JP2009521917A - Cxcr4および/または細胞運動の阻害 - Google Patents
Cxcr4および/または細胞運動の阻害 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、フェニルアラニン、システイン、該アミノ酸の誘導体、それらを含むペプチド、ならびに病状がCXCR4活性および/または細胞の運動性によって引き起こされるかまたは関連する疾患、障害または症状におけるそれらの使用に関する。
Description
本発明は、フェニルアラニン、システイン、該アミノ酸の誘導体およびそれらを含むペプチド、ならびに病状がCXCR4活性および/または細胞運動によって引き起こされるかまたは関連する疾患、障害もしくは症状におけるそれらの使用に関する。
造血幹細胞は、骨髄の微環境内の稀な細胞群である。造血幹細胞は、個体の一生にわたって、TおよびBリンパ球といった免疫システムの主な構成成分を含むすべての成熟血液細胞系統の連続的な産生を活発に維持しており、その間、未分化の幹細胞および前駆細胞の小さなプールを保持している(Mayani, 2003)。
成長中、または実験的および臨床的移植術において、幹細胞は、順番に循環系の中に遊離される未熟なおよび成熟骨髄性およびリンパの血液細胞とともに自己を再増殖しながら、血液循環を通じて遊走し、骨髄(BM)に生着する。幹細胞の機能および免疫システムの発達に極めて重要である造血幹細胞のホーミングおよび再増殖の過程はあまりよく解明されていない。ケモカインストローマ細胞由来因子−1(SDF−1)は、多くのタイプの細胞によってならびにまた骨髄性のストローマ細胞および内皮細胞によって産生されるが、未成熟および成熟造血細胞に対する強力な化学誘引物質であり、定常状態における白血球輸送の恒常性を制御している。
SDF−1は進化を通じて高度に保全されている。ヒトおよびマウスのSDF−1は交差反応性であり、1つのアミノ酸のみ異なる。SDF−1(CXCL12とも呼ばれる)は幹細胞および前駆細胞のための生存因子としてはたらき、未成熟B細胞および巨核球の成長に関与している(McGrath et al., 1999; Nagasawa et al., 1996)。
免疫不全の移植マウスにおけるヒト幹細胞のホーミングならびにそれらのその後の増殖および分化は、宿主の骨髄によって発現されているSDF−1とドナーの生着細胞上で発現されているそのレセプターCXCR4との間の相互作用に依存していることが見出された。未成熟ヒトCD34+細胞を抗CXCR4中和抗体で前処理することによるSDF−1/CXCR4相互作用の阻害は、CD34+細胞のインビボでのホーミングおよび再増殖を遮断した。一方、未処理の細胞は数時間以内にレシピエントマウスのBM中に生着することができた[Peled et al., 1999(a)]。
サイトカイン刺激によるCXCR4発現の増加は、ホーミングおよび移植の向上を伴いながら、SDF−1への応答を増強することが見出された。細胞表面にCXCR4を発現していない未成熟ヒトCD34+細胞は、内在CXCR4を含んでおり、移植に続いてインビボでオシレート(oscillate)し得る。このCXCR4の上方調節の阻止は、低いレベルのヒトCD34+CXCR4-細胞移植を遮断する。これゆえ、再増殖能のあるヒト幹細胞の表現型はCD34+CD38-/lowCXCR4+細胞として定義される(Kollet et al., 2002)。
骨髄から循環系への幹細胞の遊離および移動は臨床的移植のために誘導される。G−CSFなどのサイトカインを用いた多重刺激が循環系からヒト幹細胞を補充(recruit)するために用いられる。G−CSF投与後、BM内でのSDF−1/CXCR4相互作用が移動過程に関与していることが判明した(Petit et al., 2002)。
好中球エラスターゼなどのタンパク質分解酵素は、G−CSF投与の間、骨髄中でSDF−1を分解することが判明した。同時に、骨髄内の造血細胞におけるCXCR4の発現レベルは、それらの移動以前に増加していることが見出された。CXCR4またはSDF−1に対する中和抗体は、ヒトおよびマウスの幹細胞の移動を減少させた。これは細胞放出におけるSDF−1/CXCR4シグナル伝達を示している。
したがって、幹細胞のホーミングおよび遊離/移動は類似の機序を利用しており、かつ両方のプロセスにおいて、SDF−1/CXCR4相互作用が主要な役割を担っている。
SDF−1はまた、白血病性細胞の遊走においても重要な役割を果たしている。正常細胞および白血病性の細胞は遊走において類似の機序を共有しているが、SDF−1シグナル経路と同様にホーミングパターンにおいても異なることが、悪性腫瘍のヒトPre−B ALL細胞(前駆B細胞型急性リンパ芽球性白血病)を正常な未成熟CD34+細胞と比較した場合に判明した(Siegel et al., 2004)。別の悪性疾患である急性骨髄性白血病(AML)においては、高レベルの細胞内CXCR4およびSDF−1が、表面上のCXCR4を発現していない細胞を含めたすべての白血病性細胞において見つかっている。CXCR4は、免疫不全マウスのBMへのこれらの細胞のホーミングに不可欠であり、これは、これらの細胞におけるCXCR4の動的調節を証明している(Tavor et al., 2005)。
血管内内皮細胞の細胞表面におけるSDF−1の発現は、循環系からの骨髄への成功的な経内皮移動のために不可欠な段階である、せん断流下のおける細胞停止を誘導するために大変重要であることが見出された。加えて、SDF−1は、遊走性のヒト幹細胞および前駆細胞上のCD44、LFA−1、VLA−4およびVLA−5などの主要な接着性分子を、ホーミングおよび経内皮移動の多段階過程の一環として、活性化した(Peled et al., 2000)。
SDF−1のCXCR4への結合によって誘発される、SDF−1刺激およびシグナル伝達経路後の細胞運動および遊走を誘導する機序は知られていない。MAPKでなく、PI3Kの活性化が、濃縮された未成熟CD34+細胞の運動性に必要であることが判明している。異型のPKCゼータアイソフォームは遊走の過程に不可欠であることが判明した。さらに、SDF−1によるPKCゼータの活性化はPI3K依存性であることが判明した(Petit et al., 2005)。
SDF−1は、細胞骨格を変化させ、かつ表面上のCD44発現を再配置させることによって、BMニッチの細胞外マトリックスへの幹細胞の接着および固定(anchorage)を媒介していると考えられている(Avigdor et al., 2004)。
遊走および接着における役割とは別に、SDF−1はまた、正常なヒトCD34+細胞および白血病性細胞を含む様々な細胞の増殖および生存に関与している(Lee et al., 2002; Nishii et al., 1999, および Tavor et al., 2005)。
ある局面において、本発明は、CXCR4活性の阻害および/または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造における、フェニルアラニンまたはその誘導体のアミノ酸;システインまたはその誘導体のアミノ酸;フェニルアラニンまたはその誘導体およびシステインまたはその誘導体を含むアミノ酸の組み合わせ;少なくとも1つのフェニルアラニンもしくはその誘導体、少なくとも1つのシステインもしくはその誘導体、または少なくとも1つのフェニルアラニンもしくはその誘導体および少なくとも1つのシステインもしくはその誘導体を含む22個までのアミノ酸残基を含むペプチドの使用に関する。
本発明のある実施態様では、CXCR4活性の阻害および/または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造において、フェニルアラニンまたはその誘導体のアミノ酸が使用される。
本発明のさらなる実施態様では、フェニルアラニン誘導体は、溶解性が改良されたフェニルアラニン誘導体である。
本発明のさらなる別の実施態様では、フェニルアラニン誘導体は、フェニルアラニノール(Phe−ol)またはサクシニルフェニルアラニン(Suc−Phe)である。
本発明のさらなる別の実施態様では、フェニルアラニン誘導体は、β−フェニルエチルアミンである。
本発明の他の実施態様では、CXCR4活性の阻害および/または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造において、システインまたはその誘導体のアミノ酸が使用される。
本発明のさらなる実施態様では、システイン誘導体は、溶解性が改良されたシステイン誘導体である。
本発明のさらなる別の実施態様では、システイン誘導体は、システインエチルエステル、システインスルフィン酸およびシステインアミンから選択される。
本発明の別の実施態様では、CXCR4活性の阻害および/または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造において、フェニルアラニンまたはその誘導体およびシステインまたはその誘導体を含むアミノ酸の組み合わせが使用される。
本発明の別の実施態様では、CXCR4活性の阻害および/または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造において、少なくとも1つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む22個までのアミノ酸残基のペプチドが使用される。
本発明のさらなる実施態様では、ペプチドは、少なくとも1つのフェニルアラニンを含む2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21個のアミノ酸残基からなる。
本発明のさらなる別の実施態様では、ペプチドは少なくとも1つのフェニルアラニンおよび少なくとも1つの、荷電したフェニルアラニンでない残基を含む約2、3、4、5または6個の連続したアミノ酸残基からなる。
本発明のさらなる別の実施態様では、少なくとも1つのフェニルアラニンでない残基は、リジンまたはアルギニンなどの正電荷をもつアミノ酸または負電荷をもつアミノ酸残基である。
本発明のさらなる別の実施態様では、ペプチドは、配列番号1、配列番号2、配列番号3またはアミノカプロイック酸に結合したその誘導体、配列番号4、配列番号5および配列番号8から選択されるアミノ酸を含む。
本発明のさらなる別の実施態様では、負電荷をもつアミノ酸残基は、グルタミン酸である。
本発明のさらなる別の実施態様では、ペプチドは、配列番号6または配列番号7のアミノ酸配列を含む。
本発明の別の実施態様では、CXCR4活性の阻害および/または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造において、少なくとも1つのシステインもしくはその誘導体を含む22個までのアミノ酸残基を含むペプチドが使用される。
本発明のさらなる実施態様では、ペプチドは、少なくとも1つのシステインを含む2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21個のアミノ酸残基からなる。
本発明のさらなる別の実施態様では、ペプチドは、少なくとも1つのシステインならびにプロリン、アルギニンおよびグルタミン酸から選択される少なくとも1つのシステインでない残基を含む、約2、3、4、5または6個の連続したアミノ酸残基を含む。
本発明のさらなる別の実施態様では、ペプチドはグルタチオンからなる。
本発明の別の実施態様では、CXCR4活性の阻害および/または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造において、LSYモチーフ(配列番号19)を含むSDF−1のアミノ末端由来のペプチドを除く、少なくとも1つのフェニルアラニンまたはその誘導体および少なくとも1つのシステインまたはその誘導体を含む22個までのアミノ酸残基のペプチドが使用される。
本発明のさらなる実施態様では、ペプチドは、少なくとも1つのフェニルアラニンまたはその誘導体および少なくとも1つのシステインまたはその誘導体を含む2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21個のアミノ酸残基からなる。
本発明のさらなる別の実施態様では、ペプチドは、少なくとも1つのシステインまたはその誘導体および少なくとも1つのフェニルアラニン残基またはその誘導体を含む、約2、3、4、5、6または7個の連続したアミノ酸残基を含む。
本発明のさらなる別の実施態様では、ペプチドは、少なくとも1つのシステインではないアミノ酸残基またはフェニルアラニンではないアミノ酸残基で隔てられた、1つのシステインまたはその誘導体および1つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む、約3、4、5、6または7個の連続したアミノ酸残基を含む。
本発明のさらなる別の実施態様では、ペプチドは配列番号12の3個の連続したアミノ酸残基を含む。
本発明のさらなる別の実施態様では、ペプチドは、少なくとも1つのシステインではないアミノ酸残基またはフェニルアラニンではないアミノ酸残基で隔てられた、1つのシステインまたはその誘導体および1つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む4個の連続したアミノ酸残基を含む。
本発明のさらなる別の実施態様では、4個の連続したアミノ酸残基の配列が配列番号11からなる。
本発明のさらなる別の実施態様では、4個の連続したアミノ酸残基の初めの残基が、配列番号13からなる連続したアミノ酸残基の配列にあるようにプロリンである。
本発明のさらなる別の実施態様では、ペプチドは、少なくとも1つのシステインではないアミノ酸残基またはフェニルアラニンではないアミノ酸残基で隔てられた、1つのシステインまたはその誘導体および1つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む5個の連続したアミノ酸残基を含む。
本発明のさらなる別の実施態様では、5個の連続したアミノ酸残基の初めの残基が、配列番号16、またはシステインの代わりにdCys(Trt)残基を有する配列番号16の誘導体の配列にあるようにプロリンである。
本発明のさらなる別の実施態様では、5個の連続したアミノ酸残基の5番目の残基が、配列番号10の配列にあるようにグルタミン酸である。
本発明のさらなる別の実施態様では、ペプチドは、少なくとも1つのシステインではないアミノ酸残基またはフェニルアラニンではないアミノ酸残基で隔てられた、1つのシステインまたはその誘導体および1つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む、6個の連続したアミノ酸残基を含む。
本発明のさらなる別の実施態様では、配列番号9の配列にあるように、6個の連続したアミノ酸残基の6番目の残基がグルタミン酸であって、および/または、連続したアミノ酸残基の初めの残基がプロリンである。
本発明は、CXCR4活性の阻害および/または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造における、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、システインの代わりにdCys(Trt)残基を含む配列番号16の誘導体、配列番号17の配列を含む2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21個のアミノ酸残基のペプチドの使用を提供する。
本発明はまた、CXCR4活性の阻害および/または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造における、C−X−X−F(配列番号18)のアミノ酸配列であって、Xがアルギニンまたはアラニンであるアミノ酸配列を含む4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21個のアミノ酸残基のペプチドの使用を提供する。
本発明のある実施態様では、アミノ酸配列は配列番号14または配列番号15からなる。
本発明のさらなる実施態様では、ペプチドは融合ペプチドおよび/またはその塩である。
本発明のある実施態様では、該アミノ酸および/またはペプチドの使用は、CXCR4を発現している癌、後天性免疫不全症候群(AIDS)および/または炎症などの疾患、障害または症状の治療のための医薬の製造のためである。
本発明のさらなる実施態様では、前記疾患は、白血病、眼内悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、多発性骨髄腫、膵臓癌、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、甲状腺癌、直腸癌、口腔扁平上皮癌、子宮頸癌、神経芽腫、神経膠腫、星状細胞腫、横紋筋肉腫、小細胞肺癌および黒色腫などの、CXCR4を発現している癌である。
本発明のさらなる実施態様では、前記癌は、急性リンパ芽球性白血病などの白血病である。
