JP2009281879A - 吸着防止方法、吸着防止材、内壁コートキャピラリ、その製造方法、及び、リン酸化合物とアニオンの同時分析方法 - Google Patents

Abstract

【課題】リン酸化合物に対して、高い耐久性で簡単に吸着防止を図る。
【解決手段】シラノールを壁面に含むキャピラリ１０内に、例えばＭＰＣとＳＭＡ又はＭＰＣとＢＭＡを組合せたリン脂質ポリマーを含む高分子溶液を流すことによって、例えばホスホリルコリン基１２でなるリン酸基を含む双性イオン型高分子が、イオン的相互作用で、シラノールを含む壁面に固定化された内壁コートキャピラリを得る。
【選択図】図１

Description

本発明は、吸着防止方法、吸着防止材、内壁コートキャピラリ、その製造方法、及び、リン酸化合物とアニオンの同時分析方法に係り、特に、キャピラリ電気泳動法等で用いられる溶融石英製毛細管の内壁に対するリン酸化合物の吸着を高い耐久性で簡単に防止できる吸着防止方法、吸着防止材、吸着防止処理を施した内壁コートキャピラリ、その製造方法、及び、前記内壁コートキャピラリを用いたリン酸化合物とアニオンの同時分析方法に関する。

キャピラリ電気泳動（ＣＥ）は、内径１００μｍ以下の毛細管の中で行なう電気泳動の総称であり、超高分離能、高速性、微小規模等の特徴を有することから、ＤＮＡシークエンシング、食品・薬品分析をはじめ、多くの分野で使われている。

最近では、特許文献１に記載されているように、質量分析計（ＭＳ）と直結させたＣＥ−ＭＥがメタボローム分析システムに使われる等の更なる応用研究も行なわれている。

分離に用いられる毛細管は、通常溶融石英ガラスが用いられているが、試料によっては壁面上のシラノール基に由来する吸着が認められ、ピーク形状の歪み、分離効率の低下を招くだけでなく、定量的な解析が不可能になることが知られている。

これまでに、親水性ポリマーを共有結合させたものや、物理的に吸着させたもの等、種々の内壁コートキャピラリが開発され、市販されている。

発明者の１人が共同発明者である特許文献２に記載された内壁コートキャピラリ（以下、ＳＭＩＬＥコートキャピラリと称する）は、正電荷を有するポリマーを被覆した唯一の市販キャピラリであることから、ＣＥ−ＭＳを用いたメタボローム分析（アニオン分析）に必須のツールとなっている。

更に、今回の発明者２人が発明者となっている特許文献３に記載された内壁コートキャピラリ（以下、ＫＥＩＯコートキャピラリと称する）も、ＣＥ−ＭＳを用いたメタボローム分析（アニオン分析）を目的の一つに開発されたものである。

一方、リン脂質型高分子のシリカゲルやマイクロチップ内壁の固定化については、特許文献４や非特許文献１、２に記載されている。

特許第３０３８１８４公報 特開平１０−２２１３０５号公報 特開２００８−３２３９７号公報 特開２００７−２２８８６号公報 Jiang．et．al．，Journal of Chromatography A，1127（2006）82-91 Xu．et．al．，Lab Chip，2007，7，119-206

しかしながら、従来の内壁コートキャピラリは、いずれも安定性に乏しく、又、ロット差がある等、多くの問題をかかえており、価格の面からも実分析に耐えられるものではなかった。

特許文献２で提案したＳＭＩＬＥコートキャピラリは、再現性の乏しい化学反応による被覆を避け、正負電荷を有するポリマーを交互に吸着させることにより、その当時で最高の安定性と耐久性を実現したが、残念ながら試薬メーカーから供給されるポリマーの性質が大きく変わってしまったため、現在の市販キャピラリの耐久性は低下しており、数十回の分析しか行なうことができない。

