JP5392674B2 - Collagen pharmaceutical compositions and a method of manufacturing the same - Google Patents

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本発明は、薬物と複合した生体適合性高分子化合物を保持するコラーゲンゲル医薬組成物及びその製造方法に関する。 The present invention, collagen gel pharmaceutical composition for holding the biocompatible polymer compound complexed with a drug and a method for producing the same.

癌の転移は、癌の治療において大きな問題の1つである。 Cancer metastasis is one of the major problems in the treatment of cancer. 癌の転移は、癌細胞がマトリクスメタロプロテアーゼ(MMP)などのタンパク質分解酵素を分泌して、ラミニン、ゼラチン、フィブロネクチン、プロテオグリカンなどの細胞外マトリクスを分解して浸潤し、血管などの循環経路に浸透することにより進行すると推測されている。 Metastasis of cancer, cancer cells secrete proteolytic enzymes such as matrix metalloproteinases (MMP), laminin, gelatin, fibronectin, by decomposing extracellular matrix, such as proteoglycans invade, penetrate the circulation path such as a blood vessel it has been estimated to proceed by.

癌の治療に関して、送達システムを利用することが、現在までに開発されている。 For the treatment of cancer, is possible to use the delivery system, it has been developed up to now. 例えば、特開昭61−56134号(特許文献1)には、化学療法薬物を分散させたコラーゲン組成物を、腫瘍部位、その周囲又は腫瘍を除去したあとの組織に注入して、該薬物を含む組成物を組織に付着させて薬物を組織に送達することが記載されている。 For example, JP 61-56134 (Patent Document 1), a chemotherapy drug collagen composition prepared by dispersing, tumor site, by injecting into the tissue after removal of the surrounding or tumors, the drug it is described that a composition comprising by adhering to the tissue to deliver the drug to the tissue.

特開昭61−56134号公報 JP-A-61-56134 JP

しかし、コラーゲンは繊維状タンパク質であり、網目構造を有しているので、薬物を包含する従来の医薬組成物を用いた場合、薬物が網目構造から外れて漏れ出し、正常な細胞に接触してしまう。 However, the collagen is fibrous protein, since it has a network structure, when a conventional pharmaceutical composition comprising a drug, the drug leaks out from the network structure, in contact with normal cells put away. 通常、抗癌剤のような薬物は、正常細胞にとっては毒性が高いので、従来の組成物を用いることにより副作用が発生してしまうという問題が発生する。 Typically, drugs such as anticancer agents, for the normal cells because of its high toxicity, a problem that side effect occurs by using a conventional compositions occurs.

そこで、本発明者らは、上記の問題点を解決するために研究を重ねた結果、抗癌剤のような薬物と複合した生体適合性高分子化合物をコラーゲン中に保持させることにより、薬物がコラーゲンから漏れ出して正常細胞に影響を及ぼすことを回避できることを見出した。 Accordingly, the present inventors have made extensive research to solve the above problems, a biocompatible polymer compound drugs and complexed as anticancer agents by holding in the collagen, drug collagen It was found to be able to avoid affecting the normal cells to leak out. また、このようなコラーゲンは、癌細胞が特異的に分泌するMMPにより分解されるので、癌細胞が存在する部位で特異的に薬物を放出できることも見出して、本発明を完成した。 Moreover, such a collagen, because the cancer cells are degraded by MMP secreting specific, also found to be able to release a specific drug at sites where cancer cells are present, and have completed the present invention.

よって、本発明は、薬物と複合した生体適合性高分子化合物と、基材としてのコラーゲンとを含む医薬組成物を提供する。 Accordingly, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising a biocompatible polymer compound complexed with a drug, and a collagen as a substrate.
また、本発明は、薬物と複合した生体適合性高分子化合物を基材としてのコラーゲンと混合し、得られる混合物をゲル化させることを含む、上記の医薬組成物を製造する方法も提供する。 Further, the present invention is a biocompatible polymer compound complexed with the drug mixed with collagen as a substrate, the resulting mixture comprising gelling also provides a method for producing the above pharmaceutical composition.

本発明の医薬組成物は、正常細胞にとって有害な抗癌剤のような薬物が、癌細胞が存在する部位で特異的に放出され、正常細胞が存在する部位では放出されにくいので、副作用が少ない薬物の送達を可能にする。 The pharmaceutical compositions of the present invention, drugs such as toxic anticancer agents to normal cells, is specifically released at sites where cancer cells are present not easily be released at the site where normal cells are present, side effects of small drug to enable the delivery. これは、徐放されてしまう低分子量の薬物が高分子量の生体適合性高分子化合物と複合していることによって達成される。 This low molecular weight drugs is achieved by being combined with a biocompatible polymeric compound high molecular weight would be sustained. また、生体適合性高分子化合物と薬物との複合を癌細胞の内部で特異的に切断されるものとすれば、より特異的に癌細胞にのみ薬物を送達できる。 Further, a composite of biocompatible polymer compound and a drug if that is specifically cleaved inside the cancer cells, capable of delivering a drug only to the more specific cancer cells.

アドリアマイシン(ADR)と結合したPEG修飾ポリアミドアミンデンドリマーの合成のスキームを示す。 It shows a scheme of synthesis of PEG-modified polyamidoamine dendrimer conjugated with adriamycin (ADR). デンドリマーと結合したADRのデンドリマーからの解離に及ぼすpHの影響を示すグラフである。 It is a graph showing the effect of pH on dissociation from dendrimers ADR bound to the dendrimer. コラーゲンゲルへのADR又はADRと結合したデンドリマーの保持率を示すグラフである。 Is a graph showing the retention of the dendrimer bound to ADR or ADR to collagen gel. (a)MDA-MB-231細胞に対するADR単独(■)及びPEG-PAMAM-N-ADR(◆)の影響、及び(b)MCF-7細胞に対するADR単独(■)及びPEG-PAMAM-N-ADR(◆)の影響を示す。 (A) MDA-MB-231 ADR alone to cells (■) and PEG-PAMAM-N-ADR (◆) effects, and (b) ADR alone against MCF-7 cells (■) and PEG-PAMAM-N- It shows the influence of ADR (◆). (a)ADR単独を含むコラーゲンを用いた場合、及び(b)PEG-PAMAM-N-ADRを含むコラーゲンを用いた場合のMCF-7及びMDA-MB-231細胞の細胞生存率を示す。 (A) shows the case of using the collagen containing ADR alone and (b) the cell viability of MCF-7 and MDA-MB-231 cells in the case of using the collagen containing PEG-PAMAM-N-ADR. 実施例2で得られた化合物の1 H-NMRスペクトルを示す。 1 H-NMR spectrum of the compound obtained in Example 2. 実施例2の合成スキームを示す。 The synthesis scheme of example 2. 実施例2で製造したコラーゲンペプチド単独、及びコラーゲンペプチド結合デンドリマーにおけるコラーゲンペプチドの3重ヘリックス形成性を示すCDスペクトルを示す。 Collagen peptide alone produced in Example 2, and shows the CD spectrum having a triple-helix formation of the collagen peptide in the collagen peptide bond dendrimers. 実施例2のデンドリマー結合ADRからのADR解離の挙動を示すグラフである。 Is a graph showing the behavior of ADR dissociation from the dendrimer binding ADR of Example 2. (a)MCF-7細胞に対するADR単独(◆)、コラーゲンペプチドを結合させていないADR結合デンドリマー(●)及びAcCP-PAMAM-N-ADR(▲)の影響、並びに(b)MDA-MB-231細胞に対するADR単独(◆)、コラーゲンペプチドを結合させていないADR結合デンドリマー(●)及びAcCP-PAMAM-N-ADR(▲)の影響を示す。 (A) ADR alone against MCF-7 cells (◆), the influence of ADR binding dendrimers not bound collagen peptide (●) and AcCP-PAMAM-N-ADR (▲), and (b) MDA-MB-231 ADR alone to cells (◆), shows the influence of ADR binding dendrimers not bound collagen peptide (●) and AcCP-PAMAM-N-ADR (▲). (a)MCF-7細胞に対するADR単独(◆)、コラーゲンペプチドを結合させていないADR結合デンドリマー(●)及びAcCP-PAMAM-N-ADR(▲)をそれぞれ含むコラーゲンの影響、並びに(b)MDA-MB-231細胞に対するADR単独(◇)、コラーゲンペプチドを結合させていないADR結合デンドリマー(○)、及びAcCP-PAMAM-N-ADR(△)をそれぞれ含むコラーゲンの影響を示す。 (A) ADR alone against MCF-7 cells (◆), ADR binding dendrimers not bound collagen peptide (●) and AcCP-PAMAM-N-ADR (▲) the effect of collagen containing respectively, and (b) MDA ADR alone against -MB-231 cells (◇), shows the influence of collagen including ADR binding dendrimers not bound collagen peptide (○), and AcCP-PAMAM-N-ADR and (△), respectively. 実施例3で得られた化合物の1 H-NMRスペクトルを示す。 1 H-NMR spectrum of the compound obtained in Example 3. 実施例3の合成スキームを示す。 The synthesis scheme of Example 3. 実施例4で得られた化合物の1 H-NMRスペクトルを示す。 1 H-NMR spectrum of the compound obtained in Example 4. 実施例4の合成スキームを示す。 The synthesis scheme of Example 4. (a)MCF-7細胞に対するADR結合ポリグルタミン酸(■)及びADR結合デンドリマー(▲)の影響、並びに(b)MDA-MB-231細胞に対するADR結合ポリグルタミン酸(■)及びADR結合デンドリマー(▲)の影響を示す。 (A) MCF-7 ADR binding polyglutamic acid to cells (■) and ADR-binding dendrimers (▲) effects, as well as (b) MDA-MB-231 ADR binding polyglutamic acid to cells (■) and ADR-binding dendrimers (▲) It shows the influence.

本明細書において「複合する」とは、薬物と生体適合性高分子化合物とが1つの物質のように挙動する状態であることを意味し、薬物と生体適合性高分子化合物とが共有結合などの化学結合、又は静電相互作用、疎水性相互作用などによる物理結合により結合している状態である。 By "composite" as used herein, means that the drug and the biocompatible polymer compound is a state that behaves as a single substance, a drug and a biocompatible polymer compound and a covalent bond such as chemical bonds, or electrostatic interactions, a state bound by physical binding by hydrophobic interactions and the like.
上記の化学結合は、薬物中に存在する何らかの官能基と、生体適合性高分子化合物中の官能基との直接又は間接的な結合により達成できる。 Additional chemical bonding can be achieved with some functional groups present in the drug, by direct or indirect coupling with a functional group of the biocompatible polymer compound.
上記の物理結合は、生体適合性高分子化合物が樹状構造又は網目構造を有する場合に、その内部の間隙への薬物の包接(encapsulation)により達成できる。 The above physical binding, when the biocompatible polymer compound having a dendritic structure or a network structure, can be achieved by inclusion (encapsulation) of drug into the inside of the gap.
上記の化学結合及び物理結合は、以下に記載するように、特定の条件、例えば温度、pHなどに応じて切断され得るものがより好ましい。 Said chemical bonds and physical bonds, as described below, specific conditions, such as temperature, it is more preferred that can be cleaved in accordance with the pH.

上記の薬物は、生体適合性高分子化合物と複合するための官能基を有する薬物が好ましい。 The drug is a drug having a functional group for conjugating a biocompatible polymer compound is preferable. 薬物として抗癌剤を用いることが好ましく、抗癌剤としては、アドリアマイシン(ドキソルビシン)、ブレオマイシン、マイトマイシンCのような抗生物質、シスプラチン、オキサリプラチンのような白金化合物、5−フルオロウラシル、シタラビン、ゲムシタビンのような代謝拮抗剤、ビンクリスチン、タキソール(パクリタキセル)、ビンブラスチン、ドセタキセルのような天然物由来抗癌剤などが挙げられる。 It is preferred to use an anti-cancer agent as a drug, the anticancer agent, adriamycin (doxorubicin), bleomycin, antibiotics such as mitomycin C, cisplatin, platinum compounds such as oxaliplatin, 5-fluorouracil, cytarabine, antimetabolites such as gemcitabine agents, vincristine, taxol (paclitaxel), vinblastine, and the like naturally derived anticancer agents such as docetaxel.

上記の生体適合性高分子化合物は、生体内での毒性が低く、薬物と複合可能な高分子化合物である。 Additional biocompatible polymer compound has low toxicity in vivo, a complex capable of polymer compounds with the drug. 該化合物は、直鎖構造を有する直鎖状高分子化合物、及び分岐構造を有する分岐状高分子化合物のいずれの構造であってもよい。 The compounds may be any structure of branched polymer compound having a straight-chain polymer compound, and branched structures having a linear structure.

生体適合性高分子化合物は、薬物と複合可能な官能基を1種以上有するものが好ましい。 Biocompatible polymer compound is preferably one having a drug complexed functional group of one or more. 該官能基としては、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシ基などが挙げられる。 The functional group, an amino group, a carboxyl group, such as hydroxy group.
生体適合性高分子化合物と薬物との複合が、該高分子化合物中の官能基と薬物中に存在する何らかの官能基との結合によるものである場合、高分子化合物中の官能基と薬物中の官能基とは、高分子化合物の官能基と薬物の官能基との間で直接又は適切なリンカーを介在させて結合させることができる。 Combined with a biocompatible polymer compound and drug, if it is due to binding of any functional group present in the functional group and the drug in a polymer compound, in the polymer compound functional group in the drug of the functional group can be attached by interposing directly or suitable linker between the functional group of the functional group and the drug polymer. 該リンカーは、薬物が、好ましくは特定の条件下で、高分子化合物から切り離されることを可能にする結合を含むものが好ましく、例えば特定のpH条件下で切断されるヒドラゾン結合を含むもの、特定の酵素の存在下で切断される一連のペプチド、加水分解可能なエステル結合を含むものなどが挙げられる。 The linker, the drug is preferably one that contains under certain conditions, preferably those containing coupling that allows decoupled from the polymer compound, for example, a hydrazone bond cleaved under certain pH conditions, particular a series of peptides of cleaved in the presence of the enzyme, and the like which contains a hydrolyzable ester bond.

