JP2009028049A - 単離されたホモ接合性幹細胞、これ由来の分化細胞、ならびにこれを作製及び使用するための材料及び方法 - Google Patents

単離されたホモ接合性幹細胞、これ由来の分化細胞、ならびにこれを作製及び使用するための材料及び方法 Download PDF

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Abstract

【課題】細胞療法のならびに移植のための細胞、細胞の塊、組織及び器官の生産の細胞の源として使用できる、単離されたホモ接合性幹細胞の新規で改良された生産方法を提供する。
【解決手段】本発明は、多分化能性ホモ接合性幹（ＨＳ）細胞、ならびにこれを作製するための方法及び材料を開示するものである。本発明はまた、ＨＳ細胞の前駆（多能性）細胞または他の所望の細胞、細胞の群若しくは組織への分化方法を提供するものである。さらに、本明細書で開示されるＨＳ細胞の用途としては、（以下に制限されないが）様々な病気（例えば、遺伝病、神経変性疾患、内分泌関連障害及び癌）、外傷性損傷の診断及び治療、美容及び治療のための移植、ならびに遺伝子治療及び細胞置換療法が挙げられる。
【選択図】なし

Description

Ｉ．発明の分野
本発明は、多分化能性(pluripotent)ホモ接合性幹（ＨＳ）細胞、ならびにこれを作製するための方法及び材料を開示するものである。本発明はまた、ＨＳ細胞の前駆細胞または他の所望の細胞、細胞の群若しくは組織への分化方法を提供するものである。さらに、本明細書で開示されるＨＳ細胞は、遺伝病、神経変性疾患、内分泌関連障害及び癌、外傷性損傷等の、様々な病気の診断及び治療、美容及び治療のための移植、ならびに遺伝子治療及び細胞置換療法に使用されうる。
ＩＩ．発明の背景および関連技術の説明
１９８１年に、Evans and Kaufmanが、マウスの胚盤胞から胚幹（ＥＳ）細胞を単離する技術を記載した。Establishment in Culture of Pluripotent Cells from Mouse Embryos," Nature 292:154-6 (1981)。この技術では、内部細胞塊（ＩＣＭ）を用いて、未分化でありかつ多分化能性であり続ける細胞を得た、即ち、この細胞はいずれかの細胞型に発達できる能力を有していた。さらに、ＥＳ細胞系が、ニワトリ(Pain et al, Development 122:2339-48 (1996))、ハムスター(Doetschmann et al., Dev. Biol. 127:224-7 (1988))、ブタ(Wheeler et al., Reprod. Fertil. Dev. 6:563-8 (1994))、マーモセット(Thompson et al., Biol. Reprod. 55:254-9 (1996))、及びアカゲザル（(Thompson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844-8 (1995))等の他の動物モデルで生産された。
Saito et al., Roux’s Arch. Dev. Biol., 201:134-141 (1992)は、３継代生存したが、４継代目以降は失われたウシ胚性幹細胞様細胞系を報告した。さらに、Handyside et al., Roux's Arch. Dev. Biol., 196:185-190 (1987)は、マウスの内部細胞塊（ＩＣＭ）由来のマウスのＥＳ細胞系を単離させる条件下でヒツジ胚の免疫手術により単離された内部細胞塊の培養を開示した。さらに、このような条件下では、ヒツジのＩＣＭが付着し、拡張し、ＥＳ細胞様及び内胚葉様細胞双方の領域を発達させたが、長期間の培養後では、内胚葉様細胞のみが明らかであることが報告された。Ｉｄ．
より初期には、ＥＳ細胞が、マウスの胚盤胞にインビボで注入されると、レシピエント胚中に取り込まれて、生殖系等の、多くの異なる組織型に寄与することが決定された。Stewart et al., "Stem Cells from Primordial Germ Cells Can Reenter the Germ Line," Dev. Biol. 161:626-8 (1984)。また、Bradley et al., Nature 309: 255-256 (1984)を参照。
近年、Cherny et al., Theriogenology, 41:175 (1994)は、多分化能性ウシ原始生殖細胞が長期間培養物中に維持される細胞系を誘導することを報告した。７日培養した後、このような細胞はアルカリホフファターゼ（ＡＰ）で陽性に染色され、胚様体の形成能を示し、さらに少なくとも２個の異なる細胞型に自発的に分化するＥＳ様コロニーを生産した。これらの細胞はまた、転写因子ＯＣＴ４、ＯＣＴ６及びＨＥＳ１のｍＲＮＡを発現することが報告された。
Campbell et al., Theriogenology, 43:181 (1995)（要約）には、マウスのＥＳ細胞系の単離を促進するような条件下で培養される、９日ヒツジ胚から培養胚盤（ＥＤ）を核転移した後、生きた小羊を生産したことが報告された。これらの結果に基づいて、著者らは、９日ヒツジ胚からのＥＤ細胞は核転移によって全能性であり、全能性は３継代までは培養物中に維持されると結論した。Campbell et al., Nature, 380:64-68 (1996)はさらに、培養細胞系からの核転移によるヒツジのクローニングを報告した。
Van Stekelenburg-Hamers et al., Mol. Reprod. Dev., 40:444-454 (1995)は、ウシ胚盤胞のＩＣＭ細胞から永久であると称される細胞系の単離及び特徴を報告した。著者らは、異なる条件下で８または９日ウシ胚盤胞からＩＣＭを単離、培養して、どのフィーダー細胞及び培地がウシＩＣＭ細胞の付着及び増殖を支持するのに最も効率的であるかを決定した。彼らは、培養ＩＣＭ細胞の付着及び増殖が、（ウシ子宮上皮細胞の代わりに）ＳＴＯ（マウス線維芽細胞）フィーダー細胞を使用することによって、および培地に捕捉するのに（正常血清ではなく）木炭剥離血清(charcoal stripped serum)を使用することによって促進することを、結果に基づいて結論した。しかしながら、Van Stekelenburg et al.は、その細胞系は、多分化能性ＩＣＭ細胞より上皮細胞により似ていることを報告している。Ｉｄ．
１９９４年１０月２７日に公開された、Smith et al.、ＷＯ ９４／２４２７４号、１９９０年４月５日に公開された、Evans et al.、ＷＯ ９０／０３４３２号、及び１９９４年１１月２４日に公開された、Wheeler et al.、ＷＯ ９４／２６８８９号には、形質転換動物を得るのに使用されると称される動物の幹細胞の単離、選択及び増殖が報告された。また、１９９０年４月５日に公開された、Evans et al.、ＷＯ ９０／０３４３２号には、形質転換動物の生産を目的とした、ブタ及びウシ種由来の多分化能性であると称される胚性幹細胞の誘導が報告された。さらに、１９９４年１１月２４日に公開された、Wheeler et al.、ＷＯ ９４／２６８８４号には、キメラ及び形質転換有蹄動物の製造を目的とする、胚性幹細胞が開示された。
核移植に有蹄動物のＩＣＭ細胞を使用することもまた報告された。例えば、Collas et al., Mol. Reprod. Dev., 38:264-267 (1994)には、除核された成熟卵母細胞中に溶解ドナー細胞をマイクロインジェクションすることによるウシＩＣＭの核移植の技術が開示された。この参考文献には、７日間インビトロで胚を培養して、１５個の胚盤胞を得、これらは、ウシレシピエントに転移すると、４回の妊娠及び２回の誕生を生じたことが開示された。また、Keefer et al., Biol. Reprod., 50:935-939 (1994)には、核転移処置にウシＩＣＭ細胞をドナー核として使用して、胚盤胞を生産し、これからウシレシピエントに移植すると幾つかの生きた子孫を得たことが開示された。さらに、Sims et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:6143-6147 (1993)には、除核された成熟卵母細胞中に短期間インビトロで培養されたウシＩＣＭ細胞を転移することによってコウシが生産されたことが開示された。
短期間培養された胚盤細胞（３継代まで）の核転移後の生きたコヒツジの生産が報告された(Campbell et al., Theriogenology, 43:181 (1995))。さらに、核転移でのウシ多分化能性胚細胞の使用及びキメラ胎児の生産もまた報告された(Stice et al., Theriogenology, 41:301 (1994))。
より近年では、２００１年４月２６日に公開され、Advanced Cell Technology（ＡＣＴ）に譲渡された、Cibelli et al, ＷＯ ０１／２９２０６号には、胚盤胞の内部細胞塊から単離された、ヒトを含む、哺乳動物のＥＳ細胞を分化させて、同種同系、同種異系、および／または異種移植用の細胞及び器官を得ることが開示された。しかしながら、開示された幹細胞は、本発明とは異なり受精胚から作製された。さらに、ＡＣＴでの研究者らによる非受精胚からの幹細胞の作製努力はうまくいかなかった、Washington Post, "First Human Embryos Are Cloned in US," November 26, 2001を参照。
前記に基づいて、多くのグループがＥＳ細胞系を生産しようと試みていることは明らかである。主にＥＳ細胞が多分化能性であり、ゆえに成熟した、分化した、機能性細胞を生じうるため、ＥＳ細胞が受け入られたことに注目される。しかしながら、ＥＳ細胞の治療のための及び予防のための用途が有望であるにもかかわらず、ＥＳ細胞の使用は様々な倫理的な問題がある。ＥＳ細胞は、前記段落で記載したように、卵母細胞の受精時に発達する胚盤胞由来である。ゆえに、ＥＳ細胞は、本来、犠牲にするために明らかに作製される潜在的に生育可能な胚由来であり、またはこれから集められる。
さらに、ＥＳ細胞の使用または発達と関連する技術的な問題がある。例えば、他の個体由来の、例えば、現在存在する細胞系由来の、ＥＳ細胞は、不適合なレシピエントに移植されると免疫反応性を生じるかもしれず、また、体細胞核転移由来のＥＳ細胞は、核ドナーの寿命中に起こる遺伝子の突然変異が多分化能性細胞系に起こるであろうため、治療用途にはあまり理想的ではない。
しかしながら、ＥＳ細胞などの、多分化能性細胞は、損傷を受けた神経を修復しその機能を回復することによって、または置換組織若しくは器官の源を提供することによって、遺伝病、神経変性疾患、及び癌等の病気を処置するのに治療上使用できるため、非常に有用である。多分化能性細胞はまた、生殖細胞系キメラを生じうるまたは次世代にゲノムを転移できるため、発達生物学の研究に、および移植療法に使用できる。
ゆえに、他の源の多分化能性細胞の発達は、当該分野において必要である。本発明は、このような源を提供するものである。一実施態様においては、本発明は、（ａ）２個の卵母細胞または２個の精子細胞を融合する；（ｂ）卵形成中の第二極体の放出(extrusion)を防止する；（ｃ）適当な条件下で第二極体の放出及び自発的なゲノムの自己複製を行なわせる；または（ｄ）２個の１倍体卵または精子核を除核した卵母細胞に移すことによって作製される胚盤胞様塊から単離される単離されたホモ接合性幹（ＨＳ）細胞を提供するものである。加えて、ホモ接合性である幹細胞に関するスクリーニングは、方法（ａ）または（ｂ）を使用する際には、遺伝子型別(genotyping)を用いて行なわれる。
本発明のＨＳ細胞は、多分化能性であり、また、非受精であり、生育可能な胚に発達できない細胞塊から単離されるため、倫理的な問題が生じない。さらに、ヘテロ接合性ＥＳ細胞系を組織または細胞移植療法に使用する、またはバンクおよび／または寄託機関に維持される際に、免疫組織適合性マッチングが達成しにくい。これは、Advanced Cell Technology及び他の機関によって開発されたものなどの、ＥＳ細胞系は、受精胚または成体分化細胞を用いた核転移技術由来であり、ゲノム的にヘテロ接合性であるためである。本発明の多分化能性細胞はホモ接合性である（ヘテロ接合性が最小限であるまたはホモ接合性が均一である）ため、このような細胞は、現在利用されているＥＳ細胞系を用いた移植、細胞置換、及び遺伝子療法技術によって、またはＥＳ細胞系をバンクおよび／または寄託機関に維持される際に直面する免疫組織適合性を解消するのに使用される。
配偶子形成中、ヘテロ接合性生殖細胞、即ち、父親及び母親双方の染色体を有する生殖細胞は、減数分裂を受ける。１回目の減数分裂（減数分裂Ｉ）では、相同染色体が分離して、交差の現象のため、ある程度ヘテロ接合性である父親または母親のいずれかの染色体が導入される２個のホモ接合性娘細胞を形成する。さらに、卵形成中に、１個の娘細胞（第一極体）の放出が観察される。他の娘細胞は、分裂中期ＩＩで停止する。このような分裂中期ＩＩの２倍体の卵母細胞が、最小限のヘテロ接合性を有するホモ接合性幹細胞を誘導するのに使用されてもよい。
適当な活性化で、分裂中期ＩＩの卵母細胞を、一方の染色分体（即ち、第二極体）の放出によって減数分裂を終了して、１倍体細胞を得るように処理してもよい。このような減数分裂が終了した１倍体卵母細胞は、細胞分裂を伴わずに自己複製して、２倍体に及び均一にホモ接合性にする。ゆえに、このような減数分裂が終了した１倍体卵母細胞は、ヘテロ接合性を有さない本発明のホモ接合性幹細胞を作製するのに使用されてもよい。また、Kaufman M.H., Robertson E.J., Handyside A.H., Evans M.J., "Establishment of pluripotential cell lines from haploid mouse embryos," J. Embryol. Exp. Morphol., 73:249-61 (1983)を参照。
ヘテロ接合性が最小限であるＨＳ細胞よ均質なホモ接合性を有するＨＳ細胞とは双方とも、ホモ接合性幹細胞が２セットの同一の主要組織適合抗原（ＭＨＣ）のハプロタイプを含みうるという点で、ヘテロ接合性ＥＳ細胞を有する幹細胞（受精胚性胚、治療のためのクローニング胚、及び成体幹細胞を用いることにより誘導されるものなど）に比べて優れている。したがって、ドナー及び移植療法の必要な個体間の免疫組織適合性マッチングはＨＳ細胞でより容易に達成される。一つのＭＨＣハプロタイプについてホモ接合性であるこのような幹細胞は、同一のハプロタイプを有するレシピエントによってのみでなく、親のハプロタイプのいずれかで同一のＭＨＣ成分を有するレシピエントによっても、許容される。
さらに、ヒトＭＨＣの遺伝子座は第６染色体上の４Ｍｂ内にあり、ＭＨＣ対立遺伝子は、一般的に総括的に受け継がれる。ＭＨＣ対立遺伝子の組み合わせによっては、集団においてかなりより高い頻度で共有しており、例えば、１５個の最も共通するＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−ＤＲのハプロタイプが２１．３％の白色アメリカ人で共有され、ハプロタイプ頻度の同様の考察が、他の民族学的な背景に見られる、Mori, M. et al., "HLA gene and haplotype frequencies in the North American population: the National Marrow Donor Program Donor Registry", Transplantation, 64(7): 1017-27 (1997)。このような関連平衡異常を支持するこのような証拠を考慮すると、非受精の、減数分裂Ｉ後の(post-meiosis I)２倍体生殖体由来のＨＳ細胞を使用することによって、組織または細胞移植用の幹細胞バンクまたは寄託機関に維持される必要のある免疫学的に異なる細胞系の数を減らすことができる。
