JP2009077716A - ＥｒｂＢ４レセプター特異的ニューレグリン関連リガンド及びその使用 - Google Patents

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Abstract

【課題】ＮＲＧ１及びＮＲＧ２のＥＧＦ様ドメインとは異なるＥＧＦ様ドメインを有する新規なポリペプチドであるＮＲＧ３を提供する。
【解決手段】ニューレグリン（ＮＲＧ１）ファミリーの新たな成員の同定、組み換え製造、及び特徴付けに基づく、ＥｒｂＢ４レセプター特異的な新規タンパク質。該タンパク質は細胞増殖及び分化、上皮発達、心臓発達、神経発達に含まれるとともに、グリア細胞マイトジェン、並びに間葉及びニューロン因子として作用する。
【選択図】なし

Description

本発明は、新規なニューレグリン(neuregulin)関連リガンドに関する。より詳細には、本発明は、ニューレグリンファミリーの新たな成員及び新規なポリペプチドの機能的な誘導体に関する。
細胞成長及び分化に影響するシグナルトランスダクションは、部分的に種々の細胞性タンパク質のリン酸化によって調節されている。タンパク質チロシンキナーゼは、この過程を触媒する酵素である。レセプタータンパク質チロシンキナーゼは、細胞内基質のリガンド−刺激性チロシンリン酸化を介して細胞成長を命令すると考えられている。クラスＩサブファミリーの成長因子レセプタータンパク質チロシンキナーゼは、ｅｒｂＢ１遺伝子によってコードされる１７０ｋＤａの表皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）を含む。ｅｒｂＢ１は、ヒト悪性疾患の原因に関係している。特に、この遺伝子の発現は、乳、膀胱、肺及び胃のガンが進行するにつれて増加することが観察されている。クラスＩサブファミリーの第２の成員、ｐ１８５neuは、最初は、化学的に処理されたラットの神経芽細胞腫からの形質転換遺伝子の産物として同定されていた。ｎｅｕ遺伝子（ｅｒｂＢ２及びＨＥＲ２とも呼ばれる）は、１８５ｋＤａレセプタータンパク質チロシンキナーゼをコードする。ヒトＨＥＲ２遺伝子の増幅及び／または過発現は、乳及び卵巣ガンにおける予後の貧弱性と関連している（Slamon等, (1987) Science 235: 177-182; 及び Slamon等, (1987) Science 244: 707-712）。ＨＥＲ２の過発現は、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸及び膀胱のガンを含む他のガンと関係している。ｅｒｂＢ３またはＨＥＲ３と呼ばれる、さらに関連する遺伝子も記載されている（Kraus等, (1989) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 86: 9193-9197）。Kraus等(1989)は、ある種のヒト哺乳類中庸細胞系にｅｒｂＢ３ｍＲＮＡの顕著に上昇したレベルが存在し、ｅｒｂＢ３がｅｒｂＢ１及びｅｒｂＢ２と同様にヒト悪性疾患における役割を果たしていることを示していることを発見した。ｅｒｂＢ３遺伝子は、乳ガン（Lemoine等, (1992) Br. J. Cancer 66: 1116-1121）、胃腸管ガン（Poller等, (1992) J. Pathol. 168: 275-280, Rajkumer等, (1993) J. Pathol. 170: 271-278, 及びSanidas等, (1993) Int. J. Cancer 54: 935-940）、及び膵臓ガン（Lemoine等, (1992) J. Pathol. 168: 269-273 及びFriess等, (1995) Clinical Cancer Research 1: 1413-1420）において過発現されることがわかっている。
成長因子レセプタータンパク質チロシンキナーゼのクラスＩサブファミリーは、ＨＥＲ４／ＥｒｂＢ４レセプターを包含するまでさらに拡張された（欧州特許出願第599,274号、Plowman等, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1746-1750; 及びPlowman等, (1993) Nature 366: 473-475）。Plowman等は、ＨＥＲ４発現の増加が、乳腺癌を含むある種の表皮起源のガンと密接に関係していることを見出した。ＨＥＲ４発現を評価するヒトの腫瘍性状態（特に乳ガン）検出のための診断方法が、欧州特許出願第599,274号に記載されている。
ＨＥＲ２オンコジーンの活性化剤の探求により、ポリペプチドのファミリーが発見され、集合的にニューレグリン（ＮＲＧ１）と呼ばれている。Orr-Urtreger等(1993) Proc. Natl. acad. Sci. USA 90: 1867-1871 により、これらのタンパク質が、ヒト染色体８の短腕(short arm)にマッピングされた単一の遺伝子の交互スプライシングからもたらされることがわかった。
Holmes等は、ヘレグリン-α(ＨＲＧ-α)、ヘレグリン-β１(ＨＲＧ-β１)、ヘレグリン-β２(ＨＥＲＧ-β２)、及びヘレグリン-β３(ＨＥＧ-β３)と呼ばれるＨＥＲ２レセプターのポリペプチド活性化剤のファミリーを単離及びクローン化した。Holmes等, (1992) Science 256: 1205-1210; WO 92/20798; 及び米国特許第5,367,060号参照。４５ｋＤａポリペプチド、ＨＲＧ-αは、ＭＤＡ-ＭＢ-２３１ヒト乳ガン細胞系の条件を整えた媒質から精製した。これらの研究者は、精製したヘレグリンポリペプチドが、ＭＣＦ７乳腫瘍細胞におけるＨＥＲ２レセプターのチロシンリン酸化を活性する可能性を示した。さらに、ヘレグリンポリペプチドの（高レベルのＨＥＲ２レセプターを発現する）ＳＫ-ＢＲ-３細胞に対するマイトジェン活性も示されている。ＦＧＲファミリーに属する他の成長因子と同様に、可溶性ＨＲＧポリペプチドは、膜結合前駆体（プロ-ＨＲＧと呼ばれる）から誘導され、タンパク質分解的に処理されて４５ｋＤａの可溶性形態を放出することがわかる。これらのプロ-ＨＲＧ類は、Ｎ-末端シグナルペプチドを欠いている。
ヘレグリン類は、最初の２１３アミノ酸残基において実質的に一致しているが、それらは、Ｃ-末端部分において相違する２つの変異体ＥＧＦ様ドメインに基づいて、２つの大きな型、α及びβに分類される。それにも関わらず、これらＥＧＦ様ドメインは、そこに含まれる６つのシステイン残基の間隔において一致している。アミノ酸配列の比較に基づいて、Holmes等は、ＥＧＦ様ドメインにおける第１及び第６のシステインの間で、ＨＲＧ類は、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子(ＨＢ-ＥＧＦ)と４５％類似であり、アンフィレグリン(amphiregulin)（ＡＲ）と３５％同一であり、ＴＧＦ-αと３２％同一であり、ＥＧＦと２７％同一であることを見出した。
４４ｋＤａのｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）は、ヒトＨＲＧのラット等価体であるが、Peles等, (1992) Cell 69: 205-216; 及びWen等, (1992) Cell 69: 559-572によって最初に発見された。ＨＲＧポリペプチドと同様に、ＮＤＦは、免疫グロブリン(Ｉｇ)相同ドメインを有し、それにＥＧＦ様ドメインが続き、Ｎ-末端シグナルペプチドは持たない。従って、Wen等, (1994) Mol. Cell. Biol. 14(3): 1909-1919は、ＮＤＦ類のファミリーを拡張するためのクローニング実験を行った。この研究は、６つの異なる線維芽細胞的プロ-ＮＤＦ類を明らかにした。Holmes等の命名法を用いて、これらのＮＤＦ類は、ＥＧＦ様ドメインの配列に基づいてαまたはβの何れかに分類された。アイソフォーム(isoform)１から４は、ＥＧＦ様ドメインと膜貫通ドメインとの間の領域に基づいて特徴付けされる。また、種々の長さの細胞質ドメインを有するアイソフォームａ、ｂ及びｃも記載されている。これらの研究者らは、異なるＮＤＦアイソフォームは、交互スプライシングによって生成され、異なる組織特異的機能を発揮すると結論づけた。ＮＤＦについては、EP 505,148；WO 93/22424及びWO 94/28133も参照。
Falls等, (1993) Cell 72: 801-815は、ヘレグリンファミリーの他の成員を記載し、アセチルコリンレセプター含有活性（ＡＲＩＡ）ポリペプチドと呼んでいる。キチン由来のＡＲＩＡポリペプチドは、筋肉アセチルコリンレセプターの合成を刺激する。WO 94/08007も参照。ＡＲＩＡはβ-型のヘレグリンであり、ＨＲＧアルが、及びＨＲＧβ１-β３のＩｇ様ドメインとＥＧＦ様ドメインの間のグリコシル化部位の豊富な全スペーサー領域を欠いている。
Marchionni等は、数種のウシ由来タンパク質を同定し、グリア成長因子(ＧＧＦ)と呼んでいる（Marchionni等, (1993) Nature 362: 312-318）。これらのＧＧＦ類は、上記の他のヘレグリンタンパク質とともにＩｇ様ドメイン及びＥＧＦ様ドメインを有するが、アミノ末端クリングルドメインも有する。ＧＧＦ類は一般に、Ｉｇ様ドメインとＥＧＦ様ドメインの間に競合的なグリコシル化スペーサー領域を持たない。一つのＧＧＦ、ＧＧＦＩＩのみが、Ｎ-末端シグナルペプチドを有する。ＧＧＦ及びその使用に関するWO 92/18627；WO 94/00140；WO 94/04560；WO 94/26298及びWO 95/32724も参照。
Ho等は、(1995) J. Biol. Chem. 270(4): 14523-14532において、感覚及び運動ニューロン由来因子（ＳＭＤＦ）と呼ばれる、ヘレグリンファミリーの他の成員を記載している。このタンパク質は、他の全てのヘレグリンポリペプチドの特徴を持つＥＧＦ様ドメインを有するが、異なるＮ-末端ドメインを有する。ＳＭＤＦと他のヘレグリンポリペプチドとの主な構造的相違点は、ＳＭＤＦがＩｇ様ドメイン及び他の全てのヘレグリンポリペプチドに特徴的な”糖”スペーサーを欠くことである。ＳＭＤＦの他の特徴は、Ｎ-末端近傍に疎水性アミノ酸の２つストレッチ(stretch)が存在することである。
ヘレグリンポリペプチドは、ＨＥＲ２レセプターを活性化する能力に基づいて最初に同定されたが（Holmes等、上記参照）、ｎｅｕ及びｎｅｕでトランスフェクトした線維芽細胞を発現するある種の卵巣細胞は、ＮＤＦに結合も架橋もせず、ＮＤＦに反応してチロシンリン酸化を受けることが見出された（Peles等, (1993) EMBO J. 12: 961-971）。このことは、全部のヘレグリン反応性を確実にするには他の細胞性成分が必要であることを示している。従ってCarraqway等は、非トランスフェクトおや細胞ではなく、ＮＩＨ-３Ｔ３線維芽細胞に結合した125Ｉ-ｒＨＲＧβ１177-244が、ウシｅｒｂＢ３で安定にトランスフェクトされることを示した。従って、彼らは、ＥｒｂＢ３がＨＲＧのレセプターであり、内在性チロシン残基のリン酸化、並びに両方のレセプターを発現する細胞のＥｒｂＢ２レセプターのリン酸化を仲介すると結論した。Caraway等, (1994) J. Biol. Chem. 269(19): 14303-14306。Sliwkowski等, (1994) J. Biol. Chem. 269(20): 14661-14665は、ＨＥＲ３のみでトランスフェクトされた細胞はヘレグリンに低い親和性を示すが、ＨＥＲ２及びＨＥｒ３の両方でトランスフェクトされた細胞は高い親和性を示すことを見出した。
この観察は、Kokai等, Cell 58: 287-292 (1989); Stern等, (1988) EMBO J. 7: 995-1001; 及びKing等, 4: 13-18 (1989)に既に記載されている”レセプタークロストキング”に関係する。これらの研究者らは、ＥＧＦのＥＧＦＲへの結合がＥＧＦＲキナーゼドメインの活性化及びｐ１８５HER2の交差-リン酸化をもたらすことを見出した。このことは、リガンド誘発性レセプターヘテロ二両体化、及び二両体内におけるレセプターの交差-リン酸化の結果であると思われる（Wada等, (1990) Cell 61: 1339-1347）。
Plowman及び共同研究者は、同様にｐ１８５HER4／ｐ１８５HER2の活性化を研修した。彼らは、ｐ１８５HER4単独、ｐ１８５HER2単独、または２つのレセプターを共にヒトＴリンパ球で発現させ、ヘレグリンがｐ１８５HER4のリン酸化を刺激できるが、ｐ１８５HER2はのリン酸化は両方のレセプターを発現する細胞においてのみ刺激できることを示した。Plowman等, Nature 336: 473-475 (1993)。従って、ヘレグリンは、ＥＧＦ成長因子ファミリーの数種のレセプターと相互作用できる唯一の知られた成員である。Carraway及びCantley (1994) Cell 78: 5-8。
ヘレグリンの生物学的役割は、幾つかのグループによって研究されている。例えば、Falls等(上記)は、ＡＲＩＡが筋管分化における役割を果たす、即ち、運動ニューロンのシナプス後の筋肉細胞において神経伝達物質レセプターの合成及び濃縮に影響することを見出した。Corfas及びFischbachは、ＡＲＩＡが、チキン筋肉におけるナトリウムチャンネルの数を増加させることも示した。Corfas及びFischbach, (1993) J. neuroscience 13(5): 2118-2125。また、ＧＧＦＩＩが、サブコンフルエント(subconfluent)な静態のヒト筋芽細胞にマイトジェニックであり、ＧＧＦＩＩが連続的に存在するクローナルヒト筋芽細胞の分化が、分化の６日後に筋管数の増加をもたらすことも示された（Sklar等, (1994) J. Cell Biochem., Abst. W462, 18D, 540）。1994年11月24日に発行されたWO 94/26298も参照。
Holmes等、上記、は、ＨＲＧが哺乳類細胞系(ＳＫ-ＢＲ-３及びＭＣＦ-７等)にマイトジェン的効果を及ぼすことを見出した。ＧＧＦのシュワン細胞へのマイトジェン的効果も報告されている。例えば、Brockes等, (1980) J. Biol. Chem. 255(18): 8374-8377; Lemke及びBrockes (1984) J. Neurosci. 4: 75-83; Brockes等, (1984) J. Neuroscience 4(1): 75-83; Brockes等, (1986) Ann. Neurol. 20(3): 317-322; Brockes, J. (1987) Methods in Exzym. 147: 217-225 及びMarchionni等, 上記も参照。シュワン細胞は、ニューロンの軸索の周囲を被うミエリンを提供する重要なグリア細胞を構成し、それにより、個々の神経繊維を形成する。よって、シュワン細胞は、末梢神経の発達、機能及び再生において重要な役割を果たすことは明らかである。このことの治療的見地からの意味付けは、Levi等, (1994) J. Neuroscience 14(3): 1309-1319によってなされている。Levi等は、損傷した脊髄の領域に移植できる、シュワン細胞を含む細胞性プロテーゼの構築の可能性を議論している。シュワン細胞の生体外での培養方法が記載されている。WO 94/00140及びLi等, (1996) J. Neuroscience 16(6): 2012-2019参照。
Pinkas-Kramarski等は、胚芽及び成人のラット脳及びラット脳細胞の一次培地におけるニューロン及びグリア細胞でＮＤＦが発現されることを見出し、それが星状細胞の生存及び突然変異因子として作用することを示唆した（Pinkas-Kramarski等, (1994) PNAS, USA 91: 9387-9391）。Mayer及びBrichmeir (1994) PNAS, USA 91: 1061-1068は、マウス胚形成中及び周産期の動物におけるヘレグリンの発現を、in situハイブリダイゼーション及びＲＮアーゼ保護実験を用いて分析した。これらの著者らは、この分子の発現に基づいて、ヘレグリンがインビボで間葉及びニューロン因子として振る舞うと結論した。また、彼らの発見は、ヘレグリンが上皮の発達において機能することを意味する。同様に、Danilenko等, (1994) Abstract 3101, FASEB 8(4-5): A535 は、ＮＤＦとＨＥＲ２レセプターとの相互作用が、傷修復中の上皮移動及び分化の制御において重要であることを見出した。
ＮＲＧ１は最初、レセプターチロシンキナーゼＥｒｂＢ２のリガンドであると提唱されたが、さらなる研究により、ＥｒｂＢ２の活性化は、ＮＲＧ１のＥｒｂＢ３（Sliwkowski, M.X.等, (1994) J. Biol. Chem. 269: 14661-14665）またはＥｒｂＢ４（Ploeman, G.D.等, (1993) Nature 366: 473-475;及びCarraway, K.L.及びCarraway, L.C. (1994) Cell 78: 5-8）レセプターへの結合の結果としてしばしば起こることが示された。最近の研究は、心臓の発達におけるＮＲＧ１、ＥｒｂＢ２及びＥｒｂＢ４レセプターの役割に集中し始めている。ＥｒＢｂ４レセプター、ＥｒｂＢ２レセプター、またはＮＲＧ１を欠くマウスは、心室の心筋小柱の発達が停止してから胚形成中期（１０．５日胚）に死亡する（Meyer及びBirchmeier (1995) Nature 378: 386-90; Gassmann等, (1995) Nature 378: 390-4; 及び Lee等, (1995) Nature 378: 394-8）。これらの結果は、心内膜で発現されたＮＲＧ１が、心内膜におけるＥｒｂＢ２及びＥｒｂＢ４レセプターの活性化に必要な重要なリガンドであるという見方と一致する。
これらの研究は同時に、ＮＲＧ１及びＥｒｂＢ２レセプターが、後脳(hind brain)の発達において、ＥｒｂＢ４レセプターとは異なる役割を果たしうることを示唆している。ＮＲＧ１は、神経上皮及び菱脳の神経小片２，４及び６から生ずる細胞において発現するが、ＥｒｂＢ４レセプターは菱脳の神経小片３及び５において発現する。ＮＲＧ１及びＥｒｂＢ２ノックアウトマウスは、頭側の感覚神経節の細胞及び軸索の喪失を示した。対照的に、ＥｒｂＢ４レセプター欠失マウスは、頭側の神経節に細胞性の喪失を示さなかった。むしろ、これらの神経節の中枢神経系へ及びからの神経支配の構成、離間及びパターンが破壊される（Gassmann等、上記）。ＮＲＧ１及びＥｒｂＢ４レセプターノックアウトマウスの後脳発現型（フェノタイプ）におけるこの相違の理由となりうるのは、ＮＲＧ１とは異なる付加的なリガンド（類）がＣＮＳにおいてＥｒｂＢ４に認識されることである（Gassmann等、上記）。
Slamon等, (1987) Science 235: 177-182 Slamon等, (1987) Science 244: 707-712 Kraus等, (1989) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 86: 9193-9197 Lemoine等, (1992) Br. J. Cancer 66: 1116-1121 Poller等, (1992) J. Pathol. 168: 275-280 Rajkumer等, (1993) J. Pathol. 170: 271-278 Sanidas等, (1993) Int. J. Cancer 54: 935-940 Lemoine等, (1992) J. Pathol. 168: 269-273 Friess等, (1995) Clinical Cancer Research 1: 1413-1420
本発明は、ニューレグリン（ＮＲＧ１）ファミリーの新たな成員の同定、組み換え製造、及び特徴付けに基づく。より詳細には、本発明は、ＮＲＧ１及びＮＲＧ２のＥＧＦ様ドメインとは異なるＥＧＦ様ドメインを有する新規なポリペプチドであるＮＲＧ３に関する。さらに、ここに開示するＮＲＧ３は、他のニューレグリン様ポリペプチドに比較して異なるレセプター結合特性を示す。
相同配列モチーフの分析において、ＮＲＧ１のＥＧＦ様ドメインの相同性は、ほとんどのニューレグリンに保持されているアミノ酸のサブセットに観察された。この観察及び観察されたＥｒｂＢ４レセプター結合特性に基づいて、新規なタンパク質であるＮＲＧ３が、ニューレグリンファミリーの新たな成員として同定された。この新規なタンパク質は、ＮＲＧ１ファミリーの他の成員に見られるものとは、かすかに関係しているが相違している。さらに、それは中枢神経系の胚及び成人の組織において主に発現する。ＮＲＧ３は、ニューレグリンファミリーの化合物の新たな成員を表現し、そのファミリーの成員は、細胞増殖及び分化、上皮発達、心臓発達、神経発達に含まれるとともに、グリア細胞マイトジェン、並びに間葉及びニューロン因子として作用する。
一実施態様において、本発明は、ＥＧＦ様ドメインを有する新規な単離された哺乳類ＮＲＧ３ポリペプチド、及びこの新規なＮＲＧ３の機能的誘導体に関し、当該ポリペプチドはＥｒｂＢ４レセプターに結合する。本発明の範囲内の天然ポリペプチドは、ＥＧＦ様ドメインを含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインを含むことを特徴としている。本発明は特に、本発明の新規なＮＲＧ３リガンド分子の可溶性形態を包含し、それは、細胞膜に結合できない膜貫通ドメインを有し、任意に、細胞質ドメインの全部又は一部を欠いている。「膜貫通(transmembrane)ドメイン」とは、ポリペプチドのドメインを意味し、当該ポリペプチドを細胞膜に挿入及び固定(anchor)するのに十分な数の疎水性アミノ酸を含む。「細胞膜に結合できない膜貫通ドメイン」とは、細胞膜への挿入又は他の結合を可能とするには不十分な疎水性となるように、突然変異又は欠失によって変化した膜貫通ドメインを意味する。このような膜貫通ドメインは、例えば、本は爪のＮＲＧ３の融合体、またはそのフラグメントを排除するものではなく、細胞からのポリペプチドの分泌に有用な分泌シグナル配列を持ち、活性な膜貫通ドメインを欠いて存在する不十分な数の疎水性アミノ酸側鎖は細胞膜に挿入しない。活性な膜貫通ドメインを達成するのに有用なアミノ酸配列の突然変異または変化は、膜貫通ドメイン内での欠失または置換を含むが、これらに限られない。
特別な実施態様において、本発明は、単離されたポリペプチド、好ましくはＮＲＧ３リガンドに関し、それは以下の群から選択されるポリペプチドを少なくとも７５％のアミノ酸の同一性を有する： （１）図３に示すＥＧＦ様ドメインをコードするアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）； （２）図３に示すマウスまたはヒトのＮＲＧ３細胞外ドメインをコードするアミノ酸配列を含むポリペプチド（各々、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）； （３）図３に示すマウスまたはヒトのＮＲＧ３天然ポリペプチドをコードするアミノ酸配列を含むポリペプチド（各々、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）； （４）ポリペプチド（１）−（３）のさらなる哺乳類相同体； （５）ポリペプチド（１）−（４）のいずれかの、膜貫通ドメインを欠く可溶性形態； （６）ポリペプチド（１）−（５）のいずれかの、ＥＧＦ様ドメインの性質及びポリペプチド（１）−（５）のＮＲＧ３レセプター結合特性を保持する誘導体。
本発明の天然ＮＲＧ３ポリペプチドは糖タンパク質であるが、本発明は、天然のグリコシル化を伴わない、または変異体グリコシル化パターンを有する変異体分子も包含する。好ましくは、ＮＲＧ３ポリペプチドのＥＧＦ様ドメインは、非グリコシル化のものである。
さらなる実施態様では、本発明は、本発明に係る新規なＮＲＧ３のアンタゴニストも包含する。本発明のアンタゴニストは、抗-ＮＲＧ３抗体またはその結合性フラグメントなどのＮＲＧ３に結合するペプチドであってよい。好ましくは、本発明のＮＲＧ３アンタゴニストは、ＮＲＧ３などの天然ＥｒｂＢ４レセプターリガンドのＮＲＧ３レセプターへの結合を実質的に低下させ、それによりレセプターの活性化を防止または抑制する。好ましい実施態様では、アンタゴニストは、ＮＲＧ３のそのレセプターへの結合性を、類似条件下でのＮＲＧ３の結合性の５０％未満、好ましくは２０％未満、最も好ましくは１０％未満に低下させる。
さらに他の実施態様では、本発明は、本発明の新規なＮＲＧ３のアゴニストを包含する。本発明のアゴニストは、ＮＲＧ３でもよく、または抗-ＮＲＧ３レセプター抗体またはそのレセプター結合性フラグメントでもよい。本発明のＮＲＧ３アゴニストは、天然ＮＲＧ３コード遺伝子の交互にスプライスされた形態にコードされるポリペプチドでもよく、好ましくは、ここに述べたＮＲＧ３ ＥＧＦ様ドメインを含む。本発明のアゴニストの一実施態様では、ＮＲＧ３アゴニストは、抗-ＥｒｂＢ４レセプター抗体であり、その抗体はＥｒｂＢ４レセプターに結合して活性化する。好ましくは、アゴニストの結合親和性は、天然リガンドの親和性の少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは天然リガンドの親和性の少なくとも９０％である。同様に、本発明のアゴニストは、ＥｒｂＢ４レセプターを、天然ＮＲＧ３の活性化の少なくとも２５％、より好ましくは５０％、最も好ましくは９０％のレベルで活性化する。
さらに本発明は、本発明の新規なＮＲＧ３をコードする核酸分子、その核酸を含むベクター、及びそのベクターで形質転換された宿主細胞に関する。核酸は、好ましくは少なくとも本発明の天然または変異体ＥｒｂＢ４レセプター特異的なＮＲＧ３のＥＧＦ様ドメインをコードする。本発明はさらに、緊縮条件下で本発明の天然ＥｒｂＢ４レセプター特異的なＮＲＧ３をコードする核酸の補体にハイブリダイズし、ここに開示した天然ＮＲＧ３のＥｒｂＢ４レセプター特異的結合特性の性質を保持するタンパク質をコードする核酸を含む。さらに、本発明は、American Type Culture Collection にＡＴＣＣ２０９１５６（ｐＬＸＳＮ．ｍＮＲＧ３）として寄託された核酸を含み、その核酸は、マウスＮＲＧ３オープンリーディングフレームをコードする核酸を含む発現ベクターである（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）。また本発明は、American Type Culture Collection にＡＴＣＣ２０９１５７（ｐＲＫ５．ｔｋ．ｎｅｏ．ｈＮＲＧ３Ｂ１）として寄託された核酸も含み、その核酸は、ヒトＮＲＧ３核酸をコードする核酸を含む発現ベクターである（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）。また本発明は、American Type Culture Collection にＡＴＣＣ２０９２９７（ｐＲＫ５．ｔｋ．ｎｅｏ．ｈＮＲＧ３Ｂ２）として寄託された核酸も含み、その核酸は、ヒトＮＲＧ３核酸の交互にスプライスされた形態をコードする核酸を含む発現ベクターであり（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の核酸１５８５から１６５６を欠いている。交互にスプライスされたヒトＮＲＧ３Ｂ２の演繹されたアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に見られ、それは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸５２９から５５２を欠く。ｈＮＲＧ３Ｂ１とｈＮＲＧ３Ｂ２アミノ酸配列の比較を図６及び７に示す。さらに本発明は、寄託されたベクターによってコードされる、マウス及びヒトＮＲＧ３、その交互にスプライスされた形態またはそのフラグメントのＮＲＧ３アミノ酸配列を含む。
他の実施態様では、本発明は、本発明のＮＲＧ３を製造する方法にも関し、この方法は、宿主細胞を所望のＮＲＧ３をコードする核酸で形質転換し、形質転換した宿主細胞を培養し、宿主細胞または宿主細胞培地から産生されたＮＲＧ３を回収することを含む。
形質転換細胞でのＮＲＧ３の製造に換えて、本発明は、（ａ）内因性ＮＲＧ３遺伝子を含む細胞を、増幅可能な遺伝子及び少なくとも１５０塩基対のフランキング配列であって、前記内因性ＮＲＧ３遺伝子の内部または近傍のＤＮＡ配列を持つ相同体である配列を含む相同体ＤＮＡで形質転換し、それにより相同体ＤＮＡを組み換えにより細胞ゲノムに導入し；（ｂ）当該細胞を、増幅可能な遺伝子の増幅のために選択する条件下で培養し、それによりＮＲＧ３遺伝子も増幅し；その後（ｃ）細胞からＮＲＧ３を回収することを含んでなるＮＲＧ３の製造方法を提供する。
さらなる態様において、本発明は、本発明のＮＲＧ３に特異的に結合する抗体、及びそのような抗体を産生するハイブリドーマ細胞系に関する。
さらに他の態様では、本発明は、免疫グロブリン配列に融合した、ここに述べたような新規なＮＲＧ３配列を含むイムノアドヘシン(immunoadhesin)に関する。ＮＲＧ３配列は、好ましくは免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合した天然または変異体ポリペプチドの膜貫通ドメインを欠く形態であり、少なくとも本発明の天然ＮＲＧ３の細胞外ドメインのＥＧＦ様ドメインを含む。他の好ましい実施態様では、イムノアドヘシンに存在するＮＲＧ３配列は、各々マウスまたはヒトＮＲＧ３についてのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のＮＲＧ３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示した配列の細胞外ドメインと、少なくとも８０％の配列の相同性を示す。免疫グロブリン定常ドメイン配列は、好ましくはＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２またはＩｇＧ-３分子のものであるが、ＩｇＡまたはＩｇＭ分子であってもよい。
さらなる態様において、本発明は、変化したＮＲＧ３遺伝子を持つトランスジェニック動物を包含し、この変化した遺伝子によってコードされるポリペプチドが生物学的に活性ではなく（非機能的）、そのポリペプチドを欠いており、または野生型活性の７０％以下、好ましくは天然ＮＲＧ３ポリペプチドの５０％以下、最も好ましくは２５％以下の活性を持つ。さらに、本発明のトランスジェニック動物は、天然ＮＲＧ３、あるいはＮＲＧ３のスプライスされた形態またはそのフラグメントまたは変異体を含み発現するトランスジェニック動物を包含する。このようなトランスジェニック動物は、潜在的なＮＲＧ３アゴニスト及びアンタゴニストをスクリーニングするのに有用である。
