KR20210077677A - 방출 가능한 중합체성 시약의 제조 방법 - Google Patents

방출 가능한 중합체성 시약의 제조 방법 Download PDF

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사무엘 피 맥매너스
앤토니 코즐로우스키
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Abstract

본 개시는 (무엇보다도) 플루오레닐계 중합체성 시약을 제조하는 개선된 방법, 이러한 중합체성 시약을 회수 및 정제하는 방법, 플루오레닐계 중합체성 시약에서 원치 않는 불순물을 감소시키는 방법, 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 플루오레닐계 중합체성 시약, 및 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 플루오레닐계 중합체성 시약과의 반응에 의해 제조된 접합체를 제공한다.

Description

방출 가능한 중합체성 시약의 제조 방법
관련 출원에 대한 교차 참조
이 출원은 35 U.S.C. §119(e) 하에 2018년 10월 11일에 출원된 미국 특허 출원 번호 62/744,512에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 그 개시는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
분야
본 출원은 (무엇보다도) 플루오레닐계 중합체성 시약을 제조하는 개선된 방법, 이러한 중합체성 시약을 회수 및 정제하는 방법, 플루오레닐계 중합체성 시약에서 원치 않는 불순물을 감소시키는 방법, 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 플루오레닐계 중합체성 시약, 및 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 플루오레닐계 중합체성 시약과의 반응에 의해 제조된 접합체에 관한 것이다.
폴리에틸렌 글리콜의 공유 부착에 의한 생체 활성(bioactive) 분자의 변형은 이러한 분자의 약리학적 및 약제학적 특성을 향상시킬 수 있으며, 여러 승인된 약물에서 성공적으로 사용되어 왔다. 예를 들어, 페길화는, 예를 들어, 심지아(CIMZIA)®(페길화된 종양 괴사 인자(TNF)), 뉴라스타(NEULASTA)®(페길화된 과립구-집락 자극 인자(GCSF)), 페가시스(PEGASYS)®(페길화된 인터페론 α-2a), 및 아디노베이트(ADYNOVATE)®(페길화된 인자 VIII)와 같이, 안정적인 결합으로 폴리에틸렌 글리콜에 바이오 의약품이 공유 부착되는 시판 약물을 만드는 데 사용되었다. 많은 경우에, 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 활성제에 안정적으로 공유 부착하면 변형되지 않은 분자와 비교할 때 기능적 활성이 감소된 PEG 접합체가 생성된다. 활성 약물이 안정적인 연결을 통해 중합체에 공유 부착될 때, 중합체-결합된 약물은 결합되지 않은 약물의 특성을 유지할 수 있지만, 일반적으로 약물 그램 당 이의 효능은 변형되지 않은 약물과 다르며, 그 이유는 공유 부착된 중합체가, 무엇보다도, 약물 분자를 둘러싼 입체 및 전자 환경을 변화시켜 약물의 효과를 떨어뜨릴 수 있기 때문이다(약물 그램 당 기준). 그러나, 이러한 효과는 특정 경우에, 예를 들어, 향상된 약물 효능이 달성될 수 있도록 하는 더 긴 순환 시간에 의해 상쇄될 수 있다.
PEG 시약이 방출성 연결을 통해 치료제에 공유 부착되는 페길화 기술도 존재한다. 방출 가능한 페길화(일부 경우 "가역적 페길화"로도 지칭됨)는 활성제 접합체(폴리에틸렌 글리콜과 같은 하나 이상의 수용성 중합체 모이어티에 방출 가능하게 화학적으로 결합된 약물 분자를 포함함)가 투여 후 생체내에서 발생하는 화학적 공정을 통해 시간이 지남에 따라 약물로부터 하나 이상의 중합체 모이어티를 방출하는 기술이다. 이러한 방출 가능하게-중합체 변형된 약물은 이론적으로 중합체(들)가 순환에서 시간이 지남에 따라 방출되고 모 약물 분자의 활성이 회복될 수 있기 때문에 때때로 프로-드럭으로 지칭된다. 방출 가능한 약물 전달 시스템의 효능은, 예를 들어, 약물 접합체로부터 하나 이상의 공유 부착된 중합체 모이어티가 방출되는 속도에 영향을 받을 수 있다.
가역적(방출성) 페길화를 겪을 수 있는 약물 접합체를 형성하는 데 사용될 수 있는 페길화 시약의 한 부류는 플루오레닐메틸옥시카보닐(FMOC) 아민 보호기를 기반으로 한다(참고: 예를 들어, Wuts, P.G., Greene, T.W., Protective Groups in Organic Synthesis, Fourth Ed., 2007, John Wiley & Sons, Inc., New Jersey; Bentley, M.D., et al., 미국 특허 번호 8,252,275; Shechter Y., et al., Eur J Pharm Biopharm ,　2008, 70, 19-28). 본원에서 분지형 구조를 갖는 중합체성 또는 일부 특정 경우에 페길화된 FMOC 시약으로 지칭되는 이러한 시약의 한 특정 부류의 일반화된 구조는 하기 구조식 X로 표시되어 있다(예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함된, 벤틀리(Bentley), M.D., 등의 미국 특허 번호 8,252,275에 기재됨, 여기에 L1 및 L2, 및 Re1 및 Re2에 대한 설명이 제공되어 있음). 이 예시적인 구조에서, 중합체성 시약은 N-하이드록실 석신이미딜 카보네이트(NHS) 에스테르로서 활성화되며, 즉, 석신이미딜 카보네이트 에스테르 이탈기를 포함한다.
[화학식 X]
Figure pct00001
PEG2 FMOC 시약은, 예를 들어, 카바메이트 부가물을 형성하기 위해 FMOC-유형 시약과 반응할 수 있는 친핵성 원자를 포함하는 치료제와 반응할 수 있다. 이 반응식은 하기에 예시되어 있으며, 예로서, 반응성 N-석신이미딜 카보네이트 기를 포함하는 예시적인 PEG2-FMOC 시약의 일반화된 형태와 단백질 라이신 기의 반응을 보여준 다(반응식 I).
[반응식 I]
Figure pct00002
이전에 기재된 합성 접근법에 의해 다양한 FMOC 시약을 제조하는 동안, 출원인은 원치 않는 부반응을 경험했다. 이러한 부반응은 (i) 최종 중합체-치료제 접합체의 품질에 잠재적으로 악영향을 미칠 수 있고, (ii) 치료제로부터 FMOC 중합체 모이어티(또는 모이어티들)의 방출 메커니즘을 변경할 수 있는 바람직하지 않은 부산물의 형성을 초래할 수 있다. 본 개시는 본 중합체성 FMOC 시약을 제조하는 이전에 기재된 방법과 관련된 난제를 설명하고, 이러한 문제를 극복하기 위한 여러 공정 개선을 제공하여, 특히, 예를 들어, 중합체성 FMOC 시약의 개선된 제조 방법, 중합체성 FMOC 시약을 제조하는 데 유용한 중간체의 개선된 제조 방법, FMOC 중간체를 활성화하기 위한 개선된 방법, 하나 이상의 바람직하지 않은 중합체성 FMOC-유래 부산물 또는 불순물을 제거하는 방법, 및 특정 중합체성 FMOC 시약을 안정화하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 개시는 본 중합체성 FMOC 시약 및 이의 접합체의 제조와 관련된 이들 및 기타 난제를 해결하고자 한다.
제1 양태에서는 반응성 중합체성 시약을 제조하는 방법, 즉, 개선된 방법이 본원에 제공된다. 이 방법은 (i) 구조식 I을 갖는 수용성 9-하이드록시메틸 플루오렌 중합체:
[화학식 I]
Figure pct00003
(여기서 POLYa는 제1 수용성, 비-펩티드성 중합체이고; POLYb는 제2 수용성 비-펩티드성 중합체이고; Re1은, 존재하는 경우, 제1 전자-변경 기이고; Re2는, 존재하는 경우, 제2 전자-변경 기이고; L1은 제1 연결 모이어티이고; L2는 제2 연결 모이어티임);
를 무수 조건으로 염기의 존재하에 비양성자성 유기 용매에서 디벤조트리아졸릴 카보네이트(BTC)와 반응시켜 하기 구조를 갖는 수용성 9-메틸 벤조트리아졸릴 카보네이트 플루오렌 중합체를 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계:
[화학식 II]
Figure pct00004
(여기서 POLYa , POLYb , Re1, Re2, L1, 및 L2는 각각 단계 (i)에서 설명된 바와 같은 값을 가짐), 및 (ii) 수용성 9-메틸 벤조트리아졸릴 카보네이트 플루오렌 중합체의 침전을 촉진하는 데 효과적인 무수 용매로 침전시켜 수용성 9-메틸 벤조트리아졸릴 카보네이트 플루오렌 중합체(II)를 회수하는 단계를 포함한다.
본 방법과 관련된 하나 이상의 구현예에서, 단계 (i)에서 구조식 I의 수용성 9-하이드록시메틸 플루오렌 중합체는 약 30 당량 미만의 디벤조트리아졸릴 카보네이트(디-BTC)와 반응한다.
일부 구현예에서, 염기는 아민이다. 일부 추가 구현예에서, 염기는 비-친핵성 아민이거나 약한 친핵성 아민이다. 염기에는, 예를 들어, 피리딘, 4-디메틸아미노피리딘, N,N-디이소프로필에틸아민, 2,6-디-3급-부틸피리딘, N-메틸이미다졸, N-메틸모르폴린, 2,6-루티딘, 2,4,6-콜리딘, N,N,2,6-테트라메틸피리딘-4-아민, 및 전술한 것들 중 임의의 염기의 불용성-중합체-결합된 형태가 포함된다. 아민은 또한, 예를 들어, N,N,N',N'-테트라메틸-1,6-헥사메틸디아민, N,N', N', N",N"-펜타메틸디에틸렌트리아민, 및 헥사메틸렌테트라민과 같은 폴리아민일 수 있다.
본 방법의 하나 이상의 구현예에서, 단계 (ii)에서, 침전 촉진에 효과적인 무수 용매는 산을 추가로 포함한다.
일부 추가 구현예에서, 본 방법은, 반응 단계 전에, 구조식 I의 수용성 9-하이드록시메틸 플루오렌 중합체를 비양성자성 유기 용매에 용해시켜 중합체 용액을 형성하고, 중합체 용액을 공비 증류에 의해 건조시켜 수분 함량이 약 500 ppm 미만인 중합체 용액을 제공하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 추가 구현예에서, 단계 (ii)로부터 회수된 수용성 9-메틸 벤조트리아졸릴 카보네이트 플루오렌 중합체는 10 몰% 미만의 수용성 풀벤 중합체를 포함한다.
본 방법의 일부 다른 구현예에서, 회수 단계는 단계 (i)로부터의 반응 혼합물을 여과하여 고형물을 제거하여 수용성 9-메틸 벤조트리아졸릴 카보네이트 플루오렌 중합체를 포함하는 용액을 제공한 다음, 용액으로부터 수용성 9-메틸 벤조트리아졸릴 카보네이트 플루오렌 중합체를 침전시키는 데 효과적인 양의 무수 용매를 첨가하는 것을 포함한다.
일부 추가 구현예에서, 수용성 9-메틸 벤조트리아졸릴 카보네이트 플루오렌 중합체의 침전을 촉진하는 데 효과적인 무수 용매는 소량의 산을 포함한다.
일부 추가 구현예에서, 본 방법은 회수된 수용성 9-메틸 벤조트리아졸릴 카보네이트 플루오렌 중합체를 수용성 9-메틸 벤조트리아졸릴 카보네이트 플루오렌 중합체가 불용성이거나 실질적으로 불용성인 무수 용매로 세척하는 것을 포함하며, 용매는 약 0.0001 내지 약 0.5 몰%의 산을 포함한다.
일부 추가 구현예에서, 본 방법은 (iii) 회수된 수용성 9-메틸 벤조트리아졸릴 카보네이트 플루오렌 중합체를 정제하는 단계를 추가로 포함한다.
제2 양태에서는 상기 기재된 바와 같은 회수 또는 정제된 수용성 9-메틸 벤조트리아졸릴 카보네이트 플루오렌 중합체를, 전환을 수행하기에 효과적인 조건하에, 예를 들어, 수용성 9-메틸 N-하이드록시 석신이미딜 카보네이트 플루오렌 중합체와 같은 상이한 반응성 카보네이트로 전환시키는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 하나 이상의 예시적인 구현예에서, 이러한 전환은 디메틸아미노피리딘의 존재하에 수행된다. 또 다른 하나 이상의 구현예에서, 전환 반응은, 예를 들어, 디클로로메탄과 같은 용매에서 수행된다.
또한, 제3 양태에서는 N-하이드록실 석신이미딜 카보네이트 에스테르-활성화된 중합체성 시약을 제조하는 방법이 제공된다. 본 방법은 (i) 하기 구조를 갖는 수용성 9-하이드록시메틸 플루오렌 중합체:
[화학식 I]
Figure pct00005
(여기서 POLYa는 제1 수용성, 비-펩티드성 중합체이고; POLYb는 제2 수용성 비-펩티드성 중합체이고; Re1은, 존재하는 경우, 제1 전자-변경 기이고; Re2는, 존재하는 경우, 제2 전자-변경 기이고; L1은 제1 연결 모이어티이고; L2는 제2 연결 모이어티이고; 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 Re1은 제1 전자-변경 기이고; 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 Re2는 제2 전자-변경 기임);
를 염기의 존재하에 무수 비양성자성 유기 용매에서 약 1 당량 내지 20 당량의 디석신이미딜 카보네이트와 반응시켜 하기 구조를 갖는 수용성 9-메틸 N-석신이미딜 카보네이트 플루오렌 중합체를 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계:
[화학식 III]
Figure pct00006
(여기서 POLYa , POLYb , Re1, Re2, L1, 및 L2는 각각 단계 (i)에서 설명된 바와 같은 값을 가짐), 및 (ii) 반응 혼합물로부터 구조식 III의 수용성 9-메틸 N-하이드록시석신이미딜 카보네이트 플루오렌 중합체를 회수하는 단계를 포함한다.
예시적인 수용성 9-메틸 N-하이드록시석신이미딜 카보네이트 플루오렌 중합체는 하기 구조식 XI 내지 구조식 XIV를 포함하며, 여기서 mPEGO~는 메톡시폴리에틸렌 글리콜 또는 CH3O(CH2CH2O)nCH2CH2O-의 약칭이고, (폴리에틸렌 글리콜 이외의 플루오렌 코어 상에 치환되는 추가적인 수용성 중합체 사슬일 수 있는, 벤조트리아졸릴 카보네이트와 같은 표적 약물 분자의 작용기와의 반응에 적합한 다수의 반응성 기 중 임의의 것이 적절하게 고려될 수 있음), 여기서 각각의 (n)은 약 3 내지 2273의 범위에 있으며, 본원의 다른 곳에서 설명된 (n)에 대한 각각의 모든 하위 범위 및 특정 값을 포함한다:
[화학식 XI]
Figure pct00007
구조식 XI: 9-하이드록시메틸-4-(mPEG-카복시아미드)-7-(3-(mPEG카바모일-프로필)-플루오렌-N-하이드록시석신이미딜 카보네이트("CAC-PEG2-FMOC-NHS")
[화학식 XII]
Figure pct00008
구조식 XII: 9-하이드록시메틸-2,7-디(mPEG-아미도글루타르산 아미드)플루오렌-N-하이드록시석신이미딜 카보네이트("G2-PEG2-FMOC-NHS")
[화학식 XII]
Figure pct00009
구조식 XIII: 9-하이드록시메틸-4-(mPEG-카복시아미드)-7-(mPEG 아미도글루타르산 아미드)플루오렌-N-하이드록시석신이미딜 카보네이트("CG-PEG2-FMOC-NHS")
[화학식 XIV]
Figure pct00010
구조식 XIV : 9-하이드록시메틸-2,7-(bis-mPEG-카복시아미드)-플루오렌-N-하이드록시석신이미딜 카보네이트("C2-PEG2-FMOC-NHS").
전술한 방법의 일부 구현예에서, 반응 단계 (i) 전에, 수용성 9-하이드록시메틸 플루오렌 중합체를 무수 비양성자성 유기 용매에 용해시켜 중합체 용액을 제공한 다음, 존재할 수 있는 물을 제거하기 위해 중합체 용액을 건조시켜 수분 함량이 500 ppm 미만인 건조된 중합체 용액을 제공한다.
본 방법의 일부 추가 구현예에서, 수분 함량이 200 ppm 미만인 건조된 중합체 용액이 얻어질 때까지 건조를 반복한다.
일부 추가의 특정 구현예에서, 건조 단계는 중합체 용액을 공비 증류하는 것을 포함한다.
전술한 것과 관련된 일부 추가 구현예에서, 중합체 용액의 수분 함량이 일정하게 유지될 때까지 건조가 반복된다.
하나 이상의 추가 구현예에서, 본 방법은, 회수 단계 전에, 단계 (i)로부터의 반응 혼합물에 염기를 중화하는 데 효과적인 양의 산을 첨가하는 것을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 방법은 15 몰% 이하의 수용성 풀벤 중합체를 포함하는 회수된 수용성 9-메틸 N-하이드록시석신이미딜 카보네이트 플루오렌 중합체를 생성하는 데 효과적이다.
본 방법의 하나 이상의 구현예에서, 침전 용매의 온도는 이의 빙점보다 높고 실온보다 낮다.
일부 추가 구현예에서, 침전 용매는 소량의 산을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 방법은 회수된 수용성 9-메틸 N-하이드록시석신이미딜 카보네이트 플루오렌 중합체를 산성화된 침전 용매로 세척하는 것을 추가로 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 본 방법은 회수된 수용성 9-메틸 N-하이드록시석신이미딜 카보네이트 플루오렌 중합체를 정제하는 것을 추가로 포함한다.
일부 추가 구현예에서, 정제 단계는 회수된 수용성 9-메틸 N-하이드록시석신이미딜 카보네이트 플루오렌 중합체를 용매에 용해시켜 용액을 제공하고, 용액을 티올-함유 수지에 통과시켜 임의의 수용성 풀벤 중합체를 제거함으로써 정제된 용액을 제공하고, 정제된 용액에서 용매를 제거하여 정제된 수용성 9-메틸 N-하이드록시석신이미딜 카보네이트 플루오렌 중합체를 회수하는 것을 포함한다.
또 다른 하나 이상의 추가 구현예에서, 회수 또는 정제된 수용성 9-메틸 벤조트리아졸릴 카보네이트 플루오렌 중합체 또는 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 다른 반응성 카보네이트를 아민-함유 생물학적 활성제와 반응시켜 접합체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 브롬화된 수용성 플루오렌 중합체가 제공된다. 하나 이상의 구현예에서, 브롬화된 수용성 플루오렌 중합체는 하기로부터 선택된 구조를 갖는다:
[화학식 IVa]
Figure pct00011
,
[화학식 IVb]
Figure pct00012
및
[화학식 IVc]
Figure pct00013
,
(여기서 POLYa , POLYb , L1, 및 L2는 본원의 다른 곳에서 설명된 값을 가짐).
추가 양태 및 구현예는 다음의 설명 및 청구범위에서 설명된다.
정의
본 개시의 어떤 특징을 설명하고 청구함에 있어서, 달리 지시되지 않는 한, 하기에 설명된 정의에 따라 다음 용어가 사용될 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수 형태(영문의 "a", "an" 및 "the")는 문맥상 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "중합체"에 대한 언급은 단일 중합체뿐만 아니라 2종 이상의 동일하거나 상이한 중합체를 포함하고, "접합체"에 대한 언급은 단일 접합체뿐만 아니라 2종 이상의 동일하거나 상이한 접합체를 지칭하며, "부형제"에 대한 언급은 단일 부형제뿐만 아니라 2종 이상의 동일하거나 상이한 부형제를 포함한다.
"수용성, 비-펩티드성 중합체"는 실온에서 물에 적어도 35%(중량 기준) 용해되는 중합체를 지칭한다. 그러나 바람직한 수용성, 비-펩티드성 중합체는 바람직하게는 70%(중량 기준) 초과, 더욱 바람직하게는 95%(중량 기준) 초과로 물에 용해된다. 전형적으로, "수용성" 중합체의 여과되지 않은 수성 제제는 여과 후 동일한 용액에 의해 투과되는 광량의 적어도 75%를 투과시킨다. 바람직하게는, 이러한 여과되지 않은 수성 제제는 여과 후 동일한 용액에 의해 투과되는 광량의 적어도 95%를 투과시킨다. 가장 바람직한 것은 물에 적어도 95%(중량 기준) 용해되거나 물에 완전히 용해되는 수용성 중합체이다. "비-펩티드성"과 관련하여, 중합체는 35%(중량 기준) 미만의 아미노산 잔기를 함유할 때 비-펩티드성이다.
용어 "단량체", "단량체 서브유닛" 및 "단량체 단위"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 중합체의 기본 구조 단위 중 하나를 지칭한다. 동종-중합체의 경우 단일 반복 구조 단위가 중합체를 형성한다. 공중합체의 경우 2개 이상의 구조 단위가 패턴으로 또는 무작위로 반복되어 중합체를 형성한다. 본 발명과 관련하여 사용되는 바람직한 중합체는 동종-중합체이다. 수용성 비-펩티드성 중합체는 연속적으로 부착된 3개 이상의 단량체를 포함하여 단량체 사슬을 형성한다.
본원에 사용된 "PEG" 또는 "폴리에틸렌 글리콜"은 임의의 수용성 폴리(에틸렌 옥사이드)를 포함하는 것을 의미한다. 달리 지시되지 않는 한, "PEG 중합체" 또는 폴리에틸렌 글리콜은 실질적으로 모든(바람직하게는 모든) 단량체 서브유닛이 에틸렌 옥사이드 서브유닛인 것이지만, 중합체는, 예를 들어, 접합을 위해 별개의 말단 캡핑 모이어티 또는 작용기를 함유할 수 있다. PEG 중합체는 일반적으로, 예를 들어, 합성 변형 동안 말단 산소(들)가 치환되었는지 여부에 따라 다음 2개의 구조식 중 하나를 포함할 것이다: "-(CH2CH2O)n-" 또는 "-(CH2CH2O)n- 1CH2CH2-". 상기 언급된 바와 같이, PEG 중합체의 경우, 변수(n)는 약 3 내지 2273의 범위이며, 전체 PEG의 말단 기 및 구조는 다양할 수 있다. "n"에 대한 추가 하위 범위가 본원에 설명되어 있다. 본 개시와 관련된 PEG 중합체는 전형적으로 말단 캡핑되며, 여기서 바람직한 말단-캡핑기는 저급 알킬기이고, 가장 바람직한 말단-캡핑기는 메틸이다.
PEG와 같은 수용성 중합체의 맥락에서 분자량은 수 평균 분자량 또는 중량 평균 분자량으로 표현될 수 있다. 달리 지시되지 않는 한, 본원에서 분자량에 대한 모든 언급은 중량 평균 분자량을 지칭한다. 수 평균 및 중량 평균의 분자량 측정은 둘 모두 겔 투과 크로마토그래피 또는 다른 액체 크로마토그래피 기술(예를 들어 겔 여과 크로마토그래피)을 사용하여 측정될 수 있다. 가장 일반적으로 사용되는 것은 겔 투과 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피이다. 분자량을 결정하는 다른 방법에는 수 평균 분자량을 결정하기 위한 말단-기 분석 또는 총괄성(예를 들어, 빙점 강하, 비점 상승 또는 삼투압) 측정 또는 중량 평균 분자량을 결정하기 위한 광 산란 기술, 초원심분리, MALDI TOF, 또는 점도측정법의 사용이 포함된다. PEG 중합체는 전형적으로 다분산성(즉, 중합체의 수 평균 분자량 및 중량 평균 분자량이 동일하지 않음)이며, 바람직하게는 약 1.2 미만, 보다 바람직하게는 약 1.15 미만, 더욱더 바람직하게는 약 1.10 미만, 더욱더 바람직하게는 약 1.05 미만, 가장 바람직하게는 약 1.03 미만의 낮은 다분산성 값을 갖는다.
중합체의 기하학적 구조 또는 전체 구조와 관련하여 "분지형"은 분지점 또는 중심 구조적 특징부로부터 연장되는 2개 이상의 중합체 "암(arm)" 또는 "사슬"을 갖는 중합체를 지칭한다. 일부 바람직한 분지형 중합체의 예는 다음 특징 중 하나 이상을 갖는 것들이다: 2개 이상의 중합체 암을 가짐, 2개의 중합체 암을 가짐, 동일한 구조를 갖는 중합체 사슬로 구성됨(예를 들어, 동일한 단량체 서브유닛으로 구성됨), 및 동일한 중량 평균 분자량을 갖는 중합체 암으로 구성됨.
