JP2009523738A - Modified polymer - Google Patents
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Abstract
本発明は、制御された末端基化学量論を持つ高分子であって、表面層、少なくとも一つのサブ表面層、ならびに医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、および医薬活性剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基を含む少なくとも二つの末端基を含む高分子(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)に関する。The present invention is a polymer with controlled end group stoichiometry, comprising a surface layer, at least one sub-surface layer, and a first end group that is the residue of a pharmaceutically active agent, derivative or precursor thereof. And a polymer comprising at least two end groups comprising a second end group selected to modify the pharmacokinetics of the pharmaceutically active agent and / or polymer (in this case, end group stoichiometry is defined as end group stoichiometry) Number and type).
Description
本発明は、高分子、特に、あるトポロジー異性体の比率が濃縮されるようにその表面アーキテクチャを制御することができるデンドリマー、その製造、およびそれらの使用に関する。特に、本高分子は、二つ以上の表面基を持ち、その表面基の少なくとも一つは薬学的に活性であることができる。 The present invention relates to macromolecules, particularly dendrimers that can control their surface architecture so that the proportion of certain topological isomers is concentrated, their production, and their use. In particular, the polymer has two or more surface groups, and at least one of the surface groups can be pharmaceutically active.
医薬製剤に使用するための新化合物の同定は、より高い信頼性および有効性を持つ治療法の探索の重要な一部分である。しかし同じぐらい重要なのは、新薬候補に付随するリスクを低下させ、薬物を臨床開発に到達させるための開発およびコストを著しく低下させる、既知化合物の開発および修飾である。 The identification of new compounds for use in pharmaceutical formulations is an important part of the search for treatments with higher reliability and effectiveness. Of equal importance, however, is the development and modification of known compounds that reduce the risks associated with new drug candidates and significantly reduce the development and cost of bringing the drug to clinical development.
多くの薬物は、その物理的性質(特に溶解性)が製剤化を困難にするため、または治療係数が小さく、それが投薬直後に生じる高薬物濃度時の毒性作用を引き起こすため、臨床試験で失敗する。他の短所には、低い吸収性、低いバイオアベイラビリティ、不安定性、そして一旦投与されると薬物をターゲティングできないこと、その生体内分布、代謝および腎または肝クリアランスを制御できないことによる全身性副作用などがある。同様に、このような問題に関して、現在市販されている一部の製品を改良することができる。 Many drugs fail in clinical trials because their physical properties (especially solubility) make formulation difficult, or because the therapeutic index is small and it causes toxic effects at high drug concentrations that occur immediately after dosing To do. Other disadvantages include low absorption, low bioavailability, instability, and inability to target the drug once administered, systemic side effects due to inability to control its biodistribution, metabolism and renal or hepatic clearance. is there. Similarly, some products currently on the market can be improved with respect to such problems.
医薬化合物の特性を改良するために、リポソーム、ミセルまたはポリマーミセル製剤への医薬剤の処方、ならびに親水性ポリマーバックボーンへの医薬剤の共有結合など、いくつかのアプローチが試みられている。 Several approaches have been attempted to improve the properties of pharmaceutical compounds, including the formulation of pharmaceutical agents into liposomes, micelles or polymeric micelle formulations, as well as the covalent attachment of pharmaceutical agents to hydrophilic polymer backbones.
理想的な特性修飾剤の特徴としては、問題にしている化合物の吸収、分布、代謝および排泄(ADME)特徴(薬物動態ともいう)の正確な制御を可能にする明確に定義された構造であること、そして好適には、一つの薬剤またはコンストラクトにつき複数の化合物を保持できることが挙げられる。問題にしている化合物の毒性は、身体が治療的血漿中濃度の当該化合物にしか曝露されないように、前記薬剤またはコンストラクトからの当該化合物の放出を制御することによって、改善することができる。 The ideal property modifier features a well-defined structure that allows precise control of absorption, distribution, metabolism and excretion (ADME) characteristics (also known as pharmacokinetics) of the compound in question. And preferably the ability to hold more than one compound per agent or construct. The toxicity of the compound in question can be improved by controlling the release of the compound from the drug or construct so that the body is only exposed to therapeutic plasma concentrations of the compound.
近年、デンドリティック高分子は、バイオテクノロジーおよび薬学的用途への応用例が増えつつある。デンドリティック高分子は、単位分子体積あたりの官能基の濃度が通常のポリマーよりも高いことを特徴とする、高密度に分岐した構造を持つ特殊な種類のポリマーである。それぞれのデンドリティックアーキテクチャ中に存在する構造制御の相対的度合いに基づいて分類される四つの高分子サブクラス、すなわちランダム高分岐ポリマー;デンドリグラフト(dendrigraft)ポリマー;デンドリティックモチーフ;およびデンドリマーがある。特にデンドリマーは、高い分岐度、多価性、球状アーキテクチャおよび明確に定義された分子量などといった、そのユニークな性質ゆえに、薬物送達用の新しい足場として有望視されている。生体適合性デンドリマーの設計および合成ならびに薬物送達を含む生物科学の多くの分野へのそれらの応用に関する研究は、過去十年間に増加している。 In recent years, dendritic polymers have been increasingly applied to biotechnology and pharmaceutical applications. Dendritic polymers are a special type of polymer having a densely branched structure characterized by a higher concentration of functional groups per unit molecular volume than ordinary polymers. There are four polymeric subclasses that are classified based on the relative degree of structural control present in each dendritic architecture: random hyperbranched polymers; dendrigraft polymers; dendritic motifs; and dendrimers. In particular, dendrimers are promising as new scaffolds for drug delivery due to their unique properties such as high degree of branching, multivalency, spherical architecture and well-defined molecular weight. Research on the design and synthesis of biocompatible dendrimers and their application to many areas of bioscience, including drug delivery, has increased over the past decade.
薬物送達ベクターとしても、医薬活性物質としても、デンドリティックポリマーの潜在的有用性は、近年、ますます多くの関心を集めている1,18。しかし、文献には、例えばデンドリマーアセンブリのための合成スキームの報告、デンドリマー-薬物相互作用および薬物負荷効率の記述、ならびに、ますます増えつつあるデンドリマーと細胞株との相互作用のインビトロ評価が満載されているものの2,3、デンドリマーの基本的薬物動態および代謝運命を記述する情報はほとんどない。 The potential usefulness of dendritic polymers, both as drug delivery vectors and as pharmaceutically active substances, has attracted increasing interest in recent years 1,18 . However, the literature is packed with reports of synthetic schemes, for example for dendrimer assembly, a description of dendrimer-drug interactions and drug loading efficiencies, and an in vitro evaluation of the increasing interaction between dendrimers and cell lines. although it has few, there is little information describes the basic pharmacokinetic and metabolic fate of the dendrimer.
デンドリマーと腸組織との相互作用も、いくつかの研究の主題になっており4-11、表面電荷および表面官能性に伴う透過性および細胞毒性の傾向は確立されているものの、体循環に吸収された後のデンドリマーの運命を記述した研究は比較的少ない。これら数少ない研究のうち、GilliesらはPEG化された「蝶ネクタイ型(bow-tie)」ポリエステルデンドリマーの薬物動態を調べて、デンドリマークリアランスの機序が複合体の分子量および可撓性に強く依存することを明らかにし12、Kobayashiらは、重金属または抗体の複合体化(そしてそれゆえに生体イメージングへの応用)が容易になるように設計されたデンドリマーの生体内分布に構造変化が及ぼす影響を調べている13-17。しかし今のところ、ポリリジンデンドリマー固有の全身薬物動態は、詳細には記述されていない。 The interaction between dendrimers and intestinal tissue has also been the subject of several studies4-11 , but the permeability and cytotoxicity trends associated with surface charge and surface functionality have been established but are absorbed into the systemic circulation. Relatively few studies have described the fate of dendrimers after they were made. Among these few studies, Gillies et al. Investigated the pharmacokinetics of PEGylated “bow-tie” polyester dendrimers, and the mechanism of dendrimer clearance strongly depends on the molecular weight and flexibility of the complex 12 , Kobayashi et al. Investigated the effect of structural changes on the biodistribution of dendrimers designed to facilitate complexation of heavy metals or antibodies (and hence application to bioimaging). 13-17 . But so far, the specific systemic pharmacokinetics of polylysine dendrimers have not been described in detail.
さらに、ターゲット部位に蓄積するのに十分な時間、血中を循環するが、それと同時に、長期蓄積を避けるために適当な速度で身体から排除されうるようなデンドリマーを製造することも、依然として難問である。また、デンドリマーの組織局在化を前もって予測することは今なお困難であり、これらの性質に周縁デンドリティック基が及ぼす影響を決定するには、より多くの研究が必要である。研究が必要なもう一つの領域は、デンドリマーからの薬物の放出である。高密度な球状デンドリティックアーキテクチャに伴う立体障害が、酵素的に切断可能な結合の工作を困難にしている。 In addition, it remains a challenge to produce dendrimers that circulate in the blood for a time sufficient to accumulate at the target site, but at the same time can be eliminated from the body at an appropriate rate to avoid long-term accumulation. is there. In addition, it is still difficult to predict the tissue localization of dendrimers in advance, and more research is needed to determine the effect of peripheral dendritic groups on these properties. Another area that needs to be studied is the release of drugs from dendrimers. The steric hindrance associated with high-density spherical dendritic architecture makes it difficult to engineer enzymatically cleavable bonds.
したがって本発明の目的は、先行技術に関係する難点および/または欠点の一つ以上を克服し、または少なくとも軽減することである。 Accordingly, it is an object of the present invention to overcome or at least mitigate one or more of the difficulties and / or disadvantages associated with the prior art.
第1の態様として、本発明は、制御された末端基化学量論を持つ高分子であって、表面層、少なくとも一つのサブ表面層、ならびに
・医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、および
・医薬活性剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基
を含む少なくとも二つの末端基を含む高分子(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)を提供する。
As a first aspect, the present invention provides a polymer having controlled end group stoichiometry, comprising a surface layer, at least one sub-surface layer, and the remainder of a pharmaceutically active agent, derivative or precursor thereof. A first end group that is a group, and a polymer comprising at least two end groups including a second end group selected to modify the pharmacokinetics of the pharmaceutically active agent and / or polymer (in this case, the end group) Stoichiometry refers to the number and type of end groups.
さらにもう一つの実施形態において、本高分子は、さらに、制御されたトポロジーも示す(この場合、トポロジーは、高分子の表面層またはサブ表面層へのその接続という観点から見た、ある末端基ともう一つの末端基との関係を表す)。 In yet another embodiment, the polymer further exhibits a controlled topology (where the topology is a certain end group in terms of its connection to the surface layer or sub-surface layer of the polymer). And the relationship to another terminal group).
好ましい実施形態において、第2末端基は、ポリエチレングリコール(PEG)またはポリエチルオキサゾリン(例えばPEOX)を含みうる。 In preferred embodiments, the second end group can comprise polyethylene glycol (PEG) or polyethyloxazoline (eg, PEOX).
さらにもう一つの実施形態において、第2末端基は、以下の一つ以上から選択される:医薬活性剤および/または高分子の血漿中半減期を修飾する部分;一つ以上の細胞タイプまたは組織タイプへの医薬活性剤および/または高分子のターゲティングを容易にする部分;ならびに一つ以上の細胞タイプまたは組織タイプへの医薬活性剤および/または高分子の取り込みを容易にする部分。 In yet another embodiment, the second end group is selected from one or more of the following: a moiety that modifies the plasma half-life of the pharmaceutically active agent and / or macromolecule; one or more cell types or tissues A moiety that facilitates targeting of a pharmaceutically active agent and / or macromolecule to a type; and a moiety that facilitates incorporation of a pharmaceutically active agent and / or macromolecule into one or more cell types or tissue types.
好ましい実施形態において、第2末端基は、医薬活性剤および/または高分子の半減期が延びるように選択される。 In preferred embodiments, the second end group is selected such that the half-life of the pharmaceutically active agent and / or macromolecule is increased.
高分子は好ましくはデンドリマーであり、より好ましくはリジンデンドリマーである。 The polymer is preferably a dendrimer, more preferably a lysine dendrimer.
本発明のこの態様による高分子は、後述するさまざまな用途に利用することができ、その際、末端基化学量論および/またはトポロジーを制御できることは、医薬活性剤に一貫した薬物動態特性を与える上で有利である。 The polymers according to this aspect of the invention can be utilized in a variety of applications, as described below, where the ability to control end group stoichiometry and / or topology provides consistent pharmacokinetic properties to pharmaceutically active agents. This is advantageous.
本明細書および特許請求の範囲において使用する単数形「a」「an」および「the」は、文脈上そうでないことが明白である場合を除き、複数である指示対象を包含するものとする。したがって、例えば「高分子(a macromolecule)」への言及は、一つ以上のそれら高分子を包含する。 As used herein and in the claims, the singular forms “a”, “an”, and “the” are intended to include a plurality of referents unless the context clearly indicates otherwise. Thus, for example, reference to “a macromolecule” includes one or more of those polymers.
本明細書および特許請求の範囲において使用する用語「comprises(を含む)」(またはその文法的変形)は、用語「includes(を含む)」と等価であって、他の要素または特徴の存在を排除するものと解釈してはならない。 As used herein and in the claims, the term “comprises” (or grammatical variations thereof) is equivalent to the term “includes” and is intended to indicate the presence of other elements or features. Do not interpret it as excluded.
本明細書および特許請求の範囲において使用する用語「トポロジー」とは、高分子の表面層またはサブ表面層へのそれらの接続という観点から見た、ある末端基ともう一つの末端基との関係を意味するものとする。 As used herein and in the claims, the term “topology” refers to the relationship between one end group and another end group in terms of their connection to a surface layer or subsurface layer of polymers. Means.
本明細書および特許請求の範囲において使用する用語「トポロジー異性体」とは、ある特定のトポロジーを持つ高分子を意味するものとする。 As used herein and in the claims, the term “topological isomer” shall mean a polymer having a certain topology.
本明細書および特許請求の範囲において使用する用語「表面」とは、「末端基」または「キャッピング」基と反応しうる表面アミンを有する世代構築単位の層を意味するものとする。 As used herein and in the claims, the term “surface” shall mean a layer of generational building units having surface amines that can react with “end groups” or “capping” groups.
本明細書および特許請求の範囲において使用する用語「サブ表面」とは、表面層の下にある単数または複数の層を意味するものとする。 As used herein and in the claims, the term “subsurface” shall mean one or more layers below the surface layer.
本明細書および特許請求の範囲において使用する用語「表面アミン」とは、デンドリマーの任意の表面反応可能アミン基を意味するものとする。 As used herein and in the claims, the term “surface amine” is intended to mean any surface-reactive amine group of a dendrimer.
本明細書および特許請求の範囲において使用する用語「末端基化学量論」とは、高分子の表面上にある末端基の組成(数およびタイプ)を意味するものとする。 As used herein and in the claims, the term “end group stoichiometry” shall mean the composition (number and type) of end groups on the surface of the polymer.
本明細書および特許請求の範囲において使用する用語「世代構築単位」とは、デンドリマーの骨組みを形成する繰り返し単位、例えばリジンデンドリマーの場合であればリジンまたはリジン類似体を意味するものとする。 As used herein and in the claims, the term “generation building unit” is intended to mean a repeating unit that forms a dendrimer framework, such as lysine or lysine analogs in the case of lysine dendrimers.
本明細書および特許請求の範囲において使用する用語「デンドリティックモチーフ」は、高分子の不連続なセグメントを意味するものとする。世代構築単位またはコアの反応可能アミンの一つを、取付けられた世代構築単位のカルボキシルに接続している結合において、高分子分岐の一つが切断されると、デンドリティックモチーフが放出されることになる。デンドリティックモチーフのカルボキシルは、本発明の高分子を合成するプロセスにおいて、その位置をもって、デンドリティックモチーフが成長中の高分子コアに取付けられる、ユニークな点(point)または頂端(apex)に相当する。 As used herein and in the claims, the term “dendritic motif” is intended to mean a discontinuous segment of a macromolecule. The dendritic motif is released when one of the polymer branches is cleaved at the bond connecting one of the generation building units or core reactive amines to the carboxyl of the attached generation building unit. Become. The carboxyl of the dendritic motif corresponds to a unique point or apex where, in the process of synthesizing the polymer of the present invention, the dendritic motif is attached to the growing polymer core. .
本発明での使用には、どの高分子でも適しうる。高分子は、アルボロール(arborol)、デンドリグラフト、PAMAMデンドリマー、リジンデンドリマーなどを含む一つ以上のデンドリティックポリマーから選択することができる。 Any polymer can be suitable for use in the present invention. The macromolecule can be selected from one or more dendritic polymers including arborol, dendrigrafts, PAMAM dendrimers, lysine dendrimers and the like.
デンドリマーポリマーの製造はよく知られており、例えば、米国特許第4,289,872号および同第4,410,688号(リジン単位の層に基づくデンドリマーポリマーが記述されている)や、米国特許第4,507,466号、同第4,558,120号、同第4,568,737号および同第4,587,329号(ポリアミドアミンまたはPAMAMデンドリマーポリマーを含む、他の単位に基づくデンドリマーポリマーが記述されている)に記述されている。これらの米国特許に開示されているデンドリマーポリマーは、表面修飾剤、金属キレート剤、解乳化剤または油/水エマルション、紙の製造における湿潤強度向上剤(wet strength agent)、および塗料などの水性製剤における粘度を修飾するための薬剤などといった用途に適していると記載されている。また、米国特許第4,289,872号および第4,410,688号には、リジン単位に基づくデンドリマーポリマーを、医薬製剤を製造するための基剤として使用しうることも、示唆されている。 The preparation of dendrimer polymers is well known, for example, U.S. Pat. Nos. 4,289,872 and 4,410,688 (describing dendrimer polymers based on layers of lysine units), U.S. Pat. Nos. 4,507,466, 4,558,120. No. 4,568,737 and No. 4,587,329, which describe dendrimer polymers based on other units, including polyamidoamines or PAMAM dendrimer polymers. The dendrimer polymers disclosed in these US patents are used in aqueous formulations such as surface modifiers, metal chelators, demulsifiers or oil / water emulsions, wet strength agents in paper manufacture, and paints. It is described as being suitable for uses such as drugs for modifying viscosity. US Pat. Nos. 4,289,872 and 4,410,688 also suggest that dendrimer polymers based on lysine units can be used as a base for manufacturing pharmaceutical formulations.
以下に、デンドリマー(特にポリリジンに基づくもの)に関して、本発明を詳細に説明する。 In the following, the present invention is described in detail with respect to dendrimers (especially those based on polylysine).
任意の与えられた応用におけるデンドリマーの効力の重要な決定因子の一つは、高分子表面の性質である。出願人らは、驚くべきことに、一定の医薬化合物を明確に定義され制御されたプロセスでデンドリマーにコンジュゲートすることによって、それら一定の医薬化合物の吸収、分布、代謝および排泄(ADME)特性を修飾する技法を発見した。より具体的には、デンドリマーのサイズおよび/または表面官能性を修飾することで、薬物の排泄(クリアランス)、分布および代謝(吸収および再吸収)特性を調節することができる。本発明のプロセスでは、その薬物に特有の要求を満たすためにさまざまでありうる正確な構造を製造することが可能である。さらにまた、薬物負荷量を高め、より多様な治療法に対応することができるように、複数の分子を制御された様式でデンドリマーに取付けることもできる。デンドリマーの世代数を変化させることによって、薬物負荷をさらに修飾することもできる。 One important determinant of dendrimer efficacy in any given application is the nature of the polymer surface. Applicants have surprisingly determined the absorption, distribution, metabolism and excretion (ADME) properties of certain pharmaceutical compounds by conjugating them to dendrimers in a well-defined and controlled process. I found a technique to modify. More specifically, modification of dendrimer size and / or surface functionality can regulate drug excretion (clearance), distribution and metabolic (absorption and reabsorption) properties. The process of the present invention makes it possible to produce precise structures that can vary to meet the unique requirements of the drug. Furthermore, multiple molecules can be attached to the dendrimer in a controlled manner to increase drug loading and accommodate a wider variety of therapies. Drug loading can be further modified by changing the number of generations of dendrimers.
アンキャップト3H標識ポリ-L-リジンデンドリマーは、静脈内投与後に、遊離リジンへと迅速に代謝されることが、以前の研究によって示唆されている。しかし、驚くべきことに、デンドリマーをPEG化すると、タンパク質分解酵素ならびに血清タンパク質によるデンドリマーの認識が低下して、食細胞によるクリアランスが抑制され、その結果、血漿循環時間は延びることが証明された。さらにまた、PEG化は、デンドリマーの流体力学的容積を増加させ、その結果として、腎クリアランスを低下させうる。 Previous studies have suggested that uncapped 3 H-labeled poly-L-lysine dendrimers are rapidly metabolized to free lysine after intravenous administration. Surprisingly, however, PEGylation of dendrimers has been shown to reduce dendrimer recognition by proteolytic enzymes as well as serum proteins and suppress phagocytic clearance, resulting in increased plasma circulation time. Furthermore, PEGylation can increase the hydrodynamic volume of the dendrimer and consequently reduce renal clearance.
例えば本発明者らは、3H標識PEG化リジンデンドリマーの血漿中半減期および尿排除の程度が、分子量に依存することを見出した。小さいデンドリマー複合体が、高分子量種の生成につながる血漿成分との相互作用の徴候を示したという事実にもかかわらず、小さいデンドリマー(すなわち<20kD)と比較して、大きいPEG化デンドリマー(すなわち>30kD)の方が、血漿から尿中に相対的にゆっくりと除去された。これらの複合体の排除は迅速であり、完全なデンドリマーだけが尿中に回収された。さらに本発明者らは、医薬活性成分およびPEG基をデンドリマーの表面に取付けた場合、網内系による取り込みをそのデンドリマーが回避できるかどうかは、デンドリマー表面に取付けられたPEG基のサイズが決定しうることも観察した。したがって、何らかの手段でサイズを増やすことが、必ずしもそのデンドリマーの血漿中寿命を延ばす結果にならないことは、明らかである。大きいデンドリマーは肝臓および脾臓に蓄積することがわかった。しかしこれは、長期間にわたって起こり、蓄積した量は投与量の10%未満だった。 For example, the inventors have found that the plasma half-life and degree of urinary exclusion of 3 H-labeled PEGylated lysine dendrimers are dependent on molecular weight. Despite the fact that small dendrimer complexes showed signs of interaction with plasma components leading to the generation of high molecular weight species, large PEGylated dendrimers (ie,> 20 kD) compared to small dendrimers (ie, <20 kD) 30 kD) was removed relatively slowly from plasma into urine. The elimination of these complexes was rapid and only complete dendrimers were recovered in the urine. Furthermore, the present inventors determined that the size of the PEG group attached to the surface of the dendrimer determines whether the dendrimer can avoid uptake by the intranet system when the pharmaceutically active ingredient and the PEG group are attached to the surface of the dendrimer. We also observed stagnation. Thus, it is clear that increasing the size by some means does not necessarily result in extending the plasma lifetime of the dendrimer. Large dendrimers were found to accumulate in the liver and spleen. However, this occurred over a long period of time and the accumulated amount was less than 10% of the dose.
さらにもう一つの好ましい実施形態において、PEGまたはポリエチルオキサゾリン末端基は、デンドリマー上の末端基の約25%〜75%、より好ましくは約25%〜50%を構成しうる。個々のPEGまたはポリエチルオキサゾリン基の相対サイズを増やすことで、必要な血漿中寿命を維持し、肝取り込みを回避することができる。異なる医薬活性剤に適合するように、PEGまたはポリエチルオキサゾリン基のパーセンテージおよび/またはPEGまたはポリエチルオキサゾリン基のサイズを修飾し、適応させることができる。 In yet another preferred embodiment, the PEG or polyethyloxazoline end groups may comprise about 25% to 75%, more preferably about 25% to 50% of the end groups on the dendrimer. Increasing the relative size of individual PEG or polyethyloxazoline groups can maintain the required plasma life span and avoid liver uptake. The percentage of PEG or polyethyloxazoline groups and / or the size of PEG or polyethyloxazoline groups can be modified and adapted to suit different pharmaceutically active agents.
好ましい実施形態において、PEG基は比較的単分散であって、200〜10,000ダルトンの分子量範囲から選択され、より好ましくは、PEG基は500〜5,000ダルトンの分子量範囲から選択される。 In a preferred embodiment, the PEG groups are relatively monodisperse and are selected from a molecular weight range of 200 to 10,000 daltons, more preferably the PEG groups are selected from a molecular weight range of 500 to 5,000 daltons.
PEG化は、化合物の溶解性を改善することもでき、それゆえに、デンドリマーの表面にコンジュゲートされた本来ならば不溶性である薬物の溶解性を助長することができる。 PEGylation can also improve the solubility of the compound and thus promote the solubility of the inherently insoluble drug conjugated to the surface of the dendrimer.
したがって本発明は、高い毒性もしくは低い溶解性またはその両方を持つ薬物を工作して、長期薬物濃度が治療的ではあるが毒性ではない血漿中レベルに維持されるように当該薬物を制御放出させるであろうビヒクルが得られるようにする手段を提供する。 Thus, the present invention engineered drugs with high toxicity and / or low solubility to allow controlled release of such drugs so that long-term drug concentrations are maintained at plasma levels that are therapeutic but not toxic. Providing a means to get a promising vehicle.
二つの異なる末端基を保持するデンドリマーは、異なるトポロジー異性体として製造することができる(この場合、トポロジーは、表面層およびサブ表面層へのその接続という観点から見た、ある末端基ともう一つの末端基との関係を表す)。二つ以上の異なる末端基を保持するデンドリマーはAU2005905908に開示されており、その開示は全て参照により本明細書に組み入れられる。各トポロジー異性体とある複雑系との相互作用の仕方は異なりうる。したがって、異なる応用のために、異なる末端基の表面分布を制御できることは、有利になりうる。 Dendrimers carrying two different end groups can be produced as different topological isomers (in this case, the topology is one end group different from the other in terms of its connection to the surface and subsurface layers). Represents the relationship with two end groups). Dendrimers bearing two or more different end groups are disclosed in AU2005905908, the entire disclosure of which is hereby incorporated by reference. The way each topological isomer interacts with a complex system can vary. Therefore, it may be advantageous to be able to control the surface distribution of different end groups for different applications.
デンドリティック高分子試料において同じトポロジーを持つ分子を濃縮できることは、有機物質において特定の立体異性体を濃縮することが、とりわけ生物学的応用にとって、望ましいことが示されているのと同じように望ましいだろう。したがって、高分子中のあるトポロジー異性体は、ある与えられた応用においては、別のトポロジー異性体よりも有効でありうる。 The ability to concentrate molecules with the same topology in dendritic polymer samples is as desirable as enrichment of specific stereoisomers in organic materials has been shown to be particularly desirable for biological applications right. Thus, one topology isomer in a polymer may be more effective than another topology isomer in a given application.
二つ以上の異なる末端基を持つデンドリマーを製造するための先行技術の方法では、ランダム表面官能化法を使った合成が行われる。 Prior art methods for producing dendrimers having two or more different end groups involve synthesis using random surface functionalization methods.
第1の先行技術アプローチでは、高分子の表面上にある反応性末端アミン部分(表面アミン)の半分だけをキャッピングする試みとして、準化学量論量の第1活性末端基を使用する。次に、残りの表面アミンを反応させることができ、この第2の反応では、反応を完了させるために、過剰量の第2活性末端基を使用することができる。このアプローチでは、反応の第1段階から生じるさまざまな末端基化学量論を持つ生成物の統計的分布が起こる上、二つの異なる末端基のトポロジーはほとんどまたは全く制御されない。 The first prior art approach uses a substoichiometric amount of the first active end group in an attempt to cap only half of the reactive terminal amine moiety (surface amine) on the surface of the polymer. The remaining surface amine can then be reacted, and in this second reaction, an excess amount of the second active end group can be used to complete the reaction. This approach results in a statistical distribution of products with different end group stoichiometry resulting from the first stage of the reaction, and little or no control over the topology of the two different end groups.
また、第2の先行技術アプローチでは、両方の末端基を反応性表面アミン部分と同時に反応させることができる。そのようなアプローチでは、各末端基の異なる反応性を考慮して各末端基の化学量論を調節することが可能であるだろうが、脱保護された窒素基との反応には二タイプ以上の世代構築単位または二つ以上の末端基を利用することができるので、分子間変動は依然として生じることになり、したがって、各反応の蓋然的結果は統計的分布によって記述することしかできず、ここでも、反応のトポロジー結果は制御されない。 Also, in the second prior art approach, both end groups can be reacted simultaneously with a reactive surface amine moiety. In such an approach, it would be possible to adjust the stoichiometry of each end group to account for the different reactivity of each end group, but there are more than two types of reactions with deprotected nitrogen groups. Generational building units or more than one end group can be utilized, so intermolecular variability will still occur, so the probable outcome of each reaction can only be described by a statistical distribution, here But the reaction topology results are not controlled.
先行技術のランダム表面官能化と比較して、正確に指定された末端基を持つデンドリティック部分の存在分率が、ランダムに表面官能化された物質におけるそれらの存在分率よりも、少なくとも2倍(2倍の単分散度)、好ましくは4倍(4倍の単分散度)高い場合、その高分子は「濃縮されている」とみなされる。末端基について例示した濃縮の概念は、AU2005905908(その内容は全て参照により本明細書に組み入れられる)に詳述されている表面カプレット、カルテットおよびオクテットなどにも適用することができる。高分子は、特定の末端基化学量論および/またはトポロジーについて濃縮することができる。 Compared to prior art random surface functionalization, the abundance of dendritic moieties with precisely specified end groups is at least 2 times higher than their abundance in randomly surface functionalized materials A polymer is considered "concentrated" if it is high (2 times monodispersity), preferably 4 times (4 times monodispersity). The enrichment concept illustrated for the end groups can also be applied to the surface couplets, quartets, octets, etc., detailed in AU2005905908, the contents of which are hereby incorporated by reference in their entirety. Macromolecules can be enriched for specific end group stoichiometry and / or topology.
末端基化学量論の濃縮が最大レベルに達すると、各高分子は同じ組成(数およびタイプ)の末端基を持つことになる。濃縮レベルがそれほどでもない場合、例えば20%濃縮されている場合、これは高分子の20%が同じ組成(数およびタイプ)の末端基を持つことを意味すると解釈される。 When the end group stoichiometry enrichment reaches a maximum level, each macromolecule will have end groups of the same composition (number and type). If the concentration level is not so great, for example 20% enriched, this is taken to mean that 20% of the macromolecules have end groups of the same composition (number and type).
もう一つの選択肢として、この濃縮は、組成を、ランダムに官能化された高分子組成と比較することによって指定することもできる。例えば、ランダム法によって高分子の5%に特定の表面組成が与えられるとすると、濃縮は、この5%レベルを超える特定の末端基組成(数およびタイプ)を持つ高分子の増加を構成することになるだろう。したがって、2倍濃縮とは、その特定末端基組成を高分子の10%が示したことを意味するだろう。 As another option, this concentration can be specified by comparing the composition with a randomly functionalized polymeric composition. For example, if the random method gives 5% of the polymer a specific surface composition, the enrichment constitutes an increase in the polymer with a specific end group composition (number and type) above this 5% level. Will be. Thus, a 2-fold enrichment would mean that 10% of the macromolecule showed its specific end group composition.
最も簡単なタイプのトポロジー濃縮は、カプレットレベルでの濃縮である。デンドリマー組成は、末端基のレベルでは完全に濃縮されていても、カプレットのレベルでは完全には濃縮されていない場合がある。これは、同じ末端基をいくつかの形でカプレットにグループ分けしうるからである。例えば、図9.1〜9.5のいずれにおいても、デンドリマーは16個の末端A基および16個の末端B基を含有している。しかし、図9.1〜9.4では8個の(AA)カプレットおよび8個の(BB)カプレットが存在するのに対して、図9.5では16個の(AB)カプレットが存在する。より高次のトポロジー濃縮は、カルテット、オクテットおよび16テットのレベルでの濃縮であり、これはAU2005905908に詳述されている。 The simplest type of topology enrichment is at the couplet level. The dendrimer composition may be fully enriched at the end group level, but not fully enriched at the caplet level. This is because the same end groups can be grouped into couplets in several ways. For example, in any of FIGS. 9.1-9.5, the dendrimer contains 16 terminal A groups and 16 terminal B groups. However, there are 8 (AA) and 8 (BB) couplets in FIGS. 9.1-9.4, whereas in FIG. 9.5 there are 16 (AB) couplets. Higher order topological enrichment is enrichment at the quartet, octet and 16-tet levels, which is detailed in AU2005905908.
もう一つの態様では、表面層および少なくとも一つのサブ表面層を持つ、少なくとも一つのリジンまたはリジン類似体デンドリティックモチーフを含む高分子であって、
・医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、および
・医薬活性剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基
を含む少なくとも二つの末端基を含む高分子(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)が提供される。
In another embodiment, a polymer comprising at least one lysine or lysine analog dendritic motif having a surface layer and at least one sub-surface layer comprising:
A first terminal group that is the residue of a pharmaceutically active agent, derivative or precursor thereof, and Macromolecules comprising one end group (where end group stoichiometry refers to the number and type of end groups) are provided.
本発明のこの態様のさらにもう一つの実施形態において、高分子は、さらに、制御されたトポロジーも示す(この場合、トポロジーは、高分子の表面層またはサブ表面層へのその接続という観点から見た、ある末端基ともう一つの末端基との関係を表す)。 In yet another embodiment of this aspect of the invention, the polymer further exhibits a controlled topology (where the topology is in terms of its connection to the surface layer or sub-surface layer of the polymer). Represents a relationship between one terminal group and another terminal group).
好ましい実施形態において、第2末端基は、ポリエチレングリコール(PEG)またはポリエチルオキサゾリン(例えばPEOX)モチーフを含みうる。 In preferred embodiments, the second end group can comprise a polyethylene glycol (PEG) or polyethyloxazoline (eg, PEOX) motif.
さらにもう一つの実施形態において、第2末端基は、医薬活性剤の血漿中半減期を修飾するために選択される。好ましい実施形態において、第2末端基は、医薬活性剤の半減期が延びるように選択される。 In yet another embodiment, the second end group is selected to modify the plasma half-life of the pharmaceutically active agent. In preferred embodiments, the second end group is selected to increase the half-life of the pharmaceutically active agent.
さらにもう一つの実施形態において、第2末端基は、一つ以上の細胞タイプまたは組織タイプへの医薬活性剤のターゲティングおよび/または取り込みが容易になるように選択される。 In yet another embodiment, the second end group is selected to facilitate targeting and / or uptake of the pharmaceutically active agent to one or more cell types or tissue types.
本発明のもう一つの態様では、制御されたキャッピング基化学量論および式:
コア[繰り返し単位]m[表面構築単位]n[キャッピング基1]p[キャッピング基2]q
[式中、
コアは、リジン、もしくはその誘導体、ジアミン化合物、トリアミン化合物またはテトラアミン化合物からなる群より選択され;
繰り返し単位は、アミドアミン、リジンまたはリジン類似体からなる群より選択され;
表面構築単位は、構築単位のものと同じであっても異なってもよく、アミドアミン、リジンまたはリジン類似体から選択され;
キャッピング基1は医薬活性剤、その誘導体、その前駆体またはその残基であり;
キャッピング基2は医薬活性剤の薬物動態を修飾するために選択され;
mはデンドリマーの1または複数のサブ表面層の繰り返し単位の和を表し、1〜32の整数であり;
nはデンドリマーの1または複数の表面層の表面構築単位の数を表し、2〜32の整数であり;
pはキャッピング基1基の数を表し、1〜64の整数であり;
qはキャッピング基2基の数を表し、1〜64の整数である]
を持つデンドリマー(この場合、キャッピング基化学量論とは、キャッピング基の数およびタイプを指す)が提供される。
In another embodiment of the invention, controlled capping group stoichiometry and formula:
Core [repeating unit] m [surface building unit] n [capping group 1] p [capping group 2] q
[Where:
The core is selected from the group consisting of lysine, or derivatives thereof, diamine compounds, triamine compounds or tetraamine compounds;
The repeat unit is selected from the group consisting of amidoamine, lysine or lysine analogs;
The surface building unit may be the same as or different from that of the building unit and is selected from amidoamine, lysine or lysine analogues;
Capping
Capping
m represents the sum of repeating units of one or more subsurface layers of the dendrimer and is an integer from 1 to 32;
n represents the number of surface building units of one or more surface layers of the dendrimer and is an integer from 2 to 32;
p represents the number of one capping group and is an integer from 1 to 64;
q represents the number of two capping groups and is an integer from 1 to 64]
(In this case, capping group stoichiometry refers to the number and type of capping groups).
デンドリマーポリマーのコアは、任意の適切な化合物から選択することができる。好ましくは、コアは、リジン、もしくはその誘導体、ジアミン化合物、トリアミン化合物、またはテトラアミン化合物から選択される。最も好ましくは、コアは、ベンズヒドリルアミド-リジン(BHALys)、または
から選択される化合物である。
The core of the dendrimer polymer can be selected from any suitable compound. Preferably, the core is selected from lysine or derivatives thereof, diamine compounds, triamine compounds, or tetraamine compounds. Most preferably, the core is benzhydrylamide-lysine (BHALys), or
Is a compound selected from
本発明のこの実施形態による繰り返し単位は、好ましくは、
の一つ以上から選択することができる。
The repeating unit according to this embodiment of the invention is preferably
You can choose from one or more.
本発明の好ましい一態様では、デンドリマーがリジンコアまたはリジン類似体コアを持つ。リジンデンドリティックコアは、以下の式:
デンドリマーは、PAMAMポリマー、例えばPAMAM32、繰り返し単位が[Lys]Qまたは[Su(NPN)2]Qであるリジンまたはリジン類似体ポリマー[式中、Qは、2価コアでは2、6、14、30または32の整数であり、3価コアでは3、9、21または45の整数である]であることができる。 Dendrimers are PAMAM polymers, such as PAMAM 32 , lysine or lysine analog polymers where the repeating unit is [Lys] Q or [Su (NPN) 2 ] Q , where Q is 2, 6, 14 for the divalent core. , 30 or 32, and in the case of a trivalent core, it is an integer of 3, 9, 21 or 45].
本発明のデンドリマーは必要な数の世代にわたって拡がりうる。好ましくはデンドリマーは1〜5世代、より好ましくは1〜3世代にわたって拡がる。 The dendrimers of the present invention can be spread over as many generations as necessary. Preferably the dendrimer extends over 1-5 generations, more preferably 1-3 generations.
本発明の高分子(特にデンドリマー)の医薬活性剤は、水不溶性医薬、水溶性医薬、親油性医薬、またはその混合物を含みうる。 The polymeric (especially dendrimer) pharmaceutically active agent of the present invention may comprise a water-insoluble pharmaceutical, a water-soluble pharmaceutical, a lipophilic pharmaceutical, or a mixture thereof.
医薬活性剤の例として、表1に示す群から選択される一つ以上を挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。
本発明は、極めて少量でも著しく活性であり、その持続的長期投与が、特に標準的用量に伴う毒性問題を克服するために求められている医薬には、とりわけ適している。限定するわけではないが、その例には、代謝拮抗物質メトトレキサート、抗有糸分裂薬タキソール、肥満治療薬ゼニカル(zenical)、免疫抑制薬シクロスポリン、抗炎症治療薬インドメタシンなどがある。 The present invention is particularly active even in very small quantities, and its long-term administration is particularly suitable for medicaments that are particularly sought to overcome the toxicity problems associated with standard doses. Examples include, but are not limited to, the antimetabolite methotrexate, the anti-mitotic drug taxol, the obesity drug zenical, the immunosuppressant drug cyclosporine, and the anti-inflammatory drug indomethacin.
ある実施形態において、本発明の高分子は、末端基として、二つ以上の異なる医薬活性剤、その誘導体、その前駆体、またはその残基を含む。 In certain embodiments, the polymers of the present invention include two or more different pharmaceutically active agents, derivatives thereof, precursors thereof, or residues thereof as end groups.
さらにもう一つの態様において、本発明は、制御された末端基化学量論を持ち、かつ、
・異なる医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である少なくとも二つの末端基、および
・医薬活性剤および/またはデンドリマーの薬物動態を修飾するために選択されるさらにもう一つの末端基
を含むデンドリマー(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)を提供する。
In yet another embodiment, the invention has a controlled end group stoichiometry, and
At least two end groups that are residues of different pharmaceutically active agents, derivatives or precursors thereof, and yet another end group selected to modify the pharmacokinetics of the pharmaceutically active agent and / or dendrimer A dendrimer comprising (in this case, end group stoichiometry refers to the number and type of end groups).
本発明のこの態様によるデンドリマーは併用療法に応用することができる。 The dendrimers according to this aspect of the invention can be applied in combination therapy.
医薬活性剤は、表1に例示したカテゴリーのうち、任意の二つ以上のカテゴリーの組み合わせであることができる。例示的な組み合わせとして、化学療法医薬;抗炎症医薬および抗関節炎医薬;肥満治療薬および糖尿病治療薬;成長ホルモンおよび成長促進薬;筋弛緩薬および抗炎症薬;呼吸器医薬および気管支拡張薬または抗微生物薬;化学療法薬およびビタミンなどの組み合わせが挙げられるが、これらに限るわけではない。より具体的な組み合わせは実施例に記載する。 The pharmaceutically active agent can be a combination of any two or more of the categories exemplified in Table 1. Exemplary combinations include chemotherapeutic drugs; anti-inflammatory drugs and anti-arthritic drugs; anti-obesity drugs and anti-diabetic drugs; growth hormones and growth-promoting drugs; muscle relaxants and anti-inflammatory drugs; respiratory drugs and bronchodilators Microbial drugs; including but not limited to combinations of chemotherapeutic drugs and vitamins. More specific combinations are described in the examples.
本発明の高分子、特にデンドリマーは、固形腫瘍および炎症部位への薬物の受動ターゲティングを容易にするのに、とりわけ役立ちうる。このターゲティングが可能になるのは、腫瘍および炎症に関連する脈管構造が高分子に対して増加した透過性を持つこと、およびリンパ排液が制限されることが理由である。 The macromolecules of the present invention, especially dendrimers, can be particularly useful in facilitating passive targeting of drugs to solid tumors and inflammatory sites. This targeting is possible because the vasculature associated with tumors and inflammation has increased permeability to macromolecules and limited lymph drainage.
本発明の高分子は、デンドリマー上に存在するターゲティング部分を使って、特定の細胞タイプまたは組織タイプにターゲティングすることもできる。 The macromolecules of the invention can also be targeted to specific cell types or tissue types using targeting moieties present on dendrimers.
したがって、本発明のさらにもう一つの態様では、制御された末端基化学量論を持ち、かつ、
・医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、および
・一つ以上の特異的細胞タイプまたは組織タイプに医薬活性剤および/または高分子をターゲティングするためのターゲティング部分である第2末端基
を含む、デンドリマー(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)が提供される。
Thus, in yet another aspect of the invention, having controlled end group stoichiometry, and
A first end group that is the residue of a pharmaceutically active agent, derivative or precursor thereof, and a targeting moiety for targeting the pharmaceutically active agent and / or macromolecule to one or more specific cell or tissue types A dendrimer is provided, wherein the end group stoichiometry refers to the number and type of end groups.
適切なターゲティング部分の例には、レクチン、抗体および抗体の機能的フラグメントなどがある。ターゲティング部分として、細胞表面受容体のリガンドを挙げることもできる。 Examples of suitable targeting moieties include lectins, antibodies and functional fragments of antibodies. The targeting moiety may also include a cell surface receptor ligand.
いくつかの異なる細胞表面受容体が、高分子の結合および/または取り込みのためのターゲットとして役立つ。特に、本発明において有用な受容体およびその関連リガンドには、葉酸受容体、アドレナリン作動性受容体、成長ホルモン受容体、黄体形成ホルモン受容体、エストロゲン受容体、上皮成長因子受容体、線維芽細胞成長因子受容体(例えばFGR2)、IL-2受容体、CFTRおよび血管上皮成長因子受容体などがあるが、これらに限るわけではない。 Several different cell surface receptors serve as targets for macromolecular binding and / or uptake. In particular, receptors useful in the present invention and related ligands include folate receptors, adrenergic receptors, growth hormone receptors, luteinizing hormone receptors, estrogen receptors, epidermal growth factor receptors, fibroblasts These include, but are not limited to, growth factor receptors (eg FGR2), IL-2 receptor, CFTR and vascular epidermal growth factor receptor.
本発明のさらにもう一つの態様では、制御された末端基化学量論を持つ高分子であって、表面層、少なくとも一つのサブ表面層、ならびに
・医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、および
・細胞受容体リガンドとして機能する能力を持つ第2末端基
を含む少なくとも二つの末端基を含む高分子(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)が提供される。
In yet another embodiment of the present invention, a polymer with controlled end group stoichiometry, comprising a surface layer, at least one subsurface layer, and the remainder of the pharmaceutically active agent, derivative or precursor thereof. A macromolecule comprising at least two end groups, including a first end group that is a group and a second end group capable of functioning as a cell receptor ligand (in this case, end group stoichiometry is defined as Refers to number and type).