本発明のさらなる実施態様では、前記使用は、転移を治療または予防するための医薬の製造のためである。
本発明のさらなる実施態様では、前記使用は、AIDSを治療するための医薬の製造のためである。
本発明のさらなる実施態様では、前記使用が、慢性関節リウマチ、化膿性関節炎、変形性関節症、歯周炎、歯肉炎、喘息、自己免疫疾患、乾癬、乾癬性関節炎、アトピー性皮膚炎、間質性腎炎、眼内炎症、肝硬変、神経炎症性障害、移植片対宿主病および炎症性胃腸症状などの炎症性疾患、障害もしくは症状を治療または予防するためのものである。
ある局面において、本発明は、C−X−X−F(配列番号18)のアミノ酸配列であって、Xがアルギニンまたはアラニンであるアミノ酸配列を含む4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21または22個のアミノ酸残基のペプチドを提供する。
本発明のある実施態様では、ペプチドは、配列番号14または配列番号15のアミノ酸配列を含む。
本発明はまた、少なくとも1つのアラニンで隔てられた、1つのシステインまたはその誘導体および1つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む3、4、5、6、7または8個の連続したアミノ酸残基を含む3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21または22個のアミノ酸残基のペプチドを提供する。
本発明のある実施態様では、システインまたはその誘導体およびフェニルアラニンまたはその誘導体は、1つまたは2つのアラニン残基で隔てられている。
本発明のさらなる実施態様では、ペプチドは、少なくとも1つのアラニンで隔てられた、1つのシステインまたはその誘導体および1つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む4個の連続したアミノ酸残基を含む。
本発明のさらなる別の実施態様では、4個の連続したアミノ酸残基の初めのおよび/または最後のアミノ酸残基は、それぞれ、システインまたはその誘導体およびフェニルアラニンまたはその誘導体である。
本発明はまた、LSYモチーフ(配列番号19)を含むSDF−1のアミノ末端由来のペプチドを除く、1つのアルギニンで隔てられた1つのシステインまたはその誘導体および1つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む3、4、5、6または7個の連続したアミノ酸残基を含む22個までのアミノ酸残基のペプチドを提供する。
本発明のある実施態様では、22個までのアミノ酸残基のペプチドは、配列番号12からなる3個の連続したアミノ酸残基を含む。
本発明の別の実施態様では、22個までのアミノ酸残基のペプチドは、1つのアルギニンで隔てられた、1つのシステインまたはその誘導体および1つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む4個の連続したアミノ酸残基を含む。
本発明のさらなる実施態様では、連続したアミノ酸残基の初めおよび最後のアミノ酸残基は、配列番号11からなる4個の連続したアミノ酸残基の配列にあるようにそれぞれ、システインまたはその誘導体およびフェニルアラニンまたはその誘導体である。
本発明のさらなる実施態様では、4個の連続したアミノ酸残基の初めの残基は、配列番号13の配列にあるようにプロリンである。
本発明の別の実施態様では、22個までのアミノ酸残基のペプチドは、1つのアルギニンで隔てられた、1つのシステインまたはその誘導体および1つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む5個の連続したアミノ酸残基を含む。
本発明のさらなる実施態様では、5個の連続したアミノ酸残基の初めの残基は、配列番号16、またはシステインの代わりにdCys(Trt)残基を有する配列番号16の誘導体の配列にあるようにプロリンである。
本発明のさらなる実施態様では、5個の連続したアミノ酸残基の5番目の残基は、配列番号10の配列にあるようにグルタミン酸である。
本発明のほかの実施態様では、22個までのアミノ酸残基のペプチドは、1つのアルギニンで隔てられた、1つのシステインまたはその誘導体および1つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む6個の連続したアミノ酸残基を含む。
本発明のさらなる実施態様では、6個の連続したアミノ酸残基の6番目の残基は、グルタミン酸である。
本発明のさらなる実施態様では、6個の連続したアミノ酸残基の初めの残基は、配列番号9の配列にあるようにプロリンである。
本発明はまた、配列番号15の配列にあるように、2つのアルギニンで隔てられた1つのシステインまたはその誘導体および1つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む4、5、6、7または8個の連続したアミノ酸残基を含む22個までのアミノ酸残基のペプチドを提供する。
加えて、本発明は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号6、または配列番号7からなる2個の連続したアミノ酸を含む2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21または22個のアミノ酸残基のペプチドを提供する。
また、本発明は、アミノカプロイック酸に結合した配列番号1、または配列番号8からなる3個の連続したアミノ酸残基を含む3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21または22個のアミノ酸残基のペプチドを提供する。
本発明は、配列番号5からなる4個の連続したアミノ酸残基を含む4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21または22個のアミノ酸残基のペプチドを提供する。
本発明は、配列番号1、アミノカプロイック酸に結合した配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、システインの代わりにdCys(Trt)残基を有する配列番号16の誘導体または配列番号17のアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。
また、本発明は、LSYモチーフを含むSDF−1のアミノ末端由来のペプチドを除く、アミノ酸配列C−R−Fを含む約3、4、5、6、7、8または9個のアミノ酸残基であるペプチドまたは最後のアミノ酸残基がセリンであるLSYモチーフを欠失している6から9個のアミノ酸残基からなるペプチドを提供する。
本発明によって提供されるペプチドは、環状に置換されたペプチドおよび/または融合ペプチドを含む。
本発明のある実施態様では、融合ペプチドは免疫グロブリンなどのタンパク質に融合されたペプチドである。
本発明のある実施態様では、融合ペプチドはポリエチレングリコール(PEG)などの高分子ポリマーに融合されたペプチドである。
加えて、本発明は、本発明によって提供されるペプチドの塩も包含する。
さらなる局面では、本発明は、本発明によって提供されるペプチドをコードする単離されたDNA、該DNAを含む発現ベクター、該DNAおよび/または発現ベクターを含有する宿主細胞、および宿主細胞を培養することおよび産生されたタンパク質を単離することを含む該ペプチドの製造方法に関する。
本発明のある実施態様では、宿主細胞は、HeLa、293T HEKおよびCHOなどの哺乳類細胞、昆虫細胞、またはイースト菌といった真核細胞である。
本発明のある実施態様では、宿主細胞は、原核細胞である。
さらなる局面では、本発明は、CXCR4を発現している癌、後天性免疫不全症候群(AIDS)、炎症および転移から選択される疾患、障害もしくは症状の治療または予防のための医薬の製造における、本発明によって提供されるペプチドまたはその塩の使用に関する。
さらなる別の局面では、本発明は、薬学的に許容され得る担体および本発明によって提供されるペプチドまたはその塩を含む医薬組成物に関する。
さらなる別の局面では、本発明は、薬学的に許容され得る担体ならびにLSYモチーフを含むSDF−1のアミノ末端由来のペプチドを除く、1つのアルギニンで隔てられた、1つのシステインまたはその誘導体および1つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む約3、4、5、6または7個の連続したアミノ酸残基を含む3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21または22個のアミノ酸残基のペプチドに関する。
さらなる別の局面では、本発明は、本発明のDNAおよび薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物に関する。
さらなる別の局面では、本発明は、本発明のベクターおよび薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物に関する。
さらなる別の局面では、本発明は、薬学的に許容され得る担体ならびにフェニルアラニンまたはその誘導体およびシステインまたはその誘導体からなるアミノ酸の混合物を含む医薬組成物に関する。
さらなる別の局面では、本発明は、必要とする対象における、CXCR4活性の阻害および/または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状の治療または予防方法であって、該方法が、対象に、治療上有効量の、フェニルアラニンまたはその誘導体であるアミノ酸;システインまたはその誘導体であるアミノ酸;フェニルアラニンまたはその誘導体およびシステインまたはその誘導体を含むアミノ酸の組み合わせ;少なくとも1つのフェニルアラニンもしくはその誘導体、少なくとも1つのシステインもしくはその誘導体、または少なくとも1つのフェニルアラニンもしくはその誘導体および少なくとも1つのシステインもしくはその誘導体を含む22個までのアミノ酸残基を含むペプチド(LSYモチーフを含むSDF−1のアミノ末端由来のペプチドを除く)を投与することを含む方法に関する。
さらなる別の局面では、本発明は、CXCR4活性が病状または経過に関与している疾患、障害もしくは症状の治療または予防方法であって、該方法を必要とする対象に、治療上有効量の、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、システインの代わりにdCys(Trt)残基を含む配列番号16の誘導体、配列番号17またはそれらの組み合わせで示される配列を含むペプチドを投与することを含む方法に関する。
さらなる別の局面では、本発明は、CXCR4活性が病状または経過に関与している疾患、障害もしくは症状の治療または予防方法であって、該方法を必要とする対象に、治療上有効量の、配列番号1、アミノカプロイック酸に結合した配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8またはそれらの組み合わせで示される配列を含むペプチドを投与することを含む方法に関する。
さらなる別の局面では、本発明は、CXCR4を発現している癌、後天性免疫不全症候群(AIDS)、炎症および転移から選択される疾患、障害もしくは症状の治療または予防方法であって、該方法を必要とする対象に、治療上有効量の、本発明によって提供されるペプチドを投与することを含む方法に関する。
本発明は、CXCR4活性の阻害および/または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造における、フェニルアラニンまたはその誘導体のアミノ酸;システインまたはその誘導体のアミノ酸;フェニルアラニンまたはその誘導体およびシステインまたはその誘導体を含むアミノ酸の組み合わせ;少なくとも1つのフェニルアラニンもしくはその誘導体、少なくとも1つのシステインもしくはその誘導体、または少なくとも1つのフェニルアラニンもしくはその誘導体および少なくとも1つのシステインもしくはその誘導体を含む22個までのアミノ酸残基を含むペプチドの使用に関する。
システインまたはその誘導体のアミノ酸、フェニルアラニンまたはその誘導体のアミノ酸、例えば、自然界ではフェニルアラニンアミノ酸から酵素的脱炭酸反応によって合成されるβ−フェニルエチルアミン、溶解性が改良されたフェニルアラニン誘導体、例えばフェニルアラニノール(Phe−ol)、サクシニルフェニルアラニン(Suc−Phe)、システインエチルエステル、システインスルフィン酸、システインアミン;およびシステイン、フェニルアラニンまたは両方のアミノ酸の組み合わせを含む短鎖ペプチドといった薬剤が、細胞遊走および/または細胞でのCXCR4発現またはその両方を阻害することができるという、本発明による発見は、病状が、細胞の運動性の阻害および/または細胞中でのCXCR4発現のレベルおよび/または活性の阻害によって改善、緩和もしくは予防され得るようなCXCR4活性の阻害および/または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害または症状のための新しい治療法への道を開くものである。
実際、本発明によって得られた結果は、上記の薬剤(本明細書において「本発明の薬剤」または「本発明による薬剤」という)が、CXCR4活性または応答性をその機序にとらわれることなく、例えば細胞中のCXCR4の発現レベルを減少させることによって減少させるために用いられ得ること、および/または細胞の運動性を阻害するために用いられ得ることを明らかにしている。したがって、これらの薬剤は、病状が細胞中のCXCR4を介する活性またはシグナル伝達および/または細胞の運動性によって引き起こされるかまたは関連する疾患、障害もしくは症状を治療または予防するために用いられ得る。病状が細胞中のCXCR4のレベルおよび/または細胞の運動性によって引き起こされるかまたは関連する疾患、障害もしくは症状は、CXCR4活性の阻害および/または細胞の運動性の阻害に反応し、かつCXCR4活性および/または運動性の阻害によって予防または改善され得る疾患、障害もしくは症状である。CXCR4活性の阻害という用語は、例えば、活性の阻害またはCXCR4の発現のレベルの阻害を示している。
本発明によって、システインまたはその誘導体;フェニルアラニンまたはβ−フェニルエチルアミンなどのその誘導体;およびフェニルアラニンを含むペプチドといった本発明の薬剤が、トランスウェルアッセイ(transwell assay)によってインビトロで測定した場合、前駆−B ALL(Pre−BLL)細胞の自発運動性、ならびにSDF−1依存性の運動性を阻害することが発見された。Pre−BLLは、最も発症率の高い小児悪性腫瘍であり、二番目に発生率の高い成人の急性白血病である。実際、DおよびLフェニルアラニンの遊走阻害の効果は類似しており、それゆえ、遊走阻害の効果はアミノ酸の立体異性構造には依存しないことが判明している。特に、本発明による発見は、Phe−olがインビボにおいてPre−BLL細胞の循環系から骨髄、脾臓、肺および肝臓への遊走(またはホーミング)を阻害することを示している。
本発明による薬剤の阻害効果はまた、正常な非新生細胞においても検知された。例えば、本発明によって、造血細胞、CD34+細胞などの正常細胞の運動性は、Phe−olによって阻害され、正常な初代T細胞の運動性は、フェニルアラニンを含む短鎖ペプチドまたはフェニルアラニンおよびシステインを含む短鎖ペプチドによって阻害されることが示された。
本発明による発見は、本発明の薬剤が、SDF−1およびそのレセプターであるCXCR4によって媒介される活性を阻害できることを示している。例えば、本発明によって、システインまたはフェニルアラニンのアミノ酸;およびフェニルアラニノール(Phe−ol)、サクシニルフェニルアラニン(Suc−Phe)、システインエチルエステル、システインスルフィン酸、システインアミン、β−フェニルエチルアミンなどの該アミノ酸の誘導体;およびシステインおよび/またはフェニルアラニンのアミノ酸を含む短鎖ペプチドが、細胞のSDF−1依存性の運動性を阻害できることが見出された。また、本発明によって、Phe−olが、SDF−1活性に依存性であることが知られている過程である、Pre−BLL細胞の骨髄へのホーミングの阻害;SDF−1依存性のCa+インフラックスの阻害;およびSDF−1産生細胞へのCD34+細胞の接着の阻害を媒介し得ることが示された。Phe−olで処理された細胞中でのCXCR4の発現のレベルは、本発明によって試験され、その結果Phe−olが、Pre BLL細胞などの新生細胞中ならびに初代T細胞およびCD34+細胞などの正常細胞中でのCXCR4発現を阻害することが発見された。