ゆえに、潜在的に、異なるハプロタイプについてホモ接合性である数百の幹細胞系があれば、主要な集団にマッチするのに十分であろう。この数は、胚性幹細胞由来の幹細胞系、成体幹細胞、または治療のためのクローニング幹細胞用のバンクまたは寄託機関を維持する必要のあるハプロタイプの数に対して非常により小さいものである。例えば、２００個のハプロタイプ毎に、２０，０００を超えるヘテロ接合性の可能性がある。
したがって、本発明は、一実施態様においては、遺伝病、例えば、血友病、糖尿病、ハンチントン病等を、処置するのにレシピエントに関連するメスドナーの非受精の卵母細胞由来でありうるＭＨＣの遺伝子座及び野生型（正常な）遺伝子に関してホモ接合性である幹細胞を提供するものである。本発明のＨＳ細胞系では異常な（病気を引き起こす）対立遺伝子が排除される利点というは、現在利用されているＥＳ細胞系では現時点では達成できない。
奇形腫は、３種の胚葉のいずれかの正常な誘導体と似ている様々な組織要素から構成される良性腫瘍である。自然界で見出される奇形腫は、３種の胚葉、即ち、外胚葉、中胚葉及び内胚葉のいずれかを代表とする要素への分化能を有する、２倍体の全能細胞、具体的には非受精の生殖細胞由来である。奇形腫の源に関する科学的な理論は、隔離全能割球または原始生殖細胞が不完全に双生し、腫瘍的に増殖し、体細胞の核における全能遺伝子情報が抑制解除されて、生殖細胞が単為生殖により発達することを含む。
自然発生する自発的な奇形腫(spontaneous teratoma)は、２倍体、場合によっては多倍数体である(Surti et al., Am. J. Hum. Gene. 47:635-643 (1990))。２倍体の奇形腫組織は、減数分裂Ｉに従属して、または第二極体と卵細胞との融合によって起こると考えられる(Eppig and Eicher, Genetics, 103:797-812 (1 983); Eppig and Eicher, J. Hered., 79:425-429 (1988))。さらに、奇形腫は、ヘテロ接合性宿主において遺伝学的にホモ接合性であることが分かった(Linder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 63:699-704 (1969); Linder and Power, Ann. Hum. Genet. 34:21-30, (1970); Linder et al., Nature, 254:597-598 (1975); Kaiser-McCaw et al., Cytogenet. Cell. Genet., 16:391-395 (1975))。しかしながら、以降の研究では、このような結果を矛盾なく再現することができなかった(Surti et al., Am. J. Hum. Gene., 47:635-643 (1990); Carritt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:7400-7404 (1982); Parrington et al., J. Med. Genet., 21:1-12 (1984); Deka et al., Am. J. Hum. Genet., 47:644-655 (1990); Dahl et al, Cancer Genet. Cytogenet., 46:115-123 (1990))。
他の腫瘍と比べると、奇形腫は特有の組織学的な特徴を示す。奇形腫は、表皮、中枢神経系組織、または成熟軟骨等の組織を含む、様々な分化組織から構成される。奇形腫はまた、非特異的な組織型、例えば、リンパ組織または線維支質(fibrous stroma)を含む。「ステムプラズム(stemplasm)」は、宿主へのＨＳ細胞の移植時に発達する塊を説明するのに使用される新たに派生したことばである。奇形腫とは異なり、ステムプラズムは、３種の胚性胚葉(embryonic germ layer)すべて由来の細胞を含んではいるものの、成長が制御される。したがって、ステムプラズムは、本発明のＨＳ細胞のインビボでの分化のための手段として使用されうる。
分化を誘導できる幹細胞の信頼性の高い源に対して当該分野における必要性があることは明らかである。本発明は、受精処置を必要とせずにホモ接合性幹細胞を提供することによるこの必要性を満足するものである。本発明は、非受精の、減数分裂Ｉ後の２倍体生殖細胞由来のホモ接合性幹（ＨＳ）細胞を開示するものである。インビトロの受精の分野で一般的に使用される技術を用いて個体ドナーから集められてもよい、ドナー細胞が、本発明のＨＳ細胞がこれ由来である胚盤胞様塊を形成するように誘導でき、このようなＨＳ細胞はいずれかの細胞型、細胞の群、または組織型に分化しうる。さらに、ＨＳで誘導される分化細胞および／または組織はさらに、診断及び処置、特に細胞置換療法及び遺伝子療法、ならびに美容および／または治療のための移植に使用されてもよい。しかしながら、このような用途は、例示であり、限定するものではないと解される。
ＩＩＩ．発明の要約
本発明は、単離されたホモ接合性幹細胞（ＨＳ）の生産、ならびにこれらの細胞が特定の及び予想できるように分化しうる特有の性質を有するという発見に関するものである。このように、ＨＳ細胞は、ＥＳ細胞に似ているが、受精処置、または胚組織の収集を必要としない。
細胞療法のならびに移植のための細胞、細胞の塊、組織及び器官の生産の細胞の源として使用できる、単離されたホモ接合性幹細胞の新規で改良された生産方法を提供することが、本発明の目的である。
単離されたホモ接合性幹（ＨＳ）細胞を提供することが、本発明の目的である。以下の種：哺乳動物、鳥類、魚類、両生類、及び爬虫類の動物などの、動物ドナー材料由来のＨＳ細胞を提供することが、本発明のさらなる目的である。一つの好ましい実施態様においては、動物は、哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。ＨＳ細胞は、ドナーから回収される非受精の、減数分裂Ｉ後の２倍体生殖細胞由来であり、この際、ドナー細胞は現在の及び未来のインビトロの受精技術を用いて集められる。
本発明の他の目的は、（ａ）２個の卵母細胞または２個の精子細胞を融合する；（ｂ）卵形成中の第二極体(second polar body)の放出(extrusion)を防止する；（ｃ）適当な条件下で第二極体の放出及び自発的なゲノムの自己複製を行なわせる；または（ｄ）２個の１倍体卵または精核を除核した卵母細胞に移すことによって有糸分裂により作製される胚盤胞様塊由来のホモ接合性幹細胞（ＨＳ）を提供することである。加えて、ホモ接合性である幹細胞に関するスクリーニングは、方法（ａ）または（ｂ）を使用する際には、遺伝子型別(genotyping)を用いて行なわれる。
本発明の目的はまた、非受精の、減数分裂Ｉ後の２倍体生殖細胞からのホモ接合性幹細胞の誘導方法を提供することである。好ましくは、ＨＳ細胞は、卵形成中の卵母細胞から第二極体の放出を防止する、またはこのような１倍体の卵母細胞がＨＳ細胞が抽出される胚盤胞様塊を作製するような適当な条件下で第二極体の放出及び自発的なゲノムの自己複製を行なわせる方法を用いて誘導される。
非受精の、減数分裂Ｉ後の２倍体生殖細胞の活性化時に作製されるＨＳ細胞は、生きた動物に移植されると、ステムプラズム(stemplasm)を形成する。さらなる目的は、当該ステムプラズム内の様々な発達段階からＨＳ細胞を単離することである。本発明の他の目的は、当該ステムプラズムから単離される細胞の選択方法を提供することである。
本発明の他の目的は、所望の細胞、細胞の群、または組織型に到達するように、適当な条件下で、上記したような単離されたＨＳ細胞の分化を誘導することを有する、所望の細胞、細胞の群、または組織型の作製方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、ＨＳ細胞由来の分化細胞を提供し、および治療および／または診断を目的としてこのような分化細胞を使用することである。具体的な組織としては、以下に制限されないが、上皮組織、結合組織、筋組織または神経組織が挙げられる。
上皮細胞の詳細な型としては、以下に制限されないが、ケラチン化上皮細胞；湿性重層バリヤ上皮細胞(wet-stratified barrier epithelium)；内層上皮細胞(lining epithelium)；外分泌上皮細胞；内分泌上皮細胞；細胞外マトリックス分泌上皮細胞；腸、外分泌腺、及び尿生殖路の上皮細胞等の、吸収性上皮細胞；ならびに収縮性上皮細胞が挙げられる。結合細胞の詳細な型としては、以下に制限されないが、細胞外マトリックス分泌細胞；代謝及び貯蔵に特化した細胞；ならびに血液及び免疫系の循環細胞が挙げられる。筋細胞の詳細な型としては、以下に制限されないが、収縮性細胞及び前方突進機能を有する線毛細胞が挙げられる。神経または感覚細胞の詳細な型としては、以下に制限されないが、ａ）感覚伝達細胞(transducer)；ｂ）自律性ニューロン；ｃ）感覚器官の支持細胞；およびｄ）末梢ニューロン；ならびに中枢神経系のニューロン及びグリア細胞が挙げられる。生殖細胞(reproductive cell)の詳細な型としては、以下に制限されないが、胚胞(germ cell)及び栄養細胞が挙げられる。
本発明のさらなる特定の目的は、ＨＳ細胞由来の細胞を、診断、処置、例えば、細胞療法、遺伝子療法を目的として、および移植用の細胞、細胞の塊、組織及び器官の生産を目的として細胞の源としても使用できる多分化能性前駆細胞に分化するように誘導する方法を提供することである。このような用途は、さらに、網羅するものではなく例示である。
本発明の目的は、診断、処置、例えば、細胞療法、遺伝子療法を目的として、ならびに移植用の細胞、細胞の塊、組織及び器官の生産を目的として源として使用できる、ＨＳ細胞由来の遺伝子操作された前駆細胞の改善された生産方法を提供することである。このような用途は、さらに、網羅するものではなく例示である。一実施態様においては、所望の遺伝子を、さらに前駆細胞に分化させるＨＳ細胞に挿入、除去または修飾してもよい。さらなる実施態様においては、前駆細胞自身を、遺伝的に変更した後、培養して、遺伝的に変更された前駆細胞のコロニーを生産してもよい。
本発明の他の目的は、前駆細胞、好ましくはＨＳ細胞由来のヒト前駆細胞を提供することである。このような前駆細胞は、一実施態様においては、細胞、細胞の群、組織および／または器官に分化するように誘導される。さらに、治療および／または診断を目的として分化した細胞および／または組織を培養するのにこのような前駆細胞を使用することが、本発明の目的である。
本発明の特定の目的は、細胞、組織または器官の移植、遺伝子療法および／または細胞療法が治療または診断からみて有益である病気の処置または診断を目的とした、好ましくはヒトの、前駆細胞を提供することである。本発明のＨＳ細胞、前駆細胞、および／または分化細胞は、同種でまたは種を越えて使用されてもよい。
本発明のＨＳ及び前駆細胞、ならびにさらに分化したＨＳ及び前駆細胞は、同じ、関連するまたは関連しない哺乳動物、好ましくはヒトの卵子または精子を用いて作製されてもよい。
本発明の他の特定の目的は、細胞の分化の研究を目的としておよびアッセイを目的として、例えば、薬剤の研究を目的としてインビトロまたはインビボで本発明に従って生産される分化細胞を使用することである。
本発明の他の目的は、単離されたＨＳ細胞から生じる遺伝的に修飾されたＨＳ細胞、または細胞の群、組織若しくは器官を用いた調査または診断に使用される病気の状態のモデルを提供することである。
本発明の他の目的は、単離されたＨＳ細胞から適当な置換細胞、細胞の群、組織または器官を、ｉｎ ｓｉｔｕでまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで、生産することによる疾患または病気の状態の処置方法を提供することである。疾患及び病気の状態の例としては、以下に制限されないが、外傷性損傷（例えば、肢置換(limb replacement)、脊髄損傷、火傷などでの、外傷後修復及び再建）及び先天性異常；細胞、組織、及び器官の病的な及び悪性の症状（例えば、癌）；ならびに筋肉の細胞及び組織（例えば、筋ジストロフィー、心臓の状態）、神経（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、及び多発性硬化症）、上皮（例えば、失明及び筋障害、動脈硬化及び他の狭窄性血管症状、クローン病等の酵素欠損症、および糖尿病等のホルモン欠損症）、および結合組織（例えば、免疫症状及び貧血）の変性及び先天性の病気が挙げられる。ＨＳ由来細胞及び組織を、好ましくは被検者の自己ドナー材料を用いて、必要な被検者にグラフトして(graft)も移植して(transplant)もよい。
本発明の他の目的は、本発明に従って生産される分化細胞から生産される同種同系または同種異系細胞、組織、または器官を使用することを有する診断及び移植、遺伝子および／または細胞置換療法の改良された方法を提供することである。このような治療の例としては、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、ＡＬＳ、脊髄損傷、多発性硬化症、筋ジストロフィー、糖尿病、肝疾患、心臓病、軟骨置換、火傷、血管疾患、尿路疾患等の病気及び損傷の処置、さらには免疫不全及び癌の処置、ならびに骨髄移植が挙げられる。
本発明のこれらの及びさらなる目的は、下記詳細な説明、実施例及び特許請求の範囲に十分記載される。
ＩＶ．図面の簡単な説明
図１：卵母細胞の単為生殖活性化(parthenogenetic activation)の産物。
図２：精子形成及び卵形成の概略図。
図３：卵母細胞の融合及び卵母細胞融合産物の発達。
図４：卵母細胞の単為生殖活性化の産物の詳細。
図５Ａ：マウスＨＳ細胞由来のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の形態の写真。
図５Ｂ：マウスＨＳ細胞由来の赤血球の形態の写真。
図５Ｃ：マウスＨＳ細胞由来の単球の形態の写真。
図５Ｄ：マウスＨＳ細胞由来のリンパ球の形態の写真。
図５Ｅ：マウスＨＳ細胞由来の顆粒を有する造血細胞の形態の写真。
図５Ｆ：マウスＨＳ細胞由来の顆粒及び単球双方を有する造血細胞の形態の写真。
図６：マウスＨＳ細胞由来の脈拍筋細胞(beating muscle cell)の形態の写真。
図７Ａ：マウスＨＳ細胞由来の膵臓細胞のクラスターの形態の写真。
図７Ｂ：インスリン染色が茶色で示され、グルカゴン染色が赤色で示されるマウスＨＳ細胞由来の脾臓細胞インスリン及びグルカゴン染色の写真。
図８Ａ：ヒトのホモ接合性減数分裂Ｉ後の２倍体卵母細胞由来の桑実胚様塊の発達を示す写真。
図８Ｂ：ヒトのホモ接合性減数分裂Ｉ後の２倍体卵母細胞由来の初期胚盤胞塊の発達を示す写真。
図８Ｃ：ヒトのホモ接合性減数分裂Ｉ後の２倍体卵母細胞由来の内部細胞塊を現わす胚盤胞様塊の写真。
図８Ｄ：ヒトのホモ接合性減数分裂Ｉ後の２倍体卵母細胞由来のフィード層（Ｄ）上に成育する単離された内部細胞塊の写真。
図９Ａ：マウスＨＳ細胞由来のネスチン(Nestin)陽性ニューロン前駆細胞の形態の写真。
図９Ｂ：マウスＨＳ細胞由来のチロシンヒドロキシラーゼ陽性ニューロン細胞の形態の写真。
Ｖ．好ましい実施態様の詳細な説明
本明細書に列挙される参考文献はすべて、参考によって完全に引用される。本発明が従来の発明によるこのような開示に先行する権利を有するものではなくまたは従来技術が可能な若しくは適切な開示を提供することを認めると解されるものではない。本記載を通じて、示される好ましい実施態様及び実施例は、本発明を制限するものではなく、例示と解されるべきである。