本発明のさらにもう一つの態様では、制御された末端基化学量論を持つ高分子であって、表面層、少なくとも一つのサブ表面層、ならびに
・医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、および
・細胞受容体として機能する能力を持つ第2末端基
を含む少なくとも二つの末端基を含む高分子(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)が提供される。
In yet another embodiment of the present invention, a polymer with controlled end group stoichiometry, comprising a surface layer, at least one subsurface layer, and the remainder of the pharmaceutically active agent, derivative or precursor thereof. A macromolecule comprising at least two end groups including a first end group that is a group and a second end group capable of functioning as a cell receptor (in this case, end group stoichiometry is the number of end groups) And type).
葉酸は、ヌクレオチド塩基の生合成に不可欠なビタミンであり、それゆえ、増殖細胞では多量に要求される。がん細胞では、この増加した葉酸要求量が、しばしば、細胞膜を横切る葉酸の輸送を担う葉酸受容体の過剰発現に反映される。これに対し、正常細胞への葉酸の取り込みは、葉酸受容体よりもむしろ還元葉酸輸送体によって促進される。葉酸受容体は、卵巣、脳、腎臓、乳房、骨髄性細胞および肺の悪性腫瘍を含む多くのヒトがんでアップレギュレートされ、細胞表面上の葉酸受容体の密度は、がんが発達するにつれて増加するようである。 Folic acid is an essential vitamin for nucleotide base biosynthesis and is therefore required in large quantities in proliferating cells. In cancer cells, this increased folate requirement is often reflected in the overexpression of folate receptors responsible for transport of folate across the cell membrane. In contrast, folate uptake into normal cells is promoted by reduced folate transporters rather than folate receptors. Folate receptors are upregulated in many human cancers, including ovarian, brain, kidney, breast, myeloid cells and lung malignancies, and the density of folate receptors on the cell surface increases as cancer develops It seems to increase.
腫瘍細胞、特に進行腫瘍細胞に対する葉酸受容体の相対的特異性は、葉酸受容体リガンドである葉酸が、化学療法薬を腫瘍にターゲティングするための有用な候補になりうることを意味する。葉酸受容体と葉酸受容体リガンド-化学療法薬コンジュゲートとの相互作用の特異性は、一定の非形質転換上皮細胞と悪性形質転換上皮細胞との間に見られる葉酸受容体の細胞表面発現パターンの相違によって、さらに強化される。非形質転換細胞の場合、葉酸受容体は、体腔に面していて血中に存在する試薬類には接近しにくい細胞の頂端膜上に、優先的に発現される。しかし形質転換が起こると、細胞はその極性を失い、受容体は葉酸受容体にターゲティングされた循環系内の薬物に、接近できるようになりうる。したがって葉酸または葉酸誘導体は、本発明の高分子の有用なターゲティング部分になりうる。 The relative specificity of folate receptors for tumor cells, particularly advanced tumor cells, means that folate, a folate receptor ligand, can be a useful candidate for targeting chemotherapeutic drugs to tumors. The specificity of the interaction between the folate receptor and the folate receptor ligand-chemotherapeutic conjugate is determined by the cell surface expression pattern of the folate receptor found between certain nontransformed and malignant transformed epithelial cells. The difference is further strengthened. In the case of non-transformed cells, folate receptors are preferentially expressed on the apical membrane of cells facing the body cavity and inaccessible to the reagents present in the blood. However, when transformation occurs, the cell loses its polarity and the receptor can gain access to drugs in the circulatory system targeted to the folate receptor. Thus, folic acid or folic acid derivatives can be useful targeting moieties for the polymers of the present invention.
本発明のさらにもう一つの態様では、制御された末端基化学量論を持つ高分子であって、
・医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、および
・葉酸または葉酸類似体の残基である第2末端基
を含む二つ以上の異なる末端基を有する高分子(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)が提供される。
In yet another embodiment of the present invention, a polymer with controlled end group stoichiometry, comprising:
A polymer having two or more different end groups, including a first terminal group that is the residue of a pharmaceutically active agent, derivative or precursor thereof, and a second terminal group that is the residue of folic acid or a folic acid analog (In this case, end group stoichiometry refers to the number and type of end groups).
本発明のこの態様の好ましい実施形態では、医薬活性剤が抗腫瘍医薬剤である。細胞毒性剤、サイトカイン、抗血管新生剤、抗有糸分裂剤などを使用するか、またはそれらの任意の組み合わせを使用することができる。 In a preferred embodiment of this aspect of the invention, the pharmaceutically active agent is an antitumor pharmaceutical agent. Cytotoxic agents, cytokines, anti-angiogenic agents, anti-mitotic agents, etc. can be used, or any combination thereof can be used.
好ましい実施形態では、医薬活性剤が、メトトレキサート、タキソール、シスプラチン、カルボプラチンおよびドキソルビシンの一つ以上から選択される。 In a preferred embodiment, the pharmaceutically active agent is selected from one or more of methotrexate, taxol, cisplatin, carboplatin and doxorubicin.
本発明のデンドリマーの合成には、例えば世代構築単位の代りに使用することによって、または世代構築単位への末端基の取付けを仲介するために、リンカー部分を組み入れることができる。 In the synthesis of the dendrimers of the present invention, a linker moiety can be incorporated, for example by use in place of a generation building unit or to mediate the attachment of end groups to the generation building unit.
したがって本発明のさらなる態様では、制御された末端基化学量論を持つ高分子(好ましくはデンドリマー)であって、
・一つ以上のリンカー部分、
・医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、および
・医薬活性剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基
を含む二つ以上の異なる末端基を有し、第1および/または第2末端基がリンカー部分によって高分子の骨組みに取付けられる高分子(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)が提供される。
Accordingly, in a further aspect of the invention, a polymer (preferably a dendrimer) with controlled end group stoichiometry, comprising:
One or more linker moieties,
Two containing a first terminal group that is the residue of a pharmaceutically active agent, derivative or precursor thereof, and a second terminal group selected to modify the pharmacokinetics of the pharmaceutically active agent and / or macromolecule A polymer having these different end groups, and the first and / or second end groups are attached to the polymer framework by a linker moiety (in this case, end group stoichiometry is the number and type of end groups Pointing).
さらにもう一つの実施形態では、第2末端基が、一つ以上の細胞タイプまたは組織タイプへの医薬活性剤および/または高分子のターゲティングを容易にする部分ならびに一つ以上の細胞タイプまたは組織タイプへの医薬活性剤および/または高分子の取り込みを容易にする部分から選択され、一つ以上のリンカー部分がPEGを含む。 In yet another embodiment, the second end group is a moiety that facilitates targeting of the pharmaceutically active agent and / or macromolecule to one or more cell types or tissue types and one or more cell types or tissue types. Selected from moieties that facilitate incorporation of the pharmaceutically active agent and / or polymer into the one or more linker moieties comprising PEG.
リンカーは、表面に取付けられる基の要求に応じて、切断可能であっても、非切断可能であってもよい。切断可能なリンカーは、酵素的に切断されるように設計することができ、例えばそれらの酵素を発現させる組織にターゲティングされるデンドリマーに使用することができる。あるいは、そこに取付けられた化合物が低酸素組織などの酸性条件下で放出されるように、酸不安定なリンカーが好ましい場合もある。 The linker may be cleavable or non-cleavable depending on the requirements of the group attached to the surface. A cleavable linker can be designed to be cleaved enzymatically, for example, for dendrimers targeted to tissues that express those enzymes. Alternatively, an acid labile linker may be preferred so that the compound attached thereto is released under acidic conditions such as hypoxic tissue.
さまざまなリンカーの概要
リンカー部分は以下の一つ以上から選択することができる。
アミドリンカー(19〜21)
遊離の薬物がコンジュゲートから放出されるかどうかの決定には、アミド結合の性質が重要である。例えば、薬物(すなわちドキソルビシン)をアミド結合を介して担体にコンジュゲートすると、加水分解に対して安定であり、インビトロでは抗がん作用を一切発揮しないコンジュゲートが生成する。また、アミド結合を介fして担体に直接結合された薬物は、遊離の薬物として容易に切断されることはなく、むしろ担体自体が分解性である場合に薬物-アミノ酸として切断される。直接アミドリンカーを介して結合された担体からの遊離薬物の放出は、その薬物自体がペプチド様分子であり、薬物と担体の間の結合が酵素的に切断可能であるという稀な情況でしか達成することはできないだろう。
Amide linker (19-21)
The nature of the amide bond is important in determining whether free drug is released from the conjugate. For example, conjugating a drug (ie, doxorubicin) to a carrier through an amide bond produces a conjugate that is stable to hydrolysis and does not exert any anticancer activity in vitro. Also, a drug directly bonded to a carrier via an amide bond is not easily cleaved as a free drug, but rather cleaved as a drug-amino acid when the carrier itself is degradable. Release of free drug from a carrier directly linked through an amide linker is achieved only in rare circumstances where the drug itself is a peptide-like molecule and the bond between the drug and the carrier is enzymatically cleavable. You won't be able to do it.
ヒドラゾン、オキシムおよびイミンリンカー(21〜25)
ヒドラゾン、オキシムおよびイミン結合は、薬物を担体から切断させるのに、酵素の存在を必要としない。これらは、腫瘍血管外腔またはリソソーム内などといった低pH環境では、C=N結合で加水分解的に切断されうる。よく使用されるヒドラゾン、オキシムおよびイミンリンカーは、それぞれ、リンカーのヒドラジン、アルコキシアミンまたはアミン部分と、医薬活性部分のカルボニル(ケトンまたはアルデヒド)との反応によって生じる。この連結は、C=N結合部分を取り囲むアルキル基の数を修飾することによって、または電子吸引部分(酸不安定性を増加させるため)もしくは電子供与部分(酸不安定性を減少させるため)で置換することによって、加水分解の速度が遅くなるように修飾することもできる。
Hydrazones, oximes and imine linkers (21-25)
Hydrazone, oxime and imine linkages do not require the presence of an enzyme to cleave the drug from the carrier. These can be hydrolytically cleaved at C = N bonds in low pH environments such as in tumor extravascular space or in lysosomes. Commonly used hydrazones, oximes, and imine linkers result from the reaction of the hydrazine, alkoxyamine, or amine moiety of the linker with the carbonyl (ketone or aldehyde) of the pharmaceutically active moiety, respectively. This linkage is replaced by modifying the number of alkyl groups surrounding the C = N bond moiety, or with an electron withdrawing moiety (to increase acid instability) or an electron donating moiety (to reduce acid instability). In some cases, modification may be performed so that the rate of hydrolysis is reduced.
エステルリンカー(19,26)
酸不安定性でありかつ代謝可能なエステルリンカーを作成することができる。オルトエステルは、アニオン性膜担体を結合する脂質にPEGをコンジュゲートするために使用されてきた。酸性条件(pH4〜6)におけるこのコンジュゲートの安定性は、エステルまたはオルトエステルリンカーの構造に依存する。一般に、α-メトキシ-ω-{N-(2-オクタデシルオキシ-[1,3]ジオキソラン-4-イル)メチルアミド}-ポリエチレングリコール110はpH4でもpH5でも良好な安定性を示し、α-メトキシ-ω-{N-(2-コレステリルオキシ-[1,3]ジオキソラン-4-イル)メチルアミド}-ポリエチレングリコール110はpH5では非常に安定であるが、pH4ではわずかに不安定であり、α-メトキシ-ω-{N-(2-メチル-s-オクタデシルオキシ-[1,3]ジオキサン-5-イル)-アミド}-ポリエチレングリコール110およびα-メトキシ-ω-{N-2-(3-ヒドロキシプロピル-コレステリルカルバメート)-2-メチル-[1,3]ジオキサン-5-イル-アミド}-ポリエチレングリコール110は安定でない。小分子への単純なエステルコンジュゲーションに関して、ジエステル官能性は、ジスルフィドより安定であるがアミド結合よりは不安定なモノエステルと比較して、より多くの代謝切断部位を与える。
Ester linker (19, 26)
Acid labile and metabolizable ester linkers can be made. Orthoesters have been used to conjugate PEG to lipids that bind anionic membrane carriers. The stability of this conjugate in acidic conditions (pH 4-6) depends on the structure of the ester or orthoester linker. In general, α-methoxy-ω- {N- (2-octadecyloxy- [1,3] dioxolan-4-yl) methylamide} -polyethylene glycol 110 exhibits good stability at both
ペプチドリンカー(27〜33)
ペプチドリンカーは、切断速度および切断酵素を制御するために多くの異なるアミノ酸の組み合わせを使用できるので、全ての切断可能リンカーのなかで、その用途が格段に最も広い。しかしこれらのリンカーには、薬物と担体のコンジュゲートとしてそれらを使用するにあたって、1)それらは一般に、体中の非特異的ペプチダーゼによって切断可能であり、それゆえに非腫瘍分布部位で、非特異的な薬物毒性をもたらしうること、および2)アミノ酸が薬物分子に結合した状態で残るようなリンカー内の部位で、切断が起こりうることという、二つの問題がある。これは薬物分子の化学療法作用を妨害しうる。あるいは、結合しているアミノ酸は薬物の薬理作用を変化させないが、その薬物動態に影響を及ぼすかもしれない。しかし、これらの切断作用は、薬物分子に直接結合されるペプチドリンカー中のアミノ酸(例えばプロリン)を適切に選択することによって、制御することができる。
Peptide linker (27-33)
Peptide linkers are by far the most versatile of all cleavable linkers because many different combinations of amino acids can be used to control the cleavage rate and cleavage enzyme. However, in using these linkers as drug-carrier conjugates, these linkers are generally 1) they are cleavable by non-specific peptidases in the body and are therefore non-specific at sites of non-tumor distribution. There are two problems: it can lead to significant drug toxicity and 2) cleavage can occur at sites in the linker where amino acids remain attached to the drug molecule. This can interfere with the chemotherapeutic action of drug molecules. Alternatively, the bound amino acid does not change the pharmacological action of the drug, but may affect its pharmacokinetics. However, these cleavage effects can be controlled by appropriate selection of the amino acid (eg, proline) in the peptide linker that is directly attached to the drug molecule.
一般に、カテプシンB切断が可能なリンカーは、薬物コンジュゲートのエンドサイトーシス後に、リソソーム系によって切断されるように設計されてきた。カテプシンはリソソーム内に位置し、細胞質ゾル中に遊離していることはないからである。エンドサイトーシスは一般に、細胞膜への担体(これは通常、がん特異的細胞表面受容体に対する抗体またはがん特異的細胞表面受容体のリガンドである)の結合に続いて開始される。 In general, linkers capable of cathepsin B cleavage have been designed to be cleaved by the lysosomal system after drug conjugate endocytosis. This is because cathepsin is located in the lysosome and is not released in the cytosol. Endocytosis is generally initiated following the binding of a carrier (which is usually an antibody to a cancer-specific cell surface receptor or a ligand for a cancer-specific cell surface receptor) to the cell membrane.
非特異的プロテアーゼ(すなわち、特定のペプチド配列に対して特異的でないプロテアーゼ)は、PEG化デンドリマーが腫瘍組織で十分な管外遊出と蓄積を起こした後に、そのPEG化デンドリマーから薬物を切断しうる。 Nonspecific proteases (ie, proteases that are not specific for a particular peptide sequence) can cleave drugs from PEGylated dendrimers after they have undergone sufficient extravasation and accumulation in tumor tissue .
ペプチド切断の速度については以下の指針が当てはまる(この場合、a>bは、aの切断速度がbの切断速度よりも大きいことを示す)。活性医薬とデンドリマー末端窒素の間にリンカーとして使用されるペプチド配列の場合、末端CG>末端CGなし>末端G=末端GFG>末端GGGおよび末端GGGF=末端GPG。注:CG結合はGSHによって還元される。GGG結合は一般に他のペプチド結合と比較して極めて安定である。ジペプチドの切断は一般に特定のプロテアーゼに特異的であり、腫瘍細胞内に含まれるさまざまなプロテアーゼの発現に基づいて制御することができる。 The following guidelines apply for the rate of peptide cleavage (where a> b indicates that the cleavage rate of a is greater than the cleavage rate of b): For peptide sequences used as a linker between the active drug and the dendrimer terminal nitrogen, terminal CG> no terminal CG> terminal G = terminal GFG> terminal GGG and terminal GGGF = terminal GPG. Note: CG bonds are reduced by GSH. GGG bonds are generally very stable compared to other peptide bonds. Dipeptide cleavage is generally specific for a particular protease and can be controlled based on the expression of various proteases contained within the tumor cells.
グルタルアルデヒド(34,35)
グルタルアルデヒドは一般に、通常のリンカーとしては使用されないが、特にゲル製剤において安定化剤として使用されるか、または望ましい吸着表面に薬物を共有結合的に取付けるために使用される。これは非代謝可能スペーサーとしても使用され、薬物分子と大きな担体の間に、架橋反応によって間隙を作り出す。
Glutaraldehyde (34, 35)
Glutaraldehyde is generally not used as a normal linker, but is used as a stabilizer, particularly in gel formulations, or used to covalently attach a drug to a desired adsorption surface. It is also used as a non-metabolizable spacer and creates a gap between the drug molecule and the large carrier by a crosslinking reaction.
PEG-ペプチド(2,36)
PEG-ペプチドは、PEG部分によって担体に生体内安定性と質量とが追加される点以外は、通常のペプチドと同じように使用される。典型的には、薬物を抗体担体にコンジュゲートするために使用され、Abと薬物の間の距離を増加させると同時に、酵素切断部位を露出させ、コンジュゲートの免疫原性を低下させ、血中循環時間を増加させ、複合体の溶解性を増加させるという利点を持つ。アドリアマイシンおよびデュオカルマイシン誘導体に関して、コンジュゲートの内在化および活性薬物の酵素的放出(これは必ずしも遊離の薬物として放出されるわけではない)後に、抗増殖作用が観察されている。
PEG-peptide (2, 36)
PEG-peptides are used in the same way as normal peptides except that the PEG moiety adds in vivo stability and mass to the carrier. Typically used to conjugate a drug to an antibody carrier, increasing the distance between the Ab and the drug while simultaneously exposing the enzymatic cleavage site, reducing the immunogenicity of the conjugate, and It has the advantage of increasing the circulation time and increasing the solubility of the complex. For adriamycin and duocarmycin derivatives, antiproliferative effects have been observed after conjugation internalization and enzymatic release of the active drug, which is not necessarily released as a free drug.
ジスルフィドリンカー(1,37,38)
ジスルフィドリンカーは、現在使用されているリンカーの中で最も不安定であり、インビトロで迅速な還元的切断を受ける。しかしその生体内安定性は、一般に、そのインビトロ安定性よりも高い。これらは、含硫アミノ酸間のジスルフィド結合によって形成されるか、非ペプチドベースのジスルフィド結合に形成されうる。これらは、体内の他の求核チオールとも高い反応性を示すので、迅速な血漿クリアランスを示す。
Disulfide linker (1, 37, 38)
Disulfide linkers are the most labile of currently used linkers and undergo rapid reductive cleavage in vitro. However, its in vivo stability is generally higher than its in vitro stability. These can be formed by disulfide bonds between sulfur-containing amino acids or can be formed by non-peptide based disulfide bonds. They are highly reactive with other nucleophilic thiols in the body and thus show rapid plasma clearance.
リンカー切断可能性の一般的概要
循環では、リンカー切断可能性の順序は以下のとおりである:
ジスルフィド>長鎖ペプチド≧エステル>ヒドラゾン≧テトラペプチド(GGGF)=トリペプチド(GFG>GGG=GPG)≒または>ジペプチド(AV、AP、GP、FL、V-Cit)>グルタルアルデヒド=アミド。
General overview of linker cleavability In circulation, the order of linker cleavability is as follows:
Disulfide> long peptide ≧ ester> hydrazone ≧ tetrapeptide (GGGF) = tripeptide (GFG> GGG = GPG) ≈or> dipeptide (AV, AP, GP, FL, V-Cit)> glutaraldehyde = amide.
リンカー推奨
さまざまなリンカーの安定性は、それらがコンジュゲートされる基(すなわちそのリンカーへの酵素の接近可能性)、活性が要求される部位におけるコンジュゲートの挙動(すなわち細胞取り込みまたは細胞外蓄積)ならびにコンジュゲートの性質(すなわちエステル対アミド)に基づく。現在の系では、ジスルフィドコンジュゲートの生体内挙動は、予測することが比較的難しいと予想される。長鎖ペプチドは、より容易にプロテアーゼの接近を受けて、迅速に切断されるものの、その切断は迅速すぎる場合があり、また非特異的部位で起こって、生物学的に活性でないかもしれない医薬活性ペプチド/アミノ酸種の放出が起こることもある。
Linker Recommendations The stability of various linkers depends on the group to which they are conjugated (ie the accessibility of the enzyme to the linker), the behavior of the conjugate at the site where activity is required (ie cellular uptake or extracellular accumulation). As well as the nature of the conjugate (ie ester vs. amide). In current systems, the in vivo behavior of disulfide conjugates is expected to be relatively difficult to predict. Long-chain peptides are more readily accessible to proteases and are cleaved rapidly, but the cleaving may be too rapid and may occur at non-specific sites and may not be biologically active Release of active peptide / amino acid species may occur.
C=Nに基づくリンカー(ヒドラゾン、オキシムまたはイミン)、エステルまたはペプチドコンジュゲートの切断は、少なくとも数日間にわたって起こるため、コンジュゲートが腫瘍組織に蓄積することが可能になる。それぞれに利点はあるが、エステルまたはヒドラゾンリンカーが好ましいかもしれない。医薬活性物質をデンドリマーに連結するエステル結合は、迅速に切断される結合をもたらし、それはターゲット部位に特異的ではないかもしれないが、切断は遊離の医薬活性物質の放出をもたらす。ヒドラゾン結合は、体循環ではエステルより安定であり、C=N結合での加水分解により、腫瘍部位において、より高い特異性で切断されるコンジュゲートをもたらす。しかし、ヒドラゾン形成を可能にするには、カルボニル部分またはヒドラジン部分の組み込みによって、医薬活性分子を修飾する必要があるかもしれない。 Cleavage of the C = N based linker (hydrazone, oxime or imine), ester or peptide conjugate occurs over at least several days, allowing the conjugate to accumulate in tumor tissue. Each has advantages, but an ester or hydrazone linker may be preferred. The ester bond linking the pharmaceutically active substance to the dendrimer results in a bond that is rapidly cleaved, which may not be specific for the target site, but cleavage results in the release of the free pharmaceutically active substance. Hydrazone linkages are more stable than esters in systemic circulation, and hydrolysis at the C = N bond results in conjugates that are cleaved with higher specificity at the tumor site. However, to allow hydrazone formation, it may be necessary to modify the pharmaceutically active molecule by incorporation of a carbonyl moiety or a hydrazine moiety.
好ましい実施形態では、リンカー部分が、1個以上の炭素またはヘテロ原子(好ましくは炭化水素バックボーン)で接続された二つの反応性官能基FおよびYを含みうる。官能基Fは、デンドリマーの表面上にあるような反応性アミン部分と反応するように活性化することができる。典型的には、官能基Fはカルボキシレート基またはその残基である。他方の官能基Yは、保護基を含むアミンであるか、またはデンドリティックモチーフの表面に取付けられる望ましい有機基の反応性基に対して相補的な特異的反応性を持つように選択される。Yの典型例には、アミン、ヒドロキシル、チオール、アルケニルまたはアルキニル、ニトリル、ハライド、カルボキシレートまたはアジド基などがある。 In a preferred embodiment, the linker moiety may comprise two reactive functional groups F and Y connected by one or more carbon or heteroatoms (preferably a hydrocarbon backbone). The functional group F can be activated to react with reactive amine moieties such as on the surface of the dendrimer. Typically, the functional group F is a carboxylate group or residue thereof. The other functional group Y is an amine containing a protecting group or is selected to have a specific reactivity complementary to the reactive group of the desired organic group attached to the surface of the dendritic motif. Typical examples of Y include amine, hydroxyl, thiol, alkenyl or alkynyl, nitrile, halide, carboxylate or azide groups.
末端基をデンドリマーの表面アミン基に接続するためにリンカー部分を使用する場合、リンカーと有機基の間の反応は、リンカー部分をデンドリティックモチーフの表面アミンと反応させる前に行ってもよいし、リンカー部分をデンドリティックモチーフの表面アミンと反応させた後に行ってもよい。デンドリティックモチーフに一つ以上のリンカー部分を導入するために使用される反応は、デンドリマーの脱保護された表面アミンの全てがリンカー部分と完全に反応することが保証されるように行われる。典型的には、これは、選択したリンカー部分を過剰に使用することによって行われる。 When a linker moiety is used to connect the end group to the surface amine group of the dendrimer, the reaction between the linker and the organic group may be performed before reacting the linker moiety with the surface amine of the dendritic motif, This may be done after reacting the linker moiety with the surface amine of the dendritic motif. The reaction used to introduce one or more linker moieties into the dendritic motif is performed to ensure that all of the deprotected surface amines of the dendrimer are fully reacted with the linker moiety. Typically this is done by using an excess of the selected linker moiety.
本発明では、上述のリンカーに加えて、光切断可能なリンカーも使用することができる。例えば、ヘテロ二官能性光切断可能リンカーを使用することができる。ヘテロ二官能性光切断可能リンカーは、水溶性であるか、有機溶媒可溶性であることができる。これらは、アミンまたはアルコールと反応しうる活性化エステルおよびチオール基と反応しうるエポキシドを含有する。エステル基とエポキシ基の間には、3,4-ジメトキシ-6-ニトロフェニル光異性化基があり、これは、近紫外光(365nm)に曝露されると、アミンまたはアルコールを完全な形で放出する。したがって、そのようなリンカーを使ってデンドリマーに連結された医薬活性成分は、ターゲット領域を近紫外光に曝露することにより、生物学的に活性または活性化可能な形で放出されうる。 In the present invention, a photocleavable linker can be used in addition to the above-mentioned linker. For example, a heterobifunctional photocleavable linker can be used. The heterobifunctional photocleavable linker can be water soluble or organic solvent soluble. These contain activated esters that can react with amines or alcohols and epoxides that can react with thiol groups. Between the ester group and the epoxy group is a 3,4-dimethoxy-6-nitrophenyl photoisomerization group which, when exposed to near-ultraviolet light (365 nm), fully forms the amine or alcohol. discharge. Thus, a pharmaceutically active ingredient linked to a dendrimer using such a linker can be released in a biologically active or activatable form by exposing the target area to near ultraviolet light.
例えば、タキソールのアルコール基を、有機溶媒可溶性リンカーの活性化エステルと反応させることができる。次に、この生成物を、一部がチオール化されているデンドリマー表面と反応させる。シスプラチンの場合、薬物のアミノ基を水溶性型のリンカーと反応させることができる。アミノ基が必要な活性を持たない場合は、シスプラチンの1級アミノ含有活性類似体、例えばPt(II)スルファジアジンジクロリドと反応させることができる。このようにコンジュゲート化されると、薬物は不活性であり、正常細胞を傷つけないだろう。コンジュゲートが腫瘍細胞内に局在化した時に、それを適当な近UV波長のレーザー光に曝露して、活性薬を細胞中に放出させる。 For example, the alcohol group of taxol can be reacted with an activated ester of an organic solvent soluble linker. This product is then reacted with a partially thiolated dendrimer surface. In the case of cisplatin, the amino group of the drug can be reacted with a water-soluble linker. If the amino group does not have the required activity, it can be reacted with a primary amino-containing active analog of cisplatin, such as Pt (II) sulfadiazine dichloride. When conjugated in this way, the drug is inactive and will not harm normal cells. When the conjugate is localized within the tumor cell, it is exposed to laser light of the appropriate near UV wavelength to release the active agent into the cell.
本発明のさらにもう一つの態様では、制御された末端基化学量論を持つ高分子であって、表面層、少なくとも一つのサブ表面層、ならびに
・医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、および
・医薬活性剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基
を含む二つ以上の異なる末端基を有する高分子と、
そのための薬学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤
とを含む医薬組成物が提供される。
In yet another embodiment of the invention, a polymer with controlled end group stoichiometry, comprising a surface layer, at least one subsurface layer, and the remainder of the pharmaceutically active agent, derivative or precursor thereof. A first end group that is a group, and a polymer having two or more different end groups, including a pharmaceutically active agent and / or a second end group selected to modify the pharmacokinetics of the polymer;
Pharmaceutical compositions comprising a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient therefor are provided.
高分子成分はデンドリマー、好ましくはリジンデンドリマーであることができる。 The polymeric component can be a dendrimer, preferably a lysine dendrimer.
医薬活性剤は、上述した医薬活性剤のカテゴリーの一つ以上から選択することができる。好ましくは、医薬活性剤は、抗有糸分裂剤または代謝拮抗剤を含むがん治療薬およびがん関連医薬、肥満治療剤、抗炎症剤、または免疫抑制剤である。 The pharmaceutically active agent can be selected from one or more of the categories of pharmaceutically active agents described above. Preferably, the pharmaceutically active agent is a cancer therapeutic agent and a cancer-related drug including an antimitotic agent or an antimetabolite, an obesity therapeutic agent, an anti-inflammatory agent, or an immunosuppressive agent.
第2末端基は、医薬活性物質の血漿中半減期が延びるように選択することができる。さらにもう一つの実施形態では、一つ以上の特異的細胞タイプまたは組織タイプへの医薬活性剤のターゲティングおよび/または取り込みが容易になるように、第2末端基が選択される。 The second end group can be selected to increase the plasma half-life of the pharmaceutically active substance. In yet another embodiment, the second end group is selected to facilitate targeting and / or uptake of the pharmaceutically active agent to one or more specific cell types or tissue types.
第2末端基は、ポリエチレングリコール(PEG)またはポリエチルオキサゾリン(例えばPEOX)モチーフを含みうる。 The second end group can include a polyethylene glycol (PEG) or polyethyloxazoline (eg, PEOX) motif.
本発明のさらにもう一つの態様では、制御された末端基化学量論を持つ高分子であって、表面層、少なくとも一つのサブ表面層、ならびに
・医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、および
・葉酸または葉酸類似体の残基である第2末端基
を含む二つ以上の異なる末端基を有する高分子と、
そのための薬学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤
とを含む医薬組成物(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)が提供される。
In yet another embodiment of the present invention, a polymer with controlled end group stoichiometry, comprising a surface layer, at least one subsurface layer, and the remainder of the pharmaceutically active agent, derivative or precursor thereof. A polymer having two or more different terminal groups, including a first terminal group that is a group, and a second terminal group that is a residue of folic acid or a folic acid analog;
A pharmaceutical composition is provided comprising a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient therefor (where end group stoichiometry refers to the number and type of end groups).
本発明のこの態様の好ましい実施形態では、医薬活性剤が抗腫瘍医薬剤である。細胞毒性剤、サイトカイン、抗血管新生剤、抗有糸分裂剤などを使用するか、またはそれらの任意の組み合わせを使用することができる。 In a preferred embodiment of this aspect of the invention, the pharmaceutically active agent is an antitumor pharmaceutical agent. Cytotoxic agents, cytokines, anti-angiogenic agents, anti-mitotic agents, etc. can be used, or any combination thereof can be used.
抗腫瘍医薬剤は、以下の一つ以上から選択することができる:リツキシマブ、オキサリプラチン、ドセタキセル、ゲムシタビン、トラスツズマブ、イリノテカン、パクリタキセル、ベバシズマブ、カルボプラチン、セツキシマブ、ドキソルビシン、ペメトレキセド、エピルビシン、ボルテゾミブ、トポテカン、アザシチジン、ビノレルビン、ミトキサントロン、フルダラビン、ドキソルビシン、アレムツズマブ、カルムスチン、イホスファミド、イダルビシン、マイトマイシン、フルオロウラシル、シスプラチン、メトトレキサート、メルファラン、ヒ素、デニロイキン・ジフティトクス(denileukin diftitox)、シタラビン、レボホリナートカルシウム、シクロホスファミド、エトポシド、ヤドリギ(viscum album)、メスナ、ゲムツズマブ、オゾガミシン、ブスルファン、ペントスタチン、クラドリビン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ベンダムスチン、ダカルバジン、ラルチトレキセド、ビンクリスチン、ホテムスチン、リン酸エトポシド、ポルフィマーナトリウムおよびビンブラスチン。 The anti-tumor pharmaceutical agent can be selected from one or more of the following: rituximab, oxaliplatin, docetaxel, gemcitabine, trastuzumab, irinotecan, paclitaxel, bevacizumab, carboplatin, cetuximab, doxorubicin, pemetrexed, epirubicin, bortotezine , Vinorelbine, mitoxantrone, fludarabine, doxorubicin, alemtuzumab, carmustine, ifosfamide, idarubicin, mitomycin, fluorouracil, cisplatin, methotrexate, melphalan, arsenic, denileukin diftitox, cyclotharibin calcium, cytarifamide Etoposide, mistletoe (viscum album), mesna, gemtuzumab, ozoga Sewing machine, busulfan, pentostatin, cladribine, bleomycin, daunorubicin, bendamustine, dacarbazine, raltitrexed, vincristine, hotemustine, etoposide phosphate, porfimer sodium and vinblastine.
好ましい実施形態では、医薬活性剤が、メトトレキサート、タキソール、シスプラチン、カルボプラチンおよびドキソルビシンの一つ以上から選択される。 In a preferred embodiment, the pharmaceutically active agent is selected from one or more of methotrexate, taxol, cisplatin, carboplatin and doxorubicin.
薬学的に許容できる担体または賦形剤は、その活性剤のために選択した送達経路に応じて、任意の既知担体または既知賦形剤から選択することができる。 The pharmaceutically acceptable carrier or excipient can be selected from any known carrier or excipient depending on the delivery route selected for the active agent.
医薬組成物は、経口的送達、注射送達、直腸送達、非経口的送達、皮下送達、静脈内送達、筋肉内送達または他の送達用に製剤化することができる。医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、カプレット剤、注射用アンプルバイアル、または調製済(ready-to-use)溶液剤、凍結乾燥物質、坐剤、ボーラスまたはインプラントとして製剤化することができる。 The pharmaceutical composition can be formulated for oral delivery, injection delivery, rectal delivery, parenteral delivery, subcutaneous delivery, intravenous delivery, intramuscular delivery or other delivery. The pharmaceutical compositions can be formulated as tablets, capsules, caplets, ampoules for injection, or ready-to-use solutions, lyophilized substances, suppositories, boluses, or implants.
そのような組成物の製剤は当業者にはよく知られている。適切な薬学的に許容できる担体および/または賦形剤として、ありとあらゆる通常の溶媒、分散媒、媒質、充填剤、固形担体、水溶液、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張化および吸収遅延剤などが挙げられる。医薬活性物質のためのそのような媒質および薬剤の使用は当技術分野ではよく知られており、例えば「Remington's Pharmaceutical Sciences」(第18版、Mack Publishing Company、米国ベンシルバニア州)などに記載されている。通常の媒質または薬剤が本明細書に記載するデンドリマーポリマーの末端基と適合しない場合を除き、本発明の医薬組成物にはそれらを使用することが考えられる。補助的活性成分も組成物に組み入れることができる。 The formulation of such compositions is well known to those skilled in the art. Any and all conventional solvents, dispersion media, media, fillers, solid carriers, aqueous solutions, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic and absorption delaying agents as suitable pharmaceutically acceptable carriers and / or excipients Etc. The use of such media and agents for pharmaceutically active substances is well known in the art and is described, for example, in "Remington's Pharmaceutical Sciences" (18th Edition, Mack Publishing Company, Bensylvania, USA). Yes. Unless the usual media or agents are compatible with the end groups of the dendrimer polymers described herein, it is contemplated to use them in the pharmaceutical compositions of the present invention. Supplementary active ingredients can also be incorporated into the compositions.
投与を容易にし、投薬量を均一にするために、組成物を投薬単位形で製剤化することは、とりわけ有益である。本明細書にいう「単位投薬形」とは、処置されるヒト対象への単位投薬量として適している物理的に不連続な単位であって、各単位が、必要な医薬担体および/または医薬希釈剤と一緒になって所望の治療作用をもたらすように計算された所定量の活性成分を含有しているものを指す。本発明の新規単位投薬形に関する仕様は、(a)その活性成分のユニークな特徴および達成されるべき特定の治療作用、ならびに(b)特定の処置のためにそのような活性化合物を配合する技術に固有の制限事項によって決定され、それらに直接依存する。 It is especially beneficial to formulate the composition in dosage unit form for ease of administration and uniformity of dosage. As used herein, a “unit dosage form” is a physically discrete unit suitable as a unit dosage for a human subject to be treated, wherein each unit is a necessary pharmaceutical carrier and / or pharmaceutical. It refers to those containing a predetermined amount of active ingredient calculated to produce a desired therapeutic effect together with a diluent. The specifications for the novel unit dosage forms of the present invention are: (a) the unique characteristics of the active ingredient and the specific therapeutic action to be achieved, and (b) the technology of formulating such active compounds for specific treatments. Are determined by the limitations inherent in and depend directly on them.
本発明のさらにもう一つの態様では、ヒトもしくは非ヒト動物患者の予防的処置もしくは治療的処置における、またはヒトもしくは非ヒト動物患者を処置するための医薬品の製造における、有効量の上記高分子の使用が提供される。 In yet another aspect of the present invention, an effective amount of the macromolecule in the prophylactic or therapeutic treatment of a human or non-human animal patient or in the manufacture of a medicament for treating a human or non-human animal patient. Use is provided.
本発明のさらにもう一つの態様では、哺乳動物(ヒトを含む)患者における疾患指標または生理的欠陥を処置するための方法であって、そのような処置を必要としている患者に、予防有効量または治療有効量の上記医薬組成物を投与することを含む方法が提供される。 In yet another aspect of the invention, a method for treating a disease indicator or physiological defect in a mammalian (including human) patient, wherein a patient in need of such treatment has a prophylactically effective amount or There is provided a method comprising administering a therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition.
さまざまな投与経路を利用することができる。選択される特定の様式は、もちろん、処置される特定の状態および治療効力を得るために必要な投薬量に依存するだろう。本発明の方法は、一般的に言って、医学的に許容できる任意の投与様式(すなわち、臨床的に許容できない有害作用を引き起こさずに治療レベルの本発明活性成分をもたらす任意の様式)を使って実施することができる。そのような投与様式には、経口経路、直腸経路、局所外用経路、鼻腔経路、吸入経路、経皮経路または非経口(例えば皮下、筋肉内および静脈内)経路、眼内および硝子体内(目の硝子体への)経路などがある。経口投与用の製剤としては、カプセル剤、錠剤、口中剤などの不連続な単位が挙げられる。他の経路には、髄液への直接的な髄腔内投与、当業者に周知のさまざまなカテーテルおよびバルーン血管形成術装置による直接導入、ならびにターゲット領域への実質内注射などがある。 A variety of administration routes are available. The particular mode chosen will, of course, depend on the particular condition being treated and the dosage required to achieve therapeutic efficacy. The methods of the invention generally use any medically acceptable mode of administration (ie, any mode that provides a therapeutic level of the active ingredient without causing clinically unacceptable adverse effects). Can be implemented. Such modes of administration include oral, rectal, topical, nasal, inhalation, transdermal or parenteral (eg, subcutaneous, intramuscular and intravenous) routes, intraocular and intravitreal (eye). Route to the vitreous). Examples of the preparation for oral administration include discontinuous units such as capsules, tablets, and oral preparations. Other routes include direct intrathecal administration to the cerebrospinal fluid, direct introduction by various catheters and balloon angioplasty devices well known to those skilled in the art, and intraparenchymal injection into the target area.
組成物は単位剤形で提供すると好都合であり、薬学分野でよく知られる任意の方法で製造することができる。そのような方法には、活性化合物を、一つ以上の補助成分を構成する担体と混合するステップが含まれる。一般に組成物は、活性化合物を液体担体、微細固形担体、またはその両方と、均一かつ十分に混合した後、必要ならば、その生成物を付形することによって製造される。 The composition is conveniently provided in unit dosage form and can be prepared by any method well known in the pharmaceutical arts. Such methods include the step of bringing into association the active compound with the carrier which constitutes one or more accessory ingredients. In general, the compositions are prepared by uniformly and intimately bringing into association the active compound with liquid carriers, fine solid carriers or both and then, if necessary, shaping the product.
経口投与に適した本発明の組成物は、それぞれが所定量の高分子を含有するカプセル剤、分包、錠剤または口中剤などの不連続な単位として提示するか、リポソームに入れて、または水性もしくは非水性液中の懸濁剤、例えばシロップ剤、エリキシル剤もしくはエマルションなどとして提示することができる。 Compositions of the present invention suitable for oral administration may be presented as discrete units, such as capsules, sachets, tablets or mouthpieces each containing a predetermined amount of a polymer, placed in liposomes, or aqueous Alternatively, it can be presented as a suspension in a non-aqueous liquid, such as a syrup, elixir or emulsion.
非経口投与に適した組成物は、活性成分の滅菌水性調製物(好ましくは受容者の血液と等張であるもの)を含むと好都合である。この水性調製物は、既知の方法に従い、適切な分散または湿潤剤および懸濁化剤を使って製剤化することができる。滅菌注射用調製物は、例えばポリエチレングリコール中の溶液などといった、無毒性で非経口的に許容できる希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液または懸濁液であることもできる。使用することができる許容できる賦形剤および溶媒は、水、および等張食塩溶液が含まれる。また、滅菌固定油も溶媒または分散媒として便利に使用される。この目的には、合成モノ-またはジ-グリセリドを含む任意の無刺激性固定油を使用することができる。また、オレイン酸などの脂肪酸も、注射剤の製造に役立つ。 Compositions suitable for parenteral administration conveniently comprise a sterile aqueous preparation of the active ingredient, preferably one that is isotonic with the recipient's blood. This aqueous preparation may be formulated according to known methods using suitable dispersing or wetting agents and suspending agents. The sterile injectable preparation may also be a sterile injectable solution or suspension in a non-toxic parenterally acceptable diluent or solvent, for example as a solution in polyethylene glycol. Among the acceptable vehicles and solvents that can be employed are water, and isotonic sodium chloride solution. Sterile fixed oils are also conveniently used as solvents or dispersion media. For this purpose any bland fixed oil can be employed including synthetic mono- or di-glycerides. Fatty acids such as oleic acid are also useful in the manufacture of injections.
本発明の高分子は、鼻内投与または吸入によってデンドリマーポリマーを投与するために設計された系として、例えば活性成分を含有する微細エアロゾルスプレーなどとして、送達用に製剤化することもできる。 The polymers of the present invention can also be formulated for delivery as a system designed to administer dendrimer polymers by intranasal administration or inhalation, such as a fine aerosol spray containing the active ingredient.
他の送達系として徐放送達系を挙げることができる。好ましい徐放送達系は、徐放性ペレットまたは徐放性カプセル中の本発明高分子の放出に対応しうる系である。いろいろなタイプの徐放送達系を利用することができる。それらには、(a)活性成分がマトリックスに含まれている浸食系、および(b)活性成分が制御された速度でポリマーを通して浸透する拡散系などがあるが、これらに限るわけではない。また、ポンプ型ハードウェア送達系も使用することができ、その中には、植込みに適するものもある。 Another delivery system can be a slow broadcast delivery system. A preferred sustained broadcast delivery system is a system that can cope with the release of the polymer of the present invention in sustained release pellets or sustained release capsules. Various types of Xu Broadcasting system can be used. These include, but are not limited to, (a) an erosion system in which the active ingredient is contained in the matrix, and (b) a diffusion system in which the active ingredient penetrates through the polymer at a controlled rate. Pump-type hardware delivery systems can also be used, some of which are suitable for implantation.
本発明の高分子は予防有効量または治療有効量で投与される。予防有効量または治療有効量とは、所望の効果を少なくとも部分的に達成するのに必要な量、または処置される特定の状態の発生を遅らせ、その進行を抑制し、またはその発生もしくは進行を完全に停止させるのに必要な量を意味する。そのような量は当然、処置される特定の状態、その状態の重症度、ならびに個々の患者のパラメーター、例えば年齢、身体状態、サイズ、体重および併用処置などに依存するだろう。これらの因子は当業者にはよく知られており、定型的な実験だけで対処することができる。一般的には最大量(すなわち妥当な医学的判断による最高安全量)を使用することが好ましい。しかし医学的理由、心理学的理由または事実上任意の他の理由から、より低い用量または許容量を投与できることは、当業者には理解されるだろう。 The polymers of the present invention are administered in a prophylactically effective amount or a therapeutically effective amount. A prophylactically effective amount or therapeutically effective amount is an amount necessary to at least partially achieve a desired effect, or delay the onset of, suppress the progression of, or prevent the occurrence or progression of a particular condition being treated. It means the amount necessary to stop completely. Such amounts will of course depend on the particular condition being treated, the severity of the condition, and individual patient parameters such as age, physical condition, size, weight and combination treatment. These factors are well known to those skilled in the art and can be addressed by routine experimentation alone. In general, it is preferred to use the maximum amount (ie, the highest safe amount according to reasonable medical judgment). However, those skilled in the art will appreciate that lower doses or tolerated doses may be administered for medical reasons, psychological reasons, or virtually any other reason.