又、特許文献３で提案したＫＥＩＯコートキャピラリは、被覆すべきポリマー自身を固定化するのではなく、キャピラリ内で作製するシリカ膜に巻き込みながら固定化するという新しい方法で開発され、特許文献２に記載のＳＭＩＬＥコートキャピラリを上回る性能を示したが、リン酸基を有する化合物の分析については、壁面と相互作用が認められ、定量分析の適用が困難であった。

一方、特許文献４や非特許文献１、２に記載されたリン脂質型高分子のシリカゲルやマイクロチップ内壁の固定化方法は、いずれも、高分子中にシリル化反応のための官能基を予め導入して、共有結合を介して固定化しており、処理が複雑である。又、その適用は、タンパク質の吸着防止やペプチド分離を目的とした親水性相互作用クロマトグラフィ用分離担体であり、リン酸化合物への応用は報告されていない。

キャピラリへの種々の化合物の固定化は、数多く試されており、リン脂質をキャピラリやシリカゲル上にコーティングしたものは有ったが、コーティング強度は弱く、せいぜいセミパーネントコーティングであって、これ迄、リン酸基を含む双性イオン高分子をイオン的相互作用のみで固定化しようとする試みは無かった。

本発明は、前記従来の問題点を解消するべくなされたもので、リン酸化合物に対して高い耐久性で簡単に吸着防止を図ることを課題とする。

本発明は、脂溶性を有する両性イオンのポリマーを用いて、リン酸化合物の吸着を防止することにより、前記課題を解決したものである。

ここで、前記ポリマーを、リン脂質ポリマーとすることができる。

前記リン脂質ポリマーとして、２−メタクリロイルオキシエチル・ホスホリルコリン（ＭＰＣ）とステアリル・メタクリレート（ＳＭＡ）を組合せたものや、ＭＰＣとｎ−ブチル・メタクリレート（ＢＭＡ）を組合せたものを用いることができる。

本発明は、又、前記のポリマーを含むことを特徴とする吸着防止材を提供するものである。

又、前記のポリマーが、イオン的相互作用で壁面に固定化されていることを特徴とする内壁コートキャピラリを提供するものである。

ここで、前記壁面はシラノールを含むことができる。

本発明は、又、キャピラリ内に前記のポリマーを含む高分子溶液を流すことを特徴とする前記の内壁コートキャピラリの製造方法を提供するものである。

又、前記内壁コートキャピラリを用いることを特徴とするリン酸化合物とアニオンの同時分析方法を提供するものである。

本発明によれば、リン酸化合物に対して、高い耐久性で簡単に吸着防止を図ることができる。

今回開発した内壁コートキャピラリは、双性イオンタイプの高分子を固定化したもので、その固定化法は、キャピラリに高分子溶液を通液するだけという単純なものであり、分析の再現性が非常に高い。

又、今までのカチオン性ポリマー固定化キャピラリでは不可能であった、リン酸化合物の定量分析も可能であり、更に、陰イオン性メタボローム試料との同時分析も可能になる。

以下図面を参照して、本発明の実施形態を詳細に説明する。

本実施形態は、従来と同様の溶融石英ガラス製のキャピラリ１０の内側に、例えばＭＰＣとＢＭＡ又はＭＰＣとＳＭＡでなるリン脂質ポリマーを流すことによって、図１（模式図）及び図２（部分拡大斜視図）に示す如く、例えばホスホリルコリン基１２でなるリン酸基を含む双性イオン高分子をイオン的相互作用で固定化するようにしたものである。図において、１４はポリメタクリロイル基、１６は、例えばブチル（ＢＭＡの場合）やステアリル（ＳＭＡの場合）のようなアルキル基である。

コーティングに際しては、例えば長さ１２０ｃｍ、内径５０μｍの溶融石英キャピラリ１０にポリマーをコートする場合、図３に示す如く、まず、ステップ１００で、キャピラリ１０を前もって１Ｎ ＮａＯＨで１５分、蒸留水で更に１５分洗浄し、そして、ステップ１１０で、窒素を１５分パージしておく。

