JP2016516796A - 修飾されたヒドロゲル - Google Patents

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Abstract

本発明は、ヒドロゲル連結プロドラッグにおける担体として適当なヒドロゲルを調製する方法、該方法から得ることができるヒドロゲル、ヒドロゲル連結プロドラッグにおける担体としてのそのようなヒドロゲルの使用、及び本発明の共有結合によりコンジュゲートされたヒドロゲルを含むヒドロゲル連結プロドラッグに関する。ヒドロゲルプロドラッグ担体は、ヒドロゲル担体の外側への薬物負荷が低下している。これは、ヒドロゲルの官能基、特に、その表面における官能基の数を減少させることによって達成される。【選択図】なし

Description

本発明は、ヒドロゲル連結プロドラッグにおける担体として適当なヒドロゲルを調製する方法、該方法から得ることができるヒドロゲル、そのようなヒドロゲルのヒドロゲル連結プロドラッグにおける担体としての使用、及び本発明の共有結合によりコンジュゲートされたヒドロゲルを含むヒドロゲル連結プロドラッグに関する。
ヒドロゲルは、担体連結プロドラッグ用の多用途担体である。例えば、WO2006003014A2及びWO2011012715A1参照。薬物のほとんどはヒドロゲルの内部に接続されているので、薬物は、患者の体に存在する修飾酵素及び/又は分解酵素から保護され、それにより活性薬物がそのようなプロドラッグから放出される期間が延長される。
しかしながら、ヒドロゲル担体への薬物負荷の一部はヒドロゲル担体の外部にも接続されており、これは特定の場合には潜在的に不利点となり得る。1つの不利点は、患者にヒドロゲル連結プロドラッグが投与されると、ヒドロゲルの外部に結合した薬物分子が患者の体に存在する修飾酵素及び/又は分解酵素に暴露される可能性があることであり得る。
別の不利点は、ヒドロゲルの外部に結合した薬物が、あるレベルの残存する活性又は免疫原性を潜在的に有する可能性があり、これは稀な場合には免疫反応及び/又は炎症のような望ましくない効果を引き起こす可能性がある。
それに応じて、前記欠点を少なくともある程度は克服するヒドロゲルプロドラッグ担体が必要とされている。
したがって、本発明の目的は、前記した欠点の少なくともいくつかを克服し、ヒドロゲル担体の外部への薬物負荷が低下したヒドロゲルドラッグ担体を提供することである。これは、ヒドロゲルの官能基、特に、その表面にある官能基の数を減少させることによって達成される。
1つの態様において、本発明は、ヒドロゲル連結プロドラッグにおける担体として適当なヒドロゲルを調製する方法であって、
(a)同一又は異なる、好ましくは同一の官能基を表す基Ax0を有するヒドロゲルを準備する工程、
(b)任意選択で、式(I):
Ax1-SP2-Ax2 (I)
[式中、
SP2は、C1〜50アルキル、C2〜50アルケニル又はC2〜50アルキニルであり、前記C1〜50アルキル、C2〜50アルケニル及びC2〜50アルキニルは、-NH-、-N(C1〜4アルキル)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)NH、-C(O)N(C1〜4アルキル)-、-O-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、4から7員のヘテロシクリル、フェニル及びナフチルからなる群から選択される1つ以上の基によって任意選択で中断されていてもよく、
Ax1は、ヒドロゲルのAx0との反応のための官能基であり、
Ax2は、官能基である]
のスペーサー試薬を、工程(a)からのヒドロゲルのAx0に共有結合によりコンジュゲートさせる工程、及び
(c)工程(a)又は工程(b)のヒドロゲルを式(II):
Ax3-Z (II)
(式中、
Ax3は、官能基であり、
Zは、10Daから1000kDaの範囲の分子量を有する不活性部分である)
の試薬と、Ax0又はAx2の最大99mol%がAx3と反応するように反応させる工程
を含む方法に関する。
今回、驚くべきことに、そのような修飾されたヒドロゲルは、未修飾ヒドロゲルと比較して、ヒドロゲルの表面で利用可能な減少した数の官能基Ax0を有し、かくして、そのようなヒドロゲルをヒドロゲル連結プロドラッグ用の担体として使用すると、その表面に結合したより少ない生物学的に活性な部分を有することが判明した。
本発明内では、用語は以下の意味で用いられる。
本明細書で用いる場合、用語「ヒドロゲル」は、共有結合性化学的架橋の存在のため不溶性である、ホモポリマー又はコポリマーで構成された親水性又は両親媒性ポリマーネットワークを意味する。該架橋は、ネットワーク構造及び物理的一体性を提供する。ヒドロゲルは、水との熱力学的適合性を呈し、これは、それらが水性媒体中で膨潤することを可能とする。
本明細書で用いる場合、用語「試薬」は、別の試薬又は部分の官能基との反応のための少なくとも1つの官能基を含む化学化合物を意味する。
本明細書で用いる場合、用語「骨格試薬」は、ヒドロゲルを形成するための出発物質として適当な試薬を意味する。本明細書で用いる場合、骨格試薬は、好ましくは、生分解性結合を含まない。骨格試薬は、複数の他の部分が結合した原子又は部分を意味する「分岐コア」を含んでもよい。
本明細書で用いる場合、用語「架橋剤試薬」は、骨格試薬を架橋させるための出発物質として適当な直鎖状又は分岐鎖状試薬を意味する。好ましくは、架橋剤試薬は直鎖状化学化合物である。架橋剤試薬は少なくとも1つの生分解性結合を含む。
本明細書で用いる場合、用語「部分」は、対応する試薬と比較して1つ以上の原子を欠如する分子の一部を意味する。例えば、式「H-X-H」の試薬がもう1つの試薬と反応し、反応生成物の一部分となれば、反応生成物の対応する部分は構造「H-X-」又は「-X-」を有し、他方、各「-」は別の部分への結合を示す。
したがって、フレーズ「結合された形態である」は、試薬の対応する部分を意味するのに用いられ、すなわち、「結合された形態であるリシン」とは、リシン試薬の1つ以上の原子を欠き、分子の一部であるリシン部分を指す。
用語「薬物」は、限定されるものではないが、ウイルス、細菌、真菌、植物、動物及びヒトを含めた、生物有機体の1つ以上の物理的又は生化学的特性をもたらすことができる任意の物質を意味する。特に、本明細書で用いる場合、該用語は生物、特に、ヒト又は動物における疾患の診断、治癒、緩和、治療、又は予防が意図された、又はそうでなければ、生物、特に、ヒト又は動物の身体的又は精神的健康を増強することが意図された任意の物質を含む。
用語「生物学的に活性な部分」とは、薬物を1つ以上の他の部分へ共有結合によりコンジュゲートした後に生じる部分であって、薬物の1つ以上の官能基は、該1つ以上の他の部分の官能基にコンジュゲートして結合を形成する。
用語「スペーサー部分」とは、本明細書で用いる場合、2つの部分を接続するのに適した任意の部分を意味し、適当なスペーサー部分は当業者に知られている。
本明細書で用いる場合、用語「官能基」は、他の官能基と反応することができる原子の群を意味する。官能基は、限定されるものではないが、以下の基:カルボン酸(-(C=O)OH)、第一級若しくは第二級アミン(-NH2、-NH-)、マレイミド、チオール(-SH)、スルホン酸(-(O=S=O)OH)、カルボネート、カルバメート(-O(C=O)N<)、ヒドロキシ(-OH)、アルデヒド(-(C=O)H)、ケトン(-(C=O)-)、ヒドラジン(>N-N<)、イソシアネート、イソチオシアネート、リン酸(-O(P=O)OHOH)、ホスホン酸(-O(P=O)OHH)、ハロアセチル、ハロゲン化アルキル、アクリロイル、フッ化アリール、ヒドロキシルアミン、ジスルフィド、ビニルスルホン、ビニルケトン、ジアゾアルカン、オキシラン、及びアジリジンを含む。
本明細書で用いる場合、用語「活性化された官能基」は、活性化基に接続された官能基を意味し、すなわち、官能基は活性化試薬と反応した。好ましい活性化された官能基は、限定されるものではないが、活性化されたエステル基、活性化されたカルバメート基、活性化されたカルボネート基及び活性化されたチオカルボネート基を含む。好ましい活性化基は、式((f-i)から(f-vi):
Figure 2016516796
 [式中、
破線は、分子の残りへの結合を示し、
bは、1、2、3又は4であり、
XHは、Cl、Br、I、又はFである]
からなる群から選択される。
従って、好ましい活性化されたエステルは式:
-(C=O)-Y1:
[式中、
Y1は、式(f-i)、(f-ii)、(f-iii)、(f-iv)、(f-v)及び(f-vi)からなる群から選択される]
を有する。
従って、好ましい活性化されたカルバメートは式:
-N(C=O)-Y1:
[式中、
Y1は、式(f-i)、(f-ii)、(f-iii)、(f-iv)、(f-v)及び(f-vi)からなる群から選択される]
を有する。
従って、好ましい活性化されたカルボネートは式:
-O-(C=O)-Y1:
[式中、
Y1は、式(f-i)、(f-ii)、(f-iii)、(f-iv)、(f-v)及び(f-vi)からなる群から選択される]
を有する。
従って、好ましい活性化されたチオカルボネートは式:
-S-(C=O)-Y1:
[式中、
Y1は、式(f-i)、(f-ii)、(f-iii)、(f-iv)、(f-v)及び(f-vi)からなる群から選択される]
を有する。
従って、「官能性末端基」は、部分又は分子の末端に局所化された官能基であり、すなわち、末端官能基である。
化学的官能基が別の官能基にカップリングされると、得られる化学的構造は「結合」という。例えば、アミン基とカルボキシル基との反応の結果、アミド結合が得られる。
本明細書で用いる場合、用語「保護基」は、官能基に可逆的に接続して、官能基を、例えば、別の官能基と反応できないようにする部分を意味する。適当なアルコール(-OH)保護基は、例えば、アセチル、ベンゾイル、ベンジル、β-メトキシエトキシメチルエーテル、ジメトキシトリチル、メトキシメチルエーテル、メトキシトリチル、p-メトキシベンジルエーテル、メチルチオメチルエーテル、ピバロイル、テトラヒドロピラニル、トリチル、トリメチルシリル、tert-ブチルジメチルシリル、トリイソプロピルシリルオキシメチル、トリイソプロピルシリルエーテル、メチルエーテル、及びエトキシエチルエーテルである。適当なアミン保護基は、例えば、カルボベンジルオキシ、p-メトキシベンジルカルボニル、tert-ブチルオキシカルボニル、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル、アセチル、ベンゾイル、ベンジル、カルバメート、p-メトキシベンジル、3,4-ジメトキシベンジル、p-メトキシフェニル、及びトシルである。適当なカルボニル保護基は、例えば、アセタール及びケタール、アシラール及びジチアンである。適当なカルボン酸保護基は、例えば、メチルエステル、ベンジルエステル、tert-ブチルエステル、2,6-ジメチルフェノール、2,6-ジイソプロピルフェノール、2,6-ジ-tert-ブチルフェノール、シリルエステル、オルトエステル、及びオキサゾリンである。適当なホスフェート保護基は、例えば、2-シアノエチル及びメチルである。
本明細書で用いる場合、用語「後処理」及び「後処理する」とは、化学反応、特に、重合の生成物を単離し、精製するのに有用な、及び/又はそれに必要な一連の操作を指す。
本明細書で用いる場合、用語「ポリマー」は、直鎖状、環状、分岐鎖状、架橋状又はデンドリマー状、又はそれらの組合せにて化学結合によって接続された反復構造単位、すなわち、モノマーを含む分子を意味し、これは、合成又は生物学的起源、又は双方の組合せのものであってよい。ポリマーは、例えば、官能基を含むものであってもよいのは理解される。好ましくは、ポリマーは少なくとも0.5kDaの分子量、例えば、少なくとも1kDaの分子量、少なくとも2kDaの分子量、少なくとも3kDaの分子量又は少なくとも5kDaの分子量を有する。最大、ポリマーは、好ましくは、100万Daの分子量を有する。
本明細書で用いる場合、用語「ポリマー性」は、1つ以上のポリマーを含む試薬又は部分を意味する。
当業者であれば、重合反応から得られた重合生成物は、全てが同一の分子量を有するのではなく、むしろ、分子量分布を呈することを理解する。結果として、ポリマーにおける分子量範囲、分子量、モノマーの数の範囲、及びポリマー中のモノマーの数は、本明細書で用いる場合、数平均分子量及びモノマーの数平均を指す。本明細書で用いるように、用語「数平均分子量」は、個々のポリマーの分子量の通常の幾何平均を意味する。
本明細書で用いる場合、用語「重合」又は「重合する」は、限定されるものではないが、ヒドロゲルを含めたポリマー鎖又はネットワークを形成するための、化学反応におけるモノマー又はマクロモノマー試薬を反応させる方法を意味する。
本明細書で用いる場合、用語「マクロモノマー」は、モノマー試薬の重合から得られた分子を意味する。
本明細書で用いる場合、用語「縮合重合」又は「縮合反応」は、2つの試薬の官能基が反応して、1つの単一の分子、すなわち、反応生成物を形成し、及び低分子量の分子、例えば、水が放出される化学反応を意味する。
本明細書で用いる場合、用語「懸濁重合」は、モノマー試薬を第1の溶媒に溶解し、分散相を形成し、これを第2の溶媒に乳化し、連続相を形成する、不均一及び/又は二相重合反応を意味する。本発明においては、モノマー試薬は少なくとも1つの骨格試薬及び少なくとも1つの架橋剤試薬である。第1の溶媒及びモノマー試薬の双方は、第2の溶媒に可溶性でない。そのようなエマルジョンは、撹拌、振盪、超音波への暴露、又はMicrosieve(商標)乳化によって形成され、より好ましくは、撹拌又はMicrosieve(商標)乳化によって、より好ましくは、撹拌によって形成される。このエマルジョンは適切な乳化剤によって安定化される。重合は、第1の溶媒に可溶性である開始剤としての塩基の添加によって開始される。開始剤として適当な通常知られた塩基は、テトラメチルエチレンジアミン(TMEDA)のような第三級塩基であってよい。
本明細書で用いる場合、用語「不活性」とは、化学的に反応性でない部分を指し、すなわち、それは他の部分又は試薬と反応しない。当業者であれば、用語「不活性な」は、それ自体、官能基の存在を排除するものではないことを理解するが、不活性部分に潜在的に存在する官能基は、例えば、引き続いての反応において、該不活性部分と接触された部分/試薬の官能基と反応性でないことを理解する。特に、不活性部分ZはAx0又はAx2と、又は、例えば、本発明のヒドロゲルに共有結合によりコンジュゲートして、本発明のヒドロゲル連結プロドラッグを得ることができる、可逆的なプロドラッグリンカー試薬、薬物、可逆的なプロドラッグリンカー部分-生物学的活性部分コンジュゲート試薬又はスペーサー試薬に存在する官能基と反応しない。
本明細書で用いる場合、用語「非混和性」は、雰囲気温度及び圧力にて、すなわち、典型的には、典型的な研究室環境における温度及び圧力条件にて、2つの物質が組み合わされて、均一な混合物を形成することができない特性を意味する。
本明細書で用いる場合、用語「ポリアミン」は、1個を超えるアミン(-NH-及び/又はNH2)、例えば、2から64個のアミン、4から48個のアミン、6から32個のアミン、8から24個のアミン、又は10から16個のアミンを含む試薬又は部分を意味する。特に好ましいポリアミンは、2から32個のアミンを含む。
本明細書で用いる場合、部分又は試薬に関連する用語「少なくともX%のPEGを含むPEG系」は、該部分又は試薬が少なくともX%(w/w)エチレングリコール単位(-CH2CH2O-)を含み、ここで、該エチレングリコール単位はブロック様式、交互に配置することができ、又は部分又は試薬内にランダムに分布することができ、好ましくは、該部分又は試薬の全てのエチレングリコール単位は1つのブロックに存在し、PEG系の部分又は試薬の残りの重量百分率は、特に、
・C1〜50アルキル、C2〜50アルケニル、C2〜50アルキニル、C3〜10シクロアルキル、4から7員のヘテロシクリル、8から11員のヘテロビシクリル、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、及びテトラリニル、及び
・
Figure 2016516796
 [式中、
破線は、部分又は試薬の残りへの結合を示し、R1及びR1aは、相互に独立して、H又はC1〜6アルキルである]
からなる結合の群から選択される結合、
からなる群から選択される他の部分であることを意味する。
用語「少なくともX%のヒアルロン酸を含むヒアルロン酸系」は、同様な状況に応じて、用いられる。
本明細書で用いる場合、用語「C1〜4アルキル」は、単独で、又は組み合わされて、1から4個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐鎖状アルキル基を意味する。分子の末端に存在すると、直鎖状及び分岐鎖状C1〜4アルキル基の例は、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル及びtert-ブチルである。分子の2個の部分がC1〜4アルキル基によって連結される場合、そのようなC1〜4アルキル基についての例は、-CH2-、-CH2-CH2-、-CH(CH3)-、-CH2-CH2-CH2-、-CH(C2H5)-、-C(CH3)2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-、及びCH2-CH2-CH2(CH3)-である。C1〜4アルキル基の各水素原子は、以下に定義される置換基によって置き換えられていてよい。
本明細書で用いる場合、用語「C1〜6アルキル」は、単独で、又は組み合わされて、1から6個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐鎖状アルキル基を意味する。分子の末端に存在すると、直鎖状及び分岐鎖状C1〜6アルキル基の例は、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、2-メチルブチル、2,2-ジメチルピロピル、n-ヘキシル、2-メチルペンチル、3-メチルペンチル、2,2-ジメチルブチル、2,3-ジメチルブチル及び3,3-ジメチルプロピルである。分子の2個の部分がC1〜6アルキル基によって連結される場合、そのようなC1〜6アルキル基についての例は、-CH2-、-CH2-CH2-、-CH(CH3)-、-CH2-CH2-CH2-、-CH(C2H5)-及びC(CH3)2-である。C1〜6アルキル基の各水素原子は以下に定義される置換基によって置き換えられていてよい。
従って、本明細書で用いる場合、用語「C1〜20アルキル」は、単独で、又は組み合わされて、1から20個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐鎖状アルキル基を意味する。用語「C8〜18アルキル」は、単独で、又は組み合わされて、8から18個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐鎖状アルキル基を意味する。従って、本明細書で用いるように、用語「C1〜50アルキル」は、単独で、又は組み合わされて、1から50個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐鎖状アルキル基を意味する。C1〜20アルキル基、C8〜18アルキル基及びC1〜50アルキル基の各水素原子は、置換基によって置き換えられていてよい。各場合において、アルキル基は分子の末端に存在してよく、又は分子の2個の部分はアルキル基によって連結されていてよい。
本明細書で用いる場合、用語「C2〜6アルケニル」は、単独で、又は組み合わされて、2から6個の炭素原子を有する少なくとも1個の炭素-炭素二重結合を含む直鎖状又は分岐鎖状の炭化水素部分を意味する。分子の末端に存在すると、例は、-CH=CH2、-CH=CH-CH3、-CH2-CH=CH2、-CH=CHCH2-CH3及びCH=CH-CH=CH2である。分子の2個の部分がC2〜6アルケニル基によって連結されている場合、そのようなC2〜6アルケニルについての例は-CH=CH-である。C2〜6アルケニル基の各水素原子は、以下に定義される置換基によって置き換えられていてよい。任意選択で、1個以上の三重結合が出現してよい。
従って、本明細書で用いる場合、用語「C2〜20アルケニル」は、単独で又は組み合わされて、2から20個の炭素原子を有する少なくとも1個の炭素-炭素二重結合を含む直鎖状又は分岐鎖状炭化水素残基を意味する。用語「C2〜50アルケニル」は、単独で、又は組み合わされて、2から50個の炭素原子を有する少なくとも1個の炭素-炭素二重結合を含む直鎖状又は分岐鎖状炭化水素残基を意味する。分子の末端に存在すると、例は、-CH=CH2、-CH=CH-CH3、-CH2-CH=CH2、-CH=CHCH2-CH3及びCH=CH-CH=CH2である。分子の2個の部分がアルケニル基によって連結されている場合、例は、例えば、-CH=CH-である。C2〜20アルケニル又はC2〜50アルケニル基の各水素原子は、以下に定義されるような置換基によって置き換えられていてよい。任意選択で、1個以上の三重結合が出現してよい。
本明細書で用いる場合、用語「C2〜6アルキニル」は、単独で、又は組み合わされて、2から6個の炭素原子を有する少なくとも1個の炭素-炭素三重結合を含む直鎖状又は分岐鎖状炭化水素残基を意味する。分子の末端に存在すると、例は-C≡CH、-CH2-C≡CH、CH2-CH2-C≡CH及びCH2-C≡C-CH3である。分子の2個の部分がアルキニル基によって連結されている場合、例は-C≡C-である。C2〜6アルキニル基の各水素原子は、以下に定義される置換基によって置き換えられていてもよい。任意選択で、1個以上の二重結合が出現してよい。
従って、本明細書で用いる場合、用語「C2〜20アルキニル」は、単独で、又は組み合わされて、2から20個の炭素原子を有する少なくとも1個の炭素-炭素三重結合を含む直鎖状又は分岐鎖状炭化水素残基を意味し、「C2〜50アルキニル」は、単独で、又は組み合わされて、2から50個の炭素原子を有する少なくとも1個の炭素-炭素三重結合を含む直鎖状又は分岐鎖状炭化水素残基を意味する。分子の末端に存在すると、例は、-C≡CH、-CH2-C≡CH、CH2-CH2-C≡CH及びCH2-C≡C-CH3である。分子の2個の部分がアルキニル基によって連結されている場合、例は、-C≡C-である。C2〜20アルキニル又はC2〜50アルキニル基の各水素原子は以下に定義される置換基によって置き換えられていてよい。任意選択で、1個以上の二重結合が出現してよい。
本明細書で用いる場合、用語「C3〜8シクロアルキル」又は「C3〜8シクロアルキル環」は、飽和又は不飽和であってよい、3から8個の炭素原子を有する環状アルキル鎖、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、シクロオクチルを意味する。シクロアルキル炭素の各水素原子は以下に定義される置換基によって置き換えられていてよい。用語「C3〜8シクロアルキル」又は「C3〜8シクロアルキル環」は、ノルボナン又はノルボネンのような架橋二環も含む。従って、「C3〜5シクロアルキル」は、3から5個の炭素原子を有するシクロアルキル及び3から10個の炭素原子を有するC3〜10シクロアルキルを意味する。
従って、本明細書で用いる場合、用語「C3〜10シクロアルキル」は、飽和又は不飽和であってよい、3から10個の炭素原子を有する炭素環系、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシルを意味する。用語「C3〜10シクロアルキル」はまた、少なくとも部分的に飽和された炭素単環及び二環を含む。
本明細書で用いる場合、用語「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨードを意味する。特に好ましいのは、フルオロ又はクロロである。
本明細書で用いる場合、用語「4から7員のヘテロシクリル」又は「4から7員の複素環」は、最大数までの二重結合を含有してよい4、5、6又は7個の環原子を有する環(十分に飽和され、部分的飽和され、又は飽和されていない芳香族若しくは非芳香族環)を意味し、ここで、少なくとも1個の環原子から4個までの環原子は(-S(O)-、-S(O)2-を含めた)硫黄、酸素及び(=N(O)-を含めた)窒素からなる群から選択されるヘテロ原子によって置き換えられ、ここで、該環は炭素若しくは窒素原子を介して分子の残りに連結されている。4から7員の複素環の例としては、限定されるものではないが、アゼチジン、オキセタン、チエタン、フラン、チオフェン、ピロール、ピロリン、イミダゾール、イミダゾリン、ピラゾール、ピラゾリン、オキサゾール、オキサゾリン、イソオキサゾール、イソオキサゾリン、チアゾール、チアゾリン、イソチアゾール、イソチアゾリン、チアジアゾール、チアジアゾリン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェン、ピロリジン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、オキサゾリジン、イソオキサゾリジン、チアゾリジン、イソチアゾリジン、チアジアゾリジン、スルホラン、ピラン、ジヒドロピラン、テトラヒドロピラン、イミダゾリジン、ピリジン、ピリダジン、ピラジン、ピリミジン、ピペラジン、ピペリジン、モルホリン、テトラゾール、トリアゾール、トリアゾリジン、テトラゾリジン、ジアゼパン、アゼピン及びホモピペラジンが挙げられる。4から7員のヘテロシクリル又は4から7員の複素環基の各水素原子は以下に定義される置換基によって置き換えられていてもよい。
本明細書で用いる場合、用語「8から11員のヘテロビシクリル」又は「8から11員の複素二環」は、8から11個の環原子を有する2個の環の複素環系を意味し、ここで、少なくとも1個の環原子は双方の環によって共有され、それは最大数までの二重結合を含有してもよく(十分に飽和、部分的に飽和、又は不飽和である芳香族若しくは非芳香族環)、ここで、少なくとも1個の環原子から6個までの環原子は、(-S(O)-、-S(O)2-を含めた)硫黄、酸素及び(=N(O)-を含めた)窒素からなる群から選択されるヘテロ原子によって置換されており、ここで、該環は炭素若しくは窒素原子を介して分子の残りに連結されている。8から11員の複素二環についての例は、インドール、インドリン、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、ベンゾオキサゾール、ベンゾイソオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾイソチアゾール、ベンズイミダゾール、ベンズイミダゾリン、キノリン、キナゾリン、ジヒドロキナゾリン、キノリン、ジヒドロキノリン、テトラヒドロキノリン、デカヒドロキノリン、イソキノリン、デカヒドロイソキノリン、テトラヒドロイソキノリン、ジヒドロイソキノリン、ベンズアゼピン、プリン及びプテリジンである。用語8から11員の複素二環は、1,4-ジオキサ-8-アザスピロ[4.5]デカンのような2つの環のスピロ構造又は8-アザ-ビシクロ[3.2.1]オクタンのような架橋複素環も含む。8から11員のヘテロビシクリル又は8から11員の複素二環の炭素の各水素原子は、以下に定義される置換基によって置き換えられていてもよい。
