JP2009126745A - バイオシリカ製造法、およびバイオシリカ固定基板の製造法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明のバイオシリカ製造法は、シラフィンを用いてバイオシリカ粒を形成する場合に、使用するシラフィンのリピートユニット濃度、および/又は、形成時の温度を調節することにより、形成するバイオシリカ粒の粒径を制御する。また、本発明のバイオシリカ固定基板の製造法は、所定の結晶面を有する基板上にシラフィンを吸着させて、基板上でシラフィンによりバイオシリカを形成させる。
【選択図】なし
Description
A) シラフィンを用いてバイオシリカ粒を形成する方法において、使用するシラフィンのリピートユニット濃度、および/又は、形成時の温度を調節することにより、形成するバイオシリカ粒の粒径を制御することを特徴とするバイオシリカの製造法。
B) 使用するシラフィンのリピートユニット濃度を10nM以上1500nM以下、および/又は、形成時の温度を40℃以上80℃以下の範囲に設定することを特徴とする上記A)記載のバイオシリカ製造法。
C) 組換えシラフィンを使用することを特徴とする上記A)又はB)記載のバイオシリカ製造法。
D) 単リピート型又は7回リピート型の組換えシラフィンを使用することを特徴とする上記C)記載のバイオシリカ製造法。
E) ヒスチジンのタグを付加した組換えシラフィンを使用することを特徴とする上記C)記載のバイオシリカ製造法。
F) 所定の結晶面を有する基板上にシラフィンを吸着させて、基板上でシラフィンによりバイオシリカを形成させることを特徴とするバイオシリカ固定基板の製造法。
G) 基板表面上に異なった結晶面をパターニングにより形成した後、シラフィンを選択吸着させ、次いで、シラフィン吸着部にバイオシリカを選択的形成させることを特徴とするパターニングされたバイオシリカ固定基板の製造法。
H) 低指数結晶面を有するGaAs結晶基板をエッチングすることにより、基板表面上に異なった結晶面をパターニングにより形成させることを特徴とする上記G)記載のパターニングされたバイオシリカ固定基板の製造法。
I) 基板表面上に異なった結晶面をパターニングにより形成させた後、強制酸化皮膜を形成することを特徴とする上記H)記載のパターニングされたバイオシリカ固定基板の製造法。
J) 7回リピート型の組換えシラフィンを使用することを特徴とする上記F)〜I)のいずれかに記載のバイオシリカ固定基板の製造法。
上述のように、本発明のバイオシリカ製造法は、シラフィンを用いてバイオシリカ粒を形成する場合に、使用するシラフィンのリピートユニット濃度、および/又は、形成時の温度を調節することにより、形成するバイオシリカ粒の粒径を制御することを特徴とする。
本発明のバイオシリカ固定基板の製造法は、(a)所定の結晶面を有する基板上にシラフィンを吸着させて、基板上でシラフィンによりバイオシリカを形成させる方法、あるいは、(b)基板表面上に異なった結晶面がパターニングされた状態を創出させた後、シラフィンを選択吸着させ、次いで、シラフィン吸着部にバイオシリカを選択的形成させることを特徴とするパターニングされたバイオシリカ固定基板の製造法である。
[1]バイオシリカの粒径制御に関する実験
[1-1]実験に使用したシラフィン
シラフィンは、大腸菌発現系により大量精製した単リピート型の組換えシラフィン-1および7回リピート型の組換えシラフィン-1の2種類を使用した。(以下、これらを総称して、「組換えシラフィン」あるいは単に「シラフィン」という場合がある。)
シラフィン(リピートユニット)濃度、基質(TMOS)量、pHおよび反応温度の各反応条件について、シラフィンのバイオシリカ形成活性にどのような影響を与えるか、特にここではバイオシリカの粒径に与える影響を検討した。
