BR112013031556B1 - Macromoléculas, uso das mesmas para tratar ou suprimir o crescimento de um câncer e composições farmacêuticas - Google Patents

Macromoléculas, uso das mesmas para tratar ou suprimir o crescimento de um câncer e composições farmacêuticas Download PDF

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Abstract

MACROMOLÉCULAS, USO DAS MESMAS PARA TRATAR OU SUPRIMIR O CRESCIMENTO DE UM CÂNCER E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA. A presente invenção se refere a uma macromolécula compreendendo um dendrímero tendo grupos amino de superfície aos quais pelo menos dois grupos terminais diferentes são fixados incluindo um agente farmaceuticamente ativo e um agente modificador farmacocinético, o agente farmaceuticamente ativo compreendendo um grupo hidroxila e sendo fixado ao grupo amino de superfície do dendrímero através de um ligante diácido. Composições farmacêuticas compreendendo as macromoléculas e os métodos de tratamento usando as macromoléculas são descritas também.

Description

Campo da Invenção
[001]A presente invenção refere-se a uma macromolécula compreendendo um dendrímero contendo grupos amina de superfície aos quais pelo menos dois grupos terminais diferentes são ligados incluindo um agente farmaceuticamente ativo e um agente de modificação farmacocinético, o agente farmaceuticamente ativo sendo covalentemente ligado por um ligante diácido. Composições farmacêuticas e métodos de tratamento são ainda descritos.
Fundamentos da Invenção
[002] Há um número de dificuldades associadas com a formulação e liberação de agentes farmaceuticamente ativos incluindo solubilidade aquosa fraca, toxicidade, baixa disponibilidade, instabilidade em condições biológicas, falta de direcionamento ao sítio de ação e rápida degradação in vivo.
[003] Para combater algumas destas dificuldades, agentes farmaceuticamente ativos podem ser formulados com agentes de solubilização que por si só podem causar efeitos colaterais como hipersensibilidade e podem requerer pré-medicação para reduzir estes efeitos colaterais. Abordagens alternativas incluem encapsulamento do agente farmaceuticamente ativo em lipossomas, micelas ou matrizes poliméricas ou ligação do agente farmaceuticamente ativo, micelas e matrizes poliméricas.
[004] Embora estas abordagens possam melhorar alguns dos problemas associados com a formulação e liberação de agentes farmaceuticamente ativos, muitas ainda têm desvantagens.
[005]As drogas da oncologia podem ser particularmente difíceis de formular e têm efeitos colaterais que podem limitar a quantidade e regime de dosagem que podem ser usados para o tratamento. Isto pode resultar em eficácia reduzida no tratamento. Por exemplo, drogas taxano como paclitaxel, docetaxel e cabazitaxel têm baixa solubilidade aquosa e são geralmente formuladas com excipientes de solubilização como óleos de rícino polietoxilados (Cremophor EL) ou polissorbato 80. Embora estes excipientes de solubilização permitem quantidades aumentadas da droga na formulação, são conhecidos por resultarem em efeitos colaterais significativos incluindo hipersensibilidade. Para reduzir a hipersensibilidade, pré- medicação com esteroides como dexametasona é algumas vezes usada no regime de dosagem. No entanto, isto também têm desvantagens pois os corticosteroides têm efeitos colaterais e não podem ser usados em pacientes diabéticos, que formam um subgrupo significativo de pacientes com mais de 50 com câncer de mama.
[006] O uso de lipossomas, micelas e matrizes poliméricas como carreadores encapsulando ou contendo o agente farmacêutico ligado, embora permitindo a solubilização do agente farmaceuticamente ativo e em alguns casos biodisponibilidade melhorada e direcionamento, apresenta dificuldades em relação à liberação do agente farmaceuticamente ativo. Em alguns casos, o carreador se degrada rapidamente liberando o agente farmaceuticamente ativo antes de este atingir o órgão alvo. Em outros casos, a liberação do agente farmaceuticamente ativo do carreador é variável e, portanto, pode não atingir uma dose terapêutica da droga no corpo ou no órgão alvo.
[007] Outra dificuldade com lipossoma, micela e matrizes poliméricas como carreadores é que o carregamento da droga pode ser variável. Isto pode resultar em alguns lotes de uma composição particular sendo efetivos enquanto outros não são e/ou dificuldades no registro de um produto para uso clínico devido à variabilidade no produto.
[008]Além disso, estas moléculas podem ser instáveis ou materiais fracamente caracterizados, podem sofrer de polidispersividade e devido à sua natureza serem difíceis de analisar e caracterizar. Elas podem ainda ter difíceis vias de fabricação. Essas dificuldades, especialmente com relação à análise e inconsistência lote a lote, significativamente impedem a via para a submissão e aprovação regulatórias.
[009] Com agentes farmaceuticamente ativos que têm solubilidade fraca, geralmente o método de liberação é limitado, por exemplo, à administração parenteral. Isto pode limitar o regime de dosagem disponível e a dosagem que pode ser liberada.
[010] Há uma necessidade de formulações alternativas e meios de liberação para liberar drogas para reduzir efeitos colaterais, melhorar regimes de dosagem e melhorar a janela terapêutica que pode levar a melhoras na adesão e eficácia da droga nos pacientes.
Sumário da Invenção
[011]A invenção é prevista em parte na descoberta que macromoléculas compreendendo um dendrímero com grupos amino de superfície tendo pelo menos dois grupos terminais diferentes fixados aos grupos amino de superfície do dendrímero e em que o primeiro grupo terminal é um agente farmaceuticamente ativo covalentemente fixado ao grupo amino de superfície através de um ligante diácido e o segundo grupo terminal é um agente modificador farmacocinético pode permitir alto carregamento da droga, solubilidade melhorada e liberação controlada do agente farmaceuticamente ativo.
[012] Em um primeiro aspecto da invenção é fornecido uma macromolécula compreendendo: i) um dendrímero compreendendo um núcleo e pelo menos uma geração de unidades de construção, a geração mais externa de unidades de construção tendo grupos amino de superfície, em que pelo menos dois grupos terminais diferentes são covalentemente fixados aos grupos amino de superfície do dendrímero; ii) um primeiro grupo terminal que é um resíduo de um agente farmaceuticamente ativo compreendendo um grupo hidroxil; iii) um segundo grupo terminal que é um agente modificador farmacocinético; em que o primeiro grupo terminal é covalentemente fixado ao grupo amino de superfície do dendrímero por um ligante diácido, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[013] Em algumas modalidades o agente farmaceuticamente ativo é uma droga de oncologia, especialmente docetaxel, paclitaxel, cabazitaxel, camptotecina, topotecano, irinotecano ou gencitabina. Em outras modalidades o agente farmaceuticamente ativo é um esteroide, especialmente testosterona. Em algumas modalidades, o agente farmaceuticamente ativo é escassamente solúvel ou insolúvel em solução aquosa.
[014] Em algumas modalidades o agente modificador farmacocinético é polietileno glicol, especialmente polietileno glicol tendo um peso molecular na faixa de 220 a 2500 Da, mais especialmente 570 a 2500 Da. Em algumas modalidades, o polietileno glicol tem um peso molecular entre 220 e 1100 Da, especialmente 570 e 1100 Da. Em outras modalidades, o polietileno glicol tem um peso molecular entre 1000 e 5500 Da ou 1000 e 2500 Da, especialmente 1000 e 2300 Da.
[015] Em algumas modalidades o ligante diácido tem a fórmula: -C(O)-J-C(O)-X-C(O)- em que X é selecionado de -C1-C10alquileno-, -(CH2)s-A- (CH2)t- e Q; -C(O)-J- é ausente, um resíduo de aminoácido ou um peptídeo de 2 a 10 resíduos de aminoácidos, em que o -C(O)- é derivado de carbóxi terminal ao aminoácido ou peptídeo; A é selecionado de -O-, -S-, -NR1-, -N+(R1)2-, -S-S-, - [OCH2CH2]r-O-, -Y-, e -O-Y-O-; Q é selecionado de Y ou -Z=N-NH-S(O)w-Y-; Y é selecionado de cicloalquil, heterocicloalquil, aril e heteroaril; Z é selecionado de -(CH2)x-C(CH3)=, -(CH2)xCH=, cicloalquil e heterocicloalquil; R1 é selecionado de hidrogênio e C1-C4 alquil; s e t são independentemente selecionados de 1 e 2; r é selecionado de 1, 2 e 3; w é selecionado de 0, 1 e 2; e x é selecionado de 1, 2, 3 e 4.
[016] Em algumas modalidades o dendrímero tem 1 a 8 gerações de unidades de construção, especialmente 3 a 6 gerações de unidades de construção. Em algumas modalidades o dendrímero é um dendrímero compreendendo unidades de construção de lisina ou análogos de lisina. Em outras modalidades o dendrímero compreende unidades de construção de poliéterhidroxilamina.
[017] Em algumas modalidades o primeiro grupo terminal e o segundo grupo terminal estão presentes em uma razão de 1:1. Em algumas modalidades a macromolécula compreende um terceiro grupo terminal que é um grupo de bloqueio, especialmente um grupo acila como acetato. Em algumas modalidades a razão do primeiro grupo terminal, segundo grupo terminal e terceiro grupo terminal é 1:2:1.
[018] Em algumas modalidades, pelo menos 50% dos grupos terminais compreendem um primeiro ou segundo grupo terminal.
[019] Em algumas modalidades o dendrímero compreende um agente alvo fixado a um grupo funcional no núcleo opcionalmente por um grupo espaçador, especialmente onde o agente alvo é selecionado de hormônio de liberação de hormônio luteinizante, um análogo de hormônio de liberação de hormônio luteinizante como deslorelina, LYP-1 e um anticorpo ou fragmento do mesmo.
[020] Em algumas modalidades a macromolécula tem um tamanho de partícula menor do que 1000 nm, especialmente entre 5 e 1000 nm, mais especialmente entre 5 e 400 nm, mais especialmente entre 5 e 50 nm. Em algumas modalidades, a macromolécula tem um peso molecular d pelo menos 30 kDa, especialmente 40 a 300 kDa, mais especialmente 40 a 150 kDa.
[021] Em outro aspecto da invenção é fornecida uma composição farmacêutica compreendendo a macromolécula da invenção e um transportador farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a composição é substancialmente isenta de excipientes de solubilização como óleo de rícino polietoxilado (por exemplo: Cremphor EL) e polissorbato 80. Ao remover o excipiente de solubilização a composição de dendrímero é menos provável de causar efeitos colaterais como hipersensibilidade aguda ou posterior incluindo anafilaxia que ameaça a vida e/ou retenção de fluido grave.
[022] Em algumas modalidades a macromolécula é formulada como uma formulação de liberação lenta. Em algumas modalidades o ligante é selecionado para permitir liberação controlada do agente farmaceuticamente ativo. Em algumas modalidades, a macromolécula é formulada para liberar mais de 50% do agente farmaceuticamente ativo entre 5 minutos a 60 minutos. Em outras modalidades, a macromolécula é formulada para liberar mais de 50% do agente farmaceuticamente ativo entre 2 horas e 48 horas. Ainda em outras modalidades, a macromolécula é formulada para liberar mais de 50% do agente farmaceuticamente ativo entre 5 dias e 30 dias.
[023] Em outro aspecto da invenção é fornecido um método para tratar ou suprimir o crescimento de câncer compreendendo administrar uma quantidade eficaz da macromolécula ou composição farmacêutica da invenção em que o agente farmaceuticamente ativo do primeiro grupo terminal é uma droga de oncologia.
[024] Em algumas modalidades, os tumores são tumores primários ou metastáticos da próstata, testículos, pulmão, cólon, pâncreas, rim, osso, baço, fígado, cérebro, cabeça e/ou pescoço, mama, trato gastrointestinal, pele ou ovário.
[025] Em algumas modalidades, o método compreende a administração da composição da macromolécula que é substancialmente livre de óleo de rícino polietoxilado como Cremophor EL, ou polissorbato 80.
[026] Em outro aspecto da invenção é fornecido um método para reduzir hipersensibilidade no tratamento com uma droga de oncologia compreendendo administrar a composição farmacêutica da presente invenção, em que a composição é substancialmente livre de excipientes de solubilização como Cremophor EL e polissorbato 80.
[027] Em outro aspecto da invenção é fornecido um método para reduzir a toxicidade de uma droga de oncologia ou formulação de uma droga de oncologia, compreendendo administrar a macromolécula da invenção em que a droga de oncologia é o agente farmaceuticamente ativo do primeiro grupo terminal.
[028] Em algumas modalidades, a toxicidade que é reduzida é toxicidade hematológica, toxicidade neurológica, toxicidade gastrointestinal, cardiotoxicidade, hepatotoxicidade, nefrotoxicidade, ototoxicidade ou encefalotoxicidade.
[029] Em ainda outro aspecto da invenção é fornecido um método para reduzir efeitos colaterais associados com uma droga de oncologia ou formulação de uma droga de oncologia, compreendendo administrar a macromolécula da invenção em que a droga de oncologia é o agente farmaceuticamente ativo do primeiro grupo terminal.
[030] Em algumas modalidades, os efeitos colaterais que são reduzidos são selecionados de neutropenia, leucopenia, trombocitopenia, mielotoxicidade, mielosupressão, neuropatia, fadiga, problemas neurocognitivos não específicos, vertigem, encefalopatia, anemia, disguesia, dispneia, constipação, anorexia, distúrbios das unhas, retenção de fluido, astenia, dor, náusea, vômito, mucosite, alopecia, reações de pele, mialgia, hipersensibilidade e anafilaxia.
[031] Em algumas modalidades, a necessidade para pré- medicação com agentes como corticosteroides e anti-histaminas é reduzido ou eliminado.
[032] Em ainda outro aspecto da invenção é fornecido um método para tratar ou prevenir uma doença ou distúrbio relacionado a baixos níveis de testosterona compreendendo administrar a macromolécula ou composição farmacêutica da invenção em que o agente farmaceuticamente ativo é testosterona.
[033] Em algumas modalidades, a composição é formulada para liberação transdérmica, especialmente por adesivo transdérmico opcionalmente tendo microagulhas. Descrição da Invenção
[034]As formas singulares “um”, “uma” e “o/a” incluem aspectos do plural salvo se o contexto claramente indicar o contrário.
[035]Ao longo desta especificação e das reivindicações que seguem, salvo se o contexto requerer de outra forma, a palavra “compreende”, e variações como “compreendem” e “compreendendo”, serão entendidos por indicar a inclusão de um inteiro declarado ou etapa ou grupo de inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer inteiro ou etapa ou grupo de inteiros ou etapas.
[036] Como usado aqui, o termo “alquil” refere-se a um grupo hidrocarboneto saturado de cadeia linear ou ramificada tendo 1 a 10 átomos de carbono. Onde apropriado, o grupo alquil pode ter um número especificado de átomos de carbono, por exemplo, C1-4alquil que inclui grupos alquil tendo 1, 2, 3 ou 4 átomos de carbono em um arranjo linear ou ramificado. Exemplos de grupos alquil apropriados incluem, entre outros, metil, etil, n-propil, i-propil, n-butil, i-butil, t-butil, n-pentil, 2-metilbutil, 3-metilbutil, 4-metilbutil, n-hexil, 2-metilpentil, 3-metilpentil, 4-metilpentil, 5-metilpentil, 2-etilbutil, 3-etilbutil, heptil, octil, nonil e decil.
[037] O termo “alquileno” como usado aqui refere-se a um grupo alquil divalente de cadeia linear tendo 1 a 10 átomos de carbono. Onde apropriado, o grupo alquileno pode ter um número especificado de átomos de carbono, por exemplo, C1-C6 alquileno inclui -CH2-, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5 e -(CH2)6-.
[038] Como usado aqui, o termo “cicloalquil” refere-se a um hidrocarboneto cíclico saturado ou insaturado. O anel cicloalquil pode incluir um número especificado de átomos de carbono. Por exemplo, um grupo cicloalquil de 3 a 8 membros inclui 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 átomos de carbono. Exemplos de grupos cicloalquil apropriados incluem, entre outros, ciclopropil, ciclobutil, ciclopentanil, ciclopentenil, ciclohexanil, ciclohexenil, 1,4-ciclohexadienil, cicloheptanil e ciclo-octanil.
[039] Como usado aqui, o termo “aril” pretende significar qualquer anel de carbono estável, monocíclico ou bicíclico de até 7 átomos em cada anel, em que pelo menos um anel é aromático. Exemplos de ditos grupos aril incluem, entre outros, fenil, naftil, tetrahidronaftil, indanil, bifenil e binaftil.
[040] O termo “heterocicloalquil” ou “heterociclil” como usado aqui, refere-se a um hidrocarboneto cíclico em que um a quatro átomos de carbono podem ser substituídos por heteroátomos independentemente selecionados do grupo que consiste em N, N(R), S, S(O), S(O)2 e O. Um anel heterocíclico pode ser saturado ou insaturado. Exemplos de grupos heterociclil apropriados incluem tetrahidrofuranil, tetrahidrotiofenil, pirrolidinil, pirrolinil, piranil, piperidinil, pirazolinil, ditiolil, oxatiolil, dioxanil, dioxinil, morfolino e oxazinil.
[041] O termo “heteroaril” como usado aqui, representa um anel estável monocíclico ou bicíclico de até 7 átomos em cada anel, em que pelo menos um anel é aromático e pelo menos um anel contém de 1 a 4 heteroátomos selecionados do grupo que consiste em O, N e S. Grupos heteroaril dentro do escopo desta definição incluem, entre outros, acridinil, carbazolil, cinnolinil, quinoxalinil, quinazolinil, pirazolil, indolil, benzotriazolil, furanil, tienil, tiofenil, 3,4- propilenedioxitiofenil, benzotienil, benzofuranil, benzodioxano, benzodioxin, quinolinil, isoquinolinil, oxazolil, isoxazolil, imidazolil, pirazinil, piridazinil, piridinil, pirimidinil, pirrolil, tetrahidroquinolina, tiazolil, isotiazolil, 1,2,4-triazolil, 1,2,3-triazolil, 1,2,4-oxadiazolil, 1,2,4-thiadiazolil, 1,3,5-triazinil, 1,2,4-triazinil, 1,2,4,5-tetrazinil e tetrazolil.
[042] O termo “dendrímero” refere-se a uma molécula contendo um núcleo e pelo menos um dendron fixados ao núcleo. Cada dendron é feito de pelo menos uma camada ou geração de unidades de construção ramificadas resultando em uma estrutura ramificada com número crescente de ramificações com geração de unidades de construção. O número máximo de dendrons fixados ao núcleo é limitado pelo número de grupos funcionais no núcleo. O núcleo pode ter um ou mais grupos funcionais apropriados para conte rum dendron e opcionalmente um grupo funcional adicional para fixação de um agente apropriado para direcionar a um órgão específico ou tecido, sinalizando ou imagenado.
[043] O termo “unidade de construção” usado aqui se refere a uma molécula ramificada tendo pelo menos três grupos funcionais, um para fixação ao núcleo ou uma geração de unidades de construção anterior e pelo menos dois grupos funcionais para fixação à geração de unidades de construção seguinte ou formando a superfície da molécula de dendrímero.
[044] O termo “geração” refere-se ao número de camadas de unidades de construção que preparar um dendron ou dendrímero. Por exemplo, a geração de um dendrímero terá uma camada de unidades de construção ramificadas fixadas ao núcleo, por exemplo, Núcleo-[[unidade de construção]]u onde u é o número de dendrons fixados ao núcleo. Um dendrímero de duas gerações tem duas camadas de unidades de construção em cada dendron fixados ao núcleo, por exemplo, quando a unidade de construção tem um ponto de ramificação, o dendrímero pode ser: Núcleo[[unidade de construção][unidade de construção]2]u, um dendrímero de três gerações tem três camadas de unidades de construção em cada dendron fixado ao núcleo, por exemplo, Núcleo-[[unidade de construção][unidade de construção]2[unidade de construção]4]u, um dendrímero de 6 gerações tem seis camadas de unidades de construção fixados ao núcleo, por exemplo, Núcleo-[[unidade de construção][unidade de construção]2[unidade de construção]4[unidade de construção]8[unidade de construção]16[unidade de construção]32]u, e semelhantes. A última geração de unidades de construção (a geração mais externa) fornece a funcionalização da superfície do dendrímero e o número de grupos funcionais disponíveis para ligação aos grupos terminais. Por exemplo, em um dendrímero tendo um núcleo com dois dendrons fixados (u = 2), se cada unidade de construção tem um ponto de ramificação point e há 6 gerações, a geração mais externa tem 64 unidades de construção e 128 grupos funcionais disponíveis para ligar aos grupos terminais.
[045] O termo “escassamente solúvel” como usado aqui refere-se a uma droga ou agente farmaceuticamente ativo que tem uma solubilidade entre 1 mg / mL e 10 mg / mL em água. As drogas que têm uma solubilidade em água menor do que 1 mg / mL são consideradas insolúveis.
[046] O termo “agente farmaceuticamente ativo” como usado aqui refere-se a um composto que é usado para exercer um efeito terapêutico in vivo. Este termo é usado de modo intercambiável com o termo “droga”. O termo “resíduo de um agente farmaceuticamente ativo” refere-se à porção da macromolécula que é um agente farmaceuticamente ativo quando o agente farmaceuticamente ativo foi modificado por fixação à macromolécula.
[047] O termo “droga de oncologia” usado aqui refere-se a um agente farmaceuticamente ativo usado para tratar câncer, como uma droga quimioterápica.
[048] Como usado aqui, o termo “excipiente de solubilização” refere-se a um aditivo de formulação que é usado para solubilizar drogas insolúveis ou escassamente solúveis em uma formulação aquosa. Exemplos incluem surfactantes como óleo de rícino polietoxilado incluindo Cremophor EL, Cremophor RH 40 e Cremophor RH 60, D- α-tocoferol-polietileno-glicol 1000 succinato, polissorbato 20, polissorbato 80, solutol HS 15, monoleato sorbitano, poloxâmero 407, Labrasol e semelhantes.
[049]As macromoléculas da invenção podem estar na forma de sais farmaceuticamente aceitáveis. Será apreciado, no entanto, que sais não farmaceuticamente aceitáveis ainda estão dentro do escopo da invenção uma vez que estes podem ser úteis como intermediários na preparação de sais farmaceuticamente aceitáveis ou podem ser uteis durante armazenamento ou transporte. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, entre outros, sais de ácidos orgânicos farmaceuticamente aceitáveis como ácidos clorídrico, sulfúrico, fosfórico, nítrico, carbônico, bórico, sulfâmico, e bromídrico, ou sais de ácidos orgânicos farmaceuticamente aceitáveis como acético, propiônico, butírico, tartárico, maleico, hidroximaleico, fumárico, maleico, cítrico, láctico, múcico, glucônico, benzoico, succínico, oxálico, fenilacético, metanossulfônico, toluenossulfônico, benezenossulfônico, salicíclico sulfanílico, aspártico, glutâmico, edético, esteárico, palmítico, oleico, láurico, pantotênico, tânico, ascórbico e valérico.
[050] Sais base incluem, entre outros, aqueles formados com cátions farmaceuticamente aceitáveis, como sódio, potássio, lítio, cálcio, magnésio, amônio e alquilamônio.
[051] Grupos contendo nitrogênio básico podem ser quaternizados com ditos agentes como haleto de alquil inferior, como metil, etil, propil, e butil cloretos, brometos e iodetos; dialquil sulfatos como dimetil e dietil sulfato; e outros.
