JP2009139694A - 焦点検出装置 - Google Patents

Abstract

【課題】簡単な構成で、合焦対象でない表面からの反射光による悪影響を排除しながら、合焦対象である表面からの反射光量を高い検出感度で検出可能な焦点検出装置を提供する。
【解決手段】対物レンズ６と、透明基板４ａ１に合焦信号生成用の照明光を対物レンズを通して照射する点光源１７と、照明光の光束の一方の領域を遮光する第１の遮光部１６ａを有するマスク手段１６と、２つの受光部１９ａ，１９ｂ有する光検出器１９とを備え、マスク手段は、光検出器の一方の受光部と相似形状に形成され、且つ、透明基板４ａ１の第１又は第２の表面の一方の近傍に対物レンズの焦点が位置するときに、該一方の表面からの反射光が２つの受光部に入射するとともに他方の表面からの反射光が一方の領域に配置された受光部を外れた領域を通るように、照明光の光束の他方の領域を通る一部の光束を遮断する、第２の遮光部１６ｂを有する。
【選択図】図１

Description

本発明は、焦点検出装置に関し、特に、顕微観察装置において、マイクロプレートやスライドガラスなどの透明基板の所望の表面に焦点合わせを自動的に行うための焦点検出装置に関する。

バイオテクノロジーの分野においては、様々な条件下での種々の生細胞の反応を明らかにするため、多数の細胞を対象とした統計解析結果を用いることが頻繁に行われている。このような目的のため、従来、フローサイトメーターと呼ばれる装置が使用されてきたが、近年、顕微観察装置によって多数の細胞の画像を取得し、取得した画像を解析することにより統計解析結果を得るという手法が用いられるようになってきている。

ところで、実際に様々な条件下での生細胞の反応を試験するためには、マイクロプレートなどの容器の中で培養された非常に多くの生細胞を解析対象とする必要がある。
このため、細胞画像を取得する顕微観察装置としては、マイクロプレートなどの容器の下方より観察する倒立顕微鏡型の光学配置を採用し、さらに視野位置変更、焦点合わせ、撮像などの画像取得に係わる一連の動作を自動化したものが望まれる。

顕微観察装置を自動化する場合には、特に、焦点合わせの自動化方式が重要である。一般的に、焦点合わせの自動化方式には、大別して対象物（被写体）に赤外線等の照明光を照射し、その反射光が戻るまでの時間、照射角度、あるいは光量等を検出することにより焦点を検出するアクティブ方式と、レンズで捉えた画像を利用して焦点を検出するパッシブ方式の２つの方式が存在する。

しかるに、様々な条件下での種々の生細胞の反応を明らかにすることを目的として細胞画像を取得する顕微観察装置においては、多数の画像を取得する必要があるため、迅速な動作速度を有するアクティブ方式の焦点合わせ方式が採用されることが多い。このようなアクティブ方式を採用した焦点検出装置としては、例えば、次の特許文献１に記載のものがある。

ところで、アクティブ方式を採用した焦点検出装置においては、透明基板の一方の面に焦点を合わせるために、その一方の面からの反射光を光検出器で検出するような場合に、他方の面からの反射光も光検出器で検出されてノイズとなって焦点の検出に悪影響を及ぼすという問題がある。
しかるに、特許文献１に記載の焦点検出装置では、透明基板における焦点合わせの対象となっている一方の面（透明基板の表面）で反射された光の検出時に外乱光となる光線を遮光するために用いられる開口絞りを、透明基板の表面での開口数が所定値より大きい光のみを選択的に透過させるように輪帯形状に形成することによって、透明基板における焦点合わせの対象となっていない他方の面（透明基板の裏面）で反射された光がノイズとして検出されないようにしている。
特開２００６−１８４７７７号公報

