JP2009510253A - 保護されたアミン塩を用いて、末端アミン基を有するポリマーを調製する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、末端アミンを含有するポリアルキレンオキシドなどの線状ポリマーを高純度で調製する方法に関する。ある好ましい方法は、末端トシレートを含有するポリエチレングリコールなどのポリアルキレンオキシドを保護されたアミン塩と反応させて、保護された末端アミンを含有するポリマーを形成し、その後、保護された末端アミンを含有するポリマーを脱保護して、末端アミンを有するポリマーを形成する各工程を有してなる。得られたポリマーアミンは、薬剤グレードのポリマーに要求される費用と時間のかかる精製工程が避けられるほどの十分な純度のものである。

Description

本発明は、ポリアルキニルオキシドなどの活性ポリマーを調製する方法に関する。特に、本発明は、末端アミンを含有する線状ポリマーを高純度で調製する方法に関する。

水溶性ポリアルキレンオキシドのタンパク質およびポリペプチドなどの治療部分との結合が知られている。例えば、ここにその開示を引用する特許文献１を参照のこと。特許文献１には、ＰＥＧで修飾された生理活性ポリペプチドが、体内で長期間に亘り循環し、減少した免疫原性および抗原性を有することが開示されている。

ポリアルキレンオキシドを結合させるために、最初に、このポリマーのヒドロキシル末端基を活性官能基に転化しなければならない。このプロセスはたびたび「活性化」と称され、その生成物は、「活性ポリアルキレンオキシド」と呼ばれる。他のポリマーも同様に活性化される。

ＰＥＧ−ＮＨ₂などのアミン末端ポリマーが知られている。非特許文献１を参照のこと。それらは、いくつかの生物学的活性化合物に見られるＣＯＯＨ基への直接結合のために「そのまま」使用できる。さらにしばしば、ＰＥＧ−ＮＨ₂（すなわちＰＥＧ−アミン）が中間体として使用される。この中間体は、他の高分子デリバリーシステムが望ましい場合、さらに官能化される。例えば、ベンジル除去システム、トリメチルロックシステムなどを含有するあるポリマー系のドラッグ・デリバリー・プラットホームシステムは、合成プロセスにおける重要な中間体としてＰＥＧ−ＮＨ₂を含み得る。例えば、非特許文献２から４を参照のこと。先の文献の各々の内容がここに引用される。

ＰＥＧ−アミンは、アルデヒド基が利用できる生物学的活性の小分子およびポリペプチドとの結合（還元アミン化による）にも有用である。その内容をここに引用する非特許文献５も参照のこと。

従来、ＰＥＧ−アミンは、ＰＥＧ−ＯＨからＰＥＧ−ハロゲン化物、メシレートまたはトシレートを調製し、その後、アンモニア水（ホフマン反応）、ナトリウムアジドまたはカリウムフタルイミド（ガブリエル試薬(Gabriel Reagent)）との求核置換反応を行うことにより調製できることが一般に知られていた。ＰＥＧ−ハロゲン化物のアンモニアとの反応でＰＥＧ−アミンが直接形成される。さらに重要なことは、重大な欠点は、濃アンモニア水処理中に、ＰＥＧ−ハロゲン化物がかなりの割合で加水分解されて、ＰＥＧ−ＯＨが形成されることである。このことは、高分子量ＰＥＧ−アミンを形成するときに特別な懸念である。ＰＥＧの分子量が大きくなるほど、ＰＥＧ−ＯＨがより形成される。例えば、ＰＥＧ_5,000の場合、その量は約５％であり、ＰＥＧ_40,000などのようにＰＥＧの分子量が大きくなると、その量は２０％までになり得る。その結果、所望の最終生成物の純度は著しく減少し得る。

ＰＥＧ−アミンを製造するために中間体としてＰＥＧ−アジドを使用する場合でさえ、金属触媒による水素化を用いるときに、ある欠点が観察される。さらに、カリウムフタルイミドとの反応により、塩基で保護されたアミンが形成され、これは、環流下のエタノール中でヒドラジンにより脱保護される。このことも欠点に関連する。フタロイル基の除去に要求される厳しい条件および最終生成物の徹底的な精製の必要性により、所望の生成物の費用が著しく増してしまう。
米国特許第４１７９３３７号明細書 Zalipsky et al. Eur. Polym. J. Vol.19 No.12., pp1177-1183 Greenwald et al. J. Med. Chem. Vol. 42, No. 18, 3657-3667 Greenwald et al. J. Med. Chem. Vol. 47, No. 3, 726-734 Greenwald et al. J. Med. Chem. Vol. 43, No. 3, 475-487 Nektar Advanced PEGylation catalog 2005-2006, page 24

上述に鑑みて、従来技術の短所や欠点に対処した、ＰＥＧ−アミンおよび末端アミンを有する関連するポリマーを調製する改良方法を提供することが望ましいであろう。本発明は、この必要性に取り組むものである。