Macromoléculas da invenção
[052]As macromoléculas da invenção compreendem: i) um dendrímero compreendendo um núcleo e pelo menos uma geração de unidades de construção, a geração mais externa de unidades de construção tendo grupos amino de superfície, em que pelo menos dois grupos terminais diferentes are covalentemente fixados aos grupos amino de superfície do dendrímero; ii) um primeiro grupo terminal que é um resíduo de um agente farmaceuticamente ativo compreendendo um grupo hidroxil; iii) um segundo grupo terminal que é um agente modificador farmacocinético; em que o primeiro grupo terminal é covalentemente fixados ao grupo amino de superfície do dendrímero através de um ligante diácido, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[053] Os dendrímeros tendo grupos amino de superfície têm pelo menos dois grupos terminais diferentes covalentemente fixados aos grupos amino de superfície.
[054] O primeiro grupo terminal é um resíduo de um agente farmaceuticamente ativo compreendendo um grupo hidroxil livre. O agente farmaceuticamente ativo é fixado ao grupo amino de superfície do dendrímero através de um ligante diácido. O ligante diácido forma uma ligação éster com o grupo hidroxil do agente farmaceuticamente ativo e uma ligação amida com o grupo amino de superfície.
[055] O agente farmaceuticamente ativo pode ser qualquer agente farmaceuticamente ativo que tem um grupo hidroxil disponível para formação éster com o ligante diácido e é administrado a um sujeito para produzir um efeito terapêutico.
[056] Em algumas modalidades o agente farmaceuticamente ativo é uma droga de oncologia como um taxano, um nucleosídeo ou um inibidor de quinase, um esteroide, um analgésico opioide, uma droga respiratória, uma droga do sistema nervoso central (CNS), uma droga hipercolesterolêmica, uma droga anti-hipertensiva, uma droga imunossupressora, um antibiótico, um agonista de hormônio de liberação de hormônio luteinizante (LHRH), um antagonista LHRH, uma droga antiviral, uma droga antiretroviral, um modulador de receptor de estrogênio, um mimético de somatostatina, uma droga anti- inflamatória, um análogo de vitamina D2, uma tiroxina sintética, um anti-histamínico, um agente antifúngico ou uma droga anti-inflamatória não esteroidal (NSAID).
[057] Drogas de oncologia apropriadas incluem taxanos como paclitaxel, cabazitaxel e docetaxel, camptotecina e seus análogos como irinotecano e topotecano, outros agentes anti- microtúbulos como vinflunina, nucleosídeos como gencitabina, cladribina, fludarabina capecitabina, decitabina, azacitidina, clofarabina e nelarabina, inibidores de quinase como sprycel, temisirolimus, dasatinib, AZD6244, AZD1152, PI- 103, R-roscovitina, olomoucina e purvalanol A, e análogos de epotilone B como Ixabepilone, antrociclinas como amrubicina, doxorubicina, epirubicina e valrubicina, indutores de super óxidos como trabectecina, inibidores de proteosoma como bortezomib e outros inibidores de topoisomerase, agentes intercalantes e agentes alquilantes.
[058] Esteroides apropriados incluem esteroides anabólicos como testosterona, di-hidrotestosterona e etinilestradiol, e corticosteroides como cortisona, prednisilona, budesonida, triamcinoloae, fluticasona, mometasona, amcinonida, flucinolona, fluocinanida, desonida, halcinonida, prednicarbato, fluocortolona, dexametasone, betametasona e fluprednidina.
[059]Analgésicos opioide apropriados incluem morfina, oximorfona, naloxona, codeína, oxicodona, metilnaltrexona, hidromorfona, buprenorfina e etorfina.
[060] Drogas respiratórias apropriadas incluem broncodilatadores, esteroides inalados, e descongestionantes e mais particularmente salbutamol, brometo de ipratróprio, montelukast e formoterol.
[061] Drogas do CNS apropriados incluem antipsicóticos como quetiapina e antidepressivos como venlafaxina.
[062] Drogas apropriadas para controlar hipercolesterolemia incluem ezetimibe e estatinas como simvastatina, lovastatina, atorvastatina, fluvastatina, pitavastatina, provastatina e rosuvastatina.
[063] Drogas anti-hipertensivas apropriadas incluem losartan, olmesartan, medoxomil, metrolol, travoprost e bosentan.
[064] Drogas imunossupressoraS apropriadas incluem glicocorticoides, citostáticos, fragmentos de anticorpos, anti-imunofilinas, interferons, proteínas de ligação ao TNF e mais particularmente, inibidores de cacineurina como tacrolimus, ácido micofenolico e seus derivados como micofenolato mofetil, e ciclosporina.
[065]Agentes antibacterianos apropriados incluem antibióticos como amoxicilina, meropenem e ácido clavulânico.
[066]Agonistas de LHRH apropriados incluem goserelina acetato, deslorelina e leuprorelina.
[067]Antagonistas de LHRH apropriados incluem cetrorelix, ganirelix, abarelix e degarelix.
[068]Agentes antivirais apropriados incluem análogos de nucleosídeos como lamivudina, zidovudina, abacavir e entecavir e drogas antivirais apropriados incluem inibidores de protease como atazanavir, lapinavir e ritonavir.
[069]Moduladores de receptor de estrogênio seletivo apropriados incluem raloxifeno e fulvestrant.
[070]Miméticos de somastatina apropriadas incluem octreotida.
[071] Drogas anti-inflamatórias apropriadas incluem mesalazina e NSAIDs apropriados incluem acetaminofeno (paracetamol).
[072]Análogos de vitamina D2 apropriados incluem paricalcitol.
[073] Tiroxinas sintéticas apropriadas incluem levotiroxina.
[074]Anti-histamínicos apropriados incluem fexofenadina.
[075]Agentes antifúngicos apropriados incluem azois como viriconazol.
[076] Em algumas modalidades o agente farmaceuticamente ativo é escassamente solúvel ou insolúvel em solução aquosa.
[077] Em modalidades particulares o agente farmaceuticamente ativo é selecionado de docetaxel, paclitaxel, testosterona, gencitabina, camptotecina, irinotecano e topotecano, especialmente docetaxel, paclitaxel e testosterona.
[078] O ligante diácido que liga o agente farmaceuticamente ativo aos grupos amino de superfície do dendrímero têm uma fórmula: -C(O)-J-C(O)-X-C(O)- em que X é selecionado de -C1-C10alquileno-, -(CH2)s-A- (CH2)t- e Q; -C(O)-J- é ausente, um resíduo de aminoácido ou um peptídeo de 2 a 10 resíduos de aminoácidos, em que o -C(O)- é derivado de carbóxi terminal do aminoácido ou peptídeo; A é selecionado de -O-, -S-, -NR1-, -N+(R1)2-, -S-S-, - [OCH2CH2]r-O-, -Y-, e -O-Y-O-; Q é selecionado de Y ou -Z=N-NH-S(O)w-Y-; Y é selecionado de cicloalquil, heterocicloalquil, aril e heteroaril; Z é selecionado de -(CH2)x-C(CH3)=, -(CH2)xCH=, cicloalquil e heterocicloalquil; R1 é selecionado de hidrogênio e C1-C4 alquil; s e t são independentemente selecionados de 1 e 2; r é selecionado de 1, 2 e 3; w é selecionado de 0, 1 e 2; e x é selecionado de 1, 2, 3 e 4.
[079] Em algumas modalidades um ou mais dos seguintes se aplicam: X é -C1-C6-alquileno, -CH2-A-CH2-, -CH2CH2-A-CH2CH2- ou heteroaril; -C(O)-J é ausente, um resíduo de aminoácido ou um peptídeo de 2 a 6 resíduos de aminoácidos, em que o -C(O)- é derivado de carbóxi terminal do aminoácido ou peptídeo; A é selecionado de -O-, -S-, -S-S-, -NH-, -N(CH3)-, - N+(CH3)2-, -O-1,2-fenil-O-, -O-1,3-fenil-O-, -O-1,4-fenil-O-, -OCH2CH2O-, -[OCH2CH2]2-O- e -[OCH2CH2]3-O-; Y é heteroaril ou aril, especialmente tiofenil, 3,4- propilenodioxitiofenil ou benzeno; Z é -(CH2)xC(CH3)=, -(CH2)xCH= e cicloalquil, especialmente -CH2CH2C(CH3)=, -CH2CH2CH2C(CH3)=, -CH2CH2CH2CH=, ciclopentil e ciclohexil; R1 é hidrogênio, metil ou etil, especialmente hidrogênio ou metil, mais especialmente metil; um de s e t é 1 e o outro é 1 ou 2, especialmente onde ambos s e t are 1; r é 1 ou 2, especialmente 2; w é 1 ou 2, especialmente 2; e x é 2 ou 3, especialmente 3.
[080] Em algumas modalidades, -C(O)-J- é ausente. Em outras modalidades, -C(O)-J- é um resíduo de aminoácido ou um peptídeo tendo 2 a 6 resíduos de aminoácidos. Nestas modalidades, o N-terminal do aminoácido ou peptídeo forma uma ligação amida com o grupo -C(O)-X-C(O)-. Em algumas modalidades, o peptídeo é um peptídeo que compreende uma sequência de aminoácido que é reconhecido e clivado por uma enzima endógena, como uma protease. Em algumas modalidades, a enzima é uma enzima intracelular. Em outras modalidades, a enzima é uma enzima extracelular. Em modalidades particulares, a enzima é uma que está presente em ou ao redor do tecido neoplásico, como tecido de tumor. Em algumas modalidades, o peptídeo é reconhecido por catepsina B ou a metaloprotease como uma metaloproteinase neutra (NMP), MMP-2 e MMP-9. Peptídeos exemplares incluem GGG, GFLG e GILGVP.
[081] Em modalidades particulares o ligante diácido é selecionado de: -C(O)-CH2CH2-C(O)-, -C(O)-CH2CH2CH2-C(O)-, -C(O)-CH2OCH2- C(O)-, -C(O)-CH2SCH2-C(O)-, -C(O)CH2NHCH2-C(O)-, -C(O)- CH2N(CH3)CH2-C(O)-, -C(O)-CH2N+(CH3)2CH2-C(O)-, -C(O)-CH2-S-S- CH2-C(O)-, -C(O)-OCH2CH2OCH2CH2OC(O)-,
Figure img0001
[082] Em outras modalidades, o ligante diácido ainda compreende um peptídeo. Ligantes diácidos exemplares incluem:
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[083]Em algumas modalidades, o ligante diácido é selecionado para fornecer uma taxa droga. Por exemplo, uma liberação rápida pode ser requerida onde a carga total de agente farmacêutico é requerida em um curto espaço de tempo enquanto que uma liberação lenta pode ser mais apropriada quando uma dose terapêutica constante de agente farmaceuticamente ativo é requerido.
[084] Em algumas modalidades, a taxa de liberação é mais rápida do que a droga liberada independente da macromolécula, especialmente pelo menos duas vezes mais rápido. Em algumas modalidades, a droga é liberada mais lentamente do que a droga independente da macromolécula, especialmente onde a droga é liberada pelo menos duas vezes mais lenta, mais especialmente a droga é liberada pelo menos 10 vezes mais lenta. Em algumas modalidades, a droga é liberada pelo menos 30 vezes mais lenta como descrito no Exemplo 39. Taxas baixas de liberação podem ser particularmente apropriadas quando a macromolécula inclui um grupo alvo, para permitir a liberação da droga no sítio ativo, mas não no plasma. Taxas baixas de liberação podem ainda ser apropriadas para drogas formuladas para permitir liberação lenta controlada em períodos de tempo longos, como entre 1 semana e 6 meses. A droga pode ser liberada de uma macromolécula por um período de tempo prolongado, como dias, semanas ou meses. Liberação rápida preferencialmente libera release mais de 50% em 0 a 480 minutos, especialmente em 0 a 120 minutos, e mais especialmente em 5 a 60 minutos. Liberação média preferencialmente libera mais de 50% em 1 a 72 horas, especialmente em 2 a 48 horas. Liberação lenta preferencialmente libera de mais de 50% em mais de 2 dias, especialmente 2 dias a 6 meses, e mais especialmente em 5 dias a 30 dias.
[085]A taxa de liberação da droga pode ser controlada pela seleção do ligante diácido. Ligantes diácidos contendo um ou mais átomos de oxigênio em suas estruturas, como ácido diglicólico, ácido fenilenodioxidiacético, e polietileno glicol, ou com um átomo de nitrogênio catiônico, tendem a liberar a droga em uma taxa rápida, ligantes diácidos tendo um átomo de enxofre em suas estruturas, como ácido tiodiacético, têm uma taxa média de liberação e ligantes diácidos tendo um ou mais átomos de nitrogênio, dois ou mais átomos de enxofre, cadeias de alquil ou grupos heterocíclicos ou heteroaril liberam a droga em uma taxa lenta. A taxa de liberação pode ser sumarizada em um ou mais -O- > -N+(R1)2- > ona -S- > ona -NR- > -N-NH-SO2- > -S-S- > -alquil- > - heterociclil-.
[086] Pode ser observado da tabela 2, estudos de macromoléculas em amostras de plasma que o ácido diglicólico (Experimento 3 (b)) liberou docetaxel em uma taxa rápida, com uma meia-vida menor do que 22 horas, ligante ácido tiodiacético (Experimento 8 (c)) liberou docetaxel em uma taxa média, com uma meia-vida de um pouco mais do que 22 horas, extrapolado em cerca de 24 a 30 horas e o ligante ácido glutárico (Experimento 5 (b)) liberou docetaxel em uma taxa lenta com uma meia-vida de muito mais de 22 horas, e previsto para mais do que 2 dias. Experimento 16 e 17 não substancialmente libera docetaxel em plasma, mas permite que uma macromolécula seja direcionada a um tumor em que proteases podem clivar a sequência de peptídeo par fornecer o docetaxel no local da ação.
[087]A taxa de liberação pode ainda ser dependente na identidade do agente farmaceuticamente ativo.
[088] Em algumas modalidades, cada agente farmaceuticamente ativo é fixado ao dendrímero com o mesmo ligante diácido. Em outras modalidades, dois ou mais ligantes diácidos diferentes são usados permitindo que o agente farmaceuticamente ativo seja liberado de uma macromolécula em diferentes taxas.
[089] O segundo grupo terminal é um agente modificador farmacocinético, que pode ser qualquer molécula ou resíduo do mesmo que modifica ou modula o perfil farmacocinético do agente farmaceuticamente ativo ou a macromolécula incluindo absorção, distribuição, metabolismo e/ou excreção. Em uma modalidade particular, o agente modificador farmacocinético é um agente selecionado para prolongar a meia-vida plasmática do agente farmaceuticamente ativo, de modo que a macromolécula tem uma meia-vida que é mais de a meia-vida do agente farmaceuticamente ativo nativo, ou o agente farmaceuticamente ativo comercializado em uma formulação não dendrímero. Preferencialmente a meia-vida da macromolécula ou composição é pelo menos 2 vezes e mais preferencialmente 10 vezes mais de o agente farmaceuticamente ativo nativo, ou o agente farmaceuticamente ativo comercializado em uma formulação não dendrímero.
[090] Em algumas modalidades, o segundo grupo terminal é polietileno glicol (PEG), a polialquiloxazolina como polietiloxazolina (PEOX), polivinilpirrolidona e polipropileno glicol, especialmente PEG. Em outras modalidades, o segundo grupo terminal é um poliéter dendrímero.
[091] Em algumas modalidades, o PEG tem um peso molecular de entre 220 e 5500 Da. Em algumas modalidades, o PEG tem um peso molecular de 220 a 1100 Da, especialmente 570 e 1100 Da. Em outras modalidades, o PEG tem um peso molecular de 1000 a 5500 Da, especialmente 1000 a 2500 Da ou 1000 a 2300.
[092] Em algumas modalidades, a macromolécula compreende um terceiro grupo terminal. O terceiro grupo terminal é um grupo de bloqueio que serve para bloquear a reatividade de um grupo amino de superfície do dendrímero. Em modalidades particulares, o grupo de bloqueio é um grupo acila como um grupo C2-C10 acil, especialmente acetil. Em outras modalidades, o terceiro grupo terminal é um segundo agente farmaceuticamente ativo ou um agente alvo.
[093] Em algumas modalidades onde há um primeiro grupo terminal e um segundo grupo terminal, a razão do primeiro grupo terminal e segundo grupo terminal é entre 1:2 e 2:1, especialmente 1:1.
[094] Em algumas modalidades onde há um primeiro grupo terminal, um segundo grupo terminal e um terceiro grupo terminal, a razão é 1:1:1 a 1:2:2, especialmente 1:2:1.
[095] Em algumas modalidades, nem todos os grupos amino de superfície do dendrímero são ligados a um primeiro grupo terminal, um segundo grupo terminal, ou um terceiro grupo terminal. Em algumas modalidades, alguns dos grupos amino de superfície permanecem grupos amino livres. Em algumas modalidades pelo menos 50% dos grupos totais terminais compreendem um de um agente modificador farmacocinético ou um agente farmaceuticamente ativo, especialmente pelo menos 75% ou pelo menos 80% dos grupos terminais compreende um de um agente modificador farmacocinético ou a agente farmaceuticamente ativo. Em modalidades particulares, um agente farmaceuticamente ativo é ligado a mais de 14%, 25%, 27%, 30% 39%, 44% ou 48% dos números totais de grupos amino de superfície. Onde dendrímero é um dendrímero G5 polilisina, o número total do agente farmaceuticamente ativo é preferencialmente mais de 15, e especialmente mais de 23 e mais especialmente mais de 27. Em algumas modalidades, o agente modificador farmacocinético é ligado a mais de 15%, 25%, 30%, 33% ou 46% do número total de grupos amino de superfície. Onde dendrímero é um dendrímero G5 polilisina, o número total de agentes modificadores farmacocinéticos é preferencialmente mais de 25, e especialmente mais de 30.
[096]A macromolécula da invenção compreende um dendrímero em que a geração mais externa de unidades de construção tem grupos amino de superfície. A identidade do dendrímero da macromolécula não é particularmente importante, contanto que esta tenha grupos amino de superfície. Por exemplo, o dendrímero pode se uma polilisina, análogo de polilisina, poliamidoamina (PAMAM), dendrímero de polietilenoimina (PEI) ou dendrímero de poliéter hidroxilamina (PEHAM).
[097] O dendrímero compreende um núcleo e um ou mais dendrons feitos de uma ou mais unidades de construções. As unidades de construção são construídas em camadas referenciadas como gerações.
[098] Em algumas modalidades, a unidade de construção é a poliamina, mais preferencialmente um di ou tri- amino com um ácido carboxílico único. Preferencialmente o peso molecular de unidade de construção é de 110 Da a 1 KDa. Em algumas modalidades, a unidade de construção é lisina ou análogo de lisina selecionada de: Lisina 1: tendo a estrutura:
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Glicil-Lisina 2 tendo a estrutura: tendo a estrutura
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[099]Análogo 3 abaixo, onde a um inteiro de 1 ou 2; b e c são os mesmos ou diferentes são inteiros de 1 a 4:
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[100]Análogo estrutura abaixo, onde a um inteiro de 0 a 2; e c são os mesmos ou diferentes são inteiros de 2 a 6:
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[101]Análogo tendo a estrutura abaixo, onde a um inteiro de 0 a 5; e c são os mesmos ou diferentes são inteiros de 1 a 5: 6, tendo a estrutura
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[102]Análogo abaixo, onde a um inteiro de 0 a 5; b e c são os mesmos ou diferentes são inteiros de 0 a 5:
Figure img0011
[103]Análogo 7 inteiro de 0 a 5; inteiros de 1 a 5:
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[104]Análogo 8 inteiro de 0 a 5; b inteiros de 1 a 5:
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[105]Análogo 9, tendo a estrutura abaixo, onde a é um inteiro de 0 a 5; b e c são os mesmos ou diferentes e são inteiros de 1 a 5:
Figure img0014
e além disso, as frações de cadeia alquil (por exemplo: -C-C-C-) das unidades de construção podem ser entendidas para incluírem fragmentos alcóxi como C-O-C ou C-C-O-C-C onde um ou mais átomo de carbono não adjacente é substituído com um átomo de oxigênio, contanto que dita uma substituição não forma um grupo O-C-X onde X é O ou N. e além disso, as frações de cadeia alquil (por exemplo: -C-C-C-) das unidades de construção podem ser entendidas para incluírem fragmentos alcóxi como C-O-C ou C-C-O-C-C onde um ou mais átomo de carbono não adjacente é substituído com um átomo de oxigênio, contanto que dita uma substituição não forma um grupo O-C-X onde X é O ou N.
[106] Em algumas modalidades a unidade de construção é uma unidade de construção amidoamina com a estrutura 10:
Figure img0015
uma unidade de eterhidroxiamina construção com a estrutura 11:
Figure img0016
ou uma unidade de construção propilenoimina com a estrutura 12:
Figure img0017
[107] Em um aspecto preferencial da invenção, as unidades de construção são selecionadas de Lisina 1, Glicil-Lisina 2 ou Lisina análogo 5:
Figure img0018
onde a é um inteiro de 0 a 2 ou o ligante alquil é C-O- C; b e c são os mesmos ou diferentes e são inteiros de 1 a 2; especialmente onde as unidades de construção are lisina.
[108] Em algumas modalidades, o núcleo é um composto monoamina, composto diamina, composto triamina, composto tetraamina ou composto pentaamina, um ou mais dos grupos amina tendo um dendron compreendendo unidades de construção fixadas a este. Em modalidades particulares, o peso molecular da unidade de construção é de 110 Da a 1 KDa.
[109]Núcleos apropriados incluem benzidrilamina (BHA), um benzidrilamida de lisina (BHALys) ou um análogo de lisina, ou:
Figure img0019
onde a é um inteiro de 1 a 9, preferencialmente 1 a 5;
Figure img0020
onde a, b e c, que podem ser os mesmos ou diferentes, e são inteiros de 1-5, e d é um inteiro de 0-100, preferencialmente 1-30;
Figure img0021
onde a e b, podem ser os mesmos ou diferentes, e são inteiros de 0 a 5;
Figure img0022
onde a e c, que podem ser os mesmos ou diferentes, são inteiros de 1 a 6 e onde c é um inteiro de 0 a 6;
Figure img0023
onde a e d, que podem ser os mesmos ou diferentes, são inteiros de 1 a 6 e onde b e c, que podem ser os mesmos ou diferentes, são inteiros de 0 a 6;
Figure img0024
onde a e b são os mesmos ou diferentes e são inteiros de 1 a 5, especialmente 1 a 3, mais especialmente 1; um composto triamina selecionado de:
Figure img0025
onde a, b e c, que podem ser os mesmos ou diferentes, são inteiros de 1 a 6;
Figure img0026
onde a, b e c, que podem ser os mesmos ou diferentes, são inteiros de 0 a 6;
Figure img0027
onde a, b e c, que podem ser os mesmos ou diferentes,
Figure img0028
onde a, b e c, que podem ser os mesmos ou diferentes, são inteiros de 0 a 6; e d, e e f, diferentes, são inteiros de 1 a 6;
Figure img0029
onde a, b e c, que podem ser os mesmos ou diferentes, são inteiros de 1 a 6;
Figure img0030
onde a, b, c e d, que podem ser os mesmos ou diferentes, são inteiros de 0 a 6;
Figure img0031
onde a, b, c e d, que podem ser os mesmos ou diferentes, são inteiros de 1 a 6;
Figure img0032
onde a, b e c, que podem ser os mesmos ou diferentes, são inteiros de 1 a 6;
Figure img0033
em que a, b e c, que podem ser os mesmos ou diferentes, onde a, b, c e d, que podem ser os mesmos ou diferentes, são inteiros de 0 a 6; e e, f, g e h, que podem ser os mesmos ou diferentes, são inteiros de 1 a 6; e além disso, as frações de cadeia alquil (por exemplo: -C-C-C-) das unidades de construção podem ser entendidas para incluírem fragmentos alcóxi como C-O-C ou C-C-O-C-C onde um ou mais átomo de carbono não adjacente é substituído com um átomo de oxigênio, contanto que dita uma substituição não forma um grupo O-C-X onde X é O ou N.