しかしながら、特許文献１に記載の焦点検出装置における、焦点検出の際に外乱光となる光線を遮光するための開口絞りの輪帯形状は、一般に矩形状に形成されている検出領域の形状を考慮したものとはなっていない。即ち、透明基板の表面での開口数が所定値以下であってもノイズとはならない光は存在する。しかるに、輪帯形状の開口絞りで、そのようなノイズはならない光を検出領域に入射させようにすると、外乱光までもが検出領域に入ってしまう。しかし、輪帯形状の開口絞りで、外乱光を検出領域に入射させないようにすると、透明基板の表面での開口数が所定値以下でノイズとはならない光が検出部に入射しなくなる。このため、特許文献１に記載のような輪帯形状に形成された開口絞りで外乱光となる光線を遮光する構成を採用した従来の焦点検出装置では、透明基板の表面での開口数が所定値以下であってもノイズとはならない光を焦点検出のために有効に利用することができず、その分、検出光量が小さくなって検出感度が低下するという問題があった。

本発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、従来の焦点検出装置に比べて簡単な構成で、透明基板における焦点合わせの対象となっていない側の表面からの反射光による悪影響を排除しながら、ノイズとはならない光を焦点検出のために有効に利用し、透明基板における焦点合わせの対象となっている側の表面からの反射光量を高い検出感度で検出して、この焦点合わせの対象となっている側の表面に焦点合わせを行うことが可能な焦点検出装置を提供することを目的とする。

上記目的を達成するため、本発明による焦点検出装置は、対物レンズと、透明基板に対し合焦信号を生成するための照明光を発し、前記対物レンズを通して照射する点光源と、前記照明光の光束のうち該照明光の光軸に沿う第１の仮想平面で分割したときの一方の領域を通る光束を遮光する第１の遮光部を有するマスク手段と、前記透明基板で反射された光の光軸に沿う第２の仮想平面を挟んで対称に配置された２つの受光部を有する光検出器とを備え、前記２つの受光部を介して夫々検出された前記透明基板からの反射光の光量に基づいて、前記透明基板の第１又は第２の表面に前記対物レンズの焦点合わせを行うための焦点検出装置であって、前記マスク手段は、前記光検出器における一方の受光部と相似形状に形成され、且つ、前記透明基板における第１又は第２の表面のうち一方の表面近傍に前記対物レンズの焦点が位置するときに、該一方の表面からの反射光が前記２つの受光部に入射するとともに他方の表面からの反射光が前記第２の仮想平面で分割したときの一方の領域における当該領域に配置された受光部を外れた領域を通るように、前記照明光の光束のうち光軸に沿う前記第１の仮想平面で分割したときの他方の領域を通る一部の光束を遮断する、第２の遮光部を有することを特徴としている。

また、本発明の焦点検出装置においては、前記マスク手段が、形状可変であるのが好ましい。

また、本発明の焦点検出装置においては、前記マスク手段における第１及び第２の遮光部が、２枚の薄板の組み合わせで構成されているのが好ましい。

本発明によれば、従来の焦点検出装置に比べて簡単な構成で、透明基板における焦点合わせの対象となっていない側の表面からの反射光による悪影響を排除しながら、ノイズとはならない光を焦点検出のために有効に利用し、透明基板における焦点合わせの対象となっている側の表面からの反射光量を高い検出感度で検出して、この焦点合わせの対象となっている側の表面に焦点合わせを行うことが可能な焦点検出装置が得られる。

以下、本発明の実施形態を図面を用いて詳細に説明する。
図１は本発明の一実施形態にかかる焦点検出装置を備えた顕微観察装置の概略構成を示す説明図、図２は図１の顕微観察装置に備わる焦点検出装置におけるマスク手段を構成する第１及び第２の遮光部の形状、及び照明光束における第１及び第２の遮光部で遮光されない領域と遮光される領域を示す説明図、図３は図２に示す第１及び第２の遮光部で遮光されない領域の照明光について、透明基板における焦点合わせの対象となっている側の表面で反射された光と、焦点合わせの対象となっていない側の表面で反射された光の、２つの受光部との位置関係を示す説明図である。図４は本実施形態の焦点検出装置において、焦点を透明基板の被検物側の面に合わせた場合における、焦点合わせの対象となっている側の表面で反射する光と、焦点合わせの対象となっていない側の表面で反射する光の経路を概念的に示す説明図である。図５は図４に示す状態の焦点検出装置において、透明基板における焦点検出対象となっている側と焦点検出対象となっていない側の夫々の表面で反射する光の２つの受光部近傍での入射状態を示す説明図である。図６は本実施形態の焦点検出装置において、焦点を透明基板の被検物側とは反対側の面に合わせた場合における、焦点合わせの対象となっている側の表面で反射する光と、焦点合わせの対象となっていない側の表面で反射する光の経路を概念的に示す説明図である。図７は図６に示す状態の焦点検出装置において、透明基板における焦点検出対象となっている側と焦点検出対象となっていない側の夫々の表面で反射する光の２つの受光部近傍での入射状態を示す説明図である。図８は本実施形態の焦点検出装置における２つの受光部で検出される、合焦状態に応じた受光量の変化の一例を示すグラフである。図９は図８に示した２つの受光部で検出された受光量に基づき計算された評価関数計算値の一例を示すグラフである。なお、図４及び図６では説明の便宜上、本発明における点光源及びマスク手段と、光検出器の位置を入れ替えた状態で示してある。また、後述する外乱光遮光部材も省略して示してある。