本発明のある好ましい態様において、末端アミンを有するポリマーを調製する改良方法が提供される。この方法は、化学式（Ｉ）
（Ｉ） Ｒ₃−Ｒ₂−Ｒ₁
ここで、Ｒ₁は、離脱基などの反応性ポリマー末端基であり、
Ｒ₂は、実質的に非抗原性ポリマーであり、
Ｒ₃は、キャッピング基またはＲ₁である、
の実質的に非抗原性のポリマーを、
保護されたアミン塩と反応させて、保護された末端アミンを含有するポリマーを形成し；その後、それから得られた保護された末端アミンを含有するポリマーを酸と反応させて、保護基を除去し、末端アミンを有するポリマーを形成する各工程を有してなる。

好ましい反応性ポリマー末端基の例としては、トシレート、メシレート、ブロシレート、トレシレート、ノシレート、Ｂｒ、Ｃｌなどの離脱基が挙げられる。

化学式（Ｉ）のポリマーの保護アミン塩との反応は、ジメチルホルムアミドなどの溶媒中で行われることが好ましく、その反応体は、反応の各工程を実質的に完了し、これにより最終的にポリマーに末端アミンを形成させるのに十分な反応条件下で、十分な時間に亘り反応せしめられる。本発明のより好ましい態様において、アミン誘導体に転化されるポリマーはＰＥＧ−トシレートであり、そのトシレート基は、ＰＥＧの少なくとも１つまたはそれより多い末端にあって差し支えない。

本発明の代わりの態様において、好ましい保護アミン塩は、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルイミドジカーボネートのカリウム塩（ＫＮＭｅＢｏｃ）またはジ−ｔｅｒｔ−ブチルイミドジカーボネートのカリウム塩（ＫＮＢｏｃ₂）である。

ここに記載したプロセスにより形成された末端アミンを含有するポリマーの純度は、約９５％より大きい、好ましくは９８％より大きい、より好ましくは９９％より大きい。

本発明の主要な利点の内の１つは、そのポリアルキレンオキシド誘導体などの、得られた末端アミン含有ポリマーが高純度で調製されることである。それゆえ、生成物の汚染物、すなわち、ｍＰＥＧ−ＯＨなどの出発材料は感知できる量では検出されない、すなわち、それらは、約５％未満、好ましくは約２％未満、最も好ましくは約１％未満の量でしか検出されない。好ましいＰＥＧ−アミンが高純度でより経済的に形成されたときに、当業者は、ＰＥＧ−アミンを含む最終生成物をより効率的かつより低いコストで製造できる。ＰＥＧ−アミンを製造するための反応は強制的に完了でき、再結晶化によって、過剰な小分子試薬を除去できる。この効率が得られるのは、一部には、出発アルコールまたは反応性中間体（例えば、トシレート）から所望のアミン末端ポリマーを分離する必要がないためである。さらに、所望のＰＥＧ−アミンを提供するために、退屈なカラムまたはイオン交換またはＨＰＬＣ技法は必要ない。それゆえ、本発明は、費用のかかるカラム精製を行わずに、高純度のＰＥＧ−アミンを提供する。

別の利点は、ここに記載したプロセスにより製造されたアミンは、ＰＥＧの主鎖が全く変わらないという事実である。したがって、このアミンは、ＰＥＧアミンの現行と将来の用途の全てに適合している。

本発明の方法は、一般に、少なくとも１つの末端アミンを含有するポリマーの形成に関する。本発明のほとんどの態様において、ここに記載したプロセスを使用して修飾できるポリマーは、実質的に非抗原性ポリマーである。この種類のポリマーの内では、ポリアルキレンオキシドが好ましく、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が最も好ましい。制限というよりむしろ説明を容易にする目的で、このプロセスは時々、ＰＥＧを代表例のポリマーとして使用して説明する。しかしながら、このプロセスは、線状、実質的に線状、分岐などであって差し支えない幅広いポリマーに適用できる。唯一の要件は、そのポリマーが、そこに所望の反応性ポリマー末端基を共有結合させる手段を含有し、ここに記載した条件下で、トシルまたは他の中間体をアミンに変換するのに要求される処理に耐えられることである。

先に記載したことにしたがって、末端アミンを有するポリマーを調製するための本発明のある好ましい態様は、
ａ） 化学式（Ｉ）
（Ｉ） Ｒ₃−Ｒ₂−Ｒ₁
ここで、Ｒ₁は反応性ポリマー末端基であり、
Ｒ₂は実質的に非抗原性ポリマーであり、
Ｒ₃はキャッピング基またはＲ₁である、
の実質的に非抗原性ポリマーを、保護されたアミン塩と反応させて、保護された末端アミンを含有するポリマーを形成し、
ｂ） それから得られた保護された末端アミンを含有するポリマーを、酸と反応させて、保護基を除去し、末端アミンを有するポリマーを形成する、
各工程を有してなる。

本発明の目的について、Ｒ₁に関する文脈で用いたときに、「反応性ポリマー末端基」という用語は、当該技術分野において公知のものなどの脱離基を意味することが理解されよう。適切な脱離基の非限定的リストとしては、トシレート、メシレート、ブロシレート、トレシレート、ノシレート、Ｂｒ、Ｃｌなどが挙げられる。

