ES2288764T3 - Neuroregulina especifica del receptor de erbb4, ligandos relacionados y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

Polipéptido aislado, polipéptido que es capaz de unirse al receptor ErbB4, pero no al receptor ErbB2 o al receptor ErbB3, y se selecciona del grupo consistente en (a) polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75% de identidad de secuencia con el dominio extracelular de la neuregulina 3 (NRG3) codificada por las SEC. Nº ID.: 3 o 7; y (b) polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75% de identidad de secuencia con la SEC. Nº ID.: 2, SEC. Nº ID.: 6, o SEC. Nº ID.: 23.

Description

Neuroregulina específica del receptor de ErbB4, ligandos relacionados y usos de los mismos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevos ligandos relacionados con la neuregulina. Más concretamente, la invención se refiere a un nuevo miembro de la familia de las neuregulinas, y a derivados funcionales del nuevo polipéptido.

Antecedentes de la invención

La transducción de señales que afectan el crecimiento y diferenciación celular está regulada, en parte, por la fosforilación de varias proteínas celulares. Las proteínas tirosín quinasas son enzimas que catalizan este proceso. Se cree que los receptor del tipo proteínas tirosín quinasas dirigen el crecimiento celular a través de la fosforilación, estimulada por ligandos, de tirosinas de sustratos intracelulares. Los receptores del factor del crecimiento del tipo proteínas tirosín quinasas incluyen el receptor de 170 kDa del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) codificado por el gen erbB1. Casualmente, erbB1 se ha visto que está implicado en el cáncer humano. En particular, se ha observado la expresión incrementada de este gen en los carcinomas de mama, vejiga, pulmón y estómago más agresivos. El segundo miembro de la subfamilia clase I, p185neu, se identificó originalmente como el producto del gen transformante de neuroblastomas de ratas tratadas químicamente. El gen neu (también denominado erbB2 y HER2) codifica un receptor de 185 kDa del tipo proteína tirosín quinasa. La amplificación y/o la sobreexpresión del gen HER2 humano se correlación con una mala prognosis en los cánceres de mama y ovario (Slamon et al., Science, 235:177-182 (1987); y Slamon et al., Science, 244:707-712 (1989)). La sobreexpresión de HER2 se ha correlacionado con otros carcinomas, incluyendo los carcinomas de estómago, endometrio, glándula salivar, pulmón, riñón, colon y vejiga. También se ha descrito otro gen relacionado, denominado erbB3 o HER3 (Kraus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9193-9197 (1989)). Kraus et al., (1989) descubrieron que los niveles marcadamente elevados de ARNm de erbB1 presentes en ciertas líneas celulares de tumores mamarios humanos, indicaban que el erbB3, al igual que el erbB1 y erbB2, pueden jugar un papel en los cánceres humanos. Se ha hallado que el gen erbB3 está sobreexpresado en cánceres de mama (Lemoine et al., (1992) Br. J. Cancer, 66:1116-1121), gastrointestinales (Poller et al., J. Pathol., 168:275-280 (1992), Rajkumer et al., J. Pathol., 170:271-278 (1993), y Sanidas et al., Int. J. Cancer, 54:935-940 (1993), y pancreáticos (Lemoine et al., J. Pathol., 168:269-273 (1992), y Friess et al., Clinical Cancer Research, 1:1413-1420 (1995)).

La subfamilia Clase I de los receptores del tipo proteínas tirosín quinasas se ha extendido además para incluir el receptor HER4/Erb4 receptor (Solicitud de Patente Europea nº 599.274; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993); y Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993). Plowman et al., hallaron que la expresión incrementada del HER4 se correlacionaba con ciertos carcinomas de origen epitelial, incluyendo los adenocarcinomas de mama. En la Solicitud de Patente Europea nº 599.274 se describen procedimientos diagnósticos para la detección de condiciones neoplásicas humanas (especialmente los cánceres de mama) que evalúan la expresión del HER4.

La búsqueda del activador del oncogén HER2 ha conducido al descubrimiento de una familia de polipéptidos, denominados colectivamente neuregulinas (NRG1). Estas proteínas parecen ser el resultado de ayustes alternativos de un único gen, el cual fue mapeado sobre el brazo corto del cromosoma 8 humano por Orr-Urtreger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1867-1871 (1993).

Holmes et al., aislaron y clonaron una familia de activadores polipeptídicos del receptor HER2, a los cuales denominaron heregulina-\alpha (HRG-\alpha), heregulina-\beta1 (HRG-\beta1), heregulina-\beta2 (HRG-\beta2), heregulina-\beta2-like (HRG-\beta2-like), y heregulina-\beta3 (HRG-\beta3). Ver Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992); WO 92/20798; y Patente Estadounidense nº 5.367.060. El polipéptido HRG-\alpha de 45 kDa se purificó a partir del medio condicionado de la línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB-231 I. Estos investigadores demostraron la capacidad de los polipéptidos de heregulina purificados para activar la fosforilación de tirosina del receptor HER2 en células de tumor mamario MCF7. Más aún, se ilustró la actividad mitogénica de los polipéptidos de heregulina sobre las células SK-BR-3 (las cuales expresan niveles elevados del receptor HER2). Al igual que otros factores de crecimiento que pertenecen a la familia del EGF, los polipéptidos HRG solubles parecen derivarse de un precursor unido a membrana (denominado pro-HRG), el cual es procesado proteolíticamente para liberar la forma soluble de 45 kDa. Estos pro-HRGs carecen de un péptido señal N-terminal.

Si bien la heregulinas son sustancialmente idénticas en los primeros 213 residuos aminoácidos, se clasifican en dos tipos principales, \alpha y \beta, en base a dos dominios variantes similares al EGF, los cuales difieren en sus extremos C-terminales. No obstante, estos dominios similares al EGF son idénticos en el espaciado de seis residuos cisteína contenidos en ellos. En base a una comparación de las secuencias de aminoácidos, Holmes et al., hallaron que, entre las cisteínas primera y sexta de los dominios similares al EGF, las HRG eran similares en un 45% al factor de crecimiento similar al EGF unidor de heparina (HB-EGF), idénticas en un 35% a la amfiregulina (AR), idénticas en un 32% al TGF-\alpha, e idénticas en un 27% al EGF.

El factor de diferenciación neu de 44 kDa (NDF), el cual es el equivalente en rata a la HRG humana, fue descrito por primera vez por Peles et al., Cell, 69:205-216 (1992); y Wen et al., Cell, 69:559-572 (1992). Al igual que los polipéptidos de HRG, el NDF tiene un dominio de homología con inmunoglobulinas (Ig) seguido por un dominio similar al EGF, y carece de un péptido señal N-terminal. Posteriormente, Wen et al., Mol. Cell. Biol., 14(3):1909-1919 (1994) llevaron a cabo experimentos de clonación para extender la familia de NDF. Este trabajo reveló seis pro-NDF fibroblásticos distintos. Adoptando la nomenclatura de Holmes et al., los NDF se clasificaron como polipéptidos \alpha o \beta en base a las secuencias de los dominios similares al EGF. Las isoformas 1 a 4 se caracterizan en base a la región entre el domino similar al EGF y el dominio transmembrana. También se han descrito las isoformas a, b y c, las cuales tienen dominios citoplasmáticos de longitud variable. Estos investigadores concluyen que se generan diferentes isoformas de NDF mediante ayustes alternativos, y que realizan distintas funciones específicas de tejidos. Ver también EP-505.148; WO-93/22424; y WO-94/28133 en relación al NDF.

Falls et al., Cell, 72:801-815 (1993) describen otro miembro de la familia heregulina, el cual denominan polipéptido inductor de la actividad del receptor de acetilcolina (ARIA). El polipéptido ARIA derivado del pollo estimula la síntesis de receptores de acetilcolina del músculo. Ver también WO-94/08007. ARIA es una heregulina del tipo \beta y carece de toda la región espaciadora rica en sitios de glicosilación que hay entre el dominio similar a Ig y el dominio similar a EGF de la HRG\alpha, y las HRG\beta1-\beta3.

Marchionni et al., identificaron varias proteínas derivadas de bovino, las cuales denominaron factores de crecimiento glial (GGF) (Marchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993)). Estas GGF comparten el dominio similar a Ig y el dominio similar a EGF con las otras proteínas heregulinas descritas más arriba, pero también tienen un dominio kringle amino terminal. Los GGF generalmente no tienen toda la región espaciadora glicosilada entre el dominio similar a Ig y el dominio similar a EGF. Sólo uno de los GGF, GGFII, posee un péptido señal N-terminal. Ver también, WO-92/18627; WO-94/00140; WO-94/04560; WO-94/26298; y WO-95/32724, las cuales se refieren a los GGF y a los usos de los mismos.

Ho et al., en J. Biol. Chem., 270(4):14523-14532 (1995) describen otro miembro de la familia heregulina denominado factor derivado de neuronas sensoriales y motoras (SMDF). Esta proteína tiene un dominio similar al EGF característico de todo los otros polipéptidos de heregulina, pero un dominio N-terminal distinto. La principal diferencia estructural entre el SMDF y los otros polipéptidos de heregulina es la ausencia en SMDF de el dominio parecido a Ig y del espaciador "glico" característicos de todos los otros polipéptidos de heregulina. Otra característica del SMDF es la presencia de dos tramos de aminoácidos hidrofóbicos cerca del extremo N-terminal.

Aunque los polipéptidos de heregulina se identificaron primero por su capacidad para activar el receptor HER2 (ver Holmes et al., supra), se descubrió que ciertas células ováricas que expresaban neu y fibroblastos transfectados con neu no se unían ni entrecruzaban con el NDF, ni respondían al NDF para experimentar la fosforilación de la tirosina (Peles et al., EMBO J., 12:961-971 (1993)). Esto indica que era necesario otro componente celular para conferir una respuesta completa a la heregulina. Posteriormente, Carraway et al. demostraron que ^{125}I-rHRG\beta1_{177-244} se unía a los fibroblastos NIH-3T3 transfectados establemente con erbB3 ovino, pero no a las células progenitoras transfectadas. En consecuencia, concluyeron que el ErbB3 es un receptor para las HRG, y que media la fosforilación de los residuos tirosina intrínsecos, así como la fosforilación del receptor ErbB2 en células que expresan ambos receptores. Caraway et al., J. Biol. Chem., 269(19):14303-14306 (1994). Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665 (1994) hallaron que las células transfectadas con HER3 solo muestran bajas afinidades por las heregulina, mientras que las células transfectadas con ambas HER2 y HER3 muestran afinidades más elevadas.

Esta observación se corresponde con la "interferencia de receptor" descrita previamente por Kokai et al., Cell, 58:287-292 (1989); Stem et al., EMBO J., 7:995-1001 (1988); y King et al., 4:13-18 (1989). Estos investigadores hallaron que la unión del EGF al EGFR resultaba en la activación del dominio quinasa del EGFR y la fosforilación cruzada del p185/HER2. Se cree que esto es un resultado de la heterodimerización del receptor inducida por un ligando y la concomitante polarización cruzada de los receptores en el heterodímero (Wada et al., Cell, 61:1339-1347 (1990)).

Plowman y sus colegas han estudiado de forma similar la activación de p185^{HER4}/p185^{HER2}. Expresaron p185^{HER2} solo, p185^{HER4} solo, o los dos receptores juntos en linfocitos T humanos, y demostraron que la heregulina es capaz de estimular la fosforilación de tirosina del p185^{HER4}, pero que sólo podía estimular la fosforilación del p185^{HER2} en células que expresaban ambos receptores. Plowman et al., Nature, 336:473-475 (1993). Por tanto, la heregulina es el único ejemplo conocido de un miembro de la familia del factor de crecimiento EGF que puede interactúa con varios receptores. Carraway y Cantley, Cell, 78:5-8 (1994).

El papel biológico de la heregulina ha sido investigado por varios grupos. Por ejemplo, Falls et al., (mencionada más arriba) hallaron que ARIA juega un papel en la diferenciación de los miotubos, a saber, que afecta la síntesis y concentración de receptores de neurotransmisor en la células musculares postsinápticas de las neuronas motoras. Corfas y Fischbach demostraron que ARIA también incrementa el número de canales de sodio en el músculo del pollo. Corfas y Fischbach, J. Neuroscience, 13 (5):2118-2125 (1993). Se ha observado también que GGFII es mitogénico para los mioblastos humanos quiescentes subconfluentes, y que la diferenciación de mioblastos humanos clónicos en presencia continuada de GGFII resulta en un mayor número de miotubos después de seis días de diferenciación (Sklar et al., J. Cell Biochem., Resumen W462, 18D, 540 (1994)). Ver también WO-94/26298, publicada el 4 de noviembre de 1994.

Holmes et al., supra, hallaron que la HRG ejercía un efecto mitogénico sobre líneas celulares mamarias (tales como SK-BR-3 y MCF-7). También se ha descrito la actividad mitogénica del GGF sobre las células de Schwann. Consultar, por ejemplo, Brockes et al., J. Biol. Chem., 255(18):8374-8377 (1980); Lemke y Brockes, J. Neurosci., 4:75-83 (1984); Brockes et al., J. Neuroscience, 4(1):75-83 (1984); Brockes et al., Ann. Neurol., 20(3):317-322 (1986); Brockes, J., Methods in Enzym., 147:217-225 (1987); y Marchionni et al., supra. Las células de Schwann son células gliales importantes que proporcionan la vaina de mielina alrededor de los axones de las neuronas, formando de ese modo fibras nerviosas individuales. Por tanto, es evidente que las células de Schwann juegan un papel importante en el desarrollo, función y regeneración de los nervios periféricos. Las implicaciones de este hecho desde un punto de vista terapéutico han sido tratadas por Levi et al., J. Neuroscience, 14(3):1309-1319 (1994). Levi et al., discuten el potencial para la construcción de una prótesis celular que comprenda células de Schwann humanas que podrían trasplantarse en áreas de la médula vertebral lesionada. Los procedimientos para cultivar células de Schwann ex vivo han sido descritos. Consultar WO-94/00140 y Li et al., J. Neuroscience, 16(6):2012-2019 (1996).

Pinkas-Kramarski et al. hallaron que el NDF parece expresarse en neuronas y células gliales en el cerebro de rata embrionario y adulto, y en cultivos primarios de células cerebrales de rata, y sugirieron que podría actuar como un factor de supervivencia y maduración para astrocitos (Pinkas-Kramarski et al., PNAS USA, 91:9387-9391 (1994)). Meyer y Birchmeier, PNAS USA, 91:1064-1068 (1994), analizaron la expresión de la heregulina durante la embriogénesis del ratón y en animales perinatales usando experimentos de hibridación in situ y protección de la ARNasa. Estos autores concluyeron que, en base a la expresión de esta molécula, la heregulina juega un papel in vivo como factor mesenquimal y neuronal. Sus hallazgos también implican que la heregulina funciona en el desarrollo de los epitelios. De forma similar, Danilenko et al., Resumn 3101, FASEB, 8(4-5):A535 (1994), hallaron que la interacción del NDF y del receptor HER2 es importante para dirigir la migración y diferenciación epidérmica durante la reparación de heridas.

Aunque inicialmente se propuso que la NRG era el ligando para el receptor tirosín quinasa ErbB2, estudios adicionales han demostrado que la activación del ErbB2 frecuentemente ocurría a resultas de la unión de la NRG 1 a los receptores ErbB3 (Sliwkowski, M.X., et al., J. Biol. Chem., 269:14661-14665 (1994)) o ErbB4 (Plowman, G.D. et al., Nature, 366:473-475 (1993); y Carraway, K.L. y Cantley, L.C., Cell, 78:5-8 (1994)). Estudios recientes han comenzado a destacar los papeles de la NRG 1, el receptor ErbB2 y el receptor ErbB4 en el desarrollo del corazón. Los ratones que carecen del receptor ErbB4, del receptor ErbB2, o de la NRG 1, mueren hacia la mitad de la embriogénesis (día embrionario 10,5) a causa del desarrollo abortado de la trabéculas miocárdicas en el ventrículo (Meyer & Birchmeier, Nature, 378:386-390 (1995); Gassmann et al., Nature, 378:390-394 (1995); y Lee et al., Nature, 378:394-398 (1995)). Estos resultados son consistentes con el punto de vista de que la NRG 1, expresada en el endocardio, es un ligando importante requerido para la activación de los receptores ErbB2 y ErbB4 en el miocardio.

Estos mismos estudios sugieren que la NRG 1 y el receptor ErbB2 podrían jugar un papel diferente que el receptor Erb8 en el desarrollo del romboencéfalo. La NRG 1 se expresa en el neuroepitelio y las células que proceden de los rombómeros 2, 4 y 6, mientras que el receptor ErbB4 se expresa en los rombómeros 3 y 5. Los ratones knockout de NRG1 y receptor ErbB2 presenta una pérdida de células y axones de los ganglios sensoriales craneales. Por contra, los ratones deficientes en receptor ErbB4 no presentan una pérdida de celularidad Más bien, la organización, espaciado y patrón de inervación de estos ganglios hacia y desde el sistema nervioso central está alterado. Una posible razón de esta diferencia en los fenotipos de romboencéfalo en ratones knockout sin NRG1 ni ErbB4, es que ligandos adicionales distintos de la NRG 1 podrían ser reconocidos por el ErbB4 en el SNC (Gassmann et al., supra).

Resumen de la invención

La presente invención se basa en la identificación, producción recombinante y caracterización de un nuevo miembro de la familia de las neuregulinas (NRG1). Más específicamente, la invención se refiere a un nuevo polipéptido, NRG3, que comprende un dominio similar al EGF, distinto de los dominios similares al EGF de las NRG1 y NRG2. Además, la NRG3 descrita en la presente invención muestra unas características de unión la receptor en relación a otros polipéptidos similares a la neuregulina.

Al analizar el motivo de la secuencia homóloga, se observó homología del dominio similar al EGF de la NRG1 en el subconjunto de aminoácidos que están conservados en la mayoría de las neuregulinas. En base a esta observación, y a las características de unión del receptor ErbB4 observadas, la nueva proteína, NRG3, se ha identificado como un nuevo miembro de la familia de las neuregulinas. La nueva proteína contiene dominios que están poco relacionados con, pero son distintos de, los hallados en los otros miembros de la familia NRG 1. Además, se expresa ante todo en tejidos embrionarios y adultos del sistema nervioso central. La NRG3 representa un nuevo miembro de la familia de compuestos neuregulina, algunos miembros de la cual están implicados en la proliferación y diferenciación celular, en el desarrollo epitelial, el desarrollo cardíaco, el desarrollo neurológico, a la vez que actúan como mitógenos de células gliales, y como factores mesenquimales y neuronales.

En un aspecto, la presente invención se refiere a un nuevo polipéptido NRG3, aislado de mamífero, que tiene un dominio similar al EGF, tal como se define en la reivindicación 1, y a derivados funcionales del nuevo NRG3, los cuales polipéptidos que se unen al receptor ErbB4. Los polipéptidos nativos dentro del ámbito de la presente invención se caracterizan por contener un dominio extracelular que incluye un dominio similar al EGF, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático. La presente invención incluye específicamente las formas solubles de las nuevas moléculas del ligando NRG3 de la invención, las cuales tienen un dominio transmembrana que no puede asociarse con una membrana celular, y carecen opcionalmente de la totalidad o parte del dominio citoplasmático. Por "dominio transmembrana" se quiere indicar un dominio del polipéptido que contiene un número suficiente de aminoácidos hidrofóbicos para permitir que el polipéptido se inserte y ancle en una membrana de célula. Por "dominio transmembrana que no puede asociarse con una membrana celular" se quiere indicar un dominio transmembrana que ha sido alterado por mutación o supresión, de tal forma que es insuficientemente hidrofóbico para permitir la inserción u otra asociación con una membrana celular. Semejante dominio transmembrana no excluye, por ejemplo, la fusión de la NRG3 de la invención, o un fragmento de la misma, con una secuencia de señal de secreción útil para la secreción del polipéptido a partir de la célula, cuando un número insuficiente de aminoácidos con cadenas laterales hidrofóbicas están presentes desprovistas de un dominio transmembrana activo no se inserta en una membrana celular. Las mutaciones o alteraciones de la secuencia de aminoácidos útiles para conseguir un dominio transmembrana inactivo incluyen, pero no se limitan a, la supresión o sustitución de aminoácidos dentro del dominio transmembrana.

En particular, la invención se refiere a polipéptidos aislados, preferiblemente ligandos NRG3, seleccionados de entre el grupo consistente en:

(1)

un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75% de identidad de secuencia con el dominio extracelular de la NRG3 de ratón o humana mostrada en la Figura 3 (SEC. Nº ID.: 3 o SEC. Nº ID.: 7, respectivamente); y

(2)

un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75% de identidad de secuencia con el polipéptido NRG3 de ratón o humana nativo mostrado en la Figura 3 (SEC. Nº ID.: 2 y SEC. Nº ID.:6, respectivamente), o con la SEC. Nº ID.: 23.

Aunque los polipéptidos NRG3 nativos de la presente invención son glicoproteínas, la presente invención también abarca moléculas variantes no acompañadas por la glicosilación nativa, o que tienen un patrón de glicosilación variante. Preferiblemente, el dominio similar al EGF del polipéptido NRG3 no está glicosilado.

En una realización adicional, la invención incluye un anticuerpo antagonista de una nueva NRG3 de la presente invención. El antagonista de la invención puede ser un péptido que une una NRG3, tal como un anticuerpo anti-NRG3 o un fragmento unidor del mismo. Preferiblemente, el antagonista del NRG3 de la invención reduce sustancialmente la unión de un ligando natural del receptor ErbB4, tal como una NRG3, al receptor ErbB4, impidiendo o limitando de ese modo la activación del receptor. En una realización preferida, el antagonista reduce la unión de la NRG3 a su receptor a menos del 50%, preferiblemente menos del 20%, más preferiblemente menos del 10% de la unión de una NRG3 en condiciones similares.

En aún otra realización, la invención incluye un anticuerpo agonista de una nueva NRG3 de la presente invención. El agonista de la invención puede ser una NRG3, o puede ser un anticuerpo anti-receptor de la NRG3, o un fragmento unidor al receptor. Una NRG3 agonista de la invención puede ser también un polipéptido codificado por una forma de ayuste alternativa del gen nativo que codifica la NRG3, comprendiendo preferiblemente el dominio similar al EGF de la NRG3 descrito en la presente invención. En una realización del agonista de la invención, el agonista de la NRG3 es un anticuerpo anti-receptor ErbB4, anticuerpo que se une y activa el receptor ErbB4. Preferiblemente, la afinidad de unión del agonista es al menos el 25% de la afinidad del ligando nativo, más preferiblemente al menos el 50%, y lo más preferiblemente al menos el 90% de la afinidad del ligando nativo. De forma similar, se prefiere que el agonista de la invención active el receptor ErbB4 al nivel de al menos el 25%, más preferiblemente al menos el 50%, lo más preferiblemente al menos al 90% de la activación de la NRG3 nativa.

La invención se refiere además a una molécula de ácido nucleico que codifica una nueva NRG3 de la presente invención, a vectores que contienen tal ácido nucleico, y a células huéspedes transformadas con los vectores. El ácido nucleico preferiblemente codifica al menos el dominio similar al EGF de una NRG3 específica del receptor ErbB4, nativa o variante, específica de la presente invención. La invención incluye además ácidos nucleicos que se hibridan en condiciones de elevada rigurosidad con el complemento de un ácido nucleico que codifica una NRG3 específica del receptor ErbB4, nativa, de la presente invención, y codifican una proteína que retiene las propiedades cualitativas de unión específica al receptor ErbB4 de la NRG3 nativa descrita en la presente invención. Además, la invención incluye un ácido nucleico depositado en la American Type Culture Collection como ATCC 209156 (pLXSN.mNRG3), ácido nucleico que es un vector de expresión que comprende el ácido nucleico que codifica el marco de lectura abierta de la NRG3 de ratón (SEC. Nº ID.: 1). La invención incluye también un ácido nucleico depositado en la American Type Culture Collection como ATCC 209157 (pRKS.tk.neo.hNRG3B1), ácido nucleico que es un vector de expresión que comprende el ácido nucleico que codifica un ácido nucleico de la NRG3 humana (SEC. Nº ID.: 5). La invención incluye también un ácido nucleico depositado en la American Type Culture Collection como ATCC 209297 (pRK5.tk.neo.hNRG3B2), ácido nucleico que es un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica una forma ayustada alternativamente del ácido nucleico de la NRG3 humana (SEC. Nº ID.: 22) y que carece de los ácidos nucleicos 1585 a 1656 de la SEC. Nº ID.:5. La secuencia de aminoácidos deducida de la NRG3B2 humana alternativamente ayustada se halla en la SEC. Nº ID.:23, la cual carece de los aminoácidos 529 a 552 de la SEC. Nº ID.:6. En la Figura 4B se muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos hNRG3B 1 y hNRG3B2. La invención incluye además las secuencias de aminoácidos de la NRG3 de ratón y de la NRG3 humana, formas ayustadas alternativamente o fragmentos de las mismas, codificadas por los vectores de expresión
depositados.

En otro aspecto, la invención se refiere a un proceso para producir una NRG3 de la invención, proceso que compre transformar una célula huésped con un ácido nucleico que codifica la NRG3 deseada, cultivar la célula huésped transformada, y recuperar la NRG3 producida a partir de la célula huésped o del cultivo de la célula huésped.

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Como una alternativa a la producción de la NRG3 en una célula huésped transformada, la invención proporciona un procedimiento para producir la NRG3, el cual comprende: (a) transformar una célula que contiene un gen de NRG3 endógeno con un ADN homólogo que comprende un gen amplificable y una secuencia flanqueadora, de al menos aproximadamente 150 pares de bases, que es homóloga con una secuencia de ADN dentro o en la proximidad del gen NRG3 endógeno, en donde el ADN homólogo se integra en el genoma de la célula mediante recombinación; (b) cultivar la célula en condiciones que seleccionan para la amplificación del gen amplificable, en donde el gen NRG3 también se amplifica; y a continuación (c) recuperar la NRG3 a partir de la célula.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a la NRG3 de la presente invención, y a una línea celular de hibridoma que produce tal anticuerpo.

En aún otro aspecto, la invención concierne a una inmunoadhesina que comprende una secuencia nueva NRG3, tal como se describe en la presente invención, fusionada a una secuencia de inmunoglobulina. La secuencia de la NRG3 es preferiblemente una forma con el dominio transmembrana suprimido de un polipéptido nativo o variante fusionado a una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina, y comprende al menos el dominio similar al EGF del dominio extracelular de una NRG3 nativa de la presente invención. En otra realización preferida, la secuencia de NRG3 presente en la inmunoadhesina muestra el menos aproximadamente un 80% de homología de secuencia con el dominio extracelular de la secuencia mostrada en la SEC. Nº ID.:3 o SEC. Nº ID.:7 respectivamente para la NRG3 de ratón o humana. La secuencia de dominio constante de inmunoglobulina preferiblemente es la de una molécula IgG-1, IgG-2 o IgG-3, pero puede ser también una molécula IgA o IgM.

La invención se refiere además a composiciones farmacéuticas que comprenden una NRG3 como se ha definido más arriba en mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable. Las dosis y la administración de la NRG3 en una composición farmacéutica pueden ser determinadas por alguien con la formación ordinaria en el campo de la farmacología clínica o de la farmacocinética (consultar, por ejemplo, Mordenti, J. y Rescigno, A., Pharmaceutical Research, 9:17-25 (1992); Morenti, J. et al., Pharmaceutical Research, 8:1351-1359 (1991); y Mordenti, J. y Chappell, W., "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" en Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., (eds), Pergamon Press, NY, pp. 42-96, (1989), cada una de las referencias se incorpora en la presente invención por referencia en su totalidad.

En un aspecto adicional de la invención, el ácido nucleico aislado que codifica la NRG3 de la invención, o fragmento de la misma, puede usarse también para la terapia génica in vivo o ex vivo.

En una realización de la invención, una secuencia de ácido nucleico que codifica una NRG3, o fragmento o variante de la misma, se introduce en una célula de un animal como parte de un casete de expresión, de tal forma que la secuencia de ácido nucleico que codifica la NRG3 se expresa en la célula. Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico que codifica la NRG3 comprende secuencias (tales como una secuencia promotora) para el control de la expresión de la NRG3 en la célula. Preferiblemente, el casete de expresión comprende un vector retroviral para la administración de la secuencia de ácido nucleico a una célula del animal.

