JP2009175095A - 測定装置及び測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】蛍光物質の濃度が少ないような試料の測定でも、蛍光強度を増加する測定装置を提供する。
【解決手段】本発明は、試料中に入射した励起光によって、該試料中で発生する励起光と異なる波長の光を測定する測定装置２００であって、励起光の波長の光を含む光を照射する光源２０１と、光源２０１から照射された光を所定の集光位置に集光させる対物レンズ２０３と、対物レンズ２０３からの光を直接反射する第１ミラー２２１と、開口Ｐが設けられると共に、第１ミラー２２１によって反射された光を反射する第２ミラー２２２と、試料中で発生する励起光と異なる波長の光を測定する測定器２０５と、を有し、第１ミラー２２１と第２ミラー２２２は試料を挟むようにして配置されると共に、対物レンズ２０３の集光位置を開口Ｐの位置に設定し、測定器２０５は該試料中で発生し開口Ｐを通過した励起光と異なる波長の光を測定することを特徴とする。
【選択図】 図２

Description

本発明は、微小試料の蛍光測定装置に関し、より具体的には、マイクロチップなどの微小な蛍光スポットを効率的に測定可能とする測定装置及び測定方法に関する。

従来利用されてきた測定装置を小型化し、極微量の液体試薬を反応させるＬＯＣ（Ｌａｂ． ｏｎ a ｃｈｉｐ／ラボオンアチップ）の技術に関する検討が進んでいる。このＬＯＣでは、例えば血液などの試料の量を微量にするために、１０ｃｍから数ｃｍ角程度以下のプラスチック製やガラス製やシリコン製のチップの表面に溝を形成する。そして、その溝中に試薬溶液や試料を流して分離、 反応を行って、微量試料の分析を行う。この技術においては、試料の量、 検出に必要な試薬量、検出に用いた消耗品等の廃棄物、廃液の量がいずれも少なくなる上、検出に必要な時間も短時間で済むという利点がある。

上記のようなＬＯＣ技術で用いられる測定装置としては、基板（マイクロアレイ）に励起光スポットを照射して、前記微量試料からの蛍光を検出する測定装置が知られている（例えば、特開２００７−７８５７４号公報など）。
特開２００７−７８５７４号公報

しかしながら、特許文献１に記載の測定装置では、照射された励起光は、一点に集光するため、試料が発する微弱な光を観測することが困難であるという問題点がある。

本発明は、上記の問題点を鑑みてなされたものであり、試料が発する微弱な光を観測することができる測定装置および測定方法を提供することを目的とする。

本発明は上記のような課題を解決するためのものであり、測定装置において、励起光を照射する光源と、対物レンズと、第１ミラーと、第２ミラーと、測定器と、を有し、該対物レンズと、該第１ミラーと、の間に、該第２ミラーが配置され、該第１ミラーのミラー面と、該第２ミラーのミラー面と、が対向して配置され、該第１ミラーは、該第２ミラーの側に曲率中心を有する曲面であり、該第１ミラーの曲率中心が、該対物レンズの光軸上に位置し、該第２ミラーは、該光軸が通過する位置に開口を有し、該開口の位置が該対物レンズの焦点距離と一致するように、該第２ミラーが配置されていることを特徴とする。

また、本発明は、試料中に入射した励起光によって、該試料中で発生する励起光と異なる波長の光を測定する測定装置であって、該励起光の波長の光を含む光を照射する光源と、該光源から照射された光を所定の集光位置に集光させる対物レンズと、該対物レンズからの光を反射する第１ミラーと、開口が設けられると共に、該第１ミラーによって反射された光を反射する第２ミラーと、該試料中で発生する励起光と異なる波長の光を測定する測定器と、を有し、該第１ミラーと該第２ミラーとの間に該試料が配置されると共に、該対物レンズの集光位置を該開口の位置に設定し、該測定器は該試料中で発生し該開口を通過した励起光と異なる波長の光を測定することを特徴とする。

また、本発明は、試料中に入射した励起光によって、該試料中で発生する励起光と異なる波長の光を測定する測定装置であって、該励起光の波長の光を含む光を照射する光源と、該光源から照射された光を所定の集光位置に集光させる対物レンズと、該対物レンズからの光を反射する第１ミラーと、開口が設けられると共に、該第１ミラーによって反射された光を反射する第２ミラーと、少なくとも該試料中で発生する励起光と異なる波長の光を集光する集光レンズと、該試料中で発生する励起光と異なる波長の光を測定する測定器と、該測定器に光が入射される直前に配置され励起光をカットする励起光カットフィルターと、を有し、該第１ミラーと該第２ミラーとの間に該試料が配置され、該対物レンズの集光位置を該開口の位置に設定し、励起光が集光する位置と該測定器とが共役位置関係となるように該集光レンズを配置し、該測定器は該試料中で発生した励起光と異なる波長の光を測定することを特徴とする。

また、本発明は、上記の測定装置において、該第２ミラーはダイクロイックミラーであることが好ましい。

また、本発明は、上記の測定装置において、該第１ミラーと該第２ミラーとの間の空気換算長をＬ、該第１ミラーの焦点距離をｆとすると、ｆ＜Ｌであることが好ましい。

また、本発明は、上記の測定装置において、該第１ミラーと該第２ミラーとの間の空気換算長をＬ、該第１ミラーの焦点距離をｆとすると、ｆ＜Ｌ／２であることが好ましい。

また、本発明は、上記の測定装置において、該第２ミラーの反射面が曲面であることが好ましい。

また、本発明は、測定方法において、上記の測定装置を配置し、該光軸と、該第１ミラーと、の交点から、該光軸上で、かつ、該交点より該第２ミラー側に、Ｌｆ／（Ｌ−ｆ）の距離離れた位置に試料を配置し、該試料が発する光を測定することが好ましい。

ここで、Ｌは、該第１ミラーと、該第２ミラーと、の間の空気換算長
ｆは、該第１ミラーの焦点距離である。

また、本発明は、上記の測定方法において、該光軸上で、かつ、該交点より該第２ミラー側であって、かつ、下記の条件を満たす全てのＸの位置に試料を配置することが好ましい。
Ｌ−（Ｌ²−２ｆＬ）^1/2≦ Ｘ ≦ Ｌｆ／（Ｌ−ｆ）
ここで、Ｘは、該交点からの距離
Ｌは、該第１ミラーと、該第２ミラーと、の間の空気換算長
ｆは、該第１ミラーの焦点距離である。

また、本発明は、上記の測定装置を用いた測定方法において、該測定器によって該試料中で発生した励起光と異なる波長の光を測定したとき、該測定器で測定できる輝度の限界を超えた場合には、調整を行うことが好ましい。