上述したように、ある実施の形態において、Ｒ₃はキャッピング基であって差し支えない。本発明の目的に関して、キャッピング基とは、ポリマーの末端に見られる基を意味することが理解されよう。ある態様において、キャッピング基は、ＣＯ₂Ｈ、Ｃ_1-6アルキル（ＣＨ₃が好ましい）、ＯＨなど、または当業者に理解されるような他の末端基から選択できる。

Ｒ₂もまた、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）などの室温で水溶性のポリマーであることが好ましく、ｍＰＥＧまたはビス−活性化ＰＥＧなどのポリエチレングリコールであることがより好ましい。したがって、そのようなポリマーの非限定的リストとしては、ブロックコポリマーの水溶性が維持されるという条件で、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコールなどのポリアルキレンオキシドホモポリマー、またはポリオキシエチレン化ポリオール、そのコポリマーおよびそのブロックコポリマーが挙げられる。

制限ではなく説明の目的で、Ｒ₂のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の残基部分は、

の中から選択でき、ここで、ｘは重合度、すなわち、約１０から約２，３００である。

本発明の代わりの態様において、ビス−活性化ポリマーが望ましい場合、Ｒ₃はＲ₁と同じであり、得られた反応体は、ビス−アミン末端ポリマー化合物の製造に使用される。そのようなビス−活性化ポリマーは化学式（Ｉａ）：

のものであって差し支えなく、ここで、Ｒ₁はトシレートであることが好ましく、ｘは上述したものと同じである。

ポリマーの重合度は、ポリマー鎖における繰返し単位の数を表し、ポリマーの分子量に依存する。実質的に非抗原性ポリマーである、ＰＡＯおよびＰＥＧは、重量平均分子量が実質的に様々であって差し支えないが、本発明のほとんどの態様において、Ｒ₂が、約２００から約１００，０００Ｄａの重量平均分子量を有することが好ましい。実質的に非抗原性ポリマーは、約２，０００から約４８，０００ダルトンの重量平均分子量を有することがより好ましい。

Ｒ₂は、その開示をここに引用する、Shearwater Corporation’s 2001 catalog "Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Application"に記載されたものなどの「星形(star-)ＰＥＧ」またはマルチアームＰＥＧであって差し支えない。

さらに別の好ましい実施の形態において、Ｒ₂は、本発明のポリマーに相当する分岐ポリマーの一部である。具体的には、Ｒ₂は、化学式：

のものであって差し支えなく、ここで、ｎは、好ましくは約１２，０００から約４０，０００の総分子量を有するポリマーを提供するために、約１０から約３４０の整数であり、残基の末端部分ａの少なくとも１であり３までが、メチルまたは他の低級アルキルによりキャッピングされ、残りの末端基がＲ₃基である。上述したNektar Advanced PEGylation catalog 2005-2006, page 26"4-arm PEG"も参照のこと。末端アミノ化前のそのような化合物としては：

を含むことが好ましく、ここで、Ｒ₁は、

であり、ここで、Ｒ₇はメチルであることが好ましく、他の全ての変数はここにおいて先に定義されたものである。ここに記載したアミノ化プロセスを経ることのできるある特別なポリマーは：

である。もちろん、この実施の形態の他の態様は、上述したＲ₁と一致するように、トシル基により置換される末端メチル基を１つ以上有するであろう。

ここにそれぞれを引用する、同一出願人による米国特許第５６０５９７６号、同第５６４３５６５号、同第５９１９４５５号および同第６１１３９０６号の各明細書に記載された分岐ポリマー残基を含む、様々な他のＰＥＧ系化合物上に末端アミンを形成することも、本発明の範囲内で考えられる。いくつかの特定の化合物の代表的リストとしては：

が挙げられ、ここで、Ｒ₇はメチルであることが好ましく、ｚが１から約１２０の整数であり、Ｌ₁およびＬ₃が、以下の非限定的化合物：

のうちの１つなどの独立して選択される二官能性連結基であり、
ここで、Ｒ_9-13は先にＲ₄について定義されたものと同じ基から独立して選択され、ＨまたはＣＨ₃であることが好ましく、
Ｒ₆は、Ｒ₄を定義したのと同じ基、ＮＯ₂、Ｃ_1-6ハロアルキルおよび水素から選択され、
ｑ、ｔおよびｙの各々は、１から約１２などのそれぞれ独立して選択される正の整数であり、Ｌ₂は、ジアミノアルキルまたはリシン残基などの分岐連結基である。例えば、上述した米国特許第６１１３９０６号明細書を参照のこと。

さらに別の実施の形態において、またＰＡＯ系ポリマーの代わりとして、Ｒ₂は必要に応じて、デキストラン、ポリビニルアルコール、炭水化物系ポリマー、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド（ＨＰＭＡ）、ポリアルキレンオキシド、および／またはそれらのコポリマーなどの、１種類以上の効果的な非抗原性材料の中から選択される。ここに引用する同一出願人による米国特許第６１５３６５５号明細書も参照のこと。ＰＥＧなどのＰＡＯに関してここに記載したように、同じタイプの活性化が利用されることが当業者には理解されよう。当業者にはさらに、先のリストは単に例示であり、ここに記載した性質を有する全ての高分子材料が考えられることも理解するであろう。