本発明は、CXCR4活性の阻害および/または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造における、フェニルアラニンまたは、例えば、フェニルアラニノール(Phe−ol)もしくはサクシニルフェニルアラニン(Suc−Phe)などの溶解性が改良された誘導体のようなその誘導体のアミノ酸、またはフェニルエチルアミドのようなフェニルアラニンアミノ酸から合成される誘導体;システインエチルエステル、システインスルフィン酸およびシステインアミンのようなシステインまたはその誘導体のアミノ酸;またはフェニルアラニンもしくはその誘導体およびシステインもしくはその誘導体を含むアミノ酸の混合物の使用を提供する。
ここで使用される「アミノ酸」という用語は、他で特定されない限り、1つのアミノ酸もしくはその誘導体、または2つもしくはそれ以上のアミノ酸の混合物を意味し、タンパク質中で見出される全ての自然に存在するアミノ酸および非天然アミノ酸を含む。非天然アミノ酸の例として、4−ヒドロキシプロリン、5−ヒドロキシリジン、およびN−メチルリジン、γ―カルボキシグルタメート、デスモシン、セレノシステイン、シトルリンおよびオルニチンなどのN−メチルアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
アミノ酸の誘導体は、通常はアミノ酸の一部にはない付加的な化学部位を含むアミノ酸残基であってもよく、CXCR4発現もしくは活性の阻害剤としてならびに/または自発的なおよび/もしくはSDF−1によって介される細胞遊走の阻害剤として、その使用が認められるアミノ酸の機能の少なくとも一部を保持している限りにおいて、本発明に包含される。この用語は、アミノ酸のOH、SH(システイン中に存在する)またはカルボキシ基のエステル;OHおよびSHのエーテル;アミド;アミノ基における置換などを含むが、これらに限定はされない。β−フェニルエチルアミンはフェニルアミンの誘導体である。自然界では、フェニルアラニンアミノ酸から酵素的脱炭酸反応によって合成される。
アミノ酸は、1または複数の立体異性体として存在していてもよく、非対称的な原子または回転の制限の存在のために、それぞれのキラル中心でRもしくはSの立体化学を有する多数の立体異性体として、またはそれぞれのキラル軸においてRもしくはSの立体化学を有するアトロプ異性体として存在し得る。本発明は、全てのこれらの鏡像異性体およびジアステレオマーならびにそれらの混合物の使用を包含する。
フェニルアラニンおよび/またはシステインアミノ酸および/または、フェニルアラニノール、サクシニルフェニルアラニン、β−フェニルエチルアミン、システインエチルエステル、システインスルフィン酸、およびシステインアミンなどのそれらの誘導体は、本発明によって、メチオニン、プロリン、バリン、グルタミン酸および/またはそれらの組み合わせなどの追加のアミノ酸と共に、投与または使用され得る。
本発明のある実施態様では、アミノ酸は、フェニルアラニン、フェニルアラニノール、サクシニルフェニルアラニンもしくはフェニルアラニンおよびシステイン、システインエチルエステル、システインスルフィン酸、もしくはシステインアミンの組み合わせまたは混合物を含む。
本発明によって、フェニルアラニンおよび/またはシステインを含む2、3、4、5、または6個のアミノ酸残基である短鎖の合成ペプチドが、細胞遊走を阻害することが見出された。このようなペプチドの、自発的および/またはSDF−1依存性の遊走に対する阻害効果は、正常な成熟T細胞を用いた場合と同様に白血病細胞(G2)を用いて行われたインビトロでのアッセイでも検知された。
本発明によって、F−K(配列番号1)のようなペプチドを含むフェニルアラニン、配列番号1であるが、F−K−ε―アミノカプロイック酸のようにアミノカプロイック酸に結合しているようなペプチド、K−F(配列番号2)、F−R(配列番号3)、R−F(配列番号4)、K−F−K−F(配列番号5)、F−E(配列番号6)、E−F(配列番号7)、およびF−L−K(配列番号8);またはグルタチオンのようなペプチドを含むシステインが、Pre−BLL細胞の自発的な遊走を阻害することが見出された。F−K、K−F、F−R、R−FおよびF−Eが約50%の細胞遊走を阻害することができ、F−L−KおよびF−K−ε―アミノカプロイック酸が約30%の細胞遊走を阻害できることが判明した。
本発明は、少なくとも1つのフェニルアラニンもしくはその誘導体を含む、または少なくとも1つのフェニルアラニンもしくはその誘導体を含む2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21個のアミノ酸残基である短鎖ペプチドを含む約22個のアミノ酸である短鎖ペプチドの使用を提供する。短鎖ペプチドは、少なくとも1つのフェニルアラニンおよび少なくとも1つの荷電性アミノ酸であってフェニルアラニンでない残基を含む2、3、4、5または6個の連続したアミノ酸残基を含んでもよい。荷電性アミノ酸は、リジンもしくはアルギニンといった正電荷をもつアミノ酸であってもよく、またはグルタミン酸のような負電荷をもつアミノ酸であってもよい。これらペプチドの非限定的な例としては、F−K、K−F、F−R、R−F、K−F−K−F、F−L−K、F−K−ε―アミノカプロイック酸、F−E、およびE−Fまたはそれらの塩で表されるアミノ酸配列の1つを含む22個までのアミノ酸残基の短鎖ペプチドである。これらの配列のN−末端またはC−末端の片方または両方に付加的なアミノ酸が含まれることは可能であり、もちろん、これらの付加的なアミノ酸残基はペプチドの機能活性を顕著に妨げるものであってはならない。
本発明はまた、少なくとも1つのシステインもしくはその誘導体を含む22個までのアミノ酸である短鎖ペプチド、例えば、少なくとも1つのシステインを含む2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21個のアミノ酸残基のペプチド、例えば、少なくとも1つのシステインならびにプロリン、アルギニンおよびグルタミン酸から選択される少なくとも1つのシステインでない残基を含む2、3、4、5または6個の連続したアミノ酸であるペプチドの使用に関する。本発明のある実施態様では、このようなペプチドはグルタチオンである。
本発明によれば、例えば、P−C−R−F−F−E(配列番号9);C−R−F−F−E(配列番号10);C−R−F−F(配列番号11);C−R−F(配列番号12);P−C−R−F(配列番号13);C−A−A−F(配列番号14);C−R−R−F(配列番号15)およびP−C−R−F−F(配列番号16)の誘導体、P−dCys(Trt)−R−F−Fなどのフェニルアラニンおよびシステインを含む短鎖ペプチドは、インビトロでのトランスウェルアッセイによって測定されるように、SDF−1によって介されるT細胞遊走の非常に有力な阻害剤であることが見出された。
これらは、C−P−C−R−F−F−E(配列番号17)であるシステインおよびフェニルアラニン残基を有する(SDF−1のアミノ酸9〜15)SDF−1分子のN−末端配列に基づいた、合成の小さなペプチドである。配列番号9のペプチド、P−C−R−F−F−Eは、1つのプロリン残基を位置1に、1つのシステイン残基を位置2に、2つのフェニルアラニンを位置4および5に含み、システインおよびフェニルアラニンがアルギニンで隔てられ、かつ最後の残基がグルタミン酸であるSDF−1のN−末端配列からの6個のペプチドである。配列番号10のペプチド、C−R−F−F−Eは、プロリンが欠失している以外は配列番号9のペプチドと同様であり、その結果、システインが位置1にある5個のペプチドである。配列番号11のペプチド、C−R−F−Fは、グルタミン酸が欠失している以外は配列番号10のペプチドと同様であり、その結果、同じようにシステインが位置1にあり、最後の残基がフェニルアラニンであり、かつ全部で2つのフェニルアラニンを有する4個のペプチドである。配列番号12のペプチド、C−R−Fは、最後のアミノ酸のフェニルアラニンが欠失している以外は配列番号11のペプチドと同様であり、その結果、システインが位置1にあり、ただ1つのフェニルアラニン残基を位置3に有し、かつシステインおよびフェニルアラニンが1つのアルギニンで隔てられている4個のペプチドである。配列番号13のペプチド、P−C−R−Fは、1つのフェニルアラニン残基および1つのグルタミン酸残基がそれぞれ位置5および6にて欠失している以外は配列番号9のペプチドと同様であり、その結果、プロリンが位置1にあり、かつシステインが位置2にあり、かつただ1つのフェニルアラニンを有する4個のペプチドである。配列番号14のペプチド、C−A−A−Fは、配列番号11のペプチドのような4個のペプチドであり、位置2のアルギニンおよび位置3のフェニルアラニンがアラニンによって置換されており、その結果、システインが位置1にあり、かつただ1つのフェニルアラニンを位置4に有するペプチドである。配列番号15のペプチド、C−R−R−Fは、配列番号11のペプチドのような4個のペプチドであり、位置3のフェニルアラニンがアルギニンによって置換されており、その結果、システインが位置1にあり、かつただ1つのフェニルアラニンを位置4に有するペプチドである。ペプチド、P−dCys(Trt)−R−F−FはペプチドP−C−R−F−F(配列番号16)の誘導体であり、システイン残基がシステイン誘導体dCys(Trt)に置換されている。配列番号16のペプチドは、システイン残基がdCys(Trt)に置換されており、かつグルタミン酸が欠失している以外は配列番号9のペプチドと同様である。Trtはトリチルであって、システインのSH官能部位のための保護基である。Fmoc−CYS(Trt)が、ペプチド鎖の組み立てのためのビルディングブロックとして使用された。本発明によって、細胞にとって有毒ではないような濃度で使用されるこれらのペプチドが、SDF−1によって介されるT細胞遊走に対する非常に有用な阻害剤(50〜90%の阻害の幅で)あることが見出された。これらのペプチドは、自発的な遊走も同様に阻害することができたが、より少ない程度であった。
10個のアミノ酸であるSDF−1のアミノ末端からのペプチドまたはより大きいLSYモチーフを含むペプチドは、Hevekerら(1998, 2001)、Loetscherら(1998)およびLuoら(1999)によって、開示されている。留意すべきは、全ての開示された活性なペプチドはLSYモチーフを含むことである。Hevekerら(2001)によって開示されたように、ペプチドは多形核白血球(PMN)に対して化学走性の効果を表すが、それらのどれ1つとして、これらの細胞内でSDF−1によって誘導される化学走性を阻害できるものはなかった。同じ発明者らは、それ以前の論文で、LSYモチーフ(配列番号19)はHIV阻害にとって不可欠であることを示している(Heveker 1998)。
報告されたペプチドとは異なり、SDF−1のアミノ末端由来のシステインおよびフェニルアラニンを含む本発明によるペプチドは、LSYモチーフを欠失しており、かつSDF−1によって誘導される化学走性を阻害することができる。HIVの複製には、SDF−1の化学走性の活性と同様に、CXCR4が関連しているので、本発明のこれらのペプチドは、HIVウイルスをもまた阻害することが可能であると思われる。
これゆえ、別の局面では、本発明は、CXCR4活性の阻害および/または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造における、LSYモチーフを含むSDF−1のアミノ末端由来のペプチドを除く、少なくとも1つのフェニルアラニンまたはその誘導体および少なくとも1つのシステインまたはその誘導体を含む22個までのアミノ酸残基のペプチドの使用に関する。
ペプチドは、少なくとも1つのシステインまたはその誘導体および少なくとも1つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む2、3、4、5、6または7個の連続したアミノ酸残基を含む22個までのアミノ酸残基のペプチドのような、少なくとも1つのフェニルアラニンまたはその誘導体および少なくとも1つのシステインまたはその誘導体を含む2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20および21個のアミノ酸残基からなることができる。本発明のある実施態様では、ペプチドは、P−C−R−F−F−E(配列番号9)、C−R−F−F−E(配列番号10)、C−R−F−F(配列番号11)、C−R−F(配列番号12)、P−C−R−F(配列番号13)、C−R−R−F(配列番号15)、P−dCys(Trt)−R−F−F(配列番号16)のような、1または複数のアルギニンで隔てられた、1つのシステインまたはその誘導体および1つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む3、4、5、6または7個の連続したアミノ酸残基からなる。本発明の別の実施態様では、ペプチドは、ペプチドC−A−A−Fのように、1または複数のアラニンで隔てられた、1つのシステインまたはその誘導体および1つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む3、4、5、6または7個の連続したアミノ酸残基を含む。本発明の別の実施態様では、ペプチドは、ペプチドC−A−A−F(配列番号14)、C−R−R−F(配列番号15)およびC−R−F−F(配列番号11)のように、4個の連続したアミノ酸残基であって、連続したアミノ酸残基の初めの残基がシステインまたはその誘導体でありかつ4番目の残基がフェニルアラニンまたはその誘導体であるアミノ酸残基を含む。
本発明のある実施態様では、ペプチドは、少なくとも1つのシステインまたはその誘導体および少なくとも1つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む4または5個の連続したアミノ酸残基であって、例えば、それぞれP−C−R−F(配列番号13)およびP−dCys(Trt)−R−F−F(配列番号16)のように、連続したアミノ酸残基の初めの残基がプロリンであるアミノ酸残基を含む。
本発明の別の実施態様では、ペプチドは、少なくとも1つのシステインまたはその誘導体および少なくとも1つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む5、6または7個の連続したアミノ酸残基であって、それぞれC−R−F−F−E(配列番号10)、P−C−R−F−F−E(配列番号9)およびC−P−C−R−F−F−E(配列番号17)のように、連続したアミノ酸残基の最後の残基がグルタミン酸であるアミノ酸残基を含む。
本発明の更なる実施態様は、初めのアミノ酸がプロリンであり、および/または最後のアミノ酸がグルタミン酸である場合、ならびに少なくとも1つのシステインまたはその誘導体および少なくとも1つのフェニルアラニンまたはその誘導体が、アルギニンまたはアラニン残基のような、システインまたはフェニルアラニンとは異なる、1または2個のアミノ酸残基で隔てられている場合の、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20および21個の連続したアミノ酸残基を含む22個までのアミノ酸残基のペプチドに関する。
本発明によって使用可能である典型的なペプチドは、F−K、K−F、F−R、R−F、K−F−K−F、F−E、E−F、F−L−K、F−L−ε―アミノカプロイック酸およびグルタチオン、ならびに、C−P−C−R−F−F−E;P−C−R−F−F−E;C−R−F−F−E;C−R−F−F;C−R−F;P−C−R−F;C−A−A−F;C−R−R−FおよびP−dCys(Trt)−R−F−F、それらの塩、機能性誘導体、その活性な変異体、すなわち、フェニルアラニンおよびシステインを含むその他のペプチドであって、構造中の1または複数のアミノ酸が欠失しているかもしくは他のアミノ酸で置換されている、または1または複数のアミノ酸が、細胞の運動性および/またはCXCR4活性を阻害するような同じ活性を有する22個までのアミノ酸残基のペプチドを得るためにその配列に付加されている、フェニルアラニンおよびシステインの両方のタイプのアミノ酸を含むペプチドを含むが、これらに限定はされない。
ペプチドは、体液中で、より長い半減期を有する「融合ペプチド」を結果として生じるような、タンパク質または高分子ポリマーなどの半減期を延長させるための部位を含んでもよい。例えば、本発明のペプチドは、例えば免疫グロブリンといったタンパク質に、また、例えばポリエチレングライコール(PEG)といった高分子ポリマーなどに、融合され得る。
本発明のペプチドが、T細胞遊走の非常に有用な阻害剤であることが見出されたので、それらは、病状がT細胞補充を含んでいる疾患、障害もしくは症状における医薬品として使用され得る。したがって、これらのペプチドによるT細胞補充の阻害は、該疾患、障害もしくは症状の病状の予防または改善に有益であり得る。病状がT細胞補充を含んでいる疾患、障害または症状の例としては、自己免疫疾患および炎症が挙げられる。
別の局面として、本発明は、例えば、C−X−X−F(配列番号18)のアミノ酸配列であって、Xがアルギニンもしくはアラニンであるアミノ酸配列を含む4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21個のアミノ酸残基のペプチドを提供する。本発明のある実施態様では、ペプチドは、配列番号14または配列番号15のアミノ酸配列を含む。