一般に、高分子の1日量は、約0.01mg/kg/日〜1000mg/kg/日でありうる。最初は少量(0.01〜1mg)を投与し、その後、最大約1000mg/kg/日まで用量を増やすことができる。対象における応答がそれらの用量において不十分である場合は、患者の耐性が許す範囲で、さらに高い用量(または、より限局的な異なる送達経路による、より高い有効量)を使用してもよい。化合物の全身レベルを適当なものにするために、一日あたり複数回の投与を行なうことが考えられる。 In general, the daily dose of polymer can be from about 0.01 mg / kg / day to 1000 mg / kg / day. Small doses (0.01-1 mg) can be administered initially, and then doses can be increased up to about 1000 mg / kg / day. If the response in the subject is inadequate at those doses, higher doses (or higher effective doses by more localized different delivery routes) may be used to the extent patient tolerance allows. Multiple doses per day may be considered to achieve an appropriate systemic level of compound.
さらにもう一つの好ましい実施形態では、薬学的に許容できる担体または賦形剤を、食塩水および緩衝媒質、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、ならびに乳酸加リンゲル液を含む滅菌水性塩溶液、懸濁液およびエマルションの一つ以上から選択することができる。静脈内ビヒクルには、水分栄養補充剤、電解質補充剤、例えばリンゲルデキストロースに基づくものなどがある。非静脈内経路による投与の場合、担体は凝固血漿(好ましくはその患者の凝固血漿)の形をとることができる。あるいは、担体は、血漿を含まない生理学的に適合する生分解性の固体または半固体、例えばゲル、懸濁液または水溶性ゼリーであることもできる。アラビアゴム、メチルセルロースおよび他のセルロース誘導体、アルギン酸ナトリウムならびにトラガカント懸濁液またはゲル、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム2.5%、トラガカント1.25%およびグアーゴム0.5%は、本発明の実施にあたって担体として使用するのに適している。 In yet another preferred embodiment, the pharmaceutically acceptable carrier or excipient is a sterile aqueous salt solution, suspension and solution comprising saline and buffered medium, Ringer's dextrose, dextrose and sodium chloride, and lactated Ringer's solution. One or more of the emulsions can be selected. Intravenous vehicles include water and nutrient replenishers, electrolyte replenishers such as those based on Ringer's dextrose. For administration by non-intravenous routes, the carrier can take the form of coagulated plasma, preferably the patient's coagulated plasma. Alternatively, the carrier can be a physiologically compatible biodegradable solid or semi-solid that does not contain plasma, such as a gel, suspension or water-soluble jelly. Gum arabic, methylcellulose and other cellulose derivatives, sodium alginate and tragacanth suspensions or gels such as sodium carboxymethylcellulose 2.5%, tragacanth 1.25% and guar gum 0.5% are suitable for use as carriers in the practice of the present invention. .
さらにもう一つの好ましい実施形態では、医薬組成物中の高分子が、薬学的に活性な少なくとも二つの異なる末端基を含みうる。 In yet another preferred embodiment, the macromolecule in the pharmaceutical composition can comprise at least two different end groups that are pharmaceutically active.
そのような実施形態はさまざまなタイプの併用療法に利用することができる。 Such embodiments can be utilized for various types of combination therapy.
さらにもう一つの好ましい実施形態では、医薬組成物が、
・制御された末端基化学量論を持つ高分子(好ましくはデンドリマー)であって、
少なくとも一つの切断可能なまたは非切断可能なリンカー部分;
医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基;
医薬活性剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基
を含む少なくとも二つの末端基を含む高分子と、
・そのための薬学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤
とを含み、この場合、第1および/または第2末端基は、一つ以上のリンカー部分によって高分子の骨組みに取付けられる(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)。
In yet another preferred embodiment, the pharmaceutical composition comprises
A polymer (preferably a dendrimer) with controlled end group stoichiometry,
At least one cleavable or non-cleavable linker moiety;
A first terminal group that is the residue of a pharmaceutically active agent, derivative or precursor thereof;
A macromolecule comprising at least two end groups comprising a second end group selected to modify the pharmacokinetics of the pharmaceutically active agent and / or macromolecule;
A pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient therefor, wherein the first and / or second end groups are attached to the polymeric framework by one or more linker moieties (this In some cases, end group stoichiometry refers to the number and type of end groups).
がん性腫瘍は、直径約2mmまでは迅速かつ制御不可能に成長した後、腫瘍の内部への効果的な栄養供給の欠如がさらなる細胞複製を制限するようになる(1)。血管新生が始まって腫瘍に自ら血液供給をもたらすまでは、腫瘍は長年にわたってこのサイズのままとどまりうる。これが起こりうる機序の一つは、酸素およびグルコース供給が制限されている部位(例えば腫瘍塊の内部)でアップレギュレートされる転写因子であって、血管新生に関与する遺伝子のアップレギュレーションを招く、低酸素誘導性因子-1αの活性化によるものである(2)。しかし、腫瘍内での迅速な脈管化は、血管内皮細胞間に大きな間隙を持つ血管アーキテクチャを作り出し、それが正常な脈管構造では通常は透過可能でない大きな粒子の蓄積を可能にする。また、蓄積した粒子を除去するためのリンパ排液が腫瘍塊内では生じないため、腫瘍EPR効果も存在する(1)。 After cancerous tumors grow rapidly and uncontrollably to about 2 mm in diameter, the lack of effective nutrient supply inside the tumor will limit further cell replication (1). Until angiogenesis begins and provides the tumor with its own blood supply, the tumor can remain at this size for many years. One of the mechanisms by which this can occur is a transcription factor that is up-regulated at sites where oxygen and glucose supply is restricted (eg inside the tumor mass), leading to up-regulation of genes involved in angiogenesis This is due to the activation of hypoxia-inducible factor-1α (2). However, rapid vascularization within the tumor creates a vascular architecture with large gaps between vascular endothelial cells, which allows the accumulation of large particles that are not normally permeable in normal vasculature. There is also a tumor EPR effect because lymph drainage to remove accumulated particles does not occur in the tumor mass (1).
腫瘍内での変則的な代謝および血管供給は、正常細胞とは異なるpH勾配を生じさせる。腫瘍内での乳酸および炭酸の増加した蓄積は、わずかに酸性な細胞外環境(pH〜6.5)をもたらし、Na/H交換体の欠陥ゆえに、細胞内環境は中性またはわずかにアルカリ性(pH7.0〜7.4)である。この特異なpH勾配は、弱塩基である一部の化学療法薬、例えばドキソルビシンの蓄積を妨害する。酸性細胞外環境は、間質マトリックスおよび細胞間ギャップジャンクションの分解によるがん転移にも関連づけられている。 Anomalous metabolism and vascular supply within the tumor results in a different pH gradient than normal cells. Increased accumulation of lactic acid and carbonic acid within the tumor results in a slightly acidic extracellular environment (pH ~ 6.5), and due to a defect in the Na / H exchanger, the intracellular environment is neutral or slightly alkaline (pH 7. 0 to 7.4). This unique pH gradient prevents the accumulation of some chemotherapeutic drugs that are weak bases, such as doxorubicin. The acidic extracellular environment has also been linked to cancer metastasis by degradation of the stromal matrix and intercellular gap junctions.
この細胞外酸性度を利用して、酸不安定リンカーによって結合された担体分子からのpHによる抗がん薬の放出を可能にすることができる。放出は細胞外腔(pH約6.5)またはリソソームコンパートメント(pH約4〜5)で起こりうる。抗がん薬は、大半の腫瘍細胞がその受容体を過剰発現させているトランスフェリンなどの腫瘍ターゲティング基にも連結されている。腫瘍リソソーム内で過剰発現されるカテプシンBまたはDによって切断されうる他のリンカーも使用されている。 This extracellular acidity can be used to allow release of anticancer drugs by pH from carrier molecules linked by acid labile linkers. Release can occur in the extracellular space (pH about 6.5) or in the lysosomal compartment (pH about 4-5). Anticancer drugs are also linked to tumor targeting groups, such as transferrin, in which most tumor cells overexpress their receptors. Other linkers that can be cleaved by cathepsins B or D that are overexpressed in tumor lysosomes have also been used.
したがって、本発明のさらにもう一つの態様では、腫瘍(悪性腫瘍を含む)の処置を必要としている哺乳動物(ヒトを含む)患者における腫瘍(悪性腫瘍を含む)を処置するための方法であって、その患者に、
・制御された末端基化学量論を持つ高分子であって、表面層、少なくとも一つのサブ表面層、ならびに
抗腫瘍医薬剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、
抗腫瘍医薬剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基、を含む少なくとも二つの末端基を含む高分子と、
・そのための薬学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤
とを含む医薬組成物の有効量を投与することを含む方法(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)が提供される。
Accordingly, in yet another aspect of the invention, a method for treating a tumor (including a malignant tumor) in a mammalian (including human) patient in need of treatment of the tumor (including a malignant tumor), To the patient,
A polymer with controlled end group stoichiometry, comprising a surface layer, at least one sub-surface layer, and a first end group that is the residue of an antitumor pharmaceutical agent, derivative or precursor thereof,
A macromolecule comprising at least two end groups comprising an anti-tumor pharmaceutical agent and / or a second end group selected to modify the pharmacokinetics of the macromolecule;
A method comprising administering an effective amount of a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient therefor (where end group stoichiometry is the number and type of end groups Is provided).
ある実施形態では、高分子が一つ以上のリンカー部分をさらに含み、その一つ以上のリンカー部分が第1および/または第2末端基を高分子の骨組みに取付ける。 In certain embodiments, the polymer further comprises one or more linker moieties, wherein the one or more linker moieties attach the first and / or second end groups to the polymer framework.
抗腫瘍医薬剤は任意の適切なタイプであることができる。細胞毒性剤、サイトカイン、抗血管新生剤、抗有糸分裂剤などを使用するか、またはそれらの任意の組み合わせを使用することができる。 The anti-tumor pharmaceutical agent can be of any suitable type. Cytotoxic agents, cytokines, anti-angiogenic agents, anti-mitotic agents, etc. can be used, or any combination thereof can be used.
抗腫瘍剤は以下の一つ以上から選択することができる:リツキシマブ、オキサリプラチン、ドセタキセル、ゲムシタビン、トラスツズマブ、イリノテカン、パクリタキセル、ベバシズマブ、カルボプラチン、セツキシマブ、ドキソルビシン、ペメトレキセド、エピルビシン、ボルテゾミブ、トポテカン、アザシチジン、ビノレルビン、ミトキサントロン、フルダラビン、ドキソルビシン、アレムツズマブ、カルムスチン、イホスファミド、イダルビシン、マイトマイシン、フルオロウラシル、シスプラチン、メトトレキサート、メルファラン、ヒ素、デニロイキン・ジフティトクス(denileukin diftitox)、シタラビン、レボホリナートカルシウム、シクロホスファミド、エトポシド、ヤドリギ(viscum album)、メスナ、ゲムツズマブ、オゾガミシン、ブスルファン、ペントスタチン、クラドリビン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ベンダムスチン、ダカルバジン、ラルチトレキセド、ビンクリスチン、ホテムスチン、リン酸エトポシド、ポルフィマーナトリウムおよびビンブラスチン。 The antineoplastic agent can be selected from one or more of the following: rituximab, oxaliplatin, docetaxel, gemcitabine, trastuzumab, irinotecan, paclitaxel, bevacizumab, carboplatin, cetuximab, doxorubicin, pemetrexed, epirubicin, bortepomibine , Mitoxantrone, fludarabine, doxorubicin, alemtuzumab, carmustine, ifosfamide, idarubicin, mitomycin, fluorouracil, cisplatin, methotrexate, melphalan, arsenic, denileukin diftitox, denitalukin diftitox, cytarabine, levoforifamide Mistletoe (viscum album), mesna, gemtuzumab, ozogamicin , Busulfan, pentostatin, cladribine, bleomycin, daunorubicin, bendamustine, dacarbazine, raltitrexed, vincristine, hotemustine, etoposide phosphate, porfimer sodium and vinblastine.
好ましい実施形態では、抗腫瘍医薬剤が、メトトレキサート、タキソール、シスプラチン、カルボプラチンおよびドキソルビシンの一つ以上から選択される。 In a preferred embodiment, the anti-tumor pharmaceutical agent is selected from one or more of methotrexate, taxol, cisplatin, carboplatin and doxorubicin.
第2末端基は、医薬活性物質の血漿中半減期が延びるように選択することができる。第2末端基は、一つ以上の特異的細胞タイプまたは組織タイプへの抗腫瘍医薬剤のターゲティングおよび/または取り込みが容易になるように選択することができる。好ましい実施形態では、第2末端基がポリエチレングリコール(PEG基)またはポリエチルオキサゾリンを含む。 The second end group can be selected to increase the plasma half-life of the pharmaceutically active substance. The second end group can be selected to facilitate targeting and / or uptake of the anti-tumor pharmaceutical agent to one or more specific cell types or tissue types. In a preferred embodiment, the second end group comprises polyethylene glycol (PEG group) or polyethyloxazoline.
薬学的に許容できる担体または賦形剤は、その活性物質のために選択した送達経路に応じて、任意の既知担体または既知賦形剤から選択することができる。 The pharmaceutically acceptable carrier or excipient can be selected from any known carrier or known excipient, depending on the delivery route selected for the active agent.
本発明の高分子、特にデンドリマーは、医薬活性剤をリンパ系にターゲティングするために使用することができる。 The polymers of the invention, in particular dendrimers, can be used to target pharmaceutically active agents to the lymphatic system.
リンパ系は、身体の脈管領域の全体にわたって分布する特殊化した脈管、節およびリンパ組織が集合した区域の複雑なネットワークからなる。リンパ管は主として体液平衡の維持を担っているが、腸吸収および中性脂肪の輸送ならびに効果的な免疫防御機構の維持にも役割を果たしている。大半の毛細管床では、血管内皮が連続していて、途切れることのない基底膜を伴っている。したがって毛細血管は(例えば皮下または筋肉内注射によって)間質腔に注入された大分子および小粒子に対する透過性が比較的低い。対照的に、毛細リンパ管は、不完全な基底膜を伴うオーバーラップした内皮細胞の単層からなる。これは、毛細血管に見られるものよりも「開いた」細胞間ジャンクションを持つ内皮層をもたらす。細胞間ジャンクション距離の推定値は、数ミクロン(3〜5)から15〜20nm(5〜10)の範囲に及ぶ。したがって、これら大きな細胞間ジャンクションは、間質腔からリンパ管への高分子、コロイドおよび潜在的にはデンドリマーの優先的輸送または排出を容易にしうる。 The lymphatic system consists of a complex network of specialized vessels, nodes and areas of lymphatic tissue that are distributed throughout the vascular region of the body. Lymphatic vessels are primarily responsible for maintaining fluid balance, but also play a role in maintaining intestinal absorption and transport of neutral fat and effective immune defense mechanisms. In most capillary beds, the vascular endothelium is continuous, with an unbroken basement membrane. Capillaries are therefore relatively poorly permeable to large and small particles injected into the interstitial space (eg, by subcutaneous or intramuscular injection). In contrast, capillary lymph vessels consist of a monolayer of overlapping endothelial cells with an incomplete basement membrane. This results in an endothelial layer with an “opener” intercellular junction than that found in capillaries. Estimates of intercellular junction distances range from a few microns (3-5) to 15-20 nm (5-10). Thus, these large intercellular junctions can facilitate preferential transport or excretion of macromolecules, colloids and potentially dendrimers from the interstitial space to the lymphatic vessels.
リンパ管への指向的送達または標的送達に関して言うと、リンパは、腫瘍転移の播種に際して主たる導管としても働き、固形腫瘍からの転移の拡散を叩くために設計された細胞毒性剤のターゲットして広く利用されている。リンパ中に比較的高濃度に存在するBリンパ球およびTリンパ球も、インターフェロンなどのサイトカインおよび免疫調節薬全般にとって魅力的なターゲットになる。さらに、最近、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)陽性患者において、リンパ組織にウイルス負荷量の増加およびウイルス増殖の増加が見出されたことから、HIVおよびAIDSの処置における治療ターゲットとして、リンパへの関心が高まっている。現在までに、リンパ節への薬物の標的送達をもたらすリポソーム製剤が、特に抗癌薬ドキソルビシン(Doxil/Caelyx)に関して、いくつか開発されている(16〜21)。 In terms of directed or targeted delivery to lymphatic vessels, lymph also serves as the primary conduit for tumor metastasis dissemination and is widely used as a target for cytotoxic agents designed to counter the spread of metastases from solid tumors. It's being used. B lymphocytes and T lymphocytes, which are present in relatively high concentrations in the lymph, are also attractive targets for cytokines such as interferons and immunomodulators in general. In addition, recently, in human immunodeficiency virus (HIV) positive patients, lymphoid tissue has been found to have increased viral load and increased viral growth, which has led to interest in lymph as a therapeutic target in the treatment of HIV and AIDS. Is growing. To date, several liposomal formulations that provide targeted delivery of drugs to lymph nodes have been developed, particularly with respect to the anticancer drug doxilubicin (Doxil / Caelyx) (16-21).
したがって、本発明のさらにもう一つの態様では、動物のリンパ系に医薬活性剤を標的送達するための方法であって、その動物に、
・制御された末端基化学量論を持つ高分子であって、表面層、少なくとも一つのサブ表面層、ならびに
医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、
医薬活性剤および/または高分子のリンパへの取り込みを容易にするために選択される第2末端基
を含む少なくとも二つの末端基を含む高分子の有効量と、
・そのための薬学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤
とを投与することを含む方法が提供される。
Accordingly, in yet another aspect of the invention, a method for targeted delivery of a pharmaceutically active agent to an animal's lymphatic system, comprising:
A polymer with controlled end group stoichiometry, a surface layer, at least one subsurface layer, and a first end group that is the residue of a pharmaceutically active agent, derivative or precursor thereof,
An effective amount of a macromolecule comprising at least two end groups comprising a second end group selected to facilitate uptake of the pharmaceutically active agent and / or macromolecule into the lymph;
• A method is provided comprising administering a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient therefor.
好ましい実施形態では、第2末端基がPEGまたはポリエチルオキサゾリンである。好ましい実施形態では、PEG基が比較的単分散であって、200〜10,000ダルトンの分子量範囲から選択され、より好ましくは、PEG基は500〜5,000ダルトンの分子量範囲から選択される。さらにもう一つの好ましい実施形態では、第2末端基が約1000ダルトンより大きい分子量を持つPEGである。さらにもう一つの好ましい実施形態では、第2末端基が、約1500ダルトンより大きい分子量を持つPEGモチーフである。 In a preferred embodiment, the second end group is PEG or polyethyloxazoline. In a preferred embodiment, the PEG groups are relatively monodisperse and are selected from a molecular weight range of 200 to 10,000 daltons, more preferably the PEG groups are selected from a molecular weight range of 500 to 5,000 daltons. In yet another preferred embodiment, the second end group is PEG with a molecular weight greater than about 1000 Daltons. In yet another preferred embodiment, the second end group is a PEG motif having a molecular weight greater than about 1500 daltons.
好ましい実施形態では、デンドリマーが約20kDaより大きい分子量、好ましくは約30kDaより大きい分子量、より好ましくは約50kDaより大きい分子量を持つ。 In a preferred embodiment, the dendrimer has a molecular weight greater than about 20 kDa, preferably greater than about 30 kDa, more preferably greater than about 50 kDa.
好ましい実施形態では、デンドリマーが、第1末端基をデンドリマーの骨組みに取付ける切断可能なまたは非切断可能なリンカー部分を含む。 In a preferred embodiment, the dendrimer comprises a cleavable or non-cleavable linker moiety that attaches the first end group to the dendrimer skeleton.
好ましい実施形態では、デンドリマーが、ヒトを含む動物に、皮下注射によって投与される。 In a preferred embodiment, dendrimers are administered by subcutaneous injection to animals, including humans.
高分子の合成
さらにもう一つの態様として、本発明は、制御された末端基化学量論を持つ高分子であって、表面層、少なくとも一つのサブ表面層および二つ以上の異なる末端基を持ち、少なくとも一つの末端基が医薬活性剤、その誘導体、その前駆体、またはその残基であり、かつ少なくとも一つの末端基が医薬活性剤の薬物動態を修飾するために選択される高分子(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)を製造する方法を提供する。
In yet another embodiment, the present invention provides a polymer having controlled end group stoichiometry having a surface layer, at least one subsurface layer, and two or more different end groups. At least one end group is a pharmaceutically active agent, derivative thereof, precursor thereof, or residue thereof, and at least one end group is selected to modify the pharmacokinetics of the pharmaceutically active agent (this In some cases, end group stoichiometry refers to the number and type of end groups).
本発明のデンドリマーを合成するためのプロセスには、成長中のデンドリマーコア部分と、世代構築化合物としてのリジンまたはリジン類似体の一つ以上の層との逐次的な反応が含まれる。合成プロセス中にデンドリティックモチーフが成長中の高分子コアに取付けられる位置となるユニークな点に相当するリジン類似体の頂端カルボキシレートFは、保護されていないアミン部分との反応に先だって、必然的に活性化されるだろう。リジン類似体のアミン基AおよびBのそれぞれは、自己縮合を防ぐために保護される。世代構築化合物のカルボキシレートFを、成長中のデンドリマーの保護されていない窒素と反応させる場合、世代構築化合物のアミンAおよびBは、常に保護される。さらにまた、保護されていないアミンと活性化されたリジン類似体との反応は、常に、保護されていないアミンが選択したリジン類似体と完全に反応することが保証されるような形で行われる。これは、最も簡単には、化学量論的過剰量の活性化リジン類似体を使用することによって行われる。 The process for synthesizing the dendrimers of the present invention involves the sequential reaction of a growing dendrimer core moiety with one or more layers of lysine or lysine analogs as generation building compounds. The apical carboxylate F of the lysine analog, which represents the unique point where the dendritic motif is attached to the growing polymer core during the synthesis process, is inevitably required prior to reaction with the unprotected amine moiety. Will be activated. Each of the amine groups A and B of the lysine analog is protected to prevent self-condensation. When the carboxylate F of the generation building compound is reacted with the unprotected nitrogen of the growing dendrimer, the amines A and B of the generation building compound are always protected. Furthermore, the reaction of the unprotected amine with the activated lysine analog is always carried out in a manner that ensures that the unprotected amine reacts completely with the selected lysine analog. . This is most simply done by using a stoichiometric excess of activated lysine analog.
本発明のデンドリマーを合成するためのプロセスは、成長中のデンドリマーの保護されていないアミンと、医薬活性物質、細胞表面リガンド、およびPEGなどのリンカー基または末端基との反応を含みうる。いずれの場合も、リンカーまたは末端基のカルボキシレート基は、反応に先だって、または系中(in situ)で、アミド結合形成のために活性化される。リンカー基のアミンは保護されるか、既に末端基と反応している。さらにまた、成長中のデンドリマーの保護されていないアミンと活性化されたリンカーまたは末端基との反応は、典型的には活性化された基を過剰に使用することにより、保護されていないアミンが活性化された基と完全に反応することが保証されるような形で行われる。 The process for synthesizing the dendrimers of the present invention may involve the reaction of the unprotected amine of the growing dendrimer with a pharmaceutically active agent, a cell surface ligand, and a linker or end group such as PEG. In either case, the linker or terminal carboxylate group is activated for amide bond formation prior to the reaction or in situ. The amine of the linker group is protected or already reacted with the end group. Furthermore, the reaction of the unprotected amine of the growing dendrimer with an activated linker or end group typically results in the unprotected amine being removed by using an excess of the activated group. It is carried out in such a way that it is guaranteed to react completely with the activated group.
保護基を除去する順序は、異なるアミン保護基を含むデンドリマーを製造するために使用しうる反応のシーケンスを決定する上で、特にあるアミン保護基に関する切断条件が傍観アミン保護基の喪失につながりうる場合には、重要な因子になりうる。以下の保護基の表に、分割可能なアミノ保護基およびオルトゴナルなアミン保護基の好ましいセットを示す。 The order in which protecting groups are removed determines the sequence of reactions that can be used to produce dendrimers containing different amine protecting groups, and in particular the cleavage conditions for certain amine protecting groups can lead to the loss of bystander amine protecting groups. In some cases, it can be an important factor. The following table of protecting groups shows a preferred set of resolvable amino protecting groups and ortho amine protecting groups.
分割可能なアミン保護基のセットとは、切断するつもりのない基が切断条件に対して不活性であるような除去の順序が存在するセットであると定義される。保護基がオルトゴナルであると定義される場合、これは、各基がそのオルトゴナルセットの他の基のそれぞれを除去するために要求される切断条件に対して不活性であることを意味する。例示的アミン保護基に関する情報は以下の参考文献に求めることができる:Greene, T.W.およびWuts, P.G.M.「Protective groups in Organic Synthesis」(第3版、John Wiley and Sons、ニューヨーク、1999)、Kocienski, P.J.「Protecting Groups」(第3版、Thieme、シュトゥットガルト、2004)。好ましいアミン保護基は表2から選択することができる。 A set of resolvable amine protecting groups is defined as a set in which there is an order of removal such that groups that are not intended to cleave are inert to the cleavage conditions. When a protecting group is defined as orthogonal, this means that each group is inert to the cleavage conditions required to remove each of the other groups in the orthogonal set. Information on exemplary amine protecting groups can be found in the following references: Greene, TW and Wuts, PGM “Protective groups in Organic Synthesis” (3rd edition, John Wiley and Sons, New York, 1999), Kocienski, PJ "Protecting Groups" (3rd edition, Thieme, Stuttgart, 2004). Preferred amine protecting groups can be selected from Table 2.
1.表の第1列に挙げた保護基と、表の最上段に挙げた保護基との組み合わせを、「分割可能」(R)または「オルトゴナル」(O)と定義する。ある組み合わせが「分割可能」とみなされる場合、カッコ内の保護基は、最初に除去されるべき基を表す。
2.2-クロロ-Cbzおよび2-ブロモ-Cbzを指す。
3.分割可能でもオルトゴナルでもない組み合わせ。
1. The combination of the protecting group listed in the first column of the table and the protecting group listed at the top of the table is defined as “divisible” (R) or “orthogonal” (O). When a combination is considered “dividable”, the protecting group in parentheses represents the group to be removed first.
2. Refers to 2-chloro-Cbz and 2-bromo-Cbz.
3. Combinations that are neither split nor orthogonal.
さらにもう一つの態様として、本発明は、
(i)・官能基および二つ以上の異なる保護基を有する外側層を含む成長中の高分子、
・医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基の前駆体、および
・医薬活性剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基の前駆体
を供給するステップ、
(ii)第1保護基を除去することによって外側層上の官能基を脱保護するステップ、
(iii)第1または第2末端基前駆体の一方を活性化するステップ、
(iv)脱保護された官能基を活性化された末端基前駆体と反応させるステップ、
(v)第2の保護基を除去することによって外側層上の官能基を脱保護するステップ、
(vi)他方の第1または第2末端基前駆体を活性化するステップ、および
(iv)脱保護された官能基を活性化された末端基前駆体と反応させるステップ
を含む、制御された末端基化学量論を持つ高分子を製造するためのプロセス(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)を提供する。
As yet another aspect, the present invention provides:
(I) a growing polymer comprising an outer layer having a functional group and two or more different protecting groups,
A precursor of a first end group that is the residue of a pharmaceutically active agent, derivative or precursor thereof, and a second end group selected to modify the pharmacokinetics of the pharmaceutically active agent and / or polymer. Supplying a precursor;
(Ii) deprotecting the functional group on the outer layer by removing the first protecting group;
(Iii) activating one of the first or second end group precursors;
(Iv) reacting the deprotected functional group with an activated end group precursor;
(V) deprotecting the functional group on the outer layer by removing the second protecting group;
A controlled end comprising: (vi) activating the other first or second end group precursor; and (iv) reacting the deprotected functional group with the activated end group precursor. A process for producing a polymer with group stoichiometry (where end group stoichiometry refers to the number and type of end groups) is provided.
さらにもう一つの態様として、本発明は、
(i)・官能基および二つ以上の異なる保護基を有する外側層を含む成長中の高分子、
・医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基前駆体、および
・医薬活性剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基、ならびに
・カルボキシレート基および保護されたアミン基を含むリンカー部分
を供給するステップ、
(ii)第1保護基を除去することによって外側層上の官能基を脱保護するステップ、
(iii)リンカー部分上のカルボキシレート基を活性化するステップ
(iv)脱保護された官能基をリンカー部分上の活性化されたカルボキシレート基と反応させるステップ、
(v)リンカー部分上のアミン基を脱保護するステップ、
(vi)第1または第2末端基前駆体の一方を活性化するステップ、
(vii)脱保護されたアミン基を活性化された末端基前駆体と反応させるステップ、
(viii)第2の保護基を除去することによって外側層上の官能基を脱保護するステップ、
(ix)他方の第1または第2末端基前駆体を活性化するステップ、および
(x)脱保護された官能基を活性化された末端基と反応させるステップ
を含む、制御された末端基化学量論を持つ高分子を製造するためのプロセス(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)を提供する。
As yet another aspect, the present invention provides:
(I) a growing polymer comprising an outer layer having a functional group and two or more different protecting groups,
A first terminal group precursor that is the residue of a pharmaceutically active agent, derivative or precursor thereof, and a second terminal group selected to modify the pharmacokinetics of the pharmaceutically active agent and / or polymer, and Providing a linker moiety comprising a carboxylate group and a protected amine group;
(Ii) deprotecting the functional group on the outer layer by removing the first protecting group;
(Iii) activating a carboxylate group on the linker moiety (iv) reacting the deprotected functional group with an activated carboxylate group on the linker moiety;
(V) deprotecting the amine group on the linker moiety;
(Vi) activating one of the first or second end group precursors;
(Vii) reacting a deprotected amine group with an activated end group precursor;
(Viii) deprotecting the functional group on the outer layer by removing the second protecting group;
Controlled end group chemistry comprising (ix) activating the other first or second end group precursor, and (x) reacting the deprotected functional group with the activated end group Provides a process for producing a polymer with stoichiometry, where end group stoichiometry refers to the number and type of end groups.
本発明の高分子を合成するための好ましいプロセスは、成長中の高分子に取付けるための表面修飾剤化合物を用意するという予備ステップを含む。表面修飾剤化合物は、
・成長中の高分子へのその修飾化合物の取付けを容易にするためのカルボキシレート基、
・医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、および/または
・医薬活性剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基
を含む。
A preferred process for synthesizing the polymers of the present invention involves the preliminary step of providing a surface modifier compound for attachment to a growing polymer. The surface modifier compound is
A carboxylate group to facilitate attachment of the modifying compound to a growing polymer,
A first terminal group that is the residue of a pharmaceutically active agent, derivative or precursor thereof, and / or a second terminal group selected to modify the pharmacokinetics of the pharmaceutically active agent and / or macromolecule .
末端基の表面基化学量論(数およびタイプ)は、末端アミン保護基表面基化学量論およびトポロジーが確立されているデンドリティックモチーフの使用によって制御することができる。そのようなアプローチは、純度の高い本発明のデンドリマーをもたらしうることが、観察されている。 The surface group stoichiometry (number and type) of the end groups can be controlled by the use of dendritic motifs with established terminal amine protecting group surface group stoichiometry and topology. It has been observed that such an approach can result in a highly pure dendrimer of the invention.
表面修飾剤化合物は任意の適切な方法で製造することができる。ある実施形態では、表面修飾剤化合物を製造するためのプロセスであって、
(i)・二つ以上の異なるアミン保護基およびカルボキシレート基を有するリジンまたはリジン類似体化合物、
・医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基の前駆体、および
・医薬活性剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基の前駆体
を供給するステップ、
(ii)保護されたリジンまたはリジン類似体化合物上の第1アミンを脱保護するステップ、
(iii)第1または第2末端基前駆体を活性化するステップ、
(iv)活性化された末端基前駆体を脱保護されたアミン基と反応させるステップ、
(v)保護されたリジンまたはリジン類似体化合物上の第2アミンを脱保護するステップ、
(vi)他方の第1または第2末端基前駆体を活性化するステップ、および
(vii)前記他方の活性化された末端基前駆体を第2の脱保護されたアミン基と反応させて表面修飾剤化合物を得るステップ
を含むプロセスが提供される。
The surface modifier compound can be produced by any suitable method. In certain embodiments, a process for producing a surface modifier compound comprising:
(i) lysine or lysine analog compounds having two or more different amine protecting groups and carboxylate groups,
A precursor of a first end group that is the residue of a pharmaceutically active agent, derivative or precursor thereof, and a second end group selected to modify the pharmacokinetics of the pharmaceutically active agent and / or polymer. Supplying a precursor;
(Ii) deprotecting a primary amine on the protected lysine or lysine analog compound;
(Iii) activating the first or second end group precursor;
(Iv) reacting the activated end group precursor with a deprotected amine group;
(V) deprotecting the secondary amine on the protected lysine or lysine analog compound;
(Vi) activating the other first or second end group precursor; and (vii) reacting said other activated end group precursor with a second deprotected amine group to surface A process is provided that includes obtaining a modifier compound.
表面修飾剤化合物は、好ましくは、リジンまたはリジン類似体バックボーンを含む。表面修飾剤化合物は、そのバックボーン内に複数のリジンまたはリジン類似体モチーフを含みうる。 The surface modifier compound preferably comprises a lysine or lysine analog backbone. The surface modifier compound can include multiple lysine or lysine analog motifs in its backbone.
本発明の表面修飾剤化合物を合成するためのプロセスは、一つ以上の末端アミン保護基を除去して一つ以上の反応性アミン基を得ることを含みうる。次に、これらの反応性アミン基を、第1または第2末端基の前駆体と反応させる。末端基前駆体のカルボキシレート部分は、反応に先だって、または系中で、アミド結合形成のために活性化されるだろう。さらにまた、リジンまたはリジン類似体バックボーンの保護されていないアミンと、活性化された末端基との反応は、保護されていないアミンが活性化された末端基と完全に反応することが保証されるような形で、典型的には活性化された基を化学量論的過剰に使用することによって行うことができる。 The process for synthesizing the surface modifier compounds of the present invention can include removing one or more terminal amine protecting groups to obtain one or more reactive amine groups. These reactive amine groups are then reacted with a precursor of the first or second end group. The carboxylate portion of the end group precursor will be activated for amide bond formation prior to reaction or in the system. Furthermore, the reaction of the unprotected amine of the lysine or lysine analog backbone with the activated end group ensures that the unprotected amine reacts completely with the activated end group. In such a manner, it can typically be done by using a stoichiometric excess of the activated group.
ある実施形態では、表面修飾剤化合物を製造するためのプロセスが、場合により、リジンまたはリジン類似体バックボーン上に存在する末端アミン上の保護基の除去に先だって、選択したカルボキシレート基を保護することを含みうる。保護カルボキシレート基に使用される保護基は、好ましくは、末端アミン上に存在する保護基を除去するのに要求される条件に対して安定である。メチルエステル、より好ましくはエチルエステルなどのカルボキシレート保護基は適切である。例示的カルボキシレート保護基に関する情報は以下の参考文献に求めることができる:Greene, T.W.およびWuts, P.G.M.「Protective groups in Organic Synthesis」(第3版、John Wiley and Sons、ニューヨーク、1999)、Kocienski, P.J.「Protecting Groups」(第3版、Thieme、シュトゥットガルト、2004)。 In certain embodiments, the process for producing the surface modifier compound optionally protects the selected carboxylate group prior to removal of the protecting group on the terminal amine present on the lysine or lysine analog backbone. Can be included. The protecting group used for the protected carboxylate group is preferably stable to the conditions required to remove the protecting group present on the terminal amine. Carboxylate protecting groups such as methyl esters, more preferably ethyl esters are suitable. Information on exemplary carboxylate protecting groups can be found in the following references: Greene, TW and Wuts, PGM “Protective groups in Organic Synthesis” (3rd edition, John Wiley and Sons, New York, 1999), Kocienski, PJ "Protecting Groups" (3rd edition, Thieme, Stuttgart, 2004).
表面修飾剤化合物の合成が、末端基の付加後に、さらなる脱保護ステップを要求する場合は、後続の反応に対するこの末端基の安定性を考慮することが重要である。末端基付加の好ましいシーケンスでは、医薬活性剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基を、まず、リジンまたはリジン類似体バックボーンに付加する。さらにまた、医薬活性剤をリジンまたはリジン類似体バックボーンに不安定なリンカーを介して取付けるべき情況においては、リジンまたはリジン類似体バックボーンの保護されていない末端アミン基の反応に先だって、デンドリティックモチーフコアの選択したカルボキシレートを脱保護することが必要になる場合があり、さらにまた、リジンまたはリジン類似体バックボーンの選択したカルボキシレートが保護されていない場合は、医薬活性剤-リンカー部分のカルボキシレート基を、保護されていない末端アミン基が生じる前に、活性化する必要があるだろう。 If the synthesis of the surface modifier compound requires an additional deprotection step after the addition of the end group, it is important to consider the stability of this end group for subsequent reactions. In a preferred sequence of end group addition, a second end group selected to modify the pharmacokinetics of the pharmaceutically active agent and / or macromolecule is first added to the lysine or lysine analog backbone. Furthermore, in situations where a pharmaceutically active agent should be attached to a lysine or lysine analog backbone via a labile linker, the dendritic motif core is preceded by reaction of the unprotected terminal amine group of the lysine or lysine analog backbone. It may be necessary to deprotect the selected carboxylate of the lysine or lysine analog backbone when the selected carboxylate of the lysine or lysine analog backbone is not protected. May need to be activated before the unprotected terminal amine group occurs.
次に、表面修飾剤化合物を合成するためのプロセスは、末端アミン保護基のさらなる除去と、表面修飾剤化合物の表面修飾を完了するための追加末端基との反応を含みうる。表面修飾剤化合物の選択したカルボキシレートが保護基を有する場合、保護されたカルボキシレートは、末端基が全て取付けられてから脱保護されるか、不安定なリンカーの取付けに先だって脱保護されるだろう。表面修飾剤化合物の選択したカルボキシレートが脱保護された後は、保護されていない末端アミン基と末端基のカルボキシレートの間にアミド結合を形成するための後続の反応は全て、末端基のカルボキシレートが表面修飾剤化合物の導入に先だって活性化されることを必要とするだろう。 The process for synthesizing the surface modifier compound can then include further removal of the terminal amine protecting group and reaction with additional end groups to complete the surface modification of the surface modifier compound. If the selected carboxylate of the surface modifier compound has a protecting group, the protected carboxylate may be deprotected after all of the end groups have been attached, or deprotected prior to attachment of the labile linker. Let's go. After the selected carboxylate of the surface modifier compound is deprotected, all subsequent reactions to form an amide bond between the unprotected terminal amine group and the terminal carboxylate are all carboxy groups of the terminal group. The rate will need to be activated prior to the introduction of the surface modifier compound.
次に、本発明の高分子を合成するためのプロセスは、成長中の高分子の保護されていないアミンを表面修飾剤化合物と反応させることによって続けられる。デンドリティックモチーフのカルボキシレート部分は、反応に先だって、または系中で、アミド結合形成のために活性化されるだろう。好ましい方法では、表面修飾剤化合物のカルボキシレート部分が系中で活性化される。この方法は好ましく、成長中の高分子コア上または表面修飾剤化合物上に、遮蔽されていないヒドロキシル部分が存在する場合には、水または他のヒドロキシル供与体を含めることにより、高分子への偶発的なエステル結合の形成を制限することが可能である。ある実施形態では、表面修飾剤化合物が、リンカー部分を介して成長中の高分子に取付けられる。 The process for synthesizing the polymer of the present invention is then continued by reacting the unprotected amine of the growing polymer with a surface modifier compound. The carboxylate portion of the dendritic motif will be activated for amide bond formation prior to reaction or in the system. In a preferred method, the carboxylate moiety of the surface modifier compound is activated in the system. This method is preferred, and in the presence of an unmasked hydroxyl moiety on the growing polymer core or surface modifier compound, accidental introduction to the polymer by including water or other hydroxyl donors. It is possible to limit the formation of typical ester bonds. In certain embodiments, the surface modifier compound is attached to the growing polymer via a linker moiety.
したがって、本発明の代替実施形態では、
(i)・官能基および一つ以上の保護基を有する外側層を含む成長中の高分子、ならびに
・カルボキシレート基
医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、および
医薬活性剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基
を含む表面修飾剤化合物
を供給するステップ、
(ii)表面修飾剤化合物上のカルボキシレート基を活性化するステップ、
(iii)保護基を除去することによって、成長中の高分子の外側層上の官能基を脱保護するステップ、
(vii)成長中の高分子上の脱保護された官能基を、表面修飾剤化合物上の活性化されたカルボキシレート基と反応させるステップ
を含む、制御された末端基化学量論を持つ高分子を製造するためのプロセス(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)が提供される。
Thus, in an alternative embodiment of the invention,
(I) a growing polymer comprising an outer layer having a functional group and one or more protecting groups, and a first terminal group that is the residue of a carboxylate group pharmaceutically active agent, derivative or precursor thereof, Providing a surface modifier compound comprising a second terminal group selected to modify the pharmacokinetics of the pharmaceutically active agent and / or macromolecule;
(Ii) activating a carboxylate group on the surface modifier compound;
(Iii) deprotecting the functional groups on the outer layer of the growing polymer by removing the protecting groups;
(Vii) a polymer with controlled end group stoichiometry comprising reacting a deprotected functional group on the growing polymer with an activated carboxylate group on the surface modifier compound Is provided, wherein end group stoichiometry refers to the number and type of end groups.
本発明の高分子は、第1または第2末端基のどちらか一方に対してユニークな取付け点を含みうる。そうすることで、単一の第1または第2末端基を持つ高分子を合成することができる。好ましくは、ユニークな取付け点に取付けられる末端基は、医薬活性剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基である。より好ましくは、ユニークな取付け点に取付けられる第2末端基は、一つ以上の細胞タイプまたは組織タイプへの医薬活性剤のターゲティングおよび/または取り込みを容易にするために選択される。 The polymer of the present invention may comprise a unique attachment point for either the first or second end group. By doing so, it is possible to synthesize a polymer having a single first or second terminal group. Preferably, the end group attached to the unique attachment point is a second end group selected to modify the pharmacokinetics of the pharmaceutically active agent and / or macromolecule. More preferably, the second end group attached to the unique attachment point is selected to facilitate targeting and / or uptake of the pharmaceutically active agent to one or more cell types or tissue types.
代替実施形態では、本発明の高分子が、第1または第2末端基のどちらかに対して、選択された単一の取付け点を含みうる。 In an alternative embodiment, the polymer of the present invention may include a single selected attachment point for either the first or second end group.
ポリアミン分子の選択的モノ保護については、当技術分野では、その一般方法が記述されている。そのような方法は、KrapchoおよびKuell, Synthetic Commun. 1990 20 2559に記述されている。好ましい方法では、ユニークな取付け点を持つデンドリマーが、二価または三価コアから製造され、その場合、反応性アミン部分の一つだけが、リジンデンドリマーを構築するためのプロセス中に他のアミノ保護基を除去するために使用される条件に対して不活性またはオルトゴナルである保護基を使って保護される。次に、リジン縮合およびアミン脱保護のサイクルを反復することにより、他の末端アミン部分とはそのユニークなアミン保護基によって区別される単一の末端アミン部分が存在する1〜6世代(より好ましくは3〜5世代)のデンドリマーを構築することができる。このユニークな末端アミンは、単一の選択された分子、例えばタンパク質もしくはペプチド、またはターゲティング分子を、その位置をもって、デンドリマーに取付けることができる部位に相当する。 For selective mono-protection of polyamine molecules, the general methods are described in the art. Such a method is described in Krapcho and Kuell, Synthetic Commun. 1990 20 2559. In a preferred method, a dendrimer with a unique attachment point is produced from a divalent or trivalent core, in which case only one of the reactive amine moieties is subjected to other amino protection during the process to build lysine dendrimers. It is protected using a protecting group that is inert or orthogonal to the conditions used to remove the group. Then, by repeating the cycle of lysine condensation and amine deprotection, 1-6 generations (more preferred) where there is a single terminal amine moiety that is distinguished from other terminal amine moieties by its unique amine protecting group. Can build 3-5 generation dendrimers. This unique terminal amine corresponds to a site where a single selected molecule, such as a protein or peptide, or targeting molecule can be attached to the dendrimer at that position.
この実施形態の好ましい形式では、制御された末端基化学量論を持つ高分子であって、表面層、少なくとも一つのサブ表面層、ならびに
・ペプチドもしくはタンパク質、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基(この第1末端基は高分子上の単一の選択された取付け部位に取付けられる)、および
・ペプチドもしくはタンパク質および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基
を含む少なくとも二つの末端基を含む高分子(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)が提供される。
In a preferred form of this embodiment, the polymer has a controlled end group stoichiometry, comprising a surface layer, at least one subsurface layer, and residues of peptides or proteins, derivatives or precursors thereof. A first end group (which is attached to a single selected attachment site on the macromolecule), and selected to modify the pharmacokinetics of the peptide or protein and / or macromolecule A macromolecule comprising at least two end groups comprising a second end group (where end group stoichiometry refers to the number and type of end groups) is provided.