ここに記載した水溶性ポリマーのいずれも、必要であれば、アミノ化の前に過度の実験を行わずに、Ｒ₃基、例えば、トシレート、メシレートなどに結合させるために官能化することができることも理解されよう。ポリマー（例えば、ＰＥＧ）末端ＯＨのトシレートなどへの転化または活性化が従来技術に報告されている。例えば、ここに引用する、米国特許第５２０６３４４号および米国特許出願公開第２００３／０１４９３０７号の各明細書を参照のこと。

本発明の方法によれば、保護された末端アミンを含有するポリマーの形成には、１つ以上のＲ₁基、例えば、トシレート、メシレート、ブロシレート、トレシレート、ノシレート、ＢｒまたはＣｌなどの反応性ポリマー末端基を含有する化学式（Ｉ）の実質的に非抗原性ポリマーを、保護アミン塩と反応させることが要求される。この反応は、制限を意図するものではない、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルアセトアミドまたは同様の試薬およびそれらの混合物などの適切な溶媒中で行われる。好ましい溶媒はジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）である。当業者により認識されるように、本発明のプロセスに使用できる適切な溶媒には他にも数多くある。適切な溶媒としては、メタノール、エタノール、ブタノール、イソプロパノール、ジオキサンなどの極性溶媒が挙げられる。この工程はほぼ室温で行うことができるが、その温度は、約０℃から溶媒の環流点または沸点までに及んで差し支えない。

本発明のプロセスに様々な保護アミン塩を使用できる。一般に、保護アミン塩は、化学式：
ＭＮＰ₁Ｒ₄
に相当し得、ここで、Ｍは水素またはリチウム、ナトリウムおよびカリウムから選択される金属であり、
Ｐ₁としては、以下に限られないが、以下のリスト：Ｃ（Ｏ）Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＯＭｅ、Ｃ（Ｏ）ＯＢｚｌ（Ｚ）、Ｃ（Ｏ）ＯｔＢｕ（Ｂｏｃ）、Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ₂ＣＣｌ₃（Ｔｒｏｃ）、Ｐ（Ｏ）（ＯＥｔ）₂、ＣＰｈ₃（トリチル）が挙げられ、
Ｒ₄は、Ｐ₁または例えば、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_3-12分岐アルキル、Ｃ_3-8シクロアルキル、Ｃ_1-6置換アルキル、Ｃ_3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ_1-6ヘテロアルキル、置換Ｃ_1-6ヘテロアルキル、Ｃ_1-6アルコキシ、フェノキシ、およびＣ_1-6ヘテロアルコキシなどである。

可能性のある試薬の上述した群の内で、いくつかの好ましい適切な試薬の非限定的リストとしては、制限するものではなく、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルイミドジカ−ボネートのカリウム塩（ＫＮＢｏｃ₂）、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルイミドジカ−ボネートのリチウム塩（ＬｉＮＢｏｃ₂）、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルイミドジカ−ボネートのナトリウム塩などが挙げられる。本発明の好ましい態様において、保護アミン塩は、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルイミドジカ−ボネートのカリウム塩（ＫＮＢｏｃ₂）である。

本発明の上述した態様の代わりの態様において、保護アミン塩は、ＮＲ₄Ｂｏｃのカリウム、ナトリウムおよびリチウム塩から選択することができ、ここで、Ｒ₄は、上述したように、例えば、Ｃ_1-6アルキルなどであり、Ｂｏｃはｔ−ブチルカーボネートである。

本発明の多くの態様の内で、好ましい保護アミン塩は、メチル−ｔ−ブチルイミドジカーボネートのカリウム塩（ＫＮＭｅＢｏｃ）である。

保護アミンを含有するポリマーが形成された後、保護基（例えば、Ｂｏｃ）を上述したように加水分解により除去して、所望のＰＥＧ−アミン誘導体を高純度で提供する。非Ｂｏｃ−保護基は、他の当該技術分野において公知の技法を用いて除去される。

次いで、高純度のＰＥＧ−アミンは、どのような当該技術分野において公知の様式で使用しても差し支えない。例えば、制限するものではなく、そのアミンは、当業者に良く知られた技法を用いて、ＣＯ₂Ｈ基、または関心のある生物学的に活性な標的上に見つけられる他の適切な反応性基との直接結合のために用いてもよい。あるいは、ＰＥＧ−アミンは、上述したベンジル除去（ＲＮＬ）プラットホームなどのより複雑なポリマー連結系における高純度中間体として、またはＰＥＧ−リポソーム系の一部としてさえ、使用できる。説明の目的で、ＲＮＬ系は、ＰＥＧ−アミンを適切な保護ベンジルアルコールと反応させ、その後、当業者に公知の技法を用いて、脱保護および活性化を行うことにより製造できる。以下の最後の実施例を参照のこと。