本実施形態の焦点検出装置を備えた顕微観察装置は、図1に示すように、顕微鏡本体１と、落射照明装置２と、焦点検出装置３とからなる。
顕微鏡本体1は、被検物４を載置するＸＹステージ５を備えている。ＸＹステージ５の下方には、対物レンズ６と、ハーフミラー７，２０と、結像レンズ８と、ＣＣＤカメラ９とを備えている。ＸＹステージ５は、水平面内（紙面に対して垂直な平面内）を移動可能に構成されている。対物レンズ６は、駆動部１０を介して光軸方向に移動可能に構成されている。
被検物４は、公知の複数ウェルを有するポリスチレン等の光透過性部材で製作されたマイクロプレート４ａを容器として使用し、培養液４ｂ中で培養された細胞をマイクロプレート４ａの底面部４ａ１に公知の技術によって固定化したものである。マイクロプレート４ａの底面部４ａ１は、本発明における透明基板に相当する。なお、被検物４に用いる細胞は、さらに解析する項目に応じて適切な方法によって染色された細胞でもかまわない。また、使用する容器として、ここではプラスチック製のものを例示したが、底面にガラスを貼り付けたガラスボトムプレートでもかまわない。

落射照明装置２は、ＸＹステージ５の下方に備えられ、光源１１と、レンズ１２からなる。光源１１は、白色ＬＥＤで構成されている。
焦点検出装置３は、対物レンズ８と、ハーフミラー７と、焦点検出ユニット３’を有している。焦点検出ユニット３’は、顕微鏡本体１におけるハーフミラー７の反射光路上に配置され、λ／４板１５と、レンズ１３と、偏光ビームスプリッタ１４と、マスク手段１６と、偏光ビームスプリッタ１４の透過光路上に配置された、焦点合わせ用の点光源１７と、偏光ビームスプリッタ１４の反射光路上に配置された、外乱光遮光部材１８と、光検出器１９とを備えている。焦点合わせ用の点光源１７は、レーザダイオードで構成されていて、被検物４の透明基板（マイクロプレート４ａの底面部４ａ１）に対して合焦信号を生成するための照明光を発するようになっている。外乱光遮光部材１８は、後述するマスク手段１６を通過し対物レンズ６を介して被検物４を照射し被検物４で反射されて光検出器１９側へ向かう光のうち、所定の光路を外れた乱光を遮光するように、光軸Ｘ２に沿う第２の仮想平面（図１では光軸Ｘ２を含む紙面に垂直な平面）で分割したときの一方の領域に設けられている。なお、外乱光遮光部材１８は、所定の光路を外れた乱光が殆ど発生しない場合には、その配置を省略してもよい。
光検出器１９は、２分割フォトダイオードで構成されている。２分割フォトダイオードは、２つの受光部１９ａ，１９ｂを有している。２つの受光部１９ａ，１９ｂは、光軸Ｘ２に沿う仮想平面（図１では光軸Ｘ２を含む紙面に垂直な平面）を挟んで対称に配置されている。