さらに本発明は、上に定義したＮＲＧ３に加えて製薬的に許容されるキャリアを含有する製薬組成物に関する。製薬組成物におけるＮＲＧ３の量及び投与は、臨床薬理学または薬物動態学の当業者によって決定されるであろう（例えば、Mordenti, J.及びRescigno, A. (1992) Pharmaceutical Research 9: 17-25; Moreni, J.等 (1991) Pharmaceutical Research 8: 1351-1359; 及びMordenti, J.及びChappell, W. (1989) "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" in Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi等(eds), Pergamon Press, NY, pp.42-96参照、これら各々は、その全体を参考文献としてここに取り入れる）。
本発明の一態様では、本発明のＮＲＧ３、またはそのフラグメントをコードする単離された核酸も、インビボまたはエクスビボ（生体外）の遺伝子治療に用いられる。
本発明の一実施態様では、ＮＲＧ３、またはそのフラグメントまたは変異体をコードする核酸配列が、動物の細胞に発現カセットの一部として導入され、ＮＲＧ３コード核酸配列が細胞で発現される。好ましくは、ＮＲＧ３コード核酸配列は、細胞内でのＮＲＧ３発現の制御のための配列（プロモーター配列など）を含む。好ましくは、発現カセットは、核酸配列を動物の細胞に送達するためのレトロウイルスベクターを含む。
本発明のさらなる実施態様では、ＮＲＧ３またはＮＲＧ３アゴニストを発現する宿主細胞が動物、好ましくはヒトに導入され、宿主細胞で産生されたＮＲＧ３またはＮＲＧ３アゴニストが、増加した局所的または全身のＮＲＧ３投与に敏感な疾患の治療に有効とされる。ＮＲＧ３、そのフラグメントまたは変異体を発現するように遺伝子的に加工された細胞は、宿主細胞に移植して有効レベルの因子を与えることができる。細胞は、例えば米国特許第4,892,538号及び第5,011,472号、WO 92/19195, WO 95/05452またはAebischer等(1996), Medicine 2: 696-699に提示されているように調製、カプセル化、及び移植することができ、これらの文献は、参考としてここに取り入れる。
本発明は、ＥｒｂＢ４レセプターを含む細胞のインビボ及びインビトロでの生存、増殖または分化を促進する方法を含む。通常は、細胞はＮＲＧ３ポリペプチドまたはそのフラグメント又は変異体で処理される。しかしながら、この分野での遺伝子治療方法が記載され、それも本発明に包含される。これらの技術は、アデノウイルスであるherpes Simplex Iウイルス及びアデノ関連ウイルス並びに脂質ベースのデリバリーシステム（例えばリポソーム）を用いた細胞への遺伝子送達を含む。従って、ＮＲＧ３をコードする核酸の投与が可能であり、その結果、ＮＲＧ３ポリペプチド、そのフラグメントまたは変異体が患者または組織培地に発現される。遺伝子治療の例は、WO 93/25673及びそこに挙げられた参考文献に見られる。
本発明の一態様は、哺乳類にＮＲＧ３またはそのフラグメント、あるいは、疾患の治療の要求に応じてＮＲＧ３のアゴニストまたはアンタゴニストをコードする細胞を投与し、その細胞が本発明のＮＲＧ３を分泌することによる疾患の治療方法である。
本発明の一実施態様は、神経に対する損傷、あるいは他のＮＲＧ３発現性またはＮＲＧ３反応性細胞、例えば脳、心臓又は腎臓細胞に対する損傷を予防または治療する方法であり、その方法は、ＮＲＧ３、またはそのフラグメント又はアゴニスト、あるいは、特定の条件で必要ならばアンタゴニストを分泌する細胞を、それを必要とする患者の身体に移植することを含む。
本発明のさらなる実施態様は、神経損傷又はここに教示した他の細胞に対する損傷を予防または治療するための移植装置を含み、当該装置は、半透膜及びＮＲＧ３、またはそのフラグメント又はアゴニスト（または特定の条件で必要ならばアンタゴニスト）を含み、それらが前記膜内にカプセル化され、当該膜がＮＲＧ３、またはそのフラグメントアゴニスト透過性であり、患者からの細胞に有害な因子は不透過性である。
本発明のインビトロの方法では、ＥｒｂＢ４レセプターを含む細胞は、細胞培養媒質中に配置される。ＥｒｂＢ４含有細胞の例は、神経細胞、例えば脳細胞（新皮質、小脳及び海馬のニューロン、）；心臓細胞；骨格細胞及び平滑筋細胞；及び組み換えＮＲＧ３で形質転換された培養細胞を含む。
この分野で知られた適当な培養媒質は、Minimal Essential Medium (MEM)、RPMI-1640、及びDulbeccoの変性イーグル媒質(DMEM)を含むが、これらに限られない。これらの組織培養媒質は、Sigma Chemical Company (St. Louis, MO)及びGIBCO (Grand Island, NY)から商業的に入手可能である。次いで細胞は、有効量のＮＲＧ３の存在下で、細胞の生存及び成長のために十分な条件下、細胞培養媒質中で培養される。細胞は、クロット、寒天、液体媒質を含む種々の方法で培養できる。
細胞は、例えば３７℃といった生理的に許容される温度で、有効量のＮＲＧ３、そのフラグメントまたは変異体の存在下で培養される。ＮＲＧ３の量は変化してよいが、好ましくは約０．１ｎｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．１ｎｇ／ｍｌから約０．１ｎｇ／ｍｌの範囲内である。ＮＲＧ３は、当然のことながら、当業者が過度の実験をすることなく経験的に決定した投与量で培地に添加することができる。培地におけるＮＲＧ３の濃度は、細胞及びＮＲＧ３が培養される条件などの種々の要因に応じて変動する。インキュベーションの特定の温度及び時間、並びに他の条件は、それらの要因、例えばＮＲＧ３濃度、及び細胞及び媒質のタイプに応じて変化する。当業者は、有効かつ最適な培養条件を、過度の実験をすることなく決定できるであろう。培地における細胞（例えばニューロン）の増殖、分化及び／または生存は、上述したような当該分野で知られた種々のアッセイ法によって測定することができる。
インビトロでの細胞生存、成長及び／または分化を促進するためにＮＲＧ３を用いることは、種々の用途で有効であると考えられる。例えば、ＮＲＧ３の存在下でインビトロで培養された神経細胞は、その細胞のレベルが低下した哺乳類に注入(infuse)することができる。好適なインビトロ培地は、細胞特異的因子の単離のため、及び内因性または組み換えで導入されたタンパク質の細胞での発現のためにも用いることができる。また、ＮＲＧ３、そのフラグメントまたは変異体は、細胞培地で他の細胞の成長及び／または分化を支持する細胞の生存、増殖及び／または分化を促進するために用いることもできる。
また本発明は、ＮＲＧ３のインビボでの用途も提供する。ＮＲＧ３のニューロン細胞発現パターンに基づいて、この分子は、脱髄、またはグリア細胞の損傷又は欠損（多発性硬化症等）などの神経細胞成長を含む疾患の治療に特に有用であると思われる。
さらに本発明は、治療的有効量のＮＲＧ３、ＮＲＧ３フラグメント、又はＮＲＧ３アゴニストを哺乳類に投与することを含んでなる哺乳類の治療方法を提供する。例えば、この哺乳類は、神経学的または筋肉疾患を罹患していてもよい。疾患が神経学的疾患である場合、ＮＲＧ３は、中枢（脳及び脊髄）、末梢（交感、副交感、感覚及び内臓ニューロン）及び運動ニューロンを含むインビボでのニューロンの発達、維持、及び／または再生を促進することにおいて有用であると思われる。従って、ＮＲＧ３は、種々の神経学的疾患またはヒト等の哺乳類の神経系に影響する疾患の診断及び／または治療のための方法において利用することができる。
このような疾患は、その神経系が、例えば外傷、手術、発作、虚血、乾癬、代謝異常、神経障害、栄養障害、悪性疾患、または毒性薬によって損傷された患者に発症する。例えば、ＮＲＧ３は、外傷または手術によって損傷した運動ニューロンの生存または成長を促進するために使用できる。また、ＮＲＧ３は、筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリグ病）、ベル麻痺、及び脊髄筋萎縮、または麻痺を含む種々の病状の治療に使用できる。ＮＲＧ３は、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、ハンティングトン舞踏病、ダウン症、神経難聴、及びメニエール病といったヒトの「神経変性疾患(neurodegenerative disorders)」の治療に用いることができる。
さらに、ＮＲＧ３は、神経障害、特に末梢神経障害の治療に使用できる。「魔性神経障害」とは、末梢神経系に影響する疾患を意味し、運動、感覚、感覚運動、または自律神経の機能障害の一つまたはこれらの組み合わせで現れることが多い。末梢神経障害によって現れる広範なモルホロジーは、同様に多数の原因に帰することができる。例えば、末梢神経障害は、遺伝的に獲得され、全身性疾患によってもたらされ、あるいは毒性薬によって誘発される。これらの例は、遠位感覚運動神経障害、または自律神経障害、例えば胃腸管の運動性低下や尿嚢アトニーを含むがこれらに限られない。全身性疾患に伴う神経障害の例は、ポスト-ポリオ症候群を含み；遺伝的神経障害の例は、シャルコー‐マリー‐ツース病、レフサム病、無β‐リポ蛋白血症、タンジアー病、異染性白質萎縮症、ファブリー病、及びドゥジュリーヌ‐ソッタ病を含み；毒性薬によって生ずる神経障害は、ビンクリスチン、シスプラチン、メトトレキサート、または３’-アジド-３’-デオキシチミジン等の化学治療薬による処理で生ずるもの含む。
さらに本発明は、治療的有効量のＮＲＧ３アンタゴニストを哺乳類に投与することを含んでなる哺乳類の治療方法を提供する。この後者の場合の哺乳類は、ＮＲＧ３レベル／生物学的活性の低下が有利となるものである。
本発明のこれら及び他の目的、利点及び特徴は、以下に示す構造、合成、及び用途のより詳細な説明を読むことにより当業者に明らかになるであろう。ここに挙げた各引用文献は、それら引用文献の内容における主題事項の記載に特に注意して、それら全体をここに参考として取り入れるものとする。
本発明のポリペプチド、核酸、ベクター、及び宿主細胞、並びにそれれの製造方法を記載する前に、この発明が記載した特定の物質の組成物及び方法に限定されることなく、それらの組成物及び方法が当然変化しうると解するものとする。また、ここに用いる用語は特定の実施態様を記載するのみに用いられ、何ら限定を目的とするものではなく、本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ特定されると解するものとする。
（定義）
「新規なニューレグリン関連リガンド」、「新規なＮＲＧ３」、「新規なＥｒｂＢ４レセプター特異的ＮＲＧ３」なる用語は互換的に使用され、胎児及び成人の脳及び神経系で特異的に発現されるニューレグリンのファミリーの新たな成員を指し、さらに上記天然のポリペプチドの機能的な誘導体を指す。
「ＮＲＧ３」または「ニューレグリン関連リガンド」なる用語は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２または６（それぞれマウスまたはヒト）の天然のアミノ酸配列ＮＲＧ３の少なくとも一つの生物学的特性（以下に定義される）を有し、さらにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のアミノ酸配列を有するヒトＮＲＧ３の選択的スプライシング形態を含む、何れかのポリペプチド配列であるとここに定義する。この定義は、ヒトＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞のような天然のＮＲＧ３供給源または別の動物種のような別の供給源から単離されたポリペプチド若しくはＮＲＧ３の選択的スプライシング形態だけでなく、組換えまたは合成法によって調製されたポリペプチドをも包含する。それはまた、機能的誘導体、対立遺伝子変異体、天然で生じるアイソフォーム、及びそれらの類似体を含む、変異体形態を含む。場合により該ＮＲＧ３は、哺乳動物から単離された内因性ＮＲＧ３ポリペプチドを指す「天然のＮＲＧ３」である。ＮＲＧ３は、天然のＮＲＧ３（例えば図４及び５に示されたマウス（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）またはヒト（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）ＮＲＧ３）と同じアミノ酸配列を有する限りで、「天然配列ＮＲＧ３」であり得る。しかしながら、「天然配列ＮＲＧ３」は、組換えまたは合成法によって生産されたポリペプチドを包含する。「成熟ＮＲＧ３」は、細胞から放出された可溶性または分泌ＮＲＧ３である（即ち、Ｎ末端疎水性配列を欠いている）。この文脈において、ＮＲＧ３は、天然のシグナル配列の有無に関わらず、細胞外ドメイン内のＥＧＦ様ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む新規なＮＲＧ３を指し、そして開始メチオニンの有無に関わらず、上記ＮＲＧ３の天然で生じる可溶性形態を指し、天然の供給源から精製されたもの、組換え法によって若しくはこれら及び／または他の方法の何れかの組み合わせによって生産されたものを含む。本発明の天然のＮＲＧ３は、図４〜７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）に示されたアミノ酸配列を有するネズミＮＲＧ３、図４〜７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）に示されたアミノ酸配列を有するヒトＮＲＧ３、及びこれらの天然のリガンドのフラグメント、または哺乳動物相同体、または選択的スプライシング形態を含む。本発明の新規な天然のネズミ及びヒトＮＲＧ３は、それぞれ約７１３及び７２０アミノ酸の長さであり、ＥＧＦ様ドメイン、Ｎ末端疎水性部分、セリン／トレオニン豊富部分、予想される膜貫通ドメイン、及び予想される細胞内ドメインを含む。これらのドメインの境界は、新規なネズミ及びヒトＮＲＧ３配列について図４〜７で示されている。
場合により、ＮＲＧ３は、天然のグリコシル化を伴わない。「天然のグリコシル化」は、天然のＮＲＧ３が得られた哺乳動物細胞において生産された場合、天然のＮＲＧ３に共有結合した炭化水素部分を指す。従って、非ヒトにおいて生産されたヒトＮＲＧ３は、天然のグリコシル化を伴わないものとして記載され得、例えばそれは天然のグリコシル化以外のグリコシル化を受ける。場合により、ＮＲＧ３は、（例えば原核生物において組換え的に生産された結果として）何れのグリコシル化も伴わない。
「ＥＧＦ様ドメイン」なる用語は、ポリペプチド、好ましくは本発明のＮＲＧ３ポリペプチドの細胞外上皮増殖因子（ＥＧＦ）様ドメインを指す。ＥＧＦ様ドメインは、ニューレグリンレセプターを結合する能力を有し、細胞応答を刺激する(Holmes, W. E.等 (1992) Science 256: 1205-1210)。好ましくは、本発明のＮＲＧ３のＥＧＦ様ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ネズミまたはヒトＮＲＧ３ ＥＧＦ様ドメイン）に示されたＮＲＧ３のアミノ酸配列を有し、そこで該ＥＧＦ様ドメインは、ヒトＮＲＧ３の約アミノ酸２８４から約アミノ酸３３２まで、ネズミＮＲＧ３の約アミノ酸２８６から約アミノ酸３３４までである。本発明のＮＲＧ３は、選択的スプライシング形態ＮＲＧ３コード遺伝子によってコードされるポリペプチドを包含し、該選択的スプライシング形態は、ＮＲＧ３ ＥＧＦ様ドメインを含む。
ここで使用される用語、「ＥｒｂＢ」は、哺乳動物ＥｒｂＢレセプター（即ち、ＥｒｂＢ２または上皮増殖因子（ＥＧＦ）レセプター；ＥｒｂＢ２またはＨＥＲ２レセプター；ＥｒｂＢ３またはＨＥＲ３レセプター；ＥｒｂＢ４またはＨＥＲ４レセプター；及び将来同定されるこのクラスＩチロシンキナーゼファミリーの何れかの他の成員）の何れか一つ以上を指し、「ｅｒｂＢ」は、これらのレセプターをコードする哺乳動物ｅｒｂＢ遺伝子を指す。
用語、「可溶性形態」、「可溶性レセプター」、「可溶性ＮＲＧ３」、「可溶性ＮＲＧ３」、及びそれらの文法的な変異型は、機能的な膜貫通ドメインを含まない本発明の天然のまたは変異体ＮＲＧ３の変異体を指す。可溶性レセプターにおいては、膜貫通ドメインは、該レセプターが細胞膜に固定できないように、欠失され、切り詰められ、またはさもなければ不活性化されても良い。もし望ましければ、本発明のＮＲＧ３の上記可溶性形態は、さらに完全にまたは部分的に欠失、さもなければ不活性化された細胞質ドメインを有しても良い。
ポリペプチドの「機能的誘導体」は、天然のポリペプチドと共通の質的生物学的活性を有する化合物である。それ故、本発明の天然の新規なＮＲＧ３の機能的誘導体は、上記天然のＮＲＧ３と共通の質的生物学的活性を有する化合物である。「機能的誘導体」は、それぞれの天然のポリペプチドと共通の生物学的活性を有する限り、何れかの動物種（ヒトを含む）から得た天然のポリペプチドのフラグメント、天然の（ヒト及び非ヒト）ポリペプチドの誘導体及びそのフラグメント、並びに天然のポリペプチドのペプチド及び非ペプチド類似体を制限することなく含む。
ここで使用される用語、「フラグメント」は、成熟天然ポリペプチドの配列内の領域を指す。好ましくはＮＲＧ３フラグメントは、ＮＲＧ３のＥＧＦ様ドメインの少なくとも２０，より好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸残基の一連の配列を有するであろう。好ましいフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（マウス由来）若しくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３（ヒト由来）中のＮＲＧ３の配列の一部に等しい約３０−１５０アミノ酸残基を有する。用語、「誘導体」は、天然のポリペプチドのアミノ酸配列及びグリコシル化変異体、及び共有結合修飾体を定義するために使用される。「非ペプチド類似体」は、天然のポリペプチドのペプチド類似体と実質的に同じ表面を表示する有機化合物である。それ故、本発明の天然の新規なＮＲＧ３の非ペプチド類似体は、天然のＮＲＧ３のペプチド類似体と実質的に同じ表面を表示する有機化合物である。上記化合物は、ペプチド類似体と同じ態様で他の分子と相互作用し、本発明の天然のＮＲＧ３の生物学的活性を模倣する。好ましくは、本発明のアミノ酸配列変異体は、天然のＮＲＧ３の少なくとも一つのドメイン、好ましくはＥＧＦ様ドメインを維持し、本発明の天然のＮＲＧ３のドメインと、少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有する。アミノ酸配列変異体は好ましくは、本発明の天然のＮＲＧ３のＥＧＦ様ドメインと最も高い程度のアミノ酸配列相同性を示す。これらは、本発明の新規なＮＲＧ３と、ＮＲＧ３ファミリーの他の成員の間で最も高いパーセントのアミノ酸保存を示すドメインである（図４〜７参照）。
「単離された」または「実質的に純粋」なる用語は、他のポリペプチドまたは核酸、並びに脂質、炭化水素、または天然で会合する他の物質を含んでいないポリペプチドまたは核酸を指す。本発明のＮＲＧ３ポリペプチドのアミノ酸に共有結合した糖部分であるグリコシル化部分は除外される。当業者は、各分子型に対する適切な標準法を使用して、ＮＲＧ３ポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸を精製可能である。
ＮＲＧ３配列に関する用語、「パーセントアミノ酸配列同一性」は、配列を並べ、もし必要であれば、最大のパーセント配列同一性を得るためにギャップを導入した後に、配列同一性の一部としての何れかの保存的置換を考慮せずに、図１に記載された推定のアミノ酸配列を有するＮＲＧ３配列中の残基と同一である候補の配列中のアミノ酸残基のパーセントとしてここで定義される。ＮＲＧ３配列中のＮ末端、Ｃ末端、または内部伸長、欠失または挿入は、配列同一性または相同性に影響を与えるものとして説明されるであろう。
別の型のＮＲＧ３変異体は、「キメラＮＲＧ３」であり、その用語は、異種ポリペプチドに融合または結合された全長ＮＲＧ３またはそのフラグメントを含むポリペプチドを包含する。該キメラは、ＮＲＧ３と少なくとも一つの生物学的特性を共有する。キメラＮＲＧ３の例は、イムノアドヘシン及びエピトープタグ化ＮＲＧ３を含む。別の実施態様として、該異種ポリペプチドは、チオレドキシン、サルベージレセプター結合エピトープ、細胞毒性ポリペプチドまたは酵素（例えばプロドラッグを活性薬剤に変換するもの）である。
「共有結合修飾」及び「共有結合誘導体」なる用語は互換的に使用され、有機タンパク質性または非タンパク質性誘導化薬剤での天然のポリペプチドまたはそのフラグメントの修飾、異種ポリペプチド配列に対する融合、及び翻訳後修飾を制限することなく含む。共有結合修飾は、選択された残基または末端残基と反応可能な有機誘導化薬剤と、標的化アミノ酸残基を反応することによって、または選択された組換え宿主細胞中で機能する翻訳後修飾の機構を利用することによって伝統的に導入される。特定の翻訳後修飾は、発現されたポリペプチドに対する組換え宿主細胞の機能の結果である。グルタミニル及びアスパラギニル残基は、相当するグルタミル及びアスパルチル残基にしばしば翻訳後脱アミド化される。別法として、これらの残基は、穏やかな酸性条件下で脱アミド化される。他の翻訳後修飾は、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル、チロシルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のαアミノ基のメチル化を含む(T. E. Creighton (1983) Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86)。共有結合誘導体／修飾は特に、本発明の天然のＮＲＧ３配列を含む融合タンパク質、及びイムノアドヘシンのようなそれらのアミノ酸配列変異体、及び異種シグナル配列に対するＮ末端融合物を含む。
本発明の内容における用語、「生物学的活性」は、天然のポリペプチドと質的に共通する少なくとも一つのアドヘシン、調節またはエフェクター機能を有するものとして定義される。本発明の範囲内にある好ましい機能的誘導体は、本発明の天然のＮＲＧ３のＥＧＦ様ドメイン及びＥｒｂＢ４レセプター特異的結合を維持することによって一体化される。
「ＥｒｂＢレセプターを活性化する」なる用語は、ＥｒｂＢレセプターの細胞内キナーゼドメインが、チロシン残基リン酸化させる機能を指す。概して、これはＥｒｂＢ４レセプターまたはＥｒｂＢ４レセプターホモダイマーに対するＮＲＧ３の結合を含み、その結合は一つ以上のレセプターのキナーゼドメインを活性化し、それによって一つ以上のレセプター中のチロシン残基のリン酸化、及び／またはさらなる基質ポリペプチド中のチロシン残基のリン酸化を導く。ＥｒｂＢレセプターリン酸化は、以下に記載されるチロシンリン酸化アッセイを使用して定量可能である。本発明のＮＲＧ３は、ＮＲＧ３の細胞内ドメインを経てＥｒｂＢレセプターと相互作用することによってそれ自身活性化されると解される。それ故、ＮＲＧ３に結合する（好ましくは細胞外ドメイン、より好ましくはＥＧＦ様ドメインに結合する）ＮＲＧ３活性化リガンドは、リガンド、抗体またはレセプターを制限することなく含む。ＮＲＧ３の活性化は、細胞内ドメインのリン酸化を通じて、またはレセプター／リガンド介在性細胞シグナリングに共通な他の同様な現象を通じてなされても良い。細胞シグナリングのメディエーターとして、本発明のＮＲＧ３は、アポトーシス、代謝シグナリング、分化または細胞増殖と関連していると予測される。
天然のポリペプチドおよびその機能的誘導体に関して「同一性」または「相同性」なる語は、配列を並べ、もし必要であれば最大のパーセント同一性を達成するためにギャップを導入し、そして配列同一性の部分としていかなる保存的置換をも考慮することなく、相当する天然のポリペプチドの残基と同一である候補の配列中のアミノ酸残基のパーセントとしてここで定義される。ＮまたはＣ末端伸長または挿入のいずれも、同一性または相同性を減少するものとして解釈されない。整列についての方法およびコンピュータープログラムは本分野で周知である。例えば、ここで開示される配列は、Sequence Analysis Programs, Gnentech, Inc, Incを使用して分析された。
「アゴニスト」なる用語は、天然のＮＲＧ３の少なくとも一つの生物学的活性を維持するという条件で、本発明の天然のＮＲＧ３のペプチド及び非ペプチド類似体、および天然のＮＲＧ３を特異的に結合する抗体を指すために使用される。好ましくは、本発明のアゴニストは、天然のＮＲＧ３ポリペプチドの質的なＥＧＦ様ドメイン結合認識特性を維持する。
「アンタゴニスト」なる用語は、本発明の天然のＮＲＧ３の生物学的活性を阻害する分子を指すために使用される。好ましくは、ここでのアンタゴニストは、本発明の天然のＮＲＧ３の結合を阻害する。好ましいアンタゴニストは、さもなければ結合するＥｒｂＢ４レセプターに対する天然のＮＲＧ３の結合を本質的に完全にブロックする。ＮＲＧ３「アンタゴニスト」は、ＮＲＧ３エフェクター機能を妨害または妨げる分子である（例えばＮＲＧ３によるＥｒｂＢ４レセプターの結合及び／または活性化を妨害または妨げる分子）。上記分子は、例えばここで開示されるチロシンリン酸化アッセイにおいて、ＮＲＧ３によるＥｒｂＢレセプター活性化を競合的に阻害する能力に対してスクリーニング可能である。好ましいアンタゴニストは、ＥｒｂＢレセプターとの他のヒレグリンポリペプチドの相互作用を実質的に妨げないものである。ＮＲＧ３アンタゴニストの例は、ＮＲＧ３に対する中和抗体、及びＮＲＧ３遺伝子に対するアンチセンスポリヌクレオチドを含む。
一般的に、「アミノ酸」なる用語は、全ての天然で生じるＬ−α−アミノ酸を指す。しかしながら、ある実施態様として、Ｄ−アミノ酸が、構造的制限を容易にするために本発明のポリペプチドまたはペプチド内に存在しても良い。例えば、ジスルフィド結合形成および安定性を容易にするために、Ｄアミノ酸システインが、本発明の天然のＮＲＧ３のペプチド機能的誘導体またはペプチドアンタゴニストの一つまたは両末端に提供されても良い。アミノ酸は、一文字または三文字表記にそれぞれによって示される：
Ａｓｐ Ｄ アスパラギン酸
Ｉｌｅ Ｉ イソロイシン
Ｔｈｒ Ｔ トレオニン
Ｌｅｕ Ｌ ロイシン
Ｓｅｒ Ｓ セリン
Ｔｙｒ Ｙ チロシン
Ｇｌｕ Ｅ グルタミン酸
Ｐｈｅ Ｆ フェニルアラニン
Ｐｒｏ Ｐ プロリン
Ｈｉｓ Ｈ ヒスチジン
Ｇｌｙ Ｇ グリシン
Ｌｙｓ Ｋ リシン
Ａｌａ Ａ アラニン
Ａｒｇ Ｒ アルギニン
Ｃｙｓ Ｃ システイン
Ｔｒｐ Ｗ トリプトファン
Ｖａｌ Ｖ バリン
Ｇｌｎ Ｑ グルタミン
Ｍｅｔ Ｍ メチオニン
Ａｓｎ Ｎ アスパラギン
「アミノ酸配列変異体」なる用語は、天然のアミノ酸配列と比較してそのアミノ酸配列におけるいくつかの差異を有する分子を指す。
置換変異体は、除去された天然配列中の少なくとも一つのアミノ酸残基、および同じ位置でのその場所に挿入された異なるアミノ酸を有するものである。
挿入変異体は、天然配列中の特定の位置で一つのアミノ酸とすぐ近接して挿入された、一つ以上のアミノ酸を有するものである。一つのアミノ酸にすぐ近接するということは、該アミノ酸のα−カルボキシまたはα−アミノ官能基の何れかと結合していることを意味する。
欠失変異体は、天然アミノ酸配列中の一つ以上のアミノ酸が除去されたものをいう。
「抗体」（Ａｂｓ）及び「免疫グロブリン」（Ｉｇｓ）は、同じ構造的性質を有する糖タンパク質である。抗体が特異的な抗原に対する結合特異性を示す一方で、免疫グロブリンは、抗体、及び抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両者を含む。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系によって低レベルで、及びミエローマによって高レベルで生産される。
天然の抗体及び天然の免疫グロブリンは、通常、２の相同な軽（Ｌ）鎖及び２の相同な重（Ｈ）鎖より成る約１５０，０００ドルトンの異種テトラマー糖タンパク質である。各軽鎖は、一つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に結合し、一方でジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で変化する。重鎖及び軽鎖のそれぞれはまた、規則的な間隔の鎖内ジスルフィド結合を有する。各重鎖は、数多くの定常ドメインが引き続く一つの可変ドメイン(ＶH)を一端で有する。各軽鎖は、一端で一つの可変ドメインを有し(ＶL)、他の一端で一つの定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一の定常ドメインと並んでおり、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと並んでいる。特定のアミノ酸残基が、軽鎖と重鎖の可変ドメインの間で界面を形成していると解される(Clothia等, (1985) J. Mol. Biol. 186: 651-663並びにNovotnyおよびHaber, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4592-4596 )。
何れかの脊椎動物種から得た抗体（免疫グロブリン）の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる二つの明らかに区別されるタイプの一つに分類され得る。
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは、異なるクラスに分類可能である。免疫グロブリンには５の主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭが存在し、これらのいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）に分割される、例えばＩｇＧ−１，ＩｇＧ−２，ＩｇＧ−３，及びＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２。免疫グロブリンの異なるクラスに相当する重鎖定常ドメインは、それぞれα、デルタ、イプシロン、γ及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元構造は、周知である。