次いで、ステップ１２０で、例えば１ｍＬのシリンジを用いて、ポリマー溶液を充填する。その時、例えば先端から数十滴の液滴が出ることを確認する。

そして、ステップ１３０で、１０分放置した後、ステップ１４０で、もう一度ステップ１２０を行なう。

次いで、ステップ１５０で、１時間室温で保存する。

次いで、ステップ１６０で、空気をパージして、キャピラリ１０内から余分なポリマー溶液を除く。

次いで、ステップ１７０で、室温で終夜保存して、コーティング処理を終了する。

本実施形態は、通液のみで固定化が完了し、１００回近く、実用試料での分析が高い再現性で実現できる。これは、壁面との相互作用が、負電荷を有するシラノールと高分子中に存在するコリン性アンモニウム基間の静電的相互作用だけでなく、シラノールと高分子中に存在するリン酸基との相互作用の両方が効いているためと推測できる。

リン脂質ポリマーの種類Ａ〜Ｇと実験結果を図４に示す。図において、ＭＡは、メタクリル酸、ＧｒＭＡは、グリセロール・メタクリレートである。

図４から、基本骨格となるＭＰＣと組合せるモノマーは、（１）ある程度以上の疎水性が有れば分子量は小さくても良いが、疎水基が無いと分子量が大きくても駄目であること（ポリマーＢ、Ｄ、Ｅ）、（２）ＢＭＡ程度の疎水性であれば、分子量が重要であること（ポリマーＣとＥ）、（３）ＢＭＡ程度の疎水性であれば、組成比も重要であること（ポリマーＡとＣ）がわかる。

ポリマーＢでコートしたキャピラリで、アニオン混合物を分析した結果を図５に、ヌクレオチドの混合物を分析した結果を図６に示す。図５の分析条件は、キャピラリ長５０ｃｍ、分離溶液５０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ７．４、印加電圧−３０ｋＶ、５０ｍbarで３秒注入、試料は１００μＭ、検出は２１４ｎｍであり、図６の分析条件は、試料が５０μＭである点を除き、図５と同じである。

又、ポリマーＢでコートしたキャピラリでヌクレオチドの混合物を分析した結果を図７に示す。図７の分析条件は図６と同じである。

又、各種キャピラリの安定性を比較した結果を図８に示す。ここで、ケイ酸ポリブレンコートキャピラリとＳＭＩＬＥコートキャピラリの分析条件は、キャピラリ全長３８．５ｃｍ、有効長３０ｃｍ、分離溶液：５０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ８．５、印加電圧−１５ｋＶ、検出２００ｎｍ、ＥＯＦマーカー：ホルムアミド、分析毎に分離溶液で３分間（９３０ｍbar）洗浄であり、ポリマーＢコートキャピラリとポリマーＣコートキャピラリの分析条件は、キャピラリ全長５８．５ｃｍ、有効長５０ｃｍ、分離溶液：５０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ７．４、印加電圧−３０ｋＶ、検出２１４ｎｍ、ＥＯＦマーカー：トリメシン酸、分析毎に分離溶液で３分間（９３０ｍbar）洗浄である。

又、マーカー移動度μmarkerと劣化率は、次式で算出した。
μmarker＝ＩＬ／Ｖｔ …（１）
ここで、Ｉ：有効長、Ｌ：全長、Ｖ：印加電圧、ｔ：移動時間
劣化率＝(｜(μmarker_initial−μmarker_runX)｜/μmarker_initial)×100% …（２）

本発明に係るキャピラリの劣化率が非常に少なく、安定性に優れていることがわかる。

又、有機溶媒に対する耐久性を図９に示す。分析条件は、キャピラリ全長５８．５ｃｍ、有効長５０ｃｍ、内径５０μｍ、分離溶液：５０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ７．４、印加電圧−３０ｋＶ、ＥＯＦマーカー：トリメシン酸である。