"안정적인" 연결 또는 결합은 물에서 실질적으로 안정한 화학적 결합을 지칭하며, 즉, 생리적 조건하에 장기간에 걸쳐 상당한 정도로 가수분해 또는 분해를 겪지 않는다. 가수분해적으로 안정적인 연결의 예는 일반적으로 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 탄소-탄소 결합(예를 들어, 지방족 사슬), 에테르 연결, 아미드 연결, 아민 연결 등. 그러나 임의의 주어진 화학 결합의 안정성은, 화학 분야의 숙련자에 의해 이해되는 바와 같이, 결합이 위치하는 분자의 특정 구조적 특징부뿐만 아니라 주어진 분자, 인접 및 이웃 원자 내에서 대상 연결의 위치 등에 영향을 받을 수 있음을 이해해야 한다. 당업자는, 예를 들어, 관심 조건(예를 들어, 생리적 조건) 하에 관심 연결-함유 분자를 두고, 적절한 기간 동안 방출 증거를 시험함으로써 주어진 연결이 주어진 맥락에서 안정적인지 또는 방출 가능한지를 결정할 수 있다. 일반적으로 안정적인 연결은 생리적 조건하에 하루에 약 1% 내지 2% 미만의 가수분해율을 나타내는 연결이다. 대표적인 화학 결합의 가수분해율은 대부분의 표준 유기 화학 교과서에서 찾을 수 있다.
예를 들어, 활성 모이어티 또는 다른 분자와 같은 표적 분자에 공유적으로 부착되는 중합체성 FMOC 시약과 같은 수용성 중합체의 맥락에서 공유 "방출성" 연결은 생리학적 조건하에 활성 모이어티로부터 하나 이상의 수용성 중합체가 방출되거나 분리되는 연결이다. 방출은, 예를 들어, 임의의 적절한 메커니즘에 의해 임상적으로 유용한 비율로 발생할 수 있다. 방출성 연결은 생리학적으로 절단 가능한 결합 또는 연결로도 지칭될 수 있다.
"알킬"은 전형적으로 길이가 약 1 내지 15개 원자 범위인 탄화수소 사슬을 지칭한다. 이러한 탄화수소 사슬은 바람직하게는 포화된 것이지만 반드시 포화된 것은 아니며, 분지형 또는 직쇄일 수 있지만, 전형적으로 직쇄가 바람직하다. 예시적인 알킬기는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 3-메틸펜틸 등을 포함한다.
"저급 알킬"은 1개 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 알킬기를 지칭하며, 메틸, 에틸, n-부틸, i-부틸 및 t-부틸로 예시되는 바와 같이 직쇄 또는 분지형일 수 있다.
"알콕시"는 -OR 기를 지칭하며, 여기서 R은 알킬 또는 치환된 알킬, 바람직하게는 C1-6 알킬(예를 들어, 메톡시, 에톡시, 프로필옥시 등)이다.
예를 들어, "치환된 알킬"에서와 같이 용어 "치환된"은 모이어티(예를 들어, 알킬기)가 하나 이상의 비간섭 치환체, 예컨대, 비제한적으로, 알킬, C3-8 사이클로알킬, 예를 들어, 사이클로프로필, 사이클로부틸 등; 할로, 예를 들어, 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도; 시아노; 알콕시, 저급 페닐; 치환된 페닐; 등으로 치환된 것을 지칭한다. "치환된 아릴"은 치환체로서 하나 이상의 비간섭기를 갖는 아릴이다. 페닐 고리 상의 치환의 경우, 치환체는 임의의 방향(즉, 오르토, 메타 또는 파라)일 수 있다. 나프탈렌 또는 플루오렌 코어와 같은 보다 복잡한 시스템의 일부인 아릴 모이어티 상의 치환체는 구조에서 달리 점유되지 않은 모든 아릴 고리 위치를 점유할 수 있다.
"비간섭 치환체"는, 분자 내에 존재할 때, 전형적으로 분자 내에 함유된 다른 작용기와 비반응성인 기이다.
"아릴"은 코어 탄소 원자가 각각 5개 또는 6개인 하나 이상의 방향족 고리를 의미한다. 아릴은 나프틸에서와 같이 융합될 수 있거나 바이페닐에서와 같이 융합되지 않을 수 있는 다중 아릴 고리를 포함한다. 아릴 고리는 또한 하나 이상의 사이클릭 탄화수소, 헤테로아릴 또는 헤테로사이클릭 고리와 융합되거나 융합되지 않을 수 있다. 본원에 사용된 "아릴"은 헤테로아릴을 포함한다. 방향족 모이어티(예를 들어, Ar1, Ar2 등)는 아릴을 함유하는 구조를 의미한다.
"헤테로아릴"은 1개 내지 4개의 헤테로원자, 바람직하게는 황, 산소 또는 질소, 또는 이들의 조합을 함유하는 아릴기이다. 헤테로아릴 고리는 또한 하나 이상의 사이클릭 탄화수소, 헤테로사이클릭, 아릴 또는 헤테로아릴 고리와 융합될 수 있다.
"헤테로사이클" 또는 "헤테로사이클릭"은 불포화 또는 방향족 특성이 있거나 없는 5개 내지 12개 원자, 바람직하게는 5개 내지 7개 원자로 구성된 하나 이상의 고리를 의미하고, 탄소가 아닌 적어도 하나의 고리 원자를 갖는다. 바람직한 헤테로원자는 황, 산소 및 질소를 포함한다.
"치환된 헤테로아릴"은 치환체로서 하나 이상의 비간섭기를 갖는 헤테로아릴이다.
"치환된 헤테로사이클"은 비간섭 치환체로부터 형성된 하나 이상의 측쇄를 갖는 헤테로사이클이다.
본원에 사용된 "유기 라디칼"은 알킬, 치환된 알킬, 아릴 및 치환된 아릴을 포함할 것이다.
"무수" 물질은 500 ppm 이하의 물을 함유하는 물질이다. 바람직하게는, 무수 물질 또는 조건은 450 ppm 이하의 물 또는 400 ppm 이하의 물을 함유하는 것이다. 보다 바람직하게는, 조건의 무수 물질은 200 ppm 이하의 물을 함유한다. 가장 바람직하게는 무수 물질은 현대 분석 방법으로 측정할 수 있는 양보다 적은 물을 함유하며, 이는 현재 100 ppm 미만이다. 본원에 기재된 무수 물질 또는 조건에 대한 예시적인 수분 함량 범위는 약 80 ppm 내지 약 200 ppm이다.
예를 들어, 반응 조건과 관련하여 "무수 조건"은 반응물, 용매, 유리 제품, 분위기 등에서 수분이 배제되도록 주의를 기울인 조건을 의미한다. 무수 조건은 전형적으로 건조 용매(화학 분야의 숙련자에게 잘 알려진 임의의 적합한 건조 기술 사용), 건조 시약, 불활성 분위기, 건조 반응 장비 등의 사용을 포함한다. 용매를 건조시키고 이러한 용매 내에 잔류하는 물을 측정하는 전형적인 방법은 문헌[Pangborn, A. B., et al Organometallics , 1996, 15, 1518-1520; 및 Williams, D. B. G., et al J. Org . Chem . 2010, 75, 8351-8354]에서와 같은 연구에서 찾을 수 있다.
"실질적으로" 또는 "본질적으로"는 거의 완전히 또는 완전히, 예를 들어, 주어진 양의 95% 이상을 의미한다.
유사하게, 본원에 사용된 "약" 또는 "대략"은 주어진 양의 ± 5% 이내를 의미한다.
"선택적" 또는 "선택적으로"는 이후에 설명되는 상황이 발생할 수 있지만 반드시 발생할 필요는 없음을 의미하며, 따라서 이 설명은 상황이 발생하는 경우와 상황이 발생하지 않는 경우를 포함한다.
"약제학적으로 허용되는 부형제" 또는 "약제학적으로 허용되는 담체"는 본원에 기재된 조성물에 포함될 수 있고, 대상체에게 심각한 유해한 독성 효과를 일으키지 않는 성분을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "환자" 또는 "대상체"는 암과 같이 본원에 제공된 화합물 또는 조성물 또는 조합의 투여에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 질환을 앓고 있거나 이에 걸리기 쉬운 살아있는 유기체를 지칭하며, 인간과 동물 모두를 포함한다. 대상체는 포유동물(예를 들어, 뮤린, 유인원, 말, 소, 돼지, 개, 고양이 등)을 포함하지만, 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 인간이다.
개요
중합체성 FMOC 시약 및 최종 중합체성 시약으로 이어지는 일부 중간체는 카보네이트 작용기의 염기-촉매된 손실에 민감하다. 시약의 분해를 촉매하는 물질의 염기성 부분은 음으로 하전되거나 하전되지 않을 수 있다. 이 공정은 PEG2-FMOC-치료제 접합체에 이의 효능을 제공하는 것과 동일한 유형의 공정이다. (PEG-함유 시약 또는 접합체에 대한 언급은 본원에 기재된 것과 같은 다른 수용성 중합체에도 동일하게 적용된다는 것을 의미함을 유의한다). 보다 구체적으로, PEG2-FMOC 접합체는 플루오렌 고리의 9-위치에서 이온화 가능한 벤질 양성자를 추출할 수 있는 임의의 물질과의 생체내 반응에 의해 공유 부착된 치료제("약물")를 방출한다. 약물 방출 공정은 특정한 예시적인 PEG2-FMOC 접합체 구조와 관련하여 반응식 II에 예시되어 있다.
[반응식 II]
Figure pct00014
반응식 II에 예시된 경로와 유사한 메커니즘 경로에 따라, PEG2-FMOC-NHS 시약(또는 임의의 다른 적절하게 활성화된 PEG2-FMOC 시약)은 하전되거나 하전되지 않은 염기성 물질과 반응할 수 있다. 이는 반응식 III에 나타나 있으며, PEG2 풀벤 유도체를 제공하기 위한 PEG2-FMOC 중간체 또는 시약의 바람직하지 않은 염기-촉매된 제거 반응의 메커니즘을 설명한다.
[반응식 III]
Figure pct00015
PEG2-FMOC-BTC 중간체는 반응식 III의 NHS 시약에 대해 나타낸 것과 유사한 염기-촉매된 공정에 따라 분해되며, 여기서 이탈기는 N-하이드록시석신이미드가 아닌 1-하이드록시벤조트리아졸릴이다.
따라서, 유리한 중합체성 시약을 제공하기 위해, 이들 및 기타 유사한 에스테르-유사 시약을 제공하는 합성 공정은 이상적으로는 염기성 물질과 중간체 및 최종 시약의 상호 작용으로 인한 손실을 최소화하는 데 효과적인 조건하에 수행될 것이다. 이러한 방법은 플루오렌 고리가 구조식 X에서 Re1 및 Re2와 같은 하나 이상의 전자 끄는 기로 치환될 때 특히 바람직하다. 본원에 설명된 반응 방법, 조건, 중간체, 생성물 회수 및 정제 절차는, 예를 들어, 중합체를 연결하는 링커(들), 즉 L1 또는 L2가 플루오렌 코어 근처에 있거나 또는 플루오렌 코어에 직접 부착된 특정 원자의 존재로 인해 더 많은 전자를 끌어당길 때, 예를 들어, 처리 또는 작업 단계 동안 염기성 물질을 배제하기 위한 취급 및 관리가 또한 중요할 수 있음을 설명한다. 예를 들어, 플루오레닐 코어에 부착된 전자 끄는 기의 존재는 제거 반응(예를 들어, 반응식 II 및 III)을 훨씬 더 쉽게 만들 수 있는데, 이는 전자를 끌어당기는 영향이 9 위치에서 양성자에 영향을 미쳐 보다 산성이 되게 하여 염기성 종에 의해 더 쉽게 제거될 수 있게 하기 때문이다. 따라서, 염기 촉매된 분해는 특히 문제가 될 수 있으며, 전형적으로 PEG2-G2-FMOC 시약 클래스에서는 심각하지 않지만, PEG2-C2-FMOC 시약 및 반응성 중간체에서는 매우 심각할 수 있다. 그 결과, 반응성이 낮은 PEG-FMOC 시약의 제조를 위해 이전에 설명한 공정은 양질의 반응성이 높은 PEG-FMOC 시약(예를 들어, NHS 시약)을 제공하는 데 덜 선호되는 것으로 밝혀졌으며, 모든 반응성 유형의 PEG-FMOC 시약 제조에 성공적으로 적용되지 않을 수 있다.
시약에 PEG2 풀벤이 존재하는 한 가지 결과는 표적 치료제와 PEG2 풀벤 불순물 사이에 바람직하지 않은 부반응이 발생할 가능성이 있다는 것이다. 이 부반응은 하기 예시적인 반응식 IV에 제시되어 있다(여기서 예시적인 수용성 FMOC 시약은 예시를 위한 것이며, FMOC 중합체성 풀벤의 구조에 대해 제한하지 않음).
반응식 IV
Figure pct00016
이 반응에서 치료제, 예를 들어, 단백질의 티올 기는 PEG2 풀벤과 반응할 수 있다(참고: 예를 들어, Culbertson, S., et al., 미국 특허 번호 8,905,235). PEG2 FMOC 활성 카보네이트 시약과, 예를 들어, 단백질(예를 들어, 반응식 I 참조) 사이의 반응에 의해 형성된 의도된 접합체가 아닌 반응식 IV에 나타난 바와 같은 중합체 접합체가 형성되면, 완전히 다른 메커니즘에 의해 매우 다른 환경 조건하에 단백질의 방출이 발생할 수 있다. 따라서, 하나 이상의 양태에서, 본원에 제공된 방법의 하나의 목적은 반응식 IV에서 보여주는 공정을 최소화 및/또는 방지하는 것이다. 예를 들어, 아민과 같은 임의의 반응성 친핵체에서도 유사한 반응이 발생할 수 있지만, 이러한 반응은 전형적으로 접합 조건하에서 예상되지 않는다.
전형적인 정제 공정은 대부분의 작은 분자를 제거하지만 다른 PEG 중합체성 불순물은 제거하지 않는 재침전 절차이기 때문에 PEG-FMOC-NHS 시약의 통상적인 정제 동안에는 PEG2-풀벤이 제거되지 않는다는 점에 유의해야 한다. 이는 여러 난제들 중에서도 특히 이전에 해결되지 않았지만 본 개시에 의해 해결되는 난제를 나타낸다.
본원에 기재된 다양한 공정 개선 및 개선된 물질 중에서, 본 개시는 다음을 제공하지만 이에 제한되지 않는다:
(i) 예를 들어, C2-PEG2-FMOC-NHS와 같은 반응성 수용성 중합체성 FMOC 시약의 제조 방법 개선;
(ii) 매우 독성이 강한 시약인 포스겐(또는 이의 전구체(예를 들어 트리포스겐))을 반응성 중합체성 FMOC N-하이드록시석신이미드(NHS) 시약으로 쉽게 전환될 수 있는 중간체를 형성하는 데 효과적인 보다 안전한 시약으로 대체하는 방법(즉, 포스겐 또는 포스겐 전구체가 없는 방법);
(iii) C2-PEG2-FMOC-OH와 같은 9-하이드록실메틸 플루오렌 중합체를 디석신이미딜 카보네이트(DSC)로 직접 활성화하는 방법;
(iv) 중합체성 하이드록시메틸플루오렌의 활성화 전에 반응성 PEG 풀벤 불순물을 제거하는 방법;
(v) 산성 첨가제에 의한 중합체 FMOC 활성 카보네이트 시약의 안정화 방법; 및
(vi) 전형적인 중합체-FMOC 중간체, 예를 들어 클로로포르메이트(ClC(O)O~) 또는 BTC 유도체를 중합체-FMOC-치료제 접합체 형성에 시약으로 사용하여 중합체-치환된 풀벤의 생성을 최소화하고, 중합체-FMOC 치료제 접합체의 수율을 개선하는 방법.
이들 및 다른 양태 및 구현예는 하기 섹션에서 더 상세히 설명된다.
방법
상기 기재된 바와 같이, 특히 반응성 PEG-FMOC 시약의 제조를 허용하는 공정 개선이 본원에서 제공된다. 이러한 발견은 적어도 부분적으로는 그러한 시약의 파괴로 이어질 수 있는 반응 경로의 근본 원인을 먼저 식별함으로써 이루어졌다. 중합체 시약의 가수분해는 일반적으로 활성 에스테르 또는 활성 카보네이트 시약의 파괴 경로이지만, 이 경로는 PEG-FMOC 시약의 제조 및 회수 방법에 대한 이전 설명에서 이미 해결되었다(즉, 최소화됨)(참고: 예를 들어, Bentley, M., et al, 미국 특허 번호 8,252,275). 본원에 기재된 방법에서는, 수용성 중합체-FMOC 활성 카보네이트 생성물에서 1차 불순물로서 형성될 수 있는 수용성 중합체성 풀벤 부산물의 형성을 유도하는 제거 공정에 주목한다. 풀벤은 상기 예시적인 반응식 III에 나타낸 바와 같은 시약으로부터 형성된다. 중합체성 풀벤 부산물은 불활성 불순물이 아니라 반응성이기 때문에 시약에서 바람직하지 않은 불순물이므로 본원에 제공된 방법의 목적 중 하나는 풀벤을 제거하거나 풀벤의 형성을 최소화하는 것이다. 이를 위해 풀벤 불순물을 형성할 수 있는 몇 가지 공정 반응성 물질이 식별되었으며, (i) 해당 물질을 없애거나 제거하거나 (ii) 바람직하지 않은 반응성 물질을 중화하는 데 효과적인 물질을 추가하여 촉매 작용을 하지 않거나 중합체성 풀벤이 형성되지 않도록 할 수 있는 수정된 반응 공정이 차례로 개발되었다. 일반화된 반응식은 하기 반응식 Va로 표시된다.
[반응식 Va]
Figure pct00017
여기서, 상기 제공된 각각의 구조식에서, POLYa는 제1 수용성, 비-펩티드성 중합체이고; POLYb는 제2 수용성 비-펩티드성 중합체이고; Re1은 존재하는 경우, 제1 전자-변경 기이고; Re2는, 존재하는 경우, 제2 전자-변경 기이고; L1은 제1 연결 모이어티이고; L2는 제2 연결 모이어티이고, 여기서 POLYa, POLYb, Re1, Re2, L1, 및 L2 각각의 특징은 하기에 더 자세히 제공된다.
구체적으로, 중합체성 시약 또는 이를 유도하는 반응성 중간체로부터 풀벤 종의 형성을 가장 자주 유발하는 바람직하지 않은 물질은 반응 공정에서 일반적으로 존재하는 염기성 물질이다. 이러한 물질은 염기로 작용하는 경향이 있는 원자를 지닌 임의의 화학 종일 수 있다. 예를 들어, 물은 산 또는 염기로 작용할 수 있으며, 어느 한쪽으로 작용하는 경향은 일반적으로 매질의 pH에 따라 달라진다. 원하는 활성 카보네이트 중합체 FMOC 시약을 제조하는 방법에서 염기로 작용할 수 있는 가장 일반적으로 정의할 수 있는 물질은 피리딘 또는 유사한 유형의 염기성 물질이다. 이 화학 종은 최종 활성 카보네이트 시약의 형성을 촉진하는 역할을 한다. 따라서 이러한 화학 종을 포함하거나 유사한 종을 포함하는 것은 전형적으로 유리한 생성물 수율을 제공하는 데 이용된다. 반응식 IV에 나타낸 반응을 방지하거나 최소화하기 위해, 본원에 설명된 접근법 중 하나는 생성물 단리 동안 피리딘(또는 유사한 종)을 제거(또는 실질적으로 제거)하거나, 이러한 염기 또는 유사한 염기를 중화하여 염기로서의 반응성을 최소화하는 것이다. 따라서, 하나 이상의 양태 또는 구현예에서, 활성 카보네이트 에스테르와 같은 수용성 중합체성 FMOC 시약을 제조하기 위한 개선된 방법은 공정에 첨가된 염기성 종을 제거하기 위한 하나 이상의 단계를 포함한다.
또한, 활성 카보네이트 에스테르 또는 이의 전구체와 같은 수용성 중합체성 FMOC 시약을 제조하는 하나 이상의 추가 양태 또는 구현예에서, 반응 단계 후에 산성 종을 반응 혼합물에 첨가하여 생성물 형성을 촉진하기 위해 반응 공정 동안 첨가된 피리딘 또는 임의의 기타 염기성 종을 중화한다. 하나 이상의 구현예에서, 산은 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 제이인산나트륨(sodium dibasic phosphoric acid), 인산수소칼륨, 황산, m-니트로벤조산, 트리클로로아세트산, 인산 또는 반응성 카보네이트 생성물에 바람직하지 않은 영향을 주지 않는 임의의 기타 무기 또는 유기 산성 종으로부터 선택되지만, 이에 제한되지 않는다. 하나 이상의 특정 구현예에서, 반응 혼합물에 첨가되는 산은 아세트산, 시트르산 및 인산으로부터 선택된다.
예를 들어, 반응성 중합체성 FMOC 활성 카보네이트 시약의 제조 방법에서 수용성 9-하이드록실메틸 플루오렌 중합체(예를 들어, 구조식 I, 구조식 I-a, 구조식 I-b, 구조식 I-c, 구조식 I-d, 구조식 I-e, 구조식 I-f, 구조식 I-g, 구조식 I-h 중 어느 하나)는 염기의 존재하에 수용성 플루오렌 중합체의 활성 카보네이트를 형성하는 데 유용한 시약과 반응한 다음 침전에 의해 수용성 중합체 9-메틸 플루오렌 활성 카보네이트를 회수한다. 활성 카보네이트 또는 활성-카보네이트 전구체를 형성하는 데 적합한 반응물은, 예를 들어, 디벤조트리아졸릴 카보네이트, N-하이드록시 석신이미드, 클로로포르메이트, 예컨대 4-니트로벤질 클로로포르메이트 또는 4-니트로페닐 클로로포르메이트, 및 1-하이드록시벤조트리아졸을 포함한다.
대표적인 수용성 9-하이드록실메틸 플루오렌 중합체 출발 물질은 하기에서 보여준다:
[화학식 I]
Figure pct00018
(여기서 POLYa는 제1 수용성, 비-펩티드성 중합체이고; POLYb는 제2 수용성 비-펩티드성 중합체이고; Re1은, 존재하는 경우, 제1 전자-변경 기이고; Re2는, 존재하는 경우, 제2 전자-변경 기이고; L1은 제1 연결 모이어티이고; L2는 제2 연결 모이어티임);
[화학식 I-a]
Figure pct00019
(여기서 Re1 및 Re2, L1 및 L2는 상기(및 본원에 더 상세히) 기재된 바와 같고, 각각의 POLYa 및 POLYb는, 이 경우에, mPEG이고, 여기서 n은 독립적으로 약 3 내지 약 2273의 범위임);
[화학식 I-b]
Figure pct00020
(여기서 L1 및 L2는 상기(및 본원에 더 상세히) 기재된 바와 같고, 각각의 POLYa 및 POLYb는, 이 경우에, mPEG이고, 여기서 n은 독립적으로 약 3 내지 약 2273의 범위임);
[화학식 I-c]
Figure pct00021
(여기서 Re1, L1 및 L2는 상기(및 본원에 더 상세히) 기재된 바와 같고, 각각의 POLYa 및 POLYb는, 이 경우에, mPEG이고, 여기서 n은 독립적으로 약 3 내지 약 2273의 범위임);
[화학식 I-d]
Figure pct00022
(여기서 각각의 POLYa 및 POLYb는, 이 경우에, mPEG이고, 여기서 n은 독립적으로 약 3 내지 약 2273의 범위임);
[화학식 I-e]
Figure pct00023
(POLYa 및 POLYb는, 이 경우에, mPEG이고, 여기서 각각의 n은 독립적으로 약 3 내지 약 2273의 범위임);
[화학식 I-f]
Figure pct00024
(여기서 POLYa 및 POLYb는, 이 경우에, mPEG이고, 각각의 n은 독립적으로 약 3 내지 약 2273의 범위임);
[화학식 I-g]
Figure pct00025
(여기서 POLYa 및 POLYb는, 이 경우에, mPEG이고, 각각의 n은 독립적으로 약 3 내지 약 2273의 범위임), 및
[화학식 I-h]
Figure pct00026
(여기서 POLYa 및 POLYb는, 이 경우에, mPEG이고, 각각의 n은 독립적으로 약 3 내지 약 2273의 범위임).
일반적으로, 반응은 무수 조건하에 무수 비양성자성 용매에서 수행된다. 예시적인 비양성자성 용매는, 예를 들어, 디클로로메탄 또는 트리클로로에틸렌과 같은 할로겐화된 비양성자성 용매, 또는 벤젠, 클로로벤젠, 니트로벤젠, 자일렌, 사이클로헥산, 테트랄린 및 톨루엔과 같은 비극성 용매를 포함한다. 일부 구현예에서, 두 용매의 혼합물이 단독보다 우수한 것으로 입증될 수 있으며, 따라서 바람직할 수 있다. 일부 구현예에서, 용매는 중합체성 출발 물질을 용해시키는 데 효과적인 비양성자성 극성 용매이다. 사용될 수 있는 다른 비양성자성 용매에는, 예를 들어, 디메틸포름아미드, 아세톤, 아세토니트릴, 디옥산, 테트라하이드로푸란(THF), 디메틸설폭사이드, HMPA(헥사메틸포스포르아미드), DMA(디메틸아세트아미드), 및 NMP(N-메틸피롤리디논)가 포함된다. 다시, 일부 구현예에서, 둘 이상의 용매의 혼합물이 바람직할 수 있다. 비양성자성 용매에는 산성 수소가 부족하며, 즉, 양성자 주개가 아니다. 그러나 일부 비양성자성 용매는 약간 염기성인 경향이 있으므로 좋은 선택이 아닐 수 있다. 화학 분야의 숙련자는 본원에 기재된 반응에 사용하기에 적합한 추가 비양성자성 용매를 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 일반적으로 적절한 용매의 선택은 임의의 반응 구성 요소 또는 반응 생성물과 반응하지 않고 반응의 모든 구성 요소를 용해시키는 용매의 능력에 따라 달라진다. 대안적으로, 본원에 기재된 반응에서 수분에 민감한 반응물과 생성물을 보호하기 위해 수분을 최소화해야 하기 때문에, 무수 조건하에 사용되는 용매의 능력이 중요하다. 또한, 존재할 수 있는 수분과 함께 공동 증류하기 위해 용매가 사용될 수 있다. 본원에 제공된 지침을 사용하여 일상적인 실험을 통해 결정될 수 있는 것처럼 일부 용매가 다른 용매보다 습기 제거에 더 우수할 수 있다. 하나 이상의 구현예에서, 회수 단계 동안, 침전 용매는 반응 혼합물에 존재하는 과량의 염기를 부분적으로 또는 완전히 중화하는 데 효과적인 양의 산(예컨대 상기 기재된 바와 같음)을 포함한다.
