CN101102787A - 合成的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体、口服制剂及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供合成的I型干扰素受体多肽激动剂，其包含共有和杂种I型干扰素受体多肽激动剂，含有一个或多个天然或非天然糖基化位点。本发明还提供抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体的口服制剂，该多肽变体缺失至少一个在母体多肽中发现的蛋白酶酶切位点，因此与母体多肽相比显示提高的蛋白酶抗性，该多肽变体还包含(1)与至少一个在母体蛋白治疗剂中没有发现的非天然糖基化位点共价连接的糖部分或(2)与至少一个在母体蛋白治疗剂中发现但未糖基化的天然糖基化位点共价连接的糖部分。本发明还提供组合物，包括口服药物组合物，其包含该合成的I型干扰素受体多肽激动剂、该超糖基化的多肽变体、该抗蛋白酶的多肽变体或该超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体。本发明还提供容器、设备和试剂盒，其包含该合成的I型干扰素受体多肽激动剂、该超糖基化的多肽变体、该抗蛋白酶的多肽变体或该超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体。本发明还提供涉及给予有需要的个体有效量的口服药物组合物的治疗方法，该口服药物组合物包含合成的I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体。
Description
技术领域
本发明涉及糖基化的、抗蛋白酶的以及糖基化、抗蛋白酶的蛋白治疗剂。
发明背景
蛋白作为治疗剂已经得到了临床上的重视。尽管如此，其应用依然有各种障碍和缺点，包括免疫原性；治疗性蛋白被宿主产生的酶破坏；非最理想的药代动力学特征；以及类似问题。举例来说，治疗性蛋白的免疫原性可导致蛋白活性被治疗对象中随时间产生的中和性抗体所消除。此外，治疗性蛋白的免疫原性可导致炎性反应。宿主酶对治疗性蛋白的破坏可能排除应用某些给药途径。例如，治疗某些状况时可能需要口服治疗性蛋白；但是，该治疗性蛋白可能会被治疗个体的胃肠道中的酶破坏。而且，治疗性蛋白的血清半衰期可能较短，例如归因于宿主网状内皮系统快速清除该蛋白；结果，该治疗性蛋白的药物动力学特征可能是需要重复地经常给药。
许多具有治疗潜力的蛋白包括一个或多个糖基化位点，如被真核细胞糖基化的氨基酸序列。已有许多关于提高治疗性蛋白的糖基化水平的尝试的报道，其为了达到1)减小免疫原性；2)减少蛋白的给药频率；3)延长血清半衰期；和4)减小不利副反应，如炎症。
治疗性蛋白被宿主酶破坏可能排除某些给药途径。例如，治疗某些状况时可能需要口服治疗性蛋白；但是，该治疗性蛋白可能被治疗个体消化道和/或血清中的蛋白水解酶破坏。这些蛋白水解酶例如包括α-糜蛋白酶、羧肽酶、内切蛋白酶Arg-C、内切蛋白酶Asp-N、内切蛋白酶Glu-C、内切蛋白酶Lys-C和胰蛋白酶。
本领域需要有合适药物动力学特征的口服剂型的治疗性蛋白。本发明致力于这种需要。
文献
第6,685,933号美国专利；第4,695,623号和第4,897,471号美国专利；第6,703,225号美国专利；第6,569,420号美国专利；第6,299,877号美国专利；第6,586,398号美国专利；第6,531,122号美国专利；第6,646,110号美国专利；Egrie and Brown，Br J Cancer.2001 Apr；Suppl 1：3-10；第6,127,332号美国专利；WO 00/26354；WO 02/081507；WO 01/36001；第5,041,376号美国专利；第5,520,911号美国专利；第6,673,580号美国专利；第5,853,724号美国专利；第640,619号欧洲专利申请；WO 04/022747；和WO 004/0222593。Nyman et al.(1 998)Eur.J.Biochem.253：485-493；Runkel et al.(1998)Pharmaceutical Research 15：641；Adolf et al.(1990)J.Biol.Chem.265：9290-9295。
发明概述
本发明提供非天然糖基化位点、抗蛋白酶的多肽变体的口服制剂以及抗蛋白酶的或抗蛋白酶的、超糖基化的多肽变体的口服制剂，其中多肽变体包含至少一个代替母体多肽中发现的天然酶切位点的突变的蛋白酶酶切位点，因此展示出与母体多肽相比提高的蛋白酶抗性，其中多肽变体还包括(1)与至少一个未在母体蛋白治疗剂中发现的非天然糖基化位点共价连接的糖部分或(2)与至少一个在母体蛋白治疗剂中发现的但未糖基化的天然糖基化位点共价连接的糖部分。本发明还提供包含该糖基化的或抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体的组合物，包括口服药物组合物。本发明还提供包含编码本发明多肽激动剂的核苷酸序列的核酸；和包含本发明核酸的宿主细胞。本发明还提供治疗病毒感染的方法、治疗纤维化病症的方法和治疗增生病症的方法，所述方法通常涉及向需要该治疗的个体以有效量的本发明多肽激动剂给药。本发明还提供包含该超糖基化的或抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体的容器、设备和试剂盒。本发明还提供涉及向有需要的个体以有效量的口服药物组合物给药的治疗方法，该口服药物组合物包含超糖基化的或抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体。
发明特征
一方面，本发明提供包含母体蛋白治疗剂的已知的超糖基化的或抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的变体的口服药物组合物。
另一方面，本发明提供口服药物组合物，其在第一单位形式中含有第一摩尔数的已知的超糖基化的或抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体，含有第二摩尔数的母体蛋白治疗剂的肠胃外药物组合物以一定量皮下推注给药时被证明对患者疾病的治疗是有效的，其中该患者以选定的给药间隔接受该第二摩尔数的母体蛋白治疗剂，其中该第一摩尔数大于该第二摩尔数，并且在以该第一单位形式向患者口服给药时，释放该第一摩尔数的超糖基化的或抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的变体所需的时间不超过所选的给药间隔时长。
另一方面，本发明提供口服药物组合物，其在第一单位形式中含有第一剂量的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体，含有第二剂量的母体蛋白治疗剂的肠胃外药物组合物在选定给药间隔以该第二剂量皮下推注给药时被证明对患者疾病的治疗是有效的，其中当基于患有该疾病的患者群体的平均患者体重计算该第一和第二剂量时，以药物摩尔数每千克患者体重表示的该第一剂量中已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体的量大于第二剂量中母体蛋白治疗剂的量，以及其中以该第一剂量向患者口服给药时，释放所有该第一剂量中抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体所需的时间不超过所选的给药间隔中给药之间的时长。一些实施方案中，当肠胃外药物组合物在选定的给药间隔以基于体重的剂量向患者给药时，即该第二剂量是基于体重的剂量，并且该肠胃外药物组合物是允许基于体重服药的形式，其被证明对患者疾病的治疗是有效的。
本发明还提供涉及向有需要的个体给予有效量的口服药物组合物的治疗方法，该口服药物组合物包含已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体；
另一方面，本发明提供治疗患者疾病的方法，包括向患者给予口服药物组合物，该口服药物组合物包含母体蛋白治疗剂的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体，其中将该口服药物组合物以一定量对患者口服给药，由此该患者以第一给药间隔接受第一剂量的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体；当以一定量向患者皮下推注药时，包含该母体蛋白治疗剂的肠胃外药物组合物被证明对于治疗该患者的疾病是有效的，由此该患者以第二给药间隔接受第二剂量的母体蛋白治疗剂；当基于相同患者体重计算该第一和第二剂量时，以每千克患者体重该抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体的摩尔数表示的第一剂量大于以每千克患者体重该母体蛋白治疗剂的摩尔数表示的第二剂量；以及其中当将该第一剂量对患者口服给药时，释放所有该第一剂量中抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体所需的时间不超过该第二给药间隔给药之间的时长。一些实施方案中，当肠胃外药物组合物以第二给药间隔以基于体重的剂量向患者给药时，即该第二剂量是基于体重的剂量，并且该肠胃外药物组合物是允许基于体重给药的形式，其被证明对患者疾病的治疗是有效的。一些前述实施方案中，该第一剂量是基于体重的剂量，并且该口服药物组合物是允许基于体重给药的形式。
另一方面，本发明提供治疗患者疾病的方法，包括向患者给予口服药物组合物，该口服药物组合物包含母体蛋白治疗剂的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体；其中将该口服药物组合物以一定量对患者口服给药，由此该患者以第一给药间隔接受第一剂量的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体；当以一定量皮下推注向患者给药时，包含该母体蛋白治疗剂的肠胃外药物组合物被证明对于治疗该患者的疾病是有效的，由此该患者以第二给药间隔接受第二剂量的母体蛋白治疗剂；当基于相同患者体重计算该第一和第二剂量时，以每千克患者体重该抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体的摩尔数表示的第一剂量大于以每千克患者体重该母体蛋白治疗剂的摩尔数表示的第二剂量；以及其中第一给药间隔给药之间的时长等于或短于第二给药间隔给药之间的时长。一些实施方案中，当肠胃外药物组合物在第二给药间隔以基于体重的剂量向患者给药时，即该第二剂量是基于体重的剂量，并且该肠胃外药物组合物是允许基于体重给药的形式，其被证明对患者疾病的治疗是有效的。一些前述实施方案中，该第一剂量是基于体重的剂量，并且该口服药物组合物是允许基于体重给药的形式。
另一方面，本发明提供治疗患者疾病的方法，包括将第一单位形式的口服药物组合物对患者给药，该口服药物组合物含有第一摩尔数的母体蛋白治疗剂的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体，其中该抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体的第一摩尔数大于肠胃外药物组合物中母体蛋白治疗剂的第二摩尔数；其中该肠胃外药物组合物为适于皮下推注的速释制剂(immediate release formulation)；第一单位形式以等于或短于第二给药间隔的第一给药间隔向患者口服给药；其中当该母体蛋白治疗剂以一定量皮下推注该肠胃外药物组合物向患者给药时，由此该患者以第二给药间隔接受第二摩尔数的母体蛋白治疗剂，其被证明对于患者疾病的治疗是有效的。
附图说明
图1描述人成熟IFN-α2a的氨基酸序列。
图2描述人成熟IFN-α2b的氨基酸序列。
图3描述人IFN-β的氨基酸序列。
图4描述成熟的、天然的人IFN-γ的氨基酸序列。
图5描述G-CSF的氨基酸序列。
图6描述人生长激素的氨基酸序列。
图7描述红细胞生成素的氨基酸序列。
图8描述GM-CSF的氨基酸序列。
图9描述共有IFN-α的氨基酸序列。
图10描述IFN-αc的氨基酸序列。
图11描述IFN-α2c的氨基酸序列。
图12描述IFN-αd的氨基酸序列。
图13描述IFN-c5的氨基酸序列。
图14描述IFN-α6的氨基酸序列。
图15描述IFN-α4的氨基酸序列。
图16描述IFN-α4b的氨基酸序列。
图17描述IFN-αI的氨基酸序列。
图18描述IFN-αJ的氨基酸序列。
图19描述IFN-αH的氨基酸序列。
图20描述IFN-αF的氨基酸序列。
图21描述IFN-c8的氨基酸序列。
图22描述IFN-β1的氨基酸序列。
图23描述IFN-β2a的氨基酸序列。
图24描述Infergen(干复津)(SEQ ID NO.**)和有报道天然糖基化的I型干扰素种类(人IFN-α2b，SEQ ID NO：2；人IFN-α14，SEQ ID NO：**；人IFN-β1，SEQ ID NO：**；人IFN-ω1，SEQ ID NO：**)的氨基酸序列比较。糖基化发生处的氨基酸残基用加粗的方框标记。天冬酰胺残基是N连接糖基化的锚定位点，苏氨酸残基是O连接糖基化的锚定位点。图24还描述了基于该比较的多数序列(SEQ ID NO：**)。
图25描述Infergen(SEQ ID NO：**)和示例性的I型干扰素受体多肽激动剂61-120氨基酸的氨基酸序列比较。位点1、2和3是产生糖基化位点的位置的例子。在位点1和2产生N连接的糖基化位点。在位点3产生N连接和O连接的糖基化位点。
图26描述具有偏爱人密码子使用的合成哺乳动物Infergen核酸序列；以及翻译的开放阅读框(SEQ ID NO.**)。该开放阅读框用经翻译的Infergen核酸序列(SEQ ID NO：1)表明。六对互补引物A到F用交替的斜体字和粗体文体表示。引物对的上方有义链用奇数识别，下方无义链用偶数识别。在起始密码子ATG上游区域中，设计短序列GCCACC(Kozak共有序列)以提高真核翻译效率。使用两个串连的结束密码子-TAA和TGA-以确保翻译的完全终止。
图27描述哺乳动物Infergen及其糖基化突变体的氨基酸序列比较。不同的核苷酸显示在方框中。使用的密码子基于表8列出的偏爱的密码子用法。
图28描述人IFN-β1(SEQ ID NO.**)和人IFN-β1的示例性糖基化变体81-140氨基酸的氨基酸序列的比较。位点1和2是产生糖基化突变的位置。通常，在位点1只产生N连接的糖基化位点。在位点2产生N连接和O连接的糖基化位点。人IFN-β1和突变体的自然产生的N连接的糖基化位点显示在框中。
图29描述人IFN-ω1和人IFN-ω1的示例性糖基化变体81-140氨基酸的氨基酸序列比较。位点1和2是产生糖基化突变体的位置。通常，在位点1只产生N连接的糖基化位点。在位点2产生N连接和O连接的糖基化位点。人IFN-ω1和突变体的自然产生的N连接的糖基化位点显示在框中。
图30描述Infergen(SEQ ID NO：**)、人IFN-α14(SEQ ID NO.**)、人IFN-β1(SEQ ID NO.**)和示例性的带有人IFN-α14和人IFN-β信号肽的融合蛋白(SEQ ID NO：**和**，依序)的氨基酸序列比对。
图31描述成熟的、天然的人IFN-γ(SEQ ID NO：**)的氨基酸序列。
图32描述Cos-7细胞合成的示例性蛋白的Western印迹分析。
定义
术语“多肽”指氨基酸的聚合体，并且不指特定长度的产物；因此，肽、寡肽和蛋白包括在多肽的定义中。这一术语还不指或排除多肽的翻译后修饰，如糖基化、乙酰化、磷酸化等等。包括在术语“多肽”内的有，例如，含有一个或多个氨基酸类似物(例如包括非天然氨基酸、非编码的氨基酸等)的多肽、具有取代键(substituted linkage)的多肽以及具有本领域中已知的天然存在的和非天然存在的其它修饰的多肽。术语“多肽”包括融合蛋白和免疫标记的蛋白等，该融合蛋白包括但不限于与异源氨基酸序列的融合蛋白，与异源和同源引导序列的融合，有或没有N-末端蛋氨酸残基。
本文中可互换使用的术语“多核苷酸”和“氨基酸分子”指核苷酸任何长度的聚合形式。多核苷酸可以含有脱氧核苷酸、核苷酸和/或它们的类似物。核苷酸可以有任何已知的或未知的三维结构，并且可以执行任何已知的或未知的功能。术语“多核苷酸”包括单链的、双链的和三螺旋分子。“寡核苷酸”通常指约5个至约100个核苷酸的单链或双链DNA的多核苷酸。但是，为本公开的目的，寡核苷酸的长度没有上限。寡核苷酸也称为寡聚物(oligomers)或寡核苷酸(oligos)，其可以从基因中分离，或用本领域已知方法化学合成。术语“多核苷酸”尤其包括在线性DNA分子(如限制性片段)、病毒、质粒和染色体中存在的双链DNA。
以下为多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分枝多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。核酸分子还可包含修饰的核酸分子，如甲基化的核酸分子和核酸分子类似物。嘌呤和嘧啶的类似物为本领域已知。如本领域所知，核酸可以是天然存在的，如DNA或RNA，或者可以是合成的类似物。由于这些类似物在分析条件下有较高的稳定性，其可被优选地用作探针。天然结构的修饰，包括主链、糖或杂环碱基的改变，已被证明提高细胞内稳定性和结合亲和力。主链化学中的有用改变有硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯，其两个非桥连的氧原子均被硫代替；磷酰胺酯(phosphoroamidite)；烷基磷酸三酯和硼烷磷酸酯(boranophosphate)。非手性磷酸盐衍生物包括3’-O’-5’-S-硫代磷酸酯、3’-S-5’-O-硫代磷酸酯、3’-CH2-5’-O-膦酸酯和3’-NH-5’-O-磷酰胺酯(phosphoroamidate)。肽核酸以肽键代替全部核糖磷酸二酯主链。
多核苷酸或多肽与其它多核苷酸和多肽有某种百分比的“序列一致性”意味着，当比对后比较这两个序列时，该百分比的碱基或氨基酸是相同的。可用多种不同方法确定序列相似性。为确定序列一致性，可用特定方法和计算机程序比对序列，包括BLAST，其在万维网(world wide web)ncbi.nlm.nih.gov/BLAST上提供。参见例如Altschul et al.(1990)，J.Mol.Biol.215：403-10。另一比对算法是FASTA，在来自Madison，Wisconsin，USA的Genetics Computing Group(GCG)软件包中提供，GCG是OxfordMolecular Group，Inc.的全资子公司。Methods in Enzymology(酶学方法)，vol.266：Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis(大分子序列分析的计算机方法)(1996)，ed.Doolittle，Academic Press.Inc.中描述了其它的比对技术；Academic Press.Inc.是Harcourt Brace & Co.，SanDiego，California，USA的分部。允许序列中缺口的比对方法有特别意义。Smith-Waterman是允许序列中缺口的一种算法类型。参见Meth.Mol.Biol.70：173-187(1997)。使用Needleman和Wunsch比对方法的GAP程序也可用于比对序列。参见J.Mol.Biol.48：443-453(1970)。
术语“宿主细胞”包括个体细胞或细胞培养物，其可以是或已经是任何重组载体或合成的或外源的多核苷酸的受体。宿主细胞包括单一宿主细胞的后代，由于自然的、意外的或有意的突变和/或改变，该后代不一定需要与起始母体细胞完全相同(形态上或总DNA互补上)。宿主细胞包括体内或体外经重组载体或合成的或外源的多核苷酸转染或感染的细胞。包含本发明的重组载体的宿主细胞是“重组宿主细胞”。一些实施方案中，宿主细胞是原核细胞。其它实施方案中，宿主细胞是真核细胞。
在本文中可互换使用的术语“DNA调节序列”和“调节元件”，指转录和翻译控制序列，它们用于和/或用于调节宿主细胞中编码序列的表达和/或被编码多肽的产生，诸如启动子、增强子、多腺苷酸化信号、终止子、蛋白降解信号等等。
术语“转化(transform)”本文中可与“遗传修饰”互换使用，指引入新的核酸(即细胞外源DNA)后在细胞中诱导的永久的或暂时的遗传改变。遗传改变(修饰)可以通过该新DNA并入到宿主细胞的基因组中，或通过暂时的或稳定维持该新DNA作为游离基因元件来实现。该细胞是哺乳动物细胞时，通常通过将该DNA引入到该细胞的基因组中来实现永久性遗传改变。
本文所用术语“可操作地连接”指这样的并列，其中所描述的组成部分所处的关系允许以它们预期的方式起作用。例如，如果启动子导致编码序列的转录或表达，则该启动子可操作地连接到该编码序列。
本文所用术语“构建体”指重组核酸，通常是重组DNA，其出于表达特定核苷酸序列的目的被制备，或被用于构建其它重组核苷酸序列。
本文所用术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等指获得期望的药理和/或生理作用。该作用可以是预防性的(就完全或部分防止疾病或其症状而言)和/或治疗性的(就部分或完全治愈疾病和/或可归因于该疾病的不利影响而言)。本文所用术语“治疗(treatment)”涵盖对哺乳动物(特别是人)的疾病的任何治疗，包括：(a)延长存活时间；(b)减小由于该疾病而死亡的危险；(c)防止易患该疾病但尚未被诊断出该疾病的对象中该疾病的发生；(d)抑制疾病，即阻止其发展(如减缓疾病发展的速度)；和(e)减轻疾病，即造成疾病的消退。
术语“个体”、“宿主(host)”、“对象(subject)”和“患者”在本文中可互换使用，指哺乳动物，包括灵长动物、啮齿动物、牲畜、宠物、马等。一些实施方案中，个体是人。
术语“治疗有效量”意味着治疗剂的量或治疗剂递送的速度有效促进期望的治疗效果。确切的治疗效果根据以下因素变化：待治疗的状况、待给药的制剂和各种本领域普通技术人员所理解的其它因素。
用在本文中时，术语“证明有效”在治疗疾病的药物治疗的语境中或任何有类似意义的语言中，其应被理解为所述药物治疗(单独地或与一种或多种其它药剂结合)在受控的临床试验或成批临床试验中被证明对于疾病治疗是安全和有效的，该临床试验得到一个或多个具有统计显著性p≤0.05的该试验的主要治疗终点(primary clinical endpoint)。通常，某药物的证明有效的药物治疗包括：(1)监管部门颁发的该药市场化的许可证中明确说明的该药的任何治疗适应症；和(2)普遍承认的医学专家实体发出的声明(如NIH Consensus Statement)中描述的该药的任何治疗适应症。
在抗体结合的语境中，术语“特异结合”指抗体高亲和性(avidity)和/或高亲和力(affinity)结合特定多肽，即多肽的表位，如所述的合成I型干扰素受体多肽激动剂。例如，抗体对特定的所述合成I型干扰素受体多肽激动剂或其片段上表位的结合强于相同抗体对任何其它表位的结合，特别是那些存在于特定分子中的表位，该分子与特定关注的多肽关联或与特定关注的多肽在同一样品中，例如与所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂表位的结合比与任何其它I型干扰素受体多肽激动剂表位的结合强得多，使得通过调节结合条件，该抗体几乎与特定的所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂表位唯一结合，并且不与任何其它I型干扰素受体多肽激动剂表位，或不与任何其它不包含该表位的多肽结合。与多肽特异结合的抗体可能能够以微弱但可检测到的水平(显示与所关注多肽10％或更少的结合)与其它多肽结合。该微弱结合，或背景结合，很容易从与所述多肽的特异抗体结合中辨别出来，如通过使用适当的对照。通常，特异性抗体以10-7M或更高的结合亲和力(如10-8M或更高(如10-9M、10-10M、10-11M等))结合给定的多肽。通常，结合亲和力为10-6M或更低的抗体是无用的，因为它不能以目前使用的常规方法可检测到的水平结合抗原。
“纤维化状况”、“纤维化疾病”和“纤维化病症”可以互换使用，指可响应通过给予具有抗纤维化活性的化合物的治疗的状况、疾病或紊乱。纤维化病症包括但不限于，肺纤维化，包括特发性肺纤维化(IPF)和已知病因的肺纤维化、肝纤维化和肾纤维化。其它代表性纤维化状况包括肌骨骼纤维化、心脏纤维化、手术后粘连、硬皮病、青光眼和皮肤损伤，如瘢痕瘤。
术语“增生性紊乱”和“增生性疾病”可以互换使用，指具有病态细胞生长或增殖特征的任何疾病或状况，特别是癌症。
术语“癌症”、“赘生物”和“肿瘤”本文中互换使用，指表现相对自主生长的细胞，因此它们表现以细胞增殖控制显著缺失为特征的异常生长表型。癌症性细胞可以是良性的或恶性的。
术语“肝炎病毒感染”指甲、乙、丙、丁或戊型肝炎病毒中的一种或多种的感染，特别关注血液传播的肝炎病毒感染，特别是丙型肝炎病毒感染。
用在本文中时，术语“持续病毒反应”(SVR；也称为“持续反应”或“持久反应”)指个体对HCV感染的治疗方案的反应，依据血清HCV滴度。通常，“持续病毒反应”指停止治疗后特定时间段内在患者血清中没有可检测到的HCV RNA(如小于约500、小于约200或小于约100基因组拷贝每毫升血清)，该特定时间段为至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月或至少约6个月。
本文所用术语“治疗失败患者”(或“治疗失败”)通常指特定的HCV感染患者，其未能对之前的HCV治疗做出反应(称为“非响应者”)或最初对之前的治疗做出反应，但该治疗性反应未能维持(称为“复发者”)。该之前的治疗通常可包括使用IFN-α的单一药物治疗或IFN-α联合治疗，该联合治疗可以包括给予IFN-α和抗病毒剂，如利巴韦林。
本文所用术语“给药事件”指向有需要的患者给予抗病毒剂，该事件可以包括药物分发设备一次或多次释放抗病毒剂。因此，本文所用术语“给药事件”包括但不限于连续递送设备的安装(如泵或其它控释可注射系统)和连续递送系统安装后的单一皮下注射。
药物递送语境中所用的“模式化的”或“时序的”指在预选的时间段(如与诸如推注相关的时间段不同)内以一定模式递送药物，通常是基本规律的模式。“模式化的”或“时序的”药物递送意味着包括以逐渐增加的、逐渐减少的、基本稳定的或脉动的速度或速度范围(如每单位时间的药量或单位时间的药剂体积)递送药物，还包括连续的或基本连续的或长期的递送。
术语“可控的药物递送设备”指包括任何设备，其中容纳的药物或其它需要的物质的释放通过该设备本身控制或决定，并且不被使用环境影响，或以在该使用环境中可重复的速度释放。
在例如语境“基本连续输注”或“基本连续递送”中所用的“基本连续”指在预选的药物递送的时间段内基本上不间断地递送药物；患者在预选的时间段内任何8小时内接受的药量从未降到零。而且，“基本连续”的药物递送还可以包括以基本稳定的预选的速度或速度范围(如每单位时间的药量或单位时间的药剂体积)递送药物，该药物递送在预选定的药物递送的时间段内基本上不间断。
用在本文中时，术语“吡非尼酮”指5-甲基-1-苯基-2-(1H)-吡啶酮。用在本文中时，术语“吡非尼酮类似物”指以下式I、IIA或IIb的任何化合物。“特定吡非尼酮类似物”及其语法变体指的是但不限于表10所示的每一个吡非尼酮类似物。
术语“抗纤维化”剂、药物或化合物包括防止或减少纤维化的试剂，包括：II型干扰素受体激动剂(如干扰素γ)；吡非尼酮和吡非尼酮类似物；抗血管生成剂，如VEGF拮抗剂、VEGF受体拮抗剂、bFGF拮抗剂、bFGF受体拮抗剂、TGF-β拮抗剂、TGF-β受体拮抗剂；和抗炎剂，包括：肿瘤坏死因子(TNF)拮抗剂，如抗-TNF抗体(如REMICADETM抗TNF单克隆抗体)，和可溶性TNF受体(如ENBRELTM TNF受体-Ig免疫粘附素)，以及IL-1拮抗剂，如IL-1Ra。
术语“血管生成剂”、“血管生成化合物”和“血管生成因子”指包括促进新血管形成的试剂，如VEGF、bFGF和TGF-β。
术语“抗血管生成”或“血管生成抑制”剂、药物或化合物，或“血管生成抑制剂”指包括防止或减少新血管形成的试剂，如VEGF拮抗剂、VEGF受体拮抗剂、bFGF拮抗剂、bFGF受体拮抗剂、TGF-β拮抗剂、以及TGF-β受体拮抗剂。
用在本文中时，术语“核苷”指由连接到杂环特定位置的、或嘌呤或嘧啶的自然位置(嘌呤：9-位；嘧啶：1-位)的、或其类似物的相当位置的任何戊糖或修饰的戊糖部分组成的化合物。
用在本文中时，术语“核苷酸”指在核苷的5’位取代的磷酸酯。
用在本文中时，术语“杂环”指在环中具有诸如N、O、S、Se或P的至少一个杂原子的单价饱和的或不饱和的碳环基团，所述环的每一个可能的位置可以独立地被例如羟基、氧、氨基、亚氨基、低级烷基、溴、氯和/或氰基的基团任选取代。术语“杂环”包括嘌呤和嘧啶在内。
用在本文中时，术语“嘌呤”指含氮的二环杂环。
用在本文中时，术语“嘧啶”指含氮的单环杂环。
用在本文中时，术语“L-核苷”指具有L-核糖糖部分的核苷化合物。
术语“抗肿瘤”剂、药物或化合物指任何减少肿瘤细胞增殖的试剂剂，包括任何化疗剂、生物反应调节物(包括但不限于(i)能够加工或改变生物反应的蛋白分子，即肽分子及(ii)能够加工或改变生物反应的非蛋白分子，即非肽分子)、细胞毒性剂或细胞生长抑制剂。
术语“抗纤维化”剂、药物或化合物指包括防止或减少纤维化的试剂，包括：II型干扰素受体激动剂(例如γ-干扰素)；吡非尼酮和吡非尼酮类似物；抗血管生成剂，例如VEGF拮抗剂、VEGF受体拮抗剂、bFGF拮抗剂、bFGF受体拮抗剂、TGF-β拮抗剂、以及TGF-β受体拮抗剂；以及抗炎剂，包括肿瘤坏死因子(TNF)拮抗剂，例如抗-TNF抗体(例如REMICADETM抗-TNF单克隆抗体)和可溶TNF受体(例如ENBRELTMTNF受体-Ig免疫粘附素)，以及IL-1拮抗剂，例如IL-1Ra。
术语“化疗剂”或“化疗的”(或“化疗”，以化疗剂治疗时)指包括可用于癌症治疗的任何非蛋白(即非肽)化合物。化疗剂的实例包括诸如塞替派和环磷酰胺(CYTOXANTM)等烷化剂类；诸如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡等烷基磺酸酯类；benzodopa、卡波醌、meturedopa和uredopa等氮丙啶类(aziridines)；环乙亚胺和methylamelamines，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；番荔枝内酯(acetogenin)(特别是布拉他辛和bullatacinone)；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康)；苔藓虫素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻环肽(特别是念珠藻环肽1和念珠藻环肽8)；海兔毒素；duocarmycin(包括合成类似物KW-2189和CBI-TMI)；eleutherobin；pancratistatin；sarcodictyin；spongistatin；诸如chlorambucil、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、甲二氯二乙胺、盐酸氮芥氧化物、美法仑、novembichin、phenesterine、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥等氮芥；诸如卡莫司汀、chlorozotocin、foremustine、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀等亚硝基脲；诸如烯二炔类抗生素等抗生素(例如刺孢霉素，特别是刺孢霉素γ1I和刺孢霉素φIl，例如参见Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.，33：183-186(1994)；达内霉素，包括达内霉素A；双磷酸盐类，例如氯屈膦酸盐；esperamicin；以及新制癌菌素发色团和相关的色蛋白烯二炔类抗生素发色团)，阿克拉霉素、放线菌素、authramycin、重氮乙酰丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、carabicin、洋红霉素、carzinoplilin、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸、阿霉素(AdramycinTM)(包括吗啉-多柔比星，氰基吗啉-多柔比星、2-吡咯啉-多柔比星和脱氧多柔比星)、表阿霉素、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、例如丝裂霉素C等丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、potfiromycin、嘌呤霉素、quelamycin、罗多比星、链黑菌素、链脲佐菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)等抗代谢产物；诸如demopterin、甲氨喋呤、蝶罗呤、三甲曲沙等叶酸类似物；诸如氟达拉滨、6-巯嘌呤、thiamiprine、硫鸟嘌呤等嘌呤类似物；诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿嘧啶、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿嘧啶脱氧核苷等嘧啶类似物；诸如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯等雄激素类；诸如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦等抗肾上腺类；诸如fiolinic acid等叶酸补充物；醋葡醛内酯；醛磷酰胺葡糖苷；氨基酮戊酸；5-乙炔尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；edatraxate；defofamine；秋水仙胺；地吖醌；elfornithine；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；诸如美登素和安丝菌素等maytansinoids；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；phenamet；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼树脂酸；2-乙肼；丙卡巴肼；PSK@；雷佐生；利索新；西佐喃；spirogerrnanium；细交链孢子菌酮酸；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢霉毒素(特别是T-2毒素、verracurin A、露湿漆斑霉素和anguidine)；urethane；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(″Ara-C″)；环磷酰胺；thiopeta；紫杉醇类，例如太平洋紫衫醇(TAXOLB，Bristol Meyers Squibb Oncology，Princeton，NJ)和多烯紫衫醇(TAXOTERE@，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨(GemzarTM)；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；诸如顺铂和卡铂等铂类似物；长春花碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；mitroxantrone；vancristine；长春瑞滨(NavelbineTM)；盐酸米托蒽醌；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基喋呤；xeoloda；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；诸如视黄酸等视黄醛衍生物；卡培他滨；以及任何上述的药物可接受的盐、酸或衍生物。“化疗剂”的定义还包括抗激素剂，其作用为调节或抑制激素对肿瘤的作用，该抗激素剂例如抗雌激素类和选择性雌激素受体调节物(SERMs)，例如包括tarnoxifen(包括NolvadexTM)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(FarestonTM)；芳香化酶抑制剂，其调节肾上腺中雌激素的产生，例如4(5)-咪唑类、氨鲁米特、醋酸甲地孕酮(MegaceTM)、依西美坦、福美斯坦、fadrozole、伏氯唑(RivisorTM)、来曲唑(FemaraTM)和阿那曲唑(ArimidexTM)；以及诸如氟他胺、尼鲁米特、bicalutarnide、亮丙瑞林和戈舍瑞林等抗雄激素类；以及任何上述的药物可接受的盐、酸或衍生物。
术语“抗肿瘤”剂、药物或化合物指任何减少肿瘤细胞增殖的试剂，包括任何化疗剂、生物反应调节物(包括但不限于(i)能够加工或改变生物反应的蛋白分子，即肽分子及(ii)能够加工或改变生物反应的非蛋白分子，即非肽分子)、细胞毒性剂或细胞生长抑制剂。
术语“生物反应调节物”指能够加工或改变与癌症治疗相关的生物反应的任何蛋白(即肽)分子或任何非蛋白(即非肽)分子。生物反应调节物的实例包括诸如抗肿瘤抗原抗体等肿瘤相关抗原的拮抗物，能够诱导细胞增殖的细胞受体拮抗物，能够诱导凋亡的细胞受体激动剂如Apo-2配体，诸如干扰素-α分子和干扰素-β分子等I型干扰素受体激动剂，诸如干扰素-γ分子等II型干扰素受体激动剂，诸如IL-28A、IL-28B和IL-29等III型干扰素受体激动剂，炎性细胞因子的拮抗剂，包括诸如抗TNF抗体(例如REMICADETM抗TNF单克隆抗体)和可溶TNF受体(例如ENBRELTMTNF受体-Ig免疫粘附素)等肿瘤坏死因子(TNF)拮抗剂，生长因子细胞因子，例如生血细胞因子，其包括诸如EPOGENTM epoetin-alfa等促红细胞生成素，诸如NEUPOGENTM filgrastim等粒细胞集落刺激因子(G-CSFs)，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSFs)，以及血栓形成剂，诸如白介素-2等淋巴细胞生长因子细胞因子，以及生长因子细胞因子的拮抗剂，包括生血因子的拮抗剂，例如血管内皮细胞生长因子(VEGF)拮抗剂，例如AVASTINTM bevacizumab(抗-VEGF单克隆抗体)。
用在本文中时，术语“HCV酶抑制剂”指抑制HCV编码的酶的酶活性的任何试剂。术语“HCV酶抑制剂”包括但不限于抑制HCV NS3蛋白酶活性的试剂、抑制HCV NS3解旋酶活性的试剂、以及抑制HCV NS5BRNA依赖的RNA聚合酶活性的试剂。
用在本文中时，术语“HCV NS3蛋白酶抑制剂”和“NS3蛋白酶抑制剂”指抑制HCV NS3/NS4A复合体的蛋白酶活性的试剂。除非另外指出，术语“NS3抑制剂”与术语HCV NS3蛋白酶抑制剂”和“NS3蛋白酶抑制剂”可互换使用。
用在本文中时，术语“HCV NS5B抑制剂”、“NS5B抑制剂”和“HCVNS5B RNA依赖的RNA聚合酶抑制剂”、“HCV RDRP抑制剂”和“RDRP抑制剂”指抑制HCV NS5B RNA依赖的RNA聚合酶活性的任何试剂。
在继续描述本发明之前，应当理解本发明并不限于所述的特定实施方案，因为一些实施方案当然可以变化。还应当理解本文所用术语只是出于描述特定实施方案的目的，并非有意限制，因为本发明的范围只受到权利要求的限制。
当提供数值范围时，应当理解本发明包括在所述范围的上限和下限之间的每一个其间值，除上下文明确指出外直到下限的单位的十分之一，以及任何其它述及的范围或介于述及范围其间的值。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在该较小范围内，也被包括在本发明内，但服从所述范围内任何特定排除的限制。当所述范围包括一个或两个边界值时，排除该一个或两个边界值的范围也包括在本发明中。
除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语具有和本发明所属领域的技术人员所理解的含义相同的含义。尽管可以在本发明的实践或试验中使用与本文所述的相似或等同的任何方法和材料，但现在本文描述优选的方法和材料。通过参考将本文中提及的所有出版物并入本文，用以公开和描述与引用该参考文献相关的方法和材料。
应当指出的是，以在本文中和权利要求书中时，除上下文清楚指明之外，单数形式“a”、“an”和“the”包括所指事物的复数。因此，例如，叙述“一抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体”包括多个该多肽变体，并且，叙述“该口服制剂”包括本领域技术人员已知的一种或多种口服制剂及其等同物，等等。
仅由于本文所讨论的出版物在本申请的提交日之前公开，所以提供这些出版物。本文中的所有内容均不应被解释为承认本发明不通过在先发明而先于所述出版物。此外，所提供出版物的出版日期可能与实际出版日期不同，可能需要分别核实实际出版日期。
发明详细描述
本发明提供包含母体蛋白治疗剂的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体的口服药物组合物。该已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体含有(1)与至少一个未在母体蛋白治疗剂中发现的非天然糖基化位点共价连接的糖部分，或者(2)与至少一个在母体蛋白治疗剂中发现的但未糖基化的天然糖基化位点共价连接的糖部分。此外，该已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替在母体蛋白治疗剂中发现的天然蛋白酶切割位点，因此该多肽变体与母体蛋白治疗剂相比显示出增强的蛋白酶抗性。
本发明还提供治疗患者疾病的治疗方法，该方法涉及向患者给予口服剂型的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体，给药间隔为每剂递送更多药物(以摩尔计算)以及每单位时间内递送至少与患者在特定方法中接受到的一样多的次数，该特定方法被证明通过皮下推注肠胃外剂型的所述母体多肽有效治疗所述疾病。
本发明还提供含有一个或多个糖基化位点的合成的I型干扰素受体多肽激动剂；以及包含所述激动剂的组合物，包括药物组合物。本发明还提供包含编码所述多肽激动剂的核苷酸序列的核酸；以及包含所述核酸的宿主细胞。本发明还提供包含所述多肽激动剂的容器和试剂盒。
所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂包含含有至少一个糖基化位点的杂种或共有I型干扰素受体多肽激动剂。所述糖基化位点提供糖部分在所述合成多肽激动剂上的连接位点，使得当所述合成多肽激动剂在能够糖基化的真核细胞中产生时，所述合成多肽激动剂被糖基化。相对于母体I型干扰素受体多肽激动剂，或者与天然存在的I型干扰素受体多肽激动剂相比，糖基化赋予所述合成多肽激动剂一种或多种优势。这些优势包括增加的血清半衰期、减少的免疫原性、增加的功能性体内半衰期、减少的通过胃肠道条件的降解、以及增加的通过肠上皮细胞的吸收。更高速度的通过肠上皮细胞的吸收以及减少的通过胃肠道条件的降解对于所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂的肠内(例如口服)制剂是重要的。
所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂可用于治疗多种病症，包括病毒感染、纤维化病症和增生病症。因此，本发明还提供治疗病毒感染的方法、治疗纤维化病症的方法、以及治疗增生病症的方法，所述方法通常涉及向有需要的个体给予有效剂量的所述合成多肽激动剂。在一些实施方案中，所述治疗方法还涉及给予至少一种另外的治疗剂，以治疗病毒感染、纤维化病症和增生病症。在一些实施方案中，所述治疗方法还涉及给予至少一种副作用控制剂以减少一种或多种治疗剂引起的副作用。
另一方面，本发明合成的I型干扰素受体多肽激动剂用作检测和分离I型干扰素受体的试剂，例如I型干扰素受体在多种细胞类型和组织中表达的检测以及基于I型干扰素受体表达的细胞分选，该表达的检测包括确定I型干扰素受体密度和在细胞群中的分布。另一方面，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂可用于试剂开发，该试剂与I型干扰素受体的结合或活化模式与所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂与I型干扰素受体的结合或活化模式相似。本发明的合成的I型干扰素受体多肽激动剂可用于I型干扰素受体信号传导分析，以筛选I型干扰素受体信号的小分子激动剂或拮抗剂。
多肽变体
本发明涉及抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体。该抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替在母体蛋白治疗剂中发现的天然蛋白酶切割位点，因此该多肽变体与母体蛋白治疗剂相比显示出增强的蛋白酶抗性。
在母体蛋白治疗剂中发现的并在抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体中突变的切割位点，在本文中被称为“突变的蛋白酶切割位点”或者“突变切割位点”，所述位点不再被切割母体蛋白中蛋白酶切割位点的蛋白酶切割，或者对切割显示出更高的抗性(即与天然位点相比是蛋白水解过程的更差底物)。在母体蛋白治疗剂中发现的蛋白酶切割位点在本文中被称为“天然蛋白酶切割位点”。
此外，抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包括(1)与至少一个未在母体蛋白治疗剂中发现的非天然糖基化位点共价连接的糖部分，或者(2)与至少一个在母体蛋白治疗剂中发现的但未糖基化的天然糖基化位点共价连接的糖部分。未在母体蛋白治疗剂中发现的糖基化位点在本文中被称为“非天然糖基化位点”。在母体蛋白治疗剂中发现的但未糖基化的糖基化位点在本文中被称为“天然糖基化位点”。因此，抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包括(1)与至少一个非天然糖基化位点共价连接的糖部分和/或(2)与至少一个天然糖基化位点共价连接的糖部分。包括(1)与非天然糖基化位点共价连接的糖部分或(2)与天然糖基化位点共价连接的糖部分，并包含至少一个替代在母体蛋白治疗剂中发现的天然蛋白酶切割位点的突变的蛋白酶切割位点的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体在本文中被称为“抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体”。
“已知的”抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体指目前存在的或者此后产生的任何抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体，其(1)保留母体蛋白治疗剂的需要的药物活性以及(2)当向患者以相似形式并且以相似剂量、给药频率和给药途径给药时，与母体蛋白治疗剂相比，其显示更长的血清半衰期或更大的随时间变化的血清中药物浓度的曲线下面积(AUC)。本发明提供包含已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体的组合物，该组合物包括口服药物组合物。
已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体在适合口服递送的制剂中提供。通常将母体蛋白治疗剂在适合皮下推注的速释制剂中给药。典型地，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体的口服剂型含有第一摩尔数；肠胃外剂型中的所述母体蛋白治疗剂含有第二摩尔数。大体上，第一摩尔数大于第二摩尔数。尽管如此，在口服剂型中的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体在不长于特定时长的时间段内释放，该特定时长为在被证明有效治疗患者疾病的方案中以母体蛋白治疗剂给药的给药间隔。
所述母体蛋白治疗剂通常在通过皮下推注给药的肠胃外剂型中，该皮下推注提供了“储库(depot)”效果，通过药物从围绕注射部位的组织中向外扩散缓慢释放蛋白治疗剂到血流中。
本发明的主题方法用类似的药物动力学特征代替所述皮下推注“储库”效果，其通过口服递送长效试剂(具有比其母体蛋白更长的血清半衰期和/或AUC的已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体)而不用延长释放或者储库型制剂来实现。换句话说，当口服给药时，释放第一摩尔数的已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体所需的时间不长于在通过皮下推注给药被证明有效治疗疾病的方法中将所述母体蛋白治疗剂两次给药之间的时长。因此，在一些实施方案中，以比母体蛋白治疗剂更高的剂量(以摩尔数计算)将已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体给药，给药的频率至少与母体蛋白治疗剂相同，或者在许多情况下更经常地给药。
结构特征
抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体具有包含一个或多个突变的蛋白切割位点的氨基酸序列，该突变的蛋白切割位点代替了在相应的母体蛋白治疗剂中发现的天然蛋白切割位点；并且具有包含(1)一个或多个非天然糖基化位点和/或(2)一个或多个天然糖基化位点的氨基酸序列。因此，例如，期望的多肽变体具有包含一个或多个代替在母体蛋白治疗剂中发现的天然蛋白切割位点的突变的蛋白切割位点的氨基酸序列；并且具有包含一个或多个未在母体蛋白治疗剂中发现的或者在母体蛋白治疗剂中发现但未糖基化的糖基化位点的氨基酸序列。母体蛋白治疗剂在一些实施方案中是相应的天然存在的多肽。在其它实施方案中，母体蛋白治疗剂是非天然存在的多肽(例如合成多肽、杂种多肽、共有多肽、融合多肽、重组多肽或者天然存在多肽的其它变体)。用在本文中时，术语“多肽变体”和“变体多肽”都指包含一个或多个代替在母体蛋白治疗剂中发现的天然蛋白切割位点的突变的蛋白切割位点的任何多肽；并且其包含(1)一个或多个未在母体蛋白治疗剂中发现的糖基化位点或(2)一个或多个在母体蛋白治疗剂中发现但未糖基化的糖基化位点。
非天然的和天然的糖基化位点包括N-连接糖基化位点和O-连接糖基化位点。N-连接糖基化位点例如包括Asn-X-Ser/Thr，其中天冬酰胺残基为N-连接糖基化提供位点，并且X是任何氨基酸。N-连接糖基化位点包括至少一个丝氨酸或苏氨酸残基。本领域已知并且文献中已报道多种O-连接糖基化位点。例如参见，Ten Hagen et al.(1999)J.Biol.Chem.274(39)：27867-74；Hanisch et al.(2001)Glycobiology 11：731-740；和Ten Hagen et al.(2003)Glycobiology 13：1R-16R。
在所有的实施方案中，多肽变体被超糖基化，例如，多肽变体包含(1)与非天然糖基化位点共价连接的糖部分和/或(2)与非天然糖基化位点共价连接的糖部分。在许多实施方案中，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含与天然糖基化位点共价连接的糖部分；以及与非天然糖基化位点共价连接的糖部分。在一些实施方案中，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含O-连接的糖基化位点。在其它实施方案中，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含N-连接的糖基化位点。在其它实施方案中，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含O-连接的糖基化位点和N-连接的糖基化位点。
在一些实施方案中，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含1、2、3、4或5个糖部分，每一个都连接到不同的糖基化位点。在一些实施方案中，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体在非天然糖基化位点被糖基化。在一些这样的实施方案中，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体在单个非天然糖基化位点被糖基化。在其它实施方案中，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体在多于一个的非天然糖基化位点被糖基化，例如，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体在2、3、或4个非天然糖基化位点被糖基化。
在其它实施方案中，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体在天然糖基化位点被糖基化。在一些这样的实施方案中，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体在单个天然糖基化位点被糖基化。在其它实施方案中，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体在多于一个天然糖基化位点被糖基化，例如，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶的、超糖基化的多肽变体在2、3、或4个天然糖基化位点被糖基化。
在其它实施方案中，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体在天然糖基化位点和非天然糖基化位点被糖基化。
已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体可包含至少一个另外的糖部分，当在能够进行N-和/或O-连接的蛋白糖基化的真核细胞中合成每一个母体蛋白治疗剂时，未在其中发现所述糖部分。因此，例如，与母体蛋白治疗剂相比，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶的、超糖基化的多肽变体可以包含至少1个、至少2个、至少3个、或至少4个、或更多另外的糖部分。例如，当母体蛋白治疗剂具有一个共价连接的糖部分时，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体可以具有2、3、4个或更多的共价连接的糖部分。在一些实施方案中，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体缺乏与非天然糖基化位点共价连接的糖部分；并且取而代之地，具有至少1个、至少2个、至少3个、或至少4个、或更多的与天然糖基化位点连接的另外的糖部分。在其它实施方案中，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体缺乏与天然糖基化位点共价连接的糖部分；并且取而代之地，具有至少2个、至少3个、或至少4个、或更多的与非天然糖基化位点连接的糖部分。
糖基化的I型干扰素
所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂可具有共有或杂种I型干扰素受体多肽激动剂的氨基酸序列，该氨基酸序列包含一个或多个非天然糖基化位点。因此，例如，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂可具有包含一个或多个未在天然存在的I型干扰素受体多肽激动剂中发现的糖基化位点(例如，未在任何已知的天然存在的IFN-α、IFN-β或IFN-ω中发现)的氨基酸序列。用在此处时，术语“非天然糖基化位点”被定义为位于合成的I型干扰素受体多肽激动剂氨基酸序列中的糖基化位点，对于该糖基化位点/位置，在天然存在的I型干扰素受体多肽激动剂氨基酸序列中不存在同源的糖基化位点/位置。
可选择地，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂可具有共有或杂种I型干扰素受体多肽激动剂的氨基酸序列，该氨基酸序列包含一个或多个天然存在的或天然糖基化位点。用在本文此处时，术语“天然糖基化位点”被定义为位于合成的I型干扰素受体多肽激动剂氨基酸序列中的糖基化位点，对于该糖基化位点/位置，在至少一种天然存在的I型干扰素受体多肽激动剂氨基酸序列中存在同源的糖基化位点/位置。
用在此处时，术语“合成的I型干扰素受体多肽激动剂”被定义为包含一个或多个糖基化位点的任何共有或杂种I型干扰素受体多肽激动剂。因此，“合成的I型干扰素受体多肽激动剂”包括包含一个或多个糖基化位点的任何杂种或共有I型干扰素受体多肽激动剂，包括包含一个或多个天然糖基化位点和/或一个或多个非天然糖基化位点的任何杂种或共有I型干扰素受体多肽激动剂。
“母体I型干扰素受体多肽激动剂”是用作比较参考点的I型干扰素受体多肽激动剂。在一些实施方案中，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂包含至少一个未在母体I型干扰素受体多肽激动剂中发现的另外的糖基化位点。例如，在一些实施方案中，母体I型干扰素受体多肽激动剂是Infergen共有IFN-α(InterMune，Inc.，Brisbane，Calif.)。如图25所示，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂包含一个或多个未在母体Infergen共有IFN-α中发现的糖基化位点。
所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂具有从约150个氨基酸至约200个氨基酸的长度，例如，从约150个氨基酸至约155个氨基酸、从约155个氨基酸至约160个氨基酸、从约160个氨基酸至约165个氨基酸、从约165个氨基酸至约170个氨基酸、从约170个氨基酸至约175个氨基酸、从约175个氨基酸至约180个氨基酸、从约180个氨基酸至约185个氨基酸、从约185个氨基酸至约190个氨基酸、从约190个氨基酸至约195个氨基酸、或者从约195个氨基酸至约200个氨基酸。
在一些实施方案中，天然存在的I型干扰素受体多肽激动剂的氨基酸序列被修饰以使其包括至少一个非天然糖基化位点。作为一个非限制性实例，当天然存在的I型干扰素受体多肽激动剂包含氨基酸序列KDSS时，该KDSS序列被修饰为KNSS。作为另一非限制性实例，当天然存在的I型干扰素受体多肽激动剂包含氨基酸序列WDET时，该WDET序列被修饰为WNET。作为另一非限制性实例，当天然存在的I型干扰素受体多肽激动剂包含氨基酸序列VEET时，该VEET序列被修饰为VTET。作为另一非限制性实例，当天然存在的I型干扰素受体多肽激动剂包含氨基酸序列VEET时，该VEET序列被修饰为VNET。
在许多实施方案中，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂被糖基化。在一些实施方案中，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂包含O-连接糖基化。在其它实施方案中，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂包含N-连接糖基化。在其它实施方案中，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂包含O-连接和N-连接糖基化。
在一些实施方案中，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂在非天然糖基化位点被糖基化。在一些这样的实施方案中，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂在单个非天然糖基化位点被糖基化。在其它实施方案中，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂在多于一个非天然糖基化位点被糖基化，例如，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂在2、3或4个非天然糖基化位点被糖基化。
在其它实施方案中，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂在天然糖基化位点被糖基化。在一些这样的实施方案中，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂在单个天然糖基化位点被糖基化。在其它实施方案中，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂在多于一个的天然糖基化位点被糖基化，例如，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂在2、3或4个天然糖基化位点被糖基化。
在其它实施方案中，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂在天然糖基化位点和非天然糖基化位点被糖基化。
使用标准技术容易地确定所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂是否包含N-连接和/或O-连接的糖基化。参见，例如，“Techniques inGlycobiology(糖生物学技术)”R.Townsend and A.Hotchkiss，eds.(1997)Marcel Dekker；以及“Glycoanalysis Protocols (Methods in MolecularBiology，Vol.76)(糖分析实验方案(分子生物学方法，76卷))”E.Hounsell，ed.(1998)Hurnana Press。用化学或酶去糖基化(例如使用内切糖苷酶和/或外切糖苷酶)处理前后的蛋白电泳迁移的变化被常规地用于确定蛋白的糖基化状态。可以使用多种酶的任何一种进行酶去糖基化，包括但不限于，肽-N4-(N-乙酰基-β-D-葡糖胺基)天冬酰胺酰胺酶(PNGase F)；内切糖苷酶F1、内切糖苷酶F2、内切糖苷酶F3、α(2→3，6，8，9)神经氨酸酶等等。例如，用PNGase F或者不用PNGaseF预处理，进行所述蛋白的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。用PNGaseF处理后条带宽度的显著下降以及迁移位置的变化被认为是N-连接糖基化的鉴别特征。还可以使用蛋白印迹的凝集素分析(例如，蛋白以SDS-PAGE分离，并被转移到诸如尼龙膜等支持物上)来检测糖基化蛋白的糖含量。凝集素是来自多种植物组织的糖结合蛋白，对于许多在糖蛋白聚糖中发现的确定的糖表位具有高亲和性和严密的特异性。Cummings(1994)Methods inEnzymol.230：66-86。凝集素可被可检测地标记(直接地或间接地)，以允许检测凝集素与糖基化蛋白上的糖的结合。例如，当与生物素或地高辛(digoxigenin)连接时，可以通过采用与特定酶偶联的抗生物素蛋白或抗地高辛配基抗体的反应产生可检测的产物而容易地在膜印迹上确定与糖基化蛋白结合的凝集素，所述特定酶例如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶或辣根过氧化物酶。用一系列具有明确特异性的凝集素进行筛选提供关于糖蛋白糖补充物的大量信息。
具有非天然糖基化位点的共有I型干扰素受体多肽激动剂
在一些实施方案中，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂包含共有氨基酸序列以及至少一个非天然糖基化位点。在其它实施方案中，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂包含共有氨基酸序列以及至少一个天然糖基化位点。
通过比对三个或更多氨基酸序列并且确定至少两个序列共有的氨基酸得到共有序列。在一些实施方案中，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂包含共有序列，该共有序列得自确定天然存在的人IFN-α2b、天然存在的人IFN-α14和天然存在的人IFN-β1的共有序列。在其它实施方案中，合成的I型干扰素受体多肽激动剂包含共有序列，该共有序列得自确定天然存在的人IFN-α2b、天然存在的人IFN-α14和天然存在的人IFN-ω1的共有序列。在其它实施方案中，合成的I型干扰素受体多肽激动剂包含共有序列，该共有序列得自确定天然存在的人IFN-α2b、天然存在的人IFN-β1和天然存在的人IFN-ω1的共有序列。在其它实施方案中，合成的I型干扰素受体多肽激动剂包含共有序列，该共有序列得自确定天然存在的人IFN-α14、天然存在的人IFN-β1和天然存在的人IFN-ω1的共有序列。在其它实施方案中，合成的I型干扰素受体多肽激动剂包含共有序列，该共有序列得自确定天然存在的人IFN-α2b、天然存在的人IFN-α14、天然存在的人IFN-β1和天然存在的人IFN-ω1的共有序列。在其它实施方案中，所述比较还包含将Infergen共有IFN-α的氨基酸序列包括在所述比较中。
在一些这样的实施方案中，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂是含有一个或多个糖基化位点的共有序列，该糖基化位点来源于一个或多个用于产生该共有序列的母体I型干扰素受体多肽激动剂。在另外的实施方案中，所述共有序列被进一步修饰以包括至少一个非天然糖基化位点。
在一实施方案中，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂包含对应于图24(SEQ ID NO：**)所描述的多数序列(majority sequence)的氨基酸序列，该序列被进一步修饰以包括至少一个非天然糖基化位点。
在另一实施方案中，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂包含对应于图24所描述的多数序列的氨基酸序列，该多数序列被进一步修饰以包括至少一个选自以下的糖基化位点：IFN-α2b的VTET糖基化位点、IFN-α14的KNSS糖基化位点、IFN-β1的WNET糖基化位点和IFN-ω1的WNMT糖基化位点。在其它实施方案中，该多数序列被额外修饰以包括一个或多个非天然糖基化位点。
在其它实施方案中，从共有序列获得合成的I型干扰素受体多肽激动剂，该共有序列不具有源自母体I型干扰素受体多肽激动剂的糖基化位点。这些实施方案中，为了获得所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂，进一步修饰所述共有序列以包括至少一个非天然糖基化位点。例如，在一些实施方案中，当所述共有序列包括KDSS时，该KDSS序列被修饰为KNSS或KNST。作为另一非限制性实例，当所述共有序列包括WDET时，该WDET序列被修饰为WNET或WNES。作为另一非限制性实例，当所述共有序列包括VEET时，该VEET序列被修饰为VTET、VNES或VNET。
在特定实施方案中，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂包含在图24中被确定为“多数序列”的氨基酸序列，并且还包括一个或多个以下修饰：KDSS被修饰为KNST；WDET被修饰为WNES；VEET被修饰为VNES或VNET。
在一些特定实施方案中，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂包含如SEQ ID NOs：*-*中任一个所示的氨基酸序列，如图25中所示。
在一实施方案中，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂包含对应于图28所描述的多数序列(SEQ ID NO：**)的氨基酸序列，该多数序列被进一步修饰以包括至少一个非天然糖基化位点。在一些实施方案中，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂包含如SEQ ID NOs：*-*中任一个所示的氨基酸序列，如图28中所示。
在一实施方案中，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂包含对应于图29所描述的多数序列(SEQ ID NO：*)的氨基酸序列，该多数序列被进一步修饰以包括至少一个非天然糖基化位点。在一些实施方案中，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂包含如SEQ ID NOs：*-*中任一个所示的氨基酸序列，如图29中所示。
具有非天然糖基化位点的杂种I型干扰素受体多肽激动剂
在一些实施方案中，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂包含具有一个或多个糖基化位点的杂种I型干扰素受体多肽激动剂。在其它实施方案中，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂包含具有一个或多个未在任何天然存在的I型干扰素受体多肽激动剂中发现的糖基化位点的杂种I型干扰素受体多肽激动剂。用在本文中时，“杂种I型干扰素受体多肽激动剂”是具有特定氨基酸序列的多肽，该特定氨基酸序列包含在氨基酸一致性和数量上对应于不同的天然存在的I型干扰素受体多肽激动剂的亚序列的不连续亚序列(discrete sub-sequence)，其中所述合成的多肽激动剂的氨基酸序列与任何天然存在的I型干扰素受体多肽激动剂的氨基酸序列都不同。在一些实施方案中，所述不连续亚序列选自IFN-α2b、IFN-α14、IFN-β1和IFN-ω，并且所述多肽激动剂的氨基酸序列与天然存在的I型干扰素受体多肽激动剂IFN-α2b、IFN-α14、IFN-β1和IFN-ω的氨基酸序列都不同。
在其它实施方案中，所述不连续亚序列可以选自IFN-α2b、IFN-α14、IFN-β1、Infergen共有IFN-α以及IFN-ω，并且所述多肽激动剂的氨基酸序列分别与I型干扰素受体多肽激动剂IFN-α2b、IFN-α14、IFN-β1、Infergen共有IFN-α以及IFN-ω的每一氨基酸序列都不同。
在一些这样的实施方案中，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂是杂种I型干扰素受体多肽激动剂氨基酸序列，该氨基酸序列含有一个或多个源自用于产生所述杂种序列的一个或多个母体I型干扰素受体多肽激动剂氨基酸序列的糖基化位点。在其它实施方案中，所述杂种序列被进一步修饰以引入至少一个另外的非天然糖基化位点(除源自母体I型干扰素受体多肽激动剂氨基酸序列的任何非天然糖基化位点之外)。
应当理解，本发明的I型干扰素受体多肽激动剂包括这样的杂种I型干扰素受体多肽激动剂，即该杂种I型干扰素受体多肽激动剂通过用特定氨基酸残基替代母体IFN-α氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基而形成，其中该特定氨基酸残基在另一母体IFN-α氨基酸序列中的同源位置处形成天然糖基化位点。
在一非限制性实例中，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂是具有杂种序列的杂种I型干扰素受体多肽激动剂，该杂种序列通过用KNSS替代干扰素α-2a的序列中或干扰素α-2b的序列中的天然KDSS残基而形成。这些合成的I型干扰素受体多肽激动剂在本文中分别被称为IFN-α2a(D99N)和IFN-α2b(D99N)，其中氨基酸序列编号显示在图24中。
在另一非限制性实例中，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂是具有杂种序列的杂种I型干扰素受体多肽激动剂，该杂种序列通过用WNET替代干扰素α-2a的序列中或干扰素α-2b的序列中的天然WDET残基而形成。这些合成的I型干扰素受体多肽激动剂在本文中分别被称为IFN-α2a(D105N)和IFN-α2b(D105N)，其中氨基酸序列编号显示在图24中。
在另一非限制性实例中，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂是具有杂种序列的杂种I型干扰素受体多肽激动剂，该杂种序列通过分别用KNSS和WNET替代干扰素α-2a的序列中或干扰素α-2b的序列中的天然KDSS和WDET残基而形成。这些合成的I型干扰素受体多肽激动剂在本文中分别被称为IFN-α2a(D99N，D105N)和IFN-α2b(D99N，D105N)，其中氨基酸序列编号为图24中所示的。
在其它实施方案中，从不具有任何源自母体I型干扰素受体多肽激动剂氨基酸序列的糖基化位点的杂种序列获得所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂。在这些实施方案中，为了获得所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂，随后进一步修饰所述杂种序列以包括至少一个非天然糖基化位点。例如，在一些实施方案中，当所述杂种序列包括KDSS时，该KDSS序列被修饰为KNSS。作为另一非限制性实例，当所述杂种序列包括WDET时，该WDET序列被修饰为WNET。作为另一非限制性实例，当所述杂种序列包括VEET时，该VEET序列被修饰为VTET或VNET。
在一些实施方案中，按顺序从N-末端到C-末端，合成的I型干扰素受体多肽激动剂包含第一I型干扰素受体多肽激动剂的约2个至约90个，例如，约2个至约5个、约5个至约7个、约7个至约10个、约10个至约15个、约15个至约20个、约20个至约25个、约25个至约30个、约30个至约35个、约35个至约40个、约40个至约45个、约45个至约50个、约50个至约55个、约55个至约60个、约60个至约65个、约65个至约70个、约75个至约80个、约80个至约85个、或约85个至约90个连续的氨基酸，以及第二I型干扰素受体多肽激动剂的约2个至约90个，例如，约2个至约5个、约5个至约7个、约7个至约10个、约10个至约15个、约15个至约20个、约20个至约25个、约25个至约30个、约30个至约35个、约35个至约40个、约40个至约45个、约45个至约50个、约50个至约55个、约55个至约60个、约60个至约65个、约65个至约70个、约75个至约80个、约80个至约85个、或约85个至约90个连续的氨基酸，其中该第一I型干扰素受体多肽激动剂选自天然存在的人IFN-α2b(SEQ ID NO：*)、天然存在的人IFN-α14(SEQ ID NO：*)、天然存在的人IFN-β1(SEQ ID NO：*)和天然存在的人IFN-ω1(SEQ ID NO：*)；该第二I型干扰素受体多肽激动剂选自天然存在的人IFN-α2b、人IFN-α14、人IFN-β1和人IFN-ω1，其中所述的第一和第二I型干扰素受体多肽激动剂不同。
在一些实施方案中，所述杂种合成的I型干扰素受体多肽激动剂还包含第三I型干扰素受体多肽激动剂的约2个至约90个，例如，约2个至约5个、约5个至约7个、约7个至约10个、约10个至约15个、约15个至约20个、约20个至约25个、约25个至约30个、约30个至约35个、约35个至约40个、约40个至约45个、约45个至约50个、约50个至约55个、约55个至约60个、约60个至约65个、约65个至约70个、约75个至约80个、约80个至约85个、或约85个至约90个连续的氨基酸，该第三I型干扰素受体多肽激动剂选自天然存在的人IFN-α2b、人IFN-α14、人IFN-β1和人IFN-ω1，其中所述的第三I型干扰素受体多肽激动剂与所述第一和第二I型干扰素受体多肽激动剂不同。
在其它实施方案中，所述杂种合成的I型干扰素受体多肽激动剂还包含第四I型干扰素受体多肽激动剂的约2个至约90个，例如，约2个至约5个、约5个至约7个、约7个至约10个、约10个至约15个、约15个至约20个、约20个至约25个、约25个至约30个、约30个至约35个、约35个至约40个、约40个至约45个、约45个至约50个、约50个至约55个、约55个至约60个、约60个至约65个、约65个至约70个、约75个至约80个、约80个至约85个、或约85个至约90个连续的氨基酸，该第四I型干扰素受体多肽激动剂选自天然存在的人IFN-α2b、人IFN-α14、人IFN-β1和人IFN-ω1，其中所述的第四I型干扰素受体多肽激动剂与所述第一、第二和第三I型干扰素受体多肽激动剂不同。
在特定实施方案中，所述杂种合成的I型干扰素受体多肽激动剂的任何上述实施方案包含人IFN-α14多肽的一区段的约4个至约90个，例如，约4个至约7个、约7个至约10个、约10个至约15个、约15个至约20个、约20个至约25个、约25个至约30个、约30个至约35个、约35个至约40个、约40个至约45个、约45个至约50个、约50个至约55个、约55个至约60个、约60个至约65个、约65个至约70个、约75个至约80个、约80个至约85个、或约85个至约90个连续的氨基酸，该区段至少包括天然存在的人IFN-α14的氨基酸序列KNSS。
在特定实施方案中，所述杂种合成的I型干扰素受体多肽激动剂的任何上述实施方案包含人IFN-β1多肽的一区段的约4个至约90个，例如，约4个至约7个、约7个至约10个、约10个至约15个、约15个至约20个、约20个至约25个、约25个至约30个、约30个至约35个、约35个至约40个、约40个至约45个、约45个至约50个、约50个至约55个、约55个至约60个、约60个至约65个、约65个至约70个、约75个至约80个、约80个至约85个、或约85个至约90个连续的氨基酸，该区段至少包括天然存在的人IFN-β1的氨基酸序列WNET。
在特定实施方案中，所述杂种合成的I型干扰素受体多肽激动剂的任何上述实施方案包含人IFN-ω1多肽的一区段的约4个至约90个，例如，约4个至约7个、约7个至约10个、约10个至约15个、约15个至约20个、约20个至约25个、约25个至约30个、约30个至约35个、约35个至约40个、约40个至约45个、约45个至约50个、约50个至约55个、约55个至约60个、约60个至约65个、约65个至约70个、约75个至约80个、约80个至约85个、或约85个至约90个连续的氨基酸，该区段至少包括天然存在的人IFN-ω1的氨基酸序列WNMT。
在特定实施方案中，所述杂种合成的I型干扰素受体多肽激动剂的任何上述实施方案包含人IFN-α2b多肽的一区段的约4个至约90个，例如，约4个至约7个、约7个至约10个、约10个至约15个、约15个至约20个、约20个至约25个、约25个至约30个、约30个至约35个、约35个至约40个、约40个至约45个、约45个至约50个、约50个至约55个、约55个至约60个、约60个至约65个、约65个至约70个、约75个至约80个、约80个至约85个、或约85个至约90个连续的氨基酸，该区段至少包括天然存在的人IFN-α2b的氨基酸序列VTET。
功能特征
所述合成的多肽是I型干扰素受体多肽激动剂，例如，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂与I型干扰素受体结合并且引起通过I型干扰素受体的信号传导。可以通过任何已知的分析容易地确定所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂是否具有I型干扰素受体激动剂的功能。所述分析包括基于体外细胞的分析以检测干扰素响应基因的活化(例如，使用与含有一个或多个干扰素响应元件的启动子可操作地连接的报告基因)等等。所述分析还包括分析I型干扰素受体活化活性的KIRA分析，如以下“诊断用途”部分中所述。
在一些实施方案中，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂显示一种或多种以下活性：抗增生活性、抗病毒活性和抗纤维化活性。可以使用任何已知的分析容易地确定所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂是否显示抗病毒活性，所述分析例如包括基于体外细胞的病毒复制抑制分析。例如参见，Patick et al.(1999)Antimicrobial Agents and Chemotherapy43：2444-2450。可以使用任何已知的分析容易地确定所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂是否显示抗增生活性，所述分析包括基于体外细胞的增生抑制分析。
所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂显示一种或多种以下特性：增加的血清半衰期；减小的体内免疫原性；增加的体内功能半衰期；增加的稳定性；减少的通过胃肠道条件的降解；以及改善的水溶性。
在一些实施方案中，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂与天然存在的I型干扰素受体多肽激动剂或与母体I型干扰素受体多肽激动剂相比具有增加的血清半衰期。术语“血清半衰期”在本文中与术语“血浆半衰期”和“循环半衰期”可以互换使用。在一些实施方案中，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂的血清半衰期比缺乏非天然糖基化位点的天然存在的I型干扰素受体多肽激动剂或母体I型干扰素受体多肽激动剂的血清半衰期长至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约100％(或2倍)、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍或至少约5倍。在一些实施方案中，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂的血清半衰期比天然存在的I型干扰素受体多肽激动剂或者具有与天然存在的I型干扰素受体激动剂相同的氨基酸序列的I型干扰素受体多肽激动剂的血清半衰期长至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约100％(或2倍)、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍或至少约5倍。
使用公知的方法可以容易地确定所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂的血清半衰期。例如，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂被可检测地标记，并且将其向个体(例如非人类实验动物或者人类对象)给药，并且，在给予所述激动剂之后的不同时间点，抽取血液样品并且确定可检测地标记的合成的I型干扰素受体多肽激动剂在该血液样品中的量。
在一些实施方案中，与天然存在的I型干扰素受体多肽激动剂相比，或者与母体I型干扰素受体多肽激动剂相比，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂对通过胃肠道条件的降解显示出增强的抗性。在一些实施方案中，与缺乏非天然糖基化位点的天然存在的I型干扰素受体多肽激动剂或母体I型干扰素受体多肽激动剂的水平相比，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂显示出在胃肠道中的降解减少至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、或至少约90％或更多。
使用公知的方法可以容易地确定所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂对通过胃肠道条件的降解是否显示出增强的抗性。例如，所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂在体外与在胃肠道中发现的消化酶接触，并且确定这些酶对该所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂的结构和功能完整性的影响。可以使用体内方法确定对通过胃肠道条件降解的抗性。
适合用于本发明的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体是母体蛋白治疗剂的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体，其中该母体蛋白治疗剂是当向患者给药时能够有效治疗患者疾病或状况的任何蛋白治疗剂。示例性蛋白治疗剂的名单在以下提供。如同相应的母体蛋白治疗剂，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体在治疗患者的相同疾病或状况中有效。
抗蛋白酶的或抗蛋白酶的、超糖基化的多肽变体
已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体是蛋白治疗剂的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的变体，并且在许多实施方案中以第一单位形式提供。该第一单位形式可在口服药物组合物中包含第一摩尔数的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体。所述母体蛋白治疗剂在许多实施方案中可以处在适合皮下推注的速释制剂中，即第二单位形式，其中第一单位形式中的第一摩尔数大于第二单位形式中的所述蛋白治疗剂的第二摩尔数。例如，所述第一摩尔数可以比所述第二摩尔数高至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、或至少约75％、或至少约100％、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约6倍、或至少约7倍、或至少约8倍、或至少约9倍、或至少约10倍或更多。