En una realización adicional, la presente invención proporciona el uso médico de una célula huésped que expresa una NRG3 o agonista de la NRG3, para la introducción en un animal, preferiblemente un humano, de tal forma que la NRG3 o el agonista de la NRG3 producidas por la célula huésped son efectivas para tratar un trastorno que responde a la administración local o sistémica incrementada de la NRG3. Las células genéticamente manipuladas para expresar una NRG3, fragmento o variante de la misma, pueden implantarse en el huésped para proporcionar niveles efectivos de factor o factores. Las células pueden prepararse, encapsularse e implantarse tal y como se detalla en las Patentes Estadounidenses 4.892.538, y 5.011.472, WO-92/19195, WO-95/05452, o Aebischer et al., Nature Medicine, 2:696-699 (1996).

Un aspecto de la invención se refiere al uso médico de una célula que codifica una NRG3 o fragmento de la misma, o agonista o antagonista de la NRG3, para tratar un trastorno, célula que secreta la NRG3 de la invención.

Una realización de la invención es un uso médico para prevenir o tratar la lesión a un nervio o la lesión de otras células que expresan la NRG3 o responden a la NRG3, por ejemplo, las células cerebrales, cardíacas o renales, uso que comprende implantar células que secretan la NRG3, o un fragmento o agonista de la misma, o antagonistas, como pudiera ser preciso para la condición concreta.

Una realización adicional de la invención incluye un dispositivo de implantación, para prevenir o tratar la lesión nerviosa o la lesión de otras células tal y como se enseña en la presente invención, que contiene una membrana semipermeable y una célula que secreta la NRG3, o fragmento o agonista de la misma, (o antagonistas, como pudiera ser preciso para la condición concreta) encapsulada dentro de la membrana, siendo la membrana permeable a la NRG3, o fragmento agonista de la misma, e impermeable a factores del paciente perjudiciales para las células. Las propias células del paciente, transformadas para producir la NRG3 ex vivo, pueden implantarse en el paciente, opcionalmente sin tal encapsulación. La metodología para la encapsulado en membrana de células vivas es familiar aquéllos con formación ordinaria en la técnica, y la preparación de las células encapsuladas y su implantación en paciente puede conseguirse fácilmente tal y como se conoce en el estado de la técnica.

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De acuerdo con los procedimientos in vitro de la invención, las células que comprenden el receptor ErbB4 se colocan en un medio de cultivo de células. Los ejemplos de células que contienen el receptor ErbB4 incluyen las células neurales, por ejemplo, células del cerebro (tales como neuronas del neurocórtex, cerebelo e hipocampo); células cardíacas; células musculares esqueléticas y lisas; y células cultivadas transformadas con una NRG3 recom-
binante.

Los medios de cultivo de tejidos apropiados con bien conocidos por las personas formadas en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a, el Medio Mínimo Esencial (MEM), el RPMI-1640, y el Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM). Estos medios de cultivo de tejidos están disponibles comercialmente en Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) y GIBCO (Grand Island, NY). Las células se cultivan a continuación en el medio de cultivo de tejidos en condiciones suficientes para que las células permanezcan viables y crezcan en presencia de una cantidad efectiva de NRG3. Las células pueden cultivarse de una variedad de formas, incluyendo cultivarlas en un coágulo, agar, o en cultivo líquido.

Las células se cultivan a una temperatura fisiológicamente aceptable, tal como 37ºC, por ejemplo, y en presencia de una cantidad efectiva de NRG3, fragmento o variante. La cantidad de NRG3 puede variar, pero preferiblemente está en el rango de aproximadamente 0,1 ng/ml hasta aproximadamente 1 mg/ml, preferiblemente de aproximadamente 0,1 ng/ml hasta aproximadamente 0,1 ng/ml. La NRG3 puede, por supuesto, añadirse al cultivo, en una dosis determinada empíricamente por los especialistas en la técnica sin excesiva experimentación. La concentración de la NRG3 en el cultivo dependerá de varios factores, tales como las condiciones bajo las cuales se cultivan las células y la NRG3. La temperatura específica y la duración de la incubación, así como otras condiciones de cultivo, pueden variarse dependiendo de tales factores como, por ejemplo, la concentración de la NRG3, y el tipo de células y medio. Los especialistas en el campo serán capaces de determinar las condiciones de cultivo operativas y óptimas sin excesiva experimentación. La proliferación, diferenciación y/o supervivencia de las células (por ejemplo, neuronas) en los cultivos puede determinarse mediante varios ensayos conocidos en la técnica, tales como los descritos más arriba.

Se contempla que el uso de la NRG3 para potenciar la supervicencia, crecimiento y/o diferenciación de las células in vitro puede ser útil en una variedad de formas. Por ejemplo, las células neurales cultivadas in vitro en presencia de la NRG3 pueden infundirse en un mamífero que padece de niveles reducidos de las células. Los cultivos in vitro estables pueden usarse también para aislar factores específicos de las células y para la expresión de proteínas endógenas o introducidas de forma recombinante en la célula. La NRG3, los fragmentos o variantes de la misma, pueden usarse también parar potenciar la supervivencia, proliferación y/o diferenciación celular de células que respaldan el crecimiento y/o diferenciación de otras células en cultivo celular.

La invención también proporciona usos in vivo para la NRG3. En base al patrón de expresión de la NRG3 en la célula neuronal, se cree que esta molécula será particularmente útil para tratar enfermedades que implican el crecimiento de las células neurales, tales como las desmielinación, o la lesión o pérdida de células gliales (por ejemplo, la esclerosis múltiple).

La invención proporciona además usos médicos que emplean una cantidad terapéuticamente efectiva de la NRG3, fragmento de la NRG3, o agonista de la NRG3, para su administración a un mamífero. Por ejemplo, el mamífero puede estar padeciendo un trastorno neurológico o muscular. Cuando el trastorno es un trastorno neurológico, se cree que la NRG3 es útil para promover el desarrollo, mantenimiento, y/o regeneración de neuronas in vivo, incluyendo la centrales (cerebro y médula espinal), periféricas (simpáticas, parasimpáticas, sensoriales y entéricas), y las motoneuronas. En consecuencia, la NRG3 puede utilizarse en procedimientos para el diagnóstico y/o tratamiento de una variedad de enfermedades o trastornos neurológicos que afectar el sistema nervioso de un mamífero, tal como un humano.

Tales enfermedades o trastornos pueden surgir en un paciente en el que el sistema nervioso ha sido dañado por, por ejemplo, trauma, cirugía, embolia, isquemia, infección, trastorno metabólico, deficiencia nutricional, cáncer, o agentes tóxicos. El agente se diseña para promover la supervivencia o crecimiento de las neuronas. Por ejemplo, la NRG3 puede usarse para promover la supervivencia o crecimiento de motoneuronas que están lesionadas por trauma o cirugía. La NRG3 puede usarse también para tratar trastornos motoneuronales, tales como la esclerosis lateral amiotrófica (enfermedad de Lou Gehrig), la parálisis de Bell, y diversas condiciones que implican la atrofia muscular espinal, o parálisis. La NRG3 puede usarse para tratar "trastornos neurodegenerativos" humanos, tales como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la epilepsia, la esclerosis múltiple, la corea de Huntington, el síndrome de Down, la sordera nerviosa, y la enfermedad de Meniere.

Además, la NRG3 puede usarse para tratar las neuropatía, y especialmente la neuropatía periférica. "Neuropatía periférica" se refiere a un trastorno que afecta el sistema nervioso periférico, la mayoría de las veces se manifiesta como una, o una combinación de disfunción neural motora, sensorial, sensorimotora, o autonómica. La amplia variedad de morfología exhibidas por las neuropatías periféricas pueden atribuirse cada una, de forma singular, a un número de causas igualmente amplio. Por ejemplo, las neuropatías periféricas pueden adquirirse genéticamente, pueden resultar de una enfermedad sistémica, o pueden ser inducidas por un agente tóxico. Los ejemplos incluyen pero no se limitan a la neuropatía sensorimotora distal, o a las neuropatías autonómicas tales como la movilidad reducida del tracto gastrointestinal o la atonía de la vegija urinaria. Los ejemplos de neuropatías asociadas con enfermedades sistémicas incluyen el síndrome post-polio; los ejemplos de neuropatías hereditarias incluyen la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, la enfermedad de Refsum, la abetalipoproteinemia, la enfermedad de Tangier, la enfermedad de Krabbe, la leucodistrofia metacromática, la enfermedad de Fabry, y el síndrome de Dejerine-Sottas; y los ejemplos de neuropatías causadas por un agente tóxico incluyen aquéllas causada por el tratamiento con un agente quimioterapéutico tal como la vincristina, el cisplatino, el metotrexato, o la 3'-azido-3'-desoxitimidina.

La invención proporciona además el uso médico de una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de la NRG3 para su administración a un mamífero. El mamífero es, en este último caso, uno que puede beneficiarse de una reducción en los niveles/actividad biológica de la NRG3.

Estos y otros objetivos, ventajas y características de la presente invención se harán evidentes a las personas especialistas en la técnica a partir de la lectura de los detalles de la estructura, síntesis y uso, tal como se establecen más detalladamente a continuación.

Descripción resumida de las figuras

La Figura 1 muestra la secuencia codificante de ácido nucleico del ADNc de la NRG3 de ratón (mNRG3, SEC. Nº ID.:1), en la cual se indican los codones de inicio (ATG) y para (TGA) de la secuencia codificante subrayándolos.

La Figura 2 muestra la secuencia codificante de ácido nucleico del ADNc de la NRG3 humana (hNRG3B, SEC. Nº ID.:5), en la cual se indican los codones de inicio (ATG) y para (TGA) de la secuencia codificante subrayándolos.

La Figura 3 muestra la secuencia codificante de ácido nucleico de una forma alternativamente ayustada del ADNc de la NRG3 humana (hNRG3B2, SEC. Nº ID.:22), en la cual se indican los codones de inicio (ATG) y para (TGA) de la secuencia codificante subrayándolos.

Figuras 4A-4B. La Figura 4A muestra las secuencias de aminoácidos deducidas de los ADNc de ratón (mNRG3) y humano (hNRG3B1) tal como se muestran en las Figuras 1 y 2. La secuencia de aminoácidos deducida de la NRG3 de ratón está representada por la SEC. Nº ID.:2, y la secuencia de aminoácidos deducida de la NRG3B1 humana está representada por la SEC. Nº ID.:6. Se muestran varios dominios putativos en las secuencias de aminoácidos. Se destacan el domino similar al EGF, el segmento hidrofóbico N-terminal (doble subrayado), la porción rica en serina/treonina, y un dominio transmembrana predicho (subrayado simple). La Figura 4B muestra las secuencias de aminoácidos deducidas de los ADNc de hNRG3B1 y hNRG3B2 tal como se muestran en las Figuras 2 y 3. La secuencia de aminoácidos deducida de la NRG3B1 humana está representada por la SEC. Nº ID.:6, y la secuencia de aminoácidos deducida de la NRG3B2 humana está representada por la SEC. Nº ID.:23. La región de la secuencia de aminoácidos de la NRG3 que difiere entre las dos secuencias humanas está ilustrada.

La Figura 5A muestra un alineamiento de secuencias de los dominios similares al EGF de la NRG3B1 humana (hNRG3.egf: SEC. Nº ID.:4); la ARIA del pollo (cARIA.egf: SEC. Nº ID.:9); la amfiregulina humana (hAR.egf: SEC. Nº ID.: 10); la betacelulina humana (hBTC.egf: SEC. Nº ID.:11); el EGF humano (hEGF.egf; SEC. Nº ID.:12); el factor de crecimiento similar al EGF unidor de heparina humano (hHB-EGF.egf; SEC. Nº ID.:13); la heregulina-\alpha humana (hHRG\alpha; SEC. Nº ID.: 14): la heregulina-\beta humana (hHRG\beta.egf; SEC. Nº ID.: 15); el TGF-\alpha humano (hTGF\alpha.egf; SEC. Nº ID.: 16); y la epiregulina del ratón (mEPR.egf: SEC. Nº ID.:17). Las secuencias se analizaron usando "Sequence Analysis Programs", Genentech, Inc.

Las Figuras 6A-6H son gráficas FACS demostrando la unión de la NRG3^{EGF}.Fc al receptor ErbB4 expresado sobre la superficie de las células. En las Figura 6A-6D, las células K562 progenitoras (Figura 6A), o las células K562 que expresaban el receptor ErbB2 (células K562^{erbB2}; Figura 6B), el receptor ErbB3 (células K562^{erbB3}; Figura 6C), o el receptor ErbB4 (células K562^{erbB4}; Figura 6D) se examinaron en busca de la expresión de los correspondientes receptores. Las células se incubaron con anticuerpos anti-receptor ErbB2, anti-receptor ErbB3, o anti-receptor ErbB4 según se indica, antes de añadir el anticuerpo secundario conjugado a PE. "Log PE" representa la intensidad fluorescente relativa y "Recuentos" representa el número de células. En las Figuras 6E-6H, se muestra mediante análisis FACS que la NRG3^{EGF}.Fc se une a las células que expresan el receptor ErbB4. Las células K562 progenitoras (Figura 6E), las células K562 erbB2 (Figura 6F), las células K562^{erbB3} (Figura 6G), y las células K562^{erbB4} (Figura 6H) se incubaron con o sin la NRG3^{EGF} Fc (conteniendo la etiqueta gD) durante 1 hora, seguida por el anticuerpo primario anti-gD-tag y anticuerpo secundario conjugado con PE.

La Figura 7 es un análisis gráfico que muestra la inhibición competitiva de la unión de la ^{125}I-NRG3^{EGF}.Fc, al receptor ErbB4 soluble inmovilizado, por parte del NRG3^{EGF}.Fc o NRG^{EGF}. El receptor ErbB4 soluble se inmovilizó sobre placas de 96 pocillos, y se incubó con varias concentraciones de NRG3^{EGF}.Fc o NRG^{EGF} sin marcar, y una cantidad constante de NRG3EGF.Fc marcada con ^{125}I, durante 1,5 horas a temperatura ambiente. La fracción de radiactividad unida respecto la entrada total de ^{125}I-NRG3^{EGF} .Fc se representa frente a la concentración de competidor. Se muestran los datos de un experimento representativo de cuatro ensayos independientes. Las barras de error indican la desviación estándar de las muestras por cuadruplicando.

Antes de describir los presentes polipéptidos, ácidos nucleicos, vectores, y células huéspedes, y los procesos para prepararlos, debe entenderse que esta invención no se limita a las composiciones de material y procesos concretos descritos, puesto que tales compuestos y procedimientos pueden, por supuesto, variar. Debe entenderse también que la terminología usada en la presente invención tiene el propósito de describir solamente realizaciones particulares, y que no se pretende que sea limitante, puesto que el ámbito de la presente invención estará limitado solamente por las reivindicaciones anexas.

Descripción de las realizaciones Definiciones

Las frases "nuevo ligando relacionado con la neuregulina", "nueva NRG3!", "nueva NRG3 específica del receptor ErbB4" se usan de forma intercambiable y se refieren a un nuevo miembro de la familia de las neuregulinas, dicha NRG3 se expresa específicamente en el cerebro y sistema nervioso del embrión y adultos, y a derivados funcionales de tales polipéptidos nativos.

El término "NRG3" o "ligando relacionado con la neuregulina" se define en la presente invención como cualquier secuencia polipeptídica que posee al menos una propiedad biológica (tal y como se ha definido más arriba) de la NRG3 de secuencia de aminoácidos nativa de la SEC. Nº ID.:2 o 6 (respectivamente, de ratón o humana), y adicionalmente incluye una forma alternativamente ayustada de la NRG3 humana que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. Nº ID.:23. Esta definición abarca no sólo el polipéptido aislado de una fuente de NRG3 nativa, tal como las células MDA-MB-175 humanas, o de otra fuente, tal como otra especie animal o formas alternativamente plegadas de la NRG3, sino también al polipéptido preparado mediante procedimientos recombinantes o sintéticos. Incluye también las formas variantes, incluyendo los derivados funcionales, las variantes alélicas, las isoformas que ocurren de forma natural, y los análogos de las mismas. A veces, la NRG3 es la "NRG3 nativa", la cual se refiere al polipéptido NRG3 endógeno que se ha aislado de un mamífero. La NRG3 puede ser también la "NRG3 de secuencia nativa" en la medida en que tiene la misma secuencia de aminoácidos que una NRG3 nativa (por ejemplo, las NRG3 de ratón (SEC. Nº ID.:2) o humana (SEC. Nº ID.:6 o SEC. Nº ID.:23) mostradas en las Figuras 4A y 4B). No obstante, la "NRG3 de secuencia nativa" abarca el polipéptido producido mediante medios recombinantes o sintéticos. "NRG3 madura" una la NRG3 soluble o secretada, liberada de las células (es decir, que carece de una secuencia hidrofóbica N-terminal). En este contexto, la NRG3 se refiere a nuevas NRG3 que comprenden un dominio parecido al EGF dentro de un dominio extracelular, un dominio transmembrana, y un dominio citoplasmático, con o sin una secuencia señal nativa, y formas solubles que ocurren de forma natural de tales NRG3, con o sin la metionina iniciadora, se halla purificado a partir de una fuente nativa, sintetizado, producido mediante tecnología del ADN recombinante, o mediante cualquier combinación de estos y/u otros procedimientos. Las NRG3 nativas de la presente invención incluyen específicamente la NRG3 múrida, cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la Figura 4 (SEC. Nº ID.:2), y las NRG3 humanas que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en la Figura 4 (SEC. Nº ID.:6 o SEC. Nº ID.:23), y los fragmentos u homólogos de mamífero, o las formas alternativamente ayustadas de estos ligandos nativos. Las nuevas NRG3 múridas y humanas nativas de la presente invención tienen respectivamente aproximadamente 713 y 320 aminoácidos de longitud, y comprenden un dominio parecido al EGF, el segmento hidrofóbico N-terminal, la porción rica en serina/treonina, un dominio transmembrana predicho, y un dominio intracelular predicho. Los límites de estos dominios se indican en la Figura 4 para las secuencias de las nuevas NRG3 múrida y humana.

Opcionalmente, la NRG3 no está asociada con la glicosilación nativa. "Glicosilación nativa" se refiere a los grupos carbohidratos que están unidos covalentemente a la NRG3 nativa cuando ésta se produce en la célula de mamífero a partir de la cual se deriva la NRG3 nativa. En consecuencia, la NRG3 humana producida en un no-humano puede describirse como no asociada con la glicosilación nativa, por ejemplo, puede estar glicosilada de forma distinta a la glicosilación nativa. A veces, la NRG3 no está asociada con ninguna glicosilación en modo alguno (por ejemplo, a resultas de ser producida de forma recombinante en un procariota).

El término "dominio parecido al EGF" se refiere a un dominio extracelular parecido al factor de crecimiento epidérmico (EGF), preferiblemente un polipéptido de NRG3 de la invención. El dominio parecido al EGF es suficiente para unirse a los receptores de neuregulina y estimular las respuestas celulares (Holmes, W.E., et al., Science, 256:1205-1210 (1992)). Preferiblemente, un dominio parecido al EGF de la NRG3 de la invención tiene la secuencia de aminoácidos de las NRG3 mostradas en la SEC. Nº ID.:4 (dominio parecido al EGF de las NRG3 de ratón o humana), en donde el dominio parecido al EGF va desde aproximadamente el aminoácido 284 hasta aproximadamente el aminoácido 332 de la NRG3 humana, y desde aproximadamente el aminoácido 286 hasta aproximadamente el aminoácido 334 de la NRG3 de ratón. La NRG3 de la invención abarca un polipéptido codificado por una forma alternativamente ayustada del gen que codifica la NRG3, cuya forma alternativamente ayustada comprende el dominio parecido al EGF de la NRG3.

El término "ErbB", cuando se usa en la presente invención, se refiere a uno cualquiera o más de los receptores ErbB de mamífero (es decir, el ErbB1 o receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF); el ErbB2 o receptor de la HER2; el ErbB3 o receptor de la HER3; el ErbB4 o receptor de la HER4; y cualquier otro miembro(s) de esta familia tirosín quinasa Clase I que se identifique en el futuro), y "erbB" se refiere a los genes erbB de mamífero que codifican estos receptores.

Los términos "forma soluble", "receptor soluble", "NRG3 soluble", "NRG3 soluble", y variantes gramaticales de los mismos, se refieren a variantes de las NRG3 nativas o variantes de la presente invención, las cuales carecen de un dominio transmembrana funcional. En los receptores solubles, el dominio transmembrana puede estar suprimido, truncado, o inactivado de otro modo, de tal forma que no son capaces de anclarse en la membrana celular. Si se desea, tales formas solubles de las NRG3 de la presente invención puede tener adicionalmente sus dominios citoplasmáticos completa o parcialmente suprimidos o inactivados de otro modo.

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Un "derivado funcional" de un polipéptido es un compuesto que tiene una actividad biológica cualitativa en común con el polipéptido nativo. Por tanto, un derivado funcional de una nueva NRG3 nativa de la presente invención es un compuesto que tiene una actividad biológica cualitativa en común con dicha NRG3 nativa. Los "derivados funcionales" incluyen, pero no se limitan a, los fragmentos de polipéptidos nativos procedentes de cualquier especie animal (incluyendo los humanos), los derivados de polipéptidos nativos (humanos y no humanos) y sus fragmentos, y los análogos peptídicos y no peptídicos de polipéptidos nativos, a condición de que tengan una actividad biológica en común con un respectivo polipéptido nativo.

Tal y como se usa en la presente invención, el término "fragmentos" se refiere a regiones dentro de la secuencia de un polipéptido nativo maduro. Preferiblemente, los fragmentos de la NRG3 tendrán una secuencia consecutiva de al menos 20, y más preferiblemente al menos 50 residuos aminoácidos del dominio parecido al EGF de la NRG3. Los fragmentos preferidos tienen aproximadamente 30-150 aminoácidos que son idénticos a una porción de la secuencia de la NRG3 en la SEC. Nº ID.:2 (de ratón), o en las SEC. Nº ID.:6 o SEC. Nº ID.:23 (humana). El término "derivado" se usa para definir las variantes de secuencia de aminoácido y de glicosilación, y las modificaciones covalente de un polipéptido nativo. Los "análogos no peptídicos" son compuestos orgánicos que exhiben sustancialmente la misma superficie que los análogos peptídicos de polipéptidos nativos. Por tanto, los análogos no peptídicos de las nuevas NRG3 nativas de las presente invención son compuestos orgánicos que exhiben sustancialmente la misma superficie que los análogos peptídicos de las NRG3 nativas. Tales compuestos interaccionan con otras moléculas de una forma similar a los análogos peptídicos, e imitan una actividad biológica de una NRG3 nativa de la presente invención. Preferiblemente, las variantes de la secuencia de aminoácidos de la presente invención retienen al menos un dominio de una NRG3 nativa, preferiblemente un dominio parecido al EGF, o tienen al menos aproximadamente un 60% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente un 75% de identidad de secuencia de aminoácidos, y los más preferiblemente al menos aproximadamente un 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio de una NRG3 nativa de la presente invención. Las variantes de secuencia de aminoácidos preferiblemente muestran el máximo grado de homología de la secuencia de aminoácidos con el dominio parecido al EGF de las NRG3 nativas de la presente invención. Estos son los dominios que muestran el porcentaje más elevado de conservación de aminoácidos entre las nuevas NRG3 de la presente invención y otros miembros de la familia NRG3 (ver Figura 4).

Los términos "aislado" o "sustancialmente puro" se refieren a un polipéptido o ácido nucleico que carece de otros polipéptidos o ácidos nucleicos, así como de lípidos, carbohidratos u otros materiales con los cuales está asociado naturalmente. Se hace una excepción para la glicosilación, en la cual los grupos azúcares están unidos covalentemente a los aminoácidos del polipéptido NRG3 de la invención. Alguien con la formación ordinaria en la técnica puede purificar un polipéptido NRG3, o un ácido nucleico que codifica el polipéptido, usando técnicas estándares apropiadas para cada tipo de molécula.

El término "porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos", en relación a la secuencia de la NRG3, se define en la presente invención como el porcentaje de residuos aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos a los residuos en la secuencia NRG3 que tiene la secuencia de aminoácidos deducida descrita en la Figura 1, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de la secuencia, y no considerando ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de la secuencia. Las extensiones, supresiones o inserciones N-terminales, C-terminales o internas en la secuencia de la NRG3 deben interpretarse como afectadoras de la identidad u homología de la secuencia.

Otro tipo de variante de la NRG3 es la "NRG3 quimérica", término que abarca un polipéptido que comprende una NRG3 de longitud completa, o un fragmento de la misma, fusionado o unido a un polipéptido heterólogo. La quimérica normalmente compartirá al menos una propiedad biológica con la NRG3. Los ejemplos de las NRG3 quiméricas incluyen las inmunoadhesinas y la NRG3 etiquetadas con un epítopo. En otra realización, el polipéptido heterólogo es la tioredoxina, un epítopo unidor de un receptor de reciclaje, un polipéptido o enzima citotóxico (por ejemplo, uno que convierte una prodroga en una droga activa).

Los términos "modificación covalente" y "derivados covalentes" se usan de forma intercambiable e incluye, pero no se limitan a, las modificaciones de un polipéptido nativo o un fragmento del mismo con un agente de derivación, fusiones a secuencias polipeptídicas heterólogas, y modificaciones posteriores a la traducción. Las modificaciones covalentes se introducen tradicionalmente haciendo reaccionar los residuos aminoácidos diana con un agente de derivación orgánico que es capaz de reaccionar con residuos laterales o terminales seleccionados, o aprovechando los mecanismos de modificaciones posteriores a la traducción que funcionan en las células huésped recombinantes seleccionadas. Ciertas modificaciones posteriores a la traducción son el resultado de la acción de las células huésped recombinantes sobre los polipéptidos expresados. Los residuos glutaminilo y asparaginilo son frecuentemente desamidados a los correspondientes residuos glutamilo y aspartilo. Alternativamente, estos residuos son desamidados en condiciones ligeramente ácidas. Otras modificaciones posteriores a a la traducción incluyen, la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de los grupos hidroxilo de los residuos serilo, tirosilo o treonilo, la metilación de los grupos \alpha-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)). Los derivados/modificaciones covalentes incluyen específicamente las proteínas de fusión que comprenden las secuencias de la NRG3 nativas de la presente invención y sus variantes de la secuencia de aminoácidos, tales como las inmunoadhesinas y las fusiones N-terminales a secuencias señal heterólogas.

El término "actividad biológica" en el contexto de la presente invención se define como la posesión de al menos una función adhesiva, reguladora o efectora cualitativamente en común con un polipéptido nativo. Los derivados funcionales preferidos en el ámbito de la presente invención están unificados por la retención de un dominio parecido al EGF y la unión específica al receptor ErbB4 de una NRG3 nativa de la presente invención.

La frase "activando un receptor ErbB" se refiere al acto de causar que el dominio quinasa intracelular de un receptor ErbB fosforile residuos tirosina. Generalmente, esto implicará la unión de la NRG3 a un receptor ErbB4 u homodímero del receptor ErbB4, unión que activa un dominio quinasa de uno o más de los receptores y resulta de ese modo en la fosforilación de residuos tirosina en uno o más de los receptores, y/o la fosforilación de residuos tirosina en polipéptido(s) sustrato adicional(es). La fosforilación del receptor ErbB4 puede cuantificarse usando los ensayos de fosforilación de tirosina descritos más abajo. Se sobrentiende que la NRG3 de la invención puede ser ella misma activada por la interacción con un receptor ErbB a través del dominio intracelular de la NRG3. Por tanto, un ligando activador de la NRG3 que se una a la NRG3 (preferiblemente uniéndose al dominio extracelular, más preferiblemente al dominio parecido al EGF) incluye, pero no se limita a, un ligando, un anticuerpo, o un receptor. La activación de la NRG3 puede ser a través de la fosforilación del dominio intracelular u otro suceso parecido común a la señalización celular mediada por receptor/ligando. Como mediador de la señalización celular, la NRG3 de la invención se espera que esté asociada con la apoptosis, la señalización metabólica, la diferenciación o la proliferación
celular.

La "identidad" u "homología", en relación a un polipéptido nativo y sus derivados funcionales, se define en la presente invención como el porcentaje de residuos aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoácidos de un polipéptido nativo correspondiente, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para conseguir el máxima porcentaje de homología, y no considerando ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de la secuencia. Ni las extensiones N- o C-terminales, ni las inserciones deben interpretarse como reductoras de la identidad u homología. Los procedimientos y programas de ordenador para la alineación son bien conocidos en el campo. Por ejemplo, las secuencias descritas en la presente invención se analizaron usando "Sequence Analysis Programs", Genentech, Inc.