「抗体」なる用語は最も広義で使用され、単一のモノクローナル抗体（アゴニストおよびアンタゴニスト抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、同様に抗体フラグメント（例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2及びＦｖ）を、所望の生物学的活性を示す範囲で含む。
ここで使用される用語、「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、即ち該集団を含むそれぞれの抗体が、わずかに存在してもよい天然に生じ得る変異を除いて同等である。「モノクローナル」なる修飾語は、実質的に均質な抗体の集団から得られ、いずれかの特定方法による生産を要求するものとは解されない抗体の特徴を示す。例えば、本発明に従って使用されるべきモノクローナル抗体は、Kohler等, (1975) Nature 256: 495により最初に記述されたハイブリドーマ法により調製されも良く、あるいは組換えDNA法（米国特許第4,816,567号 (Cabilly等)、並びにMage及びLamoyi (1987) in Monoclonal Antibody Production Techniques and Application, pp. 79-97, Marcel Dekker, Inc., New York参照）により調製されても良い。該モノクローナル抗体はまた、例えば、McCafferty等 (1990) Nature 348: 552-554に記載された方法を使用して生産された、ファージライブラリーから単離されても良い。
非ヒト（例えばネズミ）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンから得られた最小の配列を含む特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそのフラグメント(Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2若しくは抗体の他の抗原結合配列等）である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（受容者抗体）であり、そのレセプターの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基は、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラットまたはウサギ等の非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲから得た残基により置換されている。ある例においては、ヒト免疫グロブリンのＦＶフレームワーク領域（ＦＲ）は、対応する非ヒトＦＲ残基により置換されている。更に、ヒト化抗体は、受容者抗体にも、あるいは導入されたＣＤＲまたはＦＲ配列にも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体の性能を更に洗練または最適化させるために行われる。一般的に、ヒト化抗体は実質的に全て、または少なくとも１つ、典型的には２つの可変領域を有し、全てまたは実質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、また全てまたは実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンのものである。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも一部をも含んでよい。更に詳細には、Jones等, (1986) Nature 321: 522-525; Reichmann等, (1988) Nature 332: 323-329; 1987年9月30日に印刷されたEP-B-239 400; Presta, (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 ;および1996年1月24日に印刷されたEP-B-451 216参照、これらの参考文献は、完全に参考としてここに含まれる。ヒト化抗体は、該抗体の抗原結合領域が、興味ある抗原でマカークサルを免疫化することによって生産された抗体から得られる、PrimatizedTM抗体を含む。
ここで定義される「中和抗体」は、天然配列ＮＲＧ３のエフェクター機能をブロックまたは顕著に減少可能な抗体分子を意味する。例えば中和抗体は、ここに記載されるチロシンリン酸化アッセイにおいて、ＥｒｂＢレセプター、好ましくはＥｒｂＢ４レセプターを活性化するＮＲＧ３の能力を阻害または減少できる。中和抗体は、ここで開示される細胞増殖アッセイにおいて、ＮＲＧ３のマイトジェン活性をブロックしても良い。
ここでのモノクローナル抗体は、特に「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含み、その重鎖及び／または軽鎖の一部は、特定の種から得られた抗体の対応する配列に同等、若しくは相同であるか、または特定の抗体種若しくは亜種に属するものであり、その一方で、鎖の残る部分は、他の種から得られた抗体の対応する配列に同等、若しくは相同的であるか、または他の抗体種若しくは亜種に属するものであり、加えて、それらが所望の生物学的活性を示す限りこのような抗体のフラグメントも含む（米国特許第4,816,567号(Cabilly等); Morrison等, (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855）。
本発明の内容において、「細胞」、「細胞系」及び「細胞培養物」及び「宿主細胞」なる用語は互換的に使用され、全てのこのような表記は、子孫の細胞も含む。また全ての子孫は、計画的または不慮の変異のために、ＤＮＡ含量において正確に同等である必要はないものと解される。元の形質転換細胞についてスクリーニングしたのと同様な機能及び生物学的活性を有する変異子孫細胞が含まれる。外来ＤＮＡを宿主中で継続的に維持することを意味する、安定な転移の方法は、本分野で周知である。
「複製可能発現ベクター」、「発現ベクター」及び「ベクター」なる用語は、外来ＤＮＡのフラグメント内に挿入された通常二本鎖のＤＮＡのフラグメントを指す。外来ＤＮＡは、宿主細胞において通常見出されないＤＮＡである、異種ＤＮＡとして定義される。該ベクターは、適切な宿主細胞内に外来または異種ＤＮＡを輸送するために使用される。一度宿主細胞に入ると、該ベクターは、宿主細胞染色体ＤＮＡと非独立に複製でき、該ベクターおよびその挿入された（外来）ＤＮＡのいくつかのコピーが生産される。さらに、該ベクターは、外来ＤＮＡをポリペプチドに翻訳することを許容するのに必要なエレメントを含む。かくして、外来ＤＮＡによってコードされたポリペプチドの多くの分子は、急速に合成される。
「コントロール配列」なる用語は、特定の宿主中で機能的に連結されたコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に好適なコントロール配列は、例えばプロモータ、場合によりオペレータ配列、リボソーム結合部位、および可能性としては他のまだほとんど理解されていない配列を含む。真核細胞は、プロモータ、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを使用することが周知である。
核酸は、他の核酸配列と機能的に関連して配置される場合に、「機能的に連結している」。例えば、プレ配列または分泌リーダーに対するＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合にポリペプチドのＤＮＡに機能的に連結し；またプロモーター若しくはエンハンサーは、それが配列の転写に影響する場合にコード配列に対して機能的に連結し；またリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように位置する場合にコード配列に機能的に連結している。一般的に、「機能的に連結」とは、ＤＮＡ配列が連続し、分泌リーダーの場合には連続かつ読み取りの枠内に連結されることを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続する必要はない。連結は、慣用の制限部位においての連結により達成される。そのような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが慣用の方法により使用される。
「オリゴヌクレオチド」とは、1988年5月4日に発行されたEP 266,032に記載されたような固相法を使用して、またはFroehler等, (1986) Nucl. Acids Res. 14: 5399に記載されたデオキシヌクレオシドＨ−ホスファナート中間体を介して、ホスホトリエステル、ホスフィト、またはホスホルアミダイト化学のような周知の方法によって化学的に合成された、短い長さの一本鎖または二本鎖ポリデオキシヌクレオチドである。次いでそれらはポリアクリルアミドゲル上で精製される。
「固相」なる用語は、興味ある物質（例えばＮＲＧ３またはそれに対する抗体）が付着可能な非水性のマトリックスを意味する。ここで包含される固相の例は、部分的または全体的にガラスで形成されたもの（例えば制御孔ガラス）、ポリサッカリド（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンを含む。特定の実施態様として、本文脈において、固相はアッセイプレートのウェルを含む；他の実施態様として、それは精製カラムである（例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム）。この用語はまた、米国特許第4,275,149号に記載されたもののような分離した粒子の非継続的な固相を含み、該文献はその全体を参考としてここに取り入れる。
「形質転換」及び「形質導入」なる用語は、ここで互換的に使用され、細胞内にＤＮＡを導入する工程を意味する。形質転換または形質導入に引き続き、ＮＲＧ３ ＤＮＡは、宿主細胞ゲノム内に挿入され、または染色体外成分として存在しても良い。もし実質的な細胞壁構築物を含む原核生物細胞が宿主として使用されたならば、ＤＮＡでの細胞の形質導入の好ましい方法は、Cohen等, (1972) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 69: 2110-2114に記載されたカルシウム処理法、またはChung等, (1988) Nuc. Acids. Res. 16: 3580のポリエチレングリコール法である。もし酵母が宿主として使用されたならば、形質導入は、Hinnen (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75: 1929-1933に教示されるポリエチレングリコールを使用して一般的に達成される。もし哺乳動物細胞が宿主細胞として使用されたならば、形質導入は一般的に、Graham等, (1978) Virology 52: 546, Gorman等 (1990) DNA and Protein Eng. Tech. 2: 3-10のリン酸カルシウム沈降法によって実施される。しかしながら、核注射、電気穿孔法、またはプロトプラスト融合のような、原核生物及び真核生物細胞内にＤＮＡを導入する他の周知の方法も、本発明における使用に適している。
ＮＲＧ３をコードするＤＮＡの哺乳動物における一過的発現を提供する発現ベクターは、本発明において特に有用である。一般的に、一過的発現は、宿主細胞が多コピーの発現ベクターを蓄積し、次いで発現ベクターによってコードされた高レベルの所望のポリペプチドを合成するように、宿主細胞において効率的に複製可能な発現ベクターの使用を含む。適切な発現ベクター及び宿主細胞を含む一過的な発現系は、クローン化ＤＮＡによってコードされるポリペプチドの簡便な陽性の同定、並びに所望の生物学的または生理学的特性に対する上記ポリペプチドの迅速なスクリーニングを可能にする。
本発明のＮＲＧ３は、1991年5月16日に発行された国際特許出願WO 91/06667に提供されたような、相同的組換えによって生産できることもさらに考慮される。略記すると、本方法は、内因性ＮＲＧ３遺伝子を含む細胞を、相同的ＤＮＡで形質転換することを含み、該相同的ＤＮＡは、（ａ）増幅可能遺伝子（例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする遺伝子）及び（ｂ）ＮＲＧ３をコードする遺伝子内またはそれに近接した細胞ゲノム中のヌクレオチド配列と相同的である、少なくとも約１５０ベースペアの長さを有する少なくとも一つの横側の配列を含む。形質導入は、組換えによって細胞ゲノム中に相同的ＤＮＡが挿入されるような条件下で実施される。相同的ＤＮＡが挿入されたものを有する細胞は、次いで増幅可能遺伝子の増幅について選択する条件を受けさせられ、それによって該ＮＲＧ３遺伝子は付随して増幅される。生成細胞は次いで、所望の量のＮＲＧ３の生産についてスクリーニングされる。ＮＲＧ３をコードする遺伝子に近接した横側の配列は、例えば出発地点として図１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のマウスＮＲＧ３，あるいは図２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）または図３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）のヒトＮＲＧ３のヌクレオチド配列またはそのフラグメントを使用して、ゲノムウォーキングの方法によって容易に同定される。マウス及びヒトＮＲＧ３ポリペプチドをコードするＤＮＡは、ATCC 209156(マウス; pLXSN.mNRG3), ATCC 209157 (ヒト; pRK5.tk.neo.hNRG3B1)またはATCC 209157(ヒト; pRK5.tk.neo.hNRG3B2)としてAmerican Type Culture Collectionに寄託される。
「細胞の生存を延長すること」なる表現は、インビトロまたはインビボの何れかで、ＮＲＧ３にさらされていない非処理細胞に対して細胞の存在する期間が増大する機能を指す。
「細胞の増殖を促進すること」なる用語は、インビトロまたはインビボの何れかで、非処理細胞に対して細胞の成長及び／または再生産の量を増大する工程を包含する。細胞培養物中の細胞増殖の増大は、ＮＲＧ３にさらす前後の細胞の数を計測することによって検出可能である（以下の実施例参照）。増殖の程度は、顕微鏡下での集合の度合いの査察を介して定量可能である。細胞増殖はまた、細胞による3Ｈ取り込みを測定することによって定量可能である。
「細胞の分化を促進すること」なる用語は、元の細胞のものとは異なる一つ以上の特徴または機能を獲得するまたは有する程度を増大する機能を意味する（即ち細胞特異化）。これは、細胞の表現型の変化をスクリーニングすることによって検出可能である（例えば細胞における形態的変化を同定すること）。
「筋細胞」は、骨格筋、心筋または平滑筋組織細胞を含む。この用語は、より特異化した筋細胞（例えば筋芽細胞）を形成するために分化した細胞を包含する。
「単離したＮＲＧ３核酸」は、天然の供給源において通常会合している少なくとも一つの混在した供給源の核酸を含んでいない、好ましくは他の何れかの哺乳動物ＲＮＡまたはＤＮＡを実質的に含んでいないＲＮＡまたはＤＮＡである。「通常会合している少なくとも一つの混在した供給源の核酸を含んでいない」なる用語は、核酸が供給源のまたは天然の細胞において存在しているが、異なる染色体位置にある、またはさもなければ供給源の細胞において通常見出されない核酸配列によって横に並んでいる場合を含む。単離されたＮＲＧ３核酸の例は、図１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に示されたマウスＮＲＧ３、若しくは図２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）または図３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）に示されたヒトＮＲＧ３と、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは９０％、最も好ましくは９５％の配列同一性を有する生物学的に活性なＮＲＧ３をコードするＲＮＡまたはＤＮＡである。
核酸は、他の核酸配列と機能的に関連して配置される場合に、「機能的に連結している」。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合にポリペプチドのＤＮＡに機能的に連結し；またプロモータ若しくはエンハンサーは、それが配列の転写に影響する場合にコード配列に対して機能的に連結し；またリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように位置する場合にコード配列に機能的に連結している。一般的に、「機能的に連結」とは、ＤＮＡ配列が連続し、分泌リーダーの場合には連続かつ読み取りの枠内に連結されることを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続する必要はない。連結は、慣用の制限部位においての連結により達成される。そのような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが慣用の方法により使用される。
ハイブリダイゼーションは好ましくは「緊縮条件」下で実施され、これは、（１）例えば５０℃で０．０１５塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムといった、低イオン強度および高温での洗浄を使用し、または（２）例えば４２℃で０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む５０ｎＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５を含む５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ホルムアミドといった、ホルムアミドのような変性試薬をハイブリダイゼーションの間に使用することを意味する。もう一つの例としては、４２℃で５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６／８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、ソニケートされたサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを使用し、４２℃で０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で洗浄する。またもう一つの例は、５５℃で１０％硫酸デキストラン、２×ＳＳＣ（塩酸ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５０％ホルムアミドを使用してハイブリダイゼーションし、引き続き５５℃でＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣより成る強緊縮洗浄を実施する。
「イムノアドヘシン」または「ＮＲＧ３−イムノアドヘシンキメラ」とは、免疫グロブリン配列と結合タンパク質の機能的ドメイン（通常リセプター、細胞接着分子またはリガンド）を組み合わせたキメラ抗体様分子である。このタイプの融合タンパク質の最も一般的な例は、特異的なリガンドを認識する細胞表面レセプターのドメインと、免疫グロブリン（Ｉｇ）のヒンジ及びＦｃ領域を組み合わせる。このタイプの分子は、「免疫」および「接着」機能を組み合わせるために、「イムノアドヘシン」と呼ばれる；他のしばしば使用される名前としては、「Ｉｇ−キメラ」、「Ｉｇ−」または「Ｆｃ融合タンパク質」、あるいは「レセプター−グロブリン」である。
「治療」は、治療的処理及び予防的または防止的手段の両者を指す。治療を必要とするものは、すでに疾患を有するもの並びに疾患が防止されなければならないものを含む。 治療のための「哺乳動物」は、ヒトを含む哺乳動物、ヒツジ、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ等の家庭及び農場の動物、及び動物園、スポーツまたはペット用の動物として分類される何れかの動物を指す。好ましくは哺乳動物はヒトである。
ここで使用される「キャリア」は、使用される投与量及び濃度でさらされる細胞または哺乳動物に対して非毒性である製薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤を含む。しばしば、製薬学的に許容可能なキャリアは、水性ｐＨ緩衝溶液である。生理学的に許容可能なキャリアの例は、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基以下）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギンまたはリシンのようなアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストランを含むモノサッカリド、ジサッカリド、及び他の炭化水素；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成対イオン；及び／またはＴｗｅｅｎTM 、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びPluronicsTMのような非イオン性界面活性剤を含む。
（組換えＤＮＡ法によるＮＲＧ３の生産のための一般的方法）
Ａ．新規なニューレグリン関連リガンド、ＮＲＧ３をコードする核酸の同定及び単離
本発明の天然のＮＲＧ３は、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーから単離できる。例えば、適切なｃＤＮＡライブラリーは、所望のＮＲＧ３を発現することが周知の細胞からポリアデニル化ｍＲＮＡを得、二本鎖ｃＤＮＡを合成するための鋳型として該ｍＲＮＡを使用することによって構築できる。ｍＲＮＡの適切な供給源は、胎児及び成人哺乳動物組織である。本発明の天然のＮＲＧ３をコードするｍＲＮＡは、例えば成人哺乳動物、脳、神経系、心臓、筋肉、及び精巣において発現される。本発明の新規なＮＲＧ３をコードする遺伝子はまた、ヒトゲノムコスミドライブラリー、またはマウス由来胚幹細胞（ＥＳ）ゲノムライブラリーのようなゲノムライブラリーから得ることができる。
ｃＤＮＡまたはゲノムのいずれかのライブラリーは、興味ある遺伝子またはそれによってコードされるタンパク質を同定するようにデザインされたプローブを使用してスクリーニングされる。ｃＤＮＡ発現ライブラリーのための適切なプローブは、本発明のＮＲＧ３を認識し特異的に結合するモノクローナル及びポリクローナル抗体を含む。ｃＤＮＡライブラリーのための適切なプローブは、同種または異種から得たＮＲＧ３ポリペプチドの周知のまたは可能性のある部分をコードする注意深く選択されたオリゴヌクレオチドプローブ（通常約２０−８０ベースの長さ）、相補的なまたは相同的なｃＤＮＡ、または同種または異種の遺伝子をコードするフラグメントを含む。ゲノムＤＮＡライブラリーのための適切なプローブは、同じまたは同様な遺伝子をコードするオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、またはフラグメント、及び／または相同的なゲノムＤＮＡまたはそのフラグメントを制限することなく含む。選択されたプローブでｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることは、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989の第１０−１２章に記載されたような標準法を使用して実施され、その内容は完全に参考としてここに取り入れる。
本発明のＮＲＧ３をコードするＤＮＡが、各種の組織から得たｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために注意深く選択されたオリゴヌクレオチド配列を使用することによって単離されたならば、プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、偽の陽性選択を最小化するのに十分な長さで十分に明確であるべきである。真のヌクレオチド配列は、一つ以上の位置で縮重しているかもしれない。縮重したオリゴヌクレオチドの使用は、好ましいコドンの使用が周知ではない種から得たライブラリーがスクリーニングされる場合、特に重要である。
該オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされているライブラリーにおいてＤＮＡにハイブリダイズした際に検出できるように標識されなければならない。好ましい標識化の方法は、該オリゴヌクレオチドの５’末端に放射性標識するために、ＡＴＰ（例えばγ32Ｐ）及びポリヌクレオチドキナーゼを使用することである。しかしながら、ビオチン化または酵素標識化を制限することなく含む他の方法も、該オリゴヌクレオチドを標識するために使用され得る。
新規なＮＲＧ３をコードするｃＤＮＡはまた、直接的発現クローニング、または1987年7月28日に印刷された米国特許第4,683,195号、Sambrook等, 上記参照の第１４章、Ausubel等編, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience 1991, Current Protocols in Molecular Biologyの第１５章に記載されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することのような、組換えＤＮＡ法の他の周知の方法によって同定し単離することができ、上記文献は完全に参考としてここに含まれる。
一種から新規な天然のＥｒｂＢ４レセプター特異的ＮＲＧ３をコードするｃＤＮＡがひとたび単離されると、他種からのｃＤＮＡは、種間交差ハイブリダイゼーションによって得ることができる。このアプローチに従って、ヒトまたは他の哺乳動物のｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーは、周知の基準に従って周知のＮＲＧ３配列（ネズミまたはヒト配列のような）から選択された標識化オリゴヌクレオチド配列によってプローブされる。好ましくは、プローブ配列は、偽の陽性を最小化するのに十分な長さで十分に明確であるべきである。典型的には、特にもし該オリゴヌクレオチドが、メチオニンまたはトリプトファンに対する一つ以上のコドンを含むのであれば、約３０から５０ベースを有する32Ｐ標識化オリゴヌクレオチドで十分である。単離された核酸は、核酸の供給源から得た他のポリペプチドをコードする混在した核酸から同定され分離されるＤＮＡであろう。ハイブリダイゼーションは、ここで定義される「緊縮条件」の下で好ましくは実施される。
一度配列が解明されると、特定のＮＲＧ３をコードする遺伝子もまた、化学的合成、及びEngels及びUhlmann, Agnew (1989) Chem. Int. Ed. Engl. 28: 716に記載された以下の方法の一つで得ることができ、該文献は完全に参考としてここに含まれる。これらの方法は、トリエステル、亜リン酸塩、ホスホロアミダイト及びＨ−ホスホナート法、ＰＣＲ及び他の自動プライマー法、及び固相上でのオリゴヌクレオチド合成を含む。
Ｂ．新規なＮＲＧ３をコードする核酸のクローニング及び発現
新規なＮＲＧ３をコードする核酸がひとたび入手可能になると、一般的にさらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のための複製可能発現ベクター内に連結される。 発現およびクローニングベクターは本分野で周知であり、ベクターを一つ以上の選択された宿主細胞において複製可能にする核酸配列を含む。適切なベクターの選択は、１）それがＤＮＡ増幅またはＤＮＡ発現のいずれのために使用されるものか、２）ベクター内に挿入されるＤＮＡのサイズ、および３）該ベクターを使用してトランスフォームされる宿主細胞に依存するであろう。核ベクターは、その機能（ＤＮＡの増幅またはＤＮＡの発現）およびそれが適合可能である宿主細胞に依存して様々な構成要素を含む。ベクター構成要素は一般的に、以下のものの一つ以上を制限することなく含む：シグナル配列、複製オリジン、一つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列。所望のコードおよびコントロール配列という上記記載の構成要素の一つ以上を含む適切なベクターの構築は、標準的な連結法を使用する。単離されたプラスミドまたはＤＮＡフラグメントは、切断され、加工され、そして必要とされるプラスミドを生産するために望ましい形態に再連結される。構築されたプラスミドにおける正確な配列を確認するための分析として、連結混合物は、例えば大腸菌Ｋ１２株２９４（ATCC 31,446）といった大腸菌細胞を形質転換するために一般的に使用され、適切であるかどうかアンピシリンまたはテトラサイクリン耐性によって成功した形質転換体を選択する。該形質転換体からプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ切断によって分析し、および／またはMessing等, (1981) Nucleic Acids Res. 9: 309 の方法、またはMaxam等, (1980) Methods in Enzymology 65: 499 の方法によって配列決定する。
本発明のポリペプチドは、様々な原核生物および真核生物宿主細胞において発現される。適切な原核生物は、例えば大腸菌またはバチルスといったグラム陰性またはグラム陽性生物が含まれる。好ましいクローニング宿主は、大腸菌２９４（ATCC 31,446）であるが、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ATCC 31,537）、大腸菌Ｗ３１１０（ATCC 27,325）、シュードモナス種、またはSerratia Marcesansのような他のグラム陰性またはグラム陽性原核生物が適している。