保護された末端アミンを含有するポリマーが形成された後、所望のアミン末端ポリマーを形成するために、そのポリマーを脱保護する、すなわち、保護基を除去する。脱保護は、制限するものではなく、Ｅｔ₂Ｏ（エーテル）またはジオキサン中のＨＣｌ溶液、酢酸、ジクロロ酢酸、蟻酸、およびジクロロメタン（またはジクロロエタン）中のトリフルオロ酢酸（１５％から３５％）などの酸、または酸を溶解し、有機環境下で脱保護を可能にするのに適合した他の溶媒を用いて行うことができる。本発明の多くの態様において、ジクロロメタン中２０％のトリフルオロ酢酸が好ましい。

本発明の方法は、少なくともほぼ等モル量の反応体を用いて行うことが好ましい。保護アミン塩は、化学式（Ｉ）の化合物に対して過剰なモル濃度で存在することがより好ましい。保護アミン塩は、ｍＰＥＧに対して少なくとも約３〜５倍過剰のモル濃度で存在することが好ましい。デルタ−ＰＥＧ（ビス−ＰＥＧまたは各末端で活性化された）が使用される場合、過剰なモル濃度は約２倍高い、例えば、約６〜１０倍過剰なモル濃度である。分岐ポリマーが用いられる場合、加えられるアミン基当たり同様の比が用いられる。末端分岐ポリマーが用いられる場合、好ましく使用される保護アミン塩の過剰なモル濃度は、ポリマーに見られる活性末端ポリマー部分（例えば、トシレートなど）の数と少なくとも等しい。

本発明の多くの態様において、キャッピングされていないＰＥＧ−ＯＨ（ジ−ＰＥＧ ＯＨ）またはｍＰＥＧなどのポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）が、化学式（ＩＩａ）または（ＩＩｂ）：

の化合物に転化され、ここで、Ｒ₂はＰＥＧまたはｍＰＥＧなどのＰＡＯであり、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＮＨＲ₈であり、ここで、Ｒ₈は、水素、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_3-12分岐アルキル、Ｃ_3-8シクロアルキル、Ｃ_1-6置換アルキル、Ｃ_3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ_1-6ヘテロアルキル、置換Ｃ_1-6ヘテロアルキル、Ｃ_1-6アルコキシ、フェノキシおよびＣ_1-6ヘテロアルコキシなどであり、
Ｒ₇は、例えば、メチル、ハロゲン、ニトロ、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、置換カルボキシル、および多数のハロゲンで置換されたベンゼンスルホニルである。ＣＨ₃が好ましい。

保護アミンを含有するポリマーが形成された後、保護基（例えば、Ｂｏｃ）が上述したように加水分解により除去されて、所望のＰＥＧ−アミン誘導体を高純度で形成する。

次いで、高純度のＰＥＧ−アミンは、どのような当該技術分野に知られた様式で用いても差し支えない。例えば、制限するものではなく、そのアミンを使用できる。

以下の実施例は、本発明をさらに理解するように働くが、本発明の有効な範囲をいかようにも制限することは意図されていない。

実施例１
^40kDaビス−ＰＥＧアミン

ａ） ＰＥＧ−トシレート（ＰＥＧ−ＯＴｓ）
８００ｍｌのＤＣＭ中の^40kDaΔＰＥＧ−ＯＨ（１００ｇ、２．５ミリモル、１当量）溶液に、４００ｍｌの３０％ＮａＯＨ水溶液およびＢｎＥｔ₃ＮＣｌ（２２８ｍｇ、１．０ミリモル、０．２当量）を加えた。次いで、激しく撹拌したこの混合物に、５００ｍｌのＤＣＭ中の塩化ｐ−トルエンスルホニル（２．８６ｇ、１５ミリモル、３当量）の溶液を２時間に亘り付加漏斗で滴下により加え、その反応混合物を室温で一晩撹拌した。５００ｍｌのＤＣＭおよび２００ｍｌの飽和ＮａＣｌ溶液を添加した後、有機相を分離し、２００ｍｌの飽和ＮａＣｌ溶液で２回洗浄した。この有機相を無水ＭｇＳＯ₄上で乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させて、固体を得た。その固体を最小量のＤＣＭ中に溶解させ、エチルエーテルで沈殿させた。濾過により、９７ｇの^40kDaΔＰＥＧ−ＯＴｓ（収率９６％）を得た。¹³C NMR: 21.57, 68.47, 69.07, 70.21-71.75 (PEG), 127.68, 129.55, 132.69, 144.44。

ｂ） ＰＥＧ−ＮＢｏｃ₂
５００ｍｌの無水ＤＭＦ中の^40kDaΔＰＥＧ−ＯＴｓ（９６ｇ、２．３８ミリモル、１当量）の溶液に、Ｂｏｃ₂ＮＫ（３．６５ｇ、１４．２８ミリモル、３当量）を加えた。この反応混合物を一晩４５℃に加熱した。室温まで冷却した後、１．２Ｌのエチルエーテルを加えた。得られた固体を濾過し、たっぷりのエーテルで洗浄した。この粗製固体を１．２ＬのＤＣＭ中に溶解させ、２００ｍｌの飽和ＮａＣｌ溶液で２回洗浄した。有機層をＭｇＳＯ₄上で乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させた。得られた固体をＤＣＭ／エチルエーテルで再結晶化させて、９０ｇの^40kDaΔＰＥＧ−ＮＢｏｃ₂（収率９４％）を得た。¹³C NMR (ppm): 27.93, 45.01, 69.05, 69.68-70.34 (PEG), 81.94, 152.20。