숙련되고 교육 수준이 높은 화학자가 반응을 수행하는 실험실에 적합한 일부 공정이 생산 시설(숙련되었지만 교육 수준이 조금 더 낮은 작업자가 반응을 수행할 수 있음)로 이동함에 따라, 기술자의 안전이 주요 관심사가 된다. 따라서, 이러한 우려를 해결하기 위해, 하나 이상의 추가 양태 또는 구현예에서, 포스겐 또는 이의 전구체(예를 들어, 트리포스겐)와 같은 취급하기에 바람직하지 않거나 위험한 특정 시약을 궁극적으로 반응성 N-하이드록시석신이미드(NHS) 시약으로 이어지는 취급하기에 더 안전한 시약으로 대체하는 합성 방법이 본원에서 제공된다. 즉, 하나 이상의 양태 또는 구현예에서, 활성 카보네이트와 같은 수용성 중합체성 FMOC 시약 또는 활성 카보네이트 에스테르와 같은 활성 에스테르를 형성하는 데 효과적인 중간체를 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 이는 상기 반응식 Va 또는 반응식 Vb에서 일반적으로 나타낸 바와 같은 포스겐 또는 이의 전구체 중 하나의 사용 없이 수행된다. 추가로, 일부 구현예에서, 특정 상황에서 폭발성인 디-BTC는 NHS 카보네이트에 대한 직접적인 경로가 사용됨에 따라 제거된다. 따라서, 일부 추가 구현예에서, 원하는 활성 카보네이트를 제조하기 위해 포스겐 유도체도 디-BTC도 사용되지 않는다.
수용성 중합체 FMOC 활성 카보네이트를 제조하는 이러한 방법 중 하나는 반응물로서 디벤조트리아졸릴 카보네이트(디-BTC)를 포함한다. 디-BTC는 건조 분말로 취급될 때 폭발 위험이 있지만, 특정 할로겐화 용매에서 현탁액으로 취급하기에 안전한 것으로 간주된다. 이러한 현탁액은 상업적으로 입수 가능하며; 또한, 디-BTC는 포스겐처럼 독성 가스를 방출할 가능성이 없다. 결과적으로, 하나 이상의 추가 양태 또는 구현예에서, 중간 수용성 중합체성 하이드록시메틸 플루오렌 유도체(참고: 예를 들어, 구조식 I, 또는 구조식 I-a, 구조식 I-b, 구조식 I-c, 구조식 I-d, 구조식 I-e, 구조식 I-f, 구조식 I-g, 구조식 I-h 중 어느 하나)를 상응하는 중합체성 플루오렌 BTC 활성 카보네이트로 전환시키기 위해 디-BTC와 같은 사용하기에 보다 안전한 시약을 사용하는 방법이 본원에 제공된다(참고: 예를 들어, 반응식 Va 및 반응식 Vb). 예시적인 BTC 카보네이트는 하기에서 제공된다.
[화학식 II]
Figure pct00027
(여기서 POLYa, POLYb, Re1, Re2, L1 및 L2는 상기(및 본원에 더 상세히) 기재된 바와 같음);
[화학식 II-a]
Figure pct00028
(여기서 Re1, Re2, L1 및 L2는 상기(및 본원에 더 상세히) 기재된 바와 같고, POLYa 및 POLYb는, 이 경우에, mPEG이고, 여기서 각각의 n은 독립적으로 약 3 내지 약 2273의 범위임);
[화학식 II-b]
Figure pct00029
(여기서 L1 및 L2는 상기(및 본원에 더 상세히) 기재된 바와 같고, POLYa 및 POLYb는, 이 경우에, mPEG이고, 여기서 각각의 n은 독립적으로 약 3 내지 약 2273의 범위임);
[화학식 II-c]
Figure pct00030
(여기서 L1 및 L2는 상기(및 본원에 더 상세히) 기재된 바와 같고, POLYa 및 POLYb는, 이 경우에, mPEG이고, 여기서 각각의 n은 독립적으로 약 3 내지 약 2273의 범위임);
[화학식 II-d]
Figure pct00031
(여기서 POLYa 및 POLYb는, 이 경우에, mPEG이고, 각각의 n은 독립적으로 약 3 내지 약 2273의 범위임);
[화학식 II-e]
Figure pct00032
(여기서 POLYa 및 POLYb는, 이 경우에, mPEG이고, 여기서 각각의 n은 독립적으로 약 3 내지 약 2273의 범위임);
[화학식 II-f]
Figure pct00033
(여기서 POLYa 및 POLYb는, 이 경우에, mPEG이고, 각각의 n은 독립적으로 약 3 내지 약 2273의 범위임);
[화학식 II-g]
Figure pct00034
(여기서 POLYa 및 POLYb는, 이 경우에, mPEG이고, 각각의 n은 독립적으로 약 3 내지 약 2273의 범위임); 및
[화학식 II-h]
Figure pct00035
(여기서 POLYa 및 POLYb는, 이 경우에, mPEG이고, 각각의 n은 독립적으로 약 3 내지 약 2273의 범위임).
이 방법에서, 구조식 I과 같은 구조를 갖는 수용성 9-하이드록시메틸 플루오렌 중합체(또는, 예를 들어, 구조식 I-a, 구조식 I-b, 구조식 I-c, 구조식 I-d, 구조식 I-e, 구조식 I-f, 구조식 I-g, 구조식 I-h 중 어느 하나)는 무수 조건으로 염기의 존재하에 무수 비양성자성 용매에서 디벤조트리아졸릴 카보네이트와 반응하여 구조식 II의 수용성 9-메틸 벤조트리아졸릴 카보네이트 플루오렌 중합체, 또는 하나 이상의 구현예에서, 예를 들어, 구조식 II-a, 구조식 II-b, 구조식 II-c, 구조식 II-d, 구조식 II-e, 구조식 II-f, 구조식 II-g, 구조식 II-h 중 어느 하나를 포함하는 반응 혼합물을 제공한 다음, 수용성 9-메틸 벤조트리아졸릴 카보네이트 플루오렌 중합체의 침전을 촉진하는 데 효과적인 무수 용매로 침전시킴으로써 수용성 9-메틸 벤조트리아졸릴 카보네이트 플루오렌 중합체를 회수한다.
상기 기재된 바와 같이, 반응을 수행하기 위한 예시적인 무수 비양성자성 용매는, 예를 들어, 디클로로메탄 또는 트리클로로에틸렌과 같은 무수 할로겐화 비양성자성 용매, 또는 벤젠, 클로로벤젠, 니트로벤젠, 자일렌, 테트랄린 및 톨루엔과 같은 비극성 용매를 포함한다. 사용될 수 있는 다른 무수 비양성자성 용매는, 예를 들어, 디메틸포름아미드, 아세톤, 아세토니트릴, 디옥산, 테트라하이드로푸란(THF), 디메틸설폭사이드, HMPA(헥사메틸포스포르아미드), DMA(디메틸아세트아미드) 및 NMP(N-메틸피롤리디논)를 포함한다. 특정 반응에 대해 허용되는 용매 또는 용매 혼합물을 선택하는 것과 관련하여 본 출원의 다른 곳에서 찾은 추가 코멘트도 여기에 적용된다. 당업자는 본원에 기재된 반응에 사용하기 위한 다른 적합한 비양성자성 용매를 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 일부 특정 구현예에서, 반응 용매는 디클로로메탄 또는 트리클로로에틸렌과 같은 무수 염소화 용매이다. 또 다른 일부 구현예에서, 반응 용매는 디메틸포름아미드, 아세톤, 아세토니트릴 및 테트라하이드로푸란으로부터 선택된 무수 용매이다. 일부 관련 구현예에서, 반응 전에, 수용성 9-하이드록시메틸 플루오렌 중합체를 비양성자성 유기 용매에 용해시켜 용액을 형성한 다음 용액을 공비 증류하여 수분 함량이 500 ppm 미만인 용액 및/또는 잔류물을 제공한다. 무수 용매 및/또는 무수 중합체성 반응물, 중간체 또는 시약을 제조하기 위한 및/또는 무수 반응 조건을 제공하기 위한 추가 접근법이 본원의 다른 곳에서 설명된다.
반응은 BTC 카보네이트 에스테르를 형성하기에 충분한 양의 디-BTC를 포함한다. 일반적으로 디-BTC의 충분한 양은 약 30 당량 미만이다. 예를 들어, 본 방법의 일부 구현예에서, 수용성 9-하이드록시메틸 플루오렌 중합체는 약 30 당량 미만의 디-BTC와 반응한다. 예를 들어, 수용성 9-하이드록시메틸 플루오렌 중합체는 약 1 당량 내지 약 30 당량의 디-BTC(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 1, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 29.9 당량, 임의의 두 선행 값 사이의 모든 범위 포함)와 반응할 수 있다. 예를 들어, 양은 약 1 당량 내지 약 25 당량의 디-BTC, 또는 약 1 당량 내지 20 당량의 디-BTC, 또는 약 1 당량 내지 15 당량의 디-BTC, 또는 약 1 당량 내지 10 당량의 디-BTC일 수 있다. 수용성 9-하이드록시메틸 플루오렌 중합체에 대한 디-BTC 시약의 추가의 적절한 양은 약 2 당량 내지 약 20 당량, 약 5 당량 내지 약 15 당량, 또는 약 10 당량 내지 20 당량이다.
일반적으로, 반응에 사용된 염기는 비-친핵성 아민이거나 약한 친핵성 아민이다. 예를 들어, 사용될 수 있는 예시적인 염기에는 피리딘, 4-디메틸아미노피리딘, N,N-디이소프로필에틸아민, 2,6-디-3급-부틸피리딘, N-메틸이미다졸, N-메틸모르폴린, 2,6-루티딘, 2,4,6-콜리딘, N,N,2,6-테트라메틸피리딘-4-아민 등이 포함된다. 추가로, 전술한 염기 중 임의의 것의 불용성-중합체-결합된 형태도 사용될 수 있다. 예를 들어, 중합체 결합된 4-디메틸아미노피리딘은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)에서 입수 가능하며(약 3 mmol/g 로딩, 2% 디비닐벤젠으로 가교된 매트릭스); 다수의 추가 중합체-지지된 염기와 함께 중합체 결합된 2,6-디-3급-부틸피리딘도 시그마-알드리치에서 입수 가능하다(약 1.8 mmol/g 로딩, 디비닐 벤젠으로 1% 가교됨). 아민은 또한, 예를 들어, N,N,N',N'-테트라메틸-1,6-헥사메틸디아민, N,N', N', N",N"-펜타메틸디에틸렌트리아민, 및 헥사메틸렌테트라민과 같은 폴리아민, 또는 전술한 것들 중 임의의 것의 불용성 중합체-결합된 형태일 수 있다. 본 방법의 하나 이상의 구현예에서, 염기의 양은 약 1 당량 내지 약 30 당량, 또는 약 1 당량 내지 약 10 당량의 범위이다. 보다 구체적으로, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 1, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 당량의 염기로 반응을 수행할 수 있으며, 여기서 전술한 것은 임의의 두 선행 값 사이의 모든 범위를 포함한다. 임의의 특정 공정에 대한 최적의 염기 양은 실험에 의해 최적으로 결정된다. 가장 높은 반응 수율을 제공하는 데 필요한 염기의 최소량이 바람직하다.
반응은 기계적 교반과 함께 또는 기계적 교반 없이 수행될 수 있다. 반드시 그런 것은 아니지만, 전형적으로, 반응은 기계적 교반과 함께 수행된다. 기계적 교반은 특히 양호한 혼합을 가능하게 하기 위해 대규모 반응에 권장된다. 일반적으로, 수용성 9-하이드록시메틸 플루오렌 중합체는 약 -20℃ 내지 약 35℃ 범위의 온도에서 디벤조트리아졸릴 카보네이트와 반응한다. 추가의 예시적인 온도 범위는 약 -10℃ 내지 약 25℃, 또는 약 -5℃ 내지 약 10℃를 포함한다.
이제 수용성 9-메틸 벤조트리아졸릴 카보네이트 플루오렌 중합체의 회수로 돌아가면, 일부 구현예에서, 수용성 9-하이드록시메틸 플루오렌 중합체 및 상응하는 수용성 9-메틸 벤조트리아졸릴 카보네이트 플루오렌 중합체 생성물은 둘 다 비양성자성 유기 용매(들)에 용해된다. 따라서, 일부 구현예에서, 생성된 반응 혼합물은 고형물을 포함하고, 생성물의 회수는 먼저 반응 혼합물에 포함된 고형물을 제거한 다음 벤조트리아졸릴 카보네이트 생성물을 회수하는 것을 포함한다. 예를 들어, 반응 혼합물에 포함된 고형물은 최선의 사례를 사용하여 임의의 적절한 방법으로 제거될 수 있다. 예를 들어, 고형물은 여과에 의해 제거될 수 있다. 고형물 제거 후, 무수 침전 용매는 전형적으로 벤조트리아졸릴 카보네이트 생성물을 침전시키는 데 효과적인 양으로 남아있는 용액(또는 여과에 의해 고형물을 제거하는 경우 여액)에 첨가된다. 대안적으로, 고형물을 제거한 후 남은 벤조트리아졸릴 카보네이트 생성물을 무수 침전 용매에 첨가한다. 즉, 중합체 생성물인 벤조트리아졸릴 카보네이트에 무수 침전 용매를 첨가하여 침전시킬 수 있거나, 중합체 생성물을 무수 침전 용매에 첨가할 수 있다. 일부 경우에, 무수 침전 용매는 반응 단계로부터의 무수 비양성자성 유기 용매와 혼화될 수 있고, 또한 9-메틸 벤조트리아졸릴 카보네이트 플루오렌 생성물이 불용성이거나 실질적으로 불용성인 용매이다.
하나 이상의 구현예에서, BTC 에스테르 생성물의 침전을 촉진하기 위해 혼입되는 무수 용매는 산을 포함할 수 있다. 하나 이상의 구현예에서, 산은 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 제이인산나트륨, 인산수소칼륨, 황산, m-니트로벤조산, 클로로아세트산, 트리클로로아세트산, 인산 또는 반응성 카보네이트 생성물에 바람직하지 않은 영향을 주지 않는 임의의 다른 무기 또는 유기 산성 종으로부터 선택되지만, 이에 제한되지 않는다. 하나 이상의 특정 구현예에서, 반응 혼합물에 첨가되는 산은 아세트산, 시트르산 및 인산으로부터 선택된다. 일부 바람직한 구현예에서, 산은 인산이다. 산은 일반적으로 반응 혼합물에 함유된 염기를 부분적으로 또는 완전히 중화하기에 충분한 양으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 수용성 9-메틸 벤조트리아졸릴 카보네이트 플루오렌 중합체의 침전을 촉진하기 위해 무수 용매에 첨가되는 산의 양은 소량의 산을 포함한다. 예를 들어, 무수 용매는 약 0.0001 내지 약 0.5 몰%의 산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 무수 침전 용매는 약 0.0002 내지 약 0.4 몰%의 산, 또는 약 0.0010 내지 약 0.4 몰%의 산, 또는 약 0.0050 내지 약 0.3 몰%의 산을 포함할 수 있다. 특정 공정에 사용되는 정확한 산의 양은 중화될 염기의 예상 양을 기준으로 선택되며, 실험에 의해 최적으로 결정된다.
예시적인 침전 용매는 당업자에 의해 결정될 수 있으며, BTC 에스테르 생성물이 불용성이거나 실질적으로 불용성인 지방족 탄화수소 및 기타 비-반응성 혼화성 용매를 포함한다. 예시적인 침전 용매에는, 예를 들어, 디에틸 에테르, 이소프로필 알코올(IPA), 메틸-t-부틸 에테르(MTBE), 펜탄, 헥산 및 헵탄, 및 전술한 것들 중 임의의 둘 이상의 혼합물이 포함된다. 하나의 예시적인 혼합물은 이소프로필 알코올과 메틸-t-부틸 에테르의 혼합물이다. 이러한 바람직한 혼합물 중 하나는 이소프로필 알코올과 메틸-t-부틸 에테르의 1:1 혼합물이지만, 두 용매의 임의의 조합이 사용될 수 있다.
예를 들어, 여과에 의해 침전된 BTC 에스테르 생성물의 회수 후, 회수된 생성물은 무수 침전 용매, 즉 BTC 에스테르가 불용성이거나 실질적으로 불용성인 용매로 추가로 세척될 수 있으며, 여기서 용매는 소량의 산, 예를 들어, 약 0.0001 몰% 내지 약 0.5 몰%의 산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 무수 침전 용매("비-용매"로도 지칭됨)에 의한 회수된 FMOC-중합체성 생성물의 세척에는 산화 분해를 방지하기 위해 부틸화된 하이드록실 톨루엔(BHT)과 같은 항산화제가 추가로 포함될 수 있다. 이후 회수된 생성물은 원하는 경우 추가로 건조될 수 있고/있거나 수용성 중합체성 시약을 정제하기 위한 당 업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 추가로 정제될 수 있다. 이러한 특히 바람직한 방법 중 하나는 크로마토그래피, 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피이다.
실시예 1은 상기 기재된 반응 및 관련 처리 단계의 예시를 제공한다. 상응하는 G2-PEG2-FMOC-OH-20kD로부터 G2-PEG2-FMOC-BTC-20kD의 제조를 설명하는 실시예 1B를 참조한다. 본원에 기재된 바와 같이, G2-하이드록시메틸 플루오렌 중합체를 무수 디클로로메탄과 무수 톨루엔에 용해시킨 후, 용매를 증류에 의해 제거하여 수분을 제거한 다음 무수 아세토니트릴에 용해시켰다. G2-하이드록시메틸 플루오렌 중합체와 디-BTC의 반응 후, 무수 이소프로필 알코올(부틸화된 하이드록시톨루엔 함유)을 첨가하여 생성물을 침전시키고, 여과에 의해 회수하고, 비-용매(예를 들어, 이소프로필 알코올 및 디에틸 에테르)로 추가로 세척하고, 진공 하에 건조시켰다.
실시예 3, 파트 2, IB는 상응하는 C2-PEG2-FMOC-OH-20kD로부터 C2-PEG2-FMOC-BTC-20kD의 제조를 설명한다. 간단히 말하면, C2-PEG2-FMOC-OH-20kD를 무수 용매인 톨루엔에 용해시킨 후 감압 하에서 용매를 공비 증류하여 건조시켰다. 그 다음 이 공정을 반복하였다. 이후 건조된 C2-PEG2-FMOC-OH-20kD를 무수 아세토니트릴에 용해시키고, 용액을 냉각(예를 들어, 5℃까지)한 다음 디-BTC와 염기인 피리딘을 첨가했다. 그 다음 혼합물을 수 시간 동안 교반하였다. 반응 후, 혼합물을 산, 즉 인산(0.005%)을 함유하는 냉각된 이소프로필 알코올 용액에 첨가하였다. 이후 혼합물을 추가로 혼합하고, 인산(0.005%)을 함유하는 냉각된 MTBE를 혼합물에 첨가한 다음 침전을 촉진하기 위해 추가로 교반하였다. 그 다음 침전된 생성물을 여과에 의해 회수하고, 인산을 함유하는 IPA/MTBE의 혼합물로 여러 번 세척하였으며, 여기서 후속 세척은 약간 더 적은 인산(예를 들어, 0.005% 및 0.002%)을 함유하였다. 그 다음 생성물을 진공 하에서 15℃의 감소된 온도에서 건조시켰다.
BTC 유도체 자체가 단백질 또는 기타 적합한 활성제와 반응하여 중합체-활성제 접합체를 형성하는 데 사용될 수 있지만, 상응하는 바이오치료제 접합체는 전형적으로 보다 활성인 카보네이트, 예를 들어, N-하이드록시 석신이미딜(NHS) 카보네이트(때때로 활성 에스테르라고도 함)가 이용될 때 빠르게 형성된다. 따라서, 또 다른 하나 이상의 추가 양태 또는 구현예에서는, 구조식 II, 또는, 예를 들어, 구조식 II-a 내지 구조식 II-h 중 어느 하나의 것과 같은 중합체성 FMOC-BTC 유도체가, 예를 들어, 구조식 X와 같은 일반화된 구조를 갖는 원하는 NHS 활성 카보네이트 에스테르로 전환될 수 있는 중간체로서 사용되는 방법이 제공된다(예를 들어, 반응식 VI 참조). 특정 PEG2 FMOC-NHS 에스테르는 구조식 XI, 구조식 XII, 구조식 XIII 및 구조식 XIV로 표시된다. 바람직한 NHS 에스테르는 구조식 XIV로 표시된다. 중합체성 FMOC-BTC 에스테르를 하기 예시적인 반응식 Vb에 나타낸 상응하는 반응성 NHS 에스테르로 전환하기 위한 특정 반응 조건(예를 들어, 아세토니트릴 용매, 피리딘 염기, N-하이드록시석신이미드(NHS) 시약; 또는 예를 들어, 디클로로메탄 용매, 디메틸아미노피리딘, NHS)은 설명을 위한 것이며; 수용성 중합체 FMOC BTC 카보네이트(또는 다른 덜 반응성인 카보네이트)를 상응하는 NHS 카보네이트로 변환하기 위해 적합한 용매, 염기, 커플링 또는 기타 추가 시약, 및 반응 조건은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 예를 들어, 전환 반응은 약 1 당량 내지 약 30 당량의 NHS를 사용하여 수행될 수 있다. NHS 시약의 추가의 예시적인 양은, 예를 들어, 약 1 당량 내지 약 25 당량, 약 2 당량 내지 약 20 당량, 약 3 당량 내지 약 15 당량, 및 약 5 당량 내지 약 15 당량을 포함한다. 전형적으로, NHS 시약을 첨가하는 동안 반응 온도는 약 -20℃에서 약 25℃로 유지된다. 예시적인 반응 온도 범위는, 예를 들어, 약 -15℃ 내지 약 20℃, 약 -10℃ 내지 약 10℃, 약 -10℃ 내지 약 0℃, 약 -8℃ 내지 약 5℃, 및 약 -7℃ 내지 약 0℃로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 온도는 약 -10℃ 내지 약 10℃의 범위이다. 특정 반응에 대한 최적 온도는 실험을 통해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, NHS와의 반응에 의해 중합체성 FMOC-BTC 에스테르를 NHS 에스테르로 전환하는 것은 디메틸아미노피리딘의 존재하에 디클로로메탄에서 수행된다. 전환을 촉진하는 데 적절한 디메틸아미노피리딘의 양, 예를 들어, 약 4 당량 내지 약 0.10 당량, 약 3 당량 내지 약 0.15 당량, 약 2 당량 내지 약 0.20 당량, 약 1 당량 내지 약 0.40 당량, 및 약 0.75 당량 내지 약 0.50 당량의 범위이다. 일부 구현예에서, DMAP는 약 2 당량 내지 약 0.20 당량의 양으로 존재한다. 일부 다른 구현예에서, DMAP는 약 1 당량 내지 약 0.4 당량의 양으로 존재한다. 일부 다른 구현예에서, DMAP는 약 0.75 당량 내지 약 0.50 당량의 양으로 존재한다. 활성 카보네이트를 제조, 단리, 정제 또는 달리 취급하는 모든 공정은 바람직하게는 매우 건조한 환경에서, 바람직하게는 건조 질소 또는 아르곤 블랭킷(blanket) 하의 글러브 박스 또는 습도가 매우 낮은 실험실에서 수행된다. 또한, 모든 용매와 시약은 바람직하게는 고품질이어야 하며, 사용하기 전에 건조한 환경에서 유지되어야 한다. 반응 전에 수분을 제거하기 위해 건조 기술을 사용하는 경우, 수분 수준이 지정된 절차를 사용하여 얻을 수 있는 만큼 낮은 수준인지 확인하기 위해 전형적으로 수분 분석이 수행된다. 반복 실험에서는 수분 제거 공정이 검증된 경우 수분 분석을 생략할 수 있다. 중합체성 FMOC-NHS 에스테르의 제조 후, 중합체성 FMOC-NHS 에스테르를 회수하고 하기 기재된 바와 같이 추가로 처리할 수 있다.
[반응식 Vb]
Figure pct00036
[반응식 VI]
Figure pct00037
예를 들어, 예시적인 9-메틸 벤조트리아졸릴 카보네이트 플루오렌 PEG 중합체인, G2-PEG2-FMOC-BTC-20kD가 본원에 제공된 방법에 따라 상응하는 석신이미딜 에스테르로 전환되는 실시예 1C를 참조한다. 예에서 설명한 바와 같이, G2-PEG2-FMOC-BTC-20kD를 무수 용매인, 디클로로메탄에 용해시킨 다음 용액을 냉각(8℃까지)했다. 그 다음 N-하이드록시석신이미드를 냉각된 용액에 첨가하고, 반응 혼합물을 8℃에서 밤새 교반했다. 이후 생성된 NHS 에스테르 생성물을 이소프로필 알코올(시트르산과 항산화제인 BHT 함유)로 침전시켜 회수하고, 여과에 의해 단리한 다음, 추가로 비-용매로 세척(먼저 무수 이소프로필 알코올(BHT 함유)로 세척한 다음 시트르산 및 BHT를 함유하는 무수 메틸-3급 부틸 에테르로 세척)한 다음 진공 건조시켰다. 활성 카보네이트의 치환율을 결정하기 위해 글리신과의 반응을 수행한 다음 분석을 수행했다. 특히, 상기 기재된 바와 같이 제조되고 처리된 NHS 에스테르는 88.1 몰% 치환을 나타냈고; 11℃에서 136시간 동안 보관 후 생성물은 86.6 몰%(약 1% 내지 2% 손실)의 치환율을 나타냈다. 대조적으로, 유사한 NHS 에스테르 생성물이 제조되지만, 용매인 이소프로필 알코올에 산을 첨가하지 않고 침전되며, 또한 메틸 3급-부틸 에테르 세척액에 산이 존재하지 않는 것은 제조 후 86.2 몰%의 치환도(본 방법에 의한 것보다 약간 더 적음)를 갖는 것으로 밝혀졌다. 그러나 11℃에서 136시간 동안 저장한 후, 저장된 생성물은 75.3 몰%의 치환율(즉, 약 11%의 생성물 손실)을 갖는 것으로 확인되었다. 따라서, 본원에 기재된 공정 개선은, 예를 들어, 중간체 및 활성 카보네이트 시약 모두의 회수 및 처리 동안 산성 첨가제를 사용함으로써 저장시 더 큰 안정성을 갖는 활성 플루오렌 중합체 NHS 에스테르 시약을 제공하는 데 효과적이다.
