rt (min) = 8.63. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 1.15-2.01 (m, 693H), 2.46 (s ancho, 57H), 3.18 (s ancho, 101H), 3.35 (s, 53H), 3.36 (s, 84H), 3.38-4.04 (m, 2990H), 4.30 (s ancho, 63H), 6.17 (s ancho, 1H), 7.29 (s ancho, 9H). La RMN 1H indica aprox. 32 Boc-GGG/dendrímero. El peso molecular es de aproximadamente 48.5 kDa.
(b) Preparación de BHALys[Lys]32[a-GGG-NH2.TFA]32[£-PEGm0]32
A una mezcla con agitación magnética de BHALys[Lys]32[a-GGG-Boc]32[£-PEGiioo]32 (98 mg, 2.02 gmol) en CH2CI2 (1 ml) a temperatura ambiente se le añadió una solución de TFA en CH2G2 (1:1, 2 ml). Después de 18 horas a temperatura ambiente, se eliminaron los compuestos volátiles. El residuo resultante se disolvió en agua MQ (15 ml) y se concentró. Este procedimiento se repitió una vez más. Luego, el residuo se disolvió en agua MQ (12.5 ml) y se purificó por SEC (PD-10, agua MQ). Las fracciones apropiadas se combinaron y liofilizaron para proporcionar 92 mg (94%) del material deseado en forma de un aceite transparente e incoloro. HPLC (C8, gradiente: 5-80% de ACN/H2O (1-7 min), 80% de ACN (7-12 min), 80-5% de ACN (12-13 min), 5% de ACN (13-15 min), TFA al 0.1%) Rt (min) = 7.94. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 1.19-2.05 (m, 351H), 2.47 (s ancho, 58H), 3.18 (s ancho, 105H), 3.36 (s, 89H), 3.38-4.15 (m, 2990H), 4.31 (s ancho, 72H), 6.17 (s ancho, 1H), 7.30 (s ancho, 9H). La RMN 1H indica aprox. 32 GGG-NH2.TFA/dendrímero. El peso molecular es de aproximadamente 48.6 kDa.
(c) Preparación de BHALys[Lys]32[a-GGG-Glu-DTX]32[£-PEGm0]32
Figure imgf000040_0001
Preparado usando el Procedimiento C anterior, usando BHALys[Lys]32[a-GGG-NH2.TFA]32[£-PEGm0]32 (75 mg, 1.53 gmol) y Glu-DTX (56 mg, 61.2 gmol). La purificación por SEC (Sephadex, LH-20, MeOH) proporcionó 96 mg (92%) de producto como un sólido blanco. HPLC (C8, gradiente: 5-80% de ACN/H2O (1-7 min), 80% de ACN (7-12 min), 80-5% de ACN (12-13 min), 5% de ACN (13-15 min), TFA al 0.1%) Rt (min) = 10.08. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 0.75-2.02 (m, 985H), 2.02-2.64 (m, 309H), 2.92-3.17 (m, 53H), 3.25 (s, 89H), 3.26-4.00 (m, 3070H), 4.00-4.40 (m, 174H), 4.82-5.00 (m, 44H), 5.04-5.39 (m, 87H), 5.54 (s ancho, 27H), 6.01 (s ancho, 22H), 7.03-7.67 (m, 227H), 7.92­ 8.10 (m, 49H). Peso molecular teórico del conjugado: 73.9 kDa. La RMN 1H indica 32 g Gg y 26 DTX/dendrímero. El peso molecular real es de aproximadamente 68.5 kDa (31% de DTX en peso).
Ejemplo 15
a) Preparación de BHALys[Lys]32[a-GFLG-Boc]32[£-PEGm0]32
Figure imgf000040_0002
A una solución con agitación magnética de Boc-GLFG-OH (32 mg, 65.2 gmol) y PyBOP (34 mg, 65.2 gmol) en DMF (1 ml) a temperatura ambiente se le añadió una solución de BHALys[Lys].32[a-NH2.TFA]32[£-PEGm0]32 (70 mg, 1.63 gmol) y DIPEA (36 gl, 208.64 gmol) en DMF (1.5 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas y luego se concentró a presión reducida. El residuo se disolvió en MeOH (1 ml) y se purificó por SEC (Sephadex, LH-20, MeOH). Las fracciones apropiadas, según se juzgó por HPLC, se combinaron y concentraron para proporcionar 77 mg (88%) de producto en forma de un aceite transparente e incoloro. HPLC (C8, gradiente: 5-80% de ACN/H2O (1­ 7 min), 80% de ACN (7-12 min), 80-5% de ACN (12-13 min), 5% de ACN (13-15 min), TFA al 0.1%) Rt (min) = 9.14. RMN 1H (300 MHz, CD3DO) 5 (ppm): 0.63-1.06 (m, 211H), 1.06-2.11 (m, 789H), 2.32-2.62 (m, 61H), 2.88-3.28 (m, 148H), 3.36 (s, 95H), 3.37-4.00 (m, 2920H), 4.17-4.69 (m, 132H), 7.23 (s ancho, 140H). La RMN 1H indica aprox.
30 Boc-GLFG/dendrímero. El peso molecular es de aproximadamente 53.8 kDa.
(b) Preparación de BHALys[Lys]32[a-GFLG-NH2.TFA]32[£-PEGiioo]32
Figure imgf000041_0001
A una mezcla con agitación magnética de BHALys[Lys]32[a-GFLG-Boc]32[£-PEGm0]32 (77 mg, 1.43 pmol) en CH2CI2 (1 ml) a temperatura ambiente se le añadió una solución de TFA en CH2CI2 ( l:1 ,2 ml). Después de 3 horas a temperatura ambiente, se eliminaron los compuestos volátiles. El residuo resultante se disolvió en agua MQ (15 ml) y se concentró. Este procedimiento se repitió una vez más. A continuación, el residuo se disolvió en agua MQ (15 ml) y se liofilizó para proporcionar 76 mg (99%) del material deseado como una resina amarillenta. HPLC (C8, gradiente: 5-80% de ACN/H2O (1-7 min), 80% de ACN (7-12 min), 80-5% de ACN (12-13 min), 5% de ACN (13-15 min), TFA al 0.1%) Rt (min) = 8.08. RMN 1H (300 MHz, CD3DO) 5 (ppm): 0.75-1.04 (m, 197H), 1.10-2.09 (m, 480H), 2.45 (m, 56H), 2.88-3.29 (m, 146), 3.35 (s, 90H), 3.37-4.05 (m, 2920H), 4.17-4.69 (m, 133H), 7.66 (s, 159H). Peso molecular teórico del conjugado: 68.9 kDa. La RMN 1H indica aprox. 30 GFLG-NH2.TFA/dendrímero. El peso molecular es de aproximadamente 54.1 kDa.