直鎖状高分子化合物としては、ポリリシン、ポリグルタミン酸などのポリペプチドのようなポリアミド、ポリ乳酸などのポリエステル、ポリグリシドールなどのポリエーテル、ポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリアリルアミンなどが好ましい。 Examples of the linear polymeric compound, polylysine, polyamides such as polypeptides such as polyglutamic acid, polyesters such as polylactic acid, ethers such as polyglycidol, polyurethane, polyvinyl alcohol, polyallylamine are preferable. なかでも、ポリアミノ酸、特にポリグルタミン酸がより好ましい。 Among them, polyamino acids, in particular polyglutamic acid is more preferable.
分岐状高分子化合物としては、樹状構造を有するデンドリマー、ポリエチレンイミン、ポリエーテル、ポリエステル、ポリアミドなどが好ましい。 Examples of the branched polymer compound, dendrimers having dendritic structures, polyethyleneimine, polyethers, polyesters, polyamides are preferable. これらの高分子は、1種又は複数種を用いることができる。 These polymers may be used alone or in combination.

上記のデンドリマーとは、一般に、樹状構造を有する3次元的に高度に分枝した化合物であり、ほぼ球状の形状を有することが知られている。 The above dendrimers, generally, a three-dimensional highly compounds branched with a dendritic structure, are known to have a substantially spherical shape. 本明細書において、「デンドリマー」とは、デンドリマーを構成する部分構造であって、コアの部分の少なくとも1つの官能基が分岐していない構造を有するデンドロンも含む。 As used herein, "dendrimer" is a partial structure constituting the dendrimer also contains dendron having a structure in which at least one functional group is not branched portion of the core.

一般に、デンドリマーは、コアと、いくつかの世代の分岐部分と、末端基とからなる。 In general, the dendrimer comprises a core and a branch portion of a few generations, the terminal groups.
デンドリマーのコアは、1つ以上の官能基を有する化合物から誘導されるものである。 Dendrimer core, are those derived from compounds that have one or more functional groups. 官能基としては、第1級アミノ基、第2級アミノ基、ヒドロキシ基、カルボン酸基、チオール基、エステル基、アミド基、ケトン基、アルデヒド基などが挙げられ、好ましくは、第1級アミノ基及び第2級アミノ基である。 The functional group, primary amino group, secondary amino group, hydroxy group, carboxyl group, thiol group, an ester group, an amide group, a ketone group, such as an aldehyde group and the like, preferably, primary amino it is a group and a secondary amino group.
上記のコアを構成する化合物としては、例えばアンモニア、エチレンジアミンなどが挙げられる。 As the compound constituting the core, such as ammonia and ethylenediamine.

デンドリマーの分岐部分は、3以上の原子価を有する原子を含む分岐構造単位の繰り返しからなる。 Branched moiety of a dendrimer, a repeating branching structure unit containing atoms having 3 or more valences. 3以上の原子価を有する原子としては、炭素、窒素、ケイ素、リンなどが挙げられる。 The atom having three or more valences, carbon, nitrogen, silicon, phosphorus, and the like.
デンドリマーの分岐部分としては、以下に示すような構造が、一般的に知られている。 The branch portions of the dendrimer, the structure shown below, is generally known.

(式中、nは1以上の整数であり、好ましくは60〜300の整数である) (Wherein, n is an integer of 1 or more, preferably an integer of 60 to 300)

上記の分岐構造を有する各デンドリマーについては、以下の文献に記載されている。 For each dendrimer having the branched structure, it is described in the following documents.
(A)DA Tomaliaら、Polym. J. 17, 117 (1985);DA Tomaliaら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 29, 138 (1990) (A) DA Tomalia et al, Polym J. 17, 117 (1985);...... DA Tomalia et al, Angew Chem Int Ed Engl 29, 138 (1990)
(B)EMM de Brabander-van den Bergら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 1308 (1993);EMM de Brabander-van den Bergら、Macromol. Symp. 77, 51 (1994);JC Hummelenら、Chem. Eng. J. 3, 1489 (1997);C. Wanerら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 1300 (1993) (B) EMM de Brabander-van den Berg et al., Angew Chem Int Ed Engl 32, 1308 (1993);..... EMM de Brabander-van den Berg et al., Macromol Symp 77, 51 (1994);.. JC Hummelen et al., Chem Eng J. 3, 1489 (1997);........ C Waner et al, Angew Chem Int Ed Engl 32, 1300 (1993)
(C)Henrik R. Ihreら、Bioconjugate Chem. 13, 443-452 (2002);Andrew P. Goodwinら、J.Am.Chem.Soc., 129, 6994 (2007) (C) Henrik R. Ihre et al, Bioconjugate Chem 13, 443-452 (2002);.. Andrew P. Goodwin et al, J.Am.Chem.Soc, 129, 6994 (2007)

デンドリマーの分岐部分は、上記のような繰り返し単位を2種以上含むものであってもよい。 Branched moiety of a dendrimer, may include repeating units, such as the two or more.

デンドリマーの末端基の構造は、所望により適宜選択できる。 Structure of the terminal groups of a dendrimer, which optionally can be appropriately selected. 例えば、末端基は、分岐部分の最後の繰り返し単位の構造を有してもよいし、末端基は、分岐部分とは別の構造を有してもよい。 For example, end group may have the structure of the last repeating units of the branch portion, the terminal group may have a different structure from the branch part.
デンドリマーの末端基としては、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシ基などが挙げられ、好ましくはアミノ基である。 Examples of the terminal groups of the dendrimer, an amino group, a carboxyl group, such as hydroxy group and the like, preferably an amino group.

本発明において、デンドリマーは、薬物と結合するか又は薬物をその内部の間隙に収容できる、すなわち包接できるものであれば、特に限定されない。 In the present invention, dendrimers, or or drug binds to the drug can be accommodated in the interior of the gap, i.e. as long as it can inclusion is not particularly limited.
デンドリマーの世代数は、用いるデンドリマーのコア及び分岐部分の構造に応じて適宜選択できる。 Number of generations of the dendrimer can be appropriately selected depending on the structure of the core and the branch portion of the dendrimer used. 現在、第0〜第10世代のものの入手が容易である。 Currently, it is easy to obtain those of the 0 to the tenth generation.

デンドリマーの製造方法は公知であり、例えば上記の文献に記載されている。 Method for producing a dendrimer are known, for example, described in the above literature. また、ポリアミドアミンデンドリマーは、Starburst(登録商標)の商品名で市販されており、入手が容易である。 Further, polyamidoamine dendrimers are commercially available under the trade name Starburst (TM), it is easy to obtain.
また、ポリアミドアミンデンドリマーは、例えば原料である第1級アミンに、アクリル酸エステルを反応させるマイケル付加反応と、ジアミノアルカンを用いるエステルアミド交換反応とにより第1世代のアミド化合物を得て、マイケル付加反応及びエステルアミド交換反応を繰り返すことにより製造できる(Tomalia, D.ら、Polym. J. 17、117〜132 (1985);Frechet, JMJ, Tomalia, DA編、(2001) Dendrimers and other dendritic polymers, J. Wiley & Sons, West Sussexを参照)。 Further, polyamidoamine dendrimers, for example, the primary amine as a raw material, to give the Michael addition reaction is reacted with acrylic acid ester, the ester amide exchange reaction using diaminoalkane the first generation of the amide compounds, Michael addition can be prepared by repeating the reaction and ester amide exchange reaction (Tomalia, D. et al., Polym J. 17,117~132 (1985);. Frechet, JMJ, Tomalia, DA ed., (2001) dendrimers and other dendritic polymers, J. Wiley & Sons, referring to the West Sussex). 原料となるジアミンは、市販で入手可能である。 Diamine as a raw material, it is commercially available.

上記の生体適合性高分子化合物、例えばデンドリマーは、該生体適合性高分子化合物に機能性を付与できる修飾物質で修飾されていてもよい。 Additional biocompatible polymer compound, for example dendrimers, may be modified by the modifier capable of imparting functionality to the biocompatible polymer. 該修飾物質としては、生体適合性を付与できる物質、温度感受性を付与できる物質(例えばN-イソプロピルアクリルアミド、イソブチル基)、基材としてのコラーゲンとの親和性を付与できる物質、細胞への結合を促進できるリガンドなどが挙げられる。 As the modifier, a substance capable of imparting biocompatibility, substances capable of imparting a temperature sensitive (such as N- isopropylacrylamide, isobutyl group), substances capable of imparting an affinity with collagen as a substrate, binding to cellular such as promotion can be a ligand, and the like.

生体適合性を付与できる修飾物質としては、ポリエチレングリコール(PEG)が挙げられる。 The modifier can impart biocompatibility, and polyethylene glycol (PEG). PEGの分子量は、120〜12000が好ましく、より好ましくは350〜12000、さらに好ましくは550〜5000である。 The molecular weight of PEG is preferably from 120 to 12,000, more preferably from 350 to 12,000, more preferably from 550 to 5,000.

コラーゲンとの親和性を付与できる物質としては、コラーゲンと架橋可能な物質が好ましい。 The substance capable of imparting an affinity with collagen, collagen and cross-linkable materials are preferred. コラーゲンと架橋可能な物質としては、コラーゲンペプチド、グルタルアルデヒドなどが挙げられる。 The crosslinkable material with collagen, collagen peptide, such as glutaraldehyde and the like. なかでも、コラーゲンペプチドが好ましい。 Among them, collagen peptide is preferred.
なお、生体適合性高分子化合物を、基材としてのコラーゲンと混合する際に縮合剤を添加することによって、コラーゲンと、ジアミン、ジカルボン酸などの架橋剤が有するアミノ基やカルボキシル基との化学反応により、生体適合性高分子化合物をコラーゲンと架橋させることもできる。 Incidentally, the biocompatible polymer compound, a chemical reaction by the addition of a condensing agent when mixed with collagen as a substrate, and collagen, a diamine, an amino group or a carboxyl group with a crosslinking agent such as a dicarboxylic acid Accordingly, the biocompatible polymer compound may also be cross-linked with collagen. このような場合、生体適合性高分子化合物が、コラーゲンと架橋可能な物質で修飾されていなくても、生体適合性高分子化合物とコラーゲンとの架橋を行うことができる。 In such a case, a biocompatible polymer compound, even if it is not modified with collagen and crosslinkable substance, it is possible to perform crosslinking with biocompatible polymer compound and collagen.

コラーゲンペプチドは、1000〜9000、より好ましくは1000〜4000の分子量を有するコラーゲンの加水分解産物である。 Collagen peptides, 1000-9000, and more preferably hydrolyzate of collagen having a molecular weight of 1000 to 4000. コラーゲンペプチドとしては、天然のコラーゲンを加水分解酵素処理して得られるもの、又は合成コラーゲンペプチドのいずれを用いることもできる。 The collagen peptide, those obtained with native collagen and hydrolase treated, or can be formed using either a synthetic collagen peptide.
コラーゲンペプチドは、水素結合を形成できる官能基を有するアミノ酸を含むものが好ましい。 Collagen peptide which comprises an amino acid having a functional group capable of forming a hydrogen bond. このようなコラーゲンペプチドを用いることにより、コラーゲンペプチドがデンドリマーと結合してデンドリマーの周囲に凝集したときに三重らせん構造を形成しやすく、形成された三重らせんが、基材としてのコラーゲンの三重らせんと架橋点を多く有することができるので、コラーゲンペプチドと基材としてのコラーゲンとの間の親和性を向上させることができる。 By using such a collagen peptide, it tends to form triple helical structures when collagen peptide is bound to the dendrimer aggregate around the dendrimer, triple helix is ​​formed, the triple helix of collagen as a substrate it is possible to have many crosslinking points, it is possible to improve the affinity between the collagen as collagen peptide and the substrate.
水素結合を形成できる官能基を有するアミノ酸としては、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、セリン、スレオニンなどのヒドロキシ基を有するアミノ酸が挙げられる。 Amino acids having a functional group capable of forming a hydrogen bond, hydroxyproline, hydroxylysine, serine, amino acid having a hydroxyl group, such as threonine.

上記の修飾物質での生体適合性高分子化合物の修飾は、それ自体公知の技術を用いて行うことができる。 Modified biocompatible polymer compound of the above modifier can be carried out using techniques known per se.
例えば、PEGでのデンドリマーの修飾は、Kojima C.ら、Bioconjuge Chem 11: 910〜7 (2000)などに記載される方法を用いて行うことができる。 For example, modification of the dendrimer in the PEG, Kojima C. et al, Bioconjuge Chem 11: 910~7 (2000) can be carried out using the methods described, for example. 具体的には、例えば、PEGの一方の末端のヒドロキシ基を、デンドリマーの末端基と反応性を有する基で誘導体化し、デンドリマーと反応させてPEGをデンドリマーの末端に結合させることができる。 Specifically, for example, the one end of the hydroxy groups of the PEG, derivatized with groups reactive with the terminal groups of the dendrimer, the PEG is reacted with the dendrimer can be bonded to the terminal of the dendrimer. デンドリマーの末端基がアミノ基である場合、この末端基とウレタン結合又はアミド結合を形成できる基、例えば4-ニトロフェニルカーボネート基又はカルボキシル基をPEGの末端に形成するようにPEGを誘導体化することができる。 If the terminal groups of the dendrimer is an amino group, derivatizing PEG to form the terminal groups and a urethane bond or an amide bond capable of forming group, for example a 4-nitrophenyl carbonate group or carboxyl group at the end of PEG can. また、デンドリマーの末端がヒドロキシ基である場合、この末端基とエステル結合を形成できる基、例えばカルボキシル基をPEGの末端に形成するようにPEGを誘導体化することができる。 Also, if the terminal of the dendrimer is a hydroxy group, group capable of forming the end group and an ester bond, for example, a carboxyl group can be derivatized PEG to form the end of the PEG.