また、本発明は、上記の測定方法において、該調整とは、測定光路中にＮＤフィルターを設けることか、該光源の出力が可変の場合には該光源の出力を下げることか、該測定器のゲインを下げることか、該測定器の露出時間を短くすることか、のいずれかであることが好ましい。

また、本発明は、試料中に入射させた励起光によって、該試料中で発生する励起光と異なる波長の光を測定する測定方法であって、第１ミラーを配置し、該第１ミラー上に該試料を内包するマイクロチップを配置し、開口を有するとともに、該マイクロチップ上に該第１ミラーによって反射された光を反射する第２ミラーを配置し、励起光を照射する光源からの光を対物レンズによって該開口に集光させて該マイクロチップ内に励起光を入射させ、該マイクロチップに内包された該試料から放射される励起光と異なる波長の光を測定することを特徴とする。

また、本発明は、上記の測定方法において、該第１ミラーと該第２ミラーとの間の空気換算長をＬ、該第１ミラーの焦点距離をｆとすると、ｆ＜Ｌであることが好ましい。

また、本発明は、上記の測定方法において、該第１ミラーと該第２ミラーとの間の空気換算長をＬ、該第１ミラーの焦点距離をｆとすると、
ｆ＜Ｌ／２であることが好ましい。

また、本発明は、上記の測定方法において、該マイクロチップを厚さＬ１、屈折率ｎ１の第１基板と、厚さＬ３、屈折率ｎ３の第２基板と、該第１基板と該第２基板との間の距離がＬ２であって、屈折率ｎ２の試料を内包する空間と、から構成し、該第１ミラーと該第２基板との間の距離がＬ４であって、屈折率ｎ４の媒質で満たし、該第１ミラーの焦点距離をｆとすると、
Ｌ３／ｎ３＋Ｌ４／ｎ４＜Ｌｆ／（Ｌ−ｆ）＜Ｌ２／ｎ２＋Ｌ３／ｎ３＋Ｌ４／ｎ４
ただし、空気換算長Ｌ＝Ｌ１／ｎ１＋Ｌ２／ｎ２＋Ｌ３／ｎ３＋Ｌ４／ｎ４
を満たすように設定することが好ましい。

また、本発明は、上記の測定方法において、該マイクロチップを、厚さＬ１、屈折率ｎ１の第１基板と、厚さＬ３、屈折率ｎ３の第２基板と、該第１基板と該第２基板との間の距離がＬ２であって、屈折率ｎ２の試料を内包する空間と、から構成し、該第１ミラーと該第２基板との間の距離がＬ４であって、屈折率ｎ４の媒質で満たし、該第１ミラーの焦点距離をｆとすると、
Ｌ３／ｎ３＋Ｌ４／ｎ４＜Ｌ−（Ｌ²−２ｆＬ）^1/2＜Ｌ２／ｎ２＋Ｌ３／ｎ３＋Ｌ４／ｎ４
ただし、空気換算長Ｌ＝Ｌ１／ｎ１＋Ｌ２／ｎ２＋Ｌ３／ｎ３＋Ｌ４／ｎ４
を満たすように設定することが好ましい。

本発明の測定装置及び測定方法によれば、試料が発する微弱な光を観測することができる。

以下、本発明の実施の形態を、図面を参照しつつ説明する。図１は本実施の形態に係る測定装置に用いるマイクロチップを示す図である。図１（ａ）はマイクロチップの上面図であり、流路も併せて示してある。また、図１（ｂ）は、図１（ａ）中Ａ−Ａ’の断面を模式的に示す図である。

マイクロチップ１００は、第１基板１３１と第２基板１３２とで構成されている。第１基板１３１と第２基板１３２は、張り合わせた状態となっている。

第１基板１３１には、第１液導入口１１１と、第２液導入口１１２と、排出口１１５と、が形成されている。

第２基板１３２には、第１流路１２１、第２流路１２２及び第３流路１２３が形成される。これらの流路の一端は互いに連結され、これにより流路全体の形状はほぼＹ字型となる。第１流路１２１の他端部は、第１液を導入する第１液導入口１１１に連結している。また、第２流路１２２の他端部は、第２液を導入する第２液導入口１１２に連結している。そして、第３流路１２３内の混合部で、第１液と第２液とが混合される。第３流路１２３中にある検出部１１３には、空間Ｒが設けられている。この空間Ｒが、測定装置における測定対象となる空間となる。第３流路１２３の他端部は、排出口１１５に連結している。排出口１１５からは、混合された第１液と第２液とが排出される。

第１の基板および第２の基板は、樹脂材料をシリコンの型から射出成型して作製することができる。樹脂材料としては、例えば、ポリスチレン（ＰＳ）やアクリルレジン（ＰＭＭＡ）などがある。

また、マイクロチップ１００は、半導体の加工技術を応用して作製することができる。例えば、シリコン等の基板上に流路なる溝を、異方性エッチング等の微細加工技術を用いて形成する。その後、この溝を覆う蓋体を基板上に接合すればよい。また、マイクロチップ１００の作製方法としては、ガラス基板から作製する手法も知られている。

マイクロチップ１００の形状の一例を挙げると、外形寸法は、例えば約８０ｍｍ×６０ｍｍ×２．５ｍｍである。流路の幅は約０．５ｍｍ、また、流路の深さは約１ｍｍである。

このようなマイクロチップ１００では、例えば、第１液導入口１１１に検体（試料）、第２液導入口１１２に試薬が導入される。この検体（試料）と試薬を、合流点で合流させる。混合液は、第３流路１２３内で混合し、所定の化学反応が起きる。この所定の化学反応は空間Ｒで測定装置によって観察される。

例えば、マイクロチップ１００を免疫学的検査に用いた場合、発光や蛍光を発する標識抗体（蛍光物質）を検体に添加する。このようにすることで、抗原抗体反応を利用した検査を行うことができる。検査では、励起光を空間Ｒに照射し、その際に発生する蛍光量もしくは発光量を光測定器で測定する。例えば、フルオレシンの結合した標識抗体を用いた場合、４９５ｎｍの励起光を照射すると、５１５ｎｍ付近の蛍光が出る。

次に、マイクロチップ１００を用いて、検液中の蛍光物質が発光する蛍光の強度を測定する蛍光測定を例に本実施の形態に係る測定装置について説明する。
（第１の実施の形態）
図２は本実施の形態に係る測定装置の検出部（空間Ｒ）の断面図を含む測定光学系の概略を模式的に示す図である。図２に記載の測定装置２００は、マイクロチップ１００がセットされている。そして、測定装置２００は、マイクロチップ１００における空間Ｒを観察する。