이 공정은 또한 C2-PEG2-FMOC-BTC 20kD로부터 C2-PEG2-FMOC-NHS 20kD의 제조를 설명하는 실시예 3, 파트 2, IC에서 추가로 예시된다.
수용성 중합체 FMOC 활성 NHS 카보네이트(에스테르)는, 예를 들어, 단백질과 같은 활성제와 접합하여 중합체성 전구 약물을 형성하기 위한 시약으로 더 많이 요구될 수 있으므로, 하나 이상의 추가 양태 또는 구현예에서, 디석신이미딜 카보네이트(DSC)로 C2-PEG2-FMOC-OH(또는 본원에 기재된 임의의 다른 수용성 9-하이드록시메틸 플루오렌 중합체)를 직접 활성화시켜 상응하는 NHS 활성 카보네이트를 제공하는 방법이 본원에 또한 제공한다. 예시적인 중합체성 출발 물질은 구조식 I, 구조식 I-a, 구조식 I-b, 구조식 I-c, 구조식 I-d, 구조식 I-e, 구조식 I-f, 구조식 I-g, 및 구조식 I-h로 기재된 것들을 포함하며, 여기서 상응하는 NHS 활성 카보네이트는 9-메틸 하이드록실 양성자가 ~C(O)O-석신이미드로 대체된 각각의 전술한 구조에 상응한다. 유사하게 예시적인 생성물, 즉, NHS 카보네이트는 구조식 III, 구조식 X, 구조식 XI, 구조식 XII, 구조식 XIII, 구조식 XIV를 갖는 것들을 포함한다. 하기 일반화된 반응식 VIa 및 VIb를 참조하며, 여기서 반응식 VIa는 일반화된 수용성 9-하이드록시메틸 플루오렌 중합체에 대한 대상 반응을 나타내는 반면, 반응식 VIb는 C2 코어를 갖는 바람직한 수용성 PEG-2 9-하이드록시메틸 플루오렌 중합체에 대한 동일한 반응을 보여준다.
[반응식 VIa]
Figure pct00038
[반응식 VIb]
Figure pct00039
이 공정은 다양한 조건에서 생산될 수 있기 때문에 최적의 조건을 찾기 위해 수많은 조건이 탐색되었다. 하나 이상의 구현예에서, 중합체성 하이드록시메틸 플루오렌 유도체, 예를 들어, C2-PEG2-FMOC-OH(또는 구조식 I, 구조식 I-a, 구조식 I-b, 구조식 I-c, 구조식 I-d, 구조식 I-e, 구조식 I-f, 구조식 I-g, 및 구조식 I-h와 같은 구조를 갖는 것)는 적절한 무수 용매에 용해된다. 예시적인 용매에는 비양성자성 유기 용매, 예를 들어, 클로로포름, 디클로로메탄, 아세토니트릴, 디메틸포름아미드, 디옥산, 아세톤, 테트라하이드로푸란 등이 포함되며, 전술한 것들의 혼합물도 포함한다. 일부 구현예에서, 비양성자성 유기 용매는 극성 비양성자성 용매이다. 바람직하게는, 중합체성 하이드록시메틸 플루오렌 유도체는 비양성자성 유기 용매에 용해된다. 그 후 생성된 용액은, 예를 들어, 고 반응성 카보네이트 시약을 가수분해할 수 있는 미량의 모든 수분을 제거하기 위해 일반적으로 사용되는 방법을 사용하여 추가로 건조될 수 있다. 이러한 방법은 당 업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 질소 또는 아르곤과 같은 불활성 건조 분위기의 사용, 분자체, 황산나트륨, 황산마그네슘, 염화칼슘, 황산칼슘과 같은 건조제의 사용, 공비 증류를 포함한다. 건조 공정은 바람직하게는 표준 수분 적정 방법 또는 당 업계에 공지된 다른 방법에 의해 측정했을 때, 수분 함량이 일정하게 유지될 때까지 반복될 수 있다. (참고: Pangborn et al.; 및 Williams et al.; op. cit.) 이상적으로는, 수분 함량이 약 500 ppm 미만이 될 때까지 공정을 반복한다. 예를 들어, 수분 함량이 약 400 ppm 미만인 건조 중합체 용액이 얻어질 때까지, 또는 보다 바람직하게는 수분이 약 300 ppm 미만인 건조 중합체 용액이 얻어질 때까지 건조를 반복할 수 있다. 가장 바람직하게는 수분 함량이 약 200 ppm 미만이 될 때까지 건조를 반복한다. 일부 구현예에서, 용매의 건조는 하나 이상의 공비 증류를 포함한다. 일부 경우에는 일부 용매 또는 용매 혼합물이 다른 것보다 더 낮은 수분 함량을 제공한다는 것이 실험에 의해 결정될 수 있다. 건조하고 불활성인 환경(예를 들어, 질소, 아르곤, 헬륨)에서 작업하면, 디석신이미딜 카보네이트(DSC)가 첨가된다. DSC는 전형적으로 약 1 당량 내지 20 당량의 비율로 첨가된다. 예를 들어, DSC 당량수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20으로부터 선택될 수 있다. DSC 시약의 예시적인 양은, 예를 들어, 약 1 당량 내지 약 15 당량, 또는 약 2 당량 내지 약 10 당량, 또는 약 2 당량 내지 약 7 당량, 또는 약 2 당량 내지 약 5 당량을 포함한다. 예를 들어 최상의 생성물 수율 및 품질을 제공하기 위해 특정 반응에 대해 최소량의 DSC를 사용해야 하며, 이는 실험에 의해 결정될 수 있다. 전형적으로 DSC 시약을 첨가하는 동안, 반응 온도는 약 0℃ 내지 30℃로 유지된다. 예시적인 반응 온도 하위 범위는, 예를 들어, 약 0℃ 내지 25℃, 약 0℃ 내지 20℃, 약 0℃ 내지 15℃, 약 5℃ 내지 30℃, 약 5℃ 내지 25℃, 약 5℃ 내지 20℃, 및 약 10℃ 내지 30℃로부터 선택된다. 다시 말해, 특정 반응에 대한 최적 온도는 실험에 의해 결정될 수 있다. DSC 시약의 첨가가 완료되면, 온도는 염기를 첨가하기 전에 필요한 경우 대략 7.5 내지 18℃로 조정될 수 있다. 그 다음 염기가 중합체성 하이드록시메틸 플루오렌 유도체를 포함하는 용액에 첨가된다. 예를 들어, 약 1 당량 내지 약 30 당량의 염기가 첨가되거나, 바람직하게는 약 2 당량 내지 약 20 당량의 염기가 첨가되거나, 약 1 당량 내지 15 당량의 염기, 또는 보다 바람직하게는 약 3 당량 내지 10 당량의 염기가 첨가된다. 적합한 염기는 아민을 포함하며; 바람직하게는, 염기는 비-친핵성 아민이거나 약한 친핵성 아민이다. 적합한 염기에는, 예를 들어, 피리딘, 4-디메틸아미노피리딘, N,N-디이소프로필에틸아민, 2,6-디-3급-부틸피리딘, N-메틸이미다졸, N-에틸이소프로필아민, 2,6-루티딘, 2,4,6-콜리딘, N,N,2,6-테트라메틸피리딘-4-아민, 및 전술한 것들 중 임의의 것의 불용성-중합체-결합된 형태(상기 기재됨)가 포함된다. 추가로, 염기는 폴리아민, 예를 들어, N,N,N',N'-테트라메틸-1,6-헥사메틸디아민, N,N', N', N",N"-펜타메틸디에틸렌트리아민, 헥사메틸렌테트라민, 및 전술한 폴리아민의 불용성 중합체-결합된 형태일 수 있다.
하나 이상의 특정 구현예에서, 염기는 피리딘 또는 4-디메틸아미노피리딘이다. 당업자는 사용될 수 있는 염기의 유형에 관한 지식을 가질 것이다. 특정 중합체성 하이드록시메틸 플루오렌 활성 카보네이트의 최고 품질 생성물을 제조하는 데 사용하기에 적합한 염기는, 예를 들어, 본원에 제공된 지침을 사용하여 실험에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
이후 반응(즉, NHS 카보네이트로의 전환)을 바람직하게는 교반/혼합하면서 약 3℃ 내지 21℃의 온도 범위로 용액 온도를 유지하면서 수행한다. 반응은 중합체성 반응물의 구조, 반응 온도, 특정 용매, 교반 속도 및 기타 요인에 따라 수 분에서 수 시간까지 걸릴 수 있다. 반응이 완료되면(반응 진행은 임의의 적합한 수단에 의해, 예를 들어, 1H NMR과 같은 임의의 적합한 분석 기술에 의해 중합체성 하이드록시메틸 플루오렌 출발 물질의 소실을 모니터링하거나, 장치에 장착된 열전대를 사용하여 반응 발열을 모니터링함으로써 모니터링될 수 있음), 염기는 중화되거나 부분적으로 중화될 수 있다. 염기(예를 들어 피리딘 등)를 중화하거나 부분적으로 중화하기 위해, 용액은 전형적으로 산이 첨가되는 동안 약 3℃ 내지 15℃ 범위의 온도에서 유지된다. 예시적인 산에는, 예를 들어, 아세트산, 인산, 시트러스산, 제이인산나트륨, 인산수소칼륨, 황산, 클로로아세트산, 메타-니트로벤조산, 트리플루오로아세트산, 트리클로로아세트산, p-톨루엔설폰산, 등이 포함된다. 본 방법의 일부 구현예에서, 산은 아세트산, 시트르산 또는 인산이다.
산-염기 반응이 가라앉을 때까지 적절한 시간 후, 반응 혼합물은 적절한 필터(고형물을 제거하기 위해)를 통해 충분한 용적의 무수 침전 용매, 바람직하게는 저온 침전 용매로, 즉, 빙점보다 높지만 실온보다 낮은 온도(예를 들어, 20℃ 내지 25℃)에서 여과될 수 있다. 침전 용매는 일반적으로 NHS 카보네이트 생성물이 불용성이거나 실질적으로 불용성인(이전에 정의됨) 무수, 비-반응성 용매이다. 침전 용매는, 예를 들어, 디에틸 에테르, 이소프로필 알코올, 메틸 t-부틸 에테르와 같은 용매, 및 예를 들어, 헥산 및 헵탄과 같은 지방족 탄화수소, 및 전술한 것들의 혼합물을 포함한다. 차가운 무수 침전 용매를 도입하거나 이에 도입될 때, 원하는 NHS 에스테르 생성물은 전형적으로 용액에서 고형물로 침전된다. 침전 용매는 바람직하게는 소량이지만 적절한 양의 산 종(예를 들어, 클로로아세트산 또는 인산)을 함유하여 혼합물 내에 포함된 임의의 잔류 염기를 중화할 수 있다. 하나 이상의 구현예에서, 산은 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 제이인산나트륨, 인산수소칼륨, 황산, m-니트로벤조산, 클로로아세트산, 트리클로로아세트산, 인산, p-톨루엔설폰산 또는 반응성 NHS 카보네이트 생성물에 바람직하지 않은 영향을 주지 않는 임의의 다른 무기 또는 유기 산성 종으로부터 선택되지만, 이에 제한되지 않는다. 하나 이상의 특정 구현예에서, 산은 클로로아세트산 또는 인산으로부터 선택된다. 일부 바람직한 구현예에서, 산은 인산이다. 산은 일반적으로 혼합물에 함유된 염기를 부분적으로 또는 완전히 중화하기에 충분한 양으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 수용성 9-메틸-N-하이드록시석신이미딜 카보네이트 플루오렌 중합체의 침전을 촉진하기 위해 무수 용매에 첨가되는 산의 양은 소량의 산을 포함한다. 예를 들어, 무수 침전 용매는 약 0.0001 내지 약 0.5 몰%의 산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 무수 침전 용매는 약 0.0002 내지 약 0.4 몰%의 산, 또는 약 0.0010 내지 약 0.4 몰%의 산, 또는 약 0.0050 내지 약 0.3 몰%의 산을 포함할 수 있다. 특정 용매에서 비정상적인 반응물 세트에 대해 몰 백분율로 훨씬 더 많은 양의 산이 필요할 수 있다. 특정 산의 최적량은 바람직하게는 실험에 의해 결정된다. 주어진 적용에 대해 최소량의 산이 바람직하다.
이후 혼합물은 무수의 차가운 비-용매 물질(즉, 생성물이 불용성이거나 실질적으로 불용성인 용매), 예컨대 이전에 기재된 바와 같은 소량의 산성 종, 바람직하게는 공정에서 앞서 사용된 것과 동일한 산, 예를 들어, 클로로아세트산 또는 인산 등을 함유하는 에틸 에테르 또는 메틸 t-부틸 에테르와 함께 교반하여 추가로 처리될 수 있다. 침전된 생성물은 전형적으로, 예를 들어, 여과에 의해 단리된다. 앞서 언급된 바와 같이, 모든 공정 단계는 습기에 대한 노출을 최소화하는 환경에서 수행되어야 한다. 이후 여과된 생성물은 바람직하게는 더 많은 무수 비-용매, 예를 들어, 디에틸 에테르 또는 메틸-t-부틸 에테르와 같은 에테르 또는 이전에 기재된 다른 적합한 침전 용매로 추가로 세척된다. 세척 용매는 전형적으로 이전에 기재된 바와 같이 소량의 산성 종을 함유할 것이다. 예를 들어, 무수 침전 용매에 의한 회수된 FMOC-중합체성 물질의 세척은, 사용된 중합체가 PEG인 경우, 중합체 사슬의 산화적 분해를 방지하기 위해 항산화제, 예컨대 부틸화된 하이드록실 톨루엔(BHT)을 추가로 포함할 수 있다. 단리된 생성물은, 예를 들어, 감압하에 건조(즉, 진공 건조)시킴으로써 추가로 건조될 수 있다. 또한, 단리된 NHS 카보네이트 생성물은 수용성 중합체성 시약을 정제하기 위한 당 업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 추가로 정제될 수 있다. 이러한 정제 방법 중 하나는 재침전이다. 또 다른 이러한 바람직한 방법은 크로마토그래피, 예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피이다.
본원에 제공된 방법 및 공정의 추가 예시로서, 실시예 3, 파트 2, II는 C2-PEG2-FMOC-OH, 20kD로부터 예시적인 활성 카보네이트, C2-PEG2-FMOC-NHS-20kD의 직접 합성을 설명한다.
본원에 제공된 방법을 사용하는 예시적인 브롬화된 FMOC 중합체, Br-G2-PEG2-FMOC-NHS-20k의 성공적인 제조는 실시예 2에 기재되어 있다. 따라서, 하나 이상의 양태에서, 다음의 예시적인 구조로 나타낸 바와 같이, 플루오렌 코어 상에 1개 또는 2개의 브로모 기가 치환된 FMOC 출발 물질, 중간체 및 활성 카보네이트가 본원에 제공된다:
[화학식 IV-a]
Figure pct00040
,
[화학식 IV-b]
Figure pct00041
,
[화학식 IV-c]
Figure pct00042
.
브롬화된 FMOC 중합체의 추가 예는 구조식 XI, 구조식 XII, 구조식 XIII, 구조식 XIV, 구조식 I-d, 구조식 I-e, 구조식 I-f, 구조식 I-g, 구조식 I-h, 구조식 II-d, 구조식 II-e, 구조식 II-f, 구조식 II-g, 및 구조식 II-h 각각의 브롬화된 버전을 포함한다.
생성된 중합체성 FMOC-NHS 카보네이트 시약은 가수분해(반응식 VII, 경로 A)를 거쳐 원래의 하이드록시메틸 플루오렌 유도체를 형성하고, 상응하는 풀벤 유도체를 형성하기 위해(반응식 VII, 경로 B) 이러한 활성화된 기질의 아직 관찰되지 않았지만 잠재적인 열 제거 반응의 가능성(참고: Meng et al. J. Am. Chem . Soc ., 1997, 119, 4834-4840)이 있기 때문에, NHS 시약은 바람직하게는, 1주를 초과하여 저장하는 경우 저온, 예를 들어 -40℃ 이하, 보다 바람직하게는 -70℃ 이하에서 건조, 불활성 분위기하에 저장함으로써 추가로 보호된다. 또한, 보호되지 않은 샘플의 운송 조건은 특히 여름철에 시약이 용납할 수 없을 정도로 높은 온도를 경험할 수 있으므로 샘플은 드라이아이스 포장으로 운송하는 것이 이상적이다.
이제 대상 중합체성 FMOC 시약의 반응성 손실을 위한 대체 경로로 돌아가면(이전에 기재된 염기성 종을 포함하는 것 제외): 중합체성 PEG 불순물은 전형적으로 크로마토그래피 절차를 사용하여 제거된다. 예를 들어, 맥매너스(McManus), S., 등, 미국 특허 번호 8,604,159를 참조한다. 예를 들어, PEG 카복실산 중간체는 적절한 크로마토그래피 매질과 같은 수지를 사용하는 크로마토그래피에 의해 중성 폴리에틸렌 글리콜로부터 분리될 수 있다. 수용성 중합체-FMOC-NHS 시약의 형성에서 불순물로 형성된 풀벤의 경우, 풀벤이 우려할 만한 양으로 존재한다면, 별도의 정제 단계를 공정에 추가하여 풀벤 불순물을 제거할 수 있다. 따라서, 원하는 경우, 회수된 수용성 9-메틸 N-하이드록시석신이미딜 카보네이트 플루오렌 중합체를 무수 용매에 용해시키고, 생성된 용액을 티올 기를 함유하는 수지 컬럼에 통과시켜 반응성 여과 공정(참고: Tripp et al, Org . Lett ., (2000), 2, 195-198)을 통해 중합체성 풀벤을 제거할 수 있다. 부가된 티올 기를 포함하는 수지는 두자르딘 등(참고: Dujardin, et al., Reactive and Functional Polymers (2000), 43, 123-132)에 의해 불순물을 제거하는 데 사용되었다. 이러한 수지는 상업적으로 입수 가능하며, 예를 들어, 텐타겔(TENTAGEL)® S SH 표준 티올 수지(독일 튀빙겐(Tuebingen) 소재의 라프 폴리메레(Rapp Polymere) 또는 미국 캔터키주 루이빌 소재의 어드밴스드 켐테크(Advanced Chemtech)) 및 이소루테(ISOLUTE)® Si-티올(스웨덴 웁살라 소재)이 포함된다. 이 반응성 여과 공정은 본원에 기재된 반응성 중합체성 시약의 정제 방법으로 남아 있지만, 반응성이 더 높은 9-메틸 N-하이드록시석신이미딜 카보네이트 플루오렌 중합체는 석신이미드 모이어티의 티올 치환에 의해 티올-수지와 반응하여 플루오렌 중합체가 수지에 부착된 채로 남아 생성물 회수를 감소시킬 수 있다. 따라서, 종합적으로, 가능하다면, 본원에서 달리 설명된 반응, 회수 및 정제 공정을 주의 깊게 적용하여 상당한 양의 중합체성 풀벤-부산물 없이 대상 중합체 시약을 대신 제공하는 것이 보다 비용 효율적이다.
풀벤 형성 가능성과 관련하여, 예를 들어, G2 시리즈와 같이 플루오렌 고리의 9 위치에서 양성자의 산도를 감소시키는 링커(반응식 I에서 L)를 갖는 PEG2-FMOC 시약의 제조 동안, 전형적으로, 제조 공정 중에 특별한 주의가 필요하지 않다. G2 및 기타 더 안정적인 PEG FMOC 시약은 특히 분리 중에 불안정하지 않을 수 있지만, 공정 종료시 여전히 존재할 수 있는 모든 염기, 예를 들어, 피리딘 등을 중화하도록 주의를 기울이는 것이 바람직하다. 또한, 소량의 산을 함유하는 비-용매로 여과한 후 고체 생성물을 세척하면 저장시 발생할 수 있는 잠재적인 문제에 대한 이점을 제공할 수 있다.
반응성이 더 높은 중간체 및 시약, 예를 들어, C2 시약의 경우, 생성물 단리 및 저장 동안 시약의 활성 손실을 방지하기 위해 특별한 조치가 필요하다. 따라서 물이 반응성 NHS 카보네이트 및 BTC 중간체를 쉽게 가수분해할 수 있기 때문에, 예를 들어, 수분을 최소화하도록 본원에 기재된 공정을 수행할 수 있다. 염기성 물질(제거 개시제 또는 촉매)의 존재를 최소화하기 위한 특별한 예방 조치를 취하더라도, 작업 및 세척 단계 동안 염기성 종의 중화를 위해 트리플루오로아세트산 또는 인산 등과 같은 산을 포함하지 않으면 시약 활성 손실이 일반적으로 발생할 것이다. 피리딘, DMAP 및 심지어 물과 같은 공정에서 잔류하는 분자가 저장 동안 생성물 분해를 일으킬 수 있기 때문에 시약이 저온에서 고형물로 저장되더라도 생성물 저장 동안 손실이 발생할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같이, 생성물 단리 및 정제 동안 수분 및 염기성 종을 제거하거나 중화하기 위해 본원에 기재된 조치를 실행하는 것이 바람직하다. 또한, 생성물은 이상적으로 건조(예를 들어, 고진공 하) 및 병입(bottling)(예를 들어, 불활성 분위기하의 건조 상자) 동안 주의 깊게 취급되어 새로운 염기성 물질(하전되거나 하전되지 않음)이 포장된(예를 들어, 병입된) 최종 시약(생성물)에 포함되지 않도록 해야 한다. 마지막으로, 병입된 시약은 바람직하게는 저온에서, 예를 들어, -40℃ 이하, 바람직하게는 -70℃ 이하에서 사용할 때까지 보관될 것이다.
PEG2 풀벤을 생산하기 위한 제거 공정은 시약 활성을 감소시키는 중요한 경로이고, 상기 논의된 바와 같이 반응성 불순물을 제공하기 때문에, 더 나은 접합 수율로 전체 최종 결과 생성물을 제공할 대체 시약 및 방법이 본원에 제공되었다. FMOC NHS 카보네이트 시약은 PEG-약물 접합체를 형성하는 단백질 또는 폴리펩티드와의 반응에서 일반적으로 바람직하기 때문에 선호될 수 있다. 그러나 NHS 성분 이탈기가 클로라이드(각각의 클로로포르메이트 유래) 또는 1-하이드록시벤조트리아졸(각각의 BTC 카보네이트 유래)보다 더 나은 이탈기이므로, 유사한 상황에서 NHS 카보네이트는 (클로라이드 또는 1-하이드록시벤조트리아졸릴 이탈기와 비교했을 때) 더 많은 양의 풀벤을 형성할 수 있을 것으로 예상할 수 있는데, 그 이유는 그러한 경로가 비교하여 더 선호되기 때문이다.
따라서, 접합될 단백질이 반응성이 높은 친핵성 질소(아민 또는 기타 질소)를 갖는 경우, PEG2-FMOC-클로로포르메이트 또는 기타 반응성 카보네이트(예를 들어, BTC 카보네이트)와의 반응을 수행하여 PEG2-FMOC-NHS 시약과의 반응에 의해 형성된 것과 동일하거나 유사한 접합체를 형성할 수 있다. 생성된 접합체는 사용된 반응성 카보네이트 시약에 관계없이 동일한 방출 특성을 가질 것으로 예상되므로, 접합된 생성물의 수율이 NHS-카보네이트 시약과 동일하거나 이보다 더 좋다면, 비-NHS 에스테르 시약과의 반응에 의해 제공되는 전체 결과는 유리하게 여겨질 것이다. 이제, 예를 들어, 클로로카보네이트 또는 BTC 카보네이트 중합체성 시약이 더 적은 시약 활성 손실을 나타내는 경우(예를 들어, NHS 에스테르 시약에 비해 상응하는 풀벤 유도체로 더 느리게 전환되어 생산성이 떨어지기 때문에), 단백질과의 반응을 위해 남아있는 온전한 활성 카보네이트 시약의 양이 더 많을 것이다. 따라서 접합체의 수율은 이론적으로 더 높을 것이다. 즉, 반응성 중합체성 시약에서 이탈기의 선택은 제조, 저장 및 그 이후 과정 중 하나 이상 동안 시약의 손실에 잠재적으로 영향을 미칠 뿐만 아니라 제조된 시약의 몰당 형성되며, 궁극적으로 고객에게 전달될 수 있는 접합체의 수율에 잠재적으로 영향을 미치는 것으로 간주되는 요소이다.
상기 기재된 바와 같이, 활성제 접합체는 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 중합체성 시약과 반응시켜 제조될 수 있다. 일반적으로, 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 중합체성 시약이 접합되는 생물학적 활성제는 아민-함유 생물학적 활성제이다. 일부 구현예에서, 생물학적 활성제는 소분자(예를 들어, 약 3,500 달톤 미만의 분자량을 갖는 생물학적 활성제)이다. 다른 구현예에서, 생물학적 활성제는 약 3,500 달톤보다 큰 분자량을 갖는 폴리펩티드와 같은 거대분자이다. 약리학적 활성 폴리펩티드는 생물학적 활성제의 바람직한 유형을 나타낸다. 본 논의의 목적상, 용어 "폴리펩티드"는 올리고펩티드 및 단백질에 대해 포괄적일 것임을 이해해야 한다. 폴리펩티드와 관련하여, 활성 중합체성 시약이 커플링되는 아민은 폴리펩티드 내 아미노산(예컨대 라이신)의 N-말단 및/또는 아민-함유 측쇄일 수 있다. 본원에 기재된 것과 같은 반응성 중합체성 시약을 생물학적 활성제에 접합하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
본원에 기재된 방법에 따라 제조된 중합체성 시약은 바람직하게는 중합체성 풀벤 부산물을 함유하지 않거나 중합체성 풀벤 부산물을 실질적으로 함유하지 않을 것이다. 본원에 제공된 방법에 따라 제조된 예시적인 중합체성 시약은 15 몰% 미만의 중합체성 풀벤 불순물을 함유하거나, 바람직하게는 10 몰% 미만의 중합체성 풀벤 불순물을 함유한다. 보다 바람직하게는, 본원에 제공된 방법에 따라 제조된 중합체성 시약은 8 몰% 미만의 중합체성 풀벤 불순물 또는 7 몰% 미만의 중합체성 풀벤 불순물을 함유한다. 더욱더 바람직하게는, 본원에 제공된 방법에 따라 제조된 중합체성 시약은 5 몰% 미만의 중합체성 풀벤 불순물을 함유한다.