精製・濃縮・Buffer置換したシラフィンのサンプルに対し、Buffer置換に使用した脱imidazole bufferを用いて、観察するシラフィン濃度条件の10倍濃度になるように段階希釈を行った。そして以下の反応溶液を混合し、最後に1M TMOS(テトラメトキシシラン)を添加し、室温でバイオシリカ形成反応を開始した。
800 mM Na2HPO4 (終pH 7.75)
(終濃度 80 mM) 10 μL
組換えシラフィン-1 10 μL
超純水 70 μL
1M TMOS (終濃度 100 mM) 10 μL
Total 100 μL
1M TMOS溶液調製し、これを段階希釈した。そして以下の反応溶液を混合し、最後にTMOSを添加し、室温でバイオシリカ形成反応を開始した。
800 mM Phosphate (終pH 7.0)
(終濃度 80 mM) 10 μL
組換えシラフィン-1(リピートユニット1500 nM) 10 μL
超純水 70 μL
1M TMOS (終濃度 100 mM, 50 mM,…) 10 μL
Total 100 μL
この後の操作は[1-2-1]と共通である。
TMOSを加える前の反応溶液混合液のpHが目的の値となるように、シラフィンのバイオシリカ形成反応に用いるリン酸溶液のpHを調節し、室温でバイオシリカ形成反応を行った。
800 mM Phosphate
(終濃度 80 mM) 10 μL
組換えシラフィン-1(リピートユニット1500 nM) 10 μL
超純水 70 μL
1M TMOS (終濃度 100 mM) 10 μL
Total 100 μL
この後の操作は[1-2-1]と共通である。
TMOS以外の反応溶液を混合した溶液、および1M TMOSをそれぞれ目的の温度環境(例えば0℃なら氷水中、40℃ならサンプルポケットに水を入れておいたヒートブロックを用いる)で3分間プレインキュベートした。プレインキュベート後TMOSを混合液に添加し反応を開始した。反応開始5分後に氷水中に入れ、13,000 rpm、3分、4℃で遠心し、超純水での洗浄操作を、5回繰り返した。
800 mM Phosphate (終pH 7.0)
(終濃度 80 mM) 10 μL
組換えシラフィン-1(リピートユニット1500 nM) 10 μL
超純水 70 μL
1M TMOS (終濃度 100 mM) 10 μL
Total 100 μL
この後の操作は[1-2-1]と共通である。
[2-1]7回リピート型シラフィン(164.4μM)を用いたバイオシリカ形成とGaAs(100)酸化膜上での固定
7回リピート型シラフィンを用いてバイオシリカの形成を行った。全ての作業は室温にて行っている。反応溶液としては、7回リピート型シラフィン 50μl, 800mMリン酸buffer 50μl, 1M TMOS 50μl, MilliQ水 350μlである。これらの溶液をエッペンチューブ内で反応させ、バイオシリカを形成させた。その後、遠心し、バイオシリカ以外の成分を分離した。形成したバイオシリカをGaAs(100)基板上に固定し、走査型電子顕微鏡(SEM)観察を行った。同時にEDX(energy dispersive X-ray analysis)を用いて組成分析を行った。
[単一基板上での7回リピート型シラフィン吸着実験]
単リピート型シラフィンよりもルイス塩基として働くアミノ酸を数多く有する7回リピート型シラフィンはGaAs自然酸化膜内の極性に依存して、吸着に選択性を持つ可能性が示唆される。そこで、GaAs(100),(110),(111)A,(111)B,Si(100)基板を用い、7回リピート型シラフィン吸着能を測定した。本発明者は吸着能についてGaAs酸化膜を構成するGa2O3,As2O3に着目しており、そのため、全ての基板に対して、GaAs酸化膜内Ga2O3の局所的な化学的安定化を目的とした過熱水蒸気照射を250℃、60分間行った。また、シラフィンとGaAs基板間の吸着をより顕著に確認できることが期待されるため、基板上へシラフィンを添加後、バイオシリカ形成原料を供給した。