原核生物に加えて、糸状菌または酵母等の真核微生物も、ここでのベクターの好適な宿主である。Saccharomyces cerevisiaeまたは通常のパン酵母は、下等真核性宿主微生物の内では最も通常に使用されている。しかしながら、S. pombe (BeachおよびNurce, (1981) Nature 290:140)、Kluyveromyces. lactis (Louvencourt等, (1983) J.Bacteriol. 737); yarrowia (EP 402,226)；Pichia pastoris (EP 183,070); Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa (Case等, (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:5259-5263)およびA. nidulans (Ballance等, (1983) Biochem. Biophys. Res. Commun. 112:284-289; Tilburn等, (1983) Gene 26: 205-221 ; Yelton等, (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1470-1474)及びA. niger (Kelly等, (1985) EMBO J. 4: 475-479)等のAspergillus宿主等、多くの他の属、種及び株が一般的に入手可能であり、また有用である。
好適な宿主細胞はまた、多細胞生物から導かれる。このような宿主細胞は、複雑な処理及びグリコシル化活性が可能である。原理的には、脊椎動物または無脊椎動物のいずれから導かれようが、任意の高等真核細胞培養物が利用可能であるが、ヒトのような哺乳動物由来の細胞が好ましい。無脊椎動物細胞の例は、植物及び昆虫細胞である。多くのバキュロウイルス株及び変異体、並びに対応する許容可能な昆虫宿主細胞が、Spodoptera frugiperda（イモ虫）、Aedes aegypti（蚊）、Aedes albopictus（蚊）、Drosophila melanogaster（ショウジョウバエ）及びBombyx mori宿主細胞から同定されている。例えば、Luckow et al., Bio/Technology 6:47-55 (1988); Miller et al., in Genetic Engineering, Setlow et al., eds. Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), pp.277-279; 及びMaeda等, (1985) Nature 315:592-594参照。例えばAutographa californixa NPVのL-1変異体等の形質導入のための多くのウイルス株が一般に入手可能であり、このようなウイルスは本発明におけるウイルスとして特にSpodoptera frugiperda細胞の形質導入のために使用され得る。
綿、トウモロコシ、ポテト、ダイズ、ペチュニア、トマト及びタバコの植物細胞培養物は、宿主として使用され得る。典型的には、植物細胞は、予めＮＲＧ３ ＤＮＡを含むように操作された細菌のある種の株、Agrobacterium tumefaciensと共に培養することにより形質導入される。植物細胞培養物とA. tumefaciensとの培養の間に、ＮＲＧ３をコードするＤＮＡが植物細胞宿主に移動し、それが形質導入されて適当な条件下でＮＲＧ３ ＤＮＡを発現するであろう。加えて、ノパリン合成酵素プロモーター及びポリアデニル化シグナル配列等の植物細胞に適合性の調節及びシグナル配列も入手可能である。Depicker等, (1982) J. Mol. Appl. Gen. 1:561。加えて、T-DNA 780遺伝子の上流領域から単離されたＤＮＡフラグメントは、組換えＤＮＡ含有植物組織において、植物が発現可能な遺伝子の転写レベルを活性化及び増大可能である。1989年6月21日発行のEP 321,196。
しかしながら、最も興味あるのは脊椎動物細胞であり、培養物（組織培養物）中での脊椎動物細胞の増殖は、本質的に周知である（例えば、Tissue Culture, Academic Press Kruse and Patterson, 編(1973)参照）。有用な哺乳動物細胞系の例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（COS-7, ATCC CRL 1651）；ヒト胚腎細胞系（２９３または懸濁培養中の生育についてサブクロ−ンされた２９３細胞、Graham等,(1977) J. Gen. Virol. 36:59 ）；仔ハムスター腎細胞9BHK, ATCC CCL 10）；モルモット卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（CHO, Urlaub等, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 ）；マウスセルトリ細胞（TM4, Mather, (1980) Biol. Reprod. 23:243-251）；サル腎細胞（CV1 ATCC CCL 70）；アフリカミドリザル腎細胞（VERO-76, ATCC CRL-1587）；ヒト頸部腫瘍細胞（HELA, ATCC CCL 2）；イヌ腎細胞（MDCK, ATCC CCL 34）；バッファローラット肝細胞（BRL 3A, ATCC CRL 1442）；ヒト肺細胞（W138, ATCC CCL 75）；ヒト肝細胞（Hep G2, HB 8065）；マウス乳癌（MMT 060562, ATCC CCL 51）；ＴＲＩ細胞（Mather等, (1982) Annal. N. Y. Acad. Sci. 383:44-68）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；並びにヒト肝癌系（Hep G2）である。好ましい宿主細胞は、ヒト胚腎２９３およびチャイニーズハムスター卵巣細胞である。
本発明の実施において特に有用な発現ベクターは、ここでの新規なＮＲＧ３をコードするＤＮＡの哺乳動物細胞における一過的発現を提供する。一過的発現が好ましい場合、発現は、宿主細胞が発現ベクターの多コピーを蓄積し、そして該発現ベクターによってコードされる所望のポリペプチドの高レベルを合成するような、宿主細胞において効率的に複製可能である発現ベクターの使用を含む。適切な発現ベクターおよび宿主細胞を含む一過的系は、クローンＤＮＡによってコードされるポリペプチドの簡便な陽性の同定を許容し、同様に所望の生物学的または生理学的性質についての上記ポリペプチドの急速なスクリーニングを許容する。それ故、一過的発現系は、本発明の天然のＮＲＧ３の類似体および変異体を同定する目的のために、本発明において特に有用である。
組換え脊椎動物細胞培養物におけるＮＲＧ３の合成の適用に適した他の方法、ベクター、および宿主細胞は、Getting等, (1981) Nature 293: 620-625; Mantel等, (1979) Nature 281: 40-46; Levinson等; EP 117,058に記載されている。ＮＲＧ３ポリペプチドの哺乳動物細胞培養物発現のための特に有用なプラスミドは、ｐＲＫ５（EP307,247）またはｐＳＶ１６Ｂ（ＰＣＴ出願番号WO 91/08291）である。
様々な宿主細胞における本発明のＮＲＧ３の発現に適した他のクローニングおよび発現ベクターは、例えば1991年11月27日に印刷されたEP 457,758に記載されている。数多くの様々な発現ベクターが、現在商業的に入手可能である。例示的な商業的な酵母発現ベクターは、ｐＰＩＣ．９(Invitrogen)であり、大腸菌細胞の形質転換に適した商業的に入手可能な発現ベクターはＰＥＴ１５ｂ(Novagen)である。
Ｃ．宿主細胞の培養
本発明のＮＲＧ３の生産に使用される原核細胞は、一般にSambrook et al., 前出文献に記述されるように適当な培地中で培養される。
哺乳動物細胞は、様々な培地で培養することができる。商業的に入手可能な、例えばHam's F10(Sigma)、最小必須培地（(MEM), Sigma）、ＲＰＭＩ−１６４０(Sigma)及び、ダルベッコ修飾イーグル培地（(DMEM)、Sigma）が、宿主細胞の培養に好適である。加えて、HamおよびWallance., (1979) Meth. Enz. 58:44, BarnsおよびSato., (1980) Anal. Biochem. 102:255, 米国特許第4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; または4,560,655; WO90/03430; WO87/00195; 及び米国再審査特許30,985に記述されている何れかの培地も宿主細胞の培養培地として使用され得る。これらのいずれの培地も、必要に応じてホルモン類及び／または多の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または表皮成長因子等）、塩類（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸等）、緩衝剤（HEPES等）、ヌクレオシド（アデノシン及びチミジン等）、抗生物質（ゲンタマイシンTM等）、微量元素（通常マイクロモルの最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、並びにグルコースまたは他の同等なエネルギー源が補充されてもよい。その他の必要な補充物が、当業者に周知である適当な濃度をもって含まれてもよい。温度、ｐＨ等の培養条件は、クローニングまたは発現のために選択された宿主について従来使用されている通りで、当業者には明らかであろう。
この開示において引用される宿主細胞は、インビトロ細胞培養物、並びに宿主動物または植物内にある細胞を含む。
本発明のＮＲＧ３は、相同的組換え、または特定のＮＲＧ３をコードするＤＮＡを既に含む細胞内に導入された制御要素を利用する組換え生産法を使用して生産されることは、さらに考慮されている。
Ｄ．遺伝子増幅及び／または発現の検出
遺伝子増幅及び／または発現は、試料中において例えば慣用のサザンブロッティング、ｍＲＮＡの転写を定量するノーサンブロッティング（Thomas, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5201-5205）、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、またはインシトゥー(in situ)・ハイブリダイゼーションにより、ここに提供される配列に基づいた適当な標識プローブを使用して直接に測定され得る。種々の標識が使用され得、最も普通には放射性同位体、特に32Ｐである。しかしながら、ポリヌクレオチドに導入するためのビオチン修飾ヌクレオチドの使用等、他の技術も採用され得る。次いでビオチンは、放射性核種、蛍光体、酵素等の広範囲の種々の標識により標識されたアビジンまたは抗体に対する結合部位として作用する。別法として、ＤＮＡ二重体、ＲＮＡ二重体、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重体またはＤＮＡ−タンパク質二重体等の特定の二重体を認識する抗体が採用され得る。次いで抗体は、標識され、またアッセイが実行され、ここにおいて二重体は表面に結合され、該表面の二重体形成により該二重体に結合する抗体が検出され得る。
別法として、遺伝子発現は組織断面の免疫組織化学的染色、及び細胞培養物または体液のアッセイ等の免疫学的方法により、遺伝子生成物の発現を直接に定量して測定され得る。免疫組織化学的染色技術によれば、細胞試料が典型的には脱水及び固定化により調製され、次いで結合される遺伝子生成物に対して特異的な標識抗体が反応に付され、ここにおいて標識は、一般に酵素標識、蛍光標識、発光性標識等の目視検出可能なものである。本発明に使用するために好適な特に高感度の染色技術は、Hse等, (1980) Am. J. Clin. Parm. 75:734-738に記述されている。
免疫組織化学的染色及び／または試料液体のアッセイのために有用な抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれでもよく、いかなる動物においても調製され得る。簡便には、該抗体は、天然ＮＲＧ３ポリペプチドに対して、または以下に開示されるＤＮＡ配列に基づいた合成ペプチドに対して調製される。
Ｅ．天然ＮＲＧ３のアミノ酸配列変異体
天然ＮＲＧ３のアミノ酸配列変異体は、天然のＮＲＧ３ ＤＮＡ内へ適切なヌクレオチド変化を導入することによって、または所望のポリペプチドのインビトロ合成によって、本分野で周知の方法により調製される。アミノ酸配列変異体の構築においては、二つの主要な変数が存在する：突然変異部位の位置および突然変異の性質である。天然のＮＲＧ３をコードするＤＮＡ配列の操作を必要としない天然で生じる対立遺伝子を除いて、ＮＲＧ３のアミノ酸配列変異体は、対立遺伝子に到達するものであれ、天然で生じないアミノ酸配列に到達するものであれ、ＤＮＡを突然変異することによって好ましくは構築される。
突然変異の一つの群は、本発明の新規な天然のマウスまたはヒトＮＲＧ３の細胞該ドメインまたはＥＧＦ様ドメイン内で作製されるであろう（ヒトまたはマウスＮＲＧ３アミノ酸配列内のそれぞれの細胞外ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）及びＥＧＦ様ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）の図式については図３参照）。これらのドメインは、機能的に重要であると解されるので、これらの領域における非保存的置換、挿入及び／または欠失のような改変は、ＥｒｂＢ４レセプター結合及び活性化のような天然のレセプター分子の特性における本当の変化を導くことが予測される。従って、この領域におけるアミノ酸改変はまた、相当する天然のポリペプチドとは顕著に異なる特性を有する変異体を導くものと解される。これらの機能的に重要なドメイン内の非保存的置換は、天然の相当するもののＥｒｂＢ４レセプター認識及び結合能力を失い、または相当する天然のタンパク質と比較して増大したＥｒｂＢ４レセプター認識特性、増大した選択性、または増大した活性化特性を有する変異体を導くかもしれない。
その代わりに、またはそれに加えて、アミノ酸改変は、達成すべき目的に依存して、様々な種から得た新規なＮＲＧ３において、または高く保存された領域において、異なる部位を作製することができる。上記部位での位置は、例えば（１）保存された選択を使用した最初の置換、それから達成する結果に依存したさらなる徹底的な選択を使用した置換、（２）ターゲット残基の欠失、または（３）位置された部位に隣接した同じまたは異なるクラスの残基の挿入、あるいは１−３のケースの組み合わせといった一連の修飾を典型的に受けるであろう。一つの役立つ方法は、「アラニンスキャニング」と呼ばれるものである(CunninghamおよびWells, (1989) Science 244, 1081-1085)。
本発明の変異体ＮＲＧ３のまた別の群において、一つ以上の機能的により重要ではないドメインが、欠失または不活性化されても良い。例えば、膜貫通ドメインの欠失または不活性化は、天然のタンパク質の可溶性形態を生ずる。代わりに、または加えて、細胞内ドメインが欠失、切り詰め、さもなければ改変されても良い。天然で生じるアミノ酸は、共通な側鎖の性質に基づいて群に分けられる：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性疎水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖の伸長に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
保存的置換は、一つの群の一つの成員を同じ群のもう一つの成員と交換することを含む一方、非保存的置換は、一つの群の成員をもう一つのこれらのクラスと交換することを含む。機能または免疫学的同一性における実質的な変化は、より保存的でないＮＲＧ３の置換によってなされる、すなわち（ａ）例えばシートまたはヘリックス構造といった置換の領域でのポリペプチド骨格の構造、（ｂ）ターゲット部位での分子の電荷または疎水性度、（ｃ）側鎖の大きさを有することにおける効果において顕著に異なるものでなされる。本発明の新規な天然のＮＲＧ３の性質における最大の変化を生産することが一般的に期待される置換は、（ａ）例えばセリルまたはスレオニルといった親水性残基を、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニルといった疎水性残基に置換すること；（ｂ）システインまたはプロリンを他の残基に置換すること；（ｃ）例えばリシル、アルギニル、またはヒスチジルといった塩基性の側鎖を有する残基を、例えばグルタミルまたはアスパラチルといった酸性の残基で置換すること；あるいは例えばフェニルアラニンといった大きな側鎖を有する残基を、例えばグリシンといった側鎖を有しないものに置換することであろう。上記置換は、ＥＧＦ様ドメインのような細胞外ドメイン内でなされた場合、より顕著な効果を有すると予測される。
本発明の新規なＮＲＧ３の置換変異体は、他のタンパク質の機能的に相同な（少なくとも約４０％−５０％の相同性を有する）ドメインが、細胞外ドメインまたはＥＧＦ様ドメインのような、新規なＮＲＧ３構築物内の上述のドメインの一つ以上について、通常の方法によって置換された変異体を含む。
アミノ酸配列欠失は、通常約１から３０残基、好ましくは約１から１０残基の範囲であり、典型的には連続している。典型的には、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメイン、または膜貫通ドメインのみが欠失される。しかしながら、天然のＮＲＧ３の生物学的活性及び免疫学的交差反応性を保存する膜貫通領域のＣ末端からＮ末端の何れかの適切なアミノ酸までの欠失が適している。ヒト及びマウスＮＲＧ３コンセンサス配列のそれぞれの膜貫通領域（ＴＭ）が、約アミノ酸３６２から約アミノ酸３８４まで（ヒトＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）、及び約アミノ酸３６０から約アミノ酸３８２まで（マウスＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の範囲で図４及び５に示されている。
本発明の好ましいクラスの置換及び／または欠失変異体は、新規なＮＲＧ３分子の膜貫通領域を含むものである。膜貫通領域は、細胞膜の脂質二重相を打ち抜くのに正確なサイズである非常に疎水性または親油性のドメインである。それらは、ＮＲＧ３を細胞膜に固定し、ホモまたはヘテロポリマー複合体形成を可能にすると解される。典型的に、膜貫通ドメインヒドロキシル化残基の欠失または置換による、膜貫通ドメインの不活性化は、細胞または膜脂質親和性を減少し、水性溶解性を増大することによって、回収及び製剤化を容易にするであろう。もし膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインが欠失されたならば、さもなければ体内で異物として認識される細胞内ポリペプチドをさらすことによって、または潜在的に免疫原性である異種ポリペプチドの挿入によっての何れかで、潜在的に免疫原性のエピトープを導入することを避けなければならない。膜挿入機能の不活性化は、膜貫通において実質的に親水性の疎水性度のプロフィールを提供するのに十分な残基を欠失することによって、または同じ結果を生ずる異種残基で置換することによって達成される。
本発明のＮＲＧ３の膜貫通不活性化変異体の主な利点は、それらが組換え宿主の培養培地中に分泌されることである。これらの変異体は、血液のような体液に可溶性であり、細胞膜脂質に対する適切な親和性を有さず、かくして組換え細胞培養物からの回収が簡素化される。一般論として、上記可溶性変異体は、機能的細胞外ドメインまたはそのフラグメントを維持するが、機能的膜貫通ドメインを有さず、好ましくは機能的細胞質ドメインをも有さないであろう。
例えば、膜貫通ドメインは、約５から５０個のセリン、トレオニン、リシン、アルギニン、グルタミン、アスパラギン酸等の親水性残基のランダムなまたは所定の配列といった、何れかのアミノ酸配列によって置換されても良く、上記の残基は全て親水性の疎水性度のプロフィールを示す。欠失（切り詰め）可溶性変異体と同様に、これらの変異体は、組換え宿主の培養培地内に分泌される。
アミノ酸挿入は、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドの範囲の長さのアミノおよび／またはカルボキシ末端融合物を含み、同様に単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。配列内挿入（すなわち新規なＮＲＧ３アミノ酸内への挿入）は、約１から１０残基、より好ましくは１から５残基、さらにより好ましくは１から３残基の範囲が一般的である。末端挿入の例は、組換え宿主細胞からの成熟ＮＲＧ３またはそのフラグメントの分泌を容易にするための、ＮＲＧ３分子のＮ末端に対する異種Ｎ末端シグナル配列の融合物を含む。上記シグナル配列は一般的に、企図された宿主種のシグナル配列から得られ、それ故それと同種である。適切な配列は、大腸菌についてＳＴＩＩまたはＩｐｐ、酵母についてアルファファクター、哺乳動物細胞についてヘルペスｇＤのようなウイルスシグナルを含む。
天然のＮＲＧ３分子の他の挿入変異体は、例えばベータラクタマーゼまたは大腸菌ｔｒｐローカスにコードされる酵素のような細菌ポリペプチド、または酵母タンパク質といった免疫原性ポリペプチドに対するＮＲＧ３分子のＮまたはＣ末端の融合物、および1989年4月6日に発行されたWO 89/02922に記載されている免疫グロブリン領域（好ましくは免疫グロブリン定常領域）、アルブミン、またはフェリチンのような長い半減期を有するタンパク質とのＣ末端融合物を含む。
さらなる挿入変異体は、新規なＮＲＧ３の免疫学的に活性な誘導体であり、それはＥＧＦ様ドメイン、および免疫学的に競合的な外因性のポリペプチドのエピトープを含むポリペプチド、すなわち融合物が投与され、または外因性ポリペプチドに対して生じた抗体によって結合可能な、動物において免疫応答を引き出すことが可能であるポリペプチドを含む。上記免疫学的に競合的なポリペプチドの典型的な例として、アレルゲン、自己免疫エピトープ、または他の潜在的な免疫原、あるいはｔｒｐＬＥ、β−ガラクトシダーゼ、またはヘルペスｇＤタンパク質のようなウイルスポリペプチド等のような細菌ポリペプチドを含む、融合物受容者において抗体を前もって存在することによって認識される抗原が挙げられる。
免疫原性融合物は、インビトロでの交差反応、または免疫原性ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡで形質転換された細胞培養物によって生産される。免疫原性融合物は、免疫原性配列がペプチド結合によって新規なＮＲＧ３分子またはそのフラグメントに結合されたまたはその中に挿入されたものであることが好ましい。それ故これらの産物は、ＮＲＧ３エピトープおよび少なくとも一つのＮＲＧ３とは外来のエピトープを含む直鎖状ポリペプチド鎖より成る。本発明のＮＲＧ３分子またはそのフラグメント内のどこかに該エピトープを導入することが、本発明の範囲内にあることは理解されよう。これらの免疫原性挿入物は、製薬学的に許容可能なキャリア内に製剤化され、ＮＲＧ３分子に対する抗体を生産するために患者へ投与される場合に特に有用であり、次に該抗体は、診断薬として、組織分類において、または標準的なイムノアフィニティー法によって新規なＮＲＧ３の精製において有用である。代わりに、本発明のＮＲＧ３の精製において、例えば抗体、レセプターまたはリガンドといった融合された外因性ポリペプチドに対する結合パートナーが、不純物を含む混合物から該融合物を吸着するために使用され、その後に融合物が溶出され、必要であれば、酵素学的な切断によって、新規なＮＲＧ３が該融合物から回収される。
変異体ＮＲＧ３の特徴を前もって予測することはしばしば困難であるので、いくつかのスクリーニングが、最適な変異体を選択するために必要であろうことは予測されよう。上記スクリーニングは、ＥｒｂＢ４レセプター結合のアッセイを制限することなく含む。
所望のミューテーションを同定した後、ＮＲＧ３変異体をコードする遺伝子は、例えば周知の方法を使用して化学的合成によって得ることが可能である。より特には、ＮＲＧ３アミノ酸配列変異体をコードするＤＮＡは、ＮＲＧ３の以前に調製された変異体または非変異体バージョンをコードするＤＮＡの部位特異的突然変異誘発によって調製される。部位特異的突然変異誘発は、横側のプライマー結合部の両側で安定な二本鎖を形成するための十分なサイズおよび配列複雑性を有するプライマー配列を提供するために、所望のミューテーション、同様に十分な数の隣接ヌクレオチドのＤＮＡ配列をコードする特異的なオリゴヌクレオチド配列の使用を通じてＮＲＧ３変異体の生産を許容する。典型的には、改変される配列の結合部の両側の約５から１０残基を有する約２０から２５ヌクレオチドの長さのプライマーが好ましい。一般的に、部位特異的突然変異誘発の方法は、Edelman等(1983), DNA 2:183のような文献によって例示されているように、本分野で周知である。予測されるであろうように、部位特異的突然変異誘発の方法は典型的に、一本鎖および二本鎖形態の両者で存在するファージベクターを使用する。部位特異的突然変異誘発で有用である典型的なベクターは、例えばMessing等, Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, A.Walton, 編, Amsterdam (1981)に開示されているようなＭ１３ファージのようなベクターを含む。これおよび他のファージベクターは商業的に入手可能であり、その使用は当業者に周知である。Ｍ１３由来ベクターを使用したＤＮＡフラグメントにおける部位特異的突然変異誘発に向けたオリゴデオキシリボヌクレオチドの構築についての万能で効率的な方法は、Zoller等 (1982), Nucleic Acids Res. 10: 6487-6500 に印刷された。また、複製の一本鎖ファージオリジンを含むプラスミドベクター(Veira等, (1987) Meth. Enzymol. 153: 3)は、一本鎖ＤＮＡを得るために使用される。代わりに、ヌクレオチド置換をインビトロで適切なＤＮＡフラグメントを合成するために導入し、本分野で周知のＰＣＲ法によってそれを増幅する。
ＰＣＲ増幅法はまた、新規なＮＲＧ３のアミノ酸配列変異体を作製するために使用される。ＰＣＲミュータジェネシスの特異的な例として、テンプレートプラスミドＤＮＡ（１μｇ）を、増幅される領域の外側のプラスミドＤＮＡにおける独特の制限部位を有する制限エンドヌクレアーゼを使用して切断することによって直線化する。この物質の１００ｎｇを、４つのデオキシリボヌクレオチドを含むＰＣＲバッファーを含むＰＣＲ混合物に加え、ＧＥＮＥＡＭＰRキット(Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT and Emeryvill, CAから得られる）、および２５ピコモルの各オリゴヌクレオチドプライマー内に、５０μｌの最終容量に含ませる。該反応混合物を、３５μｌの鉱油を使用して層状にする。該反応物を１００℃で５分変性させ、一瞬氷上におき、それから１μｌのThermus aquaticus(Taq) ＤＮＡポリメラーゼ（（５ユニット／μｌ）Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT and Emeryville, CAから購入される）を、鉱油層の下に加える。それから該反応混合物を、以下のようにプログラムされたDNA Thermal Cycler(Perkin-Elmer Cetusから購入された）内に挿入する：（例として）
５５℃、２分、
７２℃、３０秒、次いで以下の１９サイクル：
９４℃、３０秒、
５５℃、３０秒、そして
７２℃、３０秒。
プログラムの最後に、反応バイアルをサーマルサイクラーから取り出し、水相を新しいバイアルに移し、フェノール／クロロホルム（５０：５０ｖｏｌ）で抽出し、エタノール沈降し、そしてＤＮＡを標準的な方法で回収する。この物質を、ベクターに挿入するための適切な処理に受けさせる。
カセットミュータジェネシスは、変異体を調製するために有用な別法であり、Well等, (1985) Gene 34: 315に記載された方法に基づく。
さらに、ファージミドディスプレー法と呼ばれるものが、天然のまたは変異体ＮＲＧ３またはそのフラグメントのアミノ酸配列変異体を作製するのに有用である。この方法には、１）突然変異されるレセプターをコードする第一の遺伝子、天然のまたは野生型ファージコートタンパク質の少なくとも一部分をコードする第二の遺伝子で、その場合第一および第二の遺伝子は異種であり、そして第一および第二の遺伝子に機能的に連結した転写調節エレメントを含む複製可能発現ベクターを構築し、それによって融合タンパク質をコードする遺伝子融合物を形成し；２）第一の遺伝子内の一つ以上の選択された位置でベクターを突然変異し、それによって関連するプラスミドのファミリーを形成し；３）該プラスミドで適切な宿主細胞を形質転換し；４）ファージコートタンパク質をコードする遺伝子を有するヘルパーファージで形質転換された宿主細胞を感染し；５）少なくとも該プラスミドの一部を含む、宿主を形質転換可能である組換えファージミド粒子を形成するために適した条件下で形質転換された感染宿主細胞を培養し、該条件は、ファージミド粒子の少なからぬ量が、該粒子の表面に融合タンパク質の一コピーより多くを展示するように調節し；（ｆ）ファージミド粒子の少なくとも一部が抗原を結合するように適切な抗原とファージミド粒子を接触させ；そして（ｇ）結合しないものから結合するファージミド粒子を分離することを含む。工程（ｄ）から（ｇ）を一度以上繰り返す。好ましくはこの方法において、プラスミドは転写調節エレメントの制御の下におき、培養条件を該粒子の表面に融合タンパク質の一つより多いコピーを展示するファージミド粒子の量または数が約１％より少なくなるように調節する。また好ましくは、融合タンパク質の一コピーより多くを展示するファージミド粒子の量は、融合タンパク質の単一コピーを展示するファージミド粒子の量の１０％より小さい。最も好ましくは、該量は２０％より小さい。典型的にこの方法においては、発現ベクターはさらに、該ポリペプチドの各サブユニットをコードするＤＮＡに融合された分泌シグナル配列を含み、該転写調節エレメントはプロモーター系であろう。好ましいプロモーター系は、ｌａｃＺ、λPL、ｔａｃ、Ｔ７ポリメラーゼ、トリプトファン、およびアルカリホスファターゼプロモーター、並びにそれらの組み合わせを使用するであろう。また通常該方法は、Ｍ１３Ｋ０７，Ｍ１３Ｒ４０８，Ｍ１３−ＶＣＳおよびＰｈｉＸ１７４から選択されるヘルパーファージを使用するであろう。好ましいヘルパーファージはＭ１３Ｋ０７であり、好ましいコートタンパク質はＭ１３ファージ遺伝子ＩＩＩコートタンパク質である。好ましい宿主は、大腸菌および大腸菌のプロテアーゼ欠損株である。 上記および同様な突然変異誘発法のさらなる詳細は、例えばSambrook等, 上記参照およびCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubel等,編, 上記参照のような一般的な教科書に見出される。