(c) Preparación de BHALys [Lys]32[a-GFLG-Glu-DTX]32[£-PEGn00]32
Figure imgf000041_0002
Preparado usando el Procedimiento C anterior, usando BHALys[Lys]32[a-GFLG-NH2.TFA]32[£-PEGm0]32 (61 mg, 1.13 pmol) y Glu-DTX (42 mg, 45.60 pmol). La purificación por SEC (Sephadex, LH-20, MeOH) proporcionó 68 mg (85%) de producto como un sólido blanco. HPLC (C8, gradiente: 5-80% de ACN/H2O (1-7 min), 80% de ACN (7-12 min), 80-5% de ACN (12-13 min), 5% (ACN 13-15 min), TFA al 0.1%) Rt (min) = 10.16. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 0.85 (s, 173H), 0.99-2.13 (m, 1153H), 2.15-2.62 (m, 312H), 2.91-3.27 (m, 128H), 3.35 (s, 93), 3.36-4.00 (m, 2970H), 4.05-4.68 (m, 237H), 4.94-5.07 (m, 32H), 5.15-5.47 (m, 76H), 5.52-5.76 (m, 24H), 5.97-6.26 (s, 21H), 6.99-7.77 (m, 380H), 7.98-8.24 (m, 48H). Peso molecular teórico del conjugado: 80.4 kDa. La RMN 1H indica 30 GLFG y 22 DTX/dendrímero. El peso molecular real es de aproximadamente 70.6 kDa (25% de DTX en peso).
Ejemplo 16
Preparación de BHALys[Lys]32[a-GILGVP-Glu-DTX]32[£-PEGm0]32
Figure imgf000042_0001
Preparado usando el Procedimiento C anterior, usando BHALys[Lys]32[£-GILGVP-NH.TFA]32[a-PEGiioo]32 (52 mg, 0.86 pmol) y Glu-DTX (34 mg, 36 pmol). La purificación por SEC (Sephadex, LH20, MeOH) proporcionó 59 mg (80%) del material deseado como un sólido incoloro higroscópico. HPLC (C8, gradiente: 5-80% de ACN/H2O (1-7 min), 80% de ACN (7-12 min), 80-5% de ACN (12-13 min), 5% de ACN (13-15 min), tampón TFA al 0.1%) Rt (min) = 10.45. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 0.84-1.91 (m, 1808H), 2.41 (s, 287H), 3.12-3.20 (m, 106H), 3.35 (d ancho, 166H), 3.37-3.90 (m, 2800H), 4.10-4.40 (m ancho, 194H), 4.53 (s, 88H), 4.98-5.03 (m, 35H), 5.24-5.40 (m, 80H), 5.60-5.68 (m, 26H), 6.08­ 6.16 (m, 21H), 7.25-7.88 (m, 288H), 8.08-8.16 (m, 86H). Peso molecular teórico del conjugado: 85.6 kDa. La RM 1H indica 30 DTX/dendrímero. El peso molecular real es de aproximadamente 83.2 kDa (29% de DTX en peso).
Ejemplo 17
Preparación de BHALys[Lys]32[a-GILGVP-Glu-DTX]32[£-t-PEG2300]32
Figure imgf000042_0002
Preparado usando el Procedimiento C anterior, usando BHALys[Lys]32[a-GILGVP-NH2.TFA]32[£-t-PEG2300]32 (59 mg, 0.57 pmol) y Glu-DTX (23 mg, 25 pmol) y PyBOP (13 mg, 25 pmol) La purificación por SEC (Sephadex, LH20, MeOH) proporcionó 65 mg (89%) del material deseado como un sólido incoloro higroscópico. HPLC (C8, gradiente: 5-80% de ACN/H2O (1-7 min), 80% de ACN (7-12 min), 80-5% de ACN (12-13 min), 5% de ACN (13-15 min), tampón TFA al 0.1%) Rt (min) = 9.22. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 0.86-2.50 (m, 2622H), 3.12-3.20 (m, 80H), 3.35-3.88 (m, 5540H), 4.18-4.30 (m ancho, 263H), 4.50-4.58 (m, 149H), 4.96-5.04 (m, 42H), 5.24-5.38 (m, 77H), 5.62-5.68 (m, 29H), 6.08-6.14 (m, 28H), 7.25-7.70 (m, 234H), 8.10-8.15 (m, 63H). Peso molecular teórico del conjugado: 127.3 kDa. La RMN 1H indica 27 DTX/dendrímero. El peso molecular real es de aproximadamente 123.7 kDa (18% de DTX en peso).
Ejemplo 18
Preparación de BHALys[Lys]32[a-PEGm0]32[£-TDA-DTX]32
Figure imgf000043_0001
Preparado usando el Procedimiento C anterior, usando BHALys[Lys]32[£-NH2.TFA]32[a-PEGiioo]32 (57.5 mg, 1.34 pmol) y TDA-DTX (52.3 mg, 56 pmol). La purificación por SEC (Sephadex, LH20, MeOH) proporcionó 70 mg (92%) del material deseado como un sólido incoloro higroscópico. HPLC (C8, gradiente: 5-80% de ACN/H2O (1-7 min), 80% de ACN (7-12 min), 80-5% de ACN (12-13 min), 5% de ACN (13-15 min), tampón TFA al 0.1%) Rt (min) = 9.89. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 1.06-1.95 (m, 784H), 2.36-2.55 (m, 168H), 3.04-3.23 (m, 48H), 3.33 (s, 84H), 3.35-3.89 (m, 2800H), 4.13-4.40 (m, 118H), 5.23-5.40 (m, 72H), 5.59-5.66 (m, 24H), 6.06-6.16 (m, 23H), 7.25-7.65 (m, 234H), 8.10-8.12 (m, 52H). Peso molecular teórico del conjugado: 68.9 kDa. La Rm N 1H indica 27 DTX/dendrímero. El peso molecular real es de aproximadamente 64.4 kDa (34% de DTX en peso).