用語「置換された」は、分子又は部分の1個以上の-H原子が、「置換基」という異なる原子又は原子の群によって置き換えられていることを意味する。適当な置換基はハロゲン;CN;COOR9;OR9;C(O)R9;C(O)N(R9R9a);S(O)2N(R9R9a);S(O)N(R9R9a);S(O)2R9;S(O)R9;N(R9)S(O)2N(R9aR9b);SR9;N(R9R9a);NO2;OC(O)R9;N(R9)C(O)R9a;N(R9)S(O)2R9a;N(R9)S(O)R9a;N(R9)C(O)OR9a;N(R9)C(O)N(R9aR9b);OC(O)N(R9R9a);T;C1〜50アルキル;C2〜50アルケニル;又はC2〜50アルキニルであり、前記T、C1〜50アルキル、C2〜50アルケニル、及びC2〜50アルキニルは、任意選択で、同一又は異なる1つ以上のR10で置換されていてもよく、ここで、C1〜50アルキル、C2〜50アルケニル、及びC2〜50アルキニルは、T、-C(O)O-;-O-;-C(O)-;-C(O)N(R11)-;-S(O)2N(R11)-;-S(O)N(R11)-;-S(O)2-;-S(O)-;-N(R11)S(O)2N(R11a)-;-S-;-N(R11)-;-OC(O)R11;-N(R11)C(O)-;-N(R11)S(O)2-;-N(R11)S(O)-;-N(R11)C(O)O-;-N(R11)C(O)N(R11a)-;及び-OC(O)N(R11R11a)からなる群から選択される1つ以上の基によって任意選択で中断されていてもよく、
ここで、R9、R9a、R9bは、独立して、H、T、C1〜50アルキル、C2〜50アルケニル、及びC2〜50アルキニルからなる群から選択され、前記T、C1〜50アルキル、C2〜50アルケニル、及びC2〜50アルキニルは、任意選択で、同一又は異なる1つ以上のR10で置換されていてもよく、前記C1〜50アルキル、C2〜50アルケニル、及びC2〜50アルキニルは、T、-C(O)O-;-O-;-C(O)-;-C(O)N(R11)-;-S(O)2N(R11)-;-S(O)N(R11)-;-S(O)2-;-S(O)-;-N(R11)S(O)2N(R11a)-;-S-;-N(R11)-;-OC(O)R11;-N(R11)C(O)-;-N(R11)S(O)2-;-N(R11)S(O)-;-N(R11)C(O)O-;-N(R11)C(O)N(R11a)-;及び-OC(O)N(R11R11a)からなる群から選択される1つ以上の基によって任意選択で中断されていてもよく、
Tは、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、テトラリニル、C3〜10シクロアルキル、4から7員のヘテロシクリル、及び8から11員のヘテロビシクリルからなる群から選択され、ここで、Tは、任意選択で、同一又は異なる1つ以上のR10で置換されていてもよく、
R10は、ハロゲン;CN;オキソ(=O);COOR12;OR12;C(O)R12;C(O)N(R12R12a);S(O)2N(R12R12a);S(O)N(R12R12a);S(O)2R12;S(O)R12;N(R12)S(O)2N(R12aR12b);SR12;N(R12R12a);NO2;OC(O)R12;N(R12)C(O)R12a;N(R12)S(O)2R12a;N(R12)S(O)R12a;N(R12)C(O)OR12a;N(R12)C(O)N(R12aR12b);OC(O)N(R12R12a);又はC1〜6アルキルであり、C1〜6アルキルは、任意選択で、同一又は異なる1つ以上のハロゲンで置換されていてもよく、
R11、R11a、R12、R12a、R12bは、相互に独立して、H、及びC1〜6アルキルからなる群から選択され、C1〜6アルキルは、任意選択で、同一又は異なる1つ以上のハロゲンで置換されていてもよい。
1つの実施態様において、R9、R9a、R9bは、相互に独立して、Hである。
1つの実施態様において、R10は、C1〜6アルキルである。
1つの実施態様において、Tは、フェニルである。
好ましくは、部分又は分子の最大6つのH原子は、独立して、置換基によって置き換えられ、例えば、5個のH原子が、独立して、置換基によって置き換えられ、4個のH原子が、独立して、置換基によって置き換えられ、3個のH原子が、独立して、置換基によって置き換えられ、2個のH原子が、独立して、置換基によって置き換えられ、又は1個のH原子が置換基によって置き換えられている。
本明細書で用いる場合、用語「中断された」は、2個の炭素原子の間に、又は各炭素原子と水素原子との間の炭素鎖の末端に、1個以上の原子が挿入されていることを意味する。
本明細書で用いる場合、用語「プロドラッグ」は、その薬理学的効果を呈する前に生物変換を受ける化合物を意味する。かくして、プロドラッグは、親分子における望ましくない特性を改変し、又は排除するために一時的な方法で用いられる特殊化された非毒性保護基に接続された生物学的に活性な部分として見ることができる。これは、薬物における望ましい特性の増強及び望ましくない特性の抑制も含む。
本明細書で用いる場合、用語「担体連結プロドラッグ」は、生物学的に活性な部分と担体基との可逆的結合を含有するプロドラッグを意味し、その担体は生物学的に活性な部分の物理化学的若しくは薬物動態的特性を改良し、その担体は、通常、加水分解切断によってインビボにて除去される。好ましくは、担体はポリマーである。
従って、用語「ヒドロゲル連結プロドラッグ」とは、担体がヒドロゲルである担体連結プロドラッグを指す。
ヒドロゲルが「ヒドロゲル連結プロドラッグにおける担体として適当」であるためには、そのようなヒドロゲルは、可逆的プロドラッグリンカー試薬又は可逆的プロドラッグリンカー部分-生物学的活性部分コンジュゲート試薬を該ヒドロゲルにコンジュゲートさせるための官能基を必要とする。
本明細書で用いる場合、用語「可逆的プロドラッグリンカー」は、その1つの端部において、直接的に、又はスペーサー部分を介して、該ヒドロゲルの骨格部分に結合し、もう1つの端部において、可逆的結合を介して生物学的に活性な部分に結合した部分を意味する。
「生分解性結合」又は「可逆的結合」は、生理学的条件(pH7.4、37℃における水性緩衝液)下で、酵素的に及び/又は非酵素的に加水分解により分解可能な、すなわち、切断可能である結合であり、半減期は1時間から12カ月の範囲である。好ましくは、生分解性結合は、生理学的条件下で非酵素的に加水分解により分解可能であり、すなわち、酵素活性とは独立して分解可能であり、半減期は1時間から12カ月の範囲である。
対照的に、「永久的結合」は生理学的条件(pH7.4、37℃における水性緩衝液)下で非酵素的に加水分解により分解可能であり、半減期は12カ月を超える。
本明細書で用いる場合、用語「医薬組成物」は、1つ以上の有効成分、すなわち、薬物又はプロドラッグ、及び1つ以上の不活性な成分、いわゆる賦形剤、並びにいずれかの2つ以上の成分の組合せ、複合化又は凝集から、又は1つ以上の該成分の解離から、又は1つ以上の該成分の他のタイプの反応又は相互作用から、直接的に又は間接的に生じるいずれの生成物も意味する。従って、本発明の医薬組成物は、本発明のヒドロゲル連結プロドラッグ放出性タグ部分-生物学的活性部分コンジュゲート及び1つ以上の医薬として許容される賦形剤を混合することによって作成されるいずれの組成物も含む。
本明細書で用いる場合、用語「賦形剤」とは、それと一緒に有効成分が投与される希釈剤、補助剤、又はビヒクルを指す。そのような医薬賦形剤は、限定されるものではないが、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油等を含む、石油、動物、植物又は合成起源のものを含めた、水及び油のような滅菌液体であり得る。医薬組成物が経口投与される場合、水が好ましい賦形剤である。医薬組成物が静脈内投与される場合、生理食塩水及び水性デキストロースが好ましい賦形剤である。生理食塩水溶液及び水性デキストロース及びグリセロール溶液は、好ましくは、注射溶液用の液体賦形剤として使用される。適当な医薬賦形剤はデンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、トレハロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等を含む。医薬組成物は、所望であれば、少量の湿潤若しくは乳化剤、例えば、酢酸塩、コハク酸塩、トリス、炭酸塩、リン酸塩、HEPES(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)、MES(2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸)のようなpH緩衝剤も含有することができ、又はTween、ポロキサマー、ポロキサミン、CHAPS、Igepalのような洗剤、例えば、グリシン、リシン、又はヒスチジンのようなアミノ酸を含有することもできる。これらの医薬組成物は液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出製剤等の形態をとることができる。医薬組成物は、従来の結合剤及びトリグリセリドのような賦形剤とで坐薬として製剤化することができる。経口製剤は医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウム等のような標準的な賦形剤を含むことができる。適当な医薬賦形剤の例は、E.W.Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。そのような組成物は、患者への適切な投与のための形態を提供するように、適切な量の賦形剤と共に治療上有効量の薬物又はプロドラッグを含有するであろう。製剤は投与の形態に適合すべきである。
一般に、用語「含む(comprise)」又は「含んでいる(comprising)」は、「からなる(consist of)」又は「からなるものである(consisting of)」も含む。
工程(a)
工程(a)のヒドロゲルは、ヒドロゲル連結プロドラッグ用の担体として適当である、当該分野で公知のいずれのヒドロゲルであってもよい。官能基Ax0及びAx2は、可逆的なプロドラッグリンカー部分又は可逆的なプロドラッグリンカー部分-生物学的活性部分コンジュゲート試薬をヒドロゲルに共有結合によりコンジュゲートするのに用いられると理解される。
好ましくは、Ax0は、マレイミド、アミン(-NH2又はNH-)、ヒドロキシル(-OH)、チオール、カルボキシル(-COOH)及び活性化されたカルボキシル[-COY1、ここで、Y1は式(f-i)から(f-vi):
Figure 2016516796
 (式中、
破線は、分子の残りへの結合を示し、
bは、1、2、3又は4であり、
XHは、Cl、Br、I、又はFである)
から選択される]
からなる群から選択される。
より好ましくは、Ax0は、マレイミド、アミン(-NH2又はNH-)、ヒドロキシル(-OH)、カルボキシル(-COOH)及び活性化されたカルボキシル[-COY1、ここで、Y1は式(f-i)から(f-vi):
Figure 2016516796
 (式中、
破線は、分子の残りへの結合を示し、
bは、1、2、3又は4であり、
XHは、Cl、Br、I、又はFである)
から選択される]
からなる群から選択される。
より好ましくは、Ax0は、アミン又はマレイミドである。
Ax0がチオールであるのは同等に好ましい。
好ましくは、工程(a)のヒドロゲルは、コーティング、メッシュ、ステント、ナノ粒子又はマイクロ粒子のような成形物品である。より好ましくは、ヒドロゲルは、1から1000マイクロメートルの直径を有する、より好ましくは、10から300マイクロメートルの直径を有する、なおより好ましくは、20から150マイクロメートルの直径を有する、最も好ましくは30から130マイクロメートルの直径を有する、ミクロ粒子ビーズの形態である。前記した直径は、ヒドロゲルミクロ粒子が水中で十分に水和した場合に測定される。
1つの実施態様において、工程(a)のヒドロゲルは、ここに引用して援用するWO2006003014A2に開示されたヒドロゲルである。
もう1つの実施態様において。工程(a)のヒドロゲルは、ここに引用して援用するWO2011012715A1に開示されたヒドロゲルである。
好ましい実施態様において、工程(a)のヒドロゲルは、
(a-i)
(a-ia)1から100kDaの範囲の分子量を有し、少なくとも3つの官能基Ax0を含み、ここで、各Ax0は、マレイミド、アミン(-NH2又は-NH-)、ヒドロキシル(-OH)、カルボキシル(-COOH)又は活性化されたカルボキシル[-COY1、ここで、Y1は式(f-i)から(f-vi):
Figure 2016516796
 (式中、
破線は、分子の残りへの結合を示し、
bは、1、2、3又は4であり、
XHは、Cl、Br、I、又はFである)
から選択される]
である、少なくとも1つの骨格試薬、
(a-ib)0.2から40kDaの範囲の分子量を有し、活性化されたエステル基、活性化されたカルバメート基、活性化されたカルボネート基、活性化されたチオカルボネート基、アミン基及びチオール基からなる群から選択される少なくとも2つの官能性末端基を含む少なくとも1つの架橋剤試薬
を含む混合物を準備する工程であって、
少なくとも1つの骨格試薬と少なくとも1つの架橋剤試薬の重量比は1:99から99:1の範囲であり、ここで、官能性末端基に対するAx0のモル比は>1である工程、
(a-ii)工程(a-i)の混合物を重合してヒドロゲルとする工程、及び
(a-iii)任意選択で、工程(a-ii)のヒドロゲルを後処理する工程
を含む方法によって得ることができる。
等しく好ましくは、工程(a-ia)のAx0は、チオールである。
工程(a-ia)の骨格試薬
少なくとも1つの骨格試薬は、1から100kDa、好ましくは2から50kDa、より好ましくは、5から30kDa、なおより好ましくは5から25kDa、最も好ましくは5から15kDaの範囲の分子量を有する。
1つの実施態様において、Ax0がアミンである場合、工程(a-ia)の少なくとも1つの骨格試薬はその酸性塩の形態で、好ましくは酸付加塩の形態で存在する。適当な酸付加塩は非毒性塩を形成する酸から形成される。例としては、限定されるものではないが、酢酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、炭酸水素塩、炭酸塩、重硫酸塩、硫酸塩、ホウ酸塩、カンシル酸塩、クエン酸塩、エジシル酸塩、エシル酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルセプチン酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、ヒベンズ酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、イセチオン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メシル酸塩、メチル硫酸塩、ナフチル酸塩(naphthylate)、ニコチン酸塩、硝酸塩、オロチン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、サッカリン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩及びトシル酸塩が挙げられる。特に好ましくは、骨格試薬はその塩酸塩の形態で存在する。
工程(a-ia)の少なくとも1つの骨格試薬は、2-メタクリロイル-オキシエチルホスホイルコリン、ポリ(アクリル酸)、ポリ(アクリレート)、ポリ(アクリルアミド)、ポリ(アルキルオキシ)ポリマー、ポリ(アミド)、ポリ(アミドアミン)、ポリ(アミノ酸)、ポリ(アンヒドリド)、ポリ(アスパルトアミド)、ポリ(酪酸)、ポリ(グリコール酸)、ポリブチレンテレフタレート、ポリ(カプロラクトン)、ポリ(カルボネート)、ポリ(シアノアクリレート)、ポリ(ジメチルアクリルアミド)、ポリ(エステル)、ポリ(エチレン)、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(リン酸エチル)、ポリ(エチルオキサゾリン)、ポリ(グリコール酸)、ポリ(アクリル酸ヒドロキシエチル)、ポリ(ヒドロキシエチルオキサゾリン)、ポリ(ヒドロキシメタクリレート)、ポリ(ヒドロキシプロピルメタクリルアミド)、ポリ(メタクリル酸ヒドロキシプロピル)、ポリ(ヒドロキシプロピルオキサゾリン)、ポリ(イミノカルボネート)、ポリ(乳酸)、ポリ(乳酸-co-グリコール酸)、ポリ(メタクリルアミド)、ポリ(メタクリレート)、ポリ(メチルオキサゾリン)、ポリ(オルガノホスファゼン)、ポリ(オルトエステル)、ポリ(オキサゾリン)、ポリ(プロピレングリコール)、ポリ(シロキサン)、ポリ(ウレタン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルアミン)、ポリ(ビニルメチルエーテル)、ポリ(ビニルピロリドン)、シリコーン、セルロース、カルボメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、キチン、キトサン、デキストラン、デキストリン、ゼラチン、ヒアルロン酸及び誘導体、官能性化ヒアルロン酸、マンナン、ペクチン、ラムノガラクツロナン、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン、ヒドロキシエチルデンプン及び他の炭水化物系ポリマー、キシラン、及びそれらのコポリマーからなる群から選択される1つ以上のポリマーを含む。
好ましくは、工程(a-ia)の少なくとも1つの骨格試薬は、少なくとも10%のPEGを含むPEG系であり、又は少なくとも20%のヒアルロン酸を含むヒアルロン酸系である。
好ましい実施態様において、工程(a-ia)の少なくとも1つの骨格試薬は、少なくとも20%のヒアルロン酸を含む、より好ましくは少なくとも40%のヒアルロン酸を含む、なおより好ましくは少なくとも60%のヒアルロン酸を含む、なおより好ましくは少なくとも80%のヒアルロン酸を含むヒアルロン酸系である。
好ましくは、工程(a-ia)のそのようなヒアルロン酸を含む骨格試薬において、各Ax0はアミンである。
もう1つの好ましい実施態様において、工程(a-ia)の少なくとも1つの骨格試薬は、少なくとも10%のPEG、好ましくは少なくとも20%のPEG、なおより好ましくは少なくとも30%のPEG、なおより好ましくは少なくとも40%のPEG、なおより好ましくは少なくとも50%のPEG、最も好ましくは少なくとも60%のPEGを含むPEG系である。
好ましくは、工程(a-ia)のそのようなPEG系骨格試薬において、各Ax0はアミン又はマレイミドであり、最も好ましくは、各Ax0はアミンである。
1つの実施態様において、工程(a-ia)の少なくとも1つの骨格試薬は、
(i)式(IIIa):
B(-(A0)x1-(SP1)x2-A1-P-A2-Hyp1)x(IIIa)
[式中、
Bは、分岐状コアであり、
SP1は、C1〜6アルキル、C2〜6アルケニル及びC2〜6アルキニルからなる群から選択されるスペーサー部分であり、
Pは、少なくとも80%のPEG、好ましくは少なくとも85%のPEG、より好ましくは少なくとも90%のPEG、最も好ましくは少なくとも95%のPEGを含むPEG系ポリマー鎖であり、
Hyp1は、アミン(-NH2及び/又はNH-)又は少なくとも2つのアミン(-NH2及び/又はNH-)を含むポリアミンを含む部分であり、
xは、3から16の整数であり、
x1、x2は、相互に独立して、0又は1であり、但し、x2が0である場合、x1は0であり、
A0、A1、A2は、相互に独立して、
Figure 2016516796
 (式中、R1及びR1aは、相互に独立して、H又はC1〜6アルキルである)
からなる群から選択される]
の化合物、
(ii)式(IIIb):
Hyp2-A3-P-A4-Hyp3 (IIIb)
[式中、
Pは、式(IIIa)の化合物において先に定義されており、
Hyp2、Hyp3は、相互に独立して、少なくとも2つのアミン(-NH2及び/又はNH-)を含むポリアミンであり、
A3及びA4は、独立して、
Figure 2016516796
 (式中、R1及びR1aは、相互に独立して、H又はC1〜6アルキルである)
からなる群から選択される]
の化合物、
(iii)式(IIIc):
P1-A5-Hyp4 (IIIc)
[式中、
P1は、少なくとも80%のPEG、好ましくは少なくとも85%のPEG、より好ましくは少なくとも90%のPEG、最も好ましくは少なくとも95%のPEGを含むPEG系ポリマー鎖であり、
Hyp4は、少なくとも3つのアミン(-NH2及び/又はNH)を含むポリアミンであり、
A5は、
Figure 2016516796
 (式中、R1及びR1aは、相互に独立して、H又はC1〜6アルキルである)
からなる群から選択される]
の化合物、及び
(iv)式(IIId):
T1-A6-Hyp5 (IIId)
[式中、
Hyp5は、少なくとも3つのアミン(-NH2及び/又はNH)を含むポリアミンであり、
A6は、
Figure 2016516796
 (式中、R1及びR1aは、相互に独立して、H又はC1〜6アルキルである)
からなる群から選択され、
T1は、C1〜50アルキル、C2〜50アルケニル及びC2〜50アルキニルからなる群から選択され、前記C1〜50アルキル、C2〜50アルケニル又はC2〜50アルキニルは、-NH-、-N(C1〜4アルキル)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)NH-、-C(O)N(C1〜4アルキル)-、-O-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、4から7員のヘテロシクリル、フェニル及びナフチルからなる群から選択される1つ以上の基によって任意選択で中断されていてもよい]
の化合物、
からなる群から選択される。
以下のセクションにおいては、用語「Hypx」とは、集合的に、Hyp1、Hyp2、Hyp3、Hyp4及びHyp5を指す。
好ましくは、骨格試薬は、式(IIIa)、(IIIb)又は(IIIc)の化合物であり、より好ましくは、骨格試薬は、式(IIIa)又は(IIIc)の化合物であり、最も好ましくは、骨格試薬は、式(IIIa)の化合物である。
好ましい実施態様において、骨格試薬は、式(IIIa)のものであって、xは4、6又は8であり、より好ましくはxは4又は8であり、最も好ましくは、xは4である。
好ましい実施態様において、式(IIIa)から(IIId)のA0、A1、A2、A3、A4、A5及びA6は、
Figure 2016516796
 からなる群から選択される。
好ましくは、式(IIIa)のA0は、
Figure 2016516796
 からなる群から選択される。
好ましくは、式(IIIa)のA1は、
Figure 2016516796
 からなる群から選択される。
好ましくは、式(IIIa)のA2は、
Figure 2016516796
 からなる群から選択される。
好ましくは、式(IIIb)のA3は、
Figure 2016516796
 からなる群から選択される。
好ましくは、式(IIIb)のA4は、
Figure 2016516796
 からなる群から選択される。
好ましくは、式(IIIc)のA5は、
Figure 2016516796
 からなる群から選択される。
好ましくは、式(IIId)のA6は、
Figure 2016516796
 からなる群から選択される。
好ましくは、式(IIId)の化合物において、T1はH又はC1〜6アルキルである。
SP1は、C1〜6アルキル、C2〜6アルケニル及びC2〜6アルキニルからなる群から選択されるスペーサー部分である。好ましくは、SP1は、-CH2-、-CH2-CH2-、-CH(CH3)-、-CH2-CH2-CH2-、-CH(C2H5)-、-C(CH3)2-、-CH=CH-又は-CH=CH-であり、最も好ましくは、SP1は、-CH2-、-CH2-CH2-又は-CH=CH-である。
1つの実施態様において、式(IIIa)のBは:
Figure 2016516796
Figure 2016516796
[式中、
破線は、A0に対する結合を示し、又はx1及びx2が共に0であれば、A1への結合を示し、
tは、1又は2であり、好ましくは、tは1であり、
vは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13又は14であり、好ましくは、vは、2、3、4、5、6であり、より好ましくは、vは、2、4又は6であり、最も好ましくは、vは2である]
からなる群から選択される。
好ましい実施態様において、Bは、式(a-i)、(a-ii)、(a-iii)、(a-iv)、(a-v)、(a-vi)、(a-vii)、(a-viii)、(a-ix)、(a-x)、(a-xiv)、(a-xv)又は(a-xvi)の構造を有する。より好ましくは、Bは、式(a-iii)、(a-iv)、(a-v)、(a-vi)、(a-vii)、(a-viii)、(a-ix)、(a-x)又は(a-iv)の構造を有する。最も好ましくは、Bは、式(a-xiv)の構造を有する。
B及びA0、又はx1及びx2が共に0であれば、B及びA1の好ましい組合せは、以下の構造:
Figure 2016516796
 [式中、
破線は、SP1への結合を示し、又はx1及びx2が共に0であれば、Pへの結合を示す]
からなる群から選択される。
より好ましくは、B及びA0の、又はx1及びx2が共に0である場合は、B及びA1の組合せは、式(b-i)、(b-iv)、(b-vi)又は(b-viii)のものであり、最も好ましくは、式(b-i)のものである。
1つの実施態様において、式(IIIa)のx1及びx2は共に0である。
1つの実施態様において、PEG系ポリマー鎖Pは、0.3kDaから40kDa、例えば、0.4から35kDa、0.6から38kDa、0.8から30kDa、1から25kDa、1から15kDa、又は1から10kDaの分子量を有する。最も好ましくは、Pは1から10kDaの分子量を有する。
1つの実施態様において、PEG系ポリマー鎖P1は、0.3kDaから40kDa、例えば、0.4から35kDa、0.6から38kDa、0.8から30kDa、1から25kDa、1から15kDa、又は1から10kDaの分子量を有する。最も好ましくは、P1は、1から10kDaの分子量を有する。
1つの実施態様において、式(IIIa)又は(IIIb)のPは、式(c-i):
Figure 2016516796