好ましい方法では、ユニークな末端アミン部分の保護基を除去し、その末端アミン部分を、ハロ酢酸誘導体またはマレイミド誘導体、例えば3-マレイミドプロピオン酸または4-マレイミド酪酸と、アミド結合が形成される条件下で反応させる。チオール含有ペプチドおよびタンパク質をそのようなチオール活性基にカップリングするための一般方法は、Pierce 1989 Handbook and General Catalogおよびそこに挙げられている参考文献に記載されている。 In a preferred method, a unique terminal amine moiety protecting group is removed and the terminal amine moiety is removed with a haloacetic acid derivative or maleimide derivative, such as 3-maleimidopropionic acid or 4-maleimidobutyric acid, under conditions where an amide bond is formed. React with. General methods for coupling thiol-containing peptides and proteins to such thiol active groups are described in the Pierce 1989 Handbook and General Catalog and references cited therein.
添付の実施例を参照して、以下に、本発明をさらに詳しく説明する。ただし、以下の説明は単なる例示であり、決して、上述した本発明の一般論に対する限定であると解釈してはならない。 The invention is described in more detail below with reference to the accompanying examples. However, the following description is merely an example and should in no way be construed as a limitation on the generality of the invention described above.
以下の実施例におけるデンドリマーの命名には以下の式を利用する:
コア[最後の完全な層;構築単位]n-[末端基]m[不完全な外側層;構築単位]p[末端基]q
式中、
・コアは、そこに活性化リジン世代構築単位が取付けられる分子であり、リジン構築単位の第1層が付加される少なくとも一つのアミン部分を含むだろう;
・nは、その高分子の最も外側の完全な層上にあるリジン構築単位の数であり、pは、その高分子の不完全な外側層上にあるリジン構築単位の数である:
・mは、最も外側の完全な構築単位層上にある末端基、例えば医薬活性部分または末端アミン保護基の数であり、qは、不完全な外側の構築単位層上にある末端基の数である;
・場合によっては末端基および/または構築単位がコアに付加される場合もあり、その場合、コアは、上記と同じ原則に従って、[末端基]r[構築単位]sと表される。
The following formula is used for dendrimer nomenclature in the following examples:
Core [last complete layer; building unit] n- [terminal group] m [incomplete outer layer; building unit] p [terminal group] q
Where
The core is a molecule to which the activated lysine generation building unit is attached and will contain at least one amine moiety to which the first layer of the lysine building unit is added;
N is the number of lysine building units on the outermost complete layer of the polymer and p is the number of lysine building units on the incomplete outer layer of the polymer:
M is the number of end groups on the outermost complete building unit layer, e.g. pharmaceutically active moiety or terminal amine protecting group, and q is the number of end groups on the incomplete outer building unit layer Is
In some cases, terminal groups and / or building units may be added to the core, in which case the core is represented as [terminal group] r [building unit] s according to the same principle as above.
この命名法では、コアおよび外側層が与えられることにより、高分子のサイズを完全に記述することができる。というのも、これらの高分子構造の構築にはリジン構築単位だけが使用され、コアの価数はわかっているからであり、さらにまた、各高分子層の表面アミン基の全てを、新しいリジン層の付加時に、リジンと完全に反応させるからである。 In this nomenclature, given the core and outer layers, the size of the polymer can be fully described. This is because only the lysine building units are used in the construction of these polymer structures, and the valence of the core is known. Furthermore, all the surface amine groups of each polymer layer are replaced with a new lysine. This is because when the layer is added, it completely reacts with lysine.
さらなる化学略号を表4に列挙する。
本発明で使用することができる医薬活性剤の例には、以下に挙げるものがある。 Examples of pharmaceutically active agents that can be used in the present invention include:
メトトレキサート
メトトレキサートはがんおよび自己免疫疾患の処置に用いられる代謝拮抗薬である。これは、ジヒドロ葉酸レダクターゼの競合的かつ可逆的阻害により、葉酸の代謝を阻害することによって作用する。化学的には、メトトレキサートはN-[4-[[(2,4-ジアミノ-6-プテリジニル)メチル]メチルアミノ]-ベンゾイル]-L-グルタミン酸である。分子量:454.45 C20H22N8O5で、構造式は
タキソール
タキソール(パクリタキセル)は、特に、従来の治療法には応答しなかった乳がんおよび卵巣がんを持つ婦人に処置薬として使用される抗有糸分裂剤である。これは、微小管を安定化し、微小管アセンブリを促進し、その結果として、細胞がその細胞骨格を柔軟に使用することができないようにすることによって作用する。タキソールは三環式ジテルペンであり、構造式は
ゼニカル(Zenical)(Xenical、Xenecal、Zencalともいう)は、肥満を管理するための体重コントロール医薬品である。これは、胃および小腸の内腔において、胃リパーゼおよび膵リパーゼの活性セリン残基部位と共有結合を形成することにより、その治療活性を発揮する。その結果、不活化された酵素は、トリグリセリドの形態をした食事脂肪を吸収可能な遊離脂肪酸およびモノグリセリドに加水分解するために利用することができなくなる。化学的には、ゼニカルは
インドメタシン
インドメタシン(indomethacin)(indometacinとも)は、発熱、疼痛、凝り、および腫脹を軽減するためによく用いられる非ステロイド性抗炎症薬である。これは、これらの症状を引き起こすことが知られている分子であるプロスタグランジン類の産生を阻害することによって機能する。
シクロスポリン
シクロスポリンは、移植における移植片対宿主反応の予防および処置に広く用いられる免疫抑制薬である。これは、免疫学的因子が病原的役割を持ちうる多種多様な他の疾患の治療についても試験されている。
(実施例2)
Cyclosporine cyclosporine is an immunosuppressant widely used for the prevention and treatment of graft-versus-host reactions in transplantation. It has also been tested for the treatment of a wide variety of other diseases where immunological factors may have a pathogenic role.
(Example 2)
メトトレキサート保有デンドリマー
末端基の約50%および約75%が薬物(具体的にはメトトレキサート)であるリジンデンドリマーを製造した。メトトレキサートは安定な結合によってデンドリマーにコンジュゲートすることができ、この構築物のクリアランスおよび生体内分布が決定される。
Lysine dendrimers were prepared in which about 50% and about 75% of the methotrexate-containing dendrimer end groups were drugs (specifically methotrexate). Methotrexate can be conjugated to the dendrimer by stable binding, and the clearance and biodistribution of this construct is determined.
個々のPEG基のサイズは、要求される血漿中寿命を維持し、肝取り込みを回避するために、その相対存在量が減少するにつれて増加させることが望ましいだろう。血漿曝露中は、メトトレキサートの「非切断可能」性によって、構築物の完全性が保たれる。 It may be desirable to increase the size of individual PEG groups as their relative abundance decreases to maintain the required plasma life span and avoid liver uptake. During plasma exposure, the “non-cleavable” nature of methotrexate preserves the integrity of the construct.
化合物の詳細な説明:
BHALys[Lys]16[α-PEG570]16[ε-MTX]16
BHALys[Lys]16[α-PEG1100]16[ε-MTX]16
BHALys[Lys]16[α-PEG1716]16[ε-MTX]16
BHALys[Lys]16[α-PEG2845]16[ε-MTX]16
BHALys[Lys]16[α-PEG3974]16[ε-MTX]16
BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[MTX]16[PEG570]16
BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[MTX]16[PEG1100]16
BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[MTX]16[PEG171616
BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[MTX]16[PEG2845]16
BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[MTX]16[PEG3974]16
式中、MTXはγ-カルボキシレート基を介してコンジュゲートされたメトトレキサート1を表す。このアプローチにおける重要な中間体は、Aust. J. Chem. 2002 55 635-645に記載の方法に従って製造される3である。
BHALys [Lys] 16 [α-PEG 570 ] 16 [ε-MTX] 16
BHALys [Lys] 16 [α-PEG 1100 ] 16 [ε-MTX] 16
BHALys [Lys] 16 [α-PEG 1716 ] 16 [ε-MTX] 16
BHALys [Lys] 16 [α-PEG 2845 ] 16 [ε-MTX] 16
BHALys [Lys] 16 [α-PEG 3974 ] 16 [ε-MTX] 16
BHALys [Lys] 8 [Su (NPN) 2 ] 16 [MTX] 16 [PEG 570 ] 16
BHALys [Lys] 8 [Su (NPN) 2 ] 16 [MTX] 16 [PEG 1100 ] 16
BHALys [Lys] 8 [Su (NPN) 2 ] 16 [MTX] 16 [PEG 171616
BHALys [Lys] 8 [Su (NPN) 2 ] 16 [MTX] 16 [PEG 2845 ] 16
BHALys [Lys] 8 [Su (NPN) 2 ] 16 [MTX] 16 [PEG 3974 ] 16
Where MTX represents
タキソール保有デンドリマー
タキソール保有デンドリマーの例には以下に挙げるものがある:
BHALys[Lys]16[α-PEG570]16[ε-COCH2CH2CO-タキソール]16
BHALys[Lys]16[α-PEG1100]16[ε-COCH2CH2CO-タキソール]16
BHALys[Lys]16[α-PEG1716]16[ε-COCH2CH2CO-タキソール]16
BHALys[Lys]16[α-PEG2845]16[ε-COCH2CH2CO-タキソール]16
BHALys[Lys]16[α-PEG3974]16[ε-COCH2CH2CO-タキソール]16
BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[PEG570]16[COCH2CH2CO-タキソール]16
BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[PEG1100]16[COCH2CH2CO-タキソール]16
BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[PEG1716]16[COCH2CH2CO-タキソール]16
BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[PEG2845]16[COCH2CH2CO-タキソール]16
BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[PEG3974[COCH2CH2CO-タキソール]16
BHALys[Lys]16[ε,ε-PEG570]8[COCH2CH2CO-タキソール]24
BHALys[Lys]16[ε,ε-PEG1100]8[COCH2CH2CO-タキソール]24
BHALys[Lys]16[ε,ε-PEG1716]8[COCH2CH2CO-タキソール]24
BHALys[Lys]16[ε,ε-PEG2845]8[COCH2CH2CO-タキソール]24
BHALys[Lys]16[ε,ε-PEG3974]8[COCH2CH2CO-タキソール]24 Taxol-carrying dendrimers Examples of taxol-carrying dendrimers include the following:
BHALys [Lys] 16 [α-PEG 570 ] 16 [ε-COCH 2 CH 2 CO-Taxol] 16
BHALys [Lys] 16 [α-PEG 1100 ] 16 [ε-COCH 2 CH 2 CO-Taxol] 16
BHALys [Lys] 16 [α-PEG 1716 ] 16 [ε-COCH 2 CH 2 CO-Taxol] 16
BHALys [Lys] 16 [α-PEG 2845 ] 16 [ε-COCH 2 CH 2 CO-Taxol] 16
BHALys [Lys] 16 [α-PEG 3974 ] 16 [ε-COCH 2 CH 2 CO-Taxol] 16
BHALys [Lys] 8 [Su (NPN) 2 ] 16 [PEG 570 ] 16 [COCH 2 CH 2 CO-Taxol] 16
BHALys [Lys] 8 [Su (NPN) 2 ] 16 [PEG 1100 ] 16 [COCH 2 CH 2 CO-Taxol] 16
BHALys [Lys] 8 [Su (NPN) 2 ] 16 [PEG 1716 ] 16 [COCH 2 CH 2 CO-Taxol] 16
BHALys [Lys] 8 [Su (NPN) 2 ] 16 [PEG 2845 ] 16 [COCH 2 CH 2 CO-Taxol] 16
BHALys [Lys] 8 [Su (NPN) 2 ] 16 [PEG 3974 [COCH 2 CH 2 CO-Taxol] 16
BHALys [Lys] 16 [ε, ε-PEG 570 ] 8 [COCH 2 CH 2 CO-Taxol] 24
BHALys [Lys] 16 [ε, ε-PEG 1100 ] 8 [COCH 2 CH 2 CO-Taxol] 24
BHALys [Lys] 16 [ε, ε-PEG 1716 ] 8 [COCH 2 CH 2 CO-Taxol] 24
BHALys [Lys] 16 [ε, ε-PEG 2845 ] 8 [COCH 2 CH 2 CO-Taxol] 24
BHALys [Lys] 16 [ε, ε-PEG 3974 ] 8 [COCH 2 CH 2 CO-Taxol] 24
タキソールのコンジュゲーションは、二つの異なる誘導体2および4(下記参照)を使って行うことができる。2の製造はJ. Med. Chem. 1989 32 788-792に記述されている。
このリジンデンドリマーは、さまざまな「切断可能」リンカーを介して取付けられた約50%および75%のタキソール末端基を含みうる。 The lysine dendrimer can contain about 50% and 75% taxol end groups attached via various “cleavable” linkers.
全Boc保護型として製造されるリジンデンドリマーは全て、国際特許出願WO95/34595(その内容は全て参照により本明細書に組み入れられる)に記載の手法に従って合成し、精製した。Boc保護基の除去は、WO95/34595に記載の手法に従って行った。 All lysine dendrimers produced as fully Boc protected forms were synthesized and purified according to the procedures described in International Patent Application WO 95/34595, the contents of which are all incorporated herein by reference. Removal of the Boc protecting group was performed according to the method described in WO95 / 34595.
シンチレーション計数の技法を使って生物学的マトリックス中のデンドリマー物質を検出することができるように、リジンデンドリマーがトリチウムを含有する必要がある場合は、1mgあたり5μCi〜15μCiの範囲の比放射能を持つ物質が得られるように(4,5-3H)-L-リジンを非放射性L-リジンで希釈することによって、これらの物質を製造した。次に、このトリチウム化リジンを使って、ジ-Boc-リジンのp-ニトロフェノール活性エステルを製造し、それを、WO95/34595に記載の方法を使って、ターゲットリジンデンドリマーの外側リジン層に組み込んだ。
(実施例4)
If the lysine dendrimer needs to contain tritium, it can have a specific activity in the range of 5 μCi to 15 μCi per mg so that scintillation counting techniques can be used to detect dendrimer material in the biological matrix These materials were prepared by diluting (4,5- 3 H) -L-lysine with non-radioactive L-lysine so that the materials were obtained. This tritiated lysine is then used to produce a p-nitrophenol active ester of di-Boc-lysine, which is incorporated into the outer lysine layer of the target lysine dendrimer using the method described in WO95 / 34595. It is.
(Example 4)
BHALys[( 3 H)-Lys] 8 [D-Lys] 16 [NH 2 ] 32 の合成
BHALys[(3H)-Lys]8[NH2.TFA]16(38mg、0.01mmol)の乾燥DMF(3mL)溶液を窒素下で撹拌したものに、D-リジンパラニトロフェノールエステル(181mg、0.38mmol)のDMF(4mL)およびトリエチルアミン(65μL、0.46mmol)溶液を加えた。反応混合物を室温で16時間撹拌した後、アセトニトリル(60mL)に注ぎ込み、6時間撹拌した。得られた微細固体を、0.45μm親水性ポリプロピレンメンブレンフィルターを通した濾過によって集め、減圧乾燥した。生成物BHALys[(3H)-Lys]8[D-Lys]16[Boc]32は微細なクリーム色の固体(40mg、56%)だった。BHALys[(3H)-Lys]8[D-Lys]16[Boc]32(34mg、0.005mmol)をCH2Cl2(1mL)に懸濁し、0℃に冷却した。TFA(398μL、2.58 mol)を滴下し、反応を0℃で10分間撹拌放置してから、室温まで温め、さらに3時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、得られた油状物にエーテルを加え、その溶液を摩砕したところ、白色固体が生じた。エーテルを傾斜し、固体をエーテルですすいだ(3回)。エーテルを除去した後、得られた固体を最少量の水に溶解し、Amberlyst(A-26 OH)イオン交換カラムに適用した。そのカラムから100mLの水を収集し、凍結乾燥によってその水を除去することにより、BHALys[(3H)-Lys]8[D-Lys]16[NH2]32を白色固体(15mg、79%)として得た。LC-MS:(親水性(Philic)TFA、溶媒和温度300℃)Rf(分)8.45。ESI(+ve)m/z=1386.6 (M/3), 1040.3 (M/4), 832.3 (M/5) 694.0 (M/6) 594.9 (M/7)。
(実施例5)
BHALys [(3 H) -Lys] 8 Synthesis of [D-Lys] 16 [NH 2] 32
BHALys [( 3 H) -Lys] 8 [NH 2 .TFA] 16 (38 mg, 0.01 mmol) in dry DMF (3 mL) was stirred under nitrogen with D-lysine paranitrophenol ester (181 mg, 0.38 mmol) in DMF (4 mL) and triethylamine (65 μL, 0.46 mmol) was added. The reaction mixture was stirred at room temperature for 16 hours, then poured into acetonitrile (60 mL) and stirred for 6 hours. The resulting fine solid was collected by filtration through a 0.45 μm hydrophilic polypropylene membrane filter and dried under reduced pressure. The product BHALys [( 3 H) -Lys] 8 [D-Lys] 16 [Boc] 32 was a fine cream solid (40 mg, 56%). BHALys [( 3 H) -Lys] 8 [D-Lys] 16 [Boc] 32 (34 mg, 0.005 mmol) was suspended in CH 2 Cl 2 (1 mL) and cooled to 0 ° C. TFA (398 μL, 2.58 mol) was added dropwise and the reaction was left to stir at 0 ° C. for 10 minutes, then warmed to room temperature and stirred for an additional 3 hours. The solvent was removed under reduced pressure, ether was added to the resulting oil and the solution was triturated to give a white solid. The ether was decanted and the solid was rinsed with ether (3 times). After removing the ether, the resulting solid was dissolved in a minimum amount of water and applied to an Amberlyst (A-26 OH) ion exchange column. Collect 100 mL of water from the column and remove the water by lyophilization to give BHALys [( 3 H) -Lys] 8 [D-Lys] 16 [NH 2 ] 32 as a white solid (15 mg, 79% ). LC-MS: (Philic TFA,
(Example 5)
カチオン性デンドリマーの血漿クリアランスおよび生体内分布
材料
緩衝液試薬はARグレードとした。水はMilliQ水精製システム(Millipore、オーストラリア)から得た。ヘパリン(10,000IU/mL)はFaulding(オーストラリア)から入手した。注射用食塩水は、Baxter Healthcare Pty Ltd(NSW、オーストラリア)から100mLポリエチレンバッグ入りを入手した。トリチウム化L-リジン(1mCi/ml)はMP Biomedicals(米国カリフォルニア州アーバイン)から購入した。非放射標識L-リジンはSigma Chemical Co(米国ミズーリ州セントルイス)から入手した。StarscintシンチレーションカクテルおよびSoluene-350組織可溶化剤はPackard Biosciences(コネティカット州メリデン)から購入した。タンパク質標準にはブルーデキストラン2000(2000kDa)、脂肪酸フリーウシ血清アルブミン(67kDa)、ペプシン(35kDa)、トリプシン(23.8kDa)、ミオグロビン(17.6kDa)、リボヌクレアーゼA(13.7kDa)、シトクロムC(12.4kDa)およびビタミンB12(1.4kDa)を含め、これらは全てSigma Chemical Co(米国ミズーリ州セントルイス)から入手した。より高分子量のタンパク質の溶出時間は、20μlのPrecision Plusタンパク質標準をカラムに注入することによって得た(Bio-Rad、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ)。
Plasma clearance and biodistribution of cationic dendrimers
The material buffer reagent was AR grade. Water was obtained from a MilliQ water purification system (Millipore, Australia). Heparin (10,000 IU / mL) was obtained from Faulding (Australia). Saline for injection was obtained in a 100 mL polyethylene bag from Baxter Healthcare Pty Ltd (NSW, Australia). Tritiated L-lysine (1 mCi / ml) was purchased from MP Biomedicals (Irvine, CA). Non-radiolabeled L-lysine was obtained from Sigma Chemical Co (St. Louis, MO). Starscint scintillation cocktail and Soluene-350 tissue solubilizer were purchased from Packard Biosciences (Meriden, Conn.). Protein standards include blue dextran 2000 (2000 kDa), fatty acid free bovine serum albumin (67 kDa), pepsin (35 kDa), trypsin (23.8 kDa), myoglobin (17.6 kDa), ribonuclease A (13.7 kDa), cytochrome C (12.4 kDa) and These were all obtained from Sigma Chemical Co (St. Louis, MO, USA), including vitamin B12 (1.4 kDa). Elution times for higher molecular weight proteins were obtained by injecting 20 μl of Precision Plus protein standard onto the column (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
3H標識デンドリマーを製造し、凍結乾燥粉末として用意した。供給前の精製は限外濾過およびサイズ排除クロマトグラフィー(Sephadex LH20、水で溶出)によって行い、イオン交換を利用して、遊離塩基型のアンキャップトアミン末端デンドリマーを得た。純度は、キャピラリー電気泳動、NMRおよび質量分析によって確かめた。デンドリマーの比放射能および分子量を表5に列挙する。
IV投与のために、3H-L-リジン(25μCi)を、リン酸緩衝食塩水(PBS、pH7.4)中の非放射標識リジンで、最終比放射能が20μCi/mgになるように新たに希釈した。 For IV administration, 3 HL-lysine (25 μCi) is diluted with non-radiolabeled lysine in phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4) to a final specific activity of 20 μCi / mg did.
デンドリマーは全てPBSに希釈し、使用するまで-20℃で凍結した。 All dendrimers were diluted in PBS and frozen at −20 ° C. until use.
活性決定およびシンチレーション計数
デンドリマーの比放射能は、既知質量を含有する原液をPBSに希釈することにより、3重に決定した。次に、一部を1mLのStarscintに加え、Packard Tri-Carb 2000CA Liquid Scintillation Analyser(コネティカット州メリデン)でシンチレーション計数を行った。三重測定値の平均を以降の全ての計算に使用した。
Activity determination and specific activity of scintillation counting dendrimers were determined in triplicate by diluting a stock solution containing a known mass in PBS. A portion was then added to 1 mL Starscint and scintillation counting was performed with a Packard Tri-Carb 2000CA Liquid Scintillation Analyzer (Meriden, Conn.). The average of triplicate measurements was used for all subsequent calculations.
生体内法
動物実験プロトコールは全て、モナシュ大学(Monash University;オーストラリア・ビクトリア州パークビル)ビクトリアン薬科大学動物倫理委員会(the Victorian College of Pharmacy Animal Ethics Committee)によって承認された。
All in vivo animal experiment protocols were approved by the Victorian College of Pharmacy Animal Ethics Committee at Monash University (Parkville, Victoria, Australia).
静脈内薬物動態研究
デンドリマー投与に先だって、Aliら(1999)J. Biol. Chem. 274:24066-24073に記述されているように、ラット(雄、スプレーグ・ドーリー、250〜350g)の頚静脈および頚動脈に、イソフルラン麻酔下で、カニューレ(ポリエチレン管、0.96×0.58mm、Paton Scientific(オーストラリア・ビクターハーバー))を挿入しておいた。これらのカニューレにはヘパリン加食塩水(1mlあたり2I.U.)を流し、溶封してから、回復中は頚の後ろの皮下ポケット中に挿入しておいた。投薬に先だってラットを一晩回復させた。ただし、投薬前の12時間は食物を与えなかった。この回復期間後は、尿および糞を別々に収集できるようにラットを代謝ケージで飼育し、薬物投与および血液収集が容易になるように、カニューレをスイベル/リーシュアセンブリに取付けた。水への自由なアクセスは常に許した。L-リジンのデンドリマーを1mlのリン酸緩衝食塩水(PBS)に溶解し、留置頚静脈カニューレを通して、2分間にわたる静脈内注入により、5mg/kgの用量で投与した。次に、投薬量が確実に全て注入されるように、カニューレに0.25mlのヘパリン加食塩水を流した。その後、以下の名目時点に、頚動脈から血液試料(0.15ml)を採取した:投薬前(-5分)、注入終了時(t=0)、および5、10、20、30、45、60、90、120、180、240、360、480、1440および1800分。血液試料は、10I.U.のヘパリンを含有するチューブに直ちに入れて、3500×gで5分間遠心分離した。次に、血漿(50μl)を1mlのStarscintシンチレーションカクテルに加え、ボルテックスしてからシンチレーション計数を行った。この血漿アッセイに関する定量限界(20dpm)は、スパイクした血漿試料の多重(n=5)解析を使って確認した。確度および精度は±20%以内だった。
Intravenous Pharmacokinetic Study Prior to dendrimer administration, the jugular vein of rats (male, Sprague Dawley, 250-350 g) and as described in Ali et al. The carotid artery had a cannula (polyethylene tube, 0.96 × 0.58 mm, Paton Scientific (Victor Harbor, Australia)) under isoflurane anesthesia. These cannulas were flushed with heparinized saline (2 I.U. per ml), sealed, and inserted into a subcutaneous pocket behind the neck during recovery. Rats were allowed to recover overnight prior to dosing. However, no food was given for 12 hours before dosing. After this recovery period, rats were housed in metabolic cages so that urine and feces could be collected separately, and a cannula was attached to the swivel / leash assembly to facilitate drug administration and blood collection. Free access to water was always allowed. L-lysine dendrimer was dissolved in 1 ml of phosphate buffered saline (PBS) and administered through an indwelling jugular cannula at a dose of 5 mg / kg by intravenous infusion over 2 minutes. The cannula was then flushed with 0.25 ml of heparinized saline to ensure that all dosage was infused. Thereafter, blood samples (0.15 ml) were collected from the carotid artery at the following nominal time points: before dosing (-5 minutes), at the end of infusion (t = 0), and 5, 10, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240, 360, 480, 1440 and 1800 minutes. Blood samples were immediately placed in tubes containing 10 I.U. heparin and centrifuged at 3500 × g for 5 minutes. Plasma (50 μl) was then added to 1 ml Starscint scintillation cocktail and vortexed before scintillation counting. The quantification limit (20 dpm) for this plasma assay was confirmed using multiple (n = 5) analysis of spiked plasma samples. Accuracy and accuracy were within ± 20%.
生体内分布研究
生体内でのデンドリマーの運命を理解するために、さまざまな主要臓器への生体内分布を調べた。薬物動態研究(30時間)が完了したら、致死量のペントバルビタールナトリウムを注入することによって動物を屠殺し、解剖により、以下の組織を摘出した:心臓、肺、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓および脳。これらの組織は、組織の処理および分析を行う直前まで、重量計量済みのポリプロピレンチューブ中で凍結保存(-20℃)しておいた。
In order to understand the fate of the dendrimer in the distribution studies in vivo biological, it was examined in vivo distribution to a variety of major organs. Once the pharmacokinetic study (30 hours) was completed, the animals were sacrificed by injecting a lethal dose of sodium pentobarbital and the following tissues were removed by dissection: heart, lung, liver, spleen, pancreas, kidney and brain . These tissues were stored frozen (−20 ° C.) in weighted polypropylene tubes until just prior to tissue processing and analysis.
まず最初に、試料をワーリングミニブレンダー(Extech Equipment Pty. Ltd.、オーストラリア・ボローニア)で5〜10mlのMilliQ水と共に10秒間×5回ホモジナイズすることにより、組織を処理した。組織試料中の比較的低レベルの放射能を測定するための方法を開発するにあたって、シンチレーション計数時にバックグラウンドカウントの著しいばらつきをもたらす化学発光反応および色クエンチングに伴う問題に直面した。これらの問題は、温度の上昇、光への曝露、試料の撹拌によって悪化するようでもあった。これらの問題を克服するために、これ以降の組織の処理を2段階プロセスとして行った。 First, the tissue was processed by homogenizing the sample with 5-10 ml MilliQ water for 10 seconds × 5 times in a Waring mini blender (Extech Equipment Pty. Ltd., Boronia, Australia). In developing a method for measuring relatively low levels of radioactivity in tissue samples, we faced problems associated with chemiluminescent reactions and color quenching that resulted in significant variations in background counts during scintillation counting. These problems also seemed to be exacerbated by increased temperature, exposure to light, and sample agitation. To overcome these problems, the subsequent processing of the organization was performed as a two-step process.
最初の「スクリーニング」段階は、試料に含まれる放射能のおよそのレベルを決定するために使用した。この段階では、各組織ホモジネートから単一の試料(典型的には40〜100mgの組織)を、2mlのSolueneを含有する20mlポリプロピレンシンチレーションバイアルに入れ、組織消化を60℃で終夜進行させた。次にイソプロパノール(2ml)を加え、その溶液を60℃でさらに2時間加熱した。室温まで冷却してから、過酸化水素(30%w/v)を100μlずつ2回、逐次的に試料に加え、次にそれを、発泡が終わるまで、室温で放置した。次に、Starscint(12ml)を加え、その混合物をボルテックスしてから、試料を暗所で撹拌せずに4℃で96時間貯蔵した。次に、試料をシンチレーション計数し、その間、カウンターは、冷却した試料トレイを使って12℃に維持した。また、計数中の加温を最小限に抑えるために、試料を6〜12個ずつの組にして計数した。無処置ラットの臓器から一試料ずつ採取し、それを同様に加工して、加工法のみに起因すると考えられるバックグランドカウントの値を得た。これらの値をスクリーニング段階で得た値から差し引いた。このスクリーニング段階から得られるデータにより、各試料中の予想放射能量の大雑把な目安が得られた。最終分析実験にはこの情報が必要だった。 The first “screening” step was used to determine the approximate level of radioactivity contained in the sample. At this stage, a single sample (typically 40-100 mg of tissue) from each tissue homogenate was placed in a 20 ml polypropylene scintillation vial containing 2 ml of Soluene and tissue digestion was allowed to proceed at 60 ° C. overnight. Isopropanol (2 ml) was then added and the solution was heated at 60 ° C. for an additional 2 hours. After cooling to room temperature, hydrogen peroxide (30% w / v) was added to the sample in 100 μl portions, then it was allowed to stand at room temperature until foaming ceased. Then Starscint (12 ml) was added and the mixture was vortexed before storing the sample at 4 ° C. for 96 hours without stirring in the dark. The sample was then scintillation counted while the counter was maintained at 12 ° C. using a cooled sample tray. Further, in order to minimize the heating during counting, the samples were counted in groups of 6 to 12 samples. Samples were collected from the organs of untreated rats one by one and processed in the same manner to obtain a background count value that could be attributed only to the processing method. These values were subtracted from the values obtained in the screening stage. The data obtained from this screening stage provided a rough indication of the expected amount of radioactivity in each sample. This information was needed for the final analysis experiment.
組織計数プロセスの第2「分析」段階では、組織試料を三重に分析した。無処置のラットから得たブランク組織も上述のように(ただし三重に)加工して、バックグラウンド補正に備えた。デンドリマーを投薬したラットのホモジナイズした組織は、組織からの「抽出」プロセスに起因する放射能計数効率の低下(クエンチ)を補正するための追加ステップを行った点以外は、一般に、上記スクリーニング段階で述べた方法と同じ方法で加工した。計数効率の補正を可能にするために、処置ラットから得た二組目の同じ組織を、Solueneの添加に先だって既知量の放射標識デンドリマーを最初にスパイクした点以外は、同じ方法で加工した。スクリーニング試料中に測定された放射能とほぼ等価なレベルの放射能を組織にスパイクした(それゆえにスクリーニングデータが必要になる)。次に、以下のように加工効率を算出した:
効率=[(スパイクした組織)DPM−(組織)DPM,未補正]/(スパイクした溶液)DPM (1)
In the second “analysis” stage of the tissue counting process, tissue samples were analyzed in triplicate. Blank tissue from untreated rats was also processed as described above (but in triplicate) to prepare for background correction. The homogenized tissue of rats dosed with dendrimer is generally in the above screening stage, except that an additional step was taken to compensate for the decrease in radioactivity counting efficiency (quenching) due to the “extraction” process from the tissue. It was processed in the same way as described. To allow correction of counting efficiency, a second set of the same tissue from treated rats was processed in the same way, except that a known amount of radiolabeled dendrimer was first spiked prior to the addition of Soluene. The tissue was spiked with a level of radioactivity approximately equivalent to the radioactivity measured in the screening sample (hence screening data is required). Next, the processing efficiency was calculated as follows:
Efficiency = [(spiked tissue) DPM- (tissue) DPM, uncorrected ] / (spiked solution) DPM (1)
(スパイクした組織)DPMは、スパイクした試料で測定される質量補正放射能とし、(組織)DPM,未補正は余分な放射能スパイクを加えていない組織試料中の質量補正放射能とし、(スパイクした溶液)DPMは、スパイクした試料に加えられた既知量の余分な放射能とした。事実上、この計算は、各組織中の既知(スパイクされた)量の放射能を参照基準として用いることによって、計数効率の指標を与える。 (Spiked tissue) DPM is the mass-corrected radioactivity measured in the spiked sample. (Tissue) DPM, uncorrected is the mass-corrected radioactivity in the tissue sample to which no extra radioactivity spikes are added. The DPM was a known amount of excess radioactivity added to the spiked sample. In effect, this calculation gives an indication of counting efficiency by using a known (spiked) amount of radioactivity in each tissue as a reference standard.
次に、この効率の値を使って、加工された試料中の3H含量を補正する。
(組織)DPM,補正=(組織)DPM,未補正/効率 (2)
This efficiency value is then used to correct the 3 H content in the processed sample.
(Organization) DPM, Correction = (Organization) DPM, Uncorrected / Efficiency (2)
次に、加工した試料中に存在する臓器全体の質量分率を知ることによって、臓器全体での放射能を算出した。結果を、屠殺時の臓器における注射した用量のパーセンテージとして表すか、組織1グラムあたりの注射した用量のパーセンテージとして表す。加工のばらつきにより、LOQを各組織について容易に決定することはできないかもしれない。その代りに、20%より高い%CVをもたらす三重試料は繰り返すか、再現可能なデータが得られなかった場合には定量可能レベル未満と分類した。 Next, the radioactivity in the whole organ was calculated by knowing the mass fraction of the whole organ present in the processed sample. Results are expressed as a percentage of injected dose in the organ at sacrifice or as a percentage of injected dose per gram of tissue. Due to processing variations, the LOQ may not be easily determined for each organization. Instead, triplicate samples yielding% CV higher than 20% were repeated or classified as below quantifiable levels if no reproducible data was obtained.
全血薬物動態
全血薬物動態を決定するために、別個の動物群に同じ量のデンドリマー溶液を投与し、血漿の収集に使用した名目期間と同じ名目期間で、ヘパリン処理したエッペンドルフチューブに、全血試料(150μl)を収集した。各血液試料(50μl)を二つずつ、2本の20mlシンチレーションバイアルに加えた。まず最初に、一方のバイアルは処理せず、他方のバイアルには、(上述のように)全血計数効率データを得るために、既知量(約300〜600壊変毎分(DPM))の研究対象のデンドリマーをスパイクした。次にそれらの試料を、比1:1のSoluene-350およびイソプロピルアルコール4ml中、60℃で終夜可溶化した。次に試料を冷却し、200μlの過酸化水素(30%w/v)で漂白してから、Starscint(12ml)を加えた。次に試料を室温で24時間放置した後、シンチレーション計数を行った。上述のようにスパイクした試料について得られたデータとの比較により、血液試料から得たカウントを効率に関して補正した。
Whole blood pharmacokinetics To determine whole blood pharmacokinetics, separate groups of animals were administered the same amount of dendrimer solution, and in a heparinized Eppendorf tube in the same nominal period used for plasma collection. A blood sample (150 μl) was collected. Each blood sample (50 μl) was added in duplicate to two 20 ml scintillation vials. First of all, one vial is not processed, and the other vial (as described above) is studied with a known amount (approximately 300-600 decay per minute (DPM)) to obtain whole blood counting efficiency data. The subject's dendrimer was spiked. The samples were then solubilized overnight at 60 ° C. in 4 ml of a 1: 1 ratio of Soluene-350 and isopropyl alcohol. The sample was then cooled and bleached with 200 μl hydrogen peroxide (30% w / v) before adding Starscint (12 ml). The samples were then left at room temperature for 24 hours before scintillation counting. The counts obtained from the blood samples were corrected for efficiency by comparison with the data obtained for the spiked samples as described above.
静脈内投与後の血漿および全血における3H-デンドリマーの薬物動態パラメーターを表6に示す。
尿および糞便
デンドリマーを投与したラットから、投与後0〜8時間、8〜24時間および24〜30時間という三つの時間間隔にわたって、尿を収集した。投薬前の各ラットから得られるブランク尿試料も収集した。各時間間隔から得た尿のうち100μlを1mlのStarscintに加え、その混合物をボルテックスしてから、シンチレーション計数を行った。バックグラウンドを差し引いた後、試料の放射標識含量を、その時間間隔に収集された尿の総体積に関して補正し、投与された総3H用量のパーセンテージに変換した。
Urine was collected from rats receiving urine and fecal dendrimers over three time intervals of 0-8 hours, 8-24 hours and 24-30 hours post-dose. Blank urine samples obtained from each rat prior to dosing were also collected. 100 μl of urine obtained from each time interval was added to 1 ml Starscint and the mixture was vortexed before scintillation counting. After subtracting the background, the radiolabel content of the sample was corrected for the total volume of urine collected during that time interval and converted to a percentage of the total 3 H dose administered.
糞便は重量計量済みのバイアルに収集し、MilliQ水に浸漬することにより、試料をスラリーへとホモジナイズし、次に60℃で乾燥した。次に、乾燥糞便の複製試料(20mg)6個を、n=3試料の二つの群に分けた。一つの試料群はさらなる添加を行わずに加工し、3個の試料からなる一つの群には、糞便計数効率データを(上述のように)得るために、既知量の放射性デンドリマー(約500DPM)をスパイクした。次に、Lyonsら(2000)が記載した方法を使って、試料を可溶化した。簡単に述べると、再加湿した糞便に2mlのSolueneを加え、60℃で終夜加熱した。次に、さらに2mlのイソプロピルアルコールを加え、試料をさらに2時間加熱した。次に、可溶化した試料を400μlの過酸化水素(30%w/v)で漂白してから、12mlのStarscintを加えた。次に試料を室温で4時間放置してから、4℃で24時間冷却し、その後、12℃でシンチレーション計数を行った。収集した糞便の総乾燥重量を使って、糞便に排泄された3Hの総量を算出した。このアッセイのLOQはブランク糞便中の平均カウントの3倍と推定された。というのも、生じる糞便の質量は大きく変動し、それゆえに、一定の試料質量における最も小さい定量可能なカウント数は決定することができなかったからである。これらの結果を表7に要約する。 The stool was collected in a weighed vial and the sample was homogenized into a slurry by immersion in MilliQ water and then dried at 60 ° C. Next, 6 replicate replicate fecal samples (20 mg) were divided into two groups of n = 3 samples. One sample group was processed without further additions, and one group of 3 samples had a known amount of radioactive dendrimer (approximately 500 DPM) to obtain stool count efficiency data (as described above). Spiked. The sample was then solubilized using the method described by Lyons et al. (2000). Briefly, 2 ml of Soluene was added to rehumidified feces and heated at 60 ° C. overnight. Then another 2 ml of isopropyl alcohol was added and the sample was heated for another 2 hours. The solubilized sample was then bleached with 400 μl hydrogen peroxide (30% w / v) before 12 ml Starscint was added. The sample was then allowed to stand at room temperature for 4 hours and then cooled at 4 ° C. for 24 hours, after which scintillation counting was performed at 12 ° C. Using the total dry weight of the collected stool, the total amount of 3 H excreted in the stool was calculated. The LOQ for this assay was estimated to be 3 times the average count in blank feces. This is because the resulting fecal mass fluctuates greatly and therefore the smallest quantifiable count at a given sample mass could not be determined. These results are summarized in Table 7.
薬物動態計算
血漿/全血試料中の放射標識の濃度を、放射標識デンドリマーの比放射能を使って、ng換算濃度に変換した。これらの濃度はこの報文全体を通してng換算値/mlとして表されているが、これは、このアプローチが、3H放射標識は完全なデンドリマーに付随した状態を保っていると仮定していることに注意して見るべきであり、後述するように、一部にはこれが当てはまらない場合もある。
Pharmacokinetic calculation The concentration of radiolabel in the plasma / whole blood sample was converted to ng equivalent concentration using the specific activity of the radiolabeled dendrimer. These concentrations are expressed as ng equivalent / ml throughout the report, which assumes that this approach maintains the 3 H radiolabel associated with the complete dendrimer. Note that this may not be the case in some cases, as described below.
対数線形血漿中濃度対時間プロットの初期相における少なくとも3点の線形回帰によって、血漿中濃度-時間曲線の初期減衰速度を見積った。これらのデータから得た速度定数を「消失」速度定数(K)として記載しているが、これらは真の終末相消失速度定数を表すわけではない。というのも、消失が早いため、分布事象および消失事象の正確な描写は困難だったからである。初期減衰の半減期はt1/2=0.693/Kから見積った。いずれの場合も、初期分布容積(Vc)は、用量/Cp゜から算出した(式中、Cp゜は、t=0(すなわち2分間にわたる注入の終了時点)における血漿中の濃度である)。血漿からの初期消失が極めて迅速であり、その後のプロファイルも普通ではなかったため、真の消失速度定数および消失半減期の確認を含むデータのさらに詳細な薬物動態評価は行うことができなかった。
(実施例6)
The initial decay rate of the plasma concentration-time curve was estimated by linear regression of at least 3 points in the initial phase of the log-linear plasma concentration vs. time plot. Although rate constants obtained from these data are listed as “disappearance” rate constants (K), they do not represent true terminal phase disappearance rate constants. This is because the disappearance was so fast that it was difficult to accurately describe the distribution and disappearance events. The half-life of the initial decay was estimated from t 1/2 = 0.693 / K. In either case, the initial volume of distribution (V c) during was calculated from the dose / C p ° (wherein, C p ° is, t = 0 (i.e. at concentrations in plasma at the end) of infusion over 2 minutes is there). Due to the very rapid initial elimination from plasma and subsequent unusual profiles, further detailed pharmacokinetic assessment of data including confirmation of true elimination rate constant and elimination half-life could not be performed.
(Example 6)
実施例5で得た生体試料に関するサイズ排除クロマトグラフィー
いくつかの方法を使って、血漿試料中に存在する分子種のサイズを調べた。まず最初に、血漿試料を重力下でPD10ゲル濾過カラム(Pharmacia)を通して溶出させ、画分を収集することにより、粗いサイズ分離を行った。この方法では、血漿試料(500μl)を2mlのPBSで希釈してから、前もって平衡化しておいたPD10カラムの上にのせた。画分(500μl)を手作業で微量遠心管に収集し、それらを100μlずつ、1mlのStarscintに加えてから、シンチレーション計数を行った。純粋な成分の保持容量を特徴づけるために、そのカラムを通して、PBS中の完全なデンドリマーおよびリジン溶液も溶出させた。
Size Exclusion Chromatography on the biological sample obtained in Example 5 Several methods were used to determine the size of molecular species present in the plasma sample. First, a coarse size separation was performed by eluting plasma samples under gravity through a PD10 gel filtration column (Pharmacia) and collecting fractions. In this method, a plasma sample (500 μl) was diluted with 2 ml of PBS and then placed on a pre-equilibrated PD10 column. Fractions (500 μl) were collected manually into a microfuge tube and 100 μl of them were added to 1 ml Starscint before scintillation counting. The complete dendrimer and lysine solutions in PBS were also eluted through the column to characterize the retention capacity of the pure components.