Ejemplo 19
Preparación de BHALys[Lys]32[a-TDA-DTX]32[£-PoliPEG2000]32
Figure imgf000043_0002
Preparado usando el Procedimiento C anterior, usando BHALys[Lys]32[a-NH2.TFA]32[£-PEG2000]32 (88.6 mg, 1.2 pmol) y TDA-DTX (49.3 mg, 52 pmol). La purificación por SEC (Sephadex, LH20, MeOH) proporcionó 95 mg (80%) del material deseado como un sólido incoloro higroscópico. HPLC (C8, gradiente: 45-85% de ACN/H2O (1-7 min), 85% de ACN (7-12 min), 85-45% de ACN (12-13 min), 45% de ACN (13-15 min), tampón TFA al 0.1%) Rf (min) = 6.29 min. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 0.82-1.96 (m, 2076H), 2.36-2.54 (m, 314H), 3.10-3.24 (m, 125H), 3.35-3.89 (m, 6300H), 4.96-5.04 (m, 35H), 5.25-5.45 (m, 79H), 5.60-5.70 (m, 29H), 6.06-6.18 (m, 24H), 7.20-7.75 (m, 269H), 8.06-8.16 (m, 52H). Peso molecular teórico del conjugado: 101.1 kDa. La RMN 1H indica 27 DTx/dendrímero. El peso molecular real es de aproximadamente 95.5 kDa (23% de DTX en peso). El tamaño de partículas utilizando la dispersión dinámica de luz muestra un intervalo de promedios dependientes de la concentración de 10.9 - 15.5 nm.
Ejemplo 20
Preparación de BHALys[Lys]32[a-DGA-testosterona]32[£-PEGn00]32
(a) Preparación de DGA-testosterona
Figure imgf000043_0003
Preparado usando el Procedimiento B anterior, usando testosterona (256 mg, 0.88 mmol), piridina (10 ml) como disolvente y anhídrido diglicólico (1.02 g, 8.8 mmol) como conector. Purificación por HPLC preparatoria (BEH 300 Waters XBridge C18, 5 pM, 30 x 150 mm, 40-90% de ACN/agua, sin tampón, RT = 62 min) para dar el compuesto deseado 241 mg (67% de rendimiento) como un sólido higroscópico blanquecino. LCMS (C8, gradiente: 40-90% de ACN/H2O (1-7 min), 90% de ACN (7-9 min), 90-40% de ACN (9-11 min), 40% de ACN (11-15 min), TFA al 0.1%) Rt (min) = 5.61. ESI (-va) observado [M - H]- = 403.29. Calculado para C23H31O6 = 403.21 Da. RMN 1H (300 MHz, CD3DO) 5 (ppm) 0.88 (s, 3H, CH3), 0.93-1.23 (m, 3H), 1.24 (s, 3H, CH3), 1.25-2.58 (m ancho, 16H), 4.18 (s, 2H, CH2), 4.23 (s, 2H, CH2), 4.70 (m, 1 H, CH), 5.71 (s, 1 H, CH).
(b) Preparación de BHALys[Lys]32[a-DGA-Testosterona]32[£-PEG1100]32
Figure imgf000044_0001
Preparado usando el Procedimiento C anterior, usando BHALys[Lys]32(a-NH2.TFA)32(£-PEG1100)32 (30 mg, 0.75 pmol) y DGA-Testosterona (19 mg, 47 pmol). La purificación por SEC (LH20, eluyente: metanol) proporcionó 15 mg (39%) como un sólido blanquecino. HPLC (C8, gradiente: 30-80% de ACN/H2O (1-7 min), 80% de ACN (7-9 min), 80-30% de ACN (9-11 min), 30% de ACN (11-15 min), formiato de amonio 10 mM) Rt (min) = 9.41. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm) 0.79 (s, 80 H, CH3), 0.81-2.42 (m ancho, 1101H), 3.08 (m, 116H, CH2), 3.26 (s, 98H, CH2), 3.37-3.81 (m, 2800H, CH2), 3.95-4.47 (m, 173H, CH), 4.61 (m, 29H, CH), 5.62 (s, 29H, CH), 6.08 (m, 1H, CH), 7.17 (m, 10H, ArH). Peso molecular teórico del conjugado: 52.4 kDa. La RMN 1H indica 29 testosteronas/dendrímero. El peso molecular real es de aproximadamente 51.2 kDa (16% en peso de testosterona).
Ejemplo 21
Preparación de BHALys[Lys]32[a-DGA-Testosterona]32[£-PEG570]32
Figure imgf000044_0002
Preparado usando el Procedimiento C anterior, usando BHALys[Lys]32(a-NH2.TFA)32(£-PEG570)32 (40 mg, 1.33 pmol) en DMF (2 ml) y DGA-Testosterona (43 mg, 106 pmol). La purificación por SEC (LH20, eluyente: metanol) proporcionó 22.1 mg (rendimiento de 40%) como un sólido higroscópico blanco. HPLC (C8, gradiente: 30-80% de ACN/H2O (1-7 min), 80% de ACN (7-9 min), 80-30% de ACN (9-11 min), 30% de ACN (11-15 min), formiato de amonio 10 mM) Rt (min) = 9.99. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm) 0.89 (s, 96H, CH3), 0.90-2.63 (m ancho, 1214H), 3.36 (m, 125H, CH2), 3.36 (s, 100H, CH3), 3.45-3.97 (m, 1472H, CH2), 4.05-4.62 (m, 218H), 4.71 (m, 37H, CH), 5.72 (s, 31H, CH), 6.18 (m, 1H, CH), 7.17 (m, 10H, ArH). Peso molecular teórico del conjugado: 42.5 kDa. La RMN 1H indica 31 testosteronas/dendrímero. El peso molecular real es de aproximadamente 42.1 kDa (21% en peso de testosterona).
Ejemplo 22
Preparación de BHALys[Lys]32[a-Glu-testesterona]32[£-PEG1100]32
(a) Preparación de Glu-Testosterona
Figure imgf000045_0001
Preparado usando el Procedimiento B anterior, usando testosterona (100 mg, 0.35 mmol), piridina (6 ml) como disolvente y anhídrido glutárico (396 mg, 3.5 mmol) como conector. Purificación por HPLC preparatoria (BEH 300 Waters XBridge C18, 5 pM, 30 x 150 mm, 40-90% de ACN/agua, sin tampón, RT = 62 min) para dar el compuesto deseado 86 mg (86%) como un sólido higroscópico blanquecino. LCMS (C8, gradiente: 40-90% de ACN/H2O (1-7 min), 90% de ACN (7-9 min), 90-40% de ACN (9-11 min), 40% de ACN (11-15 min), TFA al 0.1%) Rt (min) = 6.40. ESI (+va) observado [M H]+ = 403.29. Calculado para C24H35O5 = 403.25 Da. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm) 0.89 (s, 3H, CH3), 0.93-1.23 (m, 3H), 1.24 (s, 3H, CH3), 1.36-2.57 (m ancho, 22H), 4.62 (m, 1H, CH), 5.71 (s, 1 H, CH).