[110] Em algumas modalidades, o núcleo tem pelo menos dois grupos funcionais amino, um dos quais tem fixados uma fração alvo diretamente ou por um grupo espaçador. Pelo menos um dos grupos funcionais restantes do núcleo tendo um dendron fixado como descrito em WO 2008/017125.
[111] O agente alvo é um agente que se liga a uma célula alvo biológica, órgão ou tecido com alguma seletividade assim auxiliando o direcionamento de uma macromolécula a um alvo particular no corpo e permitindo seu acúmulo na célula alvo, órgão ou tecido. O grupo alvo pode ainda fornecer um mecanismo para que uma macromolécula seja ativamente absorvida pela célula ou tecido por endocitose mediada por receptor.
[112] Exemplos particulares incluem lectinas e anticorpos e outros ligantes (incluindo moléculas pequenas) para receptores de superfície celular. A interação pode ocorrer através de qualquer tipo de ligação ou associação incluindo ligação covalente, iônica e de hidrogênio, forças de Van der Waals.
[113] Grupos de alvos apropriados incluem aqueles que se ligam aos receptores de superfície celular, por exemplo, o receptor de folato, receptor adrenérgico, receptor de hormônio de crescimento, receptor de hormônio luteinizante, receptor de estrogênio, receptor de crescimento de fator epidérmico, receptor de fator de crescimento de fibroblasto (por exemplo, FGFR2), receptor IL-2, receptor de CFTR e fator de crescimento epitelial vascular (VEGF).
[114] Em algumas modalidades, o agente de alvo é hormônio de liberação de hormônio luteinizante (LHRH) ou um derivado do mesmo que se liga ao receptor de hormônio de liberação de hormônio luteinizante. LHRH tem a sequência: pyroGlu-His-Trp- Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2. Derivados apropriados de LHRH incluem aqueles em que um dos resíduos 4-7 é substituído por outro aminoácido, especialmente resíduo 6 (Gly). Em algumas modalidades, a substituição de resíduo de aminoácido é apropriadamente um que tem uma cadeia lateral capaz de formar uma ligação com o núcleo ou com o espaçador. Em algumas modalidades o derivado é LHRH Gly6Lys, LHRH Gly6Asp ou LHRH Gly6Glu, especialmente LHRH Gly6Lys. Em outras modalidades, o derivado é LHRH Gly6Trp (deslorelina). Este receptor é geralmente encontrado ou sobre-expresso em células cancerígenas, especialmente em cânceres de mama, próstata, ovariano ou endometrial.
[115] Em algumas modalidades, o agente de alvo é LYP-1, um peptídeo que tem por alvo o sistema linfático de tumores, mas não o sistema linfático de tecido normal. LYP-1 é um peptídeo tendo a sequência H-Cys-Gly-Asn-Lys-Arg-Thr-Arg-Gly- Cys-OH e em que o peptídeo está na forma cíclica devido a uma ligação dissulfeto entre os átomos de enxofre dos dois resíduos de cisteína.
[116] Em algumas modalidades, o agente de alvo pode ser um peptídeo RGD. Peptídeos RGD são peptídeos contendo a sequência -Arg-Gly-Asp-. Esta sequência é o sítio de reconhecimento de integrina primário nas proteínas de matriz extracelular.
[117]Anticorpos e fragmentos de anticorpos como scFvs e diabodies conhecidos por interagirem com receptores ou fatores celulares incluem CD20, CD52, MUC1, Tenascin, CD44, TNF-R, especialmente CD30, HER2, VEGF, EGF, EFGR e TNF-α.
[118] Em algumas modalidades o agente de alvo pode ser folato. Folato é uma vitamina que é essencial para a biossíntese de bases de nucleotídeo e é, portanto, requerida em grandes quantidades em células de proliferação. Em células cancerígenas, este requisito aumentado para ácido fólico é frequentemente refletido em uma sobre expressão do receptor de folato que é responsável pelo transporte de folato através da membrana celular. Em contraste, a absorção de folato em células normais é facilitada pelo transportador de folato reduzido, ao invés de o receptor de folato. O receptor de folato é regulado para cima em muitos cânceres, incluindo malignidades do de células do ovário, cérebro, rim, mama, e mieloides e o pulmão e a densidade de receptores de folato na superfície celular parece aumentar conforme o câncer se desenvolve.
[119] Estrogênios podem ainda ser usados para células alvos que expressam receptor de estrogênio.
[120] O agente de alvo pode ser ligado ao dendrímero núcleo diretamente ou preferencialmente por um espaçador. O grupo espaçador pode ser qualquer grupo divalente de ligação a ambos o grupo funcional do núcleo e o grupo funcional no agente alvo. O tamanho do grupo espaçador é preferencialmente suficiente para prevenir qualquer aglomeração estérica. Exemplos de grupos espaçadores apropriados incluem cadeias de alquileno e cadeias alquileno em que um ou mais átomos de carbono são substituídos por um heteroátomo selecionado de - O-, -S-, ou NH. A cadeia de alquileno termina com grupos funcionais para fixação a ambos o grupo funcional do núcleo e o agente alvo. Grupos espaçadores exemplares incluem X- (CH2)p-Y, X-(CH2O)p-CH2-Y, X-(CH2CH2O)p-CH2CH2-Y e X- (CH2CH2CH2O)pCH2CH2CH2-Y, onde X e Y são grupos funcionais para ligação com ou ligados ao núcleo e o agente de alvo respectivamente, e p é um inteiro de 1 a 100, especialmente 1 a 50 ou 1 a 25.
[121] Em algumas modalidades, o grupo alvo pode ser ligado aos grupos amino de superfície como terceiro grupo funcional. Em algumas modalidades, 1 a 32 grupos alvos são ligados à superfície, especialmente, 1 a 10 são ligados, mais especialmente 1 a 4 são ligados.
[122] Em algumas modalidades, o agente de alvo e o grupo espaçador são modificados para facilitar a reação. Por exemplo, o grupo espaçador pode incluir um grupo azida funcional e o agente de alvo pode incluir um grupo alquino ou o grupo espaçador é modificado com um alquino e o agente de alvo modificado com uma azida e os dois grupos são conjugados usando uma reação click.
[123] Em algumas modalidades o grupo funcional do núcleo que não contém um dendron pode ser ligado a biotina, opcionalmente por um grupo espaçador descrito acima, e a macromolécula reagida com um anticorpo avidina ou complexo de anticorpo avidina-biotina. Cada complexo de avidina pode ser ligada até 4 conjugados de macromolécula-biotina ou uma combinação de conjugados de macromolécula-biotina e conjugados de anticorpo-biotina.
[124] Em modalidades particulares, o núcleo é BHA ou BHALys ou NEOEOEN [SuN(PN)2].
[125] Em algumas modalidades, o dendrímero tem 1 a 5 dendrons fixados ao núcleo, especialmente 2 a 4 dendrons, mais especialmente 2 ou 3 dendrons.
[126] Em algumas modalidades, o dendrímero tem 1 a 8 gerações de unidades de construção, especialmente 2 a 7 gerações, 3 a 6 gerações, mais especialmente 4 a 6 gerações.
[127]A macromolécula da invenção pode ser nanopartícula tendo um diâmetro de partícula de menos de 1000 nm, por exemplo, entre 5 e 1000 nm, especialmente 5 e 500 nm, mais especialmente 5 a 400 nm, como 5 a 50 nm, especialmente entre 5 e 20 nm. Em modalidades particulares, a composição contém macromoléculas com um tamanho médio de entre 5 e 20nm. Em algumas modalidades, a macromolécula tem um peso molecular de pelo menos 30 kDa, por exemplo, 40 a 150 kDa ou 40 a 300 kDa.
[128] Em algumas modalidades, as macromoléculas da invenção têm um tamanho de partícula que é apropriado para ter vantagem do Efeito de Retenção e Permeabilidade Melhorada (efeito EPR) em tumores e tecido inflamatório. Vasos sanguíneos formados em tumores são formados rapidamente e são anormais devido a células endoteliais defeituosas fracamente alinhadas, uma falta de camada de músculo liso e/ou inervação com um lúmen maior. Isto torna os vasos do tumor permeáveis às partículas de um tamanho que não normalmente não existiram a vasculatura e permitem que as macromoléculas sejam coletadas no tecido do tumor. Além disso, tecidos de tumor são desprovidos de drenagem linfática efetiva, portanto, uma vez que as macromoléculas entram no tecido do tumor, são retidas lá. Acúmulo semelhante e retenção são encontrados em sítios de inflamação.
[129]A macromolécula da invenção pode ter um carregamento de agente farmaceuticamente ativo de 2, 4, 8, 16, 32, 64 ou 120 resíduos, especialmente 16, 32 ou 64 resíduos por macromolécula.
[130]Métodos para preparar dendrímeros são conhecidos na técnica. Por exemplo, os dendrímeros da macromolécula podem ser preparados por um método divergente ou método convergente ou uma mistura dos mesmos.
[131]No método divergente, cada geração de unidades de construção é sequencialmente adicionada ao núcleo ou uma geração anterior. A geração da superfície tendo um ou ambos dos grupos amino de superfície protegidos. Se um dos grupos amino é protegido, o grupo amino livre é reagido com um dos ligantes, o ligante-agente farmaceuticamente ativo ou o agente modificador farmacocinético. Se ambos os grupos amino são protegidos, são protegidos com diferentes grupos de proteção, um dos quais pode ser removido sem a remoção de outro. Um dos grupos de proteção amino é removido e reagido com um de ligante, o ligante-agente farmaceuticamente ativo ou o agente modificador farmacocinético. Uma vez o grupo inicial grupo terminal foi fixado ao dendrímero, o outro grupo de proteção de amino é removido e o outro do primeiro e segundo grupo terminal é adicionado. Estes grupos são fixados aos grupos amino de superfície por formação de amida como conhecido na técnica.
[132]No método convergente, cada de unidades de construção é construída na geração anterior para formar um dendron. O primeiro e segundo grupos terminais podem ser fixados aos grupos amino de superfície como descrito acima antes ou depois de fixação do dendron ao núcleo.
[133] Em uma abordagem mista, cada geração de unidades de construção é adicionada ao núcleo ou uma geração anterior de unidades de construção. No entanto antes da última geração é adicionada ao dendrímero, os grupos amino de superfície são funcionalizados com grupos terminais, por exemplo, um primeiro e segundo grupo terminal, um primeiro e terceiro grupo terminal ou um segundo e terceiro grupo terminal. A geração funcionalizada final é então adicionada à camada de subsuperfície de unidades de construção e o dendron é fixado ao núcleo.
[134] O agente farmaceuticamente ativo é reagido com um dos ácidos carboxílicos do ligante por formação éster como conhecido na técnica. Por exemplo, um ácido carboxílico ativado é formado, como um cloreto ácido ou um anidrido é usado e reagido com o grupo hidroxi do agente farmaceuticamente ativo. Se o agente farmaceuticamente ativo tem mais do que um grupo hidroxi, outros grupos hidroxi podem ser protegidos.
[135]No caso onde um agente alvo é fixado ao núcleo, um grupo funcional no núcleo pode ser protegido durante a formação do dendrímero então desprotegido e reagido com o agente alvo, o grupo espaçador ou o agente alvo-grupo espaçador. Alternativamente, o núcleo pode ser reagido com o grupo espaçador ou agente alvo-grupo espaçador antes da formação do dendrímero.
[136] Grupos de proteção apropriados, métodos para suas introduções e remoções são descritos em in Greene & Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, Third Edition, 1999.
Composições Compreendendo a Macromolécula
[137] Enquanto é possível que as macromoléculas da invenção possam ser administrados como um produto químico puro, em modalidades particulares, a macromolécula é apresentada como uma composição farmacêutica.
[138]A invenção fornece formulações farmacêuticas ou composições, ambos para uso veterinário ou humano, que compreende uma ou mais macromoléculas da invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, com um ou mais transportadores farmaceuticamente aceitáveis, e opcionalmente qualquer um dos outros ingredientes terapêuticos ou semelhantes. Os transportadores devem ser farmaceuticamente aceitáveis no sentido de serem compatíveis com os outros ingredientes da formulação e não indevidamente prejudicial ao receptor do mesmo. As composições da invenção podem ainda incluem excipientes poliméricos/aditivos ou transportadores, por exemplo, polivinilpirrolidonas, celuloses derivatizados de celuloses como hidroximetilceluloses, hidroxietilcelulose, e hidroxipropilmetilcelulose, Ficolls (um açúcar polimérico), hidroxietilamido (HES), dextratos (por exemplo, ciclodextrinas, como 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina e sulfobutiléter-e-ciclodextrina), polietileno glicóis, e pectina. As composições podem ainda incluir diluentes, tampões, ligantes, desintegrantes, espessantes, lubrificantes, preservativos (incluindo antioxidantes), agentes flavorizantes, agentes que mascaram o sabor, sais inorgânicos (por exemplo, cloreto de sódio), agentes antimicrobianos (por exemplo, cloreto de benzalcônio), adoçantes, agentes antiestáticos, ésteres de sorbitano, lipídeos (por exemplo, fosfolipídeos como lecitina e outras fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas, ácidos graxos, e ésteres graxos, esteroides (por exemplo, colesterol)), e agentes quelantes (por exemplo, EDTA, zinco e outros ditos cátions apropriados). Outros excipientes farmacêuticos e/ou aditivos apropriados para uso nas composições de acordo com a invenção são listados em “Remington: The Science & Practice of Pharmacy”, 19.sup.th ed., Williams & Williams, (1995), e em “Physician's Desk Reference”, 52.sup.nd ed., Medical Economics, Montvale, N.J. (1998), e em “Handbook of Pharmaceutical Excipients”, Third Ed., Ed. A. H. Kibbe, Pharmaceutical Press, 2000.
[139]A macromolécula pode ainda ser formulada na presença de uma proteína albumina apropriada como albumina sérica humana. Albumina transporta nutrientes ao redor do corpo e podem ser ligar a uma macromolécula e transportar esta até o local de ação.
[140]As macromoléculas da invenção podem ser formuladas nas composições incluindo aquelas apropriadas para administração oral, retal, tópica, nasal, inalação ao pulmão, por aerossol, oftálmica, ou parenteral (incluindo intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, ou injeção intramuscular). As composições podem ser convenientemente apresentadas em forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por qualquer um dos métodos conhecidos na técnica farmacêutica. Todos os métodos incluem a etapa de trazer a macromolécula em associação com um transportador que constitui um ou ingredientes acessórios. Em geral, as composições são preparadas colocando a macromolécula em associação com um transportador líquido para formar uma solução ou uma suspensão, ou alternativamente, colocar a macromolécula em associação com componentes de formulação apropriados para formar um sólido, opcionalmente um produto particulado, então, se garantido, moldando o produto em uma forma de liberação desejada. Formulações sólidas da invenção, quando particulados, irão tipicamente compreender partículas com tamanho variando de cerca de 1 nanômetro a cerca de 500 mícron. Em geral, para formulações sólidas pretendidas para administração intravenosa, as partículas irão tipicamente variar de cerca de 1 nm a cerca de 10 mícron em diâmetro. A composição pode conter macromolécula da invenção que são nanopartículas tendo um diâmetro de partícula de menos de 1000 nm, por exemplo, entre 5 e 1000 nm, especialmente 5 e 500 nm, mais especialmente 5 a 400 nm, como 5 a 50 nm e especialmente entre 5 e 20 nm. Em modalidades particulares, a composição contém macromoléculas com um tamanho médio de entre 5 e 20nm. Em algumas modalidades, a macromolécula é polidispersa na composição, com PDI de entre 1,01 e 1,8, especialmente entre 1,01 e 1,5, e mais especialmente entre 1,01 e 1.2. Em modalidades particulares, a macromolécula é monodispersa na composição. Particularmente preferenciais são as composições estéreis, liofilizadas que são reconstituídas em um veículo aquoso antes da injeção.
[141] Composições da presente invenção apropriadas para administração oral podem ser apresentadas como unidades discretas como cápsulas, pastilhas, comprimidos, losangos, e semelhantes cada um contendo uma quantidade predeterminada do agente ativo como um pó ou grânulos; ou uma suspensão em um líquido aquoso ou líquido não aquoso como um xarope, um elixir, uma emulsão, um gole e semelhantes.
[142] Um comprimido pode ser preparado por compressão ou moldagem, opcionalmente com um ou more ingredientes acessórios. Comprimidos feitos por compressão podem ser preparados por compressão em uma máquina apropriada com o composto sendo ativo em uma forma de livre fluidez como um pó ou grânulos que é opcionalmente misturado com um ligante, desintegrante, lubrificante, diluente inerte, agente de superfície ativo ou agente de dispersão. Comprimidos moldados com um transportador apropriado podem ser preparados por moldagem em uma máquina apropriada.
[143] Um xarope pode ser preparado adicionando o composto ativo em uma solução aquosa concentrada de um açúcar, por exemplo, sacarose, a qual pode ser adicionado qualquer ingrediente acessório. Ditos ingredientes acessórios podem incluir flavorizantes, preservativos apropriados, um agente para retardar a cristalização do açúcar, e um agente para aumentar a solubilidade de qualquer outro ingrediente como álcool polihídrico, por exemplo, glicerol ou sorbitol.
[144]As formulações apropriadas para administração parenteral convenientemente compreendem uma preparação aquosa estéril da macromolécula, que pode ser formulada como isotônica com o sangue do receptor.
[145] Formulações de spray nasal compreendem soluções aquosas purificadas do ingrediente ativo com agentes preservativos e agentes isotônicos. Ditas formulações são preferencialmente ajustadas a um pH e estado isotônico com as membranas mucosas nasais.
[146] Formulações para administração retal podem ser apresentadas como um supositório com um transportador apropriado como manteiga de cacau, ou gorduras hidrogenadas ou ácidos carboxílicos hidrogenados.
[147] Formulações oftálmicas são preparadas por um método semelhante ao spray nasal, exceto que pH e fatores isotônicos são preferencialmente ajustados para combinar com os dos olhos.
[148] Formulações tópicas compreendem o composto ativo dissolvido ou suspenso em um ou mais meio como óleo mineral, petróleo, álcoois polihidroxi ou outras bases usadas para formulações tópicas. A adição de outros ingredientes acessórios como notado acima pode ser desejável.
[149] Formulações farmacêuticas são ainda fornecidas que são apropriadas para administração como um aerossol por inalação. Estas formulações compreendem uma solução ou suspensão da macromolécula desejada ou um sal do mesmo. A formulação desejada pode ser colocada em uma câmara pequena e nebulizada. A nebulização pode ser obtida por ar comprimido ou por energia ultrassônica para formar uma pluralidade de gotículas líquidas ou partículas sólidas compreendendo as macromoléculas ou sais dos mesmos.
[150] Geralmente drogas são coadministradas com outras drogas em terapia de combinação, especialmente durante a quimioterapia. As macromoléculas da invenção podem, portanto, ser administradas como terapias de combinação. Por exemplo, quando o agente farmaceuticamente ativo é docetaxel, a macromolécula pode ser administrada com doxorubicina, ciclofosfamida ou capecitabina. Não somente as macromoléculas são administradas com outras drogas quimioterápicas, mas ainda podem ser administradas em combinação com outros medicamentos como corticosteroides, anti-histamínicas, analgésicos e drogas que ajudam na recuperação ou protegem de hematotoxicidade, por exemplo, citocinas.
[151] Em algumas modalidades, particularmente com drogas de oncologia, a composição é formulada para infusão parenteral como parte de um regime de quimioterapia. Nestas modalidades, as composições são substancialmente livres ou totalmente livres de excipientes de solubilização, especialmente excipientes de solubilização como Cremophor e polissorbato 80. Em modalidades particulares, o agente farmaceuticamente ativo é selecionado de docetaxel ou paclitaxel e a formulação é substancialmente livre ou totalmente livre de excipientes de solubilização como Cremophor e polissorbato 80. Ao remover o excipiente de solubilização a composição de dendrímero é menos propensa a causar efeitos colaterais como hipersensibilidade aguda ou posterior incluindo anafilaxia que ameaça a vida e/ou retenção de fluido grave
[152] Em algumas modalidades, a macromolécula é formulada para liberação transdérmica como uma pomada, uma loção ou um adesivo transdérmico ou uso de tecnologia de microagulhas. Alto carregamento de droga solubilidade aquosa permitem que pequenos volumes transportem droga suficiente para as tecnologias de adesivo e microagulhas para fornecer uma quantidade terapeuticamente eficaz. Ditas formulações são particularmente apropriadas para liberação de testosterona.
[153]As macromoléculas da invenção podem ainda ser usadas para fornecer liberação controlada dos agentes farmaceuticamente ativos e/ou formulações de liberação lenta.
[154] Em formulações de liberação lenta, os ingredientes da formulação são selecionados para liberar a macromolécula da formulação por um período prolongado de tempo, como dias, semanas ou meses. Este tipo de formulação inclui adesivos transdérmicos, ou em dispositivos implantáveis que podem ser depositados por via subcutânea ou por injeção intravenosa, subcutânea, intramuscular, intraepidural ou intracranial.
[155]Nas formulações de liberação controlada, o ligante diácido é selecionado para liberar a maioria de seu agente farmaceuticamente ativo em determinada janela de tempo. Por exemplo, quando o tempo que leva para a maior parte da macromolécula se acumular em um órgão alvo, tecido ou tumor é conhecido, o ligante pode ser selecionado para liberar a maior parte de seu agente farmaceuticamente ativo após o tempo de acúmulo ter passado. Isto pode permitir uma alta carga de droga sendo liberada em determinado ponto de tempo no local onde sua ação é requerida. Alternativamente, o ligante é selecionado para liberar o agente farmaceuticamente ativo em um nível terapêutico por um período de tempo prolongado.
[156] Em algumas modalidades, a formulação pode ter várias características de liberação controlada. Por exemplo, a formulação compreende macromoléculas em que a droga é fixada por diferentes ligantes permitindo uma carga inicial de droga liberada rápida seguida por liberação mais lenta em níveis terapêuticos baixos, mas constantes por um período de tempo prolongado.
[157] Em algumas modalidades, a formulação pode ter várias características de liberação controlada e liberação lenta. Por exemplo, os ingredientes da formulação podem ser selecionados para liberar a macromolécula por um período de tempo prolongado e o ligante é selecionado para liberar um nível terapêutico constante baixo do agente farmaceuticamente ativo.
[158] Em algumas modalidades, o agente farmaceuticamente ativo é fixado na mesma molécula por diferentes ligantes. Em outras modalidades, cada combinação de droga-ligante é fixada em diferentes macromoléculas na mesma formulação.
Métodos de Uso
[159]A macromolécula da invenção pode ser usada pra tratar ou prevenir qualquer doença, distúrbio ou sintoma que o agente farmaceuticamente ativo não modificado pode ser usado para tratar ou prevenir.