 [式中、nは6から900の範囲であり、より好ましくは、nは20から700の範囲であり、最も好ましくは、nは20から250の範囲である]
のものである。
1つの実施態様において、式(IIIc)のP1は式(c-ii):
Figure 2016516796
 [式中、
nは、6から900の範囲であり、より好ましくは、nは、20から700の範囲であり、最も好ましくは、nは、20から250の範囲であり、
T0はC1〜6アルキル、C2〜6アルケニル及びC2〜6アルキニルからなる群から選択され、前記C1〜6アルキル、C2〜6アルケニル及びC2〜6アルキニルは、-NH-、-N(C1〜4アルキル)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)NH-、-C(O)N(C1〜4アルキル)-、-O-C(O)-、-S(O)-及びS(O)2-からなる群から選択される1つ以上の基によって任意選択で中断されていてもよい]
の構造を有する。
1つの実施態様において、式(IIIa)から(IIId)の部分Hypxはポリアミンであり、好ましくは、式(d-i)、(d-ii)、(d-iii)及び/又は(d-iv):
Figure 2016516796
 [式中、
z1、z2、z3、z4、z5、z6は、相互に独立して、1、2、3、4、5、6、7又は8である]
の部分を、結合形態にて、及び適用可能であれば、R及び/又はS立体配置にて含む。
より好ましくは、Hypxは、リシン、オルニチン、ジアミノプロピオン酸及び/又はジアミノ酪酸を、結合した形態にて、及びR及び/又はS立体配置にて含む。Hypxは、リシンを、結合形態にて、及びR及び/又はS立体配置にて含む。
好ましくは、Hypxは、40Daから30kDa、好ましくは0.3kDaから25kDa、より好ましくは0.5kDaから20kDa、なおより好ましくは、1kDaから20kDa、最も好ましくは、2kDaから15kDaの分子量を有する。
Hypxは、好ましくは:
式(e-i):
Figure 2016516796
 [式中、
p1は、1から5の整数であり、好ましくは、p1は4であり、
破線は、骨格試薬が式(IIIa)のものであれば、A2への結合を示し、骨格試薬が式(IIIb)のものであれば、A3又はA4への結合を示す]
の部分、
式(e-ii):
Figure 2016516796
 [式中、
p2、p3及びp4は、同一又は異なり、各々は、他のものから独立して、1から5の整数であり、好ましくは、p2、p3及びp4は4であり、
破線は、骨格試薬が式(IIIa)のものであれば、A2への結合を示し、骨格試薬が式(IIIb)のものであれば、A3又はA4への結合を示し、骨格試薬が式(IIIc)のものであれば、A5への結合を示し、骨格試薬が式(IIId)のものであれば、A6への結合を示す]
の部分、
式(e-iii):
Figure 2016516796
 [式中、
p5からp11は、同一又は異なり、各々は、他のものから独立して、1から5の整数であり、好ましくは、p5からp11は4であり、
破線は、骨格試薬が式(IIIa)のものであれば、A2への結合を示し、骨格試薬が式(IIIb)のものであれば、A3又はA4への結合を示し、骨格試薬が式(IIIc)のものであれば、A5への結合を示し、骨格試薬が式(IIId)のものであれば、A6への結合を示す]
の部分、
式(e-iv):
Figure 2016516796
 [式中、
p12からp26は、同一又は異なり、各々は、他のものから独立して、1から5の整数であり、好ましくは、p12からp26は4であり、
破線は、骨格試薬が式(IIIa)のものであれば、A2への結合を示し、骨格試薬が式(IIIb)のものであれば、A3又はA4への結合を示し、骨格試薬が式(IIIc)のものであれば、A5への結合を示し、骨格試薬が式(IIId)のものであれば、A6への結合を示す]
の部分、
式(e-v):
Figure 2016516796
 [式中、
p27及びp28は、同一又は異なり、各々は、他のものとは独立して、1から5の整数であり、好ましくは、p27及びp28は4であり、
qは、1から8の整数であり、好ましくは、qは、2又は6であり、最も好ましくは、qは6であり、
破線は、骨格試薬が式(IIIa)のものであれば、A2への結合を示し、骨格試薬が式(IIIb)のものであれば、A3又はA4への結合を示し、骨格試薬が式(IIIc)のものであれば、A5への結合を示し、骨格試薬が式(IIId)のものであれば、A6への結合を示す]
の部分、
式(e-vi):
Figure 2016516796
 [式中、
p29及びp30は、同一又は異なり、各々は、他のものから独立して、2から5の整数であり、好ましくは、p29及びp30は3であり、
破線は、骨格試薬が式(IIIa)のものであれば、A2への結合を示し、骨格試薬が式(IIIb)のものであれば、A3又はA4への結合を示し、骨格試薬が式(IIIc)のものであれば、A5への結合を示し、骨格試薬が式(IIId)のものであれば、A6への結合を示す]
の部分、
式(e-vii):
Figure 2016516796
 [式中、
p31からp36は、同一又は異なり、各々は、他のものから独立して、2から5の整数であり、好ましくは、p31からp36は3であり、
破線は、骨格試薬が式(IIIa)のものであれば、A2への結合を示し、骨格試薬が式(IIIb)のものであれば、A3又はA4への結合を示し、骨格試薬が式(IIIc)のものであれば、A5への結合を示し、骨格試薬が式(IIId)のものであれば、A6への結合を示す]
の部分、
式(e-viii):
Figure 2016516796
 [式中、
p37からp50は、同一又は異なり、各々は、他のものから独立して、2から5の整数であり、好ましくは、p37からp50は3であり、
破線は、骨格試薬が式(IIIa)のものであれば、A2への結合を示し、骨格試薬が式(IIIb)のものであれば、A3又はA4への結合を示し、骨格試薬が式(IIIc)のものであれば、A5への結合を示し、骨格試薬が式(IIId)のものであれば、A6への結合を示す]
の部分、
式(e-ix):
Figure 2016516796
 [式中、
p51からp80は、同一又は異なり、各々は、他のものから独立して、2から5の整数であり、好ましくは、p51からp80は3であり、
破線は、骨格試薬が式(IIIa)のものであれば、A2への結合を示し、骨格試薬が式(IIIb)のものであれば、A3又はA4への結合を示し、骨格試薬が式(IIIc)のものであれば、A5への結合を示し、骨格試薬が式(IIId)のものであれば、A6への結合を示す]
の部分、
からなる群から選択され、
ここで、部分(e-i)から(e-v)は、各キラル中心において、R又はS立体配置であってよく、好ましくは、部分(e-i)から(e-v)の全てのキラル中心は同一の立体配置である。
好ましくは、Hypxは、式(e-i)、(e-ii)、(e-iii)、(e-iv)、(e-vi)、(e-vii)、(e-viii)又は(e-ix)のものである。より好ましくは、Hypxは、式(e-ii)、(e-iii)、(e-iv)、(e-vii)、(e-viii)又は(e-ix)のものであり、なおより好ましくは、Hypxは、式(e-ii)、(e-iii)、(e-vii)又は(e-viii)のものであり、最も好ましくは、Hypxは、式(e-iii)のものである。
好ましくは、部分-A2-Hyp1は、
Figure 2016516796
 [式中、
破線はPへの結合を示し、
E1は式(e-i)から(e-ix)から選択される]
である。
好ましくは、部分Hyp2-A3-は、
Figure 2016516796
 [式中、
破線はPへの結合を示し、
E1は式(e-i)から(e-ix)から選択される]
である。
好ましくは、部分-A4-Hyp3は、
Figure 2016516796
 [式中、
破線はPへの結合を示し、
E1は式(e-i)から(e-ix)から選択される]
である。
好ましくは、部分-A5-Hyp4は、
Figure 2016516796
 [式中、
破線はP1への結合を示し、
E1は式(e-i)から(e-ix)から選択される]
である。
より好ましくは、骨格試薬は式(IIIa)のものであり、Bは式(a-xiv)のものである。
なおより好ましくは、骨格試薬は式(IIIa)のものであり、Bは式(a-xiv)のものであり、x1及びx2は0であり、A1は-O-である。
なおより好ましくは、骨格試薬は式(IIIa)のものであり、Bは式(a-xiv)のものであり、A1は-O-であり、Pは式(c-i)のものである。
なおより好ましくは、骨格試薬は式(IIIa)のものであり、Bは式(a-xiv)のものであり、x1及びx2は0であり、A1は-O-であり、Pは式(c-i)のものである。
最も好ましくは、骨格試薬は以下の式:
Figure 2016516796
 [式中、
nは10から40の範囲であり、好ましくは、10から30の範囲であり、より好ましくは10から20の範囲である]
を有する。同等に好ましくは、nは20から30の範囲であり、最も好ましくは、nは28である。
工程(a-ib)の架橋剤試薬
好ましくは、工程(a-ib)の少なくとも1つの架橋剤試薬はポリマーを含む。
工程(a-ib)の少なくとも1つの架橋剤試薬は、2-メタクリロイル-オキシエチルホスホイルコリン、ポリ(アクリル酸)、ポリ(アクリレート)、ポリ(アクリルアミド)、ポリ(アルキルオキシ)ポリマー、ポリ(アミド)、ポリ(アミドアミン)、ポリ(アミノ酸)、ポリ(アンヒドリド)、ポリ(アスパルトアミド)、ポリ(酪酸)、ポリ(グリコール酸)、ポリブチレンテレフタレート、ポリ(カプロラクトン)、ポリ(カルボネート)、ポリ(シアノアクリレート)、ポリ(ジメチルアクリルアミド)、ポリ(エステル)、ポリ(エチレン)、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(リン酸エチル)、ポリ(エチルオキサゾリン)、ポリ(グリコール酸)、ポリ(アクリル酸ヒドロキシエチル)、ポリ(ヒドロキシエチルオキサゾリン)、ポリ(ヒドロキシメタクリレート)、ポリ(ヒドロキシプロピルメタクリルアミド)、ポリ(メタクリル酸ヒドロキシプロピル)、ポリ(ヒドロキシプロピルオキサゾリン)、ポリ(イミノカルボネート)、ポリ(乳酸)、ポリ(乳酸-co-グリコール酸)、ポリ(メタクリルアミド)、ポリ(メタクリレート)、ポリ(メチルオキサゾリン)、ポリ(オルガノホスファゼン)、ポリ(オルトエステル)、ポリ(オキサゾリン)、ポリ(プロピレングリコール)、ポリ(シロキサン)、ポリ(ウレタン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルアミン)、ポリ(ビニルメチルエーテル)、ポリ(ビニルピロリドン)、シリコーン、セルロース、カルボメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、キチン、キトサン、デキストラン、デキストリン、ゼラチン、ヒアルロン酸及び誘導体、官能性化ヒアルロン酸、マンナン、ペクチン、ラムノガラクツロナン、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン、ヒドロキシエチルデンプン及び他の炭水化物系ポリマー、キシラン、及びそれらのコポリマーからなる群から選択される1つ以上のポリマーを含む。
好ましくは、工程(a-ib)の少なくとも1つの架橋剤試薬は、ヒアルロン酸又はPEGを含む。
1つの好ましい実施態様において、工程(a-ib)の少なくとも1つの架橋剤試薬は、ヒアルロン酸を含む。好ましくは、工程(a-ib)のそのようなヒアルロン酸を含む架橋剤試薬は、少なくとも70%のヒアルロン酸を含み、より好ましくは少なくとも80%のヒアルロン酸を含み、最も好ましくは少なくとも90%のヒアルロン酸を含み、さらに、
(i)少なくとも2つのカルボニルオキシ基(-(C=O)-O-又はO-(C=O)-)、及び、加えて、
(ii)活性化されたエステル基、活性化されたカルバメート基、活性化されたカルボネート基、活性化されたチオカルボネート基、アミン基及びチオール基からなる群から選択される少なくとも2つの末端官能基
を含む。
もう1つの好ましい実施態様において、工程(a-ib)の少なくとも1つの架橋剤試薬は、PEGを含む。好ましくは、工程(a-ib)のそのようなPEGを含む架橋剤試薬は、少なくとも70%のPEGを含み、より好ましくは少なくとも80%のPEGを含み、最も好ましくは少なくとも90%のPEGを含み、さらに、
(i)少なくとも2つのカルボニルオキシ基(-(C=O)-O-又は-O-(C=O)-)、及び、加えて、
(ii)活性化されたエステル基、活性化されたカルバメート基、活性化されたカルボネート基、活性化されたチオカルボネート基、アミン基及びチオール基からなる群から選択される少なくとも2つの末端官能基
を含む。
少なくとも1つの架橋剤試薬は、好ましくは、生分解性結合である、少なくとも2つのカルボニルオキシ基(-(C=O)-O-又はO-(C=O)-)を含む。これらの生分解性結合は、ヒドロゲルを生分解性とし、これは有利である。加えて、少なくとも1つの架橋剤試薬は、工程(a-ii)の重合の間に、工程(a-ia)の少なくとも1つの骨格試薬の官能基Ax0と反応する少なくとも2つの官能性末端基を含む。
架橋剤試薬は、0.2から40kDaの範囲、より好ましくは0.5から30kDaの範囲、なおより好ましくは0.5から20kDaの範囲、なおより好ましくは0.5から15kDaの範囲、最も好ましくは1から10kDaの範囲の分子量を有する。
好ましくは、架橋剤試薬の官能性末端基と、骨格試薬の官能基Ax0との反応は、骨格部分と架橋剤部分との間のアミド結合の形成をもたらし、すなわち、骨格部分及び架橋剤部分は、好ましくは、アミド結合を介して接続されている。
1つの好ましい実施態様において、架橋剤試薬は、式(IV-I):
Figure 2016516796
 [式中、
各D1、D2、D3及びD4は、同一又は異なり、各々は、他のものとは独立して、-O-、-NR5-、-S-及びCR6R6a-からなる群から選択され、
各R1、R1a、R2、R2a、R3、R3a、R4、R4a、R6及びR6aは、同一又は異なり、各々は、他のものとは独立して、-H、-OR7、-NR7R7a、-SR7及びC1〜6アルキルからなる群から選択され、任意選択で、対R1/R2、R3/R4、R1a/R2a、及びR3a/R4aの各々は、独立して、化学結合を形成してよく、及び/又は対R1/R1a、R2/R2a、R3/R3a、R4/R4a、R6/R6a、R1/R2、R3/R4、R1a/R2a、及びR3a/R4aの各々は、相互から独立して、それらが結合している原子と一緒に連結して、C3〜8シクロアルキルを形成し、又は環Aを形成し、又はそれらが結合している原子と一緒に連結して、4から7員のヘテロシクリル又は8から11員のヘテロビシクリル、又はアダマンチルを形成し、
各R5は、独立して、-H及びC1〜6アルキルから選択され、任意選択で、対R1/R5、R2/R5、R3/R5、R4/R5及びR5/R6の各々は、独立して、化学結合を形成してよく、及び/又はそれらが結合している原子と一緒に連結して、4から7員のヘテロシクリル又は8から11員のヘテロビシクリルを形成し、
各R7、R7aは、独立して、H及びC1〜6アルキルから選択され、
Aはインデニル、インダニル及びテトラリニルからなる群から選択され、
P2は、
Figure 2016516796
 であり、
mは、120から920の範囲、好ましくは120から460の範囲、より好ましくは120から230の範囲であり、
r1、r2、r7、r8は、独立して、0又は1であり、
r3、r6は、独立して、0、1、2、3、又は4であり、
r4、r5は、独立して、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10であり、
s1、s2は、独立して、1、2、3、4、5又は6であり、
Y1、Y2は同一又は異なり、各々は、他のものとは独立して、式(f-i)から(f-vi):
Figure 2016516796
 (式中、
破線は、分子の残りへの結合を示し、
bは、1、2、3又は4であり、
XHは、Cl、Br、I、又はFである)
から選択される]
の化合物である。
好ましくは、架橋剤試薬は、式(IV-II):
Figure 2016516796
 [式中、
D1、D2、D3及びD4は、同一又は異なり、各々は、他のものとは独立して、O、NR5、S及びCR5R5aからなる群から選択され、
R1、R1a、R2、R2a、R3、R3a、R4、R4a、R5及びR5aは、同一又は異なり、各々は、他のものとは独立して、H及びC1〜6アルキニルからなる群から選択され、任意選択で、対R1/R1a、R2/R2a、R3/R3a、R4/R4a、R1/R2、R3/R4、R1a/R2a、及びR3a/R4aのうちの1つ以上は、化学結合を形成してよく、又はそれらが結合している原子と一緒に連結して、C3〜8シクロアルキルを形成し、又は環Aを形成してよく、又はそれらが結合している原子と一緒に連結して、4から7員のヘテロシクリル又は8から11員のヘテロビシクリル又はアダマンチルを形成してよく、
Aは、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル又はテトラリニルであり、
p2は、
Figure 2016516796
 であり、
mは、5から920の範囲、好ましくは5から460の範囲、より好ましくは40から230の範囲であり、
r1、r2、r7、r8は、独立して、0又は1であり、
r3、r6は、独立して、0、1、2、3、又は4であり、
r4、r5は、独立して、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10であり、
s1、s2は、独立して、1、2、3、4、5又は6であり、
Y1、Y2は同一又は異なり、各々は、他のものとは独立して、式(f-i)から(f-vi):
Figure 2016516796
 (式中、
破線は、分子の残りへの結合を示し、
bは、1、2、3又は4であり、
XHは、Cl、Br、I、又はFである)
から選択される]
の化合物である。
好ましくは、式(IV-I)及び(IV-II)のY1及びY2は、式(f-i)、(f-ii)又は(f-v)のものである。より好ましくは、式(IV-I)及び(IV-II)のY1及びY2は、式(f-i)又は(f-ii)のものであり、最も好ましくは、式(IV-I)及び(IV-II)のY1及びY2は式(f-i)のものである。
好ましくは、式(IV-I)及び(IV-II)の部分Y1及びY2の双方は同一の構造を有する。より好ましくは、Y1及びY2の双方は式(f-i)のものである。
式(IV-I)及び(IV-II)の部分:
Figure 2016516796
 は、少なくとも2つの官能性末端基を表すことは理解される。
好ましくは、式(IV-II)及び(IV-II)のr1及びr8は共に0である。
好ましくは、式(IV-I)及び(IV-II)のr1、r8、s1及びs2は全て0である。
好ましくは、式(IV-I)及び(IV-II)の対R1/R1a、R2/R2a、R3/R3a、R4/R4a、R1/R2、R3/R4、R1a/R2a、及びR3a/R4aのうちの1つ以上は、化学結合を形成し、又はそれらが結合している原子と一緒に連結して、C3〜8シクロアルキル又は環Aを形成する。
好ましくは、式(IV-I)及び(IV-II)の対R1/R2、R1a/R2a、R3/R4、R3a/R4aのうちの1つ以上は、それらが結合している原子と一緒に連結して、4から7員のヘテロシクリル又は8から11員のヘテロビシクリルを形成する。
好ましくは、式(IV-I)及び(IV-II)の架橋剤試薬は対称であり、すなわち、部分:
Figure 2016516796
 は、部分:
Figure 2016516796
 と同一の構造を有する。
好ましい架橋剤試薬は、式(g-i)から(g-liv):
Figure 2016516796
Figure 2016516796
Figure 2016516796
Figure 2016516796
Figure 2016516796
Figure 2016516796
Figure 2016516796
Figure 2016516796
Figure 2016516796
[式中、
各架橋剤試薬は、適用可能な場合には、そのラセミ混合物の形態であってよく、
m、Y1及びY2は先に定義されている]
のものである。
なおより好ましい架橋剤試薬は、式(ga-1)から(ga-54):
Figure 2016516796
Figure 2016516796
Figure 2016516796
Figure 2016516796
Figure 2016516796
Figure 2016516796
Figure 2016516796
Figure 2016516796
[式中、
各架橋剤試薬は、適用可能な場合には、そのラセミ混合物の形態であってよく、
m、Y1及びY2は先に定義されている]
のものである。
驚くべきことに、カルボニルオキシ基のアルファ炭素において、分岐、すなわち、H以外の残基を有する架橋剤試薬の使用は、エステラーゼを介する分解のような酵素分解に対してより抵抗性であるヒドロゲルの形成に導くことが見出された。
同様に、驚くべきことに、カルボニルオキシ基の(C=O)と、隣接する活性化されたエステル、活性化されたカルバメート、活性化されたカルボネート又は活性化されたチオカルバメートの(C=O)との間にある原子が少ないほど、得られるヒドロゲルは、分解に対してより抵抗性となり、例えばエステラーゼを介する分解に対してより抵抗性となることが見出された。
1つの実施態様において、架橋試薬g-i、g-ii、g-v、g-vi、g-vii、g-viii、g-ix、g-x、g-xi、g-xii、g-xiii、g-xiv、g-xv、g-xvi、g-xvii、g-xviii、g-xix、g-xx、g-xxi、g-xxii、g-xxiii、g-xxiv、g-xxv、g-xxvi、g-xxvii、g-xxviii、g-xxix、g-xxx、g-xxxi、g-xxxii、g-xxxiii、g-xxxiv、g-xxxv、g-xxxvi、g-xxvii、g-xxxviii、g-xxxix、g-xl、g-xli、g-xlii、g-xliii、g-xliv、g-xlv、g-xlvi、g-xlvii、g-xlviii、g-xlix、g-l、g-li、g-lii、g-liii及びg-livは、好ましい架橋剤である。より好ましくは、少なくとも1つの架橋剤試薬は、式g-v、g-vi、g-vii、g-viii、g-ix、g-x、g-xiv、g-xxxii、g-xxxiii、g-xliii、g-xliv、g-xlv又はg-xlviのものであり、なおより好ましくは、少なくとも1つの架橋剤試薬は、式g-v、g-vi、g-ix又はg-xivのものである。最も好ましくは、少なくとも1つの架橋剤試薬は、式g-xivのものである。
もう1つの実施態様において、架橋剤試薬ga-i、ga-ii、ga-v、ga-vi、ga-vii、ga-viii、ga-ix、ga-x、ga-xi、ga-xii、ga-xiii、ga-xiv、ga-xv、ga-xvi、ga-xvii、ga-xviii、ga-xix、ga-xx、ga-xxi、ga-xxii、ga-xxiii、ga-xxiv、ga-xxv、ga-xxvi、ga-xxvii、ga-xxviii、ga-xxix、ga-xxx、ga-xxxi、ga-xxxii、ga-xxxiii、ga-xxxiv、ga-xxxv、ga-xxxvi、ga-xxvii、ga-xxxviii、ga-xxxix、ga-xl、ga-xli、ga-xlii、ga-xliii、ga-xliv、ga-xlv、ga-xlvi、ga-xlvii、ga-xlviii、ga-xlix、ga-l、ga-li、ga-lii、ga-liii及びga-livが、好ましい架橋剤試薬である。より好ましくは、少なくとも1つの架橋剤試薬は、式ga-v、ga-vi、ga-vii、ga-viii、ga-ix、ga-x、ga-xiv、ga-xxxii、ga-xxxiii、ga-xliii、ga-xliv、ga-xlv又はga-xlviのものであり、なおより好ましくは、少なくとも1つの架橋剤試薬は、式ga-v、ga-vi、ga-ix又はga-xivのものである。最も好ましくは、少なくとも1つの架橋剤試薬は、式ga-xivのものである。
前記した式(IV-I)及び(IV-II)の式の化合物の好ましい実施態様は、状況に応じて、式(g-i)から(g-liv)の好ましい化合物に適用される。工程(a-ii)から得られたヒドロゲルは、それが蛋白質薬物のヒドロゲル連結プロドラッグにおける担体として使用されるべきであれば、好ましくは、0.01から1.2mmol/gの第一級アミン基(-NH2)、より好ましくは0.02から1.0mmol/gの第一級アミン基、なおより好ましくは0.02から0.5mmol/gの第一級アミン基、最も好ましくは0.05から0.3mmol/gの第一級アミン基を含有する。本発明のヒドロゲルが小分子のヒドロゲル連結プロドラッグにおける担体として使用されるべきであれば、それは、好ましくは、0.01から2mmol/gの第一級アミン基、より好ましくは0.02から1.8mmol/gの第一級アミン基、なおより好ましくは0.05から1.5mmol/gの第一級アミン基を含有する。
より好ましくは、工程(a-ii)から得られるヒドロゲルは、好ましくは、0.01から1.2mmol/gの第一級アミン基(-NH2)、より好ましくは0.02から1.0mmol/gの第一級アミン基、なおより好ましくは0.02から0.5mmol/gの第一級アミン基、最も好ましくは0.05から0.3mmol/gの第一級アミン基を含有する。
用語「Xmmol/gの第一級アミン基」は、1gの乾燥したヒドロゲルがXmmolの第一級アミン基を含むことを意味する。ヒドロゲルのアミン含有量の測定は、Gude et al.(ここに引用してその全体を援用する、Letters in Peptide Science, 2002, 9(4): 203-206)に従って行われ、また、実験セクションに詳細に記載されている。
好ましくは、本明細書で用いる用語「乾燥した」は、(カールフィッシャーに従って求められる)最大10%、好ましくは5%未満、より好ましくは2%未満の残存水含有量を有することを意味する。乾燥の好ましい方法は凍結乾燥である。
工程(a-ii)の重合