マスク手段１６は、図２に示すように、第１の遮光部１６ａと、第２の遮光部１６ｂを有している。
第１の遮光部１６ａは、点光源１７から発せられた照明光の光束のうち光軸Ｘ１に沿う第１の仮想平面（図１では光軸Ｘ１を含む紙面に垂直な平面）で分割したときの一方の領域を通る光束を遮光する形状及び大きさに形成されている。なお、本実施形態では、第１の遮光部１６ａは、矩形形状をしているが、この一方の片側部分の光束を遮光することができる形状であればどのような形状でもよい。
第２の遮光部１６ｂは、光検出器１９における一方の受光部と相似形状に形成され、且つ、透明基板（マイクロプレート４ａの底面部４ａ１）における第１又は第２の表面（底面部４ａ１の表面４ａ１１又は表面４ａ１２）のうち、一方の表面近傍に対物レンズ６の焦点が位置するときに、一方の表面からの反射光が２つの受光部１９ａ，１９ｂに入射するとともに他方の表面からの反射光が、例えば図３に示すように、第２の仮想平面で分割したときの一方の領域におけるその一方の領域に配置された受光部（図３の例では受光部１９ａ）を外れた領域を通るように、点光源１７から発せられた照明光の光束のうち光軸Ｘ１に沿う第１の仮想平面で分割したときの他方の領域を通る一部の光束を遮光するように構成されている。

このように構成された本実施形態の焦点検出装置を備えた顕微観察装置では、まず、落射照明装置２の光源１１である白色ＬＥＤから射出された光が、レンズ１２、ハーフミラー２０、ハーフミラー７、対物レンズ６を介してＸＹステージ５に載置された被検物４を照明する。このときの被検物４からの光は、対物レンズ６、ハーフミラー７、ハーフミラー２０、レンズ８を経由してＣＣＤカメラ９へ導かれる。これにより、ＣＣＤカメラ９を介して被検物４を撮像することができる。

また、焦点検出装置３では、レーザダイオード１７から射出された光の一部が、遮光部材１６を介して遮光される。一方、遮光部材１６によって遮光されることなく通り抜けた光は、偏光ビームスプリッタ１４、レンズ１３、λ／４板１５、ハーフミラー７、対物レンズ８を経由して、被検物４へ導かれる。このときの被検物４からの反射光は、対物レンズ８、ハーフミラー７、λ／４板１５、レンズ１３、偏光ビームスプリッタ１４を経由して、受光素子１９側に導かれる。

ここで、焦点検出装置３において、マイクロプレート４ａの底面部４ａ１からの反射光が受光素子１９へ入射する状態は、底面部４ａ１の表面位置と対物レンズ８の焦点位置との関係において次のように変化する。

まず、底面部４ａ１における培養液４ｂ及び細胞と接する側の表面４ａ１１に対物レンズ８の焦点位置を合わせる場合（以下、対物レンズ８の焦点を合わせる表面を目的表面と称す。）において、目的表面４ａ１１近傍に対物レンズ８の焦点が位置するときは、図４に示すように、焦点検出装置３の光路を辿る。
すなわち、レーザダイオード１７から発してマイクロプレート４ａの底面部４ａ１で反射された光のうち、目的表面４ａ１１で反射された光は、対物レンズ８を透過した後、受光素子１９である２分割フォトディテクター上の結像点２１に結像する。一方、目的表面４ａ１１に対向する表面４ａ１２で反射された光は、結像点２１よりも遠い結像点２３で結像する。

ここで、本実施形態の焦点検出装置３では、マスク手段１６の第２の遮光部１６ｂが、光検出器１９における一方の受光部と相似形状に形成され、一方の表面近傍に対物レンズ６の焦点が位置するときに、一方の表面からの反射光が２つの受光部１９ａ，１９ｂに入射するとともに他方の表面からの反射光が、例えば図３に示すように、第２の仮想平面で分割したときの一方の領域におけるその一方の領域に配置された受光部（図３の例では受光部１９ａ）を外れた領域を通るように、点光源１７から発せられた照明光の光束のうち光軸Ｘ１に沿う第１の仮想平面で分割したときの他方の領域を通る一部の光束を遮光するように構成されている。
したがって、図５に示すように、目的表面４ａ１１で反射された光は、ほぼ点に近い状態に集光して２分割フォトディテクターに入射し、２分割フォトディテクターの双方の受光部１９ａ，１９ｂで均等な光量が検出される。一方、表面４ａ１２で反射された光は、結像しない状態で２分割フォトディテクター側に向かうが、点光源１７から発せられて表面４ａ１２で反射しうる光のうち２分割フォトディテクターに入射しうる領域の光は、マスク手段１６の第２の遮光部１６ｂによって遮光され、表面４ａ１２で反射されない。このため、表面４ａ１２で反射された光は、そのすべてが、２分割フォトディテクターから外れた位置を通る。