Ｆ．グリコシル化変異体
グリコシル化変異体は、本発明の範囲に含まれる。それらは、グリコシル化を完全に欠失した変異体（非グリコシル化）、天然形態よりも少なくとも一つの少ないグリコシル化部位を有する変異体、同様にグリコシル化が変化している変異体を含む。脱グリコシル化及び非グリコシル化アミノ酸配列変異体、脱グリコシル化及び非グリコシル化天然ＮＲＧ３またはそのフラグメント、および他のグリコシル化変異体が含まれる。例えば、置換または欠失ミュータジェネシスが、本発明の天然または変異体ＮＲＧ３におけるＮまたはＯ結合グリコシル化部位を除去するために使用され、例えばアスパラギン残基が欠失またはリシンまたはヒスチジンのようなもう一つの塩基性残基に置換される。代わりに、グリコシル化認識部位を除去することによってグリコシル化を妨げるために、たとえアスパラギン残基を変化させないのであっても、グリコシル化部位を形成する隣の残基が置換または欠失される。好ましいＮＲＬ変異体が、ＮＲＧ３のＥＧＦ様ドメインである場合、外フラグメントは好ましくはグリコシル化されない。
さらに、天然分子のグリコシル化部位を有する非グリコシル化ＮＲＧ３は、原核生物はポリペプチド内にグリコシル化を導入できないために、組換え原核生物細胞培養物において生産される。
グリコシル化変異体は、適切な宿主細胞によって、またはインビトロの方法によって生産される。例えば酵母および昆虫細胞は、哺乳動物系のものとは有意に変化しているグリコシル化を導入する。同様に、ＮＲＧ３の供給源とは異なる種（例えばハムスター、ネズミ、ブタ、ウシまたはヒツジ）、または組織起源（例えば肺、肝、リンパ、間葉または表皮）を有する哺乳動物細胞は、例えばマンノースの上昇したレベルまたはマンノース、フコース、シアル酸、および哺乳動物糖タンパク質において典型的に見出される他の糖について特徴付けられるような変異体グリコシル化を導入する能力について一般的にスクリーニングされる。ＮＲＧ３のインビトロでのプロセシングは、例えばノイラミニダーゼ切断といった酵素的な加水分解によって典型的に成し遂げられる。
Ｇ．共有結合修飾
本発明の新規なＮＲＧ３の共有結合修飾は、本発明の範囲に含まれる。上記修飾は、選択されたアミノ酸側鎖または末端残基と反応可能な有機誘導化試薬と、ＮＲＧ３のターゲット化アミノ酸残基を反応することによって、または選択された組換え宿主細胞において機能する翻訳後修飾のメカニズムを利用することによって、伝統的に導入される。生成共有結合誘導体は、生物学的活性、ＮＲＧ３のイムノアッセイ、または組換え体のイムノアフィニティー精製のための抗ＮＲＧ３抗体の調製において重要である残基の同定に向けたプログラムにおいて有用である。例えば、ニンヒドリンとの反応の後の該タンパク質の生物学的活性の完全な不活性化は、少なくとも一つのアルギニルまたはリシル残基がその活性に重要であることを示唆し、その後、選択された条件下で修飾された個々の残基は、修飾アミノ酸残基を含むペプチドフラグメントの単離によって同定される。上記修飾は当業者の範囲内にあり、過度の実験なく実施される。
二官能試薬を使用した誘導体化は、ポリペプチドとＮＲＧ３の分子内凝集を調製するために、同様にアッセイまたはアフィニティー精製での使用のための水不溶性支持マトリックスまたは表面に対するＮＲＧ３ポリペプチドを架橋するために有用である。さらに、鎖内架橋の研究は、形態学的な構造に対する直接的な情報を提供するであろう。一般的に使用される架橋試薬は、１，１−ビス（ヂアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、ホモ二官能性イミドエステルおよび二官能性マレイミドを含む。メチル−３−［（p-アジドファニル）ジチオ］プロピオイミダートのような融合化試薬は、光の存在下で架橋を形成することが可能な光活性化可能中間体を産する。代わりに、臭化シアン活性化炭化水素、および米国特許第3,959,642; 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; 4,055,635;および4,330,440号に記載されているシステム反応性基質のような反応性水不溶性マトリックスが、タンパク質固定化および架橋のために使用される。
ある種の翻訳後修飾は、発現されたポリペプチド上での組換え宿主細胞の機能の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、相当するグルタミルおよびアスパルチル残基にしばしば翻訳後で脱アミド化される。代わりにこれらの残基は、穏やかな酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基の各形態は、本発明の範囲に含まれる。
他の翻訳後修飾は、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル、トレオニルまたはチロシル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化を含む(T. E. Creighton (1983) Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86)。
ここでのＮＲＧ３のさらなる誘導体は、「イムノアドヘシン」と称されるものであり、それは結合タンパク質（通常レセプター、細胞接着分子またはリガンド）の機能的ドメインを、免疫グロブリン配列と組み合わせたキメラ抗体様分子である。この型の融合タンパク質の最も一般的な例は、免疫グロブリン（Ｉｇ）のヒンジ及びＦｃ領域を、特異的なリガンドを認識する細胞表面レセプターのドメインと組み合わせる。この型の分子は、「免疫」及び「接着」機能を組み合わせたものであるため、「イムノアドヘシン」と称される；他のしばしば使用される名前は、「Ｉｇ−キメラ」、「Ｉｇ−」または「Ｆｃ−融合タンパク質」、または「レセプター−グロブリン」である。
文献中に報告されたイムノアドヘシンは、例えばＴ細胞レセプター（Gascoigne等, (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2936-2940）；ＣＤ４（Capon等, (1980) Nature 337:525-531; Traunecker等, (1980) Nature 339:68-70; Zetmeissl等, (1990) DNA Ceel Biol. USA 9: 347-353; Byrn等, (1990) Nature 344:667-670）；Ｌ−ｓｅＮＲＧ３（ホーミングレセプター）（Watson等, (1990) J. Cell. Biol. 110:2221-2229; Watson等, (1991) Nature 349:164-167 )；Ｅ−ｓｅＮＲＧ３(Mulligan等, (1993) J.Immunol. 151: 6410-17; Jacob等, (1995) Biochemistry 34: 1210-1217);Ｐ−ｓｅＮＲＧ３(Mulligan等, 上記参照; Hollenbaugh等, (1995) Biochemistry 34: 5678-84);ＩＣＡＭ−１(Sauton等, (1992) J.Exp.Med. 176: 1471-1476; Martin等, (1993) J.Virol. 67: 3561-68; Roep等, (1994) Lancet 343: 1590-93);ＩＣＡＭ−２(Damle等, (1992) J.Immunol. 148: 665-71 );ＩＣＡＭ−３(Holness等, (1995) J.Biol.Chem. 270: 870-84);ＬＦＡ−３(Kanner等, (1992) J.Immunol. 148: 223-229);Ｌ１グリコプロテイン(Doherty等, (1995) Neuron 14: 57-66);ＴＮＦ−Ｒ１(Ashkenazi等, (1991) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88: 10535-539;Lesslauer等, (1991) Eur.J.Immunol. 21: 2883-86; Peppel等, (1991) J.Exp.Med. 174: 1483-1489);ＴＮＦ−Ｒ２(Zack等, (1983) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2335-39;Wooley等, (1993) J.Immunol. 151: 6602-07 );ＣＤ４４（Aruffo等, (1990) Cell 61:1303-1313 ）；ＣＤ２８およびＢ７（Linsley等, (1991) J. Exp. Med. 173:721-730);ＣＴＬＡ−４(Linsley等, (1991) J.Exp.Med 174:651-569）；ＣＤ２２（Stamenkovic等, (1991) Cell 66:1133-1144）；ＮＰレセプター(Bennett等, (1991) J.Biol.Chem. 266: 23060-23067 );ＩｇＥレセプターα(Ridgway and Gorman, (1991) J.Cell.Biol. 115,abstr. 1448);ＩＦＮ−γＲ αおよびβ鎖(Marsters等, (1995) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:5401-05);ｔｒｋ−Ａ、−Ｂおよび−Ｃ(Shelton等, (1995) J.Neurosci. 15: 477-91);ＩＬ−２(Landolfi, (1991) J.Immunol. 146: 915-19)；ＩＬ−１０(Zheng等, (1995) J.Immunol. 154: 5590-5600)を含む。
最も単純で最も容易なイムノアドヘシンデザインは、免疫グロブリン重鎖のヒンジ及びＦｃ領域と、「アドヘシン」タンパク質の結合領域（類）を組み合わせる。一般的に、本発明のＮＲＧ３−免疫グロブリンキメラを調製する場合、所望のＮＲＧ３ポリペプチドをコードする核酸を、免疫グロブリン定常ドメイン配列のＮ末端をコードする核酸のＮ末端に、所望の配列のＣ末端で融合するが、所望のＮＲＧ３配列のＮ末端での融合もまた可能である。典型的には、上記融合物中でコードされるキメラポリペプチドは、少なくとも機能的に活性な免疫グロブリン重鎖の定常領域のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを維持している。融合物はまた、定常ドメインのＦｃ部分のＣ末端で、または重鎖のＣＨ１または軽鎖の相当する領域に対してすぐＮ末端で作製される。融合物が作製される正確な部位は重要ではない；特定の部位が周知であり、ＮＲＧ３−免疫グロブリンキメラの生物学的活性、分泌または結合特性を最適化するために選択される。
好ましい実施態様において、天然の成熟ＮＲＧ３ポリペプチド、あるいはその（膜貫通ドメイン−不活性化またはＥＧＦ様ドメインポリペプチド）形態のような可溶性形態の配列は、例えばＩｇＧ１等の免疫グロブリンのエフェクター機能を含む抗体のＣ−末端部分（特にＦｃ領域）のＮ−末端に融合される。重鎖定常領域の全体を、ＮＲＧ３配列に融合することも可能である。しかしながら、より好ましくはパパイン切断部位の直ぐ上流のヒンジ領域から始まる配列（ＩｇＧのＦｃを化学的に定義し；重鎖定常領域の最初の残基を１１４位として、残基２１６、または他の免疫グロブリンの類似する部位）が、融合に使用される。特に好適な実施態様において、ＮＲＧ３配列（全長または可溶性）は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３重鎖のヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３、またはＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域に対して融合される。融合が行われる厳密な部位は重要ではなく、至適部位は常法の実験により決定され得る。
いくつかの実施態様において、ＮＲＧ３−免疫グロブリンキメラは、マルチマーとして、及び特にはホモダイマーまたはテトラマーとして集合する(WO 91/08298)。一般的にはこれらの集合体免疫グロブリンは、既知の単位構造を有するであろう。基本的な４本鎖構造単位は、ＩｇＧ、ＩｇＤ及びＩｇＥが存在する形態である。４本単位は、より高分子量の免疫グロブリンにおいて反復され；ＩｇＭは、ジスルフィド結合により互いに保持される基本的４本単位のペンタマーとして一般には存在する。ＩｇＡグロブリン及び場合によってはＩｇＧグロブリンは、血清中においてマルチマーとしても存在し得る。マルチマーの場合、各４本単位は、同じであるかまたは異なってもよい。
本発明の範囲にある種々の典型的な集合ＰＳＴＰＩＰ−免疫グロブリンキメラは、下記に模式的に図表化される：
(a) ACL-ACL;
(b) ACH-[ACH,ACL-ACH,ACL-VHCH,またはVLCL-ACH];
(c) ACL-ACH-[ACL-ACH,ACL-VHCH,VLCL-ACH,またはVLCL-VHCH];
(d) ACL-VHCH-[ACH,またはACL-VHCH,またはVLCL-ACH];
(e) VLCL-ACH-[ACL-VHCH,またはVLCL-ACH];及び
(f) (A-Y)n-[VLCL-VHCH]2,
式中、
各Aは、同じまたは異なったＮＲＧ３ポリペプチドのアミノ酸配列を表し；
VLは、免疫グロブリン軽鎖可変領域であり；
VHは、免疫グロブリン重鎖可変領域であり；
CLは、免疫グロブリン軽鎖の定常領域であり；
CHは、免疫グロブリン重鎖の定常領域であり；
nは、１より大きい整数であり；
Yは、共有的交差結合試薬の残基を示す。
簡素化するために前述の構造は、基本的特徴のみを示し；それらは免疫グロブリンの連結部(J)または他の領域は示されず、またジスルフィド結合も示されない。しかしながら、そのような領域が結合活性のために必要な場合には、それらは免疫グロブリン分子に占める通常の位置に存在するように構築されるであろう。
免疫グロブリン軽鎖の存在は、本発明のイムノアドヘシンにおいては必要とされないが、免疫グロブリン軽鎖は、ＮＲＧ３−免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有的に結合するか、あるいは、ＮＲＧ３ポリペプチドに直接に融合するかの何れかで存在するであろう。前者の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、典型的にはＮＲＧ３−免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするＤＮＡと共に発現される。分泌に際して、ハイブリッド重鎖及び軽鎖は共有的に結合して、２個のジスルフィド結合した免疫グロブリン重鎖−軽鎖対を有する免疫グロブリン様構造を与えるであろう。このような構造の調製のための好適な方法は、例えば1989年3月28日発行の米国特許第4,816,567号に開示されている。
好適な実施態様において、本発明のイムノアドヘシンの構築に使用される免疫グロブリン配列は、ＩｇＧ免疫グロブリン重鎖定常領域に由来する。ヒトイムノアドヘシンについては、ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ３免疫グロブリン配列の使用が好ましい。ＩｇＧ１を使用することの主な優位点は、ＩｇＧ１イムノアドヘシンが固定化プロテインＡにて効率的に精製され得ることである。対照的に、ＩｇＧ３の精製には顕著により不安定な媒体であるプロテインＧを必要とする。しかしながら、特定のイムノアドヘシン構造のためのＩｇ融合の相手を選択する際には、免疫グロブリンの他の構造的及び機能的性質を考慮しなければならない、例えば、ＩｇＧ３のヒンジはより長く、より柔軟性であって、それはＩｇＧ１と融合させた場合に、適切に畳み込みまたは機能しないであろうより大きいアドヘシン領域を適合させ得る。ＩｇＧイムノアドヘシンは典型的に一価または二価である一方、ＩｇＡおよびＩｇＭのような他のＩｇサブタイプは、基本的Ｉｇホモダイマー単位のそれぞれ二量体または五量体構造を生ずる。マルチマーイムノアドヘシンは、そのＩｇＧベースカウンターパートよりも大きな親和性を有してそれぞれのターゲットを結合できる点で有利である。上記構造物の報告された例は、ＣＤ４−ＩｇＭ(Trunecker等, 上記参照）；ＩＣＡＭ−ＩｇＭ(Martin等 (1983), J.Virol. 67: 3561-68 )；およびＣＤ２−ＩｇＭ(Arulanandam等, (1993) J.Exp.Med. 177: 1439-50)。
インビボの応用のためにデザインされたＮＲＧ３−Ｉｇイムノアドヘシンについて、Ｆｃ領域によって特定される薬物速度論的性質およびエフェクター機能は、同様に重要である。ＩｇＧ−１，ＩｇＧ−２およびＩｇＧ−４は全て２１日のインビボ半減期を有するが、補体系を活性化するその相対的能力は異なる。ＩｇＧ−４は補体を活性化せず、ＩｇＧ−２はＩｇＧ−１より補体活性化について有意に弱い。さらにＩｇＧ−１とは異なり、ＩｇＧ−２は、単核細胞または好中球上のＦｃレセプターに結合しない。ＩｇＧ−３は補体活性化に最適である一方、そのインビボ半減期は他のＩｇＧアイソタイプのおよそ三分の一である。ヒトの治療薬として使用されるようにデザインされたイムノアドヘシンに対するもう一つの重要な考慮は、特定のアイソタイプのアロタイプ変異体の数である。一般的に、より小さく血清学的に定義されたアロタイプを有するＩｇＧアイソタイプが好ましい。例えば、ＩｇＧ−１は、４つのみの血清学的に定義されたアロタイプ部位を有し、そのうちの二つ（Ｇ１ｍおよび２）は、Ｆｃ領域中に位置する；これらの部位の一つ、Ｇ１ｍ１は非免疫原性である。対照的に、ＩｇＧ−３には１２個の血清学的に定義されたアロタイプが存在し、その全てがＦｃ領域中に存在する；これらの部位の三つだけが（Ｇ３ｍ５，１１および２１）、非免疫原性である一つのアロタイプを有する。それ故、γ３イムノアドヘシンの潜在的な免疫原性は、γ１イムノアドヘシンのものより大きい。
ＮＲＧ３−Ｉｇイムノアドヘシンは、Ｉｇ ｃＤＮＡ配列にフレーム中でＮＲＧ３部分をコードするｃＤＮＡ配列を融合することによって最も簡便に構築される。しかしながら、ゲノムＩｇフラグメントへの融合もまた使用される（例えばGascoigne等, (1987) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84: 2936-2940; Aruffo等, (1990) Cell 61: 1303-1313; Stamenkovic等, (1991) Cell 66: 1133-1144)。融合物の後者のタイプは、発現のためのＩｇ調節配列の存在を必要とする。ＩｇＧ重鎖定常領域をコードするｃＤＮＡを、ハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術によって、脾臓または抹消血液リンパ球から由来するｃＤＮＡライブラリーから、印刷された配列に基づいて単離することができる。
天然分子より長い半減期を有する、本発明の新規なＮＲＧ３の他の誘導体は、非蛋白性ポリマーに共有的に結合されたＮＲＧ３、ＮＲＧ３フラグメント（ＥＧＦ様ドメインのような）またはＮＲＧ３−免疫グロブリンキメラを含む。非蛋白性ポリマーは、通常は親水性合成ポリマー、即ち天然には他に見出されないポリマーである。しかしながら、天然の供給源から単離されるポリマーのように、天然に存在し、また組換え的若しくはインビトロの方法により生産されるポリマーは有用である。親水性ポリビニルポリマー、例えばポリビニルアルコール及びポリビニルピロリドンは、本発明の範囲内にある。特に有用なものは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のポリアルキレンエステル；ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、及びポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンとのブロックコポリマー（Pluronics）等のポリエルキレン；ポリメタクリレート；カルボマー；ラクトース、アミロプクチン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、アミロース、デキストランサルフェート、デキストラン、デキストリン、グリコーゲン、若しくは例えばヒアルロン酸等の酸ムコポリサッカリドのポリサッカリドサブユニット等の、ホモポリサッカリドまたはヘテロポリサッカリドを含む、サッカリド単量体、Ｄ−マンノース、Ｄ−およびＬ−ガラクトース、フコース、フラクトース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルクロン酸、シアル酸、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｄ−マンニュロン酸（例えば、ポリマンニュロン酸またはアルギン酸）、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−グルコース、及びノイラミン酸からなる分枝鎖また非分枝鎖のポリサッカリド；ポリソルビトール及びポリマンニトール等の糖アルコールのポリマー；ヘパリン若しくはヘパロンを含む。該ポリマーは、好ましくは水溶性であるが、交差結合の前にはそうである必要はなく、しかしながら接合体は水溶性でなければならない。更に、該ポリマーは、接合体形態で高度に免疫原性であってはならず、また血管内輸液または注射により投与されるべき場合には、このような経路に適合しないような粘性を有してはならない。
好ましくは該ポリマーは、反応性の単一の基のみを有する。このことは、タンパク質分子の交差結合の防止を助ける。しかしながら、交差結合を低減すべく反応条件を至適化すること、または実質的に均質な誘導体を回収するために、ゲル濾過またはクロマトグラフィー的ふるいを通して反応生成物を精製することは、ここにおける権利範囲内にある。
該ポリマーの分子量は、望ましくは約１００〜５００，０００の範囲にあり、好ましくは約１，０００〜２０，０００である。選択される分子量は、ポリマーの性質及び置換の程度に依存するであろう。一般的には、ポリマーの親水性がより大きく、かつ置換の程度が大きいほど、採用される分子量はより小さい。至適分子量は、常法の実験により決定されるであろう。
該ポリマーは、該ポリマー及び結合されるべき新規なＮＲＧ３、ＮＲＧ３フラグメントまたはＮＲＧ３−免疫グロブリンキメラの１個以上のアミノ酸または糖残基と反応する多官能性交差結合試薬を介して、ＮＲＧ３またはＮＲＧ３−免疫グロブリンキメラに共有的に結合される。しかしながら、誘導化ポリマーをハイブリッドと直接結合させることにより、該ポリマーを直接に交差結合させること、またはその逆も、本発明の範囲にある。
ＮＲＧ３またはＮＲＧ３−免疫グロブリンキメラの共有的交差結合部位は、Ｎ−末端アミノ基及びリジン残基に見出されるイプシロンアミノ基、並びに他のアミノ、イミノ、カルボキシル、スルヒドリル、ヒドロキシまたは他の親水性基を含む。該ポリマーは、多官能性（通常二官能性）交差結合試薬を使用することなくハイブリッドに直接に共有的に結合され得る。アミノ基に対する共有結合は、塩化シアヌル酸、カルボニルジイミダゾール、アルデヒド反応基（ＰＥＧアルコキシドとブロモアセトアルデヒドのジエチルアセタール；ＰＥＧとＤＨＳＯ及び無水酢酸；ＰＥＧと４−ヒドロキシベンズアルデヒドのフェノキシド、スクシンイミジル活性化エステル、活性化ジチオカルボネートＰＥＧ、２，４，５−トリクロロフェニルクロロホルメートまたはＰ−ニトロフェニルクロロホルメート活性化ＰＥＧ）に基づく既知の化学によりなされる。カルボキシル基は、カルボジイミドを使用してＰＥＧ−アミン結合により誘導される。
ポリマーは、化学試薬、例えばメタ過ヨウ素酸または酵素、例えばグルコース若しくはガラクトースオキシダーゼ（何れかが炭水化物のアルデヒド誘導体を生成する）を使用する酸化により、次いでオリゴサッカリドのビオチンまたはアビジンにより標識に関するHeitzmann等, (1974) P. N. A. S. 71:3537-41またはBayer等, (1979) Methods in Enzymology 62:310により記述されるのと同様な方法でヒドラジンまたはアミノ誘導体ポリマーとの反応により、オリゴサッカリドの基に接合される。更に、オリゴサッカリドを結合するために使用された他の化学的または酵素的方法は、一般に誘導のためのアミノ酸部位よりも少ない置換が存在し、従ってオリゴサッカリド生成物はより均質であるため、特に有利である。オリゴサッカリド置換基は、場合により酵素消化、例えばノイラミニダーゼ消化により、ポリマー誘導に先立って修飾されてもよい。
該ポリマーは、結合されるポリペプチドのアミノ酸側鎖、またはＮ−若しくはＣ−末端に対して直接に反応性を有するか、または多官能性交差結合試薬と反応性の基を有する。一般的に、このような反応性基を有するポリマーは、固定化タンパク質の調製について知られている。ここにおいてこのような化学を使用するためには、タンパク質固定化のために従来使用された不溶性ポリマーと同様な様式で誘導するのでなければ、水溶性ポリマーを採用しなければならない。シュウ化シアン活性化は、ポリサッカリドの交差結合において採用するために、特に有用な手法である。
出発ポリマーについて称される「水溶性」とは、接合のために使用される該ポリマーまたは反応性中間体が、誘導反応に関与するために充分に水溶性であることを意味する。ポリマー接合体について称される「水溶性」とは、該接合体が血液糖の生理学的液体に可溶性であることを意味する。
このようなポリマーによる置換の程度は、タンパク質上の反応部位の数、タンパク質の全てまたはフラグメントが使用されるか、該タンパク質が異種タンパク質との融合物であるか否か（例えばＮＲＧ３−免疫グロブリンキメラ）、分子量、親水性、及びポリマーの他の性質、並びに選択される特定のタンパク質誘導部位等に依存して変化するであろう。一般的に、接合体は１〜１０個のポリマー分子を有し、一方で任意の異種的配列は、所望の活性が有意に悪影響を受けない限り、基本的には限定されない個数のポリマー分子により置換されてもよい。交差結合の至適な程度は、所望の提要にて機能する接合体の能力が決定された後には、置換の程度を変化させるための時間、温度及び他の反応条件が変化する実験的マトリクスにより容易に決定される。
例えばＰＥＧ等のポリマーは、ＰＥＧ等の非蛋白ポリマーによるタンパク質の共有結合修飾について、それ自体既知の広範囲の方法により交差結合される。しかしながら、これらの方法のいくつかは、ここにおける目的に対しては好ましくない。塩化シアヌル酸化学は、タンパク質交差結合を含む多くの副反応を招く。更に、それは特にスルヒドリル基を含むタンパク質の不活性化を導く恐れが大きい。カルボニルジイミダゾール化学（Beauchamp等, (1983) Anal. Biochem., 131:25-33）は、高いｐＨ（＞８．５）を必要とし、これはタンパク質を不活性化し得る。更に、「活性化ＰＥＧ」中間体は水と反応し得る為、タンパク質に対して大過剰モルの「活性化ＰＥＧ」が必要とされる。カルボニルジイミダゾール化学に要求される高濃度のＰＥＧは、ゲル濾過クロマトグラフィー及び親水性クロマトグラフィーの両者に対して悪影響を与えるため、精製において問題を生じる。加えて、高濃度の「活性化ＰＥＧ」は、タンパク質を沈殿させ得、これはそれ自体既に指摘されている問題点である（Davis, 米国特許第4,179,337）。他方において、アルデヒド化学（Royer, 米国特許第4,002,531）は、わずかに４０倍のモル過剰量のＰＥＧ及び１−２時間のインキュベートを必要とすることから、より効率的である。しかしながら、「断言されているＰＥＧの金属ベース酸化剤と複合体を形成する傾向の為に」（Harris等, (1984) J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed. 22:341-52）、ＰＥＧアルデヒドの調製についてRoyerにより示唆された二酸化マンガンは問題である。ＤＭＳＯ及び無水酢酸を使用するMoffatt酸化の使用は、この問題を取り除く。更にRoyerにより示唆されたナトリウムボロヒドリドは高いｐＨにおいて使用されなければならず、ジスルフィド結合を還元する顕著な傾向を有する。対照的に、ナトリウムシアノボロヒドリドは、中性ｐＨにおいて有効であり、ジスルフィド結合を還元する極めてわずかな傾向のみを有するため、好ましい。
本発明の長半減期接合体は、未反応原料からゲル濾過により分離できる。接合体の異種的分子種は、同様な方法で他から精製される。該ポリマーは疎水性ゲルとして水不溶性であってもよい。
新規なＮＲＧ３は、コロイド状薬剤輸送系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）、またはマクロエマルションにおいて、コアセルベーション法または界面重合によって調製されたマイクロカプセルに封入されても良い。上記方法は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第16版, Osol, A.編, (1980)に開示されている。
Ｈ．抗体調製
（ｉ）ポリクローナル抗体
一般に本発明のＮＲＧ３，またはそのフラグメント（ＥＧＦ様ドメインのような）に対するポリクローナル抗体は、ＮＲＧ３およびアジュバントの複数回の経皮的（ｓｃ）または腹腔内的（ｉｐ）注射により、動物に生じさせ得る。ＮＲＧ３またはタンパク質に対するターゲットアミノ酸配列を含むフラグメントを、免疫されるべき種に対して免疫原性のタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリンまたはダイズトリプシンインヒビタ等と、二官能性または誘導化試薬、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介しての接合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介して）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ2、またはＲ及びＲ1が異なるアルキル基であるＲ1Ｎ＝Ｃ＝ＮＲを使用して接合させることは有用であろう。