血漿中の放射標識含有分子種のサイズに関してさらなる情報を得るために、次に、Waters 590 HPLCポンプ(Millipore Corporation、米国マサチューセッツ州ミルフォード)と連結された分析用サイズ排除カラム(Superdex Peptide 10/300 GL、Amersham Bioscience)を使って、より正確な分離を行った。血漿試料を同体積のPBSに再び希釈し、その混合物のうち100μlをカラムに注入した。0.3M NaCl(pH3.5)を含有する0.5ml/分のPBSで試料を溶出させ、Gilson FC10フラクションコレクター(John Morris Scientific Pty. Ltd.、オーストリア・ヴィクトリア州)を使って1分間隔で画分を収集した。次に、各画分中の放射能を決定するために、一部をStarscint(3ml)と混合し、液体シンチレーションによって分析した。別途、そのカラムを通して、完全なデンドリマーおよびリジンのPBS溶液を再び溶出させて、その保持容量を特徴づけた。また、デンドリマーおよびリジンを新鮮なヘパリン加血漿中で1時間インキュベートし、そのデンドリマーまたはリジン-血漿混合物をSECで分析した。この分析は、デンドリマーまたはリジンと血漿成分との物理的相互作用が血漿中に高MW分子種の生成をもたらしうる可能性の目安を得るために行った。
To obtain further information regarding the size of the radiolabeled molecular species in plasma, an analytical size exclusion column (
血漿中に存在する高MW放射標識分子種をより良く分割するために、Superdex 75 HR 10/30サイズ排除カラムを使った試料の分析も行った。画分(0.5ml)を再び1分間隔で収集し、Starscint(3ml)に希釈し、液体シンチレーション計数で分析して、各画分中の放射能を決定した。タンパク質標準を使って標準曲線(線形R2=0.9915)を作成し、それを使って、溶出するタンパク質の分子量を見積った。Waters 486 UV検出器(Millipore Corporation、米国マサチューセッツ州ミルフォード)を使ってタンパク質の溶出を280nmで監視した。カラムのボイド容積はブルーデキストラン2000を使って決定した。
(実施例7)
To better resolve high MW radiolabeled species present in plasma, samples were also analyzed using a Superdex 75
(Example 7)
トリチウム標識アニオン性デンドリマーの合成
BHALys[ 3 H-Lys] 16 [CO-3,5-Ph(SO 3 Na) 2 ] 32 の製造
デンドリマー(BHALys[3H-Lys]16[NH2.TFA]32)(2.12g、0.27mmol)のDMF/DMSO(1:1)(200mL)溶液を撹拌したものに、PyBOP(9.56g、18.37mmol)を加えた。3,5-ジスルホ安息香酸(5.39g、19.11mmol)およびジイソプロピルエチルアミン(12.2mL、70.02mmol)のDMF/DMSO(1:1)(150mL)溶液を徐々に加えた。粘着性の沈殿物が生成した。その沈殿物を取り出し、DMSOに再溶解し、反応に戻した。その混合物を室温で16時間撹拌した。反応混合物を水(3.5L)に注ぎ込み、0.45ミクロンフィルターを通して濾過した。
Synthesis of tritium-labeled anionic dendrimers
BHALys [3 H-Lys] 16 [CO-3,5-Ph (SO 3 Na) 2] 32 production dendrimer (BHALys [3 H-Lys] 16 [
精製はCentramate(3Kメンブレン、2L試料レザバー)でのタンジェンシャルフロー濾過によって行った。Milli-Q水(18L)による初期洗浄後に、保持液を、1M炭酸ナトリウム(100mL)により、Milli-Q水洗浄(1L)を間に挟んで3回洗浄し、次に、濾液のpHが中性になるまで濾過を続けた(約20L)。保持液を減圧下で濃縮し、凍結乾燥することにより、所期の生成物をオフホワイトの固体(2.34g、61%)として得た。
1H nmr (300MHz, D2O) λ(ppm):1.0-2.0 (186H);2.8-3.4 (62H);4.0-4.4 (31H);5.9 (1H);7.0-7.3 (10H);8.1-8.3 (96H)。
LC/MS(イオンペア):ESI(-ve)m/z=740.83 ((M-17H)17-);699.94 ((M-18H)18-);662.83 ((M-19H)19-);629.99 ((M-20H)20-);599.53 ((M-21H)21-)。最大エントロピー法を使ってデータをデコンボリュートすることにより、MW=12614(M-、H型)を得た。計算値(H型)(C423H513N63O255S64)12612(M-)Rf(分)=3.14。
CE(pH3):98.6% Rf(分)=10.97
CE(pH9):97.6% Rf(分)=12.90
Purification was performed by tangential flow filtration on Centramate (3K membrane, 2L sample reservoir). After the initial wash with Milli-Q water (18 L), the retentate is washed 3 times with 1 M sodium carbonate (100 mL) with Milli-Q water wash (1 L) in between, then the pH of the filtrate is medium Filtration continued until it became sex (about 20 L). The retentate was concentrated under reduced pressure and lyophilized to give the desired product as an off-white solid (2.34 g, 61%).
1H nmr (300 MHz, D 2 O) λ (ppm): 1.0-2.0 (186H); 2.8-3.4 (62H); 4.0-4.4 (31H); 5.9 (1H); 7.0-7.3 (10H); 8.1-8.3 (96H).
LC / MS (ion-pair): ESI (-ve) m / z = 740.83 ((M-17H) 17-); 699.94 ((M-18H) 18-); 662.83 ((M-19H) 19-); 629.99 ((M-20H) 20- ); 599.53 ((M-21H) 21- ). MW = 12614 (M-, H-type) was obtained by deconvolving the data using the maximum entropy method. Calculated value (H type) (C 423 H 513 N 63 O 255 S 64 ) 12612 (M-) Rf (min) = 3.14.
CE (pH 3): 98.6% Rf (min) = 10.97
CE (pH 9): 97.6% Rf (min) = 12.90
BHALys[ 3 H-Lys] 8 [CO-4-Ph(SO 3 Na)] 16 の製造
デンドリマー(BHALys[3H-Lys]8[NH2.TFA]16)(68mg、17.3μmol)のDMF(5mL)溶液を撹拌したものに、PyBOP(303mg、0.58mmol)を加えた。4-スルホ安息香酸モノナトリウム塩(124mg、0.55mmol)およびジイソプロピルエチルアミン(386μL、2.22mmol)のDMSO/DMF(5mL/10mL)溶液を徐々に加えた。その混合物をアルゴン下、室温で24時間撹拌した後、水(200mL)に注ぎ込み、0.45ミクロンフィルターを通して濾過した。精製は、タンジェンシャルフロー濾過によってMinimate(1Kメンブレン、250mL試料レザバー)で行い、これを水(1.5L)で洗浄した。減圧下で保持液から溶媒を減少させた。生成物を水(5mL)に再溶解し、Sephadexサイズ排除カラム(LH20、溶離液:水)にかけて、画分1〜8を収集した。合わせた画分を減圧下で濃縮し、イオン交換カラム(69F、Na+)に通し、凍結乾燥することにより、所期の生成物BHALys[3H-Lys]8[CO-4-Ph(SO3Na)]16を白色固体(20mg、22%)として得た。
1H nmr (300MHz, D2O) λ(ppm):1.0-1.9 (90H, CH2);2.8-3.3 (30H, CH2);4.0-4.4 (15H, CH);5.9 (1H, CH);7.0-7.2 (10H, Ar-H);7.5-7.8 (64H, Ar-H)。
MS(直接注入):ESI(-ve)m/z=5406 (M-H)-(M-, ナトリウム型)
計算値(ナトリウム型)(C215H257N31O79Na16S16)5404 (M-)。
CE(pH7):91% Rf(分)=10.51
BHALys [3 H-Lys] 8 [CO-4-Ph (SO 3 Na)] 16 manufacturing dendrimer (BHALys [3 H-Lys] 8 [
1H nmr (300 MHz, D 2 O) λ (ppm): 1.0-1.9 (90H, CH2); 2.8-3.3 (30H, CH2); 4.0-4.4 (15H, CH); 5.9 (1H, CH); 7.0- 7.2 (10H, Ar-H); 7.5-7.8 (64H, Ar-H).
MS (direct injection): ESI (-ve) m / z = 5406 (MH)-(M-, sodium type)
Calculated value (sodium type) (C215H257N31O79Na16S16) 5404 (M-).
CE (pH 7): 91% Rf (min) = 10.51
BHALys[ 3 H-Lys] 16 [CO-4-Ph(SO 3 Na)] 32 の製造
デンドリマー(BHALys[3H-Lys]16[NH2.TFA]32)(100mg、13μmol)のDMSO(8mL)溶液を撹拌したものに、PyBOP(448mg、0.86mmol)を加えた。4-スルホ安息香酸モノカリウム塩(197mg、0.82mmol)およびジイソプロピルエチルアミン(571μL、3.28mmol)のDMSO(12mL)溶液を徐々に加えた。その混合物をアルゴン下、室温で24時間撹拌した。反応混合物を水(200mL)に注ぎ込み、0.45ミクロンフィルターを通して濾過した。精製は、タンジェンシャルフロー濾過により、Stirred Cell(5Kメンブレン、250mL試料レザバー)で行い、これを水(1.5L)で洗浄した。減圧下で保持液から溶媒を減少させた。生成物を水(5mL)に再溶解し、イオン交換カラム(69F、Na+)に通し、凍結乾燥することにより、所期の生成物BHALys[Lys]16[CO-4-Ph(SO3Na)]32を白色固体(89mg、65%)として得た。
1H nmr (300MHz, D2O) λ(ppm):1.0-1.9 (186H, CH2);2.8-3.2 (62H, CH2);4.0-4.4 (31H, CH);5.9 (1H, CH);7.0-7.2 (10H, Ar-H);7.5-7.8 (128H, Ar-H)。
MS(直接注入):ESI(-ve)m/z=10756 (M-H)-(M-, ナトリウム型)
計算値(ナトリウム型)(C423H481N63O159Na32S32)10754 (M-)。
CE(pH9):98% Rf(分)=12.17
BHALys [3 H-Lys] 16 [CO-4-Ph (SO 3 Na)] 32 production dendrimer (BHALys [3 H-Lys] 16 [
1H nmr (300 MHz, D 2 O) λ (ppm): 1.0-1.9 (186H, CH2); 2.8-3.2 (62H, CH2); 4.0-4.4 (31H, CH); 5.9 (1H, CH); 7.0- 7.2 (10H, Ar-H); 7.5-7.8 (128H, Ar-H).
MS (direct injection): ESI (-ve) m / z = 10756 (MH)-(M-, sodium type)
Calculated value (sodium type) (C423H481N63O159Na32S32) 10754 (M-).
CE (pH 9): 98% Rf (min) = 12.17
BHALys[ 3 H-Lys] 16 [COCH 2 CH 2 (CO 2 Na)] 32 の製造
デンドリマー(BHALys[3H-Lys]16[NH2.TFA]32)(32mg、4.1μmol)およびトリエチルアミン(36μL、0.26mmol)のDMF(5mL)溶液を撹拌したものに、無水コハク酸(26mg、0.26mmol)を加えた。その混合物をアルゴン下、室温で24時間撹拌した。反応混合物を水(50mL)に注ぎ込み、0.45ミクロンフィルターを通して濾過した。精製はタンジェンシャルフロー濾過により、Minimate(1Kメンブレン、70mL試料レザバー)で行った。NaHCO3(飽和)(100mL)による初期洗浄後に、保持液を水(1.5L)で洗浄した。減圧下で保持液から溶媒を減少させた。生成物を水に再溶解し、イオン交換カラム(69F、Na+)に通し、凍結乾燥することにより、所期の生成物BHALys[3H-Lys]16[COCH2CH2(CO2Na)]32を白色固体(17mg、52%)として得た。
1H nmr (300MHz, D2O) λ(ppm):1.0-1.8 (186H, CH2);2.3-2.7 (128H, CH2);2.9-3.2 (62H, CH2);4.0-4.2 (31H, CH);6.0 (1H, CH);7.1-7.3 (10H, Ar-H)。
MS(直接注入):ESI(-ve)m/z=7360 (M-H)-(M-, H型)
計算値(H型)(C327H513N63O127)7359 (M-)。
CE(pH9):96% Rf(分)=13.02
BHALys [3 H-Lys] 16 [
1H nmr (300 MHz, D 2 O) λ (ppm): 1.0-1.8 (186H, CH2); 2.3-2.7 (128H, CH2); 2.9-3.2 (62H, CH2); 4.0-4.2 (31H, CH); 6.0 (1H, CH); 7.1-7.3 (10H, Ar-H).
MS (direct injection): ESI (-ve) m / z = 7360 (MH)-(M-, H type)
Calculated value (H type) (C327H513N63O127) 7359 (M-).
CE (pH 9): 96% Rf (min) = 13.02
アニオン性デンドリマーの血漿クリアランスおよび生体内分布の研究
この研究で使用した方法は実施例5で使用したものと同じである。ラットに5mg/kgをIV投与した後のBHALys[Lys]8[CO-4-Ph(SO3Na)]16(閉じた円形)、BHALys[Lys]16[CO-4-Ph(SO3Na)]32(中空の円形)およびBHALys[Lys]16[CO-3,5-Ph(SO3Na)2]32(三角形)について血漿中濃度-時間プロファイルを、図10に図解する。
Study of plasma clearance and biodistribution of anionic dendrimers The method used in this study is the same as that used in Example 5. BHALys [Lys] 8 [CO-4-Ph (SO 3 Na)] 16 (closed circle), BHALys [Lys] 16 [CO-4-Ph (SO 3 Na) after IV administration of 5 mg / kg to rats )] 32 (hollow circle) and BHALys [Lys] 16 [CO-3,5-Ph (SO 3 Na) 2 ] 32 (triangle), the plasma concentration-time profile is illustrated in FIG.
ラットにBHALys[Lys]8[CO-4-Ph(SO3Na)]16(黒)、BHALys[Lys]16[CO-4-Ph(SO3Na)]32(明るい灰色)、BHALys[Lys]16[CO-3,5-Ph(SO3Na)2]32(暗い灰色)またはBHALys[Lys]16[CO-CH2CH2(CO2Na)]32(白)をIV投与した30時間後の、注射した3Hの生体内分布を、図11に図解する。パネルA−臓器ごとに存在する3Hの注射量に対する%。パネルB−組織1グラムあたりに存在する3Hの注射量に対する%。
(実施例9)
BHALys [Lys] 8 [CO-4-Ph (SO 3 Na)] 16 (black), BHALys [Lys] 16 [CO-4-Ph (SO 3 Na)] 32 (light gray), BHALys [Lys ] 16 [CO-3,5-Ph (SO 3 Na) 2 ] 32 (dark gray) or BHALys [Lys] 16 [CO-CH 2 CH 2 (CO 2 Na)] 32 (white) IV administered 30 The biodistribution of injected 3 H after time is illustrated in FIG. Panel A-% of injected 3 H present for each organ. Panel B-% of 3 H injection present per gram of tissue.
Example 9
実施例8で得た生体試料に関するサイズ排除クロマトグラフィー
この研究で使用した方法は実施例6の場合と同じである。Superdex 75カラムでの血漿中および尿中のBHALys[Lys]16[CO-4-Ph(SO3Na)]32およびBHALys[Lys]16[CO-3,5-Ph(SO3Na)2]32のサイズ排除プロファイルを図12に図解する。
(実施例10)
Size Exclusion Chromatography on the Biological Sample Obtained in Example 8 The method used in this study is the same as in Example 6. BHALys [Lys] 16 [CO-4-Ph (SO 3 Na)] 32 and BHALys [Lys] 16 [CO-3,5-Ph (SO 3 Na) 2 ] in plasma and urine on a Superdex 75 column The 32 size exclusion profiles are illustrated in FIG.
(Example 10)
トリチウム標識PEGデンドリマー
BHALys[ 3 H-Lys] 8 [PEG 200 ] 16 の製造
BHALys[3H-Lys]8[NH2.TFA]16(125mg、0.03mmol)のDMF(8mL)溶液を撹拌したものに、PyBOP(556mg、1.0mmol)を加えた後、PEG200(240mg、1.0mmol)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(709μL、4.0mmol)のDMF(16mL)およびDMSO(2mL)溶液を加えた。その溶液を室温で16時間撹拌した。反応混合物を水(180mL)に注ぎ込み、濾過し、水で洗浄した。その水溶液を3K撹拌セルに移し、セルに水を通し、残った水を凍結乾燥で除去することにより、BHALys[3H-Lys]8[PEG200]16を易流動性白色固体(20mg、11%)として得た。
LC/MS(親水性(Philic)TFA):Rf(分)=16.72。ESI(+ve)m/z=5598 (M+H+)。
Tritium labeled PEG dendrimer
BHALys production of [3 H-Lys] 8 [ PEG 200] 16
To a stirred solution of BHALys [ 3 H-Lys] 8 [NH 2 .TFA] 16 (125 mg, 0.03 mmol) in DMF (8 mL) was added PyBOP (556 mg, 1.0 mmol), and then PEG200 (240 mg, 1.0 mmol). mmol), N, N-diisopropylethylamine (709 μL, 4.0 mmol) in DMF (16 mL) and DMSO (2 mL) were added. The solution was stirred at room temperature for 16 hours. The reaction mixture was poured into water (180 mL), filtered and washed with water. The aqueous solution was transferred to a 3K stirring cell, water was passed through the cell, and the remaining water was removed by lyophilization, whereby BHALys [ 3 H-Lys] 8 [PEG 200 ] 16 was free-flowing white solid (20 mg, 11 %).
LC / MS (Philic TFA): Rf (min) = 16.72. ESI (+ ve) m / z = 5598 (M + H + ).
BHALys[ 3 H-Lys] 16 [PEG 200 ] 32 の製造
BHALys[3H-Lys]16[NH2.TFA]32(30mg、0.004mmol)のDMF(3mL)溶液をアルゴン下で撹拌したものにPyBOP(142mg、0.271mmol)を加え、次にPEG200(62mg、0.263mmol)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(182μL、1.04mmol)のDMF(3mL)溶液を加えた。その溶液を室温で16時間撹拌した。減圧下で溶媒を除去し、得られた粗混合物を最少量の水に溶解した。水を溶離液とするSephadexカラム(LH-20)での精製により、凍結乾燥による水の除去後に、所期の生成物BHALys[3H-Lys]16[PEG200]32を白色固体(20mg、44%)として得た。LC/MS(親水性(Philic)TFA):Rf(分)=16.74。ESI(+ve)m/z=11,141 (M+H+)。
BHALys production of [3 H-Lys] 16 [ PEG 200] 32
To a stirred solution of BHALys [ 3 H-Lys] 16 [NH 2 .TFA] 32 (30 mg, 0.004 mmol) in DMF (3 mL) was added PyBOP (142 mg, 0.271 mmol) followed by PEG200 (62 mg 0.263 mmol), N, N-diisopropylethylamine (182 μL, 1.04 mmol) in DMF (3 mL) was added. The solution was stirred at room temperature for 16 hours. The solvent was removed under reduced pressure and the resulting crude mixture was dissolved in a minimum amount of water. Purification on a Sephadex column (LH-20) with water as the eluent, after removal of the water by lyophilization, the desired product BHALys [ 3 H-Lys] 16 [PEG 200 ] 32 is obtained as a white solid (20 mg, 44%). LC / MS (Philic TFA): Rf (min) = 16.74. ESI (+ ve) m / z = 11,141 (M + H + ).
BHALys[ 3 H-Lys] 16 [PEG 570 ] 32 の製造
BHALys[3H-Lys]16[NH2.TFA]32(20mg、0.003mmol)の乾燥DMF(2mL)溶液を窒素下で撹拌したものに、トリエチルアミン(36μL、0.261mmol)およびPEG685.75,NHSエステル(119mg、0.174mmol)を加えた。反応混合物を室温で16時間撹拌した。その溶液を5K撹拌セルに注ぎ込み、そのセルに水(600mL)を通し、残った水を凍結乾燥(2回)で除去することにより、BHALys[3H-Lys]16[PEG570]32をガラス状の固体(50mg、88%)として得た。LC(親水性(Philic)TFA):Rf(分)12.42。
BHALys production of [3 H-Lys] 16 [ PEG 570] 32
BHALys [ 3 H-Lys] 16 [NH 2 .TFA] 32 (20 mg, 0.003 mmol) in dry DMF (2 mL) was stirred under nitrogen with triethylamine (36 μL, 0.261 mmol) and PEG685.75, NHS. The ester (119 mg, 0.174 mmol) was added. The reaction mixture was stirred at room temperature for 16 hours. The solution was poured into a 5K stirred cell, water (600 mL) was passed through the cell, and the remaining water was removed by lyophilization (twice) to remove BHALys [ 3 H-Lys] 16 [PEG 570 ] 32 in glass. Obtained as a solid (50 mg, 88%). LC (Philic TFA): Rf (min) 12.42.
BHALys[ 3 H-Lys] 8 [PEG 2KD ] 16 の製造
BHALys[3H-Lys]8[NH2.TFA]16(30mg、0.008mmol)の乾燥DMF(2mL)溶液を窒素下で撹拌したものにPyBOP(141mg、0.271mmol)を加え、次に、PEG2000,NHSエステル(612mg、0.306mmol)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(180μL、1.04mmol)のDMF(1.4mL)およびDMSO(0.6mL)溶液を加えた。その溶液を室温で16時間撹拌した。反応混合物を10K撹拌セルに注ぎ込み、そのセルに水(800mL)を通し、残った水を凍結乾燥で除去することにより、BHALys[3H-Lys]8[PEG2KD]16を易流動性白色固体(149mg、54%)として得た。
BHALys production of [3 H-Lys] 8 [ PEG 2KD] 16
PYBOP (141 mg, 0.271 mmol) was added to a stirred solution of BHALys [ 3 H-Lys] 8 [NH 2 .TFA] 16 (30 mg, 0.008 mmol) in dry DMF (2 mL) under nitrogen, then PEG2000 , NHS ester (612 mg, 0.306 mmol), N, N-diisopropylethylamine (180 μL, 1.04 mmol) in DMF (1.4 mL) and DMSO (0.6 mL) were added. The solution was stirred at room temperature for 16 hours. The reaction mixture was poured into a 10K stirred cell, water (800 mL) was passed through the cell, and the remaining water was removed by lyophilization, whereby BHALys [ 3 H-Lys] 8 [PEG 2KD ] 16 was free-flowing white solid. (149 mg, 54%).
BHALys[ 3 H-Lys] 16 [PEG 2KD ] 32 の製造
BHALys[3H-Lys]16[NH2.TFA]32(30mg、0.004mmol)の乾燥DMF(2mL)溶液をアルゴン下で撹拌したものにPyBOP(142mg、0.272mmol)を加え、次に、PEG2000,NHSエステル(522mg、0.261mmol)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(182μL、1.04mmol)のDMF(3mL)およびDMSO(1mL)溶液を加えた。その溶液を室温で16時間撹拌した。反応混合物を水に注ぎ込み、濾過し、水で洗浄した。精製は、タンジェンシャルフロー濾過により、Mini-mate(10Kメンブレン、水2L)で行った。 凍結乾燥で溶媒を除去することにより、BHALys[3H-Lys]16[PEG2KD]32を易流動性白色固体(210mg、76%)として得た。
LC/MS(親水性(Philic)TFA):Rf(分)=16.29。ESI(+ve)m/z=67,696 (M+H+)
BHALys production of [3 H-Lys] 16 [ PEG 2KD] 32
To a stirred solution of BHALys [ 3 H-Lys] 16 [NH 2 .TFA] 32 (30 mg, 0.004 mmol) in dry DMF (2 mL) was added PyBOP (142 mg, 0.272 mmol), and then PEG2000 , NHS ester (522 mg, 0.261 mmol), N, N-diisopropylethylamine (182 μL, 1.04 mmol) in DMF (3 mL) and DMSO (1 mL) were added. The solution was stirred at room temperature for 16 hours. The reaction mixture was poured into water, filtered and washed with water. Purification was performed with Mini-mate (10K membrane, 2 L of water) by tangential flow filtration. BHALys [ 3 H-Lys] 16 [PEG 2KD ] 32 was obtained as a free-flowing white solid (210 mg, 76%) by removing the solvent by lyophilization.
LC / MS (Philic TFA): Rf (min) = 16.29. ESI (+ ve) m / z = 67,696 (M + H + )
PEGデンドリマーの血漿クリアランスおよび生体内分布の研究
この研究で使用した方法は実施例5で使用したものと同一である。
BHALys[Lys]16[PEG200]32(閉じた円形)、BHALys[Lys]16[PEG570]32(中空の円形)、BHALys[Lys]8[PEG2000]16(閉じた三角形)およびBHALys[Lys]16[PEG2000]32(中空の三角形)に関する血漿中濃度-時間プロファイルを図13に図解する。BHALys[Lys]8[PEG200]16に関するデータは示していない。というのも、消失が極めて迅速で、BHALys[Lys]16[PEG200]32に関するデータに隠れるからである。 BHALys [Lys] 16 [PEG 200 ] 32 (closed circle), BHALys [Lys] 16 [PEG 570 ] 32 (hollow circle), BHALys [Lys] 8 [PEG 2000 ] 16 (closed triangle) and BHALys [ The plasma concentration-time profile for Lys] 16 [PEG 2000 ] 32 (hollow triangle) is illustrated in FIG. Data on BHALys [Lys] 8 [PEG 200 ] 16 are not shown. This is because the disappearance is very rapid and is hidden in the data related to BHALys [Lys] 16 [PEG 200 ] 32 .
IV投与後のBHALys[Lys]16[PEG2000]32(黒いバー、7日)、BHALys[Lys]8[PEG2000]16(灰色のバー、5日)およびBHALys[Lys]16[PEG570]32(白いバー、30時間)の生体内分布を図14に図解する。
(実施例12)
BHALys [Lys] 16 [PEG 2000 ] 32 (black bar, 7 days), BHALys [Lys] 8 [PEG 2000 ] 16 (gray bar, 5 days) and BHALys [Lys] 16 [PEG 570 ] after IV administration The biodistribution of 32 (white bar, 30 hours) is illustrated in FIG.
Example 12
実施例11で得た生体試料に関するサイズ排除クロマトグラフィー
この研究で使用した方法は実施例6の場合と同じである。5mg/kgをIV投与した後の血漿における3H標識BHALys[Lys]16[PEG200]32(パネルA;t0,中空の四角形、t=1時間,閉じた円形、t=4時間,中空の円形)、BHALys[Lys]16[PEG570]32(パネルB;24時間)、BHALys[Lys]8[PEG2000]16(パネルC;48時間)およびBHALys[Lys]16[PEG2000]32(パネルD;48時間)に関して、Superdex 75カラムでのサイズ排除プロファイルを、図15A〜Dに図解する。
Size Exclusion Chromatography on the Biological Sample Obtained in Example 11 The method used in this study is the same as in Example 6. 3 H-labeled BHALys [Lys] 16 [PEG 200 ] 32 (Panel A; t0, hollow square, t = 1 hour, closed circle, t = 4 hour, hollow in plasma after IV administration of 5 mg / kg (Circle), BHALys [Lys] 16 [PEG 570 ] 32 (panel B; 24 hours), BHALys [Lys] 8 [PEG 2000 ] 16 (panel C; 48 hours) and BHALys [Lys] 16 [PEG 2000 ] 32 ( For panel D; 48 hours), the size exclusion profile on a Superdex 75 column is illustrated in FIGS.
BHALys[Lys]16[PEG200]32(パネルA;0〜4時間尿,閉じた円形、8〜24時間尿、中空の円形)およびBHALys[Lys]16[PEG570]32(パネルB;8〜24時間尿)をIV投与した後に尿中に排泄された3Hのサイズ排除プロファイルを図16AおよびBに図解する。矢印は完全なデンドリマーの保持時間を示す。 BHALys [Lys] 16 [PEG 200 ] 32 (Panel A; 0 to 4 hours urine, closed circle, 8 to 24 hours urine, hollow circle) and BHALys [Lys] 16 [PEG 570 ] 32 (Panel B; 8 16A and B illustrate the size exclusion profile of 3 H excreted in urine after IV administration (˜24 hours urine). Arrows indicate complete dendrimer retention time.
要約
出願人は3H標識ポリ-L-リジンデンドリマーの研究を行った(ここでは、BHALys[Lys]8[NH2]16またはBHALys[Lys]16[NH2]32をどちらも製造し、表面はキャッピングなしにしておいた)。比較のために、第3のデンドリマー、すなわちBHALys[Lys]8[NH2]16コアをD-リジンで完全にキャッピングして、その外側層にD-リジンを持つLys16デンドリマーBHALys[Lys]8[D-Lys]16[NH2]32を形成させたものも調べた。いずれの場合もデンドリマーは生理的pHにおいてカチオン性アミン基で覆われた。これらの物質に関して血漿クリアランスおよび生体内分布を決定した(実施例5)。血漿中に存在する異なる放射標識分子種をサイズ排除クロマトグラフィーで分離することにより、3Hデンドリマーの生体内運命をさらに詳しく調べた(実施例6)。ポリ-L-リジンデンドリマーは静脈内投与後、迅速に血漿から除去されるが、その後、代謝され、遊離したL-リジンが内在性再合成プロセスに再び取り込まれることを、データは示している。
The abstract applicant has studied 3 H-labeled poly-L-lysine dendrimers (here, both BHALys [Lys] 8 [NH 2 ] 16 or BHALys [Lys] 16 [NH 2 ] 32 are produced on the surface Was left without capping). For comparison, a third dendrimer, namely BHALys [Lys] 8 [NH 2 ] 16 core, is completely capped with D-lysine and Lys 16 dendrimer BHALys [Lys] 8 with D-lysine in its outer layer. What formed [D-Lys] 16 [NH 2 ] 32 was also examined. In both cases, the dendrimer was covered with cationic amine groups at physiological pH. Plasma clearance and biodistribution were determined for these substances (Example 5). The in vivo fate of 3 H dendrimers was examined in more detail by separating different radiolabeled species present in plasma by size exclusion chromatography (Example 6). The data shows that poly-L-lysine dendrimers are rapidly removed from plasma after intravenous administration, but are subsequently metabolized and re-incorporated into the endogenous resynthesis process.
静脈内投与後は、BHALys[Lys]8[NH2]16も、BHALys[Lys]16[NH2]32も、極めて迅速に血漿から除去されて、10分未満の初期血漿中半減期を示す(図2)。この迅速な初期喪失は用量にはあまり依存せず(図3)、(血漿ではなく)全血プロファイルを調べた場合(図4)にも、L-リジン表面基をD-リジンに変えた場合(図5)にも明白だった。比較的分子量が高いこれらの分子種では初期分布容積(Vc)が驚くほど高く、より高い分子量を持つ4世代のデンドリマーBHALys[Lys]16[NH2]32およびBHALys[Lys]8[D-Lys]16[NH2]32のVcは、分子量が低い3世代の比較対象よりも高かった。したがって、3世代および4世代のデンドリマーに関するVc値は、分子量よりも、表面電荷とより高い相関関係にあると思われる。このデータは、ポリカチオン性デンドリマーの血管内皮への迅速な結合を反映する初期「分布」過程(これは静電相互作用によって駆動され、循環血漿からの喪失をもたらす過程として起こる)と合致している。対照的に、典型的な血管外遊出過程ではなさそうである。というのも、このような高荷電高分子にとって血管内皮を迅速に横切ることは難しく、分子量および表面電荷の減少と共に増加すると予想されるのに対し、実際にはそれとは反対の現象が観察されたからである。これらの傾向は、全血薬物動態でも明白だった。ただし、小さいデンドリマーの場合、Cp 0値は約1/2(そして対応するVc値は2倍)だった。これは、電荷が比較的少ない3世代のデンドリマーでは、赤血球へのデンドリマーの結合が少なかったことを示唆している。 After intravenous administration, both BHALys [Lys] 8 [NH 2 ] 16 and BHALys [Lys] 16 [NH 2 ] 32 are removed from plasma very rapidly, showing an initial plasma half-life of less than 10 minutes (Figure 2). This rapid initial loss is not dose-dependent (Figure 3), and when examining the whole blood profile (not plasma) (Figure 4), the L-lysine surface group is changed to D-lysine. (Figure 5) was also obvious. These relatively high molecular weight species have a surprisingly high initial distribution volume (V c ) with higher molecular weights of the 4th generation dendrimers BHALys [Lys] 16 [NH 2 ] 32 and BHALys [Lys] 8 [D- Lys] 16 [NH 2 ] 32 had a higher V c than the three generations with lower molecular weights. Thus, the V c values for the 3rd and 4th generation dendrimers appear to be more highly correlated with surface charge than molecular weight. This data is consistent with an initial “distribution” process that reflects the rapid binding of polycationic dendrimers to the vascular endothelium, which occurs as a process driven by electrostatic interactions and resulting in loss from circulating plasma. Yes. In contrast, it does not appear to be a typical extravasation process. This is because it is difficult for such highly charged polymers to cross the vascular endothelium quickly, and it is expected to increase with decreasing molecular weight and surface charge, but in fact the opposite phenomenon was observed. It is. These trends were also evident in whole blood pharmacokinetics. However, for small dendrimers, the C p 0 value was about 1/2 (and the corresponding V c value was doubled). This suggests that the 3rd generation dendrimer with relatively low charge had less dendrimer binding to erythrocytes.
要約すると、アンキャップトポリ-L-リジンデンドリマーは、静脈内注射時に血漿から迅速に除去されること、およびその後、最初は完全なデンドリマーに付随していた放射標識が、SECにおいて遊離リジンおよびいくつかのより大きい分子量(おそらくはタンパク質性)の物質(アルブミンを含む)と同時溶出する分子種に付随して血漿中に再び現われることが、このデータによって示された。またこのデータは、高度に荷電したカチオン性デンドリマーが注射後直ちに内皮細胞表面に迅速に結合し、その後、加水分解されて、循環する遊離リジンを生じ、そしてそれが最終的にはタンパク質生合成経路に再び取り込まれることも示唆している。これらのデータは、我々の知る限り、ポリ-L-リジンデンドリマーの生体内での生分解および再吸収を記述した初めてのデータである。したがって、ポリ-L-リジンデンドリマーの表面の性質を適当に操作することにより、血漿における初期滞留時間を高めることができる。したがって、アンキャップトポリ-L-リジン表面は、生分解性および生体吸収性デンドリマーに基づく薬物送達システムになりうる。 In summary, uncapped poly-L-lysine dendrimers are rapidly removed from plasma upon intravenous injection, and radiolabels that were originally associated with complete dendrimers are now free lysine and some The data showed that it reappears in plasma associated with molecular species co-eluting with larger molecular weight (possibly proteinaceous) substances (including albumin). This data also shows that highly charged cationic dendrimers quickly bind to the endothelial cell surface immediately after injection and are then hydrolyzed to yield circulating free lysine, which ultimately leads to the protein biosynthetic pathway It is also suggested that it will be taken in again. These data are, as far as we know, the first data describing the biodegradation and resorption of poly-L-lysine dendrimers in vivo. Therefore, by appropriately manipulating the surface properties of poly-L-lysine dendrimers, the initial residence time in plasma can be increased. Thus, uncapped poly-L-lysine surfaces can be drug delivery systems based on biodegradable and bioabsorbable dendrimers.
別途の研究により、ポリ-L-リジンデンドリマーコアの表面をアニオン性アリールスルホネート基またはアルキルカルボキシレート基でキャッピングすることが、ラットへの静脈内投与後のデンドリマーの薬物動態および生体内分布パターンに及ぼす影響も調べた。 In a separate study, capping the surface of poly-L-lysine dendrimer cores with anionic aryl sulfonate or alkylcarboxylate groups affects the pharmacokinetics and biodistribution pattern of dendrimers after intravenous administration to rats The effect was also investigated.
ベンゼンスルホネート(CO-4-Ph(SO3Na))またはベンゼンジスルホネート(CO-3,5-Ph(SO3Na)2)末端基でキャッピングされた、サイズが異なる二つのデンドリマーコアBHALys[Lys]8[NH2]16およびBHALys[Lys]16[NH2]32(それぞれ外側層に8個および16個のリジン基を持つ)を利用して、デンドリマーのサイズおよび表面電荷の影響を容易に区別できるようにした(合成実施例7)。四つのトリチウム標識リジンデンドリマーBHALys[Lys]8[CO-4-Ph(SO3Na)]16;BHALys[Lys]16[CO-4-Ph(SO3Na)]32;BHALys[Lys]16[CO-3,5-Ph(SO3Na)2]32およびBHALys[Lys]16[CO-CH2CH2(CO2Na)]32を静脈内に投与(5mg/kg)し、血漿、尿および糞便中の放射能を30時間にわたって監視した(実施例8)。投与の30時間後に動物を屠殺し、主要臓器を摘出し、ホモジナイズし、放射標識をアッセイした。 Two different size dendrimer cores BHALys [Lys capped with benzene sulfonate (CO-4-Ph (SO 3 Na)) or benzene disulfonate (CO-3,5-Ph (SO 3 Na) 2 ) end groups ] 8 [NH 2 ] 16 and BHALys [Lys] 16 [NH 2 ] 32 (with 8 and 16 lysine groups on the outer layer, respectively) make it easy to influence the size and surface charge of dendrimers It was made possible to distinguish (Synthesis Example 7). Four tritium-labeled lysine dendrimers BHALys [Lys] 8 [CO-4-Ph (SO 3 Na)] 16 ; BHALys [Lys] 16 [CO-4-Ph (SO 3 Na)] 32 ; BHALys [Lys] 16 [ CO-3,5-Ph (SO 3 Na) 2 ] 32 and BHALys [Lys] 16 [CO-CH 2 CH 2 (CO 2 Na)] 32 were administered intravenously (5 mg / kg), plasma, urine And the radioactivity in the stool was monitored over 30 hours (Example 8). Animals were sacrificed 30 hours after administration, major organs were removed, homogenized, and radiolabeled assayed.
四つのデンドリマーの消失半減期はいずれも基本的に同じ(約1時間)だったが、BHALys[Lys]8[CO-4-Ph(SO3Na)]16の血漿クリアランスおよび分布容積はLys16デンドリマーより高いことが、血漿中濃度-時間プロファイルによって示された。BHALys[Lys]8[CO-4-Ph(SO3Na)]16およびBHALys[Lys]16[CO-4-Ph(SO3Na)]32デンドリマーに付随する注射された放射標識の約30%が、投与後30時間の間に尿中に排泄されたのに対して、高度に荷電したBHALys[Lys]16[CO-3,5-Ph(SO3Na)2]32の場合は、同じ期間に用量の3%が尿中に排除されるに過ぎなかった。
The elimination half-life of all four dendrimers was essentially the same (about 1 hour), but the plasma clearance and volume of distribution of BHALys [Lys] 8 [CO-4-Ph (SO 3 Na)] 16 was Lys 16 A higher than dendrimer was shown by plasma concentration-time profile. About 30% of the injected radiolabel associated with BHALys [Lys] 8 [CO-4-Ph (SO 3 Na)] 16 and BHALys [Lys] 16 [CO-4-Ph (SO 3 Na)] 32 dendrimers Is excreted in the
スクシネートデンドリマーのクリアランスプロファイルは、他のアニオン性デンドリマーとはかなり異なり、スクシネートデンドリマーは静脈内注入時に血漿から極めて迅速に除去された。初期分布容積(Vc)も他のアニオン性デンドリマーより高く、カチオン性デンドリマーのそれに近いことから、放射標識を血漿から迅速に除去する血液成分または内皮表面との初期相互作用が示唆された(図4)。血漿における最初の20分間での初期喪失速度も極めて迅速であり、やはり、カチオン性デンドリマーで見られたものと類似する時間尺度で起こった。初期の迅速な低下後は、放射標識の除去速度が低下するらしく、投与の30時間後に定量可能な量の放射標識が残っていた。この第2のゆっくりした除去速度が、先にカチオン系で見られたような血漿への標識の再分布を反映しているかどうかはわからない。アニオン性デンドリマーは、赤血球からはほぼ完全に排除されるようだった。他のアニオン性デンドリマーとは対照的に、スクシネートデンドリマーに付随する注射された放射標識の大半が尿中に排泄され(63.71±8.98%)、一方、プールされた糞便には、極めて少量であるが定量可能な量の放射標識が回収された(1.21±0.97%)(表3)。
The clearance profile of succinate dendrimers was quite different from other anionic dendrimers, and succinate dendrimers were cleared from plasma very rapidly upon intravenous infusion. The initial volume of distribution (V c ) was also higher than other anionic dendrimers and close to that of cationic dendrimers, suggesting an initial interaction with blood components or endothelial surfaces that rapidly remove radiolabel from plasma (Figure Four). The initial loss rate in the first 20 minutes in plasma was also very rapid and again occurred on a time scale similar to that seen with cationic dendrimers. After the initial rapid decline, the radiolabel removal rate appeared to be reduced, leaving a quantifiable amount of
BHALys[Lys]16[CO-4-Ph(SO3Na)]32およびBHALys[Lys]16[CO-3,5-Ph(SO3Na)2]32を投与したラットから得た血漿試料のサイズ排除クロマトグラフィーにより、どちらのアニオン性デンドリマーも血漿成分に迅速に結合して、高分子量種(<67kDa)を形成することが明らかになった。血漿中に分解生成物は同定されなかったが、尿中の放射標識は主として、Lys-アリールスルホネートモノマーの分子量に近い分子種に付随していた。興味深いことに、尿中の放射標識は、血漿中放射能レベルが極めて低い時間尺度(投与後8〜24時間)に、大半が排泄された。臓器沈着パターンから、各デンドリマーを投与した30時間後に存在する残存放射能は主として肝臓、脾臓および腎臓に濃縮されることが明らかになった。BHALys[Lys]16[CO-3,5-Ph(SO3Na)2]32の場合、放射能の回収率は肝臓において特に高かった(用量の約50%)。このデータは、ベンゼンスルホネートデンドリマーが血漿から排除された後に、代謝が起こり、それが続いて、分解生成物の尿排除を容易にすることを示唆している。対照的に、尿におけるBHALys[Lys]16[CO-3,5-Ph(SO3Na)2]32に由来する放射能の回収率が低いのは、おそらくデンドリマーの表面電荷密度が増加した結果として、代謝に対する感受性が低下したことを反映しており、それが結果として、肝臓における高い回収率をもたらしているのだろう。 Of plasma samples from rats administered BHALys [Lys] 16 [CO-4-Ph (SO 3 Na)] 32 and BHALys [Lys] 16 [CO-3,5-Ph (SO 3 Na) 2 ] 32 Size exclusion chromatography revealed that both anionic dendrimers bind rapidly to plasma components to form high molecular weight species (<67 kDa). Although no degradation products were identified in plasma, radiolabels in urine were primarily associated with molecular species close to the molecular weight of Lys-aryl sulfonate monomers. Interestingly, most of the radiolabel in the urine was excreted on a time scale (8-24 hours after administration) with very low levels of plasma radioactivity. The organ deposition pattern revealed that the residual radioactivity present 30 hours after administration of each dendrimer was concentrated mainly in the liver, spleen and kidney. In the case of BHALys [Lys] 16 [CO-3,5-Ph (SO 3 Na) 2 ] 32 , the recovery of radioactivity was particularly high in the liver (about 50% of the dose). This data suggests that metabolism occurs after the benzenesulfonate dendrimer is cleared from the plasma, which subsequently facilitates urinary elimination of degradation products. In contrast, the low recovery of radioactivity from BHALys [Lys] 16 [CO-3,5-Ph (SO 3 Na) 2 ] 32 in urine is probably a result of increased surface charge density of dendrimers As such, it reflects the reduced sensitivity to metabolism, which may result in high recovery in the liver.
したがって、アニオン性デンドリマーの血漿クリアランスは、アンキャップトカチオン性ポリ-L-リジンデンドリマーについて先に見られたものよりも遅い。第2に、アニオンシリーズ内では、血漿クリアランスが、主として、表面電荷よりもデンドリマーサイズによって決定される。しかし、最終的には、表面電荷が腎排除および生体内分布のパターンを決定し、ベンゼンスルホネートキャップトデンドリマーとベンゼンジスルホネートキャップトデンドリマーとの代謝に対する感受性の相違に起因しうる。 Thus, the plasma clearance of anionic dendrimers is slower than that seen previously for uncapped cationic poly-L-lysine dendrimers. Second, within the anion series, plasma clearance is primarily determined by dendrimer size rather than surface charge. Ultimately, however, the surface charge determines the pattern of renal exclusion and biodistribution and may be attributed to the difference in sensitivity to metabolism of benzene sulfonate capped dendrimers and benzene disulfonate capped dendrimers.
PEG化は、タンパク質分解酵素によるタンパク質の認識を減少させ、タンパク質およびコロイドの食作用による除去を抑制し、その結果として、血漿循環時間を延ばすことが知られている。そこで本願では、3H標識ポリ-L-リジンデンドリマーの血漿プロファイル、生体内分布パターンおよび尿排除にPEG化(合成実施例10)が及ぼす影響を、5mg/kgのデンドリマーを静脈内投与した後のラットで調べた(薬物動態および生体内分布実施例11)。一般に、PEG化デンドリマーの血漿中半減期および尿排除の程度は分子量に依存し、大きいPEG化デンドリマー(すなわち>30kDa)は比較的ゆっくりと血漿から除去されたのに対し(t1/2 1〜3日)、小さい分子種(すなわち<20kDa)は血漿から尿中に迅速に除去された(t1/2 1〜10時間)。大きいデンドリマーは最終的には網内系の臓器(肝臓および脾臓)に濃縮されるようだったが、これは長い時間をかけて起こり、絶対的な蓄積の程度は低かった(用量の<10%)。SECでは、最も小さい(200Da)PEG鎖で誘導体化されたデンドリマーが、見かけ上さらに高分子量の分子種の生成をもたらす血漿成分との相互作用の徴候をいくつか示したが、尿への排除は極めて迅速であり、尿には完全なデンドリマーしか回収されなかった。より大きなPEG化種(すなわち2000Da)で誘導体化されたデンドリマーは、血漿中にも尿中にも、親(変化していない)デンドリマーとして存在した。したがって、PEG化ポリ-L-リジンデンドリマー複合体のサイズを操作して、それらの薬物動態を最適に調整することができる。
PEGylation is known to reduce protein recognition by proteolytic enzymes and suppress phagocytic removal of proteins and colloids, resulting in increased plasma circulation time. Therefore, in this application, the effect of PEGylation (Synthesis Example 10) on the plasma profile, biodistribution pattern and urinary exclusion of 3 H-labeled poly-L-lysine dendrimer was investigated after intravenous administration of 5 mg / kg dendrimer. Investigated in rats (Pharmacokinetics and Biodistribution Example 11). In general, the plasma half-life of PEGylated dendrimers and the extent of urinary exclusion depend on molecular weight, whereas large PEGylated dendrimers (ie> 30 kDa) were removed from plasma relatively slowly (
弁別的に保護された中間体および部分PEG構造の例
(実施例15)
Example of differentially protected intermediate and partial PEG structure (Example 15)
BHALys[Lys] 8 [α-Boc] 8 [ε-NH 2 ] 8 の製造
i.BHALys[Lys] 8 [α-Boc] 8 [ε-CBz] 8 の製造
BHALys[Lys]4[NH2.TFA]8(1.59mmol)、トリエチルアミン(4.50ml、32.30mmol)およびDMF(30ml)の溶液を磁気撹拌したものに、固形のPNPO-α-Boc-ε-CBz-Lys(7.75g、15.45mmol)を室温で一度に加えた。反応懸濁液は直ちに明黄色に変色し、約5分間の撹拌後は、活性エステルが完全に溶解していた。撹拌を室温でさらに22時間続けた。粗反応混合物を、氷水が入っている大きなビーカーに注ぎ込んだところ、微細な黄色沈殿物が生成した。その懸濁液を濾過し、その結果保持された固形物を吸引しながら終夜風乾した。得られた乾燥淡黄色ケーキを微粉末に粉砕し、アセトニトリルに再懸濁した。その懸濁液を室温で30分間撹拌してから濾過した。保持された固形物をもう一度風乾し、再び粉砕し、アセトニトリルに再懸濁した後、濾過し、終夜風乾することにより、BHALys[Lys]8[α-Boc]8[ε-CBz]8t(5.52g、87%)を無色の固体として得た。
LC/MS(疎水性(Phobic)/TFA):ESI(+ve)実測値 [M+H/3]+ m/z=1328;計算値(C207H305N31O47として)3979.9;Rf(分)=20.22分。
Production of BHALys [Lys] 8 [α- Boc] 8 [ε-NH 2] 8
i. Production of BHALys [Lys] 8 [α- Boc] 8 [ε-CBz] 8
A solution of BHALys [Lys] 4 [NH 2 .TFA] 8 (1.59 mmol), triethylamine (4.50 ml, 32.30 mmol) and DMF (30 ml) was added to a magnetically stirred solution of solid PNPO-α-Boc-ε-CBz. -Lys (7.75 g, 15.45 mmol) was added in one portion at room temperature. The reaction suspension immediately turned light yellow and the active ester was completely dissolved after stirring for about 5 minutes. Stirring was continued at room temperature for a further 22 hours. The crude reaction mixture was poured into a large beaker containing ice water and a fine yellow precipitate formed. The suspension was filtered and the resulting retained solid was air dried overnight with suction. The resulting dry pale yellow cake was pulverized to a fine powder and resuspended in acetonitrile. The suspension was stirred at room temperature for 30 minutes and then filtered. The retained solid was air dried once more, ground again, resuspended in acetonitrile, filtered, and air dried overnight to give BHALys [Lys] 8 [α-Boc] 8 [ε-CBz] 8 t ( 5.52 g, 87%) was obtained as a colorless solid.