El término "agonista" se usa para referirse a análogos peptídicos y no peptídicos de las NRG3 nativas de la presente invención, y a anticuerpos que se unen específicamente a tales NRG3 nativas, a condición de que retengan al menos una actividad biológica de una NRG3 nativa. Preferiblemente, los agonistas de la presente invención retienen las propiedades cualitativas de reconocimiento del dominio parecido al EGF de los polipéptidos NRG3
nativos.

El término "antagonista" se usa para referirse a una molécula que inhibe una actividad biológica de una NRG3 nativa de la presente invención. Preferiblemente, los antagonistas en la presente invención inhiben la unión de una NRG3 nativa de la presente invención. Los antagonistas preferidos esencialmente bloquean completamente la unión de una NRG3 nativa a un receptor ErbB4 al cual, de otro modo, se unen. Un "antagonista" de la NRG3 es una molécula que impide, o interfiere con, una función efectora de la NRG3 (por ejemplo, una molécula que impide o interfiere en la unión y/o activación de un receptor ErbB4 por parte de la NRG3). Tales moléculas pueden cribarse en función de su capacidad para inhibir competitivamente la activación del receptor ErbB por parte de la NRG3, por ejemplo, en un ensayo de fosforilación de la tirosina descrito en la presente invención. Los antagonistas preferidos son aquellos que no interfieren sustancialmente con la interacción de otros polipéptidos heregulina con el(los) receptor(es) ErbB. Los ejemplos de antagonistas de la NRG3 incluyen los anticuerpos neutralizadores contra la NRG3, y los polinucleótidos antisentido contra el gen de la NRG3.

Ordinariamente, los términos "aminoácido" y "aminoácidos" se refieren a todos los L-\alpha-aminoácidos que ocurren de forma natural. No obstante, en algunas realizaciones pueden estar presentes D-aminoácidos en los polipéptidos o péptidos de la presente invención, con objeto de facilitar la restricción conformacional. Por ejemplo, con objeto de facilitar la formación y estabilidad de un enlace disulfuro, puede proporcionarse un D-aminoácido cisteína en uno o ambos extremos de un derivado funcional del péptido o antagonista del péptido de las NRG3 nativas de la presente invención. Los aminoácidos se identifican por cualquiera de sus denominaciones de una letra o tres
letras:

100

El término "variante de la secuencia de aminoácidos" se refiere a moléculas con algunas diferencias en sus secuencias de aminoácidos en comparación con una secuencia de aminoácidos nativa.

Las variantes por sustitución son aquéllas que tienen al menos un residuo aminoácido en una secuencia nativa eliminado y un aminoácido diferente insertado en su lugar en la misma posición.

Las variantes por inserción son aquéllas con uno o más aminoácidos insertados inmediatamente adyacentes a un aminoácido en un posición determinada en una secuencia nativa. Inmediatamente adyacente a un aminoácido significa conectado bien al grupo funcional \alpha-carboxi o \alpha-amino del aminoácido.

Las variantes por supresión son aquéllas con uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos nativa suprimidos.

Los "anticuerpos (Ab)" y las "inmunoglobulinas (Ig)" son glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos exhiben una especificidad de unión por un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen tanto los anticuerpos, como otras moléculas parecidas a los anticuerpos que carecen de especificidad por el antígeno. Los polipéptidos de este último tipo son producidos, por ejemplo, a niveles bajos por el sistema linfático y a niveles incrementados por los mielomas.

Los anticuerpos e inmunoglobulinas nativos son usualmente glicoproteínas tetraméricas de aproximadamente 150.000 daltones, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de los diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Cada cadena pesada y ligera tiene también puentes disulfuro intracatenarios espaciados de forma regular. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (V_{H}) seguido por un cierto número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variables en un extremo (V_{L}), y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está alineada con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que determinados residuos aminoácidos forman una interfaz entre los dominios variables de la cadenas ligera y pesada (Clothia et al., J. Mol. Biol., 186:651-663 (1985); Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4592-4596 (1985)).

Las cadenas ligeras de los anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie vertebrada pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa y lambda (\lambda), en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

Dependiendo de la secuencias de aminoácidos del dominio constantes de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de éstas pueden dividirse además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG-1, IgG-2, IgG-3, e IgG-4; IgA-1 e IgA-2. Los dominios constantes de las cadenas pesadas que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan, respectivamente \alpha, \delta, \varepsilon, \lambda, y \mu. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.

El término "anticuerpo" se usan en el sentido más amplio, y específicamente abarca los anticuerpos monoclonales simples (incluyendo los anticuerpos agonistas y antagonistas), las composiciones de anticuerpos con especificidad poliepitópica, así como los fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab, F(ab')_{2}, y Fv), con tal que exhiban la actividad biológica deseada.

El término "anticuerpo monoclonal" tal como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que forman la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que ocurren de forma natural que podrían estar presentes en pequeñas cantidades. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo en el sentido que se obtiene a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe limitarse en el sentido de requerir la producción del anticuerpo mediante cualquier procedimiento determinado. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a ser usados de acuerdo con la presente invención pueden prepararse mediante el procedimiento del hibridoma descrito por primera ver por Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975), o prepararse mediante procedimientos de ADN recombinante (consultar, por ejemplo, la Patente Estadounidense nº 4.816.567 (Cabilly et al.) y Mage y Lamoyi, in Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 79-97, Marcel Dekker, Inc., Nueva York (1987)). Los anticuerpos monoclonales también pueden aislarse a partir de bibliotecas en fagos usando, por ejemplo, las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990).

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, múridos) son inmunoglobulinas quiméricas específicas, cadenas de inmunoglobulinas, o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2}, u otras subsecuencias de los anticuerpos unidoras de antígeno), que contienen una secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales se remplazan residuos, procedentes de una región determinante de la complementariedad (CDR) del anticuerpo receptor, con residuos procedentes de las CDR de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como el ratón, la rata o conejo, que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región estructural (FR) de Fv son remplazados por los correspondientes residuos FR no humanos. Además, el anticuerpo humanizado puede comprender residuos que no se hallan, ni en el anticuerpo receptor, ni en el CDR o secuencias estructurales importados. Estas modificaciones se hacen para refinar aún más y optimizar las prestaciones del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos un, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales la totalidad o sustancialmente la totalidad de las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana, y la totalidad o sustancialmente la totalidad de las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado, óptimamente comprenderá también al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles consultar: Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); EP-B-239.400 publicada el 30 de septiembre de 1987; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992); y la EP-B-451.216 publicada el 24 de enero de 1996), referencias que se incorporan en su totalidad en la presente invención por referencia. El anticuerpo humanizado incluye un anticuerpo Primatized^{TM}, en donde la región unidora de antígeno del anticuerpo se deriva de un anticuerpo producido inmunizando monos macacos con el antígeno de interés.

Por "anticuerpo neutralizador" se quiere indicar una molécula de anticuerpo, tal y como se define en la presente invención, que es capaz de bloquear o reducir significativamente una función efectora de la NRG3 de secuencia nativa. Por ejemplo, un anticuerpo neutralizador puede inhibir o reducir la capacidad de la NRG3 para activar un receptor ErbB, preferiblemente un receptor ErbB4, en el ensayo de fosforilación de tirosina descrito en la presente invención. El anticuerpo neutralizador puede bloquear también la actividad mitogénica de la NRG3 en el ensayo de proliferación celular descrito en la presente invención.

Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen específicamente los anticuerpos (inmunoglobulinas) "quiméricos", en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica a, u homóloga de, las correspondientes secuencias en anticuerpos derivados de una especie determinada, o pertenecientes a una determinada clase o subclase de anticuerpo, mientras que el resto de la cadena o cadena son idénticas con, u homólogas de, las correspondientes secuencias en anticuerpos derivados de otra especie, o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de tales anticuerpos, con tal que exhiban la actividad biológica deseada (Patente Estadounidense nº 4.816.567 (Cabilly et al.; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)).

En el contexto de la presente invención, las expresiones "célula", "línea celular", y "cultivo celular" y "célula huésped" se usan de forma intercambiable, y la totalidad de tales denominaciones incluyen la progenie. Se entiende también que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en su contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie mutante que tiene la misma función o propiedad biológica, tal y como se cribó en la célula transformada originalmente. Los procedimientos de transferencia estable, indicando que el ADN extraño es mantenido continuamente en el huésped, son conocidos en el estado de la técnica.

Los términos "vector de expresión replicable", "vector de expresión", y "vector" se refieren a una pieza de ADN, usualmente de doble hebra, que puede tener insertado en ella una pieza de ADN ajeno. El ADN ajeno se define como un ADN heterólogo, el cual es un ADN que no se halla de forma natural en la célula huésped. El vector se usa para transportar el ADN ajeno o heterólogo al interior de una célula huésped apropiada. Una vez en la célula huésped, el vector puede replicarse independientemente del ADN cromosómico del huésped, y pueden generarse varias copias del vector y su ADN (ajeno) insertado. Además, el vector contiene los elementos necesarios que permiten la traducción del ADN ajeno en un polipéptido. Por tanto, pueden sintetizarse muchas moléculas del polipéptido codificado por el ADN ajeno.

El término "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión en un determinado organismo huésped de una secuencia codificante operativamente ligada. Las secuencias de control que son apropiadas para los procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, un sitio de unión de ribosomas, y, posiblemente, otras aún poco comprendidas. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

El ácido nucleico está "unido operativamente" cuando está colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o un líder secretorio está unido operativamente a un ADN para un polipéptido, si éste se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o un potenciador están operativamente unidos a una secuencia codificante si éstos afectan la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión de ribosomas está unido operativamente a una secuencia codificante si está ubicado de forma que facilita la traducción. Generalmente, "operativamente unido" significa que las secuencias de ADN que están unidas son contiguas, y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en pauta de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen porque ser contiguos. La unión se consigue mediante la ligación en los sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, entonces se usan adaptadores o engarces de oligonucleótidos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

Los "oligonucleótidos" son polidesoxinucleótidos de hebra única o doble, de longitud corta, que se sintetizan químicamente mediante procedimientos conocidos, tales como la química del fosfotriéster, del fosfito, o de la fosforamidito, usando técnicas de fase sólida, tales como las descritas en EP-266.032, publicada el 4 de mayo de 1988, o a través de intermediarios desoxinucleósido H-fosfonato tal y como describen Froehler et al., Nucl. Acids Res., 14:5399 (1986). A continuación se purifican en geles de poliacrilamida.

Por "fase sólida" se quiere indicar una matriz no acuosa a la cual puede adherirse un reactivo de interés (por ejemplo, la NRG3 o un anticuerpo contra la misma). Los ejemplos de fases sólidas incluidos en la presente invención incluyen aquéllos formados parcial o completamente de vidrio (por ejemplo, vidrio de poro controlado), polisacáridos (por ejemplo, agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, alcohol polivinílico, y siliconas. En ciertas realizaciones, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender el pocillo de una placa de ensayo; en otras es una columna de purificación (por ejemplo, una columna de cromatografía por afinidad). Este término también incluye una fase sólida discontinua de partículas discretas, tales como las descritas en la Patente Estadounidense nº 4.275.149, incorporada en la presente invención por referencia en su totalidad.

Los términos "transformación" y "transfección" se usan de forma intercambiable en la presente invención, y se refieren al proceso de introducción del ADN en un célula. A continuación de la transformación o transfección, el ADN de la NRG3 puede integrarse en el genoma de la célula huésped, o puede existir como un elemento extracromosómico. Si las células procariotas o células que contienen construcciones sustanciales de pared celular se usan como huéspedes, los procedimientos de transfección preferidos de las células con ADN son el procedimiento del tratamiento con calcio descrito por Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 69:2110-2114 (1972) o el procedimiento del polietilenglicol de Chung et al., Nuc. Acids Res., 16:3580 (1988). Si se usan levaduras como huésped, la transfección se consigue generalmente usando polietilenglicol, tal y como enseñó Hinnen, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75:1929-1933 (1978). Si se usan células de mamífero como células huéspedes, la transfección generalmente se lleva a cabo mediante el procedimiento de la precipitación con fosfato cálcico, Graham et al., Virology, 52:546 (1978), Gorman et al., DNA and Protein Eng. Tech., 2:3-10 (1990). Sin embargo, otros procedimientos conocidos para introducir el ADN dentro de células procariotas y eucariotas, tales como la inyección nuclear, la electroporación, o la fusión de protoplastos, son también apropiados para su uso en esta invención.

Son particularmente útiles en esta invención los vectores de expresión que proporcionan la expresión transitoria, en células de mamíferos, del ADN que codifica la NRG3. En general, la expresión transitoria implica el uso de un vector de expresión que es capaz de replicarse eficientemente en una célula huésped, de tal forma que la célula huésped acumula muchas copias del vector de expresión y, a su vez, sintetiza niveles elevados de un polipéptido deseado codificado por el vector de expresión. Los sistemas de expresión, que comprenden un vector de expresión apropiado y una célula huésped, permiten la identificación positiva práctica de los polipéptidos codificados por los ADN clonados, así como el cribado rápido de tales polipéptidos en busca de propiedades biológicas o fisiológicas.

Se prevé además que la NRG3 de esta invención puede producirse mediante recombinación homóloga, tal y como se proporciona en WO-91/06667, publicada el 16 de mayo de 1991. En resumen, este procedimiento implica la transformación de una célula que contiene un gen de la NRG3 endógeno con un ADN homólogo, en donde el ADN homólogo comprende (a) un gen amplificable (por ejemplo, un gen que codifica la dihidrofolato reductasa (DHFR)), y (b) al menos una secuencia flanqueante, que tiene una longitud de al menos aproximadamente 150 pares de bases, la cual es homóloga con una secuencia de nucleótidos en el genoma de la células que se halla dentro o en la proximidad del gen que codifica la NRG3. La transformación se lleva a cabo en condiciones tales que el ADN homólogo se integra en el genoma de la célula mediante recombinación. Las células que tienen el ADN homólogo integrado se someten a continuación a unas condiciones que seleccionan la amplificación del gen amplificable, de manera que el gen de la NRG3 se amplifica de forma concomitante. Las células resultantes se criban a continuación para la producción de las cantidades deseadas de NRG3. Las secuencias flanqueantes que están en la proximidad de un gen que codifica la NRG3 se identifican fácilmente, por ejemplo, mediante el procedimiento del paseo genómico, usando como punto de partida la secuencia de nucleótidos, o un fragmento de la misma, de la NRG3 de ratón de la Figura 1 (SEC. Nº ID.:1), o la NRG3 humana de la Figura 2 (SEC. Nº ID.:5) o la Figura 3 (SEC. Nº ID.:22). El ADN que codifica los polipéptidos de la NRG3 de ratón o humana está depositado en la American Type Culture Collection como ATCC 209156 (ratón; pLXSN.mNRG3), ATCC 209157 (humana; pRKS.tk.neo.hNRG3B1), o ATCC 209157 (humana; pRK5.tk.neo.hNRG3B2).

La expresión "potenciar la supervivencia de una célula" se refiere al acto de incrementar el período de existencia de una célula, en relación a una célula no tratada, la cual no ha sido expuesta a la NRG3, sea in vivo o in vitro.

La frase "potenciar la proliferación de una célula" abarca el paso de incrementar la extensión de crecimiento y/o reproducción de la célula, en relación a una célula no tratada, sea in vitro o in vivo. Un incremento en la proliferación celular en el cultivo de células puede detectarse contando el número de células antes y después de su exposición a la NRG3 (ver el Ejemplo siguiente). El alcance de la proliferación puede cuantificarse a través del examen microscópico del grado de confluencia. La proliferación celular puede cuantificarse también midiendo la captación de ^{3}H por parte de las células.

Por "potenciando la diferenciación de una célula" se quiere significar el hecho de incrementar el alcance de la adquisición o posesión de una o más características o funciones que difieren de las de la células original (es decir, especialización celular). Esto puede detectarse cribando en busca de un cambio en el fenotipo de la célula (por ejemplo, identificando cambios morfológicos en la célula).

Las "células musculares" incluyen las células del tejido del músculo esquelético, cardíaco o liso. Este término abarca aquellas células que se diferencian para formar células musculares más especializadas (por ejemplo, mioblastos).

El "ácido nucleico de la NRG3 aislado" es un ARN o ADN libre de al menos un ácido nucleico de la fuente contaminante, con el cual está normalmente asociado en la fuente natural, y está sustancialmente libre de cualquier otro ARN o ADN de mamífero. La frase "libre al menos de un ácido nucleico de la fuente contaminante con el cual está normalmente asociado" incluye el caso en donde el ácido nucleico está presente en la célula fuente o natural, pero está en una ubicación cromosómica diferente, o está flanqueado de otro modo por secuencias de ácido nucleico que normalmente no se hallan en la célula fuente. Un ejemplo de ácido nucleico de la NRG3 aislado es un ARN o ADN que codifica una NRG3 biológicamente activa que comparte al menos el 75%, más preferiblemente al menos el 80%, aún más preferiblemente al menos el 85%, incluso más preferiblemente el 90%, y los más preferiblemente el 95% de identidad de la secuencia con la NRG3 de ratón mostrada en la Figura 1 (SEC. Nº ID.:1), o NRG3 humana mostrada en la Figura 2 (SEC. Nº ID.:4) o Figura 3 (SEC. Nº ID.:22).

El ácido nucleico está "unido operativamente" cuando está colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o un líder secretorio está unido operativamente a un ADN para un polipéptido, si éste se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o un potenciador están operativamente unidos a una secuencia codificante si éstos afectan la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión de ribosomas está unido operativamente a una secuencia codificante si está ubicado de forma que facilita la traducción. Generalmente, "operativamente unido" significa que las secuencias de ADN que están unidas son contiguas, y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en pauta de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen porque ser contiguos. La unión se consigue mediante la ligación en los sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, se usan adaptadores o engarces de oligonucleótidos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

La hibridación se realiza preferiblemente en "condiciones rigurosas", lo que significa (1) emplear una fuerza iónica baja y una temperatura elevada para el lavado, por ejemplo, cloruro sódico 0,015 M/citrato sodio 0,0015 M/0,1% de dodecilsulfato de sodio a 50ºC, o (2) emplear durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como la formamida, por ejemplo, 50% (vol/vol) de formamida con un 0,1% de albúmina de suero bovino/0,1% de Ficoll/0,1% de polivinilpirrolidona/tampón fosfato sódico 50 nM, a pH 6,5, con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC. Otro ejemplo es el uso de formamida al 50%; 5 \times SSC (0,75 M NaCl, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6/8), 0,1% de pirofosfato sódico, 5 \times solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 \mug/ml), 0,1% de SDS, y 10% de sulfato de dextrano a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 \times SSC y 0,1% de SDS. Aún otro ejemplo es la hibridación usando un tampón de dextrano sulfato al 10%, 2 \times SSC (cloruro sódico/citrato sódico) y 50% de formamida a 55ºC, seguida por un lavado a elevada rigurosidad consistente en 0,1 \times SSC conteniendo EDTA a 55ºC.

Las "inmunoadhesinas" o "quimeras de NRG3-inmunoglobulina" son moléculas quiméricas parecidas a anticuerpos que combinan el(los) dominio(s) funcional(es) de una proteína unidora (usualmente un receptor, una molécula de adhesión celular, o un ligando) con una secuencia de inmunoglobulina. El ejemplo más común de este tipo de proteína de fusión combina las regiones gozne y Fc de una inmunoglobulina (Ig) con dominios de un receptor de la superficie celular que reconoce un ligando específico. Este tipo de molécula se denomina "inmunoadhesina", puesto que combina las funciones "inmune" y de "adhesión"; otros nombres frecuentemente usados son las "Ig-quimera", "Ig-" o "proteína de fusión-Fc", o "receptor-globulina".

"Tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas, aquéllos que precisan el tratamiento incluyen a los que ya tienen este trastorno, así como a los propensos a padecer el trastorno, de entre aquellos en los que debe prevenirse el trastorno.

Mamífero, para los propósitos de tratamiento, se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo los humanos, los animales domésticos y de granja, de zoológicos y de deportes, o los animales de compañía, tales como la oveja, los perros, los caballos, los gatos, las vacas, y similares. Preferiblemente, el mamífero en la presente invención es un humano.

Los "portadores" tal y como se usan en ésta incluyen los portadores, excipientes, o estabilizadores farmacéuticamente aceptables, los cuales no son tóxicos para la célula o mamífero que está siendo expuesta a los mismos en la dosis y concentraciones empleadas. A menudo, el portador fisiológicamente aceptable es una solución de pH tamponado acuosa. Los ejemplos de portadores fisiológicamente aceptables incluyen los tampones tales como el fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo el ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como la albúmina del suero, la gelatina, o las inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como la polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como la glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; los monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos, incluyendo la glucosa, la manosa, o las dextrinas; agentes quelantes tales como el EDTA; alcoholes azúcar tales como el manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como el sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como el Tween^{TM}, polietilenglicol (PEG), y Pluronics^{TM}.

Procedimientos generales para la producción de una NRG3 mediante la tecnología del ADN recombinante A. Identificación y aislamiento del ácido nucleico que codifica el nuevo ligando relacionado con la neuregulina, NRG3

Las NRG3 nativas de la presente invención pueden aislarse a partir del ADNc o de bibliotecas genómicas. Por ejemplo, puede construirse una biblioteca de ADNc apropiada obteniendo ARNm poliadenilado a partir de células que se sabe expresan la NRG3 deseada, y usando el ARNm como una plantilla para sintetizar ADNc de doble hebra. Las fuentes apropiadas del ARNm son los tejidos de mamífero embrionarios y adultos, los ARNm que codifican las NRG3 nativas de la presente invención se expresan, por ejemplo, en el cerebro, sistema nervioso, corazón, músculo y testículos del mamífero adulto El gen que codifica las nuevas NRG3 de la presente invención puede obtenerse también a partir de una biblioteca genómica, tal como una biblioteca de cósmidos genómica humana, o una biblioteca genómica de células madre embrionarias (ES) derivadas de ratón.

Las bibliotecas, bien de ADNc o genómicas, se criban con sondas diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína codifica por él. Para las bibliotecas de expresión de ADNc, las sondas apropiadas incluyen los anticuerpos monoclonales y policlonales que reconocen y se unen específicamente a una NRG3 de la invención. Para la bibliotecas de ADNc, las sondas apropiadas incluyen sondas oligonucleotídicas cuidadosamente seleccionadas (usualmente de aproximadamente 20-80 bases de longitud) que codifican porciones conocidas o sospechadas de un polipéptido de NRG3 procedente de la misma o diferentes especies, y/o ADNc complementarios u homólogos o fragmentos de los mismos que codifican el mismo gen o uno similar. Las sondas apropiadas para cribar las bibliotecas de ADN genómico incluyen, sin limitación, oligonucleótidos, ADNc, o fragmentos de los mismos que codifican el mismo gen o uno similar, y/o ADN genómicos homólogos o fragmentos de los mismos. El cribado de la biblioteca de ADNc o genómica con la sonda seleccionada puede realizarse usando procedimientos estándares, tal y como se describe en los capítulos 10-12 de Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, incorporada en la presente invención por referencia en su totalidad.

Si el ADN que codifica una NRG3 de la presente invención se aísla cuando secuencias oligonucleotídicas cuidadosamente seleccionadas para cribar bibliotecas de ADNc procedentes de varios tejidos, las secuencias oligonucleotídicas seleccionadas como sondas deberían ser de longitud suficiente y suficientemente inambiguas de forma que se minimicen las selecciones de falsos positivos. La(s) secuencia(s) de nucleótidos actual(es) se diseña(n) en base a regiones que la mínima redundancia de codones. Los oligonucleótidos pueden estar degenerados en una o más posiciones. El uso de oligonucleótidos degenerados es de particular importancia cuando se criba una biblioteca procedente de una especie cuyo uso preferencial de codones no se conoce.

El oligonucleótido debe estar marcado de tal forma que pueda detectarse a partir de la hibridación al ADN en la librería que se está cribando. El procedimiento preferido de etiquetado es el uso de ATP (por ejemplo, \gamma^{32}P) y la polinucleótido quinasa para marcar radiactivamente el extremo 5' del oligonucleótido. Sin embargo, pueden usarse otros procedimientos para marcar el oligonucleótido, incluyendo, pero no limitándose a, la biotinilación o marcado enzimático.

Los ADNc que codifican las nuevas NRG3 pueden identificarse y aislarse también mediante otras técnicas conocidas de la tecnología del ADN recombinante, tales como mediante la clonación de expresión directa, o usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) tal y como se describe en la Patente Estadounidense nº 4.683.195, concedida el 28 de julio de 1987, en la sección 14 de Sambrook et al., supra, o en el capítulo 15 de Current Protocols in Molecular Biology, editores Ausubel et al., Greene Publishing Associates y Wiley-Interscience 1991, referencias que se incorporan en la presente invención en su totalidad por referencia.

Una vez el ADNc que codifica una nueva NRG3 nativa, específica para el receptor ErbB4, procedente de una especie se ha aislado, pueden obtenerse los ADNc de otras especies mediante la hibridación cruzada entre especies. De acuerdo con esta estrategia, las bibliotecas genómicas o de ADNc de humano u otro mamífero se examinan mediante secuencias oligonucleotídicas marcadas, seleccionadas a partir de secuencias de NRG3 conocidas (tales como las secuencias múrida o humana), de acuerdo con criterios conocidos. Preferiblemente, la secuencia de la sonda debe ser de longitud suficiente y suficientemente inambigua para que los falsos positivos estén minimizados. Típicamente, es suficiente un oligonucleótido marcado con ^{32}P que tenga aproximadamente de 30 a 50 bases, particularmente si el oligonucleótido contiene uno o más codones para la metionina o el triptófano. El ácido nucleico aislado será ADN que se ha identificado, y está separado de ácidos nucleicos contaminantes que codifican otros polipéptidos respecto la fuente de ácido nucleico. La hibridación se realiza preferiblemente en "condiciones rigurosas", tal y como se definen en la presente invención.

Una vez se conoce la secuencia, el gen que codifica una NRG3 particular puede obtenerse también mediante síntesis química, siguiendo uno de los procedimientos descritos en Engels y Uhlmann, Angew Chem. Int. Ed. Engl., 28:716 (1989), incorporada en la presente invención en su totalidad por referencia. Estos procedimientos incluyen los procedimientos del triéster, fosfito, fosforamidito y H-fosfonato, la PCR, y otros procedimientos de autocebado, y la síntesis del oligonucleótido sobre soportes sólidos.

B. Clonación y expresión del ácido nucleico que codifica las nuevas NRG3

Una vez está disponible el ácido nucleico que codifica una nueva NRG3, generalmente se liga en un vector de expresión replicable para su clonación adicional (amplificación del ADN), o para su expresión.

Los vectores de expresión y clonación son bien conocidos en el estado de la técnica, y contienen una secuencia de ácido nucleico que permite al vector replicarse en una o más células huéspedes seleccionadas. La selección del vector apropiado dependerá de (1) si va a usarse en la amplificación del ADN o en la expresión del ADN, (2) el tamaño del ADN que ha de insertarse en el vector, y (3) la célula huésped a transformar con el vector. Cada vector contiene varios componentes dependiendo de su función (amplificación del ADN o expresión del ADN) y de la célula huésped con la que es compatible. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no están limitados a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción. La construcción de vectores apropiados, que contienen uno o más de los componentes listados más arriba, las secuencias de codificación y control deseadas, emplea técnicas de ligación estándares. Los plásmidos o fragmentos de ADN aislados pueden cortarse, ajustarse, y religarse de la forma deseada para generar los plásmidos necesarios. Para el análisis para confirmar las secuencias correctas en los plásmidos construidos, las mezclas de ligación se usan comúnmente para transformar células E. coli, por ejemplo la E. coli K12 cepa 294 (ATCC 31.446), y los transformantes exitosos pueden seleccionarse por resistencia a la ampicilina o tetraciclina según sea apropiado. Los plásmidos para los transformantes se preparan, analizan mediante digestión con endonucleasas de restricción, y/o se secuencian mediante el procedimiento de Messing et al., Nucleic Acids Res., 9:309 (1981), o mediante el procedimiento de Maxam et al., Methods in Enzymology,
65:499 (1980).

Los polipéptidos de la presente invención pueden expresarse en una variedad de células huésped procariotas y eucariotas. Las procariotas apropiadas incluyen organismos gram negativos y gram positivos, por ejemplo, E. coli o bacilos. Un huésped de clonación preferido es E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque son apropiadas otras procariotas gram negativas o gram positivas tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537), E. coli W31 10 (ATCC 27.325), especies de Pseudomonas, o Serratia Marcesans.