在许多实施方案中，一旦将所述第一单位形式向患者口服给药，第一摩尔数的所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体释放所需的时间不长于当在治疗方案中以第二单位形式通过皮下推注以一定给药频率将母体蛋白治疗剂给药时其各剂之间的时长，所述治疗方案被证明有效治疗患者疾病或状况。因此，例如，当将所述第一单位形式口服给药时，释放第一摩尔数的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体所需的时间比当通过皮下推注以选定的给药频率将第二单位形式的母体治疗剂给药时其各剂之间的时间间隔短至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、或至少约50％或更多。在一些实施方案中，所述第一单位形式处于适合口服递送的速释制剂中。
可以通过口以高于通过皮下推注将相应的母体多肽给药的频率将已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体给药。例如，通过口将已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体给药的频率可以是通过皮下推注将相应的母体多肽给药的频率的至少2倍、至少21/3倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、或至少4倍、或至少5倍、或至少6倍或更多倍。因此，例如，当母体多肽治疗剂为每周一次给药时，可以将所述相应的抗蛋白酶的或抗蛋白酶的、超糖基化的多肽变体每周2次、每周3次、每天1次、每天2次、每天3次或多于每天3次给药。
作为一非限制性实例，所述母体蛋白治疗剂是IFN-γ1b，并且将该IFN-γ1b以适合皮下注射的单位剂型给药，给药剂量为皮下1×106国际单位(IU)/m2(或50μg/m2或3.0×10-9mo1./m2)，每周3次，使得一周总剂量为150μg/m2(或3×106 IU/m2或9.0×10-9mol./m2)。期望的IFN-γ1b的超糖基化、抗蛋白酶的变体处于适合口服输送的单位剂型中；将已知的超糖基化、抗蛋白酶的IFN-γ1b变体以口服并且高于每周3次的频率(例如，每周4次、每周5次、每周6次、每天1次、每天2次或每天3次)给药；并且将超糖基化、抗蛋白酶的IFN-γ1b变体以高于或等于9.0×10-9mol./m2的每周总剂量给药，例如，该每周总剂量从约9.0×10-9mol./m2至约1.0×10-8mol./m2、从约1.0×10-8mol./m2至约2.5×10-8mol./m2、从约2.5×10-8mol./m2至约5.0×10-8mol./m2、或从约5.0×10-8mol./m2至约7.5×10-8mol./m2、或从约7.5×10-8mol./m2至约1.0×10-7mol./m2、或从约1.0×10-7mo1./m2至约1.0×10-6mol./m2。
在另一方面，被给药的所述超糖基化、抗蛋白酶的IFN-γ1b变体的每周总剂量高于或等于500μg，例如，从约500μg至约750μg、从约750μg至约1000μg、从约1000μg至约1500μg或从约1500μg至约2000μg。
与相应的母体多肽相比，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体显示增强的蛋白酶抗性。在一些实施方案中，在人血液中、人血清中或含有一种或多种蛋白酶的体外混合物中，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体对血清蛋白酶的抗性显示出比相应的母体蛋白治疗剂对血清蛋白酶的抗性高至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约100％(或2倍)、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约600倍、至少约700倍、至少约800倍、至少约900倍、或至少约1000倍、或更多倍。
在一些实施方案中，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体对α-胰凝乳蛋白酶、内切蛋白酶Arg-C、内切蛋白酶Asp-N、内切蛋白酶Glu-C、内切蛋白酶Lys-C和胰蛋白酶中的一种或多种显示出比相应的母体蛋白治疗剂高至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约100％(或2倍)、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约600倍、至少约700倍、至少约800倍、至少约900倍、或至少约1000倍、或更多倍的抗性。
在一些实施方案中，通过比较在体外人血液或人血清中，或者在包含一种或多种血清蛋白酶的体外组合物中，所述多肽变体的半衰期和相应的母体蛋白治疗剂的半衰期，确定所述多肽变体的蛋白酶抗性增强的程度。例如，可以通过以下方法确定对蛋白酶切割的抗性，该方法为在使所述多肽变体和所述相应的母体蛋白治疗剂分别接触蛋白酶混合物、人血清或人血液后，检测抗蛋白酶多肽变体的生物活性水平；并且比较所述多肽变体和所述相应的母体蛋白治疗剂的活性。如果在与人血液、人血清、或一种或多种蛋白酶一起孵育之后，所述多肽变体的生物活性高于所述相应的母体蛋白治疗剂，那么所述多肽变体与所述母体蛋白治疗剂相比具有增强的蛋白酶抗性。
以下为用于确定蛋白酶抗性的体外分析的一个非限制性实例。在不同的容器中，向含有α-胰凝乳蛋白酶、羧肽酶、内切蛋白酶Arg-C、内切蛋白酶Asp-N、内切蛋白酶Glu-C、内切蛋白酶Lys-C和胰蛋白酶各1.5pg的混合物中加入多肽变体和相应的母体蛋白治疗剂，形成反应混合物；将该反应混合物在25保持30分钟。在30分钟的反应时间结束时，加入抑制所述蛋白酶活性的试剂；并且检测所述多肽变体以及相应的母体蛋白治疗剂的生物活性。以下为用于确定蛋白酶抗性的体外分析的另一非限制性实例。在不同的容器中，向人血液的溶解物或者人血清中加入多肽变体和相应的母体蛋白治疗剂，形成反应混合物；将该反应混合物在37℃保持合适的时长(例如，5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、或60分钟等等)。然后加入抑制所述蛋白酶活性的试剂；并且检测所述多肽变体以及相应的母体蛋白治疗剂的生物活性。
所述相应的母体蛋白治疗剂可以是被证明有效治疗患者疾病或状况的任何母体蛋白治疗剂，该母体蛋白治疗剂以速释制剂通过以适合的给药频率皮下推注所述第二单位形式向患者给药。在这些实施方案中，当以特定给药频率以第一单位形式向患者口服给药时，所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体有效治疗患者的相同的疾病或状况，其中该特定给药频率不低于所述母体蛋白治疗剂方案的给药频率。
在许多实施方案中，已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体在哺乳动物宿主中显示期望的药理活性，例如，超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体可以显示至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或至少约95％的相应的母体蛋白治疗剂的期望的药理活性。作为非限制性实例，超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体可以显示一种或多种以下活性：抗增生活性、抗病毒活性、抗纤维化活性、造血活性、血管生成活性、酶活性、生长因子活性、趋化因子活性、受体激动剂活性、受体拮抗剂活性和抗血管生成活性；所述活性是相应的母体蛋白治疗剂的期望活性。
已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体与在相似条件下给药的母体蛋白治疗剂相比显示增加的血清半衰期或增加的AUC。
在一些实施方案中，与相应的母体多肽相比，已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体具有增加的血清半衰期。术语“血清半衰期”与术语“血浆半衰期”和“循环半衰期”在本文中可以互换使用。在一些实施方案中，超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体具有比相应的母体蛋白治疗剂的血清半衰期长至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约100％(或2倍)、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约600倍、至少约700倍、至少约800倍、至少约900倍、或至少约1000倍、或更多倍的血清半衰期。在一些实施方案中，通过比较体内人血液或人血清中所述已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的半衰期和相应的母体蛋白治疗剂的半衰期，确定所述已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的半衰期增加的程度。
在一些实施方案中，通过比较在体外人血液或人血清中，或者在包含一种或多种血清蛋白酶的体外组合物中，所述已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的半衰期和相应的母体蛋白治疗剂的半衰期，确定所述已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的半衰期增加的程度。例如，可以通过以下方法确定对蛋白酶切割的抗性，该方法为在使所述多肽变体和所述相应的母体蛋白治疗剂分别接触蛋白酶混合物、人血清或人血液后，检测所述已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的生物活性水平；并且比较所述多肽变体和所述相应的母体蛋白治疗剂的活性。如果在与人血液、人血清、或一种或多种蛋白酶一起孵育之后，所述多肽变体的生物活性高于所述相应的母体蛋白治疗剂，那么所述多肽变体与所述母体蛋白治疗剂相比具有增加的半衰期。
在一些实施方案中，已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的AUC比在相似条件下给药的母体蛋白治疗剂的AUC高至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约100％(或2倍)、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍或至少约5倍。
使用公知的方法可以容易地确定已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的血清半衰期或AUC。例如，已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体被可检测地标记，并且将其向个体(例如非人类实验动物或者人类对象)给药，并且在给予所述超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体之后的不同时间点，抽取血液样品并且确定可检测地标记的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体在该血液样品中的量。
3D-扫描方法
可使用3D-扫描(结构同源性)方法产生母体蛋白治疗剂的糖基化的或抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体。结构同源性指两个蛋白之间的拓扑结构和三维结构的同源性。本领域已知多种方法用于确定三维结构同源的蛋白的结构相关氨基酸位置。示例性方法包括但不限于：CATH(分类、结构、拓扑结构和同源超家族)，其为蛋白结构域结构的基于四种不同水平的分等级的分类(Orengo et al.，Structure，5(8)：1093-1108，1997)；CE(最佳路径的组合延伸(combinatorial extension))，其为计算成对的结构比对的方法(Shindyalov et al.，Protein Engineering，11(9)：739-747，1998)；FSSP(基于蛋白的结构-结构比对的折叠分类(fold classification))，其为基于目前Protein Data Bank(PDB)中所有的三维蛋白结构的完全比较的数据库(Holm et al.，Science，273：595-602，1996)；SCOP(蛋白的结构分类)，其提供基于所有已知其结构的蛋白之间的结构和进化关系的说明性数据库(Murzin et al.，J.Mol.Biol.，247：536-540，1995)；以及VAST(载体比对检索工具)，其将新确定的3维蛋白结构坐标与MMDB/PDB数据库中的那些进行比较(Gibrat et al.，Current Opinion in Structural Biology，6：377-385，1995)。
作为非限制性实例，通过2维推理扫描方法产生对蛋白酶解具有增强抗性的IFN-α2b突变体；确定了与IFN-α2b具有结构同源性的细胞因子家族成员上相应的残基，以及该确定的在其它细胞因子上的残基被类似地修饰以产生对蛋白酶解具有增强抗性的细胞因子。例如参见WO04/022593。
蛋白治疗剂
已知的抗蛋白酶或抗蛋白酶的、超糖基化的多肽变体是在治疗哺乳动物宿主疾病或状况中在哺乳动物宿主中具有治疗功能的多肽(“母体蛋白治疗剂”)的变体。已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体治疗与母体蛋白治疗剂相同的宿主疾病或状况。
应当注意，在氨基酸替代以产生母体蛋白治疗剂的抗蛋白酶变体的情况下，用于描述改变蛋白酶切割位点的氨基酸替代的氨基酸编号与图1-23中所示的氨基酸编号一致。在氨基酸替代以产生母体蛋白治疗剂的超糖基化变体的情况下，用于描述产生超糖基化位点的氨基酸替代的氨基酸编号与图24-30中所示的氨基酸编号一致。可以容易地确定例如图1和图24中所示的IFN-α的相应氨基酸的位置。例如，图24所示的IFN-α2b的D99对应于图2所示的IFN-α2b的D71和图1所示的IFN-α2a的D71对于本领域技术人员是很明显的。因此，例如，图24所示的IFN-2b氨基酸序列的D99和D105分别对应于图1所示的IFN-α2a氨基酸序列以及图2所示的IFN-α2b氨基酸序列的D71和D77；图24所示的IFN-α2b氨基酸序列的R50对应于图2所示的IFN-α2b氨基酸序列的R23；图24所示的Infergen氨基酸序列的D99、D105和E134分别对应于图9所示的共有IFN-α氨基酸序列的D71、D77和D106；图24所示的IFN-β1氨基酸序列的S99、E134和F136氨基酸位置分别对应于图3所示的IFN-β氨基酸序列的S74、E109和F111；图31所示的IFN-γ氨基酸序列的E38、S40和S99氨基酸位置分别对应于图4所示的IFN-γ氨基酸序列的E41、S43和S102。
适合的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包括哺乳动物宿主需要的任何母体蛋白治疗剂的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的形式，所述母体蛋白治疗剂包括但不限于干扰素(例如IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IFN-ω、IFN-τ；以下有更详细的描述)；胰岛素((例如诺和灵、优泌林(mumulin)、优泌乐(humalog)、兰德仕(Lantus)、特慢胰岛素(Ultralente)等等)；促红细胞生成素(例如Procrit、Eprex、或Epogen(依泊汀-α)；Aranesp(达依泊汀-α)；NeoRecormon、Epogin(依泊汀-β)等等)；抗体(例如单克隆抗体)(例如Rituxan(利妥昔单抗)；Remicade(英利昔单抗)；Herceptin(曲妥珠单抗)；HumiraTM(阿达木单抗)；Xolair(奥马珠单抗)；Bexxar(托西莫单抗)；RaptivaTM(efalizurnab)；ErbituxTM(西妥昔单抗)等等)，包括单克隆抗体的抗原结合片段；血液因子(例如Activase(组织纤维蛋白溶酶原激活剂)组织纤溶酶原激活剂；NovoSeven(重组人凝血因子VIIa)；凝血因子VIIa；凝血因子VIII(例如Kogenate)；凝血因子IX；β-球蛋白；血红蛋白等等)；集落刺激因子(例如Neupogen(惠尔血；G-CSF)；Neulasta(聚乙二醇化非格司亭)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-单核细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、巨核细胞集落刺激因子等等)；生长激素(例如，生长激素(somatotropin)，如Genotropin、Nutropin、Norditropin、Saizen、Serostim、Humatrope等等；人生长激素等等)；白介素(例如IL-1；IL-2，包括例如Proleukin；IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9等等)；生长因子(例如Regranex(beclapermin；PDGF)；Fiblast(曲弗明；bFGF)；Stemgen(ancestim；干细胞因子)；角质形成细胞生长因子；酸性成纤维细胞生长因子、干细胞因子、碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子等等)；可溶受体((例如TNF-α-结合可溶受体，例如Enbrel(依那西普)；可溶VEGF受体；可溶白介素受体；可溶γ/δT细胞受体等等)；酶(例如α-葡萄糖苷酶；Cerazyme(伊米苷酶；β-葡糖脑苷脂酶)，Ceredase(阿糖脑苷酶))；酶激活剂(例如组织纤溶酶原激活剂)；趋化因子(例如IP-10；Mig；Groα/IL-8，RANTES；MIP-1α；MIP-1β；MCP-1；PF-4等等)；血管生成剂(例如血管内皮生长因子(VEGF))；抗血管生成剂(例如可溶VEGF受体)；蛋白疫苗；神经活性肽，例如缓激肽、胆囊收缩素、胃泌素、肠促胰液素、催产素、促性腺激素释放激素、β-内啡呔、脑啡肽、P物质、生长激素释放抑制因子、促乳素、甘丙肽、生长激素释放激素、蛙皮素、华法林、强啡肽、神经紧张素、能动素、促甲状腺激素、神经肽Y、促黄体素、降钙素、胰岛素、高血糖素、血管加压素、血管紧张素II、促甲状腺激素释放激素、血管活性肠肽、睡眠肽等等；其它蛋白，例如血栓溶解剂、心房肽、骨形态发生蛋白、血小板形成蛋白、松弛素、胶质原纤维酸性蛋白、卵泡刺激素、人α-1抗胰蛋白酶、白血病抑制因子、转化生长因子、组织因子、胰岛素样生长因子、黄体化激素、卵泡刺激素、巨噬细胞活化因子、肿瘤坏死因子、中性白细胞趋化因子、神经生长因子、金属蛋白酶的组织抑制剂；舒血管肠肽、血管生成素、促血管素、纤维蛋白；水蛭素；白血病抑制因子；IL-1受体拮抗剂(例如Kineret@(阿那白滞素))等等。包含任何上述蛋白的全部或其部分的融合蛋白也是适合的。
如上所述，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的蛋白变体显示至少一种相应母体蛋白的期望药理活性。分析特定治疗性蛋白的实例包括但不限于GMCSF(Eaves，A.C.and Eaves C.J.，Erythropoiesis inculture(培养物中的红血球生成).In：McCullock E A(edt)Cell culturetechniques--Clinics in hematology(细胞培养技术--临床血液学)。W BSaunders，Eastbourne，pp 371-91(1984)；Metcalf，D.，International Journal ofCell Cloning 10：116-25(1992)；Testa，N.G.，et al.，Assays for hematopoieticgrowth factors(分析造血生长因子).In：Balkwill F R(edt)Cytokines Apractical Approach(细胞因子A实用方法)，pp 229-44；IRL Press Oxford1991)；EPO(生物分析：Kitamura et al.，J.Cell.Physiol.140 p323(1989))；水蛭素(血小板凝聚分析：Blood Coagul Fibrinolysis 7(2)：259-61(1996))；IFNα(抗病毒分析：Rubinstein et al.，J.Virol.37(2)：755-8(1981)；抗增生分析：Gao Y，et al Mol Cell Biol.19(11)：7305-13(1999)；以及生物分析：Czarniecki et al.，J.Virol.49 p490(1984))；GCSF(生物分析：Shirafuji et al，，Exp.Hematol.17 p116(1989)；鼠NFS-60细胞的增殖(Weinstein et al，ProcNatl Acad Sci 83：5010-4(1986))；胰岛素(3H-葡萄糖吸收分析：Steppan etal.，Nature 409(6818)：307-12(2001))；hGH(Ba/F3-hGHR增殖分析：J ClinEndocrinol Metab 85(11)：4274-9(2000)；生长激素的国际标准：Horm Res，51 Suppl 1：7-12(1999))；凝血因子X(凝血因子X活性分析：Van Wijk etal.Thromb Res 22：681-686(1981))；凝血因子VII(使用凝血酶原凝结时间的血凝固分析：Belaaouaj et al.，J.Biol.Chem.275：27123-8(2000)；Diaz-Collier et al.，Thromb Haemost 71：339-46(1994))。
干扰素
在一些实施方案中，所述母体蛋白治疗剂是干扰素，并且已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含(1)与至少一个未在所述母体干扰素中发现的非天然糖基化位点共价连接的糖部分，或(2)与至少一个在所述母体干扰素中发现的但未糖基化的天然糖基化位点共价连接的糖部分；并且包含一个或多个代替母体蛋白治疗剂中发现的天然蛋白酶切割位点的突变的蛋白酶切割位点。
在一些实施方案中，所述母体蛋白治疗剂是I型干扰素受体多肽激动剂。I型干扰素受体多肽激动剂包括IFN-α、IFN-β、IFN-τ和IFN-ω。因此，例如，抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体可以是抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的I型干扰素受体多肽激动剂变体，包括超糖基化的IFN-α、IFN-β、IFN-τ和IFN-变体，它们缺乏至少一个在母体蛋白中发现的蛋白酶切割位点。
在其它实施方案中，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体是于2004年8月9日提交的题为“Synthetic Type I InterferonReceptor Polypeptide Agonists(合成的I型干扰素受体多肽激动剂)”的美国临时专利申请(USSN 60/600,202)中描述了任何抗蛋白酶的或抗蛋白酶的、超糖基化的合成的I型干扰素受体多肽激动剂，将该申请在此并入其全部公开以供参考。
在其它实施方案中，所述母体蛋白治疗剂是II型干扰素受体多肽激动剂。II型干扰素受体多肽激动剂包括干扰素-γ(IFN-γ)。因此，例如，抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体可以是抗蛋白酶的或抗蛋白酶的、超糖基化的II型干扰素受体多肽激动剂变体，包括超糖基化的IFN-γ，其缺乏至少一个在所述母体蛋白中发现的蛋白酶切割位点。IFN-α
任何已知的IFN-α的氨基酸序列都可以被修饰以产生所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂。术语“干扰素-α”在本文中指相关多肽的家族，其抑制病毒复制和细胞增殖以及调节免疫应答。
适合的α干扰素包括但不限于天然存在的IFN-α(包括但不限于天然存在的IFN-α2a、IFN-α2b和IFN-α14)；美国专利第6,704,225号中描述的IFN-α；重组干扰素α-2b，例如Schering Corporation，Kenilworth，N.J.提供的Intron-A干扰素；重组干扰素α-2a，例如Hoffmann-La Roche，Nutley，N.J.提供的Roferon干扰素；重组干扰素α-2c，例如Boehringer IngelheimPharmaceutical，Inc.，Ridgefield，Conn.提供的Berofor干扰素；干扰素α-n1，纯化的天然α干扰素的混和物，例如Sumitomo，Japan提供的Sumiferon或如Glaxo-Wellcome Ltd.，London，Great Britain提供的Wellferon干扰素α-n1(INS)；以及干扰素α-n3，其为Interferon Sciences生产的天然α干扰素的混和物并且由Purdue Frederick Co.，Norwalk，Conn.以商标名Alferon提供；以及IFN-α14。
适合的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包括任何母体α干扰素多肽的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的形式。一方面，母体α干扰素多肽的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的变体具有与所述母体多肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列，其不同的程度为所述变体包含一个或多个未在所述母体多肽中发现的糖基化位点；并且所述变体还包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替在所述母体蛋白中发现的天然蛋白酶切割位点。
另一方面，所述母体多肽是IFN-α2a，并且所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体是[D99N]IFN-α2a糖肽，该[D99N]IFN-α2a糖肽是IFN-α2a的变体，其具有(a)天冬酰胺残基，该天冬酰胺残基替代IFN-α2a氨基酸序列的第99位氨基酸的天然天冬氨酸残基，以及(b)与所述天冬酰胺残基的R-基团共价连接的糖部分。应当理解，如果IFN-α2a序列具有赖氨酸残基，其替代图1所示的IFN-α2b序列的第50位氨基酸的精氨酸残基，那么IFN-α2a的氨基酸序列与图1所示的IFN-α2b的氨基酸序列相同。
另一方面，所述母体多肽是IFN-α2a，并且所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶的、超糖基化的多肽变体是[D99N，D105N]IFN-α2a糖肽，该[D99N，D105N]IFN-α2a糖肽是IFN-α2a的变体，其具有(a)天冬酰胺残基，该天冬酰胺残基替代IFN-α2a氨基酸序列的第99位和第105位氨基酸的每一个天然天冬氨酸残基，以及(b)与每一所述天冬酰胺残基的R-基团共价连接的糖部分。应当理解，如果IFN-α2a序列具有赖氨酸残基，其替代图1所示的IFN-α2b序列的第50位氨基酸的精氨酸残基，那么IFN-α2a的氨基酸序列与图1所示的IFN-α2b的氨基酸序列相同。
另一方面，所述母体多肽是IFN-α2b，并且所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体是[D99N]IFN-α2b糖肽，该[D99N]IFN-α2b糖肽是IFN-α2b的变体，其具有(a)天冬酰胺残基，该天冬酰胺残基替代图1所示的IFN-α2b氨基酸序列的第99位氨基酸天然天冬氨酸残基，以及(b)与所述天冬酰胺残基的R-基团共价连接的糖部分。
另一方面，所述母体多肽是IFN-α2b，并且所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶的、超糖基化的多肽变体是[D99N，D105N]IFN-α2b糖肽，该[D99N，D105N]IFN-α2b糖肽是IFN-α2b的变体，其具有(a)天冬酰胺残基，该天冬酰胺残基替代图1所示的IFN-α2b氨基酸序列的第99位和第105位氨基酸的每一天然天冬氨酸残基并且(b)具有与每一所述天冬酰胺残基的R-基团共价连接的糖部分。
适合的α干扰素还包括共有IFN-α(consensus IFN-α)。共有IFN-α(也被称为“CIFN”和“IFN-con”和“共有干扰素”)包括但不限于在美国专利第4,695,623号和第4,897,471号中公开的被称为IFN-con1、IFN-con2和IFN-con3的氨基酸序列；以及通过确定天然存在的干扰素α(如Infergen，InterMune，Inc.，Brisbane，Calif.)的共有序列而定义的共有干扰素。IFN-con1是Infergenalfacon-1产品的共有干扰素试剂。在本文中用其商标名(Infergen)或种类名(干扰素alfacon-1)指明Infergen共有干扰素产品。
适合的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包括任何母体共有IFN-α多肽的超糖基化形式；所述变体缺乏至少一个在母体蛋白中发现的蛋白酶切割位点。一方面，母体共有IFN-α多肽的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的变体具有与所述母体多肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列，其不同的程度为所述变体包含一个或多个未在所述母体多肽中发现的糖基化位点；并且所述变体包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替在所述母体蛋白中发现的天然蛋白酶切割位点。
另一方面，所述母体多肽是干扰素a1facon-1多肽，并且所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体是[D99N]干扰素alfacon-1糖肽，该[D99N]干扰素alfacon-1糖肽是干扰素alfacon-1多肽的变体，其具有(a)天冬酰胺残基，该天冬酰胺残基替代图1所示的Infergen(干扰素alfacon-1)氨基酸序列的第99位氨基酸天然天冬氨酸残基和(b)与所述天冬酰胺残基的R-基团共价连接的糖部分。
另一方面，所述母体多肽是干扰素alfacon-1多肽，并且所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体是[D99N，D105N]干扰素alfacon-1糖肽，该[D99N，D105N]干扰素alfacon-1糖肽是干扰素alfacon-1多肽的变体，其具有(a)天冬酰胺残基，该天冬酰胺残基替代图1所示的Infergen氨基酸序列的第99位和第105位氨基酸的每一天然天冬氨酸残基，以及(b)与每一所述天冬酰胺残基的R-基团共价连接的糖部分。
另一方面，所述母体多肽是干扰素alfacon-1多肽，并且所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体是[D99N，D105N，E134N]干扰素a1facon-1糖肽，该[D99N，D105N，E134N]干扰素alfacon-1糖肽是干扰素alfacon-1多肽的变体，其具有(a)天冬酰胺残基，该天冬酰胺残基分别替代图1所示的Infergen氨基酸序列的第99位氨基酸天然天冬氨酸残基、第105位氨基酸天然天冬氨酸残基和第134位氨基酸天然谷氨酸残基，以及(b)与每一所述天冬酰胺残基的R-基团共价连接的糖部分。
另一方面，所述母体多肽是干扰素alfacon-1多肽，并且所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体是[D99N，E134N]干扰素alfacon-1糖肽，该[D99N，E134N]干扰素alfacon-1糖肽是干扰素alfacon-1多肽的变体，其具有(a)天冬酰胺残基，该天冬酰胺残基分别替代图1所示的Infergen氨基酸序列的第99位氨基酸天然天冬氨酸残基和第134位氨基酸天然谷氨酸残基，以及(b)与每一所述天冬酰胺残基的R-基团共价连接的糖部分。
另一方面，所述母体多肽是干扰素alfacon-1多肽，并且所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体是[D105N，E134N]干扰素alfacon-1糖肽，该[D105N，E134N]干扰素alfacon-1糖肽是干扰素alfacon-1多肽的变体，其具有(a)天冬酰胺残基，该天冬酰胺残基分别替代图1所示的Infergen氨基酸序列的第105位氨基酸天然天冬氨酸残基和第134位氨基酸天然谷氨酸残基，以及(b)与每一所述天冬酰胺残基的R-基团共价连接的糖部分。
另一方面，所述母体多肽是干扰素alfacon-1多肽，并且所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体是[D99N，D105N，E134T]干扰素alfacoI-1糖肽，该[D99N，D105N，E134T]干扰素alfacon-1糖肽是干扰素alfacon-1多肽的变体，其具有(a)天冬酰胺残基，该天冬酰胺残基分别替代图1所示的Infergen氨基酸序列的第99位和第105位氨基酸天然天冬氨酸残基，(b)苏氨酸残基，该苏氨酸残基替代图1所示的Infergen氨基酸序列的第134位氨基酸谷氨酸残基，以及(c)与每一所述天冬酰胺和苏氨酸残基的R-基团共价连接的糖部分。
另一方面，所述母体多肽是干扰素alfacon-1多肽，并且所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体是[D99N，E134T]干扰素alfacon-1糖肽，该[D99N，E134T]干扰素alfacon-1糖肽是干扰素alfacon-1多肽的变体，其具有(a)天冬酰胺残基，该天冬酰胺残基替代图1所示的Infergen氨基酸序列的第99位氨基酸天然天冬氨酸残基，(b)苏氨酸残基，该苏氨酸残基替代图1所示的Infergen氨基酸序列的第134位氨基酸的谷氨酸残基，以及(c)与每一所述天冬酰胺和苏氨酸残基的R-基团共价连接的糖部分。
另一方面，所述母体多肽是干扰素alfacon-1多肽，并且所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体是[D105N，E134T]干扰素alfacon-1糖肽，该[D105N，E134T]干扰素alfacon-1糖肽是干扰素alfacon-1的变体，其具有(a)天冬酰胺残基，该天冬酰胺残基替代图1所示的Infergen氨基酸序列的第105位氨基酸天然天冬氨酸残基，(b)苏氨酸残基，该苏氨酸残基替代图1所示的Infergen氨基酸序列的第134位氨基酸的谷氨酸残基，以及(c)与每一所述天冬酰胺和苏氨酸残基的R-基团共价连接的糖部分。
当讨论氨基酸替代以产生所述母体蛋白治疗剂的超糖基化变体时，氨基酸的编号与用于描述图24所示的I型干扰素氨基酸序列的氨基酸编号一致。当氨基酸替代以产生所述母体蛋白治疗剂的抗蛋白酶变体时，用于描述IFN-α变体的氨基酸编号与图1中所述的氨基酸编号一致。
另一方面，母体干扰素α治疗剂的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体与该母体干扰素α治疗剂不同，以至于所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含(1)与未在所述母体干扰素α治疗剂中发现的非天然糖基化位点共价连接的糖部分和/或(2)与在所述母体干扰素α治疗剂中发现但未糖基化的天然糖基化位点共价连接的糖部分；并且包含至少一个代替母体IFN-α蛋白治疗剂中发现的天然蛋白酶切割位点的突变的蛋白酶切割位点。
IFN-β
任何已知的IFN-β的氨基酸序列都可以被修饰以产生所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂。术语干扰素-β(“INF-β”)包括天然存在的INF-β多肽；以及非天然存在的INF-β多肽。适合的β干扰素包括但不限于天然存在的IFN-β；IFN-β1a，例如Avonex(Biogen，Inc.)和Rebif(Serono，SA)；IFN-β1b(Betaseron；Berlex)等等。IFN-β的氨基酸序列是公开提供的；例如，用GenBank登记号NP_002167可找到人IFN-β1氨基酸序列，图24描述了该序列(SEQ ID NO：**)。图3也描述了人IFN-β氨基酸序列。
适合的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包括任何母体IFN-β多肽的超糖基化的形式。一方面，母体IFN-β多肽的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的变体具有与所述母体多肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列，以至于所述变体包含一个或多个未在所述母体多肽中发现的糖基化位点；并且包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替在所述母体IFN-β多肽中发现的天然蛋白酶切割位点。
当讨论氨基酸替代以产生所述母体蛋白治疗剂的超糖基化变体时，氨基酸的编号与用于描述图24所示的I型干扰素氨基酸序列的氨基酸编号一致。当氨基酸替代以产生所述母体蛋白治疗剂的抗蛋白酶变体时，用于描述IFN-β变体的氨基酸编号与图3中所述的氨基酸编号一致。
另一方面，母体干扰素β治疗剂的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体与该母体干扰素β治疗剂不同，以至于所述抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含(1)与未在所述母体干扰素-β治疗剂中发现的非天然糖基化位点共价连接的糖部分和/或(2)与在所述母体干扰素-β治疗剂中发现但未糖基化的天然糖基化位点共价连接的糖部分；并且包含至少一个代替在母体IFN-β蛋白治疗剂中发现的天然蛋白酶切割位点的突变的蛋白酶切割位点。
IFN-tau
任何已知的IFN-tau的氨基酸序列都可以被修饰以产生所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂。术语干扰素-tau包括天然存在的INF-tau多肽；以及非天然存在的INF-tau多肽。适合的tau干扰素包括但不限于天然存在的IFN-tau；Tauferon(Pepgen Corp.)；等等。IFN-tau可以包括GenBank登记号P15696、P56828、P56832、P56829、P56831、Q29429、Q28595、Q28594、S08072、Q08071、Q08070、Q08053、P56830、P28169、P28172和P28171所述的任何氨基酸序列。在本发明的方法或组合物中可以使用任何保留IFN-tau期望药理活性的抗蛋白酶或抗蛋白酶的、超糖基化的IFN-tau多肽变体。
适合的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包括任何母体IFN-tau多肽的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的形式。一方面，母体IFN-tau多肽的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶的、超糖基化的变体具有与所述母体多肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列，该不同的程度为所述变体包含一个或多个未在所述母体多肽中发现的糖基化位点；并且所述变体还包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替在所述母体IFN-tau多肽中发现的天然蛋白酶切割位点。
IFN-ω
任何已知的IFN-ω的氨基酸序列都可以被修饰以产生所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂。术语干扰素-ω(“IFN-ω”)包括天然存在的INF-ω多肽；以及非天然存在的INF-ω多肽。适合的IFN-ω包括但不限于天然存在的IFN-ω；重组IFN-ω，例如Biomed 510(BioMedicines)；等等。IFN-ω可以包括GenBank登记号NP_002168或AAA70091所述的氨基酸序列。
适合的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包括任何母体IFN-ω多肽的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的形式。一方面，母体IFN-ω多肽的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的变体具有与所述母体多肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列，该不同的程度为所述变体包含一个或多个未在所述母体多肽中发现的糖基化位点；并且包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替在所述母体多肽中发现的天然蛋白酶切割位点。
另一方面，所述母体多肽是IFN-ω1，并且所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体是[R99N]IFN-ω1糖肽，该[R99N]IFN-ω1糖肽是IFN-ω1的变体，其具有(a)天冬酰胺残基，该天冬酰胺残基替代IFN-ω1氨基酸序列的第99位氨基酸天然精氨酸残基，以及(b)与所述天冬酰胺残基的R-基团共价连接的糖部分；其中所述变体包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替在所述母体蛋白中发现的天然蛋白酶切割位点。
另一方面，所述母体多肽是IFN-ω1，并且所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体是[G134N]IFN-ω1糖肽，该[G134N]IFN-ω1糖肽是IFN-ω1的变体，其具有(a)天冬酰胺残基，该天冬酰胺残基替代IFN-ω1氨基酸序列的第134位氨基酸天然甘氨酸残基，以及(b)与所述天冬酰胺残基的R-基团共价连接的糖部分；并且所述变体包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替在所述母体蛋白中发现的天然蛋白酶切割位点。
另一方面，所述母体多肽是IFN-ω1，并且所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体是[G134T]IFN-ω1糖肽，该[G134T]IFN-ω1糖肽是IFN-ω1的变体，其具有(a)苏氨酸残基，该苏氨酸残基替代IFN-ω1氨基酸序列的第134位氨基酸天然甘氨酸残基，以及(b)与所述苏氨酸残基的R-基团共价连接的糖部分；并且所述变体包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替在所述母体蛋白中发现的天然蛋白酶切割位点。
另一方面，所述母体多肽是IFN-ω1，并且所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体是[S99N，G134N]IFN-ω1糖肽，该[S99N，G134N]IFN-ω1糖肽是IFN-1的变体，其具有(a)天冬酰胺残基，该天冬酰胺残基分别替代IFN-ω1氨基酸序列的第99位和第134位氨基酸天然丝氨酸和甘氨酸残基，并且(b)与每一所述天冬酰胺残基的R-基团共价连接的糖部分；并且所述变体包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替在所述母体蛋白中发现的天然蛋白酶切割位点。
另一方面，所述母体多肽是IFN-ω1，并且所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体是[S99N，G134T]IFN-ω1糖肽，该[S99N，G134 T]IFN-ω1糖肽是IFN-ω1的变体，其具有(a)天冬酰胺和苏氨酸残基，该天冬酰胺和苏氨酸残基分别替代IFN-ω1氨基酸序列(如图24所示)的第99位和第134位氨基酸天然丝氨酸和甘氨酸残基，并且(b)与每一所述天冬酰胺和苏氨酸残基的R-基团共价连接的糖部分；并且所述变体包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替在所述母体蛋白中发现的天然蛋白酶切割位点。
当讨论氨基酸替代以产生所述母体蛋白治疗剂的超糖基化变体时，氨基酸的编号与用于描述图24所示的I型干扰素氨基酸序列的氨基酸编号一致。当氨基酸替代以产生所述母体蛋白治疗剂的抗蛋白酶变体时，用于描述IFN-ω变体的氨基酸编码与图1中所述的氨基酸编码一致。
另一方面，母体干扰素-ω治疗剂的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体与该母体干扰素-ω治疗剂不同，以至于所述抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含(1)与未在所述母体干扰素-ω治疗剂中发现的非天然糖基化位点共价连接的糖部分和/或(2)与在所述母体干扰素-ω治疗剂中发现但未糖基化的天然糖基化位点共价连接的糖部分；并且包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替在所述母体多肽中发现的天然蛋白酶切割位点。
IFN-γ
可以从公共数据库(例如GenBank)、杂志发表物等等获得编码IFN-γ多肽的核酸序列。尽管多种哺乳动物IFN-γ多肽受到关注，但为了治疗人类疾病，通常使用人蛋白。人IFN-γ编码序列可以在Genbank登记号X13274、V00543和NM 000619下找到。相应的基因组序列可以在Genbank登记号J00219、M37265和V00536下找到。例如参见，Gray et al.(1982)Nature 295：501(Genbank X13274)；和Rinderknecht et al.(1984)J.B.C.259：6790。在一些实施方案中，所述IFN-γ被糖基化。
IFN-γ1b(Actimmune；人干扰素)是具有140个氨基酸的单链多肽。其在E.coli中被重组生产并且是非糖基化的(Rinderknecht et al.1984，JBiol.Chem.259：6790-6797)。美国专利第6,497,871号中讨论的重组IFN-γ也适用于本发明。
术语“IFN-γ”包括任何天然IFN-γ、重组IFN-γ及其衍生物，只要它们具有IFN-γ活性，特别是人IFN-γ活性。本领域已知人IFN-γ显示干扰素特征性的抗病毒和抗增生特性，以及数种其它的免疫调节活性。尽管IFN-γ基于上述序列，蛋白生产和蛋白水解加工可以导致其加工变体。上述Gray et al.提供的未被加工的序列由166个氨基酸(aa)组成。尽管在E.coli中生产的重组IFN-γ最初被认为具有146个氨基酸，(起始于第20位氨基酸)但随后发现天然人IFN-γ在第23位残基后被切割，产生具有143个aa的蛋白，或者如果存在末端蛋氨酸则为144个aa，所述蛋氨酸是在细菌中表达所必须的。纯化期间，成熟蛋白可以在C末端的第162位残基后被继续切割(参见Gray et al.序列)，产生具有139个氨基酸的蛋白，或者如果存在起始蛋氨酸则为140个aa，例如，如果该蛋氨酸为细菌表达所需。所述N-末端蛋氨酸是由mRNA翻译“起始”信号AUG编码的产物，并且在E.coli表达的特殊情况下未被处理掉。在其它微生物系统或真核表达系统中，蛋氨酸可能被去掉。
任何天然IFN-γ肽、其修饰物和变体、或者一种或多种肽的组合能够作为本发明方法和/或组合物所指的母体多肽。感兴趣的IFN-γ肽包括片段，并且其可以相对于全长序列在羧基末端被不同地截短。只要第24位至约第149位氨基酸(编号来自未加工多肽的残基)存在，这些片段就继续显示人γ干扰素的特征性性能。第155位氨基酸之后的氨基酸序列可被外来序列替代而不失去活性。例如参见美国专利第5,690,925号。天然IFN-γ部分包括来自氨基酸残基24-150；24-151，24-152；24-153，24-155；以及24-157的不同延伸的分子。
本发明的方法和/或组合物中可以使用保留母体IFN-γ多肽的期望药理活性的任何已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的IFN-γ多肽变体。
另一方面，母体干扰素-γ治疗剂的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体与该母体干扰素-γ治疗剂不同，以至于所述抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含(1)与未在所述母体干扰素-γ治疗剂中发现的非天然糖基化位点共价连接的糖部分和/或(2)与在所述母体干扰素-γ治疗剂中发现但未糖基化的天然糖基化位点共价连接的糖部分；并且包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替在所述母体IFN-γ多肽中发现的天然蛋白酶切割位点。
另一方面，所述母体蛋白治疗剂是干扰素γ-1b，并且所述母体干扰素γ-1b治疗剂的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体是糖基化的天然(野生型)人IFN-γ的抗蛋白酶变体。WO 02/081507中描述了糖基化的天然(野生型)人IFN-γ。
促红细胞生成素
在一些实施方案中，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含促红细胞生成素氨基酸序列，该序列与母体促红细胞生成素多肽相比包含至少一个非天然糖基化位点；所述多肽变体还包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替在母体EPO多肽中发现的天然蛋白酶切割位点。适合的促红细胞生成素多肽包括那些具有人促红细胞生成素的生物活性的蛋白，例如促红细胞生成素类似物、促红细胞生成素异构体(erythropoietin isoform)、促红细胞生成素片段、杂种促红细胞生成素蛋白、融合蛋白以及上述任何物质的寡聚物和多聚物。
促红细胞生成素的特定实例包括但不限于人促红细胞生成素(例如参见，Jacobs et al.(1985)Nature 313：806-810；以及Lin et al.(1985)Proc NatlAcad Sci USA 82：7580-7584)；美国专利第6,696,056号和第6,585,398号中讨论的促红细胞生成素多肽；在GanBank登记号NP_00790和CAA26095中提供的氨基酸序列；Epoetin alfa(EPREX；ERYPO)；新的血细胞发生刺激蛋白(NESP)(欧洲专利申请EP640619中描述的重组人促红细胞生成素(Epoetin)的超糖基化类似物)；国际专利申请WO9966054中描述的人促红细胞生成素类似物--人血清白蛋白融合蛋白；国际专利申请WO9938890中描述的促红细胞生成素突变体；促红细胞生成素ω，其可以从美国专利第5,688,679号中描述的人促红细胞生成素基因的Apa I限制性片段产生；国际专利申请WO9911781中描述的改变的糖基化的人促红细胞生成素；WO9805363或美国专利第5,643,575号中描述的PEG偶联的促红细胞生成素类似物。用于表达内源人促红细胞生成素的经修饰的细胞系的特定实例在国际专利申请WO9905268和WO9412650中有描述。
一方面，母体促红细胞生成素多肽的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体保留该母体促红细胞生成素的生血活性，如通过监测和测量患者的红细胞比容所确定的。
另一方面，所述母体多肽是EPOGENepoetin alfa，并且已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶的、超糖基化的多肽变体是ARANESPdarbepoetinalfa的抗蛋白酶变体。
胰岛素
在一些实施方案中，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含胰岛素氨基酸序列，该序列与母体胰岛素多肽相比包含至少一个非天然糖基化位点；所述多肽变体还包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替在母体胰岛素多肽中发现的天然蛋白酶切割位点。适合的胰岛素多肽包括但不限于胰岛素原、前胰岛素原和美国专利第4,992,417号、第4,992,418号、第5,474,978号、第5,514,646号、第5,504,188号、第5,547,929号、第5,650,486号、第5,693,609号、第5,700,662号、第5,747,642号、第5,922,675号、第5,952,297号、第6,034,054号、和6,211,144以及公布的PCT申请WO 00/121197、WO 09/010645和WO90/12814中公开的胰岛素形式。胰岛素类似物包括但不限于超活性胰岛素类似物、单体胰岛素和肝特异胰岛素类似物。胰岛素的各种形式包括Humalog、HumalogMix 50/50TM、HumalogMix 75/25TM、Humulin50/50、Humulin70/30、HumulinL、HumulinN、HumulinR、HumulinUltralente、Lantus、LenteIletinII、LenteInsulin、LenteL、Novolin70/30、NovolinL、NovolinN、NovolinR、NovoLogTM、NPH IletinI、NPH-N、猪NPH IletinII、猪Regular IletinII、Regular(浓缩的)IletinIIU-500、Regular IletinI和VelosvlinBR人(缓冲的)。
依照本发明适于修饰和使用的胰岛素多肽包括人胰岛素的类似物，其中位置B28是Asp、Lys、Leu、Val或Ala，并且位置B29是Lys或Pro；des(B28-B30)人胰岛素；des(B27)人胰岛素；des(B30)人胰岛素；人胰岛素的类似物，其中位置B28是Asp并且位置B29是Lys或Pro；人胰岛素的类似物，其中位置B28是Lys并且位置B29是Lys或Pro；AspB28人胰岛素；LysB28ProB29人胰岛素；B29-Nε-肉豆蔻酰基-des(B30)人胰岛素；B29-Nε-棕榈酰-des(B30)人胰岛素；B29-Nε-肉豆蔻酰人胰岛素；B29-Nε-棕榈酰人胰岛素；B28-Nε-肉豆蔻酰LysB28 ProB29人胰岛素；B28-Nε-棕榈酰LysB28ProB29人胰岛素；B30-Nε-肉豆蔻酰-ThrB29LysB30人胰岛素；B30-Nε-棕榈酰-ThrB29LysB30人胰岛素；B29-Nε-(N-棕榈酰-γ-谷氨酰基)-des(B30)人胰岛素；B29-Nε-(N-石胆酸酰基(1ithocholyl)-γ-谷氨酰)-des(B30)人胰岛素；B29-Nε-(ω-羧基十七酰)-des(B30)人胰岛素；以及B29-Nε-(ω-羧基十七酰)人胰岛素。
可以公开得到各种胰岛素多肽的氨基酸序列，例如从诸如GenBank等公共数据库、杂志发表物、专利和公开的专利申请等等得到。例如，人胰岛素的氨基酸序列可以在以下Genbank登记号下找到：CAA00714、CAA00713、CAA00712、CAA01254、1HISA和1HISB、1HIQA和1HIQB、1HITA和1HITB、1HLSA和1HLSB、1VKTA和1VKTB。
此外，胰岛素衍生物和其抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的形式可在本发明的方法和/或组合物中被分别用作母体多肽和已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体。胰岛素衍生物包括但不限于酰化的胰岛素、糖基化的胰岛素等等。酰化的胰岛素的实例包括美国专利第5,922,675号中公开的那些，例如使用C6-C21脂肪酸(例如肉豆蔻酸、十五酸、棕榈酸或硬脂酸)与甘氨酸、苯丙氨酸或赖氨酸的α-或ε-氨基酸衍生的胰岛素。
抗体
在一些实施方案中，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含抗体多肽氨基酸序列，与母体抗体多肽相比还包含至少一个非天然糖基化位点；该多肽变体还包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替在母体多肽中发现的天然蛋白酶切割位点。适合的抗体包括但不限于抗体的各种同种型(例如，IgG1、IgG3和IgG4)；通过任何方法产生的单克隆抗体；人源化抗体；嵌合抗体；单链抗体；抗体片段，例如Fv、F(ab′)2、Fab′、Fab、Facb等等；等等，只要该抗体能够结合抗原。适合的单克隆抗体包括对细胞表面受体特异的抗体和起到所述受体拮抗剂作用的抗体，包括但不限于TGF-β受体的抗体、TGF-α受体的抗体、VEGF受体的抗体(例如参见美国专利第6,617,160号、第6,448,077号和第6,365,157号)、表皮生长因子受体的抗体等等；对受体配体特异的抗体，包括但不限于针对TGF-β的抗体、针对TGF-α的抗体、针对VEGF的抗体等等；对肿瘤相关抗原特异的抗体；对CD20特异的抗体；对表皮生长因子受体-2特异的抗体；对IgE的受体结合结构域特异的抗体；对粘着分子特异的抗体(例如，对LFA-1的α亚基(CD11a)特异的抗体、对α4β7特异的抗体)等等。
血液因子
在一些实施方案中，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含血液因子多肽氨基酸序列，与母体血液因子多肽相比还包含至少一个非天然糖基化位点；该多肽变体还包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替在母体多肽中发现的天然蛋白酶切割位点。适合的血液因子多肽包括但不限于组织纤溶酶原激活剂(TPA)、凝血因子VIIa、凝血因子VIII、凝血因子IX、β-球蛋白、血红蛋白等等。可以公开得到各种血液因子的氨基酸序列，例如，从诸如GenBank等公共数据库、杂志发表物、专利和公开的专利申请等等得到。例如，人TPA的氨基酸序列在Genbank登记号P0070、NP_127509和NP-000921下找到；人凝血因子VIIa的氨基酸序列在Genbank登记号KFHU7下找到；人凝血因子IX的氨基酸序列在Genbank登记号P00740和NP_000124下找到；人凝血因子VIII的氨基酸序列在Genbank登记号AAH64380、AAH22513和P00451下找到。
一方面，所述母体多肽是ACTIVASE阿替普酶(alteplase)，并且所述抗蛋白酶的多肽变体是TNKaseTM替奈普酶(tenecteplase)的抗蛋白酶的变体。
集落刺激因子
在一些实施方案中，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含集落刺激因子多肽氨基酸序列，与母体集落刺激因子多肽相比还包含至少一个非天然糖基化位点；该多肽变体还包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替在母体多肽中发现的天然蛋白酶切割位点。适合的集落刺激因子包括但不限于粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，例如NEUPOGEN非格司亭(filgrastim)和NEULASTATM PEG化非格司亭(pegfilgrastim)；粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)，例如LEUKINE沙格司亭(sargramostim)；巨噬细胞集落刺激因子；巨核细胞集落刺激因子；IL-3；干细胞因子(SCF)等等。
可以公开得到各种血液因子的氨基酸序列，例如，从诸如GenBank等公共数据库、杂志发表物、专利和公开的专利申请等等得到。例如，IL-3的氨基酸序列在美国专利第4,877,729号和第4,959,455号以及国际专利申请WO 88/00598中公开；人G-CSF的氨基酸序列在美国专利第4,810,643号中公开；WO 91/02754和WO 92/04455公开包含IL-3的融合蛋白的氨基酸序列；WO 95/21197、WO 95/21254和美国专利第6,730,303号公开具有广泛多功能生血特性的融合蛋白；人G-CSF的氨基酸序列在Genbank登记号NP_757374、P09919、FQHUGL和NP_000750下找到；人GM-CSF的氨基酸序列在Genbank登记号NP_000749和P04141下找到；IL-3的氨基酸序列在Genbank登记号AAH66272、AAH66273和AAH66276下找到；等等。
生长激素
在一些实施方案中，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含生长激素多肽氨基酸序列，与母体生长激素多肽相比还包含至少一个非天然糖基化位点；该多肽变体还包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替在所述母体多肽中发现的天然蛋白酶切割位点。适合的生长激素多肽包括但不限于生长素(somatotropin)；人生长激素；美国专利第6,143,523号、第6,136,563号、第6,022,711号和第5,688,666号公开的任何生长激素变体；包含生长激素的融合蛋白，例如美国专利第5,889,144号中公开的；保留生长激素活性的生长激素片段；美国专利第6,387,879号公开的生长激素受体多肽激动剂；等等。生长激素包括已知生长激素的其它形式，例如人生长激素的其它形式(hGH)，包括天然存在的衍生物、变体和代谢产物，hGH的降解产物，该hGH主要为生物合成的hGH和通过重组方法产生的hGH的工程化变体(例如参见美国专利第6,348,444号)。
生长因子
在一些实施方案中，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含生长因子多肽氨基酸序列，其与母体生长激素多肽相比还包含至少一个非天然糖基化位点；该多肽变体还包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替在所述母体多肽中发现的天然蛋白酶切割位点。适合的生长因子多肽包括但不限于角质形成细胞生长因子；酸性成纤维细胞生长因子、干细胞因子、碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子等等；生长因子的活性片段；包含生长因子的融合蛋白；等等。可以公开得到各种生长因子的氨基酸序列，例如，从诸如GenBank等公共数据库、杂志发表物、专利和公开的专利申请等等得到。例如，bFGF的氨基酸序列在Genbank登记号AAB20640、AAA57275、A43498和AAB20639下找到；aFGF的氨基酸序列在Genbank登记号AAB29059、CAA46661和1605206A下找到；干细胞因子的氨基酸序列在Genbank登记号AAH69733、AAH69783和AAH69797下找到；角质形成细胞生长因子的氨基酸序列在Genbank登记号O35565、AAL05875和P21781下找到；肝细胞生长因子的氨基酸序列在Genbank登记号AAA64239、AAB20169和CAA40802下找到。
可溶受体
在一些实施方案中，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含可溶受体多肽氨基酸序列，与母体可溶受体多肽相比还包含至少一个非天然糖基化位点；该多肽变体还包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替在所述母体多肽中发现的天然蛋白酶切割位点。适合的可溶受体多肽包括但不限于结合TNF-α的可溶受体、可溶VEGF受体、可溶白介素受体、可溶IL-1受体、可溶II型IL-1受体、可溶γ/δT细胞受体、可溶受体的配体结合片段等等。适合的可溶受体结合配体，该配体在正常生理条件下结合并且激活相应的与膜结合的或细胞表面的受体。因此，由于配体通常结合处于其天然(例如膜结合的)形式的受体，适合的可溶受体通过结合该配体而起到受体拮抗剂的作用。
可以公开得到各种可溶受体的氨基酸序列，例如，从诸如GenBank等公共数据库、杂志发表物、专利和公开的专利申请等等得到。例如，可溶VEGF受体的氨基酸序列在Genbank登记号AAC50060和NP_002010下找到；可溶VEGF受体在美国专利第6,383,486号、第6,375,929号和第6,100,071号中有描述；可溶IL-4受体在美国专利第5,599,905号中有描述；可溶IL-1受体在美国专利公开第20040023869号中有描述；等等。
趋化因子
在一些实施方案中，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含趋化因子多肽氨基酸序列，与母体趋化因子多肽相比还包含至少一个非天然糖基化位点；该多肽变体还包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替在所述母体多肽中 发现的天然蛋白酶切割位点。适合的趋化因子多肽包括但不限于IP-10；Mig；Groα/IL-8，RANTES；MIP-1a；MIP-1β；MCP-1；PF-4；等等；以及含有趋化因子的融合蛋白。
可以公开得到各种趋化因子的氨基酸序列，例如，从诸如GenBank等公共数据库、杂志发表物、专利和公开的专利申请等等得到。例如，IP-10的氨基酸序列在美国专利第6,491,906号、第5,935,567号、第6,153,600号、第5,728,377号和第5,994,292号中公开；Mig的氨基酸序列在美国专利第6,491,906号和Farber(1993)Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 192(1)：223-230中公开；RANTES的氨基酸序列在美国专利第6,709,649号、第6,168,784号和第5,965,697号中公开；等等。
血管生成剂
在一些实施方案中，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含血管生成多肽氨基酸序列，与母体血管生成多肽相比该多肽变体还包含至少一个非天然糖基化位点；所述多肽变体还包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替在所述母体多肽中发现的天然蛋白酶切割位点。适合的血管生成多肽包括但不局限于VEGF多肽，包括VEGF121、VEGF165、VEGF-C、VEGF-2等等；转化生长因子-β；碱性成纤维细胞生长因子；神经胶质瘤衍生生长因子；血管生成素；血管生成素-2；等等。可以公开得到所述各种血管生成剂的氨基酸序列，例如，从诸如GenBank等公共数据库、杂志文章、专利和公开的专利申请等等得到。例如，VEGF多肽的氨基酸序列在美国专利第5,194,596号、第5,332,671号、第5,240,848号、第6,475,796号、第6,485,942号和第6,057,428号中公开；VEGF-2多肽的氨基酸序列在美国专利第5,726,152号和第6,608,182号中公开；具有血管生成活性的神经胶质瘤衍生生长因子的氨基酸序列在美国专利第5,338,840号和第5,532,343号中公开；血管生成素的氨基酸序列在以下GenBank登记号中找到：和等等。
神经活性肽
在一些实施方案中，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含神经活性多肽氨基酸序列，与母体神经活性多肽相比该多肽变体还包含至少一个非天然糖基化位点；所述多肽变体还包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替在所述母体多肽中发现的天然蛋白酶切割位点。适合的神经活性多肽包括但不局限于神经生长因子、缓激肽、胆囊收缩素、胃泌素、分泌素、催产素、促性腺激素释放激素、β-内啡肽、脑啡肽、P物质、生长激素释放抑制因子、促乳素、甘丙肽、生长激素释放激素、蛙皮素、强啡肽、神经紧张素、能动素、促甲状腺激素、神经肽Y、黄体化激素、降钙素、胰岛素、高血糖素、血管加压素、血管紧张素II、促甲状腺素释放激素、舒血管肠肽、睡眠肽等等。
其它蛋白
在最广泛的意义上，本发明的组合物和方法预期使用任何已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体，该多肽变体包含源自具有药理学意义的母体多肽的氨基酸序列；该多肽变体与母体多肽相比还包含至少一个非天然糖基化位点；该多肽变体还包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替在所述母体多肽中发现的天然蛋白酶切割位点。具有药理学意义的其它蛋白包括但不限于血栓溶解剂、心房肽、骨形态生成蛋白、血小板形成蛋白、胶质原纤维酸性蛋白、卵泡刺激素、人α-1抗胰蛋白酶、白血病抑制因子、转化生长因子、胰岛素样生长因子、黄体化激素、巨噬细胞活化因子、肿瘤坏死因子、中性白细胞趋化因子、神经生长因子、金属蛋白酶的组织抑制剂；舒血管肠肽、血管营养素、纤维蛋白；水蛭素；白血病抑制因子；等等。可以公开得到各种治疗性蛋白的氨基酸序列，例如，从诸如GenBank等公共数据库、杂志文章、专利和公开的专利申请等等得到。例如，组织纤溶酶原激活剂的氨基酸序列在GenBank登记号P00750、AAA01895、AAA01378、AAB06956和CAA00642下找到。
在一些实施方案中，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含松弛素氨基酸序列，与母体松弛素多肽相比该多肽变体还包含至少一个非天然糖基化位点；所述多肽变体还包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替在所述母体多肽中发现的天然蛋白酶切割位点。所述松弛素多肽可以是天然存在的松弛素多肽或合成的松弛素。天然存在的具有生物活性的松弛素可以来源于人、鼠(即大鼠或小鼠)、猪或其它哺乳动物。术语“松弛素”包括人H1前松弛素原、松弛素原和松弛素；H2前松弛素原、松弛素原和松弛素；重组人松弛素(rhRLX)；以及H3前松弛素原、松弛素原和松弛素。H3松弛素已在本领中被描述。例如参见，Sudo et al.(2003)J Biol Chem.7；278(10)：7855-62。人松弛素的氨基酸序列已在本领中被描述。例如，人松弛素的氨基酸序列在以下GenBank登记号下找到：Q3WXF3，人H3松弛素原；P04808，人H1松弛素原；NP_604390和NP_005050，人H2松弛素原；AAH05956，人松弛素1前松弛素原；NP_008842，人H1前松弛素原；等等。所述松弛素多肽可以是包含具有N-和/或C-末端截短的A链和B链的松弛素多肽。例如，在H2松弛素中，A链可以被从A(1-24)改变至A(10-24)并且B链可以被从B(1-33)改变至B(10-22)；并且在松弛素中，A链可以被从A(1-24)改变至A(10-24)并且B链可以被从B(1-32)改变至B(10-22)。同样适合于修饰的是具有与野生型(例如天然存在的)序列不同的氨基酸序列的松弛素类似物，包括但不限于在美国专利第5,811,395号和美国专利第6,200,9535号中公开的松弛素类似物。其它适合的松弛素和松弛素制剂可在美国专利第5,945,402号中找到。其它可能的松弛素多肽包括具有氨基酸替代的松弛素，该替代为用不同的氨基酸(包括天然氨基酸的D-型)替代B和/或A链中的一个或多个天然氨基酸，所述替代包括但不限于在B24位用正亮氨酸(Nle)、缬氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)或高丝氨酸(HomoSer)替代Met部分。其它可能的松弛素多肽包括在松弛素原的B/C和C/A连接处具有氨基酸替代的松弛素，该修饰有助于C链从松弛素原上的切割；以及含有非天然存在的C肽的变体松弛素，例如美国专利第5,759,807号中所描述的。
母体细胞因子多肽的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体
在一些实施方案中，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体是母体蛋白治疗剂的变体，并且该母体蛋白治疗剂是细胞因子。在一些实施方案中，与未修饰的母体细胞因子相比，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含一个或多个氨基酸替代，所述氨基酸替代如在以下任一SEQ ID NO的氨基酸序列中所描述的：2-181(IFN-α2b变体)，233-289(IFN-β变体)，290-311(IFN-γ变体)，362-400(GM-CSF变体)，631-662(G-CSF变体)，850-895(hGH变体)，940-977(EPO变体)，978-988(IFN-α变体)，以及989-1302(IFN-β变体)；并且所述多肽变体还包含与所述母体多肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列，以至于所述变体包含一个或多个未在所述母体多肽中发现的糖基化位点。图23-30中描述了产生超糖基化的示例性氨基酸替代。在一些实施方案中，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶的、超糖基化的多肽变体是特定蛋白的结构同源物，该特定蛋白包含以下任一SEQ ID NO的氨基酸序列：2-181(IFN-α2b变体)，233-289(IFN-β变体)，290-311(IFN-γ变体)，362-400(GM-CSF变体)，631-662(G-CSF变体)，850-895(hGH变体)，940-977(EPO变体)，978-988(IFN-α变体)和989-1302(IFN-β变体)；并且所述多肽变体还包含与所述母体多肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列，以至于所述变体包含一个或多个未在所述母体多肽中发现的糖基化位点。
在一些实施方案中，与未修饰的母体细胞因子相比，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含一个或多个氨基酸替代，所述氨基酸替代如在以下任一SEQ ID NO的氨基酸序列中所描述的：87，89，90，93，96，101，103，107，124，979，980，983，984，986和987；并且所述多肽变体还包含与所述母体多肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列，以至于所述变体包含一个或多个未在所述母体多肽中发现的糖基化位点。
在一些实施方案中，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体是修饰的细胞因子，该修饰基于与下列任一SEQ ID NO的3维结构同源性：87，89，90，93，96，101，103，107，124，979，980，983，984，986和987；所述多肽变体还包含与所述母体多肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列，以至于所述变体包含一个或多个未在所述母体多肽中发现的糖基化位点。
在一些实施方案中，所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的细胞因子变体选自以下细胞因子的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的变体：白介素-10(IL-10)、干扰素β(IFNβ)、干扰素α-2a(IFN-α2a)、干扰素α-2b(IFN-α2b)、干扰素γ(IFN-γ)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白血病抑制因子(LIF)、人生长激素(hGH)、睫状神经营养因子(CNTF)、瘦素、制癌素M、白介素-6(IL-6)、白介素-12(IL-12)、促红细胞生成素(EPO)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-2(IL-2)、白介素-3(IL-3)、白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-13(IL-13)、Flt3配体和干细胞因子(SCF)。在特定实施方案中，所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的细胞因子变体选自以下细胞因子的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的变体：IFNβ、IFN-α2a、IFN-2b、IFN-γ、G-CSF、hGH、EPO和GM-CSF。在特定实施方案中，所述已知的抗蛋白酶的细胞因子变体是干扰素。
与未修饰的(母体)细胞因子相比，所述母体细胞因子的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的细胞因子变体对蛋白水解显示增强的抗性。在一些实施方案中，所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的细胞因子变体是干扰素变体。在一些实施方案中，所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的细胞因子变体是IFN-α2a变体。在一些实施方案中，所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的细胞因子变体是IFN-α2b变体。在一些实施方案中，所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的细胞因子变体是IFN-β变体。在一些实施方案中，所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的细胞因子变体是IFN-γ变体。在一些实施方案中，所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的细胞因子变体是共有干扰素的变体，该共有干扰素包含SEQ ID NO：232所确定的，或图9中所示的，或图24中所示的氨基酸序列。
IFN-α多肽变体
在一些实施方案中，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含一个或多个以下表1中所示的突变，其氨基酸编号与图1中所示的氨基酸编号一致；所述多肽变体还包含与所述母体多肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列，以至于所述变体包含一个或多个未在所述母体多肽中发现的糖基化位点。
表1
| IFN-αLEAD | SEQ ID N0 | 突变 |
| 1 | 983 | K121Q/P109A |
| 2 | 987 | El59I/Y89H |
| 3 | 124 | E159Q |
| 4 | 90 | E58H |
| 5 | 89 | E58Q |
| 6 | 979 | E41H/Y89I/N45D |
| 7 | 103 | L117I |
| 8 | 986 | R125H/M111V |
| 9 | 96 | E107H |
| 10 | 101 | E113H |
| 11 | 87 | E41Q |
| 12 | 107 | R125Q |
| 13 | 985 | L147V/A139G |
| 14 | 980 | E41Q/194G |
| 15 | 93 | E78H |
| 16 | 984 | K133Q/K121Q/P109A/G102R |
一方面，所述母体多肽是IFN-α2a或IFN-α2b，并且所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含一个或多个图1所示的IFNα2a氨基酸序列或图2所示的IFN-α2b氨基酸序列的一个或多个单氨基酸替代，其对应如下替代：在3位L被V替代；在3位L被I替代；在4位P被S替代；在4位P被A替代；在第12位R被H替代；在第12位R被Q替代；在第13位R被H替代；在第13位R被Q替代；在第16位M被V替代；在第16位M被I替代；在第22位R被H替代；在第22位R被Q替代；在第23位R或K被H替代；在第23位R或K被Q替代；在第27位F被I替代；在第27位F被V替代；在第30位L被V替代；在第30位L被I替代；在第31位K被Q替代；在第31位K被T替代；在第33位R被H替代；在第33位R被Q替代；在第41位E被Q替代；在第41位E被H替代；在第49位K被Q替代；在第49位K被T替代；在第58位E被Q替代；在第58位E被H替代；在第70位K被Q替代；在第70位K被T替代；在第78位E被Q替代；在第78位E被H替代；在第83位K被Q替代；在第83位K被T替代；在第89位Y被H替代；在第89位Y被I替代；在第96位E被Q替代；在第96位E被H替代；在第107位E被Q替代；在第107位E被H替代；在第109位P被S替代；在第109位P被A替代；在第110位L被V替代；在第110位L被I替代；在第111位M被V替代；在第111位M被I替代；在第113位E被Q替代；在第113位E被H替代；在第117位L被V替代；在第117位L被I替代；在第120位R被H替代；在第120位R被Q替代；在第121位K被Q替代；在第121位K被T替代；在第125位R被H替代；在第125位R被Q替代；在第128位L被V替代；在第128位L被I替代；在第131位K被Q替代；在第131位K被T替代；在第132位E被Q替代；在第132位E被H替代；在第133位K被Q替代；在第133位K被T替代；在第134位K被Q替代；在第134位K被T替代；在第135位Y被H替代；在第135位Y被I替代；在第137位P被S替代；在第137位P被A替代；在第148位M被V替代；在第148位M被I替代；在第149位R被H替代；在第149位R被Q替代；在第159位E被Q替代；在第159位E被H替代；在第161位L被V替代；在第161位L被I替代；在第162位R被H替代；在第162位R被Q替代；在第164位K被Q替代；在第164位K被T替代；在第165位E被Q替代；以及在第165位E被H替代，其中残基1对应图1所示的成熟IFN-α2a蛋白的残基1或者残基1对应图2所示的成熟IFN-α2b蛋白的残基1；并且所述多肽变体还包含与所述母体多肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列，以至于所述变体包含一个或多个未在所述母体多肽中发现的糖基化位点。
另一方面，所述母体多肽是IFN-α2a或IFN-α2b，并且所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含一个或多个图1所示的IFN-α2a氨基酸序列或图2所示的IFN-α2b氨基酸序列的一个或多个单氨基酸替代，其对应如下替代：在第27位F被V替代；在第33位R被H替代；在第41位E被Q替代；在第41位E被H替代；在第58位E被Q替代；在第58位E被H替代；在第78位E被Q替代；在第78位E被H替代；在第89位Y被H替代；在第107位E被Q替代；在第107位E被H替代；在第109位P被A替代；在第110位L被V替代；在第111位M被V替代；在第113位E被Q替代；在第113位E被H替代；在第117位L被V替代；在第117位L被I替代；在第121位K被Q替代；在第121位K被T替代；在第125位R被H替代；在第125位R被Q替代；在第133位K被Q替代；在第133位K被T替代；在第159位E被Q替代以及在第159位E被H替代，其中残基1对应图1所示的成熟IFN-α2a蛋白的残基1或者残基1对应图2所示的成熟IFN-α2b蛋白的残基1；并且所述多肽变体还包含与所述母体多肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列，以至于所述变体包含一个或多个未在所述母体多肽中发现的糖基化位点。
另一方面，所述母体多肽是IFN-α2a或IFN-α2b，并且所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含图1所示的IFN-α2a氨基酸序列或图2所示的IFN-α2b氨基酸序列的一套或多套成双氨基酸替代，其对应如下替代：
在2位D被N替代并且在第4位P被S替代；
在第2位D被N替代并且在第4位P被T替代；
在第3位L被N替代并且在第5位Q被S替代；
在第3位L被N替代并且在第5位Q被T替代；
在第4位P被N替代并且在第6位T被S替代；
在第4位P被N替代并且在第6位T被T替代；
在第5位Q被N替代并且在第7位H被S替代；
在第5位Q被N替代并且在第7位被T替代；
在第6位T被N替代并且在第8位S被S替代；
在第6位T被N替代并且在第8位S被T替代；