LC / MS (Phobic / TFA): ESI (+ ve) found [M + H / 3] + m / z = 1328; calculated (as C207H305N31O47) 3979.9; Rf (min) = 20.22 min.
ii.BHALys[Lys] 8 [α-Boc] 8 [ε-NH 2 ] 8 の製造
BHALys[Lys]8[α-Boc]8[ε-CBz]8(500mg、0.126mmol)を9:1 DMF/H2O(12.5ml)に懸濁し、ギ酸アンモニウム(127mg、2.01mmol)を加え、5分間撹拌した後、Pd/C(10%w/w、266mg)を加え、撹拌を2時間続けた。触媒を濾去することによって反応を停止させ、フィルターを9:1 DMF/H2O(10ml)で洗浄した後、水(2ml)で洗浄した。合わせた濾液を減圧下で濃縮することにより、無色のシロップを得た。それを水(10ml)で処理し、その水を減圧下で除去した後、水から凍結乾燥することにより、BHALys[Lys]8[α-Boc]8[ε-NH2]8を微細な白色凍結乾燥物(155mg、42%)として得た。
LC/MS(親水性/TFA):ESI(+ve)m/z=969.83 [M+3H]/3+, 727.67 [M+4H]/4+, 582.39 [M+5H]/5+;計算値(C143H257N31O31)2906.8g/mol。換算演算を使ってデータをデコンボリュートすることにより、mw=2906.5を得た。Rf(分)=14.7。
(実施例16)
ii. Production of BHALys [Lys] 8 [α- Boc] 8 [ε-NH 2] 8
BHALys [Lys] 8 [α-Boc] 8 [ε-CBz] 8 (500 mg, 0.126 mmol) is suspended in 9: 1 DMF / H 2 O (12.5 ml) and ammonium formate (127 mg, 2.01 mmol) is added. After stirring for 5 minutes, Pd / C (10% w / w, 266 mg) was added and stirring was continued for 2 hours. The reaction was stopped by filtering off the catalyst and the filter was washed with 9: 1 DMF / H 2 O (10 ml) followed by water (2 ml). The combined filtrate was concentrated under reduced pressure to give a colorless syrup. It is treated with water (10 ml), the water is removed under reduced pressure, and then lyophilized from water to give BHALys [Lys] 8 [α-Boc] 8 [ε-NH 2 ] 8 to a fine white Obtained as a lyophilizate (155 mg, 42%).
LC / MS (Hydrophilic / TFA): ESI (+ ve) m / z = 969.83 [M + 3H] / 3 +, 727.67 [M + 4H] / 4 +, 582.39 [M + 5H] / 5 +; calculation Value (C143H257N31O31) 2906.8 g / mol. By deconvolving the data using a conversion operation, mw = 2906.5 was obtained. Rf (minutes) = 14.7.
(Example 16)
BHALys[Lys] 8 [α-NH 2 -TFA] 8 [ε-CBz] 8 の製造
BHALys[Lys]8[α-Boc]8[ε-CBz]8(1000mg、0.251mmol)を酢酸(5.5ml)に懸濁し、0℃で撹拌しつつ、トリフルオロ酢酸(5.5ml)を滴下した。反応混合物を室温まで温めて17時間撹拌放置し、その時点で反応混合物をジエチルエーテル中で摩砕した。得られた懸濁液を10分間撹拌し、液体を遠心分離と傾瀉によって除去した。残った沈殿物を、ジエチルエーテルと共に10分間撹拌することによって洗浄し、そのジエチルエーテルを再び遠心分離と傾瀉によって除去した後、沈殿物を減圧下で乾燥し、水に溶解し、凍結乾燥することにより、BHALys[Lys]8[α-NH2.TFA]8[ε-CBz]8を白色粉末(840mg、105%)として得た。
LC/MS(親水性/TFA):ESI(+ve)m/z=1060.70 [M+3H]/3+, 795.51 [M+4H]/4+, 636.30 [M+5H]/5+;計算値(C167H241N31O31)3178.95g/mol。換算演算を使ってデータをデコンボリュートすることにより、mw=3178.0を得た。Rf(分)=19.1。
(実施例17)
Production of BHALys [Lys] 8 [α- NH 2 -TFA] 8 [ε-CBz] 8
BHALys [Lys] 8 [α-Boc] 8 [ε-CBz] 8 (1000 mg, 0.251 mmol) was suspended in acetic acid (5.5 ml), and trifluoroacetic acid (5.5 ml) was added dropwise with stirring at 0 ° C. . The reaction mixture was warmed to room temperature and left to stir for 17 hours, at which time the reaction mixture was triturated in diethyl ether. The resulting suspension was stirred for 10 minutes and the liquid was removed by centrifugation and decanting. The remaining precipitate is washed by stirring with diethyl ether for 10 minutes and the diethyl ether is again removed by centrifugation and decantation, then the precipitate is dried under reduced pressure, dissolved in water and lyophilized. Gave BHALys [Lys] 8 [α-NH 2 .TFA] 8 [ε-CBz] 8 as a white powder (840 mg, 105%).
LC / MS (Hydrophilic / TFA): ESI (+ ve) m / z = 1060.70 [M + 3H] / 3 +, 795.51 [M + 4H] / 4 +, 636.30 [M + 5H] / 5 +; calculation Value (C167H241N31O31) 3178.95 g / mol. By deconvolving the data using a conversion operation, mw = 3178.0 was obtained. Rf (minutes) = 19.1.
(Example 17)
BHALys[Lys] 16 [α-Boc] 16 [ε-NH 2 ] 16 の製造
i.BHALys[Lys] 16 [α-Boc] 16 [ε-CBz] 16 の製造
BHALys[Lys]8[NH2.TFA]16(0.81mmol)、トリエチルアミン(4.50ml、32.30mmol)およびDMF(30ml)の溶液を撹拌したものに、固形のPNPO-α-Boc-ε-CBz-Lys(7.94g、15.83mmol)を室温で一度に加えた。反応懸濁液は直ちに明黄色に変色し、約5分間の撹拌後は、活性エステルが完全に溶解していた。撹拌を室温でさらに22時間続けた。粗反応混合物を、氷水が入っている大きなビーカーに注ぎ込んだところ、微細な黄色沈殿物が生成した。その懸濁液を濾過し、その結果保持された固形物を吸引しながら終夜風乾した。得られた乾燥淡黄色ケーキを微粉末に粉砕し、アセトニトリルに再懸濁した。その懸濁液を室温で30分間撹拌してから濾過した。保持された固形物を終夜風乾することにより、BHALys[Lys]16[α-Boc]16[ε-CBz]16(5.79g、91%)を無色の固体として得た。
LC/MS(疎水性(Phobic)/TFA):ESI(+ve)実測値 [M+H/4]+ m/z=1977;[M+H/5]+ m/z=1582;計算値(C407H609N63O95として)7904.9;Rf(分)=23.51分。
BHALys [Lys] 16 production of [α-Boc] 16 [ε -NH 2] 16
i. BHALys [Lys] 16 [α- Boc] 16 [ε-CBz] 16 production of
To a stirred solution of BHALys [Lys] 8 [NH 2 .TFA] 16 (0.81 mmol), triethylamine (4.50 ml, 32.30 mmol) and DMF (30 ml), solid PNPO-α-Boc-ε-CBz- Lys (7.94 g, 15.83 mmol) was added in one portion at room temperature. The reaction suspension immediately turned light yellow and the active ester was completely dissolved after stirring for about 5 minutes. Stirring was continued at room temperature for a further 22 hours. The crude reaction mixture was poured into a large beaker containing ice water and a fine yellow precipitate formed. The suspension was filtered and the resulting retained solid was air dried overnight with suction. The resulting dry pale yellow cake was pulverized to a fine powder and resuspended in acetonitrile. The suspension was stirred at room temperature for 30 minutes and then filtered. The retained solid was air-dried overnight to yield BHALys [Lys] 16 [α-Boc] 16 [ε-CBz] 16 (5.79 g, 91%) as a colorless solid.
LC / MS (Phobic / TFA): ESI (+ ve) measured value [M + H / 4] + m / z = 1977; [M + H / 5] + m / z = 1582; calculated value 7904.9 (as C407H609N63O95); Rf (min) = 23.51 min.
ii.BHALys[Lys] 16 [α-Boc] 16 [ε-NH 2 ] 16 の製造
BHALys[Lys]16[α-Boc]16[ε-CBz]16(50mg、0.006mmol)、10%Pd/C(53mg)および酢酸(2ml)の懸濁液を水素下、室温で、16時間、激しく撹拌した。その黒い懸濁液を濾過した。濾液を減圧下で濃縮することにより、麦わら色油状の生成物(26mg、71%)を得た。
LC/MS(疎水性(Phobic)/TFA):ESI(+ve)実測値 [M+H/5]+ m/z=1152;[M+H/6]+ m/z=961;[M+H/7]+ m/z=824;[M+H/8]+ m/z=721;[M+H/9]+ m/z=641;計算値(C279H513N63O63として)5758.53;Rf(分)=2.37分。
(実施例18)
ii. BHALys [Lys] 16 production of [α-Boc] 16 [ε -NH 2] 16
A suspension of BHALys [Lys] 16 [α-Boc] 16 [ε-CBz] 16 (50 mg, 0.006 mmol), 10% Pd / C (53 mg) and acetic acid (2 ml) at room temperature under hydrogen for 16 hours Stir vigorously. The black suspension was filtered. The filtrate was concentrated under reduced pressure to give a straw oil product (26 mg, 71%).
LC / MS (Phobic / TFA): ESI (+ ve) measured [M + H / 5] + m / z = 1152; [M + H / 6] + m / z = 961; [M + H / 7] + m / z = 824; [M + H / 8] + m / z = 721; [M + H / 9] + m / z = 641; calculated value (as C279H513N63O63) 5758.53; Rf ( Minutes) = 2.37 minutes.
(Example 18)
BHALys[Lys] 16 [α-NH 2 .TFA] 16 [ε-CBz] 16 の製造
BHALys[Lys]16[α-Boc]16[ε-CBz]16(1000mg、0.127mmol)を酢酸(5.5ml)に懸濁し、0℃で撹拌しつつ、トリフルオロ酢酸(5.5ml)を滴下した。反応混合物を周囲温度まで温めて17時間撹拌放置した。反応混合物をジエチルエーテル(150ml)中で摩砕し、得られた懸濁液を10分間撹拌した。遠心分離(4000rpm、10分)と傾瀉によって液体を除去し、残った沈殿物を、ジエチルエーテル(150ml)と共に10分間撹拌することによって洗浄し、そのジエチルエーテルを再び遠心分離と傾瀉によって除去した。沈殿物を減圧下で乾燥し、水(50mL)に溶解し、凍結乾燥することにより、BHALys[Lys]16[α-NH2.TFA]16[ε-CBz]16を白色粉末(832mg、114%)として得た。
LC/MS(親水性/TFA):ESI(+ve)m/z=1576.85 [M+4H]/4+, 1261.34 [M+5H]/5+, 1051.27 [M+6H]/6+, 901.15 [M+7H]/7+;計算値(C327H481N63O63として)6302.83g/mol。換算演算を使ってデータをデコンボリュートすることにより、mw=6301.5を得た。Rf(分)=19.0。
(実施例19)
BHALys [Lys] 16 [α-
BHALys [Lys] 16 [α-Boc] 16 [ε-CBz] 16 (1000 mg, 0.127 mmol) was suspended in acetic acid (5.5 ml), and trifluoroacetic acid (5.5 ml) was added dropwise with stirring at 0 ° C. . The reaction mixture was warmed to ambient temperature and left stirring for 17 hours. The reaction mixture was triturated in diethyl ether (150 ml) and the resulting suspension was stirred for 10 minutes. The liquid was removed by centrifugation (4000 rpm, 10 minutes) and decantation, the remaining precipitate was washed by stirring with diethyl ether (150 ml) for 10 minutes, and the diethyl ether was again removed by centrifugation and decantation. The precipitate was dried under reduced pressure, dissolved in water (50 mL) and lyophilized to give BHALys [Lys] 16 [α-NH 2 .TFA] 16 [ε-CBz] 16 as a white powder (832 mg, 114 %).
LC / MS (Hydrophilic / TFA): ESI (+ ve) m / z = 1576.85 [M + 4H] / 4 +, 1261.34 [M + 5H] / 5 +, 1051.27 [M + 6H] / 6 +, 901.15 [M + 7H] / 7 +; calculated (as C327H481N63O63) 6302.83 g / mol. By deconvolving the data using a conversion operation, mw = 6301.5 was obtained. Rf (minutes) = 19.0.
Example 19
BHALys[Lys] 8 [α-NH 2 ] 8 [ε-Boc] 8 の製造
i.BHALys[Lys] 8 [α-CBz] 8 [ε-Boc] 8 の製造
BHALys[Lys]4[NH2.TFA]8(1.59mmol)、トリエチルアミン(4.40ml、31.57mmol)およびDMF(32ml)の溶液を磁気撹拌したものに、固形のPNPO-α-CBz-ε-Boc-Lys(7.69g、15.33mmol)を室温で一度に加えた。反応懸濁液は直ちに明黄色に変色し、約5分間の撹拌後は、活性エステルが完全に溶解していた。撹拌を室温でさらに19時間続けた。粗反応混合物を、アセトニトリル(約300ml)が入っている大きなビーカーに注ぎ込んだ。その懸濁液を濾過し、その結果保持された固形物を吸引しながら終夜風乾した。得られた乾燥淡黄色ケーキを微粉末に粉砕し(乳鉢と乳棒)、アセトニトリル(400ml)に再懸濁した。その懸濁液を室温で60分間磁気撹拌してから濾過した。保持された固形物を再び風乾し、再度粉砕し、アセトニトリルに再懸濁した後、濾過し、終夜風乾することにより、BHALys[Lys]8[α-CBz]8[ε-Boc]8(5.41g、85%)をオフホワイトの固体として得た。
LC/MS(疎水性(Phobic)/TFA/Speedy Ramp):ESI(+ve)実測値 [M+H/3]+ m/z=1328;計算値(C207H305N31O47として)3979.9;Rf(分)=12.98分。
Production of BHALys [Lys] 8 [α- NH 2] 8 [ε-Boc] 8
i. Production of BHALys [Lys] 8 [α- CBz] 8 [ε-Boc] 8
A solution of BHALys [Lys] 4 [NH 2 .TFA] 8 (1.59 mmol), triethylamine (4.40 ml, 31.57 mmol) and DMF (32 ml) was added to a magnetically stirred solution of solid PNPO-α-CBz-ε-Boc. -Lys (7.69 g, 15.33 mmol) was added in one portion at room temperature. The reaction suspension immediately turned light yellow and the active ester was completely dissolved after stirring for about 5 minutes. Stirring was continued for an additional 19 hours at room temperature. The crude reaction mixture was poured into a large beaker containing acetonitrile (about 300 ml). The suspension was filtered and the resulting retained solid was air dried overnight with suction. The resulting dry pale yellow cake was ground to a fine powder (mortar and pestle) and resuspended in acetonitrile (400 ml). The suspension was magnetically stirred at room temperature for 60 minutes and then filtered. The retained solid was air-dried again, ground again, resuspended in acetonitrile, filtered, and air-dried overnight to obtain BHALys [Lys] 8 [α-CBz] 8 [ε-Boc] 8 (5.41 g, 85%) was obtained as an off-white solid.
LC / MS (Phobic / TFA / Speedy Ramp): ESI (+ ve) measured value [M + H / 3] + m / z = 1328; calculated value (as C207H305N31O47) 3979.9; Rf (min) = 12.98 minutes.
ii.BHALys[Lys] 8 [α-NH 2 ] 8 [ε-Boc] 8 の製造
BHALys[Lys]8[α-CBz]8[ε-Boc]8(5.0mg、1.26μmol)を9:1 DMF/H2O(2ml)に懸濁し、周囲温度で撹拌し、ギ酸アンモニウム(2.5mg、40.2μmol)を加えてから、Pd/C(10%w/w、2.7mg)を加え、撹拌を20時間続けた。触媒を濾去することによって反応を停止させ、フィルターを9:1 DMF/H2O(1ml)ですすいだ。濾液を減圧下で濃縮することにより、無色のシロップを得た。それを水(1ml)で処理し、その水を減圧下で除去した後、水(1ml)から凍結乾燥することにより、BHALys[Lys]8[α-NH2]8[ε-Boc]8を微細な白色凍結乾燥物(2mg、42%)として得た。
LC/MS(親水性/TFA):ESI(+ve)m/z=969.88 [M+3H]/3+, 727.56 [M+4H]/4+;計算値(C143H257N31O31として)2906.8g/mol。換算演算を使ってデータをデコンボリュートすることにより、mw=2906.5を得た。Rf(分)=17.2。
(実施例20)
ii. Production of BHALys [Lys] 8 [α- NH 2] 8 [ε-Boc] 8
BHALys [Lys] 8 [α-CBz] 8 [ε-Boc] 8 (5.0 mg, 1.26 μmol) was suspended in 9: 1 DMF / H 2 O (2 ml), stirred at ambient temperature, and ammonium formate (2.5 mg, 40.2 μmol) was added followed by Pd / C (10% w / w, 2.7 mg) and stirring was continued for 20 hours. The reaction was stopped by filtering off the catalyst and the filter was rinsed with 9: 1 DMF / H 2 O (1 ml). The filtrate was concentrated under reduced pressure to give a colorless syrup. It is treated with water (1 ml), the water is removed under reduced pressure, and lyophilized from water (1 ml) to give BHALys [Lys] 8 [α-NH 2 ] 8 [ε-Boc] 8 Obtained as a fine white lyophilizate (2 mg, 42%).
LC / MS (hydrophilic / TFA): ESI (+ ve) m / z = 969.88 [M + 3H] / 3 +, 727.56 [M + 4H] / 4 +; calculated value (as C143H257N31O31) 2906.8 g / mol. By deconvolving the data using a conversion operation, mw = 2906.5 was obtained. Rf (minutes) = 17.2.
(Example 20)
BHALys[Lys] 8 [α-CBz] 8 [ε-NH 2 .TFA] 8 の製造
BHALys[Lys]8[α-CBz]8[ε-Boc]8(20.0mg、0.005mmol)を酢酸(109μl)に懸濁し、水浴中で撹拌した。トリフルオロ酢酸(109μl)を注意深く加えて全ての固形物を溶解させ、撹拌を周囲温度で16時間続けた。減圧下で全ての揮発物を除去することによって反応を停止させたところ、無色透明の油状物を得た。この油状物をジエチルエーテル中で摩砕し、得られた白色沈殿物をジエチルエーテルで洗浄し、減圧下で乾燥することにより、BHALys[Lys]8[α-CBz]8[ε-NH2.TFA]8(12.1mg、76%)を白色固体として得た。
LC/MS(親水性/TFA):ESI(+ve)m/z=1060.43 [M+3H]/3+, 795.63 [M+4H]/4+, 636.79 [M+5H]/5+;計算値(C167H241N31O31として)3178.95g/mol。換算演算を使ってデータをデコンボリュートすることにより、mw=3179.25を得た。Rf(分)=16.6。
(実施例21)
Production of BHALys [Lys] 8 [α- CBz] 8 [ε-
BHALys [Lys] 8 [α-CBz] 8 [ε-Boc] 8 (20.0 mg, 0.005 mmol) was suspended in acetic acid (109 μl) and stirred in a water bath. Trifluoroacetic acid (109 μl) was carefully added to dissolve all solids and stirring was continued for 16 hours at ambient temperature. The reaction was stopped by removing all volatiles under reduced pressure to give a clear and colorless oil. This oil was triturated in diethyl ether and the resulting white precipitate was washed with diethyl ether and dried under reduced pressure to give BHALys [Lys] 8 [α-CBz] 8 [ε-NH 2 . TFA] 8 (12.1 mg, 76%) was obtained as a white solid.
LC / MS (Hydrophilic / TFA): ESI (+ ve) m / z = 1060.43 [M + 3H] / 3 +, 795.63 [M + 4H] / 4 +, 636.79 [M + 5H] / 5 +; calculation Value (as C167H241N31O31) 3178.95 g / mol. By deconvolving the data using a conversion operation, mw = 3179.25 was obtained. Rf (minutes) = 16.6.
(Example 21)
BHALys[Lys] 16 [α-NH 2 ] 16 [ε-Boc] 16 の製造
i.BHALys[Lys] 16 [α-Fmoc] 16 [ε-Boc] 16 の製造
BHALys[Lys]8[NH2.TFA]16(0.54mmol)、DIPEA(3.0ml、17.22mmol)およびDMF(11ml)の溶液を撹拌したものに、固形のペンタフルオロフェニルオキシ-α-Fmoc-ε-Boc-Lys(6.58g、10.36mmol)を室温で一度に加えた。反応懸濁液は直ちに明黄色に変色し、約10分間の撹拌後は、活性エステルが完全に溶解していた。撹拌を室温でさらに18時間続けた。その後は粗反応混合物が濃厚になりすぎて磁気撹拌をもはや続けることができなくなった。アセトニトリル(約300ml)を反応フラスコに加え、撹拌を再開させるのに十分になるまで、固形物の塊をスパチュラで砕いた(1時間)。その懸濁液を濾過し、減圧下で終夜風乾した。得られたほぼ無色のケーキを乳鉢と乳棒で粉砕し、その微細な固形物をアセトニトリル(500ml)に2時間再懸濁した。その後、懸濁液を濾過し、無色の固体を集め、室温で終夜風乾した。所期の生成物をオフホワイトの固体(4.72g、94%)として得た。この生成物をFmoc脱保護誘導体BHALys[Lys]16[α-NH2]16[ε-Boc]16として特徴づけた(ii参照)。
BHALys [Lys] 16 [α- NH 2] 16 [ε-Boc] 16 production of
i. BHALys [Lys] 16 production of [α-Fmoc] 16 [ε -Boc] 16
To a stirred solution of BHALys [Lys] 8 [NH 2 .TFA] 16 (0.54 mmol), DIPEA (3.0 ml, 17.22 mmol) and DMF (11 ml), solid pentafluorophenyloxy-α-Fmoc-ε -Boc-Lys (6.58 g, 10.36 mmol) was added in one portion at room temperature. The reaction suspension immediately turned light yellow and after about 10 minutes of stirring, the active ester was completely dissolved. Stirring was continued at room temperature for a further 18 hours. After that, the crude reaction mixture became so thick that magnetic stirring could no longer be continued. Acetonitrile (about 300 ml) was added to the reaction flask and the solid mass was crushed with a spatula until it was sufficient to resume stirring (1 hour). The suspension was filtered and air dried overnight under reduced pressure. The resulting almost colorless cake was ground with a mortar and pestle and the fine solid was resuspended in acetonitrile (500 ml) for 2 hours. The suspension was then filtered and a colorless solid was collected and air dried at room temperature overnight. The expected product was obtained as an off-white solid (4.72 g, 94%). This product was characterized as the Fmoc deprotected derivative BHALys [Lys] 16 [α-NH 2 ] 16 [ε-Boc] 16 (see ii).
ii.BHALys[Lys] 16 [α-NH 2 ] 16 [ε-Boc] 16 の製造
BHALys[Lys]16[α-Fmoc]16[ε-Boc]16(1.0g、0.108mmol)およびDMF(10ml)の懸濁液を磁気撹拌したものに、ニートのピペリジン(1ml、10.11mmol)を室温で一度に加えた。その懸濁液をさらに17時間撹拌したところ、粗反応混合物は淡黄色溶液になった。その混合物を減圧下で濃縮することにより、オフホワイトの固体を得て、その固体を次いでジエチルエーテル(約100ml)に懸濁した。室温で30分間撹拌した後、懸濁液を濾過し、集めた固形物を終夜風乾した。所期の生成物を無色の固体(0.60g、97%)として得た。
LC/MS(疎水性(Phobic)/TFA):ESI(+ve)実測値 [M+H/4]+ m/z=1441;[M+H/5]+ m/z=1153;[M+H/6]+ m/z=961;計算値(C279H513N63O63として)5758.5;Rf(分)=2.95分。
(実施例22)
ii. BHALys [Lys] 16 [α- NH 2] 16 [ε-Boc] 16 production of
To a magnetically stirred suspension of BHALys [Lys] 16 [α-Fmoc] 16 [ε-Boc] 16 (1.0 g, 0.108 mmol) and DMF (10 ml), add neat piperidine (1 ml, 10.11 mmol). Added in one portion at room temperature. The suspension was stirred for an additional 17 hours and the crude reaction mixture became a pale yellow solution. The mixture was concentrated under reduced pressure to give an off-white solid that was then suspended in diethyl ether (ca. 100 ml). After stirring at room temperature for 30 minutes, the suspension was filtered and the collected solid was air dried overnight. The expected product was obtained as a colorless solid (0.60 g, 97%).
LC / MS (Phobic / TFA): ESI (+ ve) found [M + H / 4] + m / z = 1441; [M + H / 5] + m / z = 1153; [M + H / 6] + m / z = 961; calculated (as C279H513N63O63) 5758.5; Rf (min) = 2.95 min.
(Example 22)
BHALys[Lys] 16 [α-Boc] 16 [ε-NH 2 Boc] 16 の製造
BHALys[Lys] 16 [α-Boc] 16 [ε-Fmoc] 16 の製造およびBHALys[Lys] 16 [α-Boc] 16 [ε-Fmoc] 16 の製造
BHALys[Lys]16[α-CBz]16[ε-Boc]16(0.01mmol)およびジクロロメタン(0.5ml)の混合物を撹拌したものに、窒素下で、ニートのTFA(0.5ml)を滴下した。撹拌を室温で18時間続けた。揮発性反応成分を減圧下で除去し、得られたゴム状残渣をジエチルエーテルで処理することにより、塩生成物の沈殿を誘発した。その懸濁液を濾過し、集めた固形物をジエチルエーテルで洗浄した。得られた固形物を水に溶解し、凍結乾燥により、終夜、濃縮乾固した。生成物を綿毛状無色の固体として得た。
LC/MS(親水性/TFA):ESI(+ve)実測値 [M+H/4]+ m/z=1577;[M+H/5]+ m/z=1262。計算値(C327H481N63O63として)6302.8。
(実施例23)
BHALys [Lys] 16 [α- Boc] 16 production of [ε-NH 2 Boc] 16
BHALys [Lys] 16 [α- Boc] 16 [ε-Fmoc] 16 production and BHALys [Lys] 16 [α- Boc] 16 [ε-Fmoc] 16 production of
To a stirred mixture of BHALys [Lys] 16 [α-CBz] 16 [ε-Boc] 16 (0.01 mmol) and dichloromethane (0.5 ml), neat TFA (0.5 ml) was added dropwise under nitrogen. Stirring was continued at room temperature for 18 hours. Volatile reaction components were removed under reduced pressure and the resulting rubbery residue was treated with diethyl ether to induce precipitation of the salt product. The suspension was filtered and the collected solid was washed with diethyl ether. The resulting solid was dissolved in water and concentrated to dryness by lyophilization overnight. The product was obtained as a fluffy colorless solid.
LC / MS (hydrophilic / TFA): ESI (+ ve) found [M + H / 4] + m / z = 1579; [M + H / 5] + m / z = 1262. Calculated (as C 327 H 481 N 63 O 63 ) 6302.8.
(Example 23)
BHALys[Lys] 16 [α-CBz] 16 [ε-NH 2 .TFA] 16 の製造
BHALys[Lys]16[α-CBz]16[ε-Boc]16(0.01mmol)およびジクロロメタン(0.5ml)の混合物を撹拌したものに、窒素下で、ニートのTFA(0.5ml)を滴下した。撹拌を室温で18時間続けた。揮発性反応成分を減圧下で除去し、得られたゴム状残渣をジエチルエーテルで処理することにより、塩生成物の沈殿を誘発した。その懸濁液を濾過し、集めた固形物をジエチルエーテルで洗浄した。得られた固形物を水に溶解し、凍結乾燥により、終夜、濃縮乾固した。生成物を綿毛状無色の固体として得た。
LC/MS(親水性/TFA):ESI(+ve)実測値 [M+H/4]+ m/z=1577;[M+H/5]+ m/z=1262。計算値(C327H481N63O63として)6302.8。
(実施例24)
BHALys [Lys] 16 [α- CBz] 16 [ε-
To a stirred mixture of BHALys [Lys] 16 [α-CBz] 16 [ε-Boc] 16 (0.01 mmol) and dichloromethane (0.5 ml), neat TFA (0.5 ml) was added dropwise under nitrogen. Stirring was continued at room temperature for 18 hours. Volatile reaction components were removed under reduced pressure and the resulting rubbery residue was treated with diethyl ether to induce precipitation of the salt product. The suspension was filtered and the collected solid was washed with diethyl ether. The resulting solid was dissolved in water and concentrated to dryness by lyophilization overnight. The product was obtained as a fluffy colorless solid.
LC / MS (hydrophilic / TFA): ESI (+ ve) found [M + H / 4] + m / z = 1579; [M + H / 5] + m / z = 1262. Calculated (as C 327 H 481 N 63 O 63 ) 6302.8.
(Example 24)
BHALys[Lys] 16 [α,α-Boc] 8 [α,ε-Boc] 8 [ε,α-Boc] 8 [ε,ε-CBz] 8 の製造
i.BHALys[Lys] 8 [ε-CBz] 8 [α-Lys] 8 [Boc] 16 の製造
BHALys[Lys]8[ε-CBz]8[α-NH2.TFA]8(3g、0.75mmol)のDMF(30mL)溶液を撹拌したものに、DBL-OPNP(3.6g、7.2mmol)およびトリエチルアミン(2.1mL、15mmol)を加えた。得られた黄色溶液を室温で16時間撹拌した。反応混合物を撹拌したアセトニトリル(300mL)に加えたところ、黄色溶液中に白色沈殿が生じた。この沈殿物を濾過によって集め、残存着色物質を除去するためにアセトニトリルで洗浄した。次に沈殿物を減圧下、室温で乾燥することにより、BHALys[Lys]8[ε-CBz]8[α-Lys]8[Boc]16を白色粉末(4.2g、98%)として得た。
LC/MS(ファスト疎水性(Fast Hydrophobic)/TFA):Rf(分)=13.70;ESI(+ve)m/z=1936 ([M+3]/3), 1452 ([M+4]/4), 1062 ([M+5-Boc]/5);計算値 C295H465N47O71. M+1. 5083.4。
BHALys [Lys] 16 [α, α-Boc] 8 [α, ε-Boc] 8 [ε, α-Boc] 8 [ε, ε-CBz] Production of 8
i. BHALys [Lys] 8 [ε- CBz] 8 [α-Lys] 8 [Boc] 16 production of
To a stirred solution of BHALys [Lys] 8 [ε-CBz] 8 [α-NH 2 .TFA] 8 (3 g, 0.75 mmol) in DMF (30 mL), DBL-OPNP (3.6 g, 7.2 mmol) and triethylamine (2.1 mL, 15 mmol) was added. The resulting yellow solution was stirred at room temperature for 16 hours. The reaction mixture was added to stirred acetonitrile (300 mL), resulting in a white precipitate in the yellow solution. The precipitate was collected by filtration and washed with acetonitrile to remove residual colored material. Next, the precipitate was dried at room temperature under reduced pressure to obtain BHALys [Lys] 8 [ε-CBz] 8 [α-Lys] 8 [Boc] 16 as a white powder (4.2 g, 98%).
LC / MS (Fast Hydrophobic / TFA): Rf (min) = 13.70; ESI (+ ve) m / z = 1936 ([M + 3] / 3), 1452 ([M + 4] / 4), 1062 ([M + 5-Boc] / 5); calculated value C295H465N47O71.
ii.BHALys[Lys] 8 [ε-NH 2 ]s[α-Lys] 8 [Boc] 16 の製造
BHALys[Lys]8[ε-CBz]8[α-Lys]8[Boc]16(2.2g、0.38mmol)の酢酸(30mL)溶液を撹拌したものに、10%Pd/C(101mg、0.095mmol)を加えた。得られた均一混合物を室温で16時間、水素下に置いた。その溶液を濾過し、減圧下で濃縮した。得られた粘稠な残渣を水に再溶解し、凍結乾燥することにより、BHALys[Lys]8[ε-NH2]8[α-Lys]8[Boc]16(1.97g、0.38mmol)を得た。この物質は多少の酢酸残渣を含有していた。
LC/MS(親水性/TFA):Rf(分)=18.53;ESI(+ve)m/z=1184 ([M+4]/4), 947 ([M+5]/5), 790 ([M+6]/6);計算値. C231H417N47O55. M+1. 4731.1。
ii. BHALys [Lys] 8 [ε- NH 2] s [α -Lys] 8 [Boc] 16 production of
To a stirred solution of BHALys [Lys] 8 [ε-CBz] 8 [α-Lys] 8 [Boc] 16 (2.2 g, 0.38 mmol) in acetic acid (30 mL), 10% Pd / C (101 mg, 0.095 mmol ) Was added. The resulting homogeneous mixture was placed under hydrogen for 16 hours at room temperature. The solution was filtered and concentrated under reduced pressure. The viscous residue obtained was redissolved in water and lyophilized to obtain BHALys [Lys] 8 [ε-NH 2 ] 8 [α-Lys] 8 [Boc] 16 (1.97 g, 0.38 mmol). Obtained. This material contained some acetic acid residue.
LC / MS (hydrophilic / TFA): Rf (min) = 18.53; ESI (+ ve) m / z = 1184 ([M + 4] / 4), 947 ([M + 5] / 5), 790 ( [M + 6] / 6); calculated. C231H417N47O55.
iii.BHALys[Lys] 16 [α,α-Boc] 8 [α,ε-Boc] 8 [ε,α-Boc] 8 [ε,ε-CBz] 8 の製造
BHALys[Lys]8[ε-NH2]8[α-Lys]8[Boc]16(90mg、0.019mmol)のDMF(10mL)溶液を撹拌したものに、PNPO-α-Boc-ε-CBz-Lys(90mg、0.18mmol)およびトリエチルアミン(0.05mL、0.35mmol)を加えた。得られた黄色溶液を室温で16時間撹拌した。次に反応混合物を撹拌したアセトニトリル(100mL)に加えたところ、黄色溶液中に白色沈殿物が生じた。この沈殿物を濾過によって集め、残存着色物質を除去するためにアセトニトリルで洗浄した。沈殿物を減圧下、室温で乾燥することにより、BHALys[Lys]16[α,α-Boc]8[α,ε-Boc]8[ε,α-Boc]8[ε,ε-CBz]8(51mg、35%)を得た。
LC/MS(疎水性 TFA Speedy Rp):Rf(分)=14.32;ESI(+ve)m/z=2544 ([M+3]/3), 1909 ([M+4]/4), 1527 ([M+5]/5);計算値. C383H625N63O95. M+1. 7629。
(実施例25)
iii. BHALys [Lys] 16 [α, α-Boc] 8 [α, ε-Boc] 8 [ε, α-Boc] 8 [ε, ε-CBz] Production of 8
To a stirred solution of BHALys [Lys] 8 [ε-NH 2 ] 8 [α-Lys] 8 [Boc] 16 (90 mg, 0.019 mmol) in DMF (10 mL), PNPO-α-Boc-ε-CBz- Lys (90 mg, 0.18 mmol) and triethylamine (0.05 mL, 0.35 mmol) were added. The resulting yellow solution was stirred at room temperature for 16 hours. The reaction mixture was then added to stirred acetonitrile (100 mL), resulting in a white precipitate in the yellow solution. The precipitate was collected by filtration and washed with acetonitrile to remove residual colored material. By drying the precipitate at room temperature under reduced pressure, BHALys [Lys] 16 [α, α-Boc] 8 [α, ε-Boc] 8 [ε, α-Boc] 8 [ε, ε-CBz] 8 (51 mg, 35%) was obtained.
LC / MS (hydrophobic TFA Speedy Rp): Rf (min) = 14.32; ESI (+ ve) m / z = 2544 ([M + 3] / 3), 1909 ([M + 4] / 4), 1527 ([M + 5] / 5); calculated. C383H625N63O95.
(Example 25)
BHALys[Lys] 16 [α,α-Boc] 8 [α,ε-Boc] 8 [ε,α-Boc] 8 [ε,ε-Fmoc] 8 の製造
BHALys[Lys]8[ε-NH2]s[α-Lys]8[Boc]16(100mg、0.017mmol)のDMF(10mL)溶液を撹拌したものに、PFP-Lys-α-Boc-ε-Fmoc(96mg、0.15mmol)およびトリエチルアミン(0.04mL、0.27mmol)を加えた。その溶液を室温で16時間撹拌した。次に反応混合物をアセトニトリル(100ml)に加えたところ、透明なゼラチン状の沈殿物が生じた。この沈殿物を濾過によって集め、アセトニトリルで洗浄した。沈殿物を室温で乾燥することにより、BHALys[Lys]16[α,α-Boc]8[α,ε-Boc]8[ε,α-Boc]8[ε,ε-Fmoc]8(30mg、21%)を得た。
LC/MS(疎水性/TFA):Rf(分)=7.72;ESI(+ve)m/z=1667 ([M+5]/5), 1389 ([M+6]/6), 1191([M+7]/7);計算値. C439H657N63O95. M+1 8332。
BHALys [Lys] 16 [α, α-Boc] 8 [α, ε-Boc] 8 [ε, α-Boc] 8 [ε, ε-Fmoc] Production of 8
To a stirred solution of BHALys [Lys] 8 [ε-NH 2 ] s [α-Lys] 8 [Boc] 16 (100 mg, 0.017 mmol) in DMF (10 mL), PFP-Lys-α-Boc-ε- Fmoc (96 mg, 0.15 mmol) and triethylamine (0.04 mL, 0.27 mmol) were added. The solution was stirred at room temperature for 16 hours. The reaction mixture was then added to acetonitrile (100 ml) resulting in a clear gelatinous precipitate. The precipitate was collected by filtration and washed with acetonitrile. By drying the precipitate at room temperature, BHALys [Lys] 16 [α, α-Boc] 8 [α, ε-Boc] 8 [ε, α-Boc] 8 [ε, ε-Fmoc] 8 (30 mg, 21%).
LC / MS (hydrophobic / TFA): Rf (min) = 7.72; ESI (+ ve) m / z = 1667 ([M + 5] / 5), 1389 ([M + 6] / 6), 1191 ( [M + 7] / 7); calculated. C439H657N63O95. M + 1 8332.
明確に規定されたPEG1.7KDの製造
HO2C-PEG1146-NH2(245mg、0.21mmol、1.07等量)およびPEG570-NHS(136mg、0.2mmol)のDMF(6mL)溶液を撹拌したものに、2mLの緩衝液(pH8.5、Na2HPO4の溶液(100mL)を撹拌したものに2.5mLの0.1M HCl溶液を加え、添加完了後、5分間撹拌することによって調製)を加えた。反応混合物を室温で終夜撹拌した。溶媒をロータバップで除去することにより、PEG1716-CO2Hを残渣として得た。それをLCで精製することにより、所期の生成物を得た(収率80%)。
(実施例26)
Production of clearly defined PEG1.7KD
To a stirred solution of HO 2 C-PEG 1146 -NH 2 (245 mg, 0.21 mmol, 1.07 eq) and PEG 570 -NHS (136 mg, 0.2 mmol) in DMF (6 mL) was added 2 mL of buffer (pH 8.5). , To a stirred solution of Na 2 HPO 4 (100 mL) was added 2.5 mL of 0.1 M HCl solution, and prepared by stirring for 5 minutes after the addition was complete. The reaction mixture was stirred at room temperature overnight. The solvent was removed by rotavap to give PEG 1716 -CO 2 H as a residue. It was purified by LC to give the expected product (yield 80%).
(Example 26)
BHALys[Lys] 8 (α-NH 2 .TFA) 8 (ε-PEG 571 ) 8 の製造
i.BHALys[Lys] 8 (α-Boc) 8 (ε-PEG 571 ) 8 の製造
BHALys[Lys]8(α-Boc)8(ε-NH2.TFA)8(9.2mg、0.003mmol)の乾燥DMF(1mL)およびDMSO(1mL)溶液を窒素下で撹拌したものに、NHS-PEG685.75(26mg、0.45mmol)およびトリエチルアミン(10μL、0.108mmol)を加えた。反応混合物を室温で16時間撹拌した後、減圧下で濃縮することにより、粗油状物を得て、それを分取HPLC[C18分取用カラム:Waters Xterra Prep RP18、10μm、19×250mm.周囲温度.勾配:80分で10-45%MeCN.Rf(分)85]で精製することにより、BHALys[Lys]8(α-Boc)8(ε-PEG571)8を無色の油状物(18mg、75%)として得た。
LC-MS:(疎水性(Phobic), TFA)Rf(分)12.81。ESI(+ve)m/z=1246.3 (M/6), 1068.2 (M/7), 934.8 (M/8) 831.2 (M/9)。
Production of BHALys [Lys] 8 (α-
i. Production of BHALys [Lys] 8 (α- Boc) 8 (ε-PEG 571) 8
To a solution of BHALys [Lys] 8 (α-Boc) 8 (ε-NH 2 .TFA) 8 (9.2 mg, 0.003 mmol) in dry DMF (1 mL) and DMSO (1 mL) stirred under nitrogen, NHS- PEG685.75 (26 mg, 0.45 mmol) and triethylamine (10 μL, 0.108 mmol) were added. The reaction mixture was stirred at room temperature for 16 hours and then concentrated under reduced pressure to obtain a crude oil, which was subjected to preparative HPLC [C18 preparative column: Waters Xterra Prep RP18, 10 μm, 19 × 250 mm. Ambient temperature. Gradient: 10-45% MeCN in 80 minutes. Rf (min) 85] gave BHALys [Lys] 8 (α-Boc) 8 (ε-PEG 571 ) 8 as a colorless oil (18 mg, 75%).
LC-MS: (Phobic, TFA) Rf (min) 12.81. ESI (+ ve) m / z = 1246.3 (M / 6), 1068.2 (M / 7), 934.8 (M / 8) 831.2 (M / 9).
ii.BHALys[Lys] 8 (α-NH 2 .TFA) 8 (ε-PEG 571 ) 8
BHALys[Lys]8(α-Boc)8(ε-PEG571)8(18mg、0.002mmol)のCH2Cl2(3mL)溶液を0℃で撹拌したものに、TFA(45μL、0.58mmol)を加え、0℃での撹拌を20分間続けた後、室温で2時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去することにより、BHALys[Lys]8(α-NH2.TFA)8(ε-PEG571)8を油状物(16mg、88%)として得た。
LC-MS:(親水性(Philic), TFA)Rf(分)10.36。ESI(+ve)m/z=954 (M/7), 834 (M/8), 742 (M/9)。
(実施例27)
ii. BHALys [Lys] 8 (α-NH 2 .TFA) 8 (ε-PEG 571 ) 8
To a stirred solution of BHALys [Lys] 8 (α-Boc) 8 (ε-PEG 571 ) 8 (18 mg, 0.002 mmol) in CH 2 Cl 2 (3 mL) at 0 ° C., add TFA (45 μL, 0.58 mmol). In addition, stirring at 0 ° C. was continued for 20 minutes, followed by stirring at room temperature for 2 hours. The solvent was removed under reduced pressure to give BHALys [Lys] 8 (α-NH 2 .TFA) 8 (ε-PEG 571 ) 8 as an oil (16 mg, 88%).