さらに、同一基板上においてパターニングして形成された異なった結晶面に対する選択吸着、すなわち、結晶面上の酸化膜内の極性の違いによる7回リピート型シラフィンの選択吸着を明らかにすることを目的とし、GaAs(100)基板をウエットエッチング(etchant:H2SO4:H2O2:H2O=1:8:1000)することによって、Ga-rich面およびAs-rich面を持つ構造物を作製した。その後、基板への過熱水蒸気の印加→シラフィン吸着→原料供給→洗浄を行い、SEM観察を行った。作製した基板におけるGa-rich面およびAs-rich面は微細な領域であること、さらに、バイオシリカは球の集合体で存在する可能性が高いことからバイオシリカの重力による沈殿を極力抑える必要性がある。そこで、バイオシリカ形成反応においてシラフィンが過多な条件下(原料供給律速反応)で実験を行った。この反応系では、供給した原料の量に応じたバイオシリカ形成が見込まれるため、極少量のバイオシリカ形成が可能である。そこで、「バイオシリカの沈殿力<シラフィンの面極性による吸着力」を実現すべく、原料供給量に着目した。(1)シラフィン3μl:原料3μl, (2)シラフィン3μl:原料2μl, (3)シラフィン3μl:原料1μlの3通りの条件下で行った。(1)、(2)、(3)全ての反応は原料供給律速でのバイオシリカ形成である。
GaAs酸化膜極性の違いによる7回リピート型シラフィン吸着の優位性が発生するメカニズムを検証するために、異なる表面極性を持つGaAs(111)A,(111)B酸化膜内の組成変調評価を行った。本発明者が着目したのが基板温度に依存したGaAs酸化膜熱脱離過程である。GaAs酸化膜はGa系酸化物およびAs系酸化物で構成されており、真空環境において、基板温度に応じた物質の脱離が確認可能である。GaAs(100)酸化膜脱離過程は、基板温度が100℃付近ではH2Oの脱離、143℃付近ではAsOなどのAs系酸化物の脱離、200℃〜300℃において、As2O3+2GaAs→Ga2O3+2As2(or As4)への置換、さらに、Ga系酸化物の脱離反応は、410℃においてGa2O3+Ga→Ga2Oの反応が起こることによって誘起される。
[1]バイオシリカの粒径制御に関する実験結果
[1-1]シラフィン(リピートユニット)濃度の影響検討結果
図2は、単リピート型シラフィンを使用し、そのリピートユニット濃度を1400 nM から70000 nMの範囲で変化させて、形成された各バイオシリカのSEM像を示す図である。図3は、同じく単リピート型シラフィンを使用し、そのリピートユニット濃度を100 nM から3000 nMの範囲で変化させて、形成された各バイオシリカのSEM像を示すと共に、以上の結果をもとに、シラフィンのリピートユニット濃度と形成されるバイオシリカの粒径との関係をまとめたグラフを示す。グラフに示すように、シラフィン濃度はバイオシリカの粒径に影響を与え、シラフィン濃度を低く設定するほどバイオシリカの粒径は小さくなり、特に、シラフィンのリピートユニット濃度を1500 nM以下に設定することで、バイオシリカの粒径を100-200 nm程度またはそれ以下に微細化することができた。
図5は、単リピート型シラフィンを使用した場合で、基質(TMOS)量がバイオシリカの粒径に与える影響を検討した結果を示す図であり、各基質(TMOS)量において形成されたバイオシリカのSEM像を示す。基質(TMOS)量を12.5 mM以下にするとバイオシリカを観察できなくなった。基質(TMOS)量を25 mM以上にした場合は、直径約400 nmと約150nmの異なるサイズのバイオシリカが観察された。また、7回リピート型シラフィンを用いた場合にも同様の結果が観察された。