Además de los procariotas, los microbios eucariotas, tales como los hongos filamentosos o las levaduras, son huéspedes apropiados para los vectores en la presente invención. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura común de panadería, es el más usado entre los microorganismos huéspedes que son eucariotas inferiores. Sin embargo, existe un cierto número de otros géneros, especies y cepas comúnmente disponibles y útiles en la presente invención, tales como S. pombe (Beach y Nurse, Nature, 290:140 (1981)), Kluyveromyces lactis (Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 (1983)); yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070), Trichoderma reesia (EP 244.234), Neurospora crassa (Case et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 (1979)); y huéspedes de Aspergillus tales como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 (1983); Tilburn et al., Gene, 26:205-221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474 (1984)) y A. niger (Kelly y Hynes, EMBO J., 4:475-479 (1985)).

Las células huéspedes apropiadas pueden derivarse también de organismos multicelulares. Tales células huéspedes son capaces de actividades de procesado y glicosilación complejas. En principio, cualquier cultivo de célula eucariota superior es factible, proceda de cultivo de vertebrado o invertebrado, aunque se prefieren las células procedentes de mamíferos tales como los humanos. Los ejemplos de células de invertebrados incluyen las plantas y las células de insectos. Se han identificado numerosas cepas baculovíricas y células huéspedes de insecto permisivas variantes y correspondientes procedentes de huéspedes, tales como las células huéspedes de Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melangaster (mosca de la fruta), y Bombyx mori. Consultar, por ejemplo, Luckow et al., Bio/Technology, 6:47-55 (1988); Miller et al., en Genetic Engineering, editores Setlow, J.K. et al., Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), pp. 277-279; y Maeda et al., Nature, 315:592-594 (1985). Una variedad de tales cepas víricas están disponibles públicamente, por ejemplo, la variante L1 del NPV de Autographa californica, y tales virus pueden usarse como los virus en la presente invención, de acuerdo con la presente invención, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

Los cultivos de células vegetales del algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco pueden usarse como huéspedes. Típicamente, las células vegetales se transfectan mediante la incubación con ciertas cepas de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, las cuales se han manipulado previamente para contener el ADN de la NRG3. Durante la incubación del cultivo de células vegetales con A. tumefaciens, el ADN que codifica la NRG3 se transfiere a la célula vegetal huésped, de tal forma que se transfecta y, en condiciones apropiadas, expresa el ADN de la NRG3. Además, hay disponibles secuencias reguladoras y señal compatibles con las células vegetales, tales como el promotor de la nopalín sintasa y las secuencias señal de poliadenilación. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen., 1:561 (1982). Además, los segmentos de ADN aislados de la región cadena arriba del gen 780 del T-DNA son capaces de activar o incrementar los niveles de transcripción de los genes expresables en plantas en tejidos vegetales que contienen ADN recombinante. Consultar EP-321.196 publicada el 21 de junio de 1989.

Sin embargo, ha sido mayor el interés por las células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejidos) es bien conocido por sí mismo (consultar, por ejemplo, Tissue Culture, Academic Press, editores Kruse y Patterson (1973)). Son ejemplos de líneas celulares huéspedes de mamífero útiles la línea CV1 de riñón de mono transformada por el SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea celular de riñón embrionaria humana (células 293 o 293 subclonadas para su crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen. Virol., 36:59 (1977)); las células renales de crías de hámster (BHK, ATCC CCL 10); las células ováricas de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); las células sertoli de ratón (TM4, Mather Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); las células renales de mono (CV1 ATCC CCL 70); las células renales de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); las células del carcinoma de cérvix humano (HELA, ATCC CCL 2); las células renales caninas (MDCK, ATCC CCL 34); las células hepáticas de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); las células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL75); las células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); el tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); las células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 44068 (1982)); las células MRC 5; las células FS4; y una línea celular de hepatoma humana (Hep G2). Las células huésped preferidas son las células 293 renales embrionarias humanas, y las ováricas de hámster chino.

Son particularmente útiles en la práctica de esta invención los vectores de expresión que proporcionan la expresión, en células de mamíferos, del ADN que codifica la nueva NRG3 de la presente invención. Cuando se prefiere la expresión transitoria, la expresión implica el uso de un vector de expresión que es capaz de replicarse eficientemente en una célula huésped, de tal forma que la célula huésped acumula muchas copias del vector de expresión y, a su vez, sintetiza niveles elevados de un polipéptido deseado codificado por el vector de expresión. Los sistemas transitorios, que comprenden un vector de expresión apropiado y una célula huésped, permiten la identificación positiva práctica de los polipéptidos codificados por los ADN clonados, así como el cribado rápido de tales polipéptidos en busca de propiedades biológicas o fisiológicas. Por tanto, los sistemas de expresión transitoria son particularmente útiles en la invención para los propósitos de identificar análogos y variantes de una NRG3 nativa de la invención.

Otros procedimientos, vectores y células huéspedes, apropiados para su adaptación a la síntesis de los polipéptidos deseados en cultivos de células vertebradas recombinantes, se describen, por ejemplo, en Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantel et al., Nature, 281:40-46 (1979); Levinson et al.; EP 117.060; y EP 117.058. Son plásmidos particularmente útiles para la expresión, en cultivos de células de mamífero, de los polipéptidos de la NRG3, el pRK5 (EP-307.247), o el pSVI6B (Publicación del PCT nº WO-91/08291).

Otros vectores de clonación y expresión, apropiados para la expresión de las NRG3 de la presente invención en una variedad de células huéspedes, se describen, por ejemplo, en EP-457.758, publicada el 27 de noviembre de 1991. Actualmente hay una gran variedad de vectores de expresión disponibles comercialmente. Un vector de expresión en levadura comercial ilustrativo es pPIC.9 (Invitrogen), mientras que PET 15b (Novagen) es un vector de expresión disponible comercialmente y apropiado para la transformación de células de E. coli.

C. Cultivo de las células huésped

Las células procariotas usadas para producir las NRG3 de esta invención se cultivar en medio apropiada, como se describe generalmente en Sambrook et al., supra.

Las células de mamífero pueden cultivarse en una variedad de medios. Los medios disponibles comercialmente, tales como el F10 de Ham (Sigma), el medio esencial mínimo (MEM, Sigma), el RPMI-1640 (Sigma), y el medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma) son apropiados para cultivar las células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham y Wallace, Meth. Enzymol., 58:44 (1979), Barnes y Sato, Anal. Biochem., 102:255 (1980), Patentes Estadounidenses nº 4.767.704, 4.657.866, 4.927.762 o 4.560.655; WO-90/03430; WO-87/00195, o la Solicitud de Patente Estadounidense 30.985 puede usarse como medio de cultivo para las células huéspedes. Cualquiera de estos medios puede suplementarse según fuera necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (tales como la insulina, transferrina o el factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como el cloruro sódico, el calcio, el magnesio, y el fosfato), tampones (tales como el HEPES), nucleósidos (tales como la adenosina y la timidina), antibióticos (tales como el fármaco Gentamicina^{TM}), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos presentes usualmente en concentraciones finales del orden micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualesquier otros suplementos necesarios pueden incluirse también en las concentraciones apropiadas, las cuales serán conocidas por los especialistas en el campo. Las condiciones del cultivo, tales como la temperatura, el pH y similares, convenientemente son aquéllas usadas previamente con la célula huésped seleccionada para la clonación o expresión, según el caso, y serán evidentes para el especialista ordinario.

Las células huéspedes mencionadas en esta descripción abarcan las células en cultivos de células in vitro, así como las células que se hallan en un animal o planta huésped.

Se prevé además que la NRG3 de esta invención puede producirse mediante recombinación homóloga, o con procedimientos de producción recombinante utilizando elementos de control introducidos dentro de células que ya contienen el ADN que codifica la NRG3 determinada.

D. Detección de la amplificación y/o expresión del gen

La amplificación y/o expresión del gen puede medirse directamente en una muestra, por ejemplo, mediante una transferencia Southern convencional, una transferencia Northern para cuantificar la transcripción del ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)), la transferencia en punto (análisis del ADN), o hibridación in situ, usando una sonda marcada convenientemente, basada en las secuencias proporcionadas en la presente invención. Pueden emplearse varias marcas, lo más comúnmente radioisótopos, particularmente el ^{32}P. Sin embargo, también pueden emplearse otras técnicas, tales como usar nucleótidos modificados con biotina para su introducción en un polinucleótido. La biotina sirve a continuación como un sitio de unión a avidina o anticuerpos, los cuales pueden estar marcados con una amplia variedad de marcas, tales como radionúcleos, compuestos fluorescentes, enzimas, o similares. Alternativamente, pueden emplearse anticuerpos que pueden reconocer duplexes específicos, incluyendo los duplexes de ADN, los duplexes de ARN, y los duplexes híbridos ADN-ARN o los duplexes ADN-proteína. A su vez, los anticuerpos pueden estar marcados y puede llevarse a cabo un ensayo en donde el dúplex está unido a la superficie, de forma
que, a partir de la formación del dúplex sobre la superficie, puede detectarse la presencia de anticuerpo unido al dúplex.

La expresión del gen puede medirse alternativamente mediante procedimientos inmunológicos, tales como tinción inmunohistoquímica de secciones de tejido y el ensayo del cultivo de células o fluidos corporales para cuantificar directamente la expresión del producto del gen. Una técnica de tinción particularmente sensible, y apropiada para su uso en la presente invención, es descrita por Hse et al., Am. J. Clin. Pharm., 75:734-738 (1980).

Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o el ensayo de fluidos muestra pueden ser tanto monoclonales como policlonales, y pueden prepararse en cualquier animal. De forma conveniente, los anticuerpos pueden prepararse contra un polipéptido de NRG3 nativa, o contra un péptido sintético basado en la secuencia de ADN descrita en la presente invención.

E. Variantes de la secuencia de aminoácidos de una NRG3 nativa

Las variantes de la secuencia de aminoácidos de las NRG3 nativas se preparan, mediante procedimientos conocidos en el estado de la técnica, introduciendo los cambios de nucleótidos apropiados en un ADN de NRG3 nativa, o mediante la síntesis in vitro del polipéptido deseado. Hay dos variables principales en la construcción de las variantes de la secuencia de aminoácidos: la ubicación del sitio de mutación y la naturaleza de la mutación. Con excepción de los alelos que ocurren de forma natural, los cuales no requieren la manipulación de la secuencia de ADN que codifica la NRG3 nativa, las variantes de la secuencia de aminoácidos de las NRG3 se construyen preferiblemente mutando el ADN, sea para llegar a un alelo o a una variante de la secuencia de aminoácidos que no ocurre en la naturaleza.

Un grupo de mutaciones se creará dentro del dominio extracelular o dentro del dominio parecido al EGF de una nueva NGR3 nativa de ratón o humana de la presente invención (ver Figura 3 para el esquema del dominio extracelular (SEC. Nº ID.:3 o SEC. Nº ID.:7) y del dominio parecido al EGF (SEC. Nº ID.:4) respectivamente dentro de las secuencias de aminoácidos de la NRG3 humana o de ratón. Puesto que se cree que estos dominios son funcionalmente importantes, se espera que las alteraciones tales como las sustituciones no conservadoras, las inserciones y/o las supresiones en estas regiones resulten en cambios genuinos en las propiedades de las moléculas receptoras nativas, tales como en la unión y activación del receptor ErbB4. Por consiguiente, se cree que las alteraciones de aminoácidos en esta región resultan en variantes con propiedades significativamente diferentes de las de los correspondientes polipéptidos nativos. Las sustituciones no conservadoras dentro de estos dominios funcionalmente importantes pueden resultar en variantes que pierden la capacidad de reconocimiento y unión al receptor ErbB4 de sus contrapartidas naturales, o que tienen propiedades de reconocimiento del receptor ErbB4 incrementadas, sensibilidad potenciada, o propiedades de activación potenciadas al compararlas con las correspondientes proteínas nativas.

Alternativamente, o además, las alteraciones de aminoácidos pueden hacerse en sitios que difieren en las nuevas NRG3 procedentes de varias especies, o en regiones altamente conservadas, dependiendo del objetivo a conseguir. Los sitios en tales ubicaciones típicamente se modificaran en serie, por ejemplo, (1) sustituyendo primero con elecciones conservadoras y luego con selecciones más radicales, dependiendo de los resultados conseguidos, (2) suprimiendo el residuo o residuos diana, o (3) insertando residuos de la misma o diferente clase adyacentes al sitio ubicado, o combinaciones de las opciones 1-3. Una técnica útil para tales modificaciones es el denominado "barrido con alanina" (Cunningham y Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)).

En aún otro grupo de las NRG3 variantes de la presente invención, uno o más de los dominios funcionalmente menos significativos puede suprimirse o inactivarse. Por ejemplo, la supresión o inactivación del dominio transmembrana rinde variantes solubles de las proteínas nativas. Alternativamente, o en adición, el dominio citoplasmático puede suprimirse, truncarse, o alterarse de otro modo. Los aminoácidos que ocurren de forma natural se dividen en grupos en base propiedades de cadena lateral comunes:

(1)

hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2)

hidrofóbicos neutros: cys, ser, thr;

(3)

ácidos: asp, glu;

(4)

básicos: asn, gln, his, lys, arg;

(5)

residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y

(6)

aromáticos: trp, tyr, phe.

Las sustituciones conservadoras implican intercambiar un miembro dentro de un grupo por otro miembro dentro del mismo grupo, mientras que las sustituciones no conservadoras comportan intercambiar un miembro de un grupo de estas clases por otro. Se realizan cambios sustanciales en la función o en la identidad inmunológica mediante sustituciones en la NRG3 que son menos conservadoras, es decir, que difieren más significativamente en su efectos sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en hoja o hélice, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Las sustituciones que, en general, se espera que produzcan los cambios mayores en las propiedades de las nuevas NRG3 nativas de la presente invención serán aquéllas en las cuales (a) un residuo hidrofílico, por ejemplo, serilo o treonilo, es sustituido por (o sustituye a) un residuo hidrofóbico, por ejemplo, leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo o alanilo; (b) una cisteína o prolina es sustituida por (o sustituye a) cualquier otro residuo; (c) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisilo, arginilo, o histidilo, es sustituido por (o sustituye a) un residuo electronegativo, por ejemplo, glutamilo o aspartilo; o (d) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo, la fenilalanina, es sustituido por (o sustituye a) uno que no tiene una cadena lateral, por ejemplo, una glicina. Se espera que tales sustituciones tengan su efecto más significativo cuando se hagan dentro del dominio extracelular, tal como en el dominio parecido al EGF.

Las variantes por sustitución de las nuevas NRG3 de la presente invención incluyen también variantes en las que dominios funcionalmente homólogos (que tienen al menos aproximadamente un 40%-50% de homología) de otras proteínas sustituyen, mediante procedimientos rutinarios, uno o más de los dominios identificados más arriba dentro de la estructura de la nueva NRG3, tales como el dominio extracelular o el dominio parecido al EGF.

Las supresiones en la secuencia de aminoácidos generalmente oscilan desde aproximadamente 1 hasta 30 residuos, más preferiblemente desde aproximadamente 1 hasta 10 residuos, y típicamente son contiguos. Típicamente, se suprimen los dominios transmembrana y citoplasmático, o sólo los dominios transmembrana. No obstante, es apropiada la supresión desde el extremo C-terminal hasta cualquier aminoácido apropiado, N-terminal respecto la región transmembrana, que preserva la actividad biológica o la reactividad cruzada inmunológica de una NRG3 nativa. En las Figuras 4A y 4B, se muestra que la región transmembrana (TM) de cada una de las secuencias consenso de la NRG3 humana o de ratón abarca desde aproximadamente el aminoácido 362 hasta aproximadamente el aminoácido 384 (humana, SEC. Nº ID.:6 y SEC. Nº ID.:23), y aproximadamente desde el aminoácido 360 hasta aproximadamente el aminoácido 382 (ratón, SEC. Nº ID.:2).

Una clase preferida de variantes por sustitución y/o supresión de la presente invención son aquéllas que implican una región transmembrana de una nueva molécula de NRG3. Las regiones transmembrana son dominios altamente hidrofóbicos o lipofílicos que tienen el tamaño apropiado para abarcar la bicapa lipídica de la membrana celular. Se cree que anclan la NRG3 en la membrana celular, y que permiten la formación del complejo homo- o heteropolimérico. La inactivación del dominio transmembrana, típicamente mediante supresión o sustitución de los residuos de hidroxilación del dominio transmembrana, facilitará la recuperación y la formulación reduciendo su afinidad por los lípidos de la membrana o celulares, y mejorando su solubilidad acuosa. Si se suprimen los dominios transmembrana y citoplasmático se evita la introducción de epítopos potencialmente inmunogénicos, sea por exposición de los polipéptidos de otro modo intracelulares, que pueden ser reconocidos por el cuerpo como extraños, sea por inserción de polipéptidos heterólogos que son potencialmente inmunogénicos. La inactivación de la función de inserción en la membrana es consigue mediante la supresión de suficientes residuos para producir una perfil de hidropatía sustancialmente hidrofílico en la transmembrana, o por sustitución con residuos heterólogos que consiguen el mismo resultado.

Una ventaja principal de las variantes de las NRG3 con la transmembrana inactivada de la presente invención es que pueden secretarse al medio de cultivo de los huéspedes recombinantes. Estas variantes son solubles en fluidos corporales tales como la sangre, y no tienen una afinidad apreciable por los lípidos de la membrana celular, simplificando considerablemente de ese modo su recuperación del cultivo de células recombinantes. Como una proposición general, tales variantes solubles retendrán un dominio extracelular funcional o fragmento del mismo, no tendrán un dominio transmembrana funcional, y preferiblemente no tendrán un dominio citoplasmático funcional.

Por ejemplo, el dominio transmembrana puede sustituirse por cualquier secuencia de aminoácidos, por ejemplo, una secuencia aleatoria o predeterminada de aproximadamente 5 a 50 serinas, treoninas, lisinas, argininas, glutaminas, ácidos glutámicos, y residuos hidrofóbicos similares, los cuales juntos exhiben un perfil de hidropatía hidrofílico. Al igual que las variantes solubles por supresión (truncadas), estas variantes se secretan al medio de cultivo de los huéspedes recombinantes.

Las inserciones de aminoácidos incluyen las fusiones amino- y/o carboxi-terminales que oscilan en longitud desde un residuo hasta polipéptidos que contienen un centenar o más residuos, así cmoo las inserciones intrasecuencia de un único o múltiples residuos aminoácidos. Las inserciones intrasecuencia (es decir, inserciones dentro de la secuencia de aminoácidos de la nueva NRG3) pueden oscilar generalmente desde aproximadamente 1 hasta 10 residuos, más preferiblemente desde aproximadamente 1 hasta 5 residuos, y más preferiblemente de 1 a 3 residuos. Un ejemplo de una inserción terminal incluye la fusión de una secuencia señal N-terminal heteróloga al extremo N-terminal de la molécula NRG3 para facilitar la secreción de la NRG3 madura, o de un fragmento de la misma, desde las células huésped recombinantes. Tales secuencias señal generalmente se obtendrán de una secuencia señal de las especia de la célula huésped prevista, y por tanto serán homólogas. Las secuencias apropiadas incluyen la ST1I o Ipp para E. coli, el factor alfa para levadura, y las señales vírica tales como la gD del herpes para las células de mamífero.

Otras variantes por inserción de las moléculas de NRG3 nativa incluyen la fusión de los extremos N- o C-terminales de la molécula de NRG3 a polipéptidos inmunogénicos, por ejemplo, a polipéptidos bacterianos tales como la beta-lactamasa o a un enzima codificado por el locus trp de E. coli, o a una proteína de levadura, y las fusiones C-terminales con proteínas que tienen una prolongada vida media, tales como las regiones de inmunoglobulina (preferiblemente regiones constantes de inmunoglobulina), la albúmina, la ferritina, según se describe en WO 89/02922, publicada el 6 de abril de 1989.

Otras variantes por inserción adicionales son los derivados inmunológicamente activos de las nuevas NRG3, los cuales comprenden el dominio parecido al EGF y un polipéptido que contiene un epítopo de un polipéptido extrañó inmunológicamente competente, es decir, un polipéptido que es capaz de elicitar una respuesta inmune en el animal al cual ha de administrarse la fusión, o que es capaz de ser unido por un anticuerpo generado contra un polipéptido extraño. Los ejemplos típicos de tales polipéptidos inmunológicamente competentes son los alérgenos, los epítopos autoinmunes, u otros potentes inmunogenes o antígenos reconocidos por anticuerpos preexistentes en el receptor de la fusión, incluyendo los polipéptidos bacterianos tales como el trpLE, la \beta-galactosidasa, los polipéptidos víricos tales como la proteína gD del herpes, y similares.

Las fusiones inmunogénicas se producen mediante entrecruzamiento in vitro o mediante el cultivo de células transformadas con ADN recombinante que codifica un polipéptido inmunogénico. Es preferible que la fusión inmunogénica es una en la cual la secuencia inmunogénica se une a, o se inserta dentro de una nueva molécula de NRG3 o un fragmento de la misma mediante uno o más enlaces peptídicos. Por tanto, estos productos consisten en una cadena polipeptídica lineal que contiene el epítopo de la NRG3 y al menos un epítopo extraño a la NRG3. Se sobrentenderá que, introducir los epítopos en cualquier lugar dentro de una molécula de NRG3 de la presente invención, o de un fragmento de la misma, se haya dentro del ámbito de esta invención. Estas inserciones inmunogénicas son particularmente útiles cuando se formulan en un portador farmacéuticamente aceptable, y se administran a un sujeto con objeto de generar anticuerpos contra la molécula de NRG3, anticuerpos que, a su vez, son útiles como diagnóstico, en la tipificación de tejidos, o en la purificación de las nuevas NRG3 mediante técnicas de inmunoafinidad estándares. Alternativamente, en la purificación de la NRG3 de la presente invención, los patrones de unión para el polipéptido extraño fusionado, por ejemplo, anticuerpos, receptores o ligandos, se usan para adsorber la fusión aparte de las mezclas impuras, después de lo cual se eluye la fusión y, si se desea, se recupera la nueva NRG3 de la fusión, por ejemplo, mediante corte enzimático.

Puesto que, a menudo, es difícil predecir por adelantado las características de una NRG3 variante, se apreciará que será necesario algún cribado para seleccionar la variante óptima. Tal cribado incluye, pero no se limita a, las matrices de unión al receptor ErbB4.

Después de identificar la mutación o mutaciones deseadas, el gen que codifica la variante de la NRG3 puede, por ejemplo, obtenerse mediante síntesis química, tal y como se describe en la presente invención. Más preferiblemente, el ADN que codifica una variante de la secuencia de aminoácidos de la NRG3 se prepara mediante mutagénesis dirigida del ADN que codifica una variante preparada con anterioridad o una versión que no es variante de la NRG3. La mutagénesis dirigida (específica para un sitio) permite la producción de variantes de la NRG3 a través del uso de secuencias de oligonucleótidos específicas que codifican la secuencia de ADN de la mutación deseada, así como un número suficiente de nucleótidos adyacentes, para proporcionar una secuencia cebadora de un tamaño y complejidad de secuencia suficientes para formar un dúplex estable en ambos lados de la unión de supresión que se está atravesando. Típicamente, se prefiere un cebador de aproximadamente 20 a 25 nucleótidos, con aproximadamente de 5 a 10 residuos en ambos lados de la unión de la secuencia que se está alterando. En general, las técnicas de la mutagénesis específica para un sitio son bien conocidas en el estado de la técnica, como lo ejemplifican publicaciones tales como, Edelman et al., DNA, 2:183 (1983). Como será apreciado, la técnica de la mutagénesis específica de un sitio típicamente emplea un vector de fago que existe tanto en forma de hebra sencilla como en forma de doble hebra. Los vectores típicos útiles en la mutagénesis dirigida incluyen vectores tales como el fago M13, por ejemplo, tal como es descrito por Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981). Este y otros vectores de fagos están disponibles comercialmente, y su uso es bien conocido por los especialistas en la técnica. Zoller, M.J. y Smith, M., Nucleic Acids Res., 10:6487-6500 (1982)) publicaron un procedimiento versátil y eficiente para la construcción de mutaciones específicas de un sitio, dirigidas por oligodesoxiribonucleótidos en fragmentos de ADN, usando vectores derivados de M-13. También pueden emplearse vectores que contienen un origen de replicación de fago, de hebra sencilla (Veira et al., Meth. Enzymol., 153:3 (1987)) para obtener ADN de hebra sencilla. Alternativamente, las sustituciones de nucleótidos se introducen sintetizando in vitro el fragmento de ADN apropiado, y amplificándolo mediante procedimientos de la PCR conocidos en el estado de la técnica.

La técnica de la amplificación mediante la PCR puede usarse también para crear variantes de la secuencia de aminoácidos de una nueva NRG3. En un ejemplo específico de mutagénesis mediante la PCR, el ADN de plásmido plantilla (1 \mug) se linealiza mediante digestión con una endonucleasa de restricción que tiene un único sitio de reconocimiento en el ADN del plásmido fuera de la región a amplificar. De este material, 100 ng se añaden a una mezcla de la PCr que contiene tampón de la PCR, el cual contiene los cuatro desoxinucleótidos trifosfatos y está incluido en los equipos GeneAmp^{R} (obtenidos de Perkin-Elmer Cetus, Norwatk, CT y Emeryville, CA), y 25 pmoles de cada cebador oligonucleotídico, hasta un volumen final de 50 \mul. La mezcla de reacción se recubre con 35 \mul de aceite mineral. La reacción se desnaturaliza durante 5 minutos a 100ºC, se coloca brevemente sobre hielo, y a continuación se añade 1 \mul de ADN polimerasa de Thermus aquaticus (Taq) (5 unidades/ 1), comprada a Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT y Emeryville, CA) debajo de la capa de aceite mineral. La mezcla de reacción se inserta a continuación en un Thermal Cycler de ADN (Perkin-Elmer Cetus) programado como sigue:

(como un ejemplo)

2 minutos a 55ºC,

30 s a 72ºC, a continuación 19 ciclos de:

30 s a 94ºC,

30 s a 55ºC, y

30 s a 72ºC.

Al final del programa, el vial de reacción se retira del ciclador térmico y la fase acuosa se transfiere a un nuevo vial, se extrae con fenol/cloroformo (50:50), y se precipita con etanol, y el ADN se recupera mediante procedimientos estándares. Esta materia se somete posteriormente a los tratamientos apropiados para su inserción en un vector.

La mutagénesis por inserción de un casete es otro procedimiento útil para preparar variantes, y se basa en la técnica descrita por Wells et al., Gene, 34:315 (1985).

Adicionalmente, el denominado procedimiento de exhibición en fagómido puede ser útil para preparar variantes de la secuencia de aminoácidos de NRG3 nativa o variante, o de sus fragmentos. Este procedimiento implica 1) construir un vector de expresión replicable que comprende un primer gen que codifica un receptor a mutar, un segundo gen que codifica al menos una porción de una proteína de cubierta de fago natural o del tipo salvaje, en donde el primer y segundo genes son heterólogos, y un elemento regulador de la transcripción unido operativamente al primer y segundo genes, formando de ese modo una fusión de genes que codifica una proteína de fusión; 2) mutar el vector en una o más posiciones seleccionadas dentro del primer gen, formando de ese modo una familia de plásmidos relacionados; 3) transformar células huéspedes apropiadas con los plásmidos; 4) infectar las células huéspedes transformadas con un fago auxiliar que tiene un gen que codifica la proteína de cubierta del fago; 5) cultivar las células huéspedes infectadas y transformadas en condiciones apropiadas para la formación de partículas del fagómido recombinante que contienen al menos una porción del plásmido, y son capaces de transformar el huésped, estando las condiciones ajustadas de forma que sólo una pequeña cantidad de partículas del fagómido exhiban más de una copia de la proteína de fusión sobre la superficie de la partícula; 6) poner en contacto las partículas de fagómido con una antígeno apropiado de forma que, al menos una porción de las partículas de fagómido se unan al antígeno; y 7) separar las partículas de fagómido que se unen de las que no lo hacen. Los pasos 4 a 7 pueden repetirse una o más veces. Preferiblemente, en este procedimiento el plásmido está bajo el control riguroso del elemento regulador de la transcripción, y las condiciones de cultivo se ajustan para que la cantidad o número de partículas de fagómido que exhiben más de una copia de la proteína de fusión sobre la superficie de la partícula sea inferior a aproximadamente un 1%. También, preferiblemente, la cantidad de partículas de fagómido que exhiben más de una copia de la proteína de fusión es menos del 10% de la cantidad de partículas de fagómido que exhiben una única copia de la proteína de fusión. Los más preferiblemente, la cantidad es inferior al 20%. Típicamente, en este procedimiento, el vector de expresión contendrá además una secuencia señal secretora fusionada al ADN que codifica cada subunidad del polipéptido, y el elemento regulador de la transcripción será un sistema promotor. Los sistemas promotores preferidos se seleccionan de entre lac Z, \lambda_{PL}, tac, polimerasa de T7, promotores de la triptófano fosfatasa y de la fosfatasa alcalina, y combinaciones de los mismos. También, normalmente el procedimiento empleará un fago auxiliar seleccionado de entre M 13K07, M 13R408, M 13-VCS, y Phi X 174. El fago auxiliar preferido es el M 13K07, y la proteína de cubierta preferida es la proteína de cubierta del gen III del fago M 13. El huésped preferido es E. coli, y las cepas de E. coli deficientes en proteasas.