중합체성 활성 카보네이트를 형성하기 위한 수용성 9-하이드록시메틸 플루오렌 중합체 또는 활성 카보네이트를 형성하기 위한 중간체의 예시적인 구조뿐만 아니라 중합체성 중간체 및 활성 카보네이트 자체의 예시적인 구조가 본원에 제공된다. 수용성 중합체, 전자 변경 기 및 연결 모이어티에 대한 다음 설명은 9-하이드록시메틸 플루오렌 중합체뿐만 아니라 이로부터 간접적으로 또는 직접적으로 형성된 반응성 카보네이트, 및 본원에 개시된 방법으로부터 생성된 중합체성 시약을 사용하여 형성된 상응하는 접합체에도 적용할 수 있다.
본원에 제공된 구조와 관련하여, POLYa는 제1 수용성, 비-펩티드성 중합체이고; POLYb는 제2 수용성 비-펩티드성 중합체이고; Re1은, 존재하는 경우, 제1 전자-변경 기이고; Re2는, 존재하는 경우, 제2 전자-변경 기이고; L1은 제1 연결 모이어티이고; L2는 제2 연결 모이어티이다. 제1 및 제2 전자 변경 기인 Re1 및 Re2에 있어서, 0의 아래 첨자, 예를 들어, [Re1]0 또는 [Re2]0은 전자 변경 기가 부재함(또는 존재하지 않음)을 나타내고, 1의 아래 첨자, 예를 들어, [Re1]1 또는 [Re2]1은 전자 변경 기가 존재함을 나타낸다.
주어진 수용성 중합체와 관련하여, 각각의 수용성 중합체(예를 들어, POLYa, POLYb)는 중합체가 수용성이고 비-펩티드성인 한 어떠한 중합체도 포함할 수 있다. 바람직하게는 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜)이지만, 예를 들어, 다른 수용성 중합체, 예컨대 다른 폴리(알킬렌 글리콜), 예컨대 폴리(프로필렌 글리콜)("PPG"), 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜 등의 공중합체, 폴리(올레핀계 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(하이드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(하이드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(α-하이드록시 산), 폴리(비닐 알코올), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 예컨대 미국 특허 번호 5,629,384에 기재된 것일 수 있다. 수용성 중합체는 전술한 것들 중 임의의 것의 동종중합체, 공중합체, 삼원중합체, 비랜덤 블록 중합체, 및 랜덤 블록 중합체일 수 있다. 또한, 수용성 중합체는 선형일 수 있지만, 하기 더 상세히 설명되는 바와 같이 다른 형태(예를 들어, 분지형, 포크형 등)일 수도 있다. 전체 구조에서 각각의 수용성 중합체는 동일하거나 상이할 수 있다. 그러나 전체 구조에서 모든 수용성 중합체가 동일한 유형인 것이 바람직하다. 예를 들어, 주어진 구조 내의 모든 수용성 중합체는 각각 폴리(에틸렌 글리콜)인 것이 바람직하다. 또한, 주어진 폴리(에틸렌 글리콜)에 있어서, 각각의 폴리(에틸렌 글리콜)은 하이드록실, 알콕시, 치환된 알콕시, 알케녹시, 치환된 알케녹시, 알키녹시, 치환된 알키녹시, 아릴옥시 및 치환된 아릴옥시로 구성된 군으로부터 선택된 말단-캡핑 모이어티로 말단 캡핑될 수 있다. 바람직한 말단 캡핑 기는 메톡시이다.
임의의 개별 수용성 중합체의 중량 평균 분자량은 다양할 수 있지만, 임의의 주어진 수용성 중합체 반응물, 중간체 또는 활성 카보네이트(즉, 전체 중합체성 FMOC 구조)의 중량 평균 분자량은 전형적으로 약 100 달톤 내지 약 200,000 달톤, 또는 약 100 달톤 내지 약 150,000 달톤의 범위일 것이다. 그러나 예시적인 범위는 다음 범위의 중량-평균 분자량을 포함한다: 약 880 달톤 내지 약 5,000 달톤(예를 들어, 여기서 각각의 (n)은 약 10 내지 약 57의 범위임); 5,000 달톤 초과에서 약 100,000 달톤의 범위(예를 들어, 여기서 각각의 (n)은 약 58 내지 약 1136의 범위임); 약 6,000 달톤 내지 약 90,000 달톤의 범위(예를 들어, 여기서 각각의 (n)은 약 68 내지 약 1022의 범위임); 약 10,000 달톤 내지 약 85,000 달톤의 범위(예를 들어, 여기서 각각의 (n)은 약 113 내지 약 966의 범위임); 10,000 달톤 초과에서 약 85,000 달톤의 범위(예를 들어, 여기서 각각의 (n)은 약 114 내지 약 966의 범위임); 약 20,000 달톤 내지 약 85,000 달톤의 범위(예를 들어, 여기서 각각의 (n)은 약 227 내지 약 966의 범위임); 약 53,000 달톤 내지 약 85,000 달톤의 범위; 약 25,000 달톤 내지 약 120,000 달톤의 범위(예를 들어, 여기서 각각의 (n)은 약 284 내지 약 1364의 범위임); 약 29,000 달톤 내지 약 120,000 달톤의 범위(예를 들어, 여기서 각각의 (n)은 약 330 내지 약 1364의 범위임); 약 35,000 달톤 내지 약 120,000 달톤의 범위(예를 들어, 여기서 각각의 (n)은 약 398 내지 약 1364의 범위임); 약 880 달톤 내지 약 60,000 달톤의 범위(예를 들어, 여기서 각각의 (n)은 약 10 내지 약 682의 범위임); 약 440 달톤 내지 약 40,000 달톤의 범위(예를 들어, 여기서 각각의 (n)은 약 5 내지 약 454의 범위임); 약 440 달톤 내지 약 30,000 달톤의 범위(예를 들어, 여기서 각각의 (n)은 약 5 내지 약 340의 범위임); 약 10,000 달톤 내지 약 25,000 달톤의 범위(예를 들어, 여기서 각각의 (n)은 약 113 내지 약 284의 범위임), 또는 약 15,000 달톤 내지 약 25,000 달톤의 범위(예를 들어, 여기서 각각의 (n)은 약 170 내지 약 284의 범위임), 및 약 40,000 달톤 내지 약 120,000 달톤의 범위(예를 들어, 여기서 각각의 (n)은 약 454 내지 약 1364의 범위임). 임의의 주어진 수용성 중합체 반응물, 중간체, 활성 카보네이트 시약 등에 있어서, 이러한 범위 중 하나 이상의 분자량을 갖는 PEG가 바람직하다. 일부 바람직한 구현예에서, 중합체성 시약, 중간체 또는 반응성 카보네이트는 약 20,000 달톤의 전체 분자량을 갖는다(여기서 POLYa 및 POLYb 각각은 약 10,000 달톤의 분자량을 가짐(예를 들어, 여기서 각각의 (n)은 약 227임)). 일부 바람직한 구현예에서, 중합체성 출발 물질(반응물), 중간체 또는 활성 카보네이트는 C2 코어를 포함하며, 여기서 플루오레닐 코어로부터 연장되는 각각의 PEG(POLYa 및 POLYb)는 분자량이 약 10,000 달톤이다. 예를 들어, 예시적인 구조식 XIV(NHS 에스테르), 구조식 I-h(하이드록실 반응물) 및 구조식 II-h(BTC), 또는 구조식 XIV 또는 구조식 II-h에 상응하는 구조를 참조하며, 여기서 O-석신이미딜 또는 O-벤조트리아졸릴 기 이탈기는 당 업계에 잘 알려진 또 다른 적절한 이탈기로 대체된다.
POLYa 및 POLYb 각각에 대한 예시적인 중량-평균 분자량은 약 100 달톤, 약 120 달톤, 약 200 달톤, 약 250 달톤, 약 300 달톤, 약 400 달톤, 약 440 달톤, 약 500 달톤, 약 600 달톤, 약 700 달톤, 약 750 달톤, 약 800 달톤, 약 900 달톤, 약 1,000 달톤, 약 1,500 달톤, 약 2,000 달톤, 약 2,200 달톤, 약 2,500 달톤, 약 3,000 달톤, 약 4,000 달톤, 약 4,400 달톤, 약 4,500 달톤, 약 5,000 달톤, 약 5,500 달톤, 약 6,000 달톤, 약 7,000 달톤, 약 7,500 달톤, 약 8,000 달톤, 약 9,000 달톤, 약 10,000 달톤, 약 11,000 달톤, 약 12,000 달톤, 약 13,000 달톤, 약 14,000 달톤, 약 15,000 달톤, 약 16,000 달톤, 약 17,000 달톤, 약 18,000 달톤, 약 19,000 달톤, 약 20,000 달톤, 약 22,500 달톤, 약 25,000 달톤, 약 30,000 달톤, 약 35,000 달톤, 약 40,000 달톤, 약 45,000 달톤, 약 50,000 달톤, 약 55,000 달톤, 약 60,000 달톤, 약 65,000 달톤, 약 70,000 달톤, 및 약 75,000 달톤, 약 80,000 달톤, 약 85,000 달톤, 약 90,000 달톤, 약 95,000 달톤, 및 약 100,000 달톤을 포함한다. POLYa 및 POLYb 각각에 대한 예시적인 중량-평균 분자량 범위는, 예를 들어, 약 120 달톤 내지 약 100,000 달톤(예를 들어, 여기서 각각의 (n)은 약 3 내지 약 2273의 범위임), 또는 약 250 달톤 내지 약 60,000 달톤(예를 들어, 여기서 각각의 (n)은 약 4.5 내지 약 1363의 범위임)이다. 일부 구현예에서, POLYa 및 POLYb 각각에 대한 중량-평균 분자량 범위는, 예를 들어, 약 120 달톤 내지 약 6,000 달톤(예를 들어, 여기서 각각의 (n)은 약 3 내지 약 136의 범위임), 또는 약 6,000 달톤 내지 약 80,000 달톤(예를 들어, 여기서 각각의 (n)은 약 136 내지 약 1818의 범위임), 또는 약 5,000 내지 약 25,000 달톤(예를 들어, 여기서 각각의 (n)은 약 113 내지 약 568의 범위임), 또는 약 10,000 내지 약 25,000 달톤(예를 들어, 여기서 각각의 (n)은 약 227 내지 약 568의 범위임)이다.
상기 기재된 바와 같이, POLYa 및 POLYb 둘 다 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜이다. PEG가 중합체성 시약에서 수용성 중합체로 사용되는 경우, PEG는 전형적으로 많은 (OCH2CH2) 단량체[또는 PEG가 정의된 방식에 따라 (CH2CH2O) 단량체]를 포함한다. 설명 전체에서 사용된 바와 같이, 반복 단위의 수는 "(OCH2CH2)n"에서 아래 첨자 "n"으로 식별된다. 따라서, (n)의 값은 전형적으로 다음 범위 중 하나 이상에 속한다: 2 내지 약 3400, 약 4 내지 약 1500, 약 100 내지 약 2300, 약 100 내지 약 2270, 약 136 내지 약 2050, 약 225 내지 약 1930, 약 450 내지 약 1930, 약 1200 내지 약 1930, 약 568 내지 약 2727, 약 660 내지 약 2730, 약 795 내지 약 2730, 약 795 내지 약 2730, 약 909 내지 약 2730, 및 약 1,200 내지 약 1,900. 분자량이 알려진 임의의 주어진 중합체의 경우, 중합체의 총 중량-평균 분자량을 반복 단량체의 분자량으로 나누어 반복 단위의 수(즉, "n")를 결정할 수 있다. 예를 들어, 둘 다 약 10,000 달톤의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜인 POLYa 및 POLYb의 경우, (n)의 값은 약 227이다. 둘 다 약 20,000 달톤의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜인 POLYa 및 POLYb의 경우, (n)의 값은 약 454이며, 다른 경우도 마찬가지이다.
하나 이상의 구현예에서, 플루오렌 모이어티는 탄소 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8 중 어느 하나 이상에 위치한 하나 이상의 전자 변경 기("Re1", "Re2" 등)를 선택적으로 포함한다. 전자 변경 기는 전자를 제공하는 기(따라서 "전자 공여 기"로 지칭됨) 또는 전자를 끌어당기는 기(따라서 "전자 끄는 기"로 지칭됨)이다. 예시적인 전자 끄는 기에는 할로(예를 들어, 브로모, 플루오로, 클로로 및 요오도), 니트로, 카복시, 에스테르, 포르밀, 케토, 아조, 아미도카보닐, 아미도설포닐, 카복스아미도, 설포녹시, 설폰아미드, 우레이도, 및 아릴이 포함된다. 예시적인 전자 공여 기에는 하이드록실, 저급 알콕시(예를 들어, 메톡시, 에톡시 등), 저급 알킬(예컨대 메틸, 에틸, 등), 아미노, 저급 알킬아미노, 디-저급 알킬아미노, 아릴옥시(예컨대 페녹시 등), 아릴알콕시(예컨대 페녹시 등), 아미노아릴(예컨대 p-디메틸아미노페닐 등), 머캅토, 및 알킬티오가 포함된다. 하나 이상의 구현예에서, 플루오렌 모이어티는 하나 이상의 할로 기를 포함한다. 보다 구체적인 전자-변경 기는 Br, -CF3, -CH2CF3, -CH2C6F5, -CN, -NO2, -S(O)R, -S(O)아릴, -S(O2)R, -S(O2)아릴, -S(O2)OR, -S(O2)O아릴, -S(O2)NHR, -S(O2)NH아릴, -C(O)R, -C(O)아릴, -C(O)OR, -C(O)NHR, 등(여기서 R은 H 또는 유기 라디칼임)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 전자-변경 기는 브로모이다. Re1 및 Re2 각각이 상이한 경우, (a) Re1 및 Re2는 상이한 전자 끄는 기일 수 있거나, (b) Re1 및 Re2는 상이한 전자 공여 기일 수 있거나, (c) Re1 및 Re2는 하나가 전자 끄는 기이고 다른 하나가 전자 공여 기가 될 수 있다. 그러나 많은 상황에서 Re1 및 Re2는 각각 동일할 것이다.
플루오렌 고리에서, 친전자성 방향족 치환에 의해 전자 변경 기를 첨가하는 전형적인 위치는 "2" 및 "7" 위치이다. 이러한 위치가 (수용성 중합체에 부착된) 연결 모이어티에 의해 점유되면 플루오렌 고리의 다른 위치는 (a) 연결 모이어티의 지시 능력 및 (b) 입체 영향과 같은 요인에 따라 치환될 것이다. 그러나, 종종 플루오렌 고리의 "4" 및 "5" 위치는 "2" 및 "7" 위치를 사용할 수 없을 때, 특히 알파 탄소, 즉, 플루오렌의 9-위치(즉, 이온화 가능한 수소 원자인 Hα를 지닌 탄소)가 치환될 때 부착 가능성이 더 높은 위치를 나타낸다. 전자 변경 기인 "Re1", "Re2"(둘 다 존재하는 경우)는 동일한 방향족 고리 또는 상이한 방향족 고리에 위치할 수 있다.
수용성 중합체 사슬인 POLYa 및 POLYb(예를 들어, 각각의 폴리에틸렌 글리콜 사슬)와 중심 플루오렌 고리 사이의 링커, L1 및 L2는 동일하거나 상이할 수 있다. 전형적으로 링커, L1 및 L2는, 예를 들어, 제조 공정 동안 삽입될 수 있는 작용기 또는 원자의 짧은 사슬을 포함한다. 이러한 링커는 형성되는 방출 가능한 중합체성 시약의 특성에 영향을 미칠 수 있으며, 상응하는 중합체 접합체의 방출 특성에 영향을 미칠 수 있다. 링커의 배치(고리 위치) 및 특정 구조를 조작함으로써, 중합체 접합체로부터 중합체 모이어티의 방출률을 변경할 수 있으며, 예를 들어, 전형적으로 수 시간 또는 수 일 내에 측정될 수 있다. 추가로, 본원에서 일반적으로 전자-변경 기로 지칭되는 다른 독립적 작용기, Re1 및/또는 Re2는 접합체로부터 중합체 모이어티의 방출률에 추가로 영향을 미치기 위해 방향족 고리 상에서 치환될 수 있지만, 반드시 그런 것은 아니다. 예를 들어, 일부 예시적인 Re1 및 Re2 기에는 다음이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다: 할로(예를 들어, 브로모, 플루오로, 클로로 및 요오도), 니트로, 카복시, 에스테르, 포르밀, 케토, 아조, 아미도카보닐, 아미도설포닐, 카복스아미도, 설포녹시, 설폰아미드, 우레이도 및 아릴. 예시적인 전자 공여 기는 하이드록실, 저급 알콕시(예를 들어, 메톡시, 에톡시 등), 저급 알킬(예컨대 메틸, 에틸, 등), 아미노, 저급 알킬아미노, 디-저급 알킬아미노, 아릴옥시(예컨대 페녹시 등), 아릴알콕시(예컨대 페녹시 등), 아미노아릴(예컨대 p-디메틸아미노페닐 등), 머캅토, 및 알킬티오를 포함한다. 보다 구체적인 전자-변경 기는 -CF3, -CH2CF3, -CH2C6F5, -CN, -NO2, -S(O)R, -S(O)아릴, -S(O2)R, -S(O2)아릴, -S(O2)OR, -S(O2)O아릴, -S(O2)NHR, -S(O2)NH아릴, -C(O)R, -C(O)아릴, -C(O)OR, -C(O)NHR, 등(여기서 R은 H 또는 유기 라디칼임)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 따라서, 예를 들어, L1, L2 및 존재하는 경우, Re1 및/또는 Re2의 구조, 및 각각의 플루오레닐 고리 상의 이의 위치에 따라 수 시간의 기간 또는 수 일의 기간 동안 약물을 방출할 이러한 유형의 PEG 시약을 설계할 수 있다.
POLYa 및/또는 POLYb와 플루오렌 모이어티 사이에 삽입된 예시적인 연결 모이어티, L1 및 L2는 -C(O)-, -S(O2)-, -S(O)-, -NH-S(O2)-, -S(O2)-NH-, -CH=CH-, -O-CH=CH-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-NH-, -O-C(O)-NH-, -C(S)-, -CH2-, -CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2, -O-CH2-, -CH2-O-, -O-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-O-, -O-CH2-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-, -O-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-O-, -S-CH2-, -CH2-S-, -S-CH2-CH2-, -CH2-S-CH2-, -CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2-CH2-, -CH2-S-CH2-CH2-, -CH2-CH2-S-CH2-, -CH2-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-S-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-S-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-S-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-S-, -C(O)-NH-CH2-, -C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -NH-C(O)-CH2-C(O)-NH-, -NH-C(O)-CH2-CH2-C(O)-NH-, -NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -NH-C(O)-CH=CH-C(O)-NH-, -C(O)-O-CH2-, -CH2-C(O)-O-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-O-CH2-, -C(O)-O-CH2-CH2-, -NH-C(O)-CH2-, -CH2-NH-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-, -NH-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -C(O)-NH-CH2-, -C(O)-NH-CH2-CH2-, -O-C(O)-NH-CH2-, -O-C(O)-NH-CH2-CH2-, -NH-CH2-, -NH-CH2-CH2-, -CH2-NH-CH2-, -CH2-CH2-NH-CH2-, -C(O)-CH2-, -C(O)-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -O-C(O)-NH-[CH2]h-(OCH2CH2)j-, -NH-C(O)-O-[CH2]h-(OCH2CH2)j-, 2가 사이클로알킬 기, -O-, -S-, 아미노산, -N(R6)-, 및 임의의 전술한 것들 중 둘 이상의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않으며, 여기서 R6은 H 또는 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴 및 치환된 아릴로 구성된 군으로부터 선택된 유기 라디칼이고, (h)는 0 내지 6이고, (j)는 0 내지 20이다. 다른 특정 연결 모이어티는 다음 구조를 가지며: -C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-, -NH-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-, 및 -O-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-, 여기서 각각의 메틸렌 다음의 아래 첨자 값은 구조에 함유된 메틸렌의 수를 나타내며, 예를 들어, (CH2)1-6은 구조가 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 메틸렌을 함유할 수 있음을 의미한다. 추가로, 임의의 상기 연결 모이어티는 1개 내지 20개의 에틸렌 옥사이드 단량체 단위(즉, --(CH2CH2O)1-20)를 포함하는 에틸렌 옥사이드 올리고머 사슬을 추가로 포함할 수 있다. 즉, 에틸렌 옥사이드 올리고머 사슬은 연결 모이어티 앞 또는 뒤에, 그리고 선택적으로 2개 이상의 원자로 구성된 연결 모이어티의 임의의 두 원자 사이에서 발생할 수 있다. 또한, 올리고머가 중합체 세그먼트에 인접하고 단순히 중합체 세그먼트의 연장을 나타내는 경우 올리고머 사슬은 연결 모이어티의 일부로 간주되지 않을 것이다. 마지막으로, 일부 연결 모이어티는 전자 변경 기로도 기능하는 원자 또는 원자 그룹을 포함한다는 점에 유의하며; 이러한 경우, 하나 이상의 추가적인 "별개의"(즉, 연결 모이어티의 일부가 아님) 전자 변경 기의 포함은 바람직하지 않거나 필요하지 않을 수 있다.
L1 및 L2에 대한 바람직한 연결 모이어티는 -C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(O)-, -C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-, -C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-, -C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-, -NH-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-, -NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -NH-C(O)-CH2-CH2-C(O)-, -C(O)-CH2-CH2-C(O)-NH-, -NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-, -C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-, -C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-, -C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-, -C(O)-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-, -C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-, -C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-, -NH-CH2-CH2-(OCH2CH2)1-3-NH-C(O)-, -C(O)-NH-(CH2CH2O)1-3-CH2-CH2-NH-, -C(O)-NH-CH2-CH2-(OCH2CH2)1-3-NH-C(O)-, -C(O)-NH-(CH2CH2O)1-3-CH2-CH2-NH-C(O)-, -NH-C(O)-CH2-, -CH2-C(O)-NH-, -NH-C(O)-CH2-O-, -O-CH2-C(O)-NH-, -CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -O-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-O-, -C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(O)-, -C(O)-NH-CH2-CH2-O-, 및 -O-CH2-CH2-NH-C(O)-로부터 선택된 것들을 포함한다.