測定装置２００は、光源２０１と、コリメートレンズ２０２と、対物レンズ２０３と、集光レンズ２０４と、測定器２０５と、蛍光ユニット２１０と、励起光選択フィルター２１１と、ダイクロイックミラー２１２と、測定光選択フィルター２１３と、第１ミラー２２１と、第２ミラー２２２と、を備えている。

光源２０１は、励起光の波長の光を含む光を発する。光源２０１には、ハロゲンランプ、水銀ランプ、レーザー、レーザーダイオード、またはＬＥＤ等を用いることができる。

コリメートレンズ２０２は、光源２０１が発する光を平行にする。なお、光源２０１から射出される光が平行光の場合、コリメートレンズ２０２は省略することができる。

蛍光ユニット２１０は、励起光選択フィルター２１１と、ダイクロイックミラー２１２と、測定光選択フィルター２１３と、から構成される。蛍光ユニット２１０は、励起光と蛍光を分離する。

励起光選択フィルター２１１は、空間Ｒを通過する光の波長を選択する。具体的には、測定対象に対して最適な波長を選択的に透過する。最適な波長とは、マイクロチップ１００内に導入される蛍光物質を励起する励起波長である。

ダイクロイックミラー２１２は、励起光選択フィルター２１１を透過した励起光を所定の方向に反射し、かつ、測定対象から発生する蛍光を選択的に透過する。

測定光選択フィルター２１３は、励起光の波長は透過せず（すなわち、励起光の波長が透過することを制限する）測定対象から発生する蛍光の波長を透過する。

対物レンズ２０３は、蛍光ユニット２１０で分離された励起光を集光するとともに、測定対象から発生する蛍光を集光する。

集光レンズ２０４は、測定光選択フィルター２１３を透過した蛍光を、測定器２０５に集光する。

測定器２０５は、集光レンズ２０４によって、集光された蛍光を測定する。測定器２０５には、フォトダイオードやフォトマルチプライヤーを用いることができる。

第１ミラー２２１は、対物レンズ２０３の側（第２ミラー２２２の側）に曲率中心を有する曲面（凹面鏡）である。第１ミラー２２１の曲率中心は、対物レンズ２０３の光軸上に位置する。第１ミラー２２１の焦点距離はｆである。

第２ミラー２２２は平面ミラーであり、かつ、対物レンズ２０３の光軸に対して、垂直に配置される。また、第２ミラー２２２は、対物レンズ２０３と、第１ミラー２２１との間に配置される。第２ミラー２２２のミラー面は、第１ミラー２２１のミラー面と、対向している。第２ミラー２２２は、対物レンズ２０３の集光位置に開口Ｐを有する。より具体的には、対物レンズ２０３の集光位置は、第２ミラー２２２のミラー面上に位置する。

マイクロチップ１００の空間Ｒは、第１ミラー２２１と第２ミラー２２２との間に配置される。

光源２０１からの励起光は、コリメートレンズ２０２、励起光選択フィルター２１１、ダイクロイックミラー２１２、対物レンズ２０３、および開口Pの順に入射する。

開口Ｐを抜けた励起光は、マイクロチップ１００を通過した後、第１ミラー２２１で反射される。第１ミラー２２１を反射した励起光は、空間Ｒ内で集光する。

励起光の一部は、空間Ｒ内で吸収され蛍光に変換される。空間Ｒで吸収されない励起光は、マイクロチップ１００を通過した後、第２ミラー２２２で反射される。第２ミラー２２２で反射された励起光は、再び第１ミラー２２１で反射される。そして、第１ミラー２２１で反射された励起光は、再び、空間Ｒ内で集光する。

このように、励起光は、第１ミラー２２１および第２ミラー２２２によって、複数回繰り返して反射される。そして、空間Ｒ内の複数の点で集光する。

空間Ｒ内で発生した蛍光は、開口P、対物レンズ２０３、蛍光ユニット２１０、集光レンズ２０４、および測定器２０５の順に入射する。

このように、マイクロチップ１００内の検体（試料）に励起光を照射することによって、検体（試料）中の蛍光物質により蛍光が発生する。発生した蛍光は、蛍光ユニット２１０を経由し、測定器２０５にて受光される。なお、第１ミラー２２１を反射後、開口Ｐを抜けた励起光は、測定光選択フィルター２１３で遮断されるため、測定器２０５には入射しない。

本実施の形態によれば、開口Ｐは、対物レンズ２０３の集光位置に配置されているため、対物レンズ２０３で集光した励起光は、第２ミラー２２２の開口Ｐをロスすることなく通過できる。また、開口Ｐは、対物レンズ２０３の集光位置に配置されているため、小さく形成することができる。このため、第１ミラー２２１で反射した励起光のうち、第２ミラー２２２の開口Ｐを抜ける励起光の光量を少なくすることができる。さらに、第２ミラー２２２の開口Ｐを透過した蛍光も、効率よく対物レンズ２０３で集光される。そのため、微弱な蛍光を効率よく励起・検出することができるのである。

以下、開口Pを通ってマイクロチップ１００内に入射する励起光について、より具体的に説明する。

図３は、本実施の形態に係る測定装置２００の第１ミラー２２１および第２ミラー２２２近傍（マイクロチップ１００の検出部１１３近傍）における寸法を示す図である。上記と同じ部材には、同じ符号が用いられている。符号Ｏは、対物レンズ２０３の集光位置である。符号Ｑは、対物レンズ２０３の光軸と第１ミラー２２１（ミラー面）との交点である。

第１基板１３１は、厚さがＬ１で、屈折率ｎ１の物質で形成されている。第１基板１３１の第１ミラー２２１側の面と第２基板１３２の第２ミラー２２２側の面との間の距離はＬ２（空間Ｒの上下方向の距離）である。測定する際には、第１基板１３１と第２基板１３２との間は、屈折率がｎ２の試料で満たされている。第２基板１３２は厚さがＬ３で、屈折率ｎ３の物質で形成されている。第２基板１３２の第１ミラー２２１側の面と点Ｑとの間の距離はＬ４である。第２基板１３２と第１ミラー２２１との間は、屈折率ｎ４の媒質で満たされている。例えば、第２基板１３２と第１ミラー２２１との間の媒質が空気の場合、ｎ４＝１である。

また、Ｌ１からＬ４の距離は、第１ミラー２２１の最凹部（点Ｑ）の面の高さを０とし、上方（第２ミラー２２２側）を正の方向としたｘ軸によって表す。

試料としては、水溶液などの流動体であることが好ましい。

ここで、上述したように、開口Ｐを抜けた励起光は、マイクロチップ１００を通過した後、第１ミラー２２１で反射される。第１ミラー２２１を反射された励起光は、空間Ｒのａ₁に集光する。この集光点ａ₁において、試料中の蛍光物質が蛍光を発する。さらに、ａ₁で集光した光は、第２ミラー２２２で反射されて第１ミラー２２１に到達する。ここで、第１ミラー２２１に到達した励起光は、再び反射して位置ａ₂で集光する。すなわち、励起光は、位置ａ₂でも蛍光を発生させる。ここで、位置ａ₂はａ₁より点Ｑ側に位置する。