また、コラーゲンペプチドでのデンドリマーの修飾は、コラーゲンペプチドの一方の末端をデンドリマーの末端基と反応性を有する基で誘導体化し、デンドリマーと反応させてコラーゲンペプチドをデンドリマーの末端に結合させることにより行うことができる。 Also, modifications of dendrimers with collagen peptides, be carried out by coupling one end of the collagen peptide derivatized with groups reactive with the terminal groups of the dendrimer, a collagen peptide is reacted with the dendrimer terminated dendrimers can. デンドリマーの末端がアミノ基である場合、この末端基とウレタン結合又はアミド結合を形成できる基、例えば4-ニトロフェニルカーボネート基又はカルボキシル基をコラーゲンペプチドの末端に形成するようにコラーゲンペプチドを誘導体化することができる。 If terminus of the dendrimer is an amino group, derivatizing a collagen peptide to form groups capable of forming the end group and a urethane bond or an amide bond, for example a 4-nitrophenyl carbonate group or carboxyl group at the terminal of collagen peptide be able to. また、デンドリマーの末端がヒドロキシ基である場合、この末端基とエステル結合を形成できる基、例えばカルボキシル基をコラーゲンペプチドの末端に形成するようにコラーゲンペプチドを誘導体化することができる。 Also, if the terminal of the dendrimer is a hydroxy group, group capable of forming the end group and an ester bond, for example, a carboxyl group can be derivatized collagen peptide to form the ends of the collagen peptide.

生体適合性高分子化合物と薬物との複合は、特定の条件で切断され得る結合によるものが好ましい。 Combined with a biocompatible polymeric compound and the drug is preferably by binding that can be cleaved under certain conditions. 特定の条件とは、特定の温度又はpH、特定の酵素の存在下、加水分解条件下などを含む。 The specific conditions, specific temperature or pH, the presence of certain enzymes, including hydrolysis conditions. 上記の結合は、より好ましくは、薬物を放出させるべき温度又はpHで特異的に切断される結合である。 The above coupling is more preferably a bond that is specifically cleaved at a temperature or pH to be release the drug.
薬物として抗癌剤を用いる場合、薬物を放出させるべき温度としては、温熱療法を行う際の患部の温度(40〜42℃程度)が挙げられる。 When using an anticancer agent as a drug, as the temperature should be release the drug, the temperature of the affected part in performing thermotherapy (40-42 approximately ° C.) and the like. また、薬物を放出させるべきpHとしては、エンドソーム、リソソームなどの酸性小胞内のpH(pH5〜6)が挙げられる。 As the pH should be release the drug, endosome, pH of the acidic vesicles such as lysosomes (pH 5-6) and the like.
このようなpHで切断され得る結合としては、例えばK. Konoら、Biomaterials 29 p.1664-1675 (2008)などに記載されているヒドラゾン結合を用いることができる。 As the bond that can be cleaved in a pH, can be used, for example K. Kono et al, the hydrazone bond that is described in, Biomaterials 29 p.1664-1675 (2008).

上記の生体適合性高分子化合物と、薬物とのヒドラゾン結合は、具体的には、例えば、側鎖に反応性官能基を有するアミノ酸を生体適合性高分子化合物に結合させ、該アミノ酸の側鎖部に薬物を結合させることにより形成できる。 And the biocompatible polymer compound, the hydrazone bond with the drug, specifically, for example, an amino acid having a reactive functional group in the side chain is bound to a biocompatible polymer compound, a side chain of the amino acid part can be formed by binding the drug. この場合、所望により、アミノ酸の主鎖部に上記の修飾物質を結合させることができる。 In this case, if desired, can be bound to the above modifier into the main chain of the amino acids. 生体適合性高分子化合物の末端基がアミノ基である場合、アミノ基を保護したグルタミン酸-ベンジルエステルを生体適合性高分子化合物の末端アミノ基に反応させて、アミノ基を脱保護し、所望によりアミノ基に修飾物質を反応させた後、ベンジルエステルを除去し、リンカー(ヒドラゾン結合)を介して薬物を結合させることができる。 When the terminating group of biocompatible polymeric compound is an amino group, glutamic acid and an amino group protected - benzyl ester is reacted in the terminal amino group of biocompatible polymeric compounds, deprotecting the amino group, optionally after reacting the modifier material to the amino group, removal of the benzyl ester, can be attached to the drug via a linker (hydrazone bond).

薬物をデンドリマー内部の間隙に包接させる方法は公知であり、例えばKojima C.ら、Bioconjuge Chem 11: 910〜7 (2000)などに記載されている。 Method for inclusion drug into the gap inside the dendrimer are known, for example, Kojima C. et al, Bioconjuge Chem 11: 910~7 (2000) are described in, for example.

本発明の医薬組成物において、生体適合性高分子化合物と薬物との量比は、生体適合性高分子化合物及び薬物の構造に基づく空間配置により適切に選択できる。 In the pharmaceutical compositions of the present invention, the quantity ratio of the biocompatible polymer compound and drug are suitably be selected by a spatial arrangement based on the structure of the biocompatible polymer compound and a drug.

本発明の医薬組成物を構成するコラーゲンは、医療用コラーゲンとして通常用いられるものであれば特に限定されず、哺乳動物、特にヒトの腫瘍細胞が分泌するマトリクスメタロプロテアーゼ(MMP)により分解され得るものであればよい。 Collagen constituting the pharmaceutical compositions of the invention include those which are not particularly limited as long as it is usually used as a medical collagen, mammalian, it can particularly be degraded by matrix metalloproteinases (MMP) tumor cells of a human secreted it is sufficient.
コラーゲンは、天然のものであってもよいし、変性したものであってもよい。 Collagen, it may be native, or may be obtained by modifying. 変性したコラーゲンとしては、免疫原性を低減させたアテロコラーゲン、酸可溶化コラーゲン、アルカリ可溶化コラーゲン、アシル化コラーゲン、エステル化コラーゲンなどが挙げられる。 The denatured collagen, atelocollagen with reduced immunogenicity, acid-solubilized collagen, alkali-solubilized collagen, acylated collagen, such as esterification collagen and the like. 市販のコラーゲンを用いることもできる。 It is also possible to use a commercially available collagen.

コラーゲンは、現在、19種類が知られており、これらの1種又は複数種を用いることができる。 Collagen is currently 19 types are known, it is possible to use these one or more. MMPにより分解されやすい点で、IV型コラーゲンを含むことが好ましい。 In that easily decomposed by MMP, preferably contains type IV collagen. また、ゲル化しやすい点でI型コラーゲンを含むことが好ましい。 It is also preferred to include a type I collagen in that easily gelled. より好ましくは、I型コラーゲンとIV型コラーゲンとの混合物である。 More preferably, a mixture of type I collagen and type IV collagen.
I型コラーゲンとIV型コラーゲンとを混合して用いる場合、これらの重量比は特に限定されず、I型コラーゲン:IV型コラーゲン=100〜25:0〜75の重量比で混合して用いることができる。 When using a mixture of type I collagen and type IV collagen, these weight ratios are not particularly limited, type I collagen: collagen IV = 100-25: 0-75 be used in a weight ratio of it can. すなわち、I型コラーゲンを単独で用いることもできる。 That can be used alone type I collagen.

本発明の医薬組成物は、薬物と複合した生体適合性高分子化合物とコラーゲンとを、薬物と複合した生体適合性高分子化合物:コラーゲン=3:20〜200000の重量比で含むことが好ましい。 The pharmaceutical compositions of the present invention, the collagen biocompatible polymer compound complexed with the drug, the biocompatible polymer compound complexed with the drug: Collagen = 3: preferably comprises a weight ratio of from 20 to 200,000. このような重量比でこれらの物質を含むことにより、コラーゲンがMMPにより分解された際に、薬物と複合した生体適合性高分子化合物を効率よく放出することができる。 By including such a weight ratio of these materials, when the collagen was degraded by MMP, a biocompatible polymer compound complexed with a drug can be efficiently released.

本発明の医薬組成物は、薬物と複合した生体適合性高分子化合物が、基材としてのコラーゲンに含有されることが好ましい。 The pharmaceutical compositions of the present invention, the biocompatible polymer compound complexed with the drug is preferably contained in the collagen as a substrate. 薬物と複合した生体適合性高分子化合物を含むコラーゲンは、ゲル化させことが好ましい。 Collagen comprising a biocompatible polymer compound complexed with a drug, it is preferable to gel. ゲル化させることにより、本発明の医薬組成物を患者へ塗布により投与することが容易になる。 By gel, a pharmaceutical composition of the present invention can be easily administered by application to the patient. また、ゾル溶液を患部に注入して局所でゲル化させることによって、患部にコラーゲンゲルを投与することもできる。 Further, by gelling a local by injecting the sol solution into the affected area, it is also possible to administer the collagen gel to the affected area.

本発明の医薬組成物は、上記のようにして得られた薬物と複合した生体適合性高分子化合物をコラーゲンと混合して、得ることができる。 The pharmaceutical compositions of the present invention, the biocompatible polymer compound complexed with resulting drug as described above is mixed with collagen may be obtained.
コラーゲンと薬物複合高分子化合物との混合は、コラーゲンがゲル化しない条件下で行うことができる。 Mixing the collagen and the drug complex macromolecular compound can be carried out under conditions where collagen is not gelled. 該条件は、低温、好ましくは0〜4℃の温度である。 The conditions, low temperature, a temperature of preferably 0 to 4 ° C..

本発明の医薬組成物は、上記の混合物をゲル化して得られるものが好ましい。 The pharmaceutical compositions of the invention include those obtained by gelling a mixture of the above are preferred. ゲル化は、上記の混合物を20〜40℃の温度で5〜30分間インキュベートすることにより行うことができる。 Gelation of the mixture of the above can be carried out by incubating for 5 to 30 minutes at a temperature of 20 to 40 ° C.. このようにゲル化した組成物は、例えば、患者の腫瘍部位を外科手術により切除した後に、処置された組織部分に塗布することができる。 The composition gelled in this way, for example, after resection by surgery the tumor site of a patient, can be applied to treated tissue portion.

本発明を、以下の実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。 The present invention will be described in more detail by the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
実施例1 ポリエチレングリコール(PEG)で修飾されたデンドリマーと複合したアドリアマイシンを含むコラーゲンゲル医薬組成物(1)薬物と複合したPEG修飾デンドリマーの製造 本実施例では、薬物として抗癌剤であるアドリアマイシン(ADR)を用い、生体適合性高分子化合物としてのデンドリマーとして市販のポリアミドアミン(PAMAM)デンドリマーに、修飾物質としてのポリエチレングリコール(PEG)を付加した化合物を用いた。 Example 1 Polyethylene glycol collagen gel pharmaceutical composition comprising the adriamycin complexed with modified dendrimer with (PEG) (1) Adriamycin In manufacturing this embodiment of the PEG-modified dendrimer complexed with the drug, an anticancer agent as a drug (ADR) the use, in commercial polyamidoamine (PAMAM) dendrimers as dendrimers as biocompatible polymer compound using a compound obtained by adding polyethylene glycol (PEG) as a modifier.
(1-1)メトキシポリエチレングリコール-4-ニトロフェニルカーボネートの合成 平均分子量が2000のポリエチレングリコールモノメチルエーテル (PEG(2000)、Aldrich Chemical) (5.0mmol, 10g) を、蒸留したテトラヒドロフラン(THF、キシダ化学)(50ml) に溶解し、蒸留したTHF (25ml) に溶解したクロロギ酸-4-ニトロフェニル (15.0mmol, 3.02g、SIGMA-ALDRICH) とトリエチルアミン(TEA、ナカライテスク) (22.5mmol, 3.19ml) を加え、室温で4日間撹拌し、反応溶媒(THF)を減圧留去した。 (1-1) Polyethylene glycol monomethyl ether Synthesis average molecular weight of methoxy polyethylene glycol-4-nitrophenyl carbonate 2000 (PEG (2000), Aldrich Chemical) (5.0mmol, 10g) and distilled tetrahydrofuran (THF, Kishida Chemical ) (50 ml) was dissolved in distilled THF (chloroformate 4-nitrophenyl dissolved in 25ml) (15.0mmol, 3.02g, SIGMA-ALDRICH) and triethylamine (TEA, Nacalai Tesque) (22.5mmol, 3.19ml) was added and stirred for 4 days at room temperature, the reaction solvent (THF) was distilled off under reduced pressure. 残渣をクロロホルムに溶解し、飽和食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウムを加えて脱水した。 The residue was dissolved in chloroform, washed with saturated brine, and dried over magnesium sulfate. その後、クロロホルムを減圧留去して粗生成物を得た。 Then, to obtain a chloroform was distilled off under reduced pressure a crude product. さらにこれをジエチルエーテル500mlに滴下し、再沈殿することによって精製した。 Further added dropwise to this in diethyl ether 500 ml, and purified by reprecipitation. 収率は78.5%であった。 The yield was 78.5%. NMRによって同定した結果を以下に示す。 The results identified by NMR are shown below.
1 H NMR (300MHz, CDCl3) ; δ3.38 (s,OC H 3 ), 3.65 (m, C H 2 C H 2 O), 4.43 (m, OCOOC H 2 ), 7.40 (d, aromatic), 8.28 (d, aromatic). 1 H NMR (300MHz, CDCl3) ; δ3.38 (s, OC H 3), 3.65 (m, C H 2 C H 2 O), 4.43 (m, OCOOC H 2), 7.40 (d, aromatic), 8.28 (d, aromatic).