LC-MS: (Philic, TFA) Rf (min) 10.36. ESI (+ ve) m / z = 954 (M / 7), 834 (M / 8), 742 (M / 9).
(Example 27)
BHALys[Lys] 16 [α-PEG 570 ] 16 [ε-MTX] 16 の製造
反応スキーム3(図17)を参照して標題化合物の製造を例示する。この反応スキームは以下のとおりである。BHALys[Lys]16[α-Fmoc]16[ε-Boc]16(図17の構造2;R1=Fmoc、R2=Boc)をDMF中でピペリジンと反応させて、BHALys[Lys]16[α-NH2]16[ε-Boc]16(構造3f;R1=H、R2=Boc)を得る。次に、構造3fをDIPEAを使って過剰量のPEG570-NHSとDMF中で反応させることにより、BHALys[Lys]16[α-PEG570]16[ε-Boc]16(構造3g;R1=PEG570、R2=Boc)を得る。次に、構造3gをDCM中でTFA(20%)と反応させ、次いでイオン交換樹脂(OH-型)と反応させることにより、BHALys[Lys]16[α-PEG570]16[ε-NH2]16(構造3h;R1=PEG570、R2=NH2)を得る。次に、構造3hを過剰量のα-tBu-γ-MTX-OH、EDC、HOBtおよびDIPEAとDMSO中で反応させて、BHALys[Lys]16[α-PEG570]16[ε-(α-tBu-MTX)]16(構造3i;R1=PEG570、R2=α-tBu-MTX)を得る。次に、構造3iをTFAと反応させて、BHALys[Lys]16[α-PEG570]16[ε-MTX]16(構造3j;R1=PEG570、R2=MTX)を得る。
Production of BHALys [Lys] 16 [α-PEG 570 ] 16 [ε-MTX] 16 Production of the title compound is illustrated with reference to Reaction Scheme 3 (FIG. 17). This reaction scheme is as follows. BHALys [Lys] 16 [α-Fmoc] 16 [ε-Boc] 16 (
PEG570-NHSの代りにPEG1716、PEG2645およびPEG3974を使用すると、PEGサイズの大きいデンドリマー構築物が得られ、これには、DMF中の構造3fと過剰量のPEGMW-CO2H、HOBtおよびEDCとからDIPEAを使って構造3g(R1=PEGMW、R2=CBz)BHALys[Lys]16[α-PEGMW]16[ε-CBz]16を得るための代替反応条件が必要である。
(実施例28)
The use of PEG 1716 , PEG 2645 and PEG 3974 instead of PEG 570- NHS resulted in a large PEG-sized dendrimer construct, which includes structure 3f in DMF and an excess of PEG MW -CO 2 H, HOBt And EDC and DIPEA to obtain the structure 3g (R 1 = PEG MW , R 2 = CBz) BHALys [Lys] 16 [α-PEG MW ] 16 [ε-CBz] 16 is there.
(Example 28)
BHALys[Lys] 16 [α-PEG 570 ] 16 [ε-COCH 2 CH 2 CO-タキソール] 16 の製造
反応スキーム5(図18)を参照して標題化合物の製造を例示する。この反応スキームは以下のとおりである。BHALys[Lys]16[α-PEG570]16[ε-NH2]16(構造3h;R1=PEG570、R2=H)とTFA(16等量)とを過剰量のHO2CCH2CH2CO-タキソール、EDC、HOBtおよびDIPEAとDMF中で反応させて、BHALys[Lys]16[α-PEG570]16[ε-COCH2CH2CO-タキソール]16(構造3l;R1=PEG570、R2=COCH2CH2CO-タキソール)を得る。
Production of BHALys [Lys] 16 [α-PEG 570 ] 16 [ε-COCH 2 CH 2 CO-Taxol] 16 The production of the title compound is illustrated with reference to Reaction Scheme 5 (FIG. 18). This reaction scheme is as follows. BHALys [Lys] 16 [α-PEG 570 ] 16 [ε-NH 2 ] 16 (
構造3hにおいてPEG570の代りにPEG1716、PEG2645およびPEG3974を使用すると、PEGサイズが増加したデンドリマー構築物が得られる。
(実施例29)
Use of PEG 1716 , PEG 2645 and PEG 3974 instead of PEG 570 in
(Example 29)
BHALys[Lys] 16 [ε,ε-PEG 570 ] 8 [COCH 2 CH 2 CO-タキソール] 24 の製造
i.BHALys[Lys] 8 [α-NH 2 ] 8 [ε-CBz] 8 の製造
反応スキーム6(パート1)(図19A)を参照して中間体化合物の製造を例示する。この反応スキームは以下のとおりである。BHALys[Lys]4[NH2-TFA]8(構造4;R1=H.TFA)を過剰量のPNPO-α-Boc-ε-CBz-LysおよびDIPEAとDMF中で反応させて、BHALys[Lys]8[α-Boc]8[ε-CBz]8(構造5a;R1=Boc、R2=CBz)を得る。構造5aをTFA/酢酸と反応させた後、イオン交換樹脂(0H-型)と反応させることにより、BHALys[Lys]8[α-NH2]8[ε-CBz]8(構造5b;R1=H、R2=CBz)を得る。
BHALys [Lys] 16 [ε, ε-PEG 570] Production of 8 [COCH 2 CH 2 CO- Taxol] 24
i. Production of BHALys [Lys] 8 [α-NH 2 ] 8 [ε-CBz] 8 The production of the intermediate compound is illustrated with reference to Reaction Scheme 6 (Part 1) (FIG. 19A). This reaction scheme is as follows. BHALys [Lys] 4 [NH 2 -TFA] 8 (
ii.BHALys[Lys] 16 [ε,ε-PEG 570 ] 8 [COCH 2 CH 2 CO-タキソール] 24 の製造
反応スキーム6(パート2)(図19B)を参照して標題化合物の製造を例示する。この反応スキームは以下のとおりである。BHALys[Lys]8[α-NH2]8[ε-CBz]8(構造5b;R1=H、R2=CBz)とTFA(8等量)とを、過剰量のDBL-OPNPおよびDIPEAとDMF中で反応させて、BHALys[Lys]8[ε-CBz]8[Lys]8[α,α-Boc]8[α,ε-Boc]8(構造6a;R1=Boc、R2=CBz)を得る。構造6aをH2およびPd(10%)炭と酢酸中で反応させた後、イオン交換樹脂(OH-型)と反応させることにより、BHALys[Lys]8[ε-NH2]8[Lys]8[α,α-Boc]8[α,ε-Boc]8(構造6b;R1=Boc、R2=H)を得る。構造6bとTFA(8等量)とを過剰量のPNPO-α-Boc-ε-CBz-LysおよびDIPEAとDMF中で反応させて、BHALys[Lys]16[ε,ε-CBz]8[Boc]24(構造7a;R1=Boc、R2=CBz)を得る。構造7aをH2およびPd(10%)炭と酢酸中で反応させ、次にイオン交換樹脂(OH-型)と反応させることにより、BHALys[Lys]16[ε,ε-NH2]8[Boc]24(構造7b;R1=Boc、R2=H)を得る。構造7bを過剰量のPEG570-NHSとDMF中でDIPEAを使って反応させることにより、BHALys[Lys]16[ε,ε-PEG570]8[Boc]24(構造7c;R1=Boc、R2=PEG570)を得る。構造7cをTFAと反応させてBHALys[Lys]16[ε,ε-PEG570]8[NH2-TFA]24(構造7d;R1=H.TFA、R2=PEG570)を得る。構造7dIを過剰量のHO2CCH2CH2CO-タキソール、EDC、HOBtおよびDIPEAとDMF中で反応させて、BHALys[Lys]16[ε,ε-PEG570]8[COCH2CH2CO-タキソール]24(構造7e;R1=COCH2CH2CO-タキソール、R2=PEG570)を得る。
ii. BHALys [Lys] 16 [ε, ε-PEG 570] illustrates the preparation of 8 [COCH 2 CH 2 CO- taxol] 24 production reaction scheme 6 (Part 2) The title compound with reference to (Figure 19B). This reaction scheme is as follows. BHALys [Lys] 8 [α-NH 2 ] 8 [ε-CBz] 8 (Structure 5b; R 1 = H, R 2 = CBz) and TFA (8 equivalents) are combined with excess DBL-OPNP and DIPEA And DMF in BMFALys [Lys] 8 [ε-CBz] 8 [Lys] 8 [α, α-Boc] 8 [α, ε-Boc] 8 (
PEG570-NHSの代りにPEG1716、PEG2645およびPEG3974を使用すると、PEGサイズの大きいデンドリマー構築物が得られ、これには、構造7bをDMF中で過剰量のPEGMW-CO2HならびにHOBtおよびEDCとDIPEAを使って反応させて、BHALys[Lys]16[ε,ε-PEGMW]8[Boc]24(構造7c;R1=Boc、R2=PEGMW)を得るための代替反応条件が必要である。
(実施例30)
The use of PEG 1716 , PEG 2645 and PEG 3974 instead of PEG 570- NHS resulted in a large PEG-sized dendrimer construct, which included structure 7b in excess of PEG MW -CO 2 H and HOBt in DMF. And reaction using EDC and DIPEA to obtain BHALys [Lys] 16 [ε, ε-PEG MW ] 8 [Boc] 24 (structure 7c; R 1 = Boc, R 2 = PEG MW ) Conditions are needed.
(Example 30)
明確に規定されたPEG部分:PEG 1716 、PEG 2645 、PEG 3974 の製造
上記の反応スキームにおいて代用するための上記代替PEG部分の製造を、反応スキーム7(図20)を使って例示する。この反応スキームは以下のとおりである。i.HO2C-PEG1146-NH2をPEG570-NHSとDMF-緩衝液pH8.5中で反応させてPEG1716-CO2Hを得る。ii.PEG1716-CO2HをDCCおよびNHSと反応させ、次にHO2C-PEG1146-NH2とDMF-緩衝液pH8.5中で反応させることにより、PEG2845-CO2Hを得る。iii.PEG2845-CO2HをDCCおよびNHSと反応させた後、HO2C-PEG1146-NH2とDMF-緩衝液pH8.5中で反応させることにより、PEG3974-CO2Hを得る。
(実施例31)
Production of well-defined PEG moieties: PEG 1716 , PEG 2645 , PEG 3974 The production of the above alternative PEG moiety to substitute in the above reaction scheme is illustrated using Reaction Scheme 7 (FIG. 20). This reaction scheme is as follows. i. HO 2 C-PEG 1146 -NH 2 is reacted with PEG 570 -NHS in DMF-buffer pH 8.5 to give PEG 1716 -CO 2 H. ii. PEG 1716 -CO 2 H is reacted with DCC and NHS and then reacted with HO 2 C-PEG 1146 -NH 2 in DMF-buffer pH 8.5 to give PEG 2845 -CO 2 H. iii. PEG 2845 -CO 2 H is reacted with DCC and NHS and then reacted with HO 2 C-PEG 1146 -NH 2 in DMF-buffer pH 8.5 to obtain PEG 3974 -CO 2 H.
(Example 31)
BHALys[Lys] 2 [Su(NPN) 2 ] 4 [α-tBu-MTX] 4 [PEG 570 ] 4 の製造
i.N-(ベンジルオキシカルボニル)-3-ブロモプロピルアミンの製造
i. Production of N- (benzyloxycarbonyl) -3-bromopropylamine
ii.[BOC][Cbz][NPN] 2 の製造
iii.[BOC][Cbz][NPN] 2 SuOHの製造
iv.[BOC][Cbz][NPN] 2 SuOPNPの製造
v.[BOC][Cbz][NPN] 2 SuOEtの製造
LCMS(LC:親水性(philic), ホルメート、RT=9.3分;MS(M(計算値) C25H39N3O7=493.61):511 ([M+NH4]+, 13%)、494([M+H]+, 100%)、438 ([M-t-Bu+H]+, 15%)、394 ([M-BOC+H]+, 13%)。
1H (CDCl3):δ 7.30-7.38 (m, 5H), 5.70(br s, 0.5H), 5.25 (br s, 0.5H), 5.10(br s, 0.5H), 5.10, 5.08 (2s, 2H), 4.70(br s, 0.5H), 4.12 (q, J=9.0Hz, 2H), 2.95-3.45 (m, 8H), 2.52-2.70(m, 4H), 1.73-1.90(m, 2H), 1.60-1.70(m, 2H), 1.42, 1.44 (2s, 9H), 1.25 (t, J=9.0Hz, 3H)。
v. [BOC] [Cbz] [NPN] 2 Manufacture of SuOEt
LCMS (LC: hydrophilic, formate, RT = 9.3 min; MS (M (calculated) C 25 H 39 N 3 O 7 = 493.61): 511 ([M + NH 4 ] + , 13%), 494 ([M + H] + , 100%), 438 ([Mt-Bu + H] + , 15%), 394 ([M-BOC + H] + , 13%).
1 H (CDCl 3 ): δ 7.30-7.38 (m, 5H), 5.70 (br s, 0.5H), 5.25 (br s, 0.5H), 5.10 (br s, 0.5H), 5.10, 5.08 (2s, 2H), 4.70 (br s, 0.5H), 4.12 (q, J = 9.0Hz, 2H), 2.95-3.45 (m, 8H), 2.52-2.70 (m, 4H), 1.73-1.90 (m, 2H) , 1.60-1.70 (m, 2H), 1.42, 1.44 (2s, 9H), 1.25 (t, J = 9.0Hz, 3H).
vi.[BOC][NH 2 ][NPN] 2 SuOEtの製造
LCMS(LC:親水性(philic), TFA、RT=6.2分;MS(M(計算値) C17H33N3O5=359.47):360 ([M+H]+, 100%)。
1H (CDCl3):δ 5.30(br s, 1H), 4.80(br s, 1H), 4.12 (q, J=9.0Hz, 2H), 3.29-3.46 (m, 4H), 3.14 (m, 1H), 3.07 (m, 1H), 2.56-2.80(m, 6H), 1.60-1.90(m, 4H), 1.42, 1.43 (2s, 9H), 1.25 (t, J=9.0Hz, 3H)。
vii.[BOC][PEG 570 ][NPN] 2 SuOEtの製造
LCMS(LC:親水性(philic), TFA、RT=8.2分;MS(M(計算値) C43H83N3O18=930.15):948 ([M+NH4]+, 12%)、931 ([M+H]+, 2%)、416 (1/2[M-BOC+2H+], 100%)。
1H (CDCl3):δ 7.10(br s, 1H), 7.03 (br s, 1H), 4.16 (q, J=9.0Hz, 2H), 3.72 (m, 2H), 3.58-3.66 (m, 36H), 3.52-3.56 (m, 2H), 3.47 (s, 2H), 2.96-3.42 (m, 7H), 3.37 (s, 4H), 2.70(s, 4H), 2.60(m, 4H), 2.47 (m, 2H), 1.60-1.90(m, 4H), 1.41, 1.43 (2s, 9H), 1.24 (t, J=9.0Hz, 3H)。
vi. [BOC] [NH 2 ] [NPN] 2 Manufacture of SuOEt
LCMS (LC: hydrophilic, TFA, RT = 6.2 min; MS (M (calculated) C 17 H 33 N 3 O 5 = 359.47): 360 ([M + H] + , 100%).
1 H (CDCl 3 ): δ 5.30 (br s, 1H), 4.80 (br s, 1H), 4.12 (q, J = 9.0Hz, 2H), 3.29-3.46 (m, 4H), 3.14 (m, 1H ), 3.07 (m, 1H), 2.56-2.80 (m, 6H), 1.60-1.90 (m, 4H), 1.42, 1.43 (2s, 9H), 1.25 (t, J = 9.0Hz, 3H).
vii. [BOC] [PEG 570 ] [NPN] 2 Manufacture of SuOEt
LCMS (LC: hydrophilic, TFA, RT = 8.2 min; MS (M (calculated) C 43 H 83 N 3 O 18 = 930.15): 948 ([M + NH 4 ] + , 12%), 931 ([M + H] + , 2%), 416 (1/2 [M-BOC + 2H + ], 100%).
1 H (CDCl 3 ): δ 7.10 (br s, 1H), 7.03 (br s, 1H), 4.16 (q, J = 9.0Hz, 2H), 3.72 (m, 2H), 3.58-3.66 (m, 36H ), 3.52-3.56 (m, 2H), 3.47 (s, 2H), 2.96-3.42 (m, 7H), 3.37 (s, 4H), 2.70 (s, 4H), 2.60 (m, 4H), 2.47 ( m, 2H), 1.60-1.90 (m, 4H), 1.41, 1.43 (2s, 9H), 1.24 (t, J = 9.0 Hz, 3H).
viii.[NH 2 -TFA][PEG 570 ][NPN] 2 SuOEtの製造
LCMS(LC:親水性(philic), TFA、RT=5.9分;MS(M(計算値) C38H75N3O16=830.03):831 ([M+H]+, 7%)、425 (1/2[M+Na++H+], 30%)、416 (1/2[M+2H+], 100%)。
1H (D2O):δ 4.17 (q, J=9.0Hz, 2H), 3.80(t, J=6.0Hz, 2H), 3.62-3.75 (m, 43H), 3.38-3.53 (m, 4H), 3.40(s, 3H), 2.90-3.31 (m, 4H), 2.77 (s, 4H), 2.64-2.89 (m, 4H), 2.52-2.58 (m, 2H), 1.72-2.11 (m, 4H), 1.13 (t, J=9.0Hz, 3H)。
viii. [NH 2 -TFA] [PEG 570 ] [NPN] 2 Manufacture of SuOEt
LCMS (LC: hydrophilic, TFA, RT = 5.9 min; MS (calculated) C 38 H 75 N 3 O 16 = 830.03): 831 ([M + H] + , 7%), 425 (1/2 [M + Na ++ H + ], 30%), 416 (1/2 [M + 2H + ], 100%).
1 H (D 2 O): δ 4.17 (q, J = 9.0Hz, 2H), 3.80 (t, J = 6.0Hz, 2H), 3.62-3.75 (m, 43H), 3.38-3.53 (m, 4H) , 3.40 (s, 3H), 2.90-3.31 (m, 4H), 2.77 (s, 4H), 2.64-2.89 (m, 4H), 2.52-2.58 (m, 2H), 1.72-2.11 (m, 4H) , 1.13 (t, J = 9.0Hz, 3H).
ix.[α-tBu-MTX][PEG 1570 ][NPN] 2 SuOEtの製造
LCMS(LC:親水性(philic), TFA、RT=8.0分;MS(M(計算値) C62H103N11O20=1322.57):1323 ([M+H]+, 2%)、662 (1/2[M+2H+], 17%)、634 (1/2[M-tBu+2H+], 82%)。
ix. [α-tBu-MTX] [PEG 1570 ] [NPN] 2 Production of SuOEt
LCMS (LC: hydrophilic, TFA, RT = 8.0 min; MS (M (calculated) C 62 H 103 N 11 O 20 = 1322.57): 1323 ([M + H] + , 2%), 662 (1/2 [M + 2H + ], 17%), 634 (1/2 [M-tBu + 2H + ], 82%).
x.[α-tBu-MTX][PEG 570 ][NPN] 2 SuOHの製造
LCMS(LC:親水性(philic), TFA、RT=6.8分;MS(M(計算値) C60H99N11O2O=1294.52):1317 ([M+Na]+, 3%)、1295 ([M+H]+, 2%)、648 (1/2[M+2H+], 10%)、620 (1/2[M-tBu+2H+], 74%)、419 (100%)。
x. [α-tBu-MTX] [PEG 570 ] [NPN] 2 Production of SuOH
LCMS (LC: hydrophilic, TFA, RT = 6.8 min; MS (M (calculated) C 60 H 99 N 11 O 2O = 1294.52): 1317 ([M + Na] + , 3%), 1295 ([M + H] + , 2%), 648 (1/2 [M + 2H + ], 10%), 620 (1/2 [M-tBu + 2H + ], 74%), 419 (100% ).
xi.BHALys[Lys] 2 [Su(NPN) 2 ] 4 [α-tBu-MTX] 4 [PEG 570 ] 4 の製造
DMF(1.2mL)中の[α-tBu-MTX][PEG570][NPN]2SuOH(10mg、7.7μmol)とBHALys[Lys]2[NH2.TFA]4(1.43mg、1.4μmol)の混合物を0℃で撹拌したものに、PyBOP(4.0mg、7.7μmol)およびDIPEA(3.9μL、22.4μmol)を加えた。その混合物を0℃で30分間撹拌した後、室温で3時間撹拌した。DMFを除去し、残渣を分取HPLC(Waters Xterra MS C18、10μm、19×250mm、30-60%ACN, 0.1%TFA、8mL/分、RT=34分)で精製することにより、2mg(25%{大半がボイドに溶出}のBHALys[Lys]2[Su(NPN)2]4[α-tBu-MTX]4[PEG570]4を得た。
LCMS(LC:親水性(philic), TFA、RT=8.0分;MS:1136 (1/5[M+5H+], 18%)、946 (1/6[M+6H+], 100%)、812 (1/7[M+7H+], 22%)。換算値5,673.34(M(計算値) C271H437N51O79=5,673.80)。
(実施例32)
xi. BHALys [Lys] 2 [Su ( NPN) 2] 4 [α-tBu-MTX] 4 production of [PEG 570] 4
[Α-tBu-MTX] [PEG 570 ] [NPN] 2 SuOH (10 mg, 7.7 μmol) and BHALys [Lys] 2 [NH 2 .TFA] 4 (1.43 mg, 1.4 μmol) in DMF (1.2 mL) To the stirred mixture at 0 ° C., PyBOP (4.0 mg, 7.7 μmol) and DIPEA (3.9 μL, 22.4 μmol) were added. The mixture was stirred at 0 ° C. for 30 minutes and then stirred at room temperature for 3 hours. DMF was removed and the residue was purified by preparative HPLC (Waters Xterra MS C 18 , 10 μm, 19 × 250 mm, 30-60% ACN, 0.1% TFA, 8 mL / min, RT = 34 min) to give 2 mg ( BHALys [Lys] 2 [Su (NPN) 2 ] 4 [α-tBu-MTX] 4 [PEG 570 ] 4 of 25% {mostly eluted in voids] was obtained.
LCMS (LC: hydrophilic, TFA, RT = 8.0 min; MS: 1136 (1/5 [M + 5H + ], 18%), 946 (1/6 [M + 6H + ], 100%) 812 (1/7 [M + 7H + ], 22%) Conversion value 5,673.34 (M (calculated value) C 271 H 437 N 51 O 79 = 5,673.80).
(Example 32)
BHALys[Lys] 4 [Su(NPN) 2 ] 8 [α-tBu-MTX] 8 [PEG 570 ] 8 の製造
実施例31に記載したものと同様の手法を使ってBHALys[Lys]4[NH2.TFA]8を[α-tBu-MTX][PEG570][NPN]2SuOHと反応させることにより、BHALys[Lys]4[Su(NPN)2]8[α-tBu-MTX]8[PEG570]8(10mg)(51%)を得た。分取HPLC(5-60%ACN、90分、RT54分)。
LCMS(LC:親水性(philic), TFA、RT=9.0分;MS:1614 (1/7[M+7H+], 26%)、1413 (1/8[M+8H+], 73%)、1256 (1/9[M+9H+], 100%)。換算値11,294.54(M(計算値) C535H873N103O159=11,292.52)。
(実施例33)
BHALys [Lys] 4 [Su (NPN) 2 ] 8 [α-tBu-MTX] 8 [PEG 570 ] 8 Production of BHALys [Lys] 4 [NH 2 using the same method as described in Example 31 .TFA] 8 reacts with [α-tBu-MTX] [PEG 570 ] [NPN] 2 SuOH to produce BHALys [Lys] 4 [Su (NPN) 2 ] 8 [α-tBu-MTX] 8 [PEG 570 ] 8 (10 mg) (51%). Preparative HPLC (5-60% ACN, 90 minutes, RT 54 minutes).
LCMS (LC: hydrophilic, TFA, RT = 9.0 min; MS: 1614 (1/7 [M + 7H + ], 26%), 1413 (1/8 [M + 8H + ], 73%) , 1256 (1/9 [M + 9H + ], 100%) Conversion value 11,294.54 (M (calculated value) C 535 H 873 N 103 O 159 = 11,292.52).
(Example 33)
BHALys[Lys] 8 [Su(NPN) 2 ] 16 [α-tBu-MTX] 16 [PEG 570 ] 16 の製造
実施例31に記載したものと同様の手法を使ってBHALys[Lys]8[NH2.TFA]16を[α-tBu-MTX][PEG570][NPN]2SuOHと反応させることにより、BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[α-tBu-MTX]16[PEG570]16(6mg)(46%)を得た。分取HPLC(5-60%ACN、90分、RT66分)。
LCMS(LC:親水性(philic), TFA、RT=9.0分;MS:2254 (1/10[M+10H+], 24%)、2049 (1/11[M+11H+], 56%)、1879 (1/12[M+12H+], 100%)、1734 (1/13[M+13H+], 55%)。換算値22,531.91(M(計算値) C1063H1745N207O319=22,529.73)。
BHALys [Lys] 8 [Su (NPN) 2 ] 16 [α-tBu-MTX] 16 [PEG 570 ] 16 Production of BHALys [Lys] 8 [NH 2 using the same method as described in Example 31 .TFA] 16 is reacted with [α-tBu-MTX] [PEG 570 ] [NPN] 2 SuOH to produce BHALys [Lys] 8 [Su (NPN) 2 ] 16 [α-tBu-MTX] 16 [PEG 570 ] 16 (6 mg) (46%). Preparative HPLC (5-60% ACN, 90 minutes, RT66 minutes).
LCMS (LC: hydrophilic, TFA, RT = 9.0 min; MS: 2254 (1/10 [M + 10H + ], 24%), 2049 (1/11 [M + 11H + ], 56%) , 1879 (1/12 [M + 12H + ], 100%), 1734 (1/13 [M + 13H + ], 55%), converted value 22,531.91 (M (calculated value) C 1063 H 1745 N 207 O 319 = 22,529.73).
同じ方法でBHALys[3H-Lys]8[Su(NPN)2]16[α-tBu-MTX]16[PEG570]16を製造した。15mg(65%)。1.27mCi/g。
(実施例34)
BHALys [ 3 H-Lys] 8 [Su (NPN) 2 ] 16 [α-tBu-MTX] 16 [PEG 570 ] 16 was produced by the same method. 15 mg (65%). 1.27mCi / g.
(Example 34)
BHALys[Lys] 16 [Su(NPN) 2 ] 32 [α-tBu-MTX] 32 [PEG 570 ] 32
実施例31に記載したものと同様の手法を使ってBHALys[Lys]16[NH2.TFA]32を[α-tBu-MTX][PEG570][NPN]2SuOHと反応させることにより、BHALys[Lys]16[Su(NPN)2]32[α-tBu-MTX]32[PEG570]32(7mg)(44%)を得た。分取HPLC(5-60%ACN、90分、RT71分)。LCMS(LC:親水性(philic), TFA、RT=9.2分;MS:(M(計算値) C2119H3489N415O639=45,004.27)。
(実施例35)
BHALys [Lys] 16 [Su (NPN) 2 ] 32 [α-tBu-MTX] 32 [PEG 570 ] 32
By reacting BHALys [Lys] 16 [NH 2 .TFA] 32 with [α-tBu-MTX] [PEG 570 ] [NPN] 2 SuOH using a procedure similar to that described in Example 31, BHALys [Lys] 16 [Su (NPN) 2 ] 32 [α-tBu-MTX] 32 [PEG 570 ] 32 (7 mg) (44%) was obtained. Preparative HPLC (5-60% ACN, 90 minutes, RT71 minutes). LCMS (LC: hydrophilic, TFA, RT = 9.2 min; MS: (M (calculated) C 2119 H 3489 N 415 O 639 = 45,004.27).
(Example 35)
i.[BOC][PEG 1100 ][NPN] 2 SuOEtの製造
ii.[NH 2 .TFA][PEG 1100 ][NPN] 2 SuOEtの製造
iii.[α-tBu-MTX][PEG 1100 ][NPN] 2 SuOEt
iv.[α-tBu-MTX][PEG 1100 ][NPN] 2 SuOHの製造
v.BHALys[Lys] 8 [Su(NPN) 2 ] 16 [α-tBu-MTX] 16 [PEG 1100 ] 16 の製造
DMF(1.2mL)中の[α-tBu-MTX][PEG1100][NPN]2SuOH(NH2あたり1.1等量)とBHALys[Lys]8[NH2.TFA]16の混合物を0℃で撹拌したものに、PyBOP(NH2あたり1.2等量)およびDIPEA(NH2あたり3等量)を加えた。その混合物を0℃で30分間撹拌してから、室温で3時間撹拌した。DMFを除去し、残渣を分取HPLC(Waters Xterra MS C18、10μm、19×250mm)で精製することにより、BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[α-tBu-MTX]16[PEG1100]16を得た。
(実施例36)
v. BHALys [Lys] 8 preparation of [Su (NPN) 2] 16 [α-tBu-MTX] 16 [PEG 1100] 16
A mixture of [α-tBu-MTX] [PEG 1100 ] [NPN] 2 SuOH (1.1 equivalents per NH 2 ) and BHALys [Lys] 8 [NH 2 .TFA] 16 in DMF (1.2 mL) at 0 ° C. To the stirred one was added PyBOP (1.2 equivalents per NH 2 ) and DIPEA (3 equivalents per NH 2 ). The mixture was stirred at 0 ° C. for 30 minutes and then at room temperature for 3 hours. DMF was removed, and the residue was purified by preparative HPLC (Waters Xterra MS C 18 , 10 μm, 19 × 250 mm) to obtain BHALys [Lys] 8 [Su (NPN) 2 ] 16 [α-tBu-MTX] 16 [PEG 1100 ] 16 was obtained.
(Example 36)
HOGlyLys[Lys] 2 [Boc] 3 [ε,ε-CBz]の製造
この合成を図21に図解する。
i.MeOGlyLys[α-Boc][ε-CBz]の製造
トリエチルアミン(30.36g、0.300mol)とジメチルホルムアミド(200ml)の混合物に懸濁したメチルグリシネート塩酸塩(12.56g、0.110 mol)を撹拌したものに、PNPO-α-Boc-ε-CBz-Lys(50.15g、0.100mol)を加えた。周囲温度で16時間撹拌した後、揮発成分を減圧下で蒸発させ、残渣を酢酸エチル(200ml)と5%炭酸ナトリウム水溶液(175ml)とに分配した。水相を捨て、酢酸エチル相を、新たな5%炭酸ナトリウム水溶液(200ml×4)で洗浄し、次に0.25M塩酸(50ml×2)で洗浄してから、飽和塩化ナトリウム水溶液(50ml)で洗浄した。酢酸エチル溶液を乾燥(硫酸マグネシウム)し、濾過し、溶媒を減圧下で蒸発させることにより、MeOGlyLys[α-Boc][ε-CBz](44.39g、98%)を無色の油状物として得た。
1H nmr (300MHz, CD3OD) δ(ppm):1.3-1.8 (m, 6H);1.44 (s, 9H);3.13 (t, J 6.6Hz, 2H);3.70(s, 3H);3.88 (d, J 17.7Hz, 1H);3.99 (d, J 17.7Hz, 1H);4.04 (m, 1H);5.06 (s, 2H);7.2-7.4 (m, 5H)。
LC/MS(疎水性/ホルメート):ESI(+ve)実測値 [M+H]+ m/z=452.0;計算値(C22H34N3O7として)452.2。Rf(分)=5.2。
Production of HOGlyLys [Lys] 2 [Boc] 3 [ε, ε-CBz] This synthesis is illustrated in FIG.
i. Preparation of MeOGlyLys [α-Boc] [ε-CBz] Methyl glycinate hydrochloride (12.56 g, 0.110 mol) suspended in a mixture of triethylamine (30.36 g, 0.300 mol) and dimethylformamide (200 ml) was stirred. PNPO-α-Boc-ε-CBz-Lys (50.15 g, 0.100 mol) was added. After stirring at ambient temperature for 16 hours, the volatile components were evaporated under reduced pressure and the residue was partitioned between ethyl acetate (200 ml) and 5% aqueous sodium carbonate (175 ml). The aqueous phase is discarded and the ethyl acetate phase is washed with a fresh 5% aqueous sodium carbonate solution (200 ml × 4), then with 0.25 M hydrochloric acid (50 ml × 2) and then with a saturated aqueous sodium chloride solution (50 ml). Washed. The ethyl acetate solution was dried (magnesium sulfate), filtered, and the solvent was evaporated under reduced pressure to give MeOGlyLys [α-Boc] [ε-CBz] (44.39 g, 98%) as a colorless oil. .
1 H nmr (300 MHz, CD 3 OD) δ (ppm): 1.3-1.8 (m, 6H); 1.44 (s, 9H); 3.13 (t, J 6.6 Hz, 2H); 3.70 (s, 3H); 3.88 (d, J 17.7Hz, 1H); 3.99 (d, J 17.7Hz, 1H); 4.04 (m, 1H); 5.06 (s, 2H); 7.2-7.4 (m, 5H).
LC / MS (hydrophobicity / formate): ESI (+ ve) Found [M + H] + m / z = 452.0; ( as C 22 H 34 N 3 O 7 ) Calculated 452.2. Rf (minutes) = 5.2.
ii.MeOGlyLys[α-NH 2 .TFA][ε-CBz]の製造
MeOGlyLys[α-Boc][ε-CBz](43.36g、96.0mmol)を酢酸(150ml)に溶解し、その溶液を氷浴温度で、酢酸が凍結しはじめるまで撹拌した。氷浴を除去し、酢酸の結晶が溶解するまで、トリフルオロ酢酸を撹拌しながらゆっくり加えた。その溶液をもう一度氷浴に入れ、トリフルオロ酢酸の残り(計150ml)をゆっくり加えた。酢酸の凍結が再び起こることはなかった。氷浴を取り除き、溶液を周囲温度で5時間撹拌した後、揮発成分を減圧下で可能な限り完全に蒸発させた。残った粘性油状物をメタノール(200ml)に溶解し、再び減圧下でロータリーエバポレーターにかけて、油状物を得た。この工程を、さらに5回、各200mlのメタノールを使って繰り返した後、0.1トルの減圧下で、残存メタノールを可能な限り除去した。生成物MeOGlyLys[α-NH2.TFA][ε-CBz]を淡黄色油状物として得た(46.04g、多少のメタノールがまだ存在するため理論値の103%)。
1H nmr (300MHz, CD3OD) δ(ppm):1.5-1.6 (m, 4H);1.8-2.0(m, 2H);1.44 (s, 9H);3.15 (t, J 6.8Hz, 2H);3.71 (s, 3H);3.88 (t, J 6.4Hz, 1H);3.94 (d, J 17.6Hz, 1H);4.08 (d, J 17.6Hz, 1H);5.07 (s, 2H);7.2-7.4 (m, 5H)。
LC/MS(親水性/ホルメート):ESI(+ve)実測値 [M+H]+ m/z=352.1 ;計算値(C17H26N3O5として)352.2。Rf(分)=12.3。
ii. Production of MeOGlyLys [α-NH 2 .TFA] [ε-CBz]
MeOGlyLys [α-Boc] [ε-CBz] (43.36 g, 96.0 mmol) was dissolved in acetic acid (150 ml) and the solution was stirred at ice bath temperature until the acetic acid began to freeze. The ice bath was removed and trifluoroacetic acid was added slowly with stirring until the acetic acid crystals dissolved. The solution was once again placed in an ice bath and the remainder of the trifluoroacetic acid (total 150 ml) was added slowly. Freezing of acetic acid never occurred again. After removing the ice bath and stirring the solution at ambient temperature for 5 hours, the volatile components were evaporated as completely as possible under reduced pressure. The remaining viscous oil was dissolved in methanol (200 ml) and again subjected to a rotary evaporator under reduced pressure to give an oil. This process was repeated five more times with 200 ml of methanol each, and then residual methanol was removed as much as possible under a reduced pressure of 0.1 torr. The product MeOGlyLys [α-NH 2 .TFA] [ε-CBz] was obtained as a pale yellow oil (46.04 g, 103% of theory because some methanol was still present).
1 H nmr (300 MHz, CD 3 OD) δ (ppm): 1.5-1.6 (m, 4H); 1.8-2.0 (m, 2H); 1.44 (s, 9H); 3.15 (t, J 6.8Hz, 2H) 3.71 (s, 3H); 3.88 (t, J 6.4Hz, 1H); 3.94 (d, J 17.6Hz, 1H); 4.08 (d, J 17.6Hz, 1H); 5.07 (s, 2H); 7.2- 7.4 (m, 5H).
LC / MS (hydrophilic / formate): ESI (+ ve) Found [M + H] + m / z = 352.1; ( as C 17 H 26 N 3 O 5 ) Calculated 352.2. Rf (minutes) = 12.3.
iii.MeOGlyLys[ε-CBz][α-Lys][Boc] 2 の製造
MeOGlyLys[α-NH2.TFA][ε-CBz](46.0g、96.0mmol)およびトリエチルアミン(24.3g、0.240mol)のジメチルホルムアミド(200ml)溶液を撹拌したものに、DBL-OPNP(49.37g、0.106mol)を加えた。周囲温度で17時間撹拌した後、グリシン(3.98g、53.0mmol)の水(50ml)溶液を加え、その濁った溶液を24時間撹拌した。よく撹拌した混合物に水(150ml)を加えたところ、白色の固形物が沈殿しはじめた。次に薄片状の氷(200g)を加え、氷が溶けてしまうまで、撹拌を続けた。固形物を濾過によって集め、5%炭酸ナトリウム水溶液に懸濁し、0.5時間超音波処理した。吸引によって半乾燥した後、5%炭酸ナトリウム水溶液(200ml×2)で洗浄し、次に水(200ml×3)で洗浄した。次に、その明黄色固形物を、新たな200mlの5%炭酸ナトリウム水溶液中で撹拌し、濾過することにより、淡黄色粉末を得た。その固体を水(200ml×2)で洗浄した後、新たな水(200ml)に懸濁し、1.5時間超音波処理した。濾過および吸引乾燥後に、減圧下で乾燥することにより、61.0gの黄褐色粉末を得た。酢酸エチルからの再結晶により、MeOGlyLys[ε-CBz][α-Lys][Boc]2(50.05g、77%)を白色固体として得た。
1H nmr(300MHz, CD3OD)δ(ppm):1.2-2.0(m, 30H);3.03 (t, J 6.6Hz, 2H);3.12 (t, J 6.8Hz, 2H);3.69 (s, 3H);3.87 (d, J 17.6Hz, 1H);4.00(d, J 17.6Hz, 1H);4.01 (dd, J 3.3, 7.4Hz, 1H);4.38 (dd, J 5.4, 8.4Hz, 1H);5.06 (s, 2H);7.2-7.4 (m, 5H)。
LC/MS(親水性/ホルメート):ESI(+ve)実測値 [M+H]+ m/z=680.0;計算値(C33H54N5O10として)680.4;実測値 [M+NH4]+ m/z=697.0;計算値(C33H57N6O10として)697.4。Rf(分)=8.0。
iii. MeOGlyLys [ε-CBz] [α -Lys] [Boc] 2 manufacturing
To a stirred solution of MeOGlyLys [α-NH 2 .TFA] [ε-CBz] (46.0 g, 96.0 mmol) and triethylamine (24.3 g, 0.240 mol) in dimethylformamide (200 ml), DBL-OPNP (49.37 g, 0.106 mol) was added. After stirring for 17 hours at ambient temperature, a solution of glycine (3.98 g, 53.0 mmol) in water (50 ml) was added and the cloudy solution was stirred for 24 hours. Water (150 ml) was added to the well stirred mixture and a white solid began to precipitate. Next, flaky ice (200 g) was added and stirring was continued until the ice melted. The solid was collected by filtration, suspended in 5% aqueous sodium carbonate and sonicated for 0.5 hours. After semi-drying by suction, it was washed with 5% aqueous sodium carbonate solution (200 ml × 2) and then with water (200 ml × 3). The light yellow solid was then stirred in a new 200
1 H nmr (300 MHz, CD 3 OD) δ (ppm): 1.2-2.0 (m, 30H); 3.03 (t, J 6.6 Hz, 2H); 3.12 (t, J 6.8 Hz, 2H); 3.69 (s, 3H); 3.87 (d, J 17.6Hz, 1H); 4.00 (d, J 17.6Hz, 1H); 4.01 (dd, J 3.3, 7.4Hz, 1H); 4.38 (dd, J 5.4, 8.4Hz, 1H) 5.06 (s, 2H); 7.2-7.4 (m, 5H).
LC / MS (hydrophilic / formate): ESI (+ ve) measured value [M + H] + m / z = 680.0; calculated value (as C 33 H 54 N 5 O 10 ) 680.4; measured value [M + NH 4 ] + m / z = 697.0; calculated (as C 33 H 57 N 6 O 10 ) 697.4. Rf (minutes) = 8.0.
iv.MeOGlyLys[ε-NH 2 .TFA][α-Lys][Boc] 2 の製造
MeOGlyLys[ε-CBz][α-Lys][Boc]2(680mg、1.00mmol)およびトリフルオロ酢酸(77μl、1.0mmol)のメタノール(10ml)溶液を、大気圧の水素下で、10%w/wパラジウム炭(106mg、0.10 mmol Pd)の懸濁液に加えた。その混合物を周囲温度で1時間撹拌した後、セライトのベッドを通して濾過した。メタノールを減圧下で蒸発させ、残渣をメタノール(5ml)に再溶解し、その溶液を0.2μmフィルターに通した。メタノールを減圧下で蒸発させることにより、MeOGlyLys[ε-NH2.TFA][α-Lys][Boc]2(640mg、97%)を脆い白色泡状物として得た。
1H nmr (300MHz, CD3OD) δ(ppm):1.2-2.0(m, 30H);2.93 (t, J 7.5Hz, 2H);3.03 (t, J 6.6Hz, 2H);3.72 (s, 3H);3.89 (d, J 17.7Hz, 1H);3.98 (dd, J 5.4, 9.0Hz, 1H);4.02 (d, J 17.7Hz, 1H);4.42 (dd, J 5.7, 8.4Hz, 1H)。
LC/MS(親水性/ホルメート):ESI(+ve)実測値 [M+H]+ m/z=546.2;計算値(C25H48N5O8として)546.3。Rf(分)=14.2。
iv. MeOGlyLys [ε-NH 2 .TFA] [α-Lys] [Boc] 2 manufacturing
A solution of MeOGlyLys [ε-CBz] [α-Lys] [Boc] 2 (680 mg, 1.00 mmol) and trifluoroacetic acid (77 μl, 1.0 mmol) in methanol (10 ml) under hydrogen at atmospheric pressure, 10% w / w Added to a suspension of palladium on charcoal (106 mg, 0.10 mmol Pd). The mixture was stirred at ambient temperature for 1 hour and then filtered through a bed of celite. Methanol was evaporated under reduced pressure, the residue redissolved in methanol (5 ml) and the solution passed through a 0.2 μm filter. Methanol was evaporated under reduced pressure to give MeOGlyLys [ε-NH 2 .TFA] [α-Lys] [Boc] 2 (640 mg, 97%) as a brittle white foam.
1 H nmr (300 MHz, CD 3 OD) δ (ppm): 1.2-2.0 (m, 30H); 2.93 (t, J 7.5Hz, 2H); 3.03 (t, J 6.6Hz, 2H); 3.72 (s, 3H); 3.89 (d, J 17.7Hz, 1H); 3.98 (dd, J 5.4, 9.0Hz, 1H); 4.02 (d, J 17.7Hz, 1H); 4.42 (dd, J 5.7, 8.4Hz, 1H) .