ｃ） ＰＥＧ−アミン塩（ＰＥＧ−ＮＨ₂・ＴＦＡ）
９００ｍｌのＤＣＭ中の^40kDaΔＰＥＧ−ＮＢｏｃ₂（９０ｇ、２．２３ミリモル）の溶液に、２２５ｍｌのＴＦＡを加えた。反応混合物を４時間に亘り室温で撹拌し、次いで、真空下で蒸発させた。得られた固体を、３００ｍｌのＤＣＭ中に溶解させ、２Ｌのエチルエーテルを加えることによって、沈殿させた。濾過後、固体を再度ＤＣＭ／エチルエーテルで再結晶化させて、８８ｇの^40kDaΔＰＥＧ−ＮＨ₂・ＴＦＡ（収率９８％）を得た。¹³C NMR (ppm): 39.87, 66.77, 69.71-70.72 (PEG)。

実施例２
^20kDaビス−ＰＥＧアミン

ＰＥＧ ４０ｋＤａの代わりにＰＥＧ ２０ｋＤａを使用したことを除いて、上述したのと同様に調製した^20kDaΔＰＥＧ−ＯＴｓから、対応する^20kDaΔＰＥＧ−アミンを製造した。化合物６は、実施例１の２と同じ条件下で製造した。６の構造をＮＭＲにより確認した。化合物７は、実施例１の３と同じ条件下で製造した。７の構造をＮＭＲにより確認した。化合物８は、実施例１の４と同じ条件下で製造した。８の構造をＮＭＲにより確認した。

実施例３
^40kDaビス−ＰＥＧ−Ｎ−メチルアミン

ａ） ＰＥＧ−トシレート（ＰＥＧ−ＯＴｓ）
実施例１の手法を繰り返した。

ｂ） ＰＥＧ−ＮＭｅＢｏｃ
化合物１０は、Ｂｏｃ₂ＮＫの代わりに等量のＢｏｃＭｅＮＫを用いたことを除いて、実施例１と同じ条件下で製造した。１０の構造をＮＭＲにより確認した。

ｃ） ＰＥＧ−Ｎ−メチルアミン（ＰＥＧ−ＮＨＭｅ）
化合物１１は、化合物３の代わりに等量の化合物１０を用いたことを除いて、実施例１と同じ条件下で製造した。構造はＮＭＲにより確認した。

実施例４
^30kDaｍＰＥＧ−アミン

ａ） ^30kDaｍＰＥＧ−トシレート（^30kDaｍＰＥＧ−ＯＴｓ）
８００ｍｌのＤＣＭ中の^30kDaｍＰＥＧ−ＯＨ（８５ｇ、２．８３ミリモル、１当量）の溶液に、４００ｍｌの３０％ＮａＯＨ水溶液およびＢｎＥｔ₃ＮＣｌ（２５７ｍｇ、１．１３ミリモル、０．４当量）を加えた。次いで、この激しく撹拌した混合物に、６００ｍｌのＤＣＭ中の塩化ｐ−トルエンスルホニル（１．６２ｇ、８．４９ミリモル、３当量）の溶液を２時間に亘り付加漏斗で滴下により加え、その反応混合物を室温で一晩撹拌した。８００ｍｌのＤＣＭおよび２００ｍｌの飽和ＮａＣｌ溶液を添加した後、有機相を分離し、２００ｍｌの飽和ＮａＣｌ溶液で２回洗浄した。この有機相を無水ＭｇＳＯ₄上で乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させて、固体を得た。その固体を最小量のＤＣＭ中に溶解させ、エチルエーテルで沈殿させた。濾過により、８０ｇの^30kDaΔＰＥＧ−ＯＴｓ（収率９４％）を得た。¹³C NMR: 21.57, 58.83, 68.41, 69.07, 69-69-72.95 (PEG), 127.62, 129.52, 132.68, 144.40。

ｂ） ^30kDaｍＰＥＧ−ＮＢｏｃ₂
８００ｍｌの無水ＤＭＦ中の^30kDaｍＰＥＧ−ＯＴｓ（７８ｇ、２．５９ミリモル、１当量）の溶液に、Ｂｏｃ₂ＮＫ（１．９９ｇ、７．８ミリモル、３当量）を加えた。この反応混合物を一晩４５℃に加熱した。室温まで冷却した後、３Ｌのエチルエーテルを加えた。得られた固体を濾過し、たっぷりのエーテルで洗浄した。この粗製固体を１．２ＬのＤＣＭ中に溶解させ、２００ｍｌの飽和ＮａＣｌ溶液で２回洗浄した。有機層をＭｇＳＯ₄上で乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させた。得られた固体をＤＣＭ／エチルエーテルで再結晶化させて、６７ｇの^30kDaｍＰＥＧ−ＮＢｏｃ₂（収率８６％）を得た。¹³C NMR (ppm): 27.93, 45.01, 58.83, 69.04, 69.66-71.70 (PEG), 81.94, 152.20。