動物は、１ｍｇまたは１μｇのペプチドまたは接合体（それぞれウサギまたはマウス）を３体積のフロイント完全アジュバントと合わせ、該溶液を複数部位に皮内的に注射することにより、抗原、免疫原性接合体または誘導体に対して免疫される。１ヶ月後に動物は、フロイント完全アジュバント中のペプチドまたは接合体の基の量の１／５ないし１／１０を用い、複数部位の経皮注射により追加免疫される。７〜１４日後に、動物は採血され、血清が抗ＮＲＧ３抗体力価についてアッセイされる。動物は力価がプラトーに入るまで追加免疫される。好ましくは動物は、同じＮＲＧ３ポリペプチドの接合体であるが、異なるタンパク質に接合するか及び／または異なった交差結合試薬を介して接合する接合体にて追加免疫される。接合体は、タンパク質融合体として組み換え細胞培養においても調製され得る。アルム等の凝集剤も、免疫応答を向上するために好適に使用される。
（ｉｉ）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の母集団、即ち母集団に含まれる個々の抗体は、少量存在し得る自然に起こる可能性のある変異を除いて同等である母集団から得られる。従って、修飾語「モノクローナル」は、異なる抗体の混合物ではないものとしての抗体の特徴を示す。例えば本発明の抗ＮＲＧ３モノクローナル抗体は、Kohler & Milstein., (1975) Nature 256:495 によって最初に記述されたハイブリドーマ法を使用して作製されるか、または組換えＤＮＡ法（Cabilly等、米国特許第4,816,567）によって作製されてもよい。
本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、慣用方法により容易に単離され、配列決定される（例えばネズミ抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブの使用により）。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として働く。一旦単離されれば、ＤＮＡは発現ベクターに入れられ、これは次いで、E. coli細胞、霊長類ＣＯＳ細胞、モルモット卵巣（ＣＨＯ）細胞、または免疫グロブリンタンパク質を別途生産しないミエローマ細胞にトランスフェクトさせ、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得る。ＤＮＡはまた、例えば、同種ネズミ配列の位置にヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインに対するコード配列を置換することによって修飾され、Morrison等, (1984) Proc.Natl.Acad.Sci. 81: 6851、または非免疫グロブリンポリペプチドに対するコード配列の全てまたは一部を、免疫グロブリンコード配列に共有結合することによって修飾される。この方法において、ここで抗ＰＳＴＰＩＰモノクローナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体が調製される。
典型的なこのような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常領域を置換するか、またはそれらは抗体の一方の抗原結合部位の可変領域を置換して、ＮＲＧ３に対して特異性を有する一つの抗原結合部位及び異なる抗原に特異性を有する他の抗原結合部位を有するキメラ性二価抗体を創生する。
キメラまたはハイブリッド抗体は、交差結合試薬を含む合成タンパク質化学における貴地方法を使用してインビトロにて調製されてもよい。例えば、イムノトキシンは、ジスルフィド交換反応またはチオエーテル結合形成により使用して構築される。この目的に好適な試薬の例は、イミノチオレート及びメチル−４−メルカプトブチルイミデ−トを含む。
診断的応用のために、抗体は、典型的には検出可能な部分でラベルされる。検出可能部分は、直接的又は間接的に検出可能なシグナルを生ずることのできる任意のものである。例えば、検出可能な部分は、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ又は125Ｉなどの放射性同位元素；フルオレセインイソチオシアナート、ローダミンまたはルシフェリンなどの蛍光又は化学発光化合物；ビオチン；例えば125Ｉ、32Ｐ、14Ｃまたは3Ｈのような放射性活性同位元素標識、または、アルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼまたはセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素である。
ポリペプチド変異体の検出可能な部分への分離可能な結合のためにこの分野で知られた任意の方法が採用され、Hunter 等, (1962) Nature, 144: 945; David 等, (1974) Biochemistry, 13: 1014; Pain 等, (1981) J.Immunol.Meth., 40: 219; 及び Nygren, (1982) J.Histrochem. and Cytochem., 30: 407に記載されたものも含む。
本発明の抗体は、競合結合アッセイ、直接及び間接サンドウィッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイ等の周知の検定方法に採用することができる。Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc., 1987)。
（ｉｉｉ）ヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、非−ヒトである供給源から導入される１個以上のアミノ酸残基を有する。これらの非−ヒトアミノ酸残基は、しばしば「輸入」残基と称され、これは典型的には「輸入」可変領域から採られる。ヒト化は、基本的にはネズミＣＤＲまたはＣＤＲ配列を、対応するヒト抗体配列で置換することにより、Winter及び共同研究者の方法に従って行われ得る（Jones et al., Nature 321:522-525(1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1985);Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536(1988)）。従って、このようなヒト化抗体は、キメラ抗体（Cabilllyet al. 前出文献）であり、実質的に身障の可変領域より少ない部分が非−ヒト種からの対応する配列により置換されている。実際には、ヒト化抗体は典型的にはＣＤＲ残基の幾分か及び、おそらくＦＲの幾分かが、ネズミ抗体の類似部位からの残基により置換されている。
抗体が、抗原に対する高い親和性及び他の好ましい生物学的性質を保ってヒト化されることは重要である。この目的を達成するために、好ましい方法に従えば、ヒト化抗体は親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び種々の概念的ヒト化生成物の分析工程により調製される。三次元免疫グロブリンモデルは、一般に利用可能であり当業者にはなじみがある。選択された候補の免疫グロブリン配列の可能な三次元配置構造を描いて映し出すコンピュータプログラムが利用可能である。これらのディスプレーを見ることは、候補の免疫グロブリン配列の機能における残基のそれらしい役割の分析、即ち候補の免疫グロブリンの抗原に対する結合能力に影響を与える残基の分析を可能とする。このようにして、ＦＲ残基が、標的抗原に対する増大した親和性等の所望の抗体特性が達成される様に、共通及び輸入配列から選択され、組み合わされる。一般的に、ＣＤＲ残基は、抗原結合への影響において、直接的かつ最も実質的に関与するものである。さらなる詳細は、PCT/US93/07832を参照し、それはPCT/US92/05216の一部継続出願であり、該文献は完全に参考としてここに取り入れる。
別法として、免疫により、内因性免疫グロブリン生産を伴わずに完全量のヒト抗体を生産し得るトランスジェニック動物（例えばマウス）の作成が可能である。例えば、キメラ及び生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪH）遺伝子の同型接合的削除が、内因性抗体の生産を完全に阻害することが記述されている。このような生殖系列変異マウスへのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子の並びの移送は、抗原の攻撃に対してヒト抗体の生産を生じるであろう。例えば、Jakobovits等, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551; Jakobovits等, (1993) Nature 362:255-258参照。
（ｉｖ）二重特異性抗体
二重特異性抗体とは、少なくとも二つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナルの、好ましくはヒトまたはヒト化された抗体である。この場合においては、結合特異性の一つは本発明のＮＲＧ３に対するものであり、他のものは、例えばＮＲＧ３ファミリーの別の成員といった何れかの他の抗原に対するものであってもよい。上記構築物は、二重特異性イムノアドヘシンとも称される。
従来から、二重特異性抗体の組換え生産は、２種の免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づいて２本の鎖は異なる特異性を有している（Milstein and Cuello, (1983) Nature 305:537-539）。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の無作為の収集のために、これらのハイブリドーマ（クォドローマ：Quadromas）は、１種のみが正しい二重特異性構造を有する１０種の異なる異なる抗体分子の可能な混合物を生じる。通常アフィニティクロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩雑であり、また生成物の収率も低い。同様な手法は、1993年5月13日発行のPCT出願公報WO 93/08829及びTraunecker等, (1991) EMBO J. 10:3655-3659に開示されている。この問題は、1997年5月5日に印刷された米国出願番号08/850058に開示されているように、各抗体の結合特異性を維持するように、二重特異性抗体の各腕に対して共通な軽鎖を選択することによって解消され得る。
別のより好ましい方法に従うと、所望の結合特異性を持った抗体可変領域（抗体−抗原結合部位）は、免疫グロブリン定常領域配列に融合される。融合物は、好ましくは少なくともヒンジの一部、及び免疫グロブリン重鎖の第二と第三の定常領域（ＣＨ２及びＣＨ３）を有する免疫グロブリン重鎖定常領域を伴う。軽鎖結合に必要な部位を含む、融合物の少なくとも一つに存在する第一の重鎖定常領域を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物、及び所望により免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡが、別個の発現ベクターに挿入され、適当な宿主生物に同時導入する。これは、構築に使用される３種のポリペプチドの異なる比が至適収率を与える場合に、実施態様において３種のポリペプチドフラグメントの相対比の調節に大きな柔軟性を与える。しかしながら、少なくとも２種のポリペプチド鎖の同じ比率での発現が高収率をもたらす場合、または比率が重要でない場合には、２種または３種全てのポリペプチド鎖のコード配列を１個の発現ベクター中に挿入することも可能である。この方法の好ましい実施態様において、二重特異的抗体は、第一の結合特異性を一つのアームに有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、及び他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第二の結合特異性を与える）からなる。この非対称構造は、二重特異的分子の半分のみに免疫グロブリン軽鎖が存在することが分離に容易な方法を提供するため、所望の二重特異的化合物を望まれない免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にする。この方法は、1994年3月3日発行のWO 94/04690に開示されている。
二重特異的抗体の生成の更なる詳細は、例えば、Suresh等, (1986) Methods in Enzymology 121:210参照。
（ｖ）異種接合抗体
異種接合抗体もまた、本発明の範囲に含まれる。異種接合抗体は、二つの共有結合した抗体より成る。上記抗体は例えば、非所望の細胞に対して免疫系をターゲット化するために（米国特許第4,676,980号）、およびＨＩＶ感染の治療のために（ＰＣＴ出願公報WO 91/00360およびWO 92/200373；EP 03089）提案されている。異種接合抗体は、いかなる簡便な架橋法にもっても作製される。適切な架橋試薬は本分野で周知であり、数多くの架橋法と共に米国特許第4,676,980号に開示されている。
Ｉ．診断キットおよび製造品(Article of Manufacture)
本発明は、便宜上、診断アッセイ（すなわち、神経学的疾患の検出用および抗体またはＤＮＡマーカーを用いたサンプル中のＮＲＧ３の存在の検出用）を提供し、これらのアッセイ用試薬は、キットで、すなわち、試験するサンプルと組合せるために、パッケージ化された試薬の組合せで提供できる。キットの成分は通常、前以て決定した比率で提供される。従って、キットは、適当な標識で直接的または間接的に標識された抗体またはＮＲＧ３（ＤＮＡまたはポリペプチドまたはそのフラグメント）を含み得る。検出可能な標識が酵素である場合、キットは酵素が必要とする基質および補因子を含む（例えば、検出可能な発色団または発蛍光団を提供する基質前駆体）。さらに、安定化剤、緩衝剤等の 他の添加剤も含み得る。種々の試薬の相対量は、アッセイの感度を十分に最適化する試薬の溶液中濃度が得られるように、大きく変化し得る。特に、試薬は、賦形剤を含む、通常凍結乾燥した乾燥粉末として提供され得、これを溶解すると適当な濃度を有する試薬溶液が得られる。キットはまた、適当には、生体アッセイを実施する説明書も含む。
本発明の別の実施形態において、本明細書に記載の神経学的疾患の処置に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、容器およびラベルを含む。適当な容器は、例えば、瓶、バイアル、シリンジおよび試験管を含む。容器は、グラスまたはプラスチックなどの種々の物質からなる。容器は、症状の処置に効果的な組成物を保持し、および無菌開閉口を有し得る（例えば容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針により貫通可能なストッパーを有するバイアルを含み得る）。組成物中の有効成分はＮＲＧ３またはそのアゴニストまたはアンタゴニストである。容器上またはそれに付いたラベルは、組成物を選択した症状の処置に使用することを示す。製造品は、さらに、医薬的に許容される緩衝剤、例えばリン酸緩衝溶液、リンガー溶液およびデキストロース溶液を含む第二の容器を含み得る。それは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、およびパッケージインサートを含む、商業的および使用者の立場から望ましい他の材料を使用説明書と共にさらに含み得る。
Ｊ．ペプチドおよび非−ペプチド類似体
本発明のＮＲＧ３のペプチド類似体は、天然ポリペプチドの三次元構造を基本として型作られている。ペプチドは、初めにMerrifield(1963)J.Am.Chem.Soc.15:2149-2154に記載の固相合成技術などのよく知られた技術により合成され得る。他のペプチド合成技術は、例えば、Bodanszky等, Peptide Synthesis、John Wiley & Sons、第二版、1976並びに当業者により容易に入手可能な他の参考本に記載されている。ペプチド合成の要約は、Stuart及びYoung, Solid Phase Peptide Synthelia, ierce Chemical Company, Rockford、IL(1984)に認められ得る。ペプチドはまた、所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列を用いて組換えＤＮＡ技術により製造され得る。
ペプチド類似体に加えて、本発明はまた、本発明のペプチド類似体と実質的に同一の表面を示し、ゆえに同様の形式で他の分子と相互作用する非−ペプチド（例えば有機）化合物にも関する。
Ｋ．ＮＲＧ３の使用
本発明の天然ＮＲＧ３のアミノ酸変異体は、治療に使用し得、これはそのレセプターであるＥｒｂＢ４への天然タンパク質の正常な結合と競合する。ＮＲＧ３アミノ酸配列変異体は、ゆえに、天然ＮＲＧ３の生物学的活性の競合的阻害剤として有用である。
天然ＮＲＧ３およびそのアミノ酸配列変異体は、天然ＥｒｂＢ４レセプターの同定および精製に有用である。精製は、好ましくは、本発明の天然ＮＲＧ３と、その天然ＥｒｂＢ４レセプターの認識において同等の能力を保持するＮＲＧ３アミノ酸配列を含む免疫吸着により実施する。
本発明の天然ＮＲＧ３はさらに、ＥｒｂＢ４レセプターが発現される組織の分子マーカーとして有用である。
さらに、ＮＲＧ３、好ましくは本発明のＮＲＧ３のＥＧＦ様ドメインは、他の天然のＮＲＧ３ファミリー分子の成員、例えばヘレグリン（heregulin）に挿入または置換できる価値ある配列モチーフを提供する。本発明の新規ＮＲＧ３由来の配列を置換または挿入してこれらの天然タンパク質を変化させることにより、生物学的特性（例えばレセプター結合親和性またはレセプター特異性）の変化した変異分子を産生できる。例えば、ＮＲＧ３ファミリーの別の成員の１つ以上のＮＲＧ３ドメインは、本発明のＮＲＧ３由来のＮＲＧ３ドメイン配列により全体的または部分的に置換され得る。同様に、本明細書のＮＲＧ３のＥＧＦ様ドメイン配列は、他のＮＲＧ３のアミノ酸配列に置換または挿入され得る。
本発明のＮＲＧ３をコードする核酸もまた、ｃＤＮＡの探索用ハイブリダイゼーションプローブおよび他のＮＲＧ３のコード配列のゲノムライブラリーの提供に有用である。
さらに、本発明のＮＲＧ３は、ＮＲＧ３に関連した疾病の診断、および本明細書に記載した、体液などのサンプル中のＮＲＧ３の存在または非存在についての検出法のキットに有用である。
ＮＲＧ３によるＥｒｂＢ４レセプターの結合および活性化は、ＥｒｂＢ４レセプターを発現する細胞において、特に神経組織における、細胞成長、細胞増殖、および細胞分化などの生理学的応答を仲介することが期待される。結果として、哺乳動物ＮＲＧ３、またはそのＥｒｂＢ４レセプター結合および活性化フラグメントは、神経細胞成長、増殖および／または分化が疾病の症候を軽減する疾病の処置に有用である。ＮＲＧ３は、ネズミＮＲＧ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）またはヒトＮＲＧ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）の全長アミノ酸配列であり得；別の哺乳動物種由来の全長アミノ酸配列は、アミノ酸レベルで、ネズミおよびヒトＮＲＧ３に少なくとも約７５％の相同性、好ましくはＥＧＦ様結合ドメインにおいて約９０％のアミノ酸配列相同性を有する；およびアミノ酸配列はＮＲＧ３のＥＧＦ様ドメインを含み、この配列がＥｒｂＢ４レセプターに結合する。ＮＲＧ３またはＥｒｂＢ４レセプター結合フラグメントがアゴニストである場合、ＮＲＧ３またはフラグメントは、ＥｒｂＢ４レセプターに結合し活性化する。ＮＲＧ３またはフラグメントがアンタゴニストである場合、ＮＲＧ３またはフラグメントはＥｒｂＢ４レセプターに結合するが活性化せず、よって天然に存在するＮＲＧ３またはアゴニストによる活性化を阻害する。
ＮＲＧ３またはそのアゴニスト（例えばＮＲＧ３ＥＧＦ様ドメインを含むポリペプチド）の投与により処置可能な疾病は、神経系が、例えばトラウマ、手術、卒中、虚血、感染、代謝性疾病、栄養不足、悪性腫瘍、または毒薬により傷害を受けた患者に生じ得る疾病；運動ニューロン疾患、例えば筋萎縮性側索硬化症（ロウ・ゲーリヒ病）、ベル麻痺、および背骨筋肉萎縮、または完全麻痺を含む種々の症状；ヒト「神経変性疾患」、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、癲癇、多発性硬化症、ハンチントン舞踏病、ダウン症候群、神経性難聴およびメニエール病；ニューロパシー、および特に末梢の、末梢神経系に影響を与える疾患で、最も頻繁に運動、感覚、感覚・運動、または自律神経機能不全の１つまたは組合せとして顕現し、例えば、遠位感覚・運動ニューロパシーまたは胃腸管の運動性低下または膀胱弛緩症を含む、自律性ニューロパシーを含むがこれに限定されない。全身性疾病に関連したニューロパシーの例は、ポリオ後症候群を含み；遺伝性ニューロパシーの例は、シャルコー・マリー・トゥース病、レフサム病、無βリポタンパク血症、タンジール病、クラッベ病、黒染性白質ジストロフィ、ファブリー病、およびデジュリン・ソッタス症候群を含み；毒薬により生じるニューロパシーの例は、ビンクリスチン、シスプラチン、メトトレキサート、または３′−アジド−３′−デオキシチミジンなどの化学療法剤での処置により生じたものを含む。また、ＮＲＧ３またはその生物学的に活性なフラグメント（例えばＮＲＧ３のＥＧＦ様ドメイン）は、筋ジストロフィなどの骨格筋、平滑筋の疾病または平滑筋消耗により生じた疾病の処置に使用され得る。
半透過性のインプラント可能な膜装置は、ある環境における薬物輸送手段として有用である。例えば、可溶性ＮＲＧ３、またはそのアゴニスト、またはキメラを分泌する細胞をカプセル化することができ、かかる装置は、患者に、例えば、パーキンソン病罹患患者の脳にインプラントできる。米国特許第4,892,538号、Aebischerら；米国特許第5,011,472号、Aebischerら；米国特許第5,106,627号、Aebischerら；ＰＣＴ出願WO91/10425；ＰＣＴ出願WO91/10470；Winnら（1991） Exper.Neurology 113:322-329；Aebischerら（1991） Exper.Neurology 111:269-275；およびTrescoら（1992） ASAIO 38:17-23参照。従って、本明細書で教示したように、神経に対する傷害または他のＮＲＧ３発現またはＮＲＧ３応答細胞、例えば脳、心臓、または腎臓細胞に対する傷害を予防または処置する方法も含まれ、該法は、ＮＲＧ３、またはそのフラグメントまたはアゴニスト、または特定の状態において必要とされ得るアンタゴニストを分泌する細胞を、それを必要とする患者の身体にインプラントすることを含む。最後に、本発明は、半透膜（膜は、ＮＲＧ３、またはそのフラグメントまたはアゴニストに透過性であり、細胞に有害な患者の因子には不透過である）および膜内にカプセル化されたＮＲＧ３、またはそのフラグメントまたはアゴニスト、（または特定の状態において必要とされ得るアンタゴニスト）を分泌する細胞を含む、本明細書で教義したように神経傷害または他の細胞への傷害を予防または処置するためのインプラント装置を含む。ＮＲＧ３をエクスビボ(ex vivo)で産生するように形質転換した患者自身の細胞は、所望によりかかるカプセル化を施さずに、直接患者にインプラントできる。天然細胞の膜カプセル化の方法は、当業者にはよく知られており、カプセル化細胞の調製および患者へのインプラントは当分野で公知のように容易に実施し得る。本発明は、ゆえに、細胞を、必要とする患者の身体にインプラントすることにより、細胞傷害、好ましくは神経傷害を予防または処置する方法を含み、ここで細胞は、自然にＮＲＧ３、またはそのフラグメントまたはアゴニストを産生するもの、ま
たは工学操作によりＮＲＧ３、またはそのフラグメントまたはアゴニストを分泌するものを選択する。好ましくは、患者がヒトである場合、分泌ＮＲＧ３は可溶性ヒトＮＲＧ３である。インプラントは、好ましくは非−免疫原性でありおよび／または免疫原性インプラント細胞が免疫系により認識されるのを防止する。ＣＮＳ輸送において、好ましいインプラント部位は脊髄の脳脊髄液である。
本発明のＮＲＧ３、そのフラグメントまたは変異体の投与は、種々の方法で、例えば、皮下、静脈内、大脳内、鼻腔内、経皮内、腹腔内、筋肉内、肺内、腔内、直腸内、動脈内、病巣内、心室内、脳内、または眼球内を含むがこれに限定されない、特殊な適用で公知の経路で実施できる。ＮＲＧ３はＣＮＳの液体リザーバーに注入することにより連続投与し得るが、当業者に公知の技術、例えばポンプまたはインプラントを用いた濃縮塊注入も許容できる。持続放出システムも使用できる。疾患に適合すれば、部位特異的輸送にＮＲＧ３変異体を製剤化および投薬し得る。投与は連続的または周期的であり得る。投与は、流度が一定またはプログラム化されたインプラント可能なポンプにより、または周期的注射により実施できる。
半透過性インプラント可能な膜装置は、ある環境における薬物輸送手段として有用である。例えば、可溶性ＮＧＦ変異体を分泌する細胞をカプセル化することができ、かかる装置は、患者に、例えば、パーキンソン病罹患患者の脳または脊髄（ＣＳＦ）にインプラントできる。米国特許第4,892,538号、Aebischerら；米国特許第5,011,472号、Aebischerら；米国特許第5,106,627号、Aebischerら；ＰＣＴ出願WO91/10425；ＰＣＴ出願WO91/10470；Winnら（1991）Expr.Neurology 113:322-329;Aebischerら（1991）Expr.Neurology 111:269-275；およびTrescoら（192）ASAIO 38:17-23参照。最後に、本発明は、半透膜およびＮＲＧ３を分泌する細胞を含む、本明細書で教示したように神経傷害または他の細胞への傷害の予防または処置のためのインプラント装置を含み、前記膜は、ＮＲＧ３に透過性であり、細胞に有害な患者の因子には不透過性であり、細胞は当該膜内にカプセル化される。ＮＲＧ３をエクスビボで産生するように形質転換した患者自身の細胞は、所望によりかかるカプセル化を施さずに、直接患者にインプラントできる。天然細胞の膜カプセル化の方法は、当業者にはよく知られており、カプセル化細胞の調製およびその患者へのインプラントは当分野で公知であるように容易に実施し得る。好ましくは、患者がヒトである場合、分泌ＮＲＧ３、そのフラグメントまたは変異体は可溶性ヒトＮＲＧ３である。インプラントは、好ましくは非−免疫原性でありおよび／または免疫原性インプラント細胞が免疫系により認識されるのを防ぐ。ＣＮＳ輸送において、好ましいインプラント部位は脊髄の脳脊髄液である。
本発明の医薬組成物は、患者への投与に適した形のＮＲＧ３を含む。好ましい実施形態において、医薬組成物は水溶形であり、キャリア、賦形剤、安定化剤、緩衝剤、塩、抗酸化剤、親水性ポリマー、アミノ酸、炭水化物、イオン性または非イオン性界面活性剤、およびポリエチレングリコールまたはプロピレングリコールなどの生理学的に許容される物質を含み得る。ＮＲＧ３はインプラント用時間放出形であるか、または当業者に公知の技術を用いてミクロカプセル中にトラップし得る。
治療に使用する効果量のＮＲＧ３またはＮＲＧ３アゴニストまたはアンタゴニストは、例えば、治療客体、投与経路、患者の状態に依存する。従って、治療専門家は投与量の力価を測定し、最適な治療効果を得るに必要な投与経路を修飾することが必要である。典型的な１日量は、１日あたり患者の体重の約１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまで又はそれ以上、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。典型的には、医療者は、上記の疾患の処置に所望の効果が得られる用量までＮＲＧ３またはＮＲＧ３アゴニストまたはアンタゴニストを投与する。
Ｌ．トランスジェニックおよびノックアウト動物
非−ヒト種からの新規ＮＲＧ３をコードする核酸、例えばネズミＮＲＧ３は、トランスジェニック動物または「ノックアウト」動物のいずれかを産生するために使用でき、これはまた、治療に有用な薬剤の開発およびスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物（例えばマウス）は、形質転換遺伝子を含む細胞を有する動物であり、この形質転換遺伝子は、動物または動物の祖先に、胎児期、例えば胚段階で導入した。形質転換遺伝子は、細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡであり、これからトランスジェニック動物が発生する。１つの実施形態において、ＮＲＧ３またはその適当な配列をコードするネズミｃＤＮＡを用いて、確立された技術に従って、ＮＲＧ３をコードするゲノムＤＮＡをクローン化し、ゲノム配列を使用してＮＲＧ３をコードするＤＮＡを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を産生する。トランスジェニック動物、特にネズミなどの動物を産生する方法は、当分野で慣用的となり、例えば米国特許第4,736,866号および4,870,009号に記載されている。典型的には、ニューロン細胞などの特定の細胞は、組織特異的エンハンサーと共に、ＮＲＧ３形質転換遺伝子を取り込む標的となり、これにより、細胞分化、細胞増殖、または細胞アポトーシスの変化が、発現ポリペプチドとのリガンド相互作用に依存してもたらされる。胚段階で動物の生殖細胞に導入された、ＮＲＧ３をコードする形質転換遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物を用いて、ＮＲＧ３をコードするＤＮＡを増加発現した効果について調べる。かかる動物は、例えば異常神経分化および神経細胞増殖などに関連した疾病から保護すると考えられる薬剤の試験動物として使用できる。本発明のこのファセットにより、動物を薬剤で処置すると、形質転換遺伝子を有する非処置の動物に比較して疾患の頻度が低いことにより、疾患への治療的介入が示唆される。