また、本発明は、少なくとも1つのアラニンで隔てられた、1つのシステインもしくはその誘導体および1つのフェニルアラニンもしくはその誘導体を含む3、4、5、6、7または8個の連続したアミノ酸残基を含む3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21または22個のアミノ酸残基のペプチドを提供する。
本発明のある実施態様では、ペプチドは、1つまたは2つのアラニン残基で隔てられた、1つのシステインまたはその誘導体および1つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む。
本発明はまた、4個の連続したアミノ酸残基を含む3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21または22個のアミノ酸残基のペプチドであって、連続したアミノ酸残基の初めと最後のアミノ酸残基が、それぞれ、システインまたはその誘導体およびフェニルアラニンまたはその誘導体であるペプチドに関する。
本発明はまた、LSYモチーフを含むSDF−1のアミノ末端由来のペプチド、および最後の残基としてセリンを有するLSYモチーフを除外している6、7、8、9、10または11個のアミノ酸残基からなるペプチドを除く、1つのアルギニンで隔てられた1つのシステインまたはその誘導体および1つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む3、4、5、6または7個の連続したアミノ酸残基を含む22個までのアミノ酸残基のペプチドを提供する。
本発明のある実施態様では、ペプチドは、配列番号12の3個の連続したアミノ酸を含む。
本発明の別の実施態様では、22個までのアミノ酸残基のペプチドは、連続したアミノ酸残基の最初と最後のアミノ酸残基が、配列番号11のように、それぞれ、システインまたはその誘導体およびフェニルアラニンまたはその誘導体である4個の連続したアミノ酸残基を含む。
本発明の別の実施態様では、22個までのアミノ酸残基のペプチドは、連続したアミノ酸残基の最初のアミノ酸残基が、配列番号13のように、プロリンである4個の連続したアミノ酸残基を含む。
本発明の別の実施態様では、22個までのアミノ酸残基のペプチドは、連続したアミノ酸残基の最初のアミノ酸残基が、配列番号16、またはシステインの代わりにdCys(Trt)残基を有する配列番号16の誘導体のように、プロリンである5個の連続したアミノ酸残基を含む。
本発明の別の実施態様では、22個までのアミノ酸残基のペプチドは、連続したアミノ酸残基の5番目の残基が、配列番号10のように、グルタミン酸である5個の連続したアミノ酸残基を含む。
本発明の別の実施態様では、22個までのアミノ酸残基のペプチドは、配列番号9のように、連続したアミノ酸残基の6番目の残基がグルタミン酸であり、および/または連続したアミノ酸残基の初めの残基がプロリンである6個の連続したアミノ酸残基を含む。
本発明の別の実施態様では、22個までのアミノ酸残基のペプチドは、C−P−C−R−F−F−E(配列番号17)のように、連続したアミノ酸残基の7番目の残基がグルタミン酸であり、および/または連続したアミノ酸残基の初めの残基がシステインである7個の連続したアミノ酸残基を含む。
加えて、本発明は、配列番号15のように、2つのアラニンで隔てられた、1つのシステインまたはその誘導体および1つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む3、4、5、6、7または8個の連続したアミノ酸残基を含む22個までのアミノ酸残基のペプチドを提供する。
本発明によってまた、LSYモチーフ(配列番号19)を含むSDF−1のアミノ末端由来のペプチドを除く、C−R−F(配列番号12)のアミノ酸配列を含む3、4、5、6、7、8または9個のアミノ酸残基のペプチドが提供される。
本発明はまた、F−K、K−F、F−R、R−F、F−EもしくはE−Fからなる2個の連続したアミノ酸;F−L−KもしくはF−K−ε―アミノカプロイック酸からなる3個の連続したアミノ酸;またはK−F−K−Fからなる4個の連続したアミノ酸を含む約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21または22個のアミノ酸であるペプチドを提供する。
加えて、本発明は、F−K、K−F、F−R、R−F、K−F−K−F、F−L−K、F−K−ε―アミノカプロイック酸、F−E、E−F、P−C−R−F−F−E、C−R−F−F−E、C−R−F−F、C−R−F、P−C−R−F、C−A−A−F、C−R−R−FまたはP−dCys(Trt)−R−F−Fであるアミノ酸配列を含む12個までのアミノ酸であるペプチドを提供する。
本発明のある実施態様では、ペプチドは、F−K、K−F、F−R、R−F、K−F−K−F、F−L−K、F−K−ε―アミノカプロイック酸、F−E、E−F、P−C−R−F−F−E、C−R−F−F−E、C−R−F−F、C−R−F、P−C−R−F、C−A−A−F、C−R−R−F、P−C−R−F−FまたはP−dCys(Trt)−R−F−Fからなる。付加的なアミノ酸が、これらの配列のN−もしくはC−末端の片方または両方に含まれ得るが、もちろん、これらの付加的なアミノ酸残基はペプチドの機能活性を顕著に妨げるものであってはならない。
本発明は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号8、アミノカプロイック酸に結合した配列番号1、配列番号6、配列番号7、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、システインの代わりにdCys(Trt)残基を有する配列番号16の誘導体または配列番号17(C−P−C−R−F−F−E)、それらの誘導体、またはそれらの組み合わせであるアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。
K−F−K−Fは、2つのK−Fペプチドを含むデュアルペプチドであって、K−Fペプチドもまた阻害活性を有しそれゆえ別の実施態様である;本発明は、多くの本発明と同じまたは異なるペプチドを含む複合的なペプチドを提供する。
本発明のペプチドは、例えば、ペプチド合成で従来用いられているアミノ末端のための様々な保護基とカップリングさせることによって、末端のアミノ基において「保護される」ことが可能である。例えば、適切な基として、フォルミル、アセチル、およびベンゾイルなどのアシル保護基;例えば、ベンジロキシカルボニル基などの環状ウレタン保護基;ならびに例えば、tert−ブトキシカルボニル基などの脂肪族ウレタン保護基を含む。
本発明のペプチドは、例えば、カルボキシル末端のための様々な保護基とカップリングさせることによって、末端のカルボキシル基において「保護される」ことが可能である。例えば、適切な保護基は、エステルまたはエーテル結合を介して末端のカルボキシル基と結合される、tert−ブチル基またはベンジル基を含む。
ペプチドという用語は、アミノ酸および/またはアミノ酸誘導体の鎖に関する。本発明のペプチドの誘導体は、付加的な化学部位をペプチドの一部分として含んでもよい。このような化学部位の例は、ペプチドのC−末端におけるカルボキシル基のアミドおよびアスパラギン酸またはグルタミン酸残基の遊離型カルボキシル基のアミドである。もちろん、本発明によって包含されるこれらの誘導体は、本発明のペプチドと実質的に同様な活性をもたねばならない。
ペプチドは、Dおよび/またはLアミノ酸を含んでもよい。1または複数のDアミノ酸残基を含むペプチドを用いることの利点は、これらのペプチドが、タンパク質分解に対し、より抵抗性があるかもしれないことであり、したがって、血漿などの生物学的液体中においてより長い半減期を有するかもしれないことである。
本発明のある実施態様では、ペプチドは、短鎖ペプチドであり、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21もしくは22個までのアミノ酸残基から、10個までのアミノ酸残基から、または2、3、4、5、6、7、8もしくは9個のアミノ酸残基からなる。
本発明はまた、円順列転換されたペプチドである本発明のペプチドを包含する。ここで使用されている「円順列転換された」という用語は、直鎖のペプチドを、直接的にまたはリンカーを介してのどちらかの方法で、環状ペプチドを作製するために末端が互いに接合し、その後、その環状ペプチドを、最初のペプチドにおける末端とは異なる末端を有する新規の直鎖のペプチドを作製するために別の位置で開環した、直鎖のペプチドを意味する。円順列転換は、環化されその後開環されたペプチドに、構造が等しいペプチドを含む。したがって、円順列転換されたペプチドは、直鎖のペプチドとしてデノボで合成されてもよく、かつ、環化および開環の段階を経ないかもしれない。ペプチドの特異的な円順列転換は、その間のペプチド結合が欠失されるアミノ酸残基を含んだひとくくりによって指定される。円順列転換されたペプチドは、単鎖のペプチドであり、通常の両末端は融合されており、しばしば融合にはリンカーが用いられ、そして、別の位置に新たな末端を含んでいる。ここに、参考文献として組み込まれる、GoldenbergらのJ. Mol. Biol., 165: 407-413 (1983)およびPanらのGene 125: 111-114 (1993)を参照。円順列転換は、直鎖ペプチドを用いて、両端を融合して環状ペプチドを作製し、そして新規の異なる両末端を有する直鎖ペプチドを作製するために、環状ペプチドを異なる位置で切断することと、機能的には同一である。したがって、円順列転換は、異なる位置に新規の末端を作りながらも、基本的にペプチドの配列およびアミノ酸の同一性を保持する効果を有している。
本発明によるペプチドは、直鎖状または環状であり得る。
フェニルアラニンおよび/またはシステインを含み、運動性および/またはCXCR4の阻害効果を示す、異なるアミノ酸の組み合わせを含む、本発明の付加的なペプチドは、例えば、化学的合成によって、または組換え技術によって、作製され得る。これらの方法は当該技術分野において公知である。化学的合成の1つの例は、マルチペプチド合成機(AMS 422. アビメド アナライザー テック社(Abimed Analyzer Tech))を用いた固相合成法である。ある実施態様では、Fmoc(N−9フルオレンチルメトキシカルボニル)法が、会社の市販用プロトコールにしたがって用いられた。ペプチド合成に関するこの方法は、広く用いられている(Fridkin et al., 2006)。ペプチド合成の後、運動性および/またはCXCR4の阻害効果を示すペプチドが、インビトロでのトランスウェルアッセイを用いることによって、実施例の部分に記載されているようにおよび/または以下に記載されているように、選択され得る。
本発明のペプチドまたは融合ペプチドの哺乳類細胞での発現は、ペプチドまたは融合ペプチドをコードしているDNAを、プロモーター配列、任意にはイントロン配列およびスプライシングドナー/アクセプターシグナル配列を含み、さらに任意には停止配列を含むベクターに挿入することによって、行われてもよい。これらの技術は一般的にAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology (Chapter 16),Greene Publications and Wiley Interscience, New York, NY, 1987-1995;Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されている。
上記のプロモーター、イントロン、および停止配列は、哺乳類細胞で動作可能である。プロモーターは、好ましくは、上記で記載したようなRSV、CMVまたはMPSVプロモーターなどの強力なプロモーターである。プロモーターはまた、SV40アーリープロモーター(Everett, et al. 1983, およびその中の参考文献)、またはベータアクチンプロモーターもしくはELF−1プロモーターなどのセルラープロモーター(Tokushige, et al., 1997)であってもよい。また、Edamatusら、1997年によって記載されているlacオペレーターおよびヒトELF−1アルファプロモーターとの間のハイブリッド、Akagiら(1997)によって記載されているCMV−ベータアクチンハイブリッドプロモーター、またはオペレーター配列およびCMVプロモーターの間のハイブリッド(Furth et al., 1994, およびその中の参考文献)などの、ハイブリッドプロモーターも使用可能であるかもしれない。
完全な配列、すなわちスプライスドナーおよびアクセプターサイトを含む配列として挿入されるかもしれない、イントロン配列は、発現させようとしているポリペプチドをコードしている配列に挿入されるかもしれない。そのようなイントロン配列の挿入は、RNAの安定性を増大させ、したがって所望のポリペプチドの産生を増大させる。原則的には、適切なイントロン配列は、イントロンを含むいかなる遺伝子から選択されてもよく、イントロン配列の例としては、ベーターアクチンイントロン、SV40イントロン、およびp55TNFレセプターイントロンが挙げられる。
イントロン配列は、上記に記載したプロモーターからの転写を増大させる、エンハンサー要素を含んでいてもよい。
しばしば、イントロン配列はまた、細胞に特異的な発現ができるようにするための転写または翻訳制御配列を含む。これゆえ、本発明のペプチドまたは融合ペプチドを細胞特異的に発現させようとする際に、このようなイントロン配列が有利に使用されるかもしれない。細胞特異的なエンハンサー要素を含むイントロンの例は、ヒト5−アミノレブリネートシンターゼ2遺伝子(Surinya et al. 1998)のイントロン8に存在する赤血球特異的エンハンサーであり、イントロン配列を用いることによるタンパク質産生の増大に関する原理についての議論は、イントロン配列の例とともに、Huangら1990によってなされている。
転写停止配列およびポリアデニレーションシグナル配列は、発現させようとしているポリペプチドをコードしているDNAの3’末端に加えられるかもしれない。このような配列は多くの、またはまさに大部分の遺伝子の中に見出されるかもしれない。有利には、SV40ポリアデニレーションシグナル配列が使用され得る(Schek et al., 1992, およびその中の参考文献)。
本発明のペプチドまたは融合ペプチドの哺乳類細胞内での発現のためのベクターとしては、例えば、所望するポリペプチドをコードしている遺伝子を発現させるためのCMVプロモーターを含むpcDNA3.1ベクター(インビトロジェン社(Invitrogen))およびMPSVプロモーターを有するpMPSVEHベクターが使用され得る。
組換えポリペプチドは、このようなポリペプチドをコードしているベクターで遺伝子導入されたバクテリアもしくは真核細胞(たとえば、CHO)の培養宿主細胞中、またはトランスジェニック動物中のどちらででも産生されうる。トランスジェニック動物を使用する場合は、異種のポリペプチドをその母乳中で産生するために特に有利である。牛、羊およびヤギなどの乳用動物はしたがって、宿主の例である。例えば、国際公開第88/00239号パンフレット、同第90/05188号パンフレット、同91/02318号パンフレットおよび同92/11757号パンフレット;および米国特許第4,873,191号;4,873,316号;および5,304,489号明細書を参照のこと。またこれらはここに引用文献として完全に組み入れられる。
本発明はまた、本発明のペプチドまたは融合ペプチドをコードしているDNA配列を含む発現ベクター、および該ベクターを、昆虫細胞、イースト菌、またはHeLa、293T HEKおよびCHO細胞などの哺乳類細胞などの、原核または真核宿主細胞に遺伝子導入すること、それら細胞を培養することおよび産生されたタンパク質を単離することによってペプチドを産生するための方法を提供する。
さらに、本発明は、ペプチドまたはその融合ペプチドをコードしているウイルスベクターを提供する。
したがって、本発明による付加的なペプチドは、例えば、システインおよび/またはフェニルアラニンを含有する22個までのアミノ酸残基のペプチドの化学的合成または組換え発現、それらペプチドの運動性阻害効果および/またはSDF−1/CXCR4阻害活性の評価、および配列番号1から配列番号16のペプチドのように同様の運動性阻害効果および/またはSDF−1/CXCR4阻害活性を示すペプチドの選択によって単離され得る。これゆえ、付加的なシステインおよび/またはフェニルアラニンを含有するペプチドまたは融合ペプチドは合成されることができ、そして様々な濃度でSDF−1によっておよび/または自発的に誘導される遊走性についてインビトロまたはインビボでヒト初代T細胞、CD34+幹細胞またはPre−BLL細胞を用いて試験され得る。一般的に、インビトロでの遊走実験のためには、細胞(例えば、1×106/mL)が、例えば2時間37℃、95%の湿度でペプチドとインキュベートされ、それから、コースター製24−ウェルの孔径5μmのフィルターを備えたトランスウェルプレート(コーニング社(Corning Inc.)、コーニング、NY)の上部のチャンバーに未洗浄で加えられ、2時間37℃、95%の湿度、5%のCO2で自発的またはSDF−1(20ng/mL)に対して遊走させられ得る。あるいは、ペプチドはトランスウェルアッセイの下部のチャンバーに加えられてもよい。移動した細胞は下部のチャンバーより集められ、そしてFACSCaliburフローサイトメーター(ベクトン デッキンソン社(Becton Dickinson)、サンジョゼ、カリフォルニア)を用いてカウントされ得る。細胞は、常数ゲインで設定された前方散乱光および側方散乱光をパラメーターとしてゲーティングされ得る。データは、移動した未処理の細胞の割合を100%とした場合に比べて、ペプチドで前処理された場合の移動した細胞の割合として示され得る。