本発明は、単離されたホモ接合性幹（ＨＳ）細胞、ＨＳ細胞の生産方法、および診断、細胞療法、遺伝子療法に、または美容及び治療のための移植を目的とする組織及び器官を提供するための細胞の源として使用される分化細胞の作製方法を提供するものである。しかしながら、このような用途に限定されるものではない。より詳しくは、ＨＳ細胞は、非受精の、減数分裂Ｉ後の２倍体生殖細胞由来の胚盤胞様塊から単離される。
以前は、胚性幹（ＥＳ）細胞が、受精した胚盤胞の内部細胞塊由来の細胞を長期間培養することによって得られた。次に、ＥＳ細胞は、培養され、遺伝的に修飾されて、治療のための形質転換動物または細胞を作製するための細胞を生産することを目的として分化するように誘導された。
本発明は、ホモ接合性であり、非受精の、減数分裂Ｉ後の２倍体生殖細胞の有糸分裂活性化(mitotic activation)時に作製される胚盤胞様塊から単離される幹細胞を提供するという点で、分化できる多分化能性細胞を得る従来の方法とは異なる。さらに、胚盤胞様塊から単離されたＨＳ細胞は、分化細胞若しくは組織、多分化能性前駆細胞が得られるように分化するように誘導されても、または永久細胞系として維持されてもよい。必要であれば、遺伝子修飾を本発明のＨＳ細胞または前駆細胞中に導入してもよい。
ゆえに、本発明は、多分化能性ＨＳ細胞、多能性前駆細胞、および／または最終分化細胞、これらの作製方法を提供するものであり、このような細胞は様々な治療及び診断の目的に使用される。
Ａ．定義
本発明の説明において、下記定義が適用される。
「分化」は、細胞が正常な機能細胞に成熟するように処理される高度に調節されたプロセスである。分化細胞は、明白な特徴を有し、特異的な機能を行ない、あまり分裂しないと考えられる。これに対して、未分化細胞は、多くの非特異的な活性及び機能を有する非特異的な様相を有する迅速に分裂する未成熟な、胚または原始的細胞である。
本明細書に使用される際の、「幹細胞」ということばは、適当な刺激を受けると、成熟した、分化した、機能細胞になる、能動的に分裂、サイクルする比較的未分化な細胞を意味する。幹細胞の特定の性質としては：（ａ）それ自身では最終的に分化しない；（ｂ）動物の寿命に制限されずに分裂できる；及び（ｃ）分裂すると、各娘は幹細胞であり続けるかまたは不可逆的に最終的な分化に移行するような経過をとるかを選択する。初めはその能力に制限のない（即ち、様々な型の分化細胞を生じることが可能である）これらの幹細胞を、「多分化能性(pluripotent)」と称する。多分化能性細胞の一般的な源としては、胚性（ＥＳ）幹細胞、胎児性癌（ＥＣ）細胞、体細胞クローニング、奇形腫及びテラトカルシノーマから得られる細胞が挙げられる。
それぞれが３種の胚葉、即ち、内胚葉、中胚葉及び外胚葉のうちの一つから細胞を生産することができる、前駆細胞系を、本明細書にでは「多能性(multi-potent)」と称する。各前駆細胞系は最終的に分化せず、動物の寿命中分裂し続けることができるが、胚葉の一つの型からのみから異なる組織または細胞に拘束される(commit)と考えられる。したがって、特定の前駆細胞系を、骨、軟骨、平滑筋、横紋筋及び造血細胞（中胚葉）；肝臓、原腸、及び呼吸上皮（内胚葉）；またはニューロン、グリア細胞、毛嚢及び歯蕾（外胚葉）に分化してもよい。ここで、「前駆細胞」ということばは、「多能性幹細胞」または「プレカーサー細胞」と交互に使用されてもよい。インビボ（この際、「インビボ」ということばは、同種同系または同種異系動物中にＨＳ細胞を被包してこのようにして被包された細胞からステムプラズムを得ることによって誘導される分化を包含する）またはインビトロでＨＳ細胞の特定の分化によって作製される、このような前駆細胞系は、永久細胞系として培養物中に維持されうる。
「奇形腫」は、分裂し続けてより多くのこれらの分化組織を生じる未分化の幹細胞と混合される、多くの型の分化組織、骨、筋肉、軟骨、神経、歯蕾、腺上皮などの、３種すべての胚葉由来の組織を含む異常な細胞の自然発生する(naturally occurring)自発的な(spontaneous)塊である。
奇形腫は、３種の胚性胚葉すべて由来の細胞を含む、生殖組織中に一般的に見出される自然発生的に形成される新生物である。さらに、成長が調節されないという特徴を有する。「ステムプラズム」は、宿主へのＨＳ細胞の移植時に発達する塊を説明するのに使用される新たに派生したことばである。奇形腫とは異なり、ステムプラズムは、３種の胚性胚葉すべて由来の細胞を含んではいるものの、成長が制御される。したがって、ステムプラズムは、本発明のＨＳ細胞のインビボでの分化のための手段として使用されうる。
「テラトカルシノーマ」は、奇形腫に従属するものである。奇形腫は、主に良性である；しかしながら、悪性になると、テラトカルシノーマが発達して、宿主を死に至らせうる。
従来では、「奇形腫幹細胞」または「ＴＳ細胞」と称されていた、「ホモ接合性幹細胞」は、非受精の、減数分裂Ｉ後の２倍体生殖細胞から生じる未分化幹細胞である。好ましくは、これは、卵形成中の第二極体の放出を防止すること（または「活性化」）、または適当な条件で第二極体の放出及び自発的なゲノムの自己複製を行なわせることによって、形成される。ホモ接合性幹（ＨＳ）細胞は、（ａ）２個の卵母細胞または２個の精子細胞を融合する；（ｂ）卵形成中の第二極体の放出(extrusion)を防止する；（ｃ）適当な条件で第二極体の放出及び自発的なゲノムの自己複製を行なわせる；または（ｄ）２個の１倍体卵または精核を除核した卵母細胞に移すことによって達成されうる、非受精の、減数分裂Ｉ後の２倍体生殖細胞の「有糸分裂活性化(mitotic activation)」時に発達する胚盤胞様塊の内部細胞塊から得られる単離された細胞である。加えて、ホモ接合性である幹細胞に関するスクリーニングは、方法（ａ）または（ｂ）を使用する際には、遺伝子型別(genotyping)を用いて行なわれる。
哺乳動物の発達において、卵割により、薄壁中空球、「胚盤胞」が生じ、この際、適当な胚が「内部細胞塊」としても知られている、一方の側での細胞の塊によって表わされる。胚盤胞は、内移植前に形成され、「胞胚(blastula)」と等しい。薄壁中空球の壁は、哺乳動物の胚盤胞周辺で形成し、胚を子宮壁に付着する上皮の胚体外層である、「トロホブラスト」と称される。トロホブラストは、柔毛膜の外層を形成し、母体組織と一緒に、胎盤を形成するであろう。
本発明の説明において、「胚盤胞様塊」は、有糸分裂により活性化した非受精の、減数分裂Ｉ後の生殖細胞の産物であるという点で、（当該分野において使用される）「胚盤胞」とは異なる。
本明細書に使用される際の、「有糸分裂により活性化した(mitotically activated)」ということばは、有糸分裂により規則的な細胞分裂を受けることができことを意味し、卵母細胞の単為生殖活性化及び精子細胞の雄性生殖活性化双方を包含する。本願を目的として、有糸分裂活性化は、単為生殖活性化または雄性生殖活性化と相互に使用される。
本明細書に使用される際の、「ホモ接合性、減数分裂Ｉ後の２倍体生殖細胞」ということばは、細胞が父性または母性の相同染色体のいずれかの２コピーを含む配偶子形成の段階である生殖細胞を意味する。
Ｂ．本発明の単離された幹細胞
前記段落で述べたように、本発明のホモ接合性幹（ＨＳ）細胞は、活性化された非受精の、減数分裂Ｉ後の２倍体生殖細胞から生じる。例えば、２個の成熟した卵母細胞または静止細胞の融合によって、ＨＳ細胞が誘導される胚盤胞様塊が生じる。このような胚盤胞様塊由来の幹細胞は、ホモ接合性、多分化能性、及び生物学的に良性となる減数分裂後の遺伝子型を有する。
さらに、好ましい実施態様においては、本発明のＨＳ細胞は、個体から獲得され、同じ個体またはレシピエントとＨＳ細胞、前駆細胞、またはＨＳ細胞若しくは前駆細胞由来の分化細胞および／または組織との間に高い免疫学的な適合性を有する関連する若しくは関連しない免疫組織適合性を有する個体で使用されてもよい。
ＨＳ細胞は、３種すべての胚葉由来の様々な型の組織に、インビトロでまたはインビボで分化するように誘導されてもよい。好ましい実施態様においては、ＨＳ細胞は、同種同系または同種異系動物中に被包されて、このような細胞が、以下に制限されないが、ヒト等の、動物における診断または治療用途のある皮膚、毛、神経組織、膵臓島細胞、骨、骨髄、脳下垂体、肝臓、膀胱、及び他の組織などの、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉由来の様々な型の組織に分化できる、ステムプラズムを生産してもよい。さらに、分化技術の分野における通常の知識を有するもの、特にＥＳ細胞及び胎児性癌（テラトカルシノーマ）細胞の分化について開発するものは、過度の実験を伴わなくとも多分化能性細胞を所望の型の組織に分化するように誘導できる。
例えば、本明細書中に引用される、Hole, Cells Tissues Organs, 165: 181-189 (1999)には、インビトロで胚性幹細胞の造血細胞の分化を誘導する方法が記載される。加えて、本明細書中に引用される、Doetschman et al., Embryol. Exp. Morphol., 87: 27-45 (1985)には、浮遊培養で生育したＥＳ細胞から白血病抑制因子（ＬＩＦ）を抜くと、赤血球及びマクロファージから作製される血液アイランド(blood island)を含む嚢胞性胚様体が形成することが示唆される。幹細胞から、好中球、肥満細胞、マクロファージ及び赤血球系細胞等の、他の造血細胞の生産がまた記載された（例えば、Wiles and Keller, Development, 111: 259-267 (1991); Keller et al, Mol. Cell. Biol. 13: 473-486 (1993a); 及びLieschke and Dunn, Exp. Hematol., 23: 328-334 (1995)を参照、それぞれ、参考によって完全に本明細書中に引用される）。このような方法は、本発明のＨＳ細胞に適用できる。
ＥＳ細胞を成熟したＩｇ分泌Ｂリンパ球に効率的に分化させることに関する、本明細書中に引用される、Cho et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:9797-9802 (1999)に記載される技術もまた、本発明のＨＳ細胞による使用に適用できる。同様にして、本明細書中に引用される、Dani, Cells Tissues Organs, 165: 173-180 (1999)には、細胞の方法が記載され、ＥＳ細胞を脂肪細胞に分化させることは本発明の説明に使用される有益なモデルとなる。例えば、短期間レチノイン酸（ＲＡ）によるその分化初期段階の胚様体の処置は、脂肪形成に関連があると考えられる。
様々なニューロン細胞への幹細胞の分化を誘発する技術が、本明細書中に引用される、Okabe et al. Mech. Dev., 59: 89-102 (1996)に記載される。同様にして、本明細書中に引用される、McDonald et al., Nature Medicine, 5:1410-1412 (1999)には、損傷を受けた脊髄を処置するのに特に使用される幹細胞由来の乏突起神経膠芽細胞及びニューロンが記載される。これらの技術は、本発明のＨＳ細胞で使用できる。
ＯＰ９等の、補助細胞系を特定の細胞系列を誘導するのに使用することもまた包含される。例えば、赤血球、骨髄球及びリンパ球系列に関する、本明細書中に引用される、Nakano et al., Science, 265:1098-1101 (1994)、及び本明細書中に引用される、Nakayama et al., Blood, 91: 2283-2295 (1998)を参照。
瀘胞細胞、さらには表皮細胞への本発明のＨＳ細胞の分化を誘発する技術もまた包含される。例えば、本明細書中に引用される、Taylor et al., Cell, 102: 451-361 (2000)には、ＥＳ細胞由来の瀘胞及び表皮細胞が毛の置換及び皮膚移植療法に使用されることが記載される。これらの技術は本発明のＨＳ細胞による使用に適用できる。特定の調節遺伝子の発現もまた、分化を誘導するのに使用されてもよい。例えば、造血遺伝子に関する、本明細書中に引用される、Hole et al., Blood, 90:1266-1276 (1996a), 及びBattieres. Clin. Hematol., 3:467-483 (1997)を参照。同様にして、予備的な証拠から、以下に制限されないが、ＰＰＡＲ（ＰＰＡＲδ及びＰＰＡＲγ）及びＣ／ＥＢＰδ（Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ及びＣ／ＥＢＰα）等の、脂質代謝に関連のある核の調節因子がまた脂肪細胞への前脂肪細胞(preadipocyte)の最終分化を開始するかもしれないことが示唆される。このような因子は、本発明の分化方法の説明に使用されるであろう。
必要な機能に応じて、分化は、分化に特異的な遺伝子の発現を検出することによって、組織に特異的な抗原を検出することによって、細胞若しくは組織の形態を試験することによって、イオンチャンネル機能等の機能的な発現を検出することによって、またはＥＳ細胞の分化を検出するのに適当な手段によって、評価されてもよい。
インビボまたはインビトロで誘導された分化技術によって本発明のＨＳ細胞から誘導された、多分化能性前駆細胞は、３種すべての胚葉：内胚葉、中胚葉及び外胚葉から細胞を生産することができる。例えば、前駆細胞は、骨、軟骨、平滑筋、横紋筋及び造血細胞（中胚葉）；肝臓、原腸、及び呼吸上皮（内胚葉）；またはニューロン、グリア細胞、毛嚢及び歯蕾（外胚葉）に分化させてもよい。本発明の前駆細胞は不死である必要はないが、不死系として維持されてもよい。形態学的には、前駆細胞は、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、アルカリホスファターゼ活性に陽性であり、及びＳＳＥＡ−１に陰性である霊長類のＥＳ細胞系に特徴的である細胞表面マーカー等の、ＥＳ細胞で見出される細胞表面マーカーを発現しない。
好ましくは、他の多分化能性ＨＳ細胞の不存在下でＨＳ細胞を培養することによって、本発明の前駆細胞が生産される。さらに、前駆細胞の増殖は、当該前駆細胞がそれ由来である多分化能性ＨＳ細胞のさらなる成長及び増殖を防止することによって促進される。当該分野において既知である技術を前駆細胞を得るのに使用でき、例えば、胚盤胞様塊から単離されたＨＳ細胞を、分化誘導剤の存在下で、及び他のＨＳ細胞の不存在下で培養して、多分化能性前駆細胞を生産し、未分化ＨＳ細胞がさらに増殖するのを防止してもよい。
さらに、本発明の単離されたＨＳ細胞は、ゲノムインプリンティングのために満期胚に発達することはできない；しかしながら、ＨＳは、下記実施例で示されるように、機能性分化細胞および／または組織への分化能は保持する。ゲノムインプリンティングのメカニズムは、現在、あまり理解されていないが、単為生殖胚がインプリンティングの結果最後まで発達しないことは明らかに示された(Surani et al, Development Supplement, 89-98 (1990))。インプリンティングは、インプリントされた遺伝子の発現がこれらの親によって決定されるので、生殖細胞系に特異的な発生作製プロセスにかかわりがある(Allen et al., Development, 120: 1473-1482 (1994))。インプリンティングメカニズムに使用されうる遺伝性発生的修飾としては、対立遺伝子に特異的なＤＮＡのメチル化及びＤＮａｓｅ Ｉ感受性亢進アッセイによって検出されるものなどのクロマチン構造修飾がある。Ｉｄ．特定の遺伝子（例えば、Ｉｇｆ２ｒ及びＨ１９）によっては、親の対立遺伝子がインプリントされ、他の遺伝子（例えば、Ｉｇｆ２及びＳｎｒｐｎ）では、母親の対立遺伝子が常にインプリントされるものがある。Ｉｄ．（また、雄性及び単為生殖胚の多分化能性の討論、ならびに遺伝的インプリンティングに関する含意に関しては、本明細書中に引用される、Mann et al., Cell, 62:251-260 (1990), and Devel. Biol., 3:77-85 (1992)を参照）。