[160] Em algumas modalidades, onde o agente farmaceuticamente ativo é uma droga de oncologia, a macromolécula é usada em um método para tratar ou prevenir câncer, ou suprimir o crescimento de um tumor. Em modalidades particulares, a droga é selecionada de docetaxel, camptotecina, topotecano, irinotecano e gencitabina, especialmente docetaxel.
[161] Em algumas modalidades, o câncer é um câncer de origem óssea como leucemina ou linfoma. Em outras modalidades, o câncer é um tumor sólido. O tumor sólido pode ser um tumor primário ou metastático. Tumores sólidos exemplares incluem tumores de mama, pulmão especialmente câncer pulmonar de célula não pequena, de cólon, estômago, rim, cérebro, cabeça e pescoço especialmente carcinoma de célula escamosa de cabeça e pescoço, tireoide, ovário, testículos, fígado, melanoma, próstata especialmente câncer de próstata independente de androgênio (refratário a hormônio), neuroblastoma e adenocarcinoma gástrico incluindo adenocarcinoma da junção gastroesofágica.
[162] Drogas de oncologia geralmente têm efeitos colaterais significativos que são devido a toxicidade fora do alvo como toxicidade hematológica, toxicidade neurológica, cardiotoxicidade, hepatotoxicidade, nefrotoxicidade, ototoxicidade e encefalotoxicidade. Por exemplo, taxanos como docetaxel pode causar os seguintes efeitos adversos: infecções, neutropenia, anemia, neutropenia febril, hipersensibilidade, trombocitopenia, mielotoxicidade, mielosupressão, neuropatia, disguesia, dispneia, constipação, anorexia, distúrbios de unha, retenção de fluido, astenia, dor, náusea, diarreia, vômito, fadiga, problemas neuro cognitivos não específicos, vertigem, encefalopatia, mucosite, alopecia, reações de pele e mialgia.
[163]Além disso, excipientes de solubilização requeridos para formular as drogas de oncologia podem causar anafilaxia, retenção de fluido e hipersensibilidade. A pré-medicação com corticosteroides, anti-histamínicos, citocinas e/ou analgésicos podem ainda ser requeridos, cada um tendo seus próprios efeitos colaterais. As macromoléculas da presente invenção têm alto carregamento de droga, liberação controlada, podem passivamente ter como alvo um tecido particular e solubilidade melhorada permitindo uma redução de efeitos colaterais associados com a droga de oncologia, a formulação da droga sem excipientes de solubilização e administração sem ou com pré-medicação reduzida.
[164] Em outro aspecto da invenção, é fornecido um método para reduzir os efeitos colaterais de uma droga de oncologia ou os efeitos colaterais relacionados à formulação de uma droga de oncologia compreendendo administrar uma quantidade eficaz da macromolécula da presente invenção a um sujeito, em que a droga de oncologia é o agente farmaceuticamente ativo do primeiro grupo terminal.
[165]Ainda em outro aspecto da invenção, é fornecido um método para reduzir hipersensibilidade durante quimioterapia compreendendo administrar uma quantidade eficaz da macromolécula da invenção a um sujeito.
[166] Regimes terapêuticos para tratamento de câncer geralmente envolve uma terapia cíclica onde uma droga de oncologia é administrada a cada duas a quatro semanas. Geralmente a droga é administrada por infusão por 3 a 24 horas. Em alguns casos para reduzir os efeitos colaterais da drogas, ou o risco de hipersensibilidade, especialmente anafilaxia de uma formulação da droga; pré-medicação é requerida e sua administração pode ser requerida até 6 horas antes do tratamento com a droga de oncologia. Ditos regimes terapêuticos complexos são demorados e requerem que o paciente permaneça no hospital desde várias horas a 2 dias. Os efeitos colaterais graves podem ainda limitar a dose de droga de oncologia usados e/ou o número de ciclos de terapia que podem ser administrados e, portanto, em alguns casos a eficácia da terapia é reduzida.
[167]Na presente invenção, a macromolécula compreendendo a droga de oncologia reduz efeitos colaterais associados com a droga conforme esta passivamente se acumula no local do tumor ou é direcionada ao local do tumor por um agente alvo apropriado e a liberação da droga do dendrímero é controlada.
[168]A solubilidade das macromoléculas em solução aquosa permite que estas sejam formuladas sem excipientes prejudiciais de solubilização assim reduzindo efeitos colaterais da formulação e em alguns casos eliminando a necessidade de pré-medicação.
[169]Além disso, as macromoléculas da presente invenção não precisam ser administradas por infusão prolongada. Em algumas modalidades, podem ser administradas por infusão rápida, por exemplo, em menos de 3 horas, incluindo 2,5 horas, 2 horas, 1,5 horas, 1 hora ou 30 minutos. Em algumas modalidades, a macromolécula ou formulação da macromolécula pode ser administrada como um bolus, por exemplo, em 5 segundos a 5 minutos.
[170]As macromoléculas da presente invenção podem ainda permitir que a dose do agente farmaceuticamente ativo seja aumentada em comparação com o agente farmaceuticamente ativo sendo administrado isolado. Em outro aspecto da invenção é fornecido um método para aumentar a dose de um agente farmaceuticamente ativo compreendendo administrar a macromolécula da presente invenção em que o primeiro grupo terminal é o agente farmaceuticamente ativo. Em modalidades particulares, a dose máxima tolerada é aumentada pelo menos duas vezes comparado ao agente farmaceuticamente ativo quando administrado isolado.
[171] Em modalidades particulares destes aspectos, a formulação da macromolécula usada na administração é substancialmente livre de excipientes de solubilização como óleo de rícino polietoxilado (Cremophor EL) e polissorbato 80.
[172] Em algumas modalidades onde o agente farmaceuticamente ativo é testosterona ou dihidrotestosterona e a macromolécula é usada em um método para tratar ou prevenir uma doença ou distúrbio associado com níveis baixos de testosterona.
[173]Níveis baixos de testosterona podem resultar de um número de condições. Por exemplo, os órgãos que produzem testosterona (testículos, ovários) não produzem suficiente testosterona (hipogonadismo primário), a glândula pituitária e sua capacidade de regular a produção de testosterona não estão trabalhando corretamente (hipogonadismo secundário) ou o hipotálamo não pode regular corretamente a produção de hormônio (hipogonadismo terciário).
[174] Causas comuns de hipogonadismo primário incluem criptorquidia, lesão ao escroto, terapia de câncer, envelhecimento, caxumba orquite, anormalidades cromossômicas, condições do ovário como falência prematura de ovário ou remoção de ambos os ovários. As causas de hipogonadismo secundário e terciário incluem dano à glândula pituitária de tumores ou tratamento de tumores próximos, má formação de hipotálamo como na síndrome de Kellman, fluxo sanguíneo comprometido para a glândula pituitária ou hipotálamo, inflamação causada por HIV/AIDS, inflamação de tuberculose ou sarcoidose e o uso ilegal de esteroides anabólicos em construção corporal.
[175] Deve ser notado que a obesidade pode ainda ser uma causa de níveis baixos de testosterona como obesidade significativamente melhora a conversão de testosterona ao estrogênio, um processo que ocorre predominantemente nas células de gordura.
[176] Os sintomas de testosterona baixa incluem alterações no humor (depressão, fadiga, raiva), redução de pelo corporal, densidade óssea mineral reduzida (risco aumentado de osteoporose), massa magra corporal reduzida e tensão muscular, libido e disfunção erétil reduzidas, gordura abdominal aumentada, desenvolvimento de mama rudimentar em homens e baixo ou nenhum esperma no sêmen.
[177] Uma “quantidade eficaz” significa uma quantidade necessária pelo menos parcialmente para reter a resposta desejada, ou para atrasar o início ou inibir a progressão ou interromper completamente o início ou progressão de uma condição particular sendo tratada. A quantidade varia dependendo da doença sendo tratada, a saúde e condição física do indivíduo a ser tratado, o grupo taxonômico do indivíduo sendo tratado, o grau de proteção desejado, a formulação da composição, a avaliação da situação clínica e outros fatores relevantes. É esperado que a quantidade estará em uma faixa relativamente ampla que pode ser determinara por estudos clínicos de rotina. Uma quantidade eficaz em relação a um paciente humano, por exemplo, pode estar na faixa de cerca de 0,1 ng por kg de peso corporal a 1 g por kg de peso corporal por dosagem. Em uma modalidade particular a dosagem está na faixa de 1μg a 1 g por kg de peso corporal por dosagem, como é na faixa de 1mg a 1g por kg de peso corporal por dosagem. Em uma modalidade, a dosagem está na faixa de 1 mg a 500mg por kg de peso corporal por dosagem. In outra modalidade, a dosagem está na faixa de 1 mg a 250 mg por kg de peso corporal por dosagem. Ainda em outra modalidade, a dosagem está na faixa de 1 mg a 100 mg por kg de peso corporal por dosagem, como até 50 mg por kg de peso corporal por dosagem. Ainda em outra modalidade, a dosagem está na faixa de 1 μg a 1 mg por kg de peso corporal por dosagem. Regimes de dosagem podem ser ajustados para fornecer a resposta terapêutica ideal. Por exemplo, várias doses divididas podem ser administradas diariamente, semanalmente, mensalmente ou outros intervalos de tempo, ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida pelas exigências da situação.
[178] Em algumas modalidades a macromolécula é administrada por via intravenosa, intra-arterial, intrapulmonar, oral, por inalação, intravesicular, intramuscular, intratraqueal, subcutânea, intraocular, intratecal ou transdérmica.
[179] Em algumas modalidades a macromolécula é administrada como um bolus ou por infusão rápida, especialmente como bolus.
[180] Em outro aspecto da invenção é fornecido o uso da macromolécula da invenção no fabricante de um medicamento para tratar ou suprimir o crescimento de câncer, reduzir a toxicidade de uma droga de oncologia ou a formulação de uma droga de oncologia, reduzir efeitos colaterais associados com uma droga de oncologia ou a formulação de uma droga de oncologia ou reduzir hipersensibilidade no tratamento com uma droga de oncologia; em que o agente farmaceuticamente ativo do primeiro grupo terminal é uma droga de oncologia.
[181] Já outro aspecto da invenção é fornecido um uso da macromolécula da invenção no fabricante de um medicamento para tratar ou prevenir uma doença ou distúrbio relacionado a níveis baixos de testosterona; em que o agente farmaceuticamente ativo do primeiro grupo terminal é testosterona.
[182] A invenção será agora descrita com referência aos seguintes Exemplos que ilustram alguns aspectos particulares da presente invenção. No entanto, é entendido que a particularidade da seguinte descrição da invenção não deve suplantar a generalidade da descrição anterior da invenção. Abreviaturas:
Figure img0034
Figure img0035
EXEMPLOS
[183] Os dendrímeros representados nos exemplos abaixo incluem referência ao núcleo e as unidades de construção na geração mais externa do dendrímero. O 1° para subsuperfície de gerações não é descrito. O dendrímero BHALys [Lys]32 é representativo de uma 5 geração de dendrímero tendo a fórmula BHALys [Lys]2 [Lys]4 [Lys]8 [Lys]16 [Lys]32, os 64 grupos amino de superfície estando disponíveis para ligar aos grupos terminais.
[184]A preparação de estruturas de dendrímero BHALys [Lys]32 [α-NH2.TFA]32 [ε-PEG570]32, BHALys [Lys]32 [α- NH2.TFA]32 [ε-PEG1100]32, BHALys [Lys]32 [α-NH2.TFA]32 [ε-t- PEG2300]32 BHALys [Lys]32 [α-4-HSBA]32 [ε-PEG1100]32, BHALys [Lys]32 [α-GILGVP-NH2.TFA]32 [ε-PEG1100]32, e BHALys [Lys]32 [α-GILGVP-NH2.TFA]32 [ε-t-PEG2300]32 pode ser encontrada em Kaminskas et al., J Control. Release (2011) doi 10.1016/j.jconrel.2011,02,005. Preparação de estruturas de dendrímero 4-azidobenzamida-PEG12-NEOEOEN [Su(NPN)2] [Lys]16 [NH2.TFA]32 podem ser encontradas WO08/017122. Procedimentos gerais Procedimento geral A. Instalação de ligantes às drogas A
[185]A uma solução magneticamente agitada de ligante de ácido carboxílico (0.2 - 0,5 mmol) em solvente DMF ou acetonitrila (1 - 5 mL) a 0oC foi adicionado agente de acoplamento com EDC ou DCC (1,2 equivalentes). A mistura foi deixada agitar por 5 min., então uma solução de solvente (1 mL) contendo uma mistura de droga (0,4 - 1 equivalentes) e DMAP (0,4 - 1 equivalentes) foi adicionado sob gotejamento. A mistura foi mantida a 0oC por 1 hora então deixada aquecer em temperatura ambiente. Os voláteis foram então removidos em vácuo e o resíduo purificado por HPLC preparativa (BEH 300 Waters XBridge C18, 5 μM, 30 x 150 mm, 40-80% ACN/água (5-40 min), sem tampão) para gerar o produto desejado. Procedimento geral B. Instalação de ligantes às drogas B
[186]A uma solução magneticamente agitada da droga (0,3 - 1,0 mmol) e anidreto (2 equivalentes) em DMF (3 - 5 mL) foi adicionado DIPEA (3 equivalentes). A mistura foi agitada em temperatura ambiente overnight. Os voláteis foram então removidos em vácuo e o resíduo purificado por HPLC preparativa (BEH 300 Waters XBridge C18, 5 μM, 30 x 150 mm, 40-70% ACN/água (5-40 min), sem tampão, RT = 34 min). As frações apropriadas foram concentradas em vácuo para fornecer o alvo desejado. Procedimento geral C. Carregamento de dendrímero com droga-ligante.
[187]A uma mistura magneticamente agitada de BHALys [Lys]32 [α-NH2.TFA]32 [ε-PEG1100]32 (0,5 — 1,0 μmol) e DIPEA (1,2 equivalentes per amina) em DMF em temperatura ambiente foi adicionado ligante - droga (1,2 equivalentes por grupo de amina) e PyBOP (1,2 equivalentes por grupo de amina). Após 1,5 horas em temperatura ambiente os voláteis foram removidos e o resíduo purificado por SEC (sephadex, LH20, MeOH). As frações apropriadas, como julgado pelo HPLC, foram combinadas e concentradas para fornecer o material desejado. Procedimento Geral D. Reação Click
[188]A uma solução de dendrímero magneticamente agitada (0,5 - 1,0 mmol) em 1:1 H2O/t-BuOH (aproximadamente 0,5 mL) foi adicionado reagente alquino (2 equivalentes), solução de ascorbato de sódio (2 equivalentes) e solução CuSO4 (20 mol%). A solução foi aquecida a 80°C e monitorada por HPLC. Cargas adicionais de ambos ascorbatos de sódio e CuSO4 foram adicionadas como requerido para direcionar a reação até a conclusão. Após a reação ser julgada completa a reação foi concentrada em vácuo e então purificada. Exemplo 1 (a) Preparação de 4-Aba-DTX
Figure img0036
[189] Preparado usando o Procedimento A acima, usando DTX (200 mg, 0,25 mmol) e ácido 4-acetilbutírico (42 mg, 0,32 mmol) como o ligante. HPLC Preparativo (RT = 32 min) forneceu 73 mg (32%) de produto como um sólido branco. LCMS (C8, gradiente: 40-90% ACN/H2O (1-7 min), 90% ACN (7-9 min), 90 40% ACN (9-11 min), 40% ACN (11-15 min), 0,1% TFA) Rt (min) = 7,60. ESI (+ve) observado [M + H]+ = 920. Calculado para C49H61NO16 = 919,40 Da. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm): 1,09 (s, 3H), 1,13 (s, 3H), 1,38 (s, 9H), 1,66 (s, 3H), 1,74-1,97 (m, 7H), 2,10 (s, 3H), 2,12-2,36 (m, 1H), 2,29-2,58 (m, 8H), 3,83 (d, J = 6,9 Hz, 1H), 4,14-4,26 (m, 3H), 4,95-5,05 (m, 2H), 5,18-5,35 (m, 3H), 5,61 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 6,05 (m, 1H), 7,17-7,20 (m, 1H), 7,23-7,45 (m, 4H), 7,52-7,62 (m, 2H), 7,63-7,72 (m, 1H), 8,10 (d, J = 7,2Hz, 2H). (b) Preparação de BHALys [Lys]32 [α-4-HSBA-4Aba-DTX]32 [ε- PEG1100]32
Figure img0037
[190] Preparado usando Procedimento C acima. A uma solução magneticamente agitada de 4-Aba-DTX (15 mg, 16,3 μmol) em MeOH seco (1 mL) foi adicionado TFA (50 μL) e BHALys [Lys]32 [α-4-HSBA]32 [ε-PEG1100]32 (20 mg, 0,43 μmol). A mistura foi deixada agitar durante a noite em temperatura ambiente então adicionada diretamente a uma coluna sephadex (LH20, MeOH) para purificação. As frações apropriadas, como julgado por HPLC, foram combinadas e concentradas para fornecer 25 mg (78%) de material desejado como um sólido branco. HPLC (C8, gradiente: 40-80% ACN/H2O (1-7 min), 80% ACN (7-9 min), 80-40% ACN (9-11 min), 40% ACN (11-15 min), 10 mM formato de amônio) Rt (min) = 6,77. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm): 0,6-2,2 (m, 812H), 2,2-2,5 (m, 115H), 2,9-3,2 (m, 78H), 3,26 (s, 79H), 3,3-3,8 (m, 2824H), 5,1-5,3 (m, 31H), 5,5-5,6 (m, 10H), 5,9-6,1 (m, 9H), 6,9-8,2 (m, 329H). Peso molecular teórico de conjugado: 78,6 kDa. 1H NMR indica 9 DTX/dendrímero. Peso molecular real é aproximadamente 56,4 kDa (13% DTX em peso). Exemplo 2 [1] Preparação de PSSP-DTX:
Figure img0038
[191]Neste exemplo (R1 = R2 = H) este poderia ser vislumbrado que a taxa de liberação de docetaxel poderia ser aumentada ou reduzida aumentando ou reduzindo o grau de impedimento estérico ao redor da ligação dissulfeto (Worrell N. R., Cumber A. J., Parnell G. D., Mirza A., Forrester J. A., Ross W. C. J.: Effect of linkage variation on pharmacokinetics of ricin-A-chainantibody conjugates in normal rats. Anti-Cancer Drug Design 1, 179, 1986). Este poderia ser obtido através da adição de substituintes, entre outros α e ou β à ligação dissulfeto. Este tipo de estratégia de sintonização é geralmente usado nas estratégias de desenho de pró-droga e tem a vantagem do efeito bem conhecido de Thorpe-Ingold ou gem-dimetil (The gem-Dimetil Effect Revisited Steven M. Bachrach, J. Org. Chem. 2008, 73, 2466 2468).
[192] Preparado usando Procedimento A acima, usando DTX (500 mg, 0,62 mmol) e ácido 3,3’-ditiopropanoico (130 mg, 0,62 mmol) como o ligante. HPLC Preparativo (RT = 32 min) forneceu 179 mg (29%) de produto como um sólido branco. LCMS (C8, gradiente: 40-90% ACN/H2O (1-7 min), 90% ACN (7-9 min), 90-40% ACN (9-11 min), 40% ACN (11-15 min), 0,1% TFA) Rf (min) = 7,57. ESI (+ve) observado [M + H]+ = 1000. Calculado para C49H61NO17S2 = 999,34 Da. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm): 1,13(s, 3H), 1,17 (s, 3H), 1,43 (s, 9H), 1,70 (s, 3H), 1,721,99 (m, 6H), 2,13-2,32 (m, 1H), 2,37-2,55 (m, 4H), 2,66-2,76 (m, 2H), 2,76-3,02 (m, 6H), 3,87 (d, J = 6,9 Hz, 1H), 4,184,31 (m, 3H), 5,00-5,06 (m, 3H), 5,24-5,42 (m, 3H), 5,64 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 6,10 (m, 1H), 7,23-7,33 (m, 1H), 7,36-7,48 (m, 4H), 7,53-7,65 (m, 2H), 7,66-7,76 (m, 1H), 8,13 (d, J = 7,2Hz, 2H). [2] Preparação de BHALys [Lys]32 [α-PSSP-DTX]32 [ε-PEG1100]32
Figure img0039
R1 = R2 = H
[193] Preparado usando Procedimento C acima, usando BHALys [Lys]32 [α-NH2.TFA]32 [ε-PEG1100]32 (34 mg, 0,78 μmol) e PSSP-DTX (30 mg, 30 μmol). Purificação por SEC forneceu 50 mg (89%) de material desejado como um sólido branco. HPLC (C8, gradiente: 40-80% ACN/H2O (1-7 min), 80% ACN (7-9 min), 80-40% ACN (9-11 min), 40% ACN (11-15 min), 10 mM formato de amônio) Rf (min) = 7,96 min. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm): 0,7-2,0 (m, 1041H), 2,0-2,2 (m, 15H), 2,2-2,5 (m, 119H), 2,52,7 (m, 31H), 2,7-3,0 (m, 119H), 3,0-3,2 (m, 68H), 3,26 (s, 132H), 3,3-3,8 (m, 2806H), 3,9-4,3 (m, 76H), 5,1-5,3 (m, 55H), 5,5-5,6 (m, 17H), 5,9-6,1 (m, 17H), 7,1-8,1 (m, 243H). Peso molecular teórico de conjugado: 74,9 kDa. 1H NMR indica 17 DTX/dendrímero. Peso molecular real é aproximadamente 56,1 kDa (24% DTX em peso). Exemplo 3 (a) Preparação de DGA-DTX:
Figure img0040
[194] Preparado usando Procedimento B acima, usando DTX (300 mg, 371 μmol) e diglicólico anidreto (86 mg, 742 μmol) como o ligante. HPLC Preparativo (RT = 34 min) forneceu 85 mg (25%) de DGA-DTX como um sólido branco. LCMS (C8, gradiente: 40-90% ACN/H2O (1-7 min), 90% ACN (7-9 min), 90-40% ACN (9-11 min), 40% ACN (11-15 min), 0,1% Ácido fórmico) Rt (min) = 5,90. ESI (+ve) observado [M + H]+ = 924,10. Calculado para C47H57NO18 = 923,36 Da. 1H NMR (300MHz, CDCl3) δ (ppm): 1,11 (s, 3H), 1,21 (s, 3H), 1,33 (s, 9H), 1,58-2,66 (m, 7H), 1,73 (s, 3H), 1,93 (s, 3H), 2,67-3,67 (br s, 5H), 3,73-3,97 (br s, 1H), 4,02-4,68 (m, 7H), 4,96 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 5,24 (s, 1H), 5,35-5,55 (m, 1H), 5,50 (s, 1H), 5,66 (d, J = 6,7 Hz, 1H), 5,95-6,30 (m, 1H), 7,24-7,68 (m, 7H), 8,08 (d, J = 6,9 Hz, 2H). (b) Preparação de BHALys [Lys]32 [α-DGA-DTX]32 [ε-PEG1100]32
Figure img0041
[195] Preparado usando Procedimento C acima, usando BHALys [Lys]32 [α-NH2.TFA]32 [ε-PEG1100]32 (36 mg, 0,84 μmol) e DGA-DTX (30 mg, 33 μmol). Purificação por SEC forneceu 45 mg (79%) de material desejado como um sólido branco. HPLC (C8, gradiente: 40-80% ACN/H2O (1-7 min), 80% ACN (7-9 min), 80-40% ACN (9-11 min), 40% ACN (11-15 min), 10 mM formato de amônio) Rt (min) = 7,69. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm): 1,02,1 (m, 833H), 2,3-2,6 (m, 125H), 3,0-3,3 (m, 68H), 3,5-4,0 (m, 2803H), 4,0-4,7 (m, 214H), 5,0-5,1 (m, 23H), 5,3-5,5 (m, 54H), 5,6-5,8 (m, 19H), 6,0-6,3 (m, 18H), 7,2-7,8 (m, 203H), 8,1-8,2 (m, 46H). Peso molecular teórico de conjugado: 72,4 kDa. 1H NMR indica 18 DTX/dendrímero. Peso molecular real é aproximadamente 55,7 kDa (26% DTX em peso). Exemplo 4 (a) Preparação de Cp-DTX:
Figure img0042
[196] Preparado usando Procedimento A acima, usando DTX (500 mg, 619 μmol) e ácido 3-oxo-1-ciclopentanecarboxílico (79 mg, 619 μmol) como o ligante. HPLC Preparativo (RT = 33,5 min) forneceu Cp-DTX (401 mg, 71%) como um sólido branco. LCMS (C8, gradiente: 40-90% ACN/H2O (1-7 min), 90% ACN (7-9 min), 90-40% ACN (9-11 min), 40% ACN (11-15 min), 0,1% Ácido fórmico) Rt(min) = 6,61. ESI (+ve) observado [M + H]+ = 918,54. Calculado para C49H59NO16 = 917,38 Da. 1H NMR (300MHz, CDCl3) δ (ppm): 1,13 (s, 3H), 1,24 (s, 3H), 1,33 (s, 9H), 1,76 (s, 3H), 1,77-2,01 (m, 3H), 1,95 (s, 3H), 2,11-2,49 (m, 6H), 2,46 (s, 3H), 2,60 (ddd, J = 16,2, 9,9 e 6,9 Hz, 1H), 3,10-3,24 (m, 1H), 3,94 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 4,20 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 4,27 (dd, J = 11,1 e 6,6 Hz, 1H), 4,33 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 4,97 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 5,21 (s, 1H), 5,33 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 5,42 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 5,48-5,58 (br d, J = 9 Hz, 1H), 5,69 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 6,27 (t, J = 8,7 Hz, 1H), 7,25-7,45 (m, 5H), 7,47-7,53 (m, 2H), 7,57-7,64 (m, 1H), 8,09-8,14 (m, 2H). (b) Preparação de 4-HSBA-Cp-DTX:
Figure img0043
[197] Uma solução de DTX-Cp (30 mg, 32,7 μmol) em TFA/MeOH (5% v/v, 1 mL) foi adicionada ao ácido 4- hidrazinosulfonilbenzoico (6 mg, 27,8 μmol). A mistura foi deixada reagir a 38°C por 1,5 h após a qual o solvente foi evaporado em vácuo. O semissólido branco obtido foi usado diretamente na etapa seguinte. (c) Preparação de BHALys [Lys]32 [α-4-HSBA-Cp-DTX]32 [ε- PEG1100]32
Figure img0044
[198] Método A: A uma solução magneticamente agitada de Cp-DTX (7,5 mg, 8,15 μmol) em MeOH seco (1 mL) foi adicionado TFA (50 μL). Esta solução foi adicionada a BHALys [Lys] 32 [α-4- HSBA]32 [ε-PEG1100]32 (10 mg, 0,215 μmol). A mistura foi deixada reagir durante a noite em temperatura ambiente então adicionada diretamente a uma coluna sephadex (LH20, MeOH) para purificação. As frações apropriadas, como julgado por HPLC, foram combinadas, concentradas e liofilizadas para fornecer 18 mg (70%) de material desejado como um sólido branco.