(1-2)Bocグルタミン酸結合PAMAMデンドリマーの合成 (1-2) Boc synthesis of glutamate binding PAMAM dendrimers
t-ブトキシカルボニルグルタミン酸-γ-ベンジルエステル(Boc-Glu(OBzl)、和光純薬工業) (1.35mmol, 455.7mg)、N-ヒドロキシスクシンイミド(HONSu、東京化成工業) (1.62mmol, 186.4mg)、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC、東京化成工業) (2.03mmol, 417.8mg)及びTEA (3.97mmol, 287μl) を、蒸留したN,N-ジメチルホルムアミド(DMF、キシダ化学)(3ml) に溶解し、氷冷下で4時間反応させた。 t- butoxycarbonyl glutamic acid -γ- benzyl ester (Boc-Glu (OBzl), Wako Pure Chemical Industries) (1.35mmol, 455.7mg), N- hydroxysuccinimide (HONSu, Tokyo Kasei Kogyo) (1.62mmol, 186.4mg), N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, Tokyo Kasei Kogyo) (2.03mmol, 417.8mg) dissolution and TEA (3.97mmol, 287μl) and distilled N, N- dimethylformamide in (DMF, product of Kishida chemical) (3 ml) then, the reaction was allowed to proceed for 4 hours under ice-cooling. この溶液を室温に戻した後、メタノールを除去し、ジメチルスルホキシド(DMSO、和光純薬工業)(2ml) に溶解した第4世代(以下、「G4」という)のStarburst(登録商標)ポリアミドアミン(PAMAM)デンドリマー(14.07μmol、Aldrich Chemical)を加え、4日間反応させた。 After returning the solution to room temperature, methanol was removed, dimethyl sulfoxide (DMSO, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) fourth generation (hereinafter, referred to as "G4") dissolved in (2 ml) Starburst (R) polyamidoamines ( PAMAM) dendrimers (14.07μmol, Aldrich Chemical) was added and allowed to react for 4 days.
沈殿物を除去したのち、Sephadex LH-20カラム (溶離液:メタノール)によって分離及び精製し、真空乾燥によってBoc-Glu(OBzl)結合PAMAMデンドリマーを得た。 After removing the precipitate, Sephadex LH-20 column (eluent: methanol) were separated and give the Boc-Glu (OBzl) bonds PAMAM dendrimers by vacuum drying. 収率は75.1%であった。 The yield was 75.1%. NMRによって同定した結果を以下に示す。 The results identified by NMR are shown below.
1 H NMR (300MHz, DMSO) ; Boc-Glu(OBzl)-PAMAM: δ 1.34 (s, Boc), 2.17 (br, Hc), 2.36 (br, He), 2.63 (br, Hd), 3.09 (br, Ha, Hb, Hf), 6.86, 7.78, 7.87 and 7.92 (br, NHCO), 3.90 (br, Hg), 1.76, 1.91 (br, Hh), 2.50 (br, Hi), 5.06 (s, Hj), 7.33 (s, Hk). 1 H NMR (300MHz, DMSO) ; Boc-Glu (OBzl) -PAMAM: δ 1.34 (s, Boc), 2.17 (br, Hc), 2.36 (br, He), 2.63 (br, Hd), 3.09 (br , Ha, Hb, Hf), 6.86, 7.78, 7.87 and 7.92 (br, NHCO), 3.90 (br, Hg), 1.76, 1.91 (br, Hh), 2.50 (br, Hi), 5.06 (s, Hj) , 7.33 (s, Hk).

(1-3)グルタミン酸結合PAMAMデンドリマーの合成 (1-2)で合成したBoc-Glu(OBzl)-PAMAMデンドリマー(10.6μmol, 366.3mg) にTFA 2mlを加え、氷冷下で撹拌した。 (1-3) glutamate binding PAMAM synthesis of dendrimer (1-2) synthesized Boc-Glu (OBzl) -PAMAM dendrimer (10.6μmol, 366.3mg) in the TFA 2 ml was added, and stirred under ice-cooling. 4時間後、トリフルオロ酢酸(TFA、ナカライテスク)を減圧留去し、さらに蒸留水を30ml加えて、減圧留去した。 After 4 hours, trifluoroacetic acid (TFA, Nacalai Tesque) was distilled off under reduced pressure, further distilled water was added 30 ml, was distilled off under reduced pressure. この操作を3回繰り返して、Glu(OBzl)結合PAMAMデンドリマーを得た。 This operation was repeated three times to obtain the Glu (OBzl) bonds PAMAM dendrimers. 収率は100%であった。 The yield was 100%.

(1-4)PEG-グルタミン酸結合PAMAMデンドリマーの合成 (1-3)で合成したGlu(OBzl)-PAMAMデンドリマー(10.6μmol, 365mg) をDMSO (17.9ml)に溶解し、(1-1)で合成したメトキシPEG(2000)-4-ニトロフェニルカーボネート(1.37mmol)を加え、さらにTEA (2.08mmol, 1503μl) を加えて、室温で5日間反応させた。 (1-4) PEG-glutamate binding synthesized Glu (OBzl) in PAMAM synthesis of dendrimer (1-3) -PAMAM dendrimer (10.6μmol, 365mg) was dissolved in DMSO (17.9 ml), (1-1) the synthesized methoxy PEG (2000) -4- nitrophenyl carbonate (1.37 mmol) was added, further added TEA (2.08mmol, 1503μl), was reacted at room temperature for 5 days. 反応溶液に蒸留水(3ml)を加えて、蒸留水中で2日間透析した後、SephadexG-75カラム (溶離液:0.1M Na 2 SO 4水溶液) により精製し、さらに蒸留水中で1日透析し、凍結乾燥によってPEG-Glu(OBzl)-PAMAMデンドリマーを得た。 And distilled water (3 ml) was added to the reaction solution, was dialyzed for 2 days in distilled water, SephadexG-75 column: (eluting solution 0.1 M Na 2 SO 4 aqueous solution) was dialyzed for 1 day at further distilled water, to obtain a PEG-Glu (OBzl) -PAMAM dendrimer by lyophilization. 収率は56.0%であった。 The yield was 56.0%. 1 H NMRによって同定した結果を以下に示す。 The results identified by 1 H NMR are shown below.
1 H NMR (400MHz, D 2 O+NaOD) ; PEG-Glu(OBzl)-G4: δ 2.19 (br, Hc), 2.39 (br, He), 1 H NMR (400MHz, D 2 O + NaOD); PEG-Glu (OBzl) -G4: δ 2.19 (br, Hc), 2.39 (br, He),
2.58 (br, Hd), 3.06 (br, Ha, Hb, Hf), 3.99 (br, Hg), 1.63, 1.84 (br, Hh), 1.98 (br, Hi), 4.41 (s, Hj), 7.20 (s, Hk), 3.16 (s,OC H 3 ), 3.45 (m, C H 2 C H 2 O). 2.58 (br, Hd), 3.06 (br, Ha, Hb, Hf), 3.99 (br, Hg), 1.63, 1.84 (br, Hh), 1.98 (br, Hi), 4.41 (s, Hj), 7.20 ( s, Hk), 3.16 (s , OC H 3), 3.45 (m, C H 2 C H 2 O).

(1-1)〜(1-4)の反応のスキームを、図1(a)に示す。 (1-1) to the scheme of reaction (1-4), shown in Figure 1 (a).

(1-5)ヒドラジド基を有するPEG-グルタミン酸結合PAMAMデンドリマーの合成 (1-4)で合成したPEG-Glu(OBzl)-PAMAMデンドリマー(158μmol, 259.5mg)を、蒸留したDMF (1.5ml) に溶解し、ヒドラジン1水和物 (5.03mmol, 244.2μl、和光純薬工業) を加え、N 2雰囲気下35℃で4日間反応させた。 (1-5) The synthesized PEG-Glu in the synthesis of PEG- glutamate binding PAMAM dendrimer having a hydrazide group (1-4) (OBzl) -PAMAM dendrimer (158μmol, 259.5mg), in distilled DMF (1.5 ml) dissolved, hydrazine monohydrate (5.03mmol, 244.2μl, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added and allowed to react for 4 days under N 2 atmosphere at 35 ° C.. その後、反応混合物にメタノール(2ml)を加え、Sephadex LH-20カラム(溶離液:メタノール)により精製し、真空乾燥して、ヒドラジド基を有するPEG-Glu(NH-NH 2 )-PAMAMデンドリマーを得た。 Thereafter, methanol (2 ml) was added to the reaction mixture, Sephadex LH-20 column (eluent: methanol) to give to give dried under vacuum, the PEG-Glu (NH-NH 2 ) -PAMAM dendrimer with hydrazide groups It was.
1 H NMR (400MHz, D 2 O) ; PEG-Glu(NH-NH 2 )-PAMAM: δ 2.32 (br, Hc), 2.59 (br, He), 1 H NMR (400MHz, D 2 O); PEG-Glu (NH-NH 2) -PAMAM: δ 2.32 (br, Hc), 2.59 (br, He),
2.76 (br, Hd), 3.18 (br, Ha, Hb, Hf), 4.06 (br, Hg), 1.74, 1.94 (br, Hh), 2.16 (br, Hi), 3.22 (s,OC H 3 ), 3.55 (m, C H 2 C H 2 O). 2.76 (br, Hd), 3.18 (br, Ha, Hb, Hf), 4.06 (br, Hg), 1.74, 1.94 (br, Hh), 2.16 (br, Hi), 3.22 (s, OC H 3), 3.55 (m, C H 2 C H 2 O).

(1-6)ヒドラゾン結合を介して薬物(アドリアマイシン)と結合したPEG修飾PAMAMデンドリマーの合成 (1-5)で合成したPEG-Glu(NH-NH 2 )-PAMAMデンドリマー(0.487μmol, 80.0mg)をメタノール(9.67ml)に溶解し、アドリアマイシン塩酸塩(ADR・HCl、協和発酵工業)(97.4μmol, 56.5mg)及びCH 3 COOH(884μl)を加え、N 2雰囲気下に室温で3日間反応させた。 (1-6) a drug via a hydrazone bond (adriamycin) and bound PEG-modified PAMAM dendrimer PEG-Glu was synthesized in (1-5) of (NH-NH 2) -PAMAM dendrimer (0.487μmol, 80.0mg) was dissolved in methanol (9.67ml), adriamycin hydrochloride (ADR · HCl, Kyowa Hakko Kogyo) (97.4μmol, 56.5mg) and CH 3 COOH and (884μl) was added, allowed to react for 3 days at room temperature under N 2 atmosphere It was. その後、反応混合物にメタノール(5ml)を加え、Sephadex LH-20カラム(溶離液:メタノール)により精製し、さらに、蒸留水を0.01M NaOH水溶液でpH8.0に調整した水溶液中で6時間透析して、凍結乾燥して、ADRと結合したPAMAMデンドリマー(PEG-PAMAM-N-ADR)を得た。 Then, methanol (5ml) was added to the reaction mixture, Sephadex LH-20 column (eluent: methanol) to give further distilled water in an aqueous solution adjusted to pH8.0 with 0.01 M NaOH aqueous solution was dialyzed 6 hours Te, and lyophilized to give the PAMAM dendrimer conjugated with ADR (PEG-PAMAM-N-ADR). デンドリマー:ADRのモル比は、1:200であった。 Dendrimers: The molar ratio of ADR was 1: 200. 収量は117.9mgであった。 The yield was 117.9mg.

また、この合成は、PEG-Glu(NH-NH 2 )-PAMAMデンドリマーに対するADR・HClのモル比を変動させて行った。 Also, the synthesis was conducted by varying the molar ratio of the ADR · HCl for PEG-Glu (NH-NH 2 ) -PAMAM dendrimer. 上記以外のモル比としてはPEG-Glu(NH-NH 2 )-PAMAMデンドリマー(0.606μmol, 99.4mg)に対して、ADR・HCl (24.2μmol, 14.05mg)、又はPEG-Glu(NH-NH 2 )-PAMAMデンドリマー(1.032μmol, 169.4mg)に対して、ADR・HCl (0.103μmol, 60.9mg)で行った。 The molar ratio other than the PEG-Glu (NH-NH 2 ) -PAMAM dendrimer (0.606μmol, 99.4mg) with respect to, ADR · HCl (24.2μmol, 14.05mg ), or PEG-Glu (NH-NH 2 ) -PAMAM dendrimer (1.032μmol, relative 169.4mg), were performed in ADR · HCl (0.103μmol, 60.9mg). すなわち、デンドリマー:ADRのモル比は、1:40及び1:100であった。 In other words, the dendrimer molar ratio of ADR is 1: 40 and 1: was 100. 収量は、それぞれ86.4mg、165.9mgであった。 The yield, respectively 86.4 mg, was 165.9Mg.

(1-5)及び(1-6)の反応のスキームを、図1(b)に示す。 (1-5) and the scheme of reaction (1-6), shown in FIG. 1 (b).