また、ＮＲＧ３の非−ヒト相同体を用いて、ＮＲＧ３「ノックアウト」動物を構築でき、ＮＲＧ３をコードする内因性遺伝子および動物の胚細胞に導入したＮＲＧ３をコードする変化したゲノムＤＮＡ間での相同的組換えの結果、ＮＲＧ３をコードする遺伝子が欠損または変化している。例えば、ＮＲＧ３をコードするネズミｃＤＮＡを用いて、確立された技術に従って、ＮＲＧ３をコードするゲノムＤＮＡをクローン化することができる。ＮＲＧ３をコードするゲノムＤＮＡの一部は、欠失、または、例えば組み込みを監視するために使用可能な選択マーカーをコードする遺伝子などの他の遺伝子で置換できる。典型的には、数キロベースの非変化フランキングＤＮＡ（５′および３′末端の両方）がベクターに含まれる（例えば、ThomasおよびCapecchi、Cell 51:503(1987)、相同的組換えベクターの記載参照）。ベクターを、胚幹細胞系に導入し（例えば電気穿孔により）、導入されたＤＮＡが内因性ＤＮＡで相同的に組換えられた細胞を選択する（例えば、Liら、Cell 69:915(1992)参照）。次いで、選択した細胞を動物（例えばマウス）の胚盤胞に注射し、凝集キメラを形成する（例えば、Bradley、Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:A Practical Approach、E.J.Robertson編(IRL、Oxford、1987)pp.113-152参照）。次いで、キメラ胚は、適当な偽妊娠雌飼育動物にインプラントでき、胚から「ノックアウト」動物が作製される。相同的組換えＤＮＡをその生殖細胞に有する子孫は、標準的な技術により同定でき、全ての動物細胞が相同的組換えＤＮＡを含む動物を産生することができる。ノックアウト動物は、天然ＮＲＧ３により開始または維持される細胞プロセスを回復する効果的治療薬、例えばＮＲＧ３アゴニストの選択に使用でき；またはノックアウト動物はｎｒｇ３変異の効果の研究にも使用できる。
本発明は、最も実際的で好ましい実施形態であると考えられるものに関して本明細書で示し記載されている。しかし、本発明の範囲内で変形させ得、明らかな修飾がこの開示を読んだ当業者により施されると解される。
以下の実施例は、当業者に、本発明の化合物および組成物の製造法および本発明の方法の実施法に関する完全な開示および記載を提供するために提供され、発明者が発明であると考える範囲を制限するためではない。使用した数値（例えば、量、温度等）に関して正確さを保証するために努力がなされたが、いくらかの実験的誤差および偏差は考慮されるべきである。特記しない限り、部は重量部であり、温度は摂氏温度Ｃであり、圧力は大気圧または大気圧近傍である。
（実施例１：マウスおよびヒトの新規なＮＲＧ３の分子クローニング）
新規ＮＲＧ３ｃＤＮＡは以下で示される発現配列タグを用いて同定した：
ＡＡＴＴＴＣＴＧＣＣＧＡＡＡＡＣＴＧＡＴＴＣＣＡＴＣＴＴＡＴＣＧＧＡＴＣＣＡＡＣＡＧＡＣＣＡＣＴＴＧＧＧＧＡＴＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＧＡＧＴＧＡＡＧＡＡＧＴＴＴＡＴＣＡＡＡＧＧＣＡＧＧＴＧＣＴＧＴＣＡＡＴＴＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡＴＣＴＴＴＧＧＡＡＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＧＧＧＣＡＴＧＴＴＣＴＧＴＧＣＡＧＣＡＴＴＣＴＡＣＴＴＣＡＡＡＡＧＣＡＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＴＡＡＡＣＡＡＡＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＡＧＴＧＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＧＴＡＡＡＡＧＣＴＡＣＡＧＴＣＴＣＡＡＡＧＣＡＴＣＣＡＧＣＡＣＡＡＴＧＧＣＡＡＡＧＴＣＡＧＡＧＡＡＣＴＴＧＧＴＧＡＡＧＡＧＣＣＡＴＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＧＴＣＡＧＧＣＴＴＣＴＧＡＧＣＣＣＡＡＧＣＴＡＡＧＣＣＡＴＣＡＴＡＴＣＣＣＣＴＧＴＮＧＡＣＣＴＧＣＡＣＧＴＧＣＡＣＡＴＣＣＮＧＡＴＧＧＣＣＣＧＴＴＴＣＣＴＧＣＣＴＴＴＴＮＴＧＡＴＧＡＣＡＴＴＴＮＣＡＣＣＡＣＡＡＡＴＧＮＡＧＴＧＡＡＡＡＴＧＧＧＮＣＴＴＴＴＣＮＴＧＣＣＴＴＡＡＣＴＧＧＴＴＧＡＣＮＴＴＴＴＴＮＣＣＣＣＡＡＡＡＧＧＡＧ（ＥＳＴ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１；Genbank登録H23651）これは、ＥＳＴのNational Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）データベースからのものである。ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーからのこのＥＳＴは、ヘレグリン−β１（またニューレグリン−β１、すなわちＮＲＧ１とも指称される）のアミノ酸２３２−３１６に対して約６２％同一なアミノ酸配列をコードする。
部分的ヒトｃＤＮＡクローンを得るために、５０塩基の一本鎖オリゴヌクレオチドプローブ（５′−ＴＧＧＴＡＡＡＡＧＣＴＡＣＡＧＴＣＴＣＡＡＡＧＣＡＴＣＣＡＧＣＡＣＡＡＴＧＧＣＡＡＡＧＴＣＡＧＡＧＡ−３′；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）をＥＳＴ配列に基づいて合成した。このプローブを用いて、Godowskiら（Godowski,P.J.ら,(1989)PNAS USA86:8083-8087、その全体を引用によりここに援用する）に記載されているように、ヒト胎児脳ＲＮＡ（HL3003a、Clontech）から調製したλｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリーから１．５×１０６プラークをスクリーニングした。９つの陽性クローンを得、最も大きいインサートの両鎖の配列を標準的なシークエンス技術により決定した。これらのクローン化重複配列から、ヒトＮＲＧ３の部分的ｃＤＮＡ配列を得た。
追加の５′ヒトＮＲＧ３配列を、ヒト海馬ＲＮＡのアンカーＰＣＲ（Clontech）により得た。ｈＮＲＧ３Ｂ１ｃＤＮＡの直接的シークエンスから推定される完全なヒトオープンリーディングフレーム核酸配列を図２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）に示す。ＡＴＣＣ２０９１５７は、発現ベクターおよびヒトＮＲＧ３Ｂ１オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列を含む核酸である。
ヒトＮＲＧ３の任意スプライシング形は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３の推定アミノ酸配列をコードするｐＲＫ５．ｔｋ．ｎｅｏ．ｈＮＲＧ３Ｂ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）としてクローン化され、このアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸５２９−５５２を欠失する（図６及び７参照）。ヒトＮＲＧ３のこの任意スプライシング形は、他のＮＲＧのＥＧＦ様ドメイン並びに高いアミノ酸配列相同性を含み、本明細書に開示したＮＲＧ３の生物学的特性を示すことが期待される。
ネズミＮＲＧ３ｃＤＮＡ配列をクローン化するために、２つの変性プライマーを、アミノ酸配列ＮＤＧＥＣＦＶＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）およびＥＦＭＥＳＥＥＶＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）をコードする部分的ヒトｃＤＮＡの膜貫通ドメインに隣接する領域に基づいて設計した。マウス脳ｃＤＮＡライブラリー（Clontech、ML1042a）をスクリーニングし、部分的ネズミＮＲＧ３ｃＤＮＡを含むクローン（Ｃ５ａ）を標準的技術により得た。Ｃ５ａ配列由来のプローブを用いて、２つの追加のマウス脳ｃＤＮＡライブラリー（ML1034h、Clontech；および936309、Stratagene）をスクリーニングした。２つの重複ネズミ部分的ＮＲＧ３クローン（ＳＷＡＪ−３およびＺＡＰ−１）の両鎖をシークエンスし、共に、ＤＮＡ配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および図４及び５で示される推定アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を有する２１３９ｂｐの全オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードすることが判明した。発現ベクターにクローン化されたネズミＮＲＧ３オープンリーディングフレームを含む核酸は、ｐＬＸＳＮ．ｍＮＲＧ３（ＡＴＣＣ２０９１５６）と指称する。
ヒトＮＲＧ３の染色体位置は、体細胞ハイブリッドＤＮＡのＰＣＲ解析により１０ｑ２２と位置づけられ、一方、ＮＲＧ１遺伝子は８ｐ１１−２２に位置する（Lee,J.およびWood,W.I.(1993) Genomics 16:790-791；およびOrr-Urtreger,A.ら,(1993) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:1867-1871）。従って、ＮＲＧ３はタンパク質リガンドのＥＧＦ様ファミリ−の新規な成員である。
（実施例２：マウスおよびヒトＮＲＧ３推定アミノ酸配列の特徴づけ）
ヒトおよびネズミＮＲＧ３のｃＤＮＡは、それぞれ、７２０および７１３アミノ酸のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、ヒトＮＲＧ３の推定分子量は７７，９０１ＤａでありネズミＮＲＧ３は７７，３７０Ｄａである（図４〜７）。この２種のＮＲＧ３はアミノ酸配列が９３％同一である。
ヒトＮＲＧ３のアミノ酸配列の解析により、それはＮＲＧ１ファミリー成員に対して相同性を含むことが判明した（すなわち、ＳＭＤＦ（Ho,W.H.ら,（1995) J.Biol.Chem.270:14523-32）およびヘレグリン−β１（Holmes,W.E.ら,（1992) Science 256:1205-10）に対して各々２３％および１９％の配列相同性）。ヒドロパシー(hydropathy)分析により、２つの疎水性セグメントが示された：Ｗ66−Ｖ91およびＬ362−Ｆ383（ヒトＮＲＧ３によるアミノ酸番号）。ＮＲＧ１と同様に、Ｃ−末端疎水性セグメントは膜貫通ドメインとしての役割を果たし得、Ｎ−末端領域は内部シグナル配列として作用し得る（Wickner,W.T.およびLodish,H.F.(1985) Science 230:400-7；Sabatini,D.D.ら,(1982) J.Cell Biol.92:1-22；およびBlobel,G.(1980) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:1496-500）。多くのニューレグリンファミリーの成員とは対照的に、ＮＲＧ３の細胞外ドメインは、Ｉｇ様またはクリングル(kringle)ドメインが欠損している。その代わり、ＮＲＧ３は、Ｎ−末端におけるユニークなＡｌａ／Ｇｌｙに富むセグメント、Ｏ−結合グリコシル化の豊富な部位を含むムチン様Ｓｅｒ／Ｔｈｒに富む領域、およびＥＧＦモチーフを含む。Ｎ−結合グリコシル化の推定部位は全くない。ＮＲＧ３のＥＧＦ様ドメインは、ＮＲＧ１（ニューレグリン−β１ＥＦＧ様ドメインと比較して３１％相同性）およびＮＲＧ２（ニューレグリン−β１ＥＦＧ様ドメインと比較して３９％相同性）によりコードされるものとは別個であり、このことはＮＲＧ３は任意にスプライシングされたＮＲＧ１アイソフォームではないことを示唆する。ＥＧＦ様ドメインとＥＧＦファミリー成員との図による比較を図８に示す。ＮＲＧ３の推定細胞内ドメインは、ＮＲＧ１の細胞内ドメインとわずか約１３％の配列相同性を含む。ＥＧＦファミリー成員のＥＧＦ様ドメインは、以下の起源から得、各参考文献はその全体を引用によりここに援用する。図８に比較した配列は、ヒトＮＲＧ３（ｈＮＲＧ３．ｅｇｆ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４；本明細書に開示）；チキンＡＲＩＡ（ｃＡＲ
ＩＡ．ｅｇｆ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）（Fall,D.L.ら．(1993) Cell 72:801-815）、ヒトアンフィレグリン（ｈＡＲ．ｅｇｆ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）（Plowman,G.D.ら,(1990) Mol.Cell.Biol.10:1969-81）；ヒトベータセルリン(betacellulin)（ｈＢＴＣ．ｅｇｆ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）（Sasada,R.ら,(1993) Biochem.Biophy.Res.Com.190:1173-9）；ヒトＥＧＦ（ｈＥＧＦ．ｅｇｆ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）（Nagai,M.ら.(1985) Gene 36:183-8）；ヒトヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ｈＨＢ−ＥＧＦ．ｅｇｆ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）（Higashiyama,S.ら,(1991) Science 251:936-9）；ヒトヘレグリン−α（ｈＨＲＧα；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）；ヒトヘレグリン−β（ｈＨＲＧβ．ｅｇｆ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）（Holmes,W.E.ら,(1992) Science 256:1205-1210）；ヒトＴＧＦ−α（ｈＴＧＦα．ｅｇｆ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）（Derynck,R.ら,(1984) Cell 38:287-97）；およびマウスエピレグリン（ｍＥＰＲ．ｅｇｆ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）（Toyoda,H.ら,(1995)FEBS Lett.377:403-7）のＥＧＦ様ドメインを含む。
（実施例３：ネズミおよびヒトＮＲＧ３の発現）
Ａ．ヒト組織のノーザンブロット解析
ヒトＮＲＧ３の組織発現プロフィールは、ノーザンブロット解析により検証した。ヒト組織由来の各２μｇのポリ（Ａ)+ＲＮＡを含む多組織ＲＮＡブロットをClontechから購入した。アミノ酸３９４−５３６をコードするヒトＮＲＧ３核酸配列の領域を用いて、ＰＣＲ増幅によりＤＮＡハイブリダイゼーションプローブを作製した。ＤＮＡプローブは、ランダムプライミングによりα-32Ｐ-ｄＣＴＰで標識した（Promega）。ＲＮＡブロットを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、５×デンハード溶液、１０％硫酸デキストランを用いて４２℃で２０時間ハイブリダイズした。ブロットを０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで、５０℃で３０分間洗浄し、Phospho ImagerTMにあてた。組織の混合物におけるＮＲＧ３の発現を指標として用いてin situハイブリダイゼーションにより特定の組織における発現を決定した。
Ｂ．マウス組織のin situ ハイブリダイゼーション解析
ホルマリンで固定しパラフィンで包埋したマウス胚（胚１３、１４、１６日目）およびグルタルアルデヒドで固定しパラフィンで包埋した、またはパラホルムアルデヒドで固定した凍結成熟マウス脳、卵巣、空腸、腎臓、副腎、肺、胃、脾臓、骨格筋、肝臓および結腸を薄片化し、LuおよびGillettの方法（Lu,L.H.およびGillett,N.A.(1994) Cell Vision 1:169-176）に修正を加えて、in situ ハイブリダイゼーション用に処理した。簡潔には、in situ ハイブリダイゼーションプローブは、記載したようにプラスミドＤＮＡではなくＰＣＲフラグメントから直接的にインビトロでの転写により作製した。32Ｐ−ＵＴＰ−標識センスおよびアンチセンスリボプローブは、ネズミＮＲＧ３のアミノ酸Ｃ292−Ｎ482をコードするｃＤＮＡフラグメントのＰＣＲ産物を標識することにより作製した。
Ｃ．ノーザンブロットおよびin situ ハイブリダイゼーション解析によりＮＲＧ３の神経発現パターンが明らかになる。
ヒトＮＲＧ３のアミノ酸３９４−５３６由来のプローブにハイブリダイズする４．４ｋｂのｍＲＮＡ転写物が脳で高度に発現された。種々の脳組織のノーザンブロットにおいて、ＮＲＧ３発現が、脳梁以外の脳のほとんどの領域で高いレベルで検出された。１．９ｋｂ転写物の低レベルの発現が精巣で検出された。１．９ｋｂ転写物ではなく、４．４ｋｂ転写物がＮＲＧ３をコードするに十分なサイズであり、このことはより小さい方の転写物は、ＮＲＧ３の任意スプライシング形をコードし得ることを示唆する。類似したＮＲＧ３発現形式が、ＥＧＦ様ドメインと重複するネズミＮＲＧ３の領域から誘導したプローブを用いて、ネズミ組織由来のＲＮＡブロットにおいて観察された。
ＮＲＧ３発現の組織分布は、胚および成熟マウスの組織を用いたin situ ハイブリダイゼーションにより特徴づけられた。胚１３日目（Ｅ１３）（検証した最も早い時間点）において、ＮＲＧ３ｍＲＮＡは神経系に限定された。胚１６日目（Ｅ１６）のマウスの脳、脊髄、三叉神経、前庭−蝸牛および脊髄神経節において、強力なＮＲＧ３ｍＲＮＡのシグナルがまた実証された。分化している細胞を含む端脳領域（例えば皮質板）は、強力なＮＲＧ３シグナルを示したが、一方、増殖または移動細胞を含む根底にある領域（脳室および脳室下領域）はほとんど発現を示さなかった。従って、ＮＲＧ３は胚マウスの神経系に主に発現されているようである。成体動物において、ＮＲＧ３アンチセンスプローブは、脊髄および数多くの脳領域（小脳核、前庭核、大脳皮質、梨状皮質、腹側嗅覚神経核、内側手綱、海馬、視床下部および視床を含む）においてｍＲＮＡとハイブリダイズした。
（実施例４：ＮＲＧ３フラグメントの結合特性の特徴づけ）
Ａ．哺乳動物細胞におけるＮＲＧ３ＥＧＦ融合タンパク質の発現および精製
ＮＲＧ３ＥＧＦ様ドメインの結合特性を検証するため、並びに、本発明のＮＲＧ３フラグメントの機能を実証するために、ＥＧＦ様ドメイン（このドメインはマウスおよびヒトＮＲＧ３において同一のアミノ酸配列を有する）の配列を含む可溶性融合タンパク質を調製した。
ネズミＮＲＧ３284-344のＥＧＦ様ドメインを含む分泌されたエピトープ標識ポリペプチドを、Ｎ末端からＣ末端方向に発現させた、１）ｇＤシグナル配列のコード配列およびエピトープ標識（Mark,M.R.ら,(1994) J.Biol.Chem.269、10720-10728）；２）ネズミＮＲＧ３のアミノ酸２８４−３４４をコードする配列（ヒトＮＲＧ３アミノ酸２８２−３４２と同一）；および３）ヒトＩｇＧ1のＦｃ部分のコード配列をｐＳＡ．ＳＤ５ベクター（A. Shen, Genentech,Inc. からのpsar.SD5）において連結することにより構築した。これらの配列をコードするプラスミドは、ＮＲＧ３EGF．Ｆｃと指称した。ＮＲＧ３EGF．Ｆｃ発現プラスミドは、LipofectAMINE（GIBCO/BRL、Bethesda、ＭＤ）を用いて、ＤＨＦＲ−チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ／ＤＰ１２；ＡＴＴＣ指称ＣＣＬ９０９６）にトランスフェクトした。クローンをグリシン／ヒポキサンチン／チミジンマイナス培地で選択し、例えば（Sambrook,J.ら.、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory(1989)参照）、プールし、増殖させた。コードされた融合タンパク質は選択したクローンの培養物中で発現していた。これらの細胞のならし培地を回収し、組換えタンパク質をハイトラップ(Hitrap)・プロテインＡアフィニティーカラム（Pharmacia）により精製した。
ＮＲＧ３EGF．Ｈ６融合タンパク質と指称される単量体の融合タンパク質はＦｃ融合タンパク質と同一系で産生し、コバルトアフィニティーカラムを通して精製した。ＮＲＧ３EGF．Ｈ６は、Ｎ末端ｇＤ標識、ネズミＮＲＧ３284-344、および６つのヒスチジン残基のコード配列を含む。精製はコバルトアフィニティーカラム（コバルトアフィニティーカラム、R.Vandlen、Genentech,Inc.）を用いて固定コバルトに対するヒスチジン側鎖の親和性を基本とした。タンパク質濃度は、バイオラド・プロテイン・アッセイ（BioRad、Richmond、CA）により決定した。
Ｂ．Ｋ５６２erbB細胞系の産生
ヒトＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４レセプターを発現する安定な細胞系をＫ５６２細胞から誘導した（Ｋ５６２細胞はＡＴＣＣ指称ＣＣＬ２４３を有する）。
ヒトｅｒｂＢ２、ｅｒｂＢ３およびｅｒｂＢ４のｃＤＮＡは、L.BaldおよびG.Scoffer、Genentech(Sliwkowski,M.ら,（1994)、J.Biol.Chem.269:14661-14665）から得た。これらのｃＤＮＡをＣＭＶ−基本発現ベクターにサブクローニングし、Ｋ５６２ヒト骨髄白血球細胞系に電気穿孔により導入した（１１８０ｍＦ、３５０Ｖ）。トランスフェクション体を、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、および０．８ｍｇ／ｍｌＧ４１８含有の１０ｍＭＨＥＰＥＳを補足したＲＰＭＩ１６４０中で培養した。耐性クローンを限界希釈法により得、レセプター発現をウエスタンブロットおよびＮＲＧ結合アッセイにより確認した。レセプター発現は各ＥｒｂＢレセプターの抗体を用いたウエスタンブロット解析により確認された（抗体はGenentech,Inc.で製造）。ホルボールエステル刺激は、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４トランスフェクション体の両方においてレセプター発現を顕著に亢進することが判明し、安定にトランスフェクトしたＫ５６２細胞系を１０ｎｇ／ｍｌホルボール、１２−ミリステート、１２−アセテート−（ＰＭＡ）を含む培地中で使用前に一晩培養した。
Ｃ．ＦＡＣＳ解析
各結合反応において、５×１０5の安定にトランスフェクトしたＫ５６２細胞を、ＰＢＳ／２％ＢＳＡ中に、４℃で３０分間懸濁し、次いで５μｇの単離精製したＮＲＧ３EGF．Ｆｃ（分子量９０ｋＤａ）と共に、容積０．２５ｍｌ中氷上で６０分間インキュベートした。１μｇの一次抗体（抗−ｇＤまたは抗−ＥｒｂＢレセプター）および二次ＰＥ−複合体（CALTAG、CA、ヤギ抗−マウス、１：１００希釈）抗体を連続的に３０−６０分間のインキュベート時間で加え、各添加前には十分に洗浄した。ＦＡＣＳ解析は、Becton&Dickson のＦＡＣＳ装置で実施した。抗−ｇＤ（５Ｂ６）、抗−ＥｒｂＢ２レセプター（４Ｄ５）、抗−ＥｒｂＢ３レセプター（２Ｆ９）および抗−ＥｒｂＢ４レセプター（３Ｂ９）モノクローナル抗体を、モノクローナル抗体グループ、Genentech,Inc.により標準的な方法を用いて調製した
Ｄ．ＮＲＧ３のＥＧＦ様ドメインは特異的にＥｒｂＢ４レセプターチロシンキナーゼに結合する。
ＮＲＧ３のレセプターを同定するために、任意の公知のニューレグリンレセプターへのＮＲＧ３の結合能について調査した。レセプターＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４を発現する安定な細胞系を作製した。親細胞系Ｋ５６２は検出可能なレベルのＥｒｂＢレセプターを発現しない（図９）。Ｋ５６２erb2、Ｋ５６２erb3およびＫ５６２erb4細胞は、対応するレセプターのみを発現した（図９）。
ＥＧＦ様ドメインは、ＮＲＧ１のそのレセプターへの結合特異性を決定するので、ヒトＩｇＧのＦｃ部分に融合したＮＲＧ３のＥＧＦ様ドメインのエピトープ標識型を含むタンパク質を発現および精製した。ＦＡＣＳアッセイを用いて、ＮＲＧ３EGF．ＦｃはＥｒｂＢ４レセプターを発現する細胞に結合することが観察された（図１０）。結合はＮＲＧ３EGF．Ｆｃは親Ｋ５６２細胞にも、またＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３のいずれかを発現する細胞にも結合しないという点で特異的であった（図１０）。対照融合タンパク質であるＲＳＥ．Ｆｃは、これらの細胞系のいずれにも結合しなかった。このＮＲＧ３EGF．ＦｃのＫ５６２erb4細胞への結合は、用量依存的にヘレグリン−β１のＥＧＦ様ドメイン（ＮＲＧ１EGF）と競合するが、ＲＳＥ．Ｆｃによっては競合せず、これはＮＲＧ３EGF．Ｆｃは細胞表面上で直接ＥｒｂＢ４と相互作用することが示唆された。
ＥｒｂＢ４レセプターの可溶形態はインビトロにおいてＮＲＧ３EGF．Ｆｃにより共免疫沈降し、さらにＮＲＧ３EGF．ＦｃのＥｒｂＢ４レセプターへの結合が示唆された。
ＮＲＧ３EGF．ＦｃのＥｒｂＢ４レセプターへの結合は、さらに、125Ｉ−標識ＮＲＧ３EGF．Ｆｃを用いた直接的競合結合アッセイにより解析した。精製ＮＲＧ３EGF．Ｆｃは、Sliwkowskiら（Sliwkowski,M.X.ら,(1994) J.Biol.Chem.269、14661-5）により記載のラクトペルオキシダーゼを用いて放射性ヨウ素化した。放射標識タンパク質の平均比活性は、３００μＣｉ／μｇであった。125Ｉ−ＮＲＧ３EGF．Ｆｃの固定ＥｒｂＢ４．Ｆｃへの結合は、濃度依存的に、ＮＲＧ３EGF．ＦｃまたはＮＲＧ１EGFのＥＧＦドメイン（ｒＨＲＧβ１177-244）のいずれかと競合した。
置換結合アッセイは、Maxisorp C９６ウエル（Nunc、Naperville、Illinois）中で実施した。ヤギ抗−ヒト抗体（Boehringer Mannheim、Germany）を、４℃で一晩、１００μｌの５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中、０．２μｇ／ウエルの濃度でプレート上に被覆した。プレートを、ＴＢＳＴ緩衝液（２５ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０）中１％ＢＳＡにより３０分間室温（ＲＴ）で遮断した。ＥｒｂＢ４レセプターの可溶形態を、１％ＢＳＡ／ＴＢＳＴ中、１５ｎｇ／ウエルで添加し、１．５時間室温でインキュベートした。放射標識タンパク質が残留ヤギ抗−ヒト抗体と相互作用するのを防ぐために、１μＭのヒト化モノクローナル抗体（ｒｈｕＭＡＢ ＨＥＲ２；Carter,P.ら,(1992) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285-9）を、プレートに２０分間で加え、その後の結合反応に含めた。
次いで、競合的結合アッセイを、８０ｐＭ（２００，０００ｃｐｍ）の125Ｉ−ＮＲＧ３EGF．Ｆｃを、種々の濃度の非標識ＮＲＧ３EGF．ＦｃまたはＮＲＧ１EGF（大腸菌発現、Ｆｃ無し）と共に添加することにより開始した。ＮＲＧ１EGF は、ＮＲＧ１のＥＧＦドメインであり、ニューレグリン−β１アイソフォーム（Holmes,W.E.ら，(1992) Science 256:1205-10）のアミノ酸１７７−２４４に対応し、J.A.Lofgren、Genentech,Inc.から得られる。最終インキュベート容量は結合緩衝液中１００μｌであり（Ｆ−１２／ＤＭＥＭ培地、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、２％ＢＳＡ）、反応は室温で１．５時間進行させた。非結合物質はＴＢＳＴで十分に洗浄し、結合放射活性はBeckman Iso ガンマ−カウンター（Smith-Kline Beckmann、PA）で計測した。データは非線形回帰コンピュータープログラムを用いて解析した。
図９及び１０に示される結合実験の結果に基づいて、ＮＲＧ３EGF．ＦｃのＥｒｂＢ４．Ｆｃに対する結合推定親和性（Ｋｉ）は、９±４ｎＭ（ｎ＝４）と決定され、ＮＲＧ１EGFの見かけのＫｉは約１ｎＭであった。ＮＲＧ３EGF．Ｆｃの置換曲線の浅さは、ＮＲＧ３EGF．Ｆｃが二価Ｆｃ融合タンパク質として発現される事実に起因し得る（図１１）。対照実験の結果により、125Ｉ−ＮＲＧ３EGF ．Ｆｃは、同実験において対照レセプターＲＳＥ．Ｆｃには結合せず、ＲＳＥ．ＦｃはＥｒｂＢ４．Ｆｃに対する結合に関して125Ｉ−ＮＲＧ３EGF．Ｆｃと競合しないことが示された。
Ｅ．チロシンリン酸化アッセイ
ＮＲＧ１はＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４レセプターに結合および活性化し、その結果、チロシンリン酸化および下流シグナリング事象を引き起こす（Sliwkowski,M.X.ら，(1994)上記；Plowman,G.D.ら，(1993)上記；およびCarraway,K.L.およびCantley,L.C.(1994)上記）。先行実施例で実証されたように、ＮＲＧ３はＥｒｂＢ４レセプターに結合するが、ＥｒｂＢ２またはＥｒｂＢ３レセプターには検出可能なレベルで結合しない。ＮＲＧ３（ＮＲＧ３ＥＧＦ）のＥＧＦ様ドメインのＥｒｂＢ４レセプター、Ｋ５６２erbB4細胞の活性化能を検証した。
Ｋ５６２erbB4細胞またはＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞（ネガティブコントロール；ＡＴＣＣ名称ＨＢ１３１）を、血清を欠失した培地中で１２時間培養し、次いで、ＮＲＧ３EGF．Ｆｃ、ＮＲＧEGF．Ｈ６またはＮＲＧ１EGFで刺激した。Ｋ５６２erbB4細胞を、２．５ｎＭまたは２５ｎＭのＮＲＧ３EGF．Ｆｃで３分間または８分間処理した。ポジティブコントロールとしては、細胞を、同様にＮＲＧ１EGFで処理した。