존재하는 경우, 전체 구조에서 각각의 연결 모이어티는 전체 구조 내 임의의 다른 연결 모이어티와 동일하거나 상이할 수 있다. L1 및 L2와 관련하여, L1 및 L2가 동일한 것이 때때로 바람직하다.
바람직한 연결 모이어티는 아미도카복시, 카복시아미도, 설폰아미드, 에스테르 및 우레이도를 포함한다. 추가의 특정 연결 모이어티는, 예를 들어, -(CH2)1-6C(O)NH- 및 -NH-C(O), NH-C(O)-(CH2)1- 6C(O)NH-를 포함한다. 보다 구체적인 연결 모이어티는, 예를 들어, -(CH2)C(O)NH-, -(CH2)3C(O)NH-, -NH-C(O), 및 NH-C(O)-(CH2)3C(O)NH-로부터 선택된다.
연결 모이어티, L1 및 L2 및 이에 따른 수용성 중합체 "암", POLYa 및 POLYb는 유사하게 플루오렌 고리 상의 임의의 2개의 이용 가능한 위치, 예를 들어, 탄소 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8에 위치할 수 있다. 일부 구현예에서, L1 및 L2는 플루오렌 탄소 C-2 및 C-7에 부착된다. 일부 다른 구현예에서, L1 및 L2는 플루오렌 탄소 C-2 및 C-5에 부착된다. 예를 들어, 예시적인 구조식 XI, 구조식 XIII, 구조식 I-d, 구조식 I-f, 구조식 I-g, 구조식 II-d, 구조식 II-f 및 구조식 II-g(위치 C-2 및 C-5) 및 구조식 XII, 구조식 XIV, 구조식 I-e, 구조식 I-h, 구조식 II-e, 및 구조식 II-h(위치 C-2 및 C-7)를 참조한다.
하기 실시예는 특히, (i) 플루오레닐계 중합체성 시약을 제조하기 위한 개선된 방법, (ii) 이러한 시약을 회수 및 정제하는 방법, (iii) 플루오레닐계 중합체성 시약에서 원하지 않는 불순물을 감소시키는 방법, (iv) 각각 포스겐 및 디-BTC와 같은 유독하고 잠재적으로 폭발성인 반응물의 사용을 피하는 방법, (v) 비-석신이미딜 플루오레닐계 중합체성 에스테르를 원하는 NHS-에스테르로 전환하는 방법을 예시한다.
본원에 참조된 모든 논문, 서적, 특허, 특허 간행물 및 기타 간행물은 그 전문이 참조로 포함된다. 본 명세서의 교시와 참조로 포함된 기술 사이에 불일치가 있는 경우, 본 명세서의 교시 및 정의의 의미가 우선할 것이다(특히 본원에 첨부된 청구범위에서 사용되는 용어와 관련하여). 예를 들어, 본 출원과 참조로 포함된 간행물이 동일한 용어를 다르게 정의하는 경우, 용어의 정의는 정의가 있는 문서의 교시 내에서 유지되어야 한다.
실시예
전술한 설명 및 하기 실시예는 본원에 제공된 본 발명(들)의 범위를 예시하기 위한 것이며, 제한하려는 것이 아님을 이해할 것이다. 본 발명의 범위 내의 다른 양태, 이점 및 수정은 본 발명이 속하는 당업자에게 명백할 것이다.
재료 및 방법
본 개시는, 달리 지시되지 않는 한, 당업자가 이해하고, 문헌에서 설명되는 유기 합성 등의 통상적인 기술을 이용할 것이다. 다음 실시예에서는 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력했지만, 일부 실험 오차와 편차를 고려해야 한다. 달리 지시되지 않는 한, 온도는 섭씨온도이고, 압력은 해수면에서 대기압이거나 그 근처이다.
방사성 표지된 중합체의 모든 방사 화학적 공정 및 분석(1H 및 3H-NMR, 비활성, RI 및 UV 검출기 둘 다와 함께 GFC를 사용한 분자량)은 미국 캘리포니아주 로스앤젤레스 소재의 모라벡 바이오케미칼즈, 인코포레이티드(Moravek Biochemicals, Inc.)에서 수행되었고, 발명가 중 한 명이 감독과 협의를 위해 참석한다.
PEG 시약을 제외한 모든 시약은 달리 지시되지 않는 한 상업적으로 입수되었다. 모든 PEG 원료는 미국 앨라배마주 헌츠빌 소재의 넥타르 테라퓨틱스(Nektar Therapeutics)에서 공급되었다. 넥타르 테라퓨틱스에서 생성된 모든 NMR 데이터는 브루커(Bruker)(미국 매사추세츠주 빌레리카 소재)에서 제조된 300 MHz 또는 400 MHz NMR 시스템을 사용하여 얻어졌다. PEG 유도체와 관련된 반응은 유리 또는 유리로 라이닝된 용기에서 수행되었다.
안전 경고: 안전 또는 위험 경고가 포함된 시약으로 절차를 수행하기 전에 실험실 작업자는 심각한 사고를 방지하기 위해 안전한 취급 절차에 익숙해져야 한다. 특히 디벤조트리아졸릴 카보네이트(디-BTC)는 특정 상태에서 폭발 위험이 있다. 이러한 절차는 숙련된 화학자 또는 고도로 훈련된 기술자가 수행해야 한다.
약어:
ACN 아세토니트릴
anh 무수
BHT 부틸화된 하이드록시톨루엔
디-BTC 디벤조트리아졸릴 카보네이트
DCM 디클로로메탄
DCC N,N'-디사이클로헥실 카보디이미드
DMAP 4-디메틸아미노피리딘
DMF 디메틸포름아미드
EDAC HCl 1-에틸-3-(3'-디메틸아미노프로필)카보디이미드, HCl
HOBT 하이드록시벤조트리아졸
IPA 이소프로필 알코올
MTBE 메틸-3급-부틸 에테르
NHS N-하이드록시석신이미드
Pyr 피리딘
RB 둥근 바닥
RT 실온, 20℃ 내지 25℃
THF 테트라하이드로푸란
실시예 1
예시적인 G2- PEG2 - FMOC - NHS 시약의 합성
반응식 E1 - 벤조트리아졸 카보네이트를 통한 G2- PEG2 - FMOC - NHS 시약의 합성을 위한 예시적인 반응의 설명
Figure pct00043
A. G2- PEG2 - FMOC -OH 20K의 제조
무수 톨루엔(250 mL)에 용해된 mPEG-NH2(10,000 Da)(25.1 g, 2.51 mmol)를 회전 증발기에서 45℃에서 감압하에 톨루엔을 증류 제거하여 공비 건조시켰다. 고체 잔류물을 질소 분위기 하에 무수 디클로로메탄(DCM)(125 mL)에 용해시켰다. 무수 DMF(12.7mL)에 용해된 G2-FMOC-코어(9-하이드록시메틸-2,7-디(아미도글루타르산)플루오렌)(0.5211 g, 1.15 mmol) 및 무수 N-하이드록시벤조트리아졸(HOBt)(0.3251 g, 2.41 mmol)의 용액을 mPEG-NH2 용액에 첨가했다. 그 다음 1,3-디사이클로헥실카보디이미드(DCC)(0.645 g, 3.13 mmol)를 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 17시간 동안 교반하였다. 다음으로 용매를 감압하에 증류 제거하였다. 진한 시럽을 약하게 가열하면서 무수 이소프로필 알코올(IPA)(300 mL, 서서히 첨가)에 용해시켰다. PEG 생성물을 실온에서 디에틸 에테르(200 mL)를 첨가하여 침전시켰다. 침전물을 20분 동안 10℃로 냉각시키고, 여과하고, IPA(300 mL)에 이어 디에틸 에테르(500 mL x 3)로 세척하였다. 조 생성물을 진공 하에 건조시켜 황백색 분말 25 g을 얻었다.
조 물질을 탈이온수(500 mL)에 용해시키고, 총 부피 1300 ml로 희석하였다. 용액의 pH는 1 M NaOH를 사용하여 9.7로 조정되었다. 미반응된 mPEG-NH2(10,000)의 크로마토그래피 제거는 용리액으로 물을 사용하여 POROS HS50 매체(500 mL)에서 수행되었다. PEG 생성물을 함유하는 분획을 수집하고, DEAE 세파로스 FF 매체(200 mL)에 통과시켜 추가로 정제하였다. 정제된 생성물은 mPEG-NH2(10,000) 또는 모노 PEG 산 생성물을 함유하지 않는 것으로 밝혀졌다(HPLC 분석).
소량의 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA) 및 염화나트륨(170g)을 첨가하고, 1 M NaOH를 사용하여 pH를 7.56으로 조정하였다. 생성물을 DCM(250, 250, 100 mL)을 사용하여 수성 층으로부터 추출하였다. DCM 추출물을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, IPA 및 디에틸 에테르로 단리하였다. 정제된 생성물을 진공 하에 건조시켰다(수율 20.95 g, 황백색 분말). GPC 분석 결과 99%의 원하는 G2-PEG2-FMOC-OH 20K를 보여주었다. 1H-NMR (CD2Cl2): δ (ppm): 8.6 (s, NH, 2H); 7.9 (s, Ar, 2H); 7.6 (m, Ar, 4H); 6.4 (bs, NH, 2H); 4.1 (m, CH, 1H); 4.0 (d, CH2, 2H) 3.6 (bs, PEG 백본); 3.3 (s, OCH3, 6H); 2.4 (t, CH2, 4H); 2.3 (t, CH2, 4H); 2.0 (m, CH2, 4H).
B. G2- PEG2 - FMOC - BTC 20K의 제조
G2-PEG2-FMOC-OH 20K(1.8 g, 0.28 mmol)를 DCM(5 mL)에 용해시키고, 무수 톨루엔(20 mL)을 첨가하였다. 다음으로, 수분을 제거하기 위해 용매를 증류 제거하여 건조시키고, 건조된 물질을 무수 아세토니트릴 5.4 mL에 용해시켰다. 이 용액에 디벤조트리아졸릴 카보네이트(디-BTC)(77 mg) 및 무수 피리딘(7.3 μL)을 첨가했다. 용액을 실온에서 2시간 15분 동안 교반한 다음, 무수 IPA(200 mL, BHT 50 ppm 함유)를 첨가하여 생성물을 침전시켰다. 15분 후, 용액을 여과하고, 고형물을 무수 IPA(45 mL, BHT 50 ppm 함유)에 이어 디에틸 에테르(4 x 50 mL, BHT 100 ppm 함유)로 세척하였다. 생성물을 진공 하에 밤새 건조시켰다. 수율 1.49 g. 1H-NMR (DMSO-d6): δ (ppm) 8.6 (s, NH, 2H); 8.0 (s, Ar, 2H); 7.6 (m, Ar, 4H); 6.4 (bs, NH, 2H); 5.0 (m, CH2-BTC, 2H); 4.5 (t, CH, 1H); ) 3.6 (s, PEG 백본); 3.3 (s, OCH3, 6H); 2.4 (t, CH2, 4H); 2.3 (t, CH2, 4H); 2.0 (m, CH2, 4H).
C. G2- PEG2 - FMOC - NHS 20K의 제조
G2-PEG2-FMOC-BTC 20K(1.47 g)를 무수 DCM(5.9 mL)에 용해시키고, 용액을 8℃까지 냉각시켰다. NHS(170.6 mg)를 첨가하고, 혼합물을 8℃에서 밤새 교반하였다. IPA(60mL, 시트르산 293 mg 및 BHT 10 mg 함유)를 첨가하여 생성물을 침전시키고, 여과하고, 무수 IPA(60 mL, 10 mg BHT 함유)에 이어 무수 메틸 3급-부틸 에테르(MTBE)(50 mL, 시트르산 35 mg 및 BHT 8.2 mg 함유)로 세척하였다. 다음으로, 생성물을 진공 하에 밤새 건조시켰다. 수율 1.27 g. 1H-NMR (DMSO-d6): δ (ppm) 8.6 (s, NH, 2H); 7.8 (s, Ar, 1H); 7.7 (s, Ar, 2H); 7.6 (m, Ar, 4H); 6.4 (bs, NH, 2H); 4.6 (d, CH2, 2H); 4.3 (t, CH, 1H), 3.6 (bs, PEG 백본); 3.3 (s, OCH3, 6H); 2.8 (s, NHS, 4H); 2.4 (t, CH2, 4H); 2.3 (t, CH2, 4H); 2.0 (m, CH2, 4H).
활성 카보네이트의 생성물 말단기 치환율은 글리신과의 반응에 이어 접합체의 HPLC 분석에 의해 결정되었고, 88.1 몰%를 나타냈다. 11℃에서 136시간 저장 후, 글리신 치환에 의한 분석 결과 86.6 몰%의 치환율을 나타냈다. IPA에 시트르산을 첨가하지 않고, MTBE 세척액에 시트르산이 없는 상태로 침전된 유사한 생성물은 제조 후 86.2 몰%의 치환율 및 11℃에서 136시간 저장 후 75.3 몰%의 치환율을 나타냈다. G2-PEG2-FMOC-글리신 접합체를 다음과 같이 제조하였다: G2-PEG2-FMOC-NHS 20K(10 mg)를 5% 글리신(pH 7.4)의 완충 용액 1 mL에 용해시켰다. 생성된 용액을 잘 혼합하고, 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 분석은 GFC 분석용 용액 샘플을 주입하여 수행되었다(워터스(Waters); 울트라하이드로겔250; pH 7.4에서 10 mM HEPES 완충액, 75℃).
실시예 2
브롬화된 G2- PEG2 - FMOC - NHS 20K(BR-G2- PEG2 - FMOC - NHS 20K)의 합성
Figure pct00044
반응식 E2 브롬화된 G2 시약(Br-G2- PEG2 - FMOC - NHS 20K)의 합성.
A. 브롬화된 G2- FMOC 코어(9- 하이드록시메틸 - 브로모 -2,7- 디(아미도글루타르 산)플루오렌)의 제조
9-하이드록시메틸-2,7-디(아미도글루타르산)플루오렌(1.5 g, 3.3 mmol)을 1,4-디옥산(45 mL) 및 탈이온수(30 mL)에 용해시켰다. 피리딘 하이드로브로마이드 퍼브로마이드(비닐 피리딘 중합체 상에 결합됨, 약 2 mmol Br3/g 수지, 25 g)를 첨가하고, 어두운 곳에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 현탁액을 여과하고, 1,4-디옥산/물(20 mL)에 이어 1,4-디옥산(20 mL)으로 세척하였다. 생성물을 반-포화된 염화나트륨 및 에틸 아세테이트(400 mL x 2)로 추출하였다. 유기 추출물을 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 용매를 감압하에 증류 제거하였다. 생성된 조 생성물을 50 mM 아세트산암모늄(pH 4.75) 및 메탄올 구배 용리를 사용하는 C18 실리카 크로마토그래피로 정제하여 황백색 분말 0.4 g을 수득하였다. 1H-NMR (DMSO-d6): δ (ppm) 8.1 (s, Ar, 1H); 7.9 (s, Ar, 1H); 7.8 (m, Ar, 2H); 7.6 (d, Ar, 1H); 4.0 (t, CH, 1H); 3.7 (m, CH2, 2H,); 2.4 (m, CH2, 4H); 2.2 (m, CH2, 4H); 1.8 (m, CH2, 4H).
B. 브롬화된 G2- PEG2 - FMOC -OH(9- 하이드록시메틸 - 브로모 -2,7-디(mPEG(10K)-아미도글루타르산 아미드) 플루오렌 )의 제조
무수 톨루엔(250 mL)에 용해된 mPEG-NH2(10,000 Da)(14 g, 1.42 mmol)를 회전 증발기에서 50℃에서 감압하에 용매를 증류 제거하여 공비 건조시켰다. 고체 잔류물을 질소 분위기 하에 무수 DCM(130 mL)에 용해시켰다. 무수 DMF(8 mL) 중의 브롬화된 G2-FMOC-OH(0.315 g, 0.59 mol) 및 무수 N-하이드록시벤조트리아졸(HOBt)(0.17 g, 1.24 mmol)의 용액을 PEG-NH2 용액에 첨가했다. 그 다음 1,3-디사이클로헥실카보디이미드(DCC)(0.34 g, 1.65 mmol)를 첨가했다. 혼합물을 실온에서 21시간 동안 교반하고, 용매를 감압하에 증류 제거하였다. 진한 시럽을 약하게 가열하면서 IPA(500 mL, 서서히 첨가)에 용해시켰다. PEG 생성물은 실온에서 디에틸 에테르(200 mL)를 첨가하여 침전되었다. 침전물을 10℃까지 10분 동안 냉각시키고, 여과하고, 차가운 IPA(150 mL) 및 디에틸 에테르(150 mL)로 세척한 다음 진공 하에 건조시켜 13.2 g의 황백색 분말을 수득했다.
건조된 조 생성물을 탈이온수(850 mL)에 용해시키고, pH를 1 M NaOH를 사용하여 pH 9.7로 조정하였다. 미반응된 mPEG-NH2(10,000 Da)의 크로마토그래피 제거는 용리액으로 물을 사용하여 POROS HS50 매체(500 mL)에서 수행되었다. PEG 생성물을 함유하는 분획을 수집하고, DEAE 세파로스 매체(200 mL)로 추가로 정제하였다. GPC 분석 결과 93%의 원하는 브롬화된 G2-PEG2-FMOC-OH 생성물을 보여주었다. 1H-NMR (CD2Cl2): δ (ppm) 8.8 (s, NH); 8.5 (s, NH); 7.9 (s, Ar, 2H); 7.8 (s, Ar); 7.7 (m, Ar); 7.6 (m, Ar); 6.6 (bs, NH); 6.4 (bs, NH); 4.1 (m, CH2); 3.6 (bs, PEG 백본); 3.4 (s, OCH3); 2.6 (t, CH2); 2.5 (t, CH2); 2.3 (m, CH2).
C. 브롬화된 G2- PEG2 - FMOC - BTC의 제조
톨루엔(55 mL)에 용해된 브롬화된 G2-PEG2-FMOC-OH(5.6 g, 0.28 mmol)는 50℃에서 용매를 증류 제거하여 공비 건조시킨 다음 무수 아세토니트릴 10 mL에 용해시켰다. 다음으로 디-BTC(0.33 g, 0.50 mmol) 및 무수 피리딘(22.5 μL, 0.28 mmol)을 첨가했다. 용액을 실온에서 3시간 동안 교반한 다음 생성물을 IPA(250 mL)로 침전시키고, 여과했다. 여액을 IPA(100 mL) 및 디에틸 에테르(100 mL)로 세척한 다음 실온에서 진공에서 2시간 동안 건조시켰다. 수득된 브롬화된 G2-PEG2-FMOC-BTC를 추가 정제 없이 다음 합성 단계에 사용하였다. 1H-NMR (CDCl3): δ (ppm) 9.0 (s, NH); 8.6 (s, NH); 8.1-7.5 (m, Ar); 6.9 (bs, NH); 6.8 (bs, NH); 4.9 (d, CH2); 4.4 (t, CH); 3.6 (bs, PEG 백본); 3.4 (s, OCH3); 2.5 (t, CH2); 2.3 (t, CH2); 2.0 (m, CH2).
D. 브롬화된 G2- PEG2 - FMOC - NHS (Br-G2- PEG2 - FMOC - NHS 20K)의 제조
브롬화된 G2-PEG2-FMOC-BTC(4.71 g. 0.235 mmol)를 DCM(18.8 mL)에 용해시키고, N-하이드록시석신이미드(NHS)(0.542 g, 4.71 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 22시간 동안 교반한 다음 0.5% 아세트산을 함유하는 IPA(200 mL)에 첨가하였다. 침전된 생성물을 여과하고, 0.5% 아세트산을 함유하는 20 mL의 IPA(20 mL)로 세척한 다음 0.5% 아세트산을 함유하는 디에틸 에테르(60 mL)로 세척하였다. 습윤 생성물을 진공에서 2시간 동안 건조시킨 후, 무수 아세토니트릴(14.1 mL)에 용해시킨 다음 0.5% 아세트산을 함유하는 IPA(235 mL)를 첨가하여 재침전시켰다. 침전물을 여과하고, 0.5%의 아세트산 및 0.005% BHT를 함유하는 디에틸 에테르(60 mL)로 세척하고, 실온에서 밤새 진공에서 건조시켰다. 수율: 4.2 g. 활성 NHS 에스테르 기의 87 몰% 치환. 20K. GFC 분석 결과 20K PEG 생성물의 93.3% 및 10K PEG 생성물의 6.4%가 존재하는 것으로 나타났다. 1H-NMR (CD2Cl2) δ (ppm): 8.8 및 8.5 (s,s, NH); 8.0-7.5 (m, Ar); 6.6 및 6.4 (s, s, NH); 4.7, 4.6 (m, CH2); 4.3 (m, CH); 3.6 (bs, PEG 백본); 3.4 (s, OCH3); 2.8 (s, NHS); 2.5 (t,CH2); 2.3 (t, CH2) 2.0 (m, CH2).
실시예 3
C2- PEG2 - FMOC - NHS 20K의 합성 방법
파트 1. 9- 하이드록시메틸 -2,7- 플루오렌디카복실산(C2-FMOC 코어)의 합성, 반응식 E3a 참조.
Figure pct00045
반응식 E3a C2- FMOC 코어의 합성
A. 2,7- 플루오렌디카복실산의 제조
아르곤 퍼징된 플라스크에서 9-플루오레논-2,7-디카복실산(10.0 g, 0.037 mol)을 디에틸렌 글리콜(75mL)에 현탁시켰다. 플라스크를 실온 오일욕에 넣은 다음 NaOH(6.2 g, 0.155 mol) 및 80% 하이드라진 수화물 용액(7.4 mL, 0.12 mol)을 연속하여 첨가했다. 반응 혼합물을 110℃까지 서서히 가열한 다음 대략 4시간 동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 냉각하고, 조심스럽게 물에 붓고, 진한 HCl을 사용하여 pH 2로 산성화시켰다. 침전된 조 생성물을 여과하고, 물로 세척한 다음 따뜻한 NaOH 용액(0.5 M)에 용해시키고, HCl을 사용하여 pH 2로 산성화함으로써 재침전시켰다. 침전물을 여과하고, 물로 세척하여 고체 황색 생성물(9.0 g, 96%)을 수득했다. 1H-NMR (DMSO- d6): δ (ppm) 8.2 (s, Ar, 2H); 8.1 (m, Ar, 2H); 8.0 (m, Ar, 2H ); 4.1 (s, 2H, CH2).
B. 2,7- 플루오렌디카복실산 디벤질 에스테르의 제조
질소 퍼징된 건조 플라스크에서, 2,7-플루오렌디카복실산(8.0 g, 0.031 mol)을 무수 DMF(400 mL)에 용해시켰다. 다음으로 무수 벤질 알코올(82 mL, 0.788 mol), DMAP(0.58 g, 0.0047 mol) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDAC) 하이드로클로라이드(16 g, 0.082 mol)를 실온에서 첨가했다. 24시간 동안 교반한 후 희석된 HCl 용액(1.5 L)을 첨가했다. 혼합물을 냉각시키고, 고체 침전물을 여과하고, 물로 세척했다. 다음으로 생성물을 따뜻한 아세톤(800 mL)에 용해시키고, 용액을 여과하고, 용매를 감압하에 증류 제거했다. (수율 5.9 g, 43%). 1H-NMR (DMSO-d6): δ (ppm) 8.3 (s, Ar, 2H); 8.2 (m, Ar, 2H); 8.1 (m, Ar, 2H); 7.5-7.4 (m, BnO, 10H); 5.4 (s, CH2, 4H); 4.1 (s, Ar, 2H).
C. 9- 포르밀 -2,7- 플루오렌디카복실산 디벤질 에스테르의 제조