在第7位H被N替代并且在第9位L被S替代；
在第7位H被N替代并且在第9位L被T替代；
在第8位S被N替代并且在第10位G被S替代；
在第8位S被N替代并且在第10位G被T替代；
在第9位L被N替代并且在第11位S被S替代；
在第9位L被N替代并且在第11位S被T替代；
在第21位M被N替代并且在第23位K被S替代；
在第21位M被N替代并且在第23位K被T替代；
在第22位R被N替代并且在第24位I被S替代；
在第22位R被N替代并且在第24位I被T替代；
在第23位R或K被N替代并且在第25位S被S替代；
在第23位R或K被N替代并且在第25位S被T替代；
在第24位I被N替代并且在第26位L被S替代；
在第24位I被N替代并且在第26位L被T替代；
在第25位S被N替代并且在第27位F被S替代；
在第25位S被N替代并且在第27位F被T替代；
在第26位L被N替代并且在第28位S被S替代；
在第26位L被N替代并且在第28位S被T替代；
在第28位S被N替代并且在第30位L被S替代；
在第28位S被N替代并且在第30位L被T替代；
在第30位L被N替代并且在第32位D被S替代；
在第30位L被N替代并且在第32位D被T替代；
在第31位K被N替代并且在第33位R被S替代；
在第31位K被N替代并且在第33位R被T替代；
在第32位D被N替代并且在第34位H被S替代；
在第32位D被N替代并且在第34位H被T替代；
在第33位R被N替代并且在第35位D被S替代；
在第33位R被N替代并且在第35位D被T替代；
在第34位H被N替代并且在第36位F被S替代；
在第34位H被N替代并且在第36位F被T替代；
在第35位D被N替代并且在第37位G被S替代；
在第35位D被N替代并且在第37位G被T替代；
在第36位F被N替代并且在第38位F被S替代；
在第36位F被N替代并且在第38位F被T替代；
在第37位G被N替代并且在第39位P被S替代；
在第37位G被N替代并且在第39位P被T替代；
在第38位F被N替代并且在第40位Q被S替代；
在第38位F被N替代并且在第40位Q被T替代；
在第39位P被N替代并且在第41位E被S替代；
在第39位P被N替代并且在第41位E被T替代；
在第40位Q被N替代并且在第42位E被S替代；
在第40位Q被N替代并且在第42位E被T替代；
在第41位E被N替代并且在第43位F被S替代；
在第41位E被N替代并且在第43位F被T替代；
在第42位E被N替代并且在第44位G被S替代；
在第42位E被N替代并且在第44位G被T替代；
在第43位F被N替代并且在第45位N被S替代；
在第43位F被N替代并且在第45位N被T替代；
在第44位G被N替代并且在第46位Q被S替代；
在第44位G被N替代并且在第46位Q被T替代；
在第45位N被N替代并且在第47位F被S替代；
在第45位N被N替代并且在第47位F被T替代；
在第46位Q被N替代并且在第48位Q被S替代；
在第46位Q被N替代并且在第48位Q被T替代；
在第47位F被N替代并且在第49位K被S替代；
在第47位F被N替代并且在第49位K被T替代；
在第48位Q被N替代并且在第50位A被S替代；
在第48位Q被N替代并且在第50位A被T替代；
在第49位K被N替代并且在第51位E被S替代；
在第49位K被N替代并且在第51位E被T替代；
在第50位A被N替代并且在第52位T被S替代；
在第50位A被N替代并且在第52位T被T替代；
在第68位S被N替代并且在第70位K被S替代；
在第68位S被N替代并且在第70位K被T替代；
在第70位K被N替代并且在第72位S被S替代；
在第70位K被N替代并且在第72位S被T替代；
在第75位A被N替代并且在第77位D被S替代；
在第75位A被N替代并且在第77位D被T替代；
在第77位D被N替代并且在第79位T被S替代；
在第77位D被N替代并且在第79位T被T替代；
在第100位I被N替代并且在第102位G被S替代；
在第100位I被N替代并且在第102位G被T替代；
在第101位Q被N替代并且在第103位V被S替代；
在第101位Q被N替代并且在第103位V被T替代；
在第102位G被N替代并且在第104位G被S替代；
在第102位G被N替代并且在第104位G被T替代；
在第103位V被N替代并且在第105位V被S替代；
在第103位V被N替代并且在第105位V被T替代；
在第104位G被N替代并且在第106位T被S替代；
在第104位G被N替代并且在第106位T被T替代；
在第105位V被N替代并且在第107位E被S替代；
在第105位V被N替代并且在第107位E被T替代；
在第106位T被N替代并且在第108位T被S替代；
在第106位T被N替代并且在第108位T被T替代；
在第107位E被N替代并且在第109位P被S替代；
在第107位E被N替代并且在第109位P被T替代；
在第108位T被N替代并且在第110位I被S替代；
在第108位T被N替代并且在第110位I被T替代；
在第134位K被N替代并且在第136位S被S替代；
在第134位K被N替代并且在第136位S被T替代；
在第154位S被N替代并且在第156位N被S替代；
在第154位S被N替代并且在第156位N被T替代；
在第155位T被N替代并且在第157位L被S替代；
在第155位T被N替代并且在第157位L被T替代；
在第156位N被N替代并且在第158位Q被S替代；
在第156位N被N替代并且在第158位Q被T替代；
在第157位L被N替代并且在第159位E被S替代；
在第157位L被N替代并且在第159位E被T替代；
在第158位Q被N替代并且在第160位S被S替代；
在第158位Q被N替代并且在第160位S被T替代；
在第159位E被N替代并且在第161位L被S替代；
在第159位E被N替代并且在第161位L被T替代；
在第160位S被N替代并且在第162位R被S替代；
在第160位S被N替代并且在第162位R被T替代；
在第161位L被N替代并且在第163位S被S替代；
在第161位L被N替代并且在第163位S被T替代；
在第162位R被N替代并且在第164位K被S替代；
在第162位R被N替代并且在第164位K被T替代；
在第163位S被N替代并且在第165位E被S替代；以及
在163位S被N替代并且在165位E被T替代，其中残基1对应图1所示的成熟IFN-α2a蛋白的残基1或者对应图2所示的成熟IFN-α2b蛋白的残基1；并且所述多肽变体还包含与所述母体多肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列，以至于所述变体包含一个或多个未在所述母体多肽中发现的糖基化位点。
另一方面，所述母体多肽是IFN-2a或IFN-α2b，并且所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含图1所示的IFN-α2a氨基酸序列或图2所示的IFN-α2b氨基酸序列的一套或多套成双氨基酸替代，其对应如下替代：
在第5位Q被N替代并且在第7位H被S替代；
在第39位P被N替代并且在第41位E被S替代；
在第39位P被N替代并且在第41位E被T替代；
在第40位Q被N替代并且在第42位E被S替代；
在第40位Q被N替代并且在第42位E被T替代；
在第41位E被N替代并且在第43位F被S替代；
在第41位E被N替代并且在第43位F被T替代；
在第43位F被N替代并且在第45位N被S替代；
在第44位G被N替代并且在第46位Q被T替代；
在第45位N被N替代并且在第47位F被S替代；
在第45位N被N替代并且在第47位F被T替代；
在第46位Q被N替代并且在第48位Q被S替代；
在第47位F被N替代并且在第49位K被S替代；
在第47位F被N替代并且在第49位K被T替代；
在第100位I被N替代并且在第102位G被S替代；
在第100位I被N替代并且在第102位G被T替代；
在第105位V被N替代并且在第107位E被S替代；
在第105位V被N替代并且在第107位E被T替代；
在第106位T被N替代并且在第108位T被S替代；
在第106位T被N替代并且在第108位T被T替代；
在第107位E被N替代并且在第109位P被S替代；
在第107位E被N替代并且在第109位P被T替代；
在第157位L被N替代并且在第159位E被S替代；
在第157位L被N替代并且在第159位E被T替代；
在第159位E被N替代并且在第161位L被S替代；以及
在第159位E被N替代并且在第161位L被T替代，其中残基1对应图1所示的成熟IFN-α2a蛋白的残基1或者对应图2所示的成熟IFN-α2b蛋白的残基1；并且所述多肽变体还包含与所述母体多肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列，以至于所述变体包含一个或多个未在所述母体多肽中发现的糖基化位点。
在一些实施方案中，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的细胞因子变体是IFN-α2b、IFN-α2a或IFN-2c变体，这些变体包含一个或多个单氨基酸替代，其对应如下替代：在45位N被D替代、在94位D被G替代、在102位G被R替代、在139位A被G替代或任何其组合，氨基酸编号如图1中所示。
在一些实施方案中，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的细胞因子变体是IFN-α2b、IFN-α2a或IFN-2c变体，这些变体包含在SEQ IDNos.1、182、185或232的任一序列(例如在任一图2、1、11和9分别描述的序列)中的一个或多个单氨基酸替代，其对应如下替代：在3位L被V替代；在第3位L被I替代；在第4位P被S替代；在第4位P被S替代；在第4位P被A替代；在第12位R被H替代；在第12位R被Q替代；在第13位R被H替代；在第13位R被Q替代；在第16位M被V替代；在第16位M被I替代；在第22位R被H替代；在第22位R被Q替代；在第23位R或K被H替代；在第23位R或K被Q替代；在第27位F被I替代；在第27位F被V替代；在第30位L被V替代；在第30位L被I替代；在第31位K被Q替代；在第31位K被T替代；在第33位R被H替代；在第33位R被Q替代；在第41位E被Q替代；在第41位E被H替代；在第49位K被Q替代；在第49位K被T替代；在第58位E被Q替代；在第58位E被H替代；在第70位K被Q替代；在第70位K被T替代；在第78位E被Q替代；在第78位E被H替代；在第83位K被Q替代；在第83位K被T替代；在第89位Y被H替代；在第89位Y被I替代；在第96位E被Q替代；在第96位E被H替代；在第107位E被Q替代；在第107位E被H替代；在第109位P被S替代；在第109位P被S替代；在第110位L被V替代；在第110位L被I替代；在第111位M被V替代；在第111位M被I替代；在第113位E被Q替代；在第113位E被H替代；在第117位L被V替代；在第117位L被I替代；在第120位R被H替代；在第120位R被Q替代；在第121位K被Q替代；在第121位K被T替代；在第125位R被H替代；在第125位R被Q替代；在第128位L被V替代；在第128位L被I替代；在第131位K被Q替代；在第131位K被T替代；在第132位E被Q替代；在第132位E被H替代；在第133位K被Q替代；在第133位K被T替代；在第134位K被Q替代；在第134位K被T替代；在第135位Y被H替代；在第135位Y被I替代；在第137位P被S替代；在第位P被A替代；在第148位M被V替代；在第148位M被I替代；在第149位R被H替代；在第149位R被Q替代；在第159位E被Q替代；在第159位E被H替代；在第161位L被V替代；在第161位L被I替代；在第162位R被H替代；在第162位R被Q替代；在第164位K被Q替代；在第164位K被T替代；在第165位E被Q替代；或在第165位E被H替代；或其任何组合，其中残基1对应SEQ ID NO：1或182所示的(或图2和1分别所示的)成熟IFN-α2b或IFN-α2a细胞因子的残基1；并且所述多肽变体还包含与所述母体多肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列，以至于所述变体包含一个或多个未在所述母体多肽中发现的糖基化位点。
在一些实施方案中，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的细胞因子变体是IFN-α2b、IFN-α2a或IFN-2c变体，这些变体包含在SEQ IDNo.1、182、185或232的任一序列(例如在任一图2、1、11和9分别描述的序列)中的一个或多个单氨基酸替代，其对应如下替代：在3位L被V替代；在3位L被I替代；在4位P被S替代；在4位P被A替代；在第12位R被H替代；在第12位R被Q替代；在第13位R被H替代；在第13位R被Q替代；在第16位M被V替代；在第16位M被I替代；在第22位R被H替代；在第22位R被Q替代；在第23位R或K被H替代；在第23位R或K被Q替代；在第27位F被I替代；在第27位F被V替代；在第30位L被V替代；在第30位L被I替代；在第31位K被Q替代；在第31位K被T替代；在第33位R被H替代；在第33位R被Q替代；在第41位E被Q替代；在第41位E被H替代；在第49位K被Q替代；在第49位K被T替代；在第58位E被Q替代；在第58位E被H替代；在第70位K被Q替代；在第70位K被T替代；在第78位E被Q替代；在第78位E被H替代；在第83位K被Q替代；在第83位K被T替代；在第89位Y被H替代；在第89位Y被I替代；在第96位E被Q替代；在第96位E被H替代；在第107位E被Q替代；在第107位E被H替代；在第109位P被S替代；在第109位P被A替代；在第110位L被V替代；在第110位L被I替代；在第111位M被V替代；在第111位M被I替代；第113位E被Q替代；第113位E被H替代；在第117位L被V替代；在第117位L被I替代；在第120位R被H替代；在第120位R被Q替代；在第121位K被Q替代；在第121位K被T替代；在第125位R被H替代；在第125位R被Q替代；在第128位L被V替代；在第128位L被I替代；在第131位K被Q替代；在第131位K被T替代；在第132位E被Q替代；在第132位E被H替代；在第133位K被Q替代；在第133位K被T替代；在第134位K被Q替代；在第134位K被T替代；在第135位Y被H替代；在第135位Y被I替代；在第137位P被S替代；在第137位P被A替代；在第148位M被V替代；在第148位M被I替代；在第149位R被H替代；在第149位R被Q替代；在第159位E被Q替代；在第159位E被H替代；在第161位L被V替代；在第161位L被I替代；在第162位R被H替代；在第162位R被Q替代；在第164位K被Q替代；在第164位K被T替代；在第165位E被Q替代；在第165位E被H替代；在第45位N被D替代；在第94位D被G替代；在第102位G被R替代；或在第139位A被G替代；或其任何组合，其中残基1对应SEQID NO：1或182所示的成熟IFN-α2b或IFN-α2a细胞因子的残基1；并且所述多肽变体还包含与所述母体多肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列，以至于所述变体包含一个或多个未在所述母体多肽中发现的糖基化位点。
在一些实施方案中，任何上述抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的IFN-α2a变体是[D99N]IFN-α2a糖肽，该[D99N]IFN-2a糖肽是IFN-α2a的变体，其具有(a)天冬酰胺残基，该天冬酰胺残基替代IFN-α2a氨基酸序列的第99位氨基酸天然天冬氨酸残基(其中该氨基酸位置显示在图24中；并且对应图1中所示序列的D71)，以及(b)与所述天冬酰胺残基的R-基团共价连接的糖部分。在一些实施方案中，IFN-α2a序列具有赖氨酸残基，其替代图24所示的IFN-α2b序列的50位氨基酸精氨酸残基(对应图2中所示的IFN-2b序列的23位氨基酸)。
在一些实施方案中，任何上述抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的IFN-α2a变体是[D99N，D105N]IFN-α2a糖肽，其中该[D99N，D105N]IFN-α2a糖肽是IFN-α2a的变体，其具有(a)天冬酰胺残基，该天冬酰胺残基替代IFN-α2a氨基酸序列的99位和105位氨基酸每一天然天冬氨酸残基(其中该氨基酸位置显示在图24中；并且图24中的D99和D105分别对应图1和图2中的D71和D77)，以及(b)与每一所述天冬酰胺残基的R-基团共价连接的糖部分。在一些实施方案中，IFN-α2a序列具有赖氨酸残基，其替代图24所示的IFN-α2b序列的第50位氨基酸精氨酸残基(对应图2中所示的IFN-α2b序列的Arg23)。
在一些实施方案中，任何上述抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的IFN-α2b变体是[D99N]IFN-α2b糖肽，其中该[D99N]IFN-2b糖肽是IFN-α2b的变体，其具有(a)天冬酰胺残基，该天冬酰胺残基替代图24中所示的IFN-α2b氨基酸序列的第99位氨基酸天然天冬氨酸残基(其中该氨基酸位置显示在图24中；并且图24中的D99对应图1和图2中的D71)，以及(b)与所述天冬酰胺残基的R-基团共价连接的糖部分。
在一些实施方案中，任何上述抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的IFN-α2b变体是[D99N，D105N]IFN-α2b糖肽，其中该[D99N，D105N]IFN-α2b糖肽是IFN-α2b的变体，其具有(a)天冬酰胺残基，该天冬酰胺残基替代图24中所示的IFN-α2b氨基酸序列的第99位和第105位氨基酸每一天然天冬氨酸残基(其中该氨基酸位置显示在图24中；并且图24中的D99和D105分别对应图1和图2中的D71和D77)，以及(b)与每一所述天冬酰胺残基的R-基团共价连接的糖部分。
另一方面，任何上述的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的IFN-α2a或IFN-2b多肽变体还包含一个或多个假野生型突变(pseudo-wild typemutation)。在特定实施方案中，任何上述的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的IFN-α2a多肽变体还包含一个或多个假野生型突变，该假野生型突变位于图1中所示的氨基酸残基9，10，17，20，24，25，35，37，41，52，54，56，57，58，60，63，64，65，76，89和90中的一处或多处，其中所述突变是一个或多个插入、缺失和天然氨基酸残基的替代。在其它特定实施方案中，任何上述的抗蛋白酶的或抗蛋白酶的、超糖基化的IFN-α2b多肽变体还包含一个或多个假野生型突变，该假野生型突变位于图2中所示的氨基酸残基9，10，17，20，24，25，35，37，41，52，54，56，57，58，60，63，64，65，76，89和90中的一处或多处，其中所述突变是一个或多个插入、缺失和天然氨基酸残基的替代。
示例性的假野生型替代是图1中所示的IFN-α2a氨基酸序列或图2中所示的IFN-α2b氨基酸序列的一个或多个突变，对应于：在4位P被A替代；在第5位Q被A替代，在第6位T被A替代；在第9位L被A替代，在第10位LG被A替代；在第17位L被A替代，在第20位Q被A替代；在第24位I被A替代，在第25位S被A替代；在第35位D被A替代，在第37位G被A替代；在第39位G被A替代；在第41位E被A替代；在第42位E被A替代，在第51位E被A替代；在第52位T被A替代，在第54位P被A替代；在第55位V被A替代，在第56位L被A替代；在第57位H被A替代，在第58位E被A替代；在第60位I被A替代，在第63位I被A替代；在第64位F被A替代，在第65位N被A替代；在第76位W被A替代，在第77位D被A替代；在第78位E被A替代，在第81位L被A替代；在第85位Y被A替代，在第89位Y被A替代；在第90位Q被A替代，在第104位G被A替代；在第110位L被A替代，在第115位S被A替代和在第146位E被A替代。
另一方面，任何上述的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的IFN-α2a或IFN-α2b多肽变体还包含一个或多个假野生型突变。在特定实施方案中，任何上述的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的IFN-α2a多肽变体还包含一个或多个假野生型突变，该假野生型突变位于图1中所示的氨基酸残基4，5，6，9，10，17，20，24，25，35，37，39，41，42，51，52，54，56，57，58，60，63，64，65，76，77，78，81，85，89，90，104，110，115和146中的一处或多处，其中所述突变是一个或多个插入、缺失和天然氨基酸残基的替代。在其它特定实施方案中，任何上述的抗蛋白酶的或抗蛋白酶的、超糖基化的IFN-α2b多肽变体还包含一个或多个假野生型突变，该假野生型突变位于图2中所示的氨基酸残基4，5，6，9，10，17，20，24，25，35，37，39，41，42，51，52，54，56，57，58，60，63，64，65，76，77，78，81，85，89，90，104，110，115和146中的一处或多处，其中所述突变是一个或多个插入、缺失和天然氨基酸残基的替代。
示例性的假野生型替代是图1中所示的IFN-α2a氨基酸序列或图2中所示的IFN-α2b氨基酸序列的一个或多个突变，对应于：在4位P被A替代；在第5位Q被A替代；在第6位T被A替代；在第9位L被A替代；在第10位LG被A替代；在第1 7位L被A替代；在第20位Q被A替代；在第24位I被A替代；在第25位S被A替代；在第35位D被A替代；在第37位G被A替代；在第39位G被A替代；在第41位E被A替代；在第42位E被A替代；在第51位E被A替代；在第52位T被A替代；在第54位P被A替代；在第55位V被A替代；在第56位L被A替代；在第57位H被A替代；在第58位E被A替代；在第60位I被A替代；在第63位I被A替代；在第64位F被A替代；在第65位N被A替代；在第76位W被A替代；在第77位D被A替代；在第78位E被A替代；在第8 1位L被A替代；在第85位Y被A替代；在第89位Y被A替代；在第90位Q被A替代；在第104位G被A替代；在第110位L被A替代；在第115位S被A替代和在第146位E被A替代。
在一些实施方案中，所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体是显示抗病毒活性的母体细胞因子的变体。在一些实施方案中，当所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的抗病毒细胞因子(例如，IFN-α2a多肽、IFN-α2b多肽、IFN-γ多肽的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的变体)与相应的未修饰(母体)细胞因子相比时(例如，当与所述母体IFN-α2a多肽、IFN-α2b多肽、IFN-γ多肽对比时)，其显示保留至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或直至至少约100％的抗病毒活性。
使用任何已知分析可容易地检测抗病毒活性。例如，使用以下方法在体外检测IFN-α2a多肽的抗病毒活性。使干扰素敏感HeLa细胞系(如，ATCC登记号CCL-2)在体外与IFN-α2a多肽接触；随后，使该细胞与脑心肌炎病毒接触(EMCV)。通过评估细胞病变效应(CPE)而检测抗病毒活性；或者采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)通过测量被感染细胞提取物中EMCV mRNA的数量而检测抗病毒活性。
所述分析可以是定量的。例如，在一些实施方案中，通过逆转录定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)评估抗病毒活性。例如，将汇合细胞(例如，ATCC登记号CCL-2)以2×104细胞/孔的密度接种到合适的培养基中(如，DMEM 5％SVF培养基)。然后将细胞与浓度为500U/ml的IFN-α2b一起在37℃下孵育24小时。与IFN-α2b一起孵育24小时后，用EMCV(MOI＝100)处理该细胞。与病毒一起孵育16小时后，或当病毒诱导CPE在未经IFN-α2b处理的对照细胞中接近最大值时，每孔中EMCV颗粒的数目在细胞裂解物中通过EMCV mRNA的RT-PCR确定。从细胞裂解物中纯化RNA。例如参见美国专利公开第2004/0132977号。
在一些实施方案中，所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体有效地减少个体中的病毒负荷。可以通过测量血清中病毒的滴度或水平可以测量病毒负荷。这些方法包括但不限于定量聚合酶链式反应(PCR)和分枝DNA(bDNA)试验。已发展出用于测量HCV RNA的病毒负荷(滴度)的定量分析。许多所述分析都可购得，包括定量逆转录PCR(RT-PCR)(Amplicor HCV MonitorTM，Roche Molecular Systems，NewJersey)；以及分枝DNA(脱氧核糖核酸)信号扩增分析(QuantiplexTM HCVRNA Assay(bDNA)，Chiron Corp.，Emeryville，California)。例如参见Gretch et al.(1995)Ann.Intern.Med.123：321-329。还感兴趣的是由Gen-Probe Inc.(San Diego)和Chiron Corporation开发并且由ChironCorporation以商品名Procleix销售的核酸试验(NAT)，NAT同时检测HIV-1和HCV的存在。例如参见Vargo et al.(2002)Transfusion42：876-885。
在一些实施方案中，所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的抗病毒细胞因子变体(例如，IFN-α2a多肽、IFN-α2b多肽、IFN-γ多肽的抗蛋白酶的变体)与未修饰的(母体)细胞因子蛋白治疗剂相比显示抗增生活性的保留。
可以使用任何已知方法检测抗增生活性。例如，通过测量在所述抗蛋白酶的抗病毒细胞因子变体存在下的细胞增殖评估抗增生活性，其中细胞增殖使用任何方便的分析法测量。使用特定分析法测量细胞增殖，该特定分析法基于3H-胸腺嘧啶核苷的掺入、胸腺嘧啶核苷类似物BrdU的掺入、四唑盐的切割、DNA-染料复合体形成等等。合适的细胞增殖分析法的一个非限制性实例是The CellTiter 96AQueousNon-Radioactive Cell Proliferation Assay(Promega)。The CellTiter 96Aqueous分析法是比色方法，用于在增生或化学敏感性分析中确定存活细胞的数目。The CellTiter 96AQueous Assay由四唑化合物(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑，内盐；MTS)的溶液和电子偶联剂(吩嗪硫酸甲酯；PMS)组成。MTS被细胞生物还原为在培养基中可溶的甲
(formazan)产物。可以从96孔分析板直接测量甲
在490nm处的吸收而无需更多处理。MTS向水溶液的、可溶的甲
的转化由在代谢活跃细胞中的脱氢酶完成。490nm吸收测量的甲
产物的量与培养物中活细胞的数目直接成比例。
在一些实施方案中，所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的抗病毒细胞因子变体(例如，IFN-α2a多肽、IFN-α2b多肽、IFN-γ多肽的超糖基化、抗蛋白酶的变体)与干扰素受体结合，但是该变体与未修饰(母体)细胞因子蛋白治疗剂相比显示降低的抗病毒活性，或者该变体与所述母体细胞因子蛋白治疗剂相比显示降低的抗增生活性。
在一些实施方案中，所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的抗病毒细胞因子变体(例如，IFN-α2a多肽、IFN-α2b多肽、IFN-γ多肽的抗蛋白酶的变体)包含两个或更多突变，例如，与所述相应的母体细胞因子相比，所述抗蛋白酶的抗病毒细胞因子变体包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个单氨基酸改变。在一些实施方案中，所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的抗病毒细胞因子变体是IFN-α2a多肽的变体。在其它实施方案中，所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的抗病毒细胞因子变体是IFN-α2a多肽的变体。在其它实施方案中，所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的抗病毒细胞因子变体是IFN-γ多肽的变体。
在一些实施方案中，所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽细胞因子变体包含任一SEQ ID NO：2-181中所示的氨基酸序列，其中23位的精氨酸被赖氨酸替代；所述变体还包含与所述母体多肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列，以至于所述变体包含一个或多个未在所述母体多肽中发现的糖基化位点。在其它实施方案中，与未修饰(母体)细胞因子相比，所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽细胞因子变体对蛋白水解显示更强的抗性，并且所述抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽细胞因子变体在所述细胞因子的一个或多个位置包含一个或多个氨基酸替代，所述位置对应IFN-α2a多肽、IFN-α2b多肽、IFN-α2c多肽或图9所示的共有IFN-α的3-D结构中的结构相关的修饰的氨基酸位置。在一些实施方案中，如上所述，通过体外接触所述多肽变体以测量其对蛋白水解的抗性。在其它实施方案中，通过在体外或体内使所述多肽与血液(例如人血液)接触以测量其对蛋白水解的抗性。在其它实施方案中，通过在体外使所述多肽与血清(例如人血清)接触以测量其对蛋白水解的抗性。
在一些实施方案中，任何上述的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽IFN-α2b变体与未修饰(母体)细胞因子相比具有增强的稳定性，该稳定性通过下述方法评估：如上所述，在所述变体与蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物、或者血清一起孵育后，测量抑制病毒复制或者在适当细胞中抑制细胞增殖的残留生物活性。
在一些实施方案中，任何上述的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽IFN-α2b变体与未修饰(母体)细胞因子相比具有增强的生物活性，该生物活性通过下述方法评估：如上所述，在所述变体与蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物、或者血清一起孵育后，测定所述变体在适当细胞中抑制病毒复制或者在适当细胞中抑制细胞增殖的能力。
在一些实施方案中，任何上述的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽IFN-α2a变体与未修饰(母体)细胞因子相比具有增强的稳定性，该稳定性通过下述方法评估：如上所述，在所述变体与蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物、或者血清一起孵育后，测量抑制病毒复制或者在适当细胞中抑制细胞增殖的残留生物活性。
在一些实施方案中，任何上述的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽IFN-α2a变体与未修饰(母体)细胞因子相比具有增强的生物活性，该生物活性通过下述方法评估：如上所述，在所述变体与蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物、或者血清一起孵育后，测定所述变体在适当细胞中抑制病毒复制或者在适当细胞中抑制细胞增殖的能力。
在一些实施方案中，任何上述的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽IFN-α2c变体与未修饰(母体)细胞因子相比具有增强的稳定性，该稳定性通过下述方法评估：如上所述，在所述变体与蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物、或者血清一起孵育后，测量抑制病毒复制或者在适当细胞中抑制细胞增殖的残留生物活性。
在一些实施方案中，在与蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物、或者血清一起孵育后，任何上述的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽IFN-α2c变体与未修饰(母体)细胞因子相比具有增强的生物活性。
3-D结构同源物
在一些实施方案中，超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体为修饰的细胞因子。在一些实施方案中，超糖基化、抗蛋白酶的细胞因子变体为修饰的干扰素。在一些实施方案中，为IFN-α2b的结构同源物的任何上述的超糖基化、抗蛋白酶的细胞因子变体包含一个或多个氨基酸替代，该替代位于对应于修饰的IFN-α2b、IFN-α2a、IFN-α2c或图9中所示的共有IFN-α的3-D结构中三维结构上类似的经修饰的位置。在一些实施方案中，结构同源物与其未修饰的(母体)细胞因子对应物相比增强了对蛋白酶的抗性，其中对蛋白酶的抗性通过上述与体外蛋白酶混和、与血液孵育或与血清孵育来测定。
在一些实施方案中，超糖基化、抗蛋白酶的细胞因子变体为IFN-α细胞因子的结构同源物。在一些实施方案中，超糖基化、抗蛋白酶的IFN-α变体为IFN-α2b的结构同源物。在一些这类实施方案中，IFN-α细胞因子选自IFN-α2a、IFN-α2c、IFN-αc、IFN-αd、IFN-α5、IFN-α6、IFN-α4、IFN-α4b、IFN-αI、IFN-αJ、IFN-αH、IFN-αF、IFN-α8和共有IFN-α的变体。因此，在一些实施方案中，已知的超糖基化、抗蛋白酶的IFN-α变体包含一个或多个氨基酸替代，该替代位于IFN-α2a、IFN-α2c、IFN-αc、IFN-αd、IFN-α5、IFN-α6、IFN-α4、IFN-α4b、IFN-αI、IFN-αJ、IFN-αH、IFN-αF、IFN-α8或共有IFN-α氨基酸序列中的一个或多个靶位置，对应于上述IFN-α2b经修饰的蛋白的三维结构中结构上相关的经修饰的氨基酸位置。与未修饰的(母体)IFN-α相比较，例如与母体IFN-α2a或IFN-α2b多肽相比较，该替代使得对蛋白酶有更强抗性，如通过与蛋白酶或血液溶解物一起孵育、或与血清一起孵育所评估的。
在一些实施方案中，超糖基化、抗蛋白酶的IFN-α变体为修饰的IFN-α2a细胞因子，包含一个或多个氨基酸替代，该替代位于图1(或SEQ ID NO：182)中所示的氨基酸序列的一个或多个靶位置，对应于上述INF-α2b变体三维结构中结构上相关的经修饰的氨基酸位置，其中与未修饰的IFN-β相比较，该替代使得对蛋白酶有更强的抗性，如通过与蛋白酶或血液溶解物一起孵育、或与血清一起孵育所评估的(如上所述)。
在一些实施方案中，超糖基化、抗蛋白酶的IFN-α2a变体包含一个或多个单氨基酸替代，该替代位于SEQ ID NO：182(或图1所示的氨基酸序列)中的一个或多个靶位置，对应于如下任一氨基酸位置：41、58、78、107、117、125、133和159；其进一步包含不同于母体多肽氨基酸序列的氨基酸序列，以至于该变体包含一个或多个未在母体多肽中发现的糖基化位点。
在其他实施方案中，超糖基化、抗蛋白酶的IFN-α变体为修饰的IFN-αc细胞因子，包含一个或多个氨基酸替代，该替代位于SEQ IDNO：183(如图10所示)中的一个或多个靶位置，对应于上述INF-α2b多肽变体三维结构中的结构上相关的经修饰的氨基酸位置，其中与未修饰的IFN-αc相比该替代使得对蛋白酶有更强抗性，如通过与蛋白酶或血液溶解物一起孵育、或与血清一起孵育所评估的(如上所述)。在一些这样的实施方案中，修饰的IFN-αc选自包含一个或多个单氨基酸替代的蛋白，该替代位于SEQ ID NO：183(如图10所示)中的一个或多个靶位置，对应于如下任一氨基酸位置：41、59、79、108、118、126、134和160；其中该变体还包含不同于母体多肽氨基酸序列的氨基酸序列，以至于该变体包含一个或多个未在母体多肽中发现的糖基化位点。
在其他实施方案中，超糖基化、抗蛋白酶的IFN-α变体为修饰的IFN-α2c细胞因子，包含一个或多个氨基酸替代，该替代位于SEQ IDNO：185(如图11所示)中的一个或多个靶位置，对应于上述INF-α2b多肽变体三维结构中的结构上相关的经修饰的氨基酸位置，其中与未修饰的IFN-α2c相比，该替代使得对蛋白酶有更强抗性，如通过与蛋白酶或血液溶解物一起孵育、或与血清一起孵育所评估的(如上所述)。在一些这样的实施方案中，修饰的IFN-α2c选自包含一个或多个单氨基酸替代的蛋白，该替代位于SEQ ID NO：185(如图11所示)中的一个或多个靶位置，对应于如下任何氨基酸位置：41、58、78、107、117、125、133和159，或对应于如下任何氨基酸位置：27、33、41、59、79、90、108、110、111、112、114、118、122、126、134和160；其中该变体进一步包含不同于母体多肽氨基酸序列的氨基酸序列，以至于该变体包含一个或多个未在母体多肽中发现的糖基化位点。
在一些实施方案中，与未修饰的(母体)细胞因子相比，任何上述超糖基化、抗蛋白酶的IFN-α2c变体具有增强的稳定性，如上所述，所述稳定性通过在与一些物质一起孵育之后测定残留的生物活性来进行评估，这些物质为蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物、或血清。在其他实施方案中，如上所述与蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物、或血清一起孵育之后，与未修饰的(母体)细胞因子相比，任何上述的超糖基化、抗蛋白酶的IFN-α2c变体具有增强的生物活性。
在其他实施方案中，超糖基化、抗蛋白酶的IFN-α变体为修饰的IFN-αd细胞因子，包含一个或多个氨基酸替代，该替代位于SEQ IDNO：186(如图12所示)中的一个或多个靶位置，对应于上述INF-α2b多肽变体三维结构中结构上相关的经修饰的氨基酸位置，其中与未修饰的IFN-αd相比较，该替代使得对蛋白酶有更强抗性，如通过与蛋白酶或血液溶解物一起孵育、或与血清一起孵育所评估的(如上所述)。在一些这样的实施方案中，修饰的IFN-αd选自包含一个或多个单氨基酸替代的蛋白，该替代位于SEQ ID NO：186(如图12所示)中的一个或多个靶位置，对应于如下任何氨基酸位置：41、59、79、108、118、126、134和160，或对应于如下任何氨基酸位点27、33、41、59、79、90、108、110、111、112、114、118、122、126、134和160；其中该变体还包含不同于母体多肽氨基酸序列的氨基酸序列，以至于该变体包含一个或多个未在母体多肽中中发现糖基化位点。
在一些实施方案中，与未修饰的(母体)细胞因子相比，任何上述超糖基化、抗蛋白酶的IFN-αd变体具有增强的稳定性，如上所述，所述稳定性通过与一些物质一起孵育之后测定残留的生物活性来进行评估，这些物质为蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物、或血清。在其他实施方案中，如上所述与蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物、或血清一起孵育之后，与未修饰的(母体)细胞因子相比，任何上述的超糖基化、抗蛋白酶的IFN-αd变体具有增强的生物活性。
在其他实施方案中，超糖基化、抗蛋白酶的IFN-α变体为修饰的IFN-α5细胞因子，包含一个或多个氨基酸替代，该替代位于SEQ IDNO：187(如图13所示)中的一个或多个靶位置，对应于上述INF-α2b多肽变体三维结构中结构上相关的经修饰的氨基酸位置，其中与未修饰的IFN-α5相比，该替代使得对蛋白酶有更强抗性，如通过与蛋白酶或血液溶解物一起孵育、或与血清一起孵育所评估的(如上所述)。在一些这样的实施方案中，修饰的IFN-α5选自包含一个或多个单氨基酸替代的蛋白，该替代位于SEQ ID NO：187(如图13所示)中的一个或多个靶位置，对应于如下任何氨基酸位点41、59、79、108、118、126、134和160，或对应于如下任何氨基酸位点：27、33、41、59、79、90、108、110、111、112、114、118、122、126、134和160；其中该变体进一步包含不同于母体多肽氨基酸序列的氨基酸序列，以至于该变体包含一个或多个未在母体多肽中发现的糖基化位点。
在一些实施方案中，与未修饰的(母体)细胞因子相比，任何上述超糖基化、抗蛋白酶的IFN-α5变体具有增强的稳定性，如上所述，所述稳定性通过与一些物质一起孵育之后测定残留的生物活性来评估，这些物质为蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物、或血清。在其他实施方案中，如上所述与蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物、或血清一起孵育之后，与未修饰的(母体)细胞因子相比，任何上述超糖基化、抗蛋白酶的IFN-α5变体具有增强的生物活性。
在其他实施方案中，超糖基化、抗蛋白酶的IFN-α变体为修饰的IFN-α6细胞因子，包含一个或多个氨基酸替代，该替代位于SEQ IDNO：188(如图14所示)中的一个或多个靶位置，对应于上述INF-α2b多肽变体三维结构中结构上相关的经修饰的氨基酸位置，其中与未修饰的IFN-α6相比，该替代使得对蛋白酶有更强抗性，如通过与蛋白酶或血液溶解物一起孵育、或与血清一起孵育所评估的(如上所述)。在一些这样的实施方案中，修饰的IFN-α6选自包含一个或多个单氨基酸替代的蛋白，该替代位于SEQ ID NO：188(如图14所述)中的一个或多个靶位置，对应于如下任何氨基酸位置41、59、79、108、118、126、134和160，或对应于如下任何氨基酸位点27、33、41、59、79、90、108、110、111、112、114、118、122、126、134和160；其中该变体还包含不同于母体多肽氨基酸序列的氨基酸序列，以至于该变体包含一个或多个未在母体多肽中发现的糖基化位点。
在一些实施方案中，与未修饰的(母体)细胞因子相比，任何上述超糖基化、抗蛋白酶的IFN-α6变体具有增强的稳定性，如上所述，所述稳定性通过与一些物质一起孵育之后测定残留的生物活性来评估，这些物质为蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物、或血清。在其他实施方案中，如上所述与蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物、或血清一起孵育之后，与未修饰的(母体)细胞因子相比，任何上述的超糖基化、抗蛋白酶的IFN-α6变体具有增强的生物活性。
在其他实施方案中，超糖基化、抗蛋白酶的IFN-α变体为修饰的IFN-α4细胞因子，包含一个或多个氨基酸替代，该替代位于SEQ IDNO：189(如图15所示)中的一个或多个靶位置，对应于上述INF-α2b多肽变体三维结构中结构上相关的经修饰的氨基酸位置，其中与未修饰的IFN-α4相比，该替代使得对蛋白酶有更强抗性，如通过与蛋白酶或血液溶解物一起孵育、或与血清一起孵育所评估的(如上所述)。在一些这样的实施方案中，修饰的IFN-α4选自包含一个或多个单氨基酸替代的蛋白，该替代位于SEQ ID NO：189(如图15所述)中的一个或多个靶位置，对应于如下任何氨基酸位置：41、59、79、108、118、126、134和160，或对应于如下任何氨基酸位点27、33、41、59、79、90、108、110、111、112、114、118、122、126、134和160；其中该变体进一步包含不同于母体多肽氨基酸序列的氨基酸序列，以至于该变体包含一个或多个未在母体多肽中发现的糖基化位点。
在一些实施方案中，与未修饰的(母体)细胞因子相比，任何上述的超糖基化、抗蛋白酶的IFN-α4变体具有增强的稳定性，如上所述，所述稳定性通过与一些物质一起孵育之后测定残留的生物活性来评估，这些物质为蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物、或血清。在其他实施方案中，如上所述与蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物、或血清一起孵育之后，与未修饰的(母体)田胞因子相比，任一上述的超糖基化、抗蛋白酶的IFN-α4变体具有增强的生物活性。
在其他实施方案中，超糖基化、抗蛋白酶的IFN-α变体为修饰的IFN-α4b细胞因子，包含一个或多个氨基酸替代，该替代位于SEQ IDNO：190(如图16所示)中的一个或多个靶位置，对应于上述INF-α2b多肽变体三维结构中结构上相关的经修饰的氨基酸位置，其中与未修饰的IFN-α4b相比，该替代使得对蛋白酶有更强抗性，如通过与蛋白酶或血液溶解物一起孵育、或与血清一起孵育所评估的(如上所述)。在一些这样的实施方案中，修饰的IFN-α4b选自包含一个或多个单氨基酸替代的蛋白，该替代位于SEQ ID NO：190(如图16所述)中的一个或多个靶位置，对应于如下任何氨基酸位点41、59、79、108、118、126、134和160，或对应于如下任何氨基酸位点27、33、41、59、79、90、108、110、111、112、114、118、122、126、134和160；其中该变体进一步包含不同于母体多肽氨基酸序列的氨基酸序列，以至于该变体包含一个或多个未在母体多肽中发现的糖基化位点。
在一些实施方案中，与未修饰的(母体)细胞因子相比，任何上述的超糖基化、抗蛋白酶的IFN-α4b变体具有增强的稳定性，如上所述，所述稳定性通过与一些物质一起孵育之后测定残留的生物活性来评估，这些物质为蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物、或血清。在其他实施方案中，如上所述与蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物、或血清一起孵育之后，与未修饰的(母体)细胞因子相比，任何上述的超糖基化、抗蛋白酶的IFN-α4b变体具有增强的生物活性。
在其他实施方案中，超糖基化、抗蛋白酶的IFN-α变体为修饰的IFN-αI细胞因子，包含一个或多个氨基酸替代，该替代位于SEQ IDNO：191(如图17所示)中的一个或多个靶位置，对应于上述INF-α2b多肽变体三维结构中结构上相关的经修饰的氨基酸位置，其中与未修饰的IFN-αI相比，该替代使得对蛋白酶有更强抗性，如通过与蛋白酶或血液溶解物一起孵育、或与血清一起孵育所评估的(如上所述)。在一些这样的实施方案中，修饰的IFN-αI选自包含一个或多个单氨基酸替代的蛋白，该替代位于SEQ ID NO：191(如图17所述)中的一个或多个靶位置，对应于如下任何氨基酸位置：41、59、79、108、118、126、134和160，或对应于如下任何氨基酸位置：27、33、41、59、79、90、108、110、111、112、114、118、122、126、134和160；其中该变体进一步包含不同于母体多肽氨基酸序列的氨基酸序列，以至于该变体包含一个或多个未在母体多肽中发现的糖基化位点。
在一些实施方案中，与未修饰的(母体)细胞因子相比，任何上述的超糖基化、抗蛋白酶的IFN-αI变体具有增强的稳定性，如上所述，所述稳定性通过与一些物质一起孵育之后测定残留的生物活性来评估，这些物质为蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物、或血清。在其他实施方案中，如上所述与蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物、或血清一起孵育之后，与未修饰的(母体)细胞因子相比，任何上述的超糖基化、抗蛋白酶的IFN-αI变体具有增强的生物活性。
在其他实施方案中，超糖基化、抗蛋白酶的IFN-α变体为修饰的IFN-αJ细胞因子，包含一个或多个氨基酸替代，该替代位于SEQ IDNO：192(如图18所述)中的一个或多个靶位置，对应于上述INF-α2b多肽变体三维结构中结构上相关的经修饰的氨基酸位置，其中与未修饰的IFN-αJ相比，该替代使得对蛋白酶有更强抗性，如通过与蛋白酶或血液溶解物一起孵育、或与血清一起孵育所评估的(如上所述)。在一些这样的实施方案中，修饰的IFN-αJ选自包含一个或多个单氨基酸替代的蛋白，该替代位于SEQ ID NO：192(如图18所示)中的一个或多个靶位置，对应于如下任何氨基酸位置：41、59、79、108、118、126、134和160，或对应于如下任何氨基酸位置：27、33、41、59、79、90、108、110、111、112、114、118、122、126、134和160；其中该变体进一步包含不同于母体多肽氨基酸序列的氨基酸序列，以至于该变体包含一个或多个未在母体多肽中发现的糖基化位点。
在一些实施方案中，与未修饰的(母体)细胞因子相比，任何上述的超糖基化、抗蛋白酶的IFN-αJ变体具有增强的稳定性，如上所述，所述稳定性通过与一些物质一起孵育之后测定残留的生物活性来评估，这些物质为蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物、或血清。在其他实施方案中，如上所述与蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物、或血清一起孵育之后，与未修饰的(母体)细胞因子相比，任何上述的超糖基化、抗蛋白酶的IFN-αJ变体具有增强的生物活性。
在其他实施方案中，超糖基化、抗蛋白酶的IFN-α变体为修饰的IFN-αH细胞因子，包含一个或多个氨基酸替代，该替代位于SEQ IDNO：193(如图19所示)中的一个或多个目标位置，对应于上述INF-α2b多肽变体三维结构中结构上相关的经修饰的氨基酸位置，其中与未修饰的IFN-αH相比，该替代使得对蛋白酶有更强抗性，如通过与蛋白酶或血液溶解物一起孵育、或与血清一起孵育所评估的(如上所述)。在一些这样的实施方案中，修饰的IFN-αH选自包含一个或多个单氨基酸替代的蛋白，该替代位于SEQ ID NO：193(如图19所示)中的一个或多个靶位置，对应于如下任何氨基酸位置：41、59、79、108、118、126、134和160，或对应于如下任何氨基酸位置：27、33、41、59、79、90、108、110、111、112、114、118、122、126、134和160；其中该变体进一步包含不同于母体多肽氨基酸序列的氨基酸序列，以至于该变体包含一个或多个未在母体多肽中发现的糖基化位点。
在一些实施方案中，与未修饰的(母体)细胞因子相比，任何上述的超糖基化、抗蛋白酶的IFN-αH变体具有增强的稳定性，如上所述，所述稳定性通过与一些物质一起孵育之后测定残留的生物活性来评估，这些物质为蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物、或血清。在其他实施方案中，如上所述与蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物、或血清一起孵育之后，与未修饰的(母体)细胞因子相比，任何上述的超糖基化、抗蛋白酶的IFN-αH变体具有增强的生物活性。
在其他实施方案中，超糖基化、抗蛋白酶的IFN-α变体为修饰的IFN-αF细胞因子，包含一个或多个氨基酸替代，该替代位于SEQ IDNO：194(如图20所示)中的一个或多个靶位置，对应于上述INF-α2b多肽变体三维结构中结构上相关的经修饰的氨基酸位置，其中与未修饰的IFN-αF相比，该替代使得对蛋白酶有更强抗性，如通过与蛋白酶或血液溶解物一起孵育、或与血清一起孵育所评估的(如上所述)。在一些这样的实施方案中，修饰的IFN-αF选自包含一个或多个单氨基酸替代的蛋白，该替代位于SEQ ID NO：194(如图20所示)中的一个或多个靶位置，对应于如下任何氨基酸位置：41、59、79、108、118、126、134和160，或对应于如下任何氨基酸位置：27、33、41、59、79、90、108、110、111、112、114、118、122、126、134和160；其中该变体进一步包含不同于母体多肽氨基酸序列的氨基酸序列，以至于该变体包含一个或多个未在母体多肽中发现的糖基化位点。
在一些实施方案中，与未修饰的(母体)细胞因子相比，任何上述的超糖基化、抗蛋白酶的IFN-αF变体具有增强的稳定性，如上所述，所述稳定性通过与一些物质一起孵育之后测定残留的生物活性来评估，这些物质为蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物、或血清。在其他实施方案中，如上所述与蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物、或血清一起孵育之后，与未修饰的(母体)细胞因子相比，任何上述的超糖基化、抗蛋白酶的IFN-αF变体具有增强的生物活性。
在其他实施方案中，超糖基化、抗蛋白酶的IFN-α变体为修饰的IFN-α8细胞因子，包含一个或多个氨基酸替代，该替代位于SEQ IDNO：195(如图21所示)中的一个或多个靶位置，对应于上述INF-α2b多肽变体三维结构中结构上相关的经修饰的氨基酸位置，其中与未修饰的IFN-α8相比，该替代使得对蛋白酶有更强抗性，如通过与蛋白酶或血液溶解物一起孵育、或与血清一起孵育所评估的(如上所述)。在一些这样的实施方案中，修饰的IFN-α8选自包含一个或多个单氨基酸替代的蛋白，该替代位于SEQ ID NO：195(如图21所述)中的一个或多个靶位置，对应于如下任何氨基酸位置：41、59、79、108、118、126、134和160，或对应于如下任何氨基酸位置：27、33、41、59、79、90、108、110、111、112、114、118、122、126、134和160；其中该变体进一步包含不同于母体多肽氨基酸序列的氨基酸序列，以至于该变体包含一个或多个未在母体多肽中糖基化位点。
在一些实施方案中，与未修饰的(母体)细胞因子相比，任何上述的超糖基化、抗蛋白酶的IFN-α8变体具有增强的稳定性，如上所述，所述稳定性通过与一些物质一起孵育之后测定残留的生物活性来评估，这些物质为蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物、或血清。在其他实施方案中，如上所述与蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物、或血清一起孵育之后，与未修饰的(母体)细胞因子相比，任何上述的超糖基化、抗蛋白酶的IFN-α8变体具有增强的生物活性。
共有IFN-α多肽变体
在其他实施方案中，超糖基化、抗蛋白酶的IFN-α变体为修饰的共有IFN-α细胞因子，包含一个或多个氨基酸替代，该替代位于SEQID NO：232(如图9所示)中的一个或多个靶位置，对应于上述INF-α2b多肽变体三维结构中结构上相关的经修饰的氨基酸位置，其中与未修饰的共有IFN-α相比，该替代使得对蛋白酶有更强抗性，如通过与蛋白酶或血液溶解物一起孵育、或与血清一起孵育所评估的(如上所述)。在一些这样的实施方案中，修饰的共有IFN-α选自包含一个或多个单氨基酸替代的蛋白，该替代位于SEQ ID NO：232(如图9所示)中的一个或多个靶位置，对应于如下任何氨基酸位置：41、58、78、107、117、125、133和159，或对应于如下任何氨基酸位置：27、33、41、59、79、90、108、110、111、112、114、118、122、126、134和160；其中该变体进一步包含不同于母体多肽氨基酸序列的氨基酸序列，以至于该变体包含一个或多个未在母体多肽中发现的糖基化位点。
在一些实施方案中，任何上述的共有IFN-α变体为[D99N]干扰素alfacon-1糖肽，其中[D99N]干扰素alfacon-1糖肽为干扰素alfacon-1多肽的变体，其具有(a)天冬酰胺残基，该天冬酰胺残基替代图24所描述的Infergen(干扰素alfacon-1)氨基酸序列中99位氨基酸天然天冬氨酸残基(其中氨基酸位置显示在图24中；图24中的D99对应于图9中的D71)；和(b)与所述天冬酰胺残基的R基团共价连接的糖部分。
在一些实施方案中，任何上述的共有IFN-α变体为[D99N，D105N]干扰素alfacon-1糖肽，其中[D99N，D105N]干扰素alfacon-1糖肽为干扰素alfacon-1多肽的变体，其具有(a)天冬酰胺残基，该天冬酰胺残基替代图24所描述的Infergen氨基酸序列中99位和105位氨基酸的每个天然天冬氨酸残基(其中氨基酸位置显示在图24中；图24中的D99和D105分别对应于图9中的D71和D77)；和(b)与每一所述天冬酰胺残基的R基团共价连接的糖部分。
在一些实施方案中，任何上述的共有IFN-α变体为[D99N，D105N，E134N]干扰素alfacon-1糖肽，其中[D99N，D105N，E134N]干扰素alfacon-1糖肽为干扰素alfacon-1多肽的变体，其具有(a)天冬酰胺残基，该天冬酰胺残基分别替代图24所描述的Infergen氨基酸序列中99、105和134位氨基酸位点天然天冬氨酸、天冬氨酸和谷氨酸残基(其中氨基酸位置显示在图24中；图24中的D99、D105和E134分别对应于图9中的D71、D77和E106)；和(b)与每个所述天冬酰胺残基的R基团共价连接的糖部分。
在一些实施方案中，任何上述的共有IFN-α变体为[D99N，E134N]干扰素alfacon-1糖肽，其中[D99N，E134N]干扰素alfacon-1糖肽为干扰素alfacon-1多肽的变体，其具有(a)天冬酰胺残基，该天冬酰胺残基分别替代图24所描述的Infergen氨基酸序列中99和134位氨基酸天然天冬氨酸和谷氨酸残基的每一个(其中氨基酸位置显示在图24中；图24中的D99和E134分别对应于图9中的D71和E106)；和(b)与每一所述天冬酰胺残基的R基团共价连接的糖部分。
在一些实施方案中，任何上述的共有IFN-α变体为[D105N，E134N]干扰素alfacon-1糖肽，其中[D105N，E134N]干扰素alfacon-1糖肽为干扰素alfacon-1多肽的变体，其具有(a)天冬酰胺残基，该天冬酰胺残基分别替代图24所描述的Infergen氨基酸序列中105和134位氨基酸天然天冬氨酸和谷氨酸残基的每一个(其中氨基酸位置显示在图24中；图24中的D105和E134分别对应于图9中的D77和E106)；和(b)与每一所述天冬酰胺残基的R基团共价连接的糖部分。
在一些实施方案中，任何上述的共有IFN-α变体为[D99N，D105N，E134T]干扰素alfacon-1糖肽，其中[D99N，D105N，E134T]干扰素a1facon-1糖肽为干扰素alfacon-1多肽的变体，具有(a)天冬酰胺残基，该天冬酰胺残基替代图24所描述的Infergen氨基酸序列中99和105位氨基酸天然天冬氨酸残基的每一个，(b)苏氨酸残基，该苏氨酸残基替代图24所描述的Infergen氨基酸序列中134位氨基酸天然谷氨酸残基(其中氨基酸位置显示在图24中；图24中的D99、D105和E134分别对应于图9中的D71、D77和E106)；和(c)与每一所述天冬酰胺和苏氨酸残基的R基团共价连接的糖部分。
在一些实施方案中，任何上述的共有IFN-α变体为[D99N，E134T]干扰素alfacon-1糖肽，其中[D99N，E134T]干扰素alfacon-1糖肽为干扰素alfacon-1多肽的变体，其具有(a)天冬酰胺残基，该天冬酰胺残基替代图24所描述的Infergen氨基酸序列中99位氨基酸天然天冬氨酸残基，(b)苏氨酸残基，该苏氨酸残替代图24所描述的Infergen氨基酸序列中134位氨基酸天然谷氨酸残基(其中氨基酸位置显示在图24中；图24中的D99和E134分别对应于图9中的D71和E106)；和(c)与每一所述天冬酰胺和苏氨酸残基的R基团共价连接的糖部分。
在一些实施方案中，任何上述的共有IFN-α变体为[D105N，E134T]干扰素alfacon-1糖肽，其中[D105N，E134T]干扰素alfacon-1糖肽为干扰素alfacon-1多肽的变体，其具有(a)天冬酰胺残基，该天冬酰胺残基替代图24所描述的Infergen氨基酸序列中105位氨基酸天然天冬氨酸残基，(b)苏氨酸残基，该苏氨酸残基替代图24所描述的Infergen氨基酸序列中134位氨基酸天然谷氨酸残基(其中氨基酸位置显示在图24中；图24中的D105和E134分别对应于图9中的D77和E106)；和(c)与每一所述天冬酰胺和苏氨酸残基的R基团共价连接的糖部分。杂种I型干扰素受体多肽激动剂
本文所用的“杂种I型干扰素受体多肽激动剂”为具有如下氨基酸序列的多肽：包含不连续的亚序列，这些亚序列在氨基酸一致性和数量上对应于不同的、天然存在的I型干扰素受体多肽激动剂，其中，本发明多肽激动剂的氨基酸序列不同于任何天然存在的I型干扰素受体多肽激动剂。在一些实施方案中，多肽变体由选自IFN-α2b、IFN-α14、IFN-β1和IFN-ω的不连续的亚序列组成，并且该多肽变体激动剂的氨基酸序列不同于IFN-α2b、IFN-α14、IFN-β1和IFN-ω的氨基酸序列。在其他实施方案中，多肽变体由选自IFN-α2b、IFN-α14、IFN-β1、Infergen共有IFN-α和IFN-ω的不连续的亚序列组成，并且该多肽变体的氨基酸序列不同于IFN-α2b、IFN-α14、IFN-β1、Infergen共有IFN-α和IFN-ω的氨基酸序列。
适合的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包括任何母体杂种I型干扰素受体多肽激动剂的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的形式。一方面，母体杂种I型干扰素受体多肽激动剂的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的变体具有不同于母体多肽氨基酸序列的氨基酸序列，以至于该变体包含一个或多个未在母体多肽中发现的糖基化位点；并包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其替代了在母体多肽中发现的天然蛋白酶切割位点。
一方面，母体杂种I型干扰素受体多肽激动剂为[D99N]IFN-α2a糖肽，其中[D99N]IFN-α2a糖肽为IFN-α2a的变体，其具有天冬酰胺残基，该天冬酰胺残基替代了IFN-α2a氨基酸序列中99位氨基酸天然天冬氨酸残基；以及母体多肽的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体为抗蛋白酶的[D99N，D105N]IFN-α2a糖肽，其中该抗蛋白酶的[D99N，D105N]IFN-α2a糖肽为IFN-α2a的变体，其具有(a)天冬酰胺残基，该天冬酰胺残基替代了IFN-α2a氨基酸序列中99和105位氨基酸天然天冬氨酸残基的每一个(其中D99和D105氨基酸位置显示在图24中；分别对应于图1所示IFN-α2a氨基酸序列的D71和D77)；和(b)与每一所述天冬酰胺残基的R基团共价连接的糖部分；并且包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替了母体多肽的天然蛋白酶切割位点。应理解的是，如果IFN-α2a序列具有赖氨酸残基替代图24所示的IFN-α2b序列中50位氨基酸精氨酸残基(对应于图2所示的IFN-α2b序列的R50)，那么IFN-α2a的氨基酸序列与图24所描述的IFN-α2b的氨基酸序列相同。
另一方面，母体杂种I型干扰素受体多肽激动剂为[D99N]IFN-α2b糖肽，其中该[D99N]IFN-α2b糖肽为IFN-α2b的变体，其具有天冬酰胺残基代替图24所描述的IFN-α2b氨基酸序列中99位氨基酸天然天冬氨酸残基；以及母体多肽的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体为抗蛋白酶的[D99N，D105N]IFN-α2b糖肽，其中该抗蛋白酶的[D99N，D105N]IFN-α2b糖肽为IFN-α2b的变体，具有(a)天冬酰胺残基代替图24所描述的IFN-α2b氨基酸序列中99和105位氨基酸天然天冬氨酸残基的每一个(其中D99和D105氨基酸位置显示在图24中；分别对应于图2所述IFN-α2b氨基酸序列的D71和D77)；和(b)与每一所述天冬酰胺残基的R基团共价连接的糖部分；并且包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替了母体多肽的天然蛋白酶切割位点。
另一方面，母体杂种I型干扰素受体多肽激动剂为干扰素alfacon-1多肽，以及该母体多肽中的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体为[D99N]干扰素alfacon-1糖肽，其中该[D99N]干扰素alfacon-1糖肽为干扰素alfacon-1多肽的变体，其具有(a)天冬酰胺残基取代图24所描述的Infergen氨基酸序列中99位氨基酸天然天冬氨酸残基(其中D99氨基酸位置显示在图24中；对应于图9所示的共有IFN-α氨基酸序列的D71)；和(b)与所述天冬酰胺残基的R基团共价连接的糖类分；并且包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替了母体多肽的天然蛋白酶切割位点。
另一方面，母体杂种I型干扰素受体多肽激动剂为干扰素alfacon-1多肽，母体多肽中的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体为[D99N，D105N]干扰素alfacon-1糖肽，其中该[D99N，D105N]干扰素alfacon-1糖肽为干扰素alfacon-1多肽的变体，其具有(a)天冬酰胺残基取代图24所描述的Infergen氨基酸序列中99和105位氨基酸天然天冬氨酸残基的每一个(其中D99和D105氨基酸位置显示在图24中；分别对应于图9所示的共有IFN-α氨基酸序列的D71和D77)；和(b)与每一所述天冬酰胺残基的R基团共价连接的糖部分；并且包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替了母体多肽的天然蛋白酶切割位点。
另一方面，母体杂种I型干扰素受体多肽激动剂为干扰素alfacon-1多肽，以及母体多肽的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体为[D99N，D105N，E134N]干扰素alfacon-1糖肽，其中该[D99N，D105N，E134N]干扰素alfacon-1糖肽为干扰素alfacon-1多肽的变体，其具有(a)天冬酰胺残基分别取代图24所描述的Infergen氨基酸序列中99、105和134位氨基酸天然天冬氨酸、天冬氨酸和谷氨酸残基(其中D99、D105和E134氨基酸位置显示在图24中；分别对应于图9所述共有IFN-α氨基酸序列的D71、D77和E106)；和(b)与每一所述天冬酰胺残基的R基团共价连接的糖部分；并且包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替了母体多肽的天然蛋白酶切割位点。
另一方面，母体杂种I型干扰素受体多肽激动剂为干扰素alfacon-1多肽，以及母体多肽的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体为[D99N，E134N]干扰素alfacon-1糖肽，其中该[D99N，E134N]干扰素alfacon-1糖肽为干扰素alfacon-1多肽的变体，其具有(a)天冬酰胺残基分别取代图24所描述的Infergen氨基酸序列中99和134位氨基酸天然天冬氨酸和谷氨酸残基(其中D99和E134氨基酸位置显示在图24中；分别对应于图9所示的共有IFN-α氨基酸序列的D71和E106)；和(b)与每一所述天冬酰胺残基的R基团共价连接的糖部分；并且包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替了母体多肽的天然蛋白酶切割位点。
另一方面，母体杂种I型干扰素受体多肽激动剂为干扰素alfacon-1多肽，以及母体多肽的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体为[D105N，E134N]干扰素alfacon-1糖肽，其中该[D105N，E134N]干扰素alfacon-1糖肽为干扰素alfacon-1多肽的变体，其具有(a)天冬酰胺残基分别取代图24所描述的Infergen氨基酸序列中105和134位氨基酸天然天冬氨酸和谷氨酸残基(其中D105和E134氨基酸位置显示在图24中；分别对应于图9所示共有IFN-α氨基酸序列的D77和E106)；和(b)与每一所述天冬酰胺残基的R基团共价连接的糖部分；并且包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替了母体多肽的天然蛋白酶切割位点。
另一方面，母体杂种I型干扰素受体多肽激动剂为干扰素alfacon-1多肽，以及母体多肽的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体为[D99N，D105N，E134T]干扰素alfacon-1糖肽，其中该[D99N，D105N，E134T]干扰素alfacon-1糖肽为干扰素alfacon-1多肽的变体，其具有(a)天冬酰胺残基取代图24所描述的Infergen氨基酸序列中99和105氨基酸天然天冬氨酸残基的每一个；(b)苏氨酸残基取代图24所描述的Infergen氨基酸序列中134氨基酸天然谷氨酸残基(其中D99、D105和E134氨基酸位置显示在图24中；分别对应于图9所述共有IFN-α氨基酸序列的D71、D77和E106)；和(c)与每一所述天冬酰胺和苏氨酸残基的R基团共价连接的糖部分；并且包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替了母体多肽的天然蛋白酶切割位点。
另一方面，母体杂种I型干扰素受体多肽激动剂为干扰素alfacon-1多肽，以及母体多肽的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体为[D99N，E134T]干扰素alfacon-1糖肽，其中该[D99N，E134T]干扰素alfacon-1糖肽为干扰素alfacon-1多肽的变体，其具有(a)天冬酰胺残基取代图24所描述的Infergen氨基酸序列中99位氨基酸天然天冬氨酸残基；(b)苏氨酸残基取代图24所描述的Infergen氨基酸序列中134位氨基酸天然谷氨酸残基(其中D99和E134氨基酸位置显示在图24中；分别对应于图9所示的共有IFN-α氨基酸序列中的D71和E106)；和(c)与每一所述天冬酰胺和苏氨酸残基的R基团共价连接的糖部分；并且包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替了母体多肽的天然蛋白酶切割位点。
另一方面，母体杂种I型干扰素受体多肽激动剂为干扰素alfacon-1多肽，以及母体多肽的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体为[D105N，E134T]干扰素alfacon-1糖肽，其中该[D105N，E134T]干扰素alfacon-1糖肽为干扰素alfacon-1多肽的变体，其具有(a)天冬酰胺残基取代图24所描述的Infergen氨基酸序列中105位氨基酸天然天冬氨酸残基；(b)苏氨酸残基取代图24所描述的Infergen氨基酸序列中134位氨基酸天然谷氨酸残基(其中D105和E134氨基酸位置显示在图24中；分别对应于图9所示的共有IFN-α氨基酸序列的D77和E106)；和(c)与每一所述天冬酰胺和苏氨酸残基的R基团共价连接的糖部分；并且包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替了母体多肽的天然蛋白酶切割位点。
另一方面，母体杂种I型干扰素受体多肽激动剂为图24所描述的“多数”共有I型干扰素氨基酸序列；以及母体多肽的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体为[D99N]“多数”共有I型干扰素糖肽，其中该[D99N]“多数”共有I型干扰素糖肽为图24所描述的“多数”氨基酸序列，其具有(a)天冬酰胺残基取代所述“多数”氨基酸序列中99位氨基酸天然天冬氨酸残基，和(b)与所述天冬酰胺残基的R基团共价连接的糖部分；并且包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替了母体多肽的天然蛋白酶切割位点。
另一方面，母体杂种I型干扰素受体多肽激动剂为图24所描述的“多数”共有I型干扰素氨基酸序列；以及母体多肽的抗蛋白酶的或抗蛋白酶的、超糖基化的多肽变体为[D99N，D105N]“多数”共有I型干扰素糖肽，其中该[D99N，D105N]“多数”共有I型干扰素糖肽为图24所描述的“多数”氨基酸序列，其具有(a)天冬酰胺残基取代所述“多数”氨基酸序列中99和105位氨基酸天然天冬氨酸残基的每一个，和(b)与每一所述天冬酰胺残基的R基团共价连接的糖部分；并且包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替了母体多肽的天然蛋白酶切割位点。
另一方面，母体杂种I型干扰素受体多肽激动剂为图24所描述的“多数”共有I型干扰素氨基酸序列；以及母体多肽的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体为[D99N，D105N，E134N]“多数”共有I型干扰素糖肽，其中该[D99N，D105N，E134N]“多数”共有I型干扰素糖肽为图24所描述的“多数”氨基酸序列，其具有(a)天冬酰胺残基分别取代所述“多数”氨基酸序列中99、105和134位氨基酸天然天冬氨酸、天冬氨酸和谷氨酸残基的每一个，和(b)与每一所述天冬酰胺残基的R基团共价连接的糖部分；并且包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替了母体多肽的天然蛋白酶切割位点。
另一方面，母体杂种I型干扰素受体多肽激动剂为图24所描述的“多数”共有I型干扰素氨基酸序列；以及母体多肽的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体为[D99N，E134N]“多数”共有I型干扰素糖肽，其中该[D99N，E134N]“多数”共有I型干扰素糖肽为图24所描述的“多数”氨基酸序列，其具有(a)天冬酰胺残基分别取代所述“多数”氨基酸序列中99和134位氨基酸天然天冬氨酸和谷氨酸残基的每一个(其中氨基酸位置显示在图24中)；和(b)与每一所述天冬酰胺残基的R基团共价连接的糖部分；并且包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替了母体多肽的天然蛋白酶切割位点。
另一方面，母体杂种I型干扰素受体多肽激动剂为图24所描述的“多数”共有I型干扰素氨基酸序列；以及母体多肽的抗蛋白酶的或抗蛋白酶的、超糖基化的多肽变体为[D105N，E134N]“多数”共有I型干扰素糖肽，其中该[D105N，E134N]“多数”共有I型干扰素糖肽为图24所描述的“多数”氨基酸序列，其具有(a)天冬酰胺残基分别替代所述“多数”氨基酸序列中105和134位氨基酸天然天冬氨酸和谷氨酸残基的每一个(其中氨基酸位置显示在图24中)；和(b)与每一所述天冬酰胺残基的R基团共价连接的糖部分；并且包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替了母体多肽的天然蛋白酶切割位点。
另一方面，母体杂种I型干扰素受体多肽激动剂为图24所描述的“多数”共有I型干扰素氨基酸序列；以及母体多肽的抗蛋白酶的或抗蛋白酶的、超糖基化的多肽变体为[D99N，D105N，E134T]“多数”共有I型干扰素糖肽，其中该[D99N，D105N，E134T]“多数”共有I型干扰素糖肽为图24所描述的“多数”氨基酸序列，其具有(a)天冬酰胺残基替代所述“多数”氨基酸序列中99和105位氨基酸天然天冬氨酸残基的每一个，(b)苏氨酸残基替代所述“多数”氨基酸序列中134位氨基酸天然谷氨酸残基，和(c)与每一所述天冬酰胺和苏氨酸残基的R基团共价连接的糖部分；并且包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替了母体多肽的天然蛋白酶切割位点。
另一方面，母体杂种I型干扰素受体多肽激动剂为图24所描述的“多数”共有I型干扰素氨基酸序列；以及母体多肽的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体为[D99N，E134T]“多数”共有I型干扰素糖肽，其中该[D99N，E134T]“多数”共有I型干扰素糖肽为图24所描述的“多数”氨基酸序列，其具有(a)天冬酰胺残基替代所述“多数”氨基酸序列中99位氨基酸天然天冬氨酸残基，(b)苏氨酸残基取替所述“多数”氨基酸序列中134位氨基酸天然谷氨酸残基，和(c)与每一所述天冬酰胺和苏氨酸残基的R基团共价连接的糖部分；并且包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替了母体多肽的天然蛋白酶切割位点。
另一方面，母体杂种I型干扰素受体多肽激动剂为图24所描述的“多数”共有I型干扰素氨基酸序列；以及母体多肽的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体为[D105N，E134T]“多数”共有I型干扰素糖肽，其中该[D105N，E134T]“多数”共有I型干扰素糖肽为图24所描述的“多数”氨基酸序列，其具有(a)天冬酰胺残基替代所述“多数”氨基酸序列中105位氨基酸天然天冬氨酸残基，(b)苏氨酸残基替代所述“多数”氨基酸序列中134位氨基酸天然谷氨酸残基(其中氨基酸位置显示在图24中)；和(c)与每一所述天冬酰胺和苏氨酸残基的R基团共价连接的糖部分；其中包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替了母体多肽的天然蛋白酶切割位点。
本文中用于描述母体杂种I型干扰素受体多肽激动剂的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体的氨基酸替代的编号(在产生母体蛋白治疗剂的超糖基化变体的上下文中论述)与图24中用于描述I型干扰素氨基酸序列的氨基酸编号一致。
另一方面，母体杂种I型干扰素受体多肽激动剂治疗剂的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体不同于母体杂种I型干扰素受体多肽激动剂治疗剂，以至于该抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含(1)共价连接到未在母体杂种I型干扰素受体多肽激动剂治疗剂中发现的非天然糖基化位点的糖部分，和/或(2)共价连接到出现在母体杂种I型干扰素受体多肽激动剂治疗剂中但未被糖基化的天然糖基化位点的糖部分。
在一些实施方案中，与未修饰的(母体)细胞因子相比，任何上述的超糖基化、抗蛋白酶的IFN-α变体具有增强的稳定性，如上所述，所述稳定性通过与一些物质一起孵育之后测定残留的生物活性来评估，这些物质为蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物、或血清。在其他实施方案中，如上所述与蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物、或血清一起孵育之后，与未修饰的(母体)细胞因子相比，任何上述的超糖基化、抗蛋白酶的IFN-α变体具有增强的生物活性。
INF-β多肽变体
在一些实施方案中，抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的细胞因子变体为INF-β变体。在一些实施方案中，抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的INF-β变体包含SEQ ID NO：196(或如图3所示的氨基酸序列)中的一个或多个单氨基酸替代，对应的一个或多个下列替代：在1位M被V替代，在第1位M被I替代，在第1位M被T替代，在第1位M被Q替代，在第1位M被A替代，在第5位L被V替代，在第5位L被I替代，在第5位L被T替代，在第5位L被Q替代，在第5位L被H替代，在第5位L被A替代，在第8位F被I替代，在第8位F被V替代，在第9位L被V替代，在第9位L被I替代，在第9位L被T替代，在第9位L被Q替代，在第9位L被H替代，在第9位L被A替代，在第11位R被H替代，在第11位R被Q替代，在第15位F被I替代，在第15位F被V替代，在第19位K被Q替代，在第19位K被T替代，在第19位K被S替代，在第19位K被H替代，在第22位W被S替代，在第22位W被H替代，在第25位N被H替代，在第25位N被S替代，在第25位N被Q替代，在第27位R被H替代，在第27位R被Q替代，在第28位L被V替代，在第28位L被I替代，在第28位L被T替代，在第28位L被Q替代，在第28位L被H替代，在第28位L被A替代，在第29位E被Q替代，在第29位E被H替代，在第30位Y被H替代，在第30位Y被I替代，在第32位L被V替代，在第32位L被I替代，在第32位L被T替代，在第32位L被Q替代，在第32位L被H替代，在第32位L被A替代，在第33位K被Q替代，在第33位K被T替代，在第33位K被S替代，在第33位K被H替代，在第35位R被H替代，在第35位R被Q替代，在第36位M被V替代，在第36位M被I替代，在第36位M被T替代，在第36位M被Q替代，在第36位M被A替代，在第39位D被Q替代，在第39位D被H替代，在第39位D被G替代，在第42位E被Q替代，在第42位E被H替代，在第45位K被Q替代，在第45位K被T替代，在第45位K被S替代，在第45位K被H替代，在第47位L被V替代，在第47位L被I替代，在第47位L被T替代，在第47位L被Q替代，在第47位L被H替代，在第47位L被A替代，在第52位K被Q替代，在第52位K被T替代，在第52位K被S替代，在第52位K被H替代，在第67位F被I替代，在第67位F被V替代，在第71位R被H替代，在第71位R被Q替代，在第73位D被Q替代，在第73位D被H替代，在第73位D被G替代，在第81位E被Q替代，在第81位E被H替代，在第85位E被Q替代，在第85位E被H替代，在第92位Y被H替代，在第92位Y被I替代，在第99位K被Q替代，在第99位K被T替代，在第99位K被S替代，在第99位K被H替代，在第103位E被Q替代，在第103位E被H替代，在第104位E被Q替代，在第104位E被H替代，在第105位K被Q替代，在第105位K被T替代，在第105位K被S替代，在第105位K被H替代，在第107位E被Q替代，在第107位E被H替代，在第108位K被Q替代，在第108位K被T替代，在第108位K被S替代，在第108位K被H替代，在第109位E被Q替代，在第109位E被H替代，在第110位D被Q替代，在第110位D被H替代，在第110位D被G替代，在第111位F被I替代，在第111位F被V替代，在第113位R被H替代，在第113位R被Q替代，在第116位L被V替代，在第116位L被I替代，在第116位L被T替代，在第116位L被Q替代，在第116位L被H替代，在第116位L被A替代，在第120位L被V替代，在第120位L被I替代，在第120位L被T替代，在第120位L被Q替代，在第120位L被H替代，在第120位L被A替代，在第123位K被Q替代，在第123位K被T替代，在第123位K被S替代，在第123位K被H替代，在第124位R被H替代，在第124位R被Q替代，在第128位R被H替代，在第128位R被Q替代，在第130位L被V替代，在第130位L被I替代，在第130位L被T替代，在第130位L被Q替代，在第130位L被H替代，在第130位L被A替代，在第134位K被Q替代，在第134位K被T替代，在第134位K被S替代，在第134位K被H替代，在第136位K被Q替代，在第136位K被T替代，在第136位K被S替代，在第136位K被H替代，在第137位E被Q替代，在第137位E被H替代，在第138位Y被H替代，在第138位Y被I替代，在第152位R被H替代，在第152位R被Q替代，在第155位Y被H替代，在第155位Y被I替代，在第159位R被H替代，在第159位R被Q替代，在第163位Y被H替代，在第163位Y被I替代，在第165位R被H替代，在第165位R被Q替代，在第1位M被D替代，在第1位M被E替代，在第1位M被K替代，在第1位M被N替代，在第1位M被R替代，在第1位M被S替代，在第5位L被D替代，在第5位L被E替代，在第5位L被K替代，在第5位L被N替代，在第5位L被R替代，在第5位L被S替代，在第6位L被D替代，在第6位L被E替代，在第6位L被K替代，在第6位L被N替代，在第6位L被R替代，在第6位L被S替代，在第6位L被Q替代，在第6位L被T替代，在第8位F被E替代，在第8位F被K替代，在第8位F被R替代，在第8位F被D替代，在第9位L被D替代，在第9位L被E替代，在第9位L被K替代，在第9位L被N替代，在第9位L被R替代，在第9位L被S替代，在第10位Q被D替代，在第10位Q被E替代，在第10位Q被K替代，在第10位Q被N替代，在第10位Q被R替代，在第10位Q被S替代，在第10位Q被T替代，在第12位S被D替代，在第12位S被E替代，在第12位S被K替代，在第12位S被R替代，在第13位S被D替代，在第13位S被E替代，在第13位S被K替代，在第13位S被R替代，在第13位S被N替代，在第13位S被Q替代，在第13位S被T替代，在第14位N被D替代，在第14位N被E替代，在第14位N被K替代，在第14位N被Q替代，在第14位N被R替代，在第14位N被S替代，在第14位N被T替代，在第15位F被D替代，在第15位F被E替代，在第15位F被K替代，在第15位F被R替代，在第16位Q被D替代，在第16位Q被E替代，在第16位Q被K替代，在第16位Q被N替代，在第16位Q被R替代，在第16位Q被S替代，在第16位Q被T替代，在第17位C被D替代，在第17位C被E替代，在第17位C被K替代，在第17位C被N替代，在第17位C被Q替代，在第17位C被R替代，在第17位C被S替代，在第17位C被T替代，在第20位L被N替代，在第20位L被Q替代，在第20位L被R替代，在第20位L被S替代，在第20位L被T替代，在第20位L被D替代，在第20位L被E替代，在第20位L被K替代，在第22位W被D替代，在第22位W被E替代，在第22位W被K替代，在第22位W被R替代，在第23位Q被D替代，在第23位Q被E替代，在第23位Q被K替代，在第23位Q被R替代，在第24位L被D替代，在第24位L被E替代，在第24位L被K替代，在第24位L被R替代，在第79位W被D替代，在第79位W被E替代，在第79位W被K替代，在第79位W被R替代，在第80位N被D替代，在第80位N被E替代，在第80位N被K替代，在第80位N被R替代，在第82位T被D替代，在第82位T被E替代，在第82位T被K替代，在第82位T被R替代，在第83位I被D替代，在第83位I被E替代，在第83位I被K替代，在第83位I被R替代，在第83位I被N替代，在第83位I被Q替代，在第83位I被S替代，在第83位I被T替代，在第86位N被D替代，在第86位N被E替代，在第86位N被K替代，在第86位N被R替代，在第86位N被Q替代，在第86位N被S替代，在第86位N被T替代，在第87位L被D替代，在第87位L被E替代，在第87位L被K替代，在第87位L被R替代，在第87位L被N替代，在第87位L被Q替代，在第87位L被S替代，在第87位L被T替代，在第89位A被D替代，在第89位A被E替代，在第89位A被K替代，在第89位A被R替代，在第90位N被D替代，在第90位N被E替代，在第90位N被K替代，在第90位N被Q替代，在第90位N被R替代，在第90位N被S替代，在第90位N被T替代，在第91位V被D替代，在第91位V被E替代，在第91位V被K替代，在第91位V被N替代，在第91位V被Q替代，在第91位V被R替代，在第91位V被S替代，在第91位V被T替代，在第94位Q被D替代，在第94位Q被E替代，在第94位Q被Q替代，在第94位Q被N替代，在第94位Q被R替代，在第94位Q被S替代，在第94位Q被T替代，在第95位I被D替代，在第95位I被E替代，在第95位I被K替代，在第95位I被N替代，在第95位I被Q替代，在第95位I被R替代，在第95位I被S替代，在第95位I被T替代，在第97位H被D替代，在第97位H被E替代，在第97位H被K替代，在第97位H被N替代，在第97位H被Q替代，在第97位H被R替代，在第97位H被S替代，在第97位H被T替代，在第98位L被D替代，在第98位L被E替代，在第98位L被K替代，在第98位L被N替代，在第98位L被Q替代，在第98位L被R替代，在第98位L被S替代，在第98位L被T替代，在第101位V被D替代，在第101位V被E替代，在第101位V被K替代，在第101位V被N替代，在第101位V被Q替代，在第101位V被R替代，在第101位V被S替代，在第101位V被T替代，在第1位M被C替代，在第6位L被C替代，在第10位Q被C替代，在第13位S被C替代，在第16位Q被C替代，在第17位L被C替代，在第101位V被C替代，在第98位L被C替代，在第97位H被C替代，在第94位Q被C替代，在第91位V被C替代，或在第90位N被C替代，其中残基1对应于SEQ ID NO：196所示的成熟IFN-β细胞因子的残基1；并且还包含不同于母体多肽氨基酸序列的氨基酸序列，以至于该变体包含一个或多个未在母体多肽中发现的糖基化位点。