Ｃ．本発明のホモ接合性幹細胞の作製
上述したように、ＨＳ細胞は、有糸分裂活性化、または非受精の、減数分裂Ｉ後の２倍体生殖細胞の作製時に発達する胚盤胞様塊から単離される。図１は、非受精の、減数分裂Ｉ後の２倍体生殖細胞からＨＳ細胞が発達する好ましい方法を示す、フローチャートである。
生殖細胞は、本発明のＨＳ細胞がこれ由来である胚盤胞様塊を活性化時に生産する非受精の、減数分裂Ｉ後の２倍体生殖細胞に発達する。本発明のＨＳ細胞および／または分化細胞は、例えば、このような治療が必要な罹患個体への内移植(implantation)及び移植(transplantation)によって、病気の診断および／または処置に使用される。
ホモ接合性減数分裂Ｉ後の２倍体生殖細胞は、同じ個体からまたは免疫適合性のあるドナーから得られてもよいが、場合によっては、自己ドナーが好ましい。しかしながら、治療のために選ばれた罹患個体が遺伝病（即ち、突然変異または不適切な発現のいずれかによる、重要な遺伝子の欠損によって特徴付けられる病気）に罹っている場合には、自己以外のドナーを使用することが好ましい。または、選択方法の分野における通常の知識を有するものは、所望の遺伝子型を示すこれらの自己生殖細胞（例えば、損傷を受けたまたは突然変異した遺伝子のない細胞）、欠損遺伝子を発現できる細胞を選択してもよい。このような選択技術はまた、組織の移植のための免疫不適合な遺伝子型または表現型を防止するのに使用されてもよい。
ホモ接合性減数分裂Ｉ後の２倍体生殖細胞は、公知の技術、特に、インビトロの受精の分野に一般的に使用される技術を用いてドナーから集められる。例えば、ヒトの卵胞から卵母細胞を吸引する技術が記載される、Jones HW Jr. et al., Fertil. Steril., 37(1):26-29 (1982)；副睾丸及び睾丸から精子を集める技術が記載される、Lisek et al., Tech. Urol., 3(2):81-85 (1997)；ならびにあるドナーの核材料を他の除核された卵母細胞に移植する技術が記載される、Stice et al., Mol. Reprod. Dev., 38(1):61-8 (1994), 及びTakeuchi et al., Hum. Reprod., 14(5):1312-7 (1999)を参照。これらの参考文献の全内容は、参考によって本明細書中に引用される。
ＨＳ細胞は、（ａ）２個の卵母細胞または２個の精子細胞を融合した後、遺伝子型別によってホモ接合性幹細胞をスクリーニングする；（ｂ）卵形成中の第二極体の放出(extrusion)を防止する；（ｃ）適当な条件で第二極体の放出及び自発的なゲノムの自己複製を行なわせる；または（ｄ）２個の１倍体卵または精核を除核した卵母細胞に移した後、遺伝子型別によってホモ接合性幹細胞をスクリーニングすることによる。図２は、オス及びメスにおいて有糸分裂及び減数分裂の相での相違を示す、精子形成及び卵形成の該略図を示すものである。
本発明に使用される卵母細胞は、当該分野において既知である、またはいまだ開示されていない、いずれかの適当な方法を用いて得られてもよい。ヒト卵母細胞は、具体的には、ドナー個体の卵胞から集められて、周辺または付着細胞から単離される。収率を最大にするために、過排卵をドナー個体で誘導する。過排卵は、適当なゴナドトロピンまたはゴナドトロピン類似体の投与によって誘導され、単独であるいはクエン酸クロミフェンと組み合わせて投与されてもよい(本明細書中に引用される、Barriere et al., Rev. Prat., 40(29):2689-93 (1990)）。マウスでは、方法の一例としては、模擬卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を模倣するために妊馬血清（ＰＭＳ）をおよび擬黄体形成ホルモン（ＬＨ）を模倣するためにヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）を投与することがある（Hogan et al., Manipulating the mouse embryo: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994を参照）。過排卵の効率的な誘導は、以下に制限されないが、メスの年齢及び体重、ゴナドトロピンの投与量、投与時間、ならびに使用される株などの、幾つかの変数によって異なる。
排卵の過誘導および卵母細胞の収集は当該分野において既知である。詳細なマウスのプロトコルの一例としては、この全内容は参考によって本明細書中に引用される、Hogan et al., supra, pp. 130-132を参照。例えば、Hoganは、双方とも滅菌０．９％ＮａＣｌに凍結乾燥粉末から再懸濁した、ＰＭＳ及びｈＣＧを腹腔内投与することによって、過排卵を誘導することを記載する。ＰＭＳ及びｈＣＧは双方とも、内因性のＬＨの放出前に投与されなければならない。マウスからの卵母細胞の収集に関する、Hoganプロトコルは、過度の実験を行なわずにヒトに定常的に適用できる。
また、ポリエチレングリコールは、排卵卵母細胞の融合を誘導することが示された（例えば、本明細書中に引用される、GG Sekirina, Ontogenez, 16(6):583-8 (1985), 及びGulyas BJ, Dev. Biol. 101(1):246-50 (1984)を参照）。または、本明細書中に引用される、Nogues et al., Zygote, 2(1):15-28 (1994)には、不活性化センダイウィルスによって卵母細胞融合を誘導し、これにより胚の発達の第一段階を受けることができる「接合体」または「卵母細胞融合産物（ＯＦＰ）」が生産されることが記載される。卵母細胞融合技術のレビューに関しては、本明細書中に引用される、Gulyas BJ, Dev. Biol., 4:57-80 (1986)を参照。マウス卵母細胞の融合に関する詳細なプロトコルに関しては、卵丘細胞が付着した集められた卵を、５分間、ダルベッコのＰＢＳおける７％エタノールの溶液中に維持し、培地で洗浄して、３７℃で５時間インキュベートする、Hogan et al., supra, pp. 148-150を参照。卵丘細胞は、次に、ヒアルロニダーゼによる処理によって除去される。図３は、卵母細胞の融合および卵母細胞融合産物の発達を示すものである。
または、卵母細胞からの第二極体の放出を防止すると、ＨＳ細胞が得られる。自然界では、１回目の減数分裂及び第一極体の分離後、２回目の減数分裂が起こる。第二極体の放出前の卵母細胞を、以下に制限されないが、Ｃａ＋＋イオノホア（Ａ２３１８７）、またはエタノール等の、物質に暴露した後、６−ジメチルアミノプリン（６−ＤＭＡＰ）、プロマイシン、またはサイトカラシンＤ等の物質に暴露すると、このような２倍体の卵母細胞が活性化され、さらに胚盤胞様塊が形成する。図４は、活性化の可能性のある産物を示すものである。
他の実施態様においては、第二極体の放出及び自発的なゲノムの自己複製を起こすことを、ＨＳ細胞を誘導するのに使用してもよい。単為生殖活性化時に、卵母細胞は第二極体を放出して、１倍体になる。このような１倍体の卵母細胞は、適当な条件下でインキュベートすると、分裂して、胚盤胞様塊を形成する。Taylor, A.S., et al., "The early development and DNA content of activated human oocytes and parthenogenetic human embryos," Hum. Reprod., 9(12):2389-97 (1994); Kaufman, M.H. et al., "Establishment of pluripotential cell lines from haploid mouse embryos," J. Embryol. Exp. Morphol, 73:249-61 (1983)を参照。
本発明に使用される精子細胞は、当該分野において既知である、またはいまだ発見されていない、いずれかの適当な方法、特にインビトロでの受精の分野では公知である方法を用いて得られる。オスに使用されるＨＳ細胞を作製するために、精子細胞（減数分裂ＩＩ終了）を集めた後、融合するように誘導する。精子細胞の融合は、よく確立された標準技術を用いて達成できる。例えば、本明細書中に引用される、Asakura S, et al., Exp. Cell. Res., 181(2):566-73 (1989)には、１対の精子細胞の融合を誘導するのに低張培地を使用し、その結果単一のアクロソーム（シンアクロソーム(synacrosome)）を形成することが示唆される。または、第二精母細胞（減数分裂Ｉ終了）は、当該分野において既知である方法を用いて活性化されうる。
最後に、上述したように、単離されたＨＳ細胞は、除核された卵母細胞から作製できる。詳細には、２個の精子または１倍体卵核を除核された卵母細胞に移すことによって、卵母細胞細胞質中にドナーのオスまたはメスの核の遺伝情報を有する非受精の２倍体卵母細胞が作製できる。オスでは、この方法は、接合体での遺伝子の発現を引き起こす、精子が卵と受精する際にかかわりのあるプロセスを模倣するので、親の遺伝子発現に有利である。ドナーの核材料は、当該分野において公知の標準的な技術を用いて収集および／または単離できる。同様にして、転移段階は、インビトロの受精の分野において公知の技術を用いて行なわれる（本明細書中に引用される、米国特許第５，９４５，５７７号、ＷＯ ９８／０７８４１号ならびに上記したS.L. Stice and T. Takeuchi、及びWobus et al., Cells Tissues Organs, 166:1-5 (2000)を参照）。
遺伝子の修飾を、以下に制限されないが、ウィルスベクター転移、細菌ベクター転移、及び合成ベクター転移（例えば、プラスミド、リポソーム及びコロイド複合体を介して）などの、ポリヌクレオチドトランスフェクション技術を用いてＨＳ細胞に導入してもよい。
受精した胚盤胞の内部細胞塊からのＥＳ細胞の単離方法は、当該分野において既知である。このような方法は、胚盤胞様塊の内部細胞塊からＨＳ細胞を単離するのに適用されてもよい。例えば、その内容は参考によって本明細書中に引用される、Gardner et al., "Culture and Transfer of Human Blastocysts", Current Opinions in Obstetrics and Gynecology, 11:307-311 (1999)、米国特許第５，８４３，７８０号(Thomson et al.)及び米国特許第５，９０５，０４２号(Stice et al.)を参照。
Ｄ．本発明の単離されたＨＳ細胞からの前駆細胞ならびに分化した細胞、細胞の塊及び
組織型の誘導
単離されたＨＳ細胞は、適当な方法によってサイトカイン、成長因子、細胞外マトリックス成分、及び他の因子の不存在または存在下で分化するように誘導される。例えば、ＨＳ細胞は、平坦な付着環境（液体）中でまたは３次元の付着環境（例えば、１％コラーゲンゲル）中で分化するように誘導されうる。微小重力環境もまた、ＨＳ細胞の分化を誘導するのに使用できる、Ingram et al, In vitro Cell Dev. Biol. Anim., 33(6):459-466 (1997)を参照。さらなる他の分化の誘導方法としては、免疫不全マウス、Thompson et al., Science, 282(5391):1145-47 (1998)、または他の動物でのステムプラズムの生成によるものがある。分化は、ＨＳ細胞を被包して、これらを適当な宿主中でステムプラズムを形成させることによってこのように誘導される。例えば、ヒトのＨＳ細胞を被包して、このような細胞が誘導される同じ患者（同種同系）に、または異なるヒト（同種異系）に置かれる。同様にして、完全な胚盤胞様塊を、レシピエント動物に内植して、ステムプラズムを形成させてもよい。
現在、選択的に浸透性である合成膜を用いてからだの免疫系から細胞を分離する多くの技術が利用できる。このような技術は、インビボでステムプラズムを生成することによってＨＳ細胞を分化させるのに使用できる。例えば、被包されたＨＳ細胞を内植してステムプラズムを生成する際に、膜を、栄養素、酸素及び生物療法物質を血液または血漿及び被包された細胞間を自由に交換するのに使用してもよい。このような系は、膜及びマトリックス支持体の化学的な特徴に基づいて抗原、サイトカイン、及び他の免疫学的な部分の２方向拡散を調節するものであってもよい。Lanza et al., Nat. Biotechnol., 14(9):1107-11(1996)を参照。動物における胚盤胞様塊の内植にかかる系では、個々のまたは複数の細胞塊が単一の動物に内植される。
ＨＳ細胞は、いずれの動物ドナー材料から生産され、いずれの動物系で使用されてもよい。ヒト及び非ヒト双方のＨＳ細胞が本発明に包含される。適当な家畜用途としては、哺乳動物、魚類、爬虫類、鳥類、及び両生類由来のＨＳ細胞の生産及びこれらでの使用がある。
本発明の多分化能性の単離されたＨＳ細胞は、研究、診断の目的で、または個体への内植を目的として、分化組織のインビトロでの培養等の様々な治療用途のために特定の組織に分化しうる。好ましくは、ＨＳ細胞は、ＨＳ細胞形成のためのドナー材料を提供する個体に治療のために使用されるであろう。
当該分野において通常の知識を有するものに既知である多分化能性細胞を分化させるのに使用される一般的な技術としては、様々な胚及び胚外細胞型への胎児性癌（ＥＣ）細胞の分化方法がある。（本明細書中に引用される、Andrews, APMIS, 106:158-168 (1998)を参照）。このような技術はまた、ＨＳ細胞の分化を誘導するのに使用できる。ＥＣ細胞の分化の誘導に使用されるインビトロの方法としては、ＥＣ細胞を、細胞を所望の細胞型または組織に拘束及び分化させることが知られている様々な因子に暴露することがある。または、使用されるインビトロの分化スキームとしては、幹細胞の維持に有利であることが知られている成長因子を除去することがある。培地からこのような因子を除去すると、幹細胞は、この中に３種すべての胚性胚葉が見出される、胚様体として知られている、クラスターを形成する。次に、胚様体内の特定の細胞系列の存在を、さらなる成長因子及び化学物質を含む培地を捕捉することにより促進してもよい。このようにして得られた細胞集団は、さらに、所望の細胞型の割合を増加させた後、選択的に単離されてもよい。また、多分化能性幹細胞及びこれらの医薬への使用を討論している、本明細書中に引用される、Edwards et al., Modern Trend, 74(1): 1-7 (2000)を参照。