(2)ADRと結合したPEG修飾PAMAMデンドリマーを保持するコラーゲン組成物の製造 塩化カルシウム二水和物(26.8mg)、塩化マグネシウム六水和物(23.5mg)、塩化カリウム(40.43mg)、塩化ナトリウム(639.70mg)、リン酸二水素ナトリウム二水和物(14.05mg)を、蒸留水(10ml)に溶解し、10倍濃度の媒体を調製した。 (2) ADR conjugated with PEG-modified PAMAM dendrimer prepared calcium chloride dihydrate collagen compositions for holding (26.8 mg), magnesium chloride hexahydrate (23.5 mg), potassium chloride (40.43mg), sodium chloride (639.70mg), sodium dihydrogen phosphate dihydrate (14.05mg), was dissolved in distilled water (10 ml), was prepared medium 10-fold concentration. 炭酸水素ナトリウム(219.7mg)、HEPES(477.12mg)を、0.05Nに調整したNaOH溶液10mlに溶解して、再構成液を調製した。 Sodium bicarbonate (219.7mg), HEPES and (477.12mg), was dissolved in NaOH solution 10ml was adjusted to 0.05 N, and the reconstituted solution is prepared. 氷冷下で、エッペンドルフチューブにI型コラーゲン(200μl、Cellmatrix Type IA、新田ゼラチン)、IV型コラーゲン(200μl、Cellmatrix Type IV、新田ゼラチン)、10倍濃度媒体(50μl)、再構成液(50μl)をこの順に加え、10mMに調製したADR溶液(対照)、又はデンドリマー:ADRのモル比1:200で反応させて(1-6)で合成した第4世代のPEG修飾PAMAMデンドリマー(PEG-PAMAM-N-ADR) (10μl) を混合したのち、37℃で10分間静置した。 Under ice-cooling, I type collagen in an Eppendorf tube (200 [mu] l, Cellmatrix Type IA, Nitta Gelatin), IV collagen (200 [mu] l, Cellmatrix Type IV, Nitta Gelatin), 10-fold concentration medium (50 [mu] l), reconstituting liquid ( adding 50 [mu] l) in this order, ADR solution prepared in 10 mM (control), or dendrimer: ADR molar ratio 1: 200 was reacted in the fourth generation synthesized in (1-6) PEG-modified PAMAM dendrimer (PEG- PAMAM-N-ADR) (were mixed with 10 [mu] l), and allowed to stand for 10 minutes at 37 ° C.. このようにして、PEG-PAMAM-N-ADRを保持するコラーゲンをゲルの形で得た。 In this way, the collagen retains the PEG-PAMAM-N-ADR was obtained in the form of a gel.

(3)特徴決定(3-1-1)デンドリマー当たりに結合したADR数の評価 (3) Evaluation of characteristics determination (3-1-1) number ADR bound per dendrimer
3種類のデンドリマー:ADR比で(1-6)で合成したPEG-PAMAM-N-ADRに蒸留水を加えて溶解し、488nmの吸光度をV-520型 紫外・可視分光光度計(日本分光)を用いて測定することによって、デンドリマーあたりに結合したADRの量を評価した。 Three dendrimer: In ADR ratio (1-6) synthesized PEG-PAMAM-N-ADR was added with distilled water to dissolve, the absorbance of 488 nm V-520 type UV-visible spectrophotometer (JASCO) by measuring it was used to assess the amount of ADR bound per dendrimer. 488nmにおけるADRのモル吸光係数εを、1.14×10 4 lmol -1 cm -1 (λ=488nm,蒸留水)とした。 The molar extinction coefficient of ADR at 488nm ε, 1.14 × 10 4 lmol -1 cm -1 (λ = 488nm, distilled water) was.

また、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によっても、デンドリマーあたりに結合したADR量を評価した。 Further, by high performance liquid chromatography (HPLC), were evaluated amount ADR bound per dendrimer. μ-Bondasphere, SMC4300カラム、PU-2089 plus Quanternary Gradient Pump(JASCO)、UV-2075 plus lntelligent UV/VIS Detector(JASCO)を用い、流速1.0ml/分で1%酢酸水溶液を溶離液として、グラジエントをアセトニトリル15%〜85%で30分、又は15%〜100%で50分かけて行った。 μ-Bondasphere, SMC4300 column, PU-2089 plus Quanternary Gradient Pump (JASCO), using a UV-2075 plus lntelligent UV / VIS Detector (JASCO), 1% aqueous acetic acid at a flow rate of 1.0 ml / min as an eluent, a gradient 30 min 15% to 85% acetonitrile, or was done over 50 minutes at 15% to 100%.
生成物をpH7.4のリン酸緩衝液、pH1.0のHCl水溶液に溶解し、FP-6200型蛍光光度計(日本分光)を用いて、励起波長471nmにおける蛍光スペクトルと、その極大波長における蛍光強度の経時変化を測定した。 Phosphate buffer product pH 7.4, was dissolved in aqueous HCl pH 1.0, using FP-6200 type fluorometer (JASCO), and a fluorescence spectrum at an excitation wavelength of 471 nm, the fluorescence at the maximum wavelength the time course of the intensity measured.

(3-1-2)結果 吸光度測定により、デンドリマー:ADRのモル比が1:40、1:100及び1:200の場合に、デンドリマー当たりに結合したADR分子の数は、それぞれ19.6、37.7及び33.2であった。 (3-1-2) The results absorbance measurement, dendrimer molar ratio of ADR is 1: 40, 1: 100 and 1: in the case of 200, the number of ADR molecules bound per dendrimer, respectively 19.6,37.7 and It was 33.2.
デンドリマー当たりの末端アミノ基の数は、64であるので、デンドリマー:ADRの比を1:100及び1:200として反応させた場合は、デンドリマーの末端基の約半数以上にADRを結合できたことがわかる。 The number of terminal amino groups per dendrimer, because it is 64, dendrimer: the ratio of the ADR 1: 100 and 1: is formed by reaction of 200, that can be combined ADR than about half of the terminal groups of the dendrimer It is seen.
この結果は、HPLCによる結果とも一致した。 This result was consistent with the results by HPLC.

(3-2-1)ADRと結合したデンドリマーからのADRの放出 デンドリマー:ADRのモル比1:200で反応させて(1-6)で合成したPEG-PAMAM-N-ADR又はADRを、塩化ナトリウム150mMを含む10mM リン酸水素二ナトリウム緩衝液中でpH 7.4又は5.5で、37℃にて透析を行った。 (3-2-1) ADR of ADR from bound dendrimers with release dendrimer molar ratio of ADR 1: 200 in reacted synthesized the PEG-PAMAM-N-ADR or ADR in (1-6), chloride in pH 7.4 or 5.5 with 10mM disodium hydrogen phosphate buffer containing sodium 150 mM, dialysis was performed at 37 ° C.. なお、pH 5.5は、薬物が取り込まれる細胞のエンドソーム内のpHとほぼ同じであると考えられている。 Incidentally, pH 5.5 is considered to be substantially the same as the pH in the endosomes of a cell which drug is incorporated.

(3-2-2)結果 結果を、図2に示す。 (3-2-2) Results The results, shown in Figure 2. この条件において、ADR単独では、速やかに透析膜内部から膜の外に放出された。 In this condition, the ADR alone, released from the interior quickly dialysis membrane to the outside of the membrane. 一方、ヒドラゾン結合によってデンドリマーに結合したADRは、pH 7.4では20%以下しか透析膜の外に放出されなかったが、pH 5.5では24時間後において80%以上のADRが外相に放出された。 Meanwhile, ADR bound to the dendrimer by a hydrazone bond is at pH 7.4 only 20% or less has not been released to the outside of the dialysis membrane, 80% of ADR at 24 hours after the pH 5.5 was released external phase. このことから、pH 7.4ではADRはデンドリマーに安定に結合しているため、放出は起こらないが、pH 5.5ではヒドラゾン結合が解裂してデンドリマーと分離したADRが透析膜を通過して膜の外に放出されたと考えられる。 Therefore, since the pH 7.4 ADR is stably bound to the dendrimer, but release does not occur, outside the membrane ADR that at pH 5.5 hydrazone bond is separated from the dendrimer and cleaved to pass through the dialysis membrane It is considered to have been released into the.

(3-3-1)コラーゲンへのADRの保持量 I型コラーゲンとIV型コラーゲンとの量比を種々変更して(2)に記載するようにして得られたPEG-PAMAM-N-ADRを埋包するコラーゲン又は対照のADR保持コラーゲンゲルを、150mM 塩化ナトリウムを含む10mM リン酸水素二ナトリウム緩衝液(pH 7.4) 500μlで洗浄した。 (3-3-1) a PEG-PAMAM-N-ADR obtained as described the quantitative ratio between the holding amount of type I collagen and type IV collagen and various modifications (2) of ADR to collagen the embedding is collagen or control ADR holding collagen gel, and washed with 10mM disodium hydrogen phosphate buffer (pH 7.4) 500 [mu] l containing 150mM sodium chloride. さらに、700μlのリン酸水素二ナトリウム緩衝液を加え、37℃で静置した。 Furthermore, addition of disodium hydrogen phosphate buffer 700 [mu] l, and allowed to stand at 37 ° C.. 溶液を60μl採取し、そこにHCl溶液(pH1.0)を240μl加えて1時間放置し、溶液中のADRの量(すなわち、放出されたADRの量)を、FP6200型蛍光光度計(日本分光)を用いて、励起波長471nm及び蛍光波長 554nmでADRの蛍光強度を測定することにより、測定した。 The solution was 60μl taken, there was left by adding 240μl of HCl solution (pH 1.0) 1 hour, the amount of ADR in the solution (i.e., the amount of released ADR) and, FP6200 type fluorometer (manufactured by JASCO ) using, by measuring the fluorescence intensity of ADR at an excitation wavelength of 471nm and emission wavelength 554 nm, was measured. 最初にコラーゲン中に導入したADRの量を100%として、コラーゲン中に保持されたままのADRの割合を算出した。 First the amount of ADR introduced into collagen as 100%, was calculated the rate of ADR which remains held in the collagen.

(3-3-2)結果 結果を図3に示す。 (3-3-2) Results The results are shown in Figure 3. この結果から、IV型コラーゲンの量を調節して、コラーゲンゲルからのPEG-PAMAM-N-ADRの放出を抑えることができることがわかる。 From this result, by adjusting the amount of type IV collagen, it can be seen that it is possible to suppress the release of PEG-PAMAM-N-ADR from collagen gel.

(3-4-1)デンドリマーに結合したADRのMDA-MB-231細胞、MCF-7細胞に対する細胞毒性 ヒト乳ガン由来の転移能を有する細胞であるMDA-MB-231細胞、及び転移能を有さない細胞であるMCF-7細胞を、24穴ディッシュに1穴当たり1.0×10 4個播種し、10%胎児ウシ血清(FBS)含有ダルベッコ改変イーグル(DMEM)培地(500μl)中、37℃で24時間培養した。 (3-4-1) Yes MDA-MB-231 cells ADR bound to the dendrimer, MDA-MB-231 cells are cells with metastatic potential from cytotoxicity human breast cancer relative to MCF-7 cells, and metastatic potential MCF-7 cells is by no cells in seeded 1.0 × 10 4 cells per well in 24-well dishes, 10% fetal bovine serum (FBS) containing Dulbecco's modified Eagle's (DMEM) medium (500 [mu] l), at 37 ° C. and cultured for 24 hours. 所定の濃度のデンドリマーに結合したADR又はADRを含む10%FBS含有DMEM培地を、1ウェルあたり300μl細胞に加え、72時間インキュベーションした。 Containing 10% FBS DMEM medium containing ADR or ADR attached to dendrimer predetermined concentration, was added to 300μl cells per well and incubated for 72 hours. その後、PBSで2回洗浄し、新しい10%FBS含有DMEM培地(200μl)を加え、それぞれのウェルにMTT溶液 (10mg/ml PBS)を30μlずつ加え、3時間インキュベーションした。 Then washed twice with PBS, and the new 10% FBS-containing DMEM medium (200 [mu] l) was added, was added to each well MTT solution (10mg / ml PBS) by 30 [mu] l, was incubated for 3 hours. 次に、DMEMを除去して、0.1M HClを含むイソプロパノール(500μl)を加えた。 Then, by removing the DMEM, was added isopropanol (500 [mu] l) containing 0.1 M HCl. Wallac 1420 ARVOsx マルチプレートリーダー(パーキンエルマーライフサイエンス)を用いて、吸収波長490nmにおける吸光度を測定することにより、細胞の生存率を求めた。 Using Wallac 1420 ARVOsx multiplate reader (PerkinElmer Life Sciences), by measuring the absorbance at the absorption wavelength of 490 nm, was determined cell viability. ここで、ADRやデンドリマーを加えずに細胞を培養した時の細胞数を100%とし、吸光度測定の直前に細胞にMTT溶液を加え、0.1M HClを含むイソプロパノールを加えたものをブランクとした。 Here, the number of cells when the cells were cultured without added ADR or dendrimers as 100%, the MTT solution was added to the cells just prior to absorbance measurement, it was blank plus isopropanol containing 0.1 M HCl.

(3-4-2)結果 結果を、図4に示す。 (3-4-2) Results The results, shown in Figure 4. 図4では、(a)MDA-MB-231細胞に対するADR単独(■)及びPEG-PAMAM-N-ADR(◆)の影響、及び(b)MCF-7細胞に対するADR単独(■)及びPEG-PAMAM-N-ADR(◆)の影響を示す。 In Figure 4, (a) Effect of ADR alone against MDA-MB-231 cells (■) and PEG-PAMAM-N-ADR (◆), and (b) ADR alone against MCF-7 cells (■) and PEG- It shows the effect of PAMAM-N-ADR (◆).
これらの結果に基づいて、細胞の成長を50%阻害する物質の濃度であるIC 50を求めた。 Based on these results, it was determined and IC 50 is the concentration of a substance that inhibits the growth of cells by 50%. ADR単独では、MDA-MB-231細胞及びMCF-7細胞に対してIC 50がそれぞれ0.2μM及び0.2μMであるのに対して、デンドリマーに結合したADRでは、上記の各細胞に対してそれぞれ1.0μM及び1.0μMであった。 The ADR alone, whereas IC 50 of respectively 0.2μM and 0.2μM against MDA-MB-231 cells and MCF-7 cells, the ADR bound to the dendrimer, respectively for each cell of the 1.0 It was μM and 1.0μM. よって、デンドリマーに結合することにより、ADRの細胞毒性が低下したことがわかる。 Thus, by binding to the dendrimers, the cytotoxicity of ADR is seen that the lowered.
また、これらの薬物による細胞毒性は、細胞の転移性の違いには関係しないこともわかる。 Furthermore, cytotoxicity of these drugs, it can also be seen that the not related to cell metastatic difference.