3-D结构的同源物
在其他实施方案中，超糖基化、抗蛋白酶的干扰素变体为修饰的IFN-β细胞因子，包含一个或多个氨基酸替代，该替代位于SEQ IDNO：196(如图3所示)中的一个或多个靶位置，对应于上述INF-α2b多肽变体三维结构中结构上相关的经修饰的氨基酸位置，其中与未修饰的IFN-β相比，该替代使得对蛋白酶有更强抗性，如通过与蛋白酶或血液溶解物一起孵育、或与血清一起孵育所评估的(如上所述)。在一些这样的实施方案中，修饰的IFN-β选自包含一个或多个单氨基酸替代的蛋白，该替代位于SEQ ID NO：196(如图3所示)中的一个或多个靶位置，对应于如下任何氨基酸位置：39、42、45、47、52、67、71、73、81、107、108、109、110、111、113、116、120、123、124、12R、130、134、136、137、163和165，其中，突变包括插入、删除和天然氨基酸残基的替代；其中该变体进一步包含不同于母体多肽氨基酸序列的氨基酸序列，以至于该变体包含一个或多个未在母体多肽中发现的糖基化位点。
在其他实施方案中，超糖基化、抗蛋白酶的干扰素变体为修饰的IFN-β细胞因子，包含一个或多个氨基酸替代，其中该替代选自SEQ IDNO：196(如图3所示)中对应于如下的氨基酸置换：在第39位D被Q替代，在第39位D被H替代，在第39位D被G替代，在第42位E被Q替代，在第42位E被H替代，在第45位K被Q替代，在第45位K被T替代，在第45位K被S替代，在第45位K被H替代，在第47位L被V替代，在第47位L被I替代，在第47位L被T替代，在第47位L被Q替代，在第47位L被H替代，在第47位L被A替代，在第52位K被Q替代，在第52位K被T替代，在第52位K被S替代，在第52位K被H替代，在第67位F被I替代，在第67位F被V替代，在第71位R被H替代，在第71位R被Q替代，在第73位D被H替代，在第73位D被G替代，在第73位D被Q替代，在第81位E被Q替代，在第81位E被H替代，在第107位E被Q替代，在第107位E被H替代，在第108位K被Q替代，在第108位K被T替代，在第108位K被S替代，在第108位K被H替代，在第109位E被Q替代，在第109位E被H替代，在第110位D被Q替代，在第110位D被H替代，在第110位D被G替代，在第111位F被I替代，在第111位F被V替代，在第113位R被H替代，在第113位R被Q替代，在第116位L被V替代，在第116位L被I替代，在第116位L被T替代，在第116位L被Q替代，在第116位L被H替代，在第116位L被A替代，在第120位L被V替代，在第120位L被I替代，在第120位L被T替代，在第120位L被Q替代，在第120位L被H替代，在第120位L被A替代，在第123位K被Q替代，在第123位K被T替代，在第123位K被S替代，在第123位K被H替代，在第124位R被H替代，在第124位R被Q替代，在第128位R被H替代，在第128位R被Q替代，在第130位L被V替代，在第130位L被I替代，在第130位L被T替代，在第130位L被Q替代，在第130位L被H替代，在第130位L被A替代，在第134位K被Q替代，在第134位K被T替代，在第134位K被S替代，在第134位K被H替代，在第136位K被Q替代，在第136位K被T替代，在第136位K被S替代，在第136位K被H替代，在第137位E被Q替代，在第137位E被H替代，在第163位Y被H替代，在第163位Y被I替代，在第165位R被H替代，在第165位R被Q替代，其中所列的第一个氨基酸在表明的位置被第二个氨基酸置换；其中该变体进一步包含不同于母体多肽氨基酸序列的氨基酸序列，以至于该变体包含一个或多个未在母体多肽中发现的糖基化位点。
在一些实施方案中，与未修饰的(母体)细胞因子相比，任何上述超糖基化、抗蛋白酶的IFN-β变体具有增强的稳定性，如上所述，所述稳定性通过与一些物质一起孵育之后测定残留的生物活性来评估，这些物质为蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物、或血清。在其他实施方案中，如上所述与蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物、或血清一起孵育之后，与未修饰的(母体)细胞因子相比，任何上述的超糖基化、抗蛋白酶的IFN-β变体具有增强的生物活性。
在其他实施方案中，超糖基化、抗蛋白酶的干扰素变体为修饰的IFN-β1细胞因子，包含一个或多个氨基酸替代，该替代位于SEQ IDNO：197(如图22所示)中的一个或多个靶位置，对应于上述INF-α2b多肽变体三维结构中结构上相关的经修饰的氨基酸位置，其中与未修饰的IFN-β1相比，该替代使得对蛋白酶有更强抗性，如通过与蛋白酶或血液溶解物一起孵育、或与血清一起孵育所评估的(如上所述)。在一些这样的实施方案中，修饰的IFN-β1选自包含一个或多个单氨基酸替代的蛋白，该替代位于SEQ ID NO：197(如图22所示)中的一个或多个靶位置，对应于如下任何氨基酸位置：39、42、45、47、52、67、71、73、81、107、108、109、110、111、113、116、120、123、124、128、130、134、136、137、163和165，其中，突变包括插入、删除和天然氨基酸残基的替代；其中该变体进一步包含不同于母体多肽氨基酸序列的氨基酸序列，以至于该变体包含一个或多个未在母体多肽中发现的糖基化位点。
在一些实施方案中，与未修饰的(母体)细胞因子相比，任何上述的超糖基化、抗蛋白酶的IFN-β1变体具有增强的稳定性，如上所述，所述稳定性通过与一些物质一起孵育之后测定残留的生物活性来评估，这些物质为蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物、或血清。在其他实施方案中，如上所述与蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物、或血清一起孵育之后，与未修饰的(母体)细胞因子相比，任一上述的超糖基化、抗蛋白酶的IFN-β1变体具有增强的生物活性。
在其他实施方案中，超糖基化、抗蛋白酶的干扰素变体为修饰的IFN-β2a细胞因子，包含一个或多个氨基酸替代，该替代位于SEQ IDNO：198(如图23所示)中的一个或多个靶位置，对应于上述INF-α2b多肽变体三维结构中结构上相关的经修饰的氨基酸位置，其中与未修饰的IFN-β2a相比，该替代使得对蛋白酶有更强抗性，如通过与蛋白酶或血液溶解物一起孵育、或与血清一起孵育所评估的(如上所述)。在一些这样的实施方案中，修饰的IFN-β2a选自包含一个或多个单氨基酸替代的蛋白，该替代位于SEQ ID NO：198(如图23所述)中的一个或多个靶位置，对应于如下任何氨基酸位置：39、42、45、47、52、67、71、73、81、107、108、109、110、111、113、116、120、123、124、128、130、134、136、137、163和165，其中，突变包括插入、删除和天然氨基酸残基的替代；其中该变体进一步包含不同于母体多肽氨基酸序列的氨基酸序列，以至于该变体包含一个或多个未在母体多肽中发现的糖基化位点。
在一些实施方案中，与未修饰的(母体)细胞因子相比，任何上述的超糖基化、抗蛋白酶的IFN-β2a变体具有增强的稳定性，如上所述，所述稳定性通过与一些物质一起孵育之后测定残留的生物活性来评估，这些物质为蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物、或血清。在其他实施方案中，如上所述与蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物、或血清一起孵育之后，与未修饰的(母体)细胞因子相比，任何上述的超糖基化、抗蛋白酶的IFN-β2a变体具有增强的生物活性。
另一方面，本发明提供了任何上述抗蛋白酶的IFN-β变体的细胞因子结构同源物，其中该同源物包含一个或多个在特定位置的氨基酸替代，该特定位置对应于修饰的IFN-β的三维结构中三维结构上类似的经修饰的位置。在很多实施方案中，与未修饰的细胞因子对应物相比，该同源物增强了对蛋白酶的抗性，其中对蛋白酶的抗性通过与体外蛋白酶混合、与血液孵育或与血清孵育来测量。在很多实施方案中，该细胞因子为IFN-β细胞因子。
另一方面，本发明提供了修饰的IFN-β细胞因子(如超糖基化、抗蛋白酶的IFN-β变体)，包含一个或多个氨基酸替代，该替代位于SEQID NO：196(如图3所示的氨基酸序列)中的一个或多个靶位置，对应于任何上述INF-β修饰的细胞因子三维结构中结构上相关的经修饰的氨基酸位置，其中与未修饰的IFN-β相比，该替代使得对蛋白酶有更强抗性，如通过与蛋白酶或血液溶解物一起孵育、或与血清一起孵育所评估的。
在一些实施方案中，与未修饰的(母体)细胞因子相比，任何上述的超糖基化、抗蛋白酶的IFN-β变体具有增强的稳定性，如上所述，所述稳定性通过在与一些物质一起孵育之后测定在适合的细胞中抑制病毒复制或刺激细胞增殖的残留生物活性，这些物质为蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物或血清。
在一些实施方案中，与未修饰的(母体)细胞因子相比，任何上述的超糖基化、抗蛋白酶的IFN-β变体具有增强的生物活性，其中所述活性的评估通过如下方法进行：如上所述在与蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物或血清一起孵育之后，测定在适合的细胞中抑制病毒复制或在适合的细胞中抑制细胞增殖的能力。
在一些实施方案中，超糖基化、抗蛋白酶的IFN-β变体(“修饰的IFN-β细胞因子”)选自包含SEQ ID NO：196(如图3所示)中的一个或多个单氨基酸替代的蛋白，对应的替代为：在第1位M被V替代，在第1位M被I替代，在第1位M被T替代，在第1位M被Q替代，在第1位M被A替代，在第5位L被V替代，在第5位L被I替代，在第5位L被T替代，在第5位L被Q替代，在第5位L被H替代，在第5位L被A替代，在第8位F被I替代，在第8位F被V替代，在第9位L被V替代，在第9位L被I替代，在第9位L被T替代，在第9位L被Q替代，在第9位L被H替代，在第9位L被A替代，在第11位R被H替代，在第11位R被Q替代，在第15位F被I替代，在第15位F被V替代，在第19位K被Q替代，在第19位K被T替代，在第19位K被S替代，在第19位K被H替代，在第22位W被S替代，在第22位W被H替代，在第25位N被H替代，在第25位N被S替代，在第25位N被Q替代，在第27位R被H替代，在第27位R被Q替代，在第28位L被V替代，在第28位L被I替代，在第28位L被T替代，在第28位L被Q替代，在第28位L被H替代，在第28位L被A替代，在第29位E被Q替代，在第29位E被H替代，在第30位Y被H替代，在第30位Y被I替代，在第32位L被V替代，在第32位L被I替代，在第32位L被T替代，在第32位L被Q替代，在第32位L被H替代，在第32位L被A替代，在第33位K被Q替代，在第33位K被T替代，在第33位K被S替代，在第33位K被H替代，在第35位R被H替代，在第35位R被Q替代，在第36位M被V替代，在第36位M被I替代，在第36位M被T替代，在第36位M被Q替代，在第36位M被A替代，在第39位D被Q替代，在第39位D被H替代，在第39位D被G替代，在第42位E被Q替代，在第42位E被H替代，在第45位K被Q替代，在第45位K被T替代，在第45位K被S替代，在第45位K被H替代，在第47位L被V替代，在第47位L被I替代，在第47位L被T替代，在第47位L被Q替代，在第47位L被H替代，在第47位L被A替代，在第52位K被Q替代，在第52位K被T替代，在第52位K被S替代，在第52位K被H替代，在第67位F被I替代，在第67位F被V替代，在第71位R被H替代，在第71位R被Q替代，在第73位D被Q替代，在第73位D被H替代，在第73位D被G替代，在第81位E被Q替代，在第81位E被H替代，在第85位E被Q替代，在第85位E被H替代，在第92位Y被H替代，在第92位Y被I替代，在第99位K被Q替代，在第99位K被T替代，在第99位K被S替代，在第99位K被H替代，在第103位E被Q替代，在第103位E被H替代，在第104位E被Q替代，在第104位E被H替代，在第105位K被Q替代，在第105位K被T替代，在第105位K被S替代，在第105位K被H替代，在第107位E被Q替代，在第107位E被H替代，在第108位K被Q替代，在第108位K被T替代，在第108位K被S替代，在第108位K被H替代，在第109位E被Q替代，在第109位E被H替代，在第110位D被Q替代，在第110位D被H替代，在第110位D被G替代，在第111位F被I替代，在第111位F被V替代，在第113位R被H替代，在第113位R被Q替代，在第116位L被V替代，在第116位L被I替代，在第116位L被T替代，在第116位L被Q替代，在第116位L被H替代，在第116位L被A替代，在第120位L被V替代，在第120位L被I替代，在第120位L被T替代，在第120位L被Q替代，在第120位L被H替代，在第120位L被A替代，在第123位K被Q替代，在第123位K被T替代，在第123位K被S替代，在第123位K被H替代，在第124位R被H替代，在第124位R被Q替代，在第128位R被H替代，在第128位R被Q替代，在第130位L被V替代，在第130位L被I替代，在第130位L被T替代，在第130位L被Q替代，在第130位L被H替代，在第130位L被A替代，在第134位K被Q替代，在第134位K被T替代，在第134位K被S替代，在第134位K被H替代，在第136位K被Q替代，在第136位K被T替代，在第136位K被S替代，在第136位K被H替代，在第137位E被Q替代，在第137位E被H替代，在第138位Y被H替代，在第138位Y被I替代，在第152位R被H替代，在第152位R被Q替代，在第155位Y被H替代，在第155位Y被I替代，在第159位R被H替代，在第159位R被Q替代，在第163位Y被H替代，在第163位Y被I替代，在第165位R被H替代，在第165位R被Q替代，在第1位M被D替代，在第1位M被E替代，在第1位M被K替代，在第1位M被N替代，在第1位M被R替代，在第1位M被S替代，在第5位L被D替代，在第5位L被E替代，在第5位L被K替代，在第5位L被N替代，在第5位L被R替代，在第5位L被S替代，在第6位L被D替代，在第6位L被E替代，在第6位L被K替代，在第6位L被N替代，在第6位L被R替代，在第6位L被S替代，在第6位L被Q替代，在第6位L被T替代，在第8位F被E替代，在第8位F被K替代，在第8位F被R替代，在第8位F被D替代，在第9位L被D替代，在第9位L被E替代，在第9位L被K替代，在第9位L被N替代，在第9位L被R替代，在第9位L被S替代，在第10位Q被D替代，在第10位Q被E替代，在第10位Q被K替代，在第10位Q被N替代，在第10位Q被R替代，在第10位Q被S替代，在第10位Q被T替代，在第12位S被D替代，在第12位S被E替代，在第12位S被K替代，在第12位S被R替代，在第13位S被D替代，在第13位S被E替代，在第13位S被K替代，在第13位S被R替代，在第13位S被N替代，在第13位S被Q替代，在第13位S被T替代，在第14位N被D替代，在第14位N被E替代，在第14位N被K替代，在第14位N被Q替代，在第14位N被R替代，在第14位N被S替代，在第14位N被T替代，在第15位F被D替代，在第15位F被E替代，在第15位F被K替代，在第15位F被R替代，在第16位Q被D替代，在第16位Q被E替代，在第16位Q被K替代，在第16位Q被N替代，在第16位Q被R替代，在第16位Q被S替代，在第16位Q被T替代，在第17位C被D替代，在第17位C被E替代，在第17位C被K替代，在第17位C被N替代，在第17位C被Q替代，在第17位C被R替代，在第17位C被S替代，在第17位C被T替代，在第20位L被N替代，在第20位L被Q替代，在第20位L被R替代，在第20位L被S替代，在第20位L被T替代，在第20位L被D替代，在第20位L被E替代，在第20位L被K替代，在第22位W被D替代，在第22位W被E替代，在第22位W被K替代，在第22位W被R替代，在第23位Q被D替代，在第23位Q被E替代，在第23位Q被K替代，在第23位Q被R替代，在第24位L被D替代，在第24位L被E替代，在第24位L被K替代，在第24位L被R替代，在第79位W被D替代，在第79位W被E替代，在第79位W被K替代，在第79位W被R替代，在第80位N被D替代，在第80位N被E替代，在第80位N被K替代，在第80位N被R替代，在第82位T被D替代，在第82位T被E替代，在第82位T被K替代，在第82位T被R替代，在第83位I被D替代，在第83位I被E替代，在第83位I被K替代，在第83位I被R替代，在第83位I被N替代，在第83位I被Q替代，在第83位I被S替代，在第83位I被T替代，在第86位N被D替代，在第86位N被E替代，在第86位N被K替代，在第86位N被R替代，在第86位N被Q替代，在第86位N被S替代，在第86位N被T替代，在第87位L被D替代，在第87位L被E替代，在第87位L被K替代，在第87位L被R替代，在第87位L被N替代，在第87位L被Q替代，在第87位L被S替代，在第87位L被T替代，在第89位A被D替代，在第89位A被E替代，在第89位A被K替代，在第89位A被R替代，在第90位N被D替代，在第90位N被E替代，在第90位N被K替代，在第90位N被Q替代，在第90位N被R替代，在第90位N被S替代，在第90位N被T替代，在第91位V被D替代，在第91位V被E替代，在第91位V被K替代，在第91位V被N替代，在第91位V被Q替代，在第91位V被R替代，在第91位V被S替代，在第91位V被T替代，在第94位Q被D替代，在第94位Q被E替代，在第94位Q被K替代，在第94位Q被N替代，在第94位Q被R替代，在第94位Q被S替代，在第94位Q被T替代，在第95位I被D替代，在第95位I被E替代，在第95位I被K替代，在第95位I被N替代，在第95位I被Q替代，在第95位I被R替代，在第95位I被S替代，在第95位I被T替代，在第97位H被D替代，在第97位H被E替代，在第97位H被K替代，在第97位H被N替代，在第97位H被Q替代，在第97位H被R替代，在第97位H被S替代，在第97位H被T替代，在第98位L被D替代，在第98位L被E替代，在第98位L被K替代，在第98位L被N替代，在第98位L被Q替代，在第98位L被R替代，在第98位L被S替代，在第98位L被T替代，在第101位V被D替代，在第101位V被E替代，在第101位V被K替代，在第101位V被N替代，在第101位V被Q替代，在第101位V被R替代，在第101位V被S替代，在第101位V被T替代，在第1位M被C替代，在第6位L被C替代，在第10位Q被C替代，在第13位S被C替代，在第16位Q被C替代，在第17位L被C替代，在第101位V被C替代，在第98位L被C替代，在第97位H被C替代，在第94位Q被C替代，在第91位V被C替代，或在第90位N被C替代，或这些替代的任何组合，其中，残基1对应于SEQ ID NO：196所示(如图3所示)的成熟IFN-β的残基1；其中该变体进一步包含不同于母体多肽氨基酸序列的氨基酸序列，以至于该变体包含一个或多个未在母体多肽中发现的糖基化位点。
在其他实施方案中，超糖基化、抗蛋白酶的IFN-β变体(“修饰的IFN-β细胞因子”)选自包含SEQ ID NO：196(如图3所示)中的一个或多个单氨基酸替代的蛋白，对应的替代为：在第39位D被Q替代，在第39位D被H替代，在第39位D被G替代，在第42位E被Q替代，在第42位E被H替代，在第45位K被Q替代，在第45位K被T替代，在第45位K被S替代，在第45位K被H替代，在第47位L被V替代，在第47位L被I替代，在第47位L被T替代，在第47位L被Q替代，在第47位L被H替代，在第47位L被A替代，在第52位K被Q替代，在第52位K被T替代，在第52位K被S替代，在第52位K被H替代，在第67位F被I替代，在第67位F被V替代，在第71位R被H替代，在第71位R被Q替代，在第73位D被H替代，在第73位D被G替代，在第73位D被Q替代，在第81位E被Q替代，在第81位E被H替代，在第107位E被Q替代，在第107位E被H替代，在第108位K被Q替代，在第108位K被T替代，在第108位K被S替代，在第108位K被H替代，在第109位E被Q替代，在第109位E被H替代，在第110位D被Q替代，在第110位D被H替代，在第110位D被G替代，在第111位F被I替代，在第111位F被V替代，在第113位R被H替代，在第113位R被Q替代，在第116位L被V替代，在第116位L被I替代，在第116位L被T替代，在第116位L被Q替代，在第116位L被H替代，在第116位L被A替代，在第120位L被V替代，在第120位L被I替代，在第120位L被T替代，在第120位L被Q替代，在第120位L被H替代，在第120位L被A替代，在第123位K被Q替代，在第123位K被T替代，在第123位K被S替代，在第123位K被H替代，在第124位R被H替代，在第124位R被Q替代，在第128位R被H替代，在第128位R被Q替代，在第130位L被V替代，在第130位L被I替代，在第130位L被T替代，在第130位L被Q替代，在第130位L被H替代，在第130位L被A替代，在第134位K被Q替代，在第134位K被T替代，在第134位K被S替代，在第134位K被H替代，在第136位K被Q替代，在第136位K被T替代，在第136位K被S替代，在第136位K被H替代，在第137位E被Q替代，在第137位E被H替代，在第163位Y被H替代，在第163位Y被I替代，在第165位R被H替代，或在第165位R被Q替代，或这些替代的任何组合，其中所列的第一个氨基酸在表明的位点被第二个氨基酸置换；其中该变体进一步包含不同于母体多肽氨基酸序列的氨基酸序列，以至于该变体包含一个或多个未在母体多肽中发现的糖基化位点。
在一些实施方案中，超糖基化、抗蛋白酶的IFN-β变体(“修饰的IFN-β细胞因子”)选自包含SEQ ID NQ：196(如图3所示)中的一个或多个单氨基酸替代的蛋白，对应的替代为：在第1位M被V替代，在第1位M被I替代，在第1位M被T替代，在第1位M被Q替代，在第1位M被A替代，在第5位L被V替代，在第5位L被I替代，在第5位L被T替代，在第5位L被Q替代，在第5位L被H替代，在第5位L被A替代，在第8位F被I替代，在第8位F被V替代，在第9位L被V替代，在第9位L被I替代，在第9位L被T替代，在第9位L被Q替代，在第9位L被H替代，在第9位L被A替代，在第11位R被H替代，在第11位R被Q替代，在第15位F被I替代，在第15位F被V替代，在第19位K被Q替代，在第19位K被T替代，在第19位K被S替代，在第19位K被H替代，在第22位W被S替代，在第22位W被H替代，在第25位N被H替代，在第25位N被S替代，在第25位N被Q替代，在第27位R被H替代，在第27位R被Q替代，在第28位L被V替代，在第28位L被I替代，在第28位L被T替代，在第28位L被Q替代，在第28位L被H替代，在第28位L被A替代，在第29位E被Q替代，在第29位E被H替代，在第30位Y被H替代，在第30位Y被I替代，在第32位L被V替代，在第32位L被I替代，在第32位L被T替代，在第32位L被Q替代，在第32位L被H替代，在第32位L被A替代，在第33位K被Q替代，在第33位K被T替代，在第33位K被S替代，在第33位K被H替代，在第35位R被H替代，在第35位R被Q替代，在第36位M被V替代，在第36位M被I替代，在第36位M被T替代，在第36位M被Q替代，在第36位M被A替代，在第39位D被Q替代，在第39位D被H替代，在第39位D被G替代，在第42位E被Q替代，在第42位E被H替代，在第45位K被Q替代，在第45位K被T替代，在第45位K被S替代，在第45位K被H替代，在第47位L被V替代，在第47位L被I替代，在第47位L被T替代，在第47位L被Q替代，在第47位L被H替代，在第47位L被A替代，在第52位K被Q替代，在第52位K被T替代，在第52位K被S替代，在第52位K被H替代，在第67位F被I替代，在第67位F被V替代，在第71位R被H替代，在第71位R被Q替代，在第73位D被Q替代，在第73位D被H替代，在第73位D被G替代，在第81位E被Q替代，在第81位E被H替代，在第85位E被Q替代，在第85位E被H替代，在第92位Y被H替代，在第92位Y被I替代，在第99位K被Q替代，在第99位K被T替代，在第99位K被S替代，在第99位K被H替代，在第103位E被Q替代，在第103位E被H替代，在第104位E被Q替代，在第104位E被H替代，在第105位K被Q替代，在第105位K被T替代，在第105位K被S替代，在第105位K被H替代，在第107位E被Q替代，在第107位E被H替代，在第108位K被Q替代，在第108位K被T替代，在第108位K被S替代，在第108位K被H替代，在第109位E被Q替代，在第109位E被H替代，在第110位D被Q替代，在第110位D被H替代，在第110位D被G替代，在第111位F被I替代，在第111位F被V替代，在第113位R被H替代，在第113位R被Q替代，在第116位L被V替代，在第116位L被I替代，在第116位L被T替代，在第116位L被Q替代，在第116位L被H替代，在第116位L被A替代，在第120位L被V替代，在第120位L被I替代，在第120位L被T替代，在第120位L被Q替代，在第120位L被H替代，在第120位L被A替代，在第123位K被Q替代，在第123位K被T替代，在第123位K被S替代，在第123位K被H替代，在第124位R被H替代，在第124位R被Q替代，在第128位R被H替代，在第128位R被Q替代，在第130位L被V替代，在第130位L被I替代，在第130位L被T替代，在第130位L被Q替代，在第130位L被H替代，在第130位L被A替代，在第134位K被Q替代，在第134位K被T替代，在第134位K被S替代，在第134位K被H替代，在第136位K被Q替代，在第136位K被T替代，在第136位K被S替代，在第136位K被H替代，在第137位E被Q替代，在第137位E被H替代，在第138位Y被H替代，在第138位Y被I替代，在第152位R被H替代，在第152位R被Q替代，在第155位Y被H替代，在第155位Y被I替代，在第159位R被H替代，在第159位R被Q替代，在第163位Y被H替代，在第163位Y被I替代，在第165位R被H替代，在第165位R被Q替代，在第1位M被D替代，在第1位M被E替代，在第1位M被K替代，在第1位M被N替代，在第1位M被R替代，在第1位M被S替代，在第5位L被D替代，在第5位L被E替代，在第5位L被K替代，在第5位L被N替代，在第5位L被R替代，在第5位L被S替代，在第6位L被D替代，在第6位L被E替代，在第6位L被K替代，在第6位L被N替代，在第6位L被R替代，在第6位L被S替代，在第6位L被Q替代，在第6位L被T替代，在第8位F被E替代，在第8位F被K替代，在第8位F被R替代，在第8位F被D替代，在第9位L被D替代，在第9位L被E替代，在第9位L被K替代，在第9位L被N替代，在第9位L被R替代，在第9位L被S替代，在第10位Q被D替代，在第10位Q被E替代，在第10位Q被K替代，在第10位Q被N替代，在第10位Q被R替代，在第10位Q被S替代，在第10位Q被T替代，在第12位S被D替代，在第12位S被E替代，在第12位S被K替代，在第12位S被R替代，在第13位S被D替代，在第13位S被E替代，在第13位S被K替代，在第13位S被R替代，在第13位S被N替代，在第13位S被Q替代，在第13位S被T替代，在第14位N被D替代，在第14位N被E替代，在第14位N被K替代，在第14位N被Q替代，在第14位N被R替代，在第14位N被S替代，在第14位N被T替代，在第15位F被D替代，在第15位F被E替代，在第15位F被K替代，在第15位F被R替代，在第16位Q被D替代，在第16位Q被E替代，在第16位Q被K替代，在第16位Q被N替代，在第16位Q被R替代，在第16位Q被S替代，在第16位Q被T替代，在第17位C被D替代，在第17位C被E替代，在第17位C被K替代，在第17位C被N替代，在第17位C被Q替代，在第17位C被R替代，在第17位C被S替代，在第17位C被T替代，在第20位L被N替代，在第20位L被Q替代，在第20位L被R替代，在第20位L被S替代，在第20位L被T替代，在第20位L被D替代，在第20位L被E替代，在第20位L被K替代，在第22位W被D替代，在第22位W被E替代，在第22位W被K替代，在第22位W被R替代，在第23位Q被D替代，在第23位Q被E替代，在第23位Q被K替代，在第23位Q被R替代，在第24位L被D替代，在第24位L被E替代，在第24位L被K替代，在第24位L被R替代，在第79位W被D替代，在第79位W被E替代，在第79位W被K替代，在第79位W被R替代，在第80位N被D替代，在第80位N被E替代，在第80位N被K替代，在第80位N被R替代，在第82位T被D替代，在第82位T被E替代，在第82位T被K替代，在第82位T被R替代，在第83位I被D替代，在第83位I被E替代，在第83位I被K替代，在第83位I被R替代，在第83位I被N替代，在第83位I被Q替代，在第83位I被S替代，在第83位I被T替代，在第86位N被D替代，在第86位N被E替代，在第86位N被K替代，在第86位N被R替代，在第86位N被Q替代，在第86位N被S替代，在第86位N被T替代，在第87位L被D替代，在第87位L被E替代，在第87位L被K替代，在第87位L被R替代，在第87位L被N替代，在第87位L被Q替代，在第87位L被S替代，在第87位L被T替代，在第89位A被D替代，在第89位A被E替代，在第89位A被K替代，在第89位A被R替代，在第90位N被D替代，在第90位N被E替代，在第90位N被K替代，在第90位N被Q替代，在第90位N被R替代，在第90位N被S替代，在第90位N被T替代，在第91位V被D替代，在第91位V被E替代，在第91位V被K替代，在第91位V被N替代，在第91位V被Q替代，在第91位V被R替代，在第91位V被S替代，在第91位V被T替代，在第94位Q被D替代，在第94位Q被E替代，在第94位Q被K替代，在第94位Q被N替代，在第94位Q被R替代，在第94位Q被S替代，在第94位Q被T替代，在第95位I被D替代，在第95位I被E替代，在第95位I被K替代，在第95位I被N替代，在第95位I被Q替代，在第95位I被R替代，在第95位I被S替代，在第95位I被T替代，在第97位H被D替代，在第97位H被E替代，在第97位H被K替代，在第97位H被N替代，在第97位H被Q替代，在第97位H被R替代，在第97位H被S替代，在第97位H被T替代，在第98位L被D替代，在第98位L被E替代，在第98位L被K替代，在第98位L被N替代，在第98位L被Q替代，在第98位L被R替代，在第98位L被S替代，在第98位L被T替代，在第101位V被D替代，在第101位V被E替代，在第101位V被K替代，在第101位V被N替代，在第101位V被Q替代，在第101位V被R替代，在第101位V被S替代，在第101位V被T替代，在第1位M被C替代，在第6位L被C替代，在第10位Q被C替代，在第13位S被C替代，在第16位Q被C替代，在第17位L被C替代，在第101位V被C替代，在第98位L被C替代，在第97位H被C替代，在第94位Q被C替代，在第91位V被C替代，或在第90位N被C替代，在第39位D被Q替代，在第39位D被H替代，在第39位D被G替代，在第42位E被Q替代，在第42位E被H替代，在第45位K被Q替代，在第45位K被T替代，在第45位K被S替代，在第45位K被H替代，在第47位L被V替代，在第47位L被I替代，在第47位L被T替代，在第47位L被Q替代，在第47位L被H替代，在第47位L被A替代，在第52位K被Q替代，在第52位K被T替代，在第52位K被S替代，在第52位K被H替代，在第67位F被I替代，在第67位F被V替代，在第71位R被H替代，在第71位R被Q替代，在第73位D被H替代，在第73位D被G替代，在第73位D被Q替代，在第81位E被Q替代，在第81位E被H替代，在第107位E被Q替代，在第107位E被H替代，在第108位K被Q替代，在第108位K被T替代，在第108位K被S替代，在第108位K被H替代，在第109位E被Q替代，在第109位E被H替代，在第110位D被Q替代，在第110位D被H替代，在第110位D被G替代，在第111位F被I替代，在第111位F被V替代，在第113位R被H替代，在第113位R被Q替代，在第116位L被V替代，在第116位L被I替代，在第116位L被T替代，在第116位L被Q替代，在第116位L被H替代，在第116位L被A替代，在第120位L被V替代，在第120位L被I替代，在第120位L被T替代，在第120位L被Q替代，在第120位L被H替代，在第120位L被A替代，在第123位K被Q替代，在第123位K被T替代，在第123位K被S替代，在第123位K被H替代，在第124位R被H替代，在第124位R被Q替代，在第128位R被H替代，在第128位R被Q替代，在第130位L被V替代，在第130位L被I替代，在第130位L被T替代，在第130位L被Q替代，在第130位L被H替代，在第130位L被A替代，在第134位K被0替代，在第134位K被T替代，在第134位K被S替代，在第134位K被H替代，在第136位K被Q替代，在第136位K被T替代，在第136位K被S替代，在第136位K被H替代，在第137位E被Q替代，在第137位E被H替代，在第163位Y被H替代，在第163位Y被I替代，在第165位R被H替代，或在第165位R被0替代，或这些替代的任何组合，其中所列的第一个氨基酸在表明的位置被第二个氨基酸置换；其中该变体进一步包含不同于母体多肽氨基酸序列的氨基酸序列，以至于该变体包含一个或多个未在母体多肽中发现的糖基化位点。
在特定的实施方案中，超糖基化、抗蛋白酶的IFN-β变体(“修饰的IFN-β细胞因子”)选自修饰的IFN-β，该修饰的IFN-β包含任意SEQID No.234-289和989-1302中描述的氨基酸序列；其中，该变体进一步包含不同于母体多肽氨基酸序列的氨基酸序列，以至于该变体包含一个或多个未在母体多肽中发现的糖基化位点。
在特定的实施方案中，超糖基化、抗蛋白酶的IFN-β变体(“修饰的IFN-β细胞因子”)包含表2(IFN-β)所示的一个或多个氨基酸替代；其中，该变体进一步包含不同于母体多肽氨基酸序列的氨基酸序列，以至于该变体包含一个或多个未在母体多肽中发现的糖基化位点。
表2(IFN-β)
1. D39Q 16. D73Q 31. F111I 46. L130I
2. D39N 17. D73N 32. F111V 47. K134Q
3. E42Q 18. E81Q 33. R113H 48. K134N
4. E42N 19. E81N 34. R113Q 49. K136Q
5. E42H 20. E81H 35. L116V 50. K136N
6. K45Q 21. E107Q 36. L116I 51. E137Q
7. K45N 22. E107N 37. L120V 52. E137N
8. L47V 23. E107H 38. L120I 53. E137H
9. L47I 24. K108Q 39. K123Q 54. Y163H
10. K52Q 25. K108N 40. K123N 55. Y163I
11. K52N 26. E109Q 41. R124H 56. R165H
12. F67I 27. E109N 42. R124Q 57. R165Q
13. F67V 28. E109H 43. R128H
14. R71H 29. D110Q 44. R128Q
15. R71Q 30. D110N 45. L130V
在一些实施方案中，任何上述的抗蛋白酶的或抗蛋白酶的、超糖基化的IFN-β变体为IFN-β1a的变体，并且所述变体为[S99N]IFN-β1a糖肽，其中该[S99N]IFN-β1a糖肽为IFN-β1a的变体，其具有(a)天冬酰胺残基置换IFN-β1a氨基酸序列中99位氨基酸天然丝氨酸残基(其中S99氨基酸位置显示在图24中；对应于图3所示的IFN-β氨基酸序列的S74)；和(b)与所述天冬酰胺残基的R基团共价连接的糖部分。
在一些实施方案中，任何上述的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的IFN-β变体为IFN-β1a变体，并且该变体为[S99N，E134N]IFN-β1a糖肽，其中该[S99N，E134N]IFN-β1a糖肽为IFN-β1a的变体，其具有(a)天冬酰胺残基分别置换IFN-β1a氨基酸序列中99和134位氨基酸天然丝氨酸和谷氨酸残基的每一个(其中S99和E134氨基酸位置显示在图24中；分别对应于图3所示的IFN-β氨基酸序列的S74和E109)；和(b)与每一所述天冬酰胺残基的R基团共价连接的糖部分。
在一些实施方案中，任何上述的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的IFN-β变体为IFN-β1a的变体，并且所述变体为[S99N，E134N，F136T]IFN-β1a糖肽，其中该[S99N，E134N，F136T]IFN-β1a糖肽为IFN-β1a的变体，其具有(a)天冬酰胺、天冬酰胺和苏氨酸残基分别置换IFN-β1a氨基酸序列中99、134和136位氨基酸天然丝氨酸、谷氨酸和苯丙氨酸残基(其中S99、E134和E136氨基酸位置显示在图24中；分别对应于图3所示的IFN-β氨基酸序列的S74、E109和F111)；和(b)与所述天冬酰胺残基的R基团共价连接的糖部分。
在一些实施方案中，任何上述的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的IFN-β变体为IFN-β1a的变体，并且所述变体为[E134N]IFN-β1a糖肽，其中该[E134N]IFN-β1a糖肽为IFN-β1a的变体，其具有(a)天冬酰胺残基置换IFN-β1a氨基酸序列中134位氨基酸天然谷氨酸残基(其中氨基酸位置显示在图24中)；和(b)与所述天冬酰胺残基的R基团共价连接的糖部分。
在一些实施方案中，任何上述的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的IFN-β变体为IFN-β1a的变体，并且所述变体为[E134N，F136T]IFN-β1a糖肽，其中该[E134N，F136T]IFN-β1a糖肽为IFN-β1a的变体，其具有(a)天冬酰胺和苏氨酸残基分别置换IFN-β1a氨基酸序列中134和136位氨基酸天然谷氨酸和苯丙氨酸残基(其中氨基酸位置显示在图24中)；和(b)与所述天冬酰胺残基的R基团共价连接的糖部分。
在一些实施方案中，任何上述的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的IFN-β变体为IFN-β1a的变体，并且所述变体为[E134T] IFN-β1a糖肽，其中该[E134T]IFN-β1a糖肽为IFN-β1a的变体，其具有(a)苏氨酸残基置换IFN-β1a氨基酸序列中134位氨基酸天然谷氨酸残基(其中氨基酸位置显示在图24中)；和(b)与所述天冬酰胺残基的R基团共价连接的糖部分。
在一些实施方案中，任何上述的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的IFN-β变体为IFN-β1a的变体，所述变体为[S99N，E134T]IFN-β1a糖肽，其中[S99N，E134T]IFN-β1a糖肽为IFN-β1a的变体，其具有(a)天冬酰胺和苏氨酸残基分别置换IFN-β1a氨基酸序列中99和134位氨基酸天然丝氨酸和谷氨酸残基(其中氨基酸位置显示在图24中)；(b)与每一所述天冬酰胺和苏氨酸残基的R基团共价连接的糖部分。
在一些实施方案中，任和上述的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的IFN-β变体为IFN-β1b的，并且所述变体为[S99N]IFN-β1b糖肽，其中该[S99N]IFN-β1b糖肽为IFN-β1b的变体，其具有(a)天冬酰胺残基置换IFN-β1b氨基酸序列中99位氨基酸天然丝氨酸残基(其中氨基酸位置显示在图24中)；和(b)与所述天冬酰胺残基的R基团共价连接的糖部分。
在一些实施方案中，任何上述的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的IFN-β变体为IFN-β1b的变体，并且所述变体为[S99N，E134N]IFN-β1b糖肽，其中该[S99N，E134N]IFN-β1b糖肽为IFN-β1b的变体，其具有(a)天冬酰胺残基分别置换IFN-β1b氨基酸序列中99和134位氨基酸天然丝氨酸和谷氨酸残基(其中氨基酸位置显示在图24中)；和(b)与每一所述天冬酰胺残基的R基团共价连接的糖部分。
在一些实施方案中，任何上述的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的IFN-β变体为IFN-β1b的变体，并且所述变体为[S99N，E134N，F136T]IFN-β1b糖肽，其中该[S99N，E134N，F136T]IFN-β1b糖肽为IFN-β1b的变体，其具有(a)天冬酰胺、天冬酰胺和苏氨酸残基分别置换IFN-β1b氨基酸序列中99、134和136位氨基酸天然丝氨酸、谷氨酸和苯丙氨酸残基(其中氨基酸位置显示在图24中)；和(b)与每一所述天冬酰胺残基的R基团共价连接的糖部分。
在一些实施方案中，任何上述的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的IFN-β变体为IFN-β1b的变体，并且所述变体为[E134N]IFN-β1b糖肽，其中该[E134N]IFN-β1b糖肽为IFN-β1b的变体，其具有(a)天冬酰胺残基置换IFN-β1b氨基酸序列中134位氨基酸天然谷氨酸残基(其中氨基酸位置显示在图24中)；和(b)与所述天冬酰胺残基的R基团共价连接的糖部分。
在一些实施方案中，任何上述的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的IFN-β变体为IFN-β1b的变体，并且所述变体为[E134N，F136T]IFN-β1b糖肽，其中该[E134N，F136T]IFN-β1b糖肽为IFN-β1b的变体，其具有(a)天冬酰胺和苏氨酸残基分别置换IFN-β1b氨基酸序列中134和136位氨基酸天然谷氨酸和苯丙氨酸残基(其中氨基酸位置显示在图24中)；和(b)与所述天冬酰胺残基的R基团共价连接的糖部分。
在一些实施方案中，任何上述的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的IFN-β变体为IFN-β1b的变体，并且所述变体为[E134T]IFN-β1b糖肽，其中该[E134T]IFN-β1b糖肽为IFN-β1b的变体，其具有(a)苏氨酸残基置换IFN-β1b氨基酸序列中134位氨基酸天然谷氨酸残基(其中氨基酸位置显示在图24中)；和(b)与所述苏氨酸残基的R基团共价连接的糖部分。
在一些实施方案中，任何上述的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的IFN-β变体为IFN-β1b的变体，并且所述变体为[S99N，E134T]IFN-β1b糖肽，其中该[S99N，E134T]IFN-β1b糖肽为IFN-β1b的变体，其具有(a)天冬酰胺和苏氨酸残基置换IFN-β1b氨基酸序列中99和134位氨基酸天然丝氨酸和谷氨酸残基(其中氨基酸位置显示在图24中)；和(b)与每一所述天冬酰胺和苏氨酸残基的R基团共价连接的糖部分。
IFN-γ多肽变体
在其他实施方案中，超糖基化、抗蛋白酶的干扰素变体为修饰的IFN-γ细胞因子，包含一个或多个氨基酸替代，该替代位于SEQ IDNO：199(如图4所示)中的一个或多个靶位置，对应于上述INF-α2b多肽变体三维结构中结构上相关的经修饰的氨基酸位置，其中与未修饰的IFN-γ相比，该替代使得对蛋白酶有更强抗性，如通过与蛋白酶或血液溶解物一起孵育、或与血清一起孵育所评估的(如上所述)。在一些这样的实施方案中，修饰的IFN-γ选自包含一个或多个单氨基酸替代的蛋白，该替代位于SEQ ID NO：199(如图4所示)中的一个或多个靶位置，对应于如下任何氨基酸位置：33、37、40、41、42、58、61、64、65和66，其中，突变包括插入、删除和天然氨基酸残基的替代。在特定的实施方案中，替代选自SEQ ID NO：199中的氨基酸置换，如下表3所示，其中所列的第一个氨基酸在表明的位置被第二个氨基酸置换；其中该变体进一步包含不同于母体多肽氨基酸序列的氨基酸序列，以至于该变体包含一个或多个未在母体多肽中发现的糖基化位点。
表3
1. L33V 12. E42H
2. L33I 13. K58Q
3. K37Q 14. K58N
4. K37N 15. K61Q
5. K40Q 16. K61N
6. K40N 17. K64Q
7. E41Q 18. K64N
8. E41N 19. D65Q
9. E41H 20. D65N
10. E42Q 21. D66Q
11. E42N
在其他实施方案中，修饰的IFN-γ包含对应于任意SEQ IDNO：290-311的氨基酸序列，并进一步包含未在母体多肽中发现的一个或多个糖基化位点。
在一些实施方案中，任何上述的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的IFN-γ变体为[S99T]IFN-γ糖肽，其中[S99T]IFN-γ糖肽为成熟的、天然的IFN-γ变体，其具有(a)苏氨酸残基置换图31描述的IFN-γ氨基酸序列中99位氨基酸天然丝氨酸残基(对应于图4所示的IFN-γ氨基酸序列中的S102)；和(b)与(a)中氨基酸序列的97位氨基酸天冬酰胺残基的R基团共价连接的糖部分；并且包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替了母体IFN-γ多肽中发现的天然蛋白酶切割位点。
由于[S99T]IFN-γ变体中N97、Y98、T99形成的糖基化位点不同于天然IFN-γ中N97、Y98、S99形成的糖基化位点，N97、Y98、T99糖基化位点就有资格作为未在母体多肽中发现的非天然糖基化位点。另外，如WO 02/081507中描述的，与在天然IFN-γ中N97、Y98、S99糖基化位点的糖基化效率相比，天然IFN-γ氨基酸序列中S99T置换提供了在[S99T]IFN-γ变体中N97、Y98、T99糖基化位点的更为有效地糖基化。因此[S99T]IFN-γ就有资格成为母体IFN-γ多肽的超糖基化多肽变体(其中图31所示的IFN-γ氨基酸序列中的N97、Y98、S99氨基酸位置对应于图4所示的IFN-γ氨基酸序列中的N100、Y101和S102)。
在一些实施方案中，任何上述的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的IFN-γ变体为[E38N]IFN-γ糖肽，其中该[E38N]IFN-γ糖肽为成熟的、天然的IFN-γ变体，其具有(a)天冬酰胺残基置换图31描述的IFN-γ氨基酸序列中38位氨基酸天然谷氨酸残基(其中图31所示的IFN-γ氨基酸序列中的氨基酸E38对应于图4所示的IFN-γ氨基酸序列中的E41)；和(b)与(a)的氨基酸序列中38氨基酸天冬酰胺残基的R基团共价连接的糖部分；并且包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替了母体IFN-γ多肽中发现的天然蛋白酶切割位点。
在一些实施方案中，任何上述的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的IFN-γ变体为[E38N，S99T]IFN-γ糖肽，其中该[E38N，S99T]IFN-γ糖肽为成熟的、天然的IFN-γ变体，其具有(a)天冬酰胺和苏氨酸残基分别置换图31描述的IFN-γ氨基酸序列中38和99位氨基酸天然谷氨酸和丝氨酸残基(其中图31所示的IFN-γ氨基酸序列中氨基酸E38和S99分别对应于图4所示的IFN-γ氨基酸序列中E41和S102)；和(b)与(a)的氨基酸序列中38和97位氨基酸天冬酰胺残基的R基团共价连接的糖部分；并且包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替了母体IFN-γ多肽中发现的天然蛋白酶切割位点。
在一些实施方案中，任何上述的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的IFN-γ变体为[E38N，S40T]IFN-γ糖肽，其中[E38N，S40T]IFN-γ糖肽为成熟的、天然的IFN-γ的变体，其具有(a)天冬酰胺和苏氨酸残基分别置换图31描述的IFN-γ氨基酸序列中38和40位氨基酸天然谷氨酸和丝氨酸残基(其中图31所示的IFN-γ氨基酸序列中氨基酸E38和S40分别对应于图4所示的IFN-γ氨基酸序列中E41和S43)；和(b)与(a)的氨基酸序列中38位氨基酸天冬酰胺残基的R基团共价连接的糖部分；并且包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替了母体IFN-γ多肽中发现的天然蛋白酶切割位点。
在一些实施方案中，任何上述的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的IFN-γ变体为[E38N，S40T，S99T]IFN-γ糖肽，其中该[E38N，S40T，S99T]IFN-γ糖肽为成熟的、天然的IFN-γ的变体，其具有(a)天冬酰胺、苏氨酸和苏氨酸残基分别置换图31描述的IFN-γ氨基酸序列中38、40和99位氨基酸天然谷氨酸、丝氨酸和丝氨酸残基(其中图31所示的IFN-γ氨基酸序列中氨基酸E38、S40和S99分别对应于图4所示的IFN-γ氨基酸序列中的E41、S43和S102)；和(b)与(a)的氨基酸序列中38氨基酸天冬酰胺残基的R基团共价连接的糖部分；任选地进一步具有(c)与(a)的氨基酸序列中97位氨基酸天冬酰胺残基的R基团共价连接的糖部分；并且包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替了母体IFN-γ多肽中发现的天然蛋白酶切割位点。
在一些实施方案中，与未修饰的(母体)细胞因子相比，任何上述的超糖基化、抗蛋白酶的IFN-β变体具有增强的稳定性，如上所述，所述稳定性通过与一些物质一起孵育之后测定残留的生物活性来评估，这些物质为蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物、或血清。在其他实施方案中，如上所述与蛋白酶混合物、单个蛋白酶、血液溶解物、或血清一起孵育之后，与未修饰的(母体)细胞因子相比，任何上述的超糖基化、抗蛋白酶的IFN-β变体具有增强的生物活性。
促红细胞生成素多肽变体
在其他实施方案中，超糖基化、抗蛋白酶的细胞因子变体为修饰的促红细胞生成素细胞因子，包含一个或多个氨基酸替代，该替代位于SEQ ID NO：201(如图7所示)中的一个或多个靶位置，对应于上述INF-α2b多肽变体三维结构中结构上相关的经修饰的氨基酸位置，其中与未修饰的促红细胞生成素相比，该替代使得对蛋白酶有更强抗性，如通过与蛋白酶或血液溶解物一起孵育、或与血清一起孵育所评估的(如上所述)。在一些这样的实施方案中，修饰的促红细胞生成素选自包含一个或多个单氨基酸替代的蛋白，该替代位于SEQ ID NO：201(如图7所示)中的一个或多个靶位置，对应于如下任何氨基酸位置：43、45、48、49、52、53、55、72、75、76、123、129、130、131、162和165，其中，突变包括插入、删除和天然氨基酸残基的替代。在特定的实施方案中，该替代选自SEQ ID NO：201中的氨基酸置换，其中所列的第一个氨基酸在表明的位点被第二个氨基酸取代，如下表4所示，其中该变体进一步包含不同于母体多肽氨基酸序列的氨基酸序列，以至于该变体包含一个或多个未在母体多肽中发现的糖基化位点。
表4
1. D43Q 14. E55N 27. L130V
2. D43N 15. E55H 28. L130I
3. K45Q 16. E72Q 29. R151H
4. K45N 17. E72N 30. R131Q
5. P48I 18. E72H 31 R162H
6. P48V 19 L75V 32. R162Q
7. Y49H 20. L75I 33. D165Q
8. Y49I 21. R76H 34. D165N
9. K52Q 22. R76Q 35. P121S
10. K52N 23. D123Q 36. P12IA
11. R53H 24. D123N 37. P122S
12. R53Q 25. P129S 38. P122A
13. E55Q 25. P129A
在其他实施方案中，修饰的促红细胞生成素包含对应于任何SEQID NO：940-977的氨基酸序列，并进一步包含未在母体多肽中发现的一个或多个糖基化位点。
GM-CSF多肽变体
在其他实施方案中，超糖基化、抗蛋白酶的细胞因子变体为修饰的GM-CSF细胞因子，包含一个或多个氨基酸替代，该替代位于SEQID NO：202(如图8所述)中的一个或多个靶位置，对应于上述促红细胞生成素多肽变体三维结构中结构上相关的经修饰的氨基酸位置，其中与未修饰的GM-CSF相比，该替代使得对蛋白酶有更强抗性，如通过与蛋白酶或血液溶解物一起孵育、或与血清一起孵育所评估的(如上所述)。在一些这样的实施方案中，修饰的GM-CSF选自包含一个或多个单氨基酸替代的蛋白，该替代位于SEQ ID NO：202(如图8所示)中的一个或多个靶位置，对应于如下任何氨基酸位置：38、41、45、46、48、49、51、60、63、67、92、93、119、120、123和124，其中，突变包括插入、删除和天然氨基酸残基的替代。在特定的实施方案中，该替代选自SEQ ID NO：202中的氨基酸置换，如下表5所示，其中所列的第一个氨基酸在表明的位置被第二个氨基酸置换；其中该变体进一步包含不同于母体多肽氨基酸序列的氨基酸序列，以至于该变体包含一个或多个位在母体多肽中发现的糖基化位点。
表5
1. E38Q 14. L49V 27. P92A
2. E38N 15. L49I 28. E93Q
3. E38H 16. W51Q 29. E93N
4. E41Q 17. E51N 30. E93H
5. E41N 18. E51H 31. F119I
6. E41H 19. E60Q 32. F119V
7. E45Q 20. E60N 33 D120Q
8. E45N 21. E60H 34. D1201N
9. E45H 22. K63Q 35. E123Q
10. M46V 23. K63N 36. E123N
11. M46I 24. R67H 37. E123H
12. D48Q 25. R67Q 38. P124S
13. D48N 26. P92S 39. P124A
在其他实施方案中，修饰的GM-CSF包含对应于任意SEQ IDNO：362-400的氨基酸序列，并进一步包含位在母体多肽中发现的一个或多个糖基化位点。
G-CSF多肽变体
在其他实施方案中，超糖基化、抗蛋白酶的细胞因子变体为修饰的G-CSF细胞因子，包含一个或多个氨基酸替代，该替代位于SEQ IDNO：210(如图5所述)中的一个或多个靶位置，对应于上述IFN-α2b多肽变体三维结构中结构上相关的经修饰的氨基酸位置，其中与未修饰的G-CSF相比，该替代使得对蛋白酶有更强抗性，如通过与蛋白酶或血液溶解物一起孵育、或与血清一起孵育所评估的(如上所述)。在一些这样的实施方案中，修饰的G-CSF选自包含一个或多个单氨基酸替代的蛋白，该替代位于SEQ ID NO：210(如图5所示)中的一个或多个靶位置，对应于如下任何氨基酸位置：61、63、68、72、86、96、100、101、131、133、135、147、169、172和177，其中，突变包括插入、删除和天然氨基酸残基的替代。在特定的实施方案中，替代选自SEQID NO：210中的氨基酸置换，如下表6所示，其中所列的第一个氨基酸在表明的位置被第二个氨基酸置换；其中该变体进一步包含不同于母体多肽氨基酸序列的氨基酸序列，以至于该变体包含一个或多个未在母体多肽中发现的糖基化位点。
表6
1. W61S 12. E96N 23. P135S
2. W61H 13. E96H 24. P135A
3. P63S 14. P100S 25. F147I
4. P63A 15. P100A 26. F147V
5. P68S 16. E101Q 27. R169H
6. P68A 17. E101N 28. R169Q
7. L72V 1S. E101H 29. R172H
8. L72I 19. P131S 30. R172Q
9. F86I 20. P131A 31. P177S
10. F86V 21. L133V 32. P177A
11. E96Q 22. L133I
在其他实施方案中，修饰的G-CSF包含对应于任何SEQ IDNO：631-662的氨基酸序列，并进一步包含未在母体多肽中发现的一个或多个糖基化位点。
人生长激素多肽变体
在其他实施方案中，超糖基化、抗蛋白酶的细胞因子变体为修饰的人生长激素(hGH)细胞因子，包含一个或多个氨基酸替代，该替代位于SEQ ID NO：216(如图6所示)中的一个或多个靶位置，对应于上述G-CSF多肽变体三维结构中结构上相关的经修饰的氨基酸位置，其中与未修饰的hGH相比，该替代使得对蛋白酶有更强抗性，如通过与蛋白酶或血液溶解物一起孵育、或与血清一起孵育所评估的(如上所述)。在一些这样的实施方案中，修饰的hGH选自包含一个或多个单氨基酸替代的蛋白，该替代位于SEQ ID NO：216(如图6所示)中的一个或多个靶位置，对应于如下任何氨基酸位置：56、59、64、65、66、88、92、94、101、129、130、133、134、140、143、145、146、147、183和186，其中，突变包括插入、删除和天然氨基酸残基的替代。在特定的实施方案中，替代选自SEQ ID NO：216中的氨基酸置换，如下表7所示，其中所列的第一个氨基酸在表明的位置被第二个氨基酸置换；其中该变体进一步包含不同于母体多肽氨基酸序列的氨基酸序列，以至于该变体包含一个或多个未在母体多肽中发现的糖基化位点。
表7
1. E56Q 17. F92I 33. K140N
2. E56N 18. F92V 34. Y143H
3. E56H 19. R94H 35. Y143I
4. P59S 20. R94Q 36. K145Q
5. P59A 21. L101V 37. K145N
6. R64H 22. L101I 38. F146I
7. E64Q 23. E129Q 39. F146V
8. E65Q 24. E129N 40. D147Q
9. E65N 25. E129H 41. D147N
10. E65H 26. D130Q 42. R183H
11. E66Q 27. D130N 43. R183Q
12. E66N 28. P133S 44. E186Q
13. E66H 29. P133A 45. E186N
14. E88Q 30. R134H 46. E186H
15. E88N 31. R134Q
16. E88H 32. K140Q
在其他实施方案中，修饰的hGH包含对应于任何SEQ IDNO：850-895的氨基酸序列，并进一步包含未在母体多肽中发现的一个或多个糖基化位点。
在其他实施方案中，超糖基化、抗蛋白酶的细胞因子变体为修饰的细胞因子，与未修饰的(母体)细胞因子相比，其表现为对蛋白水解增强了抗性，其中该修饰的细胞因子包含一个或多个氨基酸替代，该替代位于细胞因子的一个或多个靶位置，对应于上述IFN-β多肽变体三维结构中结构上相关的经修饰的氨基酸位置。与未修饰的(母体)细胞因子相比，这类氨基酸替代使得对蛋白酶增强了抗性。增强的对蛋白酶的抗性(与未修饰的hGH相比较)的评估基于与蛋白酶或血液溶解物一起孵育、或与血清一起孵育(如上所述)。
其它的修饰
典型地，抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体具有大体上类似于母体多肽氨基酸序列的氨基酸序列。例如超糖基化的、抗蛋白酶的多肽变体可具有这种氨基酸序列，其与母体多肽的氨基酸序列相比，至少有一个氨基酸不同，可能有至少两个但不多于约10个氨基酸不同。序列变化可以为置换、插入或删除。系统地引入丙氨酸或其他残基的扫描突变可用于确定关键氨基酸。感兴趣的特定氨基酸置换包括保守和非保守的变化。保守氨基酸置换通常包括以下组内的置换：(甘氨酸，丙氨酸)；(缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸)；(天冬氨酸，谷氨酸)；(天冬酰胺，谷氨酰胺)；(丝氨酸，苏氨酸)；(赖氨酸，精氨酸)；或(苯丙氨酸，酪氨酸)。
改变或不改变母体蛋白治疗剂一级氨基酸序列的感兴趣的其它修饰包括多肽的化学衍生作用，例如，乙酰化作用或羧化作用；氨基酸序列的改变以使蛋白易于被聚乙二醇化，等等。超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体可被修饰为具有一个或多个聚乙二醇部分(聚乙二醇化)。在一个实施方案中，本发明关注使用具有一个或多个非天然存在的聚乙二醇修饰物位点的多肽变体，该多肽变体被设计为提供具有减少的血清清除率的PEG衍生的多肽。还包含了具有被磷酸化的氨基酸残基(例如，磷酸化酪氨酸、磷酸化丝氨酸或磷酸化苏氨酸)的序列。
适用于本发明的还有如下多肽：其被应用普通化学技术修饰以提高对蛋白水解降解的抗性、优化溶解特性、或使它们更适合于作为治疗剂。例如，肽主链可被环化以增强稳定性(参见，例如，Friedler et al.2000，J.Biol.Chem.275：23783-23789)。类似物会被用到，其包括不同于天然存在的L-氨基酸的残基，例如，D-氨基酸或非天然存在的合成氨基酸。蛋白可被聚乙二醇化以增强稳定性。
改变或不改变一级氨基酸序列的感兴趣的修饰包括多肽的化学衍生作用，例如，乙酰化作用或羧化作用；氨基酸序列的改变以使蛋白易于聚乙二醇化(添加聚乙二醇部分)，等等。在一个实施方案中，本发明关注使用合成I型干扰素受体激动剂变体，超糖基化、抗蛋白酶的变体，其进一步包括一个或多个非天然存在的聚乙二醇化位点，它们被设计为提供具有减少的血清清除率的PEG衍生多肽。这样，本发明包括聚乙二醇化的合成I型干扰素受体激动剂。还包括糖基化的修饰，例如，在多肽的合成和加工中或在进一步加工步骤中，改变其糖基化模式；例如，使多肽接触影响糖基化的酶，如哺乳动物糖基化或去糖基化酶。本发明关注使用任何聚乙二醇化超糖基化的、聚乙二醇化抗蛋白酶的和聚乙二醇化抗蛋白酶的超糖基化的多肽变体。还包含了具有磷酸化的氨基酸残基(例如，磷酸化酪氨酸、磷酸化丝氨酸或磷酸化苏氨酸)的序列。
融合蛋白
在一些实施方案中，超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体进一步包含异种多肽(例如，融合配偶体(fusion partner))以形成融合蛋白。适合的融合配偶体包括如下性能的肽和多肽：赋予增强的体内稳定性(例如，增强的血清半衰期)；有利于纯化，例如，(His)n，例如6His等；使融合蛋白从细胞中分泌；提供表位标签，例如，GST、血球凝集素(HA；例如，CYPYDVPDYA；SEQ ID NO：1304)、FLAG(例如DYKDDDDK；SEQ ID NO：1305)、c-myc(例如CEQKLISEEDL；SEQ ID NO：1306)等；提供可检测的信号，例如，产生可检测产物的酶(例如，β-半乳糖苷酶、荧光素酶)，或本身可检测的蛋白，例如绿色荧光蛋白等；提供多聚化，例如多聚化结构域，如免疫球蛋白的Fc部分等。
融合蛋白可包含提供从细胞分泌融合蛋白的氨基酸序列。本领域技术人员知道这些分泌信号序列。适合用于细菌的分泌信号包括但不限于下列蛋白的分泌信号：E.coli、S.marcescens、E.amylosora、Mmorganii和P.rnirabilis中的布朗氏(Braun′s)脂蛋白以及E.coli和沙门氏菌中的TraT蛋白；B.licheniformis和B.cereus和S.aureus中的青霉素酶(PenP)蛋白；Klebsiella pneumoniae和Klebsiella aerogenese中的支链淀粉酶蛋白；E.coli脂蛋白lpp-28、Pa1、Rp1A、Rp1B、OsmB、NIpB和Orl17；V.harseyi中的壳二糖蛋白；Pseudomonas solanacearum中的β-1，4-葡聚糖内切酶蛋白；H.influenzae中的Pa1和Pcp蛋白；P.aeruginosa中的OprI蛋白；S.pneumoniae中的Ma1X和AmiA蛋白；Treponema pallidum中的34 kda抗原和TpmA蛋白；Mycoplasmahyorhinis中的P37蛋白；Bacillus amyloliquefaciens中的中性蛋白酶；Rickettsia rickettsii中的17kda抗原。适合用于酵母的分泌信号序列为本领域所公知，并会被用到。参见，例如，第5,712,113号美国专利。
在一些实施方案中，使用来自IFN-α14的信号肽。在其他实施方案中，使用来自IFN-β的信号肽。包含IFN-α14或IFN-β信号肽的合成I型干扰素受体多肽激动剂的例子提供在实施例2中。这样的信号肽提供了从哺乳动物细胞中的分泌。
在一些实施方案中，超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体包含融合配偶体和蛋白酶切割位点，该位点在融合部分和多肽变体余部之间。
蛋白水解切割位点为本领域技术人员所公知；已知的有很多种，并且在文献中有详细描述，包括，例如，
Handbook of Proteolytic Enzymes(蛋白水解酶手册)(1998)AJ Barrett、ND Rawlings和JFWoessner等，Academic Press。蛋白水解切割位点包括但不限于肠激酶切割位点(Asp)4Lys(SEQ ID NO：1307)；因子Xa切割位点：Ile-Glu-Gly-Arg(SEQ ID NO：1308)；凝血酶切割位点，例如Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQ ID NO：1309)；血管紧张肽原酶切割位点，例如His-Pro-Phe-His-Leu-Val-Ile-His(SEQ ID NO：1310)；胶原酶切割位点，例如X-Gly-Pro(其中X为任意氨基酸)；胰岛素切割位点，例如Arg-Lys；病毒蛋白酶切割位点，如病毒2A或3C蛋白酶切割位点包括，但不限于：细小核糖核酸病毒中的蛋白酶2A切割位点(参见，例如Sommergruber et a1.(1994)Virol.198：741-745)，甲型肝炎病毒3C切割位点(参见，例如Schultheiss et al.(1995)J.Virol.69：1727-1733)，人鼻病毒2A蛋白酶切割位点(见，例如Wang et al.(1997)Biochem.Biophys.Res.Comm.235：562-566)，和细小核糖核酸病毒3蛋白酶切割位点(参见，例如Walker et a1.(1994)Biotechnol.12：601-605)。
制备超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体
本发明合成I型干扰素受体多肽激动剂可容易地由任何公知方法制备，包括化学合成法、由标准重组技术产生及其组合。例如，本发明中合成I型干扰素受体多肽激动剂的合成可应用自动化的固相叔-丁氧基碳基和苯甲基保护策略。本发明合成I型干扰素受体多肽激动剂可通过天然化学连接作用合成，例如，约15到约40氨基酸长度的片段(例如从约15到约20，从约20到约25，从约25到约30，从约30到约35，从约35到约40的氨基酸长度的片段)可应用化学合成的标准方法来合成并采用如Dawson，et al.(1994)Science 266：776-779中所述的方法连接这些片段。合成多肽纯度的评估可通过反相高效液相色谱法(HPLC)和等电聚焦进行。配体的一级结构可用埃德曼(Edman)测序法验证。
在很多实施方案中，包含编码本发明合成I型干扰素受体多肽激动剂的核苷酸序列的表达载体应用常规方法制备，并被引入宿主细胞，尤其是能够糖基化蛋白的真核细胞。表达载体提供了在宿主细胞中生成本发明合成I型干扰素受体多肽激动剂。因此，本发明提供了制备合成I型干扰素受体多肽激动剂的方法，该方法包括在有利于生成合成I型干扰素受体多肽激动剂的条件下培养真核宿主细胞，其中宿主细胞包含所述重组表达载体；以及从培养基中分离合成I型干扰素受体多肽激动剂。本发明中的多肽激动剂可被分离和纯化到大于80％、大于90％、大于95％、大于98％、或大于99％的纯度。
所述多肽可根据常规方法基于表达目的在原核细胞或真核细胞中被表达。如上所述，在很多实施方案中，本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂在真核细胞中合成。为了大规模生产蛋白，单细胞生物，如S.cerevisiae；与杆状病毒载体组合的昆虫细胞；或高等生物如脊椎动物的细胞，尤其是哺乳动物细胞，如COS7细胞、CHO细胞、HEK293细胞等可被用作表达宿主细胞。在很多实施方案中，希望在真核细胞中表达基因，其中蛋白可受益于天然折叠和翻译后修饰。
应用表达宿主可得到大量蛋白或其片段，这些蛋白可根据常规方法分离和纯化。可制备表达宿主的溶解物并用如下方法纯化溶解物：HPLC、疏水性相互作用色谱法(HIC)、阴离子交换色谱法、阳离子交换色谱法、排阻色谱法、超滤、凝胶电泳、亲和层析或其他纯化技术。
本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂也可用常规方法从细胞培养物上清或从细胞溶解物中分离和纯化。例如，可制备表达宿主的溶解物并用如下方法纯化溶解物：HPLC、疏水性相互作用色谱法(HIC)、阴离子交换色谱法、阳离子交换色谱法、排阻色谱法、超滤、凝胶电泳、亲和层析或其他纯化方法。对大部分情况而言，用到的组合物包含至少20％重量比的期望产物，通常为至少约75％重量比，优选至少约95％重量比；对治疗目的，通常至少约99.5％重量比(相对于与制备和纯化产物的方法有关的杂质)。
在很多实施方案中，本发明合成I型干扰素受体多肽激动剂被纯化，例如，本发明合成I型干扰素受体多肽激动剂没有其他的非本发明的蛋白，并且没有其他大分子(例如，碳水化合物和脂质等)。在很多实施方案中，本发明合成I型干扰素受体多肽激动剂为至少约75％纯的、至少约80％纯的、至少约85％纯的、至少约90％纯的、至少约95％纯的、至少约98％纯的、至少约99％纯的、或大于99％纯的。测定蛋白是否不含其他蛋白和其他大分子的方法为本领域所公知。
超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体可用本领域公知的常规技术通过重组方法制备。特定的序列和制备方法取决于方便、经济、所需的纯度等。
典型地，通过化学合成法制备编码期望多肽变体的氨基酸序列的寡核苷酸，例如，通过应用寡核苷酸合成仪，其中所述寡核苷酸基于期望多肽的氨基酸序列设计，在很多实施方案中，选择那些在产生重组多肽的宿主细胞中偏爱的密码子。例如，编码期望多肽部分的一些小的寡核苷酸可被合成并通过PCR、连接作用或连接链式反应(LCR)组装。单个寡核苷酸典型的包含5′或3′突出物用于互补组装。一旦组装后，编码多肽变体的核苷酸序列被插入重组载体并可操作地连接到表达期望核酸所需的控制序列，随后在期望的转化的宿主细胞中产生本发明的多肽。
在一些实施方案中，期望的核酸被如此产生以至于至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或更多的密码子为在人序列中偏爱的密码子。参见，例如，下表8。
表8：人类中密码子的使用。分子克隆：实验室手册。Sambrook J.和Russell D.W.第三版2001，冷泉港出版社。
| 氨基酸 | 在人蛋白中的频率(％)a | 密码子以及它们在人蛋白中的使用(％)b | |
| 丙氨酸精氨酸精氨酸天冬氨酸半胱氨酸谷氨酸谷氨酰胺甘氨酸组氨酸异亮氨酸亮氨酸赖氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸脯氨酸丝氨酸苏氨酸色氨酸酪氨酸缬氨酸 | 6.995.283.925.072.446.824.477.102.354.509.565.712.233.845.677.255.681.383.136.35 | GCU(28.0)GCA(20.0)GGU(8.9)CGA(5.4)AGA(9.9)AAU(42.3)GAU(42.8)UGU(40.6)GAA(99.2)CAA(24.8)GGU(15.8)GGA(24.1)CAU(39.6)AUU(33.1)AUA(12.9)UUA(5.5)CUU(11.1)CUA(6.5)AAA(38.9)AUG(100)UUU(41.1)CCU(27.3)CCA(25.7)UCU(18.3)UCA(12.9)AGU(13.2)ACU(22.4)ACA(25.4)UGG(100)UAU(40.0)GUU(16.4)GUA(9.3) | GCC(41.6)GCG(10.3)CGC(21.4)CGG(10.4)AGG(11.1)AAC(57.7)GAG(57.2)UGC(59.4)GAG(60.7)CAG(75.2)GGC(35.8)GGG(24.3)CAC(60.4)AUC(54.0)UUG(11.5)CUC(20.8)CUG(44.5)AAG(61.1)UUC(58.2)CCC(35.2)CCG(11.6)UCC(23.7)UCG(5.9)AGG(25.9)ACC(40.5)ACG(11.8)UAC(60.0)GUC(25.7)GUG(48.7) |
编码多肽的核酸分子通常置于载体分子中扩增。使用病毒和非病毒载体，包括质粒。质粒的选择依赖于扩增所期望的细胞类型和扩增的目的。某些载体可用于扩增和生成大量期望的DNA序列。
重组表达载体可用于实现在细胞中表达编码多肽的核酸分子，例如生成超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体。合适载体的选择为本领域技术人员所熟知。许多这样的载体可从商业上购得。
表达载体适合在培养基中的细胞中表达。这些载体通常包括调控序列(“控制序列”或“控制区”)，该序列被可操作地连接到期望的多聚核苷酸上，并且为该多聚核苷酸表达所必需。
表达载体通常具有位于启动子序列附近的适宜的限制位点，使得可插入编码期望蛋白或其他蛋白的核酸序列。可表达宿主中存在起作用的选择标记。表达载体可用于生成融合蛋白，其中外源融合肽提供了附加的功能，即增加蛋白合成、稳定性、与特定免疫血清的反应性、酶标记(如β-半乳糖苷酶、荧光素酶等)。
可制备包括转录起始区、启动子区(如在真核细胞中起作用的启动子)、期望的多聚核苷酸和转录终止区的表达盒。引入DNA后，包含该构建体的细胞可通过可选择的标记进行选择，所选细胞被扩增，随后用于表达。
表达盒可被引入至适于真核宿主细胞表达的多种载体中，这些载体例如为质粒；HAC；YAC；由动物病毒获得的载体，例如莫洛尼(氏)小鼠白血病病毒(Moloney’s murine leukemia virus)、SV40、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录酶病毒；或植物病毒，如，花椰菜花叶病毒、烟草花叶病毒等，其中，载体的一般特征为提供了选择包含表达载体的细胞的能力。载体可提供染色体外维持，尤其是质粒或病毒，或被整合到宿主基因组中。当需要染色体外维持时，为质粒的复制提供起始序列，该质粒可为低或高拷贝数。很多种标记可用于选择，尤其是抗毒素的标记，特别是抗生素。被选定的特定标记是根据宿主的特性选择的，其中某些情况下，可采用与营养缺陷型宿主互补。可运用任何简便方法，如钙沉淀DNA、电穿孔法、融合、转染、病毒载体感染、生物弹射击法(biolistic)等，将DNA构建体引入宿主细胞中。
本发明进一步关注在遗传修饰的宿主细胞中生成超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体，该细胞可能是分离的宿主细胞，包含编码多肽变体的多聚核苷酸，或，在一些实施方案中，为可表达这些多聚核苷酸的表达载体。适合的宿主细胞有真核细胞，包括与杆状病毒结合的昆虫细胞；酵母细胞，如Saccharomyces cerevisiae；或高等生物的细胞，如脊椎动物，包括两栖动物(如有爪蟾蜍卵母细胞)和哺乳动物，尤其是COS细胞、CHO细胞、HEK293细胞、MA-10细胞等哺乳动物细胞可被用作表达宿主细胞。特别地，宿主细胞为可糖基化蛋白的真核宿主细胞。
超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体可从生产宿主细胞中获得，随后根据重组合成的常规方法分离和纯化。可制备表达宿主的溶解物，并用如下方法纯化溶解物：高效液相色谱法、排阻色谱法、凝胶电泳、亲和层析或其他纯化方法。对大部分情况而言，用到的组合物包含至少20％重量比的期望产物，通常为至少约75％重量比，优选至少约95％重量比；对治疗目的，通常至少约99.5％重量比(相对于与制备和纯化产物的方法相关的杂质)。通常，百分比基于总蛋白。
聚乙二醇化的I型干扰素受体多肽激动剂
如上所述，在一些实施方案中，本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂被修饰为具有一个或多个聚乙二醇部分，即，聚乙二醇化。PEG分子被偶联到本发明多肽激动剂的一个或多个氨基酸侧链上。在一些实施方案中，本发明的聚乙二醇化多肽激动剂仅包含在一个氨基酸上的PEG部分。在其他实施方案中，本发明的聚乙二醇化多肽激动剂包含在两个或多个氨基酸上的PEG部分，例如，本发明的聚乙二醇化多肽激动剂包含连接在2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个不同氨基酸残基上的PEG部分。
本发明的多肽可通过氨基基团、巯基基团、羟基基团或羧基基团直接结合到PEG上(即，无连接基团)。
在一些实施方案中，聚乙二醇化的所述多肽在本发明多肽的氨基端(N-端)或其附近聚乙二醇化，例如PEG部分在如下的一个或多个氨基酸残基上偶联到本发明中多肽：从氨基酸1至氨基酸4，或从氨基酸5至约10。在其他实施方案中，聚乙二醇化的所述多肽在从约10至约28的一个或多个氨基酸残基上聚乙二醇化。在其他实施方案中，聚乙二醇化的所述多肽在本发明多肽的羧基端(C-端)或其附近聚乙二醇化，例如，在从氨基酸156至166、或从氨基酸150至155的一个或多个氨基酸残基上。在其他实施方案中，聚乙二醇化的所述多肽在一个或多个氨基酸残基上聚乙二醇化，这些残基位于从氨基酸100至114的一个或多个残基。
在本发明蛋白的受体结合和/或活性位点区或其附近的氨基酸残基上的聚乙二醇衍生作用可破坏这些区域的功能。在本发明的某些实施方案中，应避免聚乙二醇化的氨基酸包括从氨基酸30至氨基酸40的氨基酸残基；和从氨基酸113至氨基酸149的氨基酸残基。
在一些实施方案中，PEG经连接基团偶联到本发明的多肽。所述连接基团为任何生物相容的连接基团，其中“生物相容的”指化合物或基团为无毒的，并且可在体内或体外应用而不引起损害、不适、疾病或死亡。PEG可被键合到连接基团，例如，通过醚键、酯键、硫醇键或酰胺键。适合的生物相容的连接基团包括，但不限于：酯基团、酰胺基团、酰亚胺基团、氨基甲酸酯基团、羧基基团、羟基基团、碳水化合物、琥珀酰亚胺基团(包括，例如琥珀酰亚胺琥珀酸酯(SS)、琥珀酰亚胺丙酸酯(SPA)、琥珀酰亚胺丁酸酯(SBA)、琥珀酰亚胺羧甲酸酯(SCM)、琥珀酰亚胺琥珀酰胺(SSA)或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS))、环氧化物基团、氧羰基咪唑基团(包括，例如羰基二咪唑(CDI))、硝基苯基基团(包括，例如硝基苯基碳酸酯(NPC)或三氯苯基碳酸酯(TPC))、trysylate基团、醛基团、异氰酸酯基团、乙烯基砜基团、酪氨酸基团、半胱氨酸基团、组氨酸基团或伯胺。
生成琥珀酰亚胺丙酸酯(SPA)和琥珀酰亚胺丁酸酯(SBA)活化的PEG的方法的描述见于第5,672,662号美国专利(Harris，et al.)和WO97/03106。
将PEG结合到多肽上的方法为本领域所公知，可采用任何已知的的方法。参见，例如，Park et al，Anticancer Res.，1：373-376(1981)；Zaplipsky and Lee，Polyethylene Glycol Chemistry：Biotechnical andBiomedical Applications(聚乙二醇化学：生物技术和生物医学应用)，J.M.Harris编辑，纽约Plenum出版社，第21章(1992)；第5,985,265号美国专利；第5,672,662号美国专利和WO 97/03106。
在很多实施方案中，PEG为单甲氧基PEG分子，其与本发明多肽的伯胺基团反应。通过还原性烷基化用单甲氧基PEG修饰多肽的方法为本领域所公知。参见，例如Chamow et al.(1994)Bioconj.Chem.5：133-140。
聚乙二醇
适合偶联到本发明多肽上的聚乙二醇在室温下在水中可溶，具有通式R(O-CH2-CH2)nO-R，其中R为氢或保护基团，如烷基或烷醇基基团，其中n为从1至1000的整数。其中当R为保护基团时，其通常为具有1至8碳。
在很多实施方案中，PEG具有至少一个羟基基团，例如，末端羟基基团，其中羟基基团可被修饰以产生可与氨基基团反应的功能基团，这类氨基基团例如为赖氨酸残基的ε-氨基基团、多肽N末端的自由氨基基团、或任何其他氨基基团，如天冬酰胺、谷胺酰胺、精氨酸或组氨酸的氨基基团。
在其他实施方案中，PEG可被衍生以使得其可与本发明多肽的自由羧基基团(例如，本发明中多肽羧基端的自由羧基基团)反应。与本发明中多肽的羧基端的自由羧基基团反应的PEG的适合的衍生物包括，单不限于：PEG-胺和PEG的肼衍生物(如PEG-NH-NH2)。