[199] Método B: À 4-HSBA-Cp-DTX (31 mg, 27,8 μmol) e PyBOP (14,5 mg, 27,8 μmol) foi adicionado uma solução de BHALys [Lys]32 [α-NH2.TFA]32 [ε-PEG1100]32 (31,5 mg, 0,7 μmol) e DIPEA (15 μL, 89,0 μmol) em DMF (1 mL). A mistura resultante foi agitada durante a noite em temperatura ambiente após a qual o solvente foi evaporado em vácuo. O óleo amarelo restante foi adicionado a uma coluna sephadex (LH20, MeOH) para purificação. As frações apropriadas, como julgado por HPLC, foram combinadas, concentradas e liofilizadas para fornecer 34 mg (81% em duas etapas) de material desejado como um sólido branco. HPLC (C8, gradiente: 40-80% ACN/H2O (1-7 min), 80% ACN (7-9 min), 80-40% ACN (9-11 min), 40% ACN (11-15 min), 10 mM formato de amônio) Rt (min) = 7,65. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm): 1,12 (s, 44H), 1,16 (s, 44H), 1,212,29 (m, 688H), 2,32-2,53 (m, 113H), 2,80-3,25 (m, 64H), 3,35 (s, 85H), 3,36-3,90 (m, 2815H), 4,17-4,28 (m, 77H), 4,45-4,65 (m, 50H), 4,97-5,04 (m, 23H), 5,22-5,44 (m, 40H), 5,63 (d, J = 6,9 Hz, 16H), 6,00-6,20 (m, 15H), 7,2-8,25 (m, 308H). Peso molecular teórico de conjugado: 78,8 kDa. 1H NMR indica 15 DTX/dendrímero em cada caso. Peso molecular real é de aproximadamente 60,0 kDa (20% DTX em peso). Exemplo 5 (a) Preparação de Glu-DTX:
Figure img0045
[200] Preparado usando Procedimento B acima, usando DTX (300 mg, 371 μmol) e anidreto glutárico (85 mg, 742 μmol) em DMF (3,7 mL) como o ligante. HPLC Preparativo (Rt = 33 min) forneceu 106 mg (31%) de Glu-DTX como um sólido branco. LCMS (C8, gradiente: 40-90% ACN/H2O (1-7 min), 90% ACN (7-9 min), 90-40% ACN (9-11 min), 40% ACN (11-15 min), 0,1% Ácido fórmico) Rt (min) = 6,12. ESI (+ve) observado [M + H]+ = 922,13. Calculado para C48H59NO17 = 921,38 Da. 1H NMR (300MHz, CDCl3) δ (ppm): 1,11 (s, 3H), 1,22 (s, 3H), 1,33 (s, 9H), 1,74 (s, 3H), 1,79-2,65 (m, 14H), 1,93 (s, 3H), 3,91 (d, J = 6,5 Hz, 1H), 4,19 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 4,26 (dd, J = 11,1 e 6,9 Hz, 1H), 4,31 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 4,96 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,23 (s, 1H), 5,38 (br s, 1H), 5,35-5,65 (br d, 1H), 5,67 (d, J = 6,5 Hz, 1H), 6,10-6,30 (s, 1H), 7,26-7,34 (m, 3H), 7,34-7,43 (m, 2H), 7,46-7,55 (m, 2H), 7,57-7,65 (m, 1H), 8,10 (d, J = 7,4 Hz, 2H). (b) Preparação de BHALys [Lys]32 [α-Glu-DTX]32 [ε-PEG1100]32
Figure img0046
[201] Preparado usando Procedimento C acima, usando BHALys [Lys]32 [α-NH2.TFA]32 [ε-PEG1100]32 (50 mg, 1,1 μmol) e Glu- DTX (39 mg, 42,3 μmol). Purificação por coluna sephadex (LH20, MeOH) forneceu 49,5 mg (78%) de material desejado como um sólido branco. HPLC (C8, gradiente: 40-80% ACN/H2O (1-7 min), 80% ACN (7-9 min), 80-40% ACN (9-11 min), 40% ACN (1115 min), 10 mM formato de amônio) Rt (min) = 7,78. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm): 1,00-2,10 (m, 1037H), 2,10-2,74 (m, 296H), 3,05-3,27 (br s, 88H), 3,35 (s, 96H), 3,36-3,78 (m, 2800H), 3,80-3,93 (m, 42H), 4,01-4,47 (m, 125H), 4,47-4,60 (br s, 23H), 4,92-5,08 (br s, 30H), 5,18-5,45 (m, 70H), 5,54 5,74 (br s, 22H), 6,00-6,23 (br s, 20H), 7,15-7,75 (m, 414H), 8,05-8,20 (br d, J = 6,4 Hz, 49H). Peso molecular teórico de conjugado: 72,6 kDa. 1H NMR indica 20 DTX/dendrímero. Peso molecular real é aproximadamente 57,5 kDa (28% DTX em peso). Exemplo 6 (a) Preparação de MIDA-DTX:
Figure img0047
[202] Preparado usando Procedimento A acima, usando DTX (100 mg, 124 μmol) e ácido metiliminodiacético (91 mg, 620 μmol) como o ligante. HPLC Preparativo (RT = 22,5 min) forneceu 29 mg (25%) de produto como um sólido branco. LCMS (C8, gradiente: 40-90% ACN/H2O (1-7 min), 90% ACN (7-9 min), 90-40% ACN (9-11 min), 40% ACN (11-15 min), 0,1% Ácido fórmico) Rt (min) = 4,62. ESI (+ve) observado [M + H]+ = 937,34. Calculado para C48H60N2O17 = 936,39 Da. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm): 1,13 (s, 3H), 1,17 (s, 3H), 1,40 (s, 9H), 1,70 (s, 3H), 1,84 (ddd, J = 14,1, 11,4 e 1,8 Hz, 1H), 1,93 (s, 3H), 2,04 (dd, J = 15,0 e 8,7 Hz, 1H), 2,30 (dd, J = 15,0 e 8,7 Hz, 1H), 2,43 (s, 3H), 2,46 (ddd, J = 14,1, 9,5 e 6,6 Hz, 1H), 2,61 (s, 3H), 3,49 (s, 2H), 3,81-3,94 (m, 3H), 4,21 (s, 2H), 4,24 (dd, J = 11,4 e 6,6 Hz, 1H), 5,01 (dd, J = 9,5 e 1,8 Hz, 1H), 5,29 (s, 1H), 5,43 (s, 2H), 5,65 (d, J =7,2 Hz, 1H), 6,16 (t, J = 8,7 Hz, 1H), 7,21-7,34 (m, 1H), 7,357,50 (m, 4H), 7,51-7,79 (m, 3H), 8,13 (d, J = 7,2 Hz, 2H). (b) Preparação de BHALys [Lys]32 [α-MIDA-DTX]32 [ε-PEG1100]32
Figure img0048
[203] Preparado usando Procedimento C acima, usando BHALys [Lys]32 [α-NH2.TFA] 32 [ε-PEGiioo]32 (31,5 mg, 0,7 μmol) e MIDA-DTX (26 mg, 27,8 μmol). Purificação por SEC forneceu 41,6 mg (93%) de produto desejado como um sólido branco. HPLC (C8, gradiente: 40-80% ACN/H2O (1-7 min), 80% ACN (7-9 min), 80-40% ACN (9-11 min), 40% ACN (11-15 min), 10 mM formato de amônio) Rt (min) = 7,78. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm): 1,00-2,10 (m, 1186H), 2,12-2,68 (m, 283H), 3,06-3,27 (m, 77H), 3,35 (s, 101H), 3,36-3,96 (m, 2842H), 4,07-4,61 (m, 143H), 4,93-5,10 (br s, 31H), 5,19-5,48 (m, 77H), 5,55-5,75 (m, 27H), 5,97-6,29 (m, 27H), 7,10-7,84 (m, 258H), 8,03-8,23 (m, 60H). Peso molecular teórico de conjugado: 73,1 kDa. 1H NMR indica 27 DTX/dendrímero. Peso molecular real é aproximadamente 64,2 kDa (34% DTX em peso). Exemplo 7 (a) Preparação de o-PDA-DTX:
Figure img0049
[204] Preparado usando Procedimento A acima, usando DTX (300 mg, 0,37 mmol) e ácido o-fenilenedioxidiacético (419 mg, 1,85 mmol) como o ligante. HPLC Preparativo (RT = 26 min) forneceu 21 mg (11%) de produto como um sólido branco. LCMS (C8, gradiente: 40-90% ACN/H2O (1-7 min), 90% ACN (7-9 min), 90-40% ACN (9-11 min), 40% ACN (11-15 min), 0,1% Ácido fórmico) Rt (min) = 7,27. ESI (+ve) observado [M + H]+ = 1016,29. Calculado para C53H61NO19 = 1015,38 Da. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm): 1,13 (s, 3H), 1,17 (s, 3H), 1,40 (s, 9H), 1,69 (s, 3H), 1,82 (ddd, J = 13,5, 11,4 e 2,1 Hz, 1H), 1,89 (s, 3H), 1,94-2,07 (m, 1H), 2,00-2,33 (m, 1H), 2,40 (s, 3H), 2,45 (ddd, J = 15,9, 9,6 e 6,6 Hz, 1H), 3,87 (d, J = 6,9 Hz, 1H), 4,18-4,27 (m, 3H), 4,68 (s, 2H), 4,87 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 5,00 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 5,27 (s, 1H), 5,36-5,43 (m, 2H), 5,64 (d, J = 6,9 Hz, 1H), 6,13 (t, J = 9,0 Hz, 1H), 6,86-6,98 (m, 4H), 7,23-7,32 (m, 1H), 7,35-7,43 (m, 4H), 7,52-7,60 (m, 2H), 7,62-7,70 (m, 1H), 8,07-8,15 (m, 2H). (b) Preparação de BHALys [Lys]32 [α-o-PDA-DTX]32 [ε- PEG1100]32
Figure img0050
[205] Preparado usando Procedimento C acima, usando BHALys [Lys]32 [α-NH2.TFA]32 [ε-PEGiioo] 32 (22,5 mg, 0,5 μmol) e o- PDA-DTX (21 mg, 20,7 μmol). Purificação por SEC (sephadex, LH20, MeOH) forneceu 30 mg (95%) do produto desejado como um semissólido ligeiramente bege. HPLC (C8, gradiente: 40-80% ACN/H2O (1-7 min), 80% ACN (7-9 min), 80-40% ACN (9-11 min), 40% ACN (11-15 min), 10 mM formato de amônio) Rt (min) = 9,80. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm): 0,95-2,12 (m, 1058H), 2,12-2,66 (m, 205H), 2,89-3,29 (m, 125H), 3,35 (s, 85H), 3,36-3,93 (m, 2822H), 3,98-4,75 (m, 212H), 4,83-5,08 (m, 89H), 5,18-5,34 (m, 17H), 5,34-5,54 (m, 38H), 5,54-5,79 (m, 22H), 6,01-6,26 (m, 22H), 6,68-7,13 (m, 98H), 7,13-7,78 (m, 214H), 8,02-8,22 (m, 50H). Peso molecular teórico de conjugado: 75,6 kDa. 1H NMR indica 22 DTX/dendrímero. Peso molecular real é aproximadamente 63,2 kDa (28% DTX em peso). Exemplo 8 (a) Preparação de TDA-DTX via Procedimento A:
Figure img0051
[206] Preparado usando Procedimento A acima, usando DTX (500 mg, 0,62 mmol) e ácido 2,2’-tiodiacético (370 mg, 2,5 mmol) como o ligante. HPLC Preparativo (RT = 33 min) forneceu 240 mg (41%) de produto como um sólido branco. LCMS (C8, gradiente: 40-90% ACN/H2O (1-7 min), 90% ACN (7-9 min), 90 40% ACN (9-11 min), 40% ACN (11-15 min), 0,1% TFA) Rt (min) = 10,60. ESI (+ve) observado [M + H]+ = 940. Calculado para C47H57NO17S = 939,33 Da. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm): 1,15 (s, 3H), 1,19 (s, 3H), 1,43 (s, 9H), 1,72 (s, 3H), 1,78-2,05 (m, 2H), 1,93 (s, 3H), 2,16-2,57 (m, 2H), 2,43 (s, 3H), 3,363,63 (m, 2H), 3,89 (d, J = 6,9 Hz, 1H), 4,18-4,34 (m, 3H), 5,03 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 5,28-5,44 (m, 3H), 5,66 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 6,11 (m, 1H), 7,24-7,35 (m, 1H), 7,38-7,50 (m, 4H), 7,52-7,65 (m, 2H), 7,66-7,76 (m, 1H), 8,14 (d, J = 7,2 Hz, 2H). (b) Preparação de TDA-DTX via Procedimento B:
[207] Preparado usando Procedimento B acima, usando DTX (400 mg, 0,50 mmol) e tiodiacético anidreto (66 mg, 0,50 mmol) como o ligante. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante a noite então solvente foi removido em pressão reduzida para gerar um resíduo bruto. The resíduo foi redissolvido em EtOAc (250 mL) e foi lavado com tampão PBS (ajustado para pH 4,0). A camada orgânica separada foi seca em MgSO4 e concentrada em pressão reduzida para gerar 445 mg (95%) do produto desejado como um sólido branco. LCMS (Waters XBridge coluna C8 (3,0 x 100 mm), 3,5 mícron, 214, 243 nm, 0,4 mL/min, gradiente: 40-90% ACN/H2O (1-7 min), 90% ACN (7-9 min), 90-40% ACN (9-11 min), 40% ACN 11-15 min), 0,1% TFA) Rt (min) = 10,60. ESI (+ve) observado [M + H]+ = 940. Calculado para C47H57NO17S = 939,33 Da. (c) Preparação de BHALys [Lys]32 [α-TDA-DTX]32 [ε-PEG1100]32
Figure img0052
[208] Preparado usando Procedimento C acima, usando BHALys [Lys]32 [α-NH2.TFA]32 [ε-PEGiioo] 32 (4 6 mg, 1,08 μmol) e TDA-DTX (44 mg, 47 μmol). Purificação por SEC (sephadex, LH20, MeOH) forneceu 65 mg (87%) de material desejado como um sólido branco. HPLC (C8, gradiente: 40-80% ACN/H2O (1-7 min), 80% ACN (7-9 min), 80-40% ACN (9-11 min), 40% ACN (11-15 min), 10 mM formato de amônio) Rt (min) = 9,68. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm): 0,78-2,02 (m, 809H), 2,27-2,58 (m, 114H), 3,03-3,24 (m, 43H), 3,34 (s, 73H), 3,37-3,96 (m, 2800H), 4,01-4,39 (m, 27H), 5,20-5,48 (m, 75H), 5,54-5,74 (m, 23H), 5,98-6,25 (m, 20H), 7,12-7,84 (m, 202H), 8,01-8,22 (m, 46H). Peso molecular teórico de conjugado: 68,9 kDa. 1H NMR indica 23 DTX/dendrímero. Peso molecular real é aproximadamente 60,6 kDa (31% DTX em peso). Tamanho de partícula usando Dynamic Light Scattering mostra uma faixa de médias dependentes da concentração de 8,9 - 10,1 nm. Exemplo 9 (a) Preparação de PDT-DTX:
Figure img0053
[209] Preparado usando Procedimento A acima, usando DTX (250 mg, 0,31 mmol) e ácido 3,4-propilenodioxitiofeno-2,5- dicarboxílico (PDT, 75 mg, 0,31 mmol) como o ligante. Purificação por HPLC Preparativo (RT = 28 min) forneceu 30 mg (9%) de produto como um sólido branco. LCMS (C8, gradiente: 40-90% ACN/H2O (1-7 min), 90% ACN (7-9 min), 90-40% ACN (9-11 min), 40% ACN (11-15 min), 0,1% TFA) Rt (min) = 7,24. ESI (+ve) observado [M + H]+ = 1034. Calculado para C52H59NO19S = 1033,34 Da. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm): 1,14 (s, 3H), 1,18 (s, 3H), 1,45 (s, 9H), 1,71 (s, 3H), 1,78-1,91 (m, 2H), 1,94 (s, 3H), 2,09-2,27 (m, 1H), 2,29-2,58 (m, 3H), 2,41 (s, 3H), 3,88 (d, J = 6,9 Hz, 1H), 4,20-4,30 (m, 3H), 4,31-4,43 (m, 4H), 4,94-5,16 (m, 1H), 5,30 (s, 1H), 5,36-5,42 (m, 2H), 5,65 (d, J = 6,9 Hz, 1H), 6,02-6,22 (m, 1H), 7,23-7,34 (m, 1H), 7,36-7,53 (m, 4H), 7,56-7,65 (m, 2H), 7,66-7,77 (m, 1H), 8,11 (d, J = 7,2Hz, 2H). (b) Preparação de BHALys [Lys]32 [α-PDT-DTX]32 [ε-PEG1100]32
Figure img0054
[210] Preparado usando Procedimento C acima, usando BHALys [Lys]32 [α-NH2.TFA] 32 [ε-PEGiioo] 32 (29 mg, 0,67 μmol) e PDT-DTX (30 mg, 29 μmol). Purificação por SEC (sephadex, LH20, MeOH) forneceu 42 mg (88%) de material desejado como um sólido branco. HPLC (C8, gradiente: 40-80% ACN/H2O (1-7 min), 80% ACN (7-9 min), 80-40% ACN (9-11 min), 40% ACN (11-15 min), 10 mM formato de amônio) Rt (min) = 9,03. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm): 0,76-2,10 (m, 974H), 2,23-2,66 (m, 210H), 3,08-3,30 (m, 74H), 3,40-3,98 (m, 2804H), 4,02-4,76 (m, 249H), 4,96-5,12 (m, 33H), 5,22-5,34 (m, 25H), 5,36-5,52 (m, 47H), 5,56-5,80 (m, 27H), 5,88-6,30 (m, 24H), 7,08-7,94 (m, 213H), 7,99-8,31 (m, 50H). Peso molecular teórico de conjugado: 71,9 kDa. 1H NMR indica 26 DTX/dendrímero. Peso molecular real é aproximadamente 66,3 kDa (32% DTX em peso). Exemplo 10 (a) Preparação de PEG2-DTX:
Figure img0055
[211] Preparado usando Procedimento A acima, usando DTX (200 mg, 0,25 mmol) e ácido 3,6,9-trioxaundecanedioico (220 mg, 1,0 mmol). HPLC Preparativo (RT = 30,5 min) forneceu 70 mg (28%) de produto como um sólido branco. LCMS (C8, gradiente: 40-90% ACN/H2O (1-7 min), 90% ACN (7-9 min), 90 40% ACN (9-11 min), 40% ACN (11-15 min), 0,1% Ácido fórmico) Rt (min) = 6,48. ESI (+ve) observado [M + H]+ = 1012,15. Calculado para C51H65NO20 = 1011,41 Da. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm): 1,13 (s, 3H), 1,17 (s, 3H), 1,40 (s, 9H), 1,70 (s, 3H), 1,83 (ddd, J = 13,8, 11,1 e 2,1 Hz, 1H), 1,93 (s, 3H), 1,92-2,12 (m, 1H), 2,17-2,38 (m, 1H), 2,42 (s, 3H), 2,46 (ddd, J = 14,7, 9,9 e 6,6 Hz, 1H), 3,56-3,82 (m, 8H), 3,88 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 4,06 (s, 2H), 4,16-4,39 (m, 5H), 5,01 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 5,29 (s, 1H), 5,38 (s, 2H), 5,65 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 6,13 (t, J = 8,4 Hz, 1H), 7,22-7,33 (m, 1H), 7,35-7,47 (m, 4H), 7,51-7,62 (m, 2H), 7,62-7,72 (m, 1H), 8,13 (d, J = 7,2 Hz, 2H). (b) Preparação de BHALys [Lys]32 [α-PEG2-DTX]32 [ε-PEG1100]32
Figure img0056
[212] Preparado usando Procedimento C acima, usando BHALys [Lys]32 [α-NH2.TFA]32 [ε-PEGiioo] 32 (55, 8 mg, 1,24 μmol) e PEG2-DTX (50 mg, 49,5 μmol). Purificação por SEC (sephadex, LH20, MeOH) forneceu 79 mg (>90%) do produto desejado como um sólido branco. HPLC (C8, gradiente: 40-80% ACN/H2O (1-7 min), 80% ACN (7-9 min), 80-40% ACN (9-11 min), 40% ACN (11-15 min), 10 mM formato de amônio) Rf (min) = 8,65. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm): 0,91-2,14 (m, 968H), 2,14-2,64 (m, 185H), 2,88-3,29 (m, 109H), 3,35 (s, 89H), 3,36-3,95 (m, 3016H), 3,95-4,65 (m, 251H), 5,00 (br s, 32H), 5,20-5,49 (m, 72H), 5,55-5,75 (m, 25H), 6,13 (br s, 25H), 7,12-7,81 (m, 213H), 8,13 (d, J = 7,2 Hz, 50H). Peso molecular teórico de conjugado: 75,5 kDa. 1H NMR indica 24 DTX/dendrímero. Peso molecular real é aproximadamente 63,2 kDa (31% DTX em peso). Exemplo 11 Preparação de BHALys [Lys]32 [α-Lys(α-Ac)(ε-DGA-DTX)]32 [ε- Lys(PEG570)2]32 (a) Preparação de HO-Lys(NH2.TFA)2
Figure img0057
[213]A uma suspensa magneticamente agitada de L-lisina (500 mg, 3,42 mmol) em CH2Cl2 (21 mL) foi adicionado uma solução de TFA em CH2Cl2 (21 mL, 1:1 v/v). A mistura foi agitada em temperatura ambiente for 4 h, e então concentrada em vácuo. O resíduo foi dissolvido em água (30 mL) e concentrado em vácuo. Este procedimento foi repetido uma vez mais. O óleo restante foi então liofilizado, gerando 1,33 g do produto desejado como um óleo amarelado que foi usado diretamente na etapa seguinte. (b) Preparação de HO-Lys(PEG570)2
Figure img0058