(b) Preparación de BHALys[Lys]32[a-Glu-Testosterona]32[£-PEG1100]32
Figure imgf000045_0002
Preparado usando el Procedimiento C anterior, usando BHALys[Lys]32(a-NH2.TFA)32(£-PEG1100)32 (30 mg, 0.75 pmol) en DMF (2 ml) y Glu-Testosterona (19 mg, 47 pmol). La purificación por SEC (LH20, eluyente: metanol) proporcionó 18.1 mg (47%) del producto deseado en forma de un sólido blanquecino. HPLC (C8, gradiente: 40-80% de ACN/H2O (1-7 min), 80% de Ac n (7-9 min), 80-40% de ACN (9-11 min), 40% de ACN (11-15 min), formiato de amonio 10 mM) Rt (min) = 7.22. RMN 1H (300 MHz, CD3DO) 5 (ppm) 0.88 (s, 87H, CH3), 0.89-2.61 (m ancho, 1225H), 3.17 (m, 110H, CH2), 3.36 (s, 101H, CH3), 3.46-3.98 (m, 2800H, CH2), 4.34 (m, 59H, CH), 4.61 (m, 30H, CH), 5.72 (s, 29H, CH), 6.18 (m, 1H, CH), 7.28 (m, 12H, ArH). Peso molecular teórico del conjugado: 52.3 kDa. La r Mn 1H indica 29 testosteronas/dendrímero. El peso molecular real es de aproximadamente 51.1 kDa (16% de testosterona en peso).
Ejemplo 23
Preparación de BHALys[Lys]32[a-Glu-Testosterona]32[£-PEG570]32
Figure imgf000045_0003
Preparado usando el Procedimiento C anterior, usando BHALys[Lys]32(a-NH2.TFA)32(£-PEG570)32 (30 mg, 1 pmol) en DMF (2 ml) y el Ejemplo 22 (a), Glu-Testosterona (26 mg, 64 pmol). La purificación por SEC (LH20, eluyente: metanol) proporcionó 19.8 mg (rendimiento de 47%) del producto deseado como un producto sólido blanco. HPLC (C8, gradiente: 40-80% de ACN/H2O (1-7 min), 80% de ACN (7-9 min), 80-40% de ACN (9-11 min), 40% de ACN (11-15 min), formiato de amonio 10 mM) Rt (min) = 8.93. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 0.88 (s, 96H, CH3), 0.89-2.59 (m ancho, 1423H), 3.16 (m, 127H, CH2), 3.26 (m, 135H, CH3), 3.65-3.92 (m, 1472H, CH2), 4.24 (m, 66H, CH), 4.52 (m, 39H, CH), 5.62 (s, 32H, Ch ), 6.09 (m, 1H, CH), 7.19 (m, 10H, ArH). Peso molecular teórico del conjugado: 42.5 kDa. La RMN 1H indica 32 de testosteronas/dendrímero. El peso molecular real es de aproximadamente 42.5 kDa (21% en peso de testosterona).
Ejemplo 24
Preparación de BHALys[Lys]32[a-Glu-SB]32[£-PEGiioo]32 SB = Salbutamol
(a) Preparación de Glu-SB
Figure imgf000046_0001
Preparado usando el Procedimiento B anterior, usando SB (100 mg, 0.42 mmol) y anhídrido glutárico (62 mg, 0.54 mmol) como conector. La HPLC preparativa (BEH 300 Waters XBridge C18, 5 pM, 30 x 150 mm, gradiente: 5% de ACN/H2O (1-5 min), 5-60% de a Cn (5-40 min), 60% de ACN (40-45 min), 60-5% de ACN (45-50 min), 5% de ACN (50-60 min), TFA al 0.1%, Rt = 27 min) proporcionó 50 mg (34%) del producto deseado en forma de un sólido blanco. HPLC (C18, gradiente: 5-60% de ACN/H2O (1-10 min), 60% de ACN (10-11 min), 60-5% de ACN (11-13 min), 5% de ACN (13-15 min), formiato de amonio 10 mM) Rt (min) = 6.67. ESI (+va) observado [M H]+ = 354. Calculado para C18H27NO6 = 353.18 Da. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 1.41 (s, 9H), 1.92 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.37 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.45 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.01-3.18 (m, 2H), 5.18 (s, 2H), 6.87 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.27 (dd, J = 8.4 y 2.1 Hz, 1H), 7.36 (d, J = 2.4 Hz, 1H).
(b) Preparación de BHALys[Lys]32[a-Glu-SB]32[£-PEG570]32
Figure imgf000046_0002
Preparado usando el Procedimiento C anterior, usando BHA[Lys]32[a-NH2.TFA]32[£-PEG570]32 (26 mg, 0.86 pmol) y Glu-SB (17 mg, 48.2 pmol). La purificación por SEC (Sephadex, LH20, MeOH) proporcionó 25 mg (76%) del material deseado como un sólido blanco. HPLC (C8, gradiente: 40-80% de ACN/H2O (1-7 min), 80% de ACN (7-9 min), 80-40% de ACN (9-11 min), 40% de ACN (11-15 min), formiato de amonio 10 mM) Rt (min) = 5.81. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 1.03-2.02 (m, 738H), 2.25-2.58 (m, 180H), 2.97-3.29 (m, 167H), 3.40-3.94 (m, 1469H), 4.12-4.50 (m, 74H), 5.04 (s, 55H), 6.90 (d, J = 8.1 Hz, 27H), 7.28 (d, J = 8.1 Hz, 27H), 7.36 (m, 27H). Peso molecular teórico del conjugado: 37.8 kDa. La RMN 1H indica 27 salbutamoles/dendrímero. El peso molecular real es de aproximadamente 36.1 kDa (18% de salbutamol en peso).