分化制御因子の詳細な例としては、以下に制限されないが、ＬＩＦ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＩＬ−３、甲状腺ホルモン（Ｔ３）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−２）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、毛様体神経栄養因子(ciliary neurotrophic factor)等のサイトカイン、ホルモン、及び細胞調節因子が挙げられる。ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、及びＩＬ−３等の刺激性サイトカインは分化を促進することが示されており（本明細書中に引用される、Keil et al., Ann. Hematol., 79(5):243-8 (2000)）、ＬＩＦ等の、阻害因子は、未分化多分化能性状態にマウスの胚幹（ＥＳ）細胞を維持することが示されている（本明細書中に引用される、Zandstra et al., Blood, 96(4):1215-22 (2000)）。さらに、ＳＣＦはこれらの推定上の前駆細胞からのニワトリの破骨細胞の分化を刺激することが示され（本明細書中に引用される、van’t Hof et al., FASEB J., 11(4):287-93 (1997)）、ＦＧＦ−２はラクトトロープ(lactotrope)の分化を開始しかつ不死化ＧＨＦＴ細胞でプロラクチンの発現を維持する双方の役割を果たすことが示され、これにより幹細胞の異なる下垂体前葉細胞への分化を制御するメカニズムが示唆される（本明細書中に引用される、Lopez-Fernandez et al., J. Biol. Chem. 275(28):21653-60 (2000)）。加えて、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ−ＡＡ、−ＡＢ、及び−ＢＢ）は、ニューロンの分化を支持し、また、毛様体神経栄養因子及び甲状腺ホルモンＴ３は神経膠星状細胞及び乏突起神経膠芽細胞のクローンを生成する（本明細書中に引用される、Johe et al., Genes. Dev., 10(24):3129-40 (1996)）。
さらに、２００１年４月２６日に公開された、ＷＯ ０１／２９２０６号(Cibelli et al.)には、分化剤、成長因子、ホルモン及びホルモンアンタゴニスト、細胞外マトリックス成分及び様々な因子に対する抗体などの、様々な分化因子、ならびにＥＳ細胞を分化するように誘導するのに使用できる技術が記載される。このような技術及び試薬／因子は、本発明に従って使用でき、ゆえに、参考によって本明細書中に引用される。また、本明細書中に引用される、Schuldiner et al., "Effects of Eight Growth Factors On The Differentiation Of Cells Derived From Human Embryonic Stem Cells," PNAS 97(21):11307-12 (2000)をも参照。
ＨＳ細胞はまた、インビボでの、好ましくはｉｎ ｓｉｔｕでの移植によって分化するように誘導されてもよく、この際、細胞は組織学的及び機能的な分化を受けて、宿主細胞との適当な関連を形成する。移植部位に位置する内因生の調節因子は、幹細胞の特定の型の分化した細胞または組織への分化を誘導できる。または、様々な分化した細胞および／または組織の群は、皮下組織、腹膜、及び腎被膜に移植された幹細胞から生じる。腎臓被膜内植方法の詳細については、Hogan, supra, pp. 183-184を参照。
１．ヒト奇形腫内で見出された分化細胞の組織学的な特徴および遺伝子型
奇形腫は、成熟および／または未成熟な組織から構成される。幾つかの型の分化組織からなる細胞群の形態学的な分析が、スライドガラスに固定された奇形腫の切片で同定され、組織形態分析が公知の技術を用いてこれらの奇形腫切片で行なわれた（本明細書中に引用される、Zhuang et al., J Pathol, 146:620 (1995), and Vortmeyer et al., Am. J. Pathol., 154:987-991(1999)）。奇形腫の顕微解剖によって、成熟扁平上皮、成熟腸上皮、成熟軟骨及び呼吸上皮、未成熟軟骨、成熟神経膠組織、未成熟神経組織、及び成熟呼吸上皮等の個体の組織成分を選択的に得た。（インビトロの移植可能なテラトカルシノーマから単離される様々な細胞系及びこれに関連する技術の詳細な討論に関して、参考によって本明細書中に引用される、Nicolas et al., Cancer Research, 36:4224-4231 (1976)を参照）。
ＤＮＡ抽出後、対立遺伝子の接合生殖性を、幾つかのヒト染色体での複数の遺伝マーカーを用いて分析した。限定数の成熟腫瘍の初期の研究では、同一の対立遺伝子のホモ接合性が一貫して検出された（Vortmeyer et al., Am. J. Pathol., 154:987-991 (1999)、この完全な内容は参考によって本明細書中に引用される）。しかしながら、より多数の奇形腫の分析によっては、ヘテロ接合性対立遺伝子を有する遺伝子座を持つ少数の腫瘍が明らかになった。
ヘテロ接合性奇形腫組織が減数分裂前細胞から生じるという仮説を試験するために、成熟（分化）及び未成熟（未分化）双方の組織要素を含む卵巣及び睾丸奇形腫を、同様の実験方法を用いて、解剖して、一品種の成熟及び未成熟組織要素のサンプルを得た（下記実施例参照）。ヘテロ接合性対立遺伝子を、未成熟扁平上皮、未成熟神経組織及び未成熟軟骨等の未分化組織要素で検出した。これらの腫瘍からの分化組織は、同一の遺伝マーカーに対してホモ接合性であった。試験された分化組織要素は、同一の腫瘍の同じ成熟要素の別の領域から採取した２連のサンプルを含む、成熟皮脂腺組織及び成熟皮脂腺上皮を含む。
この試験結果から、遺伝的ホモ接合性が認識可能な成熟組織型への分化と相関し、また、遺伝的ヘテロ接合性が未分化組織と相関することが示される。したがって、奇形腫内の未分化組織の領域は減数分裂前生殖細胞での催奇形事象によって開始し、また、奇形腫内の分化組織は減数分裂後生殖細胞から生じる。
減数分裂前細胞は、減数分裂前細胞が遺伝的にヘテロ接合性である細胞の集団を生産するように、各染色体の双方のコピーを含む。これに対して、減数分裂後細胞は、各染色体の一つのコピーのみを有し、遺伝的にホモ接合性である。減数分裂後前駆細胞が増殖して成熟奇形腫、または奇形腫内の成熟分化組織の領域を形成するという事実から、減数分裂は染色体の再配列及び遺伝子材料の組み換えのメカニズムであるのみでなく、組織の分化及び発達を起こす特異的な遺伝子の活性化の必要条件でもあることが示唆される。
したがって、減数分裂しなかった増殖腫瘍細胞は、未分化で、ヘテロ接合的な特性を保持して、未分化奇形腫組織に発達するであろう。分化した奇形腫組織は、減数分裂が終了した増殖腫瘍細胞由来であってもまたは催奇形事象を受けた減数分裂後細胞由来であってもよい。
ゆえに、減数分裂は、奇形腫での組織の分化に必要である。奇形腫内の組織要素の遺伝分析から、ホモ接合性は組織学的に成熟した分化組織と関連し、また、遺伝的なヘテロ接合性は組織学的に未成熟な未分化組織と関連することが示された。この結果は、減数分裂が奇形腫細胞が次の組織の分化を受けうる前に完了しなければならないという結果を支持するものである。ゆえに、本発明は、本発明の単離された、未分化の、多分化能性ホモ接合性幹細胞を作製するための生殖細胞の減数分裂の中断を示唆するものである。
２．特定の細胞または組織へのＨＳ細胞の分化
前記段落で述べたように、分化を誘導するために通常の知識を有するものに利用できるいずれの方法を本発明で使用してもよい。例えば、細胞を、各ウェルに分化因子の特有の組み合わせを含む、組織培養ウェルで培養してもよい。このような因子をコード化する核酸またはｃＤＮＡは、裸ＤＮＡとして、トランスフェクションによって、若しくはウィルスによってこのような核酸を有するように調製される構築物として、播種されうる。分化細胞は、ａ）分化に特異的な抗体；２）形態；３）分化に特異的なプライマーを用いたＰＣＲ；または４）分化細胞の特定の型を同定するのに適当な他の技術を用いて同定される。
分化プロトコルが行なわれると、特定の細胞系列の原始細胞が公知の技術によって分化ＨＳ細胞から単離できる。所望であれば、このような単離された分化前駆細胞を、細胞培養または他の適当な方法によって拡張してもよい。
前駆細胞はまた、これらの適当な分化段階でトランスフェクションされてもよい。例えば、胚盤胞様塊を形成する前に、ＨＳ細胞をトランスフェクションした後、当該細胞を除核された卵母細胞用の核ドナーとして使用してもよい。他の実施態様においては、前駆細胞を、単離後に、例えば、造血系のＣＤ３４＋、またはＣＤ３８で、直接トランスフェクションしてもよい。
所望の遺伝子の既知の挿入、欠失または修飾方法を用いて、遺伝的に変更された前駆またはＨＳ細胞を生産してもよい。
動物に、被包された(encapsulated)ＨＳ細胞、または胚盤胞様塊を内植すると、奇形腫及びテラトカルシノーマが形成しうる。ＨＳ細胞に移植レシピエントに良性または悪性の腫瘍を形成させないために、遺伝子を、未分化細胞の成長を防止するようにこのような細胞中に導入するまたはこのような細胞から欠失させてもよい。例えば、ＭＭＴＶ等の誘導性プロモーターを細胞中に導入した後、デキサメタゾンで誘導して、未分化細胞成長を遮断し、分化を誘導する遺伝子の発現を誘導してもよい。または、生殖細胞に特異的である遺伝子のプロモーターを導入して、細胞サイクルブロッカーまたはアポプトシス遺伝子の発現を誘導してもよい。
分化前駆細胞の好ましい作製方法は、カルシウムイオノホアを用いて非受精の、減数分裂Ｉ後の２倍体卵母細胞を活性化し、このようにして活性化された卵母細胞を培地中で胚盤胞様塊が形成される段階まで培養することを有する。次に、透明帯をプロナーゼを用いて細胞塊から除去した後、免疫手術によって栄養膜細胞を除去する。細胞塊を保持しながら、ＨＳ細胞の凝集物を、平坦な付着環境、３次元の付着環境、微小重力を用いてサイトカインを用いてまたは用いずに分化するように誘導し、免疫不全動物、または同種同系若しくは同種異系動物においてステムプラズムを形成する。次に、分化前駆細胞を分化細胞塊誘導体から除去してもよい。
多分化能性細胞が分化しうる細胞／組織の特定の型を以下に説明する。しかしながら、このような説明は、詳細に説明するものであり、限定するものではないと解される。本発明は、本明細書に列挙されない、またはいまだ開示されていない技術を含む、当該分野において既知である、分化方法を用いて実施できる。
内胚葉細胞型への分化
多分化能性細胞の様々な内胚葉細胞型への分化は、移植を目的とする、または栄養素の吸収及び処理を促進するための、またはパターン形成を誘導するための使用などの治療性の高い意味を有する。ＨＳ細胞は、高投与量のＲＡによるまたは骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）−２(Pera and Herzfeld, Reprod. Fert. Dev., 80:551-555 (1998))等の、トランスフォーミング成長因子β超科のものによる処理によって内胚葉前駆細胞に分化するように誘導されうる。また、ＨＳ細胞系によっては、ヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）によって別の、外見上非神経的な方向に分化するように誘導されてもよい(Andrews, APMlS, 106:158-168 (1998))。ＢＰＭ−２は、体壁、または臓器の内胚葉への分化を特異的に引き起こすのに使用できる(Rogers et al., Mol. Bio. Cell, 3:189-196 (1992))。ＢＭＰは、インビボで軟骨及び骨の成長を誘導できる分子であるが、ＢＭＰのメッセージはまた、発達する心臓、毛嚢及び中枢神経系等の、多くの非骨組織でも発現することから、細胞の拘束及び分化において重要な役割を果たすことが示される。
上皮組織への分化
上皮組織は、細胞間物質をほとんど含まない密に凝集した多面細胞から構成される。上皮細胞の形態及び寸法は、かなりの円柱から、立方体様まで、低扁平状までと、様々である。上皮細胞核は、形状が、球状から、伸張したものまで、楕円形までと、特有の外見を有する。これらの細胞間の付着は非常に強力である傾向がある。ゆえに、体の表面を被覆し、その腔をライニングする細胞シートが形成される。これらのシートは、一つの上皮細胞型から構成される、単層、または多くの異なる上皮細胞型から構成される重層多層の形態をとっていてもよい。
上皮細胞の基本的な機能としては：被覆及びライニング（例えば、皮膚）、吸収（例えば、腸）、分泌（例えば、腺の上皮細胞）、知覚（神経上皮）、及び収縮（例えば、筋上皮細胞）が挙げられる。様々な型の上皮細胞の、およびＨＳ細胞の様々な型の上皮細胞への分化方法の詳細な説明を以下に記載する。
（ａ）ケラチン化上皮細胞
ケラチン化上皮細胞は、主に体の表皮及び皮膚層（例えば、毛、皮膚、爪等）と関連がある。例としては、以下に制限されないが、表皮及び爪床のケラチノサイト（例えば、分化上皮細胞）；表皮及び爪床の基底細胞（例えば、表皮幹細胞）；ならびに毛幹（例えば、髄の、皮質の、小皮の）、毛根鞘（例えば、小皮の、ハックスリー及びヘンリー層、及び外部の）及びマトリックス細胞（毛の幹細胞）が挙げられる。
基底細胞は、幹細胞と同様に作用する、より特化した細胞を生じる上皮シートにおける比較的未分化な細胞である。皮膚の扁平上皮の基底細胞は、表皮及び爪床のケラチノサイトを生じる。同様にして、精巣上体の上皮の基底細胞（以下に説明される、吸収性上皮細胞）は、精巣上体の主細胞を生じる。嗅粘膜の基底細胞は、嗅覚及び支持細胞を生じる。ゆえに、基底細胞は、より特化した上皮細胞の前駆細胞として機能する。
本発明の単離されたＨＳ細胞は、直接、またはＥＳ細胞、ＥＣ細胞、他の種類の多分化能性または幹細胞、および／またはテラトカルシノーマ細胞の分化に関する当該分野において既知な技術を用いて適当な前駆細胞若しくは基底細胞を介して、成熟したケラチン化上皮細胞に分化しうる。例えば、瀘胞幹細胞、特に２機能性瀘胞隆起幹細胞(follicular bulge stem cells)からの濾胞及び表皮の形成が記載されるTaylor et al., Cell, 102:451-461 (2000)（その内容は参考によって本明細書中に引用される）に記載されるプロトコルを参照。
（ｂ）バリヤ上皮細胞
バリヤ上皮細胞は、２つのクラス−湿性重層バリヤ上皮細胞(wet stratified barrier epithelium)及び内層上皮細胞(lining epithelium)に分けられる。湿性重層バリヤ上皮細胞としては、例えば、尿上皮（内層膀胱(lining bladder)及び尿管）の細胞、ならびに角膜、舌、口腔、食道、肛門管、下位尿管、及び膣の重層扁平上皮の表面及び基底上皮細胞（即ち、粘膜組織の細胞）が挙げられる。内層上皮細胞としては、例えば、肺、腸、外分泌腺及び尿管をライニングする細胞さらには閉鎖した内部体腔をライニングする細胞が挙げられる。
管、管路、及び開放腔をライニングする上皮細胞の例としては、以下に制限されないが、呼吸肺胞細胞（肺の気室をライニング）；膵管細胞（房心細胞）；汗、唾液及び乳腺の非線条導管(nonstriated duct)細胞；腎糸球体の壁細胞及び足細胞；ヘンレのループの薄いセグメントの細胞（腎臓）；ならびに腎臓、精嚢、前立腺、及び他の腺の管細胞が挙げられる。
閉鎖した内部体腔をライニングする上皮細胞の例としては、以下に制限されないが、血管及びリンパ管（有窓、連続、及び脾性）の血管内皮細胞；関節腔をライニングする滑膜細胞；腹腔、胸腔及び心膜腔をライニングする漿膜細胞；耳の外リンパ腔をライニングする扁平上皮細胞；耳の扁平上皮細胞の内リンパ腔をライニングする細胞；脈絡叢細胞（脳脊髄液を分泌する）；軟膜クモ膜の扁平上皮細胞；眼のシリア線毛上皮の細胞；ならびに角膜上皮細胞が挙げられる。
本発明の単離されたＨＳ細胞は、直接、またはＥＳ細胞、ＥＣ細胞、他の種類の多分化能性若しくは幹細胞、および／またはテラトカルシノーマ細胞の分化に関する当該分野において既知の技術を用いて基底細胞等の適当な前駆細胞を介して、成熟バリア上皮細胞に分化しうる。例えば、幹細胞のレビュー及びリンボ角膜上皮細胞(limbocorneal epithelium)の分化段階が記載される、本明細書中に引用される、Wolosin et al., Progress in Retinal and Eye Research, 19(2): 223-255 (2000)を参照。