ｃ） ^30kDaｍＰＥＧ−アミン塩（^30kDaＰＥＧ−ＮＨ₂・ＴＦＡ）
６７０ｍｌのＤＣＭ中の^30kDaｍＰＥＧ−ＮＢｏｃ₂（６７ｇ、２．２２ミリモル）の溶液に、３３５ｍｌのＴＦＡを加えた。反応混合物を４時間に亘り室温で撹拌し、次いで、真空下で蒸発させた。得られた固体を、３００ｍｌのＤＣＭ中に溶解させ、２Ｌのエチルエーテルを加えることによって、沈殿させた。濾過後、固体を再度ＤＣＭ／エチルエーテルで再結晶化させて、６４ｇの^30kDaｍＰＥＧ−ＮＨ₂・ＴＦＡ（収率９８％）を得た。¹³C NMR (ppm): 39.81, 58.83, 66.90, 69.63-71.70 (PEG)。

実施例５〜８
等モル量のトシレートの代わりに対応するＰＥＧ−Ｃｌ誘導体を使用したことを除いて、実施例１〜４のプロセスを繰り返した。

実施例９
^30kDaｍＰＥＧ ＲＮＬ９リンカー
この実施例において、実施例４の^30kDaｍＰＥＧ−ＮＨ₂を以下の反応式

にしたがって、活性ＰＥＧリンカーに転化させた。

ａ） ^30kDaｍＰＥＧ ＲＮＬ９ＯＴＢＤＭＳ２３
無水ＣＨ₃Ｃｌ中のアルコール２２（２３８ｍｇ、１ミリモル、６当量）の溶液に、ＤＳＣ（２３５ｍｇ、０．９２ミリモル、５．５当量）およびピリジン（８８μｌ、１．０８ミリモル、６．５当量）を加えた。得られた懸濁液を加熱して一晩還流させ、室温まで冷却し、２５ｍｌの無水ＣＨ₃Ｃｌ中の^30kDaｍＰＥＧ−ＮＨ₂・ＴＦＡ（以後、２１）（５ｇ、０．１７ミリモル、１当量）およびピリジン（１７μｌ、０．２１ミリモル、１．２５当量）の溶液に加えた。３日間に亘り室温で撹拌した後、溶媒を真空下で蒸発させた。得られた固体を最小量のジクロロメタン中に溶解させ、次いで、エーテルの添加により沈殿させ、濾過し、ＣＨ₃ＣＮ／ＩＰＡにより再結晶化させて、４．８５ｇ（収率９４％）を得た。GPC: 98.39%. ¹³C NMR (75.4 MHz, CDCl₃) δ 154.47, 149.59, 137.90, 126.52, 121.02, 69.09-71.65 (PEG), 64.24, 58.83, 40.83, 25.84, 18.27, 5.28。

ｂ） ^30kDaｍＰＥＧ ＲＮＬ９ＯＨ２４
２０ｍｌのＣＨ₃ＣＮおよび１０ｍｌの水中の２３（２．８５ｇ、０．１６ミリモル）の溶液に、５０ｍｌの氷酢酸を加えた。この反応混合物を室温で一晩撹拌し、次いで、真空下で蒸発させた。残留物を７５ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂中に溶解させた。有機相を１５ｍｌの水で２回洗浄し、ＭｇＳＯ₄上で乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させた。得られた固体を最小量のＣＨ₂Ｃｌ₂中に溶解させ、次いで、エーテルの添加により沈殿させて、４．４９ｇ（収率９４％）を得た。GPC: 98.35%. ¹³C NMR (75.4 MHz, CDCl₃) δ 154.36, 149.90, 138.18, 127.37, 121.15, 69.42-71.69 (PEG), 63.93, 58.80, 40.83。

ｃ） ^30kDaｍＰＥＧ ＲＮＬ９ＮＨＳ２５
５０ｍｌの無水ＣＨ₂Ｃｌ₂および５ｍｌの無水ＤＭＦ中の２４（４．４９ｇ、０．１５ミリモル、１当量）の溶液に、ＤＳＣ（３０５ｍｇ、１．１９ミリモル、８当量）を加えた。その混合物を０℃まで冷却し、次いで、ピリジン（８７μｌ、１．０７ミリモル、７．２当量）を加えた。その反応混合物を室温で一晩撹拌し、次いで、真空下で蒸発させた。得られた固体を最小量のＣＨ₂Ｃｌ₂中に溶解させ、次いで、エーテルの添加により沈殿させ、濾過し、ＣＨ₃ＣＮ／ＩＰＡにより再結晶化させて、４．２６ｇ（収率９４％）を得た。GPC: 97.04%. ¹³C NMR (75.4 MHz, CDCl₃) δ 168.33, 154.01, 151.51, 151.22, 129.80, 129.53, 121.68, 69.88-73.08 (PEG), 58.83, 40.89, 25.32。

最終生成物は、結合のために利用できるアミンまたはヒドロキシルを有する、かなり多くの生物学的活性ポリペプチド、酵素、タンパク質、小分子などへの結合に使用できる。そのような結合反応のための手法は、例えば、ここにその内容を引用する、同一出願人の米国特許第６１８００９５号明細書、または前述した非特許文献２に記載されている。

Claims (22)