図6は、単リピート型シラフィンを使用した場合で、反応液のpHがバイオシリカの粒径に与える影響を検討した結果を示す図であり、5.0≦pH≦10.0の範囲の各pHにおいて形成されたバイオシリカのSEM像を示す。6.0≦pH≦8.0の範囲では、均一で球状のバイオシリカの形成が観察された。また、7回リピート型シラフィンを用いた場合にも同様の結果が観察された。
図7は、単リピート型シラフィンを使用した場合で、反応温度がバイオシリカの粒径に与える影響を検討した結果を示す図であり、0℃から60℃の範囲の各温度において形成されたバイオシリカのSEM像を示す。同図に示すように、広い温度範囲でシラフィンのバイオシリカ形成活性が認められると共に、反応温度はバイオシリカの粒径に影響を与え、反応温度を高く設定するほどバイオシリカの粒径は小さくなり、特に、反応温度を40℃以上に設定することで、バイオシリカの粒径を約300 nm程度またはそれ以下に微細化することができた。また、7回リピート型シラフィンを用いた場合にも同様の結果が観察された。
[2-1]バイオシリカ形成とGaAs(100)基板上での固定の確認
図8は、7回リピート型シラフィン(1000 nM)を用いて形成させたバイオシリカのGaAs(100)基板上に固定した状態でのSEM像およびEDX測定結果である。SEM像より、バイオシリカは球構造を最小単位としていることが分かり、その球が集合体として存在している。EDXの結果からは、バイオシリカ形成領域にのみ、Si,Oだけでなく、C,Pのピークも観察されている。つまり、バイオシリカのGaAs(100)基板上への固定はシラフィンの吸着を介しての固定であることが予測される。
以前の報告(Sandra R.Whaley,D.S.English,Evelyn L.Hu,Paul F.Barbara,Angela M.Belcher, NATURE, vol.405, 8 June 2000)より、ルイス塩基(電子対供与体)として働くアミノ酸を多く要しているペプチドほど、GaAs基板との吸着力が強いとの記述がある。つまり、GaAs基板はルイス酸(電子対受容体)として働いている。さらに、半導体表面の面極性が吸着の選択性を発現させることに言及している。具体的には、GaAs(100),GaAs(111)Aと比較して、GaAs(111)B,Si(100)にはペプチドが吸着しにくいという結果である。しかし、この報告では、GaAs基板表面全体に対してのペプチド吸着の議論が行われているが、水溶液中の実験において必ず形成されるGaAs酸化膜の影響を示唆しているものの、その効果が考慮されていない。そこで、本発明者はシラフィンのアミノ酸配列および極性半導体であるGaAs表面の酸化膜層に着目した。つまり、GaAs酸化膜層を介してのシラフィン吸着に特化した。
過熱水蒸気を印加することによって得られた酸化膜を有する単一面基板を用いて7回リピート型シラフィン吸着実験を行った。その結果、GaAs(111)A>(100)>(110)の順に吸着力に差が確認され、(111)BおよびSiにおいては吸着しなかった。ルイス塩基として働く7回リピート型シラフィンが表面極性の異なるGaAs酸化膜に対して吸着能が異なるということは、GaAs酸化膜表面における極性が異なるためと予測される。すなわち、バイオシリカ固定基板の製造においては、GaAs(111)A、(100)、(110)の結晶面を有する基板が望ましい。
さらに、極性の違いによる7回リピート型シラフィン吸着性の違いを利用してパターニングされたバイオシリカ固定基板を製造するため、表面極性が異なる(111)A面(Ga-rich面)および(111)B面(As-rich面)を同一基板上に作製し、この複合構造の酸化膜に対して過熱水蒸気を印加後、7回リピート型シラフィンをGaAs酸化膜に選択的に吸着させた。本実験はμmオーダーの微細構造物上で行っているため、「バイオシリカの沈殿力<シラフィンの面極性による吸着力」を実現する必要性がある。そのため、原料供給律速反応の条件下で、バイオシリカ形成量をコントロールした。