下部のウェル中および/または試験された細胞と接触しているペプチドの濃度は、5nM〜100nMまたは0.1mM〜10mMまたは50mMおよび100mMまで;5または10mMまで;および約0.1mM、1mM、5mMまたは10mMの範囲であり得る。
本発明は、上記で定義されたように本発明によるペプチド、それらの塩および/またはそれらの誘導体および/またはそれらの融合ペプチドに関連している。
ここで「塩」という用語は、本発明のペプチドのカルボキシル基の塩およびアミノ基の酸添加塩の両方を意味する。カルボキシル基の塩は、当該技術分野において公知の方法によって作製されるかもしれず、かつ、例えばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、第2鉄または亜鉛の塩などの無機塩、ならびに、例えばトリエタノールアミン、アルギニンまたはリジン、ピペリジン、プロカインなどのアミンとから作られるような有機塩基との塩を含む。酸添加塩は、例えば、例えば塩酸または硫酸などの無機酸との塩、および、例えば酢酸またはシュウ酸などの有機酸との塩を含む。もちろん、このような塩は何であっても、本発明のペプチドと実質的に同様な活性を有していなければならない。
本発明はまた、本発明によるペプチドまたは融合ペプチドをコードしているDNA配列に関する。その上、本発明はさらに、生物学的に活性なペプチド、断片または本発明によるペプチドの融合ペプチドをコードするDNA配列に関する。
別の局面では、本発明は、フェニルアラニンまたはその誘導体、システインまたはその誘導体、フェニルアラニンもしくはその誘導体およびシステインもしくはその誘導体の混合物または組み合わせ、フェニルアラニンもしくはその誘導体および/またはシステインもしくはその誘導体を含む22個までのアミノ酸残基のペプチド、該ペプチドをコードしているDNAまたは該DNAを包含しているベクターならびに薬学的に許容され得る担体などの、本発明による薬剤を含む医薬組成物を提供する。
本発明のある局面では、CXCR4によって引き起こされるかまたは関連する疾患もしくは症状、またはCXCR4の阻害に反応性の疾患もしくは症状の治療のための医薬または動物薬組成物であって、薬学的または動物薬学的に許容され得る賦形剤または担体とともに本発明による薬剤を含む組成物が提供される。
本発明は、CXCR4活性の阻害または運動性の阻害に反応性である疾患、障害もしくは症状、または疾患、障害もしくは症状の病状がケモカインレセプターCXCR4のレベルまたは活性および/または細胞の運動性のレベルによって引き起こされているかまたは関連している疾患もしくは症状の管理(すなわち、治療または予防)における、人間の患者などの必要とする個体または獣医学における本発明による薬剤の使用を提供する。本発明による薬剤は、インビボまたはエックスビボにて投与され得る。
明細書の記載で使用されている細胞の運動性および細胞遊走という用語は、交換可能である。
疾患、障害もしくは症状を「治療/改善」する場合、本発明による薬剤または薬物は、疾患の兆候が見られたのちに与えられ、「予防」は、疾患のいかなる徴候をも患者が感知できる以前に本発明による薬物を投与することを意味している。
CXCR4の阻害、細胞の運動性の阻害、またはCXCR4または細胞の運動性の両方の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状は、該疾患、障害もしくは症状の病状または経過に反応性または関与する細胞内でのCXCR4発現または活性の阻害、該疾患、障害もしくは症状の病状または経過に反応性または関与する細胞内での細胞運動性の阻害、または、該疾患、障害もしくは症状の病状または経過に反応性または関与する細胞内でのCXCR4発現もしくは活性および運動性の両方の阻害によって、改善または予防され得る。
CXCR4活性に関係するかもしくは引き起こされるかまたはCXCR4活性の阻害に反応性である疾患、障害もしくは症状の例は、原発性腫瘍の増殖、二次転移による湿潤;リウマチ様動脈炎、化膿性関節炎、変形性関節症、歯周炎、歯肉炎、喘息、自己免疫疾患、乾癬、乾癬性関節炎、アトピー性皮膚炎などの炎症疾患;間質性腎炎、眼内炎症、肝硬変、神経系の炎症症状または神経炎症性障害、すなわち、多発性硬化症、移植拒否反応(すなわち、移植片対宿主疾患)、胃の炎症性症状、すなわち、クローン病、炎症性腸疾患、および潰瘍性大腸炎、および後天性免疫不全症候群(AIDS)を含むが、これらに限定されるわけではない。CXCR4はニューロン細胞遊走に関連していることが知られており、したがって、本発明は、パーキンソン病および精神分裂病などの神経学的疾患における、本発明による薬剤の使用を含む。
CXCR4は癌細胞に通常発現されているようであり、遊走、湿潤、増殖、生存期間およびその他の悪化の過程において役割を果たしている。少なくとも23の異なるタイプの癌からの悪性細胞はケモカインレセプターCXCR4を発現しており、かつそのリガンドであるSDF−1に対して反応性である。
CXCR4レセプターは、Balkwill,2004年によって、転移部位への癌細胞の直接の移動に関与しており、癌細胞の生存率および腫瘍が促進するサイトカイン/ケモカインネットワークの形成を増加させることが示唆された。したがって、CXCR4のアンタゴニストは癌治療において重要である。発明者らは、理論に縛られることを望んではいないが、CXCR4のアンタゴニストは、CXCR4を発現している癌に対して、増殖の速度を低下させることによってまたは増加の停止を引き起こすことによってまたは癌細胞の死を引き起こすことによって、効果的な治療を提供することを信じている。
したがって、本発明のある実施態様は、CXCR4を発現している癌の治療における、本発明による薬剤の使用に関する。
CXCR4/SDF−1は、血管形成および内皮細胞の遊走に重要である。したがって、CXCR4阻害は、血管形成を妨げることが望ましい、固形腫瘍のような疾患の治療に有利であると思われる。
CXCR4を発現する癌の例としては、B−CLL、AML、B系ALL、眼内悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、CML、多発性骨髄腫、膵臓癌、前立腺癌(限局性および転移性癌)、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、甲状腺癌、直腸癌、口腔扁平上皮癌、子宮頸癌、神経芽腫、神経膠腫、星状細胞腫、横紋筋肉腫、小細胞肺癌および黒色腫を含むが、これらに限定はされない。CXCR4を過剰に発現している癌細胞の例としては、B−CLL、B系ALL、濾胞性リンパ腫、および星状細胞腫を含む(Balkwill, 2004)が、これらに限定はされない。
前駆B−ALLは最も発症率の高い小児悪性腫瘍であり、二番目に発生率の高い成人の急性白血病である。白血病細胞は、肝臓、脾臓、リンパ節、および中枢神経系に浸透する能力を有している。白血球細胞におけるCXCR4の高い発現率が、小児ALLの患者の中枢神経系への浸透を含む、器官侵襲性のためには強力に予測される。
本発明によって、インビボでは、本発明による薬剤がB細胞型急性リンパ芽球性白血病細胞の骨髄、脾臓、肝臓および肺へのホーミングを妨げることが見出された。したがって、該薬剤は、白血病細胞の器官への侵襲を妨げることを対象にしてもよい。
これゆえ、ある実施態様では、本発明は、B細胞型急性リンパ芽球性白血病のような白血病を治療または予防するための、本発明による薬剤の使用を提供する。
細胞運動性および/またはCXCR4/SDF−1相互作用と転移の発生との間の関連性はよく知られている。CXCR4/SDF−1相互作用は、前立腺癌、腎臓癌、神経芽腫、卵巣癌、乳癌、リンパ節、骨髄、頭部および頚部癌、ならびに皮膚を含むSDF−1の豊富な供給源である器官に対する黒色腫を含むいくつかの癌のタイプにおける転移に関係している。
したがって、別の実施態様では、本発明は、転移を治療または予防するための、本発明による薬剤の使用に関する。
CXCR4のシグナル伝達および/または細胞の運動性は炎症において役割を果たしていることが知られている。例えば、SDF−1レベルは炎症性の肝臓疾患において、リウマチ様関節の過形成被覆膜における滑膜細胞において、増加されている。慢性関節リウマチのマウスモデルにおいて、ペリアスリック(periathric)細胞に注射された外因性のSDF−1は、炎症性応答を引き出す(Balkwill 2004による総説を参照)。最初の徴候が現れる前に、CXCR4アンタゴニストであるAMD3100でマウスを治療することが、効果的であることが発見された。SDF−1は、変形性関節症および慢性関節リウマチにおける軟骨の破壊に関与している(Kanbe et al., 2004)。最近、CXCR4およびSDF−1が炎症/感染を誘発する神経毒性に関与していることの証拠が見出された。
したがって、CXCR4アンタゴニストおよび/または細胞運動性の阻害剤は、炎症を予防または治療するために効果的である。
したがって、ある実施態様では、本発明は、炎症を予防または治療するための、本発明による薬剤の使用を提供する。
CXCR4が、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)のコーレセプターとしてはたらくことは、当該技術分野で公知である。CXCR4はHIVとおよび細胞のCD4レセプターと、細胞内へのウイルスの進入を可能にするために相互作用する。これらのレセプターに対するアンタゴニストを基にした治療方法が、開発されてきており、そのうちのいくつかが現在、臨床試験段階にある(Murakami および Yamamoto, 2000)。したがって、CXCR4アンタゴニストは、後天性免疫不全症候群(AIDS)の予防または治療に効果的である。
したがって、ある実施態様では、本発明はAIDSを治療または予防するための、本発明による薬剤の使用を提供する。
本発明による発見が、本発明によるペプチドの存在下、SDF−1によって誘導されるT細胞の遊走をインビトロで減少させることを示しているので、このようなペプチドはSDF−1/CXCR4系が関与している様々な病状の状況で用いられるかもしれない。
血液からのT細胞の補充は、病気の組織の損傷および炎症の開始および管理に不可欠であると考えられている。したがって、本発明による薬剤は、抗原により活性化されたT細胞の血液から炎症位置への移動を妨げるために使用されるかもしれない。T細胞遊走を阻止する本発明のこれらの薬剤、特に本発明のペプチドは、T細胞浸透性の自己免疫疾患の病状を減少または阻害するための治療薬として使用されるかもしれない。
別の局面では、本発明は、病状が、ケモカインレセプターCXCR4の活性によって引き起こされるかまたは関連する疾患、障害もしくは症状を治療および/または予防するための方法であって、該方法が、必要とする個体に、治療上効果的な量の本発明による薬剤またはその塩を、任意には薬学的に許容され得る担体とともに投与することを含む方法を提供する。したがって、本発明は、必要とする個体における、特に人間の患者における、CXCR4の阻害反応性である疾患もしくは症状の管理(すなわち、治療または予防)の方法であって、該方法が、治療上効果的な量の上記で定義された本発明による薬剤、または薬学的に許容され得るそれらの塩を、個体に投与することを含む方法に関する。適切な塩に関する概要については、Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use by Stahl and Wermuth (Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002)を参照のこと。
したがって、本発明のある局面では、フェニルアラニン、システイン、該アミノ酸の誘導体およびそれらを含むペプチドが、例えば、CXCR4を発現している癌、後天性免疫不全症候群(AIDS)、炎症および転移の治療または予防のために、CXCR4活性および/または細胞運動の阻害剤として、投与され得る。
組成物の1回のまたは複数回の投与が、個体により必要とされかつ許容される服用量および頻度にしたがって行われるかもしれない。これらの薬剤の組成物の濃度は、治療効果を得るために充分な量の分子を体内に運ぶことができるようにデザインされるであろう。組成物は、ここに記載された疾患および症状の経過ならびに重症度に効果を示すのに充分であり、疾患を減退または寛解させる量の化合物および薬剤を運ぶことができるようにデザインされるであろう。効果的な量は、投与方法、治療される疾患および個体の症状に依存するであろう。
癌患者が本発明の薬剤による治療によって恩恵を受けるかどうかは、もし望むのであれば、患者から腫瘍サンプルを得てCXCR4がサンプル中に発現しているが否かを決定することによって(例えば、下記に例示したようにCXCR4を測定することによっておよび/またはmRNAレベルによって、また当該技術分野でよく知られている他のいかなる方法によっても)または該サンプル中でのSDF−1の、増殖、接着、運動性、ホーミング、カルシウム放出およびSDF−1によって情報伝達される他の活性を調節する能力を決定することによって、決定され得る。
予防的な投与は、罹患するリスクが非常に高い患者またはここで記載した疾患もしくは症状で苦しんでいる患者において特に有用である。
本発明による薬剤はまた、抗ウイルス製剤(例えば、HIV逆転写酵素阻害剤のヌクレオシドまたは非ヌクレオシド、HIVタンパク質分解酵素阻害剤、およびHIVインテグラーゼ阻害剤)、化学療法などの抗腫瘍剤といったほかの治療用薬剤または他の抗炎症薬剤と併せて、組み合わせ療法において使用されてもよい。
「薬学的に許容され得る」という定義は、活性成分の生物学的活性の効果を妨げず、かつそれが投与される宿主にとって有毒でないような、いかなる担体をも含むことを意図している。たとえば、非経口の投与では、本発明による薬物は、生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミンおよびリンガー溶液などの媒体中に、注射薬として単位投薬形態として製剤化されるかもしれない。
いかなる特定の患者にとっても特異的な投薬量のレベルは、使用される特異的化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与の時間、投与方法、排出速度、薬物の組み合わせおよび治療を受けている特定の疾患の深刻さを含む、様々なファクターに依存していることは理解されるであろう。理想的な投与量のレベルおよび投薬の頻度は臨床試験によって決定されるであろう。
本発明と関係のある化合物は、それらの薬物動態学的特性と一致した経路による投与のために調製されるかもしれない。
経口的に投与可能な組成物は、タブレット、カプセル、粉末、顆粒、舐剤、および経口、局所的、または滅菌の非経口溶液もしくは懸濁液などの液体またはゲルの形で調製されてもよい。経口投与のための錠剤およびカプセルは、単位用量を表す剤形であるかもしれず、かつ、例えば、シロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、またはポリビニル−ピロリドンなどの結合剤;例えば、ラクトース、砂糖、とうもろこしでんぷん、リン酸カルシウム、ソルビトールまたはグリシンなどの充填剤;例えばステアリン酸塩マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコールまたはシリカなどの錠剤潤滑剤;例えばジャガイモでんぷんなどの錠剤分解物質、または硫酸ラウリルナトリウムなどの許容可能な湿潤剤などの従来からの賦形剤を含んでいてもよい。錠剤は、通常の薬務でよく知られているような方法にしたがって、コートされてもよい。経口用液体調製は、例えば水性または油性の懸濁液、溶液、乳濁液、シロップまたはエリキシル剤などの形であるかもしれず、使用前に水またはその他の適切な媒体で再生されるような乾燥した製品として提供されるかもしれない。そのような液体調製は、たとえば、ソルビトール、シロップ、メチルセルロース、グルコースシロップ、食用のゼラチン硬化油脂のような懸濁化剤;例えばレシチン、オレイン酸塩ソルビタン、またはアカシアなどの乳化剤;例えば、アーモンドオイル、分画されたココナッツオイル、グリセリン、プロピレングリコール、またはエチルアルコールなどの油脂エステルなどの非水性媒体(食用の尾油脂を含んでいてもよい);例えば、メチルまたはプロピル パラヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸などの防腐剤、およびもし望ましいのであれば従来の香料または着色剤などの従来の添加剤を含んでいてもよい。