Construcciones dirigidas
Ejemplo 25
Preparación de 4-azidobenzamida-PEG12-NEOEOEN[SuN(PN)2][Lys]16 [Lys (a-PSSP-DM)(£-PEG1100)]32
(a) Preparación de 4-azidobenzamida-PEG12-NEOEOEN[SuN(PN)2][Lys]16 [Lys(a-NHBOC)(£-PEG1100)]32
A una solución con agitación magnética de L-lisina-(a-NHBOC)(£-PEG1100) (614 mg, 456 pmol) en DMF anhidra (2.5 ml) se añadió PyBOP (246 mg, 473 pmol) seguido de una solución de 4-azidobenzamida-PEG12-NEOEOEN SuN(PN)2] [Lys]16[NH2.TFA]32 (91 mg, 10.6 pmol) y DIPEA (235 pl, 1.35 mmol) en DMF anhidra (2.5 ml). Después de 16 horas a temperatura ambiente, la reacción se concentró a vacío y el residuo se purificó por ultrafiltración (membrana de cartucho PALL Minimate de 10 kDa) para proporcionar el compuesto objetivo como un sólido pegajoso blanquecino, 433 mg (86%). LCMS (C8 Waters X-Bridge, gradiente: 40-90% de ACN/H2O (1-7 min), 90% de a Cn (7-9 min), 90-40% de Ac n (9-11 min), 40% de ACN (11-15 min), ácido fórmico al 0.1%) Rt (min) = 5.17.
(b) Preparación de 4-azidobenzamida-PEG12-NEOEOEN[SuN(PN)2][Lys]16 [Lys(a-NH2.TFA)(£-PEG1100)]32
Una solución de 4-azidobenzamida-PEG12-NEOEOEN[SuN(PN)2] [Lys]16[Lys (a-NHBOC)(£-PEGn00)]32 (431 mg, 9.10 pmol) en TFA/DCM (5 ml/7 ml) se dejó en agitación durante 4 h. Después de este tiempo, la mezcla de reacción se concentró y el residuo resultante se destiló azeotrópicamente con agua (2 x 10 ml) para proporcionar el compuesto objetivo como un aceite amarillo pálido, 435 mg (100%). LCMS (C18 Waters X-Bridge, gradiente: 5-60% de ACN/H2O (1-10 min), 60% de ACN/H2O (10-14 min), 60-5% de ACN/H2O (14-16 min), TFA al 0.1%) Rt = 10.65. RMN 1H (300 MHz, D2O) 5 (ppm): 1.21 -2.04 (m, 376H), 2.51 -2.56 (m, 71H), 3.12-3.30 (m, 115H), 3.40 (s, 96H), 3.45-3.90 (m, 3077H), 3.91-4.42 (m, 62H), 7.25 (d, J 8.7 Hz, 2H), 7.88 (d, J 8.7 Hz, 2H).
(c) Preparación de 4-azidobenzamida-PEG12-NEOEOEN[SuN(PN)2][Lys]16 [Lys(a-PSSP-DTX)(£-PEGn00)]32
La construcción se preparó usando el Procedimiento C anterior, usando 4-azidobenzamida-PEG12-NEOEOEN[SuN(PN)2][Lys]16[Lys (a-NH2.TFA)(£-PEG110ü)]32 (104 mg, 2.18 gmol) y DTX-PSSP (94 mg, 94.0 gmol). La purificación por SEC proporcionó 133 mg (97%) del material deseado como un aceite viscoso amarillo pálido. LCMS (C18 Waters X-Bridge, gradiente: 5-60% de ACN/H2O (1-10 min), 60% de ACN/H2O (10-11 min), 60-5% de ACN/H2O (11-13 min), ácido fórmico al 0.1%) Rt (min) = 7.59. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 0.88-2.05 (m, 1080H), 2.16­ 2.56 (m, 212H), 2.60-3.26 (m, 363H), 3.35-3.41 (m, 129H), 3.50-3.94 (m, 3110H), 4.00-4.60 (134H), 4.93-5.10 (m, 28H), 5.20-5.46 (m, 73H), 5.54-5.80 (m, 24H), 5.95-6.30 (m, 23H), 7.14-7.91 (m, 268H). Peso molecular teórico del conjugado: 75.7 kDa. La RMN 1H indica 26 DTX/dendrímero, por lo que el peso molecular real es aproximadamente 69.8 kDa (37% de DTX en peso).
Ejemplo 26
Preparación de biotina-triazolobenzamida-PEG12-NEOEOEN[SuN(PN)2][Lys]16 [Lys(a-PSSP-DTX)(£-PEGn00)]32
La construcción se preparó usando el Procedimiento D anterior, usando 4-azidobenzamida-PEG12-NEOEOEN[SuN(PN)2][Lys]16[Lys(a-PSSP-DTX) (£-PEG)n00)]32 (42.5 mg, 674 nmol) y biotina-alquino (0.4 mg, 1.35 gmol). La purificación por SEC proporcionó el compuesto objetivo como un sólido blanquecino, 39 mg (91%). LCMS (C18 Waters X-Bridge, gradiente: 5-60% de ACN/H2O (1-10 min), 60% de ACN/H2O (10-11 min), 60-5% de ACN/H2O (11-13 min), ácido fórmico al 0.1%) Rt (min) = 7.04. r Mn 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 0.92-2.02 (m, 982H), 2.10­ 3.25 (m, 1027H), 3.35-3.42 (m, 128H), 3.49-3.98 (m, 3180H), 4.07-4.69 (m, 131H), 4.96-5.11 (m, 27H), 5.15-5.50 (m, 72H), 5.55-5.80 (m, 24H), 5.98-6.23 (m, 23H), 7.14-8.25 (m, 277H), 8.54-8.56 (m, 1H).
Ejemplo 27
Preparación de LyP-1-triazolobenzamida-PEG12-NEOEOEN[SuN(PN)2][Lys]16 [Lys(a-PSSP-DTX) (£-PEGn00)]32
LyP-1 (suministrado por AusPep Pty Ltd).
La construcción se preparó usando el Procedimiento D anterior, usando 4-azidobenzamida-PEG12-NEOEOEN[SuN(PN)2][Lys]16[Lys(a-PSSP-DTX)(£-PEGn00)]32 (44.2 mg, 701 nmol) LyP-alquino (185 gl de una solución de 10 mg/ml en H2O, 1.05 gmol). La purificación por SEC proporcionó un sólido pegajoso de color rosa brillante, 46 mg (102%), como una mezcla aproximadamente 60:40 de LyP-triazolobenzamida-PEG12-NEOEOEN[SuN(PN)2][Lys]16[Lys(a-PSSP-DTX)(£-PEG1100)]32/4-azidobenzamida-PEG12-NEOEOEN[SuN(PN)2][Lys]16[Lys(a-PSSP-DTX)(£-PEGn00)]32. LCMS (C8 Waters X-Bridge, gradiente: 40-90% de ACN/H2O (1-7 min), 90% de Ac N (7-9 min), 90-40% de a Cn (9-11 min), 40% de ACN (11-15 min), ácido fórmico al 0.1%) Rt (min) = 6.07 (conjugado de LyP-dendrímero); 7.10 (material de partida de azido-dendrímero).