図11はシラフィン3μl:原料1μlの条件の時に得られたSEM像である。バイオシリカ球の集合体の直径は約100nmである。原料律速の反応によって、バイオシリカ球集合体のサイズコントロールおよび低密度化を図ることによって、重力を軽減し、バイオシリカの沈殿を抑制した。洗浄過程において超音波を繰り返したのにもかかわらず、バイオシリカの剥離が確認されなかった。つまり、バイオシリカがGaAs(111)A面酸化膜表面に吸着されたシラフィンを介して固定されていることが分かる。したがって、バイオシリカの固定はGaAs酸化膜の極性に依存したものであると考えられる。本実験からも、Ga-rich面における酸化膜に対して7回リピート型シラフィンの吸着が確認され、As-rich面においては吸着が確認されなかった。
最後にGaAs酸化膜とシラフィンとの吸着メカニズムを議論するため、表面極性が異なる面上に形成された酸化膜表面の組成を検証した。そこで、本発明者は、真空環境におけるGaAs酸化膜の熱脱離過程に着目した。GaAs酸化膜はGa系酸化物およびAs系酸化物で構成されている。そして、GaAs(100)基板温度を上昇させることによって、酸化膜の熱脱離過程を観察した場合、先に述べたように基板温度が100℃付近ではH2Oの脱離、143℃付近ではAsOなどのAs系酸化物の脱離、さらに、Ga系酸化物に関しての脱離は410℃付近においてGa2O3+Ga→Ga2Oの反応が起こることによって誘起されることが知られている。
[配列番号2]単リピート型シラフィン-1のアミノ酸配列
[配列番号3]7回リピート型シラフィン-1のアミノ酸配列
[配列番号4]単リピート型シラフィン-1のN末にメチオニンを、C末にロイシン、グルタミン酸およびヒスチジンヘキサマーを付加した組換えシラフィン-1のアミノ酸配列
[配列番号5]7回リピート型シラフィン-1のN末にメチオニンを、C末にロイシン、グルタミン酸およびヒスチジンヘキサマーを付加した組換えシラフィン-1のアミノ酸配列
Claims (10)
- シラフィンを用いてバイオシリカ粒を形成する方法において、
使用するシラフィンのリピートユニット濃度、および/又は、形成時の温度を調節することにより、形成するバイオシリカ粒の粒径を制御することを特徴とするバイオシリカの製造法。 - 使用するシラフィンのリピートユニット濃度を10nM以上1500nM以下、および/又は、形成時の温度を40℃以上80℃以下の範囲に設定することを特徴とする請求項1記載のバイオシリカ製造法。
- 組換えシラフィンを使用することを特徴とする請求項1又は2に記載のバイオシリカ製造法。
- 単リピート型又は7回リピート型の組換えシラフィンを使用することを特徴とする請求項3記載のバイオシリカ製造法。
- ヒスチジンのタグを付加した組換えシラフィンを使用することを特徴とする請求項3記載のバイオシリカ製造法。
- 所定の結晶面を有する基板上にシラフィンを吸着させて、基板上でシラフィンによりバイオシリカを形成させることを特徴とするバイオシリカ固定基板の製造法。
- 基板表面上に異なった結晶面をパターニングにより形成した後、シラフィンを選択吸着させ、次いで、シラフィン吸着部にバイオシリカを選択的形成させることを特徴とするパターニングされたバイオシリカ固定基板の製造法。
- 低指数結晶面を有するGaAs結晶基板をエッチングすることにより、基板表面上に異なった結晶面をパターニングにより形成させることを特徴とする請求項7記載のパターニングされたバイオシリカ固定基板の製造法。
- 基板表面上に異なった結晶面をパターニングにより形成させた後、強制酸化皮膜を形成することを特徴とする請求項8記載のパターニングされたバイオシリカ固定基板の製造法。
- 7回リピート型の組換えシラフィンを使用することを特徴とする請求項6〜9のいずれか1項に記載のバイオシリカ固定基板の製造法。
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