在其他实施方案中，PEG可被衍生以使得其包含末端硫代羧酸基团，-COSH，它可选择性的与氨基基团反应生成酰胺衍生物。由于硫代酸的反应特性，可获得相对其他基团对特定氨基基团的选择性。例如，-SH在适合的pH条件下在与N末端氨基基团反应中充分显示了足够离去基团能力，这样就使得赖氨酸残基中的∈-氨基基团被质子化并保留了非亲核性。另一方面，在适合pH条件下的可使一些可及的赖氨酸残基进行选择性反应。
在其他实施方案中，PEG在PEG链末端包含具有反应性的酯，如N-羟基琥珀酰亚胺酯(succinimidate)。这样的包含N-羟基琥珀酰亚胺酯的PEG分子在特定的pH条件下(如中性6.5-7.5)可与选择的氨基基团反应。例如，N末端氨基基团在中性pH条件下可被选择性地修饰。然而，假如试剂的反应性是极端的，则可及的赖氨酸的-NH2基团也可反应。
PEG可被直接或通过衔接物偶联到本发明多肽。在一些实施方案中，衔接物被加到本发明多肽上形成衔接物修饰的多肽。这些衔接物提供了各种各样的功能性，例如，反应基团如巯基、氨基或羧基，已将PEG试剂偶联到该衔接物修饰的多肽。
在一些实施方案中，偶联到本发明多肽上的PEG是线性的。在其他实施方案中，偶联到本发明多肽上的PEG是分枝的。分枝的PEG衍生物如第5,643,575号美国专利所描述的，“星状-PEG”和多臂PEG的衍生物的描述如见于Shearwater Polymers，Inc.catalog“PolyethyleneGlycol Derivatives(聚乙二醇衍生物1997-1998)”。
通常采用分子量约2kDa至约100kDa的PEG，其中与PEG相关的术语“约”是指在聚乙二醇的制备中，一些分子量比标称分子量重，一些分子量比标称分子量轻。例如，适合偶联到本发明多肽上的PEG具有分子量从约2kDa至约5kDa，从约5kDa至约10kDa，从约10kDa至约15kDa，从约15kDa至约20kDa，从约20kDa至约25kDa，从约25kDa至约30kDa，从约30kDa至约40kDa，从约40kDa至约50kDa，从约50kDa至约60kDa，从约60kDa至约70kDa，从约70kDa至约80kDa，从约80kDa至约90kDa或从约90kDa至约100kDa。
本发明合成I型干扰素受体多肽激动剂的群
本发明提供了组合物，其包含如上所述的合成I型干扰素受体多肽激动剂的群。所述组合物包含本发明多肽的群，其中该群包含至少两种不同的本发明合成I型干扰素受体多肽激动剂(例如，相互之间在氨基酸序列中有至少一个氨基酸不同的多肽激动剂)。
通常，给定的本发明合成I型干扰素受体多肽激动剂为群中合成I型干扰素受体多肽激动剂总群的约0.5％至约99.5％，例如，给定的修饰的合成I型干扰素受体多肽激动剂为群中合成I型干扰素受体多肽激动剂总群的约0.5％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％、或约99.5％。
组合物
本发明提供了组合物，包括药物组合物，其包含本发明合成I型干扰素受体多肽激动剂、已知的超糖基化的多肽变体、已知的抗蛋白酶的多肽变体、或已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体，即母体蛋白治疗剂的多肽变体，其包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，该位点替代了母体蛋白治疗剂中发现的天然蛋白酶切割位点；并包含(1)与至少一个未在母体蛋白治疗剂中发现的非天然糖基化位点共价连接的糖部分，和/或(2)与至少一个在母体蛋白治疗剂中发现的但未糖基化的天然糖基化位点共价连接的糖部分。组合物包含本发明合成I型干扰素受体多肽激动剂、已知的超糖基化的多肽变体、已知的抗蛋白酶的多肽变体、或已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体；以及一个或多个其它组分，其选择部分地基于多肽变体的应用。适合的其它组分包括，但不限于：盐、缓冲剂、增溶剂、稳定剂、洗涤剂和蛋白酶抑制剂等。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、已知的超糖基化的多肽变体、已知的抗蛋白酶的多肽变体、或已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和药物上可接受的赋形剂。很多种药物上可接受的赋形剂为本领域所公知，在本文中不必详细论述。药物上可接受的赋形剂已在多种出版物中被详细描述，包括，例如A.Germaro(2000)“Remington：The Science and Practice ofPharmacy(雷明顿：药物科学与实践)”第20版，Lippincott、Williams& Wilkins；Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(药物剂型和给药体系)(1999)H.C.Ansel等编辑，第7版，Lippincott、Williams & Wilkins；以及Handbook of Pharmaceutical Excipients(药物赋形剂手册)(2000)A.HKibbe等编辑，第3版，Amer.PharmaceuticalAssoc。
在药物剂型中，在一些实施方案中，本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、已知的超糖基化的多肽变体、已知的抗蛋白酶的多肽变体、或已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体在一些实施方案中以药物可接受的盐的形式提供，单独使用、或与其他药物活性化合物的适当缔合以及联合。
适合注射的制剂
在一些实施方案中，通过将本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂溶解、悬浮或乳化于水溶剂(如盐水等)或非水溶剂，如植物或其他类似的油、合成的脂肪族酸甘油酯、高级脂肪族酸的酯或丙二醇；以及如果需要，加入常规的添加剂，如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂，而配制成适于注射的制剂(例如，皮下的、肌内的、皮内的、经皮的或其他的注射途径)。
用于肠内递送的制剂
对于口服制剂，本发明的试剂(例如本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂)被单独配制，或与适当的添加剂组合配制成片剂、粉剂、冲服剂或胶囊，例如，与常规的添加剂，如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉；与粘合剂，如晶状纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯胶、玉米淀粉或动物胶；与崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠；与润滑剂，如滑石粉或硬脂酸镁，以及如果需要，与稀释剂、缓冲剂、增湿剂、防腐剂和增香剂组合。
而且，本发明的激动剂可与多种基质混和制成栓剂，这些基质如乳化基质或水溶基质。本发明的激动剂可通过栓剂直肠给药。栓剂包括载体，如可可油、水溶性有机润滑剂(carbowax)和聚乙二醇，它们在体内温度下融化，但是在室温凝固。
可提供的口服的或直肠给药的单位剂型，如糖浆剂、酏剂和悬浮液，其中每一剂型单位，例如，一茶匙的量、一汤匙的量、片剂或栓剂，包含含有一种或多种活性剂的预定量的组合物。同样地，注射或静脉内给药的单位剂型可将激动剂包含在作为无菌水、生理盐水或其他药物可接受的载体的溶液的组合物中。
对于肠内给药，本发明的制剂在一些实施方案中包括肠溶包衣原料。适合的肠溶包衣原料包括羟丙基甲基纤维素醋酸琥珀酸酯(HPMCAS)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)、纤维素乙酸邻苯二甲酸酯(CAP)、聚乙烯基邻苯二甲酸乙酸酯(PVPA)、EudragitTM和虫胶。
作为适合的口服制剂的一个非限定性的例子，本发明合成I型干扰素受体多肽激动剂可与一种或多种药物赋形剂一起配制，并被包上肠溶包衣，如第6,346,269号美国专利所描述的。例如，包含溶剂、本发明合成I型干扰素受体多肽激动剂和稳定剂的溶液可被涂覆在包含药物上可接受的赋形剂的核心上，以形成活性剂包被的核心；将次包衣层涂覆到该活性剂包被的核心，其随后被肠溶包衣层包被。核心通常包括药物非活性组分，如乳糖、淀粉、甘露醇、羧甲基纤维素钠、淀粉乙醇酸钠、氯化钠、氯化钾、色素、褐藻酸盐、滑石粉、二氧化钛、硬脂酸、硬脂酸酯、微晶纤维素、甘油、聚乙二醇、柠檬酸三乙酯、柠檬酸三丁酯、三乙酸丙酯、磷酸氢钙、磷酸三钠、硫酸钙、环糊精和蓖麻油。对活性剂适合的溶剂包括水溶剂。适合的稳定剂包括碱金属和碱土金属、磷酸盐和有机酸盐以及有机胺。该次包衣层包含一种或多种粘合剂、增塑剂和抗胶粘剂。适合的抗胶粘剂包括滑石粉、硬脂酸、硬脂酸盐、硬脂酰延胡索酸钠、山嵛酸甘油酯、高岭土和硅胶。适合的粘合剂包括聚乙烯吡咯酮(PVP)、明胶、羟乙基纤维素(HEC)、羟丙基纤维素(HPC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、乙酸乙烯酯(VA)、聚乙烯醇(PVA)、甲基纤维素(MC)、乙基纤维素(EC)、羟丙基甲基纤维素(HPMCP)、纤维素乙酸邻苯二甲酸酯(CAP)、黄原胶、褐藻酸、褐藻酸盐、EudragitTM、甲基丙烯酸/甲基丙烯酸甲酯与聚乙烯乙酸邻苯二甲酸酯(PVAP)的共聚物。适合的增塑剂包括甘油、聚乙二醇、柠檬酸三乙酯、柠檬酸三丁酯、三乙酸丙酯、以及蓖麻油。适合的肠溶包衣原料包括羟丙基甲基纤维素醋酸琥珀酸酯(HPMCAS)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)、纤维素乙酸邻苯二甲酸酯(CAP)、聚乙烯邻苯二甲酸乙酸酯(PVPA)、EudragitTM和虫胶。
适合的口服制剂还包括与任一下述物质一起配制的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂：微粒(参见，例如第6,458,398号美国专利)；生物可降解的大单体(参见，例如第6,703,037号美国专利)；生物可降解的水凝胶(参见，例如，Graham and McNeill(1989)Biomaterials5：27-36)；生物可降解的粒性载体(参见，例如第5,736,371号美国专利)；生物可吸收的内酯聚合物(参见，例如第5,631,015号美国专利)；缓慢释放的蛋白聚合物(参见，例如第6,699,504号美国专利；PeliasTechnologies，Inc.)；聚(丙交酯-共-乙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物(参见，例如第6,630,155号美国专利；Atrix Laboratories，Inc.)；组合物，其包含生物相容的聚合物和分散在聚合物内的金属阳离子稳定剂的微粒(参见，例如，第6,379,701号美国专利；Alkermes Controlled Therapeutics，Inc.)；以及微球体(见，例如，第6,303,148号美国专利；Octoplus，B.V.)。
适合的口服制剂还包括与任一下述物质一起配制的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂：载体，如Emisphere(EmisphereTechnologies，Inc.)；TIMERx，结合黄原胶和豆角胶的亲水基质，在葡聚糖存在时，其在水中形成强粘合剂凝胶(Penwest)；GeminexTM(Penwest)；ProciseTM(GlaxoSmithKline)；SAVITTM(Mistral PharmaInc.)；RingCapTM(Alza Corp.)；Smartrix(Smartrix Technologies，Inc.)；SQZgelTM(MacroMed，Inc.)；GeomatrixTM(Skye Pharma，Inc.)；OrosTri-layer(Alza Corporation)等。
适合应用的还有如下制剂：第6,296,842号美国专利所描述的制剂(Alkermes Controlled Therapeutics，Inc.)；第6,187,330号美国专利所描述的制剂(Scios，Inc.)等。
用于口服递送的制剂
本发明提供了药物组合物，其包含本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、已知的超糖基化多肽变体、已知的抗蛋白酶多肽变体、或已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和适合口服递送的药物赋形剂。
对于口服制剂，本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、已知的超糖基化多肽变体、已知的抗蛋白酶多肽变体、或已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体被单独配制，或与适合的添加剂结合制成片剂、粉剂、冲服剂或胶囊，例如，与常规的添加剂，如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉；与粘合剂，如晶体纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯树胶或动物胶；与崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠；与润滑剂，如滑石粉或硬脂酸镁，以及如果需要，与稀释剂、缓冲剂、增湿剂、防腐剂和增香剂一起配制。
可提供口服给药的单位剂型，如糖浆剂、酏剂和悬浮剂，其中每一剂型单位，例如，一茶匙的量、一汤匙的量、片剂，包含含有预定量的一种或多种活性剂的组合物。
对口服递送，本发明的制剂在一些实施方案中包括肠溶包衣原料。适合的肠溶包衣原料包括羟丙基甲基纤维素醋酸琥珀酸酯(HPMCAS)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)、纤维素乙酸邻苯二甲酸酯(CAP)、聚乙烯基邻苯二甲酸乙酸酯(PVPA)、EudragitTM和虫胶。
作为适合的口服制剂的一个非限定性的例子，本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、已知的超糖基化多肽变体、已知的抗蛋白酶多肽变体、或已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体可与一种或多种药物赋形剂一起配制，并被包上肠溶包衣，如第6,346,269号美国专利所述。例如，包含溶剂、已知的超糖基化的、抗蛋白酶的多肽变体和稳定剂的溶液可被涂覆在包含药物上可接受的赋形剂的核心上，以形成的核心；将次包衣层涂覆到该活性剂包被的核心，它随后被肠溶包衣层涂覆。核心通常包括药物非活性组分，如乳糖、淀粉、甘露醇、羧甲基纤维素钠、淀粉乙醇酸钠、氯化钠、氯化钾、色素、褐藻酸盐、滑石粉、二氧化钛、硬脂酸、硬脂酸盐、微晶纤维素、甘油、聚乙二醇、柠檬酸三乙酯、柠檬酸三丁酯、三乙酸丙酯、磷酸氢钙、磷酸三钠、硫酸钙、环糊精和蓖麻油。对活性剂适合的溶剂包括水溶剂。适合的稳定剂包括碱金属和碱土金属、磷酸盐和有机酸盐以及有机胺。次包衣层层包含一种或多种粘合剂、增塑剂和抗胶粘剂。适合的抗胶粘剂包括滑石粉、硬脂酸、硬脂酸盐、硬脂酰延胡索酸钠、山嵛酸甘油酯、高岭土和硅胶。适合的粘合剂包括聚乙烯吡咯酮(PVP)、明胶、羟乙基纤维素(HEC)、羟丙基纤维素(HPC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、乙酸乙烯(VA)、聚乙烯醇(PVA)、甲基纤维素(MC)、乙基纤维素(EC)、羟丙基甲基纤维素(HPMCP)、纤维素乙酸邻苯二甲酸酯(CAP)、黄原胶、褐藻酸、褐藻酸盐、EudragitTM、甲基丙烯酸/甲基丙烯酸甲酯与聚乙烯乙酸邻苯二甲酸酯(PVAP)的共聚物。适合的增塑剂包括甘油、聚乙二醇、柠檬酸三乙酯、柠檬酸三丁酯、三乙酸丙酯、以及蓖麻油。适合的肠溶包衣原料包括羟丙基甲基纤维素醋酸琥珀酸酯(HPMCAS)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)、纤维素乙酸邻苯二甲酸酯(CAP)、聚乙烯邻苯二甲酸乙酸酯(PVPA)、EudragitTM和虫胶。
适合的口服制剂还包括与任一下述物质一起配制的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、已知的超糖基化多肽变体、已知的抗蛋白酶多肽变体、或已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体：微粒(参见例如第6,458,398号美国专利)；生物可降解的大单体(参见，例如第6,703,037号美国专利)；生物可降解的水凝胶(参见，例如，Graham andMcNeill(1989)Biomaterials 5：27-36)；生物可降解的粒性载体(参见，例如第5,736,371号美国专利)；生物可吸收的内酯聚合物(参见，例如第5,631,015号美国专利)；缓慢释放的蛋白聚合物(参见，例如第6,699,504号美国专利；Pelias Technologies，Inc.)；聚(丙交酯-共-乙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物(参见，例如第6,630,155号美国专利；AtrixLaboratories，Inc.)；组合物，其包含生物相容的聚合物和分散在聚合物中的金属阳离子稳定剂的微粒(参见，例如，第6,379,701号美国专利；Alkermes Controlled Therapeutics，Inc.)；以及微球体(见，例如，第6,303,148号美国专利；Octoplus，B.V.)。
适合的口服制剂还包括与任一下述物质一起配制的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、已知的超糖基化多肽变体、已知的抗蛋白酶多肽变体、或已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体：载体，如Emisphere(Emisphere Technologies，Inc.)；TIMERx，结合黄原胶和豆角胶的亲水基质，在葡聚糖存在时，其在水中形成强粘合剂凝胶(Penwest)；GeminexTM(Penwest)；ProciseTM(GlaxoSmithKline)；SAVITTM(Mistral Pharma Inc.)；RingCapTM(Alza Corp.)；Smartrix(Smartrix Technologies，Inc.)；SQZgelTM(MacroMed，Inc.)；GeomatrixTM(Skye Pharma，Inc.)；OrosTri-layer(Alza Corporation)等。
适合应用的还有如下制剂：第6,296,842号美国专利所描述的制剂(Alkermes Controlled Therapeutics，Inc.)；第6,187,330号美国专利所描述的制剂(Scios，Inc.)等。
包含肠吸收增强剂的制剂也适用于本发明。适合的肠吸收增强剂包括，但不限于：钙螯合剂(例如，柠檬酸盐、乙二胺四乙酸)；表面活性剂(例如，十二烷基硫酸钠、胆汁盐、棕榈酰肉碱和脂肪酸钠盐)；毒素(例如，闭锁小带毒素)等。
一方面，本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、已知的超糖基化多肽变体、已知的抗蛋白酶多肽变体、或已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体是口服递送制剂的第一单位形式。已知的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体为母体蛋白治疗剂的变体。在这些实施方案中，第一单位形式包含第一摩尔数的已知的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体。母体蛋白治疗剂典型地以第二单位形式以母体蛋白治疗剂的第二摩尔数给药，其中，第二单位形式为速释制剂，例如，适于皮下注射的速释制剂。母体蛋白治疗剂以选定的给药频率通过皮下推注给药。当以该选定的给药频率通过皮下推注以第二单位形式对患者给药时，母体蛋白治疗剂被证实在治疗患者疾病中是有效的。第一单位形式中的第一摩尔数多于第二单位形式中的第二摩尔数。然而，当第一单位形式口服给予患者时，第一摩尔数的已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体在一定时间段内由第一单位形式释放，该时间段不大于选定的第二给药频率中母体蛋白治疗剂给药之间的时间间隔。
另一方面，本发明的口服药物组合物在第一单位形式中包含第一剂量的已知的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体。在这些实施方案中，母体蛋白治疗剂典型地在肠胃外药物组合物中以母体蛋白的第二剂量给药，其中，该肠胃外药物组合物为速释制剂，例如，适于以选定的给药频率推注第二剂量的速释制剂。当通过皮下推注给予一定量的肠胃外药物组合物时，由此患者在选定的给药间隔接受了母体蛋白治疗剂的第二剂量，母体蛋白治疗剂在治疗患者疾病中必须被证实是有效的。当第一剂量的已知的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体口服给予患者时，释放第一剂量中所有的已知的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体所需的时间不大于该选定的给药间隔中给药之间的时间。当基于患有该疾病的患者总群体中的平均患者体重计算第一和第二剂量时，第一剂量中以药物摩尔数每公斤患者体重表示的已知的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的量多于第二剂量中以药物摩尔数每公斤患者体重表示的母体蛋白治疗剂的量。
在一些实施方案中，第二剂量为基于重量的剂量，并且第一剂量在摩尔数上大于以药物摩尔数每公斤患者体重表示的第二剂量乘以平均患者体重(例如75公斤)所得的产品。
在其他实施方案中，第二剂量根据患者体重分级(stratified)，即，第二剂量选自根据患者体重分级的一套两种或多种剂量(例如，对体重≤75kg的患者为1,000mg的药物，对体重＞75kg的患者为1,200mg的药物)，并且第一剂量在药物摩尔数上大于该套基于患者体重分级的剂量中的最大剂量。
在其他实施方案中，第二剂量为固定剂量，第一剂量在药物摩尔数上大于第二剂量。
在一个非限定性的例子中，本发明提供了在下述“应用IFN-α的治疗方法”的治疗方法中用于将已知的合成IFN-α受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体口服给药的任何口服药物组合物。
在其他非限定性的例子中，本发明提供了在下述“应用IFN-β的治疗方法”的治疗方法中用于将已知的本发明的合成IFN-β受体多肽激动剂、已知的超糖基化多肽变体、已知的抗蛋白酶的多肽变体、或已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体口服给药的任何口服药物组合物。
在其他非限定性的例子中，本发明提供了在下述“应用IFN-γ的治疗方法”的治疗方法中用于将已知的合成IFN-γ受体多肽激动剂、超糖基化多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体口服给药的任何口服药物组合物。
具有肽载体的口服制剂
适用于本发明中的另外的口服制剂包括与如WO 03/066859中描述的的口服递送载体一起配制的已知的本发明的合成I型干扰素受体多肽变体、已知的超糖基化的多肽变体、已知的抗蛋白酶的多肽变体、或已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体。例如，适合的口服制剂包括期望的合成I型干扰素受体多肽变体、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体；以及穿透肽(penetrating peptide)(也称作“肽载体”)。穿透肽为帮助物质转移穿过生物屏障(例如，衬于胃肠道的上皮层)的任何肽。适合的肽载体包括来自各种蛋白的衍生物，这些蛋白包括，但不限于：整合膜蛋白、细菌毒素、非病原菌、病毒蛋白和胞外蛋白等。肽载体的氨基酸序列可与天然存在的肽的氨基酸序列相同，或为这种肽的改变形式(例如，与天然存在的肽相比，包括一个或多个氨基酸置换)。
肽载体典型地为约10个氨基酸至约30个氨基酸长，例如从约10个氨基酸至约15个氨基酸、从约15个氨基酸至约20个氨基酸、从约20个氨基酸至约25个氨基酸、从约25个氨基酸至约30个氨基酸长度。
适合的肽载体包括，但不限于如下表9所示的肽1-34中的任何肽(SEQ ID NO：1311-1326)。
表9
| 肽/生物体 | 序列 |
| 肽1：来自ORF H10638Hoemophilne influcnzae | NYHDIVLALAGVCQSAKLVHQLA |
| 肽2：来自PM1850Pasteurella multocida | NYYDITLALAGVCQAAKLVQQFA |
| 肽3：来自YCFCEscherichia coll | NYYDITLALAGICQSARLYQQLA |
| 肽4：来自VC1127 Vibriockoferac | AIYDRTIAFAGICQAVALVQQVA |
| 肽5：来自BU262Buchnera aphidicola | KIHLITLSLAGICQSAHLVQQLA |
| 肽6：来自PA2627 Pseadoptionar ncnueinaiu | DPRQQLIALGAVFESAALVDKLA |
| 肽7：来自XF1439 Xylella fastidiose | LIDNRVLALAGVVQALQQVRQIA |
| 肽8：来自MLR0187Rhlzobium loft | NLPPIVLAVIGICAAVFLLQQVV |
| 肽9：来自人NK-2受体 | NVPIVNLALADLCMAAFNAAPNF |
| 肽10：来自CPN0710/CChltuntvdia pactrmonlae | TAFDFNKMLDGVCTYVKGVQQYL |
| 肽11：来自MLR4119Rhizabium loft | RAILIPLALAGLCQVARAGDISS |
| 肽12：来自NprBBacillus subillts | MRNLTKTSLLLAGLCTAAQMVFVTH |
| 肽13：来自Pilin Kingelladontrificons | IELMIVIAIIGILAAIALPAYQEYV |
| 肽14：来自Pilin Eikeneltacorrodons | IELMIVIAIIGILAAIALPAYQDYV |
| 肽15：来自闭锁小带毒素(ZOT) | ASFGFCIORLCVQDGF |
| 肽29：来自人NK-I受体 | NYFLVNLAFAEASMAAFNTVVNF |
| 肽30：来自YCFCEscherichia coli | MNYYDITLALAGICQSARLVQQLA |
| 肽31：来自YCFCEscherichia coli | MYYDITLALAGICQSARLVQQLA |
| 肽32：来自YCFCEscherichia coli | MYDITLALAGICQSARLVQQLA |
| 肽33：来自NprB Baciliusstafitts | MRNLTRTSLLLAGLCTAAQMVFV |
| 肽34：来自ORF HI0638Haemopinitus infiuenzae | NYHDIVLALAGVCQSARLVHQLA |
适合的肽载体还包括表9所示的肽1-34中任何肽的变体，例如，在约1个氨基酸至约5个氨基酸上不同于肽1-34中任何肽的变体；以及肽1-34中任何肽的片段。与肽1-34中任何肽的氨基酸序列相比，肽1-34中任何肽的变体包括那些具有约1个至约5个保守氨基酸置换和/或非保守氨基酸置换的肽。肽1-34中任何肽的片段包括：包含肽1-34中任何肽的约10个连续氨基酸至约15个连续氨基酸的片段、包含肽1-34中任何肽的约15个连续氨基酸至约20个连续氨基酸的片段、和包含肽1-34中任何肽的约20个连续氨基酸至约25个连续氨基酸的片段。
肽载体可以多种方式中的任一种“结合到”(也称作“融合到”、“偶联到”、“连接到”或“附着到”)期望的合成I型干扰素受体、超糖基化的、抗蛋白酶的、或超糖基化、抗蛋白酶的蛋白上，这些方式包括，例如，通过共价相互作用、离子相互作用、疏水相互作用、氢键或其他结合类型(如，通过范德瓦尔(van der Waal)相互作用、由于溶剂偏爱(solvent preference)的非特定结合等)。将肽载体连接到期望蛋白可通过化学的、生物化学的、酶的或遗传的偶联方法得到，这些方法为本领域技术人员所公知。
如果肽载体被偶联到期望的合成I型干扰素受体、超糖基化的、抗蛋白酶的、或超糖基化、抗蛋白酶的蛋白上，则典型地所期望蛋白的N端被偶联到载体肽的羧基端。期望的合成I型干扰素受体、超糖基化的、抗蛋白酶的、或超糖基化、抗蛋白酶的蛋白可通过共价键直接或间接的连接到肽载体上。例如，共价键可以为肽键；或共价键可通过同型-或异型-功能性桥接剂得到。桥接剂可以为琥珀酰亚胺基-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)-型载体。共价键可应用肽衔接物获得。
在一些实施方案中，期望的合成I型干扰素受体、超糖基化的、抗蛋白酶的、或超糖基化、抗蛋白酶的蛋白通过衔接物(linker)肽连接到肽载体上，该衔接物肽可以是可切割的。衔接物肽具有多种氨基酸序列的任一种。蛋白可通过间隔肽连接，间隔肽通常具有柔性，尽管并不排除其他化学联接。目前，所关注的最有用的衔接物序列通常为约6个至约40个氨基酸长的肽，或约6个至约25个氨基酸长的肽。这些衔接物通常通过应用合成的、编码衔接物的寡核苷酸产生，以偶联到蛋白。具有柔性度的肽衔接物通常是优选的。连接肽可能具有任何氨基酸序列，但应注意的是优选的衔接物具有产生一般柔性肽的序列。应用小的氨基酸，如甘氨酸和丙氨酸，可产生柔性肽。这些序列的产生对本领域技术人员来说是常规的。多种不同的衔接物可从市场上获得，并认为是适用于本发明。
已知富含丙氨酸和脯氨酸残基的氨基酸序列赋予多结构域蛋白结构以柔性。例如，这样的序列连接2-氧酸脱氢酶复合物(如丙酮酸脱氢酶复合物和2-氧谷氨酸脱氢酶复合物)的称作E2组分的结构域。丙氨酸-脯氨酸富集区也在肌球蛋白轻链中被发现。用于本发明的示例性衔接物具有甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸残基的组合，如AAAGGM(SEQ ID NO：1332)、AAAGGMPPAAAGGM(SEQ ID NO：1333)、AAAGGM(SEQ ID NO：1334)和PPAAAGGM2(SEQ ID NO：1335)。其他示例性衔接物肽包括IEGR(SEQ ID NO：1336，它可被因子Xa切割)和GGKGGK(SEQ ID NO：1337)。然而，通常可以采用具有约6个至约40个氨基酸的任何柔性衔接物。衔接物实际上可能为产生柔性肽的任何序列，包括以上举例类型的丙氨酸-脯氨酸富集序列。
在一些实施方案中，期望的合成I型干扰素受体、超糖基化的、抗蛋白酶的、或超糖基化、抗蛋白酶的蛋白通过可被酶切割的衔接物肽连接到肽载体。在一些实施方案中，酶在特定生理条件下被条件性地激活。
在其他实施方案中，期望的合成I型干扰素受体、超糖基化的、抗蛋白酶的、或超糖基化、抗蛋白酶的蛋白通过非共价键偶联到肽载体，其中，通过将疏水部分连接到肽载体，由此疏水部分可使肽载体整合到疏水囊泡的界面，而在该囊泡中包含期望的合成I型干扰素受体、超糖基化的、抗蛋白酶的、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽。在其他实施方案中，非共价键为非共价的、高亲和键，如生物素-抗生物素蛋白或生物素-链霉亲合素键。
肽可以是化学或酶促合成的，可以是重组生成的，可以是从自然来源或前述组合中分离的。肽可应用本领域公知的蛋白纯化的标准方法从自然来源中分离，这些标准方法包括，但不限于：高效液相色谱法、排阻色谱法、凝胶电泳、亲和层析或其他纯化技术。可能会用到固相肽合成技术，其中这样的技术为本领域技术人员所公知。参见Jones，
The Chemical Synthesis of Peptide(肽的化学合成)(Clarendon出版社，Oxford)(1949)。通常，在这样的方法中，肽的产生通过连续添加活性的单体单位到固相结合的增长的肽链上而进行。成熟的重组DNA技术可用于生成肽。
示例性的口服制剂包括肠溶包衣的片剂和明胶胶囊，其包括肽载体、期望的合成I型干扰素受体、超糖基化的、抗蛋白酶的、或超糖基化、抗蛋白酶的蛋白；以及如下物质的一种或多种：a)稀释剂，例如，乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和/或甘氨酸；b)蛋白酶抑制剂，如抑肽酶(Aprotinin)或抑胰肽酶；c)润滑剂，例如，硅石、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁和/或钙盐、泊洛沙姆或聚乙二醇；d)粘合剂(例如，对片剂)，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；e)离子型表面活性剂活性试剂，如胆汁盐；f)崩解剂，例如，淀粉、琼脂、褐藻酸或褐藻酸钠盐、或泡腾合剂；以及g)吸收剂、着色剂、增香剂和甜味剂中的一种或多种。在一些实施方案中，口服制剂进一步包括防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、溶解促进剂、盐和缓冲剂的中的一种或多种。
口服制剂在一些实施方案中进一步包括非离子型去垢剂、离子型去垢剂、蛋白酶抑制剂和还原剂中的一种或多种。非离子型去垢剂可为泊洛沙姆，如普流罗尼F-68(Pluronic F-68)；离子型去垢剂可为胆汁盐，如牛磺去氧胆酸盐；蛋白酶抑制剂可为抑肽酶或大豆胰蛋白酶抑制剂；以及还原剂可为N-乙酰基-L-半胱氨酸。
组合制剂
本发明提供了药物组合物，其包括本发明的糖基化的合成I型干扰素受体多肽激动剂、糖基化的IFN-γ和药物可接受的赋形剂。在一些实施方案中，本发明的糖基化的合成I型干扰素受体多肽激动剂和糖基化的IFN-γ为共配制(co-formulated)。在一些实施方案中，本发明糖基化的合成I型干扰素受体多肽激动剂和糖基化的IFN-γ在包含在单一贮器中的单一液体制剂中共配制，用于药物递送装置使用。在一些实施方案中，本发明的糖基化的合成I型干扰素受体多肽激动剂和糖基化的IFN-γ为适合注射递送的制剂。在其他实施方案中，本发明糖基化的合成I型干扰素受体多肽激动剂和糖基化的IFN-γ为适合口服递送的制剂。适合口服给药的制剂包括上面论述的那些。
本发明提供了药物组合物，其包括单剂量的本发明的糖基化的合成I型干扰素受体多肽激动剂和单剂量的糖基化的IFN-γ，足以用于本发明描述的任何方法，该方法在治疗患者时将本发明的糖基化的合成I型干扰素受体多肽激动剂和糖基化的IFN-γ共给药(co-administration)。在-些方面，本发明提供了药物贮器或其他容器，其包含在液体中共配制的本发明的糖基化的合成I型干扰素受体多肽激动剂和糖基化的IFN-γ，其中，本发明的糖基化的合成I型干扰素受体多肽激动剂和糖基化的IFN-γ各自以适于一次给药的量存在于该制剂中。剂量在本发明中有描述。贮器可以多种方式被提供，包括，但不限于：药筒、注射器、连续递送装置的贮器等。
在一些实施方案中，包含本发明的糖基化的合成I型干扰素受体多肽激动剂和糖基化的IFN-γ的药物组合物通过混和如下物质得到：(a)在无菌水溶液中包含本发明糖基化的合成I型干扰素受体多肽激动剂的药物组合物；和(b)在无菌水溶液中包含糖基化的IFN-γ的药物组合物。
多聚核苷酸、载体和宿主细胞
本发明进一步提供包含编码本发明合成I型干扰素受体多肽激动剂的核苷酸序列的多聚核苷酸(核酸)、包含所述多聚核苷酸的载体以及包含所述多聚核苷酸或其载体的宿主细胞。所述多聚核苷酸可用于生成所述表达载体和遗传上修饰的宿主细胞，这些载体和细胞可用于生产本发明中的多肽激动剂。
本发明提供了编码本发明合成I型干扰素受体多肽激动剂的核酸组合物。本文中用到的术语“核酸组合物”指包含具有开放阅读框的核酸序列的组合物，该开放阅读框编码本发明合成I型干扰素受体多肽激动剂，并且在适当条件下可被表达，以至于在包含该核酸的宿主细胞中合成I型干扰素受体多肽激动剂。该术语也包含与编码本发明合成I型干扰素受体多肽激动剂的核酸同源或大体上相似或相同的核酸。
因而，本发明提供了包含编码本发明合成I型干扰素受体多肽激动剂的核苷酸序列的核酸和与该核酸具有大体上相同的核苷酸序列的核酸(如同源序列)。在很多实施方案中，所述核酸包括编码本发明合成I型干扰素受体多肽激动剂的核苷酸序列和与编码本发明合成I型干扰素受体多肽激动剂的核苷酸序列至少有约75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、或更多核苷酸序列一致性(尤其是核苷酸序列的本发明多肽的编码区域)的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述核酸包含编码合成I型干扰素受体多肽激动剂的核苷酸序列，该激动剂包含SEQ ID NO：9-19中任一个所式的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述核酸包含SEQ ID NO：24-4中任一个所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述核酸包含编码合成I型干扰素受体多肽激动剂的核苷酸序列，该激动剂包含SEQ ID NO：48-52中任一个所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述核酸包含编码合成I型干扰素受体多肽激动剂的核苷酸序列，该激动剂包含SEQ ID NO：55-59中任一个所示的氨基酸序列。
序列相似性是基于参照序列计算的，参照序列可以是较长序列的子集，如保守基序、编码区、侧翼区等。参照序列通常至少约18nt长，更多情况下至少约30nt长，也可延长至被比较序列的全长。序列分析算法为本领域所公知，如BLAST，其描述见于Atschul et al.(1990)，J.Mol.Biol.215：403-10(使用默认设置值，即参数w＝4，T＝17)。
本发明还提供了与上述核酸在严紧条件下杂交的核酸。严紧杂交条件的例子为在50℃或更高温度和0.1×SSC(15mM氯化钠/1.5mM柠檬酸钠)下杂交。严紧杂交条件的另一例子为在42℃下在溶液：50％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性的、剪切的鲑鱼精子DNA中孵育过夜，随后在约65℃下在0.1×SSC中洗涤滤器。严紧杂交条件为至少与如上述典型条件一样严紧的杂交条件。其他严紧杂交条件为本领域所公知，也可用来鉴定本发明该特定实施方案的核酸。
编码本发明的蛋白和多肽的核酸在许多实施方案中为DNA，包括cDNA。本发明中用到的术语“合成I型干扰素受体多肽激动剂核酸”指编码特定所述多肽的开放阅读框，以及涉及表达调控的邻近5′和3′端的非编码核苷酸序列，如超出编码区域约100bp直到约20kb，但可能在任一方向。所述核酸可被引入适合的载体进行染色体外维持或整合到宿主基因组中，对此下文有较为详细的描述。
本发明的核酸组合物可编码本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂的全部或部分。来自该DNA序列的双链或单链片段可依据常规方法通过化学合成寡核苷酸、通过限制性酶消化、聚合酶链式反应(PCR)扩增等得到。
在一些实施方案中，所述核酸通过化学合成制备，如使用寡核苷酸合成仪，其中寡核苷酸是基于期望的多肽氨基酸序列设计的，在很多实施方案中，选择那些要在其中产生重组多肽的宿主细胞中偏爱的密码子。例如，编码期望多肽各部分的几个小寡核苷酸可由PCR、连接或连接链式反应(LCR)合成并装配。单个寡核苷酸典型地包含用于互补装配5′或3′突出物。一旦装配后，编码所述多肽的核苷酸序列被插入重组载体并可操作地连接到表达所述核酸所需的控制序列，随后在期望的转化的宿主细胞中生成本发明的多肽。
在一些实施方案中，所生成的核酸中至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的密码子中为人序列中偏爱的密码子。例如，参见下文中表8。
所述核酸分子通常置于载体中进行扩增。病毒或非病毒载体是常用的，包括质粒。质粒的选择依赖于需要扩增细胞的类型及扩增的目的。某些载体可用于扩增和生产大量的期望的DNA序列。
本发明进一步提供了包含所述多聚核苷酸的重组载体(“构建体”)。重组载体包括用于扩增本发明多聚核苷酸的载体以及表达载体。重组载体用于扩增所述多聚核苷酸(克隆载体)。所述重组表达载体用于在细胞中有效表达所述多聚核苷酸，如生成本发明合成I型干扰素受体多肽激动剂。适合载体的选择为本领域技术人员所熟知。许多这样的载体可从市场上获得。
表达载体适合在培养基中的细胞中表达。这些载体通常包括调控序列(“控制序列”或“控制区”)，该序列可操作地连接到所述多聚核苷酸上，并且为有效表达所述多聚核苷酸所必需。尽管如此，还有其他载体适于在整个生物体或人细胞中翻译和表达。
表达载体通常具有位于启动子序列附近的适宜的限制位点，使得可插入编码异种蛋白的核酸序列。在表达宿主中可存在有效的选择标记。表达载体可用于生成融合蛋白，其中外源融合肽提供了附加的功能，即增强蛋白合成、稳定性、与特定免疫血清的反应性、酶标记，如β-半乳糖苷酶、荧光素酶等。
可制备包括转录起始区、启动子区(如在真核细胞中起作用的启动子)、所述多聚核苷酸和转录终止区的表达盒。引入DNA后，包含构建体的细胞可通过可选择标记进行选择，所选细胞被扩增，随后用于表达。
表达盒可被引入各种载体，如质粒、BAC、HAC、YAC、噬菌体(如λ、P1、M13等)、动物或植物病毒等，其中，载体的一般特征为提供了选择包含表达载体的细胞的能力。载体可提供为染色体外维持，尤其是质粒或病毒，或被整合到宿主基因组中。当需要染色体外维持时，为质粒的复制提供起始序列，质粒可为低或高拷贝数。可获得很多种标记用于选择，尤其是针对毒素提供保护的标记，特别为抗生素。被选定的特定标记是根据宿主的特性选择的，其中某些情况下，可采用与营养缺陷型宿主互补。可运用任一简便方法，如接合、细菌转化、钙沉淀DNA、电穿孔法、融合、转染、病毒载体感染、生物弹射击法等，将DNA构建体引入宿主细胞中。
哺乳动物细胞宿主体系转化的主要方面已由Axel在1983年8月16日出版的第4,399,216号美国专利中描述。转化酵母可典型地根据下文中的方法实现：Van Solingen et al.，J.Bact.，130：946(1977)和Hsiaoet al.，Proc。Natl.Acad.Sci.(USA)，76：3829(1979)。磷酸钙转染真核宿主细胞的优化方法由Wurm和Jordan在第5,484,720和5,593,875号美国专利中描述。然而将DNA引入细胞的其他方法(如核注射、电穿孔法或原生质体熔合)也会用到。
本发明进一步提供了遗传修饰的宿主细胞，该细胞可能是分离的宿主细胞，其包含所述多聚核苷酸，或在一些实施方案中包含所述的表达载体。适合的宿主细胞包括原核细胞(如E.coli，B.subtilis)和真核细胞，包括与杆状病毒结合的昆虫细胞；酵母细胞(如Saccharomycescerevisiae)；或高等生物的细胞，如脊椎动物，包括两栖动物(如有爪蟾蜍卵母细胞)和哺乳动物的细胞，尤其是哺乳动物细胞如COS细胞、CHO细胞、HEK293细胞、MA-10细胞等可被用作表达宿主细胞。宿主细胞可被用于扩增所述多聚核苷酸，以生成本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂。在许多实施方案中，宿主细胞为真核宿主细胞。特别是在很多实施方案中，宿主细胞为可以糖基化蛋白的真核宿主细胞。
用于生成本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂的哺乳动物宿主细胞可在多种培养基中培养。可购得的培养基，如Ham’s F10(Sigma)、最小必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和杜伯科氏改良的伊格尔氏培养基(DMEM)，适合培养宿主细胞。此外，以下文献中描述的任一种培养基可用作宿主细胞的培养基：Ham andWallace，Meth.Enz.，58：44(1979)；Barnes and Sato，Anal Biochem.，102：255(1980)；第4,767,704、4,657,866和4,927,762号美国专利；或第4,560,655号美国专利；WO 90/03430；WO 87/00195；第30,985号美国再版专利；或第5,122,469号美国专利，将它们的公开内容通过参考并入本文。这些培养基任一种在必要时可添加：激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷(如腺苷和胸腺嘧啶核苷)、抗生素(如GentamicinTM药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔级终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能量源。一些其他必需添加剂也会以合适的浓度添加，该浓度为本领域技术人员所公知。培养条件，如温度、pH等，为之前用于所选择的表达宿主细胞的那些条件，是普通技术人员公知的。
抗体组合物
本发明还提供了特异地结合于本发明中合成I型干扰素受体多肽激动剂的抗体。适合的抗体通过用肽免疫宿主动物得到，该肽包含所述蛋白的全部或部分。适合的宿主动物包括小鼠、大鼠、绵羊、山羊、仓鼠和兔子等。在很多实施方案中，所述抗体可被分离，并且在许多实施方案中所述抗体可被纯化。
免疫原可包括完全蛋白、或其片段和衍生物。示例性的免疫原包括所述蛋白的全部或部分，这些残基包含天然目标蛋白中发现的翻译后修饰。免疫原可由本领域公知的多种方法制备，如用常规重组方法表达克隆基因、化学合成法合成I型干扰素受体多肽激动剂的多肽等。
对于制备多克隆抗体，第一步用目标蛋白免疫宿主动物，其中目标蛋白优选相当纯的形式，包含少于1％的杂质。免疫原可包括完全目标蛋白、其片段或衍生物。为增强宿主动物的免疫反应，目标蛋白可与佐剂结合，其中适合的佐剂包括明矾、葡聚糖、硫酸盐、大聚合阴离子、油和水乳状液，如弗氏佐剂、弗氏完全佐剂等。目标蛋白也可被偶联到合成载体蛋白或合成抗原上。多种宿主可被免疫以生成多克隆抗体。这些宿主包括兔子、豚鼠、啮齿动物如小鼠、大鼠、绵羊和山羊等。目标蛋白通常以初始剂量皮内注入宿主，随后注入一份或更多(通常至少两份)的追加激发剂量。免疫之后，收集宿主的血液，随后从血细胞中分离血清。生成的抗血清中存在的Ig可用公知方法(如铵盐分级分离、DEAE层析法等)进一步分离。
单克隆抗体通过常规技术产生。通常，被免疫宿主动物的脾脏和/或淋巴结提供了浆细胞源。浆细胞通过与骨髓瘤细胞融合生成杂交瘤细胞而无限增殖。运用标准技术筛选单个杂交瘤细胞的培养基上清，以鉴定那些产生具有期望的特异性的抗体的单个杂交瘤细胞。生产针对人蛋白的单克隆抗体的适合的动物包括小鼠、大鼠和仓鼠等。为了收集针对小鼠蛋白的抗体，适合的动物通常为仓鼠、豚鼠和兔子等。抗体可通过常规技术(如运用结合在不溶载体上的蛋白的亲和层析、蛋白A琼脂糖凝胶等)从杂交瘤细胞上清或腹水液中纯化。
抗体可以以单链产生，而不是通常的多聚体结构。单链抗体的描述见于Jost et al.(1994)J.Biol.Chem.269：26267-73和其他文献。编码重链可变区和轻链可变区的DNA序列被连接到编码至少约4个小的中性氨基酸(包括甘氨酸和/或丝氨酸)的间隔区。由这些融合体编码的蛋白使得能组装保留了原始抗体特异性和亲和性的功能可变区。
在某些实施方案中也研究了人源化抗体。人源化抗体的方法是本领域公知的。人源化抗体可以是具有转基因人免疫球蛋白恒定区基因的动物的产物(例如见国际专利申请WO 90/10077和WO 90/04036)。作为选择，目标抗体可通过重组DNA技术用相应的人序列替换CH1、CH2、CH3、铰链区和/或框架结构域(framework domain)来进行设计(见WO 92/02190)。
Ig cDNA在嵌合免疫球蛋白基因中的应用在本领域是公知的(Liuet al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3439以及(1987)J.Immunol.139：3521)。mRNA可从产生抗体的杂交瘤细胞或其他细胞中分离，并被用来产生cDNA。目标cDNA可应用特定的引物通过聚合酶链式反应进行扩增(第4,683,195和4,683,202号美国专利)。作为选择，生成基因库并进行筛选来分离目标序列。编码抗体可变区的DNA序列被融合到人恒定区序列。人恒定区基因序列可在Kabat et al.(1991)，Sequence of Proteins of Immunological Interest(免疫上关注的蛋白的序列)，N.I.H.出版号91-3242。人C区基因可容易地从已知克隆中得到。同种型的选择可根据期望的效应子作用(如补体给合或抗体依赖的细胞毒性的活性)进行。典型的同种型为IgG1、IgG3和IgG4。可采用任一人轻链恒定区κ或λ。嵌合的人源化抗体可通过常规方法表达。
抗体片段，如Fv、F(ab′)2和Fab，可通过裂解完整蛋白(如通过蛋白酶或化学裂解)而制备。作为选择，设计截短的基因。例如，编码一部分F(ab′)2的嵌合基因包括编码CH1和H链铰链区的DNA序列，接着是翻译终止密码子，以产生截短的分子。
H和L J区的共有序列可被用于设计作为引物的寡核苷酸，以将有效的限制性位点引入J区，以便随后将V区片段连接到人C区片段。C区cDNA可通过定点诱变将限制性位点放在人序列的相似位点。
表达载体包括质粒、逆转录病毒、YACs和EBV衍生的游离基因等。便捷的载体编码功能完全的人CH或CL免疫球蛋白序列，设计有合适的限制性位点，以便任何VH或VL序列可容易地插入和表达。在这些载体中，拼接通常发生在嵌入的J区剪接供体位点和人C区之前的剪接受体位点之间，也发生在人CH外显子内的剪接区。
多腺苷酸化和转录终止发生在编码区下游的天然染色体位点。合成的嵌合抗体可被连接到任何强启动子，包括逆转录病毒LTRs，如SV-40早期启动子(Okayama et al.(1983)Mol.Cell.Bio.3：280)，劳斯肉瘤病毒LTR(Gorman et al.(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：6777)和莫洛尼(氏)小鼠白血病毒LRT(Grosschedl et al.(1985)Cell 41：885)以及天然Ig启动子等。
诊断用途
本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂是独特的研究试剂，可以提供I型干扰素活性模板用于化学库筛选，其中专业人员可用信号转导分析法进行初始、高通量筛选，以发现抑制类似于本发明合成I型干扰素受体多肽激动剂的I型干扰素活性模式的一大批I型干扰素活性的试剂。这样，可容易获得可能抑制广谱I型干扰素活性(类似于本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂的活性)的候选试剂，避免了极昂贵的和经济上不能完成的大量的基于大量化学库的病毒生长抑制分析或细胞增殖抑制分析。
在一个实施方案中，本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂用于在激酶受体激活(KIRA)分析法中筛选化学库，如WO 95/14930(公布于1995年6月1日)中所描述的。KIRA分析法适于应用在本发明中，因为配体在表达受体的宿主细胞表面原位结合I型干扰素受体复合物引发了受体的IFNAR1和IFNAR2组分的细胞内结构域酪氨酸残基磷酸化的快速增长(见Platanias and Colamonici，J.Biol.Chem.，269：17761-17764(1994))。酪氨酸磷酸化作用的水平可被用于测量信号转导。基于KIRA分析法，库化合物对本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂引起的酪氨酸磷酸化水平的影响表示了该化合物对一大批I型干扰素的抑制活性，而该I型干扰素由本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂所模拟。
适于应用在本发明中的KIRA分析法使用了：(a)表达I型干扰素受体(受体的IFNARl和IFNAR2组分)的宿主细胞；和(b)本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂，其限定了目的抑制剂的特性。可采用天然表达I型干扰素受体的细胞，如描述在Colamonici and Domansld，J.Biol.Chem.268：10895-10899(1993)中的人Daudi细胞和U-226人骨髓瘤细胞。此外，可采用被IFNAR1和IFNAR2组分转染并包含I型干扰素信号转导所需的细胞内信号蛋白的细胞，如在Domanski et al.，J.Biol.Chem.，270：21606-21611(1995)中描述的小鼠L-929细胞。在KIRA分析法中，候选拮抗剂与本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂一起孵育，并使孵育混合物与表达I型干扰素受体的宿主细胞接触。上述处理过的细胞被溶解，细胞溶解物中的IFNAR2蛋白被固相抗IFNAR2的抗体捕获。信号转导通过测量存在于捕获的IFNAR2的细胞内结构域(ICD)的酪氨酸磷酸化的量和任何存在于协同捕获的IFNAR1的细胞内结构域的酪氨酸磷酸化的量来分析。作为选择，细胞溶解和免疫沉淀反应可在变性条件下进行，以避免IFNAR1的协同捕获和有可能单独测量IFNAR2的酪氨酸磷酸化作用，如在Platanias etal.，J.Biol.Chem.，271：23630-23633(1996)中所描述的。酪氨酸磷酸化的水平可用标记的抗磷酸酪氨酸抗体(其鉴定磷酸化的酪氨酸残基)进行准确测量。
在另一实施方案中，在KIRA分析法中采用共表达IFNAR1的细胞和包含IFNAR2的嵌合构建体，其中IFNAR2在其羧基端融合到亲和处理多肽。嵌合IFNAR2构建体能通过应用对亲和处理多肽特异的固相捕获剂(代替抗IFNAR2的抗体)捕获细胞溶解物的该构建体。在优选实施方案中，亲和处理多肽为单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus)糖蛋白D(gD)，捕获剂为抗gD的单克隆抗体，如WO 90/14930的实施例2和3中所描述的。
在该体系中，本发明的具有感兴趣的I型干扰素活性特征的合成I型干扰素受体多肽激动剂被用作分析由被筛选的化学库中的成员产生的酪氨酸磷酸化抑制模式的标准。将由合成I型干扰素受体多肽激动剂标准产生的IFNAR2 ICD酪氨酸磷酸化模式与库化合物中存在的标准产生的酪氨酸磷酸化作用模式进行比较，表明抑制酪氨酸磷酸化的模式鉴别候选试剂，该试剂可能抑制一系列I型干扰素活性，该活性类似于所述标准模拟地I型干扰素活性谱。因此，本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂提供了一种有效的方法，该方法可快速有效地筛选大量化学库化合物，已发现可能抑制特定的由本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂所显示出的I型干扰素特定活性谱。
另外，本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂可用于对特定细胞或组织中I型干扰素受体表达进行诊断分析。在这些分析中，本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂被标记(如下描述)和/或固定在不溶基质上，其使得能检出样品中的I型干扰素受体。
本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂用于任一公知的诊断分析方法中，以检出I型干扰素受体。例如，可对生物样品分析I型干扰素受体，其包括从期望的来源获得样品，将本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂与样品混和，使得本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂与混合物中的I型干扰素受体形成激动剂/I型干扰素受体复合物，然后检测混合物中的激动剂/I型干扰素受体复合物。通过本领域公知的适于特定样品的方法来制备用于分析的生物样品。可根据使用的分析法种类来选择本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂与样品混和的方法和检测激动剂/I型干扰素受体复合物的方法。这些分析法包括竞争性和夹心分析法以及立体抑制分析法。竞争性和夹心方法运用相分离步骤作为该方法的组成部分，而立体抑制分析法在单一反应混和物中进行。
所有I型干扰素受体的分析方法应用一种或几种如下试剂：标记的I型干扰素受体类似物、固定的I型干扰素受体类似物、标记的I型干扰素受体多肽激动剂、固定的I型干扰素受体多肽激动剂和立体偶联物。标记的试剂也被认为是“示踪剂”。
所用的标记具有任何可检出的功能，其不干扰I型干扰素受体与本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂的结合。已知的许多标记用在免疫测定中，这方面的例子包括可被直接检测出的部分，如荧光染料、化学发光的和放射性的标记，以及必须通过反应或衍生才可被检测出的部分，如酶。这些标记的实例包括放射性同位素32p、14C、125I、3H和131I、荧光染料如稀土螯合物或荧光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、丹酰、伞形酮、荧光素酶如虫荧光素酶和细菌荧光素酶(第4,737,456号美国专利)、荧光素、2,3-二氢邻苯二甲酰肼、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酯酶、β-半乳糖苷酶、葡糖糖化酶、溶菌酶、糖氧化酶(如葡糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，这些酶与使用过氧化氢氧化染色前体的酶偶合，如HRP、乳过氧物酶或微过氧化物酶)、生物素/抗生物素蛋白、自旋标记物、噬菌体标记物、稳定的自由基等。
可用常规方法将这些标记共价地结合到蛋白或多肽上。例如，诸如二醛、碳化二亚胺、二顺丁烯二酰亚胺、双酰亚胺酯、双偶氮联苯胺等的偶合试剂可用于将抗体标记上上述荧光的、化学发光的和酶标记物。这方面的例子如第3,940,475(荧光测定)和3,645,090(酶)号美国专利；Hunter et al.，Nature，144：945(1962)；David et al.，Biochemistry，13：1014-1021(1974)；Pain et al.，J.Immunol.Methods，40：219-230(1981)；和Nygren，J.Histochem.and Cytochem.，30：407-412(1982)。本发明优选标记为酶，如辣根过氧化物酶和碱性磷酸酯酶。
将这些标记(包括酶)偶联到抗体对免疫测定技术领域的普通技术人员来说是标准操作过程。这方面的例子见于O′Sullivan等人的文章“Methods for the Prepartion of Enzyme-antibody Conjugates for Use inEnzyme Immunoassay(制备用于酶免疫测定的酶-抗体偶联物的方法)”，in Methods in Enzymology，ed.J.J.Langone and H.Van Vunakis，Vol.73(Academic Press，New York，N.Y.，1981)，pp.147-166)。
某些分析方法需要试剂的固定。固定伴随着合成I型干扰素受体多肽激动剂与游离在溶液中的I型干扰素受体的分离。这通常可通过在分析步骤之前降低合成I型干扰素受体多肽激动剂或I型干扰素受体类似物的可溶性进行，如通过吸附到水不溶基质或表面上(Bennich等，第3,720,760号美国专利)、通过共价偶合(如应用戊二醛交联)，或可在分析步骤之后通过降低合成I型干扰素受体多肽激动剂或I型干扰素受体类似物的可溶性(如通过免疫沉淀反应)来进行。
诸如竞争性或夹心分析法的其他分析方法，已完善建立并广泛应用于商业诊断产业。
竞争性分析法依赖于示踪剂I型干扰素受体类似物与测试样品I型干扰素受体对有限的合成I型干扰素受体多肽激动剂结合位点的竞争能力。合成I型干扰素受体多肽激动剂通常在竞争前或竞争后是不溶的，这样，结合在合成I型干扰素受体多肽激动剂上的示踪剂和I型干扰素受体就可与未结合的示踪剂和I型干扰素受体分开。这种分离的进行通过沉淀法(其中结合配偶体是预先沉淀的)或通过离心法(其中结合配偶体在竞争反应后被沉淀出)。测试样品I型干扰素受体的量反比于结合示踪剂的量(通过标记物质的量来测定)。可以制备已知I型干扰素受体量的剂量-效应曲线并将其与定量测得的测试样品中I型干扰素受体的量进行比较。当酶被用作测定标记时，这些分析法称为ELISA系统。
另外的竞争性分析法，“同质”分析法，不需要相分离。其中，可制备和应用酶与I型干扰素受体的合成物，使得当I型干扰素受体多肽激动剂结合到I型干扰素受体时，存在的合成I型干扰素受体多肽激动剂修饰酶的活性。这样的话，I型干扰素受体或其免疫活性片段通过双功能有机桥被偶联到酶，如过氧化物酶。偶联物被选择与合成I型干扰素受体多肽激动剂一起使用，以至于合成I型干扰素受体多肽激动剂的结合可抑制或加强标记的酶活性。这种方法本身以EMIT的命名被广泛应用。
立体偶联物应用于同质分析的立体位阻方法。这些偶联物可通过将小分子量半抗原结合到小的I型干扰素受体片段上来合成，这样半抗原的抗体不能与合成I型干扰素受体多肽激动剂同时充分地结合偶联物。在这种分析过程中，测试样品中的I型干扰素受体结合合成I型干扰素受体多肽激动剂，从而，使得抗半抗原结合到偶联物上，导致了偶联物半抗原的性质变化，如当半抗原为荧光团时的荧光变化。
夹心分析法特别应用于样品中I型干扰素受体的测定。在顺序夹心分析法中，固定的合成I型干扰素受体多肽激动剂用于吸收测试样品中I型干扰素受体，测试样品通过洗涤除去，结合的I型干扰素受体用于吸附标记的抗I型干扰素受体抗体，接着将结合的材料与残余的示踪剂分离。结合的示踪剂的量正比于测试样品中I型干扰素受体。在“同时”夹心分析法中，测试样品在加入标记的抗I型干扰素受体抗体之前不被分离出。
前面所述仅仅是I型干扰素受体的典型诊断分析法。本发明也包括现在或将来开发的应用合成I型干扰素受体多肽激动剂测定I型干扰素受体的其他方法，包括上述生物分析法。
治疗方法
本发明提供了治疗纤维化病症的方法。所述方法主要涉及向有需要的个体给予本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂的有效组合。在一些实施方案中，所述治疗方法进一步包括给予至少一种其它的抗纤维化剂。
本发明进一步提供了治疗癌症的方法。所述方法主要涉及向有需要的患者给予有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体。在一些实施方案中，所述方法进一步包括给予至少一种其它的抗癌剂。
本发明还提供了治疗病毒感染的方法。所述方法主要涉及向有需要的患者给予有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体。在一些实施方案中，所述方法进一步包括给予至少一种其它的抗病毒剂。
在一些实施方案中，所述治疗方法进一步包括给予副作用控制药剂，以处理由治疗剂引起的副作用。
纤维化病症
本发明提供了治疗具有纤维化病症的个体的纤维化病症的方法。所述方法主要涉及给予本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II干扰素受体激动剂。所述方法提供了对纤维化疾病的治疗，包括那些影响肺部的纤维化疾病，如特发性肺纤维化、由已知病因引起的肺纤维化；肝纤维化或肝硬化；心脏纤维化和肾脏纤维化。病因可能是由于急性的或慢性的损伤，包括有毒的、代谢的、遗传的和传染性的因素。
纤维化通常以病理性或过多地积聚胶原性的结缔组织为特征。纤维化病症包括，但不限于：胶原病、间质性肺病(interstitial lung disease)、人纤维化肺病(如闭塞性细支气管炎、特发性肺纤维化、由已知病因引起的肺纤维化、肺病中的肿瘤基质、影响肺的全身性硬化、赫-普二氏综合症(Hermansky-Pudlak syndrome)、煤肺尘症、石绵沉着病、硅肺病、慢性肺动脉高血压症、艾滋病相关的肺动脉高血压症和肉状瘤病等)、纤维化脉管病、动脉硬化、动脉粥样硬化、曲张静脉、冠状梗塞、脑梗塞、心肌纤维化、肌骨骼纤维化、术后粘连、人肾病(如肾脏综合症、阿尔波特综合症(Alport’s syndrome)、HIV相关的肾病、多囊肾病、法布里氏病(Fabry’s disease)、糖尿病性肾病变、慢性血管球性肾炎、与全身性狼疮相关的肾炎等)、皮肤瘢痕瘤形成、进行性全身性硬化(PPS)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、肝纤维化、肝硬化、肾纤维化、肺纤维化、囊性纤维化、慢性移植物抗宿主病、硬皮病(局部和全身)、格雷夫斯氏病(Grave’s opthalmopathy)、糖尿病性视网膜病、青光眼、佩罗尼氏病(Peyronie’s disease)、阴茎纤维化、用膀胱镜检测后的尿道狭窄、手术后的内增生、瘢痕形成、骨髓纤维变性、特发性腹膜后纤维化、由已知病因引起的腹膜纤维化、药物诱导的麦角中毒、伴随良性或恶性肿瘤的纤维化、伴随微生物感染(如病毒的、细菌的、寄生虫的、真菌的等)的纤维化、阿耳茨海默氏病、伴随炎症性肠病(包括克罗恩病和显微大肠炎中狭窄形成)的纤维化、由化学或环境损害引起的纤维化(如癌症化学疗法、杀虫剂、辐射(如癌症放疗)等)等。
在一些实施方案中，有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂和II型干扰素受体激动剂为任一组合剂量，当给予纤维化病症个体时，与该个体治疗前纤维化程度相比或与患者不治疗时纤维化的进展速率相比，该剂量可有效减少纤维化或减少纤维化进展速率至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多。
在一些实施方案中，有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II干扰素受体激动剂为任一组合剂量，当给予纤维化病症个体时，与个体治疗前器官功能的基准水平相比或与个体不治疗时器官功能的恶化速率相比，该剂量可有效增加或减少受纤维化影响的器官(如肺、肝、肾等)的至少一种功能的恶化速率至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多。
测定给定器官纤维化程度的方法和测定任一给定器官功能的方法为本领域所熟知。
特发性肺纤维化
本发明提供了治疗特发性肺纤维化(IPF)的方法。所述方法主要涉及给予IPF个体有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂。
在一些实施方案中，对IPF的诊断通过在外科活检得到的肺组织上组织病理学评价中发现常规间质性肺炎(UIP)来确认。IPF的诊断标准是已知的。Ryu et al.(1998)Mayo Clin.Proc.73：1085-1101。
在其他实施方案中，IPF的诊断是通过高分辨率计算机断层照相(HRCT)得到确诊的或诊断为可能的IPF。在通过HRCT的诊断中，注意如下特征的存在：(1)出现基部或外周显著的网状异常和/或牵拉性细支气管扩张；(2)出现基部或外周显著的蜂窝样；(3)缺乏非典型性特征，如微结(micronodule)、支气管血管外周结、固结、分离的(非蜂窝样)囊肿、毛玻璃状弱化(ground glass attenuation)(或，如果存在的化，小于网状不透光范围(reticular opacity))和纵隔腺病(或，如果存在的化，其范围在胸部X射线中不可见)。确诊的IPF的诊断可用在出现(1)、(2)和(3)的特征时。可能的IPF的诊断可用在出现(1)和(3)的特征时。
在一些实施方案中，“有效量的”本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂为组合剂量，与安慰对照或未治疗对照相比，该剂量可有效减少疾病进展至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或更多。
疾病进展为发生如下一种或几种情况：(1)预测的FVC减少10％或更多；(2)A-a梯度增加5mm Hg或更多；(3)单呼吸DLco减少15％或更多。疾病进展是否发生的确定通过在相隔4至14周的两个连续时刻测定这些参数中的一种或几种，并与基线值相比较。
这方面的例子如：当未治疗或安慰剂治疗的个体在一段时期表现出减少50％FVC时，给予合成I型干扰素受体多肽激动剂和II型干扰素受体激动剂的有效组合的个体在同一时期表现为FVC减少45％、约42％、约40％、约37％、约35％、约32％、约30％或更少。
在一些实施方案中，“有效量的”本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂为任一组合剂量，与安慰剂治疗或未治疗对照个体相比，该剂量有效增加无进展存活时间，如从基线(如开始治疗前1天至28天的时间点)到死亡或疾病进展的时间增加至少约10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、3倍、4倍、5倍或更多。这方面的例子如：在一些实施方案中，有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂为任一组合剂量，与安慰剂治疗或未治疗对照相比，该剂量有效增加无进展存活时间至少约1周、2周、3周、4周、2月、3月、4月、5月、6月、8月、10月、12月、18月、2年、3年或更长。
在一些实施方案中，有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂为任一组合剂量，与未治疗个体或安慰剂治疗对照个体相比，该剂量有效增加至少一种肺功能参数，如组合剂量增加至少一种肺功能参数至少约10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、3倍、4倍、5倍或更多。在一些这样的实施方案中，确定肺功能参数是否增加通过将基线值与开始治疗后的任一时间点的值相比，如开始治疗后48周，或比较开始治疗后的在两个时间点，如相隔约4至14周。
在一些实施方案中，有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂为任一组合剂量，与基线相比，该剂量在相隔4至14周的两个连续时间点有效增加FVC至少约10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、3倍、4倍、5倍或更多。
在一些实施方案中，有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂为任一组合剂量，与基线相比，该剂量导致肺泡的：动脉的(A-a)梯度减少至少约5mm Hg、7mmHg、10mm Hg、12mm Hg、15mm Hg或更多。
在一些实施方案中，有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂为任一组合剂量，与基线相比，该剂量增加单呼吸DLeo至少约15％、20％、30、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、3倍、4倍、5倍或更多。CLco是对一氧化碳的肺扩散量，表示为mL CO/mm Hg/秒。
肺功能参数包括但不局限于用力肺活量(FVC)、用力呼气量(FEV1)、总的肺容量、静止动脉氧分压和最大用力动脉氧分压。
肺功能可用任一公知方法测定，包括但不局限于肺活量测定法。肝纤维化
本发明提供了治疗肝纤维化的方法，包括减少临床肝纤维化、减少肝纤维化发生的可能性和减小与肝纤维化有关的参数。该方法主要涉及给予有需要的个体有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂的组合。在许多实施方案中特别关注人的治疗。
肝纤维化是与肝硬化有关的并发症的先兆，如门静脉高血压、进行性肝功能不全和肝细胞癌。减少肝纤维化就可以减少这些并发症的发病率。因此，本发明还提供了减少患者产生与肝硬化有关的并发症的可能性的方法。
本发明的方法主要涉及给予治疗有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂。用在此处时，“有效量的”本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂为任一组合剂量，该剂量有效减少肝纤维化或减小肝纤维化的进展速率，和/或该剂量有效减少个体发生肝纤维化的可能性，和/或该剂量有效减小与肝纤维化有关的参数，和/或该剂量可有效减少与肝硬化有关的病症。
本发明还提供了治疗个体肝纤维化的方法，包括给予个体一定量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂，它们的组合有效预防或治疗个体肝纤维化，如增加存活的可能性、减少死亡的风险、改善疾病的负担或减慢个体疾病的进展。
以本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂的组合进行的治疗是否对减少肝纤维化有效由多种测定肝纤维化和肝功能的成熟方法中的任一种来确定。肝纤维化是否减少通过分析肝活检样品来确定。肝活检分析法包括两个主要成分的评估：通过“级别”评估的坏死炎症(necroinflammation)，该“级别”为对严重性和正在进行的疾病活度的测定，和通过“阶段”评估的纤维化损伤和实质(parenchymal)或脉管改型，该“阶段”反映了长期疾病进展。例如，参见Brunt(2000)Hepatol.31：241-246和METAVIR(1994)Hepatology 20：15-20。基于肝活检可确定得分。存在许多标准的得分系统，它们提供了对纤维化的程度和严重性的定量评定。这些系统包括METAVIR、Knodell、Scheuer、Ludwig和Ishak得分系统。
METAVIR得分系统基于分析肝活检的多种特征，包括纤维化(门静脉纤维化、小叶中心纤维化和硬化)、坏死(碎片状和小叶坏死、嗜酸性回缩和气球样变性)、炎症(门静脉束炎症、门静脉淋巴聚集和门静脉炎症分布)、胆管变化和Knodell指数(为门脉周坏死、小叶坏死、门静脉炎症、纤维化和全部疾病活度的得分)。METAVIR系统的每一阶段定义如下：得分0，没有纤维化；得分1，门静脉束星形放大，但没有隔膜形成；得分2，门静脉束放大，并有稀少隔膜形成；得分3，许多隔膜，没有硬化；得分4，硬化。
Knodell得分系统，也称为肝炎活度指数(Hepatitis Activity Index)，基于四种组织学特征的得分来分类样品：I、门脉周和/或桥接坏死；II、小叶内变性和病灶性坏死；III、门静脉炎症；和IV、纤维化。在Knodell分级系统中，得分如下：得分0，没有纤维化；得分1，轻微纤维化(纤维性门静脉扩张)；得分2，中等纤维化；得分3，严重纤维化(桥接纤维化)；得分4，硬化。得分越高，肝组织损伤越严重。Knodell(1981)Hepatol.1：431。
在Scheuer得分系统中，得分如下：得分0，没有纤维化；得分1，扩大的纤维性门静脉束；得分2，门脉周或门静脉之间的隔膜，但结构完整；得分3，具有结构变形的纤维化，但无明显的硬化；得分4，可能的或确诊的硬化。Scheuer(1991)J.Hepatol.13：372。
Ishak得分系统在Ishak(1995)J.Hepatol.22：696-699中有描述。阶段0，没有纤维化；阶段1，一些门静脉区的纤维性扩张，具有或没有短的纤维性隔膜；阶段2，大部分门静脉区的纤维性扩张，具有或没有短的纤维性隔膜；阶段3，大部分门静脉区的纤维性扩张，具有个别的门静脉-门静脉(P-P)桥接；阶段4，门静脉区的纤维性扩张，具有显著的静脉-门静脉(P-P)桥接和门静脉-中心(P-C)桥接；阶段5，显著的桥接(P-P和/或P-C)，具有个别的节结(不完全硬化)；阶段6，可能的或确诊的硬化。抗纤维化治疗的效果也可通过应用Child-Pugh得分系统进行测定和评估，该系统包括多组分点系统，其基于如下的异常：血清胆红素水平、血清清蛋白水平、凝血酶原时间、腹水的存在和严重性以及脑病的存在和严重性。基于这些参数异常的存在和严重性，患者可被置于临床疾病严重性渐增的三种(A、B或C)中的任一种。
在一些实施方案中，治疗有效的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂的组合为任一组合剂量，基于治疗前和治疗后的肝活检，该剂量导致了纤维化阶段一个单位或更多单位的变化。在特定的实施方案中，治疗有效的组合剂量减少METAVIR、Knodell、Scheuer、Ludwig和Ishak得分系统中肝纤维化至少一个单位。
二级的或间接的肝功能指数也可用于评价本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂的疗效。基于肝纤维化的特异胶原染色和/或血清标志物，形态测量的计算机半自动化的肝纤维化定量程度也可作为本发明治疗方法的疗效指示来测定。肝功能的二级指数包括但不局限于血清转氨酶水平、凝血酶原时间、胆红素、血小板计数、门静脉压、白蛋白水平和Child-Pugh得分评价。
在另一实施方案中，本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂的有效组合为任一组合剂量，与未治疗个体或安慰剂治疗个体的肝功能指数相比，该剂量有效增加肝功能指数至少约10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或更多。本领域的技术人员用标准分析方法可容易地测定这些肝功能指数，这些方法中许多是市售的，并且常规用于临床装置中。
肝纤维化的血清标志物也可作为本发明治疗方法的疗效指示来测定。肝纤维化的血清标志物包括但不局限于：透明质酸盐、N-端前胶原III肽、IV型胶原质的7S结构域、C-端前胶原I肽和层粘连蛋白。肝纤维化的另外的生物标记包括α-2-巨球蛋白、结合珠蛋白、γ球蛋白、脱脂蛋白A(apoliprotein A)和γ谷氨酰转肽酶。
在另一实施方案中，治疗有效的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂的组合为任一组合剂量，与未治疗个体或安慰剂治疗的个体的标志物水平相比，该剂量有效减少肝纤维化标志物的血清水平至少约10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或更多。本领域的技术人员用标准分析方法可容易地测定这些肝纤维化的血清标志物，这些方法中许多是市售的，并且常规用于临床装置中。测定血清标志物的方法包括应用对给定血清标志物特异性的抗体的基于免疫学的方法，如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射性免疫测定等。
定量测定功能性的肝储备(liver reserve)也可用于评价本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂的疗效。这些包括：靛氰绿清除率(ICG)、半乳糖清除量(GEC)、氨基比林呼吸试验(ABT)、安替比林清除率、单乙基甘氨酸-二甲苯胺(MEG-X)清除率和咖啡碱清除率。
本发明所述的“与肝硬化有关的并发症”指代偿失调的肝病的后遗症，即或者肝纤维化后发生和作为肝纤维化发展的结果，包括但不局限于产生腹水、静脉曲张破裂出血、门静脉高血压、黄疸、进行性肝功能不全、脑病、肝细胞癌、需肝移植的肝衰竭和肝相关的死亡。
在另外的实施方案中，治疗有效的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂的组合为任一组合剂量，与未治疗个体或安慰剂治疗的个体相比，该剂量有效减少与肝硬化相关的病症的发生率(如个体发生的可能性)至少约10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或更多。
用本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂的联合治疗是否有效减少与肝硬化相关的病症的发生率可由本领域技术人员容易地测定。
减少肝纤维化增强肝功能。这样，本发明提供了增强肝功能的方法，其主要涉及给予治疗有效组合剂量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂。肝功能包括但不局限于诸如血清蛋白(如白蛋白、凝固因子、碱性磷酸酶、转氨酶(如丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶)、5′-核苷酶、γ谷氨酰胺酰转肽酶等)的蛋白合成、胆红素合成、胆固醇合成和胆酸合成；肝代谢功能，包括但不限于碳水化合物代谢、氨基酸和氨代谢、激素代谢和脂质代谢；外源药物解毒；血液动力学功能，包括内脏和门静脉血液动力学等。
肝功能是否增强可由本领域技术人员用成熟的肝功能检验法容易地确定。这样，肝功能标志物(如白蛋白、碱性磷酸酶、丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、胆红素等)的合成可用标准的免疫学和酶学分析法通过测定血清中这些标志物的水平来评估。内脏循环和门静脉的血液动力学可用标准方法通过门静脉楔形压和/或阻力来测定。代谢功能通过测定血清中氨的水平来测定。
通常由肝分泌的血清蛋白是否处于正常的范围可用标准的免疫学和酶学分析法通过测定这些蛋白的水平来确定。本领域的技术人员知道这些血清蛋白的正常范围。以下是非限定性的例子。丙氨酸转氨酶的正常范围为每升血清约7-56单位。天冬氨酸转氨酶的正常范围为每升血清约5-40单位。胆红素用标准的分析法来测定。正常的胆红素水平通常少于约1.2mg/dL。血清白蛋白的水平用标准的分析法来测定。正常的血清白蛋白的水平为约35-55g/L。凝血酶原时间的延长用标准的分析法来测定。正常的凝血酶原时间与对照相比不长出4秒。
在另一实施方案中，治疗有效的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂的组合为任一组合剂量，该剂量有效增加肝功能至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多。例如，治疗有效的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂的组合包括任一组合剂量，该剂量有效减少肝功能血清标志物升高水平至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多，或减少肝功能血清标志物水平到正常范围内。治疗有效的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂的组合还包括任一组合剂量，该剂量有效增加肝功能血清标志物减少水平至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多，或增加肝功能血清标志物水平到正常范围内。
肾纤维化
本发明提供了治疗肾纤维化的方法。该方法主要涉及给予肾纤维化个体有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂。用在此处时，“有效量的”本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂为任一组合剂量，该剂量有效减少肾纤维化，和/或该剂量可有效减少个体发生肾纤维化的可能性，和/或该剂量可有效减少与肾纤维化相关的病症。
在一个实施方案中，有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂为任一组合剂量，与个体治疗前肾纤维化程度相比或与患者不治疗时纤维化的进展速率相比，该剂量足以减少肾纤维化，或减少肾纤维化的进展速率至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％。
纤维化在肾中是否减少用任一公知方法来确定。例如，对肾活检样品进行ECM沉积程度和/或纤维化的组织化学分析。其他方法在本领域中是公知的。例如，参见Masseroli et al.(1998)Lab.Invest.78：511-522和第6,214,542号美国专利。
在一些实施方案中，有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂为任一组合剂量，与个体治疗前肾功能的基准水平相比，该剂量有效增加肾功能至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％。
在一些实施方案中，有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂为任一组合剂量，与不治疗时肾功能的衰退相比，该剂量可有效减慢肾功能衰退至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％。
肾功能用任一公知分析法测定，包括但不局限于血浆肌酐水平(其中正常水平通常为约0.6-1.2mg/dL)、肌酐清除率(其中肌酐清除率的正常范围对男性为约97-137mL/分钟，对女性为约88-128mL/分钟)、肾小球滤过率(计算或从菊粉清除率或从其他方法获得)、血液尿素氮(其中正常范围为约7-20mg/dL)以及尿蛋白水平。