（ｃ）外分泌、内分泌、及びマトリックス分泌上皮細胞
外分泌腺は、皮膚の自由表面上に、または消化、呼吸または生殖管等の、体の開放腔の自由表面上に、管路または管を介して産物を分泌する。これらの産物は、血流には放出されない。外分泌産物の例としては、粘液多糖及び炭水化物、消化酵素、ミルク、涙、ワックス、皮脂、精液及び膣液がある。外分泌物の分泌に特化した上皮細胞の例としては、以下に制限されないが、唾液腺の細胞（粘液及び漿液）；舌のエブナー腺の細胞；乳腺の細胞；涙腺の細胞；耳の耳垢線の細胞；エクリン及びアポクリン汗腺の細胞；まぶたのモル腺の細胞；皮脂腺の細胞；鼻のボーマン腺の細胞；十二指腸のブルンナー腺の細胞；精嚢腺の細胞；前立腺の細胞；リトル腺の細胞；子宮内膜の細胞；呼吸及び消化管の単離された杯細胞；胃内層の粘液細胞；胃腺の酵素原及び酸分泌細胞；膵臓の腺房細胞；小腸のパネート細胞；ならびに肺のタイプＩＩ肺細胞及びクララ細胞が挙げられる。
本発明の単離されたＨＳ細胞は、直接またはＥＳ細胞、ＥＣ細胞、他の種類の多分化能性若しくは幹細胞、および／またはテラトカルシノーマ細胞の分化に関する当該分野において既知の技術を用いて適当な前駆細胞を介して外分泌腺の上皮細胞に分化しうる。このような技術は本明細書中に参考のために引用される。
内分泌腺は、血流に直接、ホルモンと称される、それらの産物を分泌する。ホルモンは、標的領域に体中で循環して、特定の体の機能を調節する化学的なメッセンジャーとして作用する。ほとんどの内分泌腺はまた、上皮細胞誘導体でもある：これらは、上皮シートからの陥入によって形成され、初めは上皮シートの自由表面と連結する管路を有する。胚の発達中、これらは管路を失い、いわゆる無排出管腺となる。これらの分泌産物は、細胞間の間質腔に放出され、最も近い毛細血管の血液中に拡散する。顕微鏡下では、内分泌腺が一つの大きな差を有する重層上皮組織に見える；これらは、自由表面を持たず、他の組織に直接囲まれる。
内分泌物の例としては、オキシトシン、バソプレシン、セロトニン、エンドルフィン、ソマスタチン(somastatin)、セクレチン、コレシストキニン、インスリン、グルカゴン、ボンベシン、カルシトニン、エピネフリン、ノルエピネフリン、ステロイド、及び他のホルモンが挙げられる。内分泌物の分泌に特化した上皮細胞の例としては、以下に制限されないが、下垂体前葉及び下垂体後葉の細胞；胃及び呼吸管の細胞；甲状腺及び副甲状腺の細胞；副腎の細胞；生殖腺の細胞；ならびに腎臓の糸球体近接部装置の細胞が挙げられる。
本発明の単離されたＨＳ細胞は、直接またはＥＳ細胞、ＥＣ細胞、他の幹細胞および／またはテラトカルシノーマ細胞の分化に関する当該分野において既知の技術を用いて適当な前駆細胞を介して、内分泌物を分泌する上皮細胞に分化しうる。このような技術は本明細書中に参考のために引用される。例えば、本明細書中に完全に引用される、Ramiya et al., Nature Medicine, 6(3):278-282 (2000)には、島生産幹細胞(Islet producing stem cells)（ＩＰＳＣ）培養物が糖尿病前症のマウスから外植された消化膵臓組織から確立された膵臓幹細胞から膵島細胞のインビトロでの生成が記載される。島前駆細胞は、正常マウス血清を含むイーグル高アミノ酸培地で培養された上皮様ＩＰＳＣの単層から発達し始めた。Ｉｄ．ＶＥＧＦ、肝実質細胞成長因子、再生遺伝子−１、トランスフォーミング成長因子アルファ及び島新生関連タンパク質(islet neogenesis-associated protein)がまた、管の上皮細胞に対して分裂促進性であり、島内分泌細胞を生じることが見出された。Ｉｄ．加えて、肝実質細胞成長因子、ベータ−セルリン及びアクチビンＡが腺房細胞をインスリン分泌細胞に分化させることが示された。Ｉｄ．（また、その内容が参考によって本明細書中に引用される、Serup et al., Nature Genetics, 25:134-135 (2000), Assady et al., Diabetes, 50:1691-7 (2001), 及びLumelsky et al., Science, 292: 1389-93 (2001)を参照。）
結合組織の主要な構成成分は、タンパク質線維、無定形基本物質、及び組織液から構成される、細胞外マトリックスである。細胞外マトリックスの成分は、上皮組織若しくは結合組織のいずれかまたは双方によって分泌される。細胞外マトリックスの分泌に特化した上皮細胞の例としては、以下に制限されないが、エナメル芽細胞（エナメルを分泌）；耳の前庭の半月面細胞、およびコルティの歯間細胞が挙げられる。
本発明の単離されたＨＳ細胞は、直接またはＥＳ細胞、ＥＣ細胞、他の種類の多分化能性若しくは幹細胞、および／またはテラトカルシノーマ細胞の分化に関する当該分野において既知の技術を用いて適当な前駆細胞を介して、細胞外マトリックスを分泌する上皮細胞に分化しうる。
（ｄ）上皮吸収性細胞
吸収に関連のある上皮細胞は、胃、外分泌腺、及び尿生殖路に見出される。このような上皮細胞の例としては、以下に制限されないが、腸の刷子縁細胞；外分泌腺の線条部導管細胞；胆嚢上皮細胞；腎臓の近位尿細管の刷子縁細胞；腎臓の遠位尿細管細胞；輸出管の非線毛細胞；ならびに精巣上体の始原(principle)及び基底細胞が挙げられる。
本発明の単離されたＨＳ細胞は、直接またはＥＳ細胞、ＥＣ細胞、他の種類の多分化能性若しくは幹細胞、および／またはテラトカルシノーマ細胞の分化に関する当該分野において既知の技術を用いて適当な前駆細胞を介して、吸収性上皮細胞に分化しうる。
（ｅ）収縮性上皮細胞
筋上皮細胞は、分泌または管細胞の基底板及び基底極間に位置する星状または紡錐体状の細胞である。筋上皮細胞の機能は、腺の分泌または伝導位置周辺で収縮するものであり、ゆえに、外部に向かって分泌産物を促すのを補助する。筋上皮細胞の例は、紅彩及び外分泌腺に見出される。
本発明の単離されたＨＳ細胞は、直接、またはＥＳ細胞、ＥＣ細胞、他の種類の多分化能性若しくは幹細胞、および／またはテラトカルシノーマ細胞の分化に関する当該分野において既知の技術を用いて適当な前駆細胞を介して、筋上皮細胞に分化しうる。
（ｆ）その他の上皮細胞
上皮細胞によっては、特に単一の機能または環境に特化するものがあり、それ自体、上記カテゴリーのいずれにも分類できないものがある。例えば、レンズ細胞としては、水晶体前極の上皮細胞、及び水晶体線維細胞がある。同様にして、色素細胞としては、網膜色素上皮細胞、及びメラノサイトがある。
本発明の単離されたＨＳ細胞は、直接、またはＥＳ細胞、ＥＣ細胞、他の種類の多分化能性若しくは幹細胞、および／またはテラトカルシノーマ細胞の分化に関する当該分野において既知の技術を用いて適当な前駆細胞を介して、特定の上皮細胞に分化しうる。
結合組織への分化
結合組織は、その細胞によって生産される豊富な細胞内材料という特徴を有する。結合組織は、体内で形態を形成及び維持する役割がある。機械的な役割を機能すると、細胞及び器官と連結、結合して、最終的に体を支持するように作用するマトリックスを提供する。
骨細胞、線維芽細胞及び脂肪組織等の、結合組織の細胞によっては、局所的に生産され、ここに存在し続けるものもある。他の細胞では、他の領域に向かうが、結合組織を循環し、一時的に存在するものもある。結合組織の細胞成分は、以下のクラスに細分化される：細胞外マトリックス分泌細胞；代謝及び貯蔵に特化した細胞；ならびに血液及び免疫系の循環細胞。
これらのクラスの結合組織細胞の詳細な説明を以下に記載する。
（ａ）細胞外マトリックス分泌細胞
結合組織の細胞外マトリックス分泌の例としては、以下に制限されないが、線維芽細胞；毛管の周皮細胞；椎間円板の髄性細胞；セメント芽細胞及びセメント細胞（歯の根の骨様セメント質を分泌する）；造歯細胞及び歯細胞(odontocyst)（象牙質を分泌する）；軟骨細胞（軟骨を分泌する）；骨芽細胞及び骨細胞；骨前駆細胞(osteoprogenitor cell)（骨芽幹細胞）；眼の硝子体の硝子体細胞；ならびに耳の外リンパ腔の星細胞が挙げられる。
本発明の単離されたＨＳ細胞は、直接またはＥＳ細胞、ＥＣ細胞、他の種類の多分化能性若しくは幹細胞、および／またはテラトカルシノーマ細胞の分化に関する当該分野において既知の技術を用いて、骨前駆細胞(osteoprogenitor)等の適当な前駆細胞を介して、細胞外マトリックス分泌細胞に分化しうる。
（ｂ）代謝及び貯蔵に特化した細胞
代謝及び貯蔵に特化した細胞の例としては、以下に制限されないが、肝実質細胞及び脂肪細胞がある。
本発明の単離されたＨＳ細胞は、直接またはＥＳ細胞、ＥＣ細胞、他の種類の多分化能性若しくは幹細胞、および／またはテラトカルシノーマ細胞の分化に関する当該分野において既知の技術を用いて適当な前駆細胞を介して、代謝及び貯蔵に特化した細胞に分化しうる。
一実施態様においては、ＨＳ細胞は、例えば、Dani, Cells Tissues Organs, 165: 173-180 (1999)の方法によって、脂肪細胞に分化するように誘導される。ＨＳ細胞がインビトロで脂肪細胞に分化できることによって、脂肪生成における初期の分化事象を研究するための及び間充織幹細胞の脂肪芽細胞(adipoblast)系列への拘束にかかわりのある調節遺伝子を同定するための有益なモデルが提供される。
脂肪細胞系列へのＨＳ細胞の拘束に関する前提条件としては、短期間レチノイン酸（ＲＡ）によりその分化初期段階のＨＳ細胞由来の胚様体を処理することがある。２相は、ＥＳ細胞からの脂肪生成の発達で識別される：胚様体（ＥＢ）形成してから２〜５日間の、第一の相は、全トランス型−ＲＡの影響を受けるＨＳ細胞の拘束のための許容される期間に相当する。第二の相は、最終分化のための許容される期間に相当し、前脂肪細胞クローン系(preadipose clonal line)からの細胞の分化で従来示されるように脂肪形成ホルモンを必要とする。処理によって、ＲＡで処理しないと２〜５％であるのに対して、５０〜７０％の脂肪細胞を含む過成長が起こる。
ＲＡは、最終分化に重要であることが知られているホルモンまたは化合物には置換されえない。初期のＥＢを、インスリン、トリヨードチロニン、デキサメタゾンまたはチアゾリジンジオン(thiazolidinedione)ＢＲＬ４９６５３等の、ＰＰＡＲの強力な活性剤、及び非代謝脂肪酸２−ブロモパルミテートで、単独あるいはこれらを組み合わせて処理すると、低レベルの脂肪生成（５％）が生じる。最終的な脂肪細胞の分化を調節することが従来報告されている因子のうち、ＲＡは、ＨＳ細胞から脂肪細胞の発達を引き起こすことができる自然で発生する化合物であると考えられる。
エネルギー源としての脂肪細胞の主な機能は、トリグリセリドを貯蔵し（脂肪生成活性)、またホルモン条件で遊離脂肪酸を放出する（脂肪分解活性）ことである。ＥＢ由来の脂肪細胞は、それぞれ、インスリンに及びβ−アドレナリン作動物質に応答して脂肪生成及び脂肪分解活性双方を発揮することが示されることから、成熟及び機能性脂肪細胞はインビトロではＨＳ細胞から形成されることが示される。
ＰＰＡＲ（ＰＰＡＲδ及びＰＰＡＲγ）及びＣ／ＥＢＰδ（Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ及びＣ／ＥＢＰα）は、脂質代謝にかかわりのある遺伝子を調節する核因子である。Ｃ／ＥＢＰαは脂肪細胞の分化した表現型を維持するのに重要であると考えられ、また、幾つかの一連の事象からＰＰＡＲγならびにＣ／ＥＢＰβ及びＣ／ＥＢＰδは脂肪細胞への前脂肪細胞の最終分化のトリガーである。幹細胞の脂肪細胞系列への拘束におけるこれらの因子の役割は、ＨＳ細胞の決定及び分化期間中のこれらの発現を研究することによって説明される。ＰＰＡＲγ及びＣ／ＥＢＰβの発現は、決定相中は低く、最終分化のマーカーである脂肪細胞−脂肪酸結合タンパク質（ａ−Ｆ ＡＢＰ）の発現と平行する。この結果から、ＰＰＡＲγ及びＣ／ＥＢＰβは脂肪細胞系列へのＨＳ細胞の拘束に関する調節遺伝子ではないことが示唆される。従来、ＰＰＡＲδ遺伝子の発現はラットの胚発達中初期に検出され、ＰＰＡＲγの発現の前に起こることが報告されていた。発現の同様の一時的なパターンが発達したＥＢで保存される。ＰＰＡＲγに対して、ＰＰＡＲδは、ＨＳ細胞の決定相中に強く発現することから、この因子は脂肪細胞系列への間充織前駆細胞の拘束にかかわりのあるマスター遺伝子としての良好な候補でありうることが示唆される。しかしながら、ＰＰＡＲδ遺伝子の発現は脂肪組織に限定されず、その発現はＨＳ細胞の脂肪生成を誘導するのに必要な処理によって修飾されない。脂肪酸２−ブロモパルミテートまたはカルボサイクリン(carbocyclin)等のＰＰＡＲδの強力な活性剤で初期ＥＢを刺激しても、脂肪生成経路に沿ったＥＢの分化は引き起こされない。
ＰＰＡＲδおよび／またはＰＰＡＲγが欠損したＨＳ細胞の生成により、異なる脂肪生成段階中のこれらの転写因子の役割の解明が容易になるであろう。２回の相同組換えによる遺伝子ターゲッティングによって、これらの突然変異ＨＳ細胞が得られる。遺伝子トラッピング及び機能の獲得または欠失などの、未分化ＨＳ細胞の遺伝子操作と、分化培養系を組み合わせることによって、脂肪生成における初期の決定事象に係わりのある新規な調節遺伝子を同定する手段が提供される。
さらに、白血病抑制因子（ＬＩＦ）及びＬＩＦレセプター（ＬＩＦ−Ｒ）遺伝子は、前脂肪細胞から脂肪細胞に分化中に発達上調節される。ＬＩＦ及びＬＩＦ−Ｒは双方とも脂肪細胞分化の第一段階中に発現するという事実から、この経路は脂肪生成における調節的な役割を果たすのではと憶測される。ＬＩＦの役割は、ＬＩＦＲ／ＨＳ細胞が脂肪細胞への分化を受けることができるかどうかを調べることによって分かる。ＬＩＦのないＥＳ細胞は野生型細胞に匹敵する効率で脂肪生成することが知られており、これはＬＩＦ発現の欠失が脂肪組織の発達を防止することを示すＬＩＦ突然変異マウスの研究結果と一致する。ＬＩＦは、ＩＬ−６サイトカイン群に属し、この群のものの特徴としては、余分な生物学的機能がある。
したがって、ＬＩＦ関連サイトカインがインビボ及びインビトロ双方でＬＩＦの欠失を補うと仮定される。したがって、脂肪生成中のＬＩＦ−Ｒの役割が調べられる。しかしながら、ＬＩＦＲ／ＨＳ細胞が生成すると、ＬＩＦのないＨＳ細胞の脂肪細胞への分化能が劇的に減少することが示される。突然変異細胞由来の過成長の５〜７％のみが、野生型ＨＳ細胞由来の過成長の５５〜７０％に比べて脂肪細胞コロニーを含んでいた。遺伝子修飾されたＨＳ細胞を、幹細胞を脂肪生成経路に拘束するような培養条件と組み合わせて使用することによって、脂肪細胞の発達におけるＬＩＦ−Ｒの役割の決定が容易になる。
他の実施態様においては、本発明のＨＳ細胞は、参考によって本明細書中に引用される、Hamazaki et al., FEBS Letters, 497:15-19 (2001)の方法を用いて肝実質細胞に分化するようにされてもよい。
（ｃ）血液及び免疫系の循環細胞
血液及び免疫系の細胞の例としては、以下に制限されないが、赤血球（赤血球）；巨核球；マクロファージ（例えば、単球、破骨細胞、ランゲルハンス細胞、樹状細胞、及び小グリア細胞）；好中球；好酸球；好塩基球；肥満細胞；キラー細胞；Ｔリンパ球（例えば、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、キラーＴ細胞）；およびＢリンパ球（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、キラー細胞）が挙げられる。
本発明の単離されたＨＳ細胞は、直接、またはＥＳ細胞、ＥＣ細胞、他の種類の多分化能性または幹細胞、および／またはテラトカルシノーマ細胞の分化に関する当該分野において既知な技術を用いて、造血幹細胞等の適当な前駆細胞を介して、血液及び免疫系の細胞に分化しうる。Suzuki et al, Int'l J. of Hematology, 73:1-5 (2001) 及びCho et al., PNAS, 96:9797-9802 (1999)に記載されるものなどの、このような技術は、参考によって本明細書中に引用される。