1つの実施態様において、工程(a-ii)における重合は、塩基を加えることによって開始される。好ましくは、塩基は、アルカンに可溶性である非求核性塩基であり、より好ましくは、塩基はN,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン(TMEDA)、1,4-ジメチルピペラジン、4-メチルモルホリン、4-エチルモルホリン、1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン、1,1,4,7,10,10-ヘキサメチルトリエチレンテトラミン、1,4,7-トリメチル-1,4,7-トリアザシクロノナン、トリス[2-(ジメチルアミノ)エチル]アミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)、トリメチルアミン、N,N-ジメチルエチルアミン、N,N,N',N'-テトラメチル-1,6-ヘキサンジアミン、N,N,N',N'',N''-ペンタメチルジエチレントリアミン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン、1,5-ジアザビシクロ[4.3.0]ノナ-5-エン、及びヘキサメチレンテトラミンからなる群から選択される。なおより好ましくは、塩基は、TMEDA、1,4-ジメチルピペラジン、4-メチルモルホリン、4-エチルモルホリン、1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン、1,1,4,7,10,10-ヘキサメチルトリエチレンテトラミン、1,4,7-トリメチル-1,4,7-トリアザシクロノナン、トリス[2-(ジメチルアミノ)エチル]アミン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン、1,5-ジアザビシクロ[4.3.0]ノナ-5-エン、及びヘキサメチレンテトラミンから選択される。最も好ましくは、塩基はTMEDAである。
工程(a-ii)における重合を開始するための塩基は、好ましくは、混合物中の活性化された官能性末端基当たり1から500当量の量で、より好ましくは、5から50当量の量で、なおより好ましくは5から25当量の量で、最も好ましくは、10当量の量で加えられる。
好ましくは、工程(a-ii)の重合は縮合反応であり、これは、好ましくは、工程(a)の混合物の継続的な撹拌下で行われる。好ましくは、先端のスピード(先端のスピード=π×スターラー回転スピード×スターラー直径)は、秒当たり0.2から10メートル(m/s)、より好ましくは、0.5から4m/s、最も好ましくは1から2m/sの範囲である。
工程(a-ii)の好ましい実施態様において、重合反応は、邪魔板を備えた円筒容器中で行われる。容器の高さに対する直径の比は、好ましくは4:1から1:2の範囲であり、より好ましくは、容器の高さに対する直径の比は、2:1から1:1の範囲である。
好ましくは、反応容器には、傾斜ブレードスターラー、マリーンタイプのプロペラ、及びLightnin A-310からなる群から選択される軸方向流スターラーが装備される。より好ましくは、スターラーは傾斜ブレードスターラーである。
工程(a-ii)は、好ましくは、-10℃から100℃の温度、より好ましくは、0℃から80℃の温度、なおより好ましくは、10℃から50℃の温度、最も好ましくは、雰囲気温度にて、広い温度範囲で行うことができる。
「雰囲気温度」とは、典型的な実験室の環境に存在する温度を指し、好ましくは、17から25℃の範囲の温度を意味する。
1つの好ましい実施態様において、工程(a-ii)における重合は懸濁重合で行われ、その場合、工程(a-ii)の混合物は、さらに、第1の溶媒及び少なくとも第2の溶媒を含み、その第2の溶媒は第1の溶媒に非混和性である。
該第1の溶媒は、好ましくは、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、炭酸プロピレン、N-メチルピロリドン、メタノール、エタノール、イソプロパノール、水及びそれらの混合物からなる群から選択される。
少なくとも1つの骨格試薬及び少なくとも1つの架橋剤試薬は、第1の溶媒、すなわち、懸濁重合の分散相に溶解させる。1つの実施態様において、少なくとも1つの骨格試薬及び少なくとも1つの架橋剤試薬は、同一又は異なるいずれかの溶媒を用い、好ましくは、双方の試薬用の同一の溶媒を用い、別々に、すなわち、異なる容器中で溶解させる。もう1つの実施態様において、少なくとも1つの骨格試薬及び少なくとも1つの架橋剤試薬は、一緒に、すなわち、同一の容器中で、同一の溶媒を用いて溶解させる。
少なくとも1つの骨格試薬のための適当な溶媒は有機溶媒である。好ましくは、溶媒は、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、炭酸プロピレン、N-メチルピロリドン、メタノール、エタノール、イソプロパノール、水及びそれらの混合物からなる群から選択される。より好ましくは、骨格試薬は、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、メタノール及びそれらの混合物から選択される溶媒に溶解させる。最も好ましくは、骨格試薬はジメチルスルホキシドに溶解させる。
1つの実施態様において、少なくとも1つの骨格試薬は、1から300mg/ml、より好ましくは5から60mg/ml、最も好ましくは10から40mg/mlの範囲の濃度にて、溶媒に溶解させる。
少なくとも1つの架橋剤試薬のための適当な溶媒は有機溶媒である。好ましくは、溶媒は、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、炭酸プロピレン、N-メチルピロリドン、メタノール、エタノール、イソプロパノール、水及びそれらの混合物からなる群から選択される。より好ましくは、架橋剤試薬は、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、メタノール及びそれらの混合物から選択される溶媒に溶解させる。最も好ましくは、架橋剤試薬はジメチルスルホキシドに溶解させる。
1つの実施態様において、少なくとも1つの架橋剤試薬は、5から500mg/ml、より好ましくは25から300mg/ml、最も好ましくは50から200mg/mlの範囲の濃度で溶媒に溶解させる。
少なくとも1つの骨格試薬及び少なくとも1つの架橋剤試薬は、1:99から99:1の範囲の重量比にて、例えば、2:98から90:10の範囲の重量比にて、3:97から88:12の範囲の重量比で、3:96から85:15の範囲の重量比にて、2:98から90:10の範囲の重量比にて、5:95から80:20の重量比にて、特に好ましくは、5:95から80:20の重量比にて混合され、ここで、最初の数字は少なくとも1つの骨格試薬を指し、第2の数字は少なくとも1つの架橋剤試薬を指す。
該比は、工程(a-i)の混合物が、少なくとも1つの架橋剤試薬の官能性末端基と比較して、少なくとも1つの骨格試薬からのモル過剰の官能基Ax0を含むように選択される。結果として、本発明の方法から得られるヒドロゲルは、遊離官能基Ax0基を有し、これは、スペーサー部分及び/又は可逆的なプロドラッグリンカー部分のような、他の部分をヒドロゲルにカップリングさせるのに用いることができる。
少なくとも1つの第2の溶媒、すなわち、懸濁重合の連続相は、好ましくは、有機溶媒であり、より好ましくは、直鎖状、分岐鎖状又は環状C5〜30アルカン、直鎖状、分岐鎖状又は環状C5〜30アルケン、直鎖状、分岐鎖状又は環状C5〜30アルキン、直鎖状又は環状ポリ(ジメチルシロキサン)、芳香族C6〜20炭化水素、及びそれらの混合物からなる群から選択される有機溶媒である。なおより好ましくは、少なくとも第2の溶媒は、直鎖状、分岐鎖状又は環状C5〜16アルカン、トルエン、キシレン、メシチレン、ヘキサメチルジシロキサン、及びそれらの混合物から選択される。より好ましくは、少なくとも第2の溶媒はヘプタン、オクタン、ノナン、デカン又はウンデカンのような直鎖状C7〜11アルカンである。
好ましくは、工程(a-i)の混合物は、さらに、洗剤を含む。好ましい洗剤は、Cithrol DPHS、Hypermer 70A、Hypermer B246、Hypermer 1599A、Hypermer 2296、及びHypermer 1083である。
好ましくは、洗剤は、1Lの合計混合物当たり0.1gから100gの濃度を有し、すなわち、分散相及び連続相を一緒に有する。より好ましくは、洗剤は、1Lの合計混合物当たり0.5gから10gの濃度を有し、最も好ましくは、洗剤は1Lの合計混合物当たり0.5gから5gの濃度を有する。
好ましくは、工程(a-i)の混合物はエマルジョンである。
任意選択の工程(a-iii)
任意選択の工程(a-iii)は、以下の工程:
(a-iiia)重合反応から過剰の液体を除去すること、
(a-iiib)ヒドロゲルを洗浄して、重合の間に用いた溶媒を除去すること、
(a-iiic)ヒドロゲルを緩衝溶液中に移動させること、
(a-iiid)ヒドロゲルをサイズ分画/分級すること、
(a-iiie)ヒドロゲルを容器中に移動させること、
(a-iiif)ヒドロゲルを乾燥させること、
(a-iiig)ヒドロゲルを、滅菌に適した特別な溶媒中に移動させること、及び/又は
(a-iiih)好ましくは、ガンマ放射線によってヒドロゲルを滅菌すること、
のうちの1つ以上を含む。
好ましくは、後処理工程は、以下の工程:
(a-iiia)重合反応から過剰の液体を除去すること、
(a-iiib)ヒドロゲルを洗浄して、重合の間に用いた溶媒を除去すること、
(a-iiic)ヒドロゲルを緩衝溶液中に移動させること、
(a-iiid)ヒドロゲルをサイズ分画/分級すること、
(a-iiie)ヒドロゲルを容器中に移動させること、
(a-iiig)ヒドロゲルを、滅菌に適した特別な溶媒中に移動させること、及び
(a-iiih)好ましくは、ガンマ放射線によってヒドロゲルを滅菌すること、
の全てを含む。
任意選択の工程(b)
好ましい実施態様において、Ax0は、アミンであり、Ax1は、ClSO2-、R1(C=O)-、I-、Br-、Cl-、SCN-、CN-、O=C=N-、Y1-(C=O)-、Y1-(C=O)-NH-、又はY1-(C=O)-O-であり、
ここで、
R1は、H、C1〜6アルキル、C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニル、C3〜8シクロアルキル、4から7員のヘテロシクリル、8から11員のヘテロビシクリル、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、又はテトラリニルであり、
Y1は式(f-i)から(f-vi):
Figure 2016516796
 [式中、
破線は、分子の残りへの結合を示し、
bは、1、2、3又は4であり、
XHは、Cl、Br、I、又はFである]
から選択される。
もう1つの好ましい実施態様において、Ax0は、ヒドロキシル基(-OH)であり、Ax1は、O=C=N-、I-、Br-、SCN-、又はY1-(C=O)-NH-であり、
ここで、Y1は、式(f-i)から(f-vi):
Figure 2016516796
Figure 2016516796
[式中、
破線は、分子の残りへの結合を示し、
bは、1、2、3又は4であり、
XHは、Cl、Br、I、又はFである]
から選択される。
もう1つの好ましい実施態様において、Ax0はカルボン酸(-(C=O)OH)であり、Ax1は第一級アミン又は第二級アミンである。
もう1つの好ましい実施態様において、Ax0はマレイミドであり、Ax1はチオールである。
より好ましくは、Ax0はアミンであり、Ax1は、Y1-(C=O)-、Y1-(C=O)-NH-、又はY1-(C=O)-O-であり、最も好ましくは、Ax0はアミンであり、Ax1はY1-(=O)-である。
Ax1は、任意選択で、保護形態で存在してもよい。
活性化されたカルボン酸を得るための適当な活性化試薬は、例えば、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、1-エチル-3-カルボジイミド(EDC)、ヘキサフルオロリン酸ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシトリピロリジノホスホニウム(PyBOP)、ヘキサフルオロリン酸ブロモトリピロリジノホスホニウム(PyBrOP)、ヘキサフルオロリン酸1-シアノ-2-エトキシ-2-オキソエチリデンアミノオキシ)ジメチルアミノモルホリノカルベニウム(COMU)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBT)、ヘキサフルオロリン酸1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール(HOAT)、O-(6-クロロベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウム(HCTU)、1-H-ベンゾトリアゾリウム(HBTU)、ヘキサフルオロリン酸O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウム(HATU)、及びテトラフルオロホウ酸O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウム(TBTU)である。これらの試薬は商業的に入手可能であり、当業者によく知られている。
好ましくは、Ax2は、任意選択の保護基を有する、-マレイミド、-SH、-NH2、-SeH、-N3、-C≡CH、-CR1=CR1aR1b、-OH、-(CH=X)-R1、-(C=O)-S-R1、-(C=O)-H、-NH-NH2、-O-NH2、-Ar-X0、-Ar-Sn(R1)(R1a)(R1b)、-Ar-B(OH)(OH)、Br、I、Y1-(C=O)-、Y1-(C=O)-NH-、Y1-(C=O)-O-、
Figure 2016516796
 [式中、
破線は、SP2への結合を示し、
XはO、S、又はNHであり、
X0は、-OH、-NR1R1a、-SH、又は-SeHであり、
XHは、Cl、Br、I又はFであり、
Arは、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、又はテトラリニルであり、
R1、R1a、R1bは、相互に独立して、H、C1〜6アルキル、C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニル、C3〜8シクロアルキル、4から7員のヘテロシクリル、8から11員のヘテロビシクリル、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、又はテトラリニルであり、
Y1は、式(f-i)から(f-vi):
Figure 2016516796
 (式中、
破線は、分子の残りへの結合を示し、
bは、1、2、3又は4であり、
XHは、Cl、Br、I、又はFである)
から選択される]
からなる群から選択される。
好ましくは、Ax2は-NH2、マレイミド又はチオールであり、最も好ましくは、Ax2はマレイミドである。
Ax2は、チオールであるのが等しく好ましい。
Ax2は、任意選択で、保護された形態で存在してよい。
工程(a)のヒドロゲルがスペーサー部分に共有結合によりコンジュゲートすれば、得られるヒドロゲル-スペーサー部分コンジュゲートは、式(V):
Figure 2016516796
 [式中、
破線は、工程(a)のヒドロゲルへの結合を示し、
Ay1は、Ax0及びAx1の間で形成された結合であり、
SP2及びAx2は、式(I)におけるように用いられる]
のものである。
好ましくは、Ay1は適当な結合である。
好ましくは、Ay1は:
Figure 2016516796
 [式中、
星印でマークされた破線は、ヒドロゲルへの結合を示し、
マークされていない破線は、SP2への結合を示す]
からなる群から選択される。
適当な反応条件は実施例セクションに記載されており、当業者に公知である。
方法工程(b)は塩基の存在下で行ってよい。適当な塩基は、慣用的な無機若しくは有機塩基を含む。これらは、好ましくは、例えば、水素化ナトリウム、ナトリウムアミド、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムtert-ブトキシド、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸カルシウム、酢酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム又は炭酸アンモニウムのような、アルカリ土類金属又はアルカリ金属の水素化物、水酸化物、アミド、アルコキシド、酢酸塩、炭酸塩又は炭酸水素塩、並びにトリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、N,N-ジメチルアニリン、N,N-ジメチルベンジルアミン、ピリジン、N-メチルピペリジン、N-メチルモルホリン、N,N-ジメチルアミノピリジン、ジアザビシクロオクタン(DABCO)、ジアザビシクロノネン(DBN)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)、ジアザビシクロウンデセン(DBU)又はコリジンのような第三級アミンを含む。
方法工程(b)は、溶媒の存在下で行ってよい。本発明の方法工程(b)を行うための適当な溶媒は、有機溶媒を含む。これらは、好ましくは、水；及び例えば、石油エーテル、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン又はデカリンのような脂肪族、脂環式若しくは芳香族炭化水素；例えば、クロロベンゼン、ジクロロベンゼン、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン又はトリクロロエタンのようなハロゲン化炭化水素；メタノール、エタノール、n-若しくはi-プロパノール、n-、i-、sec-若しくはtert-ブタノール、エタンジオール、プロパン-1,2-ジオール、エトキシエタノール、メトキシエタノール、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジメチルエーテル、ジエチレングリコールのようなアルコール；アセトニトリル、N-メチル-2-ピロリドン(NMP)、ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、N,N-ジメチルアセトアミド、ニトロメタン、ニトロベンゼン、ヘキサメチルホスホルアミド(HMPT)、1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノン(DMI)、1,3-ジメチル-3,4,5,6-テトラヒドロ-2(1H)-ピリミジノン(DMPU)、酢酸エチル、アセトン、ブタノン；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、メチルt-ブチルエーテル、メチルt-アミルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン、1,2-ジメトキシエタン、1,2-ジエトキシエタン又はアニソールのようなエーテル；又はそれらの混合物を含む。好ましくは、溶媒は水、アセトニトリル及びN-メチル-2-ピロリドンからなる群から選択される。
工程(c)
好ましくは、Ax3は、-SH、-NH2、-SeH、-マレイミド、-C≡CH、-N3、-CR1=CR1aR1b、-(C=X)-R1、-OH、-(C=O)-S-R1、-NH-NH2、-O-NH2、-Ar-Sn(R1)(R1a)(R1b)、-Ar-B(OH)(OH)、-Ar-X0、
Figure 2016516796
 [式中、
破線は、Zへの結合を示し、
Xは、O、S又はNHであり、
X0は、-OH、-NR1R1a、-SH、又は-SeHであり、
R1、R1a、R1bは、相互に独立して、H、C1〜6アルキル、C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニル、C3〜8シクロアルキル、4から7員のヘテロシクリル、8から11員のヘテロビシクリル、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、又はテトラリニルであり、
Arは、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、又はテトラリニルである]
からなる群から選択される。
Y1は、活性化されたカルボン酸、活性化されたカルボネート又は活性化されたカルバメートであり、好ましくは、Y1は、式(f-i)から(f-vi):
Figure 2016516796
 [式中、
破線は、分子の残りへの結合を示し、
bは、1、2、3又は4であり、
XHは、Cl、Br、I、又はFである]
から選択される。
好ましい実施態様において、Y1は、式(f-i)から(f-vi):
Figure 2016516796
 [式中、
破線、b及びXHは、前記したように用いられる]
から選択される。
より好ましくは、Ax3は-SH又は-マレイミドであり、最も好ましくは、Ax3は-SHである。
もう1つの好ましい実施態様において、Ax3は、式(aI):
Figure 2016516796
 [式中、
破線は、式(II)のZへの結合を示し、
PG0は、硫黄活性化部分であり、
Sは、硫黄である]
のものである。
好ましくは、式(aI)のPG0は、
Figure 2016516796
 [式中、
破線は、式(aI)の硫黄への結合を示し、
Arは、任意選択で、さらに置換されていてもよい芳香族部分であり、
R01、R02、R03、R04は、相互に独立して、-H、C1〜50アルキル、C2〜50アルケニル、又はC2〜50アルキニルであり、ここで、C1〜50アルキル、C2〜50アルケニル、及びC2〜50アルキニルは、任意選択で、同一又は異なる1つ以上のR3で置換されていてよく、ここで、C1〜50アルキル、C2〜50アルケニル、及びC2〜50アルキニルは、-Q-、-C(O)O-;-O-;-C(O)-;-C(O)N(R4)-;-S(O)2N(R4)-;-S(O)N(R4)-;-S(O)2-;-S(O)-;-N(R4)S(O)2N(R4a)-;-S-;-N(R4)-;-OC(O)R4;-N(R4)C(O)-;-N(R4)S(O)2-;-N(R4)S(O)-;-N(R4)C(O)O-;-N(R4)C(O)N(R4a)-;及び-OC(O)N(R4R4a)からなる群から選択される1つ以上の基によって任意選択で中断されていてもよく、
Qは、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、テトラリニル、C3〜10シクロアルキル、4から7員のヘテロシクリル、及び8から11員のヘテロビシクリルからなる群から選択され、ここで、Tは、任意選択で、同一又は異なる1つ以上のR3で置換されていてもよく、
R3は、ハロゲン;-CN;オキソ(=O);-COOR5;-OR5;-C(O)R5;-C(O)N(R5R5a);-S(O)2N(R5R5a);-S(O)N(R5R5a);-S(O)2R5;-S(O)R5;-N(R5)S(O)2N(R5aR5b);-SR5;-N(R5R5a);-NO2;-OC(O)R5;-N(R5)C(O)R5a;-N(R5)S(O)2R5a;-N(R5)S(O)R5a;-N(R5)C(O)OR5a;-N(R5)C(O)N(R5aR5b);-OC(O)N(R5R5a);又はC1〜6アルキルであり、ここで、C1〜6アルキルは、任意選択で、同一又は異なる1つ以上のハロゲンで置換されていてもよく、及び
R4、R4a、R5、R5a、R5bは、独立して、-H、又はC1〜6アルキルからなる群から選択され、ここで、C1〜6アルキルは、任意選択で、同一又は異なる1つ以上のハロゲンで置換されていてもよい]
からなる群から選択される。
好ましくは、R01、R03及びR04は、相互に独立して、C1〜6アルキルである。
好ましくは、R02は、H及びC1〜6アルキルから選択される。
好ましくは、Arは、
Figure 2016516796
 [式中、
破線は、式(aI)のPG0の残りへの結合を示し、
Wは、相互に独立して、O、S、又はNであり、
W'はNである]
からなる群から選択され、
ここで、Arは、任意選択で、NO2、Cl及びFからなる群から独立して選択された1個以上の置換基で置換されていてもよい。
より好ましくは、式(aI)のPG0は、
Figure 2016516796
 [式中、
破線は、式(aI)の硫黄への結合を示し、
Ar、R01、R02、R03及びR04は、前記したように用いられる]
からなる群から選択される。
より好ましくは、式(aI)のPG0は、
Figure 2016516796
 [式中、
破線は、式(aI)の硫黄への結合を示す]
である。
Ax3は、任意選択で、保護された形態で存在してよい。
Ax2及びAx3の好ましい組合せは、以下の通りである。
Figure 2016516796
Figure 2016516796
Figure 2016516796
表中、
Xは、O、S、又はNHであり、
X0は、-OH、-NR1R1a、-SH、又はSeHであり、
R1、R1a、R1bは、相互に独立して、H、C1〜6アルキル、C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニル、C3〜8シクロアルキル、4から7員のヘテロシクリル、8から11員のヘテロビシクリル、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、及びテトラリニルからなる群から選択され、
Arはフェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、又はテトラリニルである。
もう1つの好ましい実施態様において、Ax2は-SHであり、Ax3は式(aI)のものであり、ここで、PG0は、式(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)又は(viii)のものである。より好ましくは、式(aI)のPG0は、式(i)、(ii)、(iii)、(iv)又は(v)のものであり、なおより好ましくは、式(aI)のPG0は式(i)のものである。最も好ましくは、式(aI)のPG0は、式:
Figure 2016516796
 [式中、
破線は、式(aI)の硫黄への結合を示す]
のものである。
1つの好ましい実施態様において、Ax2はアミンであり、Ax3は、Y1-(C=O)-、Y1-(C=O)-NH-、又はY1-(C=O)-O-であり、最も好ましくは、Ax2はアミンであり、Ax3はY1-(C=O)-である。
もう1つの好ましい実施態様において、Ax2はマレイミドであり、Ax3は-SHである。
1つの実施態様において、任意選択の工程(b)は省略され、Ax0はアミンであり、Ax3は、ClSO2-、R1(C=O)-、I-、Br-、Cl-、SCN-、CN-、O=C=N-、Y1-(C=O)-、Y1-(C=O)-NH-、又はY1-(C=O)-O-であり、
ここで、
R1は、H、C1〜6アルキル、C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニル、C3〜8シクロアルキル、4から7員のヘテロシクリル、8から11員のヘテロビシクリル、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、又はテトラリニルであり、