Ejemplo 28
Preparación de deslorelina-triazolobenzamida-PEG12-NEOEOEN[SuN(PN)2][Lys]16[Lys(a-PSSP-DMX)(£-PEG1100)]32
La construcción se preparó usando el Procedimiento D anterior, usando 4-azidobenzamida-PEG12-NEOEOEN[SuN(PN)2][Lys]16[Lys(a-PSSP-DTX)(£-PEGn00)]32 (41.7 mg, 662 nmol) y deslorelina-alquino (130 gl de una solución de 10 mg/ml en H2O, 993 nmol). La purificación por SEC proporcionó un sólido pegajoso de color amarillo pálido, 43 mg (100%), como una mezcla aproximadamente 70:30 de deslorelina-triazolobenzamida-PEG12-NEOEOEN[SuN(PN)2][Lys]16[Lys(a-PSSP-DTX)(£-PEG1100)]32/4-azidobenzamida-PEG12-NEOEOEN[SuN(PN)2] [Lys]16[Lys(a-PSSP-DTX)(£-PEGn00)]32. LCMS (C8 Waters X-Bridge, gradiente: 40-90% de ACN/H2O (1-7 min), 90% de Ac N (7-9 min), 90-40% de ACN (9-11 min), 40% de ACN (11-15 min), ácido fórmico al 0.1%) Rt (min) = 6.42 (conjugado de deslorelina-dendrímero); 7.11 (material de partida de azido-dendrímero).
Ejemplo 29
Preparación de la conjugación anticuerpo-dendrímero usando estreptavidina como unidad de unión
A una solución de Alexa Fluor® 750 estreptavidina (Av) (0.1 gg/ml) en solución salina tamponada con fosfato (PBS, 2 ml) se añadió Abcam n° ab24293 anticuerpo anti-EGFR biotina (Ab) (30 gl de solución madre 10 gg/ml). A esta solución de reacción se le añadió una solución de biotina-triazolobenzamida-PEG12-NEOEOEN[SuN(PN)2][Lys]16[Lys(a-PSSP-DTX)(£-PEGh 00)]32 (DTX-D) en PBS (5 gl de solución madre 1.0 gg/ml). La mezcla se dejó en agitación durante 10 s y el procedimiento anterior de añadir Ab y DTX-D a la solución de Av se repitió un total de 8 veces. Finalmente, la reacción se inactivó usando 50 gg/ml de biotina, (Sigma Aldrich, n° B4501 -1G), y después de incubar durante 5 min, se hizo precipitar 1 ml de la muestra con 50 gl de Proteína G agarosa. La confirmación de la conjugación exitosa se demostró usando SDS-PAGE con una nueva banda asignada al conjugado que aparece a 260 kDa y HPLC (columna: X Bridge C8, 3.5 gm 3.0 x 100 mm, longitud de onda de detección = 243 nm, inyecciones de 10 gl y gradiente de análisis: 5-80% de ACN/H2O, TFA al 0.1% durante 15 min. Rt (min) = 1.40 biotina, 5.83 (conjugado de Ab-DTX-D diana); 7.24 (Ab sin reaccionar), 9.84 (DTX-D sin reaccionar).
Ejemplo 30
Preparación de un anticuerpo activado con una unidad de unión de azida
Se preparó una solución de tampón de acoplamiento (acetato de sodio 0.1 M NaCl 0.15 M, pH 5.5) y se usó para preparar soluciones madre para la siguiente reacción. Se disolvió metaperyodato de sodio sólido (2.1 mg) en tampón de acoplamiento (0.5 ml) y luego se añadió a una solución de mAb* Her2 (25 gg) también diluido en tampón de acoplamiento (0.5 ml). La mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente (TA) en la oscuridad durante 45 min. El material que no había reaccionado se eliminó mediante unidades de filtro de centrífuga (corte de exclusión de peso molecular 50 kDa). A una porción de la solución de mAb oxidada (0.3 ml) se le añadió una solución madre de una unidad de unión que contenía azida (JU) (NH2-O-C4H8-NH-(PEG)12-N3 ¥, 0.2 ml; 1 mg/ml en PBS), seguido de anilina (5 gl). La reacción se mezcló y se dejó durante 24 h a TA. Después de este tiempo, el conjugado mAb-JU se separó del material que no había reaccionado mediante unidades de filtro de centrífuga.
¥ De manera similar, también se podrían colocar otras unidades de unión sobre el anticuerpo, p. ej. NH2-O-C4H8-NH-(PEG)12-bencilazida, NH2-O-C4H8-NH-(PEG)12-DBCO y NH2-O-C4H8-NH-(PEG)12-maleimida.
* En este ejemplo se utiliza mAb Her2, sin embargo, de manera similar, también se podrían utilizar otros anticuerpos. Además de utilizar otras químicas de activación, p. ej. reducción parcial de grupos ditiano dentro del anticuerpo seguida de captura con unidades de unión que contienen maleimida
Ejemplo 31
Conjugación del anticuerpo activado con un dendrímero cargado con fármaco
A una solución del mAb-JU activado con azida del Ejemplo 30 anterior podía añadirse una solución de un dendrímero cargado con fármaco adecuadamente funcionalizado con un alquino reactivo, tal como DBCO. La reacción se podía monitorear hasta su finalización usando HPLC y el producto deseado se podía aislar por cromatografía SEC o HPLC preparativa usando protocolos estándar.
¥ De manera similar, también se podían colocar otras unidades de activación de dendrímero en el punto único de unión en el dendrímero, p. ej. azida y maleimida.