[214]A uma solução magneticamente agitada de PEG570-NHS (1,06 g, 1,55 mmol) em DMF (5 mL) foi adicionado DIPEA (806 μL, 4,64 mmol), seguido por uma solução de HO-Lys(NH2.TFA)2 (300 mg) em DMF (4 mL). A mistura resultante foi agitada em temperatura ambiente durante a noite. Os voláteis foram então removidos em vácuo e o resíduo purificado por HPLC Preparativo (BEH 300 Waters XBridge C18, 5 μM, 30 x 150 mm, gradiente: 5% ACN/H2O (1-5 min), 5-60% ACN (5-35 min), 60-80% ACN (35-40 min), 80% ACN (40-45 min), 80-5% ACN (45-50 min), 5% ACN (50-60 min), sem tampão, Rt = 29,3 min). As frações apropriadas foram concentradas em vácuo e liofilizadas em água, gerando 481 mg (48% em duas etapas) do produto desejado como um semissólido branco. HPLC (C18, gradiente: 5-60% ACN/H2O (1-10 min), 60% ACN (10-11 min), 60-5% ACN (11-13 min), 5% ACN (13-15 min), 10 mM formato de amônio) Rt (min) = 8,68. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm): 1,33-1,62 (m, 4H), 1,62-1,95 (m, 2H), 2,43 (t, J = 6,2 Hz, 2H), 2,52 (dt, J = 6,2 e 3,6 Hz, 2H), 3,16-3,24 (m, 2H), 3,36 (s, 6H), 3,36-3,90 (m, 95H), 4,39 (dd, J = 8,7 e 5,1 Hz, 1H). (c) Preparação de BHALys [Lys]16 [Lys(α-Boc)(ε-NH2]32
[215]A uma suspensão magneticamente agitada de BHALys [Lys]16 [Lys(α-Boc)(ε-Fmoc)]32 (500 mg, 26,9 μmol) em DMF (3,4 mL) foi adicionado piperidina (849 μL, 20% v/v in DMF). A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante a noite, então vertida em éter dietil (65 mL). O precipitado branco que se formou foi filtrado e lavado com éter dietil (100 mL). A torta filtro foi transferida a um frasco e seco em ar por 3 dias, gerando 281 mg (91%) de produto como um sólido branco. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm): 1,00-2,10 (m, 680H), 2,65-2,88 (br s, 48H), 2,91-2,98 (m, 11H), 2,99-3,28 (m, 78H), 3,81-4,21 (m, 33H), 4,21-4,55 (m, 32H), 6,21 (s, 1H), 7,20-7,41 (m, 10H). (d) Preparação de BHALys [Lys]32 [α-Boc]32 [ε-Lys(PEG570)2]32
[216]A uma solução magneticamente agitada de BHALys [Lys]16 [Lys(α-Boc)(ε-NH2)]32 (49 mg, 4,33 μmol) em DMF e DMSO (3 mL, 5:1 v/v) foi adicionado DIPEA (96 μL, 554,2 μmol). A solução resultante foi adicionado a uma solução de HO-Lys(PEG570)2 (223 mg, 173,3 μmol) e PyBOP (90 mg, 173,3 μmol) em DMF (5,5 mL). A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante a noite. Os voláteis foram então removidos em vácuo e o resíduo purificado por ultrafiltração (Pall Minimate™ Filtração de Fluxo Tangencial Capsules, Omega™ 10K Membrane, água). A solução aquosa restante foi liofilizada, gerando 120 mg (53%) do produto desejado como um óleo amarelado. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm): 1,18-1,98 (m, 863H), 2,38-2,63 (m, 123H), 3,04-3,30 (m, 194H), 3,36 (s, 172H), 3,38-3,91 (m, 2816H), 3,93-4,18 (br s, 35H), 4,18-4,47 (m, 63H), 4,47-4,60 (m, 12H), 6,18 (s, 1H), 7,19-7,43 (m, 10H). (e) Preparação de BHALys [Lys]32 [α-NH2.TFA]32 [ε- Lys(PEG570) 2]32
[217]A uma solução magneticamente agitada de BHALys [Lys]32 [α-Boc]32 [ε-Lys(PEG57o)2] 32 (120 mg, 2,3 μmol) em CH2Cl2 (2 mL) foi adicionado uma solução de TFA em CH2Cl2 (2 mL, 1:1 v/v). A mistura foi agitada em temperatura ambiente por 3,5 h, após a qual os solventes foram removidos em vácuo. O óleo restante foi dissolvido em água (5 mL) e a solução resultante concentrada em vácuo. Este procedimento foi repetido uma vez mais e o óleo que permaneceu foi tomado em água e purificado por SEC (PD-10 colunas de dessalinização, GE Healthcare, 17-0851-01, meio sephadex G-25). As frações coletadas foram combinadas e liofilizadas para fornecer 93 mg (77%) de material desejado como um óleo amarelado. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm): 1,18-2,01 (m, 556H), 2,38-2,65 (m, 118H), 3,02-3,30 (m, 181H), 3,36 (s, 178H), 3,38-3,94 (m, 2816H), 4,09-4,55 (m, 63H), 6,13-6,22 (m, 1H), 7,19-7,45 (m, 10H). (f) Preparação de BHALys [Lys]32 [α-Lys(α-Ac)(ε-Boc)]32 [ε- Lys(PEG570)2]32
[218]A uma solução de BHALys [Lys]32 [α-NH2.TFA]32 [ε- Lys(PEG570)2]32 (93 mg, 1,8 μmol) em DMF (3,6 mL) foi adicionado DIPEA (40 μL, 230,4 μmol). A solução resultante foi adicionada ao sólido HO-Lys(α-Ac)(ε-Boc) (21 mg, 72 μmol) e PyBOP (37 mg, 72 μmol) contido em um segundo frasco. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante a noite. Os voláteis foram então removidos em vácuo e o resíduo purificado por SEC (sephadex, LH20, MeOH). As frações apropriadas, como julgado por HPLC foram combinadas e concentradas. O óleo amarelado assim obtido foi liofilizado seco de água para gerar 97 mg (94%) do produto desejado como um semissólido ligeiramente amarelada. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm): 1,10-2,15 (m, 1139H), 2,36-2,63 (m, 120H), 2,93-3,30 (m, 251H), 3,36 (s, 195H), 3,37-3,91 (m, 2816H), 4,16-4,51 (br s, 122H), 6,15-6,21 (m, 1H), 7,18-7,43 (m, 10H). (g) Preparação de BHALys [Lys]32 [α-Lys(α-Ac)(ε- NH2.TFA)]32 [ε-Lys(PEG570)2]32
[219]A uma solução magneticamente agitada de BHALys [Lys]32 [α-Lys(α-Ac)(ε-Boc)]32 [ε-Lys(PEG570)2]32 (97 mg, 1,69 μmol) em CH2CI2 (1 mL) foi adicionado uma solução de TFA em CH2Cl2 (2 mL, 1:1 v/v). A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante a noite, e então os solventes foram evaporados em vácuo. O óleo restante foi dissolvido em água (4 mL) e a solução resultante concentrada em vácuo. Este procedimento foi repetido uma vez mais e o óleo que permaneceu foi tomado em água e purificado por SEC (PD-10 colunas de dessalinização, GE Healthcare, 17-0851-01, meio sephadex G-25). As frações coletadas foram combinadas e liofilizadas para fornecer 104 mg (>90%) de material desejado como um óleo amarelado. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm): 1,132,20 (m, 843H), 2,37-2,65 (m, 122H), 2,89-3,06 (m, 70H), 3,06-3,30 (m, 180H), 3,36 (s, 182H), 3,39-3,92 (m, 2816H), 4,08-4,47 (br s, 126H), 6,13-6,20 (m, 1H), 7,20-7,45 (m, 10H). (h) Preparação de BHALys [Lys]32 [α-Lys(α-Ac)(ε-DGA- DTX)]32 [ε-Lys(PEG570)2]32
Figure img0059
[220] Preparado usando Procedimento C acima, usando BHALys [Lys]32 [α-Lys(α-Ac)(ε-NH2.TFA)]32 [ε-Lys(PEG570)2]32 (49 mg, 0,85 μmol) e DGA-DTX (31 mg, 34 μmol). Purificação por SEC (sephadex, LH20, MeOH) forneceu 57 mg (>80%) do produto desejado como um sólido branco. HPLC (C8, gradiente: 40-80% 80% ACN (7-9 min), 80-40% ACN (9-11 min), 40% ACN (11-15 min), 10 mM formato de amônio) Rt (min) = 8,85 . 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm): 0,79-2,73 (m, 1698H), 3,063,29 (m, 179H), 3,35 (s, 184H), 3,36-3,92 (m, 2848H), 3,95-4,60 (m, 332H), 5,01 (br s, 32H), 5,20-5,52 (m, 77H), 5,64 (br s, 30H), 6,13 (br s, 27H), 7,14-7,34 (m, 39H), 7,34-7,52 (m, 104H), 7,52-7,76 (m, 87H), 8,02-8,24 (m, 57H). Peso molecular teórico de conjugado: 83,3 kDa. 1H NMR indica 27 DTX/dendrímero. Peso molecular real é aproximadamente 78,8 kDa (28% DTX em peso). Exemplo 12 Preparação de BHALys [Lys]32 [α-Glu-PTX]32 [ε-PEG2300]32 PTX = Paclitaxel
Figure img0060
[221]Preparado usando Procedimento C acima, usando GluPTX (300 mg, 371 μmol) e BHALys [Lys]16 [Lys(α-NH2.TFA)(ε- PEG23OO)] 32 (22,0 mg, 0,26 μmol). Purificação por HPLC Preparativo (Rt = 28 min) forneceu 12 mg (41%) do dendrímero desejado. 1H NMR (CD3OD): δ 0,78-2,80 (m, 1785H), 2,96-3,23 (m, 120H), 3,35-3,45 (m, 567H), 3,46-3,94 (m, 5610H), 4,04- 4,47 (m, 167H), 4,48-4,65 (m, 88H), 5,50 (m, 29H), 5,64 (m, 24H), 5,85 (m, 27H), 6,10 (m, 26H), 6,46 (m, 20H), 7,26 (m, 66H), 7,36-8,00 (m, 407H), 8,12 (s, 53H). Peso molecular teórico de conjugado: 112,4 kDa. 1H NMR indica 25 PTX/dendrímero. Peso molecular real é aproximadamente 105 kDa (20% PTX em peso). Exemplo 13 Preparação de BHALys [Lys]32 [α-Glu-GEM]32 [ε-PEG1100]32 GEM = gencitabina (a) Preparação de N,O-di-BOC-GEM-Glu
Figure img0061
[222]A uma mistura agitada de N,O-diBoc gemicitabina (Guo, Z.; Gallo, J. M. Selective Protection of 2’,2’Difluorodeoxycytidine J. Org. Chem, 1999, 64, 8319-8322) (200 mg, 0,43 mmol) em DMF (2 mL) a 0oC foi adicionado DIPEA (0,4 mL, 2,15 mmol) e anidreto glutárico (100 mg, 0,86 mmol). A reação foi deixada aquecer até temperatura ambiente por 1 hora, então agitada por outras 3 horas. O DMF foi então removido em vácuo e resíduo foi tomado em acetato de etila (20 mL). Esta mistura foi então lavada com NaHCO3 (10%, 2 x 10 mL), água (2 x 20 mL) e salmoura (20 mL). A fase orgânica foi então seca (Na2SO4), filtrada, e concentrada em pressão reduzida. O bruto foi então purificado por cromatografia em sílica gel (DCM/Metanol) gerando 130 mg (54%) do produto desejado como um sólido branco. LCMS (C18, gradiente: 20-60% ACN/H2O (1-7 min), 60% ACN (7-9 min), 60-20% ACN (9-11 min), 20% ACN (11-15 min), 0,1% TFA, Rt (min) = 10,8min. ESI (+ve) observado [M + H]+ = 578. Calculado para C24H32N3F2O11 = 576,20 Da. 1H NMR (CDCl3): δ 1,51 (s, 18H), 2,01-1,88 (m, 2H), 2,552,4 (m, 2H), 2,75-2,64 (m, 2H), 4,46-4,38 (m, 3H), 5,15-5,10 (m, 1H), 6,46-6,30 (m, 1H), 7,36-7,50 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,6-7,79 (d, J = 7,8 Hz, 1H). (b) Preparação de BHALys [Lys]32 [α-Glu-GEM]32 [ε-PEG1100]32
Figure img0062
[223] Preparado usando Procedimento C acima, usando BHALys [Lys]16 [Lys(α-NH2.TFA)(ε-PEG)1100]32 (40 mg, 1,03 mmol) e N,O-di-Boc-GEM-Glu (28 mg, 49 μmol). Purificação por SEC (PD- 10 coluna de dessalinização, GE Healthcare, 17-0851-01, meio sephadex G-25) forneceu 20 mg de material. O sólido foi tomado em TFA/DCM (1:1, 2 mLs) e agitado por 3 horas em temperatura ambiente. Os voláteis foram removidos em vácuo e o resíduo tomado em água e liofilizados, gerando 18 mg (47%) de pó branco. HPLC (C8, gradiente: 40-80% ACN/H2O (1-7 min), 80% ACN (7-9 min), 80-40% ACN (9-11 min), 40% ACN (11-15 min), 0,1% TFA), Rt (min) = 6,06. 1H NMR (CD3OD): δ 0,89-2,1 (m, 456H), 2,1-2,7 (m, 185H), 2,9-3,2 (m, 90H), 3,2-3,3 (m, 191H), 3,44-4,12 (m, 2650H), 4,14-4,70 (m, 160H), 5,8-6,0 (m, 28H), 6,2-6,4 (m, 28H), 7,05-7,15 (s, 11H), 7,5-7,7 (m, 24H). Peso molecular teórico de conjugado: 59,2 kDa. 1H NMR indica 26 GEM/dendrímero. Peso molecular real é aproximadamente 52,3 kDa (15% GEM em peso). Exemplo 14 (a) Preparação de BHALys [Lys]32 [α-GGG-Boc]32 [ε-PEG1100]32
Figure img0063
[224]A uma solução magneticamente agitada de Boc-GGG-OH (28 mg, 93,2 μmol) e PyBOP (48 mg, 93,2 μmol) em DMF (1 mL) em temperatura ambiente foi adicionado uma solução de BHALys [Lys]32 [α-NH2.TFA]32 [ε-PEG1100]32 (100 mg, 2,33 μmol) e DIPEA (51 μL, 298,24 μmol) em DMF (2,6 mL). A mistura foi agitada em temperatura ambiente for 18 h e então concentradas em pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em MeOH (1 mL) e purificado por SEC (Sephadex, LH-20, MeOH). As frações apropriadas, como julgado por HPLC, foram combinadas e concentradas para fornecer 98 mg de produto como um óleo claro incolor. O último foi dissolvido em água MQ e liofilizado para gerar 98 mg (87%) de produto como uma resina incolor.LCMS (C8, gradiente: 5-80% ACN/H2O (1-7 min), 80% ACN (7-12 min), 80-5% ACN (12-13 min), 5% ACN (13-15 min), 0,1% TFA) Rt (min) = 8,63. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm): 1,152,01 (m, 693H), 2,46 (br s, 57H), 3,18 (br s, 101H), 3,35 (s, 53H), 3,36 (s, 84H), 3,38-4,04 (m, 2990H), 4,30 (br s, 63H), 6,17 (br s, 1H), 7,29 (br s, 9H). 1H NMR indica ca. 32 Boc- GGG/dendrímero. Peso molecular é aproximadamente 48,5 kDa. (b) Preparação de BHALys [Lys]32 [α-GGG-NH2.TFA]32 [ε- PEG1100]32
Figure img0064
[225]A uma mistura magneticamente agitada de BHALys [Lys]32 [α-GGG-Boc]32 [ε-PEGiioo] 32 (98 mg, 2,02 μmol) em CH2Cl2 (1 mL) em temperatura ambiente foi adicionado uma solução de TFA em CH2Cl2 ( 1:1, 2 mL). Após 18 horas em temperatura ambiente os voláteis foram removidos. O resíduo resultante foi dissolvido em água MQ (15 mL) e concentrado. Este procedimento foi repetido uma vez mais. O resíduo foi então dissolvido em água MQ (12,5 mL) e purificado por SEC (PD-10, água MQ). As frações apropriadas foram combinadas e liofilizadas para fornecer 92 mg (94%) de material desejado como óleo claro, incolor. HPLC (C8, gradiente: 5-80% ACN/H2O (1-7 min), 80% ACN (7-12 min), 80-5% ACN (12-13 min), 5% ACN (13-15 min), 0,1% TFA) Rt (min) = 7,94. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm): 1,19-2,05 (m, 351H), 2,47 (br s, 58H), 3,18 (br s, 105H), 3,36 (s, 89H), 3,38-4,15 (m, 2990H), 4,31 (br s, 72H), 6,17 (br s, 1H), 7,30 (br s, 9H). 1H NMR indica ca. 32 GGG-NH2.TFA/dendrímero. Peso molecular é de aproximadamente 48,6 kDa. (c) Preparação de BHALys [Lys]32 [α-GGG-Glu-DTX]32 [ε- PEG1100]32
Figure img0065
[226] Preparado usando Procedimento C acima, usando BHALys [Lys]32 [α-GGG-NH2.TFA]32 [ε-PEG1100]32 (75 mg, 1,53 μmol) e Glu-DTX (56 mg, 61,2 μmol). Purificação por SEC (Sephadex, LH-20, MeOH) forneceu 96 mg (92%) de produto como um sólido branco. HPLC (C8, gradiente: 5-80% ACN/H2O (1-7 min), 80% ACN (7-12 min), 80-5% ACN (12-13 min), 5% ACN (13-15 min), 0,1% TFA) Rt (min) = 10,08. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm): 0,752,02 (m, 985H), 2,02-2,64 (m, 309H), 2,92-3,17 (m, 53H), 3,25 (s, 89H), 3,26-4,00 (m, 3070H), 4,00-4,40 (m, 174H), 4,82-5,00 (m, 44H), 5,04-5,39 (m, 87H), 5,54 (br s, 27H), 6,01 (br s, 22H), 7,03-7,67 (m, 227H), 7,92-8,10 (m, 49H). Peso molecular teórico de conjugado: 73,9 kDa. 1H NMR indica 32 GGG e 26 DTX/dendrímero. Peso molecular real é aproximadamente 68,5 kDa (31% DTX em peso). Exemplo 15 (a) Preparação de BHALys [Lys]32 [α-GFLG-Boc]32 [ε-PEG1100]32
Figure img0066
[227]A uma solução magneticamente agitada de Boc-GLFG-OH (32 mg, 65,2 μmol) e PyBOP (34 mg, 65,2 μmol) em DMF (1 mL) em temperatura ambiente foi adicionado uma solução de BHALys [Lys]32 [α-NH2.TFA]32 [ε-PEG1100]32 (70 mg, 1,63 μmol) e DIPEA (36 μL, 208,64 μmol) em DMF (1,5 mL). A mistura foi agitada em temperatura ambiente for 18 h e então concentrada em pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em MeOH (1 mL) e purificado por SEC (Sephadex, LH-20, MeOH). As frações apropriadas, como julgado por HPLC, foram combinadas e concentradas para fornecer 77 mg (88%) de produto como óleo claro, incolor. HPLC (C8, gradiente: 5-80% ACN/H2O (1-7 min), 80% ACN (7-12 min), 80-5% ACN (12-13 min), 5% ACN (13-15 min), 0,1% TFA) Rt (min) = 9,14. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm): 0,63-1,06 (m, 211H), 1,06-2,11 (m, 789H), 2,32-2,62 (m, 61H), 2,88-3,28 (m, 148H), 3,36 (s, 95H), 3,37-4,00 (m, 2920H), 4,17-4,69 (m, 132H), 7,23 (br s, 140H). 1H NMR indica ca. 30 Boc-GLFG/dendrímero. Peso molecular é aproximadamente 53,8 kDa. (b) Preparação de BHALys [Lys]32 [α-GFLG-NH2.TFA]32 [ε- PEG1100]32
Figure img0067
[228]A uma mistura magneticamente agitada de BHALys [Lys]32 [α-GFLG-Boc]32 [ε-PEGiioo] 32 (77 mg, 1,43 μmol) em CH2Cl2 (1 mL) em temperatura ambiente foi adicionado uma solução de TFA em CH2Cl2 ( 1:1, 2 mL). Após 3 horas em temperatura ambiente os voláteis foram removidos. O resíduo resultante foi dissolvido em água MQ (15 mL) e concentrado. Este procedimento foi repetido uma vez mais. The resíduo foi então dissolvido em água MQ (15 mL) e liofilizado para fornecer 76 mg (99%) de material desejado como uma resina amarelada.HPLC (C8, gradiente: 5-80% ACN/H2O (1-7 min), 80% ACN (7-12 min), 80-5% ACN (12-13 min), 5% ACN (13-15 min), 0,1% TFA) Rt (min) = 8,08. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm): 0,75-1,04 (m, 197H), 1,10-2,09 (m, 480H), 2,45 (m, 56H), 2,88-3,29 (m, 146), 3,35 (s, 90H), 3,37-4,05 (m, 2920H), 4.17- 4,69 (m, 133H), 7,66 (s, 159H). Peso molecular teórico de conjugado: 68,9 kDa. 1H NMR indica ca. 30 GFLG- NH2.TFA/dendrímero. Peso molecular é aproximadamente 54,1 kDa. (c) Preparação de BHALys [Lys]32 [α-GFLG-Glu-DTX]32 [ε- PEG1100]32
Figure img0068
[229] Preparado usando Procedimento C acima, usando BHALys [Lys]32 [α-GFLG-NH2.TFA]32 [ε-PEG1100]32 (61 mg, 1,13 μmol) e Glu-DTX (42 mg, 45,60 μmol). Purificação por SEC (Sephadex, LH-20, MeOH) forneceu 68 mg (85%) de produto como um sólido branco. HPLC (C8, gradiente: 5-80% ACN/H2O (1-7 min), 80% ACN (7-12 min), 80-5% ACN (12-13 min), 5% (ACN 13-15 min), 0,1% TFA) Rt (min) = 10,16. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm): 0,85 (s, 173H), 0,99-2,13 (m, 1153H), 2,15-2,62 (m, 312H), 2,91- 3,27(m, 128H), 3,35 (s, 93), 3,36-4,00 (m, 2970H), 4,05-4,68 (m, 237H), 4,94-5,07 (m, 32H), 5,15-5,47 (m, 76H), 5,52-5,76 (m, 24H), 5,97-6,26 (s, 21H), 6,99-7,77 (m, 380H), 7,98-8,24 (m, 48H). Peso molecular teórico de conjugado: 80,4 kDa. 1H NMR indica 30 GLFG e 22 DTX/dendrímero. Peso molecular real é aproximadamente 70,6 kDa (25% DTX em peso). Exemplo 16 Preparação de BHALys [Lys]32 [α-GILGVP-Glu-DTX]32 [ε- PEG1100]32