Y1は、式(f-i)から(f-vi):
Figure 2016516796
 [式中、
破線は、分子の残りへの結合を示し、
bは、1、2、3又は4であり、
XHは、Cl、Br、I、又はFである]
から選択される。
もう1つの実施態様において、任意選択の工程(b)は省略され、Ax0はヒドロキシル基(-OH)であり、Ax3はO=C=N-、I-、Br-、SCN-、又はY1-(C=O)-NH-であり、
ここで、Y1は式(f-i)から(f-vi):
Figure 2016516796
 [式中、
破線は、分子の残りへの結合を示し、
bは、1、2、3又は4であり、
XHは、Cl、Br、I、又はFである]
から選択される。
もう1つの実施態様において、任意選択の工程(b)は省略され、Ax0はカルボン酸(-(C=O)OH)であり、Ax3は第一級アミン又は第二級アミンである。
もう1つの実施態様において、任意選択の工程(b)は省略され、Ax0はアミンであり、Ax3は、Y1-(C=O)-、Y1-(C=O)-NH-、又はY1-(C=O)-O-である。
もう1つの実施態様において、任意選択の工程(b)は省略され、Ax0はマレイミドであり、Ax3はチオールである。
好ましい実施態様において、任意選択の工程(b)は省略され、Ax0はアミンであり、Ax3はY1-(C=O)-である。
もう1つの好ましい実施態様において、任意選択の工程(b)は省略され、Ax0は-SHであり、Ax3は式(aI)のものであり、ここで、PG0は、式(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)又は(viii)のものである。より好ましくは、式(aI)のPG0は、式(i)、(ii)、(iii)、(iv)又は(v)のものであり、なおより好ましくは、式(aI)のPG0は式(i)のものである。最も好ましくは、式(aI)のPG0は式:
Figure 2016516796
 [式中、
破線は、式(aI)の硫黄への結合を示す]
のものである。
工程(c)から得られたヒドロゲルは、式(VIa)又は(VIb):
Figure 2016516796
 [式中、
破線は、工程(a)のヒドロゲルへの結合を示し、
Ay0は、Ax0とAx3との間で形成された結合であり、
Ay1は、式(V)におけるように用いられ、
Ay2は、Ax2とAx3との間で形成された結合であり、
SP2は、式(I)におけるように用いられ、
Zは、式(II)におけるように用いられる]
の構造を有する。
好ましくは、Ay0及びAy2は、アミド、カルバメート、
Figure 2016516796
 [式中、
星印でマークされた破線は、各々、ヒドロゲル又はSP2への結合を示し、
マークされていない破線は、Zへの結合を示す]
からなる群から選択される。
1つの実施態様において、Zは、C1〜50アルキル、C2〜50アルケニル、C2〜50アルキニル、C3〜10シクロアルキル、4から7員のヘテロシクリル、8から11員のヘテロビシクリル、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、及びテトラリニルからなる群から選択され、前記C1〜50アルキル、C2〜50アルケニル、C2〜50アルキニル、C3〜10シクロアルキル、4から7員のヘテロシクリル、8から11員のヘテロビシクリル、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、及びテトラリニルは、任意選択で、同一又は異なる1つ以上のR10で置換されていてもよく、C1〜50アルキル、C2〜50アルケニル、及びC2〜50アルキニルは、T、-C(O)O-;-O-;-C(O)-;-C(O)N(R9)-;-S(O)2N(R9)-;-S(O)N(R9)-;-S(O)2-;-S(O)-;-N(R9)S(O)2N(R9a)-;-S-;-N(R9)-;-OC(O)R9;-N(R9)C(O)-;-N(R9)S(O)2-;-N(R9)S(O)-;-N(R9)C(O)O-;-N(R9)C(O)N(R9a)-;及び-OC(O)N(R9R9a);からなる群から選択される1つ以上の基によって任意選択で中断されていてもよく、
ここで、R9、R9aは、独立して、H、T、C1〜50アルキル、C2〜50アルケニル、及びC2〜50アルキニルからなる群から選択され、前記T、C1〜50アルキル、C2〜50アルケニル、及びC2〜50アルキニルは、任意選択で、同一又は異なる1つ以上のR10で置換されていてもよく、C1〜50アルキル、C2〜50アルケニル、及びC2〜50アルキニルは、T、-C(O)O-;-O-;-C(O)-;-C(O)N(R11)-;-S(O)2N(R11)-;-S(O)N(R11)-;-S(O)2-;-S(O)-;-N(R11)S(O)2N(R11a)-;-S-;-N(R11)-;-OC(O)R11;-N(R11)C(O)-;-N(R11)S(O)2-;-N(R11)S(O)-;-N(R11)C(O)O-;-N(R11)C(O)N(R11a)-;及び-OC(O)N(R11R11a);からなる群から選択される1つ以上の基によって任意選択で中断されていてもよく、
Tはフェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、テトラリニル、C3〜10シクロアルキル、4から7員のヘテロシクリル、及び8から11員のヘテロビシクリルからなる群から選択され、ここで、Tは、任意選択で、同一又は異なる1つ以上のR10で置換されていてよく、
R10は、ハロゲン;CN;オキソ(=O);COOR12;OR12;C(O)R12;C(O)N(R12R12a);S(O)2N(R12R12a);S(O)N(R12R12a);S(O)2R12;S(O)R12;N(R12)S(O)2N(R12aR12b);SR12;N(R12R12a);NO2;OC(O)R12;N(R12)C(O)R12a;N(R12)S(O)2R12a;N(R12)S(O)R12a;N(R12)C(O)OR12a;N(R12)C(O)N(R12aR12b);OC(O)N(R12R12a);又はC1〜6アルキルであり、C1〜6アルキルは、任意選択で、同一又は異なる1つ以上のハロゲンで置換されていてよく、
R11、R11a、R12、R12a、R12bは、相互に独立して、H、及びC1〜6アルキルからなる群から選択され、C1〜6アルキルは、任意選択で、同一又は異なる1つ以上のハロゲンで置換されていてもよい。
もう1つの実施態様において、Zは、0.5kDaから1000kDaの範囲の分子量を有する、好ましくは、0.5から500kDaの範囲の分子量を有する、より好ましくは、0.75から250kDaの範囲の分子量を有する、なおより好ましくは1から100kDaの範囲の分子量を有する、なおより好ましくは5から60kDaの範囲の分子量を有する、なおより好ましくは10から50kDaの範囲の分子量を有する不活性なポリマーであり、最も好ましくは、Zは40kDaの分子量を有する。
好ましくは、Zは、2-メタクリロイル-オキシエチルホスホイルコリン、ポリ(アクリル酸)、ポリ(アクリレート)、ポリ(アクリルアミド)、ポリ(アルキルオキシ)ポリマー、ポリ(アミド)、ポリ(アミドアミン)、ポリ(アミノ酸)、ポリ(アンヒドリド)、ポリ(アスパルトアミド)、ポリ(酪酸)、ポリ(グリコール酸)、ポリブチレンテレフタレート、ポリ(カプロラクトン)、ポリ(カルボネート)、ポリ(シアノアクリレート)、ポリ(ジメチルアクリルアミド)、ポリ(エステル)、ポリ(エチレン)、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(リン酸エチル)、ポリ(エチルオキサゾリン)、ポリ(グリコール酸)、ポリ(アクリル酸ヒドロキシエチル)、ポリ(ヒドロキシエチルオキサゾリン)、ポリ(ヒドロキシメタクリレート)、ポリ(ヒドロキシプロピルメタクリルアミド)、ポリ(メタクリル酸ヒドロキシプロピル)、ポリ(ヒドロキシプロピルオキサゾリン)、ポリ(イミノカルボネート)、ポリ(乳酸)、ポリ(乳酸-co-グリコール酸)、ポリ(メタクリルアミド)、ポリ(メタクリレート)、ポリ(メチルオキサゾリン)、ポリ(オルガノホスファゼン)、ポリ(オルトエステル)、ポリ(オキサゾリン)、ポリ(プロピレングリコール)、ポリ(シロキサン)、ポリ(ウレタン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルアミン)、ポリ(ビニルメチルエーテル)、ポリ(ビニルピロリドン)、シリコーン、セルロース、カルボメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、キチン、キトサン、デキストラン、デキストリン、ゼラチン、ヒアルロン酸及び誘導体、官能性化ヒアルロン酸、マンナン、ペクチン、ラムノガラクツロナン、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン、ヒドロキシエチルデンプン及び他の炭水化物系ポリマー、キシラン、及びそれらのコポリマーからなる群から選択される不活性なポリマーである。
好ましい実施態様において、Zは、少なくとも70%のPEGを含む不活性な直鎖状又は分岐鎖状PEG系ポリマー、又は少なくとも70%のヒアルロン酸を含むヒアルロン酸系ポリマーである。より好ましくは、Zは、少なくとも70%のPEGを含む、より好ましくは少なくとも80%のPEGを含む、最も好ましくは少なくとも90%のPEGを含む不活性な直鎖状又は分岐鎖状PEG系ポリマーである。
もう1つの好ましい実施態様において、Zは、好ましくは、0.5から100kDaの範囲の分子量を有するペプチド又は蛋白質である。より好ましくは、Zは、2から70kDaの範囲の分子量を有する蛋白質であり、なおより好ましくは、Zは、5から50kDaの範囲の分子量を有する蛋白質である。
もう1つの好ましい実施態様において、Zは、双性イオン性ポリマーである。好ましくは、そのような双性イオン性ポリマーはポリ(アミノ酸)及び/又はポリ(アクリレート)を含む。
本明細書で用いるように、用語「双性イオン」及び「双性イオン性」とは、その分子又は部分内の異なる位置に正及び負の電荷を同時に有する中性分子若しくは部分を指す。
Zhang et al.(Nature Biotechnology, 2013, 31巻, 6号, 553-557頁)によると、双性イオン性ポリマーで作成されたヒドロゲルは異物応答に対して抵抗する。
工程(c)は、99mol%以下のAx0又はAx2がAx3と反応するように、工程(a)又は工程(b)のヒドロゲルを式(II)の試薬と反応させることを含む。これは、例えば、Ax0又はAx2に対して最大0.99化学当量の式(II)の試薬を工程(a)又は(b)のヒドロゲルと反応させることによって達成することができる。
0.99化学当量を超える反応を妨げるためには、式(II)の試薬を、Ax0又はAx2に対して最大0.99化学当量の量で用いることができ、別法として、反応速度がモニターされ、Ax0又はAx2に対して最大0.99化学当量が反応した場合、特に、0.99を超える化学当量が用いられる場合、反応は中断される。また、不活性部分Zの立体障害、疎水性特性又は他の特徴などの物理的拘束のため、たとえ、より多くの化学当量が反応に加えられたとしても、0.99化学当量以下がAx0又はAx2と反応することができる。
好ましくは、工程(c)は、80mol%以下のAx0又はAx2がAx3と反応するように、なおより好ましくは、60mol%以下のAx0又はAx2がAx3と反応するように、なおより好ましくは、40mol%以下のAx0又はAx2がAx3と反応するように、なおより好ましくは、20mol%以下のAx0又はAx2がAx3と反応するように、最も好ましくは、15mol%以下のAx0又はAx2がAx3と反応するように、工程(a)又は工程(b)のヒドロゲルを式(II)の試薬と反応させることを含む。
これは、例えば、Ax0又はAx2に対して最大0.8、0.6、0.4、0.2又は0.15化学当量の式(II)の試薬を、各々、工程(a)又は(b)のヒドロゲルと反応させることによって達成することができる。
より多くの化学当量の反応を妨げるための方法は先に記載されている。
工程(a)の、及び工程(c)後のAx0の物質の量の測定に基づいて、反応したAx0の物質の量は方程式(1):
(1)mmol/gで表した反応したAx0の物質の量=(Ax0 1-Ax0 2)/(Ax0 2×MWZ+1)
で計算することができ、方程式中、
Ax0 1は、mmol/gで表した工程(a)のヒドロゲルの官能基Ax0の物質の量であり、
Ax0 2は、mmol/gで表した、工程(c)後のヒドロゲルの官能基Ax0の物質の量であり、
MWZはg/mmolで表したZの分子量である。
任意選択のスペーサー試薬を工程(a)のヒドロゲルに共有結合によりコンジュゲートさせれば、反応したAx2の数の計算がそれに応じてなされる。
工程(a)のヒドロゲルの官能基Ax0に対する反応した官能基Ax0の百分率は、方程式(2):
(2)反応したAx0のmol%=100×[(Ax0 1-Ax0 2)/(Ax0 2×MWZ+1)]/Ax0 1
に従って計算され、方程式中、変数は先に記載したように用いられる。
1つの実施態様において、Zはヒドロゲルの表面にコンジュゲートされる。これは、試薬Ax3-Zのサイズ及び構造を、それが余りにも大きくて、ヒドロゲルのポア又はネットワークに入ることができないように選択することによって達成することができる。従って、Ax3-Zの最小のサイズは、ヒドロゲルの特性に依存する。しかしながら、当業者であれば、どのようにして、試薬Ax3-Zが、標準的な実験を用い、例えば、固定相としてヒドロゲルを備えたサイズ排除クロマトグラフィーを用いることによって、ヒドロゲルに入ることができるのかを試験する方法を知っている。
他の態様
本発明のもう1つの態様は、本発明の方法から得ることができるヒドロゲルである。
本発明のもう1つの態様は、本発明のヒドロゲルの、ヒドロゲル連結プロドラッグにおける担体としての使用である。
本発明のもう1つの態様は、本発明の共有結合によりコンジュゲートされたヒドロゲルを含むヒドロゲル連結プロドラッグである。
式(VIa)及び(VIb)のコンジュゲートは、それらが、本発明のヒドロゲルが担体として使用される担体連結プロドラッグの表面にコンジュゲートされた生物学的に活性な部分を保護するようなものが好ましい。
これは、生物学的に活性な部分に対する標識抗体を用いて、該標識抗体の、工程c)及び工程a)のヒドロゲルにコンジュゲートされた生物学的に活性な部分への結合を試験し、工程a)のヒドロゲルにコンジュゲートされた生物学的に活性な部分への標識抗体に対する、工程c)のヒドロゲルにコンジュゲートされた生物学的に活性な部分への標識抗体の相対的結合を計算する免疫アッセイを用いることによって試験することができる。
好ましくは、そのような標識抗体の、工程c)のヒドロゲルにコンジュゲートされた生物学的に活性な部分への結合は、該標識抗体の、工程a)のヒドロゲルにコンジュゲートされた該生物学的に活性な部分への結合の50%以下、例えば、40%以下、30%以下、20%以下、10%以下、5%以下、2%以下、又は1%以下である。
驚くべきことに、ポリマー部分Zを有する本発明のヒドロゲルは、ヒドロゲルの表面の残存する官能基を効果的に保護し、及び/又はヒドロゲルの表面にコンジュゲートされた生物学的に活性な部分を効果的に保護することが判明した。
そのようなヒドロゲルが担体連結プロドラッグにおいて担体として使用される場合、それは、担体連結プロドラッグを、患者によって良好に許容されるようにする技術的効果を有し、免疫応答の低下を引き起こす。
本発明のヒドロゲルで得られるもう1つの技術的効果は、そのようなヒドロゲルを含む担体連結プロドラッグが、特に、疎水性薬物の担体連結プロドラッグの場合に、低下した力を用いて注射できることである。
もう1つの実施態様において、本発明の方法は、ヒドロゲルの代わりに、ヒドロゲル連結プロドラッグを工程(a)で用い、工程(b)及び(c)を先に詳細に記載したように行うように実行することができる。
[実施例]
材料及び方法
材料:
アミノ4-アームPEG5000は、JenKem Technology、北京、P.R.中国から得た。CithroI(商標)DPHSは、Croda International Pic、Cowick Hall、英国から得た。
イソプロピルマロン酸はABCR GmbH & Co.KG.76187 Karlsruhe、ドイツ国から得た。
N-マレイミドプロピオン酸NHS-エステルはTCI Deutschland、65760 Eschborn、ドイツ国から得た。
全ての他の化学物質はSigma-ALDRICH Chemie GmbH、Taufkirchen、ドイツ国からのものであった。
5kDa PEG-SH、10kDa PEG-SH、20kDa PEG-SH、10kDa PEG-NHS及び20kDa PEG-NHSは、RAPP POLYMERE GmbH、72072 Tubingen、ドイツ国から得た。
N-(3-マレイミドプロピオニル)-21-アミノ-4,7,10,13,16,19-ヘキサオキサ-ヘンエイコサン酸Pfpエステル(Mal-PEG6-Pfp)はBiomatrik、中国から得た。
30kDa PEG-NHS、40kDa PEG-NHS、分岐鎖状40kDa PEG-NHS、分岐鎖状60kDa PEG-NHS及び分岐鎖状80kDa PEG-NHSは、日油株式会社(NOF Corporation)、東京150-6019、日本国から得た。
方法:
RP-HPLCは、各々、Waters 600又は2535 HPLCシステム及びWaters 2487又は2489吸光度検出器に接続された100×20mm又は100×40mm C18 ReproSil-Pur 300 ODS-3 5μカラム(Maisch博士、Ammerbuch、ドイツ国)で行った。溶液A(H2O中0.1%TFA)及び溶液B(アセトニトリル中0.1%TFA)の直線状グラジエントを用いた。生成物を含有するHPLC画分を合わせ、凍結乾燥した。
フラッシュクロマトグラフィー精製は、Biotage KP-Silシリカカートリッジ及びn-ヘプタン、酢酸エチル、及びメタノールを溶離剤として用い、Biotage AB、スウェーデン国からのIsolera Oneシステムで行った。生成物を254nmで検出した。吸光度を示さない生成物では、240nmを超える画分をLC/MSによってスクリーニングした。
分析超高性能LC(UPLC)は、Thermo ScientificからのLTQ Orbitrap Discovery質量分析器にカップリングさせたWaters BEH300 C18カラム(2.1×50mm、1.7μm粒径)を備えたWatersのAcquityシステムで行った。
HPLC-エレクトロスプレーイオン化質量分析(HPLC-ESI-MS)は、Thermo LTQ Orbitrap Discovery高分解能にカップリングされたAcquity PDA検出器を備えたWatersのAcquity UPLC/WatersのACQUITY UPLC BEH300 C18 RPカラム(2.1×50mm、300Å、1.7μm、流量:0.25mL/分、溶媒A:UP-H2O+0.04%TFA、溶媒B:UP-アセトニトリル+0.05%TFA)を備えた高精度質量分析器で行った。
PEG生成物のMSスペクトルは、PEG出発物質の多分散のため一連の(CH2CH2O)n部分を示した。より容易な解釈のために、唯1つの代表的なm/zシグナルを実施例で与える。
[実施例1]
骨格試薬1a及び1bの合成:
Figure 2016516796
骨格試薬1aは、WO2011/012715A1の実施例1に記載されているように合成した。骨格試薬1bは、Boc-LLys(Boc)-OHの代わりにBoc-DLys(Boc)-OHを用いる以外は、WO2011/012715A1の実施例1に記載されているように合成した。
MS:m/z 888.50=[M+10H+]10+(計算値=888.54)。
多分散PEG含有化合物のマススペクトルについては、唯1つの質量ピークが選択された。
[実施例2]
架橋剤試薬2d、rac-2h、2k、2n、rac-2q、及びrac-2tの合成
架橋剤試薬2dは、以下のスキームに従い、アゼライン酸モノベンジルエステル及びPEG2000から調製した。
Figure 2016516796
アゼライン酸モノベンジルエステル2aの合成では、アゼライン酸(37.6g、200mmol)、ベンジルアルコール(21.6g、200mmol)、p-トルエンスルホン酸(0.80g、4.2mmol)、及び240mLのトルエンの混合物をDean-Stark装置中で7時間加熱還流した。冷却後、溶媒を蒸発させ、300mL飽和NaHCO3水溶液を加えた。この混合物を3×200mLのMTBEで抽出した。合わせた有機相をNa2SO4で乾燥し、溶媒を蒸発させた。生成物を、溶離剤として酢酸エチル/ヘプタン(10:90→25:75)を用いて2×340gシリカで精製した。溶離剤を蒸発させ、残渣を真空中で一晩乾燥した。
収率25.8g(46%)無色油2a。
MS:m/z 279.16=[M+H]+(計算値=279.16)。
化合物2bの合成では、アゼライン酸モノベンジルエステル2a(14.6g、52.5mmol)及びPEG2000(30.0g、15mmol)を50mLジクロロメタンに溶解させ、氷浴で冷却した。30mLのジクロロメタン中のDCC(10.8g、52.5mmol)及びDMAP(91.6mg、0.8mmol)の溶液を加えた。氷浴を取り除き、混合物を室温にて一晩撹拌した。得られた懸濁液を0℃まで冷却し、固体を濾別した。溶媒を真空中で蒸発させた。
残渣を26mLのジクロロメタンに溶解させ、室温にて、780mLのMTBEで希釈した。混合物を-20℃で一晩保存した。沈殿を、ガラスフィルターPor.3を通す濾過によって収集し、350mLの冷却されたMTBE(-20℃)で洗浄した。生成物を真空中で一晩乾燥した。
収率32.5g(86%)白色粉末2b。
MS:m/z=826.49[M+3H]3+(計算値=856.05)。
化合物2cの合成では、化合物2b(32.2g、12.8mmol)を酢酸エチル(196mL)に溶解させ、306mgの木炭上のパラジウムを加えた。雰囲気圧力の水素雰囲気下で、混合物を室温にて一晩撹拌した。反応混合物をセライトのパッドを通して濾過し、濾液を蒸発させ、真空中で一晩乾燥した。
収率28.8g(96%)ガラス状固体2c。
MS:m/z 751.78=[M+3H]3+(計算値=751.91)。
多分散PEGを含有する化合物のマススペクトルでは、唯1つのマスピークが選択された。
化合物2dの合成では、化合物2c(28.7g、12.3mmol)及びTSTU(14.8g、49.1mmol)を、室温にて、100mLのジクロロメタンに溶解させた。次いで、DIPEA(6.3g、49.1mmol)を加え、混合物を1時間撹拌した。得られた懸濁液を濾過し、170mLのジクロロメタンを加えた。濾液を200mLの水性溶液(3gのNaOH、197gのNaCl及び750gのH2O)で洗浄した。有機相をMgSO4で乾燥し、溶媒を真空中で蒸発させた。残渣を200mLのトルエンに溶解させ、200mLのMTBEで室温にて希釈し、-20℃にて一晩保存した。沈殿を、ガラスフィルターPor.3を通す濾過によって収集し、250mLの冷却されたMTBE(-20℃)で洗浄した。生成物を真空中で一晩乾燥した。
収率24.0g(77.4%)白色粉末2d。
MS:m/z 845.82=[M+3H]3+(計算値=860.68)。
多分散PEG含有化合物のマススペクトルについては、唯1つのマスピークが選択さされた。
架橋剤試薬rac-2hの合成
架橋剤試薬rac-2hは、以下のスキームに従い、イソプロピルマロン酸モノベンジルエステル及びPEG3300から調製した。
Figure 2016516796
イソプロピルマロン酸モノベンジルエステルrac-2eの合成では、イソプロピルマロン酸(35.0g、239mmol)、ベンジルアルコール(23.3g、216mmol)及びDMAP(1.46g、12.0mmol)を100mLのアセトニトリルに溶解させた。混合物を氷浴で0℃まで冷却した。150mLのアセトニトリル中のDCC(49.4g、239mmol)の溶液を、0℃にて、15分間以内に加えた。氷浴を取り除き、反応混合物を室温にて一晩撹拌し、次いで、固体を濾別した。濾液を真空中で40℃にて蒸発させ、残渣を300mLのMTBEに溶解させた。この溶液を2×300mLの飽和NaHCO3水溶液で抽出し、次いで、合わせた水性相を、6N塩酸を用いてpH=1〜3に酸性化した。得られたエマルジョンを2×300mLのMTBEで抽出し、溶媒を蒸発させた。合わせた有機相を200mLの飽和NaCl水溶液で洗浄し、MgSO4で乾燥した。溶離剤として酢酸エチル/ヘプタン(10:90→20:80)を用い、生成物を340gのシリカで精製した。溶離剤を蒸発させ、残渣を真空中で一晩乾燥した。
収率9.62g(17%)無色油rac-2e。
MS:m/z237.11=[M+H]+(計算値=237.11)。
化合物rac-2fの合成では、イソプロピルマロン酸モノベンジルエステルrac-2e(5.73g、24.2mmol)及びPEG3300(20.0g、6.06mmol)を105mLのジクロロメタンに溶解させ、氷浴で冷却した。15mLのジクロロメタン中のDCC(5.00g、24.2mmol)及びDMAP(37mg、0.30mmol)の溶液を加えた。氷浴を取り除き、混合物を室温にて一晩撹拌した。得られた懸濁液を0℃まで冷却し、固体を濾別した。溶媒を真空中で蒸発させた。
残渣を70mLのジクロロメタンに溶解させ、室温にて725mLのMTBEで希釈した。混合物を-20℃で一晩保存した。沈殿を、ガラスフィルターPor.3を通す濾過によって収集し、650mLの冷却したMTBE(-20℃)で洗浄した。生成物を真空中で一晩乾燥した。
収率21.3g(94%)白色粉末rac-2f。
MS:m/z671.39=[M+6H]6+(計算値=671.47)。
多分散PEG含有化合物のマススペクトルについては、唯1つのマスピークが選択された。
化合物rac-2gの合成では、化合物rac-2f(21.2g、5.65mmol)を酢酸エチル(130mL)に溶解させ、234mgの木炭上のパラジウムを加えた。雰囲気圧力の水素雰囲気下で、混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物をセライトのパッドを通して濾過し、濾液を蒸発させ、真空中で一晩乾燥した。
収率20.0g(99%)ガラス状固体rac-2g。
MS:m/z597.35=[M+6H]6+(計算値=597.38)。
多分散PEG含有化合物のマススペクトルでは、唯1つのマスピークが選択された。