Ejemplo 32
Estudio de solubilidad en agua en dendrímeros cargados con fármacos:
Protocolo: A 30 mg de dendrímero (liofilizado del agua) se le añadieron 100 gl de agua desionizada. Después de mezclar durante 10 minutos, se añadieron partes alícuotas adicionales de agua (10-30 gl por adición) con agitación con vórtice e incubación durante 10 minutos hasta que se obtuvo la disolución completa. Esta cantidad se representa en la Tabla 1 como la solubilidad en agua del dendrímero. La solubilidad equivalente del fármaco se determina multiplicando el % de carga de fármaco/100 y se representa en la Tabla 1 (columna 3) como la solubilidad equivalente del fármaco en el dendrímero. Finalmente, las veces que aumenta se obtiene dividiendo la solubilidad equivalente del fármaco en el dendrímero entre la solubilidad del fármaco y se representa en la Tabla 1 (columna 4).
Tabla 1
Figure imgf000048_0001
Figure imgf000049_0001
* fármaco = docetaxel. La solubilidad del docetaxel y en agua es de 5 gg/ml
¥ fármaco = testosterona: La solubilidad de la testosterona en agua es de 24 gg/ml.
Ejemplo 33
Estudio de estabilidad plasmática en dendrímeros:
Protocolo: A 0.5 ml de plasma de ratón se le añadió 0.1 ml de solución de dendrímero (2 mg/ml, equivalente de fármaco en solución salina). Las mezclas se agitaron con vórtice (30 s) y luego se incubaron a 37°C. En varios puntos de tiempo (0.5, 2.5, 4.5, 22 horas) se retiraron partes alícuotas de 0.1 ml y se añadieron a 0.2 ml de ACN. Las mezclas resultantes se agitaron con vórtice (30 s), se centrifugaron (10 min, 4°C), se filtraron y se analizaron por HPLC (C8, 3.9 x 150 mm, 5 gm, longitud de onda = 243 nm, inyecciones de 10 gl, gradiente: 40-80% de ACN/H2O (1-7 min), 80% de ACN (7-9 min), 80-40% de ACN (9-11 min), 40% de ACN (11-15 min), formiato de amonio 10 mM, pH 7.40) que cuando se compararon con una referencia (2 mg/ml) proporcionaron la concentración de docetaxel libre en la muestra.
Tabla 2 Liberación de docetaxel en plasma. Los resultados se muestran como un porcentaje del docetaxel total.
Figure imgf000049_0002
Ejemplo 34
Estudios de inhibición del crecimiento celular Ensayo SRB
La inhibición del crecimiento celular se determinó usando el ensayo de sulforrodamina B (SRB) [Voigt W. "Sulforhodamine B assay and chemosensitivity" Methods Mol. Med. 2005, 110, 39-48.] contra varias líneas de células cancerosas después de 72 horas con cada experimento realizado por duplicado. GI50 es la concentración requerida para inhibir el crecimiento celular total en 50%, según los protocolos estándar del NCI.
Todas las soluciones se prepararon en solución salina (excepto el docetaxel que se preparó en etanol). Todas las soluciones se almacenaron a -20°C. Todos los valores se basaron en la carga de fármaco equivalente. Los resultados que se muestran en la Tabla 3 son el promedio de experimentos realizados por duplicado en intervalo nanomolar. Tabla 3 Estudios de inhibición del crecimiento.
Figure imgf000049_0003
Figure imgf000050_0001
Ejemplo 35
Concentración inhibitoria semimáxima (CI50) utilizando el ensayo de MTT
La IC50 utilizando el ensayo de MTT [Wilson, Anne P. (2000). "Capítulo 7: Citotoxicidad y viabilidad". En Masters, John R. W .. "Animal Cell Culture: A Practical Approach". Vol. 1 (3a ed.). Oxford: Oxford University Press] se determinó contra varias líneas de células cancerosas después de 72 horas. Los resultados se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4 Estudios de concentración inhibitoria semimáxima (CI50).
Figure imgf000050_0002
Ejemplo 36
Estudio de dosis máxima tolerada (MTD)
Se administró a grupos de ratones hembra Balb/c una inyección intravenosa de dendrímero (0.1 ml/10 g de peso corporal) o docetaxel (0.05 ml/10 g de peso corporal) una vez a la semana durante 3 semanas (día 1, 8 y 15). Los ratones se pesaron diariamente y se observaron en busca de signos de toxicidad. Los animales se controlaron hasta 10 días después de la dosis final del fármaco. Cualquier ratón que excediera los criterios de valoración éticos (> 20% de pérdida de peso corporal, mala salud general) se sacrificó inmediatamente y se anotaron las observaciones. Los resultados mostrados en la Tabla 5 demuestran que el fármaco conjugado con el dendrímero aumenta la dosis tolerada. Se podría administrar más del doble de la dosis de docetaxel de forma segura utilizando la construcción de dendrímero de fármaco en comparación con docetaxel solo.
Tabla 5 Dosis de fármaco ensayadas y dosis máxima tolerada identificada
Figure imgf000050_0003
Ejemplo 37
Estudio de eficacia del xenoinjerto MDA-MB-231
Se inocularon en ratones atímicos hembra Balb/c (7 semanas de edad) por vía subcutánea en el flanco 3.5 x 106 células MDA-MB-231 en PBS:Matrigel (1:1). Trece días después, 50 ratones con tumores de tamaño similar (~110 mm3) se asignaron aleatoriamente a 5 grupos. A cada grupo de tratamiento se le administró una de las siguientes dosis: solución salina; docetaxel (15 mg/kg); Exp. 3 (b) (20 mg/kg); Exp. 8 (c) (32 mg/kg). Todos los tratamientos se administraron por vía intravenosa una vez a la semana durante tres semanas (día 1, 8 y 15) en 0.1 ml/10 g de peso corporal, excepto el docetaxel, que se administró en 0.05 ml/10 g de peso corporal. El experimento finalizó el día 120 o antes si se cumplía un criterio de valoración ético. Los resultados que se muestran en la Tabla 6 muestran que las construcciones de dendrímero fueron más eficaces para suprimir el crecimiento tumoral durante más tiempo.
Tabla 6. Estudio de eficacia del xenoinjerto que muestra el volumen tumoral medio en mm3 a lo largo del tiempo
Figure imgf000051_0001
** No hay datos debido al criterio de valoración ético alcanzado. n = número de animales por grupo de dosificación Ejemplo 38
Estudio de toxicidad del xenoinjerto MDA-MB-231
Se prepararon un total de veinte ratones atímicos hembra Balb/c (de 7 semanas de edad) con tumores subcutáneos como se describe anteriormente. Los 20 ratones se asignaron aleatoriamente a 5 grupos de cuatro ratones (volumen tumoral medio ~90 mm3). A los animales se les extrajo sangre del ojo por la mañana para los recuentos de células sanguíneas de referencia y luego la dosificación del fármaco comenzó más tarde ese día (día 1). La dosificación del fármaco se realizó los días 1,8 y 15 a las dosis MTD previamente determinadas: docetaxel (15 mg/kg); Exp. 3 (b) (20 mg/kg); Exp. 8 (c) (32 mg/kg); Exp. 4 (b) (20 mg/kg). Se realizó una segunda extracción de sangre del ojo el día 11 (Tabla 7 A - C). Los ratones se sacrificaron un día después de la dosis final del fármaco (día 16). Los pesos histológicos de los tejidos el día 16 se muestran en la Tabla 8.