皮膚への局所的塗布のためには、薬剤は、クリーム、ローションまたは軟膏に調合されるかもしれない。薬剤として使用されるかもしれないクリームまたは軟膏の製剤は、例えば薬剤学の標準的な教科書であるBritish Pharmacopoeiaに記載されているように、当該技術分野においてはよく知られている、従来の製剤である。
目への局在的塗布のためには、薬剤は、適切な滅菌の水性または非水性媒体中の溶液または懸濁液に調合されるかもしれない。添加剤、例えばナトリウムメタ重亜硫酸塩またはエチレンジアミン4酢酸2ナトリウム塩などの緩衝剤;例えばフェニルマーキュリック酢酸塩または硝酸塩、ベンズアルコニウムクロライドまたはクロルヘキシジンなどの殺バクテリア剤および殺真菌剤を含む防腐剤、ならびにアッシュプロメローセル(ashypromellose)などの増粘剤もまた含まれるかもしれない。
活性化成分はまた、滅菌の溶媒中で非経口で投与されるかもしれない。使用される媒体および濃度に依存して、薬剤は媒体に懸濁または溶解され得る。有利には、局所麻酔薬、防腐剤および緩衝剤などの補助剤が媒体に溶解され得る。
本発明を完全に記載したので、当業者によって、本発明の本質および範囲から外れることなく、かつ過度の実験を行うことなく、様々な範囲の同様のパラメーター、濃度および条件内で、同様のことが行われ得ることは明らかである。
本明細書で引用された、機関紙の論文または要約、刊行されたまたは未刊行である米国または外国の特許出願、発行された米国または外国の特許または他の全ての参考文献を含む全ての引用文献は、明細書中に参考文献として完全に組み入れられる。
公知の方法段階、従来の方法段階、公知の方法または従来の方法への参考文献は、いかにしても、本発明のいかなる局面、記載または実施態様が、関連技術として開示され、教示されまたは示唆されているという是認ではない。
本発明は、より詳細に以下の非限定的な実施例および付属の図に記載されるであろう。
材料および方法
(i)細胞培養:ヒトCB CD34+細胞の集積が、以前に記載されたように(Kollet et al., 2001)磁性ビーズ分離を用いて行われた。
(i)細胞培養:ヒトCB CD34+細胞の集積が、以前に記載されたように(Kollet et al., 2001)磁性ビーズ分離を用いて行われた。
MS−5およびCD34+細胞は、10%の熱により不活性化されたFCS、抗生物質およびグルタミンを追加したRPMI1640培地中で培養された。マウスのMS−5ストローマル細胞株(ミレニウム ファーマシューティカル(Millennium Pharmaceuticals)、ケンブリッジ、マサチューセッツ、USA)は以前に記載されている(Bleul et al., 1996)。
前駆B ALL細胞株G2およびB1は、以前に記載されている(Freedman et al., 1993)。B1およびG2細胞は、10%の熱により不活性化されたFCS、抗生物質およびグルタミンを追加したIMDM中で培養された。
(ii)トランスウェルアッセイ:トランスウェルアッセイはコースター製トランスウェル(6.5mm/直径、5μm/孔径)を用いて以前に記載されたように行われた(Aiuti et al., 1997)。
典型的には、細胞(100μl溶媒中に1−2×105個)がトランスウェル器具の上部チャンバーに加えられた。SDF−1(125ng/ml)が添加もしくは無添加の標準の溶媒またはB1馴化培地(600μl)が下部のチャンバーに加えられた。4時間以内にチャンバーの底に移動した細胞が、FACSort(ベクトン デッキンソン社)を用いてカウントされた。組換えヒトSDF−1はぺプロテック社(PeproTech)より購入された。
(iii)接着アッセイ:ヒトCB CD34+細胞(1×105/ウェル)はCFSE(モレキュラー プローブ社(Molecular Probes))によってラベルされ、培地でまたはPhe−olを追加した(5mMまたは10mM)培地で2時間インキュベートされ、96ウェル中37℃で(1×105細胞/ウェル)45分間、融合性MS−5細胞に接着させた。非接着性細胞は、FACSバッファー(PBS+1%FCS+0.02%NaNO3)で2回洗浄された。接着性細胞は、0.5mMEDTAが加えられた150μlのFACSバッファー中に集められた。CFSE+細胞の数は、FACS分析によって決定された(FACSCalibur; BD)。
(iv)カルシウム流入アッセイ:SDF−1(0.5μg/ml)刺激の後に、G2細胞を用いたカルシウム流入アッセイが以前に記載されているように行われた(Aiuti et al., 1997)。
(v)インビボ実験 インビボ実験は、Defined flora condition下、換気されている滅菌のマイクロアイソレーターケイジ中で交配され維持されているNOD/LtSz−Prkdcscid(NOD−SCID)マウスを用いて行われた。インビボモデルは、正常細胞のおよび白血病性のヒトCD34+CD38−/low幹細胞を、免疫不全移植マウスNOD/SCIDおよびNOD/SCID/B2mnullにおけるヒト造血を開始するためのそれらの機能的能力に基づいて同定するために育てられた(Lapidot et al., 1997)。
溶媒を含むPhe−ol(5mM)またはPhe−ol(10mM)との2時間のプレインキュベーションの後、ヒトG2細胞(107/マウス、ホーミングの試験用)が、8週齢のNOD−SCIDマウスの尾の静脈に注入された。注射から16時間後に(ホーミングを評価するため)、マウスは犠牲にされた。BM細胞は、大腿骨、脛骨、および骨盤の骨から洗い流された。ヒト細胞の割合が、以下に述べられるようにフローサイトメトリーによって決定された。
(vi)フローサイトメトリー:移植されたマウスのBM中のヒト細胞のレベルが、以前に述べられたように抗ヒトCD45 FITC(IQ Products)を用いて、検知された(Spiegel et al., 2004)。染色後、細胞はFACSCaliburによってCellQuestソフトウエア(BD バイオサイエンス社)を用いて解析された。
CXCR4発現は、抗CXCR4 PE(BD バイオサイエンス社、ファーミンゲン(Pharmingen))によって検知された。
(vii)ウェスタンブロット解析:未処理のG2細胞またはB1馴化培地で終夜前処理されたG2細胞が、200ng/mlのSDF−1で所定の時間の間、刺激され、そしてライシスバッファー(25mM Tris pH7.5、1% Triton、0.5mM EDTA、150mM NaCl、10mM NaF、NaVO3、PMSF、1% タンパク質分解酵素抑制剤カクテル[シグマ−アルドリッチ社(Sigma-Aldrich)])とともに1時間インキュベートすることによって、細胞溶解物を得た。タンパク質は、10% SDS−PAGEで分離された。ニトロセルロース中にブロットされたリン酸化ERKを検知するために使用された抗体は、シグマ社から入手した抗リン酸化ERKおよび抗ERKである。
(viii)PKC−ζのためのRT−PCR:全体のRNAがB1細胞またはG2細胞からTRI試薬(モレキュラー リサーチ センター社(Molecular Research Center Inc.))を用いて単離された。RT−PCRは以前に記載されたように(Petit et al., 2005)、PKC−ζに特異的なプライマー、センス鎖5’‘TATCTACCGCCGGGGAGCCAGAAGA’(配列番号20)アンチセンス鎖5’‘TAGCTCCCGCGCCCGATGACTCTGA’(配列番号21)を用いて行われた。PCRプロダクトは451塩基対であった。βアクチンが、RT−PCRにおけるRNA量のノーマライゼーションのコントロールとして使用された。
(ix)B1馴化培地の分画および遊走阻害ファクターの分離:C18カラムが、疎水性によって分離を行うために用いられた。HPLCは、C18カラムで、水(0.1%トリフルオロ酢酸を含む)からアセトニトリル(0.1%トリフルオロ酢酸を含む)へのリニアグラディエントを用いて行われた。検知は、220nmおよび254nmに合わせたUV分光光度計を用いて行われた。
B1馴化培地およびC18での活性画分のゲルろ過分離は、スーパーデックスペプチドHR10/30カラムを用いて行われ、そしてサンプルは脱イオン化蒸留水(DDW)によって溶出させられた。
馴化培地または適切に制御されたイスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)の低いMW(<3kDa)を有する画分がカラムによって分離され、そして異なる画分の遊走阻害能が、G2細胞を用いたトランスウェルアッセイによって評価された。
(x)ぺプチド合成:ペプチドは固相法により、マルチペプチド合成機(AMS 422、Abimed Analyzer Tech)を用いて合成された。Fmoc(N−9フルオレンチルメトキシカルボニル)法が、Fridkinら、2006によって述べられているように会社の市販用プロトコールにしたがって行われた。
(xi)初代T細胞の調製:初代T細胞の調製は、Zanin−Zhorovら、2006によって述べられているように行われた。
実施例1:リンパ芽球性白血病性前駆B細胞の馴化培地中に存在するファクターは、白血病性および正常な造血細胞の運動性を阻害する。
高い細胞密度で培養された培養液から得られたB1細胞(急性リンパ芽球性白血病B細胞[B−ALL]をもつ患者からのB細胞から調製された株)は、低い細胞密度で培養された培養液から得られたB細胞に比べて、SDF−1勾配に対して明らかに少ししか移動しないことが見出された(インビトロのトランスウェル移動アッセイによって試験されることによって)(図1A)。したがって、移動の阻害が、細胞―細胞の相互作用の阻害を誘導することができた細胞密度の結果によるものであるのか、または細胞によって培地中に分泌されたファクターによるものであるのかが、さらに調べられた。したがって、白血病性B1細胞、B1−2細胞(B1細胞由来のサブクローン)、白血病性G2細胞(異なる前駆B−ALL患者から調製された、別の前駆B細胞株)または高い細胞密度での培養からのB1細胞の培地を用いて前処理された正常の臍帯血(CB)CD34+細胞が、トランスウェルアッセイにおけるSDF−1グラディエントに対して移動する能力についてアッセイされた。トランスウェルの上部ウェルには1〜2×105の細胞がロードされ、下部のウェルには高い細胞密度での培養からのB1馴化培地またはコントロールのIMDMがロードされた。図1にまとめられた結果は、B1馴化培地による、白血病性B1細胞、G2細胞および正常なCB CD34+細胞のSDF−1依存性遊走の阻害を示している(G2およびCD34+細胞における、それぞれ35%および25%の阻害)。
したがって、得られた結果は、細胞遊走阻害ファクターが、高い細胞密度で培養されたB1細胞馴化培地中に見出されたことを示している。
続く実験は、細胞遊走阻害ファクターがSDF−1によって伝達されるシグナルの阻害を介してはたらいているのかどうかを評価するために行われた。
SDF−1刺激はCD34+ヒト前駆細胞の遊走を必要とし、ERKリン酸化を含むシグナル経路を活性化する(Petit et al., 2005)ので、発明者らはG2細胞をB1馴化培地でインキュベートし(37℃で終夜)、これらの細胞におけるSDF−1誘導性のERKリン酸化をモニターし、未処理の細胞におけるSDF−1誘導性のERKリン酸化と比較した。ERKリン酸化は、リン酸化されたERKに特異的な抗体の検知のために使用される細胞溶解物のウェスタンイムノブロッティング分析によって評価された。得られた結果は図1Cにまとめられており、G2細胞のB1馴化培地とのインキュベートが、SDF−1誘導性のリン酸化シグナルを〜1.6倍減少させていることを示している。
PKC−ζは、SDF−1シグナル伝達に関与するもう1つのカイナーゼである。PKC−ζの発現が、高濃度条件で培養されたB1細胞において顕著にダウンレギュレートされることが見出された(図1D)。このようなPKC−ζの発現のダウンレギュレーションは、同様に高い細胞濃度で培養されたが細胞遊走阻害ファクターには欠けていた別の白血病性G2細胞においては、見られなかった。
以上のことから、B1馴化培地中に存在する細胞遊走阻害ファクターが、SDF−1シグナル伝達を阻害することが示された。
実施例2:B1細胞馴化培地中に存在する細胞遊走阻害ファクターの単離。
細胞遊走阻害ファクターの大きさを決定するために、ファクターを含むB1馴化培地が、様々な孔径を有するアミコンフィルターを用いてろ過され、そして細胞遊走を阻害する能力が、ろ液および残留画分の両方について試験された。G2遊走の阻害は、分子量が<3kDaであるろ液画分で見られたが、分子量が>3kDaである画分では見受けられなかった。
アミコンろ過された低いMW(<3kDa)画分は、24mlスーパーデックスペプチドHR 10/30カラム上でゲルろ過によって分離された。0.5mlの画分が、カラムにロードされ、そして3回蒸留した水によって溶出された。異なる画分の遊走阻害能力が、トランスウェル運動性アッセイによってG2細胞を用いて測定された(0.5mlのイスコフ改変ダルベッコ培地IMDMが対照としてカラム中で分離された)。図2Aにまとめられた結果は、MWが〜150ダルトンに相当する、画分番号33〜34がG2細胞の遊走を40%阻害したことを示している(図2A、B)。
低い分子量を有する細胞遊走阻害ファクターは沸騰および低pH条件(6N HCl)に抵抗性であることが判明した。
アミコンろ過された低いMW(<3kDa)の疎水性C18カラム上での分画、続くスーパーデックスゲルろ過カラムでの分画によって精製された細胞遊走阻害ファクターは、マススペクトル分析によって特徴付けられ、フェニルアラニンである165ダルトンのMWを有することが発見された。阻害のピークのマススペクトル分析は、それがフェニルアラニンに富んでいることを示した。
次に、C18からむおよびスーパーデックスカラムにおけるフェニルアラニンの溶出パターンを試験したところ、細胞遊走阻害ファクターの溶出パターンと類似していることが判明した。
以上のことから、細胞遊走阻害ファクターの特性は、それがフェニルアラニンであることを示している。
実施例3:フェニルアラニンおよびシステインのアミノ酸が有力な細胞遊走阻害ファクターである。
前述の実施例で得られた発明者らの結果は、B1馴化培地中に存在する細胞遊走阻害ファクターがフェニルアラニンであることを示している。続く実施例は、フェニルアラニンまたは他のアミノ酸の自発的およびSDF−1誘導性のG2細胞の運動性を阻害する能力を試験する為に行われた。
トランスウェルアッセイにおけるSDF−1誘導性のまたは自発的な運動性への、様々な濃度の以下のアミノ酸のそれぞれとG2細胞のインキュベーションの効果が試験された;フェニルアラニン(Phe)、グルタミン酸(Glu)、バリン(Val)、プロリン(Pro)、システイン(Cys)およびメチオニン(Met)。
図3Aにまとめられた結果は、アミノ酸が細胞の運動性を阻害していること、PheおよびCysが自発性(図3A、左上)およびSDF−1誘導性(図3A、右上)のどちらの遊走においても最も有力な阻害剤であることおよびそれらの阻害が用量依存性であることを示している。フェニルアラニンよりも良好な溶解性を有するフェニルアラニン誘導体の遊走阻害能力がまた試験された(図3A、下部のパネル)。L−フェニルアラニノール(Phe−ol)およびサクシニルフェニルアラニン(Suc−Phe)など(Mati Fridkin教授から提供された)のフェニルアラニン誘導体の自発的またはSDF−1依存性の細胞遊走への阻害効果が評価された。トランスウェルの下部に加えられたL−またはD−フェニルアラニンのどちらかが、G2細胞の遊走を阻害することが見いだされた(図3B)。
フェニルアラニン残基、Phe−Lys、Lys−Phe、Phe−Arg、Arg−Phe、Lys−Phe−Lys−Phe、Phe−Glu、Glu−Phe、Phe−Leu−Lys、およびPhe−Lys−ε−アミノカプロイック酸を含む短鎖ペプチドの、自発的なG2細胞遊走への効果が試験された(図3C)。全てのペプチドがG2細胞の遊走を阻害することができることが見いだされた。ペプチド、Phe−Lys、Lys−Phe、Phe−Arg、Arg−PheおよびPhe−Gluは、約50%の細胞遊走を阻害することができ、そしてPhe−Leu−LysおよびPhe−Lys−ε−アミノカプロイック酸は、約30%の細胞遊走を阻害することができた。
Phe−ol阻害の分子レベルの機序を調べるために、およびそれがB1細胞馴化培地におけるもの(図1D参照)と同じであるのかを確認するために、溶媒(IMDM)、B1細胞馴化培地(図3E、上部パネル)、またはPhe−ol(図3E、下部パネル)で前処理されたG2細胞中のPKC−ζ mRNAのレベルが観測された。PKC−ζ発現は、G2細胞中で、Phe−olでのまたはB1細胞馴化培地での処理の後にダウンレギュレートされていることが発見された。したがって、B1馴化培地およびPhe−olは、PKC−ζによって制御されている同じシグナル経路を介して遊走を阻害する。