このように、開口Ｐから入射した励起光は、第１ミラー２２１と第２ミラー２２２とによって複数回反射される。ここで、マイクロチップ１００は、第１ミラー２２１と第２ミラー２２２との間に配置される。そのため、励起光は、マイクロチップ１００が内包する空間Ｒ内で位置を変えながら集光する。よって、この空間Ｒに試料が存在する場合、試料には励起光が複数回照射されることになる。

このように、本実施の形態に係る測定装置２００によれば、試料の複数の点で蛍光を発生させることができる。これにより、微弱な光（蛍光）を観測することができる。また、複数の点で蛍光が発生するため、蛍光物質の濃度が少ない試料の測定でも、蛍光強度が増加し、蛍光Ｓ／Ｎ値を高くすることが可能となる。また、蛍光の強度が強くなる分、１回の測定時間を短縮することができる。

また、上記のように、励起光が試料中を複数回集光することにより、試料は励起光により複数回励起されるため、蛍光を効率よく励起することができる。そして、励起光の集光位置は、ａ₁、ａ₂・・・・のように光軸上で異なるため、言わば多点検出を行っている状態となる。すなわち、上記のように多点検出しているため、試料中で濃度ムラや濃度勾配があったとしても、測定において前記ムラや勾配の影響を少なくすることができる。

次に、第１ミラー２２１と第２ミラー２２２との間の透過光路図によって集光条件について説明する。図４は本実施の形態に係る測定装置２００の検出部１１３の断面の透過光路図を示す図である。図４において、Ｏ＝Ｏ’＝Ｏ’’・・は、第２ミラー２２２の開口Ｐの位置を意味する。また、ｆは、第１ミラー２２１の焦点距離を意味する。また、Ｌは、第１基板１３１の第２ミラー２２２側の面と、点Ｑと、の距離の空気換算長である。すなわち、
Ｌ＝Ｌ１／ｎ１＋Ｌ２／ｎ２＋Ｌ３／ｎ３＋Ｌ４／ｎ４ （１）
である。また、ａ_nはｎ回目の集光位置を示す。また、縦の両矢印が第１ミラー２２１を示している。

図４（ａ）は、（２−√２）Ｌ＜ｆ＜Ｌの場合（第１のケース）を示す図である。図４（ｂ）は、Ｌ＝（２−√２）Ｌの場合（第２のケース）を示す図であり、図４（ｃ）は、Ｌ／２＜ｆ＜（２−√２）Ｌの場合（第３のケース）を示す図である。図４（ｄ）は、Ｌ／２＝ｆの場合（第４のケース）を示す図である。図４（e）は、０＜ｆ＜Ｌ／２の場合（第５のケース）を示す図である。

なお、ｆ＜Ｌである条件を満たすときにのみ、第１ミラー２２１で反射した励起光は、収斂光となる。従って、このとき励起光は集光するため、試料の微弱な蛍光を効率よく励起することができる。

理由を以下説明する。第２ミラー２２２の開口Ｐを光源とし、第１ミラー２２１で反射した励起光が集光する位置と、点Qとの距離をａ₁とすると、ニュートンの結像方程式から、
ａ₁＝Ｌｆ／（Ｌ−ｆ） （２）
となる。

上記条件ｆ＜Ｌを満たすときａ₁＞０になる。このことは、第２ミラー２２２の開口を通った励起光は、第１ミラー２２１で反射した収斂光となることを意味する。

以下、ケース毎に図４の透過光路図を参照しつつ説明する。
（２−√２）Ｌ＜ｆ＜Ｌの場合：（第１のケース）
開口Ｐにおける集光位置Ｏから出た光は、Ｌの距離離れた第１ミラー２２１で反射する。第１ミラー２２１で反射した光は、第２ミラー２２２で反射する。このとき、反射位置は図のＯ’である。第２ミラー２２２で反射した光は図のａ₁で集光する。次に、ａ₁で集光した光は、再度第１ミラー２２１で反射する。第１ミラー２２１で反射した光は発散する。
ｆ＝（２−√２）Ｌの場合：（第２のケース）
開口Ｐにおける集光位置Ｏから出た光は、Ｌの距離離れた第１ミラー２２１で反射する。第１ミラー２２１で反射した光は、第２ミラー２２２で反射する。このとき、反射位置は図のＯ’である。第２ミラー２２２で反射した光は図のａ₁で集光する。次に、ａ₁で集光した光は、再度第１ミラー２２１で反射する。第１ミラー２２１で反射した光は、平行光となる。そして、再度、第２ミラー２２２で反射する。このとき、反射位置はＯ’’である。第２ミラー２２２で反射した光は、第１ミラー２２１に反射された後に、ａ₂で集光する。そして、第２ミラー２２２、第１ミラー２２１を順に反射した光は、開口位置Ｏ’’’’に集光するため、第２ミラー２２２の開口から外に出る。
Ｌ／２＜ｆ＜（２−√２）Ｌの場合：（第３のケース）
開口Ｐにおける集光位置Ｏから出た光は、Ｌの距離離れた第１ミラー２２１で反射する。第１ミラー２２１で反射した光は、第２ミラー２２２で反射する。このとき、反射位置は図のＯ’である。第２ミラー２２２で反射した光は図のａ₁で集光する。次に、ａ₁で集光した光は、再度第１ミラー２２１で反射する。第１ミラー２２１で反射した光は、再度第２ミラー２２２で反射する。このとき、反射位置はＯ’’である。第２ミラー２２２で反射した光は、第１ミラー２２１に反射される。このように、第１ミラー２２１で反射された光は、次に第１ミラー２２１で反射されるまでの間に、集光しない。すなわち、第１ミラー２２１、第２ミラー２２２を反射した後に、集光した励起光は、再度集光するまでに、第１ミラー２２１を複数回繰り返して反射する必要がある。
Ｌ／２＝ｆの場合：（第４のケース）
開口Ｐにおける集光位置Ｏから出た光は、Ｌの距離離れた第１ミラー２２１で反射する。第１ミラー２２１で反射した光は、開口位置Ｏ’に集光するため、第２ミラー２２２の開口から外に出る。
０＜ｆ＜Ｌ／２の場合：（第５のケース）
開口Ｐにおける集光位置Ｏから出た光は、Ｌの距離離れた第１ミラー２２１で反射する。第１ミラー２２１で反射した光は、図のａ₁で集光する。ａ₁で集光した光は、第２ミラー２２２で反射する。このとき、反射位置は図のＯ’である。第２ミラー２２２で反射した光は、再度第１ミラー２２１で反射する。第１ミラー２２１で反射した光は、図のａ₂で集光する。ａ₂で集光した光は、再度第２ミラー２２２で反射する。このとき、反射位置は図のＯ’’である。第２ミラー２２２で反射した光は、再度第１ミラー２２１で反射する。これを繰り返す。