Los detalles adicionales de las técnicas de mutagénesis precedentes y otras similares se hallan en libros de texto generales, tales como, por ejemplo, Sambrook et al., supra, y Current Protocols in Molecular Biology, editores Ausubel et al., supra.

F. Variantes de glicosilación

Las variantes de glicosilación de incluyen dentro del ámbito de la presente invención. Incluyen variantes que carecen completamente de glicosilación (no glicosiladas), variantes que tienen al menos un sitio glicosilado menos que la forma nativa (desglicosiladas), así como variantes en las que la glicosilación ha cambiado. Se incluyen las variantes de las secuencias de aminoácidos desglicosilada y no glicosiladas, las NRG3 nativas desglicosilada y no glicosiladas, o fragmentos de las mismas y otras variantes de glicosilación. Por ejemplo, la mutagénesis por sustitución o supresión puede emplearse para eliminar los sitios de glicosilación unidos a N- u O- en una NRG3 nativa o variante de la presente invención, por ejemplo, el residuo asparagina puede suprimirse o sustituirse por otro residuo básico, tal como la lisina o la histidina. Alternativamente, los residuos flanqueadores pueden sustituirse o suprimirse, aunque los residuos asparagina permanezcan inalterados, con objeto de impedir la glicosilación mediante la eliminación del sitio de reconocimiento de la glicosilación. Cunado la variante NRL preferida es el dominio parecido al EGF de la NRG3, el fragmento está preferiblemente no glicosilado.

Adicionalmente, las NRG3 no glicosiladas que tienen el sitio de glicosilación de una molécula nativa pueden producirse en cultivos de células procariotas recombinantes, puesto que las procariotas son incapaces de introducir glicosilación en los polipéptidos.

Las variantes de glicosilación pueden producirse mediante células huéspedes apropiadas o mediante procedimientos in vitro. Las células de levadura y de insecto, por ejemplo, introducen glicosilación que varía significativamente de la de los sistemas de mamífero. De forma similar, las células de mamífero que tienen origen en una especie (por ejemplo, de hámster, múridas, porcinas, bovinas, u ovinas) o tejido (por ejemplo, pulmón, hígado, linfoides, mesenquimales o epidérmicas) distinto de la fuente de la NRG3 se examinan de forma rutinaria por su capacidad para introducir glicosilación variante, tal y como se caracteriza, por ejemplo, por los niveles elevados de manosa o las proporciones variantes de manosa, fucosa, ácido siálico, y otros azúcares que se hallan típicamente en las glicoproteínas de mamífero. El procesamiento in vitro de la NRG3 típicamente se consigue mediante hidrólisis enzimática, por ejemplo, dirección con neuraminidasa.

G. Modificaciones covalentes

Las modificaciones covalentes de las nuevas NRG3 de la presente invención es incluyen en el ámbito de la presente invención. Tales modificaciones se introducen tradicionalmente haciendo reaccionar los residuos aminoácidos diana con un agente de derivación orgánico que es capaz de reaccionar con las cadenas laterales de aminoácidos o residuos terminales seleccionados, o aprovechando los mecanismos de modificaciones posteriores a la traducción que funcionan en las células huésped recombinantes seleccionadas. Los derivados covalentes resultantes son útiles en programas dirigidos a identificar residuos importantes para la actividad biológica, para inmunoensayos de la NRG3, o para la preparación de anticuerpos anti-NRG3 para la purificación del recombinante por inmunoafinidad. Por ejemplo, la completa inactivación de la actividad biológica de la proteína después de la reacción con ninhidrina sugiere que al menos un residuo arginilo o lisilo es crítico para su actividad, después de esto, se identifican los residuos individuales, que se modificaron en las condiciones seleccionadas, aislando un fragmento de péptido que contiene el residuo aminoácido modificado. Tales modificaciones se hallan dentro de la formación ordinaria en la técnica, y se realizan sin excesiva experimentación.

La derivatización con agentes bifuncionales es útil para preparar agregados intramoleculares de las NRG3 con polipéptidos, así como para el entrecruzamiento del polipéptido de la NRG3 con un matriz de soporte insoluble al agua o una superficie, para su uso en ensayos o purificaciones por afinidad. Además, un estudio de los entrecruzamientos intercatenarios proporcionará información directa sobre la conformación estructural. Los agentes de entrecruzamiento usados comúnmente incluyen el 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, el glutaraldehído, los ésteres de N-hidroxisuccinimida, los imidoésteres homobifuncionales, y las maleimidas bifuncionales. Los agentes derivatizantes tales como el metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato rinden intermediarios fotoactivables que son capaces de formar entrecruzamientos en presencia de luz. Alternativamente, se emplean matrices insolubles en agua y reactivas, tales como los carbohidratos activados con bromuro de cianógeno, y los sistemas de sustratos reactivos descritos en las Patentes Estadounidenses nº 3.959.642; 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128, 4.247.642: 4.229.537; 4.055.635; y 4.330.440, para la inmovilización y entrecruzamiento de proteínas.

Ciertas modificaciones posteriores a la traducción son el resultado de la acción de las células huésped recombinantes sobre los polipéptidos expresados. Los residuos glutaminilo y asparaginilo son frecuentemente desamidados a los correspondientes residuos glutamilo y aspartilo. Alternativamente, estos residuos son desamidados en condiciones ligeramente ácidas. Cualquier forma de estos residuos se halla dentro del ámbito de esta invención.

Otras modificaciones posteriores a a la traducción incluyen, la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de los grupos hidroxilo de los residuos serilo, tirosilo o treonilo, la metilación de los grupos \alpha-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)).

Otros derivados de las NRG3 en la presente invención son las denominadas "inmunoadhesinas", que son moléculas quiméricas parecidas a anticuerpos que combinan el(los) dominio(s) funcional(es) de una proteína unidora (usualmente un receptor, una molécula de adhesión celular, o un ligando) con una secuencia de inmunoglobulina. El ejemplo más común de este tipo de proteína de fusión combina las regiones gozne y Fc de una inmunoglobulina (Ig) con dominios de un receptor de la superficie celular que reconoce un ligando específico. Este tipo de molécula se denomina "inmunoadhesina", puesto que combina las funciones "inmune" y de "adhesión"; otros nombres frecuentemente usados son las "Ig-quimera", "Ig-" o "proteína de fusión-Fc", o "receptor-globulina".

Las inmunoadhesinas descritas en la literatura incluyen, por ejemplo, las fusiones del receptor de la célula T (Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:2936-2940 (1987)); CD4 (Capon et al., Nature, 337:525-531 (1989); Traunecker et al., Nature, 339:68-70 (1989); Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA, 9:347-353 (1990); Byrn et al., Nature, 344:667-670 (1990)); L-seNRG3 (receptor de regreso) (Watson et al., J. Cell. Biol., 110:2221-2229 (1990)); Watson et al., Nature, 349:164-167 (1991)); E-seNRG3 (Mulligan et al., J. Immunol., 151:6410-6417 (1993); Jacob et al., Biochemistry, 34:1210-1217 (1995)); P-seNRG3 (Mulligan et al., supra; Hollenbaugh et al., Biochemistry, 34:5678-5684 (1995)); ICAM-1 (Stauton et al., J. Exp. Med., 176:1471-1476 (1992); Martin et al., J. Virol., 67:3561-3568 (1993); Roep et al., Lancet, 343:1590-1593 (1994)); ICAM2 (Damle et al., J. Immunol., 148:665-671 (1992)); ICAM-3 (Holness et al., J. Biol. Chem., 270:877-884 (1995)); LFA-3 (Kanner et al., J. Immunol., 148:23-29 (1992)); glicoproteína L1 (Doherty et al., Neuron, 14:57-66 (1995)); TNF-R1 (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:10535-10539 (1991)); Lesslauer et al., Eur. J. Immunol., 21:2883-2886 (1991); Peppel et al., J. Exp. Med., 174:1483-1489 (1991)); TNF-R2 (Zack et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2335-2339 (1993); Wooley et al., J. Immunol., 151:6602-6607 (1993)); CD44 (Aruffo et al., Cell, 61:1303-1313 (1990)); CD28 y B7 (Linsley et al., J. Exp. Med., 173:721-730 (1991)); CTLA-4 (Lisley et al., J. Exp. Med., 174:561-569 (1991)); CD22 (Stamenkovic et al., Cell, 66:1133-1144 (1991)); receptores NP (Bennett et al., J. Biol. Chem., 266:23060-23067 (1991)); receptor \alpha de IgE (Ridgway y Gorman, J. Cell. Biol., 115:1448 resumen (1991)); cadena \alpha- y \beta del IFN-\gammaR (Marsters et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:5401-05 (1995)); trk-A, -B, y -C (Shelton et al., J. Neurosci., 15:477-491 (1995)); IL-2 (Landolfi, J. Immunol., 21 146:915-919 (1991)); IL-10 (Zheng et al., J. Immunol., 154:5590-5600 (1995)).

El diseño más simple y más sencillo de inmunoadhesina combina la región o regiones de la proteína adhesina con las regiones gozne y Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina. Ordinariamente, cuando se preparan las quimeras NRG3-inmunoadhesina de la presente invención, el ácido nucleico que codifica el polipéptido de la NRG3 deseada se fusionará, en el extremo C-terminal de la secuencia deseada, al extremo N-terminal de una secuencia de ácido nucleico que codifica el una secuencia de dominio constante de una inmunoglobulina, sin embargo, también es posible la fusión al extremo N-terminal de la secuencia NRG3 deseada. Típicamente, en tales fusiones el polipéptido quimérico codificado retendrá al menos los dominios gozne, CH2 y CH3 funcionalmente activos de la región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina. Las fusiones también se hacen al extremo C-terminal de la porción Fc de un dominio constante, o inmediatamente N-terminales respecto el CH1 de la cadena pesada o la región correspondiente en la cadena ligera. El sitio preciso en el que se hace la fusión no es crítico; los sitios concretos son bien conocidos y podrían seleccionarse con objetos de optimizar la actividad biológica, la secreción o las características de unión de las quimeras NRG3-inmunoglobulina.

En una realización preferida, la secuencia de un polipéptido de NRG3 madura, nativa, o una forma soluble de la misma, tal como una forma don dominio transmembrana inactivado o una polipéptido del dominio parecido al EGF, se fusiona al extremo N-terminal de la porción C-terminal de un anticuerpo (en particular, el dominio Fc), que contiene las funciones efectoras de una inmunoglobulina, por ejemplo, la IgG-1. Es posible fusionar la región constante entera de la cadena pesada a la secuencia de la NRG3. Sin embargo, más preferiblemente, en la fusión se usa una secuencia que empieza en la región gozne, justo cadena arriba del sitio de corte con papaína (el cual define químicamente la Fc de IgG: residuo 216, tomando el 114 como primer residuo de la región constante de la cadena pesada (Kobet et al., supra), o sitios análogos de otras inmunoglobulinas). En una realización particularmente preferida, la secuencia de la NRG3 (de longitud completa o soluble) se fusiona a la región gozne y CH2 y CH3, o a los dominios CH1, gozne, CH2 y CH3 de una cadena pesada de IgG-1, IgG-2, o IgG-3. El sitio preciso en el que se realiza la fusión no es crítico, y el sitio óptimo puede determinarse mediante experimentación rutinaria.

En algunas realizaciones, las quimeras NRG3-inmunoglobulina se ensamblan como multímeros, y particularmente como homodímeros o tetrámeros (WO-91/08298). Generalmente, estas inmunoglobulinas ensambladas tendrán estructuras unitarias conocidas. La forma en la que existen las IgG, IgD e IgE es una unidad estructural básica de cuatro cadenas. En las inmunoglobulinas de mayor peso molecular se repite una unidad de cuatro cadenas; la IgM existe como un pentámero de cuatro unidades básicas mantenidas juntas mediante enlaces disulfuro. La globulina IgA, y ocasionalmente la globulina IgG, también pueden existir en forma multimérica en el suero. En el caso del multímero, cada una de las cuatro unidades puede ser la misma o diferente.

Varias quimeras NRG3-inmunoadhesina ensambladas, ilustrativas dentro del ámbito de la presente, se diagraman esquemáticamente más abajo:

(a)

AC_{L}-AC_{L};

(b)

AC_{H}-[AC_{H}, AC_{L}-AC_{H}, AC_{L},-V_{H}C_{H}, o V_{L}C_{L}-AC_{H}];

(c)

AC_{L}-AC_{H}-[AC_{L}-AC_{H}, AC_{L}-V_{H}C_{H}, V_{L}C_{L}-AC_{H}, o V_{L}C_{L}-V_{H}C_{H}];

(d)

AC_{L}-V_{H}C_{H}-[AC_{H}, o AC_{L}-V_{H}C_{H}, o V_{L}C_{L}-AC_{H}];

(e)

V_{L}C_{L}-AC_{H}-[AC_{L}-V_{H}C_{H}, o V_{L}C_{L}-AC_{H}]; y

(f)

[A-Y]_{n}-[V_{L}C_{L}-V_{H}C_{H}]_{2},

\newpage

en donde

cada A representa secuencias de aminoácidos del polipéptido de NRG3 idénticas o diferentes;

V_{L} es un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina;

V_{H} es un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina;

C_{L} es un dominio constante de cadena ligera de inmunoglobulina;

C_{H} es un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina;

n es un entero superior a 1;

Y designa el residuo de un agente entrecruzador covalente.

En interés de la brevedad, las estructuras anteriores sólo muestran las características claves: no indican la unión (J) u otros dominios de las inmunoglobulinas, tampoco se muestran los enlaces disulfuro. Sin embargo, cuando tales dominios se requieren para la actividad de unión, debe considerarse que están presentes en las ubicaciones ordinarias que ocupan en las moléculas de inmunoglobulina.

Aunque la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina no es necesario en las inmunoadhesinas de la presente invención, una cadena ligera de inmunoglobulina puede estar presente, o asociada covalentemente a un polipéptido de fusión de NRG3-cadena pesada de inmunoglobulina, o fusionada directamente a la NRG3. En el primer caso, el ADN que codifica la cadena ligera de una inmunoglobulina se coexpresa típicamente con el ADN que codifica la proteína de fusión NRG3-cadena pesada de inmunoglobulina. A partir de la secreción, la cadena pesada híbrida y la cadena ligera estarán asociadas covalentemente para proporcionar un estructura similar a un inmunoglobulina, la cual comprende dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina unidos por disulfuros. Los procedimientos apropiados para la preparación de tales estructuras se descubren, por ejemplo, en la Patente Estadounidense nº 4.816.567, concedida el 28 de marzo de 1989.

En una realización preferida, las secuencias de inmunoglobulina usadas en la construcción de las inmunoadhesinas de la presente invención procedente de un dominio constante de cadena pesada de la inmunoglobulina IgG. Para la inmunoadhesinas humanas, se prefiere el uso de las secuencias de las inmunoglobulinas IgG-1 e IgG-3 humanas. Una ventaja principal de usar la IgG-1 es que las inmunoadhesinas de IgG-1 pueden purificarse eficientemente sobre proteína A inmovilizada. Por contra, la purificación de la IgG-3 requiere proteína G, una medio significativamente menos versátil. No obstante, deberían considerase otras propiedades estructurales y funcionales de las inmunoglobulinas cuando se escoja la Ig pareja de fusión para una determinada construcción de inmunoadhesina. Por ejemplo, el gozne de la IgG-3 es más largo y más flexible, de forma que puede acomodar dominios "adhesina" mayores que no pueden plegarse o funcionar correctamente cuando se fusionan a IgG-1. Mientras que las inmunoadhesinas de IgG son típicamente mono- o bivalentes, otros subtipos de Ig como la IgA y la IgM pueden dar lugar respectivamente a estructuras diméricas o pentaméricas de la unidad homodimérica de Ig básica. Las inmunoadhesinas multiméricas son ventajosas en tanto que pueden unir sus respectivas dianas con mayor avidez que sus contrapartidas basadas en la IgG. Los ejemplos descritos de tales estructuras son la CD4-IgM (Traunecker et al., supra); la ICAM-IgM (Martin et al., J. Virol., 67:3561-3568 (1993)); y la CD2-IgM (Arulanandam et al., J. Exp. Med., 177:1439-1450 (1993)).

Para las inmunoadhesinas NRG3-Ig, que están diseñadas para su aplicación in vivo, son también importantes las propiedades farmacocinéticas y las funciones efectoras especificadas por la región Fc. Aunque la IgG-1, IgG-2 e IgG-4 tienen todas vidas medias in vivo de 21 días, sus potencias relativas para activar el sistema de complemento son diferentes. La IgG-4 no activa el complemento, y la IgG-2 es significativamente más débil en la activación del complemento que la IgG-1. Más aún, a diferencia de la IgG-1, la IgG-2 no se une a receptores de Fc sobre células mononucleares o neutrófilos. Mientras que la IgG-3 es óptima para la activación del complemento, su vida in vivo es aproximadamente un tercio de la de los otros isotipos de la IgG. Otra consideración importante para las inmunoadhesinas diseñadas para ser usada como agentes terapéuticos humanos, es el número de variantes alotípicas del isotipo particular. En general, se prefieren los isotipos de la IgG con menos alotipos serológicamente definidos. Por ejemplo, la IgG-1 tiene sólo cuatro sitios alotípicos serológicamente definidos, dos de los cuales (G1m y 2) están ubicados en la región Fc; y uno de estos sitios, G1m1, no es inmunogénico. Por contra, hay 12 alotipos definidos serológicamente en la IgG-3, todos los cuales están en la región Fc; sólo tres es estos sitios (G3m5, 11 y 21) tiene un alotipo que no es inmunogénico. Por tanto, la inmunogenicidad potencial de un inmunoadesina \gamma3 es mayor que la de una inmunoadhesina \gamma1.

La forma más conveniente de construir las inmunoadhesinas NRG3-Ig es fusionando la secuencia de ADNc que codifica la porción NRG3 en pauta con una secuencia de ADNc de Ig. No obstante, también puede usarse la fusión a fragmentos genómicos de Ig (consultar, por ejemplo, Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:2936-2940 (1987); Aruffo et al., Cell, 61:1303-1313 (1990); Stamenkovic et al., Cell, 66:1133-1144 (1991)). El último tipo de fusión requiere la presencia de secuencias reguladoras de Ig para la expresión. Los ADNc que codifican las regiones constantes de la cadena pesada de IgG pueden aislarse en base a secuencias publicadas procedentes de bibliotecas de ADNc derivadas de linfocitos del bazo o de la sangre periférica, mediante técnicas de hibridación o de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Otros derivados de las nuevas NRG3 de la presente invención, que poseen una vida media más larga que las moléculas nativas, comprende la NRG3, fragmentos de la NRG3 (tales como el dominio parecido al EGF), o una quimera NRG3-inmunoglobulina, unidos covalentemente a un polímero no proteico. El polímero no proteico ordinariamente es un polímero sintético hidrofílico, es decir, un polímero no es halla en la naturaleza de que otro modo. Sin embargo, son útiles los polímeros que existen en la naturaleza y son producidos por procedimientos recombinantes o in vitro, al igual que lo son los polímeros que se ha aislado a partir de fuentes nativas. Los polímeros de polivinilo hidrofílicos se hallan dentro del ámbito de esta invención, por ejemplo, el polivinilalcohol y la polivinilpirrolidona. Son particularmente útiles los éteres polialquilenos tales como el polietilenglicol (PEG; los polialquilenos tales como el polioxietileno, polioxipropileno, y los copolímeros de bloque de polioxietileno y polioxipropileno (Pluronics); los polimetacrilatos; los carbómeros; los polisacáridos ramificados o no ramificados que comprenden los monómeros de sacárido D-manosa, D- y L-galactosa, fucosa, fructosa, D-xilosa, L-arabinosa, ácido D-glucurónico, ácido siálico, ácido D-galacturónico, ácido D-manurónico (por ejemplo, el ácido polimanurónico, o el ácido algínico), D-glucosamina, D-galactosamina, D-glucosa y ácido neuramínico, incluyendo los homopolisacáridos y los heteropolisacáridos tales como la lactosa, amilopectina, almidón, hidroxietilalmidón, amilosa, sulfato de dextrano, dextrano, dextrinas, glucógeno, o las subunidades de polisacárido de los ácidos mucopolisacáridos, por ejemplo, el ácido hialurónico; los polímeros de alcoholes azúcar tales como el polisorbitol y polimanitol; la heparina o el heparón. El polímero antes del entrecruzamiento no tiene porque ser, pero preferiblemente es, soluble en agua, pero el conjugado final debe ser soluble en agua. Además, el polímero no debería ser altamente inmunogénico en la forma conjugada, ni debería poseer una viscosidad que es incompatible con la infusión o inyección intravenosa si se pretende administrarlo por
tales rutas.

Preferiblemente, el polímero contiene sólo un único grupo que es reactivo. Esto ayuda a evitar el entrecruzamiento de las moléculas de proteína. No obstante, se halla dentro del ámbito de la presente invención el optimizar las condiciones de reacción para reducir el entrecruzamiento, o para purificar los productos de reacción, a través de tamices de filtración en gel o cromatográficos, para recuperar derivados sustancialmente homogéneos.

El peso molecular del polímero puede oscilar deseablemente desde aproximadamente 100 hasta 500.000, y preferiblemente va desde aproximadamente 1000 hasta 20.000. El peso molecular escogido dependerá de la naturaleza del polímero y del grado de sustitución. En general, cuanto mayor sea la hidrofobicidad del polímero, y cuanto mayor sea el grado de sustitución, menor será el peso molecular que puede emplearse. Los pesos moleculares óptimos se determinarán mediante experimentación rutinaria.

El polímero generalmente se une covalentemente a la nueva NRG3, fragmento de la NRG3, o a las quimeras NRG3-inmunoglobulina a través de un agente entrecruzador multifuncional, el cual reacciona con el polímero en uno o más aminoácidos o residuos azúcares de la NRG3 o de la quimera NRG3-inmunoglobulina que ha de unirse. No obstante, se halla dentro del ámbito de la invención entrecruzar directamente el polímero haciendo reaccionar un polímero derivatizado con el híbrido, o viceversa.

El sitio de entrecruzamiento covalente en la NRG3 o NRG3-Ig incluye el grupo amino N-terminal y el grupo épsilon-amino hallado en los residuos lisina, así como los otros grupos amino, iminio, carboxilo, sulfhidrilo, hidroxilo, u otros grupos hidrofílicos. El polímero puede unirse de forma covalente directamente al híbrido sin el uso de un agente entrecruzador multifuncional (ordinariamente bifuncional). La unión covalente a grupos amino se consigue mediante reacciones químicas conocidas basadas en el cloruro de cianuro, el carbonildiimidazol, los grupos reactivos aldehído (alcóxido de PEG más dietilacetal de bromoacetaldehído; PEG más DMSO y anhídrido acético, o cloruro de PEG más el fenóxido de 4-hidroxibenzaldehído, ésteres activos de succinimidilo, PEG ditiocarbonato activado, PEG activado con 2,4,5-triclorofenilcloroformato o P-nitrofenilcloroformato). Los grupos carboxilo se derivatizan acoplándoles una PEG-amina usando carbodiimida.

Los polímeros se conjugan a los grupos oligosacáridos mediante oxidación usando agentes químicos, por ejemplo, el metaperiodato, o enzimas, por ejemplo, la glucosa o galactosa oxidasa, (cualquiera de los cuales produce el derivado aldehído del carbohidrato), seguidos por reacción con hidrazida o polímeros derivados con hidrazida o amino, de la misma forma descrita por Heitzmann et al., P.N.A.S., 71:3537-3541 (1974) o Bayer et al., Methods in Enzymology, 62:310 (1979), para el marcado de oligosacáridos con biotina o avidina. Además, otros procedimientos químicos o enzimáticos que se han usado hasta el momento para unir oligosacáridos son particularmente ventajosos porque, en general, hay menos sustituciones que sitios en aminoácidos para la derivatización, y los productos serán por tanto más homogéneos. Los sustituyentes oligosacárido también se modifican opcionalmente mediante digestión enzimática para eliminar azúcares, por ejemplo, mediante digestión con neuraminidasa, antes de la derivatización del polímero.

El polímero portará un grupo que es directamente reactivo con una cadena lateral de aminoácido, o el extremo N- o C-terminal del polipéptido unido, o que es reactivo con el agente entrecruzador multifuncional. En general, los polímeros portadores de tales grupos reactivos son conocidos para la preparación de proteínas inmovilizadas. Con objeto de usar tales reacciones químicas aquí, uno debería emplear un polímero soluble en agua, derivatizado por otra parte de la misma forma que los polímeros insolubles empleados hasta la fecha para la inmovilización de proteínas. La activación con bromuro de cianógeno es un procedimiento particularmente útil a emplear en el entrecruzamiento de polisacáridos.

"Soluble en agua", en referencia al polímero de partida, significa que el polímero, o su intermediario reactivo usado para la conjugación, es suficientemente soluble en agua para participara en una reacción de derivatización. "Soluble en agua" en referencia al conjugado de polímero significa que el conjugado es soluble en fluidos fisiológicos tales como la sangre.

El grado de sustitución con tal polímero variará dependiendo del número de sitios reactivos sobre la proteína, de si se usa toda la proteína o un fragmento, de si la proteína es una fusión con una proteína heteróloga (por ejemplo, una quimera NRG3-inmunoglobulina), del peso molecular, de la hidrofilicidad y otras características del polímero, y de los sitios de derivatizacion concretos de la proteína escogidos. En general, el conjugado contiene aproximadamente desde 1 hasta 10 moléculas de polímero, mientras que cualquier secuencia heteróloga puede sustituirse con una número esencialmente ilimitado de moléculas de polímero con tal que la actividad deseada no se vea afectada perjudicialmente. El grado óptimo de entrecruzamiento se determina fácilmente mediante una matriz de experimentación en la cual el tiempo, la temperatura, y otras condiciones de reacción se varían para cambiar el grado de sustitución, después de lo cual se determina la capacidad de los conjugados para funcionar de la forma deseada.

El polímero, por ejemplo, PEG, se entrecruza mediante una amplia variedad de procedimientos, conocidos por sí mismos, para la modificación covalente de proteínas con polímeros no proteicos tales como el PEG. Sin embargo, algunos de estos procedimientos no son preferidos para los propósitos en la presente invención. La química del cloruro de cianuro conduce a muchas reacciones secundarias, incluyendo el entrecruzamiento de proteínas. Además, podría ser particularmente probable que condujera a la inactivación de proteínas que contengan grupos sulfhidrilo. La química del carbonildiimizadol (Beauchamp et al., Anal Biochem., 131:25-33 (1983)) requiere un pH elevado (>8,5), el cual puede inactivar las proteínas. Más aún, puesto que el intermediario "PEG activado" puede reaccionar con el agua, se requiere un exceso molar muy elevado de "PEG activado" respecto proteína. Las concentraciones elevadas de PEG requeridas para la química del carbonildiimidazol también conducen a problemas en la purificación, puesto que tanto la cromatografía de filtración en gel como la cromatografía de interacción hidrofílica se ven desfavorablemente afectadas. Además, las elevadas concentraciones de "PEG activado" pueden precipitar la proteína, un problema que no se ha apuntado previamente por sí mismo (Davis, Patente Estadounidense nº 4.179.337). Por otra parte, la química del aldehído (Royer, Patente Estadounidense nº 4.002.531) es más eficiente, puesto que requiere sólo un exceso molar de PEG de 40 veces, y una incubación de 1-2 horas. Sin embargo, el dióxido de manganeso sugerido por Royer para la preparación del aldehído de PEG es problemático "a causa de la pronunciada tendencia del PEG a formar complejos con agentes oxidantes basados en metales" (Harris et al., J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed., 22: 341-352 (1984)). El uso de la oxidación Moffatt, la utilización del DMSO y del anhídrido acético obvia este problema. Además, el borohidruro de sodio sugerido por Royer debe usarse a pH elevado y tiene una tendencia significativa a reducir los enlaces disulfuro. Por contra, se prefiere el cianoborohidruro de sodio, el cual es efectivo a pH neutro y tiene una pequeña tendencia a reducir los enlaces disulfuro.