続く実施例は、フェニルアラニン誘導体であるPhe−olの自発的およびSDF−1依存性の正常な幹細胞および成熟T細胞の遊走への効果を確認するために行われた(図3D)。この目的のために、G2、CD34+前駆細胞(左)または以前述べられたように調製された(Zanin-Zhorov et at., 2005)初代T細胞(右)が上部のウェルにロードされ、Phe−olが下部のウェルに加えられ(SDF−1含有培養液と共に、またはなしで)、そして下部のウェルへの遊走が測定された。Phe−olが、効果的なG2、CD34+の(図3A、左側パネル)、およびT細胞のSDF−1依存性または自発的な遊走の阻害剤であることが見いだされた。
異なる濃度のβ−フェニルアラニン(シグマ社 カタログ番号 p-6513)が、培地とともにまたはSDF−1を追加した培地とともに、トランスウェルアッセイの下部のウェルに加えられた。フェニルアラニンは、上部のウェルにロードされたG2細胞の自発的なおよびSDF−1依存性の遊走を阻害することが見いだされた(図3F)。
実施例4:Phe−olは、G2細胞においてCXCR4ダウンレギュレーション、接着の減少およびSDF−1シグナル伝達の変化を誘導する。
前述の実施例において、フェニルアラニンおよびその誘導体が、細胞遊走に関するSDF−1活性への阻害効果を有していることを示した。以下の実施例はフェニルアラニン誘導体の阻害効果がSDF−1の他の活性に関与するか否かを評価するために行われた。そのような活性の1つは、幹細胞の接着の調節である(Peled et al., 1999; Peled et al., 2000)。ヒトCB CD34+細胞(1×105/ウェル)がCFSE(モレキュラー プローブ社)でラベルされ、Phe−ol(5および10mM)とインキュベートされ、そして融合性MS−5細胞へ、37℃で45分間(1×105細胞/ウェル)0.2%のBSAが添加された96−ウェルプレート中で接着させた。非接着細胞はFACSバッファーで2度洗浄された。接着細胞は、0.5mM EDTAを添加された150μlのFACSバッファー中に回収された。CFSE+細胞の数はFACS分析により決定された(FACSCalibur; BD)。得られた結果は図4Aにまとめられており、Phe−olがCD34+前駆細胞のストローマル細胞への接着を阻害することおよびPhe−olの阻害活性は用量依存であることを示している。
次に、G2細胞でのSDF−1によって誘導されるカルシウム流動におけるPhe−olの効果が調べられた。Phe−olはSDF−1刺激に応答してカルシウムフラックスを阻害することが発見された(図4C)。
本明細書中で得られた結果は、Phe−olがSDF−1によってシグナル伝達される、細胞遊走、細胞接着およびカルシウム流動などの様々な活性を阻害することが可能であることを示している。
次の実施例は、SDF−1に関連した活性のPhe−olによる阻害が、SDF−1レセプター、CXCR4のダウンレギュレーションと関連しているのか否かを評価するために行われた。このために、初代T細胞、G2細胞またはCD34+細胞が、Phe−olとの2時間のインキュベーションによって前処理されるかまたは未処理のまま残され、そしてCXCR4発現が観測されそして処理されたおよび未処理のままの細胞において比較がされた。図4Bにまとめられた結果は、Phe−olとの前処理が試験された全ての細胞においてCXCR4発現をダウンレギュレートすることおよび阻害の程度が用量依存性であること(図4Bの下部パネル)を示している。
以上より、得られた結果は、フェニルアラニンおよびその誘導体のアミノ酸Phe−olおよびsuc−Pheは、異なる細胞中で細胞表面でのCXCR4発現をダウンレギュレートすることによって、SDF−1によるシグナル伝達を阻害することができることを示している。
実施例5:急性リンパ芽球性白血病性B細胞(Pre−B ALL)の、NOD−SCID移植マウスの骨髄、脾臓、肝臓および肺へのホーミングは、Phe−olによって阻害される。
Pre−B ALLは、最も発症率の高い小児悪性腫瘍であり、二番目に発生率の高い成人の急性白血病である。白血病細胞は、肝臓、脾臓、リンパ節、および中枢神経系に浸透する能力を有している。白血球細胞におけるCXCR4の高い発現率が、小児ALLの患者の中枢神経系への浸透を含む、器官侵襲性のためには強力に予測される。
前述の実施例で、フェニルアラニンおよびその誘導体のアミノ酸がSDF−1のシグナル伝達を阻害することができることが示された。白血病性細胞の骨髄へのホーミングは、SDF−1/CXCR4相互作用と関連しているので、フェニルアラニン誘導体であるPhe−olがG2細胞のNOD−SCID移植マウスの骨髄、脾臓、肝臓および肺へのホーミングを阻害する可能性が試験された。このために、5または10mMのPhe−olまたは(対照として)培養液と1時間プレインキュベートされたC2細胞(107細胞/マウス)が、8週齢のNOD−SCIDマウスの尾の静脈に注入され、注射から16時間後、マウスは犠牲にされ、骨髄(大腿骨、脛骨、および骨盤の骨から洗い出された)、脾臓、肝臓および肺が採取され、そしてヒトB2細胞の存在がアッセイされた(フローサイトメトリーによって決定された)。
得られた結果は図5にまとめられており、注射以前にPhe−olで前処理されたG2細胞は、白血病性G2細胞の骨髄、脾臓、肝臓および肺へのホーミングを阻害することそして阻害が用量依存性であることを示している。
本明細書中で得られた結果は、フェニルアラニン誘導体であるPhe−olの白血病性G2細胞の異なる器官へのホーミングへの阻害効果を示している。したがって、Pheおよびその誘導体は、白血病性細胞の器官侵襲性を予防するために使用されることを目的とするかもしれない。
実施例6:システインおよびその誘導体のアミノ酸による、正常なおよび白血病性ヒト細胞の遊走ならびに増殖の阻害。
ケモカインは、それらにおけるアミノ酸のシステインの構成に基づき、CXCまたはCCメンバーに分類される。発明者らの予備的な結果は、システインが、白血病性ヒト前駆細胞(実施例3を参照)、正常な前駆細胞および成熟細胞(データは示されていない)の遊走を阻害できることを示している。L−システインおよびその誘導体(全て10mM)ならびにグルタチオン(6)の、G2の自発的およびSDF−1誘導性(50ng/ml)遊走への効果がトランスウェルアッセイによって試験された。培養溶媒のみまたはL−システイン、グルタチオンもしくはシステイン誘導体、L−システインエチルエステル塩酸塩(3)、L−システインスルフィン酸(4)、システインアミン塩酸塩(5)を含む溶媒が、トランスウェルチャンバーの下部にロードされた。G2細胞(106/ml)は上部のチャンバーにロードされ、下部のチャンバーに向かって37℃で4時間移動させられた。この期間の後、細胞は下部のチャンバーから集められ、そして蛍光活性化細胞選別機(FACSCalibur)を用いてカウントされた。システインおよびシステイン誘導体が、自発的およびSDF−1誘導性の両方の遊走を阻害することが見出された。しかしながら、システインおよびその誘導体の阻害効果は、自発的遊走において、よりはっきり現れていた。この作用の機序は現時点では明らかではないが、フェニルアラニンによる阻害における機序とは異なっているかもしれず、かつシステインの電荷および還元電位に関連しているのかもしれない。
実施例7:システインおよびフェニルアラニンを含むペプチドによるT細胞遊走の阻害。
SDF−1分子のN末端配列であって、システインおよびフェニルアラニン残基を有する(SDF−1の9〜15のアミノ酸)、C−P−C−R−F−F−E(配列番号17)配列を基本に、小さいペプチドが合成された。次のペプチドが、合成された:1)P−C−R−F−F−E(配列番号9);2)C−R−F−F−E(配列番号10);3)C−R−F−F(配列番号11);4)C−R−F(配列番号12);5)C−R−F(配列番号12)、4番のペプチドの別のバッチ;6)P−C−R−F(配列番号13);7)C−A−A−F(配列番号14);8)C−R−R−F(配列番号15);12)P−C−R−F−F−E(配列番号17)、1番のペプチドの別のバッチ;13)P−dCys(Trt)−R−F−F、P−C−R−F−F(配列番号16)の誘導体。
ペプチド1 P−C−R−F−F−E(配列番号9)は、1つのシステイン残基を位置2に、および2つのフェニルアラニンを位置4および5に含むSDF−1のN−末端配列からの6個のペプチドである。ペプチド2 C−R−F−F−E(配列番号10)は、プロリンが欠失している以外はペプチド1と同様であり、その結果、システインが位置1にある5個のペプチドである。ペプチド3 C−R−F−F(配列番号11)は、グルタミン酸が欠失している以外はペプチド2と同様であり、その結果、同じようにシステインが位置1にあり、かつ2つのフェニルアラニン残基を有する4個のペプチドである。ペプチド4 C−R−F(配列番号12)は、最後のアミノ酸のフェニルアラニンが欠失している以外はペプチド3と同様であり、その結果、システインが同様に位置1にあり、かつただ1つのフェニルアラニン残基を有する4個のペプチドである。ペプチド5 C−R−F(配列番号12)は、ペプチド4と類似のペプチドの別のバッチである。ペプチド6 P−C−R−F(配列番号13)は、フェニルアラニン残基およびグルタミン酸残基がそれぞれ位置5および6にて欠失している以外はペプチド1と同様であり、その結果、システインが位置2にあり、かつただ1つのフェニルアラニンを有する4個のペプチドである。ペプチド7 C−A−A−F(配列番号14)は、ペプチド3のような4個のペプチドであり、位置2のアルギニンおよび位置3のフェニルアラニンがアラニンによって置換されており、その結果、システインを位置1に、かつただ1つのフェニルアラニンを位置4に有するペプチドである。ペプチド8 C−R−R−F(配列番号15)は、ペプチド3のような4個のペプチドであり、位置3のフェニルアラニンがアルギニンによって置換されており、その結果、システインを位置1に、かつただ1つのフェニルアラニンを位置4に有するペプチドである。ペプチド12 P−C−R−F−F−E(配列番号9)は、1番のペプチドの別のバッチである。ペプチド13 P−dCys(Trt)−R−F−F(配列番号16のP−C−R−F−Fの誘導体)は、システイン残基がdCys(Trt)に置換されており、かつグルタミン酸が欠失している以外はペプチド1と同様である。Trtはトリチルであって、システインのSH官能部位のための保護基である。Fmoc−CYS(Trt)を、ペプチド鎖の組み立てのための成分として使用した。
1mMまたは100μMのこれらのシステイン−フェニルアラニン含有のペプチドの、インビトロにおける自発的なおよびSDF−1誘導性のヒト初代T細胞の遊走への影響が試験された。試験された濃度におけるこれらのペプチドは、細胞に有毒ではないことが見出された(データは示されていない)。遊走実験において、細胞(1×106/mL)はペプチドと37℃で2時間、95%の湿度でインキュベートされ、その後未洗浄のままコースター製24−ウェルの5μm孔径のトランスウェルプレート(コーニング社、コーニング、NY)の上部のチャンバーに加えられ、37℃、95%湿度、5%CO2のもと、自発的にまたはSDF−1(20ng/mL)へと移動させられた。遊走細胞は下部のチャンバーから集められ、そしてFACSCaliburフローサイトメーター(ベクトン デッキンソン、サンジョゼ、カリフォルニア)を用いてカウントされた。細胞は、常数ゲインで設定された前方散乱光および側方散乱光をパラメーターとしてゲーティングされ得る。データは、未処理の遊走細胞の割合を100%とした場合に比べて、ペプチドで前処理された場合の遊走細胞の割合として示されている。
1mMの濃度でシステインおよびフェニルアラニンを含んでいるペプチド(図7A)は、SDF−1によって介されるT細胞遊走の非常に有用な阻害剤であることが発見された(50〜90%の阻害の範囲)。活性についての同じ傾向が、これらのペプチドを100μMの濃度でテストした場合にも観察された(図7B)。これらのペプチドはT細胞の自発的遊走も同様に阻害したが、SDF−1誘導の遊走の阻害に比べて有用性は低かった(データは示されていない)。
Claims (108)
- CXCR4活性の阻害および/または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造における
フェニルアラニンまたはその誘導体のアミノ酸;
システインまたはその誘導体のアミノ酸;
フェニルアラニンまたはその誘導体およびシステインまたはその誘導体を含むアミノ酸の組み合わせ;
少なくとも1つのフェニルアラニンもしくはその誘導体、少なくとも1つのシステインもしくはその誘導体、または少なくとも1つのフェニルアラニンもしくはその誘導体および少なくとも1つのシステインもしくはその誘導体を含む22個までのアミノ酸残基を含むペプチドの使用。 - CXCR4活性の阻害および/または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造における、フェニルアラニンまたはその誘導体のアミノ酸の請求項1記載の使用。
- フェニルアラニン誘導体が、溶解性が改良されたフェニルアラニン誘導体である請求項2記載の使用。
- フェニルアラニン誘導体が、フェニルアラニノール(Phe−ol)またはサクシニルフェニルアラニン(Suc−Phe)である請求項3記載の使用。
- フェニルアラニン誘導体が、β−フェニルエチルアミンである請求項2記載の使用。
- CXCR4活性の阻害および/または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造における、システインまたはその誘導体のアミノ酸の請求項1記載の使用。
- システイン誘導体が、溶解性が改良されたシステイン誘導体である請求項6記載の使用。
- システイン誘導体が、システインエチルエステル、システインスルフィン酸およびシステインアミンから選択される請求項6記載の使用。
- CXCR4活性の阻害および/または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造における、フェニルアラニンまたはその誘導体およびシステインまたはその誘導体を含むアミノ酸の組み合わせの請求項1記載の使用。
- CXCR4活性の阻害および/または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造における、少なくとも1つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む22個までのアミノ酸残基のペプチドの請求項1記載の使用。
- ペプチドが、少なくとも1つのフェニルアラニンを含む2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21個のアミノ酸残基からなる請求項10記載の使用。
- ペプチドが、少なくとも1つのフェニルアラニンおよび少なくとも1つの荷電性アミノ酸であってフェニルアラニンでないアミノ酸残基を含む、約2、3、4、5または6個の連続したアミノ酸残基を含む請求項11記載の使用。
- 少なくとも1つのフェニルアラニンでない残基が、正電荷をもつアミノ酸である請求項12記載の使用。
- 正電荷をもつアミノ酸が、リジンまたはアルギニンである請求項13記載の使用。
- ペプチドが、配列番号1、配列番号2、配列番号3またはアミノカプロイック酸に結合したその誘導体、配列番号4、配列番号5および配列番号8から選択されるアミノ酸配列を含む請求項10〜14のいずれかに記載の使用。
- 少なくとも1つのフェニルアラニンでない残基が、負電荷をもつアミノ酸残基である請求項12記載の使用。
- 負電荷をもつアミノ酸残基が、グルタミン酸である請求項16記載の使用。
- ペプチドが、配列番号6または配列番号7のアミノ酸配列を含む請求項10〜12、16および17のいずれかに記載の使用。
- CXCR4活性の阻害および/または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造における、少なくとも1つのシステインまたはその誘導体を含む22個までのアミノ酸残基のペプチドの請求項1記載の使用。
- ペプチドが、少なくとも1つのシステインを含む2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21個のアミノ酸残基からなる請求項19記載の使用。
- ペプチドが、少なくとも1つのシステイン、ならびにプロリン、アルギニンおよびグルタミン酸から選択される少なくとも1つのシステインでない残基を含む、約2、3、4、5、または6個の連続したアミノ酸残基を含む請求項20記載の使用。
- ペプチドがグルタチオンからなる請求項20記載の使用。