(3-5-1)3次元培養条件におけるPEG-PAMAM-N-ADRを保持するコラーゲンの細胞毒性 氷冷下において、48穴ディッシュ(Nunc社製)にI型コラーゲン(60μl)、IV型コラーゲン(60μl)、10倍濃度のDMEM(15μl)、(2)で調製した再構成液(15μl) をこの順で混合し、さらに所定の濃度となるようにADR単独(対照)、又は(1-6)で合成したPEG-PAMAM-N-ADRを混合した。 (3-5-1) in cytotoxicity under ice cooling collagen that holds the PEG-PAMAM-N-ADR in 3D culture conditions, I collagen in 48-well dishes (Nunc, Inc.) (60 [mu] l), IV collagen (60 [mu] l), 10-fold concentration of DMEM (15 [mu] l), (2) reconstituted solution prepared in a mixture of (15 [mu] l) in this order, ADR alone (control) as further a predetermined concentration, or (1- It was mixed synthesized PEG-PAMAM-N-ADR 6). この溶液に、MDA-MB-231細胞又はMCF-7細胞を加えて攪拌し、細胞が1穴あたり2.0×10 4個となるように、混合した溶液150μlを48穴ディッシュの各ウェルに加えて、37℃で1時間静置した。 To this solution was stirred with MDA-MB-231 cells or MCF-7 cells, the cells so that 2.0 × 10 4 cells per well, the mixed solution 150μl was added to each well of a 48-well dishes , it was allowed to stand for 1 hour at 37 ℃. その後、DMEM 100μlを加え、24時間培養した。 Then added DMEM 100μl, were cultured for 24 hours. その後、新しい10%FBS含有DMEM培地(35μl)を加え、それぞれのウェルに3-(4,5-ジメチル-2-チアゾリル)-2,5-ジフェニル-2H-テトラゾリウムブロミド (MTT、和光純薬工業)溶液(10mg/ml PBS)を15μlずつ加えて、3時間インキュベーションした。 Thereafter, the new 10% FBS-containing DMEM medium (35 [mu] l) was added, to each well of 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl -2H- tetrazolium bromide (MTT, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, ) solution (10 mg / ml PBS) was added by 15 [mu] l, was incubated for 3 hours. 次に、DMEMを除去して、最終濃度が0.02%となるようにコラゲナーゼS-1(新田ゼラチン)を加え、1時間振とう機で振とうし、ゲルを溶解した。 Then, by removing the DMEM, to a final concentration of 0.02% collagenase S-1 (the Nitta Gelatin) was added, shaken for 1 hour shaker to dissolve the gel.
その後、0.1M HClを含むイソプロパノールを加え、Wallac 1420 ARVOsx マルチプレートリーダー(パーキンエルマーライフサイエンス)を用いて、吸収波長490nmにおける吸光度を測定することにより、細胞の生存率を求めた。 Then, it added isopropanol containing 0.1 M HCl, with Wallac 1420 ARVOsx multiplate reader (PerkinElmer Life Sciences), by measuring the absorbance at the absorption wavelength of 490 nm, was determined cell viability.
ここで、ADRやPEG-PAMAM-N-ADRを加えずに上記の手順に従って測定した細胞数を100%とした。 Here, the number of cells measured according to the procedure above without the addition of ADR and PEG-PAMAM-N-ADR was 100%. また、細胞を播種しない状態でゲルを作製し、最終濃度が0.02%となるようにコラゲナーゼS-1を加えて1時間振とう機で振とうし、ゲルを溶解した後、0.1M HClを含むイソプロパノールを加えたものをブランクとした。 Further, the cells to produce a gel with no seeded with a final concentration shaken for 1 hour shaker adding collagenase S-1 such that 0.02%, after dissolving the gel, containing 0.1 M HCl the plus isopropanol was blank.

(3-5-2)結果 結果を、図5に示す。 The (3-5-2) Results The results, shown in Figure 5. 図5では、(a)ADR単独を含むコラーゲンを用いた場合、及び(b)PEG-PAMAM-N-ADRを含むコラーゲンを用いた場合の細胞生存率を示す。 In Figure 5 shows cell viability in the case of using the collagen comprising (a) a case of using the collagen containing ADR alone, and (b) PEG-PAMAM-N-ADR.
ADRを単独で含むコラーゲンを用いた場合、ADR濃度の増加に伴いMDA-MB-231細胞の生存率が低下したが、MCF-7細胞の生存率も同様に低下する傾向がみられた。 When using collagen containing ADR alone, although survival of MDA-MB-231 cells with increasing ADR concentration is lowered, it tends to decrease as well survival of MCF-7 cells was observed.
一方、デンドリマーと結合したADRを含むコラーゲンを用いた場合、MDA-MB-231細胞の生存率は、ADR濃度の増加に伴い低下したが、MCF-7細胞の生存率は大きくは低下しなかった。 On the other hand, when a collagen containing ADR bound to the dendrimer, viability of MDA-MB-231 cells, was reduced with increasing ADR concentration, viability of MCF-7 cells was not decreased significantly .
これらの結果から、転移能を有する細胞が転移する際に分泌するMMPによりコラーゲンが分解され、PEG-PAMAM-N-ADRが放出されて、転移能を有する細胞に対して細胞毒性を示したと考えられる。 These results collagen is degraded by MMP that cells with metastatic potential is secreted during the transition, is released PEG-PAMAM-N-ADR, believed it showed cytotoxicity against cells with metastatic potential It is.
また、ADRを単独で含むコラーゲンは、ADR濃度の増加に伴って、転移能を持たないMCF-7細胞への毒性も高まった。 The collagen containing ADR alone, with increasing ADR concentrations also increased toxicity to MCF-7 cells without metastatic potential. これは、ADRが低分子であることから、コラーゲンゲルからのADRの拡散が生じたことが示唆される。 This, ADR is because it is low molecule, suggesting that diffusion of ADR from the collagen gel occurs. 一方、ADR結合デンドリマーを含むコラーゲンは、転移能を持たないMCF-7細胞への毒性をあまり示さなかったことから、ADRを高分子量のデンドリマーに結合させることにより、コラーゲンゲルからの拡散が抑制されたと考えられる。 Meanwhile, collagen containing ADR binding dendrimers, since it was not toxic to MCF-7 cells without metastatic potential too, by binding to the dendrimers of high molecular weight the ADR, diffusion from the collagen gel is suppressed It is considered to have.

実施例2 コラーゲンペプチドで修飾されたデンドリマーと複合したアドリアマイシンを含むコラーゲンゲル医薬組成物 本実施例では、薬物としてADRを用い、生体適合性高分子化合物としてのデンドリマーとして、実施例1で用いたのと同じ市販のPAMAMデンドリマーに修飾物質としてのコラーゲンペプチドを付加した化合物を用いた。 The In this embodiment the collagen gel pharmaceutical composition comprising the adriamycin complexed with modified dendrimer in Example 2 Collagen peptide used ADR as a drug, as a dendrimer as a biocompatible polymer compound used in Example 1 the compound obtained by adding collagen peptides as modulators to the same commercial PAMAM dendrimer was used.
(1-1)コラーゲンペプチドのアセチル化(AcCP) (1-1) acetylation of the collagen peptide (AcCP)
コラーゲンを酵素で分解して得られたコラーゲンペプチド(和光純薬製、カタログ番号035-15801、平均分子量2000)1.0050g(0.503mmol)を蒸留水5mlに溶解させた。 Collagen peptides obtained by decomposing collagen enzyme (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Catalog No. 035-15801, average molecular weight 2000) was dissolved 1.0050g of (0.503 mmol) of distilled water 5 ml. 氷冷下で1N NaOH水溶液を0.5ml加えてアルカリ性にした後、1N NaOH水溶液と無水酢酸4.75mlを同時に加えた。 After the aqueous 1N NaOH solution under cooling with ice alkaline by addition 0.5 ml, was added an aqueous 1N NaOH solution and acetic anhydride 4.75ml simultaneously. その後、1N NaOH水溶液を加えて溶液をアルカリ性にした後に、溶液を12時間攪拌した。 Then, after the solution alkaline by addition of aqueous 1N NaOH solution and the solution was stirred for 12 hours. 反応溶液に4N H 2 SO 4を加えてpHを3にした後に、蒸留水を溶離液としてSephadex LH-20(GEヘルスケアバイオサイエンス社製、溶離液、水)を用いて精製した。 After the pH to 3 by addition of 4N H 2 SO 4 to the reaction solution, Sephadex LH-20 using distilled water as eluent (GE Healthcare Bioscience, eluent water) and purified using.
精製後の溶液を凍結乾燥して、アセチル化されたコラーゲンペプチド(AcCP)を得た。 Solution after purification and freeze-dried to afford the acetylated collagen peptide (AcCP).
フルオレスカミンを用いたアミンの定量により、アセチル化が完全に進行していることを確認した。 The amine quantification of using fluorescamine, it was confirmed that the acetylation is completely proceeded. 収量:0.7794g、収率:76.1% Yield: 0.7794g, yield: 76.1%

(1-2)グルタミン酸結合PAMAMデンドリマーの合成 実施例1の(1-2)と同様にして、Bocグルタミン酸結合PAMAMデンドリマー(Boc-Glu(OBzl)結合PAMAMデンドリマー)を合成した。 (1-2) In the same manner as the glutamate binding PAMAM dendrimer of Example 1 (1-2) was synthesized Boc glutamate binding PAMAM dendrimer (Boc-Glu (OBzl) bonds PAMAM dendrimers).
さらに、実施例1の(1-3)と同様にして、グルタミン酸結合PAMAMデンドリマー(Glu(OBzl)結合PAMAMデンドリマー)を得た。 Further, in the same manner as in Example 1 (1-3) to give the glutamate binding PAMAM dendrimer (Glu (OBzl) bonds PAMAM dendrimers).

(1-3)グルタミン酸結合デンドリマーへのコラーゲンペプチドの結合 (1-2)で製造したGlu(OBzl)結合PAMAMデンドリマー0.212g(5.97μmol)を、蒸留水3mlに溶解した。 (1-3) glutamate binding Glu (OBzl) prepared in binding (1-2) of collagen peptide to the dendrimer bound PAMAM dendrimers 0.212g of (5.97Myumol), was dissolved in distilled water 3 ml. そこに、(1-1)で製造したAcCP 0.8796g(0.431mmol)、及び4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド(DMT-MM) 0.140g(0.382mmol)を順に加え、40℃のオイルバス中で3日攪拌した。 There, (1-1) AcCP 0.8796g (0.431mmol) prepared in, and 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl) -4-methyl morpholinium chloride ( added DMT-MM) 0.140g (0.382mmol) in order, and stirred for 3 days at 40 ° C. in an oil bath. 反応溶液を回収し、蒸留水に対して透析(MWCO:2000)を1日行い、凍結乾燥して、コラーゲンペプチドが結合したグルタミン酸結合PAMAMデンドリマー(以下、「AcCP-Glu(OBzl)-PAMAMデンドリマー」という)を得た。 The reaction solution was collected, dialyzed against distilled water (MWCO: 2000) was carried out 1 day, and lyophilized to glutamate binding PAMAM dendrimer collagen peptide is bound (hereinafter, "AcCP-Glu (OBzl) -PAMAM dendrimer" to obtain a) that.
フルオレスカミンによるアミンの定量により、AcCPの反応率を求めたところ、デンドリマー1分子当たり53.2個の末端にAcCPが結合したことがわかった。 Quantitation of amines by fluorescamine, was determined the reaction rate of AcCP, it was found that AcCP is bonded to 53.2 termini per dendrimer molecule.
収量:1.05g 収率:96.2% Yield: 1.05 g Yield: 96.2%

(1-4)残存アミノ基のアセチル化 (1-4) acetylation of the remaining amino groups
AcCP-Glu(OBzl)-PAMAMデンドリマー1.05g(7.66μmol)を蒸留水5mlに溶解させ、無水酢酸4.48mlを加え、40℃のオイルバス中で12時間攪拌した。 AcCP-Glu (OBzl) -PAMAM dendrimer 1.05g of (7.66μmol) was dissolved in distilled water 5 ml, was added acetic anhydride 4.48Ml, and stirred for 12 hours at 40 ° C. in an oil bath. その後、蒸留水に対して透析(MWCO:2000)を1日行い、凍結乾燥して、AcCP-Glu(OBzl)-PAMAMデンドリマーのデンドリマー部分のAcCPと結合していないアミノ基をアセチル化した。 Thereafter, dialyzed against distilled water (MWCO: 2000) was carried out 1 day and lyophilized, the AcCP-Glu (OBzl) -PAMAM dendrimer amino groups not bound to AcCP dendrimers portion of acetylated. 収量:816.7mg, 収率:77.8% Yield: 816.7mg, yield: 77.8%
フルオレスカミンによるアミンの定量により、AcCP-Glu(OBzl)-PAMAMデンドリマーに残存する1級アミノ基がないことを確認した。 Quantitation of amines by fluorescamine, it was confirmed that there are no primary amino groups remaining AcCP-Glu (OBzl) -PAMAM dendrimer.

(1-5)ヒドラジド基を有するAcCP結合PAMAMデンドリマーの合成 (1-4)で処理したAcCP-Glu(OBzl)-PAMAMデンドリマーを、実施例1(1-5)と同様の手順でヒドラジンと反応させて、ヒドラジド基を有するコラーゲンペプチド結合PAMAMデンドリマー(AcCP-Glu(NHNH2)-PAMAMデンドリマー)を得た。 (1-5) a AcCP-Glu (OBzl) -PAMAM dendrimers treated with synthesis of AcCP binding PAMAM dendrimer (1-4) having a hydrazide group, a hydrazine in the same manner as in Example 1 (1-5) Reaction by to give collagen peptide bonds PAMAM dendrimer with hydrazide groups (AcCP-Glu (NHNH2) -PAMAM dendrimer).