一実施態様においては、ＨＳ細胞は、造血系列を形成するように誘導される。全部ではないが、ほとんどの造血系列がＥＳ細胞のインビトロの分化後に生産されうる(Hole, Cells Tissues Organs, 165:181-189 (1999))。ＨＳ細胞は白血病抑制因子（ＬＩＦ）を除いた後に類似して分化し始めるであろうが、その分化中のこれらの多分化能性細胞型の培養の条件は次に生産される細胞系列の素質に果たす重要な役割を有すると考えられる。少なくとも３つの方法が使用される：（１）ＨＳ細胞を凝集して、懸濁培養で分化させてもよい；（２）ＨＳ細胞を半固体培養物に播種して、ｉｎ ｓｉｔｕで分化させてもよい；および（３）ＨＳ細胞を補助細胞型の存在下で分化させてもよい。
懸濁培養物は、ＥＳ細胞のインビトロの分化の最も初期の報告に基づいて使用される。Doetschman et al., Embryol Exp Morphol., 87:27-45 (1985)には、ＬＩＦの除去(withdrawal)及び懸濁培養での生育後のＥＳ細胞からの嚢胞性胚様体の形成が報告された。これらの胚様体は、赤血球及びマクロファージから作製される、血島（卵黄嚢造血を思い出す）を含んだ。半固体培養物での分化は、好中球、肥満細胞、マクロファージ及び赤血球系列の生産の幾つかの群による論証に基づいて使用される(Wiles and Keller, Development, 111:259-267 (1991); Keller et al., Mol. Cell Biol. 13:473-486 (1993a); Lieschke and Dunn, Exp. Hematol., 23:328-334 (1995))。赤血球、骨髄及びリンパ球系列の存在を示すことがさらに示され(Nakano el al., Science, 265:1098-1101 (1994))、後者はナチュラルキラー細胞型を含む(Nakayama el al., Blood, 91 :2283-2295 (1998))ＯＰ９等の、補助細胞系列の使用が包含される。
ＨＳ細胞は確かにインビトロでの分化中にすべてではないがほとんどの造血系列を形成する潜在性を実現できるが、自発的にするのかは明らかではない。ＥＳ細胞に関しては、幾つかのグループがさらなる造血細胞成長因子(hematopoietic growth factor)が必要であると報告した。Nakanoらの研究(Nakano et al., Science, 265:1098-1101 (1994))では、マクロファージコロニー刺激因子が欠損した系であるＯＰ９の使用が包括的な造血細胞の分化を促進するのに重要であることが示唆される。ストローマ細胞の必要性がまた、ＲＰ０１０ストローマ細胞系を用いた研究者らの研究によって示される；この場合、外因性の成長因子も使用される。これに対して、他のグループによっては、骨髄、赤血球またはリンパ球系列への拘束は外因性の細胞系または成長因子を必要としないと考えられることを報告するものもある(Hole et al., Blood 90:1266-1276 (1996a))。
ＥＳ細胞に関しては、造血細胞への分化の結果における明らかな相違は、これらのグループによる幾つかの異なるアプローチによるものであるかもしれない。低レベルの特定の系列の拘束を増幅するかもれしない、外因性のサイトカインを使用したものもあった。確かに、ＥＳ細胞自体を分化させることが、拘束過程に影響を与えうる、広範な造血系のサイトカイン(Hole et al., Blood, 90:1266-1276 (1996a); Hole et at., Gene Technology, Berlin, Springer, pp 3-10 (1996b))及び因子(Keller et al., Mol. Cell. Biol., 13:473-486 (1993b))の転写物を含むことは明らかである。
リンパ球様前駆細胞は、インビトロでのＨＳ細胞の分化後に生産、単離できる。そのリンパ球様コンパートメントが遺伝子の損傷によって傷つけられるマウスに養子移入すると、長及び短期間双方にわたってＥＳ細胞で派生するリンパ球様再増殖が起こる(Potocnik et al., Immunol. Lett., 57:131-137 (1997))。初期の報告では、ＥＳ細胞から誘導される造血前駆細胞の再増殖能はリンパ系に限定されると示唆されるが、さらなる研究から、ＥＳ細胞から誘導される細胞は長期間の、多系列の(multilineage)、造血細胞再増殖の潜在性を示しうることが示される(Palacios et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7530-7534 (1995); Hole et al., Blood, 90:1266-1276, (1996a))。
長期間再増殖する造血幹細胞は、インビトロでのＥＳ細胞の分化後に同定できる。この分化の経過の特徴を明らかにすることによって、ＥＳ細胞を、造血幹細胞が別の細胞型として初めて現れる段階での遺伝子の異なる発現を試験することに使用できる。造血幹細胞は、比較的短い分化期間内で存在する；多系列の再増殖活性は、分化４日目に存在するが、３日目または５日目には見出されない(Hole et al., Blood, 90: 1266-1276 (1996a))。既知の造血系の遺伝子の発現は、造血細胞の分化でのこの期間の重要性を強調する；発現はこの期間で劇的にアップレギュレーションされる(Hole et al., Blood, 90:1266-1276 (1996a); Hole and Graham, Battieres Clin. Hematol., 3:467-483 (1997))。減法ハイブリダイゼーション法(subtractive hybridization approach)を用いて、Hole and Graham, Battieres Clin. Hematol., 3:467-483 (1997)は、このインビトロの分化モデルは造血細胞遺伝子の豊富な源であることを示した；少なくとも２種の同定された新規な遺伝子が初期の造血細胞の拘束と同じように胚形成及び造血細胞系で発現する。
遺伝子トラッピングは、初期の造血細胞の拘束にかかわりがあると考えられる遺伝子を同定するのに使用できる。このストラテジーでは、遺伝子を、薬剤耐性を付与する発現構築物にしばしば連結される、ＨＳ細胞のゲノム中にレポーター構築物を挿入することによってランダムに突然変異する。具体的には、「トラップされた」遺伝子の発現プロフィールを、その後、キメラ動物の生産後に観察する；候補遺伝子がさらに配列決定によって同定できる。別のアプローチとしては、予備スクリーン(prescreen)としてＴＳ細胞のインビトロの分化を使用するものがある。インビトロのＥＳ細胞の造血細胞への分化のＯＰ９依存型モデルを用いて、造血及び内皮細胞の発現トラッピングが示された(Stanford et al., Blood 92:4622-4631 (1998))。
さらなる実施態様においては、ＨＳ細胞を、リンパ球に分化するように誘導する。成熟Ｉｇ分泌Ｂリンパ球へのＥＳ細胞の分化に関する有効な系を確立した、Cho et al.によって提供された方法(Cho et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:9797-9802 (1999))を用いた具体的なプロトコルは、下記のとおりである。
ＢＭストローマ細胞系、ＯＰ９を、２．２ｇ／リットルの炭酸水素ナトリウム及び２０％ ＦＣＳ（ＥＳグレート及びロット試験済；Cyclone, Logan, UT）を捕捉したαＭＥＭ中で単層として培養する。ＯＰ９培地はまた、ＴＳ／ＯＰ９共培養にも使用される。ＨＳ細胞を、１ｎｇ／ｍｌの白血病抑制因子(R & D Systems, Minneapolis, MN)と共にマイトマイシンＣで処理した胚線維芽細胞のコンフルエントな単層上で培養する。ＨＳ及び胚線維芽細胞を、１５％ ＦＣＳ、２ｍＭ グルタミン、１１０μｇ／ｍｌ ピルビン酸ナトリウム、５０μＭ ２−メルカプトエタノール、及び１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ７．４）を捕捉した、ＤＭＥＭ中で維持する。すべての共培養物を、空気中に５％ＣＯ２を含む恒湿インキュベーターで３７℃でインキュベートする。周期的に試験することによって、すべての細胞系がマイコプラスマを含まない培養物として維持されることが示される。
造血細胞誘導では、ＨＳ細胞の単一の細胞懸濁液を、６ウェルのプレートのコンフルエントなＯＰ９単層上に播種する。培地を３日目に交換する；５日までに、ほとんど１００％のＴＳコロニーが中胚葉様コロニーに分化する。この培養物を５日目にトリプシン処理する（０．２５％；ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）；単一の細胞懸濁液を、３０分間、予め播種する；さらに、非付着細胞（１〜２×１０６）を１０ｃｍディッシュの新たなコンフルエントなＯＰ９層上に再播種する。６日または７日目に、造血細胞様の、平滑な丸い細胞の小さなクラスターが現れ始める。８日目に、ゆるく付着する細胞を、ゆるやかに洗浄して落とし、新たなＯＰ９層（トリプシンを含まない）上に播種する。この処理によって、造血細胞の潜在性を有する細胞が増加し、分化した中胚葉及び未分化のＨＳコロニーが残る。
この継代後、造血細胞コロニーは１０及び１２日の間さらにはそれ以降顕著な増殖で拡張する。１９日目まで、ＨＳ／ＯＰ９共培養物から回収されたＣＤ４５＋細胞の全数がおよそ１０５細胞である−Ｆｌｔ−３Ｌが５〜２０ｎｇ／ｍｌ(R & D Systems)の最終濃度で使用される。細胞を、５日目から外因性のＦｌｔ−３Ｌの存在下で培養する。Ｆｌｔ−３Ｌをより遅い時間（８日目以降）に添加すると促進が観察されるので、５日目のＦｌｔ−３Ｌの添加は、Ｂリンパ球形成の促進のための一時的な窓を意味すると考えられる。培地を、８〜１５日の間、交換するおよび／またはトリプシンなしで継代する［即ち、単一細胞の懸濁液にして、瀘過する（７０ｕｍ）］。
ｓｌｇＭ−Ｂ細胞を得るために、リンパ−造血細胞を、１５日目に集め、新鮮なＯＰ９単層上に再播種する。２８日目に、細胞を、４日間、１０μｇ／ｍｌのリポ多糖（ＬＰＳ）で刺激する。次に、細胞及び培養上清を、それぞれ、フローサイトメトリー及びＥＬＩＳＡ用に集める。別の実験では、細胞を、４８時間、ＬＰＳ（１００μｇ／ｍｌ）で刺激し、ＣＤ８０（Ｂ７−１）のアップレギュレーションについて分析する。
形質転換した細胞系を得るために、ＩＬ−７（５ｎｇ／ｍｌ）(R & D Systems)を、Ｆｌｔ−３Ｌ含有ＴＳ／ＯＰ９共培養物に８日目に添加して、未成熟プレＢ細胞を維持する−共培養物を、プロデューサー細胞系(producer cell line)の４日目のコンフルエントなプレートから集めた未希釈のウィルスストックを添加することによって感染させる。１０ｃｍディッシュの共培養物を、培地を、４μｇ／ｍｌのポリブレン(Sigma)及びＩＬ−７を含むウィルスストック３ｍｌで置換することによって感染させる。プレートを、２〜４時間、３７℃で周期的に揺動する。この期間後、ＩＬ−７を含む新鮮なＯＰ９培地５ｍｌをプレートに添加する。この培地を５日後にＩＬ−７は含むがＦｌｔ−３Ｌは含まない培地に交換する。次の培地はＩＬ−７を含まないものに交換する。フローサイトメトリー分析から、すべての形質転換系は同じ表現型を示すことが示される。各実験では、ＣＤ４５Ｒ＋ ＣＤ２４＋ ＩｇＭｅ未成熟プレＢ細胞の有意な集団が存在する。感染細胞をバルクで生育させた後、限界希釈によってクローニングする。ウィルスゲノムの組み込まれたコピーの存在を、サザンブロット分析によって確認する。
ＨＳ／ＯＰ９共培養を開始してから異なる時間に集められた細胞のフローサイトメトリー分析から、ＣＤ４５＋細胞が共培養の５日目までに最初に観察されることが明らかである。８日目までは、ＣＤ４５＋はまた、その表面にＣＤ １１７及びＳｃａ−ｌを発現することから、初期の造血幹細胞のものに類似する表現型を示す。共培養物中で生じる初期の造血の有意な部分が、一般に、ＣＤ２４＋細胞の大部分がＴＥＲ−１１９で陽性に染色する（８及び１２日目）ことによって明らかなように、赤血球系列の細胞を生じる。大部分の共培養された１２日目の細胞が赤血球系列（ＣＤ２４ｈｉ ＣＤ４５− ＴＥＲ−１１９−）に属するが、ＣＤ４５＋細胞は、低から高レベルのＣＤ４５Ｒを発現する。この表現型から、Ｂ系列細胞が８〜１２日目の間に共培養物から現れることが示される。このＢ系列の表現型は１２日目までは非常に明らかであるが、長期間の培養物（＞２０日）からは、めったにＣＤ１９＋ ＩｇＭ Ｂ細胞が形成しない。
Ｆｌｔ−３Ｌを、造血細胞が初めて観察される際に、ＴＳ／ＯＰ９共培養物の５日目に添加する。１９日目の共培養物の分析から、Ｆｌｔ−３Ｌを添加すると、ＨＳ／ＯＰ９共培養物からのＢリンパ球の形成が劇的に促進する（Ｆｌｔ−３Ｌを添加する及びＦｌｔ−３Ｌを添加しないと、それぞれ、６０〜／ｏ ｖｓ． ６％ ＣＤ４５Ｒ＋細胞）ことが示される。ゆえに、５日目にＦｌｔ−３ＬをＨＳ／ＯＰ９共培養物に添加すると、約１０倍、より遅い時間でのＢ系列細胞の回収が増加する。有意に、骨髄球系、ＣＤ １１ ｂ ＋（Ｍａｃ−１）、及び赤芽球系、ＴＥＲ −１１９、細胞の頻度は、Ｆｌｔ−３Ｌで処理した培養物では減少する。Ｔリンパ球への分化の証拠はこれらの培養物では観察されない。１９日目のＨＳ／ＯＰ９共培養物細胞の表現型から、Ｆｌｔ−３Ｌを添加すると、細胞の全数は若干の増加（〜３０％）を観察するのみであるが、ＣＤ１９． ＣＤ４５Ｒ− ＡＡ４．１− ＣＤ２４＋ ＩｇＭ−細胞の生成の特異的な増加が起こることが明らかに示される。Ｆｌｔ−３Ｌを５日目に添加すると、ＨＳ／ＯＰ９共培養物系でのＢリンパ球形成が高い効率で起こる。
より遅く集められたＦｌｔ−３Ｌを含むＨＳ／ＯＰ９共培養物の細胞の分析から、Ｂ系列マーカーに陽性である細胞のパーセントが大きく増加することが示される。４週間培養した後、共培養物におけるほとんどすべて（＞９０％）の細胞が、Ｂ系列であるＣＤ４５Ｒ＋ ＣＤ １９＋リンパ球である。これらのＨＳから派生したＢリンパ球は、ＣＤ １１ ｂ＋の表現型及び小さなサブセット（２〜３％）のＣＤ５＋ Ｂ細胞を示すことから、ＣＤ５＋ Ｂ細胞はＨＳ／ＯＰ９共培養物では容易に形成しないことが示唆される。
さらにインビトロで生成したＢ細胞の機能的な能力を示すために、２８日目の共培養物をＬＰＳで処理すると、成熟表面ＩｇＭ− ＣＤ １９＋ Ｂ細胞は大きさを増し、かなり増殖する。マイトジェン活性化後、ＣＤ８０（Ｂ７−１）、活性化後の成熟Ｂ細胞で正常にアップレギュレートする共刺激分子の発現を調べる。さらに、ＬＰＳで刺激された細胞からの培養液上清を試験したところ、１１９−の存在について陽性（ＥＬＩＳＡ分析によって）であることから、これらの細胞は強固なレベルのＩｇ分泌が可能であることが示される−これらの知見から、成熟した、マイトジェンに応答する、Ｉｇを分泌するＢ細胞へのＨＳ細胞のインビトロでの分化に関する証拠が得られる。
外因性Ｆｌｔ−３ＬのＨＳ／ＯＰ９共培養物系への添加は、成熟した、機能的なＢリンパ球をＨＳ細胞からインビトロで生成するための有効かつ実際のモデル系の開発の鍵となる要素であることが分かる。様々な知見が、Ｆｌｔ−３がインビトロでの初期のＢリンパ球形成の重要な因子であるという考えを示唆する。さらに、様々な結果から、ＨＳ／ＯＰ９共培養物へのＦｌｔ−３Ｌの添加がＢリンパ球の生成を容易にする様式が明らかになる。インビボでのＢ細胞分化中に起こるフローサイトメトリー段階。ＨＳから派生するＢ細胞が正常な発達経路に従い、インビボで前駆細胞及び成熟Ｂ細胞と機能的に類似であるという事実から、この系はＢ細胞への分化に重要であることがわかるであろうという結論が導き出される。