Los conjugados de larga vida media de esta invención se separan de los materiales de partida sin reaccionar mediante filtración en gel. Las especies heterólogas de los conjugados se purifican las unas de las otras de la misma forma. El polímero también puede ser insoluble en agua, como un gel hidrofílico.

La nueva NRG3s puede atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, en sistemas coloidales de suministro de fármacos (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, editor Osol A., (1980).

H. Preparación de anticuerpos (i) Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos policlonales contra una NRG3, o fragmento de la misma (tal como el dominio parecido al EGF), de la presente invención generalmente se generan en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) de la NRG3 y un adyuvante. Puede ser útil conjugar la NRG3, o un fragmento que contiene la secuencia de aminoácidos diana, a una proteína que es inmunogénica en las especies a inmunizar, por ejemplo, la hemocianina de lapa con forma de ojo de cerradura, la albúmina del suero, la tiroglobulina bovina, o el inhibidor de la tripsina de la soja, usando un agente bifuncional o derivatizador, por ejemplo, el éster maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de residuos lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl_{2}, o R^{1}N=C=NR, en donde R y R^{1} son diferentes grupos alquilo.

Los animales se inmunizan contra los conjugados o derivados inmunogénicos combinando 1 mg ó 1 \mug de conjugado (respectivamente, para conejos o ratones) con 3 volúmenes del adyuvante completo de Freud, e inyectando la solución intradérmicamente en múltiples sitios. Un mes más tarde, los animales se refuerzan con de 1/5 a 1/10 de la cantidad original del conjugado, en el adyuvante completo de Freud, mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. De 7 a 14 días más tarde, los animales se sangran y se ensaya el título en anticuerpos anti-NRG3 del suero. Los animales se refuerzan hasta que el título se estabiliza. Preferiblemente, el animal se refuerza con el conjugado de la misma NRG3, pero conjugado a una proteína diferente y/o a través de un reactivo de entrecruzamiento diferente. Los conjugados pueden prepararse también en cultivo de células recombinantes como fusiones de proteínas. También se usan agentes de agregación, tales como el alum, para potenciar la respuesta inmune.

(ii) Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales se obtienen a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que forman la población son idénticos, excepto por posibles mutaciones que ocurren de forma natural que pueden estar presentes en pequeñas cantidades. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo en el sentido que no es una mezcla de anticuerpos discretos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales anti-NRG3 de la presente invención pueden prepararse usando el procedimiento del hibridoma descrito por primera ver por Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975), o pueden prepararse mediante procedimientos de ADN recombinante (Cabilly, et al., Patente Estadounidense nº 4.816.567).

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención se aísla y secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos múridos). Las células hibridomas de la invención sirven como un fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN podría colocarse en vectores de expresión, los cuales se transfectan a continuación dentro de células huéspedes, tales como las células COS de simio, las células ováricas de hámster chino (CHO), o las células de mieloma, las cuales de otro modo no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huéspedes recombinantes. El ADN también podría modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante con dominios constantes de cadena pesada y ligera humana en lugar de las secuencias homólogas múridas, Morrison, et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 81:6851 (1984), o uniendo covalentemente a la secuencia codificante de la inmunoglobulina la totalidad o parte de la secuencia codificante de un polipéptido que no es de inmunoglobulina. De esta manera se preparan anticuerpos "quiméricos" o "híbridos" que tienen la especificidad de unión de una anticuerpo monoclonal de NRG3 en la presente invención.

Típicamente, tales polipéptidos que no son de inmunoglobulina se sustituyen en lugar de los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o se sustituyen en lugar de los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico, el cual comprende un sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad por una NRG3 y otro sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad por un antígeno diferente.

Los anticuerpos quiméricos o híbridos pueden prepararse también in vitro usando procedimientos conocidos en la química de proteínas sintéticas, incluyendo aquéllos que implican agentes entrecruzadores. Por ejemplo, pueden construirse inmunotoxinas usando una reacción de intercambio de disulfuro, o formando un enlace tioéter. Los ejemplos de reactivos apropiados para este propósito incluyen el iminotiolato y el metil-4-mercaptobutirimidato.

Para las aplicaciones de diagnóstico, los anticuerpos de la invención típicamente se marcaran con un grupo detectable. El grupo detectable puede ser uno cualquiera que sea capaz de producir, bien directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, el grupo detectable puede ser una radioisótopo, tal como ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S, o ^{125}I, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como el isotiocianato de fluoresceína, la rodamina o la luciferina; la biotina; marcas isotópicas radiactivas, tales como, por ejemplo, el ^{125}I, ^{32}P, ^{14}C, o ^{3}H, o un enzima, tal como la fosfatasa alcalina, la beta-galactosidasa o la peroxidasa de rábano silvestre.

Puede emplearse cualquier procedimiento conocidos en la técnica para conjugar por separado el anticuerpo a un grupo detectable, incluyendo aquéllos procedimientos descritos por Hunter, et al., Nature, 144:945 (1962); David, et al., Biochemistry, 13:1014 (1974); Pain, et al., J. Immunol. Meth., 40:219 (1981); y Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982).

Los anticuerpos de la presente invención pueden emplearse en cualquier procedimiento de ensayo conocido, tales como los ensayos de unión competitiva, los ensayos en sándwich directos e indirectos, y los ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc., 1987).

(iii) Anticuerpos humanizados

Los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos aminoácidos introducidos en él procedentes de una fuente que no es humana. Estos residuos aminoácidos no humanos se denominan a menudo como residuos "importados", los cuales se toman típicamente de un dominio variable "importado". La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo CDR o secuencias de CDR en lugar de las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. En consecuencia, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Cabilly, supra), en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente procedente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR, y posiblemente algunos residuos de FR, se sustituyen con residuos procedentes de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

Es importante que los anticuerpos sean humanizados con retención de la elevada afinidad por el antígeno y de otras propiedades biológicas favorables. Para conseguir este objetivo, de acuerdo con un procedimiento preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias progenitoras, y de varios productos humanizados conceptuales, usando modelos tridimensionales de las secuencias progenitoras y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales están disponibles comúnmente y son familiares a los especialistas en el campo. Hay disponibles programas de ordenador que ilustran y muestran estructuras de conformación tridimensional probable de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite el análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina cantidata para unir su antígeno. De esta forma pueden seleccionarse y combinarse residuos de FR procedentes de las secuencias consenso e importada del receptor, de tal forma que se consiga la característica deseada del anticuerpo, tal como una afinidad incrementada por el antígeno o antígenos diana. En general, los residuos de CDR están directa y mayoritariamente implicados en influir la unión del antígeno. Para más detalles consultar la PCT/US93/07832, la cual es continuación en parte de la PCT/US92/05126, cuyas referencias se incorporan en la presente invención por referencia en su totalidad.

Alternativamente, es posible ahora producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, a partir de su inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de inmunoglobulina. Por ejemplo, se ha descrito que la supresión homocigótica del gen de la región de unión de la cadena pesada (J_{H}) en ratones quiméricos y mutantes de línea germinal resulta en la completa inhibición de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia del conjunto de genes de la línea germinal de inmunoglobulinas humanas en tales ratones mutantes de la línea germinal resultará en la producción de anticuerpos humanos a partir del desafío con antígenos. Consultar, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-255 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993).

(iv) Anticuerpos biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, preferiblemente humanos o humanizados, que tienen especificidades de unión por al menos dos antígenos diferentes. En el caso presente, una de las especificidades de unión es por la NRG3 de la presente invención, y la otra es por cualquier otro antígeno, por ejemplo, otro miembro de la familia NRG3. Tales construcciones pueden denominarse también como inmunoadhesinas biespecíficas.

Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas pesadas tienen especificidades diferentes (Millstein y Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)). A causa del surtido aleatorio de cadenas pesada y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (quadromas) producen una mezcla potencial de moléculas de anticuerpo, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que usualmente se realiza mediante pasos de cromatografía de afinidad, es bastante engorrosa, y los rendimientos de producto son bajos. Se describen procedimientos similares en la publicación de solicitud de PCT nº WO-93/08829 (publicada el 13 de mayo de 1993), y en Traunecker et al., EMBO, 10:3655-3659 (1991). Este problema puede superarse seleccionando una cadena ligera común para cada brazo del anticuerpo biespecífico, de forma que se mantenga la especificidad de unión de cada anticuerpo, tal como se se describe en la solicitud estadounidense con número de serie 08/850058, depositada el 5 de mayo de 1997.

De acuerdo con una estrategia diferente y más preferida, los dominios variables del anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan a secuencias del dominio constante de inmunoglobulina. La fusión preferiblemente es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte del gozne, y las regiones constantes segunda y tercera de una cadena pesada de inmunoglobulina (CH2 y CH3). Se prefiere que tenga la primera región constante de cadena pesada (CH1), que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de la inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión distintos, y se cotransfecta en un organismo huésped apropiado. Esto proporciona una gran flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en realizaciones en donde las proporciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas usadas en la construcción proporcionan el rendimiento óptimo. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes para dos cadenas polipeptídicas, o la totalidad de las las tres, en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en proporciones iguales resulta en rendimientos elevados, o cuando las proporciones no son de especial importancia. En una realización preferida de esta estrategia, lso anticuerpos biespecíficos se componen de un cadena pesada de inmunoglobulina híbrida, con una primera especificidad en un brazo, y un par cadena ligera-cadena pesada de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se halló que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas, puesto que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo una mitad de la molécula biespecífica proporciona una forma fácil de separación. Esta estrategia se describe en la solicitud de PCT WO-94/04690, publicada el 3 de marzo de 1994.

Para detalles adicionales sobre la generación de anticuerpos biespecíficos consultar, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

(v) Anticuerpos heteroconjugados

Los anticuerpos heteroconjugados se hallan también dentro del ámbito de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos por dos anticuerpos unidos covalentemente. Tales anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmune hacia células no deseadas (Patente Estadounidense nº 4.676.980), y para el tratamiento de la infección con VIH (solicitud del PCT nº. WO-91/00360 y WO-92/200373; EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados pueden prepararse usando cualquier procedimiento de entrecruzamiento conveniente. Los agentes entrecruzadores apropiados son bien conocidos en la técnica, y se describen en la Patente Estadounidense nº 4.676.980, junto con un cierto número de técnicas de entrecruzamiento.

1. Equipos de diagnóstico y artículos manufacturados

Puesto que la invención proporciona un ensayo de diagnóstico (es decir, para detectar trastornos neurológicos y para detectar la presencia de NRG3 en una muestra usando anticuerpos o marcadores de ADN) por conveniencia, los reactivos para estos reactivos pueden proporcionarse en un equipo, es decir, una combinación empaquetada de reactivos, para su combinación con la muestra a ensayar. Los componentes del equipo normalmente se proporcionarán en proporciones predeterminadas. Por tanto, un equipo puede comprender el anticuerpo, o la NRG3 (ADN, o polipéptido, o fragmento de los mismos) marcada directa o indirectamente con una marca apropiada. Cuando la marca detectable es un enzima, el equipo incluirá los sustratos y cofactores requeridos por el enzima (por ejemplo, un precursor de sustrato que proporciona el cromóforo detectable o fluoróforo). Además, pueden incluirse otros aditivos, tales como los estabilizadores, tampones, y similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos pueden variarse ampliamente para proporcionar concentraciones en solución de los reactivos que optimicen sustancialmente la sensibilidad del ensayo. Particularmente, los reactivos pueden proporcionarse como polvos secos, usualmente liofilizados, incluyendo excipientes, que al disolverse proporcionarán una solución de reactivo que tiene la concentración apropiada. El equipo incluye también de forma apropiada instrucciones para llevar a cabo el bioensayo.

En otra realización de la invención, se proporciona un artículo manufacturado que contiene materiales útiles para el tratamiento de los trastornos neurológicos descritos en la presente invención. El artículo manufacturado comprende un contenedor y una marca. Los contenedores apropiados incluyen, por ejemplo, las botellas, los viales, las jeringas y los tubos de ensayo. Los contenedores podrían estar formados por una variedad de materiales, tales como el vidrio o el plástico. El contenedor contiene una composición que es efectiva para tratar la condición, y podría tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el contenedor podría ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica). El agente activo en la composición es la NRG3 o un agonista o antagonista de la misma. Las marca sobre, o asociada al contenedor indica que la composición se usa para tratar la condición escogida. El artículo manufacturado podría comprender además un segundo contenedor que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como una solución salina tamponada con fosfato, una solución de Ringer, y una solución de dextrosa. Además, podría incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, e insertos del paquete con instrucciones para su uso.

J. Análogos peptídicos y no peptídicos

Los análogos peptídicos de las NRG3 de la presente invención se modelan a partir de la estructura tridimensional de los polipéptidos nativos. Los péptidos pueden sintetizarse por medio de técnicas bien conocidas, tales como las técnicas sintéticas en fase sólida descritas inicialmente por Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 15:2149-2154 (1963). Otras técnicas de síntesis de péptidos se describen, por ejemplo, en Bodanszky et al., Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 2ª edición, 1976, así como en otros libros de referencia fácilmente disponibles para los especialistas en la técnica. Un resumen de las técnicas de síntesis de péptidos puede hallarse en Stuart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Company, Rockford, IL (1984). Los péptidos pueden prepararse también mediante la tecnología del ADN recombinante, usando una secuencia de ADN que codifica el péptido deseado.

Además de los análogos peptídicos, la presente invención también contempla los compuestos no peptídicos (por ejemplo, orgánicos) que exhiben sustancialmente la misma superficie que los análogos peptídicos de la presente invención y, por tanto, interaccionan con otras moléculas de una forma similar.

K. Usos de las NRG3

Las variantes de la secuencia de aminoácidos de las NRG3 nativas de la presente invención pueden emplearse terapéuticamente para competir con la unión normal de las proteínas nativas a su receptor, el ErbB4. Las variantes de la secuencia de aminoácidos de la NRG3 son, por tanto, útiles como inhibidores competitivos de la actividad biológica de las NRG3 nativas.

Las NRG3 nativas y sus variantes de la secuencia de aminoácidos son útiles en la identificación y purificación del receptor ErbB4 nativo. La purificación se realiza preferiblemente mediante inmunoadhesinas que comprenden una secuencia de aminoácidos de la NRG3 que retiene la capacidad cualitativa de una NRG3 nativa de la presente invención para reconocer su receptor ErbB4 nativo.

Las NRG3 nativas de la presente invención son útiles además como marcadores moleculares de los tejidos en los que se expresa el receptor ErbB4.

Además, las NRG3, preferiblemente el dominio parecido al EGF de la NRG3 de la presente invención, proporciona valiosos motivos de secuencia que pueden insertarse o sustituirse en otros miembros nativos de la familia de moléculas de la NRG3, tales como la heregulinas. La alteración de estas proteínas nativas mediante la sustitución o inserción de secuencias procedentes de las nuevas NRG3 de la presente invención pueden proporcionar moléculas variantes con propiedades biológicas alteradas, tales como la afinidad de unión al receptor o la especificidad por el receptor. Por ejemplo, uno o más dominios de la NRG3 de otro miembro de la familia NRG3 puede remplazarse total o parcialmente por secuencias del dominio de la NRG3, derivadas de las NRG3 de la presente invención. De forma similar, las secuencias del dominio parecido al EGF, procedentes de las NRG3 en la presente invención, pueden sustituirse o insertarse en las secuencias de aminoácidos de otras NRG3.

El ácido nucleico que codifica las NRG3 de la presente invención es útil también para proporcionar sondas de hibridación para buscar bibliotecas de ADNc o genómica en busca de la secuencia codificante de otras NRG3.

Adicionalmente, las NRG3 de la invención son útiles en equipos para la diagnosis de enfermedades relacionada con la NRG3, y para procedimientos de detección de la presencia o ausencia de NRG3 en una muestra, tal como un fluido corporal, tal como se describe en la presente invención.

Se espera que la unión y activación del receptor ErbB4 por parte de la NRG3 medie, en células que expresan el receptor ErbB4 como, respuestas fisiológicas tales como el crecimiento celular, la proliferación celular, y la diferenciación celular, particularmente en el tejido nervioso. Como un resultado, la NRG3 de mamífero, o fragmento de la misma que se une y activa un receptor ErbB4, es útil en el tratamiento de enfermedades en las cuales el crecimiento, la proliferación y/o diferenciación de las células neurales alivie los síntomas de la enfermedad. La NRG3 puede ser la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la NRG3 múrida (SEC. Nº ID.: 2) o de las NRG3 humanas (SEC. Nº ID.: 6 o SEC. Nº ID.: 23); la secuencia de aminoácidos de longitud completa procedente de otra especie animal que tiene al menos aproximadamente el 75% de homología con la NRG3 múrida y humana a nivel de aminoácidos, preferiblemente aproximadamente el 90% de homología de secuencia de aminoácidos en el dominio unidor parecido al EGF; y una secuencia de aminoácidos que comprende el dominio parecido al EGF de la NRG3, cuya secuencia se une al receptor ErbB4. Cuando la NRG3 o el fragmento unidor al receptor ErbB4 es agonista, la NRG3 o fragmento se une a, y activa el receptor ErbB4. Cuando la NRG3 o el fragmento unidor al receptor ErbB4 es un antagonista, la NRG3 o fragmento se une a, pero no activa el receptor ErbB4, impidiendo de ese modo la activación por parte de NRG3 o agonistas que ocurran de forma natural.

Las enfermedades tratables mediante la administración de NRG3, o un agonista de las misma (tales como un polipéptido que comprende un dominio parecido al EGF de NRG3) incluyen, pero no se limitan a trastornos pueden surgir en un paciente en el que el sistema nervioso ha sido dañado por, por ejemplo, trauma, cirugía, apoplejía, isquemia, infección, trastorno metabólico, deficiencia nutricional, cáncer, o agentes tóxicos; trastornos motoneuronales, tales como la esclerosis lateral amiotrófica (enfermedad de Lou Gehrig), parálisis de Bell, y varias condiciones que implican la atrofia muscular espinal, o la parálisis; los "trastornos neurodegenerativos", tales como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la epilepsia, la esclerosis múltiple, la corea de Huntington. el síndrome de Down, la sordera nerviosa, y la enfermedad de Meniere; las neuropatía, y especialmente la neuropatía periférica, que se refiere a un trastorno que afecta el sistema nervioso periférico que la mayoría de las veces se manifiesta como una, o una combinación de disfunción neural motora, sensorial, sensorimotora, o disfunción neural autonómica, tal como la neuropatía sensorimotora, o las neuropatías autonómicas, incluyendo una movilidad reducida del tracto gastrointestinal o atonía de la vejiga urinaria. Los ejemplos de neuropatías asociadas con enfermedades sistémicas incluyen el síndrome post-polio; los ejemplos de neuropatías hereditarias incluyen la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, la enfermedad de Refsum, la abetalipoproteinemia, la enfermedad de Tangier, la enfermedad de Krabbe, la leucodistrofia metacromática, la enfermedad de Fabry, y el síndrome de Dejerine-Sottas; y los ejemplos de neuropatías causadas por un agente tóxico incluyen aquéllas causada por el tratamiento con un agente quimioterapéutico tal como la vincristina, el cisplatino, el metotrexato, o la 3'-azido-3'-desoxitimidina. También, la NRG3, o fragmentos biológicamente activos de la misma (tales como el dominio parecido a EGF de una NRG3) puede usarse para tratar trastornos de músculo esquelético o músculo liso, tal como la distrofia muscular o enfermedades causadas por el debilitamiento del músculo esquelético o liso.

Los dispositivos de membrana, semipermeables, implantables son útiles como medios para suministrar fármacos en ciertas circunstancia. Por ejemplo, las células que secretan las NRG3 soluble, o los agonistas de las mismas, o quimeras, pueden encapsularse y tales dispositivos pueden implantarse en un paciente, por ejemplo, en el cerebro de pacientes que padecen la enfermedad de Parkinson. Consultar, la Patente Estadounidense nº 4.892.538 de Aebischer et al.; la Patente Estadounidense nº 5.011.472 de Aebischer et al.; la Patente Estadounidense nº 5.106.627 de Aebischer et al.; la solicitud del PCT WO-91/10425; la solicitud del PCT WO-91/10470; Winn et al., Exper. Neurology, 113:322-329 (1991); Aebischer et al., Exper. Neurology, 111:269-275 (1991); y Tresco et al., ASAIO, 38:17-23 (1992). En consecuencia, se incluye también un procedimiento para para prevenir o tratar la lesión a un nervio o la lesión de otras células que expresan la NRG3 o responden a la NRG3, por ejemplo, las células cerebrales, cardíacas o renales, tal y como se enseña en la presente invención, procedimiento que comprende implantar células que secretan la NRG3, o un fragmento o agonista de la misma, o antagonistas, como pudiera ser preciso para la condición concreta, en el cuerpo del paciente que la precisa. Finalmente, la invención incluye un dispositivo de implantación, para prevenir o tratar la lesión nerviosa o la lesión de otras células tal y como se enseña en la presente invención, que contiene una membrana semipermeable y una célula que secreta la NRG3, o fragmento o agonista de la misma, (o antagonistas, como pudiera ser preciso para la condición concreta) encapsulada dentro de la membrana, siendo la membrana permeable a la NRG3, o fragmento agonista de la misma, e impermeable a factores del paciente perjudiciales para las células. Las propias células del paciente, transformadas para producir la NRG3 ex vivo, pueden implantarse en el paciente, opcionalmente sin tal encapsulación. La metodología para la encapsulado en membrana de células vivas es familiar aquéllos con formación ordinaria en la técnica, y la preparación de las células encapsuladas y su implantación en paciente puede conseguirse fácilmente tal y como se conoce en el estado de la técnica. La presente invención incluye, por tanto, un procedimiento para prevenir o tratar el daño celular, preferiblemente la lesión del nervio, mediante la implantación de células en el cuerpo de un paciente que las necesita, las células, seleccionadas por su capacidad natural para general NRG3, o un fragmento o agonista de la misma, o manipuladas para secretar la NRG3, o fragmento o agonista de la misma. Preferiblemente, la NRG3 secretada es NRG3 soluble, humana, cuando el paciente es humano. Los implantes son preferiblemente no inmunogénicos y/o impiden que las células inmunogénicas implantadas sean reconocidas por el sistema inmune. Para la administración al SNC, una ubicación preferida para el implante es el fluido espinal cerebral de la médula espinal.

La administración de la NRG3, fragmento o variante de la misma, de la presente invención puede hacerse de una variedad de formas, por ejemplos, aquellas rutas conocidas para indicaciones específicas, incluyendo, pero no limitándose a, de forma oral, subcutánea, intravenosa, intracerebral, intranasal, transdérmica, intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonar, vaginal, rectal, intraarterial, intralesional, intraventricular en el cerebro, o intraocular. La NRG3 puede administrase de forma continua mediante infusión en los reservorios de fluido del SNC, aunque es aceptable la inyección en embolada, usando técnicas bien conocidas en el estado de la técnica, tales como bombas o implantación. Pueden usarse los sistemas de liberación sostenida. Cuando el trastorno lo permita, se puede formular y dosificar la variante de NRG3 para su entrega específica en un sitio. La administración puede ser continua o periódica. La administración pue-
de conseguirse mediante una bomba implantable de flujo constante o programable, o mediante inyecciones periódicas.

Los dispositivos de membrana, semipermeables, implantables son útiles como medios para suministrar fármacos en ciertas circunstancia. Por ejemplo, las células que secretan una variante de NGF soluble pueden encapsularse, y tales dispositivos pueden implantarse en un paciente, por ejemplo, en el cerebro o médula espinal (CSF) de un paciente que padece la enfermedad de Parkinson. Consultar, la Patente Estadounidense nº 4.892.538 de Aebischer et al.; la Patente Estadounidense nº 5.011.472 de Aebischer et al.; la Patente Estadounidense nº 5.106.627 de Aebischer et al.; la solicitud del PCT WO-91/10425; la solicitud del PCT WO-91/10470; Winn et al., Exper. Neurology, 113:322-329 (1991); Aebischer et al., Exper. Neurology, 111:269-275 (1991); y Tresco et al., ASAIO, 38:17-23 (1992). Finalmente, la presente invención incluye un dispositivo de implantación, para prevenir o tratar la lesión nerviosa o la lesión de otras células tal y como se enseña en la presente invención, que contiene una membrana semipermeable y una célula que secreta una NRG3, estando la célula encapsulada dentro de la membrana, y siendo la membrana permeable a la NRG3, pero impermeable a factores del paciente perjudiciales para las células. Las propias células del paciente, transformadas para producir la NRG3 ex vivo, opcionalmente pueden implantarse directamente en el paciente sin tal encapsulación. La metodología para la encapsulado en membrana de células vivas es familiar aquéllos con formación ordinaria en la técnica, y la preparación de las células encapsuladas y su implantación en paciente puede conseguirse fácilmente tal y como se conoce en el estado de la técnica. Preferiblemente, la NRG3 secretada, el fragmento o variante de la misma, es una NRG3 humana cuando el paciente es humano. Los implantes son preferiblemente no inmunogénicos y/o impiden que las células inmunogénicas implantadas sean reconocidas por el sistema inmune. Para la administración al SNC, una ubicación preferida para el implante es el fluido espinal cerebral de la médula espinal.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden una NRG3 en una forma apropiada para su administración a un paciente. En una realización preferida, las composiciones farmacéuticas están en una forma soluble en agua, y pueden incluir tales materiales fisiológicamente aceptables como los portadores, excipientes, estabilizantes, tampones, sales, antioxidantes, polímeros hidrofílicos, aminoácidos, carbohidratos, tensioactivos iónicos o no iónicos, y polietilen- o propilenglicol. La NRG3 puede estar en un forma de liberación temporal para su implantación, o puede estar atrapada en microcápsulas usando técnicas bien conocidas en el estado de la técnica.

Una cantidad efectiva de NRG3, o de agonista o antagonista de la NRG3, a ser empleada terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la ruta de administración, y la condición del paciente. En consecuencia, será necesario para el médico ajustar la dosis y modificar la ruta de administración según se requiera para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosis diaria típica puede oscilar desde aproximadamente 10 ng/kg hasta 100 mg/kg de peso corporal del paciente o más por día, preferiblemente aproximadamente desde 1 \mug/kg/día hasta 10 mg/kg/día. Típicamente, el médico administrará la NRG3, o el agonista o antagonista de la NRG3, hasta que se alcance una dosis que consiga el efecto deseado para el tratamiento de los trastornos antes mencionados.

L. Animales transgénicos y knockout (desactivados)

Los ácidos nucleicos que codifican las nuevas NRG3 procedentes de especies no humanas, tales como la NRG3 múrida, pueden usarse para generar tanto animales transgénicos como animales "knock out", los cuales, a su vez, son útiles en el desarrollo y cribado de reactivos terapéuticamente útiles. Un animal transgénico (por ejemplo, un ratón) es un animal que tiene células que contienen un transgén, transgén que se introdujo en el animal, o en un ancestro del animal, en un estadio prenatal, por ejemplo, embrionario. Un transgén es un ADN que está integrado en el genoma de una célula de la cual se desarrolla un animal transgénico. En una realización, el ADNc múrido que codifica la NRG3, o una secuencia apropiada del mismo, puede usarse para clonar ADN genómico que codifica la NRG3 de acuerdo con técnicas establecidas, y las secuencias genómicas usadas para generar los animales transgénico pueden usarse para generar animales transgénicos que contienen células que expresan el ADN que codifica la NRG3. Los procedimientos para generar animales transgénicos, particularmente animales tales como los ratones, han pasado a ser convencionales en la técnica, y se describen, por ejemplo, en las Patentes Estadounidenses nº 4.736.866 y 4.870.009. Típicamente, células concretas, tales como las células neuronales, serán la diana para la incorporación del transgén de la NRG3, con potenciadores específicos para tejidos, los cual resultará en una diferenciación celular, proliferación celular, o apoptosis celular alterada, dependiendo de la interacción del ligando con el polipéptido expresado. Los animales transgénicos que incluyen una copia de un transgén que codifica la NRG3, introducido en la línea germinal del animal en un estado embrionario, pueden usarse para examinar el efecto de la expresión incrementada del ADN que codifica la NRG3. Tales animales pueden usarse como animales de ensayo para reactivos que se cree que confieren protección frente a, por ejemplo, enfermedades asociadas con una diferenciación neuronal o proliferación neuronal anormal. De acuerdo con esta faceta de la investigación, se trata un animal con el reactivo, y una incidencia reducida de la enfermedad, en comparación con
los animales no tratados portadores del transgén, indicará una potencial intervención terapéutica para la enfermedad.