1. 末端アミンを有するポリマーを調製する方法であって、
   ａ） 化学式（Ｉ）
   （Ｉ） Ｒ₃−Ｒ₂−Ｒ₁
   ここで、Ｒ₁は、反応性ポリマー末端基であり、
   Ｒ₂は、実質的に非抗原性ポリマーであり、
   Ｒ₃は、キャッピング基またはＲ₁である、
   の実質的に非抗原性のポリマーを、保護されたアミン塩と反応させて、保護された末端アミンを含有するポリマーを形成し、
   ｂ） 工程ａ）から得られた前記保護された末端アミンを含有するポリマーを酸と反応させて、保護基を除去し、末端アミンを有するポリマーを形成する、
   各工程を有してなる方法。
2. Ｒ₁が、トシレート、メシレート、ブロシレート、トレシレート、ノシレート、ＢｒおよびＣｌからなる群より選択される離脱基であることを特徴とする請求項１記載の方法。
3. 反応工程ａ）を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルアセトアミドおよびそれらの混合物からなる群より選択される溶媒中で行うことを特徴とする請求項１記載の方法。
4. 前記離脱基がトシレートであることを特徴とする請求項２記載の方法。
5. 前記保護されたアミン塩が、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルイミドジカ−ボネートのカリウム塩（ＫＮＢｏｃ₂）、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルイミドジカ−ボネートのリチウム塩（ＬｉＮＢｏｃ₂）、およびジ−ｔｅｒｔ−ブチルイミドジカ−ボネートのナトリウム塩からなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
6. 前記保護されたアミン塩が、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルイミドジカ−ボネートのカリウム塩（ＫＮＢｏｃ₂）であることを特徴とする請求項５記載の方法。
7. 前記保護されたアミン塩が、ＮＲ₄Ｂｏｃのカリウム、ナトリウムおよびリチウム塩から選択され、ここで、Ｒ₄は、水素、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_3-12分岐アルキル、Ｃ_3-8シクロアルキル、Ｃ_1-6置換アルキル、Ｃ_3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ_1-6ヘテロアルキル、置換Ｃ_1-6ヘテロアルキル、Ｃ_1-6アルコキシ、フェノキシ、およびＣ_1-6ヘテロアルコキシからなる群より選択され、Ｂｏｃがｔ−ブチルカーボネートであることを特徴とする請求項１記載の方法。
8. 前記保護されたアミン塩が、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルイミドジカーボネートのカリウム塩（ＫＮＭｅＢｏｃ）であることを特徴とする請求項７記載の方法。
9. 前記保護基を除去するために用いられる前記酸が、塩化水素酸、酢酸、ジクロロ酢酸、蟻酸、およびトリフルオロ酢酸からなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
10. 前記酸がトリフルオロ酢酸であることを特徴とする請求項１０記載の方法。
11. 前記Ｒ₃キャッピング基がＣＨ₃であることを特徴とする請求項１記載の方法。
12. Ｒ₃がＲ₁であることを特徴とする請求項１記載の方法。
13. Ｒ₂がポリアルキレンオキシドであることを特徴とする請求項１記載の方法。
14. 前記ポリアルキレンオキシドが、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールからなる群より選択されることを特徴とする請求項１３記載の方法。
15. 前記ポリアルキレンオキシドが化学式：−Ｏ−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）x−のポリエチレングリコールであり、ｘが約１０から約２，３００の整数であることを特徴とする請求項１４記載の方法。
16. 前記実質的に非抗原性のポリマーが、約２００から約１００，０００ダルトンの重量平均分子量を有することを特徴とする請求項１記載の方法。
17. 前記実質的に非抗原性のポリマーが、約２，０００から約４８，０００ダルトンの重量平均分子量を有することを特徴とする請求項１６記載の方法。
18. 前記化学式（Ｉ）の化合物が：
    

    

    であり、
    Ｒ₂がポリアルキレンオキシドであり、
    Ｘが、Ｏ、Ｓ、またはＮＨＲ₈であり、ここで、Ｒ₈は、水素、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_3-12分岐アルキル、Ｃ_3-8シクロアルキル、Ｃ_1-6置換アルキル、Ｃ_3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ_1-6ヘテロアルキル、置換Ｃ_1-6ヘテロアルキル、Ｃ_1-6アルコキシ、フェノキシおよびＣ_1-6ヘテロアルコキシからなる群より選択され、
    Ｒ₇は、メチル、ハロゲン、ニトロ、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、置換カルボキシル、および多数のハロゲンで置換されたベンゼンスルホニルであることを特徴とする請求項１記載の方法。
19. Ｒ₂がポリエチレングリコールであり、ＸがＯであり、Ｒ₇がメチルであることを特徴とする請求項１８記載の方法。
20. 前記方法により形成された末端アミンを含有するポリマーの純度が約９５％より高いことを特徴とする請求項１記載の方法。
21. 前記方法により形成された末端アミンを含有するポリマーの純度が９８％より高いことを特徴とする請求項２０記載の方法。
22. 前記方法により形成された末端アミンを含有するポリマーの純度が９９％より高いことを特徴とする請求項２１記載の方法。