其它的抗纤维变性试剂
任一上述针对纤维化病症的联合治疗可被修改为包括一种或多种抗纤维化剂的共给药。因此，本发明提供了治疗纤维化病症的方法，主要涉及在与至少一种其它抗纤维化剂的联合疗法中给予本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂。适合的其它抗纤维化剂包括但不局限于SAPK抑制剂(如比非尼酮或吡非尼酮类似物)、TNF拮抗剂、TGF-β拮抗剂和内皮素受体拮抗剂等。
作为非限定性的例子，有效治疗患者纤维化病症的任一上述治疗方法(以本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂的组合剂量治疗为特征)可被修改为包括以一定量的SAPK抑制剂(如吡非尼酮或吡非尼酮类似物)向患者共给药，该SAPK抑制剂的量在期望的治疗期内有效增加合成I型干扰素受体多肽激动剂和II型干扰素受体激动剂联合治疗的抗纤维化作用。
作为非限定性的例子，有效治疗患者纤维化病症的任一上述治疗方法(以本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂的组合剂量治疗为特征)可被修改为包括以一定量的TNF拮抗剂(如依那西普、英夫利昔单抗(infliximab)或阿达木单抗(adalimumab))向患者共给药，该TNF拮抗剂的量在期望的治疗期内有效增加合成I型干扰素受体多肽激动剂和II型干扰素受体激动剂联合治疗的抗纤维化作用。
作为非限定性的例子，有效治疗患者纤维化病症的任一上述治疗方法(以本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂的组合剂量疗法为特征)可被修改为包括以一定量的TGF-β拮抗剂(如GLEEVEC)向患者共给药，该TGF-β拮抗剂的量在期望的治疗期内有效增加合成I型干扰素受体多肽激动剂和II型干扰素受体激动剂联合治疗的抗纤维化作用。
作为非限定性的例子，有效治疗患者纤维化病症的任一上述治疗方法(以本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂的组合剂量疗法为特征)可被修改为包括以一定量的内皮素受体拮抗剂(如TRACLEER)向患者共给药，该内皮素受体拮抗剂的量在期望的治疗期内有效增加合成I型干扰素受体多肽激动剂和II型干扰素受体激动剂联合治疗的抗纤维化作用。
作为非限定性的例子，有效治疗患者纤维化病症的任一上述治疗方法(以本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂的组合剂量疗法为特征)可被修改为包括以组合剂量的SAPK抑制剂(如吡非尼酮或吡非尼酮类似物)和TNF拮抗剂(如依那西普、英夫利昔单抗或阿达木单抗)向患者共给药，该组合剂量在期望的治疗期内有效增加合成I型干扰素受体多肽激动剂和II型干扰素受体激动剂联合治疗的抗纤维化作用。
作为非限定性的例子，有效治疗患者纤维化病症的任一上述治疗方法(以本发明中的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂的组合剂量疗法为特征)可被修改为包括以组合剂量的SAPK抑制剂(如吡非尼酮或吡非尼酮类似物)和TGF-β拮抗剂(如GLEEVEC)向患者共给药，该组合剂量在期望的治疗期内有效增加合成I型干扰素受体多肽激动剂和II型干扰素受体激动剂联合治疗的抗纤维化作用。
作为非限定性的例子，有效治疗患者纤维化病症的任一上述治疗方法(以本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂的组合剂量疗法为特征)可被修改为包括以组合剂量的SAPK抑制剂(如吡非尼酮或吡非尼酮类似物)和内皮素受体拮抗剂(如TRACLEER)向患者共给药，该组合剂量在期望的治疗期内有效增加合成I型干扰素受体多肽激动剂和II型干扰素受体激动剂联合治疗的抗纤维化作用。
作为非限定性的例子，有效治疗患者纤维化病症的任一上述治疗方法(以本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂的组合剂量疗法为特征)可被修改为包括以组合剂量的TNF拮抗剂(如依那西普、英夫利昔单抗或阿达木单抗)和TGF-β拮抗剂(如GLEEVEC)向患者共给药，该组合剂量在期望的治疗期内有效增加合成I型干扰素受体多肽激动剂和II型干扰素受体激动剂联合治疗的抗纤维化作用。
作为非限定性的例子，有效治疗患者纤维化病症的任一上述治疗方法(以本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂的组合剂量疗法为特征)可被修改为包括以组合剂量的TNF拮抗剂(如依那西普、英夫利昔单抗或阿达木单抗)和内皮素受体拮抗剂(如TRACLEER)向患者共给药，该组合剂量在期望的治疗期内有效增加合成I型干扰素受体多肽激动剂和II型干扰素受体激动剂联合治疗的抗纤维化作用。
作为非限定性的例子，有效治疗患者纤维化病症的任一上述治疗方法(以本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂的组合剂量疗法为特征)可被修改为包括以组合剂量的TGF-β拮抗剂(如GLEEVEC)和内皮素受体拮抗剂(如TRACLEER)向患者共给药，该组合剂量在期望的治疗期内有效增加合成I型干扰素受体多肽激动剂和II型干扰素受体激动剂联合治疗的抗纤维化作用。
作为非限定性的例子，有效治疗患者纤维化病症的任一上述治疗方法(以本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化多的肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂的组合剂量疗法为特征)可被修改为包括以组合剂量的SAPK抑制剂(如吡非尼酮或吡非尼酮类似物)、TNF拮抗剂(如依那西普、英夫利昔单抗或阿达木单抗)和TGF-β拮抗剂(如GLEEVEC)向患者共给药，该组合剂量在期望的治疗期内有效增加合成I型干扰素受体多肽激动剂和II型干扰素受体激动剂联合治疗的抗纤维化作用。
作为非限定性的例子，有效治疗患者纤维化病症的任一上述治疗方法(以本发明中的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体抗蛋白酶的多肽变体或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂的组合剂量疗法为特征)可被修改为包括以组合剂量的SAPK抑制剂(如吡非尼酮或吡非尼酮类似物)、TNF拮抗剂(如依那西普、英夫利昔单抗或阿达木单抗)和内皮素受体拮抗剂(如TRACLEER)向患者给药，该组合剂量在期望的治疗期内有效增加合成I型干扰素受体多肽激动剂和II型干扰素受体激动剂联合治疗的抗纤维化作用。
作为非限定性的例子，有效治疗患者纤维化病症的任一上述治疗方法(以本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂的组合剂量疗法为特征)可被修改为包括以组合剂量的TNF拮抗剂(如依那西普、英夫利昔单抗或阿达木单抗)、TGF-β拮抗剂(如GLEEVEC)和内皮素受体拮抗剂(如TRACLEER)向患者给药，该组合剂量在期望的治疗期内有效增加合成I型干扰素受体多肽激动剂和II型干扰素受体激动剂联合治疗的抗纤维化作用。
作为非限定性的例子，有效治疗患者纤维化病症的任一上述治疗方法(以本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂的组合剂量疗法为特征)可被修改为包括以组合剂量的SAPK抑制剂(如吡非尼酮或吡非尼酮类似物)、TGF-β拮抗剂(如GLEEVEC)和内皮素受体拮抗剂(如TRACLEER)向患者给药，该组合剂量在期望的治疗期内有效增加合成I型干扰素受体多肽激动剂和II型干扰素受体激动剂联合治疗的抗纤维化作用。
作为非限定性的例子，有效治疗患者纤维化病症的任一上述治疗方法(以本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂的组合剂量疗法为特征)可被修改为包括以组合剂量的SAPK抑制剂(如吡非尼酮或吡非尼酮类似物)、TNF拮抗剂(如依那西普、英夫利昔单抗或阿达木单抗)、TGF-β拮抗剂(如GLEEVEC)和内皮素受体拮抗剂(如TRACLEER)向患者给药，该组合剂量在期望的治疗期内有效增加合成I型干扰素受体多肽激动剂和II型干扰素受体激动剂联合治疗的抗纤维化作用。
作为非限定性的例子，有效治疗患者纤维化病症的任一上述治疗方法(以本发明中的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和II型干扰素受体激动剂的组合剂量疗法为特征)，具有或没有一种或几种其它抗纤维化剂的共给药，都可被进一步修改为包括以一定量的N-乙酰半胱氨酸(NAC)向患者共给药，该N-乙酰半胱氨酸的量在期望的治疗期内有效增加该联合治疗的抗纤维化作用。
癌症
本发明提供了治疗增生病症(如癌症)的方法，该方法主要涉及给予有需要的个体有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体。
与适合的对照相比，所述方法有效降低肿瘤生长速率至少约5％、10％、20％、25％、50％、75％、85％、90％，直到完全抑制肿瘤生长。这样，在这些实施方案中，与适合的对照相比，“有效量的”本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的量足以降低肿瘤生长速率至少约5％、10％、20％、25％、50％、75％、85％、90％，直到完全抑制肿瘤生长。在试验动物系统中，适合的对照可以为没有用合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的遗传上相同的动物。在非试验系统中，适合的对照可以为给予合成I型干扰素受体多肽激动剂之前的肿瘤负荷。其他适合的对照可以为安慰剂对照。
肿瘤生长是否被抑制可用任一公知的方法来确定，包括但不局限于如实施例中所述的增生分析、3H-胸腺嘧啶吸收分析等。
所述方法可用于治疗多种癌症，包括恶性肿瘤、肉瘤、白血病和淋巴瘤。
可用所述方法治疗的恶性肿瘤包括但不局限于食管癌、肝细胞癌、基底细胞癌(皮肤癌的一种形式)、鳞状细胞癌(各种组织)、膀胱癌(包括移行细胞癌(膀胱的恶性肿瘤))、支气管癌、结肠癌、结肠直肠癌、胃癌、肺癌(包括肺小细胞癌和非小细胞癌)、肾上腺皮质癌、甲状腺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、肾细胞癌、原位导管癌或胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯氏肿瘤(Wilm’stumor)、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、骨源性癌、上皮癌和鼻咽癌等。
可用所述方法治疗的肉瘤包括但不局限于纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、骨源性肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管成内皮细胞瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤(Ewing’s sarcoma)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤和其他软组织肉瘤。
可用所述方法治疗的其他实体瘤包括但不局限于神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、间胶质瘤、脑膜瘤(meningioma)、黑色素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。
可用本方法治疗的白血病包括但不局限于a)慢性骨髓增生综合征(多能造血干细胞的瘤性病)；b)急性骨髓白血病(多能造血干细胞或限制了谱系潜能的造血细胞的瘤性转化)；c)慢性淋巴细胞白血病(CLL；免疫不成熟的和功能不全的小淋巴细胞的克隆样增殖)，包括B细胞CLL、T细胞CLL、前淋巴细胞白血病和毛细胞白血病；以及d)急性成淋巴细胞白血病(以成淋巴细胞的积聚为特征)。可用本方法治疗的淋巴瘤包括但不局限于：B细胞淋巴瘤(如伯基特淋巴瘤)和何杰金氏淋巴瘤等。
联合治疗
在一些实施方案中，本发明提供了治疗癌症的联合疗法。因此，本发明提供了治疗癌症的方法，主要涉及在与至少另一种治疗剂的联合疗法中给予本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体。
在其它实施方案中，本发明提供了治疗癌症的方法，涉及给予本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和另一种治疗剂的协同组合。用在此处时，“协同组合”的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和另一种的治疗剂为组合剂量，相比于累加的治疗结果的改进，该剂量可更有效地治疗或预防性处理癌症，其中所述累加的治疗结果可从(i)当以同样剂量作为单一疗法给予本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体时的治疗或预防性益处；(ii)当以同样剂量作为单一疗法给予所述另一种治疗剂时的治疗或预防性益处的简单相加组合而预测或预计。
在一些实施方案中，本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体作为标准癌症疗法中的辅佐疗法来给药。标准癌症治疗法包括外科手术(如手术移除癌症组织)、辐射疗法、骨髓移植、化学疗法治疗、生物反应修饰剂治疗和上述疗法的某些组合。
辐射疗法包括但不局限于X射线或γ射线，它们可由外部施加源输送，如电子束，或可由小的植入的放射性源输送。
化学治疗剂为减少癌细胞增殖的非肽(即非蛋白)化合物，包括细胞毒素和细胞生长抑制剂。化学治疗剂的非限定性例子包括烷基化试剂、亚硝基脲、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、植物(长春花)生物碱和类固醇激素。
减少细胞增殖的试剂为本领域所公知并且广泛应用。这些试剂包括烷基化试剂，如氮芥、亚硝基脲、氮丙啶衍生物、烷基磺酸酯，以及三氮烯类，包括但不限于二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、环磷酰胺(CytoxanTM)、美法仑(L-丙苯氨酸氮芥)、亚硝脲氮芥(BCNU)、环己亚硝脲(CCNU)、甲基环己亚硝脲(甲基-CCNU)、链脲霉素、吡葡亚硝脲、尿嘧啶芥、甲川氯、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、双溴丙基哌嗪、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三亚乙基硫代磷酰胺、白消安、达卡巴嗪(dacarbazine)和替莫唑胺)。
抗代谢物剂包括叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂，包括但不限于阿糖胞苷(CYTOSAR-U)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、氟尿嘧啶(5-FU)、氟脱氧尿苷(FudR)、6-硫鸟嘌呤、6-巯基嘌呤(6-MP)、喷司他丁(pentostatin)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氨甲喋呤、10-炔丙基-5，8-双脱氮叶酸(PDDF，CB3717)、5，8-双脱氮四氢叶酸(DDATHF)、甲酰四氢叶酸、氟达拉宾磷酸盐、喷司他丁和吉西他宾)。
适合的天然产物及其衍生物(如长春花生物碱、抗肿瘤抗生素、酶、淋巴因子和表鬼臼脂素)，包括但不限于Ara-C、太平洋紫杉醇(Taxol)、多烯紫杉醇(Taxotere)、脱氧柯福霉素、丝裂霉素-C、L-天门冬酰胺酶、硝基咪唑硫嘌呤、布喹那；生物碱，如长春新碱、长春花碱、去甲长春花碱、去乙酰长春酰胺等；鬼臼毒素，如足叶乙甙、替尼泊甙等、抗生素，如蒽环类抗生素、柔红霉素盐酸盐(道诺霉素、红比霉素、盐酸红比霉素)、伊达比星(idarubicin)、阿霉素、表柔比星和吗啉代衍生物等；phenoxizone biscyclopeptides，如放线菌素D；碱性糖肽，如博来霉素；蒽醌糖苷，如普卡霉素(光神霉素)；anthracenediones，如米托蒽醌；azirinopyrrolo indolediones，如丝裂霉素)；大环免疫抑制剂，如环孢霉素、FK-506(他克莫司、普乐可复)、雷帕霉素等；等等。
其他抗增生的细胞毒素为navelbene、CPT-11、阿纳司唑、来曲唑、卡培他滨、reloxafine、环磷酰胺、异环磷酰胺和droloxafine。
具有抗增生活性的微管作用试剂也适合使用，其包括但不局限于别秋水仙碱(NSC 406042)、软海绵素B(NSC 609395)、秋水仙碱(NSC757)、秋水仙碱衍生物(如NSC 334l0)、dolstatin 10(NSC 376128)、美登素(NSC 153858)、根霉素(NSC 332598)、太平洋紫杉醇(Taxol)、Taxol衍生物、多烯紫杉醇(Taxotere)、硫代秋水仙碱(NSC 361792)、三苯甲基cysterin、长春花碱硫酸盐、长春新碱硫酸盐、天然和合成的埃坡霉素(epothilone)(包括但不限于埃坡霉素A、埃坡霉素B、多羟基内酯类化合物)、雌氮芥、噻氨酯哒唑等。
适于使用的激素调节剂和类固醇(包括合成类似物)包括，但不限于：肾上腺皮质类固醇，如强的松、地塞米松等；雌激素和孕激素，如羟孕酮己酸酯、甲孕酮醋酸酯、甲地孕酮醋酸酯、雌二醇、克罗米酚、他莫昔芬等；以及肾上腺皮质抑制剂，如氨鲁米特；l7α-乙炔雌二醇已烯雌酚；乙烯雌酚、睾丸激素、氟羚甲基睾丸素、甲雄烷醇酮丙酸酯、睾内酯、甲泼尼龙、甲基-睾丸素、脱氢皮质醇、氟羟脱氢皮甾醇、氯三芳乙烯、羟孕酮、氨鲁米特、雌氮芥、甲羟孕酮醋酸盐、促性腺激素释放激素类似物、氟他胺(Drogenil)、托瑞米芬(法乐通)和Zoladex。雌激素刺激增殖与分化，因此，结合雌激素受体的化合物用于阻断这些活性。皮质类固醇激素可抑制T细胞增殖。
其他的化学治疗剂包括金属络合物，如顺铂(cis-DDP、卡波铂等；脲，如羟基脲；以及肼，如N-甲基肼；表叶毒素；拓扑异构酶抑制剂；甲基苄肼；米托蒽醌；甲酰四氢叶酸；呋氟尿嘧啶等。感兴趣的其他抗增生剂包括免疫抑制剂，如麦考酚酸、酞胺哌啶酮、desoxyspergualin、azasporine、来氟米特、咪唑立宾、氮杂螺烷(SKF 105685))；Iressa(ZD1839，4-(3-氯-4-氟苯氨基)-7-甲氧基-6-(3-(4-吗啉基)丙氧基)喹唑啉)等。
“紫杉烷”包括太平洋紫杉醇和任一活性紫杉烷衍生物或前药。“太平洋紫杉醇”(在本文中应理解为包括类似物、制剂和衍生物，例如，多烯紫杉醇、TAXOLTM、TAXOTERETM(多烯紫杉醇的制剂)、太平洋紫杉醇的10-去乙酰基类似物和3′N-去苯甲酰-3′N-叔-丁氧羰基类似物)可利用本领域技术人员公知的技术容易地制备(还参见WO94/07882、WO 94/07881、WO 94/07880、WO 94/07876、WO 93/23555、WO 93/10076；第5,294,637、5,283,253、5,279,949、5,274,137、5,202,448、5,200,534、5,229,529号美国专利和EP 590,267)，或可通过多种商业来源来获得，包括，例如Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.(来源于Taxusbrevifolia的T7402或来源于Taxus yannanensis的T-1912)。
太平洋紫杉醇应理解为不仅指太平洋紫杉醇的一般化学可用形式，而且指类似物和衍生物(如上述的TaxotereTM多烯紫杉醇)以及太平洋紫杉醇的偶联物(如太平洋紫杉醇-PEG、太平洋紫杉醇-葡萄聚糖或太平洋紫杉醇-木糖)
术语“紫杉烷”也包括了多种已知的衍生物，包括亲水衍生物和疏水衍生物。紫杉烷衍生物包括，但不限于：第WO 99/18113号国际专利申请中描述的半乳糖和甘露糖衍生物；WO 99/14209中描述的哌嗪和其他衍生物；WO 99/09021、WO 98/22451和第5,869,680号美国专利描述的紫杉烷衍生物；WO 98/28288中描述的6-硫代衍生物；第5,821,263号美国专利描述的亚磺酰胺衍生物和第5,415,869号美国专利描述的紫杉醇衍生物。它还进一步包括太平洋紫杉醇的前药，包括但不限于WO 98/58927、WO 98/13059和第5,824,701号美国专利描述的那些。
适用于本发明方法的生物反应修饰剂包括，但不限于：(1)酪氨酸激酶(RTK)活性抑制剂；(2)丝氨酸/苏氨酸激酶活性抑制剂；(3)肿瘤相关抗原拮抗剂，如特异结合肿瘤抗原的抗体；(4)凋亡受体激动剂；(5)白介素-2；(6)IFN-α；(7)IFN-γ；(8)集落刺激因子和(9)血管生成抑制剂。
一方面，本发明关注本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体作为辅助剂与任何疗法的联合，所述疗法中癌症患者接受至少一种其它抗肿瘤药物的治疗，其中该其它药物为酪氨酸激酶抑制剂。在一些实施方案中，酪氨酸激酶抑制剂为受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂，如I型受体酪氨酸激酶抑制剂(如表皮生长因子受体抑制剂)、II型受体酪氨酸激酶抑制剂(如胰岛素受体抑制剂)、III型受体酪氨酸激酶抑制剂(如血小板衍生的生长因子受体抑制剂)、以及IV型受体酪氨酸激酶抑制剂(如成纤维细胞生长因子受体抑制剂)。在其他实施方案中，酪氨酸激酶抑制剂为非受体酪氨酸激酶抑制剂，如src激酶或janus激酶抑制剂。
另一方面，本发明关注本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体作为辅助剂与任何疗法的联合，所述疗法中癌症患者接受少一种其它抗肿瘤药物的治疗，其中该其它药物为与生长因子信号通路有关的受体酪氨酸激酶抑制剂。在一些实施方案中，该抑制剂为染料木碱(genistein)。在其他实施方案中，该抑制剂为EGFR酪氨酸激酶特异拮抗剂，如IRESSATM吉非替尼(ZD1 8398；Novartis)，TARCEVATMerolotinib(OSI-774；Roche；Genentech；OSI Pharmaceuticals)或酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostin)AG1478(4-(3-氯苯胺)-6，7-二甲氧基喹唑啉)。在其他实施方案中，该抑制剂为描述在公开号2002/0183364 A1的美国专利申请中Flk-1/KDR(VEGF-R2)酪氨酸激酶活性的吲哚酮拮抗剂，如第4-5页表1中公开的Flk-1/KDR(VEGF-R2)酪氨酸激酶活性的吲哚酮拮抗剂。在另外的实施方案中， 该抑制剂为Flk-1/KDR(VEGF-R2)、FGF-R1或PDGF-R酪氨酸激酶活性的任何取代的3-[(4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-2-基)亚甲基]-1，3-二氢吲哚-2-酮拮抗剂(在Sun，L，et al.，
J.Med.Chem.，43(14)：2655-2663(2000)中公开)。在其它实施方案中，该抑制剂为Flt-1(VEGF-R1)，Flk-1/KDR(VEGF-R2)，FGF-R1或PDGF-R酪氨酸激酶活性的任何取代的3-[(3-或4-羧乙基吡咯-2-基)次甲基]吲哚-2-酮拮抗剂(在Sun，L.，et al.，
J.Med.Chem.， 42(25)：5120-5130(1999)中公开)。
另一方面，本发明关注本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体作为辅助剂与任何疗法的联合，所述疗法中癌症患者接受至少一种其它抗肿瘤药物治疗，其中该其它药物为与生长因子信号通路有关的非受体酪氨酸激酶抑制剂。在一些实施方案中，该抑制剂为JAK2酪氨酸激酶活性拮抗剂，如酪氨酸磷酸化抑制剂AG490(2-氰基-3-(3，4-二羟苯基)-N-(苯甲基)-2-丙烯酰胺)。在其他实施方案中，该抑制剂为bcr-abl酪氨酸激酶活性拮抗剂，如GLEEVECTM甲磺酸伊马替尼(STI-571；Novartis)。
另一方面，本发明关注本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体作为辅助剂与任何疗法的联合，所述疗法中癌症患者接受至少一种其它抗肿瘤药物治疗，其中该其它药物为与细胞周期调节有关的一种或几种激酶的抑制剂。在一些实施方案中，该抑制剂为CDK2激活拮抗剂，如酪氨酸磷酸化抑制剂AG490(2-氰基-3-(3，4-二羟苯基)-N-(苯甲基)-2-丙烯酰胺)。在其他实施方案中，该抑制剂为CDK1/细胞周期蛋白B活性拮抗剂，如alsterpaullone。在另外的实施方案中，该抑制剂为CDK2激酶活性拮抗剂，如靛玉红-3′-单肟。在另外的实施方案中，该抑制剂为ATP池拮抗剂，如洛美曲索(在公开号2002/0156023 A1号美国专利申请中有描述)。
另一方面，本发明关注本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体作为辅助剂与任何疗法的联合，所述疗法中癌症患者接受至少一种其它抗肿瘤药物治疗，其中该其它药物为肿瘤相关抗原拮抗剂，如抗体拮抗剂。在涉及表达HER2的肿瘤的治疗的一些实施方案中，肿瘤相关抗原拮抗剂为抗HER2的单克隆抗体，如HERCEPTINTM曲妥单抗(trastuzumab)。在涉及表达CD20的肿瘤(如B细胞淋巴瘤)的治疗的一些实施方案中，肿瘤相关抗原拮抗剂为抗CD20的单克隆抗体，如RITUXANTM利妥昔单抗(rituximab)。
另一方面，本发明关注本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体作为辅助剂与任何疗法的联合，所述疗法中癌症患者接受至少一种其它抗肿瘤药物治疗，其中该其它药物为肿瘤生长因子拮抗剂。在一些实施方案中，该肿瘤生长因子拮抗剂为表皮生长因子(EGF)拮抗剂，如抗EGF的单克隆抗体。在其他实施方案中，该肿瘤生长因子拮抗剂为表皮生长因子受体erbB1(EGFR)拮抗剂，如EGFR激活或信号转导的抗EGFR的单克隆抗体抑制剂，如ERBITUXTM西妥昔单抗(cetuximab)。
另一方面，本发明关注本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体作为辅助剂与任何疗法的联合，所述疗法中癌症患者接受至少一种其它抗肿瘤药物治疗，其中该其它药物为Apo-2配体激动剂。在一些实施方案中，该Apo-2配体激动剂为WO 97/25428中描述的任何Apo-2配体多肽。
另一方面，本发明关注本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体作为辅助剂与任何疗法的联合，所述疗法中癌症患者接受至少一种其它抗肿瘤药物治疗，其中该其它药物为抗生血管试剂。在一些实施方案中，该抗生血管试剂为血管内皮细胞生长因子(VEGF)拮抗剂，如抗VEGF的单克隆抗体，如AVASTINTM贝伐单抗(bevacizumab)(Genentech))。在其他实施方案中，该抗生血管试剂为VEGF-R1的拮抗剂，如抗VEGF-R1的单克隆抗体。在其他实施方案中，该抗生血管试剂为VEGF-R2的拮抗剂，如抗VEGF-R2的单克隆抗体。在其他实施方案中，该抗生血管试剂为碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)拮抗剂，如抗bFGF的单克隆抗体。在其他实施方案中，该抗生血管试剂为bFGF受体的拮抗剂，如抗bFGF受体的单克隆抗体。在其他实施方案中，该抗生血管试剂为TGF-β的拮抗剂，如抗TGF-β的单克隆抗体。在其他实施方案中，该抗生血管试剂为TGF-β受体的拮抗剂，如抗TGF-β受体的单克隆抗体。在其他实施方案中，该抗生血管试剂为视黄酸受体(RXR)配体，如公开号2001/0036955 A1的美国专利申请或第5,824,685、5,780,676、5,399,586、5,466,861、4,810,804、5,770,378、5,770,383或5,770,382号美国专利描述的任何RXR配体。在另外的实施方案中，该抗生血管试剂为过氧物酶体增殖活化受体(PPAR)γ配体，如公开号2001/0036955 A1号美国专利申请中描述的PPARγ配体。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者癌症的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的IFN-γ向患者共给药，该IFN-γ的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗癌作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者癌症的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的SAPK抑制剂(如吡非尼酮或吡非尼酮类似物)向患者给药，该SAPK抑制剂的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗癌作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者癌症的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的IFN-γ和一定量的SAPK抑制剂(如吡非尼酮或吡非尼酮类似物)向患者共给药，该IFN-γ和SAPK抑制剂的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗癌作用。
作为非限定性的例子，任何上述有效治疗患者癌症的治疗方法(以一定量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体与一定量的不同于IFN-γ的其它抗癌剂的联合疗法为特征)可被修改为包括以一定量的IFN-γ向患者共给药，该IFN-γ的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂和该其它抗癌剂的联合治疗的抗癌作用。
作为非限定性的例子，任何上述有效治疗患者癌症的治疗方法(以一定量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和一定量的不同于SAPK抑制剂(如吡非尼酮或吡非尼酮类似物)的其它抗癌剂的联合疗法为特征)可被修改为包括以一定量的SAPK抑制剂(如吡非尼酮或吡非尼酮类似物)向患者共给药，该SAPK抑制剂的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂和该其它抗癌剂的联合治疗的抗癌作用。
作为非限定性的例子，任何上述有效治疗患者癌症的治疗方法(以一定量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体和一定量的不同于IFN-γ或SAPK抑制剂(如吡非尼酮或吡非尼酮类似物)的其它抗癌剂的联合疗法为特征)可被修改为包括以一定量的IFN-γ和一定量的SAPK抑制剂(如吡非尼酮或吡非尼酮类似物)向患者共给药，该IFN-γ和SAPK抑制剂的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂和该其它抗癌剂的联合治疗的抗癌作用。
病毒感染
本发明提供了治疗病毒感染的方法和减少病毒感染患者的病毒负荷、或减少病毒清除时间、或减少临床结果中的发病率或死亡率的方法。本发明进一步提供了减少患者发生具有临床后遗症的病理病毒感染的风险的方法。所述方法主要涉及给予治疗有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体以治疗病毒感染。
在一些实施方案中，所述治疗方法是预防性的。当所述治疗方法是预防性的，该方法减少患者发生病理性病毒感染的风险。有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体为减少患者发生病理性病毒感染的风险或可能性的量。例如，与不用本试剂治疗情况下发生病理性病毒感染的风险相比，有效量减少患者发生病理性感染的风险至少约10％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或更多。
在一些实施方案中，与不用本试剂治疗情况下病毒负荷相比，有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体为减少病毒负荷至少约10％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或更多的量。
在一些实施方案中，与不治疗情况下病毒清除时间相比，有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体为减少病毒清除时间至少约10％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或更多的量。
在一些实施方案中，与不治疗情况下发病率和死亡率相比，有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体为减少病毒感染发病率和死亡率至少约10％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或更多的量。
本治疗方法是否有效减少病理性病毒感染的风险、减少病毒负荷、减少病毒清除时间、或减少由于病毒感染的发病率或死亡率可由本领域技术人员容易地确定。病毒负荷通过测定血清中病毒滴度或水平可容易地测定。血清中病毒数量可用任一公知方法测定，包括，如对分析的病毒应用寡核苷酸引物进行定量的聚合酶链式反应。发病率是否减少通过测定任何与病毒感染有关的症状来确定，如发烧、呼吸症状(如咳嗽、呼吸容易或困难等)。
在一些实施方案中，本发明提供了对接触病毒个体(如与病毒感染个体接触过的个体)减少病毒负荷、和/或减少病毒清除时间、和/或减少发病率和死亡率的方法，该方法涉及给予有效量的本发明的I型干扰素受体多肽激动剂。在这些实施方案中，治疗从接触后约1小时到约14天开始，如从接触病毒后约1小时至24小时、约24小时至48小时、约48小时至约3天、约3天至约4天、约4天至约7天、约7天至约10天或约10天至约14天开始。
在一些实施方案中，本发明提供了减少接触病毒个体(如与病毒感染个体接触过的个体)发生具有临床后遗症的病理性病毒感染的风险的方法，该方法涉及给予有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体。在这些实施方案中，治疗从接触后约1小时至约35天开始，如从接触病毒后约1小时至24小时、约24小时至48小时、约48小时至约3天、约3天至约4天、约4天至约7天、约7天至约10天、约10天至约14天、约14天至约21天或约21天至约35天开始。
在一些实施方案中，本发明提供了对已感染或没有感染病毒但已接触过病毒的个体减少病毒负荷、和/或减少病毒清除时间、和/或减少发病率和死亡率的方法，在一些这样的实施方案中，本方法涉及在接触病毒24小时内给予有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体。
在一些实施方案中，本发明提供了对没有感染病毒但已接触过病毒的给体减少病毒负荷、和/或减少病毒清除时间、和/或减少发病率和死亡率的方法。在一些这样的实施方案中，所述方法涉及在接触病毒48小时内给予有效量的SAPK抑制剂(如吡非尼酮或吡非尼酮类似物)和I型干扰素受体激动剂。
在一些实施方案中，本发明提供了对没有感染病毒但已接触过病毒的给体减少病毒负荷、和/或减少病毒清除时间、和/或减少发病率和死亡率的方法。所述方法涉及在接触病毒后超过48小时给予本发明的试剂，如在72小时至约35天，如接触病毒后72小时、4天、5天、6天、7天，或在接触病毒后约7天至约10天、约10天至约14天、约14天至约17天、约17天至约21天、约21天至约25天、约25天至约30天、约30天至约35天。
在一些实施方案中，本发明提供了减少接触过病毒的个体发生具有临床后遗症的病理性病毒感染的风险的方法。在一些这样的实施方案中，本方法涉及在接触病毒24小时内给予有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体。
在一些实施方案中，本发明提供了减少接触过病毒的个体(如与病毒感染个体接触过的个体)发生具有临床后遗症的病理性病毒感染的风险的方法。在一些这样的实施方案中，本方法涉及在接触病毒48小时内给予有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体。
肝炎病毒感染
本发明提供了治疗肝炎病毒感染的方法。在特定的实施方案中，本发明提供了治疗丙型肝炎病毒(HCV)感染的方法；减少与HCV和肝硬化相关的并发症发生率的方法；以及对HCV感染个体减少病毒负荷、或减少病毒清除时间、或减少临床结果中的发病率或死亡率的方法。所述方法主要涉及给予患者有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体。
在许多实施方案中，本发明的治疗方法有效减少个体的病毒负荷，并实现持续的病毒反应。任选地，所述方法进一步提供给予患者有效量的核苷类似物，如利巴韦林、左旋韦林(levovirin)和viramidine。在许多实施方案中特别关注人的治疗。
所述方法是否有效治疗HCV感染可通过测定病毒负荷或测定与HCV感染相关的参数(包括但不限于：肝纤维化、血清转氨酶水平的升高和肝坏死炎症活性)来确定。肝纤维化的指示物下面进行详细讨论。
病毒负荷通过测定血清中的病毒滴度或水平来确定。这些方法包括，但不限于：定量聚合酶链式反应(PCR)和分支DNA(bDNA)测试。测定HCV RNA的病毒负荷(滴度)的定量分析法已经被开发出。许多分析法是可购得的，包括定量反转录PCR(RT-PCR)(Amplicor HCVMonitorTM，Roche Molecular Systems，New Jersey)和分支DNA(脱氧核糖核酸)信号扩增分析法(QuantiplexTM HCV RNA Assay(bDNA)ChironCorp.，Emeryville，California)。参见，例如Gretch et al.(1995)Ann.Intern.Med.123：321-329。感兴趣的还有核酸测试(NAT)，由Gen-Probe Inc.(San Diego)和Chiron Corporation开发，由Chiron Corporation以商品名Procleix出售，其中NAT同时测定HIV-1和HCV的存在。这方面的例子如：Vargo et al.(2002)Transfusion 42：876-885。
总的来说，有效量的本发明的试剂(如本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体)为有效减少病毒负荷到不能检出的水平(如少于约5000、1000、500、200基因组拷贝/mL血清的量)。在一些实施方案中，有效量的本发明的试剂为有效减少病毒负荷至少于100基因组拷贝/mL血清的量。在许多实施方案中，本发明的方法实现持续的病毒反应，如在停止治疗后至少约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月的时期内病毒负荷减少到不能检出的水平。
所述方法是否有效治疗HCV感染可通过测定与HCV感染有关的参数(如肝纤维化)来确定。测定肝纤维化程度的方法下面详细讨论。在一些实施方案中，肝纤维化的血清标志物水平指示了肝纤维化的程度。
作为非限定性的例子，血清丙氨酸转氨酶(ALT)的水平采用标准分析法测定。一般来说，少于约45国际单位ALT水平被认为正常的。在一些实施方案中，作为所述联合治疗的一部分给予的治疗剂的有效量为有效减少ALT水平到少于约45U/ml血清的量。
联合疗法
在一些实施方案中，本发明提供了治疗病毒感染的联合疗法。因此，本发明提供了治疗病毒感染的方法，主要涉及在与至少另一种治疗剂的联合疗法中给予本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体。适合的其它治疗剂包括，但不限于：核苷类似物(如利巴韦林和viramidine)、L-核苷(如左旋韦林)、II型干扰素受体激动剂(如IFN-γ)、TNF拮抗剂、胸腺素-α、SAPK抑制剂(如吡非尼酮或吡非尼酮类似物)和金刚烷胺等。与治疗HCV感染的联合疗法有关的适合的其它治疗剂包括，但不限于：核苷类似物(如利巴韦林、左旋韦林和viramidine)、II型干扰素受体激动剂(如IFN-γ)、TNF拮抗剂、NS3抑制剂、NS5B抑制剂、α-葡糖苷酶抑制剂、胸腺素-α、SAPK抑制剂(如吡非尼酮或吡非尼酮类似物)和金刚烷胺等。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者病毒感染(如HCV感染)的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的IFN-γ向患者给药，该IFN-γ的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者病毒感染(如HCV感染)的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修该为包括以一定量的SAPK抑制剂(如吡非尼酮或吡非尼酮类似物)向患者共给药，该SAPK抑制剂的量在期望的治疗期内有效增加合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者病毒感染(如HCV感染)的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修该为包括以一定量的核苷类似物向患者共给药，该核苷类似物的量在期望的治疗期内有效增加合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者病毒感染(如HCV感染)的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修该为包括以一定量的利巴韦林向患者共给药，该利巴韦林的量在期望的治疗期内有效增加合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者病毒感染(如HCV感染)的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修该以一定量的L-核苷(如左旋韦林)向患者共给药，该L-核苷的量在期望的治疗期内有效增加合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者病毒感染(如HCV感染)的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的viramidine向患者共给药，该viramidine的量在期望的治疗期内有效增加合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者病毒感染(如HCV感染)的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的TNF拮抗剂(如依那西普、英夫利昔单抗或阿达木单抗)向患者共给药，该TNF拮抗剂的量在期望的治疗期内可有效增加合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者病毒感染(如HCV感染)的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的胸腺素-α向患者共给药，该胸腺素-α的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者病毒感染(如HCV感染)的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的NS3抑制剂向患者共给药，该NS3抑制剂的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者病毒感染(如HCV感染)的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的NS5B抑制剂向患者共给药，该NS5B抑制剂的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者病毒感染(如HCV感染)的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的α-葡糖苷酶抑制剂向患者共给药，该α-葡糖苷酶的量在期望的治疗期内有效增加合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者病毒感染(如HCV感染)的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的IFN-γ和一定量的SAPK抑制剂(如吡非尼酮或吡非尼酮类似物)向患者共给药，该IFN-γ和SAPK抑制剂的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者病毒感染(如HCV感染)的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的IFN-γ和一定量的核苷类似物向患者共给药，该IFN-γ和核苷类似物的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者病毒感染(如HCV感染)的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的IFN-γ和一定量的利巴韦林向患者共给药，该IFN-γ和利巴韦林的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者病毒感染(如HCV感染)的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的IFN-γ和一定量的L-核苷(如左旋韦林)向患者共给药，该IFN-γ和L-核苷的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者病毒感染(如HCV感染)的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修饰为包括以一定量的IFN-γ和一定量的viramidine向患者共给药，该IFN-γ和viramidine的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者病毒感染(如HCV感染)的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的IFN-γ和一定量的TNF拮抗剂(如依那西普、英夫利昔单抗或阿达木单抗)向患者共给药，该IFN-γ和TNF拮抗剂的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者病毒感染(如HCV感染)的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的IFN-γ和一定量的胸腺素-α向患者共给药，该IFN-γ和胸腺素-α的量在期望的治疗期内可有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者HCV感染的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的IFN-γ和一定量的NS3抑制剂向患者共给药，该IFN-γ和NS3抑制剂的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者HCV感染的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的IFN-γ和一定量的NS5B抑制剂向患者共给药，该IFN-γ和NS5B抑制剂的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者HCV感染的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的IFN-γ和一定量的α-葡糖苷酶抑制剂向患者共给药，该IFN-γ和α-葡糖苷酶抑制剂的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者病毒感染(如HCV感染)的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的核苷类似物(如利巴韦林、viramidine或L-核苷如左旋韦林)和一定量的IFN-γ向患者共给药，该核苷类似物和IFN-γ的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者病毒感染(如HCV感染)的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的核苷类似物(如利巴韦林、viramidine或L-核苷如左旋韦林)和一定量的TNF拮抗剂(如依那西普、英夫利昔单抗或阿达木单抗)向患者共给药，该核苷类似物和TNF拮抗剂的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者病毒感染(如HCV感染)的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的核苷类似物(如利巴韦林、viramidine或L-核苷如左旋韦林)和一定量的胸腺素-α向患者共给药，该可核苷类似物和胸腺素-α的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者病毒感染(如HCV感染)的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的核苷类似物(如比对唑、viramidine或L-核苷如左旋韦林)和一定量的SAPK抑制剂(如吡非尼酮或吡非尼酮类似物)向患者共给药，该核苷类似物和SAPK抑制剂的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者HCV感染的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的核苷类似物(如利巴韦林、viramidine或L-核苷如左旋韦林)和一定量的NS3抑制剂向患者给药，该核苷类似物和NS3抑制剂的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者HCV感染的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的核苷类似物(如利巴韦林、viramidine或L-核苷如左旋韦林)和一定量的NS5B抑制剂向患者共给药，该核苷类似物和NS5B抑制剂的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者HCV感染的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的核苷类似物(如利巴韦林、viramidine或L-核苷如左旋韦林)和一定量的TNF拮抗剂(如依那西普、英夫利昔单抗或阿达木单抗)向患者共给药，该核苷类似物和TNF拮抗剂的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者HCV感染的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的NS3抑制剂和一定量的TNF拮抗剂(如依那西普、英夫利昔单抗或阿达木单抗)向患者共给药，该NS3抑制剂和TNF拮抗剂的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者HCV感染的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的NS5B抑制剂和一定量的TNF拮抗剂(如依那西普、英夫利昔单抗或阿达木单抗)向患者共给药，该NS5B抑制剂和TNF拮抗剂的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者HCV感染的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的α-葡糖苷酶抑制剂和一定量的TNF拮抗剂(如依那西普、英夫利昔单抗或阿达木单抗)向患者共给药，该α-葡糖苷酶抑制剂和TNF拮抗剂的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者HCV感染的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的SAPK抑制剂(如吡非尼酮或吡非尼酮类似物)和一定量的TNF拮抗剂(如依那西普、英夫利昔单抗或阿达木单抗)向患者共给药，该SAPK抑制剂和TNF拮抗剂的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者HCV感染的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的胸腺素-α和一定量的TNF拮抗剂(如依那西普、英夫利昔单抗或阿达木单抗)向患者共给药，该胸腺素-α和TNF拮抗剂的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者HCV感染的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的核苷类似物(如利巴韦林、viramidine或L-核苷如左旋韦林)和一定量的胸腺素-α向患者共给药，该核苷类似物和胸腺素-α的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者HCV感染的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的SAPK抑制剂(如吡非尼酮或吡非尼酮类似物)和一定量的胸腺素-α向患者共给药，该SAPK抑制剂和胸腺素-α的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者HCV感染的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的NS3抑制剂和一定量的胸腺素-α向患者共给药，该NS3抑制剂和胸腺素-α的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者HCV感染的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的NS5B抑制剂和一定量的胸腺素-α向患者共给药，该NS5B抑制剂和胸腺素-α的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者HCV感染的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的α-葡糖苷酶抑制剂和一定量的胸腺素-α向患者共给药，该α-葡糖苷酶抑制剂和胸腺素-α的量在期望的治疗期内有效增加合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者HCV感染的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的核苷类似物(如利巴韦林、viramidine或L-核苷如左旋韦林)和一定量的SAPK抑制剂(如吡非尼酮或吡非尼酮类似物)向患者共给药，该核苷类似物和SAPK抑制剂的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者HCV感染的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的NS3抑制剂和一定量的SAPK抑制剂(如吡非尼酮或吡非尼酮类似物)向患者共给药，该NS3抑制剂和SAPK抑制剂的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者HCV感染的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修饰为包括以一定量的NS5B抑制剂和一定量的SAPK抑制剂(如吡非尼酮或吡非尼酮类似物)向患者共给药，该NS5B抑制剂和SAPK抑制剂的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者HCV感染的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的α-葡糖苷酶抑制剂和一定量的SAPK抑制剂(如吡非尼酮或吡非尼酮类似物)向患者共给药，该α-葡糖苷酶抑制剂和SAPK抑制剂的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者HCV感染的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的核苷类似物(如利巴韦林、viramidine或L-核苷如左旋韦林)和一定量的α-葡糖苷酶抑制剂，该核苷类似物和α-葡糖苷酶抑制剂的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者HCV感染的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的NS5B抑制剂和一定量的NS3抑制剂向患者共给药，该NS5B抑制剂和NS3抑制剂的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者HCV感染的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂、超糖基化的多肽变体、抗蛋白酶的多肽变体、或超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的α-葡糖苷酶抑制剂和一定量的NS3抑制剂向患者共给药，该α-葡糖苷酶抑制剂和NS3抑制剂的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
作为非限定性的例子，任何上述治疗患者HCV感染的治疗方法(以有效量的本发明的合成I型干扰素受体多肽激动剂的治疗为特征)可被修改为包括以一定量的NS5B抑制剂和一定量的α-葡糖苷酶抑制剂向患者给药，该NS5B抑制剂和α-葡糖苷酶抑制剂的量在期望的治疗期内有效增强合成I型干扰素受体多肽激动剂治疗的抗病毒作用。
患者鉴别
在某些实施方案中，用于治疗HCV患者的药物疗法的特定方案是根据患者表现的特定疾病参数来选择的，这些疾病参数例如为患者初始病毒负荷、患者中HCV感染的基因型、患者肝组织结构和/或肝硬化阶段。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了对任何上述治疗HCV感染的方法进行了修改的方法，以便持续治疗治疗失败患者48周。
在其他实施方案中，本发明提供了对任何上述治疗HCV的方法进行了修改的方法，以便治疗非应答患者，其中让患者接受48周的疗程。
在其他实施方案中，本发明提供了对任何上述治疗HCV感染的方法进行了修改的方法，以便治疗复发患者，其中让患者接受48周的疗程。
在其他实施方案中，本发明提供了对任何上述治疗HCV感染的方法进行了修改的方法，以便治疗被HCV基因型1感染的初次接受治疗的患者，其中让患者接受48周的疗程。
在其他实施方案中，本发明提供了对任何上述治疗HCV感染的方法进行了修改的方法，以便治疗被HCV基因型4感染的初次接受治疗的患者，其中让患者接受48周的疗程
在其他实施方案中，本发明提供了对任何上述治疗HCV感染的方法进行了修改的方法，以便治疗被HCV基因型1感染的初次接受治疗的患者，其中让患者接受48周的疗程，以及其中患者有高的病毒负荷(HVL)，“HVL”指HCV病毒负荷超过2×106HCV基因组拷贝/mL血清。
在其他实施方案中，本发明提供了对任何上述治疗HCV感染的方法进行了修改的方法，以便包括如下步骤：(1)确定患有晚期或严重阶段肝纤维化的患者，如根据Knodell测定为得分3或4；然后(2)给予患者本发明方法的药物治疗约24周至约60周、或约30周至约1年、或约36周至约50周、或约40周至约48周、或至少约24周、或至少约30周、或至少约36周、或至少约40周、或至少约48周、或至少约60周。
在另外的实施方案中，本发明提供了对任何上述治疗HCV感染的方法进行了修改的方法，以便包括如下步骤：(1)确定患有晚期或严重阶段肝纤维化的患者，如根据Knodell测定为得分3或4；然后(2)给予患者本发明方法的药物治疗约40周至约50周、或约48周。
在另外的实施方案中，本发明提供了对任何上述治疗HCV感染的方法进行了修改的方法，以便包括如下步骤：(1)确定具有HCV基因型1感染并且初始病毒负荷超过两百万病毒基因组拷贝/mL患者血清的患者；然后(2)给予患者本发明方法的药物治疗约24周至约60周、或约30周至约1年、或约36周至约50周、或约40周至约48周、或至少约24周、或至少约30周、或至少约36周、或至少约40周、或至少约48周、或至少约60周。
在另外的实施方案中，本发明提供了对任何上述治疗HCV感染的方法进行了修改的方法，以便包括如下步骤：(1)确定具有HCV基因型1感染并且初始病毒负荷超过两百万病毒基因组拷贝/mL患者血清的患者；(2)给予患者本发明方法的药物治疗约40周至约50周、或约48周。
在另外的实施方案中，本发明提供了对任何上述治疗HCV感染的方法进行了修改的方法，以便如下步骤：(1)确定患者，该患者具有HCV基因型1感染、初始病毒负荷超过两百万病毒基因组拷贝/mL患者血清以及没有肝纤维化或具有早期阶段肝纤维化，如根据Knodell测定得分1或2；然后(2)给予患者本发明方法的药物治疗约24周至约60周、或约30周至约1年、或约36周至约50周、或约40周至约48周、或至少约24周、或至少约30周、或至少约36周、或至少约40周、或至少约48周、或至少约60周。
在另外的实施方案中，本发明提供了对任何上述治疗HCV感染的方法进行了修改的方法，以便如下步骤：(1)确定患者，该患者具有HCV基因型1感染、初始病毒负荷超过两百万病毒基因组拷贝/mL患者血清以及没有肝纤维化或具有早期阶段肝纤维化，如根据Knodell测定得分1或2；然后(2)给予患者本发明方法的药物治疗约40周至约50周、或约48周。
在另外的实施方案中，本发明提供了对任何上述治疗HCV感染的方法进行了修改的方法，以便包括如下步骤：(1)确定具有HCV基因型1感染并且初始病毒负荷少于或等于两百万病毒基因组拷贝/mL患者血清的患者；然后(2)给予患者本发明方法的药物治疗约20周至约50周、或约24周至约48周、或约30周至约40周、或多至约20周、或多至约24周、或多至约30周、或多至约36周、或多至约48周。
在另外的实施方案中，本发明提供了对任何上述治疗HCV感染的方法进行了修改的方法，以便包括如下步骤：(1)确定具有HCV基因型1感染并且初始病毒负荷少于或等于两百万病毒基因组拷贝/mL患者血清的患者；然后(2)给予患者本发明方法的药物治疗约20周至约24周。
在另外的实施方案中，本发明提供了对任何上述治疗HCV感染的方法进行了修改的方法，以便包括如下步骤：(1)确定具有HCV基因型1感染并且初始病毒负荷少于或等于两百万病毒基因组拷贝/mL患者血清的患者；然后(2)给予患者本发明方法的药物治疗约24周至约48周。
在另外的实施方案中，本发明提供了对任何上述治疗HCV感染的方法进行了修改的方法，以便包括如下步骤：(1)确定具有HCV基因型2或3感染的患者；然后(2)给予患者本发明方法的药物治疗约24周至约60周、或约30周至约1年、或约36周至约50周、或约40周至约48周、或至少约24周、或至少约30周、或至少约36周、或至少约40周、或至少约48周、或至少约60周。
在另外的实施方案中，本发明提供了对任何上述治疗HCV感染的方法进行了修改的方法，以便包括如下步骤：(1)确定具有HCV基因型2或3感染的患者；然后(2)给予患者本发明方法的药物治疗约20周至约50周、或约24周至约48周、或约30周至约40周、或多至约20周、或多至约24周、或多至约30周、或多至约36周、或多至约48周。
在另外的实施方案中，本发明提供了对任何上述治疗HCV感染的方法进行了修改的方法，以便包括如下步骤：(1)确定具有HCV基因型2或3感染的患者；然后(2)给予患者本发明方法的药物治疗约20周至约24周。
在另外的实施方案中，本发明提供了对任何上述治疗HCV感染的方法进行了修改的方法，以便包括如下步骤：(1)确定具有HCV基因型2或3感染的患者；然后(2)给予患者本发明方法的药物治疗至少约24周。
在另外的实施方案中，本发明提供了对任何上述治疗HCV感染的方法进行了修改的方法，以便包括如下步骤：(1)确定具有HCV基因型1或4感染的患者；然后(2)给予患者本发明方法的药物治疗约24周至约60周、或约30周至约1年、或约36周至约50周、或约40周至约48周、或至少约24周、或至少约30周、或至少约36周、或至少约40周、或至少约48周、或至少约60周。
在另外的实施方案中，本发明提供了对任何上述治疗HCV感染的方法进行了修改的方法，以便包括如下步骤：(1)确定以HCV基因型5、6、7、8和9中的任一种为特征的HCV感染患者；然后(2)给予患者本发明方法的药物治疗约20周至约50周。
在另外的实施方案中，本发明提供了对任何上述治疗HCV感染的方法进行了修改的方法，以便包括如下步骤：(1)确定以HCV基因型5、6、7、8和9中的任一种为特征的HCV感染患者；然后(2)给予患者本发明方法的药物治疗至少约20周并多至约48周。
II型干扰素受体激动剂
用在此处时，术语“II型干扰素受体激动剂”包括人II型干扰素受体的任何天然存在或非天然存在的配体，其可结合该受体并引发经由该受体的信号转导。II型干扰素受体激动剂包括干扰素，包括天然存在的干扰素、修饰的干扰素、合成干扰素、聚乙二醇化干扰素、包括干扰素和异种蛋白的融合蛋白、重排干扰素(shuffled interferon))；特异于干扰素受体的抗体；非肽化学激动剂；等等。
II型干扰素受体激动剂特定的例子为IFN-γ和其变种。虽然本发明举例说明了IFN-γ多肽的应用，但任何II型干扰素受体激动剂都可用于本发明的方法中。
SAPK抑制剂
适于应用于本发明治疗方法的SAPK抑制剂特别包括吡非尼酮或吡非尼酮类似物，也特别包括公开号20030149041美国专利中阐述的任何式I化合物。
另外的适用于本发明的SAPK抑制剂包括这样的试剂，与没有SAPK抑制剂情况下的SAPK的酶活相比，该试剂抑制SAPK酶活至少约10％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。
应用促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的信号转导通路在多种细胞反应中有重要的作用，包括生长、应激诱导的基因表达和对环境变化的代偿。MAPKs的SAPK族包括c-Jun N端激酶(JNK)和p38激酶。MAPK的p38族包括至少四种成员，命名为p38或p38α、p38β、p38γ和p38δ。多种生物的p38α、p38β和p38γ的氨基酸序列是已知的。例如人p38α、p38β和p38γ的氨基酸序列在如下的GenBank登记号下找到：1)Q16539、NP_620583和NP 001306提供了人p38α多肽的氨基酸序列；2)NP 620478、NP_002742和Q15759提供了人p38β多肽的氨基酸序列；3)NP_002960、P53778和JC5252提供了人p38γ多肽的氨基酸序列。
在一些实施方案中，适合的SAPK抑制剂为抑制p38α、p38β和p38γ的酶活性的试剂。在其他实施方案中，适合的SAPK抑制剂为优先抑制p38α和p38β的试剂，即该试剂相对于抑制p38γ来说，为p38α和p38β的酶活性的较强的抑制剂，如该试剂对p38α和p38β的IC50低于对p38γ的IC50至少约2倍、或约5倍、或约10倍、或更多。
在其他实施方案中，适合的SAPK抑制剂为优先抑制p38γ的试剂，即该试剂相对于抑制p38α和p38β来说，为p38γ的酶活性的较强的抑制剂，如该试剂对p38γ的IC50低于对p38α和p38β的IC50至少约2倍、或约5倍、或约10倍、或更多。
在一些实施方案中，SAPK抑制剂为SAPK(如p38α、p38β或p38γ)的竞争性抑制剂。在一些这样的实施方案中，SAPK抑制剂与腺苷三磷酸(ATP)竞争结合p38α、p38β或p38γ的ATP结合位点。
另外，适用于本发明联合治疗的应激活化蛋白激酶(SAPK)抑制剂包括第6,548,520号美国专利公开的任何2-烷基咪唑；第6,489,325号美国专利公开的任何1，4，5-取代的咪唑化合物；第6,569,871号美国专利公开的任何1，4,5-取代的咪唑化合物；第2003/0073832号美国专利申请公开的杂芳基氨基苯酮化合物；第6,288,089号美国专利公开的吡啶基咪唑化合物和第6,432,962号美国专利公开的杂芳基氨基二苯甲酮。适合使用的还有第6,214,854号美国专利公开的化合物。适合应用的还有WO 99/61426中论述的杂环化合物。
下文详细描述了特别包括在内的吡非尼酮和吡非尼酮类似物。如上文所讨论的，特别将公开号20030149041的美国专利中的式I化合物包括在内。式I如下：
其中，R1选自-H、C1-C20烃、氨基羰基烷基、烷氧基烷基、取代的芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、杂环基烷基和取代的杂环基烷基；
R2选自卤素、C1-C20烃、羟基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基、取代的杂环基；
R5选自-H、烷基和取代的烷基；
R6选自直接的键、烷基、芳基、取代的芳基和杂芳基；
R7选自-H、酰基、烷基、取代的烷基、烷氧羰基、脒、芳基、芳烷基、杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、取代的芳氧基、杂芳基亚磺酰氨基、二烷基亚磺酰氨基，
-C(O)NR8R9、-C(NH)NR8R9和-NR8R9；
R8选自-H和烷基；
R9选自-H、烷基、取代的烷基、芳基、杂芳基、烷基羰基和芳基羰基；
R3选自直接的键、
其中左边的键是与所述环连接的点，右边的键是与R4连接的点；
R4选自-H、卤素、烷基、杂环基、烷基氨基、氨羰基、
-C(S)NHR12、-CHR13R14、-C(O)NHR15、-C(O)(CH2)0-2R16、-S(O2)R17、-OR18、
和
其中R10选自-H、-OH、烷基、环烷基和取代的环烷基；R11选自-H、-OH、-COOH、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、芳基取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、烷氧基、氨羰基、氨羰基烷基、
R12选自烷基和芳基；R13选自-H和芳基；R14选自芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的烷基、芳基取代的烷基和烷氧基取代的烷基；R15选自烷基、芳基、取代的芳基和取代的烷基；R16选自芳基、取代的芳基、杂芳基、羧基、烷氧基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、氨基羰基、取代的氨基羰基、杂环基和
R17选自烷基和二烷基氨基；R18选自C1-C20烃、取代的C1-C20烃和杂芳基；Y选自-H和低级烷基，或者Y和R1连同所连接的N一起可选自杂环基、取代的杂环基、杂芳基、和取代的杂芳基；其中X、X1和X2中至少两个为-N＝且其它的选自-C(H)＝和-N＝。
在一些实施方案中，特别关注任意如下SAPK抑制剂化合物、或其药物可接受的盐、或其衍生物、或其酯、或其类似物的应用：
该化合物的IUPAC命名为(4-苄基-哌啶-1-基)-(1H-吲哚-5-基)-甲酮。任意如下化合物也适于应用：
(4-苄基-哌啶-1-基)-(6-氯-1H-吲哚-5-基)-甲酮；
(4-氯-1H-吲哚-5-基)-[4-(4-氟-苄基)-哌啶-1-基]-甲酮；
(4-苄基-哌啶-1-基)-(4-甲氧基-1H-吲哚-5-基)-甲酮；
(4-苄基-哌啶-1-基)-{1-[3-(环己基甲基-氨基)-2-羟基-丙基]-1H-吲哚-5-基}-甲酮；(4-苄基-哌啶-1-基)-{1-[2-羟基-3-(4-甲基-哌嗪-1-基)-丙基]-1H-吲哚-5-基}-甲酮；
[1-(3-苄氨基-2-羟基-丙基)-1H-吲哚-5-基]-(4-苄基-哌啶-1-基)-甲酮；
(4-苄基-哌啶-1-基)-{1-[2-羟基-3-(4-甲氧基-苄氨基)-丙基]-1H-吲哚-5-基}-甲酮；
(4-苄基-哌啶-1-基)-[1-(2-羟基-3-丙氨基-丙基)-1H-吲哚-5-基}-甲酮；
(4-苄基-哌啶-1-基)-[1-(吡啶-4-羰基)-1H-吲哚-5-基}-甲酮；
1-[5-(4-苄基-哌啶-1-羰基)-吲哚-1-基]-乙酮；
2-[5-(4-苄基-哌啶-1-羰基)-吲哚-1-基]-N-(4-甲氧基-苄基)-乙酰胺；
5-(4-苄基-哌啶-1-羰基)-1H-吲哚-3-羧酸(2-甲氧基-乙基)-酰胺；
5-(4-苄基-哌啶-1-羰基)-1H-吲哚-3-羧酸(2-甲氨基-乙基)-酰胺；
5-(4-苄基-哌啶-1-羰基)-1H-吲哚-3-羧酸(2-氨基-乙基)-酰胺；
[3-(4-苄基-哌啶-1-羰基)-1H-吲哚-5-基]-(4-苄基-哌啶-1-基)-甲酮；
[3-(4-苄基-哌啶-1-羰基)-1H-吲哚-6-基]-(4-苄基-哌啶-1-基)-甲酮；
5-(4-苄基-哌啶-1-羰基)-1H-吲哚-3-羧酸4-氟-苄酰胺；
5-(4-苄基-哌啶-1-羰基)-1H-吲哚-3-羧酸[2-(3，5-二甲氧基-苯基)-乙基]-酰胺；
(4-苄基-哌啶-1-基)-(6-甲氧基-1H-吲哚-5-基)-甲酮；
1-[5-(4-苄基-哌啶-1-羰基)-1H-吲哚-3-基]-2，2，2-三氟-乙酮；
5-(4-苄基-哌啶-1-羰基)-6-甲氧基-1H-吲哚-3-羧酸(2-二甲氨基-乙基)-酰胺；
5-(4-苄基-哌啶-1-羰基)-1H-吲哚-3-羧酸；
5-(4-苄基-哌啶-1-羰基)-1H-吲哚-3-羧酸(2-二甲氨基-乙基)-酰胺；
(1H-苯并咪唑-5-基)-(4-苄基-哌啶-1-基)-甲酮；
(1H-苯并咪唑-5-基)-[4-(4-氟-苄基)-哌啶-1-基)-甲酮；
(4-苄基-哌啶-1-基)-(3-吗啉-4-基甲基-1H-吲哚-5-基}-甲酮；
1-[6-(4-苄基-哌啶-1-羰基)-1H-吲哚-3-基]-2，2，2-三氟-乙酮；
(4-苄基-哌啶-1-基)-[1-(哌啶-4-羰基)-1H-吲哚-6-基]-甲酮；
(3-苄基-8-氮杂--环[3.2.1]辛-8-基)-(6-甲氧基-1H-吲哚-5-基)-甲酮；
(3H-苯并咪唑-5-基)-(3-苄基-8-氮杂-二环[3.2.1]辛-8-基)-甲酮；
[3-(4-氟-苄基)-吡咯烷-1-基]-(1H-吲哚-6-基)-甲酮；
(1H-苯并咪唑-5-基)-[4-(2，6-二氟-苄基)-哌嗪-1-基]-甲酮；
(1H-苯并咪唑-5-基)-[4-(4-甲基硫烷基-苄基)-哌嗪-1-基]-甲酮；
(1H-苯并咪唑-5-基)-[4-(2，3-二氟-苄基)-哌嗪-1-基]-甲酮；
(1H-苯并咪唑-5-基)-[4-(3，5-二氟-苄基)-哌嗪-1-基]-甲酮；
(1H-苯并咪唑-5-基)-[4-(3-氯-苄基)-哌嗪-1-基]-甲酮；
4-[4-(1H-苯并咪唑-5-羰基)-哌嗪-1-基甲基]-苯甲酸甲酯；
(1H-苯并咪唑-5-基)-[4-(4-甲氧基-苄基)-哌嗪-1-基]-甲酮；
(1H-苯并咪唑-5-基)-[4-(4-三氟甲氧基-苄基)-哌嗪-1-基]-甲酮；
(1H-苯并咪唑-5-基)-[4-(4-甲基-苄基)-哌嗪-1-基]-甲酮；
(1H-苯并咪唑-5-基)-[4-(2，4-二氯-苯甲酰基)-哌嗪-1-基]-甲酮；
(1H-苯并咪唑-5-基)-[4-(3，4-二氯-苯甲酰基)-哌嗪-1-基]-甲酮；
反-1-[4-(1H-苯并咪唑-5-羰基)-哌嗪-1-基]-3-(3-三氟甲基-苯基)-丙烯酮；
(1H-苯并咪唑-5-基)-[4-(4-氯-苯甲酰基)-哌嗪-1-基]-甲酮；
(1H-苯并咪唑-5-基)-(4-苯甲酰基-哌嗪-1-基)-甲酮；
(1H-苯并咪唑-5-基)-[4-(2-三氟甲基-苯甲酰基)-哌嗪-1-基]-甲酮；
(1H-苯并咪唑-5-基)-[4-(4-甲氧基-苯甲酰基)-哌嗪-1-基]-甲酮；
(1H-苯并咪唑-5-基)-[4-(3，4-二氯-苯基)-哌嗪-1-基]-甲酮；
(1H-苯并咪唑-5-基)-{4-[(4-氯-苯基)-苯基-甲基]-哌嗪-1-基}-甲酮；
反-(1H-苯并咪唑-5-基)-[4-(3-苯基-烯丙基)-哌嗪-1-基]-甲酮；
(1H-苯并咪唑-5-基)-{4-[双-(4-氟-苯基)-甲基]-哌嗪-1-基}-甲酮；
(1H-苯并咪唑-5-基)-[4-(4-氯-苄基)-哌嗪-1-基]-甲酮；
(1H-苯并咪唑-5-基)-[4-(2-氯-苄基)-哌嗪-1-基]-甲酮；
(1H-苯并咪唑-5-基)-[4-(3，4，5-三甲氧基-苄基)-哌嗪-1-基]-甲酮；
(1H-苯并咪唑-5-基)-[4-(4-二乙氨基-苄基)-哌嗪-1-基]-甲酮；
(1H-苯并咪唑-5-基)-(4-联苯-4基甲基-哌嗪-1-基)-甲酮；
(1H-苯并咪唑-5-基)-[4-(4-苯氧基-苄基)-哌嗪-1-基]-甲酮；
(4-苄基-哌啶-1-基)-(6-甲氧基-1H-苯并咪唑-5-基)-甲酮；
(4-苄基-哌啶-1-基)-(1-异丙基-1H-苯并咪唑-5-基)-甲酮；
(4-苄基-哌啶-1-基)-(3-异丙基-3H-苯并咪唑-5-基)-甲酮；
(4-苄基-哌啶-1-基)-(1-异丙基-1H-吲哚-5-基)-甲酮；
[4-(4-氯-苄基)-哌嗪-1-基]-(1-异丙基-1H-吲哚-5-基)-甲酮；
(1H-苯并三唑-5-基)-(4-苄基-哌啶-1-基)-甲酮；
(4-苄基-哌啶-1-基)-(1-异丙基-1H-苯并三唑-5-基)-甲酮；
[4-(4-氯-苄基)-哌啶-1-基]-(1H-吲哚-5-基)-甲酮；
[4-(3-氯-苄基)-哌啶-1-基]-(1H-吲哚-5-基)-甲酮；
[4-(2-氯-苄基)-哌啶-1-基]-(1H-吲哚-5-基)-甲酮；
(4-苄基-2-甲基-哌啶-1-基)-(1H-吲哚-5-基)-甲酮；
(4-苄基-哌啶-1-基)-(4-氯-1H-吲哚-5-基)-甲酮；
(4-苄基-哌啶-1-基)-[7-氯-1-(吡啶-3-羰基)-1H-吲哚-6-基]-甲酮；
(4-苄基-哌啶-1-基)-(5-氯-1H-吲哚-6-基)-甲酮；
(4-苄基-哌啶-1-基)-(7-氯-1H-吲哚-6-基)-甲酮；
6-(4-苄基-哌啶-1-羰基)-7-氯-1-(吡啶-3-羰基)-1H-吲哚-3-羧酸(2-二甲氨基-乙基)-酰胺；
(4-苄基-哌啶-1-基)-(1-吡啶-4-基甲基-1H-吲哚-5-基)-甲酮；
(4-苄基-哌啶-1-基)-[6-甲氧基-1-(吡啶-3-羰基)-1H-吲哚-5-基]-甲酮；
[5-(4-苄基-哌啶-1-羰基)-吲哚-1-基]-醋酸甲酯；
1-[5-(4-苄基-哌啶-1-羰基)-吲哚-1-基]-3-异丙氨基-丙-1-酮；
1-[5-(4-苄基-哌啶-1-羰基)-吲哚-1-基]-3-哌嗪-1-基-丙-1-酮；
3-苄氨基-1-[5-(4-苄基-哌啶-1-羰基)-吲哚-1-基]-丙-1-酮；
1-[5-(4-苄基-哌啶-1-羰基)-吲哚-1-基]-3-吗啉-4-基-丙-1-酮；
2-[5-(4-苄基-哌啶-1-羰基)-吲哚-1-基]-N-丙基-乙酰胺；
(4-苄基-哌啶-1-基)-[1-(2-二乙氨基-乙基)-6-甲氧基-1H-吲哚-5-基]-甲酮；
(4-苄基-哌啶-1-基)-[1-(3-二乙氨基-丙基)-1H-吲哚-5-基]-甲酮；
(4-苄基-哌啶-1-基)-[1-(2-二乙氨基-乙基)-1H-吲哚-5-基]-甲酮；
(4-苄基-哌啶-1-基)-[6-氯-1-(3-二乙氨基-丙基)-1H-吲哚-5-基]-甲酮；
[1-(2-二乙氨基-乙基)-1H-吲哚-5-基]-[4-(4-氟-苄基)-哌啶-1-基]-甲酮；
(4-苄基-哌啶-1-基)-[1-(3-二乙氨基-丙基)-6-甲氧基-1H-吲哚-5-基]-甲酮；
5-(4-苄基-哌啶-1-羰基)-1H-吲哚-3-羧酸(2-氨基-乙基)-甲基-酰胺；
5-(4-苄基-哌啶-1-羰基)-1H-吲哚-3-羧酸[2-(3，4-二甲氧基-苯基)-乙基]-酰胺；
(4-苄基-哌啶-1-基)-(3-二乙氨基甲基-1H-吲哚-5-基)-甲酮；
[4-(4-氟-苄基)-哌啶-1-基]-(6-甲氧基-1H-吲哚-5-基)-甲酮；
(4-苄基-哌啶-1-基)-(1-吡啶-4-基-1H-吲哚-5-基)-甲酮；
以及4(4-苄基-哌啶-1-基)-(4-氯-2-甲基-1H-吲哚-5-基)-甲酮，或任何前述化合物的药物可接受的盐、或其衍生物、或其酯、或其类似物。
在一些实施方案中，特别关注任意如下SAPK抑制剂化合物、或其药物可接受的盐、或其衍生物、或其酯、或其类似物的应用：
该化合物的IUPAC命名为[2-(2-氯-苯基)-喹唑啉-4-基]-吡啶-4-基-胺。任意如下化合物也适于应用：
[2-(2，6-二氯-苯基)-喹唑啉-4-基]-吡啶-4-基-胺；
吡啶-4-基-(2-邻-甲苯基-喹唑啉-4-基)-胺；
[2-(2-溴-苯基)-喹唑啉-4-基]-吡啶-4-基-胺；
[2-(2-氟-苯基)-喹唑啉-4-基]-吡啶-4-基-胺；
[2-(2，6-二氟-苯基)-喹唑啉-4-基]-吡啶-4-基-胺；
(2-苯基-喹唑啉-4-基]-吡啶-4-基-胺；
[2-(4-氟-苯基)-喹唑啉-4-基]-吡啶-4-基-胺；
[2-(4-甲氧基-苯基)-喹唑啉-4-基]-吡啶-4-基-胺；
[2-(3-氟-苯基)-喹唑啉-4-基]-吡啶-4-基-胺；
异丙基-(2-苯基-喹唑啉-4-基)-吡啶-4-基-胺；
(4-甲氧基-苄基)-(2-苯基-喹唑啉-4-基)-吡啶-4-基-胺；
(2-苯基-喹唑啉-4-基)-吡啶-4-基甲基-胺；
[2-(4-氯-苯基)-喹唑啉-4-基]-吡啶-4-基甲基-胺；
(2-苯基-喹唑啉-4-基)-吡啶-3-基-胺；
(2-苯基-喹唑啉-4-基)-吡啶-2-基甲基-胺；
(2-苯基-喹唑啉-4-基)-吡啶-3-基甲基-胺；
(2-苯基-喹唑啉-4-基)-(2-吡啶-2-基-乙基)-胺；
(2-苯基-喹唑啉-4-基)-嘧啶-4-基-胺；
(2-苯基-喹唑啉-4-基)-嘧啶-2-基-胺；
苯基-(2-苯基-喹唑啉-4-基)-胺；
苄基-[2-(3-氯-苯基)-喹唑啉-4-基]-胺；
3-(2-苯基-喹唑啉-4-基氨基)-苯酚；
2-(2-苯基-喹唑啉-4-基氨基)-苯酚；
4-(2-苯基-喹唑啉-4-基氨基)-苯酚；
(1H-吲哚-4-基)-(2-苯基-喹唑啉-4-基)-胺；
(1H-吲哚-5-基)-(2-苯基-喹唑啉-4-基)-胺；
(4-甲氧基-苯基)-(2-苯基-喹唑啉-4-基)-胺；
(3-甲氧基-苯基)-(2-苯基-喹唑啉-4-基)-胺；
(2-甲氧基-苯基)-(2-苯基-喹唑啉-4-基)-胺；
2-[4-(2-苯基-喹唑啉-4-基氨基)-苯基]-乙醇；
3-(2-苯基-喹唑啉-4-基氨基)-苄腈；
(2，5-二氟-苄基)-(2-苯基-喹唑啉-4-基)-胺；
[4-(2-丁基)-苯基]-(2-苯基-喹唑啉-4-基)-胺；
N，N-二甲基-N-(2-苯基-喹唑啉-4-基)-苯-1，4-二胺；
[2-(2-氯-苯基)-6，7-二甲氧基-喹唑啉-4-基]-吡啶-4基-胺；
[2-(2-氟-苯基)-6-硝基-喹唑啉-4-基]-吡啶-4基-胺；
2-(2-氟-苯基)-N4-吡啶-4-基-喹唑啉-4，6-二胺；
2-(2-氟-苯基)-N4-吡啶-4-基-喹唑啉-4，7-二胺；
2-(2-氟-苯基)-N6-(3-甲氧基-苄基)-N4-吡啶-4-基-喹唑啉-4，6-二胺；
2-(2-氟-苯基)-N6-(4-甲氧基-苄基)-N4-吡啶-4-基-喹唑啉-4，6-二胺；
N6-异丁基-2-(2-氟-苯基)-N4-比啶-4-基-喹唑啉-4，6-二胺；
2-(2-氟-苯基)-N6-(4-甲基硫烷基-苄基)-N4-吡啶-4-基-喹唑啉-4，6-二胺；
4-(4-吡啶氨基)-2-(4-氯苯基)喹唑啉；
2-苯基-4-(2-吡啶氨基)-喹唑啉；以及
[2-(2-氟-苯基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-4-基]-吡啶-4-基-胺；或任意前述化合物的药物可接受的盐、或其衍生物、或其酯、或其类似物。
另一适合的SAPK抑制剂是BIRB796(1-(5-叔丁基-2-对甲苯基-2H-吡唑-3-基)-3-[4-(2-吗啉-4-基-乙氧基)-萘-1-基]-脲)；参见第6,319,921号美国专利。
BIRB796具有如下结构：
BIRB796的药物活性的衍生物、类似物、酯和盐也适合于应用。
另一适合的SAPK抑制剂是2(1H)-喹唑啉酮，如下所示：
2(1H)-喹唑啉酮的药物活性衍生物、类似物、酯和盐也适合于应用。
VX-745(Vertex Pharmaceuticals and Kissei Pharmaceutical Co.)也适合于应用。已报道VX-745抑制p38的多个同种型，包括p38-α、p38-β和p38-γ。
吡非尼酮及其类似物
吡非尼酮(5-甲基-1-苯基-2-(1H)-吡啶酮)及特定的吡非尼酮类似物可用于加强本文所公开的治疗HCV感染的方法。
吡非尼酮
吡非尼酮类似物
I.