一方、底面部４ａ１における培養液４ｂ及び細胞と接する側とは反対側の表面４ａ１２に対物レンズ８の焦点位置を合わせる場合において、目的表面４ａ１２近傍に対物レンズ８の焦点が位置するときは、図６に示すように、焦点検出装置３の光路を辿る。
すなわち、レーザダイオード１７から発してマイクロプレート４ａの底面部４ａ１で反射された光のうち、目的表面４ａ１２で反射された光は、対物レンズ８を透過した後、受光素子１９である２分割フォトディテクター上の結像点２３’に結像する。一方、目的表面４ａ１２に対向する表面４ａ１１で反射された光は、結像点２３’よりも近い結像点２１’で結像する。

ここで、本実施形態の焦点検出装置３では、マスク手段１６の第２の遮光部１６ｂが、光検出器１９における一方の受光部と相似形状に形成され、一方の表面近傍に対物レンズ６の焦点が位置するときに、一方の表面からの反射光が２つの受光部１９ａ，１９ｂに入射するとともに他方の表面からの反射光が、例えば図３に示すように、第２の仮想平面で分割したときの一方の領域におけるその一方の領域に配置された受光部（図３の例では受光部１９ａ）を外れた領域を通るように、点光源１７から発せられた照明光の光束のうち光軸Ｘ１に沿う第１の仮想平面で分割したときの他方の領域を通る一部の光束を遮光するように構成されている。
したがって、図７に示すように、目的表面４ａ１２で反射された光は、ほぼ点に近い状態に集光して２分割フォトディテクターに入射し、２分割フォトディテクターの双方の受光部１９ａ，１９ｂで均等な光量が検出される。一方、表面４ａ１１で反射された光は、結像しない状態で２分割フォトディテクター側に向かうが、点光源１７から発せられて表面４ａ１１で反射しうる光のうち２分割フォトディテクターに入射しうる領域の光は、マスク手段１６の第２の遮光部１６ｂによって遮光され、表面４ａ１１で反射されない。このため、表面４ａ１１で反射された光は、そのすべてが、２分割フォトディテクターから外れた位置を通る。

このようにして被検物４の目的表面からの反射光だけを受光した２分割フォトディテクター１９は、前記反射光の光量情報を捉え、焦点合わせ信号として不図示の制御部へ出力する。そして、この制御部はこの焦点合わせ信号に基づき、（Ａ−Ｂ）／（Ａ十Ｂ）なる評価関数を計算する。本実施形態の焦点検出装置における２分割フォトディテクターによって検出される光量変化の一例を図８のグラフに示す。また、図９に図８のデータに基づいて行った評価関数計算値の一例をグラフに示す。図９のグラフにおいて、横軸が被検物４と対物レンズの相対距離、縦軸が焦点合わせ評価値である。焦点合わせは、この評価関数計算値が０となるように駆動部１０を介して対物レンズ８を上下させる。評価関数計算値が０となる位置に対物レンズ８が移動したときに対物レンズ８の焦点が被検物４の目的表面に位置し合焦が達成される。

なお、本実施形態においては、被検物としてマイクロプレートなどの透明容器の内側表面に焦点合わせを行う場合について記載したが、ガラススライド等の表面に焦点合わせを行う場合など、目的表面よりも向こう側にノイズとなる反射面がある場合でも、遮光部材の大きさを調節することによって対応することができる。

このように本実施形態の焦点検出装置によれば、マスク手段１６を介してサンプル容器底面部の目的としない側の表面からの反射光が排除される一方、照明用光源から発されて目的表面からの反射光となるべき光を極力ロスを低減させて目的表面で反射させることができる。このため、この反射光が外乱光として、焦点合わせ信号に悪影響を及ぼすことなく、高精度な焦点合わせを行うことができるようになる。
また、本実施形態の焦点検出装置によれば、照明用光源として点光源を用いることで焦点合わせ用光学系を構成する部材が少なくて済む。