Figure img0069
[230] Preparado usando Procedimento C acima, BHALys [Lys]32 [ε-GILGVP-NH.TFA]32 [α-PEGiioo] 32 (52 mg, 0,86 μmol) e Glu-DTX (34 mg, 36 μmol). Purificação por SEC (sephadex, LH20, MeOH) forneceu 59 mg (80%) de material desejado como um sólido incolor higroscópico. HPLC (C8, gradiente: 5-80% ACN/H2O (1-7 min), 80% ACN (7-12 min), 80-5% ACN (12-13 min), 5% ACN (13-15 min), 0,1% TFA buffer) Rt (min) = 10,45. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm): 0,84-1,91 (m, 1808H), 2,41 (s, 287H), 3,12-3,20 (m, 106H), 3,35 (bd, 166H), 3,37-3,90 (m, 2800H), 4,10-4,40 (bm, 194H), 4,53 (s, 88H), 4,98-5,03 (m, 35H), 5,24-5,40 (m, 80H), 5,60-5,68 (m, 26H), 6,08-6,16 (m, 21H), 7,25-7,88 (m, 288H), 8,08-8,16 (m, 86H). Peso molecular teórico de conjugado: 85,6 kDa. 1H NMR indica 30 DTX/dendrímero. Peso molecular real é aproximadamente 83,2 kDa (29% DTX em peso). Exemplo 17 Preparação de BHALys [Lys]32 [α-GILGVP-Glu-DTX]32 [ε-t- PEG2300]32
Figure img0070
[231] Preparado usando Procedimento C acima, usando BHALys [Lys]32 [α-GILGVP-NH2.TFA]32 [ε-t-PEG2300]32 (59 mg, 0,57 μmol) e Glu-DTX (23 mg, 25 μmol) e PyBOP (13 mg, 25 μmol) Purificação por SEC (sephadex, LH20, MeOH) forneceu 65 mg desejado como um sólido incolor higroscópico. HPLC (C8, gradiente: 5-80% ACN/H2O (1-7 min), 80-5% ACN (12-13 min), 5% ACN (13-15 min), 0,1% TFA buffer) Rt (min) = 9,22. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm): 0,86-2,50 (m, 2622H), 3,35-3,88 (m, 5540H), 4,18-4,30 (bm, 263H), 4,50-4,58 (m, 149H), 4,96-5,04 (m, 42H), 5,24-5,38 (m, 77H), 5,62-5,68 (m, 29H), 6,08-6,14 (m, 28H), 7,25-7,70 (m, 234H), 8,10-8,15 (m, 63H). Peso molecular teórico de conjugado: 127,3 kDa. 1H NMR indica 27 DTX/dendrímero. Peso molecular real é aproximadamente 123,7 kDa (18% DTX em peso). Exemplo 18 Preparação de BHALys [Lys]32 [α-PEG1100]32 [ε-TDA-DTX]32
Figure img0071
[232] Preparado usando Procedimento C acima, usando BHALys [Lys]32 [ε-NH2.TFA]32 [α-PEG1100]32 (57,5 mg, TDA-DTX (52,3 mg, 56 μmol). Purificação por SEC (sephadex, LH20, MeOH) forneceu 70 mg (92%) de material desejado como um sólido incolor higroscópico. HPLC (C8, gradiente: 5-80% ACN/H2O (1-7 min), 80% ACN (7-12 min), 80-5% ACN (12-13 min), 5% ACN (13-15 min), 0,1% TFA buffer) Rt (min) = 9,89. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm): 1,06-1,95 (m, 784H), 2,36-2,55 (m, 168H), 3,04-3,23 (m, 48H), 3,33 (s, 84H), 3,35-3,89 (m, 2800H), 4,13-4,40 (m, 118H), 5,23-5,40 (m, 72H), 5,59-5,66 (m, 24H), 6,06-6,16 (m, 23H), 7,25-7,65 (m, 234H), 8,10-8,12 (m, 52H). Peso molecular teórico de conjugado: 68,9 kDa. 1H NMR indica 27 DTX/dendrímero. Peso molecular real é aproximadamente 64,4 kDa (34% DTX em peso). Exemplo 19 Preparação de BHALys [Lys]32 [α-TDA-DTX]32 [ε-PoliPEG2000]32
Figure img0072
[233] Preparado usando Procedimento C acima, usando BHALys [Lys]32 [α-NH2.TFA]32 [ε-PEG2ooo] 32 (88 , 6 mg, 1,2 μmol) e TDA-DTX (49,3 mg, 52 μmol). Purificação por SEC (sephadex, LH20, MeOH) forneceu 95 mg (80%) de material desejado como um sólido incolor higroscópico. HPLC (C8, gradiente: 45-85% ACN/H2O (1-7 min), 85% ACN (7-12 min), 85-45% ACN (12-13 min), 45% ACN (13-15 min), 0,1% TFA buffer) Rf (min) = 6,29 min. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm): 0,82-1,96 (m, 2076H), 2,36-2,54 (m, 314H), 3,10-3,24 (m, 125H), 3,35-3,89 (m, 6300H), 4,96-5,04 (m, 35H), 5,25-5,45 (m, 79H), 5,60-5,70 (m, 29H), 6,06-6,18 (m, 24H), 7,20-7,75 (m, 269H), 8,06-8,16 (m, 52H). Peso molecular teórico de conjugado:101,1 kDa. 1H NMR indica 27 DTX/dendrímero. Peso molecular real é aproximadamente 95,5 kDa (23% DTX em peso). Tamanho de partícula usando Dynamic Light Scattering mostra uma faixa de médias dependentes da concentração de 10,9 - 15,5 nm. Exemplo 20 Preparação de BHALys [Lys]32 [α-DGA-testosterona]32 [ε- PEG1100]32 (a) Preparação de DGA-Testosterona
Figure img0073
[234] Preparado usando Procedimento B acima, usando testosterona (256 mg, 0,88 mmol), piridina (10 mL) como o solvente e diglicólico anidreto (1,02 g, 8,8 mmol) como o ligante. Purificação por HPLC preparatório (BEH 300 Waters XBridge C18, 5 μM, 30 x 150 mm, 40-90% ACN/água, sem tampão, RT = 62 min) para gerar o composto desejado 241 mg (67% de rendimento) como um sólido higroscópico quase branco. LCMS (C8, gradiente: 40-90% ACN/H2O (1-7 min), 90% ACN (7-9 min), 90-40% ACN (9-11 min), 40% ACN (11-15 min), 0,1% TFA) Rt(min) = 5,61. ESI (- ve) observado [M - H]- = 403,29. Calculado para C23H31O6 = 403,21 Da. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm) 0,88 (s, 3H, CH3), 0,93-1,23 (m, 3H), 1,24 (s, 3H, CH3), 1,25-2,58 (br m, 16H), 4,18 (s, 2H, CH2), 4,23 (s, 2H, CH2), 4,70 (m, 1H, CH), 5,71 (s, 1H, CH). (b) Preparação de BHALys [Lys]32 [α-DGA- testosterona]32 [ε-PEG1100]32
Figure img0074
[235] Preparado usando Procedimento C acima, usando BHALys [Lys]32(α-NH2.TFA) 32 (ε-PEGiioo)32 (30 mg, 0,75 μmol) e DGA-Testosterona (19 mg, 47 μmol). Purificação por SEC (LH20, eluente: metanol) forneceu 15 mg (39%) como um sólido quase branco. HPLC (C8, gradiente: 30-80% ACN/H2O (1-7 min), 80% ACN (7-9 min), 80-30% ACN (9-11 min), 30% ACN (11-15 min), 10 mM formato de amônio) Rt(min) = 9,41. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm) 0,79 (s, 80H, CH3), 0,81-2,42 (br m, 1101H), 3,08 (m, 116H, CH2), 3,26 (s, 98H, CH2), 3,37-3,81 (m, 2800H, CH2), 3,95-4,47 (m, 173H, CH), 4,61 (m, 29H, CH), 5,62 (s, 29H, CH), 6,08 (m, 1H, CH), 7,17 (m, 10H, ArH). Peso molecular teórico de conjugado: 52,4 kDa. 1H NMR indica 29 testosterona/dendrímero. Peso molecular real é aproximadamente 51,2 kDa (16% testosterona em peso). Exemplo 21 Preparação de BHALys [Lys]32 [α-DGA-Testosterona]32 [ε- PEG570]32
Figure img0075
[236] Preparado usando Procedimento C acima, usando BHALys [Lys]32 (α-NH2.TFA)32 (ε-PEG57o)32 (40 mg, 1,33 μmol) em DMF (2 mL) e DGA-Testosterona (43 mg, 106 μmol). Purificação por SEC (LH20, eluente: metanol) forneceu 22,1 mg (40% de rendimento) como um quase higroscópico. HPLC (C8, gradiente: 30-80% ACN/H2O (1-7 min), 80% ACN (7-9 min), 80-30% ACN (9-11 min), 30% ACN (11-15 min), 10 mM formato de amônio) Rt (min) = 9,99. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm) 0,89 (s, 96H, CH3), 0,90-2,63 (br m, 1214H), 3,36 (m, 125H, CH2), 3,36 (s, 100H, CH3), 3,45-3,97 (m, 1472H, CH2), 4,05-4,62 (m, 218H), 4,71 (m, 37H, CH), 5,72 (s, 31H, CH), 6,18 (m, 1H, CH), 7,17 (m, 10H, ArH). Peso molecular teórico de conjugado: 42,5 kDa. 1H NMR indica 31 testosterona/dendrímero. Peso molecular real é aproximadamente 42,1 kDa (21% testosterona em peso). Exemplo 22 Preparação de BHALys [Lys]32 [α-Glu-testosterona]32 [ε- PEG1100]32 (a) Preparação de Glu-Testosterona
Figure img0076
[237] Preparado usando Procedimento B acima, usando testosterona (100 mg, 0,35 mmol), piridina (6 mL) como o solvente e anidreto glutárico (396 mg, 3,5 mmol) como o ligante. Purificação por HPLC preparatório (BEH 300 Waters XBridge C18, 5 μM, 30 x 150 mm, 40-90% ACN/água, sem tampão, RT = 62 min) para gerar o composto desejado 86 mg (86% ) como um sólido higroscópico quase branco. LCMS (C8, gradiente: 4090% ACN/H2O (1-7 min), 90% ACN (7-9 min), 90-40% ACN (9-11 min), 40% ACN (11-15 min), 0,1% TFA) Rt (min) = 6,40. ESI (+ ve) observado [M + H]+ = 403,29. Calculado para C24H35O5 = 403,25 Da. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm) 0,89 (s, 3H, CH3), 0,93-1,23 (m, 3H), 1,24 (s, 3H, CH3), 1,36-2,57 (br m, 22H), 4,62 (m, 1H, CH), 5,71 (s, 1H, CH). (b) Preparação de BHALys [Lys]32 [α-Glu-Testosterona]32 [ε- PEG1100]32
Figure img0077
[238] Preparado usando Procedimento C acima, usando BHALys [Lys]32(α-NH2.TFA) 32(ε-PEG1100)32 (30 mg, 0,75 μmol) em DMF (2 mL) e Glu-Testosterona (19 mg, 47 μmol). Purificação por SEC (LH20, eluente: metanol) forneceu 18,1 mg (47%) do produto desejado como um sólido quase branco. HPLC (C8, gradiente: 40-80% ACN/H2O (1-7 min), 80% ACN (7-9 min), 80 40% ACN (9-11 min), 40% ACN (11-15 min), 10 mM formato de amônio) Rt (min) = 7,22. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm) 0,88 (s, 87H, CH3), 0,89-2,61 (br m, 1225H), 3,17 (m, 110H, CH2), 3,36 (s, 101H, CH3), 3,46-3,98 (m, 2800H, CH2), 4,34 (m, 59H, CH), 4,61 (m, 30H, CH), 5,72 (s, 29H, CH), 6,18 (m, 1H, CH), 7,28 (m, 12H, ArH). Peso molecular teórico de conjugado: 52,3 kDa. 1H NMR indica 29 testosterona/dendrímero. Peso molecular real é aproximadamente 51,1 kDa (16% testosterona em peso). Exemplo 23 Preparação de BHALys [Lys]32 [α-Glu-Testosterona]32 [ε- PEG570]
Figure img0078
[239] Preparado usando Procedimento C acima, usando BHALys [Lys]32 (α-NH2.TFA)32 (ε-PEG57o)32 (30 mg, 1 μmol) em DMF (2 mL) e Exemplo 22(a), Glu-Testosterona (26 mg, 64 μmol). Purificação por SEC (LH20, eluente: metanol) forneceu 19,8 mg (47% de rendimento) do produto desejado como um produto sólido branco. HPLC (C8, gradiente: 40-80% ACN/H2O (1-7 min), 80% ACN (7-9 min), 80-40% ACN (9-11 min), 40% ACN (11-15 min), 10 mM formato de amônio) Rt (min) = 8,93. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm): 0,88 (s, 96H, CH3), 0,89-2,59 (br m, 1423H), 3,16 (m, 127H, CH2), 3,26 (m, 135H, CH3), 3,65-3,92 (m, 1472H, CH2), 4,24 (m, 66H, CH), 4,52 (m, 39H, CH), 5,62 (s, 32H, CH), 6,09 (m, 1H, CH), 7,19 (m, 10H, ArH). Peso molecular teórico de conjugado: 42,5 kDa. 1H NMR indica 32 testosterona/dendrímero. Peso molecular real é aproximadamente 42,5 kDa (21% testosterona em peso). Exemplo 24 Preparação de BHALys [Lys]32 [α-Glu-SB]32 [ε-PEG1100]32 SB = Salbutamol (a) Preparação de Glu-SB
Figure img0079
[240] Preparado usando Procedimento B acima, usando SB (100 mg, 0,42 mmol) e glutárico anidreto (62 mg, 0,54 mmol) como o ligante. HPLC Preparativo (BEH 300 Waters XBridge C18, 5 μM, 30 x 150 mm, gradiente: 5% ACN/H2O (1-5 min), 5-60% ACN (5-40 min), 60% ACN (40-45 min), 60-5% ACN (45-50 min), 5% ACN (50-60 min), 0,1% TFA, Rt = 27 min) forneceu 50 mg (34%) do produto desejado como um sólido branco. HPLC (C18, gradiente: 5-60% ACN/H2O (1-10 min), 60% ACN (10-11 min), 605% ACN (11-13 min), 5% ACN (13-15 min), 10 mM formato de amônio) Rt (min) = 6,67. ESI (+ve) observado [M + H]+ = 354. Calculado para C18H27NO6 = 353,18 Da. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm): 1,41 (s, 9H), 1,92 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 2,37 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 2,45 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 3,01-3,18 (m, 2H), 5,18 (s, 2H), 6,87 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,27 (dd, J = 8,4 e 2,1 Hz, 1H), 7,36 (d, J = 2,4 Hz, 1H). (b) Preparação de BHALys [Lys]32 [α-Glu-SB]32 [ε-PEG570]32
Figure img0080
[241] Preparado usando Procedimento C acima, usando BHA [Lys]32 [α-NH2.TFA]32 [ε-PEG570]32 (26 mg, 0,86 μmol) e Glu-SB (17 mg, 48,2 μmol). Purificação por SEC (sephadex, LH20, MeOH) forneceu 25 mg (76%) de material desejado como um sólido branco. HPLC (C8, gradiente: 40-80% ACN/H2O (1-7 min), 80% ACN (7-9 min), 80-40% ACN (9-11 min), 40% ACN (11-15 min), 10 mM formato de amônio) Rt (min) = 5,81. 1H NMR (300MHz, CD3OD) δ (ppm): 1,03-2,02 (m, 738H), 2,25-2,58 (m, 180H), 2,97-3,29 (m, 167H), 3,40-3,94 (m, 1469H), 4,12-4,50 (m, 74H), 5,04 (s, 55H), 6,90 (d, J = 8,1 Hz, 27H), 7,28 (d, J = 8,1 Hz, 27H), 7,36 (m, 27H). Peso molecular teórico de conjugado: 37,8 kDa. 1H NMR indica 27 salbutamol/dendrímero. Peso molecular real é aproximadamente 36,1 kDa (18% salbutamol em peso). Constructos de alvos Exemplo 25 Preparação de 4-azidobenzamida-PEG12- NEOEOEN [SuN(PN)2] [Lys]16 [Lys(α-PSSP-DTX)(ε-PEG1100)]32 (a) Preparação de 4-azidobenzamida-PEG12- NEOEOEN [SuN(PN)2] [Lys]16 [Lys(α-NHBOC)(ε-PEG1100)]32
[242]A uma solução magneticamente agitada de L-lisina- (α-NHBOC)(ε-PEGiioo) (614 mg, 456 μmol) em DMF anidro (2,5 mL) foi adicionado PyBOP (246 mg, 473 μmol) seguido por uma solução de 4-azidobenzamida-PEG12- NEOEOEN [SuN(PN)2] [Lys]16 [NH2.TFA]32 (91 mg, 10,6 μmol) e DIPEA (235 μL, 1,35 mmol) em DMF anidro (2,5 mL). Após 16 horas em temperatura ambiente a reação foi concentrada em vácuo e o resíduo purificado por ultrafiltração (membrana PALL Minimate cartucho 10 kDa) para fornecer o composto alvo como um sólido pegajoso quase branco, 433 mg (86%). LCMS (C8 Waters X- Bridge, gradiente: 40-90% ACN/H2O (1-7 min), 90% ACN (7-9 min), 90-40% ACN (9-11 min), 40% ACN (11-15 min), 0,1% Ácido fórmico) Rt (min) = 5,17. (b) Preparação de 4-azidobenzamida-PEG12- NEOEOEN [SuN(PN)2] [Lys]16 [Lys(α-NH2.TFA)(ε-PEG1100)]32
[243] Uma solução de 4-azidobenzamida-PEG12- NEOEOEN [SuN(PN)2] [Lys]16 [Lys(α-NHBOC)(ε-PEG1100)]32 (431 mg, 9,10 μmol) em TFA/DCM (5 mL / 7 mL) foi deixado agitando por 4 h. Após este tempo a mistura de reação concentrada e o resíduo resultante azeotropado com água (2 x 10 mL) para fornecer o composto alvo como um sólido amarelo pálido, 435 mg (100%). LCMS (C18 Waters X-Bridge, gradiente: 5-60% ACN/H2O (1-10 min), 60% ACN/H2O (10-14 min), 60-5% ACN/H2O (14-16 min), 0,1% TFA) Rt = 10,65. 1H NMR (300 MHz, D2O) δ (ppm): 1,21-2,04 (m, 376H), 2,51-2,56 (m, 71H), 3,12-3,30 (m, 115H), 3,40 (s, 96H), 3,45-3,90 (m, 3077H), 3,91-4,42 (m, 62H), 7,25 (d, J 8,7 Hz, 2H), 7,88 (d, J 8,7 Hz, 2H). (c) Preparação de 4-azidobenzamida-PEG12- NEOEOEN [SuN(PN)2] [Lys]16 [Lys(α-PSSP-DTX)(ε-PEG1100)]32
[244] O constructo foi preparado usando Procedimento C acima, usando 4-azidobenzamida-PEG12- NEOEOEN [SuN(PN)2] [Lys]16 [Lys(α-NH2.TFA)(ε-PEG1100)]32 (104 mg, 2,18 μmol) e DTX-PSSP (94 mg, 94,0 μmol). Purificação por SEC forneceu 133 mg (97%) do material desejado como um óleo amarelo pálido viscoso. LCMS (C18 Waters X-Bridge, gradiente: 5-60% ACN/H2O (1-10 min), 60% ACN/H2O (10-11 min), 60-5% ACN/H2O (11-13 min), 0,1% Ácido fórmico) Rt (min) = 7,59. 1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ (ppm): 0,88-2,05 (m, 1080H), 2,16-2,56 (m, 212H), 2,60-3,26 (m, 363H), 3,35-3,41 (m, 129H), 3,503,94 (m, 3110H), 4,00-4,60 (134H), 4,93-5,10 (m, 28H), 5,20-5,46 (m, 73H), 5,54-5,80 (m, 24H), 5,95-6,30 (m, 23H), 7,147,91 (m, 268H). Peso molecular teórico de conjugado: 75,7 kDa. 1H NMR indica 26 DTX/dendrímero, portanto peso molecular real é aproximadamente 69,8 kDa (37% DTX em peso). Exemplo 26 Preparação de biotin-triazolobenzamida-PEG12- NEOEOEN [SuN(PN)2] [Lys]16 [Lys(α-PSSP-DTX)(ε-PEG1100)]32
[245] O constructo foi preparado usando Procedimento D acima, usando 4-azidobenzamida-PEG12-NEOEOEN [SuN(PN)2] [Lys]16 [Lys(α-PSSP-DTX)(ε-PEG1100)]32 (42,5 mg, 674 nmol) e biotina- alquino (0,4 mg, 1,35 μmol). Purificação por SEC forneceu o composto alvo como um sólido quase branco, 39 mg (91%). LCMS (C18 Waters X-Bridge, gradiente: 5-60% ACN/H2O (1-10 min), 60% ACN/H2O (10-11 min), 60-5% ACN/H2O (11-13 min), 0,1% Ácido fórmico) Rt (min) = 7,04. 1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ (ppm): 0,92-2,02 (m, 982H), 2,10-3,25 (m, 1027H), 3,35-3,42 (m, 128H), 3,49-3,98 (m, 3180H), 4,07-4,69 (m, 131H), 4,96-5,11 (m, 27H), 5,15-5,50 (m, 72H), 5,55-5,80 (m, 24H), 5,98-6,23 (m, 23H), 7,14-8,25 (m, 277H), 8,54-8,56 (m, 1H). Exemplo 27 Preparação de LyP-1-triazolobenzamida-PEG12- NEOEOEN [SuN(PN)2] [Lys]16 [Lys(α-PSSP-DTX)(ε-PEG1100)]32 LyP-1 (Fornecido por AusPep Pty Ltd).