(1-6)ヒドラゾン結合を介して薬物(アドリアマイシン)と結合したコラーゲンペプチド結合PAMAMデンドリマーの合成 (1-5)で得られたAcCP-Glu(NHNH2)-PAMAMデンドリマーを、実施例1(1-6)と同様の手順で処理して、アドリアマイシンと結合したPAMAMデンドリマー(AcCP-PAMAM-N-ADR)を得た。 (1-6) a AcCP-Glu (NHNH2) -PAMAM dendrimer obtained in via the hydrazone bond drug (adriamycin) linked collagen synthesis peptide bond PAMAM dendrimer (1-5), Example 1 (1- 6) was treated in the same manner as to give PAMAM dendrimer conjugated with adriamycin (AcCP-PAMAM-N-ADR). 反応させたデンドリマー:ADRのモル比は、1:50であった。 It reacted dendrimer molar ratio of ADR was 1: 50.

上記の(1-1)、(1-3)、(1-4)及び(1-5)で得られた各物質の1 H-NMRスペクトル(溶媒:D 2 O、400MHz)を、それぞれ図6の(a)、(b)、(c)及び(d)に示す。 Above (1-1), (1-3), (1-4) and (1-5) 1 H-NMR spectrum of each material obtained in (solvent: D 2 O, 400 MHz) a respective view of 6 (a), it is shown in (b), (c) and (d).
また、(1-1)〜(1-6)のスキームを、図7に示す。 Moreover, the scheme (1-1) to (1-6), shown in FIG.

(2)ADRと結合したAcCP修飾PAMAMデンドリマーを保持するコラーゲン組成物の製造 実施例1(2)と同様の手順に従って、AcCP-PAMAM-N-ADRを保持するコラーゲンをゲルの形で得た。 (2) Following a procedure analogous to Preparation Example 1 (2) of the collagen composition to retain the AcCP modified PAMAM dendrimers conjugated with ADR, collagen to hold the AcCP-PAMAM-N-ADR was obtained in the form of a gel.

(3)特徴決定(3-1)デンドリマーあたりに結合したADR数の評価 実施例1(3-1-1)と同様の手順に従って、(1-6)で合成したAcCP-PAMAM-N-ADRのデンドリマーあたりに結合したADR分子の数を調べたところ、26であった。 (3) Following a procedure analogous to characterization (3-1) Evaluation Example number ADR bound per dendrimer 1 (3-1-1), AcCP-PAMAM-N-ADR synthesized in (1-6) Examination of the number of ADR molecules bound per dendrimer, was 26.

(3-2)コラーゲンペプチドの三重ヘリックス形成性 円偏光二色性(CD)スペクトル測定により、(1-1)で製造したAcCP及び(1-5)で製造したAcCP-Glu(NHNH2)-PAMAMデンドリマーのコラーゲンペプチドの三重ヘリックス形成性を調べた。 (3-2) by a triple-helix forming circular dichroism (CD) spectroscopy of collagen peptide, AcCP-Glu (NHNH2) prepared in (1-1) AcCP and prepared in (1-5) -PAMAM It was examined triple helix formation of the collagen peptide dendrimers.
<測定条件> <Measurement conditions>
サンプル濃度:0.04mg/ml-H 2 O Sample Concentration: 0.04mg / ml-H 2 O
測定装置:JASCO V-820 Spectropolarimeter Measurement device: JASCO V-820 Spectropolarimeter
測定温度:20℃ Measurement temperature: 20 ℃
得られたスペクトルを、図8に示す。 The resulting spectrum is shown in FIG.

(3-3)ADRと結合したデンドリマーからのADRの放出 実施例1(3-2-1)と同様の手順に従って、(1-6)で合成したAcCP-PAMAM-N-ADRの、pH 7.4又は5.5でのADRの放出について調べた。 (3-3) Following a procedure analogous to release embodiment of ADR from the dendrimer bound to ADR 1 (3-2-1), the AcCP-PAMAM-N-ADR synthesized in (1-6), pH 7.4 or it was investigated for the release of ADR in 5.5.
結果を、図9に示す。 The results, shown in Figure 9.
この結果から、AcCP-PAMAM-N-ADRも、pH 7.4の条件に比較して、細胞のエンドソーム内のpHとほぼ等しいpH 5.5において、ADRを放出しやすいことがわかる。 This result, AcCP-PAMAM-N-ADR also compared to the conditions of pH 7.4, at approximately equal pH 5.5 and pH in the endosomes of a cell, it can be seen that tends to release ADR.

(3-4)デンドリマーに結合したADRのMDA-MB-231細胞、MCF-7細胞に対する細胞毒性 (3-4) MDA-MB-231 cells ADR bound to the dendrimer, cytotoxicity against MCF-7 cells
24穴ディッシュの1穴あたりに播種した細胞数を20,000細胞とし、所定の濃度のデンドリマーに結合したADR又はADRを含む10%FBS含有DMEM培地を、1ウェルあたり300μl細胞に加えた後に24時間インキュベーションした以外は、実施例1(3-4-1)と同様の手順に従って、MDA-MB-231細胞、MCF-7細胞に対する細胞毒性を調べた。 The number of cells seeded per well in 24-well dishes and 20,000 cells, with 10% FBS-containing DMEM medium containing ADR or ADR attached to dendrimer predetermined concentration, 24 hours of incubation after addition to 300μl per well cell except that the can following the same procedure as in example 1 (3-4-1) were examined MDA-MB-231 cells, cytotoxicity against MCF-7 cells.
結果を、図10に示す。 The results, shown in Figure 10.
図10では、(a)MCF-7細胞に対するADR単独(◆)、コラーゲンペプチドを結合させていないADR結合デンドリマー(以下の実施例3を参照されたい)(●)及びAcCP-PAMAM-N-ADR(▲)の影響、並びに(b)MDA-MB-231細胞に対するADR単独(◆)、コラーゲンペプチドを結合させていないADR結合デンドリマー(●)及びAcCP-PAMAM-N-ADR(▲)の影響を示す。 In Figure 10, ADR alone for (a) MCF-7 cells (◆), (see the following examples 3) ADR binding dendrimers not bound collagen peptide (●) and AcCP-PAMAM-N-ADR (▲) effects, and (b) ADR against MDA-MB-231 cells alone (◆), the influence of ADR binding dendrimers not bound collagen peptide (●) and AcCP-PAMAM-N-ADR (▲) show.

図10の結果から、細胞の成長を50%阻害する物質の濃度であるIC 50を求めた。 From the results of FIG. 10 was determined and IC 50 is the concentration of a substance that inhibits the growth of cells by 50%. ADR単独では、MDA-MB-231細胞及びMCF-7細胞に対してIC 50がそれぞれ3μM及び30μMであるのに対して、AcCP-PAMAM-N-ADRでは、上記の各細胞に対してそれぞれ3μM及び3μM、コラーゲンペプチドが結合させていないADR結合デンドリマーでは、それぞれ100μM及び100μMであった。 The ADR alone, whereas IC 50 against MDA-MB-231 cells and MCF-7 cells are 3μM and 30μM, respectively, in AcCP-PAMAM-N-ADR, respectively for each cell of the 3μM and 3 [mu] M, the ADR binding dendrimers collagen peptide is not bound were 100μM and 100μM, respectively.

すなわち、コラーゲンペプチドを持たないADR結合デンドリマーではADRの細胞毒性が低下した。 That is, the cytotoxicity of ADR has decreased by ADR binding dendrimers without a collagen peptide. これはデンドリマー表面に疎水性の高いADRが集積し、水への溶解性が著しく低下したためであると考えられる。 This highly hydrophobic ADR is integrated to the dendrimer surface, solubility in water is considered to be because significantly decreased.
一方、コラーゲンペプチドを有するデンドリマーに結合した場合は、ADR単独と同程度か又はADRよりも高い細胞毒性が見られた。 On the other hand, when combined with dendrimers having collagen peptide, it was observed high cytotoxicity than ADR alone comparable or ADR. これは、高分子表面のコラーゲンペプチドによって、ADRの細胞との親和性が向上したためと考えられる。 This is the collagen peptide of the polymer surface, presumably because the improved affinity with the ADR cells. また、これらの薬物結合デンドリマーによる細胞毒性は、細胞の転移性の違いには関係しないこともわかる。 Furthermore, cytotoxicity of these drugs binding dendrimers, seen also not related to the cell metastatic difference.
一方、今回の条件ではADR単独の細胞毒性は細胞種の違いによって異なり、転移能が低いMCF-7細胞の細胞毒性の方が、転移能の高いMDA-MB-231細胞よりも低いことがわかった。 On the other hand, ADR alone cytotoxicity in this condition depends cell types differences towards the cytotoxicity of low metastatic potential MCF-7 cells, found that less than high transition ability MDA-MB-231 cells It was. これは薬剤耐性能が細胞間で異なったためと考えられる。 This may be because the drug-resistant capability is different between cells.

(3-5)AcCP-PAMAM-N-ADRを保持するコラーゲンの細胞毒性 実施例(3-5-1)と同様の手順に従って、AcCP-PAMAM-N-ADRを保持するコラーゲン組成物の細胞毒性を調べた。 (3-5) according AcCP-PAMAM-N-ADR of collagen to hold the cytotoxic Example (3-5-1) and the same procedure, the collagen composition to retain the AcCP-PAMAM-N-ADR cytotoxicity They were examined.
氷冷下において、実施例1(2)と同様のI型コラーゲン/IV型コラーゲン/10倍濃度のDMEM/再構成液を、2/2/0.5/0.5の体積比で混合してコラーゲン溶液を作製した。 Under ice cooling, the Example 1 (2) and DMEM / reconstitution solution similar type I collagen / IV Collagen / 10-fold concentration, mixed to a collagen solution at a volume ratio of 2/2 / 0.5 / 0.5 It was produced. ここに、ADR濃度が0.01μM、1μM、又は100μMとなるように、ADR単独(対照)、コラーゲンペプチドを結合させていないADR結合デンドリマー(以下の実施例3を参照されたい)、又は(1-6)で合成したAcCP-PAMAM-N-ADRを混合した。 Here, ADR concentration 0.01 [mu] M, 1 [mu] M, or such that 100 [mu] M, ADR alone (control), (see the following examples 3) ADR binding dendrimers not bound collagen peptide, or (1- It was mixed synthesized AcCP-PAMAM-N-ADR 6). この溶液を、100μl/ウェルとなるように48穴ディッシュに加え、37℃、5%CO 2で1時間インキュベートしてゲル化させた。 This solution was added to the 48 well dishes becomes 100 [mu] l / well, 37 ° C., 1 hour of incubation gelled with 5% CO 2.
その後、作製したゲル上に、20,000細胞/ウェルとなるように細胞のDMEM溶液を合計100μl加えた。 Then, on the gel thus produced, the cells DMEM was added a total of 100μl so that 20,000 cells / well.
24時間インキュベートした後に、各ウェルに15μl MTT溶液(10mg/ml PBS)を15μlずつ加えて、3時間インキュベーションした。 After incubation for 24 hours, the 15 [mu] l MTT solution (10mg / ml PBS) to each well was added in 15 [mu] l, was incubated for 3 hours. 次に、DMEMを除去して、最終濃度が0.02%となるようにコラゲナーゼS-1(新田ゼラチン)を加え、1時間350rpmで振とうし、ゲルを溶解した。 Then, by removing the DMEM, to a final concentration of 0.02% collagenase S-1 (the Nitta Gelatin) was added, shaken for 1 hour 350 rpm, to dissolve the gel.
その後、0.1NHCl含有イソプロパノールを500μl/ウェルとなるように加え、マルチプレートリーダーで490nmにおける吸光度を測定することにより、細胞の生存率を求めた。 Then added 0.1NHCl containing isopropanol so that 500 [mu] l / well, by measuring the absorbance at 490nm in a multi-plate reader to determine the cell viability.

結果を、図11に示す。 The results, shown in Figure 11. 図11では、(a)MCF-7細胞に対するADR単独(◆)、コラーゲンペプチドを結合させていないADR結合デンドリマー(●)及びAcCP-PAMAM-N-ADR(▲)をそれぞれ含むコラーゲンの影響、並びに(b)MDA-MB-231細胞に対するADR単独(◇)、コラーゲンペプチドを結合させていないADR結合デンドリマー(○)、及びAcCP-PAMAM-N-ADR(△)をそれぞれ含むコラーゲンの影響を示す。 In Figure 11, ADR alone for (a) MCF-7 cells (◆), ADR binding dendrimers not bound collagen peptide (●) and AcCP-PAMAM-N-ADR (▲) the effect of collagen containing respectively, and (b) ADR against MDA-MB-231 cells alone (◇), shows the influence of collagen including ADR binding dendrimers not bound collagen peptide (○), and AcCP-PAMAM-N-ADR and (△), respectively.

図11の結果から、ADR単独を用いた場合は、ADRの濃度が上昇するにつれ、転移能を有さないMCF-7細胞及び転移能を有するMDA-MB-231細胞のいずれに対しても、細胞毒性を示したが、コラーゲンペプチドを結合させたデンドリマーと結合したADRを保持するコラーゲンゲルを用いた場合、転移能を有する細胞に対してより特異的に細胞毒性の効果が及ぼされたことがわかる。 From the results of FIG. 11, in the case of using the ADR alone As the concentration of ADR increases, for any of MDA-MB-231 cells with MCF-7 cells and metastatic potential having no metastatic potential, showed cytotoxicity, in the case of using the collagen gel to hold the ADR bound to the dendrimer bound with collagen peptides, the effect of more specifically cytotoxic for cells with metastatic potential exerted Understand.
コラーゲンペプチドを結合させていないADR結合デンドリマーを用いた場合、いずれの細胞に対しても、コラーゲンペプチドを結合させたデンドリマーと結合したADRを用いた場合に比較して細胞毒性の効果が低くなっているが、これは、コラーゲンペプチドが結合していないADR結合デンドリマーでは、ADRがデンドリマー表面に露出し、水溶性が低下したために、培養液中で凝集したことが原因ではないかと推測される。 When using the ADR binding dendrimers not bound collagen peptides, to any of the cells, as compared with the case of using the ADR bound to the dendrimer conjugated with collagen peptides effect of cytotoxicity is lower are, but which in the ADR binding dendrimers collagen peptide is not bound, ADR is exposed to the dendrimer surface, for water-soluble drops, the aggregated is speculated that the cause in culture.