Alternativamente, pueden usarse homólogas no humanas de la NRG3 para construir un animal "knock out" de la NRG3, el cual tiene un gen que codifica la NRG3 defectuoso o alterado, como resultado de la recombinación homóloga entre el gen endógeno que codifica la NRG3 y el ADN genómico alterado, que codifica la NRG3, introducido en una célula embrionaria del animal. Por ejemplo, el ADNc múrido que codifica la NRG3 puede usarse para clonar ADN genómico que codifica la NRG3 de acuerdo con técnicas establecidas. Un porción del ADN genómico que codifica la NRG3 puede suprimirse o remplazarse con otro gen, tal como un gen que codifica un marcador seleccionable, el cual puede usarse para monitorizar la integración. Típicamente, se incluyen en el vector varios kilobases de ADN flanqueador inalterado (tanto en el extremo 5' como en el 3') (consultar, por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para una descripción de vectores recombinantes homólogos). El vector se introduce en una línea de células madre embrionarias (por ejemplo, mediante electroporación), y se seleccionan las células en las que el ADN introducido se ha recombinado homólogamente con el ADN endógeno (consultar, por ejemplo, Li et al., Cell, 69:915 (1992)). Las células seleccionadas se inyectan a continuación en un blastocito de un animal (por ejemplo, un ratón) para formar quimeras de agregación (consultar, por ejemplo, Bradley, en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, editor E.J. Robertson (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152). Un embrión quimérico puede implantarse a continuación en un animal nodriza hembra pseudopreñado el embrión se lleva a término para crear un animal "knock out". La progenie que alberga el ADN recombinado homólogamente en sus células germinales puede identificarse mediante técnicas estándares, y se usa para criar animales en los que todas las células del animal contienen el ADN recombinado homólogamente. Los animales knockout pueden usarse en la selección de agentes terapéuticos potenciales, tales como los agonistas de la NRG3, que restauran los procesos celulares iniciados o mantenidos por la NRG3 nativa; o los animales knockout pueden usarse en el estudio de los efectos de las mutaciones de la NRG3.

La invención actual se muestra y describe en la presente memoria en las realizaciones que se consideran más prácticas y preferidas. No obstante, se acepta que pueden haber desviaciones de la misma que se hallen dentro del ámbito de la invención, y que a alguien experto en la materia se le ocurrirán modificaciones obvias a partir de la lectura de esta descripción.

Ejemplos

Los ejemplos siguientes se proporcionan con objeto de proporcionar a los expertos en la técnica un desglose y descripción completos de cómo preparar los compuestos y composiciones de la invención, y de cómo poner en práctica los procedimientos de la invención, y no se pretende que limiten el ámbito de aquéllo que los inventores consideran como su invención. Se ha realizado un esfuerzo para asegurar la exactitud en relación a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.), pero deberían tenerse en cuenta algunos errores experimentales y desviaciones. A menos que si indique lo contrario, las partes son partes en peso, la temperatura se da en grados centígrados, y la presión es la atmosférica o próxima a ésta.

Ejemplo 1 Clonación molecular de unas nuevas NRG3 de ratón y humana

Los ADNc de las nuevas NRG3 se identificaron usando una etiqueta de secuencia expresada que se muestra a continuación:

101

1

(EST; SEC. Nº ID.: 21; registro en Genbank H23651) de la base de datos de EST del National Center for Biotechnology Information (NCBI). Esta EST procede de una biblioteca de ADNc de cerebro humano, codifica una secuencia de aminoácidos que tiene aproximadamente el 62% de identidad con los aminoácidos 232-316 de la heregulina-\beta1 (también denominada neuregulina-\beta1, o NRG1).

Para obtener un clon parcial de ADNc humano, se sintetizó una sonda de oligonucleótidos, de hebra sencilla, de 50 bases (5'-TGGTAAAAGCTACAGTCTCAAAGCATCCAGCACAATGGCAAAGTCAGAGA-3'; SEC. Nº ID.: 18) en base a la secuencia EST. La sonda se usó para cribar 1,5 \times 10^{6} placas procedentes de una biblioteca de ADNc \gammagt10 preparada a partir de ARN de cerebro fetal humano (HL3003a, Clontech) según describieron Godowski et al., (Godowski, P.J. et al., PNAS USA, 86:8083-8087 (1989), incorporada en la presente invención por referencia en su totalidad). Se obtuvieron nueve placas positivas, y se determinaron las secuencias de ambas hebras de los insertos de mayor tamaño mediante técnicas de secuenciación estándares. A partir de estas secuencias solapadas clonadas se obtuvo una secuencia de ADNc parcial de la NRG3 humana.

La secuencia adicional 5' de la NRG3 humana se obtuvo mediante la PCR anclada de ARN del hipocampo humano (Clontech). La secuencia de ácido nucleico humana completa, marco de lectura abierto, deducida de la secuenciación directa del ADNc hNRG3B1 se muestra en la Figura 2 (SEC. Nº ID.: 5). El ATCC 209157 es un ácido nucleico que comprende un vector de expresión y la secuencia nucleotídica del marco de lectura abierto de la NRG3B1 humana.

Una forma alternativamente ayustada de la NRG3 humana se clonó como pRK5.tk.neo.hNRG3B2 (SEC. Nº ID.: 22), codificando la secuencia de aminoácidos deducida de la SEC. Nº ID.: 23, secuencia de aminoácidos que carece de los aminoácidos 529 a 552 de la SEC. Nº ID.: 6 (ver Figura 4B). Puesto que esta forma alternativamente plegada de la NRG3 humana comprende el dominio parecido al EGF de las otras NRG3, así como una elevada homología de secuencia de aminoácidos, se espera que muestre las propiedades biológicas de las NRG3 descritas en la presente invención.

Para clonar las secuencias de ADNc de la NRG3 múrida, se diseñaron dos cebadores degenerados en base a regiones próximas al dominio transmembrana del ADNc humano parcial, codificando las secuencias de aminoácidos NDGECFVI (SEC. Nº ID.: 19) y EFMESEEVY (SEC. Nº ID.: 20). Se cribó una biblioteca de ADNc de cerebro de ratón (Clontech, ML1042a), y se obtuvo un clon (C5a) que contenía un ADNc de NRG3 múrida parcial mediante técnicas estándares. Usando una sonda derivada de la secuencia C5a, se cribaron dos bibliotecas adicionales de ADNc de cerebro de ratón (ML1034h, Clontech; y 936309, Stratagene). Se secuenciaron ambas hebras de dos clones solapados de la NRG3 parcial de ratón, SWAJ-3 y ZAP-1, y se halló que juntas codificaban un marco de lectura abierto (ORF) completo, de 2139 p.b. que tienen la secuencia de ADN SEC. Nº ID.: 1 y la secuencia de aminoácidos deducida SEC. Nº ID.: 2 mostrada en la Figura 4A. El ácido nucleico que comprendía el marco de lectura abierto de la NRG3 múrida clonado en un vector de expresión se denominó pLXSN.mNRG3 (ATCC 209.156).

La ubicación cromosómica de la NRG3 humana se mapeo a 10q22 mediante análisis con la PCR de ADN híbrido de células somáticas, mientras que el gen de la NRG1 está ubicado en 8p11-22 (Lee, J. y Wood, W.I., Genomics, 16:790-791 (1993); y Orr-Urtreger, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1867-1871 (1993)). Por tanto, la NRG3 es un nuevo miembro de la familia parecida al EGF de ligandos de proteínas.

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Ejemplo 2 Caracterización de las secuencias de aminoácidos deducidas de la NRG3 de ratón y humana

Los ADNc de las NRG3 humana y múrida contenían marcos de lectura abiertos qeu codificaban respectivamente proteínas de 720 y 713 aminoácidos, con un MW predicho de 77.901 Da para la NRG3 humana, y 77.370 Da para la NRG3 múrica (Figura 4). La dos especies de NRG3 son idénticas al 93% en secuencia de aminoácidos.

El análisis de la secuencia de aminoácidos de la NRG3 humana reveló que contenía homología con los miembros de la familia NRG1 (a saber, respectivamente el 23% y 19% de identidad de secuencia con la SMDF (Ho, W.H. et al., J. Biol. Chem., 270:14523-14532 (1995)) y la heregulina-\beta1 (Holmes, W.E. et al., Science, 256:1205-10 (1992))). Un análisis de hidropatía indicó dos segmentos hidrofóbicos: W^{66}-V^{91} y L^{362}-F^{383} (números de aminoácidos de acuerdo con la NRG3 humana). De forma similar a la NRG1, el segmento hidrofóbico C-terminal podría servir como dominio transmembrana, y la región N-terminal podría actuar como secuencia señal interna (Wickner. W.T. y Lodish, H.F., Science, 230:400-7 (1985); Sabatini, D.D. et al., J. Cell Biol., 92:1-22 (1982); y Blobel, G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:1496-1500 (1980)). En contraste con muchos miembros de la familia neuregulina, el dominio extracelular de la NRG3 carece de dominios kringle parecidos a Ig. En cambio, la NRG3 contiene un único segmento rico en Ala/Gly en el extremo N-terminal, una región rica en Ser/Thr parecida a mucina que contiene abundantes sitios para la glicosilación unida a O, y un motivo EGF. No hay sitio predichos para glicosilación unida a N. El dominio parecido al EGF de la NRG3 es distinto de los codificados por la NRG1 (31% de identidad en comparación con el dominio parecido a EGF de la neuregulina-\beta1) y NRG2 (39% de identidad con el dominio parecido a EGF de la neuregulina-\beta1), sugiriendo que la NRG3 no es una isoforma de la NRG1 alternativamente ayustada. En la Figura 5 se muestra una diagrama comparativo de los dominios parecidos al EGF de los miembros de la familia EGF. El dominio intracelular putativo de la NRG3 contiene sólo aproximadamente un 13% de identidad de secuencia con el dominio intracelular de la NRG1. Los dominios parecidos al EGF de los miembros de la familia EGF se obtuvieron a partir de las siguientes fuentes, cada referencia se incorpora en la presente invención por referencia en su totalidad. Las secuencias comparadas en la Figura 5 incluyen el dominio parecido al EGF de la NRG3 humana (hNRG3.egf; SEC. Nº ID.: 4; descrita en la presente invención); ARIA de pollo (cARIA.egf; SEC. Nº ID.:9) (Falls, D.L. et al., Cell, 72:801-815 (1993)); amfiregulina humana (hAR.egf; SEC. Nº ID.: 10) (Plowman, G.D. et al., Mol. Cell. Biol., 10:1969-1981 (1990)); betacelulina humana (hBTC.egf; SEC. Nº ID.: 11) (Sasada, R. et al., Biochem. Biophys. Res. Com., 190:1173-1179 (1993)); EGF humana (hEGF.egf: SEC. Nº ID.: 12) (Nagai, M. et al., Gene, 36:183-188 (1985)); factor humano de crecimiento parecido al EGF y unidor de heparina (hHB-EGF.egf: SEC. Nº ID.: 13) (Higashiyama, S. et al., Science, 251:936-939 (1991)); heregulina-\alpha humana (hHRG\alpha; SEC. Nº ID.: 14); heregulina-\beta humana (hHRG\beta.egf; SEC. Nº ID.: 15) (Holmes, W.E. et al., Science, 256:1205-1210 (1992)); TGF-\alpha alpha (hT-GF\alpha.egf; SEC. Nº ID.: 16) (Derynck, R. et al., Cell, 38:287-297 (1984)); y epiregulina de ratón (mEPR.egf; SEC. Nº ID.: 17) (Toyoda, H. et al., FEBS Lett., 377:403-407 (1995)).

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Ejemplo 3 Expresión de la NRG3 múrida y humana A. Análisis por transferencia Northern de tejido humano

Se examinó el perfil de expresión en tejidos de la NRG3 humana mediante análisis de transferencia Northern. Se compró a Clontech una transferencia de ARN multi-tejidos que contenía 2 \mug de cada unos de poly(A)^{+} ARN de tejidos humanos. La región de la secuencia de ácidos nucleicos de la NRG3 humana que codificaba los aminoácidos 394 a 536 se usó para genera las sondas de hibridación de ADN mediante amplificación con PCR. Las sondas de ADN se marcaron con \alpha-^{32}P-dCTP mediante cebado aleatorio (Promega). La transferencia de ARN se hibridó con 50% de formamida, 5 \times SSC, fosfato potásico 50 mM (pH 7,0), 5 \times Denhardt, 10% de sulfato de dextrano, a 42ºC, durante 20 horas. La transferencia se lavó con 0,1 \times SSC, 0,1% de SDS, a 50ºC, durante 30 minutos, y se expuso en Phosphoimager^{TM}. La expresión de la NRG3 en una mezcla de tejidos se usó como una guía para determinar la expresión en tejidos específicos mediante la hibridación in situ.

B. Análisis de la hibridación in situ de tejidos de ratón

Unos embriones de ratón fijados en formol e impregnados en parafina (días embrionarios 13, 15, 16), y cerebro, ovarios, yeyuno, riñón, glándula adrenal, pulmón, estómago, bazo, músculo esquelético, hígado y colon de ratón adulto congelado, fijados con glutaraldehído e impregnados con parafina, o fijados con paraformaldehído, se seccionaron y procesaron para su hibridación in situ mediante el procedimiento de Lu y Gillett (Lu, L.H. y Gillett N.A., Cell Vision, 1:169-176 (1994)) con modificaciones. En resumen, la sonda de hibridación in situ se generó mediante la transcripción in vitro directamente a partir de un fragmento de la PCR, en vez de a partir de un ADN de plásmido tal como se ha descrito. Se generaron ribosondas con sentido y antisentido marcadas con 32P-UTP marcando los productos de la PCR de un fragmento de ADNc que codificaba los aminoácidos C^{292} a N^{482} de la NRG3 múrida.

C. Los análisis de la transferencia Northern y la hibridación in situ revelan un patrón de expresión neural de la NRG3

Un transcrito de ARNm de 4,4 kb, que se hibridaba con la sonda derivada de los aminoácidos 394 a 536 de la NRG3 humana, se expresó de forma elevada en el cerebro. En una transferencia Northern de varios tejidos cerebrales, la expresión de la NRG3 se detectó a niveles elevados en la mayoría de las regiones del cerebro, con excepción del cuerpo calloso. Un nivel de expresión inferior de un transcrito de 1,9 kb se detectó en los testículos. El transcrito de 4,4 kb, pero no el transcrito de 1,9 kb, tiene la longitud suficiente para codificar la NRG3, sugiriendo que el transcrito menor puede codificar uan forma alternativamente ayustada de la NRG3. Se observó un patrón de expresión de la NRG3 similar en transferencias de ARN de tejidos múridos usando una sonda derivada de la región de la NRG3 múrida que se solapa con el dominio parecido al EGF.

La distribución tisular de la expresión de la NRG3 se caracterizó mediante hibridación in situ usando tejidos de ratones embrionarios y adultos. El día embrionario 13 (E 13) (el momento más temprano examinado) el ARNm de la NRG3 estaba confinado al sistema nervioso. También se demostró una señal intensa para el ARNm de la NRG3 en el cerebro, médula espinal, y ganglios trigémino, vestibular-coclear, y medular del día embrionario 16 (E 16) en ratones. Las regiones del telencefalón que contenían células diferenciándose (por ejemplo, la placa cortical) exhibieron una intensa señal de la NRG3, mientras que las regiones subyacentes conteniendo células en proliferación o migrando (zonas ventricular y subventricular), mostraron poca expresión. Por tanto, la NRG3 parece expresarse principalmente en el sistema nervioso de ratones embrionarios. En los animales adultos, las sondas antisentido de la NRG3 se hibridaron al ARNm en la médula espinal y numerosas regiones del cerebro, incluyendo el núcleo profundo del cerebelo, el núcleo vestibular, el córtex cerebral, el córtex piriforme, el núcleo olfativo anterior, la habenula medial, el hipocampo y el tálamo.

Ejemplo 4 Caracterización de las características de unión de los fragmentos de NRG3 A. Expresión y purificación de la proteína de fusión NRG3^{EGF} en células de mamífero

Para examinar las características de unión del dominio parecido al EGF de la NRG3, así como para demostrar la funcionalidad de un fragmento de la NRG3 de la invención, se preparó una proteína de fusión soluble que comprende una secuencia de un dominio parecido al EGF, dominio que tiene la misma secuencia de aminoácidos en las NRG3 de ratón y humana. Se construyó un polipéptido secretado, etiquetado con epítopo, que comprendía el dominio parecido al EGF de una NRG_{284-344} múrida, uniendo en la dirección expresada N-terminal a C-terminal, 1) la secuencia codificante de la secuencia señal de gD y el epítopo tag (Mark, M.R. et al., J Biol. Chem., 269, 10720-10728 (1994)); 2) la secuencia que codificaba los aminoácidos 284-344 de la NRG3 múrida (idénticos a los aminoácidos 282 a 342 de la NRG3 humana); y 3) las secuencias codificantes de la porción Fc de la IgG_{1} humana, en el vector pSAR.SD5 (psar.SD5 procedente de A. Shen, Genentech, Inc.). El plásmido que codificaba estas secuencias se denominó NRG3^{EGF}.Fc. El plásmido de expresión NRG3^{EGF}.Fc se transfectó usando LipofectAMINE (GIBCO/BRL, Bethesda, MD) en DHFR-células ováricas de hámster chino (CHO/DP12; designación de la ATCC CCL 9096). Los clones se seleccionaron en medio menos glicina/hipoxantina/timidina, consultar, por ejemplo, (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)), se juntaron y se expandieron. La proteína de fusión codificada se expresó en cultivos de los clones seleccionados. El medio condicionado procedente de estas células se recolectó, y la proteína recombinante se purificó mediante una columna de afinidad HiTrap con proteína A (Pharmacia). Se produjo una proteína de fusión monomérica, denominada proteína de fusión NRG3^{EGF}.H6, en el mismo sistema que la proteína de fusión Fc, y se purificó a través de una columna de afinidad de cobalto. La NRG3^{EGF}.H6 comprende la etiqueta tag de gD N-terminal, la NRG3_{284-344} múrida, y una secuencia codificante de seis residuos histidina. La purificación se basó en la afinidad de las cadenas laterales de histidina por el cobalto inmovilizado usando una columna de afinidad de cobalto (columna de afinidad de Cobalt, R. Vandlen, Genentech, Inc.). La concentración de proteína se determinó mediante un BioRad Protein Assay (BioRad. Richmond, CA).

B. Generación de las líneas celulares K562^{erbB}

Se derivaron líneas celulares estables que expresaban los receptores ErbB2, ErbB3 o ErbB4 humanos a partir de células K562 (las células K562 tienen la designación de ATCC CCL 243). Los ADNc de los erbB2, erbB3 y erbB4 humanos procedían de L. Bald y G. Scoffer, Genentech (Sliwkowski, M. et al., J. Biol Chem., 269:14661-14665 (1994)). Estos ADNc se subclonaron en vectores de expresión basados en CMV, y se introdujeron en la línea celular de leucemia mieloide humana K562 mediante electroporación (1180 mF, 350 V). Los transfectantes se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con un 10% de suero fetal bovino, glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina, y HEPES 10 mM conteniendo 0,8 mg/ml de G418. Los clones resistentes se obtuvieron mediante dilución limitante, y la expresión del receptor se confirmó mediante transferencia Western y ensayos de unión de NRG. La expresión del receptor se confirmó mediante análisis de transferencia Western usando anticuerpos para cada uno de los receptores ErbB (anticuerpos preparados en Genentech, Inc.). Se halló que estimulación con éster de forbol potenciaba significativamente la expresión del receptor, en ambos transfectantes de ErbB3 y ErbB4, y las líneas celulares K562 transfectadas establemente se cultivaron en medio que contenía 10 ng/ml de forbol, 12-miristato, 12-acetato (PMA) durante la noche antes de su uso.

C. Análisis FACS

Para cada reacción de unión, se suspendieron 5 \times 10^{5} células K562 transfectadas establemente en PBS/2% de BSA, a 4ºC, durante 30 minutos, seguidos por la incubación con 5 \mug de NRG3EGF.Fc aislado y purificado (MW 90 kDa) en un volumen de 0,25 ml, sobre hielo, durante 60 minutos. Se añadieron secuencialmente 1 mg de los anticuerpos primario (anti-gD o anti-receptor ErbB) y secundario conjugado con PE (CALTAG, CA., anti-ratón de cabra, dilución 1:100), con tiempos de incubación de 30-60 minutos, y lavados a fondo antes de cada adición. Los análisis FACS se realizaron en un instrumento FACS de Becton & Dickson. Se prepararon anticuerpos monoclonales anti-gD (5B6), anti-receptor ErbB2 (4D5), anti-receptor ErbB3 (2F9), y anti-receptor ErbB4 (3B9), usando técnicas estándares por parte del Monoclonal Antibody Group, Genentech, Inc.

D. El dominio parecido al EGF de la NRG3 se une específicamente a la tirosín quinasa receptor ErbB4

Para identificar el receptor o receptores de la NRG3, se investigó la capacidad de la NRG3 para unirse a cualquiera de los receptores de neuregulina conocidos. Se generaron líneas celulares estables que expresaban los receptores ErbB2, ErbB3 o ErbB4. La línea celular progenitora K562 no expresa niveles detectables de receptores ErbB (Figura 6A). Las células K562^{erb2}, K562^{erb3} y K562^{erb4} expresaban sólo los correspondientes receptores (Figuras 6B-6D).

Puesto que el dominio parecido al EGF determina la especificidad de unión de las NRG a sus receptores, se expresó y purificó una proteína que contenía una versión etiquetada con epítopo del dominio parecido al EGF de la NRG3, fusionada a la porción Fc de la IgG humana. Usando un ensayo FACS, se observó que la NRG3^{EGF}.Fc se unía a las células que expresaban el receptor ErbB4 (Figura 6H). La unión era específica, ya que la NRG3ECF.Fc no se unió, ni a las células K562 progenitoras, ni a las células que expresaban bien el ErbB2 o el ErbB3 (Figuras 6E-6G). Una proteína de fusión control, la RSE.Fc, no se unió a ninguna de estas líneas celulares. Esta unión de la NRG3^{ECF}.Fc a las células K562^{erb4} era competida, de forma dependiente de la dosis, por el dominio parecido al EGF de la heregulina-\beta1 (NRG1^{EGF}), pero no por la RSE.Fc, sugiriendo que la NRG3^{EGF}.Fc interactúa directamente con los receptores ErbB4 sobre la superficie celular.

Una forma soluble del receptor ErbB4 fue co-inmunoprecipitada por la NRG3^{EGF}.Fc in vitro, demostrando aún más la unión de la NRG3^{EGF}.Fc al receptor ErbB4.

La unión de la NRG3^{EGF}.Fc al receptor ErbB4 se analizó además mediante ensayos de unión competitivos directos usando NRG3^{ECF}.Fc marcada con ^{125}I. Se radioyodó NRG3^{ECF}.Fc purificada usando el procedimiento de la lactoperoxidasa según describieron Sliwkowski et al., (Sliwkowski, M.X. et al., J Biol. Chem., 269, 14661-14665 (1994)). La actividad específica promedio de la proteína marcada fue de 300 \muCi/\mug. La unión de la ^{125}I-NRG3^{EGF}.Fc al ErbB4.Fc inmovilizado se compitió NRG3^{EGF}.Fc o dominio EGF de NRG (rHRG\beta1_{177-244}) de forma dependiente de la concentración.

Los ensayos de unión y desplazamiento se realizaron en Maxisorp C 96-pocillos (Nunc, Naperville, Illinois). El anticuerpo anti-humano de cabra (Boehringer Mannheim, Germany) se depositó sobre la placa a una concentración de 0,2 \mug/well en 100 \mul de tampón de carbonato sódico 50 mM (pH 9,6) a 4ºC, durante la noche. Se bloqueó la placa con 1% de BSA en tampón TBST (Tris 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, 0,02% de Tween 20) durante 30 minutos, a temperatura ambiente. Se añadió una forma soluble del receptor ErbB4 a 15 ng/well en 1% de BSA/TBST, y se incubó durante 1,5 horas a RT. Para prevenir que la proteína radiomarcada interactúa con anticuerpos anti-humano de cabra residuales, se añadió a la placa 1 \muM de un anticuerpo monoclonal humanizado (rhuMAB HER2; Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289 (1992)) durante 20 minutos, y se incluyó en la subsiguiente reacción de unión.

El ensayo de unión competitivo se inició entonces con la adición de 80 pM (200.000 cpm) de ^{125}I-NRG3^{EGF}.Fc junto con varias concentraciones de NRG3^{EGF}.Fc o NRG 1^{EGF} sin marcar (expresados en E. coli, sin Fc). NRG 1^{EGF} es el dominio EGF de la NRG1, y corresponde a los aminoácidos 177-244 de la isoforma neuregulina-\beta1 (Holmes, W.E. et al., Science, 256:1205-1210 (1992)) y se obtuvo de J.A. Lofgren, Genentech, Inc. El volumen final de la incubación fue de 100 \mul en tampón de unión (F-12/medio DMEM medium, HEPES 50 mM, pH 7,5, 2% BSA), y se dejó progresar la reacción a RT durante 1,5. El material no unido se lavó a fondo con TBST, y la radiactividad se contó en un contador de gamma Beckman IsoData (Smith-Kline Beckman, PA). Los datos se analizaron usando un programa de ordenador para regresión.

En base a los resultados de los experimentos de unión, tal como se muestran en las Figuras 6A-6H, se determinó que la afinidad estimada (K_{i}) por la NRG3/EGF.Fc por la unión al ErbB4.Fc era de 9 \pm 4 nM (n = 4), y la K_{i} aparente de la NRG1^{EGF} fue aproximadamente 1 nM. La poca profundidad de la curva de desplazamiento de NRG3^{EGF} puede deberse al hecho de que la NRG3^{EGF}.Fc se expresa como una proteína de fusión con Fc bivalente (Figura 7). Los resultados de los experimentos de control mostraron que el ^{125}INRG3^{EGF}.Fc no une el receptor RSE.Fc en el mismo experimento, y que el RSE.Fc no compete el ^{125}INRG3^{EGF}.Fc unido a ErbB4.Fc.

E. Ensayo de fosforilación de tirosina

La NRG I se une y activa los receptores ErbB2, ErbB3 y ErbB4 que resultan en fosforilación de la tirosina y en sucesos de señalización cadena abajo (Sliwkowski, M.X., et al., supra (1994); Plowman, G.D. et al., supra; y Carraway, K.L. y Cantley, L.C., supra (1994)). Tal como se demostró en el ejemplo precedente, la NRG3 une el receptor ErbB4, pero no los receptores ErbB2 o ErbB3 a un nivel detectable. Se examinó la capacidad del dominio parecido al EGF de la NRG3 (NRG3^{EGF}) para activar el receptor ErbB4, células K562^{erbB4}.

Las células K562erbB4 o las células MDA-MB-453 (control negativo: designación de la ATCC, HB 131) se cultivaron en medio que carecía de suero durante 12 horas, y a continuación se estimularon con NRG3^{EGF}.Fc, NRG^{EGF}.H6 o NRG1^{EGF}. Las células K562^{erbB4} se trataron con 2,5 nM o 25 nM de NRG3^{EGF}.Fc, durante 3 u 8 minutos. Como control positivo, se trataron las células d de forma similar con NRG1^{EGF}.

La fosforilación de la tirosina del receptor ErbB4 se detectó mediante inmunoprecipitación y transferencia Western de acuerdo con el procedimiento siguiente. Se lisaron las células con tampón de lisis (Tris 20 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, NaF 30 mM, EDTA 2 mM, EGTA 2 mM, 0,1% de SDS, 1% de Triton X-100, vanadato sódico 2 mM, molibdato sódico 2 mM, PMSF 2 mM). Después de eliminar los restos celulares mediante centrifugación, se añadió 1 \mug de anticuerpo monoclonal anti-receptor ErbB4 (C-18, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), junto con 20 \mul de relleno de proteína A-agarosa (Sigma, St. Louis, MO). La inmunoprecipitación se realizó a 4ºC, durante la noche, los complejos se recolectaron mediante centrifugación y se lavaron tres veces con 1 ml de tampón de lísis. Las proteínas se separaron mediante electroforesis en gel reductor de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE), sobre minigeles Novex 4%-12%, y se transfirieron a nitrocelulosa. Las transferencias se sondearon con anticuerpo anti-fosfotirosina conjugado con peroxidasa (Transduction Laboratory). La transferencia se limpiaron y se sondearon de nuevo con anticuerpo anti-receptor ErbB4, seguido por anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo conjugado con peroxidasa (Sigma) para visualizar las proteínas receptoras ErbB4.

En base a estos experimentos, se demostró que la NRG3^{EGF}.Fc estimulaba la fosforilación de la tirosina del receptor ErbB4, en ambos instantes, y de manera dependiente de la dosis.