本発明は、自動化した顕微観察装置を用いて多数の細胞の画像を取得し、取得した画像を解析することにより統計解析結果を得ることが求められる分野に有用である。

本発明の一実施形態にかかる焦点検出装置を備えた顕微観察装置の概略構成を示す説明図である。 図１の顕微観察装置に備わる焦点検出装置におけるマスク手段を構成する第１及び第２の遮光部の形状、及び照明光束における第１及び第２の遮光部で遮光されない領域と遮光される領域を示す説明図である。 図２に示す第１及び第２の遮光部で遮光されない領域の照明光について、透明基板における焦点合わせの対象となっている側の表面で反射された光と、焦点合わせの対象となっていない側の表面で反射された光の、２つの受光部との位置関係を示す説明図である。 本実施形態の焦点検出装置において、焦点を透明基板の被検物側の面に合わせた場合における、焦点合わせの対象となっている側の表面で反射する光と、焦点合わせの対象となっていない側の表面で反射する光の経路を概念的に示す説明図である。 図４に示す状態の焦点検出装置において、透明基板における焦点検出対象となっている側と焦点検出対象となっていない側の夫々の表面で反射する光の２つの受光部近傍での入射状態を示す説明図である。 本実施形態の焦点検出装置において、焦点を透明基板の被検物側とは反対側の面に合わせた場合における、焦点合わせの対象となっている側の表面で反射する光と、焦点合わせの対象となっていない側の表面で反射する光の経路を概念的に示す説明図である。 図６に示す状態の焦点検出装置において、透明基板における焦点検出対象となっている側と焦点検出対象となっていない側の夫々の表面で反射する光の２つの受光部近傍での入射状態を示す説明図である。 本実施形態の焦点検出装置における２つの受光部で検出される、合焦状態に応じた受光量の変化の一例を示すグラフである。 図８に示した２つの受光部で検出された受光量に基づき計算された評価関数計算値の一例を示すグラフである。

符号の説明

１ 顕微鏡本体
２ 落射照明装置
３ 焦点検出装置
３’ 自動焦点検出ユニット
４ 被検物
４ａ マイクロプレート
４ａ１ 底面部
４ａ１１，４ａ１２ 底面部４ａ１の表面
４ｂ 培養液
５ ＸＹステージ
６ 対物レンズ
７，２０ ハーフミラー
８ 結像レンズ
９ ＣＣＤカメラ
１０ 駆動部
１１ 光源
１２，１３ レンズ
１４ 偏光ビームスプリッタ
１５ λ／４板
１６ マスク手段
１６ａ 第１の遮光部
１６ｂ 第２の遮光部
１７ 点光源
１８ 外乱光遮光部材
１９ 光検出器
１９ａ，１９ｂ 受光

Claims (3)

1. 対物レンズと、透明基板に対し合焦信号を生成するための照明光を発し、前記対物レンズを通して照射する点光源と、前記照明光の光束のうち該照明光の光軸に沿う第１の仮想平面で分割したときの一方の領域を通る光束を遮光する第１の遮光部を有するマスク手段と、前記透明基板で反射された光の光軸に沿う第２の仮想平面を挟んで対称に配置された２つの受光部を有する光検出器とを備え、前記２つの受光部を介して夫々検出された前記透明基板からの反射光の光量に基づいて、前記透明基板の第１又は第２の表面に前記対物レンズの焦点合わせを行うための焦点検出装置であって、
   前記マスク手段は、前記光検出器における一方の受光部と相似形状に形成され、且つ、前記透明基板における第１又は第２の表面のうち一方の表面近傍に前記対物レンズの焦点が位置するときに、該一方の表面からの反射光が前記２つの受光部に入射するとともに他方の表面からの反射光が前記第２の仮想平面で分割したときの一方の領域における当該領域に配置された受光部を外れた領域を通るように、前記照明光の光束のうち光軸に沿う前記第１の仮想平面で分割したときの他方の領域を通る一部の光束を遮断する、第２の遮光部を有することを特徴とする焦点検出装置。
2. 前記マスク手段が、形状可変であることを特徴とする請求項１に記載の焦点検出装置。
3. 前記マスク手段における第１及び第２の遮光部が、２枚の薄板の組み合わせで構成されていることを特徴とする請求項２に記載の焦点検出装置。

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