化合物rac-2hの合成では、化合物rac-2g(7.50g、2.10mmol)及びTSTU(2.52g、8.38mmol)を室温にて105mLのジクロロメタンに溶解させた。次いで、DIPEA(1.08g、8.38mmol)を加え、混合物を45分間撹拌した。反応混合物を8つの個々の50mL PP Falconチューブに濾過し、次いで、10mLのリン酸塩緩衝液0.5M pH=6.5を各Falconチューブに加えた。混合物を振盪し、遠心分離した(2000分-1、1分)。下(有機)相を除去し、組み合わせ、再度遠心分離した(2000分-1、1分)。次いで、下相をMgSO4で乾燥し、溶媒を真空中で蒸発させた。残渣を100mLのトルエンに溶解させ、濾過し、室温に145mLのMTBEで希釈し、-20℃で一晩保存した。沈殿を、ガラスフィルターPoc.3を通す濾過によって収集し、500mLの冷却されたMTBE(-20℃)で洗浄した。生成物を真空中で一晩乾燥した。
収率7.19g(91%)白色粉末rac-2h。
MS:m/z673.71=[M+6H]6+(計算値=673.77)。
多分散PEG含有化合物のマススペクトルでは、唯1つのマスピークが選択された。
架橋剤試薬2kは、以下のスキームに従って、アゼライン酸モノベンジルエステル及びPEG4000から調製した。
Figure 2016516796
化合物2iの合成では、アゼライン酸モノベンジルエステル2a(9.74g、35.0mmol)及びPEG4000(40.0g、10.0mmol)を130mLジクロロメタンに溶解させ、氷浴で冷却した。40mLのジクロロメタン中のDCC(7.22g、35.0mmol)及びDMAP(61mg、0.5mmol)の溶液を加えた。氷浴を取り除き、混合物を室温で一晩撹拌した。得られた懸濁液を0℃まで冷却し、固体を濾別した。溶媒を真空中で蒸発させた。
残渣を59mLのジクロロメタンに溶解させ、室温にて314mLのMTBEで希釈した。混合物を-20℃で一晩保存した。沈殿を、ガラスフィルターPor.3を通す濾過によって収集し、250mLの冷却されたMTBE(-20℃)で洗浄した。生成物を真空中で一晩乾燥した。
収率42.9g(95%)白色粉末2i。
MS:m/z795.48=[M+6H]6+(計算値=751.58)。
多分散PEG含有化合物のマススペクトルでは、唯1つのマスピークが選択された。
化合物2jの合成では、化合物2i(42.8g、9.47mmol)を酢酸エチル(230mL)及び35mLのエタノールに溶解させ、400mgの木炭上のパラジウムを加えた。雰囲気圧力の水素雰囲気下で、混合物を室温にて一晩撹拌した。反応混合物を、セライトのパッドを通して濾過し、濾液を蒸発させ、真空中で一晩乾燥した。
収率37.5g(91%)ガラス状固体2j。
MS:m/z758.13=[M+6H]6+(計算値=721.54)。
多分散PEG含有化合物のマススペクトルでは、唯1つのマスピークが選択された。
化合物2kの合成では、化合物2j(37.3g、8.60mmol)及びTSTU(10.4g、34.4mmol)を室温にて120mLのジクロロメタンに溶解させた。次いで、DIPEA(4.45g、34.4mmol)を加え、混合物を45分間撹拌した。得られた懸濁液を濾過し、100mLのジクロロメタンを加えた。濾液を200mL水溶液(3gのNaOH、197gのNaCl及び750gのH2O)で洗浄した。有機相をMgSO4で乾燥し、溶媒を真空中で蒸発させた。残渣を200mLのトルエンに溶解させ、室温で380mLのMTBEで希釈し、-20℃で一晩保存した。沈殿を、ガラスフィルターPor.3を通す濾過によって収集し、450mLの冷却されたMTBE(-20℃)で洗浄した。生成物を真空中で一晩乾燥した。
収率32.7g(84%)白色粉末2k。
MS:m/z790.46=[M+6H]6+(計算値=753.90)。
多分散PEG含有化合物のマススペクトルでは、唯1つのマスピークが選択された。
架橋剤2nは、以下のスキームに従って、スベリン酸モノベンジルエステル2a及びPEG6000から調製した。
Figure 2016516796
化合物21の合成では、アゼライン酸モノベンジルエステル2a(6.50g、23.3mmol)及びPEG6000(40.0g、6.67mmol)を140mLのジクロロメタンに溶解させ、氷浴で冷却した。40mLのジクロロメタン中のDCC(4.81g、23.3mmol)及びDMAP(0.040g、0.33mmol)の溶液を加えた。氷浴を取り除き、混合物を室温にて一晩撹拌した。得られた懸濁液を0℃まで冷却し、固体を濾別した。溶媒を真空中で蒸発させた。
残渣を70mLのジクロロメタンに溶解させ、室温にて300mLのMTBEで希釈した。混合物を-20℃にて一晩保存した。沈殿を、ガラスフィルターPor.3を通す濾過によって収集し、500mLの冷却されたMTBE(-20℃)で洗浄した。生成物を真空中で一晩乾燥した。
収率41.2g(95%)白色粉末2l。
MS:m/z833.75=[M+8H]8+(計算値=833.74)。
多分散PEG含有化合物のマススペクトルでは、唯1つのマスピークが選択された。
化合物2mの合成では、化合物2l(41.2g、6.32mmol)を酢酸メチル(238mL)及びエタノール(40mL)に溶解させ、次いで、400mgの木炭上のパラジウムを加えた。雰囲気圧力の水素雰囲気下で、混合物を室温にて一晩撹拌した。反応混合物を、セライトのパッドを通して濾過し、濾液を蒸発させ、真空中で一晩乾燥した。
収率38.4g(96%)ガラス状固体2m。
MS:m/z750.46=[M+9H]9+(計算値=750.56)。
多分散PEG含有化合物のマススペクトルでは、唯1つのマスピークが選択された。
化合物2nの合成では、化合物2m(38.2g、6.02mmol)及びTSTU(7.25g、mmol)を室温にて130mLのジクロロメタンに溶解させた。次いで、DIPEA(3.11g、24.1mmol)を加え、混合物を1時間撹拌した。得られた懸濁液を濾過し、濾液を100mLのジクロロメタンで希釈し、750g水/197gのNaCl/3gのNaOHの200mLの溶液で洗浄した。有機相をMgSO4で乾燥し、溶媒を真空中で蒸発させた。
残渣を210mLのトルエンに溶解させ、室温にて430mLのMTBEで希釈し、-20℃で一晩保存した。沈殿を、ガラスフィルターPor.3を通す濾過によって収集し、450mLの冷却されたMTBE(-20℃)で保存した。沈殿をガラスフィルターPor.3を通す濾過によって収集し、450mLの冷却されたMTBE(-20℃)で洗浄した。生成物を真空中で一晩乾燥した。
収率35.8g(91%)白色粉末2n。
MS:m/z857.51=[M+8H]8+(計算値=857.51)。
多分散PEG含有化合物のマススペクトルでは、唯1つのマスピークが選択された。
架橋剤試薬2qは、以下のスキームに従って、イソプロピルマロン酸モノベンジルエステル及びPEG8000から調製した。
Figure 2016516796
化合物rac-2oの合成では、イソプロピルマロン酸モノベンジルエステルrac-2e(2.25g、9.50mmol)及びPEG8000(19.0g、2.38mmol)を100mLのジクロロメタンに溶解させ、氷浴で冷却した。10mLのジクロロメタン中のDCC(1.96g、9.50mmol)及びDMAP(14mg、0.12mmol)の溶液を加えた。氷浴を取り除き、混合物を室温にて一晩撹拌した。得られた懸濁液を0℃まで冷却し、固体を濾別した。溶媒を真空中で蒸発させた。
残渣を40mLのジクロロメタンに溶解させ、室温にて270mLのMTBEで希釈した。混合物を-20℃にて一晩保存した。沈殿を、ガラスフィルターPor.3を通す濾過によって収集し、500mLの冷却されたMTBE(-20℃)で洗浄した。生成物を真空中で一晩乾燥した。
収率18.5g(92%)白色粉末rac-2o。
MS:m/z737.43=[M+13H]13+(計算値=737.42)。
多分散PEG含有化合物のマススペクトルでは、唯1つのマスピークが選択された。
化合物rac-2pの合成では、化合物rac-2o(18.4g、2.18mmol)を酢酸メチル(160mL)に溶解させ、254mgの木炭上のパラジウムを加えた。雰囲気圧力の水素雰囲気下で、混合物を室温にて一晩乾燥した。反応混合物を、セライトのパッドを通して濾過し、濾液を蒸発させ、真空中で一晩乾燥した。
収率17.7g(98%)ガラス状固体rac-2p。
MS:m/z723.51=[M+13H]13+(計算値=723.55)。
多分散PEG含有化合物のマススペクトルでは、唯1つのマスピークが選択された。
化合物rac-2qの合成では、化合物rac-2p(13.6g、1.65mmol)及びTSTU(1.96g、6.60mmol)を室温にて60mLのジクロロメタンに溶解させた。次いで、DIPEA(852mg、6.60mmol)を加え、混合物を45分間撹拌した。得られた懸濁液を濾過し、濾液を70mLの酢酸エチルで希釈し、70mLの0.5Mのリン酸塩緩衝液pH=6.5で洗浄した。有機相をMgSO4で乾燥し、溶媒を真空中で蒸発させた。残渣を80mLのトルエンに溶解させ、残存する固体を濾別し、20mLのトルエンで洗浄した。合わせたトルエン画分を室温にて35mLのMTBEで希釈し、-20℃にて一晩保存した。沈殿をガラスフィルターPor.3を通す濾過によって収集し、600mLの冷却されたMTBE(-20℃)で洗浄した。生成物を真空中で一晩乾燥した。
収率12.1g(87%)白色粉末rac-2q。
MS:m/z738.51=[M+13H]13+(計算値=738.49)。
多分散PEG含有化合物のマススペクトルでは、唯1つのマスピークが選択された。
架橋剤試薬2tは、以下のスキームに従い、イソプロピルマロン酸モノベンジルエステル及びPEG10000から調製した。
Figure 2016516796
化合物rac-2rの合成では、イソプロピルマロン酸モノベンジルエステルrac-2e(945mg、4.00mmol)及びPEG10000(10.0g、4.00mmol)を20mLのジクロロメタンに溶解させ、氷浴で冷却した。10mLのジクロロメタン中のDCC(825mg、4.00mmol)及びDMAP(6mg、0.05mmol)の溶液を加えた。氷浴を取り除き、混合物を室温にて一晩撹拌した。得られた懸濁液を0℃まで冷却し、固体を濾別した。溶媒を真空中で蒸発させた。
残渣を20mLのジクロロメタンに溶解させ、室温にて150mLのMTBEで希釈した。混合物を-20℃にて一晩保存した。沈殿を、ガラスフィルターPor.3を通す濾過によって収集し、500mLの冷却されたMTBE(-20℃)で洗浄した。生成物を真空中で一晩乾燥した。
収率9.63g(92%)白色粉末rac-2r。
MS:m/z742.50=[M+16H]16+(計算値=742.51)。
多分散PEG含有化合物のマススペクトルでは、唯1つのマスピークが選択された。
化合物rac-2sの合成では、化合物rac-2r(3.38g、0.323mmol)を酢酸メチル(100mL)に溶解させ、105mgの木炭上のパラジウムを加えた。雰囲気圧力の水素雰囲気下で、混合物を室温にて一晩撹拌した。反応混合物を、セライトのパッドを通して濾過し、濾液を蒸発させ、真空中で一晩乾燥した。
収率3.25g(98%)ガラス状固体rac-2s。
MS:m/z731.25=[M+16H]16+(計算値=731.25)。
多分散PEG含有化合物のマススペクトルでは、唯1つのマスピークが選択された。
化合物rac-2tの合成では、化合物rac-2s(3.10g、0.302mmol)及びTSTU(0.364g、1.21mmol)を室温にて15mLのジクロロメタンに溶解させた。次いで、DIPEA(0.156g、1.21mmol)を加え、混合物を45分間撹拌した。得られた懸濁液を濾過し、濾液を2×10mLの0.5Mリン酸塩緩衝液pH=6.5で洗浄した。有機相をMgSO4で乾燥し、溶媒を真空中で蒸発させた。残渣を20mLのトルエンに溶解させ、室温にて10mLのMTBEで希釈し、-20℃にて一晩保存した。沈殿を、ガラスフィルターPor.3を通す濾過によって収集し、250mLの冷却されたMTBE(-20℃)で洗浄した。生成物を真空中で一晩乾燥した。
収率2.66g(84%)白色粉末rac-2t。
MS:m/z743.37=[M+16H]16+(計算値=743.38)。
多分散PEG含有化合物のマススペクトルでは、唯1つのマスピークが選択された。
[実施例3]
遊離アミノ基を含有するヒドロゲルビーズ3aの調製
邪魔板を備えた、底部出口、直径60mmを有する円筒形250mLのリアクター中で、100mLのウンデカン中の258mgのCithrol(商標)DPHSのエマルジョンを、雰囲気温度において、750rpmにて、isojetのスターラー、直径50mmで撹拌した。22.1gのDMSO中の2400mgの1a及び3120mgの2dの溶液を加え、10分間撹拌して、懸濁液を形成した。10.7mLのTMEDAを加えて、重合を行った。混合物を雰囲気温度にて16時間撹拌した。16.5mLの酢酸を加え、次いで、10分後に、水中の100mLの15wt%塩化ナトリウム溶液を加えた。10分後、スターラーを停止させ、相を分離した。2時間後、ヒドロゲルを含有する水性相を排出した。
ビーズのサイズ分画では、水-ヒドロゲル懸濁液を50mLのエタノールで希釈し、Retsch AS200制御ふるい機を用い、100、75、63、50、40、及び32μmスチールふるいで15分間湿潤-ふるい分けした。ふるい分けの振幅は1.5mmであり、溶離剤は3Lの15wt%NaCl水溶液、次いで、1Lの純水であり、共に300mL/分の流量であった。40、50、63、及び75μmふるい上に残ったビーズ画分を0.1%AcOHで3回、エタノールで10回洗浄し、0.1ミリバールで16時間乾燥して、各々、0.65g、0.82g、0.42g、及び0.07gの3aを白色粉末として得た。
75μmの画分のヒドロゲルのアミノ基含有量は、Gude, M., J. Ryf, et al. (2002) Letters in Peptide Science 9(4): 203-206によって記載されたように、Fmoc-アミノ酸の、ヒドロゲル上の遊離アミノ酸へのコンジュゲーション、及び引き続いてのFmoc-決定によって、1.003mmol/gであると決定された。
遊離アミノ基を含有するヒドロゲルビーズ3bの調製
740rpmのスターラー速度、2570mgの1b、3341mgの2d、23.6gのDMSO、257mgのCithrol(商標)DPHS、11.5mLのTMEDA、17.6mLの酢酸の使用を適用し、40μmふるい上の0.20g、50μmふるい上の0.37g、63μmふるい上の0.81g、及び35μmふるい上の0.68gの3bを白色粉末として得る以外は、3aについて記載されたようにして、3bを調製した。遊離アミノ基1.020mmol/g。
遊離アミノ基を含有するヒドロゲルビーズ3cの調製
480rpmのスターラー速度、1000mgの1b、4466mgのrac-2h、49.2gのDMSO、486mgのCithrol(商標)DPHS、4.5mLのTMEDA、6.9mLの酢酸の使用を適用し、溶離剤として4Lの純水を用い、125、100、75、63、50、40及び32μmのスチールふるいでふるい、40μmふるい上の0.14g、50μmふるい上の0.20g、63μmふるい上の0.26g、75μmふるい上の1.17g及び100μmふるい上の0.50gの3cを白色粉末として得る以外は、3aについて記載されたようにして、3cを調製した。遊離アミノ基0.201mmol/g。
遊離アミノ基を含有するヒドロゲルビーズ3dの調製
100mm直径を有する1000mLのリアクターを用い、520rpmのスターラー速度、440mLのウンデカン中の565mgのCithrol(商標)DPHS、1000mgの1b、5355mgの2k、57.2gのDMSO、4.5mLのTMEDA、6.9mLの酢酸の使用、水中の塩化ナトリウムの200mLの15wt%溶液の添加、80mLのエタノールの相分離後添加を適用し、50μmのふるい上の0.27g、63μmのふるい上の0.69g、75μmのふるい上の1.23g、及び100μmのふるい上の0.27gの3dを白色粉末として得る以外は、3cについて記載されてようにして、3dを調製した。遊離アミノ基0.168mmol/g。
遊離アミノ基を含有するヒドロゲルビーズ3eの調製
540rpmのスターラー速度、573mgのCithrol(商標)、1000mgの1b、5445mgの2k、58.0gのDMSO、573mgのCithrol(商標)DPHSの使用を適用し、40μmのふるい上の0.34g、50μmのふるい上の0.51g、63μmのふるい上の0.83g、及び75μmのふるい上の1.16gの3eを白色粉末として得る以外は、3dについて記載されたようにして、3eを調製した。遊離アミノ基0.142mmol/g。
遊離アミノ基を含有するヒドロゲルビーズ3fの調製
560rpmのスターラー速度、398mgの1b、2690mgの2n、27.8gのDMSO、274mgのCithrol(商標)DPHS、1.8mLのTMEDA、2.7mLの酢酸の使用を適用し、50μmのふるい上の0.22g、63μmのふるい上の0.33g、及び75μmのふるい上の0.52gの3fを白色粉末として得る以外は、3cについて記載されたようにして、3fを調製した。遊離アミノ基0.152mmol/g。
遊離アミノ基を含有するヒドロゲルビーズ3gの調製
580rpmのスターラー速度、250mgの1b、2168mgのrac-2q,21.8gのDMSO、215mgのCithrol(商標)DPHS、1.1mLのTMEDA、1.7mLの酢酸の使用を適用し、50μmのふるい上の0.09g、63μmのふるい上の0.17g、及び75μmのふるい上の0.54gの3gを白色粉末として得る以外は、3cについて記載されたようにして、3gを調製した。遊離アミノ基0.154mmol/g。
遊離アミノ基を含有するヒドロゲルビーズ3hの調製
600rpmのスターラー速度、250mgの1b、2402mgのrac-2t、23.9gのDMSO、235mgのCithrol(商標)DPHS、1.1mLのTMEDA、1.7mLの酢酸の使用を適用し、63μmふるい上の0.27g、75μmのふるい上の0.54g、及び100μmのふるい上の0.02gの3hを白色粉末として得る以外は、3cについて記載されたようにして、3hを調製した。遊離アミノ基0.144mmol/g。
[実施例4]
マレイミド官能性化ヒドロゲルビーズ4の調製
228.4mgの乾燥重量のヒドロゲルビーズ3b(0.142mmol/gアミノ基/0.032mmolアミノ基)を10mLのNMP中で膨潤させ、NMPで5回、及びNMT中の2%DIEAで5回洗浄した。108.7mg(0.162mmol、5.1当量)のMal-PEG6-PfpをNMPに溶解させ、洗浄したヒドロゲルビーズ3bに加えた。ヒドロゲル懸濁液を室温で2時間インキュベートした。得られたマレイミド官能性化ヒドロゲルビーズ4を、各々、NMPで5回、その後、0.1%酢酸、0.01%Tween20で洗浄した。
ヒドロゲルビーズのマレイミド含有量は、Gude, M., J. Ryf, et al. (2002) Letters in Peptide Science 9(4): 203-206によって記載されているように、Fmoc-システインを、ヒドロゲル上のマレイミド基へコンジュゲートし、続いてFmoc-決定することによって、0.1204mmol/gであると決定された。
[実施例5]
PEG化ヒドロゲルビーズ5a-cの合成
0.1%酢酸中の懸濁液としての50mgのマレイミド官能性化ヒドロゲルビーズ4(6.02×10-3mmolのマレイミド基)、0.01%Tween20を、フリット付シリンジ中に移し、溶媒を除去した。ヒドロゲルをPBS-T/5mM EDTA/pH6.5で10回洗浄した。
PEG-SHを0.5mLのPBS-T/5mM EDTA/pH6.5に溶解させた。PEG溶液をシリンジ中に吸い取り、得られたヒドロゲル懸濁液を、温和な振盪下で、雰囲気温度にて2.5時間インキュベートした。溶媒を除去し、ヒドロゲルをPBS-T/5mM EDTA/pH6.5で5回洗浄し、5mLのSarstedtvialバイアルに移して、5aのヒドロゲル懸濁液を得た。
ヒドロゲルビーズ上のマレイミド含有量は、Gude, M., J. Ryf, et al. (2002) Letters in Peptide Science 9(4): 203-206によって記載されているように、Fmoc-システインの、ヒドロゲル上のマレイミド基へのコンジュゲーション、続いてのFmoc-決定を介して決定した。
PEG化後のマレイミド含有量は、0.0895mmol/gであると決定された。方程式(2)に基づくと、これは最初のマレイミドの17.7%のPEG化の程度を指す。
5bは、50mgのマレイミド官能性化ヒドロゲルビーズ4(6.02×10-3mmolのマレイミド基)で出発し、15.4mgの10kDaのPEG-SH(1.54×10-3mmol、0.26当量)を加えて進行させ、5aについて記載された手法に従って合成した。PEG化後のマレイミド含有量は、0.0761mmol/gであると決定された。方程式(2)に基づくと、これは、最初のマレイミドの20.9%のPEG化を指す。
5cは、50mgのマレイミド官能性化ヒドロゲルビーズ4(6.02×10-3mmolのマレイミド基)で出発し、26.5mgの20kDaのPEG-SH(1.325×10-3mmol、0.22当量)を加えて進行させ、5aについて記載された手法に従って合成した。PEG化後のマレイミド含有量は、0.0951mmol/gであると決定された。方程式(2)に基づくと、これは、最初のマレイミドの7.2%のPEG化を指す。
[実施例6]
PEG化ヒドロゲルビーズ6a-cの合成
75mgの乾燥重量のヒドロゲルビーズ3aを、フリット付10mLシリンジ中に移し、2回分のNMPを加えた。ヒドロゲルを、温和な振盪下で、雰囲気温度にて10分間膨潤させた。溶媒を除去し、ヒドロゲルを、毎回、3mLの1%TMEDA/DMSOで10回洗浄し、溶媒を毎回捨てた。
180mg(3×10-3mmol、アミン含有量に基づいて0.2当量)の分岐鎖状60kDaのPEG-NHSを37℃で1mLのDMSOに溶解し、4.5μLのTMEDA(0.03mmol、3.5mg、アミン含有量に基づいて2当量)を加えた。溶液をシリンジ中に吸い込み、得られたヒドロゲル懸濁液を、温和な振盪下で、雰囲気温度にて64時間インキュベートした。溶媒を除去し、ヒドロゲルを、毎回、3mLのDMSOで5回洗浄し、続いて、毎回、3mLの0.1%酢酸/0.01%Tween20で5回の洗浄サイクルを行った。新鮮な0.1%酢酸/0.01%Tween20をシリンジ中に入れて、最初の重量に基づいて25mg/mLのヒドロゲルの懸濁液が得られ、6aが得られた。ヒドロゲルビーズのアミノ含有量は、乾燥重量のヒドロゲルビーズで0.19mmol/gであると決定された。方程式(2)に基づき、これは、最初のアミンの0.4%のPEG化を指す。
6bの調製は、180mg(3×10-3mmol、アミン含有量に基づいて0.2当量)の分岐鎖状の60kDaのPEG-NHSの代わりに121mg(3×10-3mmol、アミン含有量に基づいて0.2当量)の分岐鎖状の40kDaのPEG-NHSを用いる以外は、6aについて記載された手法に従って行い、その結果、乾燥重量のヒドロゲルビーズにて、0.191mmol/gのアミノ含有量が得られた。方程式(2)に基づき、これは、最初のアミンの0.6%のPEG化を指す。
6cの調製は、180mg(3×10-3mmol、アミン含有量に基づいて0.2当量)の分岐鎖状の60kDaのPEG-NHSの代わりに60.3mg(3×10-3mmol、アミン含有量に基づいて0.2当量)の20kDaのPEG-NHSを用いる以外は、6aについて記載された手法に従って行い、その結果、乾燥重量のヒドロゲルビーズにて、0.126mmol/gのアミノ含有量が得られた。方程式(2)に基づき、これは、最初のアミンの10.6%のPEG化を指す。
[実施例7]
マレイミド官能性化ヒドロゲルビーズ7の調製
117.7mgの乾燥ヒドロゲルビーズ3eを5mLのNMP中で膨潤させ、NMPで5回、及びNMP中の2%DIEAで5回洗浄した。5当量(56mg)のMal-PEG6-Pfp(ヒドロゲルビーズのアミン含有量に基づく)を0.5mLのNMPに溶解させ、洗浄されたヒドロゲルビーズ3eに加えた。ヒドロゲル懸濁液を室温にて2.5時間インキュベートした。得られたマレイミド官能性化ヒドロゲルビーズを、NMPで、その後、0.1%酢酸、0.01%Tween20で、各々、5回洗浄した。
[実施例8]
マイケル付加反応を介するPEG化ヒドロゲルビーズの調製のための一般的な手法
0.1%酢酸、0.01%Tween20中の懸濁液としてのマレイミド官能性化ヒドロゲルビーズを、フリット付シリンジ中に移し、溶媒を除去した。ヒドロゲルをPBS-T/5mM EDTA/pH6.5で10回洗浄した。
0.2当量のPEG-SH(ヒドロゲルビーズのマレイミド含有量に基づく)をPBS-T/5mM EDTA/pH6.5(1mL/15mg試薬)に溶解させた。PEG溶液をシリンジ中に吸い取り、得られたヒドロゲル懸濁液を、温和な振盪下で、雰囲気温度にて3.5時間インキュベートした。溶媒を除去し、ヒドロゲルをPBS-T/5mM EDTA/pH6.5で5回洗浄し、Sarstedtバイアルに移した。
ヒドロゲルビーズ上のマレイミド含有量は、Gude, M., J. Ryf, et al. (2002) Letters in Peptide Science 9(4): 203-206によって記載されたように、Fmoc-システインの、ヒドロゲル上のマレイミド基へのコンジュゲーション、及び引き続いてのFmoc-決定を介して決定した。
方程式(2)に基づいて、PEG化の程度を決定することができる。
実施例8aは、13.3mgの10kDaのPEG-SHを用い、50mg(乾燥ヒドロゲル重量に基づく)の7で出発し、実施例8に記載された手法に従って調製した。最終化合物は、0.0761mmol/gのマレイミド含有量を有する。
実施例8bは、26.6mgの20kDaのPEG-SHを用い、50mg(乾燥ヒドロゲル重量に基づく)の7で出発し、実施例8に記載された手法に従って調製した。最終化合物は、0.0951mmol/gのマレイミド含有量を有する。
[実施例9]
DMSO中でのPEG化ヒドロゲルビーズの調製のための一般的手法
例えば、3aにおいて記載された乾燥ヒドロゲルビーズを、フリット付シリンジ中に移し、NMP(5mL/100mgヒドロゲルビーズ)を加えた。ヒドロゲルを、温和な振盪下で、雰囲気温度にて10分間膨潤させた。溶媒を除去し、ヒドロゲルを、毎回、DMSOで10回、続いて、毎回、1%TMEDA/DMSO(5mL/100mgヒドロゲルビーズ)で10回洗浄し、溶媒を毎回捨てた。
0.2当量(ヒドロゲルビーズのアミン含有量に基づく)のPEG-NHSを、37℃にて、DMSO中の2当量(ヒドロゲルビーズのアミン含有量に基づく)のTMEDAを含有する溶液に15分間で溶解させた。溶液をシリンジ中に吸い取り、得られたヒドロゲル懸濁液を、温和な振盪下で、インキュベートした。溶媒を除去し、ヒドロゲルをDMSO(5mL/100mgヒドロゲルビーズ)で5回洗浄し、続いて、0.1%酢酸/0.01%Tween20(5mL/100mgヒドロゲルビーズ)での5回の洗浄サイクルを行った。新鮮な0.1%酢酸/0.01%Tween20をシリンジ中に入れて、最初の重量に基づいて10mg/mLのヒドロゲルの懸濁液を得た。ヒドロゲルビーズのアミン含有量は、先に記載したように決定した。方程式(2)に基づき、これは、PEG化の程度を指す。