ここで、ａ₁からＯ’までの距離よりも、ａ₂からＯ’’までの距離の方が長い。同様に、ａ₂からＯ’’までの距離よりも、ａ₃からＯ’’’までの距離の方が長い。

以上の透過光路図からも分かるとおり、特に０＜ｆ＜Ｌ／２の条件を満たすときには、第２ミラー２２２の開口を通った励起光は、第１ミラー２２１で反射した後、第２ミラー２２２に届く前に集光する。また、当該励起光は、第１ミラー２２１と、第２ミラー２２２と、を繰り返し反射することで、複数の点で集光する。そのため、試料の微弱な蛍光を効率よく励起することができる。

０＜ｆ＜Ｌ／２の条件を満たすときには、励起光は、ａ₁、ａ₂・・・・のように光軸上で集光する。そして、励起光は、最終的には、所定の位置ａ∞に集光する。以下、０＜ｆ＜Ｌ／２のとき、励起光の集光位置が収束することを証明する。

図５は本実施の形態に係る測定装置２００で集光位置が収束することを説明する図である。図５（ａ）は、励起光の集光位置ａ₁、ａ₂・・・・を示す概念図である。図５（ｂ）は、集光位置ａ_n-1と集光位置ａ_nとの関係を示す透過光路図である。図５（ｃ）は、後述するｇ（ｋ）の解の特性を調べるための参照図である。

集光位置ａ_n-1と集光位置ａ_nとのニュートンの結像方程式によって、式（３）が成り立つ。

これをａ_nについて整理すると次式（４）のようになる。

ここで、ａ_nの一般項をもとめるために、特性方程式（５）をたてる。

特性方程式（５）の解は、次式（６）となる。

ここで、新たに数列ｂｎを次式（７）の通り定義する。

すなわち、ａ_n-1では、下式のようになる。

（７）式、（８）式を（４）式に代入することによって、

を得ることができる。式（９）の逆数をとることにより次の式（１０）を得ることができる。

ここで、さらに数列ｃ_nを次式（１１）により定義すると、式（１０）は式（１２）のようにかくことができる。

ここで、ｃ_nの数列の一般項を求めるために、下式（１３）を満たすαを求める。

式（１２）と式（１３）により、αは式（１４）によって表すことができる。

式（１３）を用いることによって、式（１５）を得ることができる。

すなわち、ｃ_nの一般項は式（１６）のように表現することができる。

ｂ_nの一般項は式（１７）のように表すことができ、

さらに、ａ_nの一般項は式（１８）のように表すことができる。

ここで、ｃ₁は式（１９）となる。

次に、ａ_nの一般項である式（１８）が収束することを確認するために、式（２０）が成立することを証明する。

式（２０）を式（２１）のように書き換えて、両辺を二乗すると、

式（２１）は、「式（２２）かつ式（２３）」と同値となる。

式（２２）をｋについて解くと式（２４）のようになる。

ここで、ｋの関数ｇ（ｋ）を式（２５）によって定義する。

すなわち、ｇ（ｋ）＝０の解が、ｋであることを意味する。
式（２４）の判別式Ｄは式（２６）となる。

ここで、Ｌ＞０かつ０＜ｆ＜Ｌ／２であるので、Ｄ＞０となる。すなわち、ｇ（ｋ）＝０を満たす解は２つあることが分かる。
ここで、式（２５）を式（２７）のように変形する。

ここで、ｆ＜Ｌであるので、関数ｇ（ｋ）の軸は、正である。
また、ｇ（０）を求めると、式（２８）のようになる。

図５（ｃ）は、ｙ＝ｇ（ｋ）をｋ−ｙ平面に表したものである。すなわち、関数ｇ（ｋ）は、下に凸の関数であり、かつ、軸が正であり、かつ、ｇ（０）が正であるため、ｇ（ｋ）＝０を満たす解は、いずれも正である。従って、式（２０）は真である。

式（１８）の第１項の分母の第１項右かっこ内は、式（２９）に示すように１より大きくなる。何故なら、式（２０）が真であるからである。

よって、ｎ→∞となると、式（１８）の第1項目は０に収束するので、結局、式（１８）はｎ→∞では式（３０）に収束する。

また、式（１８）により、ａ_n-1＞ａ_nが成り立つ。

以上に示すように、０＜ｆ＜Ｌ／２の条件を満たすときには、ａ_n-1＞ａ_nを満たし、かつ、励起光の集光位置はａ₁、ａ₂・・・・のように同一光軸上で集光する。そして、ａ∞のとき式（３０）によって表される位置に集光する。従って、励起光の集光位置は、単調に収束する。

すなわち、マイクロチップ１００中の空間Ｒに存在する試料に対して、第１ミラー２２１と第２ミラー２２２との間の反射によって、励起光が試料中を複数回（無限回）集光する。

これにより、試料は励起光により複数回（無限回）励起され、微弱な光（蛍光など）を観測することができる。また、励起光の集光位置は、ａ₁、ａ₂・・・・のように同一光軸上で異なるため、言わば多点検出を行っていることを意味する。

従って、試料中で濃度ムラや濃度勾配があったとしても、微弱な光の多点検出を行っているため、測定において前記ムラや勾配の影響を少なくすることができる。

次に、ｆ＜Ｌ／２を満たす場合における、励起光の集光位置ａ₁、ａ₂・・・・のシミュレーション結果を説明する。図９は本実施の形態に係る測定装置２００における励起光の集光位置の計算結果を示す図である。図９（ａ）は各部材の位置、材質（媒質）、材質（媒質）の間隔、屈折率、空気換算長を示すものである。図９（ｂ）は、第１ミラー２２１の焦点距離を示すものである。図９（ｃ）は励起光の集光位置ａ₁、ａ₂・・・・のシミュレーション結果を示す。

図９（ａ）に示すようにマイクロチップ１００の第１基板１３１は厚さＬ１＝０．５ｍｍ、屈折率ｎ１＝１．５９のＰＳ（ポリスチレン）である。従って、空気換算長は、０．３１４ｍｍである。

また、空間Ｒ中は、屈折率がｎ２＝１．３３の試料が満たされている。そして、第１基板１３１の第１ミラー２２１側の面と、第２基板１３２の第２ミラー２２２側の面と、の間の距離Ｌ２＝１．００ｍｍである。従って、空気換算長は、０．７５２ｍｍである。