II.A II.B
取代基R1、R2、X的说明
R1：碳环基(饱和的和不饱和的)、杂环基(饱和的和不饱和的)、烃基(饱和的和不饱和的)。实例包括苯基、苄基、嘧啶基、萘基、吲哚基、吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、环己基、哌啶基、吡咯烷基、吗啉基、环己烯基、丁间二烯基等等。
R1还可包括所述碳环或杂环基部分被如下取代基取代：卤素、硝基、氨基、羟基、烷氧基、羧基、氰基、硫基、烷基、芳基、杂烷基、杂芳基及其组合；例如，4-硝基苯基、3-氯苯基、2，5-二硝基苯基、4-甲氧基苯基、5-甲基-吡咯基、2，5-二氯环己基、胍基-环己烯基等等。
R2：烷基、碳环基、芳基、杂环基、羟基、烷氧基、羧基。实例包括：甲基、乙基、丙基、异丙基、苯基、4-硝基苯基、噻吩基、羟基、甲氧基、羧基等等。
X：可以是在碳环或杂环上的任意数目(1至3)的取代基。该取代基可以相同或不同。取代基可包括氢、烷基、杂烷基、芳基、杂芳基、卤素、硝基、羧基、羟基、氰基、氨基、硫基、烷基氨基、卤代芳基等等。
所述取代基还可被1-3个选自如下的取代基任选地取代：烷基、芳基、硝基、烷氧基、羟基和卤素基团。实例包括：甲基、2，3-二甲基、苯基、对甲苯基、4-氯苯基、4-硝基苯基、2，5-二氯苯基、呋喃基、噻吩基等等。
具体的实例包括表10中所示的例子：
表10
IA IB
| 5-甲基-1-(2’-吡啶基)-2-(1H)吡啶 | 6-甲基-1-苯基-3-(1H)吡啶酮 |
| 6-甲基-1-苯基-2-(1H)吡啶酮 | 5-甲基-1-对-甲苯基-3-(1H)吡啶酮 |
| 5-甲基-3-苯基-1-(2’-噻吩基)-2-(1H)吡啶酮 | 5-甲基-1-(2’-萘基)-3-(1H)吡啶酮 |
| 5-甲基-1-(2’-萘基)-2-(1H)吡啶酮 | 5-甲基-1-苯基-3-(1H)吡啶酮 |
| 5-甲基-1-对-甲苯基-2-(1H)吡啶酮 | 5-甲基-1-(5’-喹啉基)-3-(1H)吡啶酮 |
| 5-甲基-1-(1’-萘基)-2-(1H)吡啶酮 | 5-乙基-1-苯基-3-(1H)吡啶酮 |
| 5-乙基-1-苯基-2-(1H)吡啶酮 | 5-甲基-1-(4’-甲氧基苯基)-3-(1H)吡啶酮 |
| 5-甲基-1-(5’-喹啉基)-2-(1H)吡啶酮 | 4-甲基-1-苯基-3-(1H)吡啶酮 |
| 5-甲基-1-(4’-喹啉基)-2-(1H)吡啶酮 | 5-甲基-1-(3’-吡啶基)-3-(1H)吡啶酮 |
| 5-甲基-1-(4’-吡啶基)-2-(1H)吡啶酮 | 5-甲基-1-(2’-噻吩基)-3-(1H)吡啶酮 |
| 3-甲基-1-苯基-2-(1H)吡啶酮 | 5-甲基-1-(2’-吡啶基)-3-(1H)吡啶酮 |
| 5-甲基-1-(4’-甲氧基苯基)-2-(1H)吡啶酮 | 5-甲基-1-(2’-喹啉基)-3-(1H)吡啶酮 |
| 1-苯基-2-(1H)吡啶酮 | 1-苯基-3-(1H)吡啶 |
| 1，3-二苯基-2-(1H)吡啶酮 | 1-(2’-呋喃基)-5-甲基-3-(1H)吡啶酮 |
| 1，3-二苯基-5-甲基-2-(1H)吡啶酮 | 1-(4’-氯苯基)-5-甲基-3-(1H)吡啶 |
| 5-甲基-1-(3’-三氟甲基苯基)-2-(1H)吡啶酮 |
| 3-乙基-1-苯基-2-(1H)吡啶酮 | |
| 5-甲基-1-(3’-吡啶基)-2-(1H)吡啶酮 | |
| 5-甲基-1-(3-硝基苯基)-2-(1H)吡啶酮 | |
| 3-(4’-氯苯基)-5-甲基-1-苯基-2-(1H)吡啶酮 | |
| 5-甲基-1-(2’-噻吩基)-2-(1H)吡啶酮 | |
| 5-甲基-1-(2’-噻唑基)-2-(1H)吡啶酮 | |
| 3，6-二甲基-1-苯基-2-(1H)吡啶酮 | |
| 1-(4’-氯苯基)-5-甲基-2-(1H)吡啶酮 | |
| 1-(2’-咪唑基)-5-甲基-2-(1H)吡啶酮 | |
| 1-(4’-硝基苯基)-2-(1H)吡啶酮 | |
| 1-(2’-呋喃基)-5-甲基-2-(1H)吡啶酮 | |
| 1-苯基-3-(4’-氯苯基)-2-(1H)吡啶 |
第3,974,281；3,839,346；4,042,699；4,052,509；5,310,562；5,518,729；5,716,632和6,090,822号美国专利描述了合成吡非尼酮和特定的吡非尼酮类似物以及将它们配制在药物组合物中方法，它们适用于本发明所述方法。
TNF拮抗剂
适用于本文的TNF-α拮抗剂包括降低TNF-α合成水平的试剂、阻断或抑制TNF-α与TNF-α受体(TNFR)结合的试剂、以及阻断或抑制TNFR介导的信号转导的试剂。除非另有清楚地说明，本文每次提及的“TNF-α拮抗剂”或“TNF拮抗剂”应理解为是指不同于SAPK抑制剂(包括吡非尼酮和吡非尼酮类似物)的TNF-α拮抗剂。
本文所用的术语“TNF受体多肽”和“TNFR多肽”指来源于TNFR(来自任何物种)的能够结合TNF的多肽。两种截然不同的细胞表面TNFR已被描述：II型TNFR(或p75 TNFR或TNFRII)和I型TNFR(或p55 TNFR或TNFRI)。成熟的全长的人p75 TNFR是具有约75-80千道尔顿(kD)分子量的糖蛋白。成熟的全长的人p55 TNFR是具有约55-60千道尔顿(kD)分子量的糖蛋白。示例性的TNFR多肽源于I型TNFR和/或II型TNFR。可溶性TNFR包括p75 TNFR多肽；p75 TNFR与诸如免疫球蛋白Fc部分的异源的融合配偶体的融合物。
TNFR多肽可以是完整的TNFR或TNFR的合适片段。第5,605,690号美国专利提供了TNFR多肽的实例，包括适用于本发明的可溶性TNFR多肽。在许多实施方案中，所述TNFR多肽包括TNFR的胞外结构域。在一些实施方案中，所述TNFR多肽是含有与免疫球蛋白分子恒定区连接的TNFR胞外结构域的融合多肽。在其它实施方案中，所述TNFR多肽是含有与IgG1分子恒定区连接的p75 TNFR的胞外结构域的融合多肽。在一些实施方案中，当试图向人给药时，用于融合蛋白的Ig是人的，如人IgG1。
TNFR多肽的单价和多价形式可用于本发明。TNFR多肽的多价形式具有多于一个的TNF结合位点。在一些实施方案中，所述TNFR是二价或二聚体形式的TNFR。例如，如在第5,605,690号美国专利和在Mohler等人，1993，J.Immunol.，151：1548-1561中所述的，具有替代免疫球蛋白重链或轻链的可变区之一或二者的TNFR胞外结构域的嵌合抗体多肽提供了用于本发明的TNFR多肽。通常，当这类嵌合的TNFR：抗体多肽是由细胞产生时，其通过免疫球蛋白结构域之间的二硫键形成二价分子。这类的TNFR：抗体多肽称为TNFR:Fc。
在一个实施方案中，本发明方法涉及给予有效量的可溶性TNFRENBREL依那西普。ENBREL是由与人IgG1的Fc部分连接的人75千道尔顿(p75)TNFR的细胞外配体结合部分组成的二聚融合蛋白。ENBREL的Fc成分包含CH2域、CH3域和铰链区，但不含IgG1的CH1域。ENBREL是在中国仓鼠卵巢(CHO)哺乳动物细胞表达系统中产生的。其由934个氨基酸组成并具有约150千道尔顿的表观分子量。Smith等人(1990)Science 248：1019-1023；Mohler等人(1993)J.Immunol.151：1548-1561；第5,395,760号和第5,605,690号美国专利。
结合TNF-α的单克隆抗体也适合于应用。单克隆抗体包括“人源化的”小鼠单克隆抗体；嵌合抗体；在氨基酸序列中含至少约80％、至少约90％、至少约95％、或100％人氨基酸序列的单克隆抗体等等。例如参见WO 90/10077；WO 90/04036和WO 92/02190。适合的单克隆抗体包括抗体片段，如Fv、F(ab’)2和Fab；合成抗体；人工抗体；噬菌体展示抗体等等。
适合的单克隆抗体的实例包括英利昔单抗(REMICADE，Centocor)和阿达木单抗(HUMIRATM，Abbott)。REMICADE是包括约25％鼠氨基酸序列和约75％人氨基酸序列的嵌合的单克隆抗TNF-α抗体。REMICADE包含与人IgG1恒定区融合的小鼠单克隆抗TNF-α抗体的可变区。Elliott等人(1993)Arthritis Rheum.36：1681-1690；Elliott等人(1994)Lancet 344：1105-1110；Baert等人(1999)Gastroenterology 116：22-28。HUMIRATM是采用噬菌体展示技术鉴别的人的全长的IgG1单克隆抗体。Piascik(2003)J Am.Pharm.Assoc.43：327-328。
评价TNF拮抗剂活性的方法是本领域内公知的并在本文中举例说明。例如，可采用基于细胞的竞争性结合分析评价TNF拮抗剂活性。在这种分析中，将放射标记的TNF与连续稀释的TNF拮抗剂和表达细胞膜结合的TNFR的细胞混合。将混悬液部分离心以分离游离的和结合的TNFR，并测定在游离部分和结合部分中放射性量。在TNF拮抗剂的存在时，通过抑制TNF与细胞结合，评价TNF拮抗剂活性。
作为另一实例，可将对TNF的细胞毒活性易感的细胞用作靶细胞，在生物测定中分析TNF拮抗剂体外消除TNF活性的能力。在这类测定中，用不同量的TNF拮抗剂处理用TNF培养的靶细胞，随后检查细胞溶解。通过在TNF拮抗剂存在下由TNF诱导的靶细胞细胞溶解的减少评价TNF拮抗剂活性。
TGF-β拮抗剂
适用于本发明治疗方法的TGF-β拮抗剂包括降低TGF-β合成水平的试剂、阻断或抑制TGF-β与TGF-β受体结合的试剂以及阻断或抑制TGF-β受体介导的信号转导的试剂。本文所使用的术语“TGF-β拮抗剂”指降低TGF-β合成水平的任何试剂、阻断或抑制TGF-β与TGF-β受体结合的任何试剂以及阻断或抑制TGF-β受体介导的信号转导的任何试剂。除非另有清楚地说明，本文每一提及的“TGF-β拮抗剂”应理解为不同于SAPK抑制剂(包括吡非尼酮和吡非尼酮类似物)的TGF-β拮抗剂。本文所用的术语“TGF-β”包括任何TGF-β亚型，包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。适合的TGF-β拮抗剂包括但不限于对TGF-β特异的抗体(包括对特定的TGF-β亚型特异的抗体；以及与两种或多种TGF-β亚型有交叉反应的抗体)；针对TGF-β受体的抗体；可溶性TGF-β受体；核心蛋白多糖(decorin)和抑制TGF-β信号的试剂。
适合的TGF-β拮抗剂包括对TGF-β特异的抗体。对TGF-β特异的抗体是本领域内公知的。参见，例如，第5,783,185、5,772,998、5,674,843、5,571,714、5,462,925和5,426,098号美国专利；WO 97/13844；和公开号20030064069和20030091566的美国专利。适合的抗TGF-β抗体的非限制性实例包括CAT-152(lerdelibumab；TrabioTM；Cambridge AntibodyTechnology)，人抗TGF-β2单克隆抗体；CAT-192(metelimumab；CambridgeAntibody Technology)，人抗TGF-β1单克隆抗体；以及GC-1008(GenzymeCorp.)，对TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3具有广泛特异性的人单克隆抗体。
适合的TGF-β拮抗剂包括可溶性TGF-β受体。可溶性TGF-β受体通常缺乏天然存在的TGF-β受体的大部分或全部的跨膜部分，因此该蛋白不是膜结合的，而保留了TGF-β结合。可溶性TGF-β受体包括含有框内(in-frame)与异源(非TGF-β受体)蛋白(“融合配偶体”)融合的TGF-β受体一部分的可溶性融合蛋白。融合配偶体的非限制性例子为免疫球蛋白Fc、多组氨酸等等。可溶性TGF-β受体已在本领域内描述。参见，例如，Wang等人(1999)Thorax 54：805-812；George等人(1999)Proc.Natl.Acad.SciUSA 96：12719-12724；Muraoka等人(2002)J.Clin.Invest.109：1551-1559；和Yata等人(2002)Hepatology 35：1022-1030。
TGF-β拮抗剂包括GleevecTM。GleevecTM(也称为STI-571或CGP57148B)化学名为4-[(4-甲基-1-哌嗪基)甲基]-N-[4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基-苯基]苯甲酰胺甲磺酸盐，通常称为甲磺酸伊马替尼并以商标GleevecTM进行销售。GleevecTM是靶向Bcr-Abl酪氨酸激酶的激酶结构域的ATP结合位点的2-苯氨基嘧啶(参见，例如，Druker等人(1996)Nature Med.2，561和Buchdunger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA92：2558-2562)。
在某些实施方案中，所述试剂为第5,521,184号美国专利中描述的嘧啶衍生物，在此将其公开内容引入作为参考。在这些实施方案中，式(I)的N-苯基2-嘧啶-胺衍生物是令人关注的：
其中
R9’是氢或低级烷基，
X是氧代、硫代、亚氨基、N-低级烷基-亚氨基、肟基或O-低级烷基-肟基，
Y是氧或基团NH，
k是0或1，以及
R10是具有至少5个碳原子的脂肪族基、或芳基、芳族-脂肪族基、脂环基、脂环族-脂肪族基、杂环基或杂环-脂肪族基，
以及剩余的基团R4’、R5’、R6’、R7’和R8’均相互独立地为氢、未取代的低级烷基、或被如下基团取代的低级烷基：游离的或烷基化的氨基、哌嗪基、哌啶基、吡咯烷基、或吗啉基、或低级的烷酰基、三氟甲基、游离的、醚化或酯化的羟基、游离的、烷基化或酰基化的氨基、或游离的或酯化的羧基，
以及具有至少一个成盐基团的这类化合物的盐。
在这些实施方案中：
1-甲基-1H-吡咯基优选1-甲基-1H-吡咯-2-基或1-甲基-1H-吡咯-3-基。
氨基取代的或氨基-低级烷基取代的苯基R1(其中在每种情况下该氨基基团是游离的、烷基化或酰基化的)是在任何所需位置上(邻位、间位或对位)取代的苯基，其中烷基化的氨基基团优选单或二低级烷基氨基，如，二甲氨基，以及氨基-低级烷基的低级烷基部分优选直链C1-C3烷基，尤其例如甲基或乙基。
在五元环的碳原子处键合的1H-吲哚基为1H-吲哚-2-基或1H-吲哚-3-基。
在环碳原子处键合的未取代的或低级烷基取代的吡啶基是低级烷基取代的或优选未取代的2-吡啶基、或优选3-吡啶基或4-吡啶基，例如，3-吡啶基、2-甲基-3-吡啶基、4-甲基-3-吡啶基或4-吡啶基。在氮原子处被氧取代的吡啶基是源于吡啶N-氧化物的基团，即，诸如N-氧化-4-吡啶基的N-氧化-吡啶基。
氟取代的低级烷氧基是含有至少一个，但优选多个氟取代基的低级烷氧基，尤其为三氟甲氧基或优选1，1，2，2-四氟乙氧基。
当X是氧代、硫代、亚氨基、N-低级烷基-亚氨基、肟基或O-低级烷基-肟基时，上述顺序中基团C＝X分别为基团C＝O、C＝S、C＝N-H、C＝N-低级烷基、C＝N-OH或CN-O-低级烷基。X优选氧代。
k优选0，即基团Y不存在。
Y，如果存在，优选基团NH。
在本文范围内的术语“低级”指具有最多达并包括7个碳原子的基团，优选最多达并包括4个碳原子。
低级烷基R1’、R2’、R3’和R9’优选甲基或乙基。
具有至少5个碳原子的脂肪族基团R10具有不超过22个碳原子，通常不超过10个碳原子，且是取代的或优选未取代的这种脂肪族烃基，即取代的或优选未取代的这种炔基、烯基或优选烷基基团，如C5-C7烷基，例如正戊基。芳基R10具有最多达20个碳原子且是未取代或取代的，如对于芳基R10是未取代或取代的萘基的每一情况，尤其如2-萘基，或优选苯基，所述取代基优选地选自氰基、未取代的低级烷基或羟基-、氨基-或4-甲基-哌嗪基-取代的低级烷基，尤其例如甲基、三氟甲基、游离的、醚化或酯化的羟基、游离的、烷基化或酰基化的氨基和游离的或酯化的羧基。在芳族-脂肪族基团R10中，芳族部分为如上定义，且脂肪族部分优选低级烷基，尤其例如C1-C2烷基的，其为取代的或优选未取代的，例如苄基。脂环基R10具有尤其多达30个碳原子，更尤其多达20个碳原子且最尤其多达10个碳原子，该脂环基R10为单环或多环且是取代的或优选未取代的，例如环烷基，尤其如5元或6元环烷基，如优选环己基。在脂环族-芳族基团R10中，该脂环族部分为如上定义，且该脂肪族部分优选低级烷基，尤其如C1-C2烷基，其为取代的或优选未取代的。杂环基R10尤其含有多达20个碳原子，且优选具有5元或6元环及1-3个优选选自氮、氧和硫的杂原子的饱和或不饱和单环基，尤其例如噻吩基或2-、3-或4-吡啶基或二环基或三环基，其中，例如，一个或两个苯基与所提及的单环基稠合(annellated)(稠合fused)。在杂环-脂肪族基R10中，该杂环部分为如上定义，且该脂肪族部分优选低级的烷基，尤其如C1-C2烷基，其为取代的或优选未取代的。
醚化的羟基优选低级烷氧基。酯化的羟基优选被诸如低级链烷酸的有机羧酸或诸如氢卤酸的矿物酸酯化的羟基，例如低级的烷酰氧基或尤其卤素，如碘、溴或尤其氟或氯。
烷基化的氨基为例如低级烷基氨基，如甲氨基，或二低级烷基烷基，如二甲氨基。酰基化的氨基为例如低级烷酰基氨基或苯甲酰基氨基。
酯化的羧基为例如低级烷氧基羰基，如甲氧基羰基。
取代的苯基基团可具有多达5个取代基，如氟，但是尤其在相对大的取代基的情况中，该取代的苯基基团通常只被1-3个取代基取代。特别提及的取代的苯基的实例为4-氯-苯基、五氟代苯基、2-羧基-苯基、2-甲氧基-苯基、4-氟苯基、4-氰基-苯基和4-甲基苯基。
在通式(I)化合物中成盐基团为具有碱性或酸性性质的基团。具有诸如游离的氨基基团、吡嗪基或吡啶基的至少一个碱性基团的化合物可例如与无机酸或与适合的有机羧酸或磺酸形成酸加合盐，所述无机酸例如盐酸、硫酸或磷酸，所述有机羧酸或磺酸为例如脂肪族的单羧酸或二羧酸，如三氟醋酸、醋酸、丙酸、羟基乙酸、琥珀酸、马来酸、延胡索酸、羟基马来酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸或草酸或诸如精氨酸或赖氨酸的氨基酸，芳族羧酸，如苯甲酸、2-苯氧基-苯甲酸、2-乙酰氧基苯甲酸、水杨酸、4-氨基水杨酸，芳族-脂肪族羧酸，如扁桃酸或肉桂酸，杂芳香族羧酸，如烟酸或异烟酸、脂肪族磺酸，如甲磺酸、乙磺酸或2-羟基乙磺酸，或芳族磺酸，如苯磺酸、对甲苯磺酸或萘-2-磺酸。当存在多个碱性基团时，可形成单酸加合盐或多酸加合盐。
具有酸性基团的式(I)化合物，例如在基团R10中存在游离的羧基基团，则可形成金属盐或铵盐，如碱金属盐或碱土金属盐，如钠盐、钾盐、镁盐或钙盐，或与氨或合适的有机胺或杂环碱形成的铵盐，该有机胺为例如叔单胺，如三乙胺或三-(2-羟乙基)胺，该杂环碱为例如N-乙基哌啶或N，N’-二甲基-哌嗪。
具有酸性基团和碱性基团的式(I)化合物可形成内盐。
在这些实施方案中，特别关注嘧啶衍生物，在该衍生物中R1’为3-吡啶基，R2’、R3’、R5’、R6’和R8’均为氢，R4’为甲基，R7’为式(II)基团，其中R9’为氢，X为氧代，k为0及R10为4-[(4-甲基-1-哌嗪)甲基]苯基。化学名为4-[(4-甲基-1-哌嗪)甲基]-N-[4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基-苯基]苯甲酰胺甲磺酸盐的此化合物的甲磺酸盐通常称为甲磺酸伊马替尼并以商标GleevecTM销售。
内皮素受体拮抗剂
适用于本发明的内皮素受体拮抗剂包括降低内皮素合成水平的试剂，阻断或抑制内皮素与内皮素受体结合的试剂，以及阻断或抑制内皮素受体介导的信号转导的试剂。本文所用的术语“内皮素拮抗剂”指降低内皮素合成水平的任何试剂，阻断或抑制内皮素与内皮素受体结合的任何试剂，以及阻断或抑制内皮素受体介导的信号转导的任何试剂。
在一些实施方案中，内皮素受体拮抗剂对内皮素A(ETA)受体具有选择性。在一些实施方案中，内皮素受体拮抗剂对内皮素B(ETB)受体具有选择性。在其它实施方案中，内皮素受体拮抗剂为ETA和ETB受体两者的拮抗剂。
可用于本发明的内皮素拮抗剂的具体实例包括但不限于阿曲生坦(atrasentan)(ABT-627；Abbott Laboratories)、VeletriTM(替唑生坦(tezosentan)；Actelion Pharmaceuticals，Ltd.)、塞他生坦(sitaxsentan)(ICOS-TexasBiotechnology)、恩拉生坦(enrasentan)(GlaxoSmithKline)，达卢生坦(darusentan)(LU135252；Myogen)BMS-207940(Bristol-Myers Squibb)、BMS-193884(Bristol-Myers Squibb)、BMS-182874(Bristol-Myers Squibb)、J-104132(Banyu Pharmaceutical)、VML 588/Ro 61-1790(VanguardMedica)、T-0115(Tanabe Seiyaku)、TAK-044(Takeda)、BQ-788(BanyuPharmaceutical)、BQ123、YM-598(Yamanouchi Pharma)、PD145065(Parke-Davis)、A-127722(Abbott Laboratories)、A-192621(AbbottLaboratories)、A-182086(Abbott Laboratories)、TBC3711(ICOS-TexasBiotechnology)、BSF208075(Myogen)、S-0139(Shionogi)、TBC2576(TexasBiotechnology)、TBC3214(Texas Biotechnology)、PD156707(Parke-Dayis)、PD180988(Parke-Davis)、ABT-546(Abbott Laboratories)、ABT-627(AbbottLaboratories)、SB247083(GlaxoSmithKline)、SB 209670(GlaxoSmithKline)；以及本领域中讨论的内皮素受体拮抗剂，例如Davenport和Battistini(2002)ClinicalScience 103：15-35、Wu-Wong等人(2002)Clinical Science103：1075-1115以及Luescher和Barton(2000)Circulation 102：2434-2440。
适合的内皮素受体拮抗剂为TRACLEERTM(波生坦(bosentan)；由Actelion Pharmaceuticals，Ltd.制备)。TRACLEERTM是口服的活性双内皮素受体拮抗剂，阻断内皮素与其两个受体内皮素受体A和内皮素受体B的结合。
TRACLEERTM属于高度取代的嘧啶衍生物类，不具有手性中心。其化学命名为4-叔丁基-N-[6-(2-羟基-乙氧基)-5-(2-甲氧基-苯氧基)-[2，2’]-联嘧啶-4-基]-苯磺酰胺一水合物并具有如下结构式：
在一些实施方案中，TRACLEERTM治疗为将其以62.5mg的剂量每日两次口服给药，持续4周，随后以125mg的维持剂量每日两次口服给药。
N-乙酰半胱氨酸(NAC)
N-乙酰半胱氨酸(NAC)是含硫氨基酸L-半胱氨酸的稳定形式。NAC是清除H2O2和其它自由基的抗氧化剂。其是谷胱甘肽(主要的抗氧化剂)的前体，为谷胱甘肽的合成提供半胱氨酸底物。NAC作为非处方类的营养补充剂或营养品可商业获得。适用于本发明的NAC产物包括由SourceNaturals(1000mg片剂)、Biochem(750mg片剂)、Twinlab(600mg片剂)、Nutricology/Allergy Research Group(500mg片剂)等等生产的NAC营养补充剂产品。这类产品可从健康食品商店和诸如General NutrionCorporation(GNC)的营养补充品零售商中以最低成本购买。
胸腺素-α
胸腺素-α(ZadaxinTM；可从SciClone Pharmaceuticals，Inc.San Mateo，CA得到)是胸腺素α-1的合成形式，胸腺素α-1为在循环中天然发现的激素，由胸腺产生。胸腺素-α增加T细胞和NK细胞的活性。为皮下注射配制的ZadaxinTM是与人胸腺素α-1完全相同的化学合成的胸腺素α-1的纯的无菌冻干制剂。胸腺素α-1是具有如下序列的乙酰化的多肽：Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-VaI-Asp-Thr-Ser-Ser-GIu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-G1u-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH(SEQ ID NO：103)，并具有3,108道尔顿的分子量。该冻干制剂含有1.6mg合成的胸腺素-α、50mg甘露醇和磷酸钠缓冲液以调节pH至6.8。
利巴韦林
从ICN Pharmaceuticals，Inc.，Costa Mesa，Calif得到的利巴韦林(1-β-D-呋喃核糖基-1H-1，2，4-三唑-3-羧酰胺)在默克索引中有描述(第8199号化合物，第十一版)。在第4,211,771号美国专利中描述了它的生产和制剂。本发明还关注利巴韦林的衍生物(参见，例如，第6,277,830号美国专利)的应用。利巴韦林克以胶囊或片剂形式口服给药，或以与IFN-α(或者PEG化形式或者非PEG化形式)相同或不同的给药形式及相同或不同的给药途径给药。当然，因为它们是可得到的，因此可考虑两个药物的其它给药形式，如通过鼻腔喷雾、经皮肤地、通过栓剂、通过缓释剂型等等给药。只要输送恰当的剂量，而不破坏活性成分，可使用任何给药形式。
利巴韦林通常以约400mg至约1200mg每天、约600mg至约1000mg每天或约700mg至约900mg每天的量给药。在一些实施方案中，利巴韦林在PEG化IFN-α或非PEG化IFN-α治疗的全部过程自始至终地给药。在其它实施方案中，利巴韦林只在第一阶段给药。在其它实施方案中，利巴韦林只在第二阶段给药。
左旋韦林
左旋韦林是利巴韦林的L-对映异构体，并表现出相对于Th2免疫反应增强Th1免疫反应的性质。左旋韦林由ICN Pharmaceuticals制造。
左旋韦林具有如下结构：
Viramidine
Viramidine是利巴韦林的3-甲脒衍生物，并用作利巴韦林的前药。其被腺苷脱氨酶有效地转化为利巴韦林。
Viramidine具有如下结构：
核苷类似物
适用于本发明疗法的核苷类似物包括，但不限于利巴韦林、左旋韦林、viramidine、艾沙托立宾(isatoribine)、第5,559,101号美国专利所公开并由第5,559,101号美国专利中的式I包括的L-呋喃核糖基核苷(例如，1-β-L-呋喃核糖基尿嘧啶、1-β-L-呋喃核糖基-5-氟尿嘧啶、1-β-L-呋喃核糖基胞嘧啶、9-β-L-呋喃核糖基腺嘌呤、9-β-L-呋喃核糖基次黄嘌呤、9-β-L-呋喃核糖基鸟嘌呤、9-β-L-呋喃核糖基-6-硫代鸟嘌呤、2-氨基-α-L-ribofuranl[1’，2’：4，5]噁唑啉、O2，O2-脱水-1-α-L-呋喃核糖基尿嘧啶、1-α-L-呋喃核糖基尿嘧啶、1-(2，3，5-三-O-苯甲酰基-α-呋喃核糖基)-4-硫尿嘧啶、1-α-L-呋喃核糖基胞嘧啶、1-α-L-呋喃核糖基-4-硫尿嘧啶、1-α-L-呋喃核糖基-5-氟尿嘧啶、2-氨基-β-L-呋喃阿拉伯糖基[1’，2’：4，5]噁唑啉、O2，O2-脱水-β-L-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶、2’-脱氧-β-L-尿苷、3’5-二O-苯甲酰基-2’脱氧-4-硫代β-L-尿苷、2’-脱氧-β-L-胞苷、2’-脱氧-β-L-4-硫尿苷、2’-脱氧-β-L-胸苷、2’-脱氧-β-L-5-氟尿苷、2’，3’-二脱氧-β-L-尿苷、2’-脱氧-β-L-5-氟尿苷和2’-脱氧-β-L-肌苷)；在第6,423,695号美国专利所公开并由第6,423,695号美国专利中的式I包括的化合物；第2002/0058635号美国专利公开所公开的并由第2002/0058635号美国专利公开的式1包括的化合物；WO 01/90121 A2(Idenix)中公开的核苷类似物；WO 02/069903A2(Biocryst Pharmaceuticals Inc.)中公开的核苷类似物；WO 02/057287A2或WO 02/057425 A2(均为Merck/Isis)中公开的核苷类似物等等。
HCV NS3抑制剂
适合的HCV非结构蛋白-3(NS3)抑制剂包括，但不限于第6,642,204、6,534,523、6,420,380、6,410,531、6,329,417、6,329,379和6,323,180号美国专利(Boehringer-Ingelheim)中公开的三肽；第6,143,715号美国专利(Boehringer-Ingelheim)中公开的化合物；第6,608,027号美国专利(Boehringer-Ingelheim)中公开的大环化合物；第6,617,309、6,608,067和6,265,380号美国专利(Vertex Pharmaceuticals)中公开的NS3抑制剂；在第6,624,290号美国专利(Schering)中公开的氮杂肽(azapeptide)化合物；第5,990,276号美国专利(Schering)中公开的化合物；Pause等人(2003)JBiol.Chem.278：20374-20380中公开的化合物；NS3抑制剂BILN2061(Boehringer-Ingelheim；Lamarre等人(2002)Hepatology 36：301A；和Lamarre等人(2003年10月26日)Nature doi：10.1038/nature02099)；NS3抑制剂VX-950(Vertex Pharmaceuticals；Kwong等人(2003年10月24-28日)54th Ann.Meeting AASLD)；NS3抑制剂SCH6(Abib等人(2003年10月24-28日)摘要137.Program and Abstracts of the 54th AnnualMeeting of the American Association for the Study of Liver Diseases(AASLD)(美国肝病研究协会(AASLD)第54届年会的方案和摘要).2003年10月24-28日，Boston，MA.)；在WO 99/07733、WO 99/07734、WO00/09558、WO 00/09543、WO 00/59929或WO 02/060926中公开的任何NS3蛋白酶抑制剂(例如，在WO 02/060926中第224-226页的表中公开的化合物2，3，5，6，8，10，11，18，19，29，30，31，32，33，37，38，55，59，71，91，103，104，105，112，113，114，115，116，120，122，123，124，125，126和127)；公开号2003019067、20030187018和20030186895的美国专利中任一个公开的NS3蛋白酶抑制剂等等。
在许多实施方案中，特别关注为特异性NS3抑制剂的NS3抑制剂，例如抑制NS3丝氨酸蛋白酶活性但对其它丝氨酸蛋白酶，如人白细胞弹性蛋白酶、猪胰弹性蛋白酶或牛胰凝乳蛋白酶，或诸如人肝组织蛋白酶B的半胱氨酸蛋白酶不表现出显著抑制活性的NS3抑制剂。
在一些实施方案中，特别关注抑制HCV非结构蛋白-4(NS4)解旋酶活性但对其它丝氨酸蛋白酶，如人白细胞弹性蛋白酶、猪胰弹性蛋白酶或牛胰凝乳蛋白酶，或诸如人肝组织蛋白酶B的半胱氨酸蛋白酶不表现出显著抑制活性的NS3抑制剂。
NS5B抑制剂
适合的HCV非结构蛋白-5(NS5；RNA-依赖性RNA聚合酶)抑制剂包括但不限于第6,479,508号美国专利(Boehrnger-Ingelheim)中公开的化合物；第PCT/CA02/01127、PCT/CA02/01128和PCT/CA02/01129号国际专利申请中任一个公开的化合物，所述国际专利申请均由BoehringerIngelheim于2002年7月18日提交；在第6,440,985号美国专利(ViroPharma)中公开的化合物；在WO 01/47883中公开的化合物，如JTK-003(JapanTobacco)；在Zhong等人(2003)Antimicrob.Agents Chemother.47：2674-2681中公开的二核苷酸类似物；在Dhanak等人(2002)J.BiolChem.277(41)：38322-7中公开的苯并噻二嗪化合物；在WO 02/100846 A1或WO 02/100851 A2(均为Shire)中公开的NS5B抑制剂；在01/85172 A1或WO 02/098424 A1(均为Glaxo SmithKline)中公开的NS5B抑制剂；在WO 00/06529或WO 02/06246 A1(均为Merck)中公开的NS5B抑制剂；在WO 03/000254(Japan Tobacco)中公开的NS5B抑制剂；在EP 1 256,628A2(Agouron)中公开的NS5B抑制剂；JTK-002(Japan Tobacco)；JTK-109(Japan Tobacco)等等。
在许多实施方案中，特别关注为特异性NS5抑制剂的NS5抑制剂，例如，抑制剂NS5 RNA-依赖性RNA聚合酶但对其它RNA-依赖性RNA聚合酶及对DNA-依赖性RNA聚合酶缺乏显著的抑制作用的NS5抑制剂。
α-葡糖苷酶抑制剂
α-葡糖苷酶抑制剂是一类用于2型糖尿病的口服药物，其减少从肠中吸收碳水化合物，使得2型糖尿病患者一天中血糖较缓慢地增加，尤其是餐后。适用于本发明联合治疗的α-葡糖苷酶抑制剂包括但不限于n-(正壬基)-脱氧半乳糖野尻霉素(deoxygalactonojirimycin)(n，n-DGJ)；N-壬基-脱氧野尻霉素(N-壬基-DNJ)；N-丁基-脱氧野尻霉素(NB-DNJ)；1-脱氧野尻霉素(DNM)；全丁基化-N-丁基-1-脱氧野尻霉素(p-N-丁基-DNJ)；以及6-O-丁酰基栗精胺(butanoyl castanospermine)等等。
另外的抗病毒治疗剂
可在本发明的联合治疗中给药的另外的抗病毒治疗剂包括，但不限于α-葡糖苷酶抑制剂；肌苷一磷酸脱氢酶(IMPDH)抑制剂；互补于病毒苷酸序列的核酶；反义RNA抑制剂等等。
α-葡糖苷酶抑制剂
α-葡糖苷酶抑制剂是一类用于2型糖尿病的口服药物，其减少从肠中吸收碳水化合物，使得2型糖尿病患者一天中血糖较缓慢地增加，尤其是餐后。适用于本发明联合治疗的α-葡糖苷酶抑制剂包括但不限于n-(正壬基)-脱氧半乳糖野尻霉素(n，n-DGJ)；N-壬基-脱氧野尻霉素(N-壬基-DNJ)；N-丁基-脱氧野尻霉素(NB-DNJ)；1-脱氧野尻霉素(DNM)；全丁基化-N-T基-1-脱氧野尻霉素(p-N-丁基-DNJ)和6-O-丁酰基栗精胺等等。
IMPDH抑制剂
适用于本发明联合治疗的IMPDH抑制剂包括，但不限于VX-497((S)-N-3-[3-(3-甲氧基-4-噁唑-5-基-苯基)-脲基]-苄基-氨基甲酸四氢呋喃-3-基-酯)；Vertex Pharmaceuticals；参见，例如，Markland等人(2000)Antimicrob.Agents Chemother.44：859-866)；利巴韦林；左旋韦林(Ribapharm；参见，例如，Watson(2002)Curr Opin Investig Drugs3(5)：680-3)；viramidine(Ribapharm)等等。
适用于本发明联合治疗的核酶和反义抗病毒剂包括，但不限于ISIS14803(ISIS Pharmaceuticals/Elan Corporation；参见，例如，Witherell(2001)Curr Opin Investig Drugs.2(11)：1523-9)；HeptazymeTM等等。
副作用控制剂
在-些实施方案中，本发明的疗法包括给予舒减剂(palliativeagent)(例如，减少有治疗剂引起的患者不适的试剂)，或用于避免、治疗或减少治疗剂的副作用的其它试剂给药。这种试剂也称为“副作用控制剂”。
适合的副作用控制剂包括有效控制疼痛的试剂；改善胃肠不适的试剂；镇痛药；抗炎剂、抗精神病药、抗神经毒素药、抗焦虑剂和造血剂。另外，本发明关注在用本发明疗法进行治疗期间，减轻患者疼痛或任何其它副作用的任何化合物的应用。示例性的舒减剂包括对乙酰氨基酚、布洛芬和其它NSAID、H2阻断剂和抗酸剂。
在本发明所述方法中可用于缓解疼痛的镇痛药包括诸如非甾体抗炎药物(NSAIDs)的非麻醉性镇痛药，如对乙酰氨基酚、水杨酸盐、乙酰水杨酸(阿司匹林、二氟尼柳)、布洛芬、美林(Motrin)、萘普生(Naprosyn)、非诺洛芬(Nalfon)和三水杨酸胆碱镁(Trilisate)、吲哚美辛、葡美辛(glucametacine)、阿西美辛(acemetacin)、舒林酸(sulindac)、萘普生(naproxen)、吡罗昔康(piroxicam)、双氯芬酸(diclofenac)、苯噁洛芬(benoxaprofen)、酮洛芬(ketoprofen)、奥沙普嗪(oxaprozin)、依托度酸(etodolac)、酮咯酸氨基丁三醇(ketorolac tromethamine)、酮咯酸(ketorolac)、萘丁美酮(nabumetone)等等，以及上述两个或多个药物的混合物。
其它合适的镇痛药包括芬太尼(fentanyl)、丁丙诺啡(buprenorphine)、硫酸可待因、盐酸吗啡、可待因、氢吗啡酮(二氢吗啡酮)(hydromorphone(Dilaudid))、左啡诺(左吗喃)(1evorphanol(Levo-Dromoran))、美沙酮(美沙酮)(methadone(Dolophine))、吗啡、羟考酮(在Percodan(羟考酮和阿司匹林)中)(oxycodone(in Percodan))和羟吗啡酮(羟二氢吗啡酮)(oxymorphone(Numorphan))。苯并二氮卓类也适合应用，包括但不限于氟西泮(氟安定)(flurazepam(Dalmane))、地西泮(安定)(diazepam(Valium))和盐酸咪达唑仑(Versed)等等。
抗炎剂
合适的抗炎剂包括但不限于甾体抗炎剂和非甾体抗炎剂。
合适的甾体抗炎剂包括但不限于氢化可的松(hydrocortisone)、羟基去炎松(hydroxyltriamcinolone)、α-甲基地塞米松(alpha-methyldexamethasone)、地塞米松磷酸盐(dexamethasone-phosphate)、二丙酸倍氯米松(beclomethasone dipropionate)、戊酸氯倍他索(clobetasol valerate)、地奈德(desonide)、脱氧米松(desoxymethasone)、醋酸去氧皮质酮(desoxycorticosterone acetate)、地塞米松(dexamethasone)、二氯松(dichlorisone)、双醋酸二氟拉松(diflorasone diacetate)、双氟可龙戊酸酯(diflucortolone valerate)、fluadrenolone、氟氯奈德(fluclorolone acetonide)、氟氢可的松(fludrocortisone)、新戊酸氟米松(flumethasone pivalate)、fluosinolone acetonide、氟轻松(fluocinonide)、flucortine丁基酯、氟可龙(fluocortolone)、醋酸氟泼尼定(氟泼尼定)(fluprednidene(fluprednylidene)acetate)、氟氢缩松(flurandrenolone)、氯氟舒松(halcinonide)、醋酸氢化可的松(hydrocortisone acetate)、丁酸氢化可的松(hydrocortisone butyrate)、甲基强的松龙(methylprednisolone)、曲安奈德(triamcinolone acetonide)、可的松(conisone)、可托多松(cortodoxone)、flucetonide、氟氢可的松(fludrocortisone)、difluorosone diacetate、fluradrenolone acetonide、甲羟松(medrysone)、amcinafel、安西非特(amcinafide)、倍他米松(betamethasone)与其酯的平衡物、氯泼尼松(chloroprednisone)、chlorprednisone acetate、氟可龙(clocortelone)、clescinolone、二氯松(dichlorisone)、二氟泼尼酯(difluprednate)、氟氯奈德(flucloronide)、氟尼缩松(flunisolide)、氟米龙(fluoromethalone)、氟培龙(fluperolone)、氟泼尼龙(fluprednisolone)、戊酸氢化可的松(hydrocortisone valerate)、氢化可的松环戊丙酸酯(hydrocortisone cyclopentylpropionate)、氢可他酯(hydrocortamate)、甲泼尼松(meprednisone)、帕拉米松(paramethasone)、泼尼松龙(prednisolone)、泼尼松(prednisone)、二丙酸倍氯米松(beclomethasone dipropionate)、曲安奈德(triamcinolone)、以及前述两种或多种药物的混合物。
合适的非甾体抗炎剂包括但不限于1)昔康类，如吡罗昔康(piroxicam)、伊索昔康(isoxicam)、替诺昔康(tenoxicam)、舒多昔康(sudoxicam)；2)水杨酸酯类，如阿斯匹林、双水杨酯、扑炎痛(benorylate)、三水杨酸胆碱镁(trilisate)、痛热宁(safapryn)、solprin、二氟尼柳(diflunisal)和芬度柳(fendosal)；3)乙酸衍生物，如双氯芬酸(diclofenac)、芬氯酸(fenclofenac)、吲哚美辛(indomethacin)、舒林酸(sulindac)、托美汀(tolmetin)、伊索克酸(isoxepac)、呋罗芬酸(furofenac)、硫平酸(tiopinac)、齐多美辛(zidometacin)、阿西美辛(acematacin)、芬替酸(fentiazac)、zomepiract、环氯茚酸(clidanac)、奥昔平酸(oxepinac)和联苯乙酸(felbinac)；4)芬那酸类，如甲芬那酸(mefenamic)、甲氯芬那酸(meclofenamic)、氟芬那酸(flufenamic)、尼氟灭酸(niflumic)和托芬那酸(tolfenamic acids)；5)丙酸衍生物，如布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、苯噁洛芬(benoxaprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、酮洛芬(ketoprofen)、非诺洛芬(fenoprofen)、芬布芬(fenbufen)、吲哚洛芬(indoprofen)、吡洛芬(pirprofen)、卡洛芬(carprofen)、奥沙普嗪(oxaprozin)、普拉洛芬(pranoprofen)、咪洛芬(miroprofen)、硫噁洛芬(tioxaprofen)、舒洛芬(suprofen)、阿米洛芬(alminoprofen)、噻洛芬酸(tiaprofenic)；和6)吡唑类，如保泰松(phenylbutazone)、羟布宗(oxyphenbutazone)、非普拉宗(feprazone)、阿扎丙宗(azapropazone)和trimethazone，还可使用这些非甾体抗炎剂的混合物，以及这些试剂的药物可接受的盐和酯。
合适的抗炎剂包括但不限于阿氯芬酸(Alclofenac)；双丙阿氯米松(Alclometasone Dipropionate)；阿孕奈德(Algestone Acetonide)；α淀粉酶(Alpha Amylase)；安西法尔(Amcinafal)；安西非特(Amcinafide)；氨芬酸钠(Amfenac Sodium)；盐酸氨普立糖(Amiprilose Hydrochloride)；阿那白滞素(Anakinra)；阿尼罗酸(Anirolac)；阿尼扎芬(Anitrazafen)；阿扎丙宗(Apazone)；巴柳氮钠(Balsalazide Disodium)；苄达酸(Bendazac)；苯噁洛芬(Benoxaprofen)；盐酸苄达明(Benzydamine Hydrochloride)；菠萝蛋白酶(Bromelains)；溴哌莫(Broperamole)；布地奈德(Budesonide)；卡洛芬(Carprofen)；环洛芬(Cicloprofen)；辛喷他宗(Cintazone)；克利洛芬(Cliprofen)；丙酸氯倍他索(Clobetasol Propionate)；丁酸氯倍他松(Clobetasone Butyrate)；氯吡酸(Clopirac)；丙酸氯硫卡松(CloticasonePropionate)；Cormethasone Acetate；可托多松(Cortodoxone)；地夫可特(Defiazacort)；地索奈德(Desonide)；去羟米松(Desoximetasone)；二丙酸地塞米松(Dexamethasone Dipropionate)；双氯芬酸钾(DiclofenacPotassium)；双氯芬酸钠(Diclofenac Sodium)；双醋酸二氟拉松(DiflorasoneDiacetate)；二氟米酮钠(Difiumidone Sodium)；二氟尼柳(Diflunisal)；二氟泼尼酯(Difluprednate)；地弗他酮(Diftalone)；二甲亚砜(DimethylSulfoxide)；羟西奈德(Drocinonide)；恩甲羟松(Endrysone)；恩莫单抗(Enlimomab)；依诺利康钠(Enolicam Sodium)；依匹唑(Epirizole)；依托度酸(Etodolac)；依托芬那酯(Etofenamate)；联苯乙酸(Felbinac)；非那莫(Fenamole)；芬布芬(Fenbufen)；芬氯酸(Fenclofenac)；苯克洛酸(Fenclorac)；芬度柳(Fendosal)；Fenpipalone；芬替酸(Fentiazac)；夫拉扎酮(Flazalone)；氟扎可特(Fluazacort)；氟芬那酸(Flufenamic Acid)；芬氟咪唑(Flumizole)；醋酸氟尼缩松(Flunisolide Acetate)；氟尼辛(Flunixin)；氟尼辛葡甲胺(Flunixin Meglumine)；丁基氟可丁(Fluocortin Butyl)；氟米龙醋酸酯(Fluorometholone Acetate)；氟喹宗(Fluquazone)；氟比洛芬(Flurbiprofen)；氟瑞托芬(Fluretofen)；丙酸氟替卡松(Fluticasone Propionate)；呋喃洛芬(Furaprofen)；呋罗布芬(Furobufen)；哈西奈德(Halcinonide)；丙酸卤倍他索(Halobetasol Propionate)；醋酸卤泼尼松(Halopredone Acetate)；异丁芬酸(Ibufenac)；布洛芬(Ibuprofen)；布洛芬铝(Ibuprofen Aluminum)；布洛芬吡甲酯(Ibuprofen Piconol)；伊洛达普(Ilonidap)；吲哚美辛；吲哚美辛钠(Indomethacin Sodium)；吲哚洛芬(Indoprofen)；吲哚克索(Indoxole)；吲四唑(Intrazole)；醋酸异氟泼尼松(Isoflupredone Acetate)；伊索克酸(Isoxepac)；伊索昔康；酮洛芬；盐酸洛非咪唑(Lofemizole Hydrochloride)；氯诺昔康(Lornoxicam)；氯替泼诺(Loteprednol Etabonate)；甲氯芬那酸钠(Meclofenamate Sodium)；甲氯芬那酸(Meclofenamic Acid)；二丁酸甲氯松(Meclorisone Dibutyrate)；甲芬那酸(Mefenamic Acid)；美沙拉嗪(Mesalamine)；美西拉宗(Meseclazone)；磺庚甲泼尼龙(MethylprednisoloneSuleptanate)；吗尼氟酯(Morniflumate)；萘丁美酮(Nabumetone)；萘普生(Naproxen)；萘普生钠(Naproxen Sodium)；萘普索(Naproxol)；尼马宗(Nimazone)；奥沙拉嗪钠(Olsalazine Sodium)；奥古蛋白超氧化物歧化酶(Orgotein)；奥帕诺辛(Orpanoxin)；奥沙普嗪(Oxaprozin)；羟布宗(Oxyphenbutazone)；盐酸瑞尼托林(Paranyline Hydrochloride)；木聚硫钠(Pentosan Polysulfate Sodium)；甘油保泰松钠(Phenbutazone SodiumGlycerate)；吡非尼酮(Pirfenidone)；吡罗昔康(Piroxicam)；肉桂酸吡罗昔康(Piroxicam Cinnamate)；吡罗昔康乙醇胺(Piroxicam Olamine)；比洛芬(Pirprofen)；泼那扎特(Prednazate)；普立非酮(Prifelone)；普罗度酸(ProdolicAcid)；普罗喹宗(Proquazone)；普罗沙唑(Proxazole)；柠檬酸普罗沙唑(Proxazole Citrate)；利美索龙(Rimexolone)；氯马扎利(Romazarit)；柳胆来司(Salcolex)；沙那西定(Salnacedin)；双水杨酯(Salsalate)；血根氯铵(Sanguinarium Chloride)；司克拉宗(Seclazone)；丝美辛(Sermetacin)；舒多昔康(Sudoxicam)；舒林酸(Sulindac)；舒洛芬(Suprofen)；他美辛(Talmetacin)；他尼氟酯(Talniflumate)；他洛柳酯(Talosalate)；特丁非隆(Tebufelone)；替尼达普(Tenidap)；替尼达普钠(Tenidap Sodium)；替诺昔康(Tenoxicam)；替昔康(Tesicam)；Tesimide；Tetrydamine；硫平酸(Tiopinac)；巯氢可的松(Tixocortol Pivalate)；托美汀(Tolmetin)；托美汀钠(Tolmetin Sodium)；三氯奈德(Triclonide)；三氟米酯(Triflurnidate)；齐多美辛(Zidometacin)；佐美酸钠(Zomepirac Sodium)。
在本发明所述方法中可用于减轻精神病副作用的抗精神病药和抗神经病药包括任何选择性5-羟色胺受体抑制剂(SSRIs)和其它抗抑郁剂、抗焦虑剂(例如阿普唑仑)等等。抗抑郁剂包括但不限于五羟色胺再摄取抑制剂，如Celexa(西酞普兰)、Desyrel(曲唑酮)、Effexor(文拉法新)、Luvox、Paxil、Prozac、Zoloft和Serzone；三环类，如Adapin、Anafrinil、E1avil、Janimmine、Ludiomil、Pamelor、Tofranil、Vivactil、Sinequan和Surmontil；单胺氧化酶抑制剂，如Eldeprvl、Marplan、Nardil和Parnate。抗焦虑剂包括但不限于氮杂螺环类，如BuSpar，苯并二氮
类，如Ativan、Librium、Tranxene、Centrax、Klonopin、Paxipam、Serax、Valium和Xanax；以及β受体阻断剂，如Inderal和Tenormin。
减轻诸如恶心、腹泻、胃肠绞痛等等胃肠道不适的试剂是用于本发明联合治疗中的适合的舒减剂。合适的试剂包括但不限于止吐剂、止泻剂、H2受体阻断剂、抗酸剂等等。
在本发明治疗中适合用作舒减剂的合适的H2阻断剂(2型组胺受体拮抗剂)包括但不限于西咪替丁(Cimetidine)(例如泰胃美(Tagamet)、Peptol、Nu-cimet、apo-cimetidine、non-cimetidine)；雷尼替丁(Ranitidine)(例如善胃得(Zantac)、Nu-ranit、Novo-randine和apo-ranitidine)；和法莫替丁(Famotidine)(Pepcid、Apo-Famotidine和Novo-Famotidine)。
合适的抗酸剂包括但不限于氢氧化铝镁(Maalox、Mylanta)；碳酸铝凝胶(Basajel)；氢氧化铝(Amphojel、AlternaGEL)；碳酸钙(Turns、Titralac)；氢氧化镁和碳酸氢钠。
止吐剂包括但不限于5-羟色氨酸-3(5HT3)抑制剂；诸如地塞米松和甲基强的松龙的皮质类固醇激素；Marinol(屈大麻酚(dronabinol))；丙氯拉嗪(prochlorperazine)；苯二氮
；异丙嗪(promethazine)和甲氧氯普胺(metoclopramide)；西沙必利(cisapride)；盐酸阿洛司琼(AlosetronHydrochloride)；盐酸巴他必利(Batanopride Hydrochloride)；贝美司琼(Bemesetron)；苯喹胺(Benzquinamide)；氯丙嗪(Chlorpromazine)；盐酸氯丙嗪(Chlorpromazine Hydrochloride)；氯波必利(Clebopride)；盐酸赛克利嗪(Cyclizine Hydrochlonde)；茶苯海明(Dimenhydrinate)；地芬尼多(Diphenidol)；盐酸地芬尼多(Diphenidol Hydrochloride)；双羟萘酸地芬尼多(Diphenidol Pamoate)；甲磺酸多拉司琼(Dolasetron Mesylate)；多潘立酮(Domperidone)；屈大麻酚；氟多雷司(F1udorex)；氟美立酮(F1umeridone)；盐酸加丹司琼(Galdansetron Hydrochloride)；格拉司琼(Granisetron)；盐酸格拉司琼(Granisetron Hydrochloride)；甲磺酸卢罗司琼(LurosetronMesylate)；盐酸氯苯甲嗪(Meclizine Hydrochloride)；盐酸甲氧氯普胺(Metoclopramide Hydrochloride)；美托哌丙嗪(Metopimazine)；盐酸昂丹司琼(Ondansetron Hydrochloride)；泮考必利(Pancopride)；丙氯拉嗪(Prochlorperazine)；乙二磺酸丙氯拉嗪(Prochlorperazine Edisylate)；马来酸丙氯拉嗪(Prochlorperazine Maleate)；盐酸异丙嗪(PromethazineHydrochloride)；硫乙拉嗪(Thiethylperazine)；苹果酸硫乙拉嗪(Thiethylperazine Malate)；马来酸硫乙拉嗪(Thiethylperazine Maleate)；盐酸曲美苄胺(Trimethobenzamide Hydrochloride)；盐酸扎考必利(ZacoprideHydrochloride)。
[00994]止泻剂包括但不限于罗加米定(Rolgamidine)、盐酸地芬诺酯(Diphenoxylate hydrochloride)(止泻宁(Lomotil))、甲硝唑(Metronidazole)(灭滴灵(F1agyl))、甲基强的松龙(美卓乐(Medrol))、柳氮磺胺吡啶(Sulfasalazine)(Azulfidine)等等。
应用于本发明方法中的避免或修复抑郁血细胞数的适合的造血剂包括红细胞生成素(如EPOGENTM、依普定-α)、粒系集落刺激因子(G-CSFs)(如NEUPOGENTM、非格司亭)、粒巨噬系集落刺激因子(GM-CSFs)、血栓形成蛋白等。
治疗方法
本发明提供了治疗患者疾病、病症或状况的方法。一方面，所述治疗方法应用了口服药物制剂，该口服药物制剂包含母体蛋白治疗剂的已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体，该已知的抗蛋白酶的多肽变体包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，该位点替代了存在于母体蛋白治疗剂中的天然蛋白酶切割位点；并包含：i)与至少一个不存在于母体蛋白治疗剂中的非天然糖基化位点共价连接的糖部分；或ii)与至少一个存在于母体蛋白治疗剂中但未糖基化的天然糖基化位点共价连接的糖部分。该口服药物组合物以一定量口服给予患者，由此，患者以第一给药间隔接受了第一摩尔数的已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体。已知的超糖基化、抗蛋白酶的变体的第一摩尔数多于肠胃外药物组合物中的母体蛋白治疗剂的第二摩尔数。该肠胃外药物组合物为适合皮下推注的速释制剂，并且当以一定量的该肠胃外药物组合物对患者皮下推注给药，由此患者以第二给药间隔接受了第二摩尔数的母体蛋白治疗剂时，该母体多肽被证实有效治疗患者疾病、病症或状况。在治疗患者疾病的所述方法中，所述方法包括口服给予患者一定量的口服药物组合物，由此患者以第一给药间隔接受第一摩尔数的已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体，其中该第一给药间隔等于或短于第二给药间隔。
因此，在期望的治疗期内，当以第一给药间隔口服给予患者第一摩尔数的剂量时，所述已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体有效治疗患者疾病、病症或状况。
另一方面，本发明提供了对上述治疗患者疾病、病症或状况的方法的修改，其中，以第一给药频率将包含已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的口服药物组合物在第一剂量中口服给予患者；当以第二给药频率对患者皮下推注给予第二剂量的母体蛋白治疗剂时，该肠胃外药物组合物被证实有效治疗患者疾病；当第一和第二剂量基于相同患者体重计算时，以已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的摩尔数每公斤患者体重表示的第一剂量大于以母体蛋白治疗剂的摩尔数每公斤患者体重表示的第二剂量；以及当口服给予患者第一剂量的已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体时，释放第一剂量中所有已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的时长不大于第二给药频率中给药之间的时长。在一些实施方案中，以第二给药间隔给予患者基于重量剂量的母体蛋白治疗剂时，即，第二剂量是基于重量的剂量，并且该肠胃外药物组合物为允许基于重量给药的形式，该肠胃外药物组合物被证实对治疗患者疾病、病症或状况是有效的。在一些上述的实施方案中，第一剂量是已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的基于重量的剂量，并且该口服药物组合物为允许基于重量给药的形式。
另一方面，本发明提供了对上述治疗患者疾病、病症或状况的方法的修改，其中，以第一给药频率将包含已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的口服药物组合物在第一剂量中口服给予患者；以第二给药频率皮下推注给予患者第二剂量的母体蛋白治疗剂时，所述肠胃外药物组合物被证实对治疗患者疾病、病症或状况是有效的；当第一和第二剂量基于相同患者体重计算时，以已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的摩尔数每公斤患者体重表示的第一剂量大于以母体蛋白治疗剂的摩尔数每公斤患者体重表示的第二剂量；以及第一给药频率中给药之间的时长等于或短于第二给药频率中给药之间的时长。在一些实施方案中，以第二给药间隔给予患者基于重量剂量的母体蛋白治疗剂时，即，第二剂量是基于重量的剂量，并且该肠胃外药物组合物为允许基于重量给药的形式，该肠胃外药物组合物被证实对治疗患者疾病、病症或状况是有效的。在一些上述的实施方案中，第一剂量是已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的基于重量的剂量，并且该口服药物组合物为允许基于重量给药的形式。
对超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体的选择部分地依赖于所治疗的疾病、病症或状况。如上所述，期望的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体对于治疗以母体蛋白治疗剂可治疗的疾病、病症或状况是有效的。以下是非限定性的例子。
采用IFN-α的治疗方法
一方面，当所述已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体是已知的超糖基化、抗蛋白酶的IFN-α时，在治疗病毒感染(例如，丙型肝炎病毒(HCV)感染)的方法中提供了给予有需要的个体治疗有效量的已知的超糖基化、抗蛋白酶的IFN-α的方法。在一些实施方案中，所述方法通常包括以第一给药频率在第一剂量中口服给予有需要的个体母体IFN-α2的已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体，其中第一给药频率至少与第二给药频率一样频繁、或比第二给药频率更频繁，所述第二给药频率在治疗HCV感染的方案中被证实有效，该治疗HCV感染的方案包括以第二给药频率在第二剂量中给予有需要的个体母体IFN-α2的肠胃外制剂，其中，第一剂量包括第一摩尔数的已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体，该第一摩尔数大于第二剂量中的母体IFN-α2的第二摩尔数。
在一个非限定性实例中，所述母体IFN-α2被证实在以下治疗HCV感染的方法中是有效的，该方法包括皮下推注给予有需要的个体3百万单位(或15微克)的IFN-α2，每周三次推注，持续48周。在一些实施方案中，所述母体IFN-α2的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体例如可选自[D99N]IFN-α2a、[D99N，D105N]IFN-α2a、[D99N]IFN-α2b和[D99N，D105N]IFN-α2b糖肽变体(其中氨基酸编号如图24所示)；其中，所述变体进一步包括在一个或多个靶位置的一个或多个氨基酸替代，该位置对应于如下任何氨基酸位置：4l、58、78、107、117、125、133和159(其中氨基酸编号如图2所示)，或对应于表1所述的任何突变，这样，所述变体包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替了在母体IFN-α2中发现的天然蛋白酶切割位点。所述变体以第一给药频率在含有第一摩尔数的所述变体的第一剂量中口服给予患者，其中第一摩尔数大于3百万单位(或15微克)母体IFN-α2中母体IFN-α的摩尔数；以及第一给药频率为至少每周三次。或者，第一给药频率为每周四次、每周五次、每周六次、每天一次、每天两次或每天三次。
在一些实施方案中，本发明提供了用IFN-α2的已知的抗蛋白酶或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体治疗HCV感染的任何前述方法，其中已知的抗蛋白酶或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含表9中描述的任何载体多肽，该载体多肽共价或非共价地结合到期望的多肽变体。在一些这样的实施方案中，所述已知的抗蛋白酶或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包括与期望的多肽变体直接或非直接共价连接的任何这样的载体多肽，包括但不限于任何融合到期望的多肽变体N端的这样的载体多肽。
在其他的非限定性实例中，母体IFN-α2在如下治疗HCV感染的方法中被证实是有效的，该方法包括皮下推注给予有需要的患者15微克(或8.0×10-10摩尔)的IFN-α2，每周三次，持续48周。在一些这样的实施方案中，母体IFN-α2的已知的的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体例如可选自[D99N]IFN-α2a、[D99N，D105N]IFN-α2a、[D99N]IFN-α2b和[D99N，D105N]IFN-α2b糖肽变体(其中氨基酸编号如图24所示)；其中，所述变体进一步包括在一个或多个靶位置的一个或多个单氨基酸替代，该位置对应于如下任何氨基酸位置：41、58、78、107、117、125、133和159(其中氨基酸编号如图2所示)，或对应于表1所述的任何突变，这样，所述变体包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替了母体IFN-α2中发现的天然蛋白酶切割位点；以及所述变体以第一给药频率在含有第一摩尔数的所述变体的第一剂量中口服给予患者，其中，第一摩尔数量大于8.0×10-10摩尔，或至少约1.6×10-9摩尔，或至少约2.4×10-9摩尔，或至少约3.2×l0-9摩尔，或至少约4.0×10-9摩尔，或至少约4.8×10-9摩尔，或至少约5.6×10-9摩尔，或至少约6.4×l0-9摩尔，或至少约7.2×10-9摩尔，或至少约8.0×10-9摩尔，或至少约8.0×10-8摩尔；并且第一给药频率为至少每周三次。或者，第一给药频率为每周四次、每周五次、每周六次、每天一次、每天两次或每天三次。
另一方面，当所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体为已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的共有IFN-α时，在治疗病毒感染(例如，丙型肝炎病毒(HCV)感染)中的方法中提供了向有需要的患者给予治疗有效量的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的共有IFN-α的方法。在一些实施方案中，所述方法通常包括以第一给药频率在第一剂量中口服给予有需要的个体母体IFN-α的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体，其中第一给药频率至少与第二给药频率一样频繁、或比第二给药频率更频繁，所述第二给药频率在治疗HCV感染的方案中被证实有效，该治疗HCV感染的方案包括以第二给药频率在第二剂量中给予有需要的个体母体共有IFN-α的肠胃外制剂，其中，第一剂量包括第一摩尔数的已知的超糖基化、抗蛋白酶的多肽变体，该第一摩尔数大于第二剂量中的母体共有IFN-α2的第二摩尔数。
在一个非限定性实例中，母体干扰素alfacon-l在如下治疗HCV感染的方法中被证实是有效的，该方法包括皮下推注给予有需要的患者9百万单位(或9微克)的INFERGEN干扰素alfacon-1，每周三次持续48周。在一些实施方案中，母体干扰素alfacon-1的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体例如可选自[D99N]干扰素alfacon-1、[D99N，D105N]干扰素alfacon-1、[D99N，D105N，E134N]干扰素alfacon-1、[D105N，E134N]干扰素alfacon-1、[E134N]干扰素alfacon-1以及[D99N，E134N]干扰素alfacon-l糖肽(其中氨基酸编号如图24所示)；其中，所述糖肽进一步包括在一个或多个靶位置的一个或多个单氨基酸替代，所述位置对应于如下任何氨基酸位置：41、58、78、107、117、125、133和159(其中氨基酸编号如图9所示)，这样，所述变体包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替了母体共有IFN-α中发现的天然蛋白酶切割位点；以及以第一给药频率在含有第一摩尔数的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体的第一剂量中口服给予患者，其中，第一摩尔数大于9百万单位(或9微克)干扰素alfacon-1中干扰素alfacon-1的摩尔数；以及其中第一给药频率为至少每周三次。或者，第一给药频率为每周四次、每周五次、每周六次、每天一次、每天两次或每天三次。