実施例9aは、80mgのヒドロゲル3b及び326.4mgの20kDaのPEG-NHSにて、16時間の反応時間で、実施例9における一般的な手法に従って調製し、その結果、0.862mmol/gのアミン含有量を有するPEG化ヒドロゲルが得られた。方程式(2)に基づき、アミンの0.8%がPEG化された。
実施例9bは、80mgのヒドロゲル3b及び163.2mgの10kDaのPEG-NHSにて、16時間の反応時間で、実施例9における一般的な手法に従って調製し、その結果、0.756mmol/gのアミン含有量を有するPEG化ヒドロゲルが得られた。方程式(2)に基づき、アミンの3.0%がPEG化された。
実施例9cは、50mgのヒドロゲル3a及び200mgの20kDaの分岐鎖状PEG-NHSにて、16時間の反応時間で、実施例9における一般的な手法に従って調製し、その結果、0.932mmol/gのアミン含有量を有するPEG化ヒドロゲルが得られた。方程式(2)に基づき、アミンの0.4%がPEG化された。
実施例9dは、75mgのヒドロゲル3c及び180mgの60kDaの分岐鎖状PEG-NHSにて、64時間の反応時間で、実施例9における一般的な手法に従って調製し、その結果、0.190mmol/gのアミン含有量を有するPEG化ヒドロゲルが得られた。方程式(2)に基づき、アミンの0.4%がPEG化された。
実施例9eは、75mgのヒドロゲル3c及び120.6mgの40kDaの分岐鎖状PEG-NHSにて、64時間の反応時間で、実施例9における一般的な手法に従って調製し、その結果、0.191mmol/gのアミン含有量を有するPEG化ヒドロゲルが得られた。方程式(2)に基づき、アミンの0.6%がPEG化された。
実施例9fは、75mgのヒドロゲル3c及び60.3mgの20kDaのPEG-NHSにて、64時間の反応時間で、実施例9における一般的な手法に従って調製し、その結果、0.126mmol/gのアミン含有量を有するPEG化ヒドロゲルが得られた。方程式(2)に基づき、アミンの10.6%がPEG化された。
実施例9gは、25mgのヒドロゲル3d及び50.3mgの60kDaの分岐鎖状PEG-NHSにて、3時間の反応時間で、実施例9における一般的な手法に従って調製した。PEG化ヒドロゲルのアミン含有量は決定しなかった。
実施例9hは、25mgのヒドロゲル3d及び50.3mgの60kDaの分岐鎖状PEG-NHSにて、1時間の反応時間で、続いて、33.6mgの40kDaの分岐鎖状PEG-NHSを添加し、2時間の反応時間で、実施例9における一般的な手法に従って調製した。PEG化ヒドロゲルのアミン含有量は決定しなかった。
実施例9iは、25mgのヒドロゲル3d及び50.3mgの60kDaの分岐鎖状PEG-NHSにて、1時間の反応時間で、続いて、33.6mgの40kDaの分岐鎖状PEG-NHSを添加し、1時間の反応時間で、続いて、16.8mgの20kDaの分岐鎖状PEG-NHSを添加し、1時間の反応時間にて、実施例9における一般的な手法に従って調製した。PEG化ヒドロゲルのアミン含有量は決定しなかった。
実施例9jは、50mgのヒドロゲル3f及び30.4mgの20kDaのPEG-NHSにて、72時間の反応時間で、実施例9における一般的な手法に従って調製し、その結果、0.125mmol/gのアミン含有量を有するPEG化ヒドロゲルが得られた。方程式(2)に基づき、アミンの0.8%がPEG化された。方程式(2)に基づき、アミンの5.1%がPEG化された。
実施例9kは、50mgのヒドロゲル3f及び45.6mgの30kDaのPEG-NHSにて、72時間の反応時間で、実施例9における一般的な手法に従って調製し、その結果、0.133mmol/gのアミン含有量を有するPEG化ヒドロゲルが得られた。方程式(2)に基づき、アミンの2.5%がPEG化された。
実施例9lは、50mgのヒドロゲル3f及び60.8mgの40kDaのPEG-NHSにて、72時間の反応時間で、実施例9における一般的な手法に従って調製し、その結果、0.141mmol/gのアミン含有量を有するPEG化ヒドロゲルが得られた。方程式(2)に基づき、アミンの1.1%がPEG化された。
実施例9mは、50mgのヒドロゲル3f及び121.6mgの80kDaの分岐鎖状PEG-NHSにて、72時間の反応時間で、実施例9における一般的な手法に従って調製し、その結果、0.131mmol/gのアミン含有量を有するPEG化ヒドロゲルが得られた。方程式(2)に基づき、アミンの1.2%がPEG化された。
実施例9nは、50mgのヒドロゲル3f及び91.2mgの60kDaの分岐鎖状PEG-NHSにて、72時間の反応時間で、実施例9における一般的な手法に従って調製し、その結果、0.137mmol/gのアミン含有量を有するPEG化ヒドロゲルが得られた。方程式(2)に基づき、アミンの1.1%がPEG化された。
実施例9oは、50mgのヒドロゲル3g及び29.6mgの20kDaのPEG-NHSにて、72時間の反応時間で、実施例9における一般的な手法に従って調製し、その結果、0.096mmol/gのアミン含有量を有するPEG化ヒドロゲルが得られた。方程式(2)に基づき、アミンの12.9%がPEG化された。
実施例9pは、50mgのヒドロゲル3g及び47.4mgの30kDaのPEG-NHSにて、72時間の反応時間で、実施例9における一般的な手法に従って調製し、その結果、0.098mmol/gのアミン含有量を有するPEG化ヒドロゲルが得られた。方程式(2)に基づき、アミンの9.2%がPEG化された。
実施例9qは、50mgのヒドロゲル3g及び59.5mgの40kDaのPEG-NHSにて、72時間の反応時間で、実施例9における一般的な手法に従って調製し、その結果、0.118mmol/gのアミン含有量を有するPEG化ヒドロゲルが得られた。方程式(2)に基づき、アミンの4.1%がPEG化された。
実施例9rは、50mgのヒドロゲル3g及び88.2mgの60kDaの分岐鎖状PEG-NHSにて、72時間の反応時間で、実施例9における一般的な手法に従って調製し、その結果、0.121mmol/gのアミン含有量を有するPEG化ヒドロゲルが得られた。方程式(2)に基づき、アミンの2.6%がPEG化された。
実施例9sは、50mgのヒドロゲル3g及び128.3mgの80kDaの分岐鎖状PEG-NHSにて、72時間の反応時間で、実施例9における一般的な手法に従って調製し、その結果、0.116mmol/gのアミン含有量を有するPEG化ヒドロゲルが得られた。方程式(2)に基づき、アミンの2.4%がPEG化された。
実施例9tは、40mgのヒドロゲル3g及び50mgの40kDaの分岐鎖状PEG-NHSにて、72時間の反応時間で、実施例9における一般的な手法に従って調製し、その結果、0.114mmol/gのアミン含有量を有するPEG化ヒドロゲルが得られた。方程式(2)に基づき、アミンの4.7%がPEG化された。
実施例9uは、40mgのヒドロゲル3g及び50mgの40kDaの分岐鎖状PEG-NHSにて、37℃における72時間の反応時間で、実施例9における一般的な手法に従って調製し、その結果、0.132mmol/gのアミン含有量を有するPEG化ヒドロゲルが得られた。方程式(2)に基づき、アミンの2.3%がPEG化された。
実施例9vは、40mgのヒドロゲル3g及び25mgの40kDaの分岐鎖状PEG-NHSにて、24時間の反応時間で、実施例9における一般的な手法に従って調製し、その後、追加の25mgの40kDaの分岐鎖状PEG-NHSを加え、反応をさらに24時間進行させ、その後、追加の25mgの40kDaの分岐鎖状PEG-NHSを加え、反応をさらに24時間進行させ、その結果、0.119mmol/gのアミン含有量を有するPEG化ヒドロゲルが得られた。方程式(2)に基づき、アミンの3.9%がPEG化されていた。
実施例9wは、40mgのヒドロゲル3g及び25mgの40kDaの分岐鎖状PEG-NHSにて、37℃における24時間の反応時間で、実施例9における一般的な手法に従って調製し、その後、追加の25mgの40kDaの分岐鎖状PEG-NHSを加え、反応をさらに37℃にて24時間進行させ、その後、追加の25mgの40kDaの分岐鎖状PEG-NHSを加え、反応をさらに24時間進行させ、その結果、37℃にて、0.118mmol/gのアミン含有量を有するPEG化ヒドロゲルが得られた。方程式(2)に基づき、アミンの4.1%がPEG化されていた。
実施例9xは、70mgのヒドロゲル3h及び89mgの40kDaの分岐鎖状PEG-NHSにて、48時間の反応時間で、実施例9における一般的な手法に従って調製し、その結果、0.108mmol/gのアミン含有量を有するPEG化ヒドロゲルが得られた。方程式(2)に基づき、アミンの6.0%がPEG化された。
実施例9yは、70mgのヒドロゲル3h及び133.6mgの60kDaの分岐鎖状PEG-NHSにて、48時間の反応時間で、実施例9における一般的な手法に従って調製し、その結果、0.114mmol/gのアミン含有量を有するPEG化ヒドロゲルが得られた。方程式(2)に基づき、アミンの3.6%がPEG化された。
実施例9zは、70mgのヒドロゲル3h及び89mgの40kDaのPEG-NHSにて、48時間の反応時間で、実施例9における一般的な手法に従って調製し、その結果、0.085mmol/gのアミン含有量を有するPEG化ヒドロゲルが得られた。方程式(2)に基づき、アミンの10.6%がPEG化された。
実施例9aaは、70mgのヒドロゲル3h及び44.5mgの20kDaのPEG-NHSにて、48時間の反応時間で、実施例9における一般的な手法に従って調製し、その結果、0.125mmol/gのアミン含有量を有するPEG化ヒドロゲルが得られた。方程式(2)に基づき、アミンの6.1%がPEG化された。
[実施例10]
水性条件下でのPEG化ヒドロゲルビーズの調製のための一般的手法
例えば、3aに記載された乾燥ヒドロゲルビーズを、フリット付シリンジ中に移し、NMP(5mL/100mgヒドロゲルビーズ)を加えた。ヒドロゲルを、温和な振盪下で、雰囲気温度にて10分間膨潤させた。溶媒を除去し、ヒドロゲルを50mMリン酸塩/アセトニトリルpH7.4で10回洗浄し、溶媒を毎回捨てた。
0.2当量(ヒドロゲルビーズのアミン含有量に基づく)のPEG-NHSを50mMリン酸塩/アセトニトリルpH7.4に溶解させた。溶液をシリンジ中に吸い取り、得られたヒドロゲル懸濁液を、温和な振盪下で、インキュベートした。溶媒を除去し、ヒドロゲルを50mMリン酸塩/アセトニトリルpH7.4(5mL/100mgヒドロゲルビーズ)で5回洗浄し、続いて、0.1%酢酸/0.01%Tween20(5mL/100mgヒドロゲルビーズ)での5回の洗浄サイクルを行った。新鮮な0.1%酢酸/0.01%Tween20をシリンジに入れて、最初の重量に基づいて10mg/mLのヒドロゲルビーズの懸濁液を得た。ヒドロゲルビーズのアミン含有量は前記したように決定した。方程式(2)に基づき、これは、PEG化の程度を指す。
実施例10aは、21.9mgのヒドロゲル3d及び44mgの60kDaの分岐鎖状PEG-NHSにて、20時間の反応時間で、実施例10における一般的手法に従って調製した。PEG化ヒドロゲルのアミン含有量は決定しなかった。
実施例10bは、40mgのヒドロゲル3g及び25mgの40kDaの分岐鎖状PEG-NHSにて、24時間の反応時間で、実施例10における一般的手法に従って調製し、その後、追加の25mgの40kDaの分岐鎖状PEG-NHSを加え、反応をさらに24時間進行させ、その後、追加の25mgの40kDaの分岐鎖状PEG-NHSを加え、反応をさらに24時間進行させ、その結果、0.136mmol /gのアミン含有量を有するPEG化ヒドロゲルが得られた。方程式(2)に基づき、アミンの1.8%がPEG化されていた。
[実施例11]
マレイミド官能性化PEG化ヒドロゲルビーズの調製のための一般的手法
PEG化に先立ってヒドロゲルビーズの最初の重量に基づいて10mg/mLの懸濁液としてのPEG化ヒドロゲルビーズを、フリット付シリンジ中に移した。溶媒を除去し、ヒドロゲルを水(5mL/100mgヒドロゲルビーズ)で10回洗浄し、溶媒を毎回捨てた。次いで、ヒドロゲルビーズをNMPで10回、及びNMP中の2%DIEAで5回洗浄した。5当量のMal-PEG6-Pfp(ヒドロゲルビーズのアミン含有量に基づく)をNMP(1mL/50mg試薬)に溶解させ、洗浄されたヒドロゲルビーズに加えた。ヒドロゲル懸濁液を室温にて2時間インキュベートした。得られたマレイミド官能性化ヒドロゲルビーズを、NMPで、その後、0.1%酢酸/0.01%Tween20で、各々、5回洗浄した。
ヒドロゲルビーズのマレイミド含有量は、Gude, M., J. Ryf, et al. (2002) Letters in Peptide Science 9(4): 203-206によって記載されているように、Fmoc-システインの、ヒドロゲル上のマレイミド基へのコンジュゲーション、及び引き続いてのFmoc-決定によって決定した。
実施例11aは、31.7mgのMal-PEG6-Pfpを用い、47mgの9d(乾燥重量3cに基づく)で出発し、実施例11に記載された一般的手法に従って調製した。
実施例11bは、31.7mgのMal-PEG6-Pfpを用い、47mgの9e(乾燥重量3cに基づく)で出発し、実施例11に記載された一般的手法に従って調製した。
実施例11cは、31.7mgのMal-PEG6-Pfpを用い、47mgの9f(乾燥重量3cに基づく)で出発し、実施例11に記載された一般的手法に従って調製した。
実施例11dは、13.5mgのMal-PEG6-Pfpを用い、25mgの9g(乾燥重量3dに基づく)で出発し、実施例11に記載された一般的手法に従って調製した。
実施例11eは、13.5mgのMal-PEG6-Pfpを用い、25mgの9h(乾燥重量3dに基づく)で出発し、実施例11に記載された一般的手法に従って調製した。
実施例11fは、13.5mgのMal-PEG6-Pfpを用い、25mgの9g(乾燥重量3dに基づく)で出発し、実施例11に記載された一般的手法に従って調製した。
実施例11gは、13.5mgのMal-PEG6-Pfpを用い、21.9mgの10a(乾燥重量3dに基づく)で出発し、実施例11に記載された一般的手法に従って調製した。
実施例11hは、13mgのMal-PEG6-Pfpを用い、35mgの9j(乾燥重量3fに基づく)で出発し、実施例11に記載された一般的手法に従って調製した。
実施例11iは、13mgのMal-PEG6-Pfpを用い、35mgの9k(乾燥重量3fに基づく)で出発し、実施例11に記載された一般的手法に従って調製した。
実施例11jは、13mgのMal-PEG6-Pfpを用い、35mgの9l(乾燥重量3fに基づく)で出発し、実施例11に記載された一般的手法に従って調製した。
実施例11kは、13mgのMal-PEG6-Pfpを用い、35mgの9m(乾燥重量3fに基づく)で出発し、実施例11に記載された一般的手法に従って調製した。
実施例11lは、13mgのMal-PEG6-Pfpを用い、35mgの9n(乾燥重量3fに基づく)で出発し、実施例11に記載された一般的手法に従って調製した。
実施例11mは、17mgのMal-PEG6-Pfpを用い、35mgの9o(乾燥重量3gに基づく)で出発し、実施例11に記載された一般的手法に従って調製した。
実施例11nは、17mgのMal-PEG6-Pfpを用い、35mgの9p(乾燥重量3gに基づく)で出発し、実施例11に記載された一般的手法に従って調製した。
実施例11oは、17mgのMal-PEG6-Pfpを用い、35mgの9q(乾燥重量3gに基づく)で出発し、実施例11に記載された一般的手法に従って調製した。
実施例11pは、17mgのMal-PEG6-Pfpを用い、35mgの9r(乾燥重量3gに基づく)で出発し、実施例11に記載された一般的手法に従って調製した。
実施例11qは、17mgのMal-PEG6-Pfpを用い、35mgの9s(乾燥重量3gに基づく)で出発し、実施例11に記載された一般的手法に従って調製した。
実施例11rは、13mgのMal-PEG6-Pfpを用い、25mgの9t(乾燥重量3gに基づく)で出発し、実施例11に記載された一般的手法に従って調製した。
実施例11sは、13mgのMal-PEG6-Pfpを用い、25mgの9u(乾燥重量3gに基づく)で出発し、実施例11に記載された一般的手法に従って調製した。
実施例11tは、13mgのMal-PEG6-Pfpを用い、25mgの9v(乾燥重量3gに基づく)で出発し、実施例11に記載された一般的手法に従って調製した。
実施例11uは、13mgのMal-PEG6-Pfpを用い、25mgの9w(乾燥重量3gに基づく)で出発し、実施例11に記載された一般的手法に従って調製した。
実施例11vは、13mgのMal-PEG6-Pfpを用い、25mgの10b(乾燥重量3gに基づく)で出発し、実施例11に記載された一般的手法に従って調製した。
実施例11wは、21mgのMal-PEG6-Pfpを用い、40mgの9x(乾燥重量3hに基づく)で出発し、実施例11に記載された一般的手法に従って調製した。
実施例11wは、21mgのMal-PEG6-Pfpを用い、40mgの9x(乾燥重量3hに基づく)で出発し、実施例11に記載された一般的手法に従って調製した。
実施例11xは、21mgのMal-PEG6-Pfpを用い、40mgの9y(乾燥重量3hに基づく)で出発し、実施例11に記載された一般的手法に従って調製した。
実施例11yは、21mgのMal-PEG6-Pfpを用い、40mgの9z(乾燥重量3hに基づく)で出発し、実施例11に記載された一般的手法に従って調製した。
実施例11zは、21mgのMal-PEG6-Pfpを用い、40mgの9aa(乾燥重量3hに基づく)で出発し、実施例11に記載された一般的手法に従って調製した。
[実施例12]
インスリンPEG化ヒドロゲルビーズの調製のための一般的手法
PEG化ヒドロゲルビーズは実施例9に従って合成した。次いで、0.1%酢酸/0.01%Tween20中の懸濁液としてのヒドロゲルビーズを、フリット付シリンジ中に移し、溶媒を捨てた。ヒドロゲルビーズを水(2mL/100mgヒドロゲルビーズ)で5回、NMP(2mL/10mgヒドロゲルビーズ)で5回、NMP中の2%DIEA(2mL/10mgヒドロゲルビーズ)で5回、及びDMSO(2mL/100mgヒドロゲルビーズ)で5回洗浄した。溶媒を毎回捨てた。ヒドロゲルビーズのアミン含有量に基づいて、3当量のN-マレイミドプロピオン酸NHS-エステルをDMSO(750μLのDMSO/10mgN-マレイミドプロピオン酸NHS-エステル)に溶解させ、溶液をシリンジ中に吸い込み、温和な振盪下で、雰囲気温度にて1.5時間インキュベートした。溶媒を捨て、ヒドロゲルビーズをDMSO(2mL/10mgヒドロゲルビーズ)及び0.1%酢酸/0.01%Tween20(2mL/10mgヒドロゲルビーズ)で5回洗浄した。溶媒を毎回捨てた。0.1%酢酸/0.01%Tween20の新鮮な溶液をシリンジ中に吸い込み、懸濁液をFalconチューブ中に移して、10mg/mLの最終濃度を得た。さらに使用するまで、懸濁液を4℃で保存した。
インスリンと6-トリチルメルカプトヘキサン酸NHS-エステルとのリンカーコンジュゲーション及びトリチル保護基の脱保護は、WO2011/012719の実施例10に記載された手法に従って行った。インスリン-リンカー-コンジュゲートのマレイミド官能性化ヒドロゲルビーズへのコンジュゲーションは、WO2011/012719の実施例11dcに記載された手法に従って行った。
実施例12aは、4.5mgの脱保護インスリン-リンカー-コンジュゲートを用い、10mgのヒドロゲル9a(3bの最初の乾燥重量に基づく)で出発し、実施例12における一般的手法に記載された手法に従って調製して、3.5mgのインスリン-リンカー-コンジュゲートが負荷されたPEG化ヒドロゲルを得た。
実施例12bは、4.5mgの脱保護インスリン-リンカー-コンジュゲートを用い、10mgのヒドロゲル9b(3bの最初の乾燥重量に基づく)で出発し、実施例12における一般的手法に記載された手法に従って調製して、3.5mgのインスリン-リンカー-コンジュゲートが負荷されたPEG化ヒドロゲルを得た。
実施例12cは、3.9mgの脱保護インスリン-リンカー-コンジュゲートを用い、10mgのヒドロゲル9c(3aの最初の乾燥重量に基づく)で出発し、実施例12における一般的手法に記載された手法に従って調製して、3.6mgのインスリン-リンカー-コンジュゲートが負荷されたPEG化ヒドロゲルを得た。
[実施例13]
IL-1RA PEG化ヒドロゲルビーズの調製のための一般的手法
商業的に入手可能なIL-1RA溶液は、PBS-T/5mM EDTA/pH6.5に向けて緩衝液交換した。
0.1%HOAc/0.01%Tween20中の懸濁液としてのマレイミド官能性化(PEG化)ヒドロゲルビーズを、フリット付シリンジに移した。溶媒を捨て、蛋白質溶液をシリンジに吸い込んだ。得られた懸濁液を、温和な振盪下で、雰囲気温度にてインキュベートした。溶媒を除去し、ヒドロゲルを1mLのPBS-T/5mM EDTA/pH6.5で10回洗浄し、溶媒を毎回捨てた。ヒドロゲルを10mMヒスチジン/10wt%α,α-トレハロース/0.01%Tween20/pH5.5で5回洗浄し、溶媒を毎回捨てた。ヒドロゲルを、毎回、10mMヒスチジン/10wt%α,α-トレハロース/0.01%Tween20/pH5.5中の1mLの1mM β-メルカプトエタノールで10回×3分処理し、溶媒を毎回捨てた。ヒドロゲルを2mLの10mMヒスチジン/10wt%α,α-トレハロース/0.01%Tween20/pH5.5で10回洗浄し、溶媒を毎回捨てた。引き続いて、ヒドロゲルを2mLのPBS-T pH7.4で5回洗浄し、溶媒を毎回捨てた。2mLの新鮮な緩衝液をシリンジ中に吸い取り、得られたヒドロゲル懸濁液をSarstedバイアルに移した。ヒドロゲル内のIL-1RA含有量は、A280吸収(IL-1RAの吸光係数:15.470 L/(モル×cm)、分子量17,260Da)を介して決定される、洗浄用液内でのIL-1RA含有量に相関する最初のIL-1RA含有量に基づいて計算して、蛋白質負荷を得た。
実施例13aは、9.3mgのIL-1RA及び5.2mgの11a(3cの乾燥重量に基づく)を用い、実施例13に記載された手法に従って調製して、その結果、8.8mgのIL-1RAが負荷されたヒドロゲルが得られた。
実施例13bは、9.4mgのIL-1RA及び5.6mgの11b(3cの乾燥重量に基づく)を用い、実施例13に記載された手法に従って調製して、その結果、8.9mgのIL-1RAが負荷されたヒドロゲルが得られた。
実施例13cは、9.4mgのIL-1RA及び5.6mgの11c(3cの乾燥重量に基づく)を用い、実施例13に記載された手法に従って調製して、その結果、8.6mgのIL-1RAが負荷されたヒドロゲルが得られた。
実施例13dは、7.7mgのIL-1RA及び4mgの11d(3dの乾燥重量に基づく)を用い、実施例13に記載された手法に従って調製して、その結果、5.3mgのIL-1RAが負荷されたヒドロゲルが得られた。
実施例13eは、7.7mgのIL-1RA及び4mgの11e(3dの乾燥重量に基づく)を用い、実施例13に記載された手法に従って調製して、その結果、4.7mgのIL-1RAが負荷されたヒドロゲルが得られた。
実施例13fは、7.7mgのIL-1RA及び4mgの11f(3dの乾燥重量に基づく)を用い、実施例13に記載された手法に従って調製して、その結果、4.5mgのIL-1RAが負荷されたヒドロゲルが得られた。
実施例13gは、8.3mgのIL-1RA及び5mgの11g(3dの乾燥重量に基づく)を用い、実施例13に記載された手法に従って調製して、その結果、6.3mgのIL-1RAが負荷されたヒドロゲルが得られた。
実施例13hは、9.3mgのIL-1RA及び5mgの8a(3eの乾燥重量に基づく)を用い、実施例13に記載された手法に従って調製して、その結果、3.4mgのIL-1RAが負荷されたヒドロゲルが得られた。
実施例13iは、9.3mgのIL-1RA及び5mgの8b(3eの乾燥重量に基づく)を用い、実施例13に記載された手法に従って調製して、その結果、3.8mgのIL-1RAが負荷されたヒドロゲルが得られた。
実施例13jは、19mgのIL-1RA及び10mgの11h(3fの乾燥重量に基づく)を用い、実施例13に記載された手法に従って調製して、その結果、11.2mgのIL-1RAが負荷されたヒドロゲルが得られた。
実施例13kは、19mgのIL-1RA及び10mgの11i(3fの乾燥重量に基づく)を用い、実施例13に記載された手法に従って調製して、その結果、11.7mgのIL-1RAが負荷されたヒドロゲルが得られた。
実施例13lは、19mgのIL-1RA及び10mgの11j(3fの乾燥重量に基づく)を用い、実施例13に記載された手法に従って調製して、その結果、12.0mgのIL-1RAが負荷されたヒドロゲルが得られた。
実施例13mは、19mgのIL-1RA及び10mgの11k(3fの乾燥重量に基づく)を用い、実施例13に記載された手法に従って調製して、その結果、11.8mgのIL-1RAが負荷されたヒドロゲルが得られた。
実施例13nは、19mgのIL-1RA及び10mgの11l(3fの乾燥重量に基づく)を用い、実施例13に記載された手法に従って調製して、その結果、12.4mgのIL-1RAが負荷されたヒドロゲルが得られた。
実施例13oは、15.1mgのIL-1RA及び10mgの11m(3gの乾燥重量に基づく)を用い、実施例13に記載された手法に従って調製して、その結果、10.7mgのIL-1RAが負荷されたヒドロゲルが得られた。
実施例13pは、15.1mgのIL-1RA及び10mgの11n(3gの乾燥重量に基づく)を用い、実施例13に記載された手法に従って調製して、その結果、11.5mgのIL-1RAが負荷されたヒドロゲルが得られた。
実施例13qは、15.1mgのIL-1RA及び10mgの11o(3gの乾燥重量に基づく)を用い、実施例13に記載された手法に従って調製して、その結果、12.0mgのIL-1RAが負荷されたヒドロゲルが得られた。
実施例13rは、15.1mgのIL-1RA及び10mgの11p(3gの乾燥重量に基づく)を用い、実施例13に記載された手法に従って調製して、その結果、11.9mgのIL-1RAが負荷されたヒドロゲルが得られた。
実施例13sは、15.1mgのIL-1RA及び10mgの11q(3gの乾燥重量に基づく)を用い、実施例13に記載された手法に従って調製して、その結果、10.7mgのIL-1RAが負荷されたヒドロゲルが得られた。