아르곤 퍼징된 건조 플라스크에서 2,7-플루오렌디카복실산 디벤질 에스테르(3.0 g, 0.0065 mol)를 실온에서 무수 THF(60 mL)에 용해시켰다. 벤질 포르메이트(4.2 mL, 0.035 mol, 무수 K2CO3에 저장됨)를 첨가한 다음 칼륨 3급-부톡사이드 95%(2.7 g, 0.023 mol)를 첨가했다. 혼합물을 3시간 동안 교반한 다음 물을 첨가하여 반응을 켄칭하고, HCl을 사용하여 pH 2로 산성화시켰다. 유기 용매를 감압하에 부분적으로 증발시켰다. 생성물을 에틸 아세테이트로 2회(600 mL 다음에 200 mL) 추출하였다. 합한 유기층을 염수로 3회 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 증발시켜 건조시켰다. 조 생성물을 헥산 및 메탄올로 세척한 다음 건조시켰다. 수율 1.9 g(60%). 1H-NMR (DMSO- d6): δ (ppm) 11.9 (s, 포르밀,~1H); 8.8 (s, Ar, 1H); 8.5 (s, Ar, 1H); 8.4 (s, Ar, 1H); 8.2 (m, Ar, 2H); 7.9 (m, Ar, 2H); 7.5-7.4 (m, BnO, 10H); 5.4 (s, Ar, 4H).
D. 9- 포르밀 -2,7- 플루오렌디카복실산의 제조
파르(Parr) 수소화 병에서 9-포르밀-2,7-플루오렌디카복실산 디벤질 에스테르(3.0 g, 0.0061 mol)를 무수 THF(350 ml)에 용해시켰다. 다음으로 20% Pd/C(50% 물로 습윤, 600 mg)를 첨가하고, 파르 장치에서 파르 병을 3회 비우고/충진하여 수소 분위기를 확보했다. 현탁액을 20 내지 30 psi의 수소 하에서 대략 60시간 동안 진탕한 다음 남은 수소를 감압에서 제거했다. 용액을 셀라이트 층으로 여과하고, 용매를 감압하에 증류 제거했다. 1H-NMR (DMSO-d6): δ (ppm) 9.0 (s, Ar, 1H); 8.5-8.1 (m, Ar, 6H).
E. 9- 하이드록시메틸 -2,7- 플루오렌디카복실산(C2 FMOC 코어 또는 C2- FMOC -OH)의 제조
소량의 9-포르밀-2,7-플루오렌디카복실산(5 mg 내지 10 mg) 샘플을 소량의 THF를 함유하는 물에 용해시켰다. 과량의 수소화붕소나트륨을 첨가하고, 2시간 동안 반응시켰다. 1 M HCl을 주의 깊게 첨가하여 반응을 켄칭했다. 생성물을 에틸 아세테이트로 추출하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 용매를 증류 제거하고, 감압하에 건조시켰다. 1H-NMR (CD3OD): δ (ppm) 8.4 (s, Ar, 2H); 8.2 (m, Ar, 2H); 8.0 (m, Ar, 2H); 4.2 (t, CH, 1H); 4.0 (d, CH2, 2H). 이 반응의 스케일 업 버전은 전형적으로 80% 내지 85% 순수한 생성물을 초래했다. 바이오테이지(Biotage) 컬럼 크로마토그래피를 사용한 정제 결과 C2-FMOC-OH가 98% 내지 99% 순도 수준에서 제공되었다.
파트 2. C2- FMOC 코어로부터 PEG2 -C2- FMOC - NHS의 합성 방법, 반응식 E3b 및 E3c 참조.
Figure pct00046
반응식 E3b C2- PEG2 - FMOC - BTC 20K를 통한 C2- PEG2 - FMOC - NHS의 합성
I. C2- PEG2 - FMOC - BTC 20K를 통한 C2- PEG2 - FMOC - NHS의 합성
A. C2- PEG2 - FMOC -OH 20 kDa의 제조.
mPEG-NH2(Mn=10 kDa; 12.0 g)를 25℃에서 무수 DCM(10 mL)에 용해시켰다. 별도의 플라스크에서 바이오테이지 정제된 C2-FMOC-OH(0.165 g) 및 N-하이드록시벤조트리아졸 수화물(0.232 g)을 무수 DMF(5.5 mL)에 용해시키고, 생성된 용액을 mPEG-NH2 용액에 첨가했다. 다음으로 DCM(1.53 mL) 중 DCC의 1.0 M 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 25℃에서 10시간 동안 교반하였다. IPA(120 mL) 및 MTBE(350 mL)의 혼합물로 침전시켜 조 생성물을 단리하였다. 침전물을 여과하고, IPA(60 mL)로, MTBE(60 mL 및 130 mL)로 2회 헹구고, 진공 하에 건조시켰다. 다음으로 생성물을 560 mL의 탈이온수에 용해시키고, 용액의 pH를 0.2 M NaOH를 사용하여 pH 9.7로 조정하였다. 미반응된 mPEG-NH2의 이온 교환 크로마토그래피 제거는 용리액으로 물을 사용하여 POROS HS50 매체(80 mL)에서 수행되었다. PEG 생성물을 함유하는 분획을 수집하고, DEAE 세파로스 FF 매체(40 mL)를 통해 추가로 여과했다. 염화나트륨(96 g)을 DEAE 정제된 용출액에 첨가하고, 용액의 pH를 1 M NaOH를 사용하여 7.5로 조정했다. C2-PEG2-FMOC-OH 20K를 DCM(120 mL)으로 수성 층으로부터 추출했다. DCM 추출물을 건조시키고(Na2SO4), 생성물을 IPA/MTBE 혼합물로 침전시키고, 여과하고, 진공 하에 건조시켰다. 수율: 11.5 g의 백색 고체 생성물. 1H-NMR (CDCl3): δ (ppm) 8.2 (s, Ar, 2H); 7.9 (d, Ar, 2H); 7.8 (d, Ar, 2H); 4.2 (t, CH, 1H); 4.0 (d, CH2, 2H); 3.6 (bs, PEG 백본); 3.4 (s, OCH3, 6H).
B. C2- PEG2 - FMOC - BTC 20K의 제조
무수 톨루엔(110 mL)에 용해된 C2-PEG2-FMOC-OH 20K(11.0 g)를 감압하에 용매를 증류 제거하여 공비 건조시켰다. 톨루엔을 다시 첨가하고 진공에서 증류 제거하여 건조시키고, 잔류물을 무수 아세토니트릴(33 mL)에 용해시켰다. 수득된 용액을 5℃로 냉각시키고, 디-BTC(0.50 g) 및 무수 피리딘(56 μL)을 첨가했다. 혼합물을 4 내지 6℃에서 6시간 40분 동안 교반한 다음 0.005% 인산을 함유하는 5℃로 냉각된 IPA(275 mL)에 서서히 첨가했다. 0.5시간 동안 혼합한 후, 0.005% 인산을 함유하는 5℃로 냉각된 MTBE(275 mL)를 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 교반하여 생성물을 침전시켰다. 생성물을 여과한 다음 0.005% 인산을 함유하는 IPA/MTBE(275 mL)의 1:1 혼합물로 2회 세척한 다음 0.002% 인산을 함유하는 IPA/MTBE(275 mL)의 1:1 혼합물로 두 번째 2회 세척하였다. 생성된 생성물인 C2-PEG2-FMOC-BTC 20K를 진공 하에 15℃에서 건조시켰다. 수율 10.5 g. 1H-NMR (CDCl3): δ (ppm) 8.3 (s, Ar, 2H); 8.0 (d, Ar, 2H); 7.9 (d, Ar, 2H); 7.8(d, 벤조트리아졸, 1H); 7.6(d, 벤조트리아졸, 1H); 7.4(t, 벤조트리아졸, 1H); 7.1 (t, 벤조트리아졸, 1H); 4.8 (m, CH2-BTC, 2H); 4.5 (t, CH, 1H); 3.6 (bs, PEG 백본); 3.4 (s, OCH3, 6H).
C. C2- PEG2 - FMOC - BTC 20K로부터 C2- PEG2 - FMOC - NHS 20K의 제조
C2-PEG2-FMOC-BTC(10.0 g)를 무수 DCM(40 mL)에 용해시켰다. 교반하면서, 고체 NHS(0.60 g)를 첨가하고, 온도를 -5℃ 내지 -10℃로 유지하면서 최소 15분 동안 혼합했다. 반응 온도를 일정하게 유지하면서, 등가량의 무수 DMAP(0.030 g)를 첨가하고, NMR 분석에서 C2-PEG2-FMOC-BTC가 NHS 생성물로 전환되었음을 나타낼 때까지 반응 혼합물을 20시간 동안 교반했다. 다음으로 혼합물을 -5℃의 온도에서 트리플루오로아세트산(TFA)(0.30 mL)을 함유하는 IPA(250 mL)에 첨가했다. 차가운 MTBE(250 mL)를 첨가하고, 침전된 생성물을 여과하고, 0.01% TFA를 함유하는 IPA/MTBE(250 mL)의 차가운 1:1 혼합물로 세척했다. 세척 단계를 반복하고, 침전물을 0.01% 인산을 함유하는 IPA/MTBE(500 mL)의 차가운 1:1 혼합물로 추가로 세척한 다음 0.01% 인산을 함유하는 차가운 MTBE(250 mL)로 2회 세척했다. 습윤 생성물인 C2-PEG2-FMOC-NHS 20K를 진공 하에 밤새 건조시켰다. 수율 9.5 g. 1H NMR (CDCl3): δ (ppm) 8.1 (s, Ar, 2H); 8.0 (d, Ar, 2H); 7.9 (d, Ar, 2H); 4.7 (d, CH2, 2H); 4.5 (t, CH, 1H); 3.6 (bs, PEG 백본); 3.4 (s, OCH3, 6H); 2.9 (s, NHS).
II. C2- PEG2 - FMOC -OH 20K로부터 C2- PEG2 - FMOC - NHS 20K의 직접 합성
Figure pct00047
반응식 E3c C2- PEG2 - FMOC -OH 20K로부터 직접 C2- PEG2 - FMOC - NHS의 합성
무수 DCM 100 mL에 용해된 C2-PEG2-FMOC-OH 20K(5.0 g)를 감압하에 용매를 증류 제거하여 공비 건조시켰다. 건조 공정을 반복하고, 잔류물을 무수 DCM(25 mL)에 용해시켰다. 공정을 통해 불활성 분위기(건조 질소)를 유지하면서, 디석신이미딜 카보네이트(DSC)(0.130 g, 2.0 당량)를 첨가하여 욕 온도를 대략 15℃로 유지했다. 온도를 10℃로 낮추고, 피리딘(0.101 mL, 5.0 당량)을 첨가하고, 혼합물을 8℃ 내지 10℃에서 20시간 동안 교반하였다. 그 다음 5℃까지 냉각시키고, TFA(0.19 mL, 10 당량)를 첨가하고, 약 0.3시간 동안 계속 교반하였다. 용액을 0.2 마이크론 필터를 통해 여과하고, 5℃에서 0.1% TFA를 함유하는 100 mL의 차가운 IPA(100 mL)에 첨가했다. 혼합물을 약 3.0시간 동안 교반한 다음 0.1% TFA를 함유하는 차가운 MTBE(100 mL)를 첨가했다. 침전된 생성물을 여과하고, MTBE(200 mL 및 100 mL, 0.1% 인산 함유)로 세척하고, 진공 하에 12시간 동안 건조시켰다. 1H-NMR (CDCl3): δ (ppm) 8.1 (s, Ar, 2H); 8.0 (d, Ar, 2H); 7.9 (d, Ar, 2H); 4.7 (d, CH2, 2H); 4.5 (t, H, CH); 3.6 (bs, PEG 백본); 3.4 (s, OCH3, 6H); 2.9 (s, NHS).
실시예 4
삼중 수소 교환에 의한 3 H-G2- PEG2 - FMOC - NHS 20K의 합성 방법
G2- PEG2 - FMOC -OH 20K의 삼중 수소 교환
실시예 1의 G2-PEG2-FMOC-OH 20K(1.2 g)를 7.2 mL의 인산염 완충액 pH 8.5에 용해시키고, 활성탄 상의 수산화팔라듐(0.42 g, 20% Pd 함량(건조 기준), 물로 습윤 52%)을 첨가했다. 현탁액을 30분 동안 아르곤으로 살포한 다음 액체 질소로 동결시켰다. 그 다음 동결된 용액을 삼중 수소 기체에 노출시키고, 실온까지 가온한 다음 4.5시간 동안 삼중 수소로 덮었다. 삼중 수소 기체를 용기 밖으로 펌핑하고, 대략 50 mL의 탈이온수를 첨가했다. 용액을 여과하여 팔라듐 촉매를 제거했다. 물을 주위 온도에서 진공에서 증류하여 잔류 삼중 수소 기체를 제거한 다음 20 mL DI 물에 재용해시켰다. 표지된 PEG는 동결된 수용액으로 밤새 보관되었다. 실온에서 샘플을 해동한 후, 염화나트륨(8.5 g)을 첨가하고, 묽은 인산을 사용하여 pH를 pH 7.1로 조정했다. 그 다음 표지된 PEG를 DCM(3 x 20 mL)으로 추출하고, 황산나트륨(9 g)으로 건조시키고, 여과했다. DCM을 아르곤 하에서 증발시켰다. PEG를 DCM(5 mL) 및 무수 톨루엔(20 mL)에 용해시키고, 용매를 아르곤 하에서 증발시켜 3H-G2-PEG2-FMOC-OH 20K(9)를 수득했다. 수율은 0.96 g이었다. 1H-NMR (CD2Cl2): δ (ppm) 8.8, 8.7 (s, s, NH); 7.9 (d, Ar); 7.6 - 7.4 (m, Ar); 6.5 (bs, NH); 4.0 (m, CH, CH2); 3.6 (s, PEG 백본); 3.3 (s, OCH3); 2.4 (t, CH2); 2.3 (t, CH2); 2.0 (m, CH2).
활성 카보네이트 3 H-G2- PEG2 - FMOC - NHS 20K의 제조
3H-G2-PEG2-FMOC-OH 20K(0.96 g)를 무수 아세토니트릴(3mL)에 용해시켰다. 디-BTC(트리클로로에탄 중의 67 중량% 슬러리, 48 mg) 및 무수 피리딘(4 μL)을 첨가하고, 반응 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 생성물을 IPA(50 mL, BHT 50 ppm 함유)로 침전시키고, 얼음 위에서 냉각시키고, 여과하고, IPA(50 mL, BHT 50 ppm 함유)로 세척한 다음 무수 디에틸 에테르(200 mL, BHT 50 ppm 함유)로 세척했다.
수득된 3H-G2-PEG2-FMOC-BTC 20K를 무수 DCM(3.0 mL)에 용해시켰다. NHS(90.1 mg)를 첨가하고, 반응 혼합물을 4℃에서 밤새 교반하였다. 다음으로 무수 IPA(40 mL, 시트르산 및 BHT 함유)를 첨가했다. 현탁액을 얼음 배치에서 10분 동안 냉각시킨 다음 침전물을 여과하고 BHT를 함유하는 무수 IPA(40 mL) 및 시트르산과 BHT를 함유하는 MTBE(100 mL)로 세척했다. 수득된 생성물을 약 4시간 동안 진공 하에 건조시켰다. 수율 663 mg, 글리신 접합체의 HPLC에 의해 54% 활성 NHS. 1H-NMR (CD2Cl2): δ, (ppm) 8.8, 8.7 (s, s, NH); 7.9 - 7.4 (m, Ar); 6.8 (bm, NH); 4.6 (m, CH); 4.3 (m, CH2); 3.6 (s, PEG 백본); 3.3 (s, OCH3); 2.8 (s, CH2); 2.5 (t, CH2); 2.3 (t, CH2); 2.0 (m, CH2). 비활성은 7.0 Ci/mmol이었다. GPC에 의한 분석에서는 낮은 MW 분획과 높은 MW 분획을 모두 유지하면서 88% 20K MW를 보여주었다.
물질을 -80℃에서 저장 안정성 분석을 위해 3개의 부분(각각 220 mg)으로 분할했다. 고체 보관을 위한 생성물(220 mg)을 각각 40 mg의 분취량으로 나누고, 추후 분석을 위해 -80℃에서 보관했다. 또 다른 생성물 부분(220 mg)을 무수 디클로로메탄(4.4 mL)에 용해시키고, 1 mL 분취량으로 -80℃에서 보관했다. 나머지 생성물(220 mg)을 2 mM HCl 용액(2.2 mL, pH = 2.55)에 용해시키고, 0.5 mL 분취량으로 -80℃에 두었다. 샘플 분취량을 MW 및 % 치환에 대해 분석하여 다양한 저장 조건에서 방사선분해의 효과를 관찰했다. 14일째 결과는 표 1에 요약되어 있다.
[표 1]
Figure pct00048
실시예 5
삼중 수소 교환에 의한 3 H-C2- PEG2 - FMOC - NHS 20K의 합성 방법
mPEG-NH 2 10 kDa의 삼중 수소 교환
mPEG 아민 10kDa(2.0g)를 100 mM 인산염 완충액 pH 8.55에 용해시키고, 활성탄 상의 수산화팔라듐(0.71 g, 20% Pd 함량(건조 기준), 물로 습윤(50%))을 첨가했다. 현탁액을 30분 동안 아르곤으로 살포한 다음 액체 질소로 동결시켰다. 그 다음 동결된 용액을 삼중 수소 기체에 노출시키고, 실온으로 가온한 다음 3시간 동안 삼중 수소로 덮었다. 삼중 수소 기체를 용기 밖으로 펌핑하고, 대략 70 mL의 DI 물을 첨가했다. 용액을 여과하여 팔라듐 촉매를 제거했다. 물을 주위 온도에서 진공에서 증류 제거하여 잔류 삼중 수소 기체를 제거하고, 잔류물을 20 mL 내지 30 mL의 DI 물에 재용해시켰다. 증류 및 물의 첨가를 3회 반복하고, 최종 고체를 약 30 mL의 DI 물에 용해시켰다. NaCl(3 g)을 첨가하고, 수산화나트륨 용액을 사용하여 pH를 9.5로 조정했다. 생성물을 DCM(25 mL x 3; 5 mL x 1)으로 추출하고, 추출물을 건조시켰다(Na2SO4). 다음으로 용매를 감압하에 증류 제거하여 고체 3H-mPEG-NH2 10 kDa 생성물, 2.06 g을 수득했다. 생성물의 비활성은 11.59 Ci/mmol이었다. 비활성을 낮추기 위해 삼중 수소화된 생성물을 표지되지 않은 mPEG 아민 10 kDa로 희석했다. 따라서 상기의 삼중 수소 표지된 샘플에 표지되지 않은 mPEG 아민 10 kDa(2.0 g)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 DCM(6 mL)에 용해시켰다. 희석된 PEG 아민을 IPA(150 mL, BHT 100 ppm 함유) 및 디에틸 에테르(150 mL)를 첨가하여 용액으로부터 침전시킨 다음 여과했다. 침전물을 디에틸 에테르(BHT 100 ppm 함유)로 세척하고, 진공 하에 건조시켰다(약 30분); 수율 3.0 g, 비활성: 6.7 Ci/mmol.
3 H-C2- PEG2 - FMOC -OH 20 kDa의 제조
표지된 mPEG 아민(3H-mPEG-NH2 10 kDa)(3.0 g) 및 HOBt 수화물(46 mg, 0.28 mmol, 2.1 당량)을 DCM(10 mL) 및 톨루엔(10 mL)에 용해시켰다. 용매를 25℃에서 진공에서 제거하고, 잔류물을 질소 흐름 하에 약 20분 동안 건조시켰다. 별도의 플라스크에서 C2-FMOC-OH 코어(38.7 mg, 0.135 mmol, 1.0 당량)를 무수 DMF(2.2 mL)에 용해시켰다. 다음으로 용매를 50℃에서 진공에서 제거했다. 건조된 C2-FMOC-OH 코어 물질을 무수 DMF에 용해시키고, HOBt 용액을 함유하는 mPEG 아민으로 옮겼다(2.2 mL 용해, 1.0 mL 옮김). DCC(86.0 mg, 0.42 mmol, 3.1 당량)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반했다. 조 생성물을 IPA(120 mL)로 단리하고, 여과하고, 디에틸 에테르(40 mL)로 헹구고, 진공 하에 건조시켰다. 다음으로 이를 탈이온수(120mL)에 용해시키고, 용액을 추가 180 mL의 탈이온수로 희석했다. 1 M NaOH를 사용하여 용액의 pH를 pH 9.7로 조정했다. 미반응 표지된 mPEG-NH2(10,000 Da)의 크로마토그래피 제거는 용리액으로 물을 사용하여 POROS HS50 매체(40 mL)에서 수행되었다. 중성 PEG를 함유하는 분획을 수집하고, DEAE 세파로스 매체(30 mL)를 통한 여과에 의해 추가로 정제했다. 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA) 용액 및 염화나트륨(170 g)을 첨가하고, 1 M NaOH를 사용하여 pH를 7.50으로 조정했다. 생성물을 DCM(총 120 mL)으로 추출했다. 추출물을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, IPA 및 디에틸 에테르를 첨가했다. 침전된 생성물을 진공 하에 건조시켰다. 수율 1.53 g, 비활성: 11.6 Ci/mmol.
활성 카보네이트 3 H-C2- PEG2 - FMOC - NHS 20 kDa의 제조.
표지된 중간체 3H-C2-PEG2-FMOC-OH 20 kDa를 활성 벤조트리아졸릴 카보네이트(3H-C2-PEG2-FMOC-BTC) 카보네이트로 활성화시킨 다음 실시예 3에 기재된 바와 같이 NHS로 치환함으로써 3H-C2-PEG2-FMOC-NHS 20 kDa로 전환시켰다. 표지된 3H-C2-PEG2-FMOC-NHS 20 kDa 생성물의 수율은 1.24 g이었다. 글리신 접합체의 HPLC에 의해 86% 활성 NHS. 1H-NMR (CD2Cl2; 300 MHz): δ (ppm) 8.0, 7.9 (d, d, Ar); 8.0 (s, Ar); 4.7 (d, CH2); 4.5 (t, CH); 4.3 (m, CH2); 3.6 (s, PEG 백본); 3.3 (s, -OCH3); 2.9 (s, CH2). 비활성은 11.8 Ci/mmol이었다. GFC: 3.1% 높은 MW, 90.1% 생성물, 6.8% LMW.
실시예 6
글리신 접합체의 방출률
모델 약물 접합체의 방출률을 측정하기 위해, 실시예 1의 절차를 사용하여 G2, Br-G2 및 C2 PEG2-FMOC 20K NHS 시약으로부터 글리신 접합체를 제조하였다. 새로운 구조의 결과는 이전에 기재된 구조와 표 2에서 비교된다.
37℃ 및 pH 7.4에서 G2-PEG2-FMOC-20K-글리신 카바메이트 접합체에 대한 방출 데이터: 15일(1회 실험), 이는 이전에 보고된 값과 일치한다(Bentley et al, US 8,252,275).
37℃ 및 pH 7.4에서 Br-G2-PEG2-FMOC-20K-글리신 카바메이트 접합체에 대한 방출 데이터: 2.3일(1회 실험).
37℃ 및 pH 7.4에서 C2-PEG2-FMOC-20K-글리신 카바메이트 접합체에 대한 방출 데이터: 1.0 ± 0.06일(중복 실험).
[표 2]
Figure pct00049
실시예 7
C2- PEG2 - FMOC - NHS - 20KDA에서 풀벤 함량 검출
미국 특허 번호 8,252,275에 전반적으로 기재된 바와 같이 다양한 로트의 C2-PEG2-FMOC-NHS-20kDa를 제조했다. HPLC에 의해 C2-PEG2-풀벤 함량에 대해 다양한 로트를 분석했다.
Figure pct00050
실시예 8
C2- PEG2 - 풀벤과 3- 머캅토프로피온산의 반응에 이어 크로마토그래피 정제에 의한 PEG 풀벤 불순물의 제거
Figure pct00051
교반된 둥근 바닥 플라스크에서, 2,7-C2-PEG2-FMOC-OH 20K 및 2,7-C2-PEG2-풀벤 20K의 90:10 혼합물(25 mg)(후자는 컬버트슨(Culbertson) 등(미국 특허 번호 8,905,235)에 기재된 바와 같이 제조됨)을 10 mM 3-머캅토프로피온산(pH 6.8)을 함유하는 50 mM HEPES의 완충 용액에 용해시키고, 반응이 2시간 동안 진행되도록 하였다. 그 다음 반응 혼합물에서 DEAE 세파로스 FF 컬럼을 사용하여 생성된 2,7-C2-FMOC-산을 크로마토그래피 제거하였다. 생성물의 역상 HPLC 분석(워터스 2695 HPLC 시스템, C4 컬럼, 10 mM K2HPO4-THF 구배, 주변 온도, 0.5 mL/분 유속, 및 UV 검출(300 nm)) 결과, 정제된 2,7-C2-PEG2-FMOC-OH 20K는 미량이지만 검출 가능한 양의 2,7-C2-FMOC-풀벤 20K(약 0.2 중량%)를 함유했음을 나타냈다. 정제된 생성물은 2,7-C2-FMOC-산 20K을 함유하지 않았다.
이 실시예는 9-하이드록시메틸 플루오렌 중합체로부터 풀벤 불순물을 제거하기 위한 또 다른 방법을 예시한다. 이 접근법에서, 불순물인 풀벤은 9-하이드록시메틸 플루오렌 중합체(즉, 본원에 기재된 예시적인 9-하이드록시메틸 플루오렌 중합체 중 임의의 것)로부터 예시적인 이작용성 반응물인 티올-카복실산, 이 경우에, 3-머캅토프로피온산과의 반응에 의해 제거된다. 반응물은 풀벤 이중 결합(9-하이드록시메틸 플루오렌 중합체가 아님)과의 선택적 반응을 위한 티올 기, 및 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피에 의해 생성된 2,7-C2-FMOC-산 반응 생성물의 크로마토그래피 제거를 용이하게 하는 카복실산 기를 포함한다. 이 방법에 사용하기에 적합한 반응물은, 예를 들어, HS(CH2)1- 9C(O)OH와 같은 C1-C10 머캅토알칸산을 포함한다. 풀벤 형성은, 예를 들어, 9-하이드록시메틸 플루오렌 중합체와 같은 임의의 많은 FMOC 종의 형성 동안, 뿐만 아니라 상응하는 에스테르 등의 형성 동안 발생할 수 있지만, 이 접근법은 BTC 및 NHS 에스테르와 같은 가수분해에 민감한 FMOC 시약에는 적용할 수 없다.