在其他非限定性实例中，母体干扰素alfacon-1在如下治疗HCV感染的方法中被证实是有效的，该方法包括皮下推注给予有需要的患者15,000,000单位(或15微克)的INFERGEN干扰素alfacon-1，每周三次，持续48周。在一些这类实施方案中，母体干扰素alfacon-1的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体例如可选自[D99N]干扰素alfacon-1、[D99N，D105N]干扰素alfacon-1、[D99N，D105N，E134N]干扰素alfacon-1、[D105N，E134N]干扰素alfacon-1、[E134N]干扰素a1facon-1、以及[D99N，E134N]干扰素alfacon-1糖肽(其中氨基酸编号如图24所示)；其中，所述糖肽进一步包含在一个或多个靶位置的一个或多个单氨基酸替代，该位置对应于如下任何氨基酸位置：41、58、78、107、117、125、133和159(其中氨基酸编号如图9所示)，这样，所述变体包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替了母体共有IFN-α中发现的天然蛋白酶切割位点；以及以第一给药频率在含有第一摩尔数的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体的第一剂量中口服给予患者，其中，第一摩尔数大于15,000,000单位(或15微克)干扰素alfacon-1中干扰素alfacon-1的摩尔数；以及其中第一给药频率为至少每周三次。或者，第一给药频率为每周四次、每周五次、每周六次、每天一次、每天两次或每天三次。
在其他非限定性实例中，母体干扰素alfacon-1在如下治疗HCV感染的方法中被证实是有效的，该方法包括皮下推注给予有需要的患者9微克(或4.6×10-10摩尔)的干扰素alfacon-l，每周三次，持续48周。在一些这类实施方案中，母体干扰素alfacon-1的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体例如可选自[D99N]干扰素alfacon-l、[D99N，D105N]干扰素alfacon-1、[D99N，D105N，E134N]干扰素alfacon-1、[D105N，E134N]干扰素alfacon-1、[E134N]干扰素alfacon-1、以及[D99N，E134N]干扰素alfacon-1糖肽(其中氨基酸编号如图24所示)；其中，所述糖肽进一步包含在一个或多个靶位置的一个或多个单氨基酸替代，该位置对应于如下任何氨基酸位置：41、58、78、107、117、125、133和159(其中氨基酸编号如图9所示)，这样，所述变体包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替了母体共有IFN-α中发现的天然蛋白酶切割位点；以及以第一给药频率在含有第一摩尔数的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体的第一剂量中口服给予患者，其中，第一摩尔数量大于4.6×10-10摩尔，或至少约9.2×10-10摩尔，或至少约1.4×10-9摩尔，或至少约1.8×10-9摩尔，或至少约2.3×10-9摩尔，或至少约2.8×10-9摩尔，或至少约3.2×10-9摩尔，或至少约3.7×10-9摩尔，或至少约4.1×10-9摩尔，或至少约4.6×10-9摩尔，或至少约4.6×10-8摩尔；并且第一给药频率为至少每周三次。或者，第一给药频率为每周四次、每周五次、每周六次、每天一次、每天两次或每天三次。
在其他非限定性实例中，母体干扰素alfacon-1在如下治疗HCV感染的方法中被证实是有效的，该方法包括皮下推注给予有需要的患者15微克(或7.6×10-10摩尔)的干扰素alfacon-1，每周三次，持续48周。在一些这类实施方案中，母体干扰素alfacon-1的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体例如可选自[D99N]干扰素alfacon-1、[D99N，D105N]干扰素alfacon-1、[D99N，D105N，E134N]干扰素alfacon-1、[D105N，E134N]干扰素alfacon-1、[E134N]干扰素alfacon-1、以及[D99N，E134N]干扰素alfacon-1糖肽；其中，所述糖肽进一步包含在一个或多个靶位置的一个或多个单氨基酸替代，该位置对应于如下任何氨基酸位置：41、58、78、107、117、125、133和159，这样，所述变体包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替了母体共有IFN-α中发现的天然蛋白酶切割位点；以及以第一给药频率在含有第一摩尔数的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体的第一剂量中口服给予患者，其中，第一摩尔数量大于7.6×10-10摩尔，或至少约1.5×10-9摩尔，或至少约2.3×10-9摩尔，或至少约3.0×10-9摩尔，或至少约3.8×10-9摩尔，或至少约4.6×10-9摩尔，或至少约5.3×10-9摩尔，或至少约6.1×10-9摩尔，或至少约6.8×10-9摩尔，或至少约7.6×10-9摩尔，或至少约7.6×10-8摩尔；并且第一给药频率为至少每周三次。或者，第一给药频率为每周四次、每周五次、每周六次、每天一次、每天两次或每天三次。
在其他非限定性实例中，母体干扰素alfacon-1在如下治疗HCV感染的方法中被证实是有效的，该方法包括皮下推注给予有需要的患者9微克(或4.5×10-8摩尔)的干扰素alfacon-1，每天一次，持续48周。在一些这类实施方案中，母体干扰素alfacon-1的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体例如可选自[D99N]干扰素alfacon-1、[D99N，D105N]干扰素alfacon-1、[D99N，D105N，E134N]干扰素alfacon-1、[D105N，E134N]干扰素alfacon-1、[E134N]干扰素alfacon-1、以及[D99N，E134N]干扰素alfacon-1糖肽；其中，所述糖肽进一步包含在一个或多个靶位置的一个或多个单氨基酸替代，该位置对应于如下任何氨基酸位置：41、58、78、107、117、125、133和159，这样，所述变体包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替了母体共有IFN-α中发现的天然蛋白酶切割位点；以及以第一给药频率在含有第一摩尔数的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体的第一剂量中口服给予患者，其中，第一摩尔数量大于4.6×10-10摩尔，或至少约9.2×10-10摩尔，或至少约1.4×10-9摩尔，或至少约1.8×10-9摩尔，或至少约2.3×10-9摩尔，或至少约2.8×10-9摩尔，或至少约3.2×10-9摩尔，或至少约3.7×10-9摩尔，或至少约4.1×10-9摩尔，或至少约4.6×10-9摩尔，或至少约4.6×10-8摩尔；并且第一给药频率为至少每天一次。或者，第一给药频率为每天两次或每天三次。
在其他非限定性实例中，母体干扰素alfacon-1在如下治疗HCV感染的方法中被证实是有效的，该方法包括皮下推注给予有需要的患者15微克(或7.5×10-8摩尔)的干扰素alfacon-1，每天一次，持续48周。在一些这类实施方案中，母体干扰素alfacon-1的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体例如可选自[D99N]干扰素alfacon-1、[D99N，D105N]干扰素alfacon-1、[D99N，D105N，E134N]干扰素alfacon-1、[D105N，E134N]干扰素alfacon-1、[E134N]干扰素alfacon-1、以及[D99N，E134N]干扰素alfacon-1糖肽；其中，所述糖肽进一步包含在一个或多个靶位置的一个或多个单氨基酸替代，该位置对应于如下任何氨基酸位置：41、58、78、107、117、125、133和159，这样，所述变体包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替了母体共有IFN-α中发现的天然蛋白酶切割位点；以及以第一给药频率在含有第一摩尔数的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体的第一剂量中口服给予患者，其中，第一摩尔数量大于7.6×10-10摩尔，或至少约1.5×10-9摩尔，或至少约2.3×10-9摩尔，或至少约3.0×10-9摩尔，或至少约3.8×10-9摩尔，或至少约4.6×10-9摩尔，或至少约5.3×10-9摩尔，或至少约6.1×10-9摩尔，或至少约6.8×10-9摩尔，或至少约7.6×10-9摩尔，或至少约7.6×10-8摩尔；并且第一给药频率为至少每天一次。或者，第一给药频率为每天两次或每天三次。
在一些实施方案中，本发明提供了用共有IFN-α的已知的抗蛋白酶或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体治疗HCV感染的任何前述方法，其中已知的抗蛋白酶或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含表9中描述的任何载体多肽，该载体多肽共价或非共价地结合到期望的多肽变体。在一些这样的实施方案中，所述已知的抗蛋白酶或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包括与期望的多肽变体直接或非直接共价连接的任何这样的载体多肽，包括但不限于任何融合到期望的多肽变体N端的这样的载体多肽。
应用IFN-γ的治疗方法
另一方面，当已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体为超糖基化的IFN-γ时，在治疗病毒感染(例如，HCV感染)的方法中提供了向有需要的个体给予治疗有效量的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的IFN-γ的方法。在一些实施方案中，所述方法通常包括以第一给药频率在第一剂量中口服给予有需要的患者母体IFN-γ的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体，所述第一给药频率至少与第二给药频率一样频繁、或比第二给药间隔更加频繁，所述第二给频率在治疗HCV感染的方案中被证实是有效的，该治疗HCV感染的方案包括给予有需要的患者治疗有效量的IFN-α并且以第二频率在第二剂量中向该患者共给予母体IFN-γ的肠胃外制剂，其中，第一剂量包含第一摩尔数的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体，该第一摩尔数大于第二剂量中母体IFN-γ的第二摩尔数。
在一个非限定性实例中，所述母体IFN-γ为IFN-γ1b，并在如下治疗HCV感染的方法中被证实是有效的，该方法包括给予有需要的患者治疗有效量的IFN-α，并且皮下推注共给予该患者100微克(6.0×10-9摩尔)的IFN-γ1b，每周三次，持续48周。在一些实施方案中，所述母体IFN-γ1b的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体例如可选自[S99T]IFN-γ、[E38N]IFN-γ、[E38N，S40T]IFN-γ、[E38N，S99T]IFN-γ和[E38N，S40 T，S99T]IFN-γ糖肽；其中，所述糖肽变体进一步包括如表3(IFN-γ)所示的一个或多个氨基酸替代，这样，所述糖肽变体包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替了母体IFN-γ多肽中发现的天然蛋白酶切割位点；以及以第一给药频率在含有第一摩尔数已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体的第一剂量中向患者口服给药，其中，第一摩尔数大于100微克(6.0×10-9摩尔)IFN-γ1b中IFN-γ1b的摩尔数；以及第一给药频率为至少每周三次。或者，第一给药频率为每周四次、每周五次、每周六次、每天一次、每天两次或每天三次。
在一个非限定性实例中，所述母体IFN-γ为IFN-γ 1b，并在如下治疗HCV感染的方法中被证实是有效的，该方法包括给予有需要的患者治疗有效量的IFN-α，并且皮下推注共给予该患者50微克(3.0×10-9摩尔)的IFN-γ1b，每周三次，持续48周。在一些实施方案中，所述母体IFN-γ1b的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体例如可选自[S99T]IFN-γ、[E38N]IFN-γ、[E38N，S40T]IFN-γ、[E38N，S99T]IFN-γ和[E38N，S40T，S99T]IFN-γ糖肽；其中，所述糖肽变体进一步包含如表3(IFN-γ)所示的一个或多个氨基酸替代，这样，所述糖肽变体包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替了母体IFN-γ多肽中发现的天然蛋白酶切割位点；以及以第一给药频率在含有第一摩尔数已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体的第一剂量中向患者口服给药，其中，第一摩尔数大于50微克(3.0×10-9摩尔)IFN-γ1b中IFN-γ1b的摩尔数；以及第一给药频率为至少每周三次。或者，第一给药频率为每周四次、每周五次、每周六次、每天一次、每天两次或每天三次。
在其他非限定性实例中，所述母体IFN-γ为IFN-γ1b，并在如下治疗HCV感染的方法中被证实是有效的，该方法包括给予有需要的患者治疗有效量的IFN-α，并且皮下推注共给予该患者100微克(6.0×10-9摩尔)的IFN-γ1b，每周三次，持续48周。在一些实施方案中，所述母体IFN-γ1b的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体例如可选自[S99T]IFN-γ、[E38N]IFN-γ、[E38N，S40T]IFN-γ、[E38N，S99T]IFN-γ和[E38N，S40T，S99T]IFN-γ糖肽；其中，所述糖肽变体进一步包含如表3(IFN-γ)所示的一个或多个氨基酸替代，这样，所述糖肽变体包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替了母体IFN-γ多肽中发现的天然蛋白酶切割位点；以及以第一给药频率在含有第一摩尔数已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体的第一剂量中口服给予患者，其中，第一摩尔数大于6.0×10-9摩尔，或至少约1.2×10-8摩尔，或至少约1.8×10-8摩尔，或至少约2.4×10-8摩尔，或至少约3.0×10-8摩尔，或至少约3.6×10-8摩尔，或至少约4.2×10-8摩尔，或至少约4.8×10-8摩尔，或至少约5.4×10-8摩尔，或至少约6.0×10-8摩尔，或至少约6.0×10-7摩尔，以及第一给药频率为至少每周三次。或者，第一给药频率为每周四次、每周五次、每周六次、每天一次、每天两次或每天三次。
在其他非限定性实例中，所述母体IFN-γ为IFN-γ1b，并在如下治疗HCV感染的方法中被证实是有效的，该方法包括给予有需要的患者治疗有效量的IFN-α，并且皮下推注共给予该患者50微克(3.0×10-9摩尔)的IFN-γ1b，每周三次，持续48周。在一些实施方案中，所述母体IFN-γ1b的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体例如可选自[S99T]IFN-γ、[E38N]IFN-γ、[E38N，S40T]IFN-γ、[E38N，S99T]IFN-γ和[E38N，S40T，S99T]IFN-γ糖肽；其中，所述糖肽变体进一步包含如表3(IFN-γ)所示的一个或多个氨基酸替代，这样，所述糖肽变体包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替了母体IFN-γ多肽中发现的天然蛋白酶切割位点；以及以第一给药频率在含有第一摩尔数已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体的第一剂量中口服给予患者，其中，第一摩尔数大于3.0×10-9摩尔，或至少约6.0×10-9摩尔，或至少约9.0×10-8摩尔，或至少约1.2×10-8摩尔，或至少约1.5×10-8摩尔，或至少约1.8×10-8摩尔，或至少约2.1×10-8摩尔，或至少约2.4×10-8摩尔，或至少约2.7×10-8摩尔，或至少约3.0×10-8摩尔，或至少约3.0×10-7摩尔，以及第一给药频率为至少每周三次。或者，第一给药频率为每周四次、每周五次、每周六次、每天一次、每天两次或每天三次。
在一些实施方案中，本发明提供了用IFN-γ的已知的抗蛋白酶或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体治疗HCV感染的任何前述方法，其中已知的抗蛋白酶或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含表9中描述的任何载体多肽，该载体多肽共价或非共价地结合到期望的多肽变体。在一些这样的实施方案中，所述已知的抗蛋白酶或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包括与期望的多肽变体直接或非直接共价连接的任何这样的载体多肽，包括但不限于任何融合到期望的多肽变体N端的这样的载体多肽。
适用于以IFN-α和IFN-γ联合疗法治疗HCV感染的本发明方法的治疗有效量的IFN-α提供在以上标题为“应用IFN-α的治疗方法”中描述的以IFN-α疗法治疗HCV感染的方法中。另外，适用于以IFN-α和IFN-γ联合疗法治疗HCV感染的本发明方法的治疗有效量的IFN-α提供在WO 03/030613中描述的以IFN-α和IFN-γ联合疗法治疗HCV感染的方法中。
另一方面，当已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体为超糖基化的IFN-γ时，在治疗纤维化病症(例如，肺纤维化病症或肝纤维化病症)的方法中提供了向有需要的个体给予治疗有效量的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的IFN-γ的方法。在一些实施方案中，所述方法通常包括以第一给药频率在第一剂量中口服给予有需要的患者母体IFN-γ的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体，所述第一给药频率至少与第二给药频率一样频繁、或比第二给药间隔更加频繁，所述第二给频率在治疗所述纤维化病症的方案中被证实是有效的，所述治疗纤维化病症的方案包括以第二频率在第二剂量中向有需要的个体给予母体IFN-γ的肠胃外制剂，其中，第一剂量包含第一摩尔数的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体，该第一摩尔数大于第二剂量中母体IFN-γ的第二摩尔数。
在一个非限定性实例中，所述母体IFN-γ为IFN-γ1b，并在如下治疗纤维化病症的方法中被证实是有效的，该方法包括皮下推注给予有需要的患者200微克(1.2×10-8摩尔)的IFN-γ1b，每周三次，持续一年或更长时间。在一些实施方案中，所述母体IFN-γ1b的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体例如可选自[S99T]IFN-γ、[E38N]IFN-γ、[E38N，S40T]IFN-γ、[E38N，S99T]IFN-γ和[E38N，S40T，S99T]IFN-γ糖肽；其中，所述糖肽变体进一步包含如表3(IFN-γ)所示的一个或多个氨基酸替代，这样，所述糖肽变体包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替了母体IFN-γ多肽中发现的天然蛋白酶切割位点；以及以第一给药频率在含有第一摩尔数已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体的第一剂量中口服给予患者，其中，第一摩尔数大于1.2×10-8摩尔，或至少约2.4×10-8摩尔，或至少约3.6×10-8摩尔，或至少约4.8×10-8摩尔，或至少约6.0×10-8摩尔，或至少约7.2×10-8摩尔，或至少约8.4×10-8摩尔，或至少约9.6×10-8摩尔，或至少约1.1×10-7摩尔，或至少约1.2×10-7摩尔，或至少约1.0×10-6摩尔，以及第一给药频率为至少每周三次。或者，第一给药频率为每周四次、每周五次、每周六次、每天一次、每天两次或每天三次。
在一些实施方案中，本发明提供了用IFN-γ的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体治疗纤维化病症的任何前述方法，其中，所述纤维化病症为肺纤维化病症(如特发性肺纤维化)或肝纤维化病症。在治疗特发性肺纤维化的一些本发明的方法中，患者具有≥55％的预测的正常FVC的初始用力肺活量(FVC)。在治疗特发性肺纤维化的本发明的其他方法中，患者具有≥35％的预测的正常DLCO的初始一氧化碳弥散量(DLCO)。在治疗特发性肺纤维化的本发明的其他方法中，患者具有≥55％的预测的正常FVC的初始用力肺活量(FVC)和≥35％的预测的正常DLCO的初始一氧化碳弥散量(DLCO)。
在一些实施方案中，本发明提供了用IFN-γ的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体治疗纤维化病症的任何前述方法，其中所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含表9所示的任何载体多肽，其共价或非共价连接到期望的多肽变体。在一些这样的实施方案中，已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含与期望的多肽变体直接或非直接共价连接的一些这样的载体多肽，包括但不限于融合到期望的多肽变体N端的一些这样的载体多肽。
在一些实施方案中，本发明提供了用母体IFN-γ1b治疗剂的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体治疗疾病的任何前述方法，其中，所述方法被修改为将任何糖基化的天然(野生型)人IFN-γ(WO 02/081507中描述的)的抗蛋白酶的变体用作母体IFN-γ1b治疗剂的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体。在一个非限定性实例中，糖基化的天然人IFN-γ的抗蛋白酶变体包含如表3(IFN-γ)所示的一个或多个氨基酸替代，这样，所述变体包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，其代替了母体IFN-γ1b多肽中发现的天然蛋白酶切割位点。
应用IFN-β的治疗方法
在一些实施方案中，当已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体为已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的IFN-β时，在治疗多发性硬化的方法中提供了给予有需要的个体治疗有效量的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的IFN-β的方法。所述方法通常包括以第一给药频率在第一剂量中口服给予有需要的个体母体IFN-β的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的的多肽变体，其中第一给药频率至少与第二给药频率一样频繁、或比第二给药频率更频繁，所述第二给药频率在治疗多发性硬化的方案中被证实有效，该治疗多发性硬化的方案包括以第二给药频率在第二剂量中给予有需要的个体母体IFN-β的肠胃外制剂，其中，第一剂量包括第一摩尔数的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体，该第一摩尔数大于第二剂量中的母体IFN-β的第二摩尔数。
在一个非限定性实例中，所述母体IFN-β1为IFN-β1b，并在如下治疗多发性硬化的方法中被证实是有效的，该方法包括在期望的治疗期内推注给予有需要的患者0.25毫克(或1.35×10-8摩尔)的IFN-β1b(BETASERON)，每隔一天一次。在一些这样的实施方案中，所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体为活性成分AVONEXIFN-β1a的已知的抗蛋白酶的变体(例如，所述抗蛋白酶的变体包含表2所示的一个或多个氨基酸变化)，并且以第一给药频率在含有第一摩尔数的所述变体的第一剂量中被口服给予患者，其中，第一摩尔数大于1.35×10-8摩尔，或至少约2.7×10-8摩尔，或至少约4.0×10-8摩尔，或至少约5.4×10-8摩尔，或至少约6.75×10-8摩尔，或至少约8.1×10-8摩尔，或至少约9.45×10-8摩尔，或至少约1.1×10-7摩尔，或至少约1.2×10-7摩尔，或至少约1.35×10-7摩尔，或至少约1.35×10-6摩尔；以及所述第一给药频率为至少每隔一天一次。或者，第一给药频率为每周四次、每周五次、每周六次、每天一次、每天两次或每天三次。
应用促红细胞生成素(EPO)的治疗方法
在一些实施方案中，当已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体为已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的EPO时，在治疗贫血的方法中提供了给予有需要的个体治疗有效量的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的EPO的方法。所述方法通常包括以第一给药频率在第一剂量中口服给予有需要的个体母体EPO的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的的多肽变体，其中第一给药频率至少与第二给药频率一样频繁、或比第二给药频率更频繁，所述第二给药频率在治疗贫血的方案中被证实有效，该治疗贫血的方案包括以第二给药频率在第二剂量中给予有需要的个体母体EPO的肠胃外制剂，其中，第一剂量包括第一摩尔数的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体，该第一摩尔数大于第二剂量中母体EPO的第二摩尔数。
在一个非限定性实例中，所述母体EPO在如下治疗贫血的方法中被证实是有效的，该方法包括皮下推注给予有需要的患者100单位(770微克或2.5×10-8摩尔)的EPOGEN依普定α(epoetin alpha)每公斤患者体重，每周三次，持续期望的治疗期。在一些这样的实施方案中，所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体为活性成分ARANESP达贝泊汀α(darbepoetin alpa)的的抗蛋白酶的变体(例如，所述抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的变体包含表4所示的一个或多个氨基酸变化)，并且以第一给药频率在含有第一摩尔数的所述变体的第一剂量中被口服给予患者，其中，第一摩尔数大于2.5×10-8摩尔，或至少约5.0×10-8摩尔，或至少约7.5×10-8摩尔，或至少约1.0×10-7摩尔，或至少约1.25×10-7摩尔，或至少约1.5×10-7摩尔，或至少约1.75×10-7摩尔，或至少约2.0×10-7摩尔，或至少约2.25×10-7摩尔，或至少约2.5×10-7摩尔，或至少约2.5×10-6摩尔每公斤患者体重乘以患者体重的结果，以及第一给药频率为至少每周三次。或者，第一给药间隔为每周四次、每周五次、每周六次、每天一次、每天两次或每天三次。
在其他非限定性实例中，所述母体EPO在如下治疗贫血的方法中被证实是有效的，该方法包括皮下推注给予有需要的患者50单位(385微克或1.25×10-8摩尔)的EPOGEN依普定α每公斤患者体重，每周三次，持续期望的治疗期。在一些这样的实施方案中，所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体为活性成分ARANESP达贝泊汀α的已知的抗蛋白酶的变体(例如，当所述抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的变体包含表4所示的一个或多个氨基酸变化时)，以及以第一给药频率在含有第一摩尔数的所述变体的第一剂量中被口服给予患者，其中，第一摩尔数大于1.25×10-8摩尔，或至少约2.5×10-8摩尔，或至少约3.75×10-8摩尔，或至少约5.0×10-8摩尔，或至少约6.25×10-8摩尔，或至少约7.5×10-8摩尔，或至少约8.75×10-8摩尔，或至少约1.0×10-7摩尔，或至少约1.125×10-7摩尔，或至少约1.25×10-7摩尔，或至少约1.25×10-6摩尔每公斤患者体重乘以患者体重的结果，以及第一给药频率为至少每周三次。或者，第一给药频率为每周四次、每周五次、每周六次、每天一次、每天两次或每天三次。
试剂盒和容器
本发明提供了包含已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体的容器。本发明进一步提供了包括容器中的制剂和提供了使用试剂盒的说明的标签，所述制剂包含单位剂型的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体。
适合的容器包括适于皮下注射给药的那些，包括注射器(带针头使用)和注射笔(injector pen)等。在一些实施方案中，本发明的激动剂用笔式注射器给药(例如，药物输送笔)，大量的这种笔式注射器为本领域所公知。适用于本发明方法的示例性装置为多种来自BectonDickinson的笔式注射器(例如BDTMpen、BDTM PenII和BDTMAuto-Injector)；来自Innoject，Inc.的笔式注射器中的任一种；第5,728,074、6,096,010、6,146,361、6,248,095、6,277,099和6,221,053号美国专利中论述的多种药物输送笔中的任一种等。药物输送笔可以为一次性的或可重复使用再填充的。适合使用的还有Intraject无针头注射系统(Aradigm Corp.)。
本发明进一步提供了药物输送装置，包括(例如预装有)含有液体制剂的贮器，该液体制剂包含单剂量的本发明的糖基化的合成I型干扰素受体多肽激动剂。在一些实施方案中，本发明提供了包含药物组合物的预填充注射器，该药物组合物包含本发明糖基化的合成I型干扰素受体多肽激动剂。
本发明在用于在药物输送装置中使用的单一液体制剂中提供了包含本发明糖基化的合成I型干扰素受体多肽激动剂和糖基化的IFN-γ的制剂。在一些方面，本发明提供了药物贮器或其他容器，其含有共配制在液体中的本发明糖基化的合成I型干扰素受体多肽激动剂和糖基化的IFN-γ，其中本发明糖基化的合成I型干扰素受体多肽激动剂和糖基化的IFN-γ各自以适合一次给药的量存在于该制剂中。所述贮器可存在多种形式，包括但不限于：药筒、注射器和连续输送装置的容器等。
本发明进一步提供了药物输送装置，其包括(例如预装有)含有液体制剂的贮器，该液体制剂包含单剂量的本发明糖基化的合成I型干扰素受体多肽激动剂和单剂量的超糖基化的IFN-γ。示例性的、非限定性的药物输送装置包括注射装置(如笔式注射器)、针头/注射器装置和连续输送装置等。本文中描述的包括协同作用有效量在内的任何剂量都可应用在药物制剂、贮器或药物输送装置中。
在一些实施方案中，本发明提供了包含药物组合物的预填充注射器，该药物组合物包含本发明糖基化的合成I型干扰素受体多肽激动剂、糖基化的IFN-γ和药物可接受的赋形剂，其中本发明糖基化的合成I型干扰素受体多肽激动剂和糖基化的IFN-γ为共配制。
在其他实施方案中，本发明提供了注射器，该注射器包括(a)预填充药物组合物的第一筒，该药物组合物包含本发明糖基化的合成I型干扰素受体多肽激动剂；(b)预填充有药物组合物的第二筒，该药物组合物包含糖基化的IFN-γ。
在一些实施方案中，本发明提供了容器，该容器在适于口服输送的制剂中包含已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体。适合口服输送的制剂包括液体制剂、固体制剂(例如片剂和胶囊等)和半固体制剂(例如凝胶、凝胶胶囊等)。
适于治疗的个体
本发明的方法适于治疗具有或易感于多种疾病的个体。在很多实施方案中，所述个体为人。
纤维化病症
治疗纤维化病症的本发明方法适合于治疗诊断为具有纤维化病症的个体。纤维化病症包括，但不限于：包括特发性肺纤维化(IPF)、由已知病因引起的肺纤维化在内的肺纤维化、肝纤维化和肾脏纤维化。其他示例性的纤维化病症包括肌骨骼纤维化、心肌纤维化、术后粘连、硬皮病、青光眼和皮肤损害(如瘢痕瘤)。
癌症
适于以本发明治疗癌症的方法治疗的个体包括具有任何类型癌症的个体。适合治疗的还有之前用标准癌症化疗剂治疗失败的癌症个体。适合治疗的还有之前已经用标准癌症化疗剂治疗的个体，该个体最初对这种治疗有反应，随后癌症又重新出现在该个体中。适合的还有用另外一种治疗试剂治疗癌症失去反应的个体。
HCV感染
根据本发明治疗HCV感染的方法治疗的个体包括已经临床诊断为感染了HCV的个体。感染了HCV的个体的确定可根据他们血液中具有HCV RNA和/或他们血清中具有抗HCV抗体。
临床诊断为感染了HCV的个体包括未经治疗的个体(例如，之前未进行HCV治疗的个体，尤其是那些之前未接受基于IFN-α和/或基于利巴韦林的疗法的个体)和之前治疗HCV失败的个体(“治疗失败”患者)。治疗失败患者包括没有反应者(即，之前的HCV治疗未使HCV滴度显著或充分地减少的个体，该之前的HCV治疗例如为之前的IFN-α单一疗法、之前的IFN-α和利巴韦林的联合疗法、或之前的聚乙二醇化IFN-α和利巴韦林的联合疗法)；以及复发者(即，之前经HCV治疗的个体(例如，其接受了之前的IFN-α单一疗法、之前的IFN-α和利巴韦林的联合疗法、或之前的聚乙二醇化IFN-α和利巴韦林的联合疗法)，其HCV滴度降低，并随后升高)。
在感兴趣的特定实施方案中，个体具有每毫升血清中有至少约105，至少约5×105，或至少约106，或至少约2×106的HCV基因组拷贝的HCV滴度。患者可能被感染任何HCV基因型(基因型1，包括1a和1b，2，3，4，6等和亚型(例如2a，2b，3a等))感染，尤其被难以治疗的基因型如HCV基因型1和个别HCV亚型和准种(quasispecies)感染。
感兴趣的还有HCV阳性的个体(如上所述)，所述个体表现出由于慢性HCV感染引起的严重纤维化或早期硬化(非代偿失调的，Child’s-Pugh级别A或更低)，或较高级的硬化(代偿失调的，Child’s-Pugh级别B或C)，并且尽管之前有基于IFN-α的疗法进行抗病毒治疗，所述个体仍然viremic，或所述个体不能耐受基于IFN-α的治疗，或对这样的治疗具有禁忌症。在感兴趣的特定实施方案中，根据METAVIR得分系统具有阶段3或4的肝纤维化的HCV阳性个体适合用本发明的方法治疗。在其他实施方案中，适合用本发明方法治疗的个体是临床表现为代偿失调硬化的患者，包括具有高度肝硬化的患者，包括那些等候肝脏移植的患者。在其他实施方案中，适合用本发明方法治疗的个体包括中度纤维化的患者，包括那些早期的纤维化(在METAVIR，Ludwig和Scheuer得分系统中的阶段1和2；或在Ishak得分系统中的阶段1，2或3)。
实施例
提供以下实施例，以便为本领域普通技术人员提供如何实施和使用本发明的完全公开和描述，所述实施例无意限制发明人视为其发明的范围，也不表明如下实验就是进行的全部实验或仅进行的实验。发明人已尽力确保有关所用数据的准确性(如，数量、温度等)，但应考虑到一些试验误差和偏差。除非有其他的说明，份指重量份，分子量指重均分子量，温度为摄氏度，压力为或接近大气压。会用到标准的缩略语，如，bp指碱基对；kb指千碱基；pl指皮升；s或sec指秒；min指分钟；h或hr指小时；aa指氨基酸；nt指核苷酸；i.m.指肌肉内的；i.p.指腹膜内的；s.c.指皮下的，等等。
实施例1：构建具有非天然糖基化位点的杂种I型干扰素受体激动剂
在I型干扰素中，两个干扰素α亚型(IFN-α2b和14)、IFN-β1和IFN-ω1在哺乳动物细胞中被天然糖基化(图24)。图24提供了Infergen(SEQ ID NO：**)和I型干扰素种类(SEQ ID NOs：**_**)的氨基酸序列的氨基酸序列比较，所述I型干扰素种类已有它们天然糖基化的报道。糖基化发生的氨基酸残基用粗线方框标记。天冬酰胺残基为N连接的糖基化锚定位点，苏氨酸残基为O连接的糖基化锚定位点。多数序列显示在上方(SEQ ID NO：**)。
基于Infergen和其他I型干扰素之间的高度氨基酸序列一致性，基于Infergen与天然糖基化的I型干扰素之间的氨基酸序列比对，在Infergen中设计了糖基化位点(图25)。图25提供了Infergen(SEQ IDNO：**)和本发明糖基化的突变体的各种实施方案(SEQ ID NOs：**-**)氨基酸61-120的氨基酸序列之间的氨基酸序列比较。位点1、2和3是产生糖基化位点的位置的例子。在位点1和2只产生N连接的糖基化位点。在位点3产生N连接和O连接的糖基化位点。N连接和O连接的糖基化位点被设计到Infergen中。N连接的糖基化涉及独特的寡糖分支结构，其连接在Asn-X-Ser/Thr基序的天冬酰胺残基上。O连接的糖基化由添加在丝氨酸或苏氨酸的OH基团上的寡糖链或糖胺聚糖组成。多数序列显示在上方(SEQ ID NO：**)。
实验设计
设计在人细胞中最优表达的Infergen基因。目前，Infergen产生于E.coli中，因此其包含对于细菌最优表达的密码子。糖基化的Infergen必须在哺乳动物细胞系中产生。为了增强在哺乳动物细胞中的蛋白表达水平，采用所选择的每个氨基酸的最常用密码子，设计和合成了具有人密码子使用偏好的(表8)新的Infergen基因(图26)。图26显示了示例性的具有偏好的人密码子使用的合成哺乳动物Infergen核苷酸序列(SEQ ID NOs：**和**)。开放阅读框用翻译了的Infergen氨基酸序列(SEQ ID NO：**)来表明。从A到F的六对互补引物用交替的斜体字和粗体文本表示。引物对的上部有义链用奇数表示，下部的无义链用偶数表示。在起始密码子ATG的上游区域，设计了短的序列GCCACC(Kozak共有序列)以增强真核翻译效率。两个相连的终止密码子--TAA和TGA--被用来确保翻译的完全终止。表8(如上)提供了人密码子使用偏好。来自“分子克隆：实验室手册”Sambrook J.和RussellD.W，第三版，冷泉港出版社。
构建合成的哺乳动物Infergen基因的策略。既然新的哺乳动物Infergen DNA序列是合成的，而非天然存在的，则化学合成基因就成为合理的合成方法。典型地，基因的化学合成包括合成短的寡核苷酸、它们的退火、连接和克隆进质粒。所有6对寡核苷酸被用来生产合成哺乳动物Infergen基因(图26)。
每对退火的引物具有使得其能够退火到临近的寡核苷酸的末端序列。合成基因的5′和3′端分别包含Hind III和Eco RI限制性核酸内切酶位点，它使得能连接进质粒。这些引物的详细序列信息已给出(表11)。
表11：化学基因合成哺乳动物Infergen的引物序列
| 引物 | 有义链 | 序列(5′到3′方向) |
| 是 | [Phosp]AGCTTGCCACCATGTGCGACCTGCCCCAGACCCACAGCCGGGGCAACCGCCGCGCCCTGATCCTGCTGGCCCAGATGCGCCGCATCACCCCC(SEQ ID NO：**) | |
| 否 | [Phosp]GCGGCGCATCTGGGCCAGCAGGATCAGGGCCCCGCGGTTGCCCAGGCTGTGGGTCTGGGGCAGGTCGCACATGGTGGCA (SEQ ID NO：**) | |
| 是 | [Phosp]TTCAGCTGCCTGAAGGACCGCCACGACTCGGCTTCCCCCAGGAGGAGTTCGACGGCAACCAGTTCCAGAAGGCCCAGGCCATCAGCG(SEQ ID NO：**) | |
| 否 | [Phosp]CCTGGGCCTTCTGGAACTGGTTGCCGTCGAACTCCTCCTGGGGGAAGCCGAAGTCGTGGCGGTCCTTCAGGCAGCTGAAGGGGCTGAT(SEQ ID NO：**) | |
| 是 | [Phosp]TGCTGCACGAGATGATCCAGCAGACCTTCAACCTGTTCAGCACCAAGGACAGCAGCGCCGCCTGGGACGAGAGCCTGCTGGAGAAG(SEQ ID NO：**) | |
| 否 | [Phosp]AGGCTCTCCTCCCAGGCGGCGCTGCTGTCCTTGGTGCTGAACAGGTTGAAGGTCTGCTGGATCATCTCGTGCAGCACGCTGATGG(SEQ ID NO：**) | |
| 是 | [Phosp]TTCTACACCGAGCTGTACCAGCAGCTGAACGACCTGGAGGCCTGCGTGATCCAGGAGGTGGGCGTGGAGGAGACCCCCCTGATGAACGTGG(SEQ ID NO：**) | |
| 否 | [Phosp]TCAGGGGGGTCTCCTCCACGCCCACCTGGATCACGCAGGCCTCCAGGGTCGTTCAGCTGCTGGTACAGCTCGGTGTAGAACTTCTCCAGC(SEQ ID NO：**) | |
| 是 | [Phosp]ACAGCATCCTGGCCGTGAAGAAGTACTTCCAGCGCATCACCCTGTACCTGACCGAGAAGAAGTACAGCCCCTGCGCCTGGGAGGTGG(SAQ ID NO：**) | |
| 否 | [Phosp]AGGCGCAGGGGCTGTACTTCTTCTCGGTCAGGTACAGGGTGATGCCCTGGAAGTACTTCTTCACCCCCAGGATGCTGTCCACGTTCA(SEQ ID NO：**) | |
| 是 | [Phosp]TGGGCGCCGAGATCATGCGCAGCTTCAGCCTGAGCACCAACCTGCAGGAGCGCCTGCGCCGCAAGGACTAATGAG(SEQ ID NO：**) | |
| 否 | [Phosp]AATTCTCATTACTCCTTGCGGCGCAGGCGCTCCTGCAGGTTGGTGCTCAGGCTGAAGCTGCGCATGATCTCGCCGCGCACCACCTCCC(SEQ ID NO：**) |
产生哺乳动物Infergen糖基化突变体的策略。产生哺乳动物的、能糖基化的Infergen所需的序列变化是较小的，可通过标准定点突变技术引入合成基因(图27)。图27显示了哺乳动物Infergen(SEQ IDNO：**)和其糖基化的突变体(SEQ ID NO：**-**)的核酸序列的比较，多数序列显示在上方(SEQ ID NO：**)。不一致的核苷酸显示在方框中。使用的密码子基于哺乳动物偏好的密码子用法(表8)。与多数序列不一致的核苷酸显示在方框中。
图28表示了人干扰素β1(SEQ ID NO：**)和示例性的IFN-β1糖基化的突变体(SEQ ID NOs：**-**)的氨基酸序列比较；多数序列(SEQ IDNO：**)显示在上方。位点1和2是产生糖基化突变的位置。通常，在位点1只产生N连接的糖基化位点。在位点2产生N连接的和O连接的糖基化位点。在人IFN-β1和突变体中的天然存在的N连接的糖基化位点显示在方框中。
图29显示了人干扰素ω-1(SEQ ID NO：**)和示例性的IFN-β1糖基化突变体(SEQ ID NO：**-**)的氨基酸序列比较；多数序列(SEQ IDNO：**)显示在上方。位点1和2是产生糖基化突变的位置。通常，在位点1只产生N连接的糖基化位点。在位点2产生N连接的和O连接的糖基化位点。人IFN-ω1和突变体中天然存在的N连接的糖基化位点显示在方框中。
实施例2：哺乳动物Infergen与其他I型干扰素信号肽的融合构建体的设计、构建、表达和糖基化位点生成。
材料和方法
构建融合基因
Infergen和示例性的Infergen融合蛋白以及人Infergenα14和β的氨基酸比对显示在图30中。为了合成用于预定融合蛋白的融合基因，设计了两步骤的聚合酶链式反应策略。用在PCR反应中的引物在以下表12中列出：
表12
| 引物名称 | 序列(5′到3′) |
| IFNa14_Inner | GCCCFGGTGGTGCTGAGCTGCAAGAGCAGC-TGCAGCCTGGGCTGCGACCTGCCCCAGACCCACAGC(SEQ IDNO：1350) |
| IFNa14_Outer | TATAAAGCTTGCCACCATGGCCCTGCCCTTC-GCCCTGATGATGGCCCTGGTGGTGCTTGAGCTGCAAG(SEQ IDNO：1351) |
| IFNb_Inner | GCCCTGCTGCTGTGCTTCAGCACCACCGCCC-TGAGCATGAGCTGCGACCTGCCCCAGACCCACAGC(SEQ IDNO1352) |
| IFNb_Outer | TATAAAGCITGCCCACCATGACCAACAAGTGC-CTGCTGCAGATCGCCCTGCTGCTGTGTGCTTCAGCACC(SEQ IDNO：1353) |
| INFERGEN_End | TATAGAATTCTCAITACTCCTTTGCGCGGCGCAGGCG(SEQ IDNO：1354) |
合成哺乳动物Infergen基因，将其克隆到pcDNA3.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)质粒中，用作模板。对于产生具有人Infergenα14信号肽的融合Infergen基因的第一轮PCR，将IFNa14 Inner引物与INFERGEN End引物结合以产生第二轮PCR的模板，该第二轮PCR采用IFNa14 Outer引物与INFERGEN End引物结合进行。最终的PCR产物用Hind III和EcoRI消化，并克隆到预消化的pcDNA3.1载体中。应用同样的步骤产生具有人干扰素β信号肽的Infergen基因，除了IFNb Inner和Outer引物被用来分别代替IFNa14 Inner和Outer引物。
瞬时转染和Western分析
Cos-7细胞系被选择用来瞬时过量表达Infergen。将Fugene-6(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)用作转染试剂，并根据制造商的说明进行。转染三天后，收集条件培养液，然后经过0.22μM组织培养滤过装置过滤，并用Centriplus YM-10离心滤器装置(Millipore，Billerica，MA)浓缩。测定蛋白浓度。收集吸附的细胞，用常规方法制备细胞裂解物。针对E.coli过量表达的Infergen产生的兔多克隆抗体用作Western分析的初级抗体。
定点诱变
在两个融合Infergen蛋白中的示例性的糖基化位点的位置如图25所示。将QuikChange定点诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)用来产生这些突变。
实验结果
产生了融合构建体，并且确定了其序列。图30显示了Infergen(SEQID NO：**)、人IFN-α14(SEQ ID NO：**)、人IFN-β1(SEQ ID NO：**)、以及示例性的具有人IFN-α14和人IFN-β信号肽(分别为SEQ ID NO：**和**)的融合蛋白。多数序列显示在上方(SEQ ID NO：**)。
所述结构随后瞬时转染到Cos-7细胞中，转染结果采用兔抗Infergen的多克隆抗体通过Western印记来分析。实验结果如图32所示。
图32显示了瞬时转染结果的Western印记分析。1-4道以Cos-7细胞的条件培养液上样，该Cos-7细胞转染了含有编码如下蛋白的核苷酸序列的质粒：具有IFN-α14信号肽的Infergen(1道)；具有IFN-β信号肽的Infergen(2道)；没有信号肽的Infergen(3道)；β半乳糖苷酶(4道)。5-8道以Cos-7细胞裂解液上样，该Cos-7细胞转染了含有编码如下蛋白的核苷序列的质粒：具有IFN-α14信号肽的Infergen(5道)；具有IFN-β信号肽的Infergen(6道)；没有信号肽的Infergen(7道)；β半乳糖苷酶(8道)。9道以30ng的Infergen上样，该由InfergenE.coli产生，从市场上购得。
实验结果表明两个融合蛋白表达良好，并且大部分由细胞分泌到条件培养液中，然而，没有信号肽的Infergen表达贫乏，并且存在于细胞内。这两个融合基因被选择作为产生糖基化位点的模板。
尽管参考具体的实施方案已描述了本发明，但本领域技术人员应理解，在不脱离本发明的本质和范围的情况下，可做出各种变化和等同替换。另外，可做出很多修改以使特定的状况、原料、物质组成、方法、工序或步骤，适应本发明的目的、本质和范围。所有这些修改都在所附权利要求范围之内。
Claims (59)
1.口服药物组合物，包含：
(a)第一单位形式中第一摩尔数的母体蛋白治疗剂的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体，所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，所述位点代替了在所述母体蛋白治疗剂中发现的天然蛋白酶切割位点，并且还包含：i)与至少一个不存在于所述母体蛋白治疗剂中的非天然糖基化位点共价连接的糖部分；或ii)与至少一个存在于所述母体蛋白治疗剂中但未糖基化的天然糖基化位点共价连接的糖部分；以及
(b)适于口服递送的药物赋形剂，
其中在所述第一单位形式中的所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体的第一摩尔数大于所述母体蛋白治疗剂在肠胃外药物组合物中的第二摩尔数，其中所述肠胃外药物组合物为适于皮下推注的速释制剂；
其中当通过皮下推注给予患者一定量的所述肠胃外药物组合物，由此所述患者以选择的给药间隔接受了所述第二摩尔数的母体蛋白治疗剂时，所述母体蛋白治疗剂被证实在治疗所述患者疾病中是有效的；以及
其中，当向患者口服给予所述第一单位形式时，释放所述第一摩尔数的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体所需的时间不长于所述选择的给药间隔中给药之间的时间。
2.口服药物组合物，包含：
(a)第一单位形式中第一剂量的母体蛋白治疗剂的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体，所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，所述位点代替了在所述母体蛋白治疗剂中发现的天然蛋白酶切割位点，并且还包含：i)与至少一个不存在于所述母体蛋白治疗剂中的非天然糖基化位点共价连接的糖部分；或ii)与至少一个存在于所述母体蛋白治疗剂中但未糖基化的天然糖基化位点共价连接的糖部分；以及
(b)适于口服递送的药物赋形剂，
其中当以选择的给药间隔通过皮下推注给予患者第二剂量的所述母体蛋白治疗剂时，所述母体蛋白治疗剂被证实在治疗所述患者疾病中是有效的；
其中当所述第一和第二剂量基于患有所述疾病的患者的整个群体的平均患者体重计算时，所述第一剂量中以药物摩尔数每公斤患者体重表示的所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体的量大于所述第二剂量中以药物摩尔数每公斤患者体重表示的所述母体蛋白治疗剂的量；以及
其中，当向患者口服给予所述第一单位形式中的第一剂量时，释放所述第一剂量中的所有已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体所需的时间不长于所述选择的给药间隔中给药之间的时间。
3.口服药物组成包括：
(a)第一单位形式中第一摩尔数的母体蛋白治疗剂的已知的超糖基化的多肽变体，所述已知的超糖基化的多肽变体包含：i)与至少一个不存在于所述母体蛋白治疗剂中的非天然糖基化位点共价连接的糖部分；或ii)与至少一个存在于所述母体蛋白治疗剂中但未糖基化的天然糖基化位点共价连接的糖部分；以及
(b)适于口服递送的药物赋形剂，
其中所述第一单位形式中的已知的超糖基化的多肽变体的第一摩尔数大于肠胃外药物组合物中所述母体蛋白治疗剂的第二摩尔数，其中所述肠胃外药物组合物为适于皮下推注的速释制剂；
其中当通过皮下推注给予患者一定量的所述肠胃外药物组合物，由此所述患者以选择的给药间隔接受了所述第二摩尔数的母体蛋白治疗剂时，所述母体蛋白治疗剂被证实在治疗所述患者疾病中是有效的；以及
其中，当向患者口服给予所述第一单位形式时，释放所述第一摩尔数的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体所需的时间不长于所述选择的给药间隔中给药之间的时间。
4.口服药物组合物，包含：
(a)第一单位形式中第一摩尔数的母体蛋白治疗剂的已知的超糖基化的多肽变体，所述已知的超糖基化的多肽变体包含：i)与至少一个不存在于所述母体蛋白治疗剂中的非天然糖基化位点共价连接的糖；或ii)与至少一个存在于所述母体蛋白治疗剂中但未糖基化的天然糖基化位点共价连接的糖部分；以及
(b)适于口服递送的药物赋形剂，
其中当以选择的给药间隔通过皮下推注给予患者第二剂量的所述母体蛋白治疗剂时，所述母体蛋白治疗剂被证实在治疗所述患者疾病中是有效的；
其中当所述第一和第二剂量基于患有所述疾病的患者的整个群体的平均患者体重计算时，所述第一剂量中以药物摩尔数每公斤患者体重表示的所述已知的超糖基化的多肽变体的量大于所述第二剂量中以药物摩尔数每公斤患者体重表示的所述母体蛋白治疗剂的量；以及
其中，当向患者口服给予所述第一单位形式中的第一剂量时，释放所述第一剂量中的所有已知的超糖基化的多肽变体所需的时间不长于所述选择的给药间隔中给药之间的时间。
5.如权利要求2或4所述的组合物，其中所述第二剂量为固定的剂量。
6.如权利要求2或4所述的组合物，其中所述第二剂量为基于重量的剂量。
7.如权利要求2或4所述的组合物，其中所述第二剂量为分级的剂量。
8.如权利要求1至7中任一权利要求所述的组合物，其中所述至少一个非天然糖基化位点为N连接的糖基化位点。
9.如权利要求1至7中任一权利要求所述的组合物，其中至少一个非天然糖基化位点为O连接的糖基化位点。
10.如权利要求1至7中任一权利要求所述的组合物，其中所述已知的抗蛋白酶的或超糖基化的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含未在所述母体蛋白治疗剂中发现的两个非天然糖基化位点。
11.如权利要求10所述的组合物，其中所述已知的抗蛋白酶的或超糖基化的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含与所述非天然糖基化位点共价连接的糖部分。
12.如权利要求1至11中任一权利要求所述的组合物，其中所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体为母体IFN-α的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的变体。
13.如权利要求12所述的组合物，其中所述母体IFN-α为IFN-α2。
14.如权利要求13所述的组合物，其中所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体选自[D99N]IFN-α 2a、[D99N，D105N]IFN-α 2a、[D99N]IFN-α 2b和[D99N，D105N]IFN-α 2b糖肽，以及其中所述变体包含任何氨基酸位置41、58、78、107、117、125、133和159处的一个或多个氨基酸替代，以至于所述变体包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，所述位点代替了在所述母体IFN-α 2多肽中发现的天然蛋白酶切割位点。
15.如权利要求12所述的组合物，其中所述母体IFN-α为共有IFN-α。
16.如权利要求15所述的组合物，其中所述母体IFN-α为干扰素alfacon-1。
17.如权利要求16所述的组合物，其中所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体选自[D99N]干扰素alfacon-1、[D99N，D105N]干扰素alfacon-1、[D99N，D105N，E134N]干扰素alfacon-1、[D105N，E134N]干扰素alfacon-1、[E134N]干扰素alfacon-1以及[D99N，E134N]干扰素alfacon-1糖肽，以及其中所述变体包含任何氨基酸位置41、58、78、107、117、125、133和159处的一个或多个氨基酸替代，以至于所述变体包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，所述位点代替了在所述母体共有IFN-α多肽中发现的天然蛋白酶切割位点。
18.如权利要求1至11中任一权利要求所述的组合物，其中所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体为母体蛋白治疗剂IFN-γ的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的变体。
19.如权利要求18所述的组合物，其中所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体选自[S99T]IFN-γ、[E38N]IFN-γ、[E38N，S40T]IFN-γ、[E38N，S99T]IFN-γ和[E38N，S40T，S99T]IFN-γ糖肽，以及其中所述变体包含一个或多个显示在表3中的氨基酸替代，以至于所述变体包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，所述位点代替了在母体IFN-γ多肽中发现的天然蛋白酶切割位点。
20.如权利要求18所述的组合物，其中所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体为糖基化的天然(野生型)人IFN-γ的抗蛋白酶的变体。
21.如权利要求1至20中任一权利要求所述的组合物，其中所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含在所述多肽变体中的每个糖基化位点处共价连接的糖部分。
22.如权利要求1至21中任一权利要求所述的组合物，其中所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含选自表9的载体多肽的任何载体多肽。
23.如权利要求22所述的组合物，其中所述载体多肽为所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体的共价分子结构的一部分。
24.如权利要求23所述的组合物，其中所述载体多肽在所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体的N端或N端附近。
25.治疗患者疾病的方法，所述方法包括：
口服给予所述患者一定量的口服药物组合物，所述口服药物组合物包含第一摩尔数的母体蛋白治疗剂的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体，由此所述患者以第一给药间隔接受了所述第一摩尔数的所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体，所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，所述位点代替了在所述母体蛋白治疗剂中发现的天然蛋白酶切割位点，并且还包含：i)与至少一个不存在于母体蛋白治疗剂中的非天然糖基化位点共价连接的糖部分；或ii)与至少一个存在于母体蛋白治疗剂中但未糖基化的天然糖基化位点共价连接的糖部分；
其中所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体的所述第一摩尔数大于肠胃外药物组合物中所述母体蛋白治疗剂的第二摩尔数，其中所述肠胃外药物组合物为适于皮下推注的速释制剂；
其中当通过皮下推注给予患者一定量的所述肠胃外药物组合物，由此所述患者以第二给药间隔接受了所述第二摩尔数的母体蛋白治疗剂时，所述母体蛋白治疗剂被证实在治疗所述患者疾病中是有效的；以及
其中所述第一给药间隔等于或短于所述第二给药间隔。
26.治疗患者疾病的方法，所述方法包括：
口服给予所述患者以定量的口服药物组合物，所述口服药物组合物包含母体蛋白治疗剂的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体，由此所述患者以第一给药间隔接受了第一剂量的所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶的、超糖基化的多肽变体，所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，所述位点代替了在所述母体蛋白治疗剂中发现的天然蛋白酶切割位点，并且还包含：i)与至少一个不存在于所述母体蛋白治疗剂中的非天然糖基化位点共价连接的糖部分；或ii)与至少一个存在于所述母体蛋白治疗剂中但未糖基化的天然糖基化位点共价连接的糖部分；
其中当皮下推注给予患者一定量的肠胃外药物组合物，由此所述患者以第二给药间隔接受了第二剂量的所述母体蛋白治疗剂时，包含所述母体蛋白治疗剂的所述肠胃外药物组合物被证实在治疗所述患者疾病中是有效的，
其中当所述第一和第二剂量基于相同患者体重计算时，以所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体的摩尔数每公斤患者体重表示的所述第一剂量大于以所述母体蛋白治疗剂的摩尔数每公斤患者体重表示的第二剂量；以及
其中当向所述患者口服给予所述第一剂量时，需要释放所述第一剂量中的所有已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体所需的时间不长于所述第二给药间隔中给药之间的时间。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述第一给药间隔中给药之间的时长等于或短于所述第二给药间隔中给药之间的时长。
28.治疗患者疾病的方法，所述方法包括：
口服给予所述患者一定量的口服药物组合物，所述口服药物组合物包含母体蛋白治疗剂的已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体，由此患者以第一给药间隔接受了第一剂量的所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体，所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶的、超糖基化的多肽变体包含至少一个突变的蛋白酶切割位点，所述位点代替了在母体蛋白中发现的天然蛋白酶切割位点，并且还包含：i)与至少一个不存在于所述母体蛋白治疗剂中的非天然糖基化位点共价连接的糖部分；或ii)与至少一个存在于所述母体蛋白治疗剂中但未糖基化的天然糖基化位点共价连接的糖部分；
其中当皮下推注给予患者一定量，由此所述患者以第二给药间隔接受了第二剂量的所述母体蛋白治疗剂时，包含所述母体蛋白治疗剂的肠胃外药物组合物被证实在治疗所述患者疾病中是有效的，
其中当所述第一和第二剂量基于相同患者体重计算时，以每公斤患者体重的所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体的摩尔数每公斤患者体重表示的所述第一剂量大于以所述母体蛋白治疗剂的摩尔数每公斤患者体重表示的所述第二剂量；以及
其中所述第一给药间隔中给药之间的时长等于或短于所述第二给药间隔中给药之间的时长。
29.如权利要求26至28中任一权利要求所述的方法，其中所述第二剂量为固定的剂量。
30.如权利要求26至28中任一权利要求所述的方法，其中所述第二剂量为基于重量的剂量。
31.如权利要求26至28中任一权利要求所述的方法，其中第二剂量为分级的剂量。
32.如权利要求26至31中任一权利要求所述的方法，其中所述第一剂量为基于重量的剂量。
33.如权利要求26至31中任一权利要求所述的方法，其中所述第一剂量为固定的剂量。
34.如权利要求25至33中任一权利要求所述的方法，其中所述疾病为选自权利要求1-22的权利要求中所述的疾病，以及其中所述口服药物组合物为所选的权利要求中所述的口服药物组合物。
35.治疗患者疾病的方法，其中所述疾病为选自权利要求1-24的权利要求中所述的疾病，所述方法包括口服给予所述患者有效量的所选的权利要求中所述的口服药物组合物。
36.如权利要求25至33中任一权利要求所述的方法，其中所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体包含选自表9的载体多肽的任何载体多肽。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述载体多肽为所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体的共价分子结构的一部分。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述载体多肽在所述已知的抗蛋白酶的或抗蛋白酶、超糖基化的多肽变体的N端或N端附近。
39.合成的I型干扰素受体多肽激动剂。
40.如权利要求39所述的I型干扰素受体多肽激动剂，其中多肽激动剂包含至少一个非天然糖基化位点。
41.如权利要求40所述的多肽激动剂，其中所述非天然糖基化位点为N连接的糖基化位点。
42.如权利要求40所述的多肽激动剂，其中所述非天然糖基化位点为O连接的糖基化位点。
43.如权利要求39所述的I型干扰素受体多肽激动剂，其中所述多肽激动剂包含至少一个代替天然蛋白酶切割位点的突变的蛋白酶切割位点。
44.如权利要求39或40或43所述的多肽激动剂，为杂种I型干扰素受体多肽激动剂。
45.如权利要求44所述的多肽，选自干扰素-α2a(D99N)、干扰素-α2a(D105N)、以及干扰素-α2a(D99N，D105N)。
46.如权利要求44所述的多肽，选自干扰素-α2b(D99N)、干扰素-α2b(D105N)、以及干扰素-α2b(D99N，D105N)。
47.如权利要求44所述的多肽，选自干扰素alphacon-1(D99N)、干扰素alphacon-1(D95N，D105N)、干扰素alphacon-1(D99N，D105N，E134N)、干扰素alphacon-1(D105N、E134N)、干扰素alphacon-1(E134N)、以及干扰素alphacon-1(D99N，E134N)。
48.如权利要求44所述的多肽激动剂，其中所述多肽的氨基酸序列包含在氨基酸一致性和数量上对应于不同的、天然存在的I型干扰素受体多肽激动剂的亚序列的不连续的亚序列，所述天然存在的I型干扰素受体多肽激动剂选自干扰素-α2b、干扰素-α14、干扰素-β1和干扰素-ω，其中所述多肽激动剂的氨基酸序列不同于天然存在的I型干扰素受体多肽激动剂干扰素-α2b、干扰素-α14、干扰素-β1和干扰素-ω的氨基酸序列。
49.如权利要求39或40或43所述的多肽激动剂，为共有I型干扰素受体多肽激动剂。
50.如权利要求49所述的多肽激动剂，其中所述多肽激动剂包含SEQ ID No：9-19所示的氨基酸序列。
51.如权利要求39至50中任一权利要求所述的多肽激动剂，其中所述多肽激动剂被糖基化。
52.如权利要求39至44或48至50中任一权利要求所述的多肽激动剂，其中所述多肽激动剂在所述多肽激动剂中的非天然糖基化位点糖基化。
53.多核苷酸，包含编码权利要求39-50中任一权利要求所述的合成的I型干扰素受体多肽激动剂的核苷酸序列。
54.如权利要求53所述的多核苷酸，其中所述合成的I型干扰素受体多肽激动剂包含SEQ ID No：9-19中任一个所示的氨基酸序列。
55.如权利要求53所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含对应于人密码子使用偏好的密码子。
56.表达载体，包含可操作地连接到在真核细胞中有功能的启动子的权利要求53所述的多核苷酸。
57.宿主细胞，包含权利要求53所述的多核苷酸。
58.宿主细胞，包含权利要求56所述的表达载体。
59.如权利要求57或58所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为真核细胞。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Open date: 20080109 |