また、第２基板１３２は、厚さＬ３＝１．０ｍｍ、屈折率ｎ３＝１．５９のＰＳ（ポリスチレン）である。従って、空気換算長は、０．６２９ｍｍである。

第２基板１３２の第１ミラー２２１側の面と、点Ｑと、の距離は、Ｌ４＝１．０ｍｍ、屈折率ｎ４＝１の空気が存在する。従って、空気換算長は、１ｍｍである。

また、第２ミラー２２２および第１基板１３１は、密着している。また、このとき、第１ミラー２２１と第２ミラー２２２との間（第１基板１３１の第２ミラー２２２側の面と、点Ｑと、の距離）の空気換算長Ｌは、２．６９５ｍｍとなる。

また、図９（ｂ）に示すように、第１ミラー２２１の焦点距離ｆ＝１．２１３は、空気換算長Ｌの０．４５倍に設定したので、ｆ＜Ｌ／２を満足している。

以上のような条件で、集光位置を計算すると図９（ｃ）のようになる。図９（ｃ）に示すように集光位置は、ａ₁＝２．２０５ｍｍ、ａ₂＝１．９５９ｍｍ・・・と漸減し、ａ∞＝１．８４３ｍｍに収束する。このようなシミュレーション結果は、先ほどの式（３０）の結果とも合致している。

次に、マイクロチップ１００の材質や試料の種類などを考慮したときの条件について説明する。

本実施の形態では、試料は、光軸上で、かつ、点Ｑより第２ミラー２２２側であって、点ＱからＬｆ／（Ｌ−ｆ）の距離離れた位置に配置する必要がある。すなわち、少なくともａ₁の位置に、試料が配置されていることが必要である。これにより、試料は励起光により複数回（無限回）励起され、微弱な光（蛍光など）を観測することができる。従って、微弱な光を観測することができる。

また、上述した通り、励起光の集光位置ａ₁、ａ₂・・・について、ａ₁＞ａ_n＞ａ∞＝Ｌ−（Ｌ²−２ｆＬ）^1/2が成り立つ。このため、試料は、光軸上で、かつ、点Ｑより第２ミラー２２２側であって、点Ｑからの距離がａ∞からａ₁の全ての範囲に渡って、存在することが好ましい。これにより、試料は励起光により複数回（無限回）励起され、微弱な光（蛍光など）を観測することができる。従って、微弱な光を観測することができる。

また、本実施の形態は、次式（３１）の条件を満足することが好ましい。

式（３１）の条件を満たすとき、開口Ｐから入射した励起光は、第１ミラー２２１で反射した後、流路内（試料内）で集光する。そのため、試料の微弱な蛍光を効率よく励起することができる。これにより、微弱な光を観測することができる。

また、本実施の形態は、次式（３１）を満足することが好ましい。

条件式（３２）を満足すると、励起光が、第１ミラー２２１、第２ミラー２２２の反射を繰り返すことで、励起光の集光位置は、すでに述べたように一点ａ∞に収束する。このとき、励起光は流路内（試料内）で無限回反射するため、試料の微弱な蛍光を効率よく励起することができる。これにより、微弱な光を観測することができる。

次に、本発明の他の実施の形態について説明する。
（第２の実施の形態）
図６は本実施の形態に係る測定装置３００の検出部１１３（空間Ｒ）の断面図を含む測定光学系の概略を模式的に示す図である。本実施の形態が先の図２に示す実施の形態と異なっている点は、第２ミラーである。すなわち、本実施の形態に係る測定装置３００では、第２ミラー２２３は、曲面である。その他の構成は、図２に示す実施の形態と同様である。図１と共通する部材については、同じ符号を用いている。

本実施の形態では、上記の実施の形態と同様の効果を奏する。

更に、本実施の形態では、第２ミラー２２３は、ミラー面が曲面であるため、第１ミラー２２１のパワーを第２ミラー２２３に分散させることができる。従って、第１ミラー２２１のパワーを小さくすることできるため、第１ミラー２２１の製造公差を緩くすることができる。
（第３の実施の形態）
また、図２に示す実施の形態における第２ミラー２２２、または、図６に示す第２ミラー２２３に代えて、ダイクロイックミラーを用いても良い。ダイクロイックミラーは、励起光を反射させ、かつ、蛍光を透過させる。

従って、本実施の形態によれば、第２ミラー（２２２、２２３）をダイクロイックミラーとすることで、励起光は、第１ミラー２２１と第２ミラー（２２２、２２３）との間に閉じこめられ、試料からの蛍光は測定器２０５側に透過する。これにより、測定器２０５は、より大きな測定信号を得ることができる。従って、本実施の形態によれば、微弱な光を観測することができる。

次に、さらに他の実施の形態について説明する。
（第４の実施の形態）
図７は本実施の形態に係る測定装置４００の検出部１１３（空間Ｒ）の断面図を含む測定光学系の概略を模式的に示す図である。

本実施の形態に係る測定装置４００は、光源２５１は、コリメートレンズ２５２と、対物レンズ２５３と、集光レンズ２５４と、測定光選択フィルター２６０と、測定器２６１と、を備えている。また、図２と同じ符号が付された構成は、図２に関連して説明した構成と同様であるので、異なる点のみ記載する。

光源２５１は、光源２０１と同様の光源である。

コリメートレンズ２５２は、光源２５１が発する光を平行にする。なお、光源２５１が、平行光を照射する場合、コリメートレンズ２５２は、省略することができる。

対物レンズ２５３は、コリメートレンズ２５２によって平行光にされた励起光を集光する。

集光レンズ２５４は、マイクロチップ１００内の蛍光を、測定器２６１に集光する。

測定光選択フィルター２６０は、励起光の波長は透過せず（すなわち、励起光の波長が透過することを制限する）、測定対象から発生する蛍光の波長を透過する。

測定器２６１は、集光レンズ２５４によって、集光された蛍光を測定する。測定器２６１には、フォトダイオードやフォトマルチプライヤーを用いることができる。また、測定器２６１は、励起光の光軸に対して、垂直の方向に配置されている。

第１ミラー２２１は、対物レンズ２５３の側（第２ミラー２２２の側）に曲率中心を有する曲面（凹面鏡）である。第１ミラー２２１の曲率中心が、対物レンズ２５３の光軸上に位置する。

第２ミラー２２２は、対物レンズ２５３の光軸に対して、垂直に配置される。また、第２ミラー２２２は、対物レンズ２５３と、第１ミラー２２１と、の間に配置される。第２ミラー２２２は、対物レンズ２５３の集光位置に開口Ｐを有する。