Para confirmar la capacidad de la NRG3^{EGF} para activar la fosforilación de la tirosina del ErbB4, se examinó la activación del receptor en la línea celular MDA-MB-453 de cáncer de mama humana. Esta línea celular expresa niveles elevados de los receptores ErbB2 y ErbB3, y niveles bajos del receptor ErbB4. El tratamiento de la células MDA-MB-453 con la NRG3^{EGF}.Fc, o con una forma monomérica del dominio EGF (NRG3^{EGF}.H6), resultó en un incremento sustancial de la fosforilación de la tirosina del receptor ErbB4.

Los miembros de la familia NRG y otros miembros en la familia EGF exhiben un patrón complejo de unión al receptor. En la mayoría de los casos, un ligando es capaz de unir varias combinaciones de homo- y heterodímeros del receptor (Karunagaran, D. et al., EMBO J., 15:254-264 (1996), Beerli, R.R. y Hynes, N.E., J. Biol. Chem., 271:6071-6076 (1996)). Por ejemplo, las NRG unen heterodímeros del receptor ErbB2/ErbB3 y homodímeros del receptor ErbB4/ErbB4 con elevada afinidad, pero los homodímeros del receptor ErbB3/ErbB3 con baja afinidad (Sliwkowski, M.X. et al., J. Biol. Chem., 269:14661-14665 (1994), Carraway, K.L. y Cantley, L.C., Cell, 78:5-8 (1994), Tzahar, E. et al., J. Biol. Chem., 269:25226-25233 (1994), Carraway, K.L. et al., J. Biol. Chem., 269:14303-14306 (1994), y Kita, Y.A. et al., FEBS Lett., 349:139-143 (1994)). La betacelulina une ambos homodímeros de EGFR y ErbB4 (Riese, D.J. et al., Mol. Cell. Biol., 15:5770-5776 (1995)). Los dominios parecidos al EGF de los miembros de la familia del EGF y la NRG1 determinan la especificidad de activación del receptor (Barbacci, E.G. et al., J. Biol. Chem., 270:9585-9589 (1995)). La limitada homología de secuencia de aminoácidos en los dominios parecidos al EGF de la NRG3 y NRG1 sugiere que la NRG3 puede tener un espectro diferente de interacciones con receptor en relación a los miembros de la familia NRG, pero con sitios de unión solapándose potencialmente, puesto que la unión del dominio parecido al EGF de la NRG3 al ErbB4 puede competirse mediante el dominio parecido al EGF de la NRG1.

La NRG3^{EGF}.Fc no se unió a las células K562, las cuales expresan el ErbB2 o el ErbB3 (Figura 6E-6G), o a las células MDA-MB-486, las cuales expresan niveles elevados del EGFR. Tampoco se observó un incremento en la fosforilación del EGFR, ErbB2 o ErbB3 en las células in MDA-MB-453 tratadas con la NRG3.

Las mayorías de las variantes de NRG, con excepción de la forma específica neural del SMDF, se expresan ampliamente en numerosos tejidos, incluyendo el cerebro, el corazón, el músculo esquelético, la mama, el hígado y el pulmón, entre otros. La betacelulina, un ligando para ambos, el EGFR y el ErbB4, también muestra unos amplios patrones de expresión en tejidos (Shing, Y. et al., Science, 259:1604-1607 (1993); Sasada, R. et al., Biochem. Biophys. Res. Com., 190, 1173-1179 (1993)). Por contra, la expresión de la NRG3 está sorprendentemente restringida al tejido neural, tal como se descubre en la presente invención mediante análisis Northern e hibridación in situ. En relación al desarrollo, el ARNm de la NRG3 puede detectarse tan pronto como E11 (pero no E4) en ratón, a juzgar por la transferencia Northern, y E13, mediante hibridación in situ (la edad más temprana examinada). ErbB4 se expresa predominantemente en cerebro, corazón y músculo esquelético (Plowman, G.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993)). También se observó que el ErbB4 está ampliamente distribuido en los cerebros de embriones de pollo (E14, E17, predominantemente en neuronas) (Francoeur, J.R. et al., J. Neur. Res., 41:836-845 (1995)), en cultivos de retina de rata (Bermingham-McDonogh, O. et al., Development, 122:1427-1438 (1996)), en sinapsis neuromusculares (Zhu. X. et al., EMBO J., 14:5842-5848. (1995)), pero no en células de Schwann de rata y humanas cultivadas (Grinspan, J.B. et al., J. Neuroscience, 16:6107-6118 (1996), Levi, A.D. et al., J. Neuroscience, 15:1329-1340 (1995)). Recientemente, se ha hallado que el ErbB4 se co-localiza con las células GABA+ (Weber, J. et al., Soc Neurosci. Abstr., 22:1579 (1996)). Por tanto, el mismo receptor puede mediar distintas funciones biológicas en diferentes tejidos o tipos celulares cuando interacción con los ligandos correspondientes específicos del tejido. Por ejemplo, la NRG1 puede servir como un ligando para el ErbB4 durante el desarrollo del corazón, la betacelulina puede actuar como un ligando mitogénico para el ErbB4 en una variedad de tipos celulares, mientras que el ligando o ligandos específicos (tales como la NRG3) pueden funcionar como moléculas tróficas o de guía, en células que expresan el receptor ErbB4, en los sistemas nerviosos central o periférico.

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Ejemplo 5 Unión y activación de la tirosín quinasa receptor ErbB4 por parte de las NRG3 de ratón y humana de longitud completa

Se sintetizaron una NRG3 múrida o una NRG3 humana de longitud completa en base a las secuencias de ácido nucleico consensos múrida y humana, respectivamente, SEC. Nº ID.: y SEC. Nº ID.: 5, y las NRG3 se expresaron como secuencias de aminoácidos. En base a los experimentos descritos en la presente invención para la caracterización de la unión de NRG3-EGF y la activación del receptor ErbB4, se realizaron experimentos análogos para las NRG3 consensos de longitud completa procedentes de fuentes humanas y de ratón. Se hicieron ajustes en las condiciones de reacción para optimizar el pH, los solutos y sus concentraciones, y otros parámetros relevantes, para permitir la unión al receptor ErbB4 de la NRG3 consenso de longitud completa, y la activación del receptor ErbB4.

Alternativamente, se sintetizó un fragmento polipeptídico de la NRG3 múrida o humana, que comprendía el dominio parecido al EGF pero carecía del dominio transmembrana, y se ensayó la unión al receptor ErbB4 y su activación tal y como se describe en la presente invención. Tal fragmento de la NRG3 puede, por ejemplo, incluir el dominio extracelular de una NRG3, dominio extracelular que contiene el dominio parecido al EGF.

Un dominio extracelular de la NRG3 puede fusionarse opcionalmente a una región constante de inmunoglobulina, tal y como se muestra en la presente invención para las proteínas de fusión NRG3-EGF-Fc. Se espera que la proteína dominio extracelular de la NRG3-Fc, como una proteína de fusión Fc, forme un dímero. La región constante de inmunoglobulina es preferiblemente de IgG, pero puede tomarse también de IgM, IgA e IgE y permanecer dentro del ámbitos de la invención.

Cuando se desea una proteína de fusión monomérica que retenga la actividad de unión, o la capacidad de unión y activación, el dominio extracelular se fusiona a, por ejemplo, una serie de residuos histidina, tal y como se describe en la presente invención para la inmunoadhesión NRG3-EGF-H6.

Se hicieron ajustes en las condiciones de reacción para optimizar el pH, los solutos y sus concentraciones, y otros parámetros relevantes, para permitir la unión al receptor ErbB4 del fragmento de NRG3, y la activación del receptor ErbB4.

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Ejemplo 6 Potenciación de la proliferación celular

La potenciación de la proliferación celular se ilustra mediante el ensayo siguiente, en el cual se tratan con la NRG3 células que expresan el receptor ErbB4 sobre su superficie. Se sobrentiende que, de acuerdo con la invención, las células pueden tratarse con una fragmento de la NRG3 (tal como el dominio parecido al EGF de la NRG3) o una variante de la NRG3.

Como un ejemplo, se cultivaron células de la retina de rata que expresan de forma natural el receptor ErbB4 (Bermingham-McDonogh, O. et al., Development, 122:1427-1438 (1996)). Las células cultivadas se pusieron en contacto con la NRG3 de manera dependiente de la dosis, y se determinaron un incremento en el número de células (por ejemplo, un 30% de incremento a las 48 horas) y la EC50.

El tratamiento con la NRG3 puede alterar también la morfología de estas células; las células no tratadas eran multipolares, con numerosos procesos ramificados, mientras que las células tratadas con la NRG3 pueden pasar a tener procesos lisos con forma de huso y/o alinearse por sí mismas en una disposición en paralelo.

Se cree que las NRG3 estimulan el crecimiento celular neuronal de manera dependiente de la dosis. Se espera que la NRG3 sola produzca un incremento significativo en el número de células neuronales en comparación con el medio de control. Se pudo observar un efecto sinergístico entre otros potenciadores de la proliferación neuronal, tales como el gas6 (gen específico de la detención del crecimiento; consultar, por ejemplo, Schneider et al., Cell, 54:787-793 (1988); y Manfioletti et al., en Molec. Cell Biol., 13(8):4976-1985 (1993)) o la heregulina. Se espera que la NRG3 incremente tanto el número de células como la incorporación de timidina, como medidas de la proliferación celular.

Se espera que la NRG3 tenga un efecto sobre la morfología celular, tal como se determina observando micrografías con contraste de fase de células neuronales, que expresan el receptor ErbB4, en varios medios que contienen la NRG3 sola o la NRG3 más otros compuestos potenciadores de la proliferación celular, tales como la heregulina, el gas6, el suero fetal bovino, y similares. Las fotomicrografías se toman después de 96 horas de cultivo. Las células cultivadas en presencia de la NRG3 se espera que tengan procesos que no se observan en la células cultivada en ausencia de la NRG3.

Las células se tiñen con marcadores inmunofluorescentes específicos para las células neuronales cultivadas. En resumen, las células neuronales resembradas que expresan el receptor ErbB4 se pusieron en contacto con la NRG3, y se cultivaron durante 24 horas sobre portaobjetos con cámara recubiertos de laminina, y se fijaron en formalina al 10% en PBS. Las células fijadas se bloquearon con suero de cabra al 10%, y se incubaron con anticuerpo anti-marcador derivado de conejo, en las diluciones recomendadas por el distribuidor. La unión específica del anticuerpo primario se observa tiñendo con conjugados anti-conejo de cabra IgG (Fab')_{2}-FITC. Las células se contra-tiñeron con el colorante de ADN yoduro de propidio. Los controles negativos se hicieron sobre células WI-38, las cuales no se tiñen. Las células cultivadas en estas condiciones se espera que exhiban un 100% de tinción inmunofluorescente para los marcadores celulares.

La capacidad de la NRG3 para estimular la proliferación en células neuronales, que expresan el receptor ErbB4, a través de los receptores tirosín quinasa ErbB4, puede investigarse como sigue. Las células se estimularon con varias cantidades de NRG3 (por ejemplo, de 0 a 200 nM), durante 15 minutos, en un incubador a 37ºC. Los lisados de células se prepararon e inmunoprecipitaron con un anticuerpo anti-receptor ErbB4. La fosforilación de la tirosina del receptor ErbB4 se detectó con anticuerpo anti-fosforilación 4G 10. Aproximadamente se cultivaron 10^{6} células, hasta cerca de la confluencia, en medio definido. Las células se trataron con NRG3 durante 15 minutos en un incubador a 37ºC, y se lisaron sobre hielo con 1 ml de tampón de lisis (HEPES 20 mM, pH 7,4, NaCl 135 mM, NaF 50 mM, vanadato sódico 1 mM, y molibdato sódico 1 mM, EDTA 2 mM y EGTA 2 mM EGTA, 10% de glicerol, 1% de NP40, ácido okádico 1 \muM, PMSF 1 mM PMSF y AEBSF 1 mM). Los lisados de células se clarificaron mediante centrifugación a 14.000 \times g, a 4ºC, durante 10 minutos. Las inmunoprecipitaciones se realizaron usando aproximadamente 1 \mug de anticuerpo de conejo anti-receptor ErbB4 o 2 \mul de antisuero de conejo anti-receptor ErbB4. Los inmunocomplejos se recolectaron con 10 \mul de cuentas CL-4B de Proteína A-Sepharose. Las proteínas se separaron sobre un gel con Novex con gradiente 4-12%, y se transfirieron sobre membrana de nitrocelulosa. Las inmunotransferencias anti-fosfotirosina se realizaron usando el anticuerpo de ratón anti-tirosina 4G10 (UBI), el conjugado de anti-ratón de cabra y peroxidasa de rábano silvestre, y el equipo de revelado ECL (Amersham). La adición de la NRG3 a las células neuronales que expresaban el receptor ErbB4 se espera que cause la autofosforilación del residuo o residuos tirosina del receptor ErbB4.

Es beneficioso tener poblaciones de células neuronales de mamífero (preferiblemente células humanas) para usarlas como prótesis celulares para su trasplante en áreas de la médula espinal dañadas, en un esfuerzo para influir en la regeneración de los axones centrales interrumpidos, para ayudar en la reparación de las lesiones de los nervios periféricos, y como alternativas para múltiples autoinjertos. Consultar Levi et al., J. Neuroscience, 14(3):1309-1319 (1994). El uso de las técnicas de cultivos celulares para obtener una fuente abundante de material de injerto autólogo a partir de una pequeña biopsia ya se ha alcanzado, con éxito clínico al proporcionar células epidérmicas humanas para cubrir quemaduras extensas (Gallico et al., N. Eng J. Med., 311:338-451 (1984)). En consecuencia, se espera que la estrategia anterior será exitosa en los mamíferos, incluyendo los humanos.

Aunque la presente invención se ilustra con referencia a realizaciones específicas, la invención no está limitada de ese modo. Se sobrentenderá que son posibles modificaciones y variaciones adicionales sin apartarse del concepto general de la invención. Todas esas modificaciones se pretende que estén dentro del ámbito de la presente invención.

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Depósito de material

Los siguientes materiales se han depositado con la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, EE.UU. (ATCC):

2

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Estos depósitos se hicieron bajo las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento en Materia de Patentes, y las Regulaciones bajo el mismo (Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años a partir de la fecha de depósito. El depósito se hara asequible por parte de la ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest, y sometido a un acuerdo entre Genentech, Inc. y la ATCC, que asegura una disponibilidad permanente y no restringida de la progenie del cultivo del depósito al público a partir de la concesión de la pertinente patente estadounidense o a partir de la exposición al publico de cualquier solicitud de patente estadounidense o de país extranjero, cualquiera que suceda primero, y asegura la disponibilidad de la progenie para alguien determinado por el U.S. Commissioner of Patents and Trademarks como con derecho a la misma de acuerdo con los artículos 35 y 112 de la USC y las normas del Commissioner en relación a lo mismo (incluyendo el 37 CFR 1.14, con particular referencia a
886 OG 638).

En relación a aquellas designaciones en las cuales se intenta conseguir una Patente Europea, una muestra del microorganismo depositado se hará disponible, hasta la publicación de la mención de la concesión de la Patente Europea, o hasta la fecha en que la solicitud haya sido rechazada o retirada, o se estime que será retirada, sólo mediante la entrega de tal muestra a un experto nombrado por la persona solicitante de la muestra. (Regla 28(4) EPC).

El cesionario de la presente aplicación ha aceptado que, si un cultivo de los materiales en depósito muriese o se perdiera o fuera destruido cuando se cultiva en condiciones apropiadas, los materiales serán remplazados con prontitud, a partir de la notificación, con otros del mismo tipo. La disponibilidad del material de depósito no debe considerarse como una licencia para practicar la invención en contravención de los derechos garantizados bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patentes.

La memoria escrita precedente se considera que es suficiente para permitir que un especialista en el campo practique la invención. La presente invención no debe limitarse en su ámbito por la construcción depositada, puesto que la realización depositada se pretende que sea una sencilla ilustración de ciertos aspectos de la invención, y cualquier construcción que sea funcionalmente equivalente se halla dentro del ámbito de esta invención. El material depositado de la presente invención no constituye una aceptación de que la descripción escrita en la presente invención es inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el mejor modo de la misma, ni debe considerarse como limitante del ámbito de las reivindicaciones a las ilustraciones específicas que éste representa. Más aún, varias modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas en la presente, serán evidentes para los especialistas en el campo a partir de la descripción precedente, y se hallan dentro del ámbito de las reivindicaciones anexas.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: Genentech, Inc.

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Ligandos relacionados con la neuregulina específica del receptor ErbB4 y usos de los mismos.

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 23

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(iv)

DIRECCIÓN POSTAL:

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(A)

DESTINATARIO: Genentech, Inc.

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(B)

CALLE: 1 DNA Way

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(C)

CIUDAD: South San Francisco

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(D)

ESTADO: California

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(E)

PAIS: EE.UU.

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(F)

CÓDIGO POSTAL: 94080

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(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: disco flexible de 3,5 pulgadas, 1,44 Mb

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(B)

ORDENADOR: compatible con IBM PC

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

PROGRAMA: WinPatin (Genentech)

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(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE REGISTRO:

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(viii)

ABOGADO/AGENTE DE INFORMACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

A)

NOMBRE: Conley, Deirdre L.

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 36.487

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: P1084R1PCT

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIONES:

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(A)

TELÉFONO: 650/225-2066

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 650/952-9881

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº ID.: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2538 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

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(C)

HEBRA: Sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

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(ix)

CARACTERÍSTICAS:

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(A)

NOMBRE/CLAVE: ácido nucleico de la NRG3 de ratón

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(B)

UBICACIÓN: 1-2538

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(C)

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID.: 1:

102

3

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº ID.: 2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 713 aminoácidos

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(B)

TIPO: Aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

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(ix)

CARACTERÍSTICAS:

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(A)

NOMBRE/CLAVE: sec. de aminoácidos de la NRG3 de ratón (mNRG3)

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(B)

UBICACIÓN: 1-713

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(C)

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID.: 2:

103

6

7

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº ID.: 3:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 362 aminoácidos

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(B)

TIPO: Aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: sec. de aminoácidos del dominio extracelular de la mNRG3

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1-362

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:3:

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº ID.: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 47 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: sec. de aminoácidos del dominio parecido al EGF de la NRG3

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1-47

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:4:

\vskip1.000000\baselineskip

104

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº ID.: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2502 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: Sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: NRG3B1 humana (hNRG3B1) / sec. de ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1-2502

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:5:

\vskip1.000000\baselineskip

10

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº ID.: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 720 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: secuencia de aminoácidos de la hNRG3B1

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1-720

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:6:

\vskip1.000000\baselineskip

13

14

15

16

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº ID.: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 360 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: dominio extracelular de la hNRG3/Sec. de aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1-360

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:7:

\vskip1.000000\baselineskip

17

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº ID.: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 47 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: dominio parecido al EGF de la NRG3/sec. de aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1-47

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:8:

\vskip1.000000\baselineskip

105

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº ID.: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 48 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: cARIA.egf

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1-48

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:9:

\vskip1.000000\baselineskip

106

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº ID.: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 45 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: hAR.egf

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1-45

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:10:

107

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº ID.: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 45 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: hBTC.efg

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1-45

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:11:

\vskip1.000000\baselineskip

108

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº ID.: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 46 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: hEGF.egf

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1-46

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0:12:

\vskip1.000000\baselineskip

109

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº ID.: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 45 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: hHB-EGF.egf

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1-45

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:13:

\vskip1.000000\baselineskip

110

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº ID.: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 49 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: hHRGalpha.egf

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1-49

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:14:

\vskip1.000000\baselineskip

111

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº ID.: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 48 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: hHRGbeta.egf

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1-48

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:15:

\vskip1.000000\baselineskip

112

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº ID.: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 45 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: hTGFalpha.egf

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1-45

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:16:

\vskip1.000000\baselineskip

113

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº ID.: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 45 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: mEPR.egf

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1-45

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:17:

\vskip1.000000\baselineskip

114

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº ID.: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 50 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleotídica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1-50

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:18:

\vskip1.000000\baselineskip

115

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº ID.: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: proximal 1 del transmembrana de la hNRG3B1

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1-8

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:19:

\vskip1.000000\baselineskip

116

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº ID.: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: proximal 2 del transmembrana de la hNRG3B1

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1-9

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:20:

\vskip1.000000\baselineskip

117

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº ID.: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 466 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: Sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Entrada EST H23651 en Genebank

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1-466

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:21:

\vskip1.000000\baselineskip

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº ID.: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2091 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: Sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: NRG3B2 humana (hNRGB2)

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1-2091

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

20

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº ID.: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 696 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: NRG3B2 humana

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1-696

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:23:

\vskip1.000000\baselineskip

22

23

24

25

Claims (52)

1. Polipéptido aislado, polipéptido que es capaz de unirse al receptor ErbB4, pero no al receptor ErbB2 o al receptor ErbB3, y se selecciona del grupo consistente en

(a)

polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75% de identidad de secuencia con el dominio extracelular de la neuregulina 3 (NRG3) codificada por las SEC. Nº ID.: 3 o 7; y

(b)

polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75% de identidad de secuencia con la SEC. Nº ID.: 2, SEC. Nº ID.: 6, o SEC. Nº ID.: 23.

2. El polipéptido según la reivindicación 1, que comprende el dominio parecido al EGF de la SEC. Nº ID.: 4.

3. El polipéptido según la reivindicación 1 ó 2, en donde el polipéptido es capaz además de activar la fosforilación de tirosinas del receptor ErbB4.

4. El polipéptido según la reivindicación 1 ó 2, en donde el polipéptido estimula la fosforilación de tirosina del receptor ErbB4.

5. El polipéptido según la reivindicación 1 codificado por una secuencia de marco de lectura abierta de un ácido nucleico de NRG3 en ATCC, depósito 209.156 (pLXSN.mNRG3).

6. El polipéptido según la reivindicación 1 codificado por una secuencia de marco de lectura abierta de un ácido nucleico de NRG3 en ATCC, depósito 209.157 (pRK5.tk.neo.hNRG3B1).

7. El polipéptido según la reivindicación 1 codificado por una secuencia de marco de lectura abierta de un ácido nucleico de NRG3 en ATCC, depósito 209.297 (pRKS.tk.neo.hNRG3B2).

8. El polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que carece de un dominio citoplasmático, o carece de un dominio transmembrana que puede anclar el polipéptido en una membrana celular, de o ambos.

9. El polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes no acompañado por la glicosilación nativa.

10. El polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que tiene una variante de glicosilación.

11. Anticuerpo antagonista del polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. El anticuerpo según la reivindicación 11 que bloquea la unión del receptor ErbB4.

13. Anticuerpo agonista del polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

14. El anticuerpo según la reivindicación 13 que se une al receptor ErbB4.

15. Molécula de ácido nucleico aislada que codifica el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

16. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 15 que codifica el dominio extracelular de una NRG3 de mamífero, en donde el dominio extracelular codificado tiene al menos un 75% de identidad de secuencia de aminoácidos de la SEC. Nº ID.: 3 o SEC. Nº ID.: 7.

17. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 15 en donde la secuencia de aminoácidos codificada carece de un dominio citoplasmático, o de un dominio transmembrana que puede anclar el polipéptido en una membrana celular, o de ambos.

18. Vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, unida operativamente a secuencias de control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector.

19. Vector de expresión según la reivindicación 18, obtenible como ATCC 209.156 (pLXSN.mNRG3).

20. Vector de expresión según la reivindicación 18, obtenible como ATCC 209.157 (pRK5.tk.neo.hNRG3B1).

21. Vector de expresión según la reivindicación 18, obtenible como ATCC 209.297 (pRK5.tk.neo.hNRG3B2).

22. Célula huésped que comprende el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21.

23. La célula huésped según la reivindicación 22, la cual es una célula de mamífero.

24. La célula huésped según la reivindicación 23, la cual es una línea celular ovárica de hámster chino.

25. Procedimiento para producir la secuencia de aminoácidos que codifica un dominio parecido al EGF que se une al receptor ErbB4, comprendiendo el procedimiento:

(a)

cultivar una célula que comprende el ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17; y

(b)

recuperar el polipéptido del cultivo celular.

26. El procedimiento según la reivindicación 25, en donde el polipéptido se secreta al medio de cultivo y se recupera del medio de cultivo.

27. Anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

28. Línea celular de hibridoma que produce el anticuerpo según la reivindicación 27.

29. Inmunoadhesina que comprende el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, fusionado a una secuencia de inmunoglobulina.

30. La inmunoadhesina según la reivindicación 29, que comprende además el dominio parecido al EGF de la SEC. Nº ID.: 4.

31. La inmunoadhesina según la reivindicación 29, en donde la secuencia de inmunoglobulina es una secuencia de dominio constante de la cadena pesada de inmunoglobulina.

32. La inmunoadhesina según la reivindicación 31, en donde la secuencia de inmunoglobulina es una secuencia de dominio constante de una IgG1, IgG-2 o IgG-3.

33. La inmunoadhesina según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32, en donde la inmunoadhesina es un agonista del receptor ErbB4.

34. La inmunoadhesina según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32, en donde la inmunoadhesina es un antagonista del receptor ErbB4.

35. Procedimiento de detección de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en una muestra, comprendiendo el procedimiento:

a)

poner en contacto el anticuerpo según la reivindicación 27 con la muestra;

b)

detectar la unión del anticuerpo a un polipéptido en la muestra, en donde el polipéptido es una NRG3.

36. Procedimiento para detectar el receptor ErbB4 en una muestra, procedimiento que comprende:

a)

poner en contacto el polipéptido según una cualquiera de la reivindicaciones 1 a 10 con la muestra; y

b)

detectar la unión de la secuencia de aminoácidos a una proteína en la muestra.

37. El procedimiento según la reivindicación 36, en donde la muestra comprende una célula que expresa el receptor ErbB4 sobre su superficie.

38. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37, en donde la muestra es una muestra de tejido de mamífero.

39. Polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17 ó 27, una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, o una inmunoadhesina según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 34, para su uso en terapia.

40. Uso de una célula capaz de secretar una molécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, 27, ó 29 a 34, para la preparación de un médicamente para el tratamiento o prevención de una lesión a una célula que expresa la NRG3 o responde a la NRG3, en donde la célula secreta la molécula.

41. El uso según la reivindicación 40, en donde la célula que expresa la NRG3 o responde a la NRG3 es una célula nerviosa.

42. El uso según la reivindicación 40 ó la reivindicación 41, en donde la célula está contenida dentro de una matriz porosa.

43. Uso de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, de un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 13, 14 ó 27, o de una inmunoadhesina según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 34, para la preparación de un medicamento para potenciar el crecimiento, proliferación y/o diferenciación de la célula neural.

44. Uso de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, de un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 13, 14 ó 27, o de una inmunoadhesina según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 33, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno neurológico aliviado por la promoción del crecimiento, proliferación y/o diferenciación celular.

45. El uso de la reivindicación 44, en donde el trastorno es uno en el que el sistema nervios ha sido dañado por trauma, cirugía, apoplejía, isquemia, infección, trastorno metabólico, deficiencia nutricional, cáncer, o agentes tóxicos.

46. El uso de la reivindicación 44, en donde el trastorno neurológico es un trastorno de motoneurona, un trastorno neurodegenerativo, o una neuropatía.

47. El uso de la reivindicación 46, en donde el trastorno de la motoneurona es la esclerosis lateral amiotrófica (enfermedad de Lou Gehrig), parálisis de Bell, atrofia muscular espinal, o parálisis.

48. El uso de la reivindicación 46, en donde el trastorno neurodegenerativo es la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la epilepsia, la esclerosis múltiple, la corea de Huntington, el síndrome de Down, la sordera nerviosa, y la enfermedad de Meniere.

49. El uso de la reivindicación 46, en donde la neuropatía es una neuropatía periférica, y se adquiere genéticamente, resulta de una enfermedad sistémica, o es inducido por un agente tóxico.

50. El uso de la reivindicación 49, en donde la neuropatía es el síndrome post-polio, la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, la enfermedad de Refsum, la abetalipoproteinemia, la enfermedad de Tangier, la enfermedad de Krabbe, la leucodistrofia metacromática, la enfermedad de Fabry, el síndrome de Dejerine-Sottas, o es inducida por un agente quimioterapéutico.

51. Uso de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1, ó 4 a 10, de un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 11, 12 ó 27, o de una inmunoadhesina según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32 ó 34, para la preparación de un medicamento para prevenir el crecimiento, la proliferación y/o la diferenciación de la célula neural.

52. Uso de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1, ó 4 a 10, de un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 11, 12 ó 27, o de una inmunoadhesina según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32 ó 34, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno neurológico aliviado por la prevención del crecimiento, proliferación y/o diferenciación celular.