- CXCR4活性の阻害および/または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造における、LSYモチーフ(配列番号19)を含むSDF−1のアミノ末端由来のペプチドを除く、少なくとも1つのフェニルアラニンまたはその誘導体および少なくとも1つのシステインまたはその誘導体を含む22個までのアミノ酸残基のペプチドの請求項1記載の使用。
- ペプチドが、少なくとも1つのフェニルアラニンまたはその誘導体および少なくとも1つのシステインまたはその誘導体を含む2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21個のアミノ酸残基からなる請求項23記載の使用。
- ペプチドが、少なくとも1つのシステインまたはその誘導体および少なくとも1つのフェニルアラニン残基またはその誘導体を含む、約2、3、4、5、6または7個の連続したアミノ酸残基を含む請求項24記載の使用。
- ペプチドが、少なくとも1つのシステインではないアミノ酸残基またはフェニルアラニンではないアミノ酸残基で隔てられた、1つのシステインまたはその誘導体および1つのフェニルアラニン残基またはその誘導体を含む、約3、4、5、6または7個の連続したアミノ酸残基からなる請求項25記載の使用。
- ペプチドが、配列番号12の3個の連続したアミノ酸残基を含む請求項26記載の使用。
- ペプチドが、少なくとも1つのシステインではないアミノ酸残基またはフェニルアラニンではないアミノ酸残基で隔てられた、1つのシステインまたはその誘導体および1つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む4個の連続したアミノ酸残基を含む請求項26記載の使用。
- 連続したアミノ酸残基の配列が配列番号11からなる請求項28記載の使用。
- 連続したアミノ酸残基の初めの残基がプロリンである請求項28記載の使用。
- 連続したアミノ酸残基の配列が配列番号13からなる請求項30記載の使用。
- ペプチドが、少なくとも1つのシステインではないアミノ酸残基またはフェニルアラニンではないアミノ酸残基で隔てられた、1つのシステインまたはその誘導体および1つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む5個の連続したアミノ酸残基を含む請求項26記載の使用。
- 連続したアミノ酸残基の初めの残基が、プロリンである請求項32記載の使用。
- 連続したアミノ酸残基の配列が、配列番号16、またはシステインの代わりにdCys(Trt)残基を有する配列番号16の誘導体からなる請求項33記載の使用。
- 連続したアミノ酸残基の5番目の残基がグルタミン酸である請求項32記載の使用。
- 連続したアミノ酸残基の配列が配列番号10からなる請求項35記載の使用。
- ペプチドが、少なくとも1つのシステインではないアミノ酸残基またはフェニルアラニンではないアミノ酸残基で隔てられた、1つのシステインまたはその誘導体および1つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む6個の連続したアミノ酸残基を含む請求項26記載の使用。
- 連続したアミノ酸残基の6番目の残基がグルタミン酸である請求項37記載の使用。
- 連続したアミノ酸残基の初めの残基がプロリンである請求項37記載の使用。
- 連続したアミノ酸残基の配列が配列番号9からなる請求項38または39記載の使用。
- CXCR4活性および/または細胞の運動性が病状または経過に関与する疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造における、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、システインの代わりにdCys(Trt)残基を含む配列番号16の誘導体、または配列番号17の配列を含む2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21個のアミノ酸残基のペプチドの使用。
- CXCR4活性および/または細胞の運動性が病状または経過に関与する疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造における、C−X−X−F(配列番号18)のアミノ酸配列であって、Xがアルギニンまたはアラニンであるアミノ酸配列を含む4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21個のアミノ酸残基のペプチドの使用。
- アミノ酸配列が、配列番号14または配列番号15からなる請求項42記載の使用。
- ペプチドが、融合ペプチドおよび/またはその塩である請求項10〜43のいずれかに記載の使用。
- 疾患、障害または症状が、CXCR4を発現している癌、後天性免疫不全症候群(AIDS)および炎症から選択される請求項1〜44のいずれかに記載の使用。
- 疾患が、CXCR4を発現している癌である請求項45記載の使用。
- CXCR4を発現している癌が、白血病、眼内悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、多発性骨髄腫、膵臓癌、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、甲状腺癌、直腸癌、口腔扁平上皮癌、子宮頸癌、神経芽腫、神経膠腫、星状細胞腫、横紋筋肉腫、小細胞肺癌および黒色腫から選択される請求項46記載の使用。
- 癌が、白血病である請求項47記載の使用。
- 白血病が、B細胞型急性リンパ芽球性白血病である請求項48記載の使用。
- 転移を治療または予防するための請求項1〜44のいずれかに記載の使用。
- 疾患が、AIDSである請求項45記載の使用。
- 炎症性疾患、障害または症状を治療または予防するための請求項45記載の使用。
- 炎症性疾患、障害または症状が、慢性関節リウマチ、化膿性関節炎、変形性関節症、歯周炎、歯肉炎、喘息、自己免疫疾患、乾癬、乾癬性関節炎、アトピー性皮膚炎、間質性腎炎、眼内炎症、肝硬変、神経炎症性障害、移植片対宿主病および炎症性胃腸症状から選択される請求項52記載の使用。
- C−X−X−F(配列番号18)のアミノ酸配列であって、Xがアルギニンまたはアラニンであるアミノ酸配列を含む4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21または22個のアミノ酸残基のペプチド。
- アミノ酸配列が、配列番号14または配列番号15を含む請求項54記載のペプチド。
- 少なくとも1つのアラニンで隔てられた、1つのシステインまたはその誘導体および1つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む3、4、5、6、7または8個の連続したアミノ酸残基を含む3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21または22個のアミノ酸残基のペプチド。
- システインまたはその誘導体およびフェニルアラニンまたはその誘導体が、1つまたは2つのアラニン残基で隔てられている請求項56記載のペプチド。
- ペプチドが、少なくとも1つのアラニンで隔てられた、1つのシステインまたはその誘導体および1つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む4個の連続したアミノ酸残基を含む請求項56または57記載のペプチド。
- 連続したアミノ酸残基の初めのおよび/または最後のアミノ酸残基が、それぞれ、システインまたはその誘導体およびフェニルアラニンまたはその誘導体である請求項58記載のペプチド。
- LSYモチーフ(配列番号19)を含むSDF−1のアミノ末端由来のペプチドを除く、1つのアルギニンで隔てられたシステインまたはその誘導体およびフェニルアラニンまたはその誘導体を含む3、4、5、6または7個の連続したアミノ酸残基を含む22個までのアミノ酸残基のペプチド。
- 22個までのアミノ酸残基のペプチドが、配列番号12からなる3個の連続したアミノ酸残基を含む請求項60記載のペプチド。
- 22個までのアミノ酸残基のペプチドが、1つのアルギニンで隔てられた、1つのシステインまたはその誘導体および1つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む4個の連続したアミノ酸残基を含む請求項60記載のペプチド。
- 連続したアミノ酸残基の初めのおよび最後のアミノ酸残基が、それぞれ、システインまたはその誘導体およびフェニルアラニンまたはその誘導体である請求項62記載のペプチド。
- 連続したアミノ酸残基の配列が、配列番号11からなる請求項63記載のペプチド。
- 連続したアミノ酸残基の初めの残基が、プロリンである請求項62記載のペプチド。
- 連続したアミノ酸残基の配列が、配列番号13からなる請求項65記載のペプチド。
- 22個までのアミノ酸残基のペプチドが、1つのアルギニンで隔てられた、1つのシステインまたはその誘導体および1つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む5個の連続したアミノ酸残基を含む請求項60記載のペプチド。
- 連続したアミノ酸残基の初めの残基が、プロリンである請求項67記載のペプチド。
- 連続したアミノ酸残基の配列が、配列番号16、またはシステインの代わりにdCys(Trt)残基を有する配列番号16の誘導体からなる請求項68記載のペプチド。
- 連続したアミノ酸残基の5番目の残基が、グルタミン酸である請求項67記載のペプチド。
- 連続したアミノ酸残基の配列が、配列番号10からなる請求項70記載のペプチド。
- 22個までのアミノ酸残基のペプチドが、1つのアルギニンで隔てられた、1つのシステインまたはその誘導体および1つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む6個の連続したアミノ酸残基を含む請求項60記載のペプチド。
- 連続したアミノ酸残基の6番目の残基が、グルタミン酸である請求項72記載のペプチド。
- 連続したアミノ酸残基の初めの残基が、プロリンである請求項72記載のペプチド。
- 連続したアミノ酸残基の配列が、配列番号9からなる請求項73または74記載のペプチド。
- 2つのアルギニンで隔てられた1つのシステインまたはその誘導体および1つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む4、5、6、7または8個の連続したアミノ酸残基を含む22個までのアミノ酸残基のペプチド。
- 連続したアミノ酸残基の配列が、配列番号15からなる請求項76記載のペプチド。
- 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号6、または配列番号7からなる2個の連続したアミノ酸残基を含む2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21または22個のアミノ酸残基のペプチド。
- アミノカプロイック酸に結合した配列番号1または配列番号8からなる3個の連続したアミノ酸残基を含む3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21または22個のアミノ酸残基のペプチド。
- 配列番号5からなる4個の連続したアミノ酸残基を含む4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21または22個のアミノ酸残基のペプチド。
- 配列番号1、アミノカプロイック酸に結合した配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、システインの代わりにdCys(Trt)残基を有する配列番号16の誘導体または配列番号17のアミノ酸配列からなるペプチド。
- LSYモチーフを含むSDF−1のアミノ末端由来のペプチドを除く、C−R−Fアミノ酸配列を含む約3、4、5、6、7、8または9個のアミノ酸残基であるまたは最後のアミノ酸残基がセリンであるLSYモチーフを欠失している6から9個のアミノ酸残基からなるペプチド。
- 環状に置換されている、請求項54〜82のいずれかに記載のペプチド。
- 請求項54〜83のいずれかに記載のペプチドを含む融合ペプチド。
- 融合ペプチドが、タンパク質に融合されている請求項84記載の融合ペプチド。
- タンパク質が、免疫グロブリンである請求項85記載の融合ペプチド。
- ペプチドが、高分子ポリマーに融合されている請求項84記載の融合ペプチド。
- ポリマーが、ポリエチレングリコール(PEG)である請求項87記載の融合ペプチド。
- 請求項54〜88のいずれかに記載のペプチドの塩。
- 請求項54〜86のいずれかに記載のペプチドをコードする単離されたDNA。
- 請求項90記載のDNAを含む発現ベクター。
- 請求項90記載のDNAを含有する宿主細胞。
- 請求項91記載の発現ベクターを含有する宿主細胞。
- 細胞が、真核細胞である請求項93記載の宿主細胞。
- 真核細胞が、哺乳類細胞、昆虫細胞、イースト菌である請求項94記載の宿主細胞。
- 哺乳類細胞が、HeLa、293T HEKおよびCHO細胞である請求項95記載の宿主細胞。
- 細胞が、原核細胞である請求項93記載の宿主細胞。
- 請求項92〜97のいずれかに記載の宿主細胞を培養することおよび産生されたタンパク質を単離することを含む、請求項54〜86のいずれかに記載のペプチドを産生するための方法。
- CXCR4を発現している癌、後天性免疫不全症候群(AIDS)炎症および転移から選択される疾患、障害もしくは症状の治療または予防のための医薬の製造における、請求項54〜88のいずれかに記載のペプチドまたはその塩の使用。
- 薬学的に許容され得る担体および請求項54〜88のいずれかに記載のペプチドまたはその塩を含む医薬組成物。
- 薬学的に許容され得る担体ならびにLSYモチーフを含むSDF−1のアミノ末端由来のペプチドを除く、1つのアルギニンで隔てられた、1つのシステインまたはその誘導体および1つのフェニルアラニンまたはその誘導体を含む約3、4、5、6または7個の連続したアミノ酸残基を含む3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21または22個のアミノ酸残基のペプチドを含む医薬組成物。
- 請求項90記載のDNAおよび薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
- 請求項91記載のベクターおよび薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
- 薬学的に許容され得る担体ならびにフェニルアラニンまたはその誘導体およびシステインまたはその誘導体からなるアミノ酸の混合物を含む医薬組成物。
- 必要とする個体における、CXCR4活性の阻害および/または細胞の運動性の阻害に反応性の疾患、障害もしくは症状の治療または予防の方法であって、該方法が、個体に、治療上効果的な量の、LSYモチーフを含むSDF−1のアミノ末端由来のペプチドを除く、フェニルアラニンまたはその誘導体であるアミノ酸;システインまたはその誘導体であるアミノ酸;フェニルアラニンまたはその誘導体およびシステインまたはその誘導体を含むアミノ酸の組み合わせ;少なくとも1つのフェニルアラニンもしくはその誘導体、少なくとも1つのシステインもしくはその誘導体、または少なくとも1つのフェニルアラニンもしくはその誘導体および少なくとも1つのシステインもしくはその誘導体を含む22個までのアミノ酸残基を含むペプチドを投与することを含む方法。
- CXCR4活性が疾患、障害もしくは症状の病状または経過に関与している疾患、障害もしくは症状の治療または予防の方法であって、該方法が、必要とする個体に、治療上効果的な量の、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、システインの代わりにdCys(Trt)残基を含む配列番号16の誘導体、配列番号17またはそれらの組み合わせで示される配列を含むペプチドを投与することを含む方法。
- CXCR4活性が疾患、障害もしくは症状の病状または経過に関与している疾患、障害もしくは症状の治療または予防の方法であって、該方法が、必要とする個体に、治療上効果的な量の、配列番号1、アミノカプロイック酸に結合した配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8またはそれらの組み合わせで示される配列を含むペプチドを投与することを含む方法。
- CXCR4を発現している癌、後天性免疫不全症候群(AIDS)炎症、および転移から選択される疾患、障害もしくは症状の治療または予防の方法であって、該方法が、必要とする個体に、治療上効果的な量の、請求項54〜88のいずれかに記載のペプチドまたはその塩を投与することを含む方法。
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