マイクロチップ１００は、側面に透明部１１６を備えている。

透明部１１６は、空間Ｒ内の光を外部に透過する。すなわち、透明部１１６は、内部光透過窓として用いられる。

本実施の形態では、光源２５１が照射した励起光は、コリメートレンズ２５２、対物レンズ２５３、開口Ｐの順に入射する。第１ミラー２２１と第２ミラー２２２による集光の原理は、先の実施の形態と同様である。

本実施の形態では、空間Ｒに存在する試料が発する蛍光は、透明部１１６、集光レンズ２５４、測定光選択フィルター２６０、および測定器２６１の順に入射する。そして、励起光集光点ａ∞と測定器２６１が共役位置関係となるように集光レンズ２５４を配置する。

本実施の形態では、先の実施の形態と同様の効果を備えると共に、試料からの蛍光が第２ミラー２２２でカットされることを防止する。これにより、測定器２６１は、微弱な光（測定信号）を検出することができる、という効果を奏する。

次に、前述した何れかの実施の形態の測定装置を用いて、試料が発する光を測定する方法について、図８を用いて説明する。

図８において、ステップＳ１００で測定が開始される。続いて、ステップＳ１０１に進み、測定装置（２００、３００、４００）にマイクロチップ１００をセットする。そして、第１液導入口１１１から第１液を導入する。また、第２液導入口１１２から第２液を導入する。第３流路１２３で、第１液および第２液を混合させ、空間Ｒに試料を導入する。ステップＳ１０２では、測定装置（２００、３００、４００）によって試料から放射される蛍光の測定を行う。

ステップＳ１０３では、測定された蛍光の輝度が、測定器（２０５、２６１）で測定可能な輝度の限界（上限値）を下回っているか否かが判定される。
ステップＳ１０３における判定の結果がＹＥＳであるときにはステップ１０５に進み、測定処理を終了とする。

ステップＳ１０３における判定の結果がＮＯであるときにはステップ１０４に進み、測定系における光量の調整を実行した後に、ステップＳ１０２で再度蛍光測定を実行する。

このように光量の調整を行いつつ、測定を実行することで、測定のダイナミックレンジを増大することができる。

ここで、光量の調整には、測定光路中にＮＤフィルターを設けるか、該光源の出力が可変の場合には該光源の出力を下げるか、該測定器のゲインを下げるか、該測定器の露出時間を短くするか、のいずれかを用いるか、或いは、任意の組み合わせを用いるかを適宜選択することができる。

以上、本実施の形態の測定装置及び測定方法によれば、空間Ｒに存在する試料に複数回（無限回）励起光を集光させることができる。従って、試料は励起光により複数回（無限回）励起されるため、微弱な光（蛍光など）を観測することができる。

また、蛍光物質の濃度が少ない試料を測定する場合であっても、蛍光強度を増加し、蛍光Ｓ／Ｎ値を高くすることが可能となる。また、蛍光の強度が強くなる分、１回の測定時間を短縮することができる。

また、上記のように励起光が試料中を複数回（無限回）集光することで、試料は励起光により複数回励起され、微弱な蛍光などの光を効率よく励起することができる。また、励起光の集光位置は光軸上で異なるため、言わば多点検出を行っている状態となる。すなわち、上記のような多点検出しているため、試料中で濃度ムラや濃度勾配があったとしても、測定において前記ムラや勾配の影響を少なくすることができる。

なお、本明細書においては、種々の実施の形態について説明したが、それぞれの実施の形態の構成を適宜組み合わせて構成された実施の形態も本発明の範疇となるものである。

例えば、対物レンズ（２０３、２５３）と、開口Ｐと、の間に、ミラーや他の光学部材を介する場合は、上記記載の「対物レンズの光軸」を、「光学的に開口Ｐの直前に配置された光学部材の光軸」と読み替える。

また、第２の実施の形態に記載の測定器を、第４の実施の形態と同様に、励起光の光軸に対して、垂直の方向に配置してもよい。

また、本発明の測定装置を免疫測定装置として用いた場合は、臨床検査医療において、血清中に含まれる腫瘍マーカー、各種ホルモン、感染症の病原体の抗体等の測定に用いられる。

本発明の実施の形態に係る測定装置に用いるマイクロチップを示す図である。 本発明の実施の形態に係る測定装置の検出部の断面図を含む測定光学系の概略を模式的に示す図である。 本発明の実施の形態に係る測定装置の検出部における寸法を示す図である。 本発明の実施の形態に係る測定装置の検出部の断面の透過光路図を示す図である。 本発明の実施の形態に係る測定装置で集光位置が収斂することを説明する図である。 本発明の他の実施の形態に係る測定装置の検出部の断面図を含む測定光学系の概略を模式的に示す図である。 本発明の他の実施の形態に係る測定装置の検出部の断面図を含む測定光学系の概略を模式的に示す図である。 本発明の実施の形態に係る測定装置を用いての測定フローを示す図である。 本発明の実施の形態に係る測定装置における励起光の集光位置の計算結果を示す図である。

符号の説明

１００・・・マイクロチップ、１１１・・・第１液導入口、１１２・・・第２液導入口、１１３・・・検出部、１１５・・・排出口、１１６・・・透明部、１２１・・・第１流路、１２２・・・第２流路、１２３・・・第３流路、１３１・・・第１基板、１３２・・・第２基板、２００・・・測定装置、２０１・・・光源、２０２・・・コリメートレンズ、２０３・・・対物レンズ、２０４・・・集光レンズ、２０５・・・測定器、２１０・・・蛍光ユニット、２１１・・・励起光選択フィルター、２１２・・・ダイクロイックミラー、２１３・・・測定光選択フィルター、２２１・・・第１ミラー、２２２・・・第２ミラー、２２３・・・第２ミラー、２５１・・・光源、２５２・・・コリメートレンズ、２５３・・・対物レンズ、２５４・・・集光レンズ、２６０・・・測定光選択フィルター、２６１・・・測定器、３００・・・測定装置、４００・・・測定装置

Claims (16)