[246] O constructo foi preparado usando Procedimento D acima, usando 4-azidobenzamida-PEG12- NEOEOEN [SuN(PN)2] [Lys]16 [Lys(α-PSSP-DTX)(ε-PEG1100)]32 (44,2 mg, 701 nmol) LyP-alquino (185 μL de uma solução 10 mg/mL em H2O, 1,05 μmol). Purificação por SEC forneceu um sólido rosa claro brilhante pegajoso, 46 mg (102%), como uma mistura ca. de 60:40 LyP-triazolobenzamida-PEG12- NEOEOEN [SuN(PN)2] [Lys]16 [Lys(α-PSSP-DTX)(ε-PEG1100)]32/4- azidobenzamida-PEG12-NEOEOEN [SuN(PN)2] [Lys]16 [Lys(α-PSSP- DTX)(ε-PEG1100)]32. LCMS (C8 Waters X-Bridge, gradiente: 40-90% ACN/H2O (1-7 min), 90% ACN (7-9 min), 90-40% ACN (9-11 min), 40% ACN (11-15 min), 0,1% Ácido fórmico) Rt (min) = 6,07 (conjugado LyP-Dendrímero); 7,10 (matéria de partida Azido- Dendrímero).
Exemplo 28 Preparação de deslorelin-triazolobenzamida-PEG12- NEOEOEN [SuN(PN)2] [Lys]16 [Lys (α-PSSP-DTX)(ε-PEG1100)]32
[247] O constructo foi preparado usando Procedimento D acima, usando 4-azidobenzamida-PEG12-NEOEOEN [SuN(PN)2] [Lys]16 [Lys(α-PSSP-DTX)(ε-PEG1100)]32 (41,7 mg, 662 nmol) e deslorelina-alquino (130 μL de uma solução 10 mg/mL em H2O, 993 nmol). Purificação por SEC forneceu um sólido amarelo claro pálido, 43 mg (100%), como uma mistura ca. de 70:30 deslorelin-triazolobenzamida-PEG12- NEOEOEN [SuN(PN)2] [Lys]16 [Lys(α-PSSP-DTX)(ε-PEG1100)]32/4- azidobenzamida-PEG12-NEOEOEN [SuN(PN)2] [Lys]16 [Lys(α-PSSP-DTX) (ε-PEG1100)]32. LCMS (C8 Waters X-Bridge, gradiente: 40-90% ACN/H2O (1-7 min), 90% ACN (7-9 min), 90-40% ACN (9-11 min), 40% ACN (11-15 min), 0,1% Ácido fórmico) Rt (min) = 6,42 (conjugado Deslorelina-Dendrímero); 7,11 (material de partida Azido-Dendrímero).
Exemplo 29 Preparação de conjugação de Anticorpo-Dendrímero usando Estreptavadina como uma unidade de junção
[248]A uma solução de Alexa Fluor® 750 Estreptavadina (Av) (0,1 μg/mL) em salina tampão fosfato (PBS, 2 mL) foi adicionado anticorpo Abcam #ab24293 anti- EGFR biotina (Ab) (30 μL de 10 μg/mL solução estoque). À esta solução de reação foi adicionada uma solução de biotin- triazolobenzamida-PEG12-NEOEOEN [SuN(PN)2] [Lys]16 [Lys(α-PSSP- DTX)(ε-PEG1100)]32 (DTX-D) in PBS (5 μL de 1,0 μg/mL solução estoque). A mistura foi deixada agitando por for 10 s e o procedimento acima de adição de Ab e DTX-D à solução Av foi repetida no total 8 vezes. Finalmente, a reação foi extinta usando 50 μg/mL de Biotina, (Sigma Aldrich, #B4501-1G), e após incubação por 5 min, 1 mL da amostra foi precipitada como 50 μL de proteína G agarose. A confirmação de conjugação bem sucedida foi demonstrada usando SDS-PAGE com uma banda nova atribuída ao conjugado aparecendo em 260kDa e HPLC (coluna: X Bridge C8, 3,5 μm 3,0 x 100 mm, comprimento de onda de detecção = 243 nm, 10 μL injeções e gradiente de corrida: 5-80% ACN/H2O, 0,1% TFA por 15 min Rt (min) = 1,40 biotina, 5,83 (conjugado Ab alvo-DTX-D); 7,24 (Ab não reagido), 9,84 (DTX-D não reagido). Exemplo 30 Preparação de um anticorpo ativado com uma unidade de junção de azida
[249] Uma solução de tampão de acoplamento (0,1 M acetato de sódio + 0,15 M NaCl, pH 5,5) foi preparada e usada para preparar solução estoques para a seguinte reação. Meta- periodato de sódio sólido (2,1 mg) foi dissolvido em tampão de acoplamento (0,5 mL) e então foi adicionado a uma solução de Her2 mAb* (25 μg) também diluído em tampão de acoplamento (0,5 mL). A mistura de reação foi incubada em temperatura ambiente (RT) no escuro por 45 min. Material não reagido foi removido por unidades de filtro de centrífuga (MW cut off 50 kDa). A uma porção de solução de mAb oxidada (0,3 mL) foi adicionado a solução estoque de uma unidade de junção contendo azida (JU) (NH2-O-C4H8-NH-(PEG)12-N3 ¥, 0,2 mL; 1mg/mL em PBS), seguido por [4(5 μL). A reação foi misturada e deixada por 24 h em RT. Após este tempo o conjugado mAb-JU foi separado de material não reagido por unidades de filtro de centrífuga.
[250] ¥ Em um modo semelhante outra unidade de junção pode ainda ser instalada no anticorpo, por exemplo NH2-O- C4H8-NH-(PEG)12-benzylazide, NH2-O-C4H8-NH-(PEG)12-DBCO e NH2-O-C4H8-NH-(PEG)12-maleimida.
[251] * Neste exemplo Her2 mAb é utilizado, no entanto, de modo semelhante a ao de outros anticorpos utilizados. Além de utilizar outra química de ativação, por exemplo, redução parcial de grupos ditiano dentro do anticorpo seguido por captura com unidades de junção contendo maleimida.
Exemplo 31 Conjugação do anticorpo ativado com um Dendrímero carregado com droga
[252]A uma solução mAb-JU ativado por azida do Exemplo 30 acima poderia ser adicionada uma solução de um dendrímero carregado com droga apropriadamente funcionalizado com um alquino reativo, como DBCO. A reação poderia ser monitorada para conclusão usando HPLC e o produto desejado poderia ser isolado por cromatografia SEC ou HPLC prep usando protocolos padrões.
[253]¥ De modo semelhante outras unidades de ativação de dendrímero poderiam ainda ser instaladas no ponto único de fixação no dendrímero, por exemplo, azida e maleimida.
Exemplo 32 Solubilidade em água de Dendrímeros carregados com Droga:
[254] Protocolo: À 30 mg de dendrímero (liofilizadas de água) foi adicionado 100 μL de água deionizada. Após mistura por 10 minutos, alíquotas adicionais de água (10-30 μL por adição) foram adicionados com vórtice e incubação por 10 mins até a dissolução completa ser obtida. Esta quantidade é representada na Tabela 1 como a solubilidade em água do dendrímero. A solubilidade equivalente da droga é determinada por multiplicação do % carregamento da droga /100 e é representada na Tabela 1 (coluna 3) como solubilidade equivalente da droga no dendrímero. Finalmente, o aumento em múltiplos é obtido por divisão da solubilidade de droga equivalente no dendrímero pela solubilidade da droga e é representado na Tabela 1 (coluna 4). Tabela 1
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* droga = docetaxel. A solubilidade de docetaxel e em água é de 5 μg/mL ¥ droga = testosterona: A solubilidade de testosterona em água é de 24 μg/mL. Exemplo 33 Estudo de estabilidade plasmática em dendrímeros:
[255] Protocolo: À 0,5 mL de plasma de camundongos foi adicionado 0,1 mL de solução de dendrímero (2 mg/mL, droga equivalente em salina). A mistura foi vortexada (30 s) então incubada a 37oC. Em vários pontos de tempo (0,5, 2,5, 4,5, 22 horas) 0,1 mL de alíquotas oram removidos e adicionados a 0,2 mL ACN. As misturas resultantes foram vortexadas (30s), centrifugadas (10 min, 4oC) filtradas e analisadas por HPLC (C8, 3,9 x 150 mm, 5 μm, comprimento de onda = 243 nm, 10 μL injeções, gradiente: 40-80% ACN/H2O (1-7 min), 80% ACN (7-9 min), 80-40% ACN (9-11 min), 40% ACN (11-15 min), 10 mM formato de amônio, pH 7,40) que quando comparado contra um padrão (2 mg/mL) forneceu a concentração de docetaxel livre na amostra. Tabela 2 Liberação de docetaxel no plasma. Os resultados são mostrados como um percentual de docetaxel total
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Exemplo 34 Ensaio SRB de estudos de inibição de crescimento celular
[256]A inibição de crescimento celular foi determinada usando o ensaio Sulforodamina B (SRB) [Voigt W. “Sulforhodamina B assay and chemosensitivity” Methods Mol. Med. 2005, 110, 39-48.] contra várias linhagens celulares de câncer após 72 horas com cada corrida de experimento em duplicata. GI50 é a concentração requerida para inibir crescimento celular total em 50%, de acordo com protocolos padrões de NCI.
[257] Todas as soluções foram preparadas em salina (exceto docetaxel que foi preparado em etanol). Todas as soluções foram armazenadas a -20°C. Todos os valores foram baseados em carregamento de droga equivalente. Os resultados mostrados na Tabela 3 são a média das corridas dos experimentos em duplicata em uma faixa nanomolar. Tabela 3 Estudos de inibição de crescimento.
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Exemplo 35 Concentração inibitória meia-máxima (IC50) usando o ensaio MTT
[258]A IC50 usando o ensaio MTT [Wilson, Anne P. (2000). “Chapter 7: Cytotoxicity and viability”. Em Masters, John R. W.. Animal Cell Culture: A Practical Approach. Vol. 1 (3rd ed.). Oxford: Oxford University Press] foi determinada contra várias linhagens celulares após 72 horas. Os resultados são apresentados na Tabela 4. Tabela 4 Estudos de concentração inibitória meia-máxima (IC50).
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Exemplo 36 Estudo de dose máxima tolerada (MTD)
[259] Grupos de camundongos fêmeas Balb/c foram administrados em injeção intravenosa de dendrímero (0,1 ml/10 g peso corporal) ou docetaxel (0,05 ml/10 g peso corporal) uma vez por semana por 3 semanas (dia 1, 8 e 15). Os camundongos foram pesados diariamente e observados para sinais de toxicidade. Os animais foram monitorados por até 10 dias após a dose de droga. Qualquer camundongo excedendo pontos de avaliação éticos (> 20 % perda de peso corporal, saúde em geral fraca) foi imediatamente sacrificado e as observações foram anotadas. Os resultados mostrados na Tabela 5 demonstram que o conjugado da droga ao dendrímero aumenta a dose tolerada. Mais do que duas vezes a dose de docetaxel poderia ser seguramente administrada usando constructo de droga dendrímero comparado ao docetaxel isolado. Tabela 5 Doses de droga testadas e dose máxima tolerada identificada
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Exemplo 37 Estudo de eficácia de xenoenxerto MDA-MB-231
[260] Camundongos fêmeas Balb/c nude (idade de 7 semanas) foram inoculados por via subcutânea no flanco com 3,5 x 106 de células MDA-MB-231 em PBS:Matrigel (1:1). Treze dias depois 50 camundongos com tumores de tamanhos semelhantes (~110 mm3) foram randomizados em 5 grupos. Cada grupo de tratamento foi administrado com uma das seguintes doses: salina; docetaxel (15 mg/kg); Exp. 3 (b) (20 mg/kg); Exp. 8 (c) (32 mg/kg). Todos os tratamentos foram administrados por via intravenosa uma vez por semana por três semanas (dia 1, 8 e 15) a 0,1 mL/10 g peso corporal exceto docetaxel que foi administrado a 0,05mL/10 g peso corporal. O Experimento foi encerrado no dia 120 ou antes se um ponto de avaliação ético foi atingido. Os resultados mostrados na tabela 6 mostra que os constructos de dendrímero foram mais eficazes na supressão de crescimento do tumor por mais tempo. Tabela 6. Estudo de eficácia de xenoenxerto que mostra o volume de tumor médio mm3 ao longo do tempo
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** Nenhum dado referente ao ponto de avaliação ético atingido. n= número de animais por grupo de dosagem.
Exemplo 38 Estudo de toxicidade em xenoenxerto MDA-MB-231
[261] Um total de vinte camundongos fêmeas Balb/c nude (idade de 7 semanas) foram preparadas com tumores subcutâneos como delineado acima. Os 20 camundongos foram randomizados em 5 grupos de quatro camundongos (volume médio de tumor ~90 mm3). Os animais foram sangrados nos olhos na manhã para contagens de células sanguíneas basais e então a dosagem da droga começou mais tarde no mesmo dia (dia 1). A dosagem da droga foi realizada nos dias 1, 8 e 15 em doses MTD determinadas anteriormente: docetaxel (15 mg/kg); Exp. 3 (b)(20 mg/kg); Exp. 8 (c) (32 mg/kg); Exp. 4 (b) (20 mg/kg).. Um segundo sangramento ocular foi realizado no dia 11 (Tabela 7 A — C). Os camundongos foram mortos um dia após a dose de droga final (dia 16). Pesos histológicos de tecido no dia 16 são mostrados na Tabela 8. Tabela 7 A. Análise de célula branca sanguínea nos dias 1 e 11.
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Tabela 7 B. Resultados de análise de neutrófilo nos dias 1 e 11.
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Tabela 7 C. Resultados de análise de linfócito nos dias 1 e 11.
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Tabela 8. Pesos de órgão na conclusão de experimento de toxicidade.
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Exemplo 39 Análise de farmacocinética
[262]As meias-vidas plasmáticas de docetaxel marcado com trítio e o constructo do Experimento 8 (c) (preparado usando docetaxel marcado com trítio) após administração IV em ratos foram determinados (Kaminskas, L. M., Boyd, B. J., Karellas, P., Krippner, G. Y., Lessene, R., Kelly, B e Porter, C. J. H. “The Impact of molecular Weight and PEG Chain Length on the Systemic Pharmacokinetics of PEGylated Poly-L-Lysine Dendrimers” Molecular Pharm. 2008, 5, 449-463). Os resultados mostraram que docetaxel foi eliminado do plasma com uma meia- vida de <1 hora como esperado enquanto constructo Exp 8 (c) apresentou depuração plasmática reduzido com uma meia-vida de aproximadamente 30 horas.

Claims (30)

1. Macromolécula, caracterizada por compreender: i) um dendrímero compreendendo um núcleo e uma geração de unidades de construção, a geração mais externa de unidades de construção tendo grupos amino de superfície em que dois grupos terminais diferentes são covalentemente ligados aos grupos amino de superfície do dendrímero; ii) um primeiro grupo terminal o qual é um resíduo de um agente farmaceuticamente ativo compreendendo um grupo hidroxila; iii) um segundo grupo terminal o qual é um agente modificador farmacocinético; em que o primeiro grupo terminal é covalentemente ligado ao grupo amino de superfície do dendrímero através de um ligante diácido, o ligante diácido compreendendo uma cadeia alquil interrompida por átomos de oxigênio, enxofre ou nitrogênio, ou um grupo arila, cicloalquila, heterocíclico ou heteroarila; em que o ligante diácido forma uma ligação éster com o grupo hidroxila do agente farmaceuticamente ativo e uma ligação amida com o grupo amino de superfície, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
2. Macromolécula, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o agente modificador farmacocinético ser polietileno glicol.
3. Macromolécula, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por o polietileno glicol ter um peso molecular na faixa de 220 a 1100 Da.
4. Macromolécula, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por o polietileno glicol ter um peso molecular na faixa de 1000 a 2500 Da.
5. Macromolécula, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por o polietileno glicol ter um peso molecular na faixa de 1000 a 5500 Da.
6. Macromolécula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada por i) o ligante diácido ter a fórmula: C(O)-X-C(O)- em que X é selecionado de -(CH2)s-A-(CH2)t- e Q; A é selecionado de -O-, -S-, -NR1-, -N+(R1)2-, -S-S-, -[OCH2CH2]r-O-, -Y- e -O-Y- O-; Q é selecionado de Y ou -Z=N-NH-S(O)w-Y-; Y é selecionado de cicloalquil, heterocicloalquila, aril e heteroaril; Z é selecionado de -(CH2)x-C(CH3)=, -(CH2)xCH=, cicloalquil e heterocicloalquila; R1 é selecionado de hidrogênio e C1-C4 alquil; s e t são selecionados independentemente de 1 e 2; r é selecionado de 1, 2 e 3; w é selecionado de 0, 1 e 2; e x é selecionado de 1, 2, 3 e 4; ou ii) o ligante diácido ter a fórmula: -C(O)-J-C(O)-X-C(O)- em que X é selecionado de -C1-C10alquileno, -(CH2)s-A-(CH2)t- e Q; -C(O)-J- é um resíduo de aminoácido ou um peptídeo de 2 a 10 resíduos de aminoácidos, em que o -C(O)- é derivado do terminal carbóxi do aminoácido ou peptídeo; A é selecionado de -O-, -S-, -NR1-, -N+(R1)2-, -S-S-, -[OCH2CH2]r-O-, -Y- , e -O-Y- O-; Q é selecionado de Y ou -Z=N-NH-S(O)w-Y-; Y é selecionado de cicloalquil, heterocicloalquil, aril e heteroaril; Z é selecionado de -(CH2)x-C(CH3)=, -(CH2)xCH=, cicloalquil e heterocicloalquil; R1 é selecionado de hidrogênio e C1-C4 alquil; s e t são selecionados independentemente de 1 e 2; r é selecionado de 1, 2 e 3; w é selecionado de 0, 1 e 2; e x é selecionado de 1, 2, 3 e 4.
7. Macromolécula, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por X na parte i) ser -CH2-A-CH2-, -CH2CH2-A-CH2CH2-, ou heteroaril, ou X na parte ii) ser -Ci- C6-alquileno, -CH2-A-CH2-, -CH2CH2-A-CH2CH2-, ou heteroaril.
8. Macromolécula, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizada por na parte ii) a) -C(O)-J- ser um resíduo de aminoácido ou um peptídeo de 2 a 6 resíduos de aminoácidos, em que o -C(O)- é derivado do terminal carbóxi do aminoácido ou peptídeo; e/ou b) -C(O)-J- ser selecionado de -GGG-, -GFLG- e -GILGVP-.
9. Macromolécula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizada por aplicar os seguintes: a) A ser selecionado de -O-, -S-, -S-S-, -NH-, -N(CH3)-, -N+(CH3)2-, -O-1,2-fenil-O- , -O-1,3-fenil-O-, -O-1,4-fenil-O-, -OCH2CH2O-,' -[OCH2CH2]2-O- e -[OCH2CH2]3-O-; b) Y ser heteroaril ou aril; e c) Z ser -(CH2)xC(CH3)=, -(CH2)xCH= e cicloalquil.
10. Macromolécula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada por o dendrímero ter 2 a 6 gerações de unidades de construção, e/ou o dendrímero ser um dendrímero compreendendo unidades de edifício de lisina ou análogos de lisina.
11. Macromolécula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada por o primeiro grupo terminal e segundo grupo terminal estar presente em uma razão de 1:1.
12. Macromolécula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada por a macromolécula compreender um terceiro grupo terminal o qual é um grupo de bloqueio, um agente farmacêutico ou um grupo alvo.
13. Macromolécula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada por 50% dos grupos terminais compreender um dos primeiro ou segundo grupos terminais.
14. Macromolécula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada por ainda compreender um grupo alvo ligado a um grupo funcional no núcleo do dendrímero.
15. Macromolécula, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por o agente de alvo ser selecionado de hormônio de liberação de hormônio luteinizante, um análogo de hormônio de liberação de hormônio luteinizante, LYP-1 e um anticorpo ou fragmento de anticorpo.
16. Macromolécula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizada por a macromolécula ter um tamanho de particulado menor que 1000 nm e/ou um peso molecular de 30 kDa.
17. Macromolécula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizada por o agente farmaceuticamente ativo ser escassamente solúvel ou insolúvel em solução aquosa.
18. Macromolécula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada por o agente farmaceuticamente ativo ser uma droga de oncologia ou testosterona.
19. Macromolécula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizada por a droga de oncologia ser selecionada do grupo que consiste em docetaxel, paclitaxel, cabazitaxel, camptotecina, irinotecano, topotecano e gencitabina.
20. Macromolécula, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada por a droga de oncologia ser docetaxel.
21. Composição farmacêutica, caracterizada por compreender a macromolécula, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 20, e um carreador farmaceuticamente aceitável.
22. Macromolécula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizada por o agente farmaceuticamente ativo ser um resíduo de docetaxel.
23. Macromolécula, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada por a macromolécula liberar mais de 50% do docetaxel entre 2 horas e 48 horas, conforme medido in vitro, em plasma à 37 ° C.
24. Composição farmacêutica, caracterizada por compreender a macromolécula, conforme definida na reivindicação 22 ou 23, e um carreador farmaceuticamente aceitável.
25. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada por aplicar os seguintes: a) a composição é isenta de óleo de rícino polietoxilado e polissorbato 80; b) a meia-vida plasmática do docetaxel liberado é duas vezes a meia-vida do docetaxel nativo (taxotere).
26. Uso de uma macromolécula, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 20, 22, ou 23, caracterizado por ser para a preparação de uma composição farmacêutica, conforme definida nas reivindicações 21, 24, ou 25, para tratar ou suprimir o crescimento de um câncer, em que os tumores são tumores primários ou metastáticos da próstata, testículos, pulmão, cólon, pâncreas, rim, osso, baço, fígado, cérebro, cabeça e/ou pescoço, mama, trato gastrointestinal, pele ou ovário.
27. Uso de uma macromolécula, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 20, 22, ou 23, caracterizado por ser para a preparação de uma composição farmacêutica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 21, 24, ou 25, para reduzir a toxicidade hematológica, toxicidade neurológica, toxicidade gastrointestinal, cardiotoxicidade, hepatotoxicidade, nefrotoxicidade, ototoxicidade ou encefalotoxicidade.
28. Uso de uma macromolécula, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 20, 22, ou 23, caracterizada por ser para a preparação de uma composição farmacêutica, conforme definida na reivindicação 24 ou 25, para reduzir a toxicidade de, ou reduzir os efeitos colaterais selecionados de neutropenia, leucopenia, trombocitopenia, mielotoxicidade, mielosupressão, neuropatia, fadiga, problemas neurocognitivos não específicos, vertigem, encefalopatia, anemia, disguesia, dispneia, constipação, anorexia, distúrbios das unhas, retenção de fluido, astenia, dor, náusea, vômito, mucosite, alopecia, reações de pele, mialgia, hipersensibilidade e anafilaxia.
29. Uso, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por a macromolécula ser administrada em uma dose equivalente a 1 mg a 100 mg por kg de docetaxel.
30. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 29, caracterizado por a macromolécula ser administrada por infusão rápida, por uma injeção em bolus, ou transdérmicamente.
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