なお、コラーゲンペプチドを結合させていないADR結合デンドリマーは、以下の実施例3に記載するようにして合成した。 Incidentally, ADR binding dendrimers not bound collagen peptide was synthesized as described in Example 3 below.
実施例3 ADR結合デンドリマーの製造(1-1)グルタミン酸結合PAMAMデンドリマーの合成 実施例1の(1-2)と同様にして、Bocグルタミン酸結合PAMAMデンドリマー(Boc-Glu(OBzl)結合PAMAMデンドリマー)を合成した。 In the same manner as in Example 3 ADR coupling the production of dendrimer (1-1) Synthesis Example of glutamate binding PAMAM dendrimer 1 (1-2), Boc glutamate binding PAMAM dendrimer (Boc-Glu (OBzl) bonds PAMAM dendrimers) a synthesized.
さらに、実施例1の(1-3)と同様にして、グルタミン酸結合PAMAMデンドリマー(Glu(OBzl)結合PAMAMデンドリマー)を得た。 Further, in the same manner as in Example 1 (1-3) to give the glutamate binding PAMAM dendrimer (Glu (OBzl) bonds PAMAM dendrimers).

(1-2)末端アミノ基のアセチル化 グルタミン酸結合PAMAMデンドリマー(Glu(OBzl)結合PAMAMデンドリマー)0.503g(14.1μmol)を蒸留水5ml、無水酢酸8.48mlに溶解した。 (1-2) terminal acetylation glutamate binding of the amino group PAMAM dendrimer (Glu (OBzl) bonds PAMAM dendrimers) 0.503 g of (14.1Myumol) distilled water 5 ml, was dissolved in acetic anhydride 8.48Ml. 40℃オイルバス中で一晩攪拌し、蒸留水に対して透析(MWCO:2000)を1日行った。 And stirred overnight at 40 ℃ oil bath, dialyzed against distilled water (MWCO: 2000) was carried out for 1 day. その後、凍結乾燥して、PAMAMデンドリマーの末端アミノ基をアセチル化した。 Then it was freeze-dried, acetylated terminal amino group of PAMAM dendrimers. 収量:328.6mg 収率:60.8% Yield: 328.6Mg Yield: 60.8%

(1-3)ヒドラジド基を有するPAMAMデンドリマーの合成 (1-2)で処理した末端がアセチル化されたGlu(OBzl)結合PAMAMデンドリマーを、実施例1(1-5)と同様の手順でヒドラジンと反応させて、ヒドラジド基を有するPAMAMデンドリマー(Glu(NHNH2)-PAMAMデンドリマー)を得た。 (1-3) Glu (OBzl) bonds PAMAM dendrimers treated terminally acetylated in the synthesis of PAMAM dendrimers (1-2) having a hydrazide group, a hydrazine in the same manner as in Example 1 (1-5) It is reacted with to give PAMAM dendrimer (Glu (NHNH2) -PAMAM dendrimer) having a hydrazide group.

(1-4)ヒドラゾン結合を介して薬物(アドリアマイシン)と結合したPAMAMデンドリマーの合成 (1-3)で得られたGlu(NHNH2)-PAMAMデンドリマーを、実施例(1-6)と同様の手順で処理して、アドリアマイシンと結合したPAMAMデンドリマー(PAMAM-N-ADR)を得た。 (1-4) a Glu (NHNH2) -PAMAM dendrimer obtained in drug via a hydrazone bond synthesis of PAMAM dendrimers conjugated with (adriamycin) (1-3), the same procedure as Example (1-6) in processing to obtain a PAMAM dendrimer conjugated with adriamycin (PAMAM-N-ADR). 反応させたデンドリマー:ADRのモル比は、1:40であった。 It reacted dendrimer molar ratio of ADR was 1: 40.

上記の(1-1)、(1-2)及び(1-3)で得られた各物質の1 H-NMRスペクトルを、それぞれ図12の(a)、(b)及び(c)に示す。 Above (1-1), shown in (1-2) and the 1 H-NMR spectrum of the substance obtained in (1-3), respectively, of FIG 12 (a), (b) and (c) . 1 H-NMRの条件は、(a) 溶媒:D 2 O、400MHz、(b) 溶媒:CD 3 OD、400MHz、(c) 溶媒:DMSO、400MHzであった。 Conditions of 1 H-NMR is, (a) solvent: D 2 O, 400MHz, ( b) solvent: CD 3 OD, 400MHz, ( c) a solvent: DMSO, was 400 MHz.
また、(1-1)〜(1-4)のスキームを、図13に示す。 Moreover, the scheme (1-1) to (1-4), shown in Figure 13.
実施例1(3-1-1)と同様の手順に従って、(1-4)で合成したPAMAM-N-ADRのデンドリマーあたりに結合したADR分子の数を調べたところ、14であった。 Following a procedure analogous to Example 1 (3-1-1) were examined number of ADR molecules bound per dendrimer PAMAM-N-ADR synthesized in (1-4), was 14.

実施例4 ポリグルタミン酸と複合したアドリアマイシンを含むコラーゲンゲル医薬組成物 本実施例では、薬物としてADRを用いて、生体適合性高分子化合物としてポリグルタミン酸を用いた。 In this embodiment the collagen gel pharmaceutical composition comprising the adriamycin conjugated with Example 4 polyglutamic acid with ADR as a drug, using polyglutamic acid as the biocompatible polymer.
(1-1)Boc-NHNH 2結合ポリグルタミン酸の合成 50分子のグルタミン酸が重合したポリ(L-グルタミン酸ナトリウム塩) 30mg (4.0μmol, Mw=7500、Alamanda Polymer)を蒸留水1mlに溶解し、カルバジン酸tert-ブチル39.65mg (0.3mmol, 75e.q.、Sigma-Aldrich)、DMT-MM 80.68mg (0.22mmol, 55e.q.)を加えて1晩撹拌した。 (1-1) Boc-NHNH 2 poly-glutamic acid synthesis 50 molecules of binding polyglutamic acid is polymerized (L- glutamate sodium salt) 30mg (4.0μmol, Mw = 7500 , Alamanda Polymer) was dissolved in distilled water 1 ml, carbazate acid tert- butyl 39.65mg (0.3mmol, 75e.q., Sigma-Aldrich), DMT-MM 80.68mg (0.22mmol, 55e.q.) was stirred overnight added. その後、メタノールを溶離液としてSephadex LH-20カラムを用いて精製した。 Then purified using Sephadex LH-20 column with methanol as eluent.
精製後の溶液を凍結乾燥して、Boc-NHNH 2結合ポリグルタミン酸(PGlu-NHNHBoc)を得た。 Solution after purification and freeze-dried to afford the Boc-NHNH 2 binding polyglutamic acid (PGlu-NHNHBoc). 収量:35.1mg、収率:72.1% Yield: 35.1 mg, yield: 72.1%

(1-2)Boc-NHNH 2結合ポリグルタミン酸からの脱Boc基反応 (1-2)で合成したPGlu-NHNHBoc 35mg (2.88μmol) にトリフルオロ酢酸(TFA)700μLを加え、氷冷下で4時間撹拌した。 (1-2) Boc-NHNH 2 binding polypeptides removal of Boc group reaction from glutamic acid (1-2) trifluoroacetic acid (TFA) 700 [mu] L was added to the synthesized PGlu-NHNHBoc 35mg (2.88μmol), the 4 under ice-cooling and the mixture was stirred time. その後、減圧留去してTFAを除去し、さらに蒸留水を加えて減圧留去した。 Then, TFA was removed by evaporated under reduced pressure and vacuum distillation was further added distilled water. これを3回繰り返して、NHNH 2基が結合したポリグルタミン酸(PGlu-NHNH 2 )を得た。 Repeat 3 times this, NHNH 2 groups to give a bound polyglutamic acid (PGlu-NHNH 2). 収量:28.3mg、収率:80.7% Yield: 28.3 mg, yield: 80.7%

(1-3)ヒドラゾン結合を介してADRと結合したポリグルタミン酸の合成 (1-2)で得られたPGlu-NHNH 2を、実施例1(1-6)と同様の手順で処理して、アドリアマイシンと結合したポリグルタミン酸(PGlu-ADR)を得た。 (1-3) a PGlu-NHNH 2 obtained in the polyglutamic acid conjugated with ADR via a hydrazone bond (1-2), was treated in the same manner as in Example 1 (1-6), to obtain a bound polyglutamic acid (PGlu-ADR) and adriamycin. 反応させたポリグルタミン酸:ADRのモル比は、1:40であった。 It reacted with polyglutamic acid molar ratio of ADR was 1: 40.

上記の(1-1)及び(1-2)で得られた各物質の1 H-NMRスペクトル(溶媒:D 2 O、400MHz)を、図14に示す。 The above (1-1) and 1 H-NMR spectrum of each material obtained in (1-2) (solvent: D 2 O, 400MHz), shown in Figure 14.
また、(1-1)〜(1-3)のスキームを、図15に示す。 Moreover, the scheme (1-1) to (1-3), shown in Figure 15.

(2)ADRと結合したポリグルタミン酸を保持する組成物の製造 実施例1(2)と同様の手順に従って、PGlu-ADRを保持するコラーゲンをゲルの形で得た。 (2) Following a procedure analogous to Preparation Example 1 (2) of the composition to hold the polyglutamic acid conjugated with ADR, to obtain a collagen that holds PGlu-ADR in the form of a gel.

(3)特徴決定(3-1)ポリグルタミン酸1分子あたりに結合したADR数の評価 ポリグルタミン酸1分子あたりに結合したADRの数を、実施例1(3-1-1)と同様の手順に従って調べたところ、5.3個であった。 (3) the number of characterization (3-1) ADR coupled to the evaluation per molecule polyglutamic acid number ADR bound per molecule polyglutamic acid, following the same procedure as in Example 1 (3-1-1) was examined, was 5.3 pieces.

(3-2)ポリグルタミン酸に結合したADRのMDA-MB-231細胞、MCF-7細胞に対する細胞毒性 所定の濃度のPGlu-ADR又は実施例1で製造したPEG-PAMAM-N-ADRを用いた以外は、実施例2(3-4)と同様の手順に従って、MDA-MB-231細胞、MCF-7細胞に対する細胞毒性を調べた。 (3-2) MDA-MB-231 cells ADR bound to polyglutamic acid, was used PGlu-ADR or PEG-PAMAM-N-ADR prepared in Example 1 cytotoxic predetermined concentration on MCF-7 cells Otherwise, following the same procedure as in example 2 (3-4), it was investigated MDA-MB-231 cells, cytotoxicity against MCF-7 cells.
結果を、図16に示す。 The results, shown in Figure 16.
図16では、(a)MCF-7細胞に対するPGlu-ADR(■)及びPEG-PAMAM-N-ADR(▲)の影響、並びに(b)MDA-MB-231細胞に対するPGlu-ADR(■)及びPEG-PAMAM-N-ADR(▲)の影響を示す。 In Figure 16, (a) for the MCF-7 cells PGlu-ADR (■) and PEG-PAMAM-N-ADR (▲) effects, and (b) MDA-MB-231 PGlu-ADR to cells (■) and It shows the effect of PEG-PAMAM-N-ADR (▲).

図16の結果から、抗癌剤をポリグルタミン酸と結合させても、抗癌剤にPEG結合デンドリマーを結合させた場合と同様の癌細胞に対する細胞毒性を示すことがわかる。 From the results of FIG. 16, anticancer agents to be conjugated with polyglutamic acid, it can be seen that the cytotoxicity against the same cancer cell and when combined with a PEG bound dendrimers to anticancer agents.

Claims (6)

  1. 薬物と複合した生体適合性高分子化合物と、基材としてのコラーゲンとを含み、前記生体適合性高分子化合物がコラーゲンペプチドで修飾されている、医薬組成物。 And a biocompatible polymer compound complexed with a drug, see containing a collagen as a substrate, wherein the biocompatible polymer compound is modified with a collagen peptide, a pharmaceutical composition.
  2. 前記生体適合性高分子化合物が、デンドリマー又はポリペプチドである請求項1に記載の組成物。 Wherein the biocompatible polymer compound composition of claim 1 which is a dendrimer or a polypeptide.
  3. 前記薬物が、抗癌剤である請求項1 又は2に記載の組成物。 It said drug composition according to claim 1 or 2 is an anticancer agent.
  4. 前記薬物と複合した生体適合性高分子化合物が、基材としてのコラーゲンに含有される請求項1〜 のいずれか1項に記載の組成物。 Biocompatible polymer compound complexed with the drug composition according to any one of claims 1 to 3 which is contained in the collagen as a substrate.
  5. ゲルの形態である請求項に記載の組成物。 The composition of claim 4 in the form of a gel.
  6. 薬物と複合した生体適合性高分子化合物を基材としてのコラーゲンと混合し、得られる混合物をゲル化させることを含む、請求項1〜 のいずれか1項に記載の医薬組成物を製造する方法。 The biocompatible polymer compound complexed with the drug mixed with collagen as a substrate, the resulting mixture comprising gelling to produce a pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 5 Method.
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