1. 励起光を照射する光源と、対物レンズと、第１ミラーと、第２ミラーと、測定器と、を有し、
   該対物レンズと、該第１ミラーと、の間に、該第２ミラーが配置され、
   該第１ミラーのミラー面と、該第２ミラーのミラー面と、が対向して配置され、
   該第１ミラーは、該第２ミラーの側に曲率中心を有する曲面であり、
   該第１ミラーの曲率中心が、該対物レンズの光軸上に位置し、
   該第２ミラーは、該光軸が通過する位置に開口を有し、
   該開口の位置が該対物レンズの焦点距離と一致するように、該第２ミラーが配置されていることを特徴とする測定装置。
2. 試料中に入射した励起光によって、該試料中で発生する励起光と異なる波長の光を測定する測定装置であって、
   該励起光の波長の光を含む光を照射する光源と、
   該光源から照射された光を所定の集光位置に集光させる対物レンズと、
   該対物レンズからの光を反射する第１ミラーと、
   開口が設けられると共に、該第１ミラーによって反射された光を反射する第２ミラーと、
   該試料中で発生する励起光と異なる波長の光を測定する測定器と、を有し、
   該第１ミラーと該第２ミラーとの間に該試料が配置されると共に、該対物レンズの集光位置を該開口の位置に設定し、該測定器は該試料中で発生し該開口を通過した励起光と異なる波長の光を測定することを特徴とする測定装置。
3. 試料中に入射した励起光によって、該試料中で発生する励起光と異なる波長の光を測定する測定装置であって、
   該励起光の波長の光を含む光を照射する光源と、
   該光源から照射された光を所定の集光位置に集光させる対物レンズと、
   該対物レンズからの光を反射する第１ミラーと、
   開口が設けられると共に、該第１ミラーによって反射された光を反射する第２ミラーと、
   少なくとも該試料中で発生する励起光と異なる波長の光を集光する集光レンズと、
   該試料中で発生する励起光と異なる波長の光を測定する測定器と、
   該測定器に光が入射される直前に配置され励起光をカットする励起光カットフィルターと、を有し、
   該第１ミラーと該第２ミラーとの間に該試料が配置され、該対物レンズの集光位置を該開口の位置に設定し、励起光が集光する位置と該測定器とが共役位置関係となるように該集光レンズを配置し、該測定器は該試料中で発生した励起光と異なる波長の光を測定することを特徴とする測定装置。
4. 該第２ミラーはダイクロイックミラーであることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれかに記載の測定装置。
5. 該第１ミラーと該第２ミラーとの間の空気換算長をＬ、該第１ミラーの焦点距離をｆとすると、
   ｆ＜Ｌであることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれかに記載の測定装置。
6. 該第１ミラーと該第２ミラーとの間の空気換算長をＬ、該第１ミラーの焦点距離をｆとすると、
   ｆ＜Ｌ／２であることを特徴とする請求項１から請求項５のいずれかに記載の測定装置。
7. 該第２ミラーの反射面が曲面であることを特徴とする請求項１から請求項６のいずれかに記載の測定装置。
8. 請求項１に記載の測定装置を配置し、
   該光軸と、該第１ミラーと、の交点から、該光軸上で、かつ、該交点より該第２ミラー側に、Ｌｆ／（Ｌ−ｆ）の距離離れた位置に試料を配置し、
   該試料が発する光を測定する測定方法。
   ここで、Ｌは、該第１ミラーと、該第２ミラーと、の間の空気換算長
   ｆは、該第１ミラーの焦点距離である。
9. 該光軸上で、かつ、該交点より該第２ミラー側であって、かつ、下記の条件を満たす全てのＸの位置に試料を配置する請求項８に記載の測定方法。
   Ｌ−（Ｌ²−２ｆＬ）^1/2≦ Ｘ ≦ Ｌｆ／（Ｌ−ｆ）
   ここで、Ｘは、該交点からの距離
   Ｌは、該第１ミラーと、該第２ミラーと、の間の空気換算長
   ｆは、該第１ミラーの焦点距離である。
10. 該測定器によって該試料中で発生した励起光と異なる波長の光を測定したとき、該測定器で測定できる輝度の限界を超えた場合には、調整を行うことを特徴とする請求項１から請求項７のいずれかに記載の測定装置を用いた測定方法。
11. 該調整とは、測定光路中にＮＤフィルターを設けることか、該光源の出力が可変の場合には該光源の出力を下げることか、該測定器のゲインを下げることか、該測定器の露出時間を短くすることか、のいずれかであることを特徴とする請求項１０に記載の測定方法。
12. 試料中に入射させた励起光によって、該試料中で発生する励起光と異なる波長の光を測定する測定方法であって、
    第１ミラーを配置し、
    該第１ミラー上に該試料を内包するマイクロチップを配置し、
    開口を有するとともに、該マイクロチップ上に該第１ミラーによって反射された光を反射する第２ミラーを配置し、
    励起光を照射する光源からの光を対物レンズによって該開口に集光させて該マイクロチップ内に励起光を入射させ、
    該マイクロチップに内包された該試料から放射される励起光と異なる波長の光を測定することを特徴とする測定方法。
13. 該第１ミラーと該第２ミラーとの間の空気換算長をＬ、該第１ミラーの焦点距離をｆとすると、
    ｆ＜Ｌであることを特徴とする請求項８から１２に記載の測定方法。
14. 該第１ミラーと該第２ミラーとの間の空気換算長をＬ、該第１ミラーの焦点距離をｆとすると、
    ｆ＜Ｌ／２であることを特徴とする請求項８から１２に記載の測定方法。
15. 該マイクロチップを、
    厚さＬ１、屈折率ｎ１の第１基板と、
    厚さＬ３、屈折率ｎ３の第２基板と、
    該第１基板と該第２基板との間の距離がＬ２であって、屈折率ｎ２の試料を内包する空間と、から構成し、
    該第１ミラーと該第２基板との間の距離がＬ４であって、屈折率ｎ４の媒質で満たし、
    該第１ミラーの焦点距離をｆとすると、
    Ｌ３／ｎ３＋Ｌ４／ｎ４＜Ｌｆ／（Ｌ−ｆ）＜Ｌ２／ｎ２＋Ｌ３／ｎ３＋Ｌ４／ｎ４
    ただし、空気換算長Ｌ＝Ｌ１／ｎ１＋Ｌ２／ｎ２＋Ｌ３／ｎ３＋Ｌ４／ｎ４
    を満たすように設定することを特徴とする請求項１４に記載の測定方法。
16. 該マイクロチップを、
    厚さＬ１、屈折率ｎ１の第１基板と、
    厚さＬ３、屈折率ｎ３の第２基板と、
    該第１基板と該第２基板との間の距離がＬ２であって、屈折率ｎ２の試料を内包する空間と、
    から構成し、
    該第１ミラーと該第２基板との間の距離がＬ４であって、屈折率ｎ４の媒質で満たし、
    該第１ミラーの焦点距離をｆとすると、
    Ｌ３／ｎ３＋Ｌ４／ｎ４＜Ｌ−（Ｌ²−２ｆＬ）^1/2＜Ｌ２／ｎ２＋Ｌ３／ｎ３＋Ｌ４／ｎ４
    ただし、空気換算長Ｌ＝Ｌ１／ｎ１＋Ｌ２／ｎ２＋Ｌ３／ｎ３＋Ｌ４／ｎ４
    を満たすように設定することを特徴とする請求項１４に記載の測定方法。

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