更に、ポリマーＢでコートしたキャピラリでアニオンとヌクレオチドの混合物を分析した結果を図１０に示す。分析条件は、キャピラリ長１００ｃｍ、分離溶液：５０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ７．４、印加電圧−３０ｋＶ、試料を５０ｍbarで３０秒注入であり、検出ピークは、１：イソクエン酸塩、２：クエン酸塩、３：グルコース１−リン酸、４：フルクトース６−リン酸、５：グルコース６−リン酸である。

従来、ＣＥ−ＭＳ法を用いたメタボローム解析においては、キャピラリへの吸着のため、リン酸化合物分析が、アニオン分析の条件ではできなかったため、別法を設定する必要があったが、本発明により、図１０に示す如く、ヌクレオチドであるリン酸化合物分析及びアニオン分析の同時測定が可能となる。又、Soga．et．al．，Anal Chem，2002，74，2233-2239で報告されているように、ＳＭＩＬＥコートキャピラリでは、吸着のため測定が不可能であったＣｏＡ、アセチルＣｏＡ、マロニルＣｏＡについても、ポリマーＢコートキャピラリで測定できることを確認した。更に、壁面と溶質間の相互作用が最小化されたことにより、分離効率自体の向上もみられた。

このように、ＣＥ−ＭＳ法を用いるメタボローム解析において、２種類行なわなければならなかった分析法を、本発明により、１条件での分析が可能となった。

なお、前記実施形態においては、本発明が内壁コートキャピラリに適用されていたが、本発明の適用対象はこれに限定されず、ビーカーや実験装置等の吸着防止に用いることも可能である。

又、リン脂質ポリマーも、脂溶性を有する両性イオンのポリマーであれば、ＭＰＣとＢＭＡ又はＭＰＣとＳＭＡとの組合せに限定されない。

本発明に係る内壁コートキャピラリの実施形態の構成を示す断面図 同じく内壁表面の一部を拡大して示す斜視図 本発明による内壁コートキャピラリの製造手順を示す流れ図 リン脂質ポリマーの種類を示す図 本発明に係るポリマーＢコートキャピラリでアニオン混合物を分析した結果を示す図 同じくヌクレオチド混合物を分析した結果を示す図 同じくポリマーＣコートキャピラリでヌクレオチド混合物を分析した結果を示す図 内壁コートキャピラリの安定性を比較して示す図 有機溶媒に対する耐久性を比較して示す図 本発明に係るポリマーＢコートキャピラリでアニオンとヌクレオチドの混合物を分析した結果を示す図

符号の説明

１０…キャピラリ
１２…ホスホリルコリン基（リン酸基）
１４…ポリメタクリロイル基
１６…アルキル基

Claims (8)

1. 脂溶性を有する両性イオンのポリマーを用いて、リン酸化合物の吸着を防止することを特徴とする吸着防止方法。
2. 前記ポリマーが、リン脂質ポリマーであることを特徴とする請求項１に記載の吸着防止方法。
3. 前記リン脂質ポリマーが、ＭＰＣとＳＭＡ又はＢＭＡを組合せた物であることを特徴とする請求項２に記載の吸着防止方法。
4. 請求項１乃至３のいずれかに記載のポリマーを含むことを特徴とする吸着防止材。
5. 請求項１乃至３のいずれかに記載のポリマーが、イオン的相互作用で壁面に固定化されていることを特徴とする内壁コートキャピラリ。
6. 前記壁面にシラノールが含まれることを特徴とする請求項５に記載の内壁コートキャピラリ。
7. キャピラリ内に請求項１乃至３のいずれかに記載のポリマーを含む高分子溶液を流すことを特徴とする請求項５又は６に記載の内壁コートキャピラリの製造方法。
8. 請求項５又は６に記載の内壁コートキャピラリを用いることを特徴とするリン酸化合物とアニオンの同時分析方法。