Tabla 7 A. Análisis de glóbulos blancos los días 1 y 11.
Figure imgf000051_0002
Tabla 7 B. Resultados del análisis de neutrófilos los días 1 y 11.
Figure imgf000051_0003
Cuadro 7 C. Resultados del análisis de linfocitos los días 1 y 11.
Figure imgf000051_0004

Claims (24)

REIVINDICACIONES
1. Una macromolécula que comprende:
i) un dendrímero que comprende un núcleo y al menos una generación de unidades de construcción, teniendo la generación más externa de unidades de construcción grupos amino de superficie en donde al menos dos grupos terminales diferentes están unidos covalentemente a los grupos amino de superficie del dendrímero;
ii) un primer grupo terminal que es un resto de un agente farmacéuticamente activo que comprende un grupo hidroxilo; iii) un segundo grupo terminal que es un agente modificador de la farmacocinética;
en donde el primer grupo terminal está unido covalentemente al grupo amino de superficie del dendrímero a través de un conector diácido, comprendiendo el conector diácido una cadena principal que contiene uno o más átomos de oxígeno, azufre o nitrógeno; en donde el conector diácido forma un enlace éster eon el grupo hidroxilo del agente farmacéuticamente activo y un enlace amida con el grupo amino de superficie; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
2. Una macromolécula según la reivindicación 1, en donde el agente modificador de la farmacocinética es polietilenglicol.
3. Una macromolécula según la reivindicación 2, en donde el polietilenglicol tiene un peso molecular en el intervalo de 220 a 1100 Da, o de 1000 a 2500 Da, 1000-5500 Da.
4. Una macromolécula según la reivindicación 3, en donde el polietilenglicol tiene un peso molecular en el intervalo de 1000 a 2500 Da.
5. Una macromolécula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el conector diácido tiene la fórmula:
-C(O)-X-C(O)-en donde X es -(CH2)s-A-(CH2)t-;
A se selecciona de O-, -S-, -NR1-, -N+(R1)2-, -S-S- y -[OCH2CH2]r-O-;
R1 se selecciona de hidrógeno y alquilo C1-C4;
s y t se seleccionan independientemente de 1 y 2; y
r se selecciona de 1,2 y 3.
6. Una macromolécula según la reivindicación 5, en donde X es CH2-A-CH2 o CH2CH2-A-CH2CH2-.
7. Una macromolécula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el conector diácido es -C(O)-CH2OCH2-C(O)-, -C(O)-CH2SCH2-C(O)-, -C(O)-CH2NHCH2-C(O)-, -C(O)-CH2N(CH3)CH2-C(O)-, -C(O)-CH2N+(CH3)2CH2-C(O)-, -C(O)-CH2-S-S-CH2-C(O)- o -C(O)-OCH2CH2OCH2CH2OC(O)-.
8. Una macromolécula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el conector diácido es -C(O)-CH2OCH2-C(O)- o -C(O)-CH2SCH2-C(O)-,
9. Una macromolécula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el núcleo es una bencidrilamida de lisina (BHALys).
10. Una macromolécula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde las unidades de construcción son lisina.
11. Una macromolécula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el dendrímero tiene de 4 a 6 generaciones de unidades de construcción.
12. Una macromolécula según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde el dendrímero es un dendrímero de quinta generación que tiene la fórmula BHALys[Lys]2[Lys]4[Lys]s[Lys]16[Lys]32.
13. Una macromolécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde se aplica uno o más de los siguientes:
i) el dendrímero tiene de 2 a 6 generaciones de unidades de construcción,
ii) el dendrímero comprende unidades de construcción de lisina o análogos de lisina,
iii) la macromolécula tiene un tamaño de partículas de menos de 1000 nm, y
iv) la macromolécula tiene un peso molecular de al menos 30 kDa.
14. Una macromolécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el primer grupo terminal y el segundo grupo terminal están presentes en una proporción 1:1.
15. Una macromolécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde la macromolécula comprende un tercer grupo terminal que es un grupo bloqueante, un agente farmacéutico o un grupo de direccionamiento.
16. Una macromolécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, que comprende además un grupo de direccionamiento unido a un grupo funcional en el núcleo del dendrímero, en donde el agente de direccionamiento se selecciona de hormona liberadora de hormona luteinizante, un análogo de la hormona liberadora de hormona luteinizante, LYP-1 y un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
17. Una macromolécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en donde el agente farmacéuticamente activo es un fármaco oncológico, un antivírico o un esteroide.
18. Una macromolécula según la reivindicación 17, en donde el agente farmacéuticamente activo es testosterona.
19. Una macromolécula según la reivindicación 17, en donde el agente farmacéuticamente activo es un taxano, un mimético de somatostatina, un modulador del receptor de estrógeno o un análogo de nucleósido.
20. Una macromolécula según la reivindicación 17, en donde el agente farmacéuticamente activo es docetaxel, paclitaxel, cabazitaxel, camptotecina, irinotecán, topotecán, gemcitabina, fulvestrant, octreotida o una camptotecina.
21. Una composición farmacéutica que comprende la macromolécula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
22. Una macromolécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, o una composición según la reivindicación 21, para su uso en un método para tratar o suprimir el crecimiento de un cáncer, o para reducir la toxicidad de, o reducir los efectos secundarios asociados con un fármaco oncológico o formulación de un fármaco oncológico, o para reducir la hipersensibilidad en un sujeto tras el tratamiento con un fármaco oncológico o formulación de un fármaco oncológico, en el que el agente farmacéuticamente activo es un fármaco oncológico.
23. Una macromolécula o composición para su uso según la reivindicación 22, en donde la macromolécula o composición se administra como un bolo o por infusión rápida en menos de 30 minutos.
24. Una macromolécula o composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 22 o 23, en donde la macromolécula o composición se administra en combinación con otra terapia.
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