Claims (81)

  1. 반응성 중합체성 시약을 제조하는 방법으로서,
    (i) 구조 I을 갖는 수용성 9-하이드록시메틸 플루오렌 중합체:
    [화학식 I]
    Figure pct00052

    (여기서
    POLYa는 제1 수용성, 비-펩티드성 중합체이고;
    POLYb는 제2 수용성 비-펩티드성 중합체이고;
    Re1은, 존재하는 경우, 제1 전자-변경 기이고;
    Re2는, 존재하는 경우, 제2 전자-변경 기이고;
    L1은 제1 연결 모이어티이고;
    L2는 제2 연결 모이어티임);
    를 무수 조건으로 염기의 존재하에 비양성자성 유기 용매에서 디벤조트리아졸릴 카보네이트와 반응시켜 하기 구조를 갖는 수용성 9-메틸 벤조트리아졸릴 카보네이트 플루오렌 중합체를 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계:
    [화학식 II]
    Figure pct00053

    (여기서 POLYa , POLYb , Re1, Re2, L1, 및 L2는 각각 단계 (i)에서 설명된 바와 같은 값을 가짐), 및
    (ii) 수용성 9-메틸 벤조트리아졸릴 카보네이트 플루오렌 중합체의 침전을 촉진하는 데 효과적인 무수 용매로 침전시켜 수용성 9-메틸 벤조트리아졸릴 카보네이트 플루오렌 중합체(II)를 회수하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 (i)은 구조 I의 수용성 9-하이드록시메틸 플루오렌 중합체를 약 1 내지 약 30 당량의 디벤조트리아졸릴 카보네이트와 반응시키는 것을 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 염기는 아민인, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 염기는 비-친핵성 아민이거나 약한 친핵성 아민인, 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 염기는 피리딘, 4-디메틸아미노피리딘, N,N-디이소프로필에틸아민, 2,6-디-3급-부틸피리딘, N-메틸이미다졸, N-메틸모르폴린, 2,6-루티딘, 2,4,6-콜리딘, N,N,2,6-테트라메틸피리딘-4-아민, N,N,N',N'-테트라메틸-1,6-헥사메틸디아민, N,N',N',N",N"-펜타메틸디에틸렌트리아민, 헥사메틸렌테트라민, 및 전술한 것들 중 임의의 것의 불용성-중합체-결합된 형태로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i)은 약 1 내지 약 30 당량의 염기를 포함하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 단계 (i)은 약 1 내지 약 10 당량의 염기를 포함하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i)은 건조 및 불활성 기체 분위기 하에서 수행되는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i)은 기계적 교반과 함께 수행되는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 반응 단계는 약 -20℃ 내지 약 35℃ 범위의 온도에서 수행되는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 반응 단계는 약 -10℃ 내지 약 25℃ 범위의 온도에서 수행되는, 방법.
  12. 제10항에 있어서, 반응 단계는 약 -5℃ 내지 약 10℃ 범위의 온도에서 수행되는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i)의 수용성 9-하이드록시메틸 플루오렌 중합체는 무수 비양성자성 유기 용매에 용해되는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)에서, 침전을 촉진하는 데 효과적인 무수 용매는 산을 추가로 포함하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 수용성 9-메틸 벤조트리아졸릴 카보네이트 플루오렌 중합체의 침전을 촉진하는 데 효과적인 무수 용매는 약 0.0001 내지 약 0.5 몰%의 산을 포함하는, 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 산은 아세트산, 인산, 시트르산, 제이인산나트륨(sodium dibasic phosphoric acid), 인산수소칼륨, 황산, 메타-니트로벤조산, 트리플루오로아세트산, 및 트리클로로아세트산, p-톨루엔설폰산으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 산은 아세트산, 시트르산 및 인산으로부터 선택되는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 산은 인산인, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 반응 단계 전에, 구조 I의 수용성 9-하이드록시메틸 플루오렌 중합체를 비양성자성 유기 용매에 용해시켜 중합체 용액을 형성하고, 중합체 용액을 공비 증류에 의해 건조시켜 수분 함량이 500 ppm 미만인 중합체 용액을 제공하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)로부터 회수된 수용성 9-메틸 벤조트리아졸릴 카보네이트 플루오렌 중합체는 10 몰% 미만의 수용성 풀벤 중합체를 포함하는, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i)에서 디벤조트리아졸릴 카보네이트는 할로겐화된 용매에 있는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 할로겐화된 용매는 디클로로메탄 또는 트리클로로에틸렌인 염소화된 용매인, 방법.
  23. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i)로부터의 비양성자성 유기 용매는 디메틸포름아미드, 아세톤, 아세토니트릴, 디옥산, 및 테트라하이드로푸란으로부터 선택되는, 방법.
  24. 제14항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 회수 단계는 단계 (i)로부터의 반응 혼합물을 여과하여 고형물을 제거하여 수용성 9-메틸 벤조트리아졸릴 카보네이트 플루오렌 중합체를 포함하는 용액을 제공한 다음, 용액으로부터 수용성 9-메틸 벤조트리아졸릴 카보네이트 플루오렌 중합체를 침전시키는 데 효과적인 양의 무수 용매를 첨가하는 것을 포함하는, 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 회수된 침전된 수용성 9-메틸 벤조트리아졸릴 카보네이트 플루오렌 중합체를 여과에 의해 단리하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)에서 무수 용매는 단계 (i)로부터의 비양성자성 유기 용매와 혼화성이고, 수용성 9-메틸 벤조트리아졸릴 카보네이트 플루오렌 중합체가 실질적으로 불용성인 용매인, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 수용성 9-메틸 벤조트리아졸릴 카보네이트 플루오렌 중합체의 침전을 촉진하는 데 효과적인 무수 용매는 디에틸 에테르, 이소프로필 알코올, 메틸-t-부틸 에테르, 펜탄, 헥산, 헵탄, 및 전술한 것들의 혼합물로부터 선택되는, 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 회수된 수용성 9-메틸 벤조트리아졸릴 카보네이트 플루오렌 중합체를, 수용성 9-메틸 벤조트리아졸릴 카보네이트 플루오렌 중합체가 실질적으로 불용성인 무수 용매로 세척하는 것을 추가로 포함하고, 용매는 약 0.0001 내지 약 0.5 몰%의 산을 포함하는, 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, (iii) 회수된 수용성 9-메틸 벤조트리아졸릴 카보네이트 플루오렌 중합체를 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 회수 또는 정제된 수용성 9-메틸 벤조트리아졸릴 카보네이트 플루오렌 중합체를 상이한 반응성 카보네이트로 전환시키는 것을 포함하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상이한 반응성 카보네이트는 수용성 9-메틸 N-하이드록시 석신이미딜 카보네이트 플루오렌 중합체인, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 전환 반응은 회수 또는 정제된 수용성 9-메틸 벤조트리아졸릴 카보네이트 플루오렌 중합체를 디클로로메탄에서 N-하이드록시석신이미드와 반응시켜 수행되는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 전환 반응은 디메틸아미노피리딘의 존재하에 수행되는, 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, POLYa 및 POLYb는 각각 폴리에틸렌 글리콜인, 방법.
  35. 제34항에 있어서, POLYa 및 POLYb 각각은 중량 평균 분자량이 약 120 달톤 내지 약 100,000 달톤, 또는 약 250 달톤 내지 약 60,000 달톤, 또는 약 5,000 달톤 내지 약 25,000 달톤인 폴리에틸렌 글리콜인, 방법.
  36. 제35항에 있어서, POLYa 및 POLYb 각각은 중량 평균 분자량이 약 250 달톤 내지 약 60,000 달톤인 폴리에틸렌 글리콜인, 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 구조 I의 수용성 9-하이드록시메틸 플루오렌 중합체는 하기 구조를 갖고:
    [화학식 I-a]
    Figure pct00054

    (여기서 각각의 n은 독립적으로 약 3 내지 약 2273, 또는 약 4 내지 약 1363, 또는 약 3 내지 약 136, 또는 약 136 내지 약 1818, 또는 약 113 내지 약 568, 또는 약 227 내지 약 568의 범위임); 구조 II의 수용성 9-메틸 벤조트리아졸릴 카보네이트 플루오렌 중합체는 하기 구조를 갖는, 방법:
    [화학식 II-a]
    Figure pct00055
    .
  38. N-하이드록실 석신이미딜 카보네이트 에스테르-활성화된 중합체성 시약의 제조 방법으로서,
    (i) 하기 구조를 갖는 수용성 9-하이드록시메틸 플루오렌 중합체:
    [화학식 I]
    Figure pct00056

    (여기서
    POLYa는 제1 수용성, 비-펩티드성 중합체이고;
    POLYb는 제2 수용성 비-펩티드성 중합체이고;
    Re1은, 존재하는 경우, 제1 전자-변경 기이고;
    Re2는, 존재하는 경우, 제2 전자-변경 기이고;
    L1은 제1 연결 모이어티이고;
    L2는 제2 연결 모이어티이고;
    존재하거나 존재하지 않을 수 있는 Re1은 제1 전자-변경 기이고;
    존재하거나 존재하지 않을 수 있는 Re2는 제2 전자-변경 기임);
    를 염기의 존재하에 무수 비양성자성 유기 용매에서 약 1 당량 내지 20 당량의 디석신이미딜 카보네이트와 반응시켜 하기 구조를 갖는 수용성 9-메틸 N-하이드록시석신이미딜 카보네이트 플루오렌 중합체를 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계:
    [화학식 III]
    Figure pct00057

    (여기서 POLYa , POLYb , Re1, Re2, L1, 및 L2는 각각 단계 (i)에서 설명된 바와 같은 값을 가짐);
    및
    (ii) 반응 혼합물로부터 구조식 III의 수용성 9-메틸 N-하이드록시석신이미딜 카보네이트 플루오렌 중합체를 회수하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 반응 단계 (i) 전에, 수용성 9-하이드록시메틸 플루오렌 중합체를 무수 비양성자성 유기 용매에 용해시켜 중합체 용액을 제공한 다음, 존재할 수 있는 물을 제거하기 위해 중합체 용액을 건조시켜 수분 함량이 500 ppm 미만인 건조된 중합체 용액을 제공하는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 수분 함량이 200 ppm 미만 또는 100 ppm 미만인 건조된 중합체 용액이 얻어질 때까지 건조를 반복하는, 방법.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 건조 단계는 중합체 용액을 공비 증류하는 것을 포함하는, 방법.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 건조는 중합체 용액의 수분 함량이 일정하게 유지될 때까지 반복되는, 방법.
  43. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 염기는 비-친핵성 아민이거나 약한 친핵성 아민인, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 염기는 피리딘, 4-디메틸아미노피리딘, N,N-디이소프로필에틸아민, 2,6-디-3급-부틸피리딘, N-메틸이미다졸, N-메틸모르폴린, 2,6-루티딘, 2,4,6-콜리딘, N,N,2,6-테트라메틸피리딘-4-아민, N,N,N',N'-테트라메틸-1,6-헥사메틸디아민, N,N',N',N",N"-펜타메틸디에틸렌트리아민, 헥사메틸렌테트라민 및 전술한 것들 중 임의의 것의 불용성-중합체-결합된 형태로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  45. 제38항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i)은 약 1 당량 내지 약 15 당량의 염기를 포함하는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 단계 (i)은 약 3 당량 내지 약 10 당량의 염기를 포함하는, 방법.
  47. 제38항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i)은 건조 및 불활성 분위기 하에서 수행되는, 방법.
  48. 제38항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 반응 단계 (i)은 약 0℃ 내지 약 30℃의 온도를 유지하면서 무수 비양성자성 유기 용매 중의 수용성 9-메틸 N-하이드록시석신이미딜 카보네이트 플루오렌 중합체의 용액에 디석신이미딜 카보네이트를 첨가하는 것을 포함하는, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 반응 단계 (i)은, 첨가 단계 후, 반응 혼합물의 온도를 약 7.5℃ 내지 약 18℃로 조정한 다음 염기를 첨가하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  50. 제38항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i)은 혼합과 함께 수행되는, 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 혼합 동안, 반응 혼합물의 온도는 약 3℃ 내지 약 21℃의 범위로 유지되는, 방법.
  52. 제38항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 회수 단계 전에, 단계 (i)로부터의 반응 혼합물에 염기를 중화하는 데 효과적인 양의 산을 첨가하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  53. 제52항에 있어서, 산은 아세트산, 인산, 시트르산, 제이인산나트륨, 인산수소칼륨, 황산, 메타-니트로벤조산, 트리플루오로아세트산, p-톨루엔설폰산, 및 트리클로로아세트산으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  54. 제53항에 있어서, 산은 아세트산, 시트르산 및 인산으로부터 선택되는, 방법.
  55. 제38항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 회수된 수용성 9-메틸 N-하이드록시석신이미딜 카보네이트 플루오렌 중합체는 15 몰% 이하의 수용성 풀벤 중합체를 포함하는, 방법.
  56. 제38항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 회수 단계 (ii)는 (ii-a) 반응 혼합물을 여과하여 고형물을 제거하고 용액을 제공한 다음 (ii-b) 용액으로부터 수용성 9-메틸 N-하이드록시석신이미딜 카보네이트 플루오렌 중합체를 침전시키는 것을 포함하는, 방법.
  57. 제56항에 있어서, 침전 단계는 수용성 9-메틸 N-하이드록시석신이미딜 카보네이트 플루오렌 중합체가 실질적으로 불용성인 무수 침전 용매의 첨가를 포함하는, 방법.
  58. 제57항에 있어서, 침전 용매는 이의 빙점보다 높고 실온보다 낮은 온도인, 방법.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 침전 용매는 임의의 잔류 염기를 본질적으로 중화하기에 충분한 소량의 산을 포함하는, 방법.
  60. 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 침전 용매는 디에틸 에테르, 이소프로필 알코올, 메틸 t-부틸 에테르, 에틸 아세테이트, 펜탄, 헥산, 헵탄 및 전술한 것들의 혼합물로부터 선택되는, 방법.
  61. 제38항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 회수된 수용성 9-메틸 N-하이드록시석신이미딜 카보네이트 플루오렌 중합체를 산성화된 침전 용매로 세척하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  62. 제38항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, (iv) 회수된 수용성 9-메틸 N-하이드록시석신이미딜 카보네이트 플루오렌 중합체를 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  63. 제62항에 있어서, 회수된 수용성 9-메틸 N-하이드록시석신이미딜 카보네이트 플루오렌 중합체에서 수용성 풀벤 중합체를 검출하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 정제 단계 (iv)는 회수된 수용성 9-메틸 N-하이드록시석신이미딜 카보네이트 플루오렌 중합체를 용매에 용해시켜 용액을 제공하고, 용액을 티올-함유 수지에 통과시켜 임의의 수용성 풀벤 중합체를 제거함으로써 정제된 용액을 제공하고, 정제된 용액에서 용매를 제거하여 정제된 수용성 9-메틸 N-하이드록시석신이미딜 카보네이트 플루오렌 중합체를 회수하는 것을 포함하는, 방법.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i)의 수용성 9-하이드록시메틸 플루오렌 중합체는 하기 구조를 갖는, 방법:
    [화학식 I-b]
    Figure pct00058

    (여기서 각각의 n은 독립적으로 약 3 내지 2273, 또는 약 4 내지 약 1363, 또는 약 3 내지 약 136, 또는 약 136 내지 약 1818, 또는 약 113 내지 약 568, 또는 약 227 내지 약 568임).
  65. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i)의 수용성 9-하이드록시메틸 플루오렌 중합체는 하기 구조를 갖는, 방법:
    [화학식 I-a]
    Figure pct00059

    (여기서 각각의 n은 독립적으로 약 3 내지 2273, 또는 약 4 내지 약 1363, 또는 약 3 내지 약 136, 또는 약 136 내지 약 1818, 또는 약 113 내지 약 568, 또는 약 227 내지 약 568임).
  66. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i)의 수용성 9-하이드록시메틸 플루오렌 중합체는 하기 구조를 갖는, 방법:
    [화학식 I-c]
    Figure pct00060

    (여기서 각각의 n은 독립적으로 약 3 내지 227임).
  67. 제65항 또는 제66항에 있어서, Re1 및/또는 Re2는 각각 독립적으로 할로, 니트로, 저급 알킬, 저급 알콕시, 트리플루오로메틸, 및 -SO3H로부터 선택되는, 방법.
  68. 제65항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 1개 내지 25개의 원자 길이를 갖는, 방법.
  69. 제65항에 있어서, Re1 및 Re2는 둘 다 동일한 방향족 고리 상에 위치하는, 방법.
  70. 제65항에 있어서, Re1 및 Re2는 상이한 방향족 고리 상에 위치하는, 방법.
  71. 제64항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 -(CH2)1-6C(O)NH- 및 -NH-C(O), NH-C(O)-(CH2)1- 6C(O)NH-로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  72. 제71항에 있어서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 -(CH2)C(O)NH-, -(CH2)3C(O)NH-, -NH-C(O), 및 NH-C(O)-(CH2)3C(O)NH-로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  73. 제64항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 구조식 I에서 각각의 폴리에틸렌 글리콜의 중량 평균 분자량은 대략 동일한(예를 들어, 각각의 "n"은 대략 동일한), 방법.
  74. 제73항에 있어서, 구조식 I에서 각각의 폴리에틸렌 글리콜은 약 120 달톤 내지 약 6,000 달톤 범위의 중량 평균 분자량을 갖는, 방법.
  75. 제73항에 있어서, 구조식 I에서 각각의 폴리에틸렌 글리콜은 약 6,000 달톤 내지 약 80,000 달톤 범위의 중량 평균 분자량을 갖는, 방법.
  76. 제73항에 있어서, 구조식 I에서 각각의 폴리에틸렌 글리콜은 약 5,000 달톤, 7500 달톤, 10,000 달톤, 15,000 달톤, 20,000 달톤, 30,000 달톤 및 40,000 달톤으로 구성된 군으로부터 선택된 중량 평균 분자량을 갖는, 방법.
  77. 제64항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 구조식 I 및 구조식 II에서, L1은 플루오렌 탄소-5에 부착되고, L2는 플루오렌 탄소-2에 부착되는, 방법.
  78. 제64항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 구조식 I 및 구조식 II에서, L1은 플루오렌 탄소-7에 부착되고, L2는 플루오렌 탄소-2에 부착되는, 방법.
  79. 제64항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 구조식 I은 하기로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법:
    Figure pct00061

    Figure pct00062
  80. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 회수 또는 정제된 수용성 9-메틸 벤조트리아졸릴 카보네이트 플루오렌 중합체 또는 다른 반응성 카보네이트를 아민-함유 생물학적 활성제와 반응시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  81. 제38항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 회수 또는 정제된 수용성 9-메틸 N-하이드록시 석신이미딜 카보네이트 플루오렌 중합체를 아민-함유 생물학적 활성제와 반응시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
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