LC / MS (hydrophilic / formate): ESI (+ ve) Found [M + H] + m / z = 546.2; ( as C 25 H 48 N 5 O 8 ) Calculated 546.3. Rf (minutes) = 14.2.
v.MeOGlyLys[Lys]2[Boc]3[ε,ε-CBz]の製造
MeOGlyLys[ε-NH2.TFA][α-Lys][Boc]2(640mg、0.97mmol)のジメチルホルムアミド(10ml)溶液を撹拌したものに、PNPO-α-Boc-ε-CBz-Lys(535mg、1.07mmol)を加えた。トリエチルアミン(340μl、2.43mmol)を加え、その溶液を周囲温度で20時間撹拌した。グリシン(40mg、0.54mmol)の水(5ml)溶液を加え、その濁った溶液を2時間撹拌した。ジメチルホルムアミドを減圧下で蒸発させ、残った油状物を、酢酸エチル(20ml)と、5%炭酸ナトリウム水溶液および飽和塩化ナトリウム水溶液の3:1混合物(20ml)とに分配した。水相を捨て、酢酸エチル相を、新たな上記炭酸ナトリウム/塩化ナトリウム混合物(20ml×3)で洗浄した後、0.20M 塩酸(20ml×2)で洗浄し、次に飽和塩化ナトリウム水溶液(20ml)で洗浄した。その酢酸エチル溶液を乾燥(硫酸ナトリウム)し、濾過し、溶媒を減圧下で蒸発させることにより、MeOGlyLys[Lys]2[Boc]3[ε,ε-CBz](818mg、93%)を脆い白色泡状物として得た。
1H nmr (300MHz, CD3OD) δ(ppm):1.2-2.0(m, 45H);3.03 (t, J 6.6Hz, 2H);3.12 (t, J 6.6Hz, 2H);3.19 (m, 2H);3.71 (s, 3H);3.88 (d, J 17.4Hz, 1H);3.93-4.06 (m, 2H);4.00(d, J 17.7Hz, 1H);4.38 (dd, J 5.4, 8.4Hz, 1H) ;5.07 (s, 2H);7.25-7.45 (m, 5H)。
LC/MS(疎水性/ホルメート):ESI(+ve)実測値 [M+H]+ m/z=908.4;計算値(C44H74N7O13として)908.5;実測値 [M+NH4]+ m/z=925.4;計算値(C44H77N8O13として)925.5。Rf(分)=9.5。
v. Production of MeOGlyLys [Lys] 2 [Boc] 3 [ε, ε-CBz]
To a stirred solution of MeOGlyLys [ε-NH 2 .TFA] [α-Lys] [Boc] 2 (640 mg, 0.97 mmol) in dimethylformamide (10 ml), add PNPO-α-Boc-ε-CBz-Lys (535 mg 1.07 mmol). Triethylamine (340 μl, 2.43 mmol) was added and the solution was stirred at ambient temperature for 20 hours. A solution of glycine (40 mg, 0.54 mmol) in water (5 ml) was added and the cloudy solution was stirred for 2 hours. Dimethylformamide was evaporated under reduced pressure and the remaining oil was partitioned between ethyl acetate (20 ml) and a 3: 1 mixture of 5% aqueous sodium carbonate and saturated aqueous sodium chloride (20 ml). The aqueous phase is discarded, and the ethyl acetate phase is washed with a fresh sodium carbonate / sodium chloride mixture (20 ml × 3), then with 0.20 M hydrochloric acid (20 ml × 2) and then with a saturated aqueous sodium chloride solution (20 ml). Washed with. The ethyl acetate solution was dried (sodium sulfate), filtered and the solvent was evaporated under reduced pressure to give MeOGlyLys [Lys] 2 [Boc] 3 [ε, ε-CBz] (818 mg, 93%) brittle white Obtained as a foam.
1 H nmr (300 MHz, CD 3 OD) δ (ppm): 1.2-2.0 (m, 45H); 3.03 (t, J 6.6 Hz, 2H); 3.12 (t, J 6.6 Hz, 2H); 3.19 (m, 3.71 (s, 3H); 3.88 (d, J 17.4Hz, 1H); 3.93-4.06 (m, 2H); 4.00 (d, J 17.7Hz, 1H); 4.38 (dd, J 5.4, 8.4Hz , 1H); 5.07 (s, 2H); 7.25-7.45 (m, 5H).
LC / MS (hydrophobic / formate): ESI (+ ve) measured [M + H] + m / z = 908.4; calculated (as C 44 H 74 N 7 O 13 ) 908.5; measured [M + NH 4] + m / z = 925.4 ; ( as C 44 H 77 N 8 O 13 ) calculated 925.5. Rf (min) = 9.5.
vi.HOGlyLys[Lys] 2 [Boc] 3 [ε,ε-CBz]の製造
MeOGlyLys[Lys]2[Boc]3[ε,ε-CBz](500mg、0.55mmol)を水酸化ナトリウム(44mg、1.10mmol)のメタノール(8ml)および水(4ml)溶液に溶解した。その溶液を周囲温度で4時間撹拌し、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣を水(10ml)に溶解し、1M硫酸水素カリウム(2ml)を加えた。得られた白色沈殿物を酢酸エチル(10ml)に抽出し、水相を捨てた。酢酸エチル相を飽和塩化ナトリウム水溶液(10ml)で洗浄し、乾燥(硫酸ナトリウム)し、濾過し、溶媒を減圧下で蒸発させることにより、HOGlyLys[Lys]2[Boc]3[ε,ε-CBz](481mg、96%)を無定形白色固体として得た。
1H nmr (300MHz, CD3OD) δ(ppm):1.2-2.0(m, 45H);3.03 (t, J 6.6Hz, 2H);3.12 (t, J 6.6Hz, 2H);3.19 (m, 2H);3.84 (d, J 18.0Hz, 1H);3.95-4.07 (m, 2H);3.97 (d, J 17.7Hz, 1H);4.39 (dd, J 5.4, 8.4Hz, 1H);5.07 (s, 2H);7.25-7.38 (m, 5H)。
LC/MS(疎水性/TFA):ESI(+ve)実測値 [M+H]+ m/z=894.3;計算値(C43H72N7O13として)894.5。Rf(分)=8.4。
(実施例37)
vi. Production of HOGlyLys [Lys] 2 [Boc] 3 [ε, ε-CBz]
MeOGlyLys [Lys] 2 [Boc] 3 [ε, ε-CBz] (500 mg, 0.55 mmol) was dissolved in a solution of sodium hydroxide (44 mg, 1.10 mmol) in methanol (8 ml) and water (4 ml). The solution was stirred at ambient temperature for 4 hours and the solvent was evaporated under reduced pressure. The residue was dissolved in water (10 ml) and 1M potassium hydrogen sulfate (2 ml) was added. The resulting white precipitate was extracted into ethyl acetate (10 ml) and the aqueous phase was discarded. The ethyl acetate phase was washed with saturated aqueous sodium chloride solution (10 ml), dried (sodium sulfate), filtered, and the solvent was evaporated under reduced pressure to produce HOGlyLys [Lys] 2 [Boc] 3 [ε, ε-CBz ] (481 mg, 96%) was obtained as an amorphous white solid.
1 H nmr (300 MHz, CD 3 OD) δ (ppm): 1.2-2.0 (m, 45H); 3.03 (t, J 6.6 Hz, 2H); 3.12 (t, J 6.6 Hz, 2H); 3.19 (m, 2H); 3.84 (d, J 18.0Hz, 1H); 3.95-4.07 (m, 2H); 3.97 (d, J 17.7Hz, 1H); 4.39 (dd, J 5.4, 8.4Hz, 1H); 5.07 (s , 2H); 7.25-7.38 (m, 5H).
LC / MS (hydrophobicity / TFA): ESI (+ ve ) Found [M + H] + m / z = 894.3; ( as C 43 H 72 N 7 O 13 ) Calculated 894.5. Rf (min) = 8.4.
(Example 37)
BHALys[GlyLys] 2 [Lys] 4 [Boc] 6 [ε,ε-CBz] 2 (C 105 H 163 N 17 O 25 MW2063.5)の製造
図22に合成を図解する。HOGlyLys[Lys]2[Boc]3[ε,ε-CBz](536mg、0.60mmol)、BHALys[NH2.TFA]2(135mg、0.250mmol)、4,4-ジメチルアミノピリジン(7.3mg、60μmol)およびトリエチルアミン(210μl、1.50mmol)のジメチルホルムアミド(10ml)溶液に、EDCI(0.90mmol)を加えた。その溶液を周囲温度で15時間撹拌し、次に揮発成分を減圧下で除去した。シリカゲルクロマトグラフィー(メタノール/ジクロロメタン勾配)により、BHALys[GlyLys]2[Lys]4[Boc]6[ε,ε-CBz]2(245mg、47%)を得た。少量の試料(20mg)を常法により酢酸/TFAで処理して、分析データを得た。
LC/MS(親水性(philic)/TFA):ESI(+ve)実測値 [M+H]+ m/z=1463.2;計算値(C75H116N17O13として)1462.9。
(実施例38)
Preparation of BHALys [GlyLys] 2 [Lys] 4 [Boc] 6 [ε, ε-CBz] 2 (C 105 H 163 N 17 O 25 MW2063.5) The synthesis is illustrated in FIG. HOGlyLys [Lys] 2 [Boc] 3 [ε, ε-CBz] (536 mg, 0.60 mmol), BHALys [NH 2 .TFA] 2 (135 mg, 0.250 mmol), 4,4-dimethylaminopyridine (7.3 mg, 60 μmol) ) And triethylamine (210 μl, 1.50 mmol) in dimethylformamide (10 ml) was added EDCI (0.90 mmol). The solution was stirred at ambient temperature for 15 hours and then the volatile components were removed under reduced pressure. Silica gel chromatography (methanol / dichloromethane gradient) gave BHALys [GlyLys] 2 [Lys] 4 [Boc] 6 [ε, ε-CBz] 2 (245 mg, 47%). A small sample (20 mg) was treated with acetic acid / TFA in a conventional manner to obtain analytical data.
LC / MS (philic / TFA): ESI (+ ve) found [M + H] + m / z = 1463.2; calculated (as C 75 H 116 N 17 O 13 ) 1462.9.
(Example 38)
BHALys[Lys] 16 [α-PEG 570 ] 16 [COCH 3 ] 16 の製造
BHALys[Lys]16[α-PEG570]16[NH2.TFA]16のDMF溶液およびTEA(NH2あたり3等量)を撹拌したものに、無水酢酸(NH2あたり1.5等量)を加え、反応を終夜撹拌した。反応を濃縮し、残渣を、水を溶離液とするSephadex G-25でのサイズ排除クロマトグラフィーで精製することにより、BHALys[Lys]16[α-PEG570]16[COCH3]16を得た。
(実施例39)
BHALys [Lys] 16 [α- PEG 570] 16 [COCH 3] 16 production of
The BHALys [Lys] 16 [α- PEG 570] 16 [
(Example 39)
デンドリマーのリンパターゲティング
ラットの胸管(M Boydら (2003) Journal of Pharmacology and Toxicology Methods 49:115-120に記載の手法を使用)および右頚静脈(食塩水注入用)にカニューレを挿入した。ラットを一晩回復させ、食物と水を常時供給した。動物に5mg/kg用量(10mg/ml、体重100gにつき50μl)のデンドリマー(Lys16(PEG200)32、Lys16(PEG570)32、Lys16(PEG2000)32またはLys16(BS)32)を、右踵上への注射によって、皮下投与した。Lys16(BS)32を非PEG化対照デンドリマーとした。胸管へのリンパ排液を30〜48時間にわたって収集し、トリチウム放射標識についてシンチレーション計数を行った。
Dendrimer lymphatic targeting rats were cannulated into the thoracic duct (using the method described in M Boyd et al. (2003) Journal of Pharmacology and Toxicology Methods 49: 115-120) and the right jugular vein (for saline infusion). Rats were allowed to recover overnight and were constantly fed food and water. Dendrimers (Lys 16 (PEG 200 ) 32 , Lys 16 (PEG 570 ) 32 , Lys 16 (PEG 2000 ) 32 or Lys 16 (BS) 32 ) in 5 mg / kg dose (10 mg / ml, 50 μl per 100 g body weight) Was administered subcutaneously by injection onto the starboard. Lys 16 (BS) 32 was the non-PEGylated control dendrimer. Lymph drainage into the thoracic duct was collected over 30-48 hours and scintillation counting was performed for tritium radiolabel.
この研究の結果は、PEG化ポリ-L-リジンデンドリマーの皮下用量の40%までが、注射投与から48時間以内に、リンパに取り込まれうることを証明した(図23)。これは、デンドリマーのサイズに依存し、48時間で38.5±0.7%(平均±SD、n=3)のLys16(PEG2000)32(68kDa)がリンパに取り込まれ、30時間で28.8±6.6%のLys16(PEG570)32(22kDa)がリンパ中に回収されたのに対して、Lys16(PEG200)32(11kDa)は3.8%(n=1)しか胸部リンパに回収されなかった。非PEG化ベンゼンスルホネートデンドリマー(11kDa)は30時間で1.7±1.5%しかリンパに取り込まれなかったので(平均±SD、n=3)、PEG化はリンパへのデンドリマーの取り込みを増加させるのに役だった。屠殺時に、右膝窩リンパ節および腸骨リンパ節には、合計して、Lys16(PEG570)32およびLys16(PEG2000)32デンドリマーの用量の約0.3%が回収された。これは、2〜3%用量/gがリンパ節中に回収されたことを表し、IV投与の30〜168時間後に主要臓器に典型的に回収される放射標識の濃度(1.5%用量/g組織まで)よりもかなり高い。 The results of this study demonstrated that up to 40% of the subcutaneous dose of PEGylated poly-L-lysine dendrimer can be taken up into the lymph within 48 hours of injection administration (Figure 23). This depends on the size of the dendrimer, 38.5 ± 0.7% (mean ± SD, n = 3) of Lys 16 (PEG 2000 ) 32 (68 kDa) is taken up by the lymph in 48 hours and 28.8 ± 6.6% in 30 hours While Lys 16 (PEG 570 ) 32 (22 kDa) was recovered in the lymph, only 3.8% (n = 1) of Lys 16 (PEG 200 ) 32 (11 kDa) was recovered in the thoracic lymph. Non-PEGylated benzenesulfonate dendrimer (11 kDa) was only 1.7 ± 1.5% uptake into the lymph in 30 hours (mean ± SD, n = 3), so PEGylation helped to increase the uptake of dendrimer into the lymph It was. At the time of sacrifice, a total of approximately 0.3% of the dose of Lys 16 (PEG 570 ) 32 and Lys 16 (PEG 2000 ) 32 dendrimer was recovered in the right popliteal and iliac lymph nodes. This represents that 2-3% dose / g was recovered in the lymph nodes and the concentration of radiolabel typically recovered in major organs 30-168 hours after IV administration (1.5% dose / g tissue Considerably higher than).
要約すると、大きい(>20kDa)PEG化デンドリマーは皮下投与後にかなりの量が領域リンパ管に取り込まれたのに対して、小さい(11kDa)PEG化または非PEG化デンドリマーの場合、リンパに回収された量は、はるかに少なかった。非PEG化物質の場合、これは、注射部位からの排液の減少も反映しているのだろう。皮下投与の30〜48時間後に領域リンパ節内に回収されたのは、投与量のうち、わずかな割合だったが、リンパ節の質量が小さいこと(約0.1〜0.2g)を考えると、これは、リンパ節内のデンドリマー濃度が比較的高いことを表す。より大きいPEG基によるPLLデンドリマーのPEG化は、リンパ回収率をさらに増加させうる。これらの結果は、皮下投与に続いて起こるリンパへの薬物-デンドリマー複合体の取り込みを増加させるというPEG化の潜在能力を強調している。
(実施例40)
In summary, large (> 20 kDa) PEGylated dendrimers were taken up by lymphatics in the case of small (11 kDa) PEGylated or non-PEGylated dendrimers, whereas significant amounts were taken up into regional lymph vessels after subcutaneous administration. The amount was much less. In the case of non-PEGylated substances, this may also reflect a decrease in drainage from the injection site. Only a small percentage of the dose was collected in the
(Example 40)
50%PEG 570 キャップトポリ-L-リジンデンドリマーの薬物動態
以下の研究は、1)部分表面PEG化および2)PEGと薬物/アセチル基の組み合わせによるデンドリマー表面の完全キャッピングが、ラットへの5mg/kg IV投与後のデンドリマー薬物動態にどのように影響するかを決定するために行った。
Pharmacokinetics of 50% PEG 570 capped poly-L-lysine dendrimer The following studies show that 1) partial surface PEGylation and 2) complete capping of the dendrimer surface with a combination of PEG and drug / acetyl groups is This was done to determine how it affects dendrimer pharmacokinetics after kg IV administration.
この研究では以下のトリチウム化(G3)デンドリマーを使用した:
Lys16(NH2)32(MW 4.1kDa)、BHALys[3H-Lys]16[NH2]32、文中ではアンキャップトデンドリマーともいう;
Lys16(PEG570)32(MW 23kDa)、BHALys[3H-Lys]16[PEG570]32、文中では完全PEG化デンドリマーともいう;
Lys16(PEG570)16(NH2)16(MW 13.3kDa)、BHALys[3H-Lys]16[α-PEG570]16[ε-NH2]16、文中では半PEG化デンドリマーともいう;
Lys16(PEG570)16(CH3)16(MW 14kDa)、BHALys[3H-Lys]16[α-PEG570]16[ε-COCH3]16、文中では半アセチル化デンドリマーともいう;
Lys16(PEG570)16(MTXアミド)16 *(MW 22.5kDa)、BHALys[3H-Lys]8[Su(NPN)2]16[PEG570]16[α-tBu-MTX]16、文中ではMTXデンドリマーともいい、この場合、MTXはメトトレキサートである。
*メトトレキサートは非PEG化部位に安定なアミドリンカーを介してコンジュゲートした。
The following tritiated (G3) dendrimers were used in this study:
Lys 16 (NH 2 ) 32 (MW 4.1 kDa), BHALys [ 3 H-Lys] 16 [NH 2 ] 32 , also referred to as uncapped dendrimer in the text;
Lys 16 (PEG 570 ) 32 (MW 23 kDa), BHALys [ 3 H-Lys] 16 [PEG 570 ] 32 , also referred to herein as a fully PEGylated dendrimer;
Lys 16 (PEG 570 ) 16 (NH 2 ) 16 (MW 13.3 kDa), BHALys [ 3 H-Lys] 16 [α-PEG 570 ] 16 [ε-NH 2 ] 16 , also referred to herein as a semi-PEGylated dendrimer;
Lys 16 (PEG 570 ) 16 (CH 3 ) 16 (MW 14 kDa), BHALys [ 3 H-Lys] 16 [α-PEG 570 ] 16 [ε-COCH 3 ] 16 , also referred to herein as a semi-acetylated dendrimer;
Lys 16 (PEG 570 ) 16 (MTX amide) 16 * (MW 22.5 kDa), BHALys [ 3 H-Lys] 8 [Su (NPN) 2 ] 16 [PEG 570 ] 16 [α-tBu-MTX] 16 , in text Also referred to as MTX dendrimer, in which case MTX is methotrexate.
* Methotrexate was conjugated to the non-PEGylated site via a stable amide linker.
方法
SDラット(約300g)に、5mg/kg用量のトリチウム化デンドリマー(食塩水1ml中)を、
右頚静脈中の留置カニューレを通して、2分間の直接静脈内注入によって投与した。その後、Cp0(静脈内注入終了時点の血漿におけるデンドリマーの濃度)を評価するために、t0血液試料を右頚動脈の留置カニューレから収集した(0.2ml)。その後、5、10、20、30、45、60、90、120、180、240、360、480、1440および1800分時点に、血液試料をヘパリン処理チューブ中に収集した。血液試料を遠心分離した後、6mlシンチレーション管中で血漿100μlを1〜2mlのStarscintと混合し、トリチウム放射能について計数した。尿をデンドリマーの投与後0〜8時間、8〜24時間および24〜30時間の時間間隔で収集した。尿の一部(各100μl)を、同様に、トリチウム放射能について計数した。50mM PBS+0.3M NaCl(pH3.5)を溶離液とするSuperdex 75 SECカラムでのサイズ排除クロマトグラフィーによって、尿および血漿試料を分析した。カラムから溶出する画分を1分(0.5ml)間隔で収集し、6mlシンチレーション管中で2mlのStarscintと混合し、トリチウム放射能についてシンチレーション計数を行った。
Method
SD rat (about 300g) with 5mg / kg dose of tritiated dendrimer (in 1ml saline)
Administration was by direct intravenous infusion for 2 minutes through an indwelling cannula in the right jugular vein. A t0 blood sample was then collected from the indwelling cannula of the right carotid artery (0.2 ml) to assess Cp0 (the concentration of dendrimer in plasma at the end of intravenous infusion). Thereafter, blood samples were collected in heparinized tubes at 5, 10, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240, 360, 480, 1440 and 1800 minutes. After centrifugation of the blood sample, 100 μl of plasma was mixed with 1-2 ml of Starscint in a 6 ml scintillation tube and counted for tritium radioactivity. Urine was collected at time intervals of 0-8 hours, 8-24 hours, and 24-30 hours after dendrimer administration. A portion of urine (100 μl each) was similarly counted for tritium radioactivity. Urine and plasma samples were analyzed by size exclusion chromatography on a Superdex 75 SEC column eluting with 50 mM PBS + 0.3 M NaCl (pH 3.5). Fractions eluting from the column were collected at 1 minute (0.5 ml) intervals, mixed with 2 ml Starscint in a 6 ml scintillation tube and scintillation counted for tritium radioactivity.
以下のように、代用物としての肝ホモジネートへの結合を測定することにより、血管または組織表面に結合する潜在能力を各デンドリマーについて見積った。 The potential for binding to blood vessels or tissue surfaces was estimated for each dendrimer by measuring binding to liver homogenate as a surrogate as follows.
血管中の血液の大半を除去するために、麻酔ラットから得た肝臓を食塩水で灌流した。次に肝臓を単離し、1:1w/vの食塩水中、ガラスホモジナイザーですりつぶした。ラットは心臓穿刺によるLethabarbの致死的注射によって屠殺した。肝臓が目に見えてホモジナイズされたら、約1mlの肝ホモジネートを微量遠心管に入れ、3500rpmで5分間遠心分離した。上清を除去し、さらに500μlの食塩水を各チューブに加えた。各チューブを手短にボルテックスし、再び遠心分離した。この工程は、デンドリマーに結合して未結合デンドリマーとしてカウントされる可能性があるタンパク質の量を最小限に抑えるために、できる限り多くの可溶性タンパク質がホモジネートから除去されることを保証するものである。さらに500μlの食塩水を各チューブに加え、50μgのLys16(PEG570)16(CH3)16、Lys16(PEG570)16(NH2)16またはLys8(D-lys)16を各チューブに加えた。D-lysデンドリマーは結合実験の結果に影響を及ぼしうる迅速な代謝を受けないので、これをカチオン性アンキャップトデンドリマー対照として使用した。各チューブをロータリーミキサー上、37℃で30分間インキュベートした後、チューブを再び遠心分離した。上清を収集し、「未結合」デンドリマーについて解析した。残りの肝ホモジネートは、残りのデンドリマーが肝組織に結合したことを保証するために、他で説明するように可溶化した。 To remove most of the blood in the blood vessels, the liver from anesthetized rats was perfused with saline. The liver was then isolated and ground with a glass homogenizer in 1: 1 w / v saline. Rats were sacrificed by lethal injection of Lethabarb by cardiac puncture. When the liver was visibly homogenized, approximately 1 ml of liver homogenate was placed in a microfuge tube and centrifuged at 3500 rpm for 5 minutes. The supernatant was removed and an additional 500 μl of saline was added to each tube. Each tube was briefly vortexed and centrifuged again. This step ensures that as much soluble protein as possible is removed from the homogenate to minimize the amount of protein that can bind to the dendrimer and count as unbound dendrimer. . Add 500 μl of saline to each tube and add 50 μg of Lys 16 (PEG 570 ) 16 (CH 3 ) 16 , Lys 16 (PEG 570 ) 16 (NH 2 ) 16 or Lys 8 (D-lys) 16 to each tube. Added to. D-lys dendrimer was used as a cationic uncapped dendrimer control because it does not undergo rapid metabolism that can affect the results of binding experiments. Each tube was incubated on a rotary mixer at 37 ° C. for 30 minutes, after which the tube was centrifuged again. The supernatant was collected and analyzed for “unbound” dendrimers. The remaining liver homogenate was solubilized as described elsewhere to ensure that the remaining dendrimer bound to liver tissue.
結果:
Lys 16 (PEG 570 ) 16 (NH 2 ) 16
半PEGデンドリマーの投与後は、血漿中放射標識が、最初の1時間にわたって、8.6±0.3分の半減期で、迅速に減少した(図24B)。比較のために、完全アンキャップト(Lys16(NH2)32)デンドリマーの血漿プロファイルを図24Aに示す。完全アンキャップトデンドリマーと半PEG化デンドリマーの間の初期血漿/分布動態の相違の理由は、組織結合データから明らかだろう(表13)。すなわち、アンキャップトデンドリマーは、組織または脈管構造に迅速に結合し(代用物として肝ホモジネートを使って試験した)、その結果、血漿からはほとんど直ちに除去されると考えられる。対照的に、部分的にPEG化された物質でさえ、組織または血管結合活性は、はるかに低い。
Result :
Lys 16 (PEG 570 ) 16 (NH 2 ) 16
After administration of the half-PEG dendrimer, plasma radiolabel decreased rapidly with a half-life of 8.6 ± 0.3 minutes over the first hour (FIG. 24B). For comparison, the plasma profile of fully uncapped (Lys 16 (NH 2 ) 32 ) dendrimer is shown in FIG. 24A. The reason for the difference in initial plasma / distribution kinetics between fully uncapped and semi-PEGylated dendrimers will be apparent from tissue binding data (Table 13). That is, uncapped dendrimers are thought to bind rapidly to tissues or vasculature (tested using liver homogenate as a surrogate) and as a result are almost immediately removed from plasma. In contrast, even partially PEGylated material has much lower tissue or vascular binding activity.
1時間後、血漿中放射標識の減少は劇的に減速し、終末相半減期(6〜30時間にわたって算出)は22.1±2.1時間になった。サイズ排除クロマトグラフィー(図25A)は、投与後2時間までの血漿におけるトリチウム化リジンの存在を示唆し、さらに血漿中に存在する主要分子種がデンドリマーよりかなり大きいことも示している。したがって約1日という終末相半減期は、おそらく、遊離したトリチウム化リジンの再取り込みによって生成した血漿タンパク質のクリアランスを反映しているのだろう。 After 1 hour, the decrease in plasma radiolabel dramatically slowed down and the terminal half-life (calculated over 6-30 hours) was 22.1 ± 2.1 hours. Size exclusion chromatography (FIG. 25A) suggests the presence of tritiated lysine in plasma up to 2 hours after administration, and also shows that the major molecular species present in plasma are significantly larger than dendrimers. Thus, a terminal half-life of about 1 day probably reflects the clearance of plasma proteins produced by reuptake of free tritiated lysine.
完全アンキャップト分子種に関する血漿薬物動態およびSECプロファイルから、30分後には、リジンの絶え間ない「供給」を利用して、血漿タンパク質の合成を駆動できることが示唆される(すなわち投与後6〜30時間は、血漿中放射標識の明らかな減少は目につかない。長時間にわたる血漿プロファイルはここには掲載していない)。しかし、半PEG化デンドリマーから得られる血漿薬物動態およびSECプロファイルからは、類似する分解および再取り込み過程が起こったようではあるものの、それは、もっと短い期間で起こったらしいことが示唆される。というのも、再取り込み産物は、アルブミンの回転率(約24時間)を反映した半減期で排除されるからである。タンパク質生合成を駆動するためのトリチウム化リジンの供給がこのように比較的短期間であることは、30時間の試料採取期間にわたって観察された比較的たやすい腎クリアランスと合致しており、半PEG化デンドリマーに付随する投与されたトリチウムの73.5±2.8%が尿中に回収された。これは、注射された放射標識のLys16(NH2)32およびLys16(PEG570)32からの回収率(それぞれ約5%および40%)とは、極めて対照的である。尿中に同定された分子種は、SECでは、完全なデンドリマーと共溶出した(図25B)。 Plasma pharmacokinetics and SEC profiles for fully uncapped species suggest that after 30 minutes, a constant “feed” of lysine can be used to drive plasma protein synthesis (ie 6-30 post-dose). Time does not reveal a clear decrease in plasma radiolabel, plasma profiles over time are not listed here). However, plasma pharmacokinetics and SEC profiles obtained from semi-PEGylated dendrimers suggest that although a similar degradation and reuptake process appears to have occurred, it appears to have occurred in a shorter period of time. This is because reuptake products are eliminated with a half-life reflecting the turnover rate of albumin (approximately 24 hours). This relatively short period of supply of tritiated lysine to drive protein biosynthesis is consistent with the relatively easy renal clearance observed over the 30 hour sampling period, and half PEG 73.5 ± 2.8% of the administered tritium associated with dendrimer was recovered in the urine. This is in stark contrast to the recovery of injected radiolabels from Lys 16 (NH 2 ) 32 and Lys 16 (PEG 570 ) 32 (approximately 5% and 40%, respectively). Molecular species identified in urine co-eluted with complete dendrimers in SEC (Figure 25B).
Lys 16 (PEG 570 ) 16 (CH 3 ) 16
半アセチル化デンドリマーに由来する放射標識の初期血漿プロファイルは、半PEG化デンドリマーのものと類似していた(半減期=9.3±0.42分)(図24)。しかし、半PEG化デンドリマーとは異なり、半アセチル化デンドリマーの終末相半減期は、より短く、完全PEG化分子種の終末相半減期に、より近かった(半アセチル化デンドリマーの13.9±0.3時間に対して完全PEG化デンドリマーは9.45±0.42時間)。これはおそらく、半PEG化デンドリマーよりも、半アセチル化デンドリマーの方が、コア代謝の速度が遅いためだろう(図27A)。血漿SECプロファイルは、t0において、血漿中放射標識の全てが完全なデンドリマーに起因すると考えられることを示している。投与の2時間後に収集した血漿は、完全なデンドリマーに帰される小さなピークと、20分の幅広いピーク(このピークは完全なデンドリマーの2分前に溶出した)とを示したが、遊離のリジンは目につかなかった。半PEG化デンドリマーの場合、注射された放射標識の大半が、30時間尿中に排泄され(72.3±1.2%)、その大半は変化せずに排泄された。デンドリマー代謝の産物に起因すると考えられる数個の小分子量種が8〜24時間尿に同定された(図27B、8〜24時間については目盛りが異なることに注意)。
Lys 16 (PEG 570 ) 16 (CH 3 ) 16
The initial plasma profile of the radiolabel derived from the half-acetylated dendrimer was similar to that of the half-PEGylated dendrimer (half-life = 9.3 ± 0.42 min) (FIG. 24). However, unlike half-PEGylated dendrimers, the terminal half-life of the half-acetylated dendrimer was shorter and closer to the terminal half-life of the fully PEGylated molecular species (at 13.9 ± 0.3 hours for the half-acetylated dendrimer). In contrast, the complete PEGylated dendrimer is 9.45 ± 0.42 hours). This is probably due to the slower rate of core metabolism for half-acetylated dendrimers than for half-PEGylated dendrimers (FIG. 27A). The plasma SEC profile shows that at t0, all of the plasma radiolabel is believed to be due to the complete dendrimer. Plasma collected 2 hours after dosing showed a small peak attributed to the complete dendrimer and a
Lys 16 (PEG 570 ) 16 (MTXアミド) 16
MTXデンドリマーの分子量は完全PEG化デンドリマーと類似しているが、その血漿プロファイルは、むしろ半アセチル化デンドリマーのプロファイルの方に似ていた。初期血漿半減期は15.4±2.4分で、これは他方の半キャップトデンドリマーよりわずかに遅かった。終末相消失半減期は完全PEG化デンドリマーと基本的に同じ(9±0.2時間)であり、これはおそらく、終末相血漿クリアランスが総分子量に依存することを反映しているのだろう。
Lys 16 (PEG 570 ) 16 (MTX amide) 16
Although the molecular weight of the MTX dendrimer was similar to that of the fully PEGylated dendrimer, its plasma profile was more similar to that of the semi-acetylated dendrimer. The initial plasma half-life was 15.4 ± 2.4 minutes, which was slightly slower than the other half-capped dendrimer. The terminal elimination half-life is essentially the same as the fully PEGylated dendrimer (9 ± 0.2 hours), probably reflecting that terminal phase plasma clearance depends on the total molecular weight.
トリチウム化デンドリマーの投与量の3分の1未満が、30時間の間に、尿を介して排除された(29±3.4)。このうちの大半は、IV投与後、最初の8時間に排泄された。尿中に排泄されたMTXデンドリマーの量は、1)他方の半キャップトデンドリマーおよび2)完全PEG化デンドリマーよりはるかに少なかった(42.9+2.7%)。腎排除量がこのように少ないことを完全に説明することはできないが、1)デンドリマーの大きなサイズが腎排除をある程度妨害したこと、2)用量の残りが網内系(RES)の臓器に濃縮されたこと、および3)デンドリマーの一部が葉酸結合部位との相互作用によって臓器に保持されていたのかもしれないこと(MTXは葉酸受容体において葉酸の競合的アンタゴニストであるため)が考えられる。 Less than one third of the tritiated dendrimer dose was eliminated via urine during the 30 hour period (29 ± 3.4). Most of them were excreted in the first 8 hours after IV administration. The amount of MTX dendrimer excreted in urine was much lower (42.9 + 2.7%) than 1) the other half-capped dendrimer and 2) the fully PEGylated dendrimer. Although we cannot fully explain this small amount of renal exclusion, 1) the large size of the dendrimer hindered renal exclusion to some extent, 2) the remainder of the dose concentrated in the reticuloendothelial (RES) organs And 3) some of the dendrimers may have been retained in the organ by interaction with the folate binding site (because MTX is a competitive antagonist of folate at the folate receptor) .
結論:
1)PEG570による50%表面キャッピングを有する(が、表面部位の50%はアンキャップトのままである)リジンデンドリマーは、比較的迅速に血漿から排除され、分解を受けて遊離のリジンを放出するようである。しかしこれらは、完全アンキャップト分子種ほどの血管結合は示さないようである。
2)50%表面PEG化を有するデンドリマー上のアンキャップト部位をアセチル化すると、表面アミンの50%がアンキャップトのままであるデンドリマーと比較して、デンドリマーの生分解が減少するが、血漿からの初期クリアランス/分布速度は、基本的に同じである。
3)表面に50%PEGキャッピング基および50%MTXキャッピング基を有するリジンデンドリマーは、半アセチル化デンドリマーと類似する初期血漿プロファイルを示す。
4)表面に50%PEGキャッピング基および50%MTXキャッピング基を有するリジンデンドリマーは、類似するサイズの完全PEG化デンドリマー、または50%アセチル化系と比較して、IV投与後に尿中に回収される用量の割合が少ない。これはおそらく、MTXがRES中の食細胞または葉酸受容体と相互作用することによって起こるRESによる取り込み量の増加を反映しているのだろう。
Conclusion :
1) Lysine dendrimers with 50% surface capping by PEG 570 (but 50% of surface sites remain uncapped) are cleared from plasma relatively quickly and undergo free degradation to release free lysine It seems to do. However, they do not appear to exhibit as much vascular binding as the fully uncapped species.
2) Acetylation of uncapped sites on dendrimers with 50% surface PEGylation reduces dendrimer biodegradation compared to dendrimers where 50% of surface amines remain uncapped, but plasma The initial clearance / distribution speed from is basically the same.
3) Lysine dendrimers with 50% PEG capping groups and 50% MTX capping groups on the surface show an initial plasma profile similar to semi-acetylated dendrimers.
4) Lysine dendrimers with 50% PEG capping groups and 50% MTX capping groups on the surface are recovered in urine after IV administration compared to similar sized fully PEGylated dendrimers or 50% acetylated systems The dose ratio is small. This probably reflects the increased uptake by RES caused by the interaction of MTX with phagocytic cells or folate receptors in RES.
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本明細書に開示し定義した発明が、本文もしくは図面で言及した個々の特徴または本文もしくは図面から明白な個々の特徴の二つ以上の代替的組み合わせの全てに及ぶことは理解されるだろう。これらの異なる組み合わせはいずれも、本発明のさまざまな代替的態様を構成する。 It will be understood that the invention disclosed and defined herein extends to each of the individual features referred to in the text or drawings or two or more alternative combinations of individual features apparent from the text or drawings. Any of these different combinations constitute various alternative aspects of the invention.
Claims (49)
・医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、および
・医薬活性剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基,
を含む少なくとも二つの末端基を含む高分子(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)。 A polymer with controlled end group stoichiometry, comprising a surface layer, at least one sub-surface layer, and a first end group that is the residue of a pharmaceutically active agent, derivative or precursor thereof, and A second end group selected to modify the pharmacokinetics of the pharmaceutically active agent and / or macromolecule,
Macromolecules containing at least two end groups containing (wherein end group stoichiometry refers to the number and type of end groups).
・ペプチドもしくはタンパク質、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基(この第1末端基は高分子上の選択された単一の取付け点に取付けられる)、および
・ペプチドもしくはタンパク質および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基
を含む少なくとも二つの末端基を含む高分子(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)。 A macromolecule with controlled end group stoichiometry, comprising a surface layer, at least one subsurface layer, and a first end group (residue of a peptide or protein, derivative or precursor thereof) One terminal group is attached to a selected single attachment point on the polymer), and at least two containing a second terminal group selected to modify the pharmacokinetics of the peptide or protein and / or polymer Macromolecules containing one end group (in this case, end group stoichiometry refers to the number and type of end groups).
・医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、および
・医薬活性剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基
を含む少なくとも二つの末端基を含む高分子(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)。 A polymer comprising controlled end group stoichiometry and comprising at least one lysine or lysine analog dendritic motif having a surface layer and at least one sub-surface layer,
A first terminal group that is the residue of a pharmaceutically active agent, derivative or precursor thereof, and at least two comprising a second terminal group selected to modify the pharmacokinetics of the pharmaceutically active agent and / or macromolecule Macromolecules containing one end group (in this case, end group stoichiometry refers to the number and type of end groups).
コア[繰り返し単位]m[表面構築単位]n[キャッピング基1]p[キャッピング基2]q
[式中、
コアは、リジン、もしくはその誘導体、ジアミン化合物、トリアミン化合物またはテトラアミン化合物からなる群より選択され;
繰り返し単位は、アミドアミン、リジンまたはリジン類似体からなる群より選択され;
表面構築単位は、構築単位のものと同じであっても異なってもよく、アミドアミン、リジンまたはリジン類似体から選択され;
キャッピング基1は医薬活性剤、その誘導体、またはその前駆体の残基であり;
キャッピング基2は医薬活性剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択され;
mはデンドリマーの1または複数のサブ表面層の繰り返し単位の和を表し、1〜32の整数であり;
nはデンドリマーの1または複数の表面層の表面構築単位の数を表し、2〜32の整数であり;
pはキャッピング基1基の数を表し、1〜64の整数であり;
qはキャッピング基2基の数を表し、1〜64の整数である]
を持つ、リジンデンドリマーポリマー(この場合、キャッピング基化学量論とは、キャッピング基の数およびタイプを指す)。 With controlled capping group stoichiometry, the formula:
Core [repeating unit] m [surface building unit] n [capping group 1] p [capping group 2] q
[Where:
The core is selected from the group consisting of lysine, or derivatives thereof, diamine compounds, triamine compounds or tetraamine compounds;
The repeat unit is selected from the group consisting of amidoamine, lysine or lysine analogs;
The surface building unit may be the same as or different from that of the building unit and is selected from amidoamine, lysine or lysine analogues;
Capping group 1 is the residue of a pharmaceutically active agent, derivative thereof, or precursor thereof;
Capping group 2 is selected to modify the pharmacokinetics of the pharmaceutically active agent and / or macromolecule;
m represents the sum of repeating units of one or more subsurface layers of the dendrimer and is an integer from 1 to 32;
n represents the number of surface building units of one or more surface layers of the dendrimer and is an integer from 2 to 32;
p represents the number of one capping group and is an integer from 1 to 64;
q represents the number of two capping groups and is an integer from 1 to 64]
A lysine dendrimer polymer (where capping group stoichiometry refers to the number and type of capping groups).
・医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基の前駆体、および
・医薬活性剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基の前駆体
を供給するステップ、
(ii)第1保護基を除去することによって外側層上の官能基を脱保護するステップ、
(iii)第1または第2末端基前駆体の一方を活性化するステップ、
(iv)脱保護された官能基を活性化された末端基前駆体と反応させるステップ、
(v)第2の保護基を除去することによって外側層上の官能基を脱保護するステップ、
(vi)他方の第1または第2末端基前駆体を活性化するステップ、および
(iv)脱保護された官能基を活性化された末端基前駆体と反応させるステップ
を含む、制御された末端基化学量論を持つ高分子を製造するための方法(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)。 (I) a growing polymer comprising an outer layer having a functional group and two or more different protecting groups,
A precursor of a first end group that is the residue of a pharmaceutically active agent, derivative or precursor thereof, and a second end group selected to modify the pharmacokinetics of the pharmaceutically active agent and / or polymer. Supplying a precursor;
(Ii) deprotecting the functional group on the outer layer by removing the first protecting group;
(Iii) activating one of the first or second end group precursors;
(Iv) reacting the deprotected functional group with an activated end group precursor;
(V) deprotecting the functional group on the outer layer by removing the second protecting group;
A controlled end comprising: (vi) activating the other first or second end group precursor; and (iv) reacting the deprotected functional group with the activated end group precursor. Method for producing a polymer with group stoichiometry (in this case, end group stoichiometry refers to the number and type of end groups).
・カルボキシレート基、
医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、および
医薬活性剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基
を含む表面修飾剤化合物
を供給するステップ、
(ii)表面修飾剤化合物上のカルボキシレート基を活性化するステップ、
(iii)保護基を除去することによって、成長中の高分子の外側層上の官能基を脱保護するステップ、ならびに
(vii)成長中の高分子上の脱保護された官能基を、表面修飾剤化合物上の活性化されたカルボキシレート基と反応させるステップ
を含む、制御された末端基化学量論を持つ高分子を製造するための方法(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)。 (I) a growing polymer comprising an outer layer having a functional group and one or more protecting groups, and a carboxylate group,
Surface modifier compound comprising a pharmaceutically active agent, a first end group that is a residue of a derivative or precursor thereof, and a second end group selected to modify the pharmacokinetics of the pharmaceutically active agent and / or polymer Supplying steps,
(Ii) activating a carboxylate group on the surface modifier compound;
(Iii) deprotecting functional groups on the outer layer of the growing polymer by removing protecting groups; and (vii) surface modifying the deprotected functional groups on the growing polymer. A method for producing a polymer with controlled end group stoichiometry, comprising reacting with activated carboxylate groups on the agent compound (where end group stoichiometry is end group stoichiometry) Refers to the number and type of
(i)・二つ以上の異なるアミン保護基およびカルボキシレート基を有するリジンまたはリジン類似体化合物、
・医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基の前駆体、および
・医薬活性剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基の前駆体
を供給するステップ、
(ii)保護されたリジンまたはリジン類似体化合物上の第1アミンを脱保護するステップ、
(iii)第1または第2末端基前駆体を活性化するステップ、
(iv)活性化された末端基前駆体を脱保護されたアミン基と反応させるステップ、
(v)保護されたリジンまたはリジン類似体化合物上の第2アミンを脱保護するステップ、
(vi)他方の第1または第2末端基前駆体を活性化するステップ、および
(vii)前記他方の活性化された末端基前駆体を第2の脱保護されたアミン基と反応させて表面修飾剤化合物を得るステップ
を含む方法。 A method for producing a surface modifier compound comprising:
(i) lysine or lysine analog compounds having two or more different amine protecting groups and carboxylate groups,
A precursor of a first end group that is the residue of a pharmaceutically active agent, derivative or precursor thereof, and a second end group selected to modify the pharmacokinetics of the pharmaceutically active agent and / or polymer. Supplying a precursor;
(Ii) deprotecting a primary amine on the protected lysine or lysine analog compound;
(Iii) activating the first or second end group precursor;
(Iv) reacting the activated end group precursor with a deprotected amine group;
(V) deprotecting the secondary amine on the protected lysine or lysine analog compound;
(Vi) activating the other first or second end group precursor, and (vii) reacting said other activated end group precursor with a second deprotected amine group to surface Obtaining a modifier compound.
・医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、および
・医薬活性剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基
を含む少なくとも二つの末端基を含む、制御された末端基化学量論を持つ高分子と、
そのための薬学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)。 A surface layer, at least one sub-surface layer, and a first end group that is the residue of a pharmaceutically active agent, derivative or precursor thereof, and to modify the pharmacokinetics of the pharmaceutically active agent and / or macromolecule A polymer with controlled end group stoichiometry comprising at least two end groups including a selected second end group;
A pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient therefor (in this case, end group stoichiometry refers to the number and type of end groups).
表面層および少なくとも一つのサブ表面層、ならびに
・抗腫瘍医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、
・抗腫瘍医薬剤および/または高分子の薬物動態を修飾するために選択される第2末端基、を含む、制御された末端基化学量論を持つ高分子と、
そのための薬学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤
とを含む医薬組成物の有効量を投与することを含む方法(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)。 A method for treating a tumor in a patient in need of tumor treatment comprising:
A surface layer and at least one sub-surface layer, and a first terminal group that is the residue of an antitumor pharmaceutically active agent, derivative or precursor thereof,
A polymer with controlled end group stoichiometry, comprising a second end group selected to modify the pharmacokinetics of the anti-tumor pharmaceutical agent and / or polymer;
A method comprising administering an effective amount of a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient therefor (in this case, end group stoichiometry is the number and type of end groups Point).
表面層、少なくとも一つのサブ表面層、ならびに
・医薬活性剤、その誘導体またはその前駆体の残基である第1末端基、
・医薬活性高分子のリンパへの取り込みを容易にするために選択される第2末端基
を含む、制御された末端基化学量論を持つ高分子の有効量と、
そのための薬学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤
とを投与することを含む方法(この場合、末端基化学量論とは、末端基の数およびタイプを指す)。 A method for targeted delivery of a pharmaceutically active agent to an animal's lymphatic system, comprising:
A surface layer, at least one sub-surface layer, and a first terminal group that is the residue of a pharmaceutically active agent, derivative or precursor thereof,
An effective amount of a polymer with controlled end group stoichiometry, including a second end group selected to facilitate uptake of the pharmaceutically active polymer into the lymph;
A method comprising administering a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient therefor (wherein end group stoichiometry refers to the number and type of end groups).
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