実施例13tは、11.7mgのIL-1RA及び5mgの11r(3gの乾燥重量に基づく)を用い、実施例13に記載された手法に従って調製して、その結果、8.0mgのIL-1RAが負荷されたヒドロゲルが得られた。
実施例13uは、11.7mgのIL-1RA及び5mgの11s(3gの乾燥重量に基づく)を用い、実施例13に記載された手法に従って調製して、その結果、6.7mgのIL-1RAが負荷されたヒドロゲルが得られた。
実施例13vは、11.7mgのIL-1RA及び5mgの11t(3gの乾燥重量に基づく)を用い、実施例13に記載された手法に従って調製して、その結果、11.5mgのIL-1RAが負荷されたヒドロゲルが得られた。
実施例13wは、11.7mgのIL-1RA及び5mgの11u(3gの乾燥重量に基づく)を用い、実施例13に記載された手法に従って調製して、その結果、7.6mgのIL-1RAが負荷されたヒドロゲルが得られた。
実施例13xは、11.7mgのIL-1RA及び5mgの11v(3gの乾燥重量に基づく)を用い、実施例13に記載された手法に従って調製して、その結果、7.9mgのIL-1RAが負荷されたヒドロゲルが得られた。
実施例13yは、27.9mgのIL-1RA及び15mgの11w(3hの乾燥重量に基づく)を用い、実施例13に記載された手法に従って調製して、その結果、20.9mgのIL-1RAが負荷されたヒドロゲルが得られた。
実施例13zは、27.9mgのIL-1RA及び15mgの11x(3hの乾燥重量に基づく)を用い、実施例13に記載された手法に従って調製して、その結果、20.0mgのIL-1RAが負荷されたヒドロゲルが得られた。
実施例13aaは、27.9mgのIL-1RA及び15mgの11y(3hの乾燥重量に基づく)を用い、実施例13に記載された手法に従って調製して、その結果、19.4mgのIL-1RAが負荷されたヒドロゲルが得られた。
実施例13bbは、27.9mgのIL-1RA及び15mgの11z(3hの乾燥重量に基づく)を用い、実施例13に記載された手法に従って調製して、その結果、18.3mgのIL-1RAが負荷されたヒドロゲルが得られた。
[実施例14]
ブロックされたヒドロゲルビーズ14
ヒドロゲルビーズは、WO2011/012715A1の実施例1に記載された手法に従って合成し、実施例7に記載された手法に従ってマレイミド基で官能性化した。その後、67.4mg/mLの10mLのヒドロゲル懸濁液を、フリット付20mLシリンジ中に移した。溶媒を除去し、ヒドロゲルを10mLの10mMヒスチジン/10wt%α,α-トレハロース/0.01%Tween20/pH5.5で5回洗浄した。溶媒を除去し、10mMヒスチジン/10wt%α,α-トレハロース/0.01%Tween20/pH5.5中の10mLの100mM β-メルカプトエタノールをシリンジ中に吸い込んだ。得られた懸濁液を、温和な振盪下で、雰囲気温度にて1時間インキュベートした。溶媒を捨て、ヒドロゲルを、毎回、10mLのPBS-T/pH7.4で10回洗浄し、溶媒を毎回捨てた。最後に、新鮮なPBS-T/pH7.4をシリンジ中に吸い込み、懸濁液をFalconチューブに移して、14を得た。
[実施例15]
ブロックされたヒドロゲルビーズ15
ヒドロゲルビーズは、実施例3hに記載された手法に従って合成し、実施例7に記載された手法に従ってマレイミド基で官能性化した。その後、10mg/mLの4mLのヒドロゲル懸濁液を、フリット付20mLシリンジに移した。溶媒を除去し、ヒドロゲルを、5mLの10mMヒスチジン/10wt%α,α-トレハロース/0.01%Tween20/pH5.5で10回洗浄した。溶媒を除去し、10mMヒスチジン/10wt%α,α-トレハロース/0.01%Tween20/pH5.5中の5mLの1mM β-メルカプトエタノールをシリンジ中に吸い込んだ。得られた懸濁液を、温和な振盪下で、雰囲気温度にて5分間インキュベートした。溶媒を捨て、ヒドロゲルを10mMヒスチジン/10wt%α,α-トレハロース/0.01%Tween20/pH5.5中の5mLの1mM β-メルカプトエタノールでさらに9回処理した。溶媒を毎回捨てた。次いで、ヒドロゲルビーズを、毎回、5mLの10mMヒスチジン/10wt%α,α-トレハロース/0.01%Tween20/pH5.5で10回洗浄し、溶媒を毎回捨てた。次いで、ヒドロゲルビーズを、毎回、5mLのPBS-T/pH7.4で10回洗浄し、溶媒を毎回捨てた。最後に、新鮮なPBS-T/pH7.4をシリンジ中に吸い込み、懸濁液をFalconチューブに移して、15を得た。
[実施例16]
IL-1raヒドロゲルビーズへの抗体の結合
PBS-T緩衝液中の20μLのヒドロゲル懸濁液(35容量%)を、1%BSA(Sigma、A3059)を含むPBS-T中の400μLの第1の抗体溶液と混合し、200rpmにおいて、1.5mLのエッペンチューブ中で1時間インキュベートした。IL-1raヒドロゲルビーズでは、抗体ab124962(抗-IL1RA抗体[EPR6483](ab124962)-Abcam、Cambridge、UK)の1:50希釈物を用いた。ヒドロゲルビーズを、卓上遠心機中で、遠心分離工程を介して100gにて1分間沈積させた。上清をピペッティングによって除去し、いずれのヒドロゲルビーズも除去しないように注意を払った。ビーズの洗浄は、1mLのPBS-T緩衝液の添加、100gにおける1分間の遠心分離、及びピペッティングによる上清の注意深い除去を含む2ラウンドの洗浄工程を介して達成した。1%BSA(Sigma、A3059)を含むPBS-T中の400μLの二次抗体をビーズに加え、200rpmで1時間インキュベートした。IL-1raヒドロゲルビーズでは、抗体sc-3750(ウシ抗ウサギIgG-PE、Santa Cruz Biotechnology Inc.、Santa Cruz、CA 95060 USA)の1:100希釈物を用いた。上清をピペッティングによって除去し、いずれのヒドロゲルビーズも除去しないように注意を払った。ビーズの洗浄は、1mLのPBS-T緩衝液の添加、100gにおける1分間の遠心分離、及びピペッティングによる上清の注意深い除去を含む4ラウンドの洗浄工程を介して達成された。洗浄されたビーズを200μLのPBS-T中に再懸濁させ、黒色の96-ウェルプレート(黒色、非結合、品目番号655900、Greiner bio-one GmbH、72636 Frickenhausen、ドイツ国)中に完全に移した。蛍光強度は、TecanのInfinite M200蛍光プレートリーダー(励起495nm、発光575nm、フラッシュの数25、積分時間20マイクロ秒、ウェル5×5当たり複数の読み(ボーダー250μm)、最適利得)で決定した。
データの解析
PEG-修飾IL-1raヒドロゲルビーズへの抗体の結合の決定は、修飾されていないIL-1RAヒドロゲルビーズの標準曲線との比較によって達成された。修飾されていないIL-1RAヒドロゲルビーズは、常に、PEG化試薬の添加を除いてはPEG化ヒドロゲルビーズと同一の条件下で調製した。修飾されていないIL-1RAヒドロゲルビーズは、異なる比で、プラセボヒドロゲルビーズ(実施例14又は実施例15)と混合した。実施例14は実施例16aから16iで用いた。実施例15は実施例16jから16bbで用いた。プロット(修飾されていないIL-1raヒドロゲルビーズ対蛍光強度の百分率)は直線様式でフィットさせた。PEG化IL-1raヒドロゲルビーズへの抗体の結合の百分率は、得られた較正曲線に従って逆算した。
実施例16aは、13aを用い、実施例16に記載された手法に従って調製した。
実施例16bは、13bを用い、実施例16に記載された手法に従って調製した。
実施例16cは、13cを用い、実施例16に記載された手法に従って調製した。
実施例16dは、13dを用い、実施例16に記載された手法に従って調製した。
実施例16eは、13eを用い、実施例16に記載された手法に従って調製した。
実施例16fは、13fを用い、実施例16に記載された手法に従って調製した。
実施例16gは、13gを用い、実施例16に記載された手法に従って調製した。
実施例16hは、13hを用い、実施例16に記載された手法に従って調製した。
実施例16iは、13iを用い、実施例16に記載された手法に従って調製した。
実施例16jは、13jを用い、実施例16に記載された手法に従って調製した。
実施例16kは、13kを用い、実施例16に記載された手法に従って調製した。
実施例16lは、13lを用い、実施例16に記載された手法に従って調製した。
実施例16mは、13mを用い、実施例16に記載された手法に従って調製した。
実施例16nは、13nを用い、実施例16に記載された手法に従って調製した。
実施例16oは、13oを用い、実施例16に記載された手法に従って調製した。
実施例16pは、13pを用い、実施例16に記載された手法に従って調製した。
実施例16qは、13qを用い、実施例16に記載された手法に従って調製した。
実施例16sは、13sを用い、実施例16に記載された手法に従って調製した。
実施例16tは、13tを用い、実施例16に記載された手法に従って調製した。
実施例16uは、13uを用い、実施例16に記載された手法に従って調製した。
実施例16vは、13vを用い、実施例16に記載された手法に従って調製した。
実施例16wは、13wを用い、実施例16に記載された手法に従って調製した。
実施例16xは、13xを用い、実施例16に記載された手法に従って調製した。
実施例16yは、13yを用い、実施例16に記載された手法に従って調製した。
実施例16zは、13zを用い、実施例16に記載された手法に従って調製した。
実施例16aaは、13aaを用い、実施例16に記載された手法に従って調製した。
実施例16bbは、13bbを用い、実施例16に記載された手法に従って調製した。
[実施例17]
インスリンヒドロゲルビーズへの抗体の結合
PBS-T緩衝液中の20μLのヒドロゲル懸濁液(35容量%)を、1%BSA(Sigma、A3059)を含むPBS-T中の400μLの第1の抗体溶液と混合し、1.5mLエッペンチューブ中にて200rpmで1時間インキュベートした。インスリンヒドロゲルビーズでは、抗体ab8302(抗インスリン抗体[7F8](ab8302)-Abcam、Cambridge、UK)の1:100希釈物を用いた。ヒドロゲルビーズは、卓上遠心機中で、遠心分離工程を介して、100gにて1分間沈積させた。上清をピペッティングによって除去し、いずれのヒドロゲルビーズも除去しないように注意を払った。ビーズの洗浄は、1mLのPBS-T緩衝液の添加、100gにおける1分間の遠心分離、及びピペッティングによる上清の注意深い除去を含む2ラウンドの洗浄工程を介して達成された。1%BSA(Sigma、A3059)を含むPBS-T中の400μLの二次抗体をビーズに加え、200rpmにおいて1時間インキュベートした。インスリンヒドロゲルビーズでは、抗体ab97041(ヤギ抗マウスIgG H&L(フィコエリスリン)予備吸着(ab97041)-Abcam、Cambridge、UK)の1:50希釈物を用いた。上清をピペッティングによって除去し、いずれのヒドロゲルビーズも除去しないように注意を払った。ビーズの洗浄は、1mLのPBS-T緩衝液の添加、100gにおける1分間の遠心分離、及びピペッティングによる上清の注意深い除去を含む4ラウンドの洗浄工程を介して達成された。洗浄されたビーズを200μLのPBS-Tに再懸濁させ、黒色96ウェルプレート(黒色、非結合、品目番号655900、Greiner bio-one GmbH、72636 Frickenhausen、ドイツ国)中に完全に移した。蛍光強度は、TecanのInfinite M200蛍光プレートリーダー(励起495nm、発光575nm、フラッシュの数25、積分時間20マイクロ秒、ウェル5×5当たり複数の読み(ボーダー250μm)、最適な利得)で決定した。
データの分析
PEG修飾インスリンヒドロゲルビーズへの抗体の結合の決定は、修飾されていないインスリンヒドロゲルビーズの標準曲線と比較して達成された。修飾されていないインスリンヒドロゲルビーズは、常に、PEG化試薬の添加を除いてPEG化ヒドロゲルビーズと同一の条件下で調製した。修飾されていないインスリンヒドロゲルビーズを、異なる比で、プラセボヒドロゲルビーズ(実施例14)と混合した。プロット(修飾されていないインスリンヒドロゲルビーズ対蛍光強度の百分率)は、直線様式でフィットさせた。PEG化インスリンヒドロゲルビーズへの抗体の結合の百分率は、得られた較正曲線に従って逆算した。
実施例17aは、インスリン負荷ヒドロゲル実施例12aを、フリット付2mLシリンジ中へ移すことによって調製した。溶媒を捨て、ヒドロゲルを、1mLのPBS-T緩衝液pH7.4で10回洗浄した。緩衝液を毎回捨てた。新鮮な緩衝液をシリンジ中に吸い取り、懸濁液をエッペンチューブ中に移した。ヒドロゲル懸濁液の密度は、PBS-T中35容量%に調整した。試料の分析は、実施例17に記載されたように行った。
実施例17bは、インスリン負荷ヒドロゲル実施例12bを、フリット付2mLシリンジ中へ移すことによって調製した。溶媒を捨て、ヒドロゲルを、1mLのPBS-T緩衝液pH7.4で10回洗浄した。緩衝液を毎回捨てた。新鮮な緩衝液をシリンジ中に吸い取り、懸濁液をエッペンチューブ中に移した。ヒドロゲル懸濁液の密度は、PBS-T中35容量%に調整した。試料の分析は、実施例17に記載されたように行った。
実施例17cは、インスリン負荷ヒドロゲル実施例12cを、フリット付2mLシリンジ中へ移すことによって調製した。溶媒を捨て、ヒドロゲルを、1mLのPBS-T緩衝液pH7.4で10回洗浄した。緩衝液を毎回捨てた。新鮮な緩衝液をシリンジ中に吸い取り、懸濁液をエッペンチューブ中に移した。ヒドロゲル懸濁液の密度は、PBS-T中35容量%に調整した。試料の分析は、実施例17に記載されたように行った。
Figure 2016516796
Figure 2016516796
略語
Boc tert-ブチルオキシカルボニル
BSA ウシ血清アルブミン
DCC ジシクロヘキシルカルボジイミド
DCM ジクロロメタン
DIPEA ジイソプロピルエチルアミン
DMAP 4-ジメチルアミノピリジン
DMSO ジメチルスルホキシド
EDTA エチレンジアミンテトラ酢酸
Fmoc フルオレニルメチルオキシカルボニル
Lys リシン
MTBE メチルtert.ブチルエーテル
NHS N-ヒドロキシスクシンイミド
NMP N-メチル-2-ピロリドン
PBS リン酸塩緩衝化生理食塩水
PBS-T リン酸塩緩衝化生理食塩水、Tween20
PEG ポリエチレングリコール
PP ポリプロピレン
TSTU テトラフルオロホウ酸O-(N-スクシンイミジル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム

Claims (15)

  1. ヒドロゲル連結プロドラッグにおける担体として適当なヒドロゲルを調製する方法であって、
    (a)同一又は異なる、好ましくは同一の官能基を表す基Ax0を有するヒドロゲルを準備する工程、
    (b)任意選択で、式(I):
    Ax1-SP2-Ax2 (I)
    [式中、
    SP2は、C1〜50アルキル、C2〜50アルケニル又はC2〜50アルキニルであり、前記C1〜50アルキル、C2〜50アルケニル及びC2〜50アルキニルは、-NH-、-N(C1〜4アルキル)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)NH、-C(O)N(C1〜4アルキル)-、-O-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、4から7員のヘテロシクリル、フェニル及びナフチルからなる群から選択される1つ以上の基によってで中断されていてもよく、
    Ax1は、ヒドロゲルのAx0との反応のための官能基であり、
    Ax2は、官能基である]
    のスペーサー試薬を、工程(a)からのヒドロゲルのAx0に共有結合によりコンジュゲートさせる工程、及び
    (c)工程(a)又は工程(b)のヒドロゲルを式(II):
    Ax3-Z (II)
    (式中、
    Ax3は、官能基であり、
    Zは、10Daから1000kDaの範囲の分子量を有する不活性部分である)
    の試薬と、Ax0又はAx2の最大99mol%がAx3と反応するように反応させる工程
    を含む方法。
  2. Ax0が、マレイミド、アミン(-NH2又はNH-)、ヒドロキシル(-OH)、チオール、カルボキシル(-COOH)及び活性化されたカルボキシル[-COY1、ここで、Y1は式(f-i)から(f-vi):
    Figure 2016516796
     (式中、
    破線は、分子の残りへの結合を示し、
    bは、1、2、3又は4であり、
    XHは、Cl、Br、I、又はFである)
    から選択される]
    からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
  3. 工程(a)のヒドロゲルが、
    (a-i)
    (a-ia)1から100kDaの範囲の分子量を有し、少なくとも3つの官能基Ax0を含み、ここで、各Ax0は、マレイミド、アミン(-NH2又はNH-)、ヒドロキシル(-OH)、カルボキシル(-COOH)又は活性化されたカルボキシル[-COY1、ここで、Y1は式(f-i)から(f-vi):
    Figure 2016516796
     (式中、
    破線は、分子の残りへの結合を示し、
    bは、1、2、3又は4であり、
    XHは、Cl、Br、I、又はFである)
    から選択される]
    である、少なくとも1つの骨格試薬、
    (a-ib)0.2から40kDaの範囲の分子量を有し、活性化されたエステル基、活性化されたカルバメート基、活性化されたカルボネート基、活性化されたチオカルボネート基、アミン基及びチオール基からなる群から選択される少なくとも2つの官能性末端基を含む少なくとも1つの架橋剤試薬
    を含む混合物を準備する工程であって、少なくとも1つの骨格試薬と少なくとも1つの架橋剤試薬の重量比が1:99から99:1の範囲であり、ここで、官能性末端基に対するAx0のモル比が>1である工程、
    (a-ii)工程(a-i)の混合物を重合してヒドロゲルとする工程、及び
    (a-iii)任意選択で、工程(a-ii)のヒドロゲルを後処理する工程
    を含む方法によって得ることができる、請求項1又は2に記載の方法。
  4. Ax0が、アミンであり、Ax1が、ClSO2-、R1(C=O)-、I-、Br-、Cl-、SCN-、CN-、O=C=N-、Y1-(C=O)-、Y1-(C=O)-NH-、又はY1-(C=O)-O-であり、
    R1は、H、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-8シクロアルキル、4から7員のヘテロシクリル、8から11員のヘテロビシクリル、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、又はテトラリニルであり、
    Y1は、式(f-i)から(f-vi):
    Figure 2016516796
     (式中、
    破線は、分子の残りへの結合を示し、
    bは、1、2、3又は4であり、
    XHは、Cl、Br、I、又はFである)
    から選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
  5. Ax2が、保護基を有していてもよい、-マレイミド、-SH、-NH2、-SeH、-N3、-C≡CH、-CR1=CR1aR1b、-OH、-(CH=X)-R1、-(C=O)-S-R1、-(C=O)-H、-NH-NH2、-O-NH2、-Ar-X0、-Ar-Sn(R1)(R1a)(R1b)、-Ar-B(OH)(OH)、Br、I、Y1-(C=O)-、Y1-(C=O)-NH-、Y1-(C=O)-O-、
    Figure 2016516796
    Figure 2016516796
    [式中、
    破線は、SP2への結合を示し、
    XはO、S、又はNHであり、
    X0は、-OH、-NR1R1a、-SH、又は-SeHであり、
    XHは、Cl、Br、I又はFであり、
    Arは、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、又はテトラリニルであり、
    R1、R1a、R1bは、相互に独立して、H、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-8シクロアルキル、4から7員のヘテロシクリル、8から11員のヘテロビシクリル、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、又はテトラリニルであり、
    Y1は、式(f-i)から(f-vi):
    Figure 2016516796
    Figure 2016516796
    (式中、
    破線は、分子の残りへの結合を示し、
    bは、1、2、3又は4であり、
    XHは、Cl、Br、I、又はFである)
    から選択される]
    からなる群から選択される、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
  6. Ax3が、-SH、-NH2、-SeH、-マレイミド、-C≡CH、-N3、-CR1=CR1aR1b、-(C=X)-R1、-OH、-(C=O)-S-R1、-NH-NH2、-O-NH2、-Ar-Sn(R1)(R1a)(R1b)、-Ar-B(OH)(OH)、-Ar-X0、
    Figure 2016516796
     [式中、
    破線は、Zへの結合を示し、
    Xは、O、S、又はNHであり、
    X0は、-OH、-NR1R1a、-SH、又はSeHであり、
    R1、R1a、R1bは、相互に独立して、H、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-8シクロアルキル、4から7員のヘテロシクリル、8から11員のヘテロビシクリル、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、又はテトラリニルであり、
    Arは、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、又はテトラリニルであり、
    Y1は、活性化されたカルボン酸、活性化されたカルボネート又は活性化されたカルバメートであり、好ましくは、Y1は、式(f-i)から(f-vi):
    Figure 2016516796
     (式中、
    破線は、分子の残りへの結合を示し、
    bは、1、2、3又は4であり、
    XHは、Cl、Br、I、又はFである)
    から選択される]
    からなる群から選択される、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
  7. Zが、0.5kDaから1000kDaの範囲である分子量を有する不活性なポリマーである、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
  8. Zが、2-メタクリロイル-オキシエチルホスホイルコリン、ポリ(アクリル酸)、ポリ(アクリレート)、ポリ(アクリルアミド)、ポリ(アルキルオキシ)ポリマー、ポリ(アミド)、ポリ(アミドアミン)、ポリ(アミノ酸)、ポリ(アンヒドリド)、ポリ(アスパルトアミド)、ポリ(酪酸)、ポリ(グリコール酸)、ポリブチレンテレフタレート、ポリ(カプロラクトン)、ポリ(カルボネート)、ポリ(シアノアクリレート)、ポリ(ジメチルアクリルアミド)、ポリ(エステル)、ポリ(エチレン)、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(リン酸エチル)、ポリ(エチルオキサゾリン)、ポリ(グリコール酸)、ポリ(アクリル酸ヒドロキシエチル)、ポリ(ヒドロキシエチルオキサゾリン)、ポリ(ヒドロキシメタクリレート)、ポリ(ヒドロキシプロピルメタクリルアミド)、ポリ(メタクリル酸ヒドロキシプロピル)、ポリ(ヒドロキシプロピルオキサゾリン)、ポリ(イミノカルボネート)、ポリ(乳酸)、ポリ(乳酸-co-グリコール酸)、ポリ(メタクリルアミド)、ポリ(メタクリレート)、ポリ(メチルオキサゾリン)、ポリ(オルガノホスファゼン)、ポリ(オルトエステル)、ポリ(オキサゾリン)、ポリ(プロピレングリコール)、ポリ(シロキサン)、ポリ(ウレタン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルアミン)、ポリ(ビニルメチルエーテル)、ポリ(ビニルピロリドン)、シリコーン、セルロース、カルボメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、キチン、キトサン、デキストラン、デキストリン、ゼラチン、ヒアルロン酸及び誘導体、官能性化ヒアルロン酸、マンナン、ペクチン、ラムノガラクツロナン、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン、ヒドロキシエチルデンプン及び他の炭水化物系ポリマー、キシラン、及びそれらのコポリマーからなる群から選択される不活性なポリマーである、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
  9. Zが、少なくとも70%PEGを含む不活性な直鎖状又は分岐鎖状PEG系ポリマーである、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
  10. 式(II)の試薬が、Ax0又はAx2に対して最大0.99化学当量の量で使用される、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
  11. 工程(c)において、反応速度がモニターされ、Ax0又はAx2に対して最大0.99化学当量が反応すると、反応が中断される、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
  12. Ax0又はAx2の20mol%以下がAx3と反応する、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
  13. 請求項1から12のいずれか一項に記載の方法から得ることができるヒドロゲル。
  14. ヒドロゲル連結プロドラッグ中の担体としての請求項13に記載のヒドロゲルの使用。
  15. 請求項13に記載の共有結合によりコンジュゲートされたヒドロゲルを含むヒドロゲル連結プロドラッグ。
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