ＥｒｂＢ４レセプターチロシンリン酸化は、以下の方法に従って、免疫沈降およびウエスタンブロットにより検出した。細胞を溶解緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ ＮａＦ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＥＧＴＡ、０．１％ＳＤＳ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２ｍＭバナジン酸ナトリウム、２ｍＭモリブデン酸ナトリウム、２ｍＭＰＭＳＦ）で溶解した。遠心により細胞破片を除去した後、１μｇの抗−ＥｒｂＢ４レセプターモノクローナル抗体（C-18、Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz、CA）を２０μｌのプロテインＡ−アガローススラリーと共に添加した（Sigma、St.Louis、MO）。４℃で一晩免疫沈降し、複合体を遠心により回収し、３回１ｍｌの溶解緩衝液で洗浄した。タンパク質を、ノベックス（Novex）４％−１２％ミニゲル上での還元ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離し、ニトロセルロースに転写した。ブロットをペルオキシダーゼ複合抗−ホスホチロシン抗体（Transduction Laboratory）でプローブした。ブロットを剥がし、抗−ＥｒｂＢ４レセプター抗体で、次いで、ペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗−ウサギＩｇＧ抗体（Sigma）で再プローブし、ＥｒｂＢ４レセプタータンパク質を可視化した。
これらの実験に基づき、ＮＲＧ３EGF．ＦｃはＥｒｂＢ４レセプターチロシンリン酸化を、同時および用量依存的に刺激することが示された。
ＮＲＧ３EGFのＥｒｂＢ４レセプターチロシンリン酸化活性化能を確認するために、ヒト乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４５３におけるレセプター活性化を検証した。この細胞系は高レベルのＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ３レセプターを発現するが、ＥｒｂＢ４レセプターの発現は低い。ＭＤＡ-ＭＢ-４５３細胞を、ＮＲＧ３EGF．Ｆｃまたは単量体形のＥＧＦドメイン（ＮＲＧ３EGF．Ｈ６）で処理すると、ＥｒｂＢ４レセプターのチロシンリン酸化がかなり増加する結果となった。
ＮＲＧファミリー成員およびＥＧＦファミリー成員の他の成員は、複雑なレセプター結合形式を示す。ほとんどの場合、１つのリガンドは、いくつかのレセプターホモ−およびヘテロダイマーの組合せに結合できる（Karunagaran,D.ら，（1996) EMBO J 15:254-264、Beerli,R.R.およびHynes,N.E.(1996) J.Biol.Chem.271:6071-6076）。例えば、ＮＲＧはＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３レセプターヘテロダイマーおよびＥｒｂＢ４／ＥｒｂＢ４レセプターホモダイマーと高い親和性で結合するが、ＥｒｂＢ３／ＥｒｂＢ３レセプターホモダイマーとは親和性が低い（Sliwkowski,M.X.ら，(1994) J.Biol.Chem.269、14661-5、Carraway,K.L.およびCantley.L.C.(1994) Cell 78、5-8、Tzahar,E.ら，(1994) J.Biol.Chem.269、25226-33、Carraway,K.L.r.ら，(1994) J.Biol.Chem.269、14303-6、およびKita,Y.A．ら，(1994) FEBS Lett.349、139-43）。ベータセルリンはＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ４ホモダイマーの両方に結合する（Riese,D.J.ら，(1995) Mol.Cell.Biol.15:5770-6）。ＥＧＦおよびＮＲＧ１ファミリー成員のＥＧＦ様ドメインによりレセプター活性化の特異性が決まる（Barbacci,E.G.ら，（1995) J.Biol.Chem.270:9585-9589）。ＮＲＧ３およびＮＲＧ１のＥＧＦ様ドメインにおける限られたアミノ酸相同性により、ＮＲＧ３はＮＲＧファミリーの成員と比較して異なるスペクトルのレセプター相互作用を有し得ることが示唆されるが、重複した結合部位を有する。なぜなら、ＮＲＧ３のＥＧＦ様ドメインのＥｒｂＢ４への結合はＮＲＧ１のＥＧＦ様ドメインにより競合できるからである。
ＮＲＧ３EGF．Ｆｃは、ＥｒｂＢ２またはＥｒｂＢ３のいずれかを発現するＫ５６２細胞に（図１０）、または高レベルのＥＧＦＲを発現するＭＤＡ-ＭＢ-４８６細胞には結合しなかった。ＮＲＧ３で処理したＭＤＡ-ＭＢ-４５３細胞におけるＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２またはＥｒｂＢ３のリン酸化の増加もまた観察されなかった。
ＳＭＤＦの神経特異的形以外のほとんどのＮＲＧ変異体は、とりわけ脳、心臓、骨格筋、乳房、肝臓、肺を含む多くの組織に広範に発現されている。ＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ４の両方のリガンドであるベータセルリンもまた、広範な組織発現形式を示す（Shing,Y.ら，(1993) Science 259、1804-7；Sasada,R.ら，(1993) Biochem.Biophy.Res.Com.190、1173-9）。対照的に、ＮＲＧ３の発現はノーザン解析およびin situ ハイブリダイゼーションにより本明細書で開示されるように神経組織に極端に限られている。さらに、ＮＲＧ３ｍＲＮＡは、ノーザンブロットにより判定したところマウスにおいて早くもＥ１１（Ｅ４ではない）で、in situ ハイブリダイゼーションによりＥ１３で検出できる（検証された最も早い年齢）。ＥｒｂＢ４は優先的に脳、心臓および骨格筋において発現される（Plowman,G.D.ら，(1993) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90、1746-50）。ＥｒｂＢ４はまた、ヒヨコ胚の脳（Ｅ１４、Ｅ１７、ニューロンに優先的に）（Francoeur,J.R.ら，(1995) J.Neur.Res.41、836-45）、ラット網膜培養物（Bermingham-McDonogh,O.ら,（1996) Development 122、1427-38）において神経筋シナプス（Zhu,X.ら，(1995) EMBO J.14、5842-8）で広範に分布していることが示されたが、培養ヒトおよびラットシュワン細胞（Grinspan,J.B.ら，(1996) J.Neuroscience 16、6107-6118、Levi,A.D.ら，(1995) J.Neuroscience 15、1329-40）では示されなかった。近年、ＥｒｂＢ４はＧＡＢＡ+細胞と共局在していることが判明した（Weber,J.ら，(1996) Soc Neurosci Abstr 22、1579）。従って、同一レセプターが、対応する組織特異的リガンドと相互作用する時に異なる組織または細胞型において異なる生物学的機能を仲介し得る。例えば、ＮＲＧ１は心臓発達中にＥｒｂＢ４のリガンドとしての役割を果たし、ベータセルリンは種々の細胞型においてＥｒｂＢ４の有糸分裂誘発リガンドとして作用し得るが、一方、神経特異的リガンド（例えばＮＲＧ３）は中枢または末梢神経系においてＥｒｂＢ４レセプター発現細胞上で栄養または指導分子として機能し得る。
（実施例５：全長マウスおよびヒトＮＲＧ３による結合およびＥｒｂＢ４レセプターチロシンキナーゼ活性化）
全長ネズミＮＲＧ３またはヒトＮＲＧ３は、それぞれネズミおよびヒト共通核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に基づき合成し、ＮＲＧ３はアミノ酸配列として表現した。ＮＲＧ３−ＥＧＦの結合およびＥｒｂＢ４レセプター活性化の特徴づけで本明細書に記載した実験に基づき、類似の実験を、マウスおよびヒト起源の全長共通ＮＲＧ３で実施する。ｐＨ、溶質およびその濃度、および全長共通ＮＲＧ３のＥｒｂＢ４レセプター結合およびＥｒｂＢ４レセプター活性化を可能とする他の相関するパラメーターを最適化するために反応条件の調節を行う。
また、ＥＧＦ様ドメインを有するが、膜貫通ドメインを欠失するネズミまたはヒトＮＲＧ３ポリペプチドフラグメントを合成し、本明細書に記載のようにＥｒｂＢ４レセプター結合および活性化について試験する。かかるＮＲＧ３フラグメントは、例えば、ＮＲＧ３の細胞外ドメインを含み、この細胞外ドメインはＥＧＦ様ドメインを含む。
ＮＲＧ３細胞外ドメインは所望により、ＮＲＧ３−ＥＧＦ−Ｆｃ融合タンパク質として本明細書に記載のように、免疫グロブリン定常領域に融合させ得る。Ｆｃ融合タンパク質、すなわちＮＲＧ３細胞外ドメインＦｃタンパク質はダイマーを形成することが期待される。免疫グロブリン定常領域は好ましくはＩｇＧ由来であるが、またＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＥからも取り得、これは本発明の範囲内である。
結合活性または結合および活性化能を保持する単量体融合タンパク質を所望する場合、細胞外ドメインは、例えば、ＮＲＧ３−ＥＧＦ−Ｈ６免疫癒着として本明細書に開示したように一連のヒスチジン残基に融合させる。
ｐＨ、溶質およびその濃度およびＮＲＧ３フラグメントのＥｒｂＢ４レセプター結合およびＥｒｂＢ４レセプター活性化を可能とする他の相関するパラメーターを最適化するために結合反応条件の調節を行う。
（実施例６：細胞増殖の促進）
細胞増殖の促進は、表面上にＥｒｂＢ４レセプターを発現する細胞をＮＲＧ３で処理する、以下のアッセイにより例示される。本発明により、細胞をＮＲＧ３フラグメント（例えばＮＲＧ３ＥＧＦ様ドメイン）またはＮＲＧ３変異体で処理し得ると理解される
例として、天然にＥｒｂＢ４レセプターを発現するラット網膜細胞（Bermingham-McDonogh,O.ら，(1996) Development 122、1427-38）を標準的技術により培養する。培養した細胞を用量依存的にＮＲＧ３と接触させ、細胞数増加（例えば４８時間で３０％増加）およびＥＣ５０を決定する。
ＮＲＧ３処理は、これらの細胞の形態を変化させ得る；非処理細胞は数多くの分枝プロセスを有し多極性であり、一方、ＮＲＧ３−処理細胞は紡錘型で潤滑なプロセスとなりおよび／またはそれらは平行な配列で並び得る。
ＮＲＧ３は用量依存的にニューロン細胞成長を刺激すると考えられている。単独のＮＲＧ３は、対照培地と比較し、ニューロン細胞数を顕著に増加させることが期待される。他のニューロン増殖エンハンサー、例えばｇａｓ６（成長停止特異的遺伝子；例えば、Schneiderら、Cell 54:787-793(1988)；及びManfiolettiら、Molec. Cell Biol.13(8):4976-4985(1993)参照）および／またはヘレグリンの間に相乗効果が観察され得る。ＮＲＧ３は細胞数および細胞増殖の指標であるチミジン取り込みの両方を増加させることが期待される。
ＮＲＧ３は、ＮＲＧ３単独またはＮＲＧ３と他の細胞増殖強化化合物、例えばヘレグリン、ｇａｓ６、ウシ胎児血清等を含む種々の培地で成育させたＥｒｂＢ４レセプター発現ニューロン細胞の位相差顕微鏡を観察して決定したところ細胞形態に効果を及ぼすことが期待される。顕微鏡写真は培養９６時間後にとる。ＮＲＧ３の存在下で成育した細胞はＮＲＧ３の非存在下で成育した細胞には観察されないプロセスを有することが予想される。
細胞を培養したニューロン細胞に特異的なマーカーで、免疫蛍光して染色する。簡潔には、通過したＥｒｂＢ４レセプター発現ニューロン細胞をＮＲＧ３と接触させ、２４時間ラミニンで被覆したチャンバースライド上で培養し、ＰＢＳ中１０％ホルマリンで固定する。固定した細胞を、１０％ヤギ血清で遮断し、ウサギ由来抗−マーカー抗体と共に頒布者の推薦する希釈度でインキュベートする。一次抗体の特異的結合が、ヤギ抗−ウサギＩｇＧ(Ｆａｂ′)2−ＦＩＴＣ複合体による染色により観察される。細胞を、ＤＮＡ染料ヨウ化プロピジウムで対比染色した。ネガティブコントロールを、染色が陰性であるＷＩ−３８細胞上で実施する。これらの条件下で成育した細胞は、細胞マーカーに対して１００％の免疫蛍光染色を示すことが予想される。
ＥｒｂＢ４レセプター発現ニューロン細胞におけるＥｒｂＢ４チロシンキナーゼレセプターを介するＮＲＧ３の増殖刺激能は、以下のように調査し得る。細胞を種々の量のＮＲＧ３（例えば０−２００ｎＭ）で１５分間３７℃インキュベーター中で刺激する。細胞溶解物を調製し、抗−ＥｒｂＢ４レセプター抗体で免疫沈降する。ＥｒｂＢ４レセプターのチロシンリン酸化は、４Ｇ１０抗リン酸化抗体で検出する。約１０6の細胞を成育させ、一定の培地においてほぼ集密的とする。細胞を１５分間３７℃インキュベーター中ＮＲＧ３で処理し、１ｍｌの溶解緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１３５ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ バナジン酸ナトリウムおよび１ｍＭモリブデン酸ナトリウム、２ｍＭ ＥＤＴＡおよび２ｍＭ ＥＧＴＡ、１０％グリセロール、１％ＮＰ４０、１μＭオカダイック(okadaic)酸、１ｍＭ ＰＭＳＦおよび１ｍＭ ＡＥＢＳＦ）を用いて氷上で溶解する。細胞溶解物は４℃で１０分間１４０００×ｇで遠心して清澄にする。免疫沈降は、約１μｇのウサギ抗−ＥｒｂＢ４レセプター抗体または２μｌのウサギ抗−ＥｒｂＢ４レセプター抗血清を用いて実施する。免疫複合体は、１０μｌのプロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂビーズで回収する。タンパク質を、ノベックス４−１２％勾配ゲルで分離し、ニトロセルロース膜に転写する。抗−ホスホチロシンイムノブロットを、４Ｇ１０マウス抗−ホスホチロシン抗体（ＵＢＩ）、ヤギ抗−マウスセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲートおよびＥＣＬ発達キット（Amersham）を用いて実施する。ＮＲＧ３のＥｒｂＢ４レセプター発現ニューロン細胞への添加は、ＥｒｂＢ４レセプターチロシン残基の自己リン酸化を引き起こすことが予想される。
末梢神経傷害の修復を助け、中断された中心軸索の再生に影響を与えるために、傷害脊髄領域に移植する細胞プロテーゼとして、および複数の自己移植片の代価物として使用する哺乳動物ニューロン細胞（好ましくはヒト細胞）集合を有することが有益である。Leviら、J.Neuroscience 14(3):1309-1319(1994)参照。小生検から豊富な自己移植片源を得るための細胞培養技術の使用は、広範な火傷を覆うヒト表皮細胞を提供することにすでに臨床的に成功している（Gallicoら、N.Eng J.Med.311:338-451(1984)）。従って、上記の試みはヒトを含む哺乳動物において成功裏に適応することが期待される。
本明細書全体で記載した全ての文献並びにその中で引用された参考文献は、その全体を参考としてここに援用する。本発明は特定の実施形態について記載されているが、本発明はこれに限定されない。さらなる修飾および変形を本発明の全体の概念から逸脱することなくなし得ることを理解されたい。かかる全ての修飾は本発明の範囲内であると考える。
物質の寄託 以下の物質は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、12301 Parklawn Drive、Rockville、MD、USA（ＡＴＣＣ）に寄託されている：
物質 ＡＴＣＣ寄託番号 寄託日
マウスNRG3 pLXSN.mNRG3 ２０９１５６ 1997年7月22日
ヒトNRG3B1 pRK5.tk.neo.hNRG3B1 ２０９１５７ 1997年7月22日
ヒトNRG3B2 pRK5.tk.neo.hNRG3B2 ２０９２９７ 1997年9月23日
これらの寄託はブダペスト条約の特許手続およびその下での規則を目的とする微生物寄託の国際的承認の規定下でなされる（ブダペスト条約）。これにより、寄託日から３０年間、生存可能な寄託培養物を維持することが保証される。寄託はブダペスト条約の項目下でＡＴＣＣにより利用でき、ジェネンテック インクとＡＴＣＣの間の合意をとり、適切な米国特許の発行時にまたは米国または外国特許出願の公共への開示時のどちらか先の時に、公共に利用可能となり、永久的および非制限的な寄託後代培養物の利用が保証され、３５ＵＳＣ§１２２およびそれに準ずる長官の規則（特に８８６ＯＧ６３８に関連した３７ＣＦＲ§１．１４を含む）に従って特許および登録商標庁の米国長官により権利を与えると決定した者に後代の利用を保証する。
欧州特許が求める指令に関して、寄託微生物のサンプルは、欧州特許の認可の記載の公示まで、または出願が拒絶または取り下げまたは取り下げられると考えられる日まで利用でき、サンプルを要求した人により指定された専門家にかかるサンプルが供給される。（規則２８（４）ＥＰＣ）
本出願の譲受人は、寄託物質の微生物が、適当な条件下における培養時に、死滅または紛失または破壊されれば、届け時に直ちに物質を別の同一物と置換することに合意した。寄託物質の利用は、特許法に従って任意の政府の権力下に認可された権利に違反して本発明を実施する許可として解釈しない。
前記の明細書は、当業者が本発明を実施するに十分であると考えられる。本発明は、寄託された構築物により範囲が制限されない。なぜなら、寄託した実施形態は本発明のある態様の単なる説明であると考えられ、機能的に等価な任意の構築物は本発明の範囲内である。本明細書の物質の寄託は、本明細書に含む記載は、本発明の任意の態様（その最良の形態を含む）の実施を可能とするには不適切であることを認めず、またそれが示す特別な説明に対する本特許請求の範囲を制限するものとは考えない。実際、本明細書で示されおよび記載されたものに加えて、本発明の種々の修飾は、前記から当業者には明らかであり、添付の特許請求の範囲内である。
マウスＮＲＧ３ｃＤＮＡ（ｍＮＲＧ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の配列をコードする核酸を示す図である。コード配列の開始（ＡＴＧ）及び停止（ＴＧＡ）コドンは下線によって示した。 ヒトＮＲＧ３ｃＤＮＡ（ｈＮＲＧ３Ｂ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）の配列をコードする核酸を示す図である。コード配列の開始（ＡＴＧ）及び停止（ＴＧＡ）コドンは下線によって示した。 ＮＲＧ３ｃＤＮＡの交互にスプライスされた形態（ｈＮＲＧ３Ｂ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）の配列をコードする核酸を示す図である。コード配列の開始（ＡＴＧ）及び停止（ＴＧＡ）コドンは下線によって示した。 図１及び２に示したマウス（ｍＮＲＧ３）及びヒト（ｈＮＲＧ３Ｂ１）ｃＤＮＡから演繹されたアミノ酸配列を示す図である。マウスＮＲＧ３の演繹されたアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示し、ヒトｈＮＲＧ３Ｂ１の演繹されたアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で示した。アミノ酸配列内の種々の推定ドメインを示した。ＥＧＦ様ドメイン、Ｎ-末端疎水性セグメント（二重下線）、セリン／スレオニン-豊富な部分、及び予想される膜貫通ドメイン（一重下線）を目立たせた。 図１及び２に示したマウス（ｍＮＲＧ３）及びヒト（ｈＮＲＧ３Ｂ１）ｃＤＮＡから演繹されたアミノ酸配列を示す図である。マウスＮＲＧ３の演繹されたアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示し、ヒトｈＮＲＧ３Ｂ１の演繹されたアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で示した。アミノ酸配列内の種々の推定ドメインを示した。ＥＧＦ様ドメイン、Ｎ-末端疎水性セグメント（二重下線）、セリン／スレオニン-豊富な部分、及び予想される膜貫通ドメイン（一重下線）を目立たせた。 図２及び３に示したｈＮＲＧ３Ｂ１及びｈＮＲＧ３Ｂ２ｃＤＮＡから演繹されたアミノ酸配列を示す図である。ヒトＮＲＧＢ１の演繹されたアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で示し、ヒトｈＮＲＧ３Ｂ２の演繹されたアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３で示した。２つのヒト配列の間で相違するＮＲＧ３アミノ酸配列の領域を示した。 図２及び３に示したｈＮＲＧ３Ｂ１及びｈＮＲＧ３Ｂ２ｃＤＮＡから演繹されたアミノ酸配列を示す図である。ヒトＮＲＧＢ１の演繹されたアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で示し、ヒトｈＮＲＧ３Ｂ２の演繹されたアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３で示した。２つのヒト配列の間で相違するＮＲＧ３アミノ酸配列の領域を示した。 ヒトＮＲＧ３Ｂ１（ｈＮＲＧ３．ｅｇｆ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）；チキンＡＲＩＡ（ｃＡＲＩＡ．ｅｇｆ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；ヒトアンフィレグリン（ｈＡＲ．ｅｇｆ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）；ヒトベータセルリン（ｈＢＴＣ．ｅｇｆ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）；ヒトＥＧＦ（ｈＥＧＦ．ｅｇｆ；ＳＥＱ ＩＤ の：１２）；ヒトヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ｈＨＢ-ＥＧＦ．ｅｇｆ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）；ヒトヘレグリン-α（ｈＨＲＧα．ｅｇｆ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）；及びマウスエピレグリン（ｍＥＰＲ．ｅｇｆ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）のＥＧＦ様ドメインの配列アライメントを示す図である。配列は、配列分析プログラム、Genentech社を用いて分析した。 ＮＲＧ３EGF．Ｆｃの細胞表面に表現されたＥｒｂＢ４レセプターへの結合を示すＦＡＣＳプロットを示す図である。親Ｋ５６２細胞（Ａ）、または、ＥｒｂＢ２レセプター（Ｋ５６２erbB2細胞、Ｂ）、ＥｒｂＢ３レセプター（Ｋ５６２erbB3細胞、Ｃ）またはＥｒｂＢ４レセプター（Ｋ５６２erbB4細胞、Ｄ）を発現するＫ５６２細胞を、対応するレセプターの発現について試験した。ＰＥ-複合二次抗体を添加する前に、細胞を、表示したように抗-ＥｒｂＢ２レセプター、抗-ＥｒｂＢ３レセプターまたは抗-ＥｒｂＢ４レセプター抗体とともにインキュベートした。「ＬＯＧ ＰＥ」は相対蛍光強度を表し、「カウント」は細胞数を表す。 ＮＲＧ３EGF．Ｆｃの細胞表面に表現されたＥｒｂＢ４レセプターへの結合を示すＦＡＣＳプロットを示す図である。ＮＲＧ３EGF．Ｆｃは、ＥｒｂＢ４レセプター表現細胞への結合のＦＡＣＳ分析で示した。親Ｋ５６２細胞（Ｅ）、Ｋ５６２erbB2細胞（Ｆ）、Ｋ５６２erbB3細胞（Ｇ）及びＫ５６２erbB4細胞（Ｈ）を、（ｇＤタグを含む）ＮＲＧ３ＥＧＦ．Ｆｃ有無で１時間、次いで抗-ｇＤタグ一次抗体及びＰＥ複合二次抗体とともにインキュベートした。 ＮＲＧ３EGF．Ｆｃ又はＮＲＧEGFによる、125Ｉ-ＮＲＧ３EGF．Ｆｃの固定化された可溶性ＥｒｂＢ４レセプターへの結合の競合的阻害を示すグラフである。可溶性ＥｒｂＢ４レセプターは、９６-ウェルプレート上に固定化し、種々の濃度の非ラベルＮＲＧ３EGF．ＦｃまたはＮＲＧEGF、および一定量の125Ｉ-ＮＲＧ３EGF．Ｆｃとともに１．５時間室温でインキュベートした。125Ｉ-ＮＲＧ３EGF．Ｆｃインプット全体に渡って結合した放射活性画分を、競合相手の濃度に対してプロットした。４つの独立したアッセイからの代表的な実験データを示した。エラーバーは４つのサンプルの標準偏差である。

Claims (38)

  1. ＥＧＦ様ドメインをコードするアミノ酸配列を含み、当該アミノ酸配列がＮＲＧ３結合特性を有するポリペプチド。
  2. ＮＲＧ３結合特性が、（ａ）実験的に類似する条件下で、ＥｒｂＢ４レセプターには結合するがＥｒｂＢ２レセプターまたはＥｒｂＢ３レセプターには結合しないこと；及び（ｂ）ＥｒｂＢ４レセプターのチロシンリン酸化を活性化することを含む請求項１記載のポリペプチド。
  3. アミノ酸配列が、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４と少なくとも７５％のアミノ酸配列相同性を有する請求項１記載のポリペプチド。
  4. ポリペプチドがＥｒｂＢ４レセプターに結合し、ＥｒｂＢ４レセプターのチロシンリン酸化を刺激する請求項１記載のポリペプチド。
  5. ＥｒｂＢ４レセプターに結合し、 （ａ）ＮＲＧ３の細胞外ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３または７）と少なくとも７５％の相同性を持つアミノ酸配列を含むポリペプチド； （ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６と少なくとも７５％の相同性を持つアミノ酸配列を含むポリペプチド； （ｃ）ポリペプチド（ａ）または（ｂ）のさらなる哺乳類相同体； （ｄ）ポリペプチドを細胞膜に固定できない膜貫通ドメインを持つ、ポリペプチド（ａ）−（ｃ）の可溶化形態；及び （ｅ）ＮＲＧ３の結合特性を持つ、ポリペプチド（ａ）−（ｄ）の誘導体からなる群から選択されるポリペプチド。
  6. ＡＴＣＣ寄託番号２０９１５６（ｐＬＸＳＮ．ｍＮＲＧ３）のＮＲＧ３核酸オープンリーディングフレーム配列によってコードされる請求項１記載のポリペプチド。
  7. ＡＴＣＣ寄託番号２０９１５７（ｐＲＫ５．ｔｋ．ｎｅｏ．ｈＮＲＧ３Ｂ１）のＮＲＧ３核酸オープンリーディングフレーム配列によってコードされる請求項１記載のポリペプチド。
  8. ＡＴＣＣ寄託番号２０９２９７（ｐＲＫ５．ｔｋ．ｎｅｏ．ｈＮＲＧ３Ｂ２）のＮＲＧ３核酸オープンリーディングフレーム配列によってコードされる請求項１記載のポリペプチド。
  9. 細胞質ドメインを欠く、またはポリペプチドを細胞膜に固定できない膜貫通ドメインを欠く、あるいはその両方を欠く請求項１記載のポリペプチド。
  10. 天然のグリコシル化を伴わない請求項１記載のポリペプチド。
  11. 変異体グリコシル化を持つ請求項１記載のポリペプチド。
  12. 請求項１記載のポリペプチドのアンタゴニスト。
  13. 請求項１記載のポリペプチドのアゴニスト。
  14. 請求項１記載のポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
  15. 哺乳類ＮＲＧ３の細胞外ドメインをさらにコードする請求項１４記載の核酸分子。
  16. コードされる細胞外ドメインが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列と少なくとも７５％が同一のアミノ酸配列を有する請求項１５記載の核酸分子。
  17. コードされるアミノ酸配列が、細胞質ドメイン、またはポリペプチドを細胞膜に固定できない膜貫通ドメイン、あるいはその両方を欠く請求項１４記載の核酸分子。
  18. ベクターで形質転換される宿主細胞によって認識されるコントロール配列に操作可能に結合した請求項１４記載の核酸分子を含む発現ベクター。
  19. ＡＴＣＣ２０９１５６（ｐＬＸＳＮ．ｍＮＲＧ３）として入手可能な請求項１８記載の発現ベクター。
  20. ＡＴＣＣ２０９１５７（ｐＲＫ５．ｔｋ．ｎｅｏ．ｈＮＲＧ３Ｂ１）として入手可能な請求項１８記載の発現ベクター。
  21. ＡＴＣＣ２０９２９７（ｐＲＫ５．ｔｋ．ｎｅｏ．ｈＮＲＧ３Ｂ２）として入手可能な請求項１８記載の発現ベクター。
  22. 請求項１８記載のベクターを含む宿主細胞。
  23. 哺乳類細胞である請求項２２記載の宿主細胞。
  24. チャイニーズハムスター卵巣細胞系である請求項２３記載の宿主細胞。
  25. ＥｒｂＢ４レセプターに結合するＥＧＦ-様ドメインをコードするアミノ酸配列を生成する方法において、当該方法が、 ａ）請求項１４記載の核酸を含む細胞を培養し；そして ｂ）細胞培地からポリペプチド回収することを含んでなる方法。
  26. ポリペプチドが培養媒質中に分泌され、培養媒質から回収される請求項２５記載の方法。
  27. 請求項１記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
  28. 請求項２７記載の抗体を生成するハイブリドーマ細胞系。
  29. 免疫グロブリン配列に融合された請求項１記載のポリペプチドのイムノアドヘシン。
  30. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のＥＧＦ-様ドメインをさらに含む請求項２９記載のイムノアドヘシン。
  31. 免疫グロブリン配列が、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン配列である請求項２９記載のイムノアドヘシン。
  32. 免疫グロブリン配列が、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２またはＩｇＧ-３の定常ドメイン配列である請求項３１記載のイムノアドヘシン。
  33. サンプル中のＮＲＧ３を検出する方法において、当該方法が、 ａ）請求項２７記載の抗体をサンプルに接触させ； ｂ）サンプル中でのポリペプチドへの抗体の結合を検出することを含んでなり、前記ポリペプチドがＮＲＧ３である方法。
  34. サンプル中のＥｒｂＢ４レセプターを検出する方法において、当該方法が、 ａ）請求項１記載のポリペプチドをサンプルに接触させ；そして ｂ）サンプル中でのタンパク質へのアミノ酸配列の結合を検出することを含んでなる方法。
  35. サンプルが、ＥｒｂＢ４レセプターを表面に発現した細胞を含有する請求項３４記載の方法。
  36. サンプルが、哺乳類組織サンプルである請求項３５記載の方法。
  37. ＮＲＧ３ポリペプチドを、ＮＲＧ３で治療可能な疾患に罹患している哺乳類に投与する方法において、当該方法が、 請求項１４記載の核酸を含む細胞を哺乳類に導入することを含んでなり、そしてＮＲＧ３ポリペプチドが当該細胞によって分泌される方法。
  38. 細胞が、多孔性マトリクス内に包含され、当該マトリクスが哺乳類に投与される請求項３７記載の方法。
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