インビトロで完全に遺伝子修飾されたＨＳ細胞から形質転換された分化した安定した細胞系を得ることができると、さらなる用途が得られるであろう。形質転換体は、生産及び維持するのが簡単であり、速い倍増時間を有するので、細胞系の誘導は、系列に特異的な遺伝子を標的とする突然変異を研究するのに可能性のあるアプローチの武器になるであろう。例えば、Ｖ（Ｄ）Ｊ組み換えにかかわる特定の遺伝子におけるヌル突然変異(null mutation)が評価されうる。
本発明は、インビトロでＨＳ細胞から直接ヒトＢ細胞前駆体(progenitor)および／またはＢリンパ球を生成するための系を包含する。このような系は、無γグロブリン血症または特定のＢ細胞の機能不全に罹患する個体の治療用途を有する遺伝的に規定されたＨＳ細胞から派生するＢ細胞の無限の源を提供するであろう。
筋肉組織への分化
筋肉組織は、収縮または前方突進（例えば、線毛細胞）の特化した機能を有する細長い細胞から構成される。
収縮細胞の例としては、以下に制限されないが、骨格筋細胞（赤、白、中間、紡錐及び筋衛星）；心筋（普通、結節及びプルキンエ線維）；ならびに平滑筋が挙げられる。
筋衛星細胞は、骨格筋の再生にかかわる筋幹細胞である。これらの細胞は、各成熟筋線維の周辺の基底板内に横たわる単核の紡錐体形状の細胞である。これらは、筋肉への分化後に残る不活性な筋原細胞であると考えられる。しかしながら、適当な刺激の後は、これらの正常に休止した細胞は活性化されて、増殖して、新たな骨格筋線維を形成する。
筋原細胞は、一緒に融合して、最後には骨格筋線維に発達する筋管を生じることができる有糸分裂後細胞である。ゆえに、筋原細胞は、骨格筋線維の中間前駆体として認識される。
本発明の単離されたＨＳ細胞は、直接、またはＥＳ細胞、ＥＣ細胞、他の種類の多分化能性または幹細胞、および／またはテラトカルシノーマ細胞の分化に関する当該分野において既知な技術を用いて、筋衛星細胞若しくは筋原細胞等の適当な前駆細胞を介して、収縮筋細胞に分化しうる。このような技術としては、その内容は参考によって本明細書中に引用される、McKarney et al, Int J. Dev. Biol. 41(3):385-90 (1997)、及びGussoni et al., Nature 401(6751):390-4 (1999)によって記載されるものなどの方法がある。McKarney et al.は、胚幹細胞の分化への筋原調節因子（ｍｙｆ５、マイトゲニン(myogenin)、ＭｙｏＤ１及びｍｙｆ６）の効果を記載する。Gussoni et al.は、移植レシピエントの造血系のコンパートメントの再構築を起こす、放射線照射動物中への正常な造血幹細胞のデリバリーを記載する。
前方突進機能を有する線毛細胞の例としては、以下に制限されないが、呼吸管の線毛細胞；卵管及び子宮内膜の線毛細胞；停留睾丸及び精巣輸出管の線毛細胞；ならびに中枢神経系の線毛細胞が挙げられる。
さらに、脂肪細胞及び骨格筋細胞は、同じ間葉幹細胞前駆体から派生すると考えられ、インビトロでは、骨格筋及び脂肪の発達プログラムは互いに排反することが示唆された。インビトロでは、骨格筋及び脂肪組織の間に逆の関係があることが多い。脂肪細胞系列とは逆に、骨格筋細胞系列は出現する。ＲＡ（１０−８Ｍ）のＨＳ細胞濃度の分化中に自発的に低く発達する予め処理された単一のＥＢは、さらに、脂肪細胞及び骨格筋細胞双方を生じうる（それぞれ、ａ−ＦＡＢＰ及びマイトゲニン遺伝子の発現によって測定した）。しかしながら、ＲＡの濃度が増加すると、分化プログラムの進行にシフトが起こる。１０−８Ｍより高いＲＡ濃度では、マイトゲニンの発現は阻害され、ａ−Ｆ ＡＢＰの発現が増加する。
ａ−Ｆ ＡＢＰ及びマイトゲニン遺伝子の発現は、顕微鏡による試験によって記録される脂肪細胞及び筋細胞の発達に平行である。エセンキマル細胞(esenchymal cells)によって主に発現する、Ａ２ＣＯＬ６遺伝子の発現は、修飾されないことから、ＲＡで初期のＥＢを予め処理することによって、ＨＳ細胞の発達プログラムに全身の変化は起こらないことが示唆される。筋形成から脂肪形成へのスイッチは、濃度に依存してＲＡによって誘導されうる。Ｍｙｆ ５またはＭｙｏＤ等の、骨格筋形成の初期遺伝子マーカーの発現の研究は、どの段階で筋原細胞の発達が遮断されるかを知る必要があるものの、これら結果から、ＨＳ細胞の脂肪細胞系列への拘束に関する許容時間がまた筋細胞系列にも重要であるという結論が得られる。ＨＳ細胞のインビトロでの分化によって、幹細胞が脂肪形成または筋形成の発達経路に従うかの決定にかかる因子の特徴が明らかになりうる。
本発明の単離されたＨＳ細胞、及び前駆細胞はまた、本明細書中に参考によって引用される、Kehat et al., J. Clin. Invest., 108:407-414 (2001) 及びMuller et al., The FASEB Journal, 14: 2540-2548 (2000)等の当該分野において既知の技術を用いて、心筋細胞に分化するように誘導されてもよい。
神経組織への分化
神経及び感覚組織は、神経インパルスを受ける、生じる、及び伝達する特化した機能を有する細胞体から拡張する伸張した突起を有する細胞から構成される。神経及び感覚組織の細胞は４つのクラスに分けられる：自律性ニューロン；ニューロン及びグリア細胞；感覚器官及び末梢ニューロンの支持細胞；ならびに感覚伝達細胞(sensory tranducer)。様々なクラスの神経及び感覚細胞の詳細な説明を以下に記載する。
本発明の単離されたＨＳ細胞及び前駆細胞は、その内容は参考によって本明細書中に引用される、Guan et al., Cell Tissue Res, 305:171-176 (2001), Przyborski et al., Eur. J. of Neuroscience, 12:3521-28 (2000), Brustle et al., Science, 285: 754-6 (1999), Hancock et al., Biochem. & Biophys. Res. Comm., 271:418-421 (2000), Liu et al., PNAS, 97(11): 6126-31 (2000)、及びFairchild et al., Curr. Bio., 10(23): 1515-18 (2000)などの、当該分野において既知の技術を用いて様々な種類の神経組織に分化するように誘導できる。
（ａ）レチノイン酸によるホメオボックス遺伝子の分化活性化
ショウジョウバエ及び脊椎動物の胚形成における位置情報を規定する、ホメオボックス遺伝子は、天然のモルフォゲンである、ＲＡに応答する。ヒトのＨＳ細胞では、ＲＡは、ＨＯＸ１、２、３、及び４として知られている、ヒトのアンテナペディア様ホメオボックス遺伝子の４つのクラスターすべての発現を特異的に活性化するのに使用できる。例えば、ヒトのＨＯＸ２遺伝子が濃度に依存して及びクラスターで３’から５’への配列と連続した順番で一緒に直線的に(in a sequential order co-linear)ＲＡによってＥＣ細胞中で分化により活性化することを示す、本明細書中に引用される、Bottero et al., Rec. Res. Cancer Res. 123:133-143 (1991)を参照。
これらの遺伝子は、一般的に、発達した中枢神経系の前後軸に沿って発現し、この際、３’側の遺伝子はミエンセファロン(myencephalon)中でより頭側で発現し、また、５’側の遺伝子は脊髄でより後端で発現する。ホメオボックス遺伝子の濃度依存性は、ＨＳ細胞が特定の濃度のＲＡに暴露されて、特定のホメオボックスクラスターまたはクラスター内の個々の遺伝子の発現を誘発し、これにより正確な位置に相当する、例えば、中枢神経形のサブ領域に相当する、型の組織への分化に拘束することを誘発することを意味する。
（ｂ）自立性ニューロン
自立性ニューロンの例としては、以下に制限されないが、１）コリン作動性ニューロン；２）アドレナリン作動性ニューロン；及び３）ペプチド作動性ニューロンが挙げられる。
本発明の単離されたＨＳ細胞は、直接、またはＥＳ細胞、ＥＣ細胞、他の種類の多分化能性または幹細胞、および／またはテラトカルシノーマ細胞の分化に関する当該分野において既知な技術を用いて適当な前駆細胞を介して、自立性ニューロンに分化しうる。
（ｃ）ニューロン及びグリア細胞
ニューロン及びグリア細胞の例としては、以下に制限されないが、１）ニューロン、２）星状細胞、及び３）乏突起神経膠芽細胞が挙げられる。
本発明の単離されたＨＳ細胞は、直接、またはＥＳ細胞、ＥＣ細胞、他の種類の多分化能性または幹細胞、および／またはテラトカルシノーマ細胞の分化に関する当該分野において既知な技術を用いて、ニューロン性前駆細胞等の適当な中間細胞を介して、ニューロン及びグリア細胞に分化しうる。このような技術としては、その完全な内容が参考によって本明細書中に引用される、下記のものなどの方法がある。
本明細書中に引用される、Woodbury et al., J. Neurosci. Res. 61:364-370 (2000)には、組み換え骨髄ストローマ細胞（ｒＭＳＣ）でニューロンの表現型を誘導するのに１〜１０ｍＭ ＢＭＥ（ＳＦＭ／ＢＭＥ）を含む無血清培地を使用することが記載される。
Lee et al.（本明細書中に引用される、Nature Biotech. 18:675-678 (2000)）には、マイトジェンならびにソニックヘドゲホッグ(sonic hedgehog)（ＳＨＨ）、ＦＧＦ−８、アスコルビン酸ｃＡＭＰ及びこれらの類似体等の特定のシグナル伝達分子及び因子を用いてマウスの胚幹細胞から、中脳及び菱脳のニューロン、特にドーパミン作動性及びセロトニン作動性ニューロンの効率的な生成が記載される。
本明細書中に引用される、Okabe et al., Mech. Dev. 59: 89-102 (1996)には、胚幹（ＥＳ）細胞からの神経上皮前駆細胞を分化させる培養条件が記載される。詳細には、ＥＳ細胞由来の神経上皮前駆細胞の高度に強化された集団を、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）の存在下で増殖させた。これらの細胞は、ｂＦＧＦを抜いた後ニューロン及びグリア細胞双方に分化する。
本明細書中に引用される、McDonald et al., Nature Medicine 5:1410-1412 (1999)には、分化を誘導する手段としてｉｎ ｓｉｔｕ移植が記載される。詳細には、神経分化マウス胚幹細胞を、外傷性損傷後９日目に、ラットの脊髄に移植した。これから２〜５週間後の組織学的な分析から、移植組織由来の細胞は生存しており、神経膠星状細胞、乏突起神経膠芽細胞及びニューロンに分化し、損傷端から８ｍｍ離れたところまで移動していたことが示された。
本明細書中に引用される、Borlongan et al., NeuroReport 9:3703-3709 (1998)には、不死化ヒト胎児性癌細胞（Ｎｔｅｒａ２またはＮＴ２細胞）からの有糸分裂後ニューロン様（ｈＮＴ）細胞の発達を刺激するのにレチノイン酸が使用されることが記載される。
Oliver Brustle et al., "Protocol for Producing Glial Precursors from pES Cells: A Source of Myelinating Transplants", The American Association for the Advancement of Science 285: 754-756 (1999)にはさらに、ＥＳ細胞をグリア細胞に分化させる技術が記載される。このような技術は、ＨＳ細胞を分化させるのに使用でき、本明細書中に参考によって引用される。
ニューロン性前駆細胞の電気生理学的特性を明らかにするために、これらを１２日間以上、Ｂ２７及び５％ＦＣＳを含む神経基本培地(neurobasal medium)中に維持して、１５個の細胞の活性をこれらのプレートから記録する。このような細胞の静止膜電位は約−６０ｍＶであるはずであり、静止電位から２０ｍＶ脱分極すると内向き作用電流を示すはずである。
内向き電流は、速い不活性化外向き電流（ＩＡ）及び一定の外向き電流に従う。これらの電流は、Ｃｓが充填された細胞では存在しないはずであることから、外向きＫ−整流チャンネル(outward K-rectifying channel)が仲介すると考えられることが示される。
ほとんどのニューロン細胞は、様々な期間及び大きさの自発的なシナプス電流を発現する。グルタメートを記録ニューロン前駆細胞、即ち、推定上のニューロン付近の細胞に適用することによって、短い遅延で記録ニューロンにこれらのシナプス電流が生成し始める。記録シナプス電流は、２タイプある：約０ｍＶで逆転する、早い興奮性シナプス後電流、およびアセテート含有ピペットで記録されると約−５０ｍＶで逆転する、緩崩壊阻害シナプス電流（slow-decaying inhibitory synaptic current）。さらに、記録細胞はまた、静止電位で記録された印がつけられた内向き電流を有するグルタメートの局所的な適用に応答するはずである。自発的な及び誘発されたシナプス応答、さらにはグルタメートに対する細胞の応答から、培養物中の記録細胞は出生前の、培養ＣＮＳニューロンに類似する特性を有するアレイを維持することが示される。
ＮＭＤＡによる記録細胞の刺激は、環状アデノシン１リン酸応答素子結合タンパク質（ＣＲＥＢタンパク質）のリン酸化及びｃ−ｆｏｓ遺伝子の転写を誘導する。これらの２種の誘導は、機能性ＮＭＤＡレセプターが発現するかどうかを決定するために分析される。非刺激細胞は、ホスホ−ＣＲＥＢ(phospho-CREB)で染色されないはずである。これに対して、グルタメートまたはＮＭＤＡのいずれかで１０分間刺激後の記録ニューロン細胞は、強い核免疫反応性を示すはずであり、ホスホ−ＣＲＥＢで染色される。これに対して、グリア様細胞の大きな核はホスホ−ＣＲＥＢ染色を示さないはずである。
さらに、グルタメートまたはＮＭＤＡで処理された細胞のＲＴ−ＰＣＲから、ｃ−ｆｏｓの誘導が示され、これから、この調製物のニューロンによっては機能性ＮＭＤＡレセプターを有するものがあることが示唆される。シナプス連結の存在はまた、電子顕微鏡によって、または形態学的な特徴によって確認でき、例えば、多くのシナプス小胞を含む典型的なプレシナプス構造、または活性領域の特徴である、膜の肥厚が観察されるはずである。このような結果から、ＨＳ細胞由来のニューロン前駆細胞は、機能性シナプス連結を形成する、減数分裂後ニューロンに分化できることが示唆される。
従来の研究では、ｂＦＧＦが神経上皮前駆細胞の強力なマイトジェンであることが示された。ＨＳ細胞のｂＦＧＦへの応答を調べるために、６〜７日間ＩＴＳ／ＦＮ培地中に保持したＨＳ細胞を、解離し、様々な異なるＤＭＥＭ／Ｆ１２を基礎とした培地に播種する。３日後、細胞密度を測定する。修飾Ｎ３（ｍＮ３）培地、ｂＦＧＦ及びフィブロネクチンを捕捉したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地の組み合わせは、最も高い増殖効果を有するはずである。５〜５０ｎｇ／ｍｌの濃度では、ｂＦＧＦは、増殖に関して同様の効果を示すはずである。１ｎｇ／ｍｌ以下の濃度では、ｂＦＧＦは、明らかな増殖効果を示さないはずである。ラミニンはフィブロネクチンに比べて若干より高い細胞増殖の刺激を示すことが予想されるため、Ｎ３培地、ｂＦＧＦ及びラミニンの組み合わせ（「Ｎ３ＦＬ」培地）は、ニューロン前駆様細胞の増殖条件として使用される。
Ｎ３ＦＬ培地では、主な増殖細胞は、ＩＴＳ／ＦＮ培地で誘導されるネスチン陽性細胞(nestin-positive cells)に類似するはずである。Ｎ３ＦＬ培地中で生育させると、様々なＥＳ細胞系（Ｄ３、ＣＪ７及びＪｌ）と似たＨＳ細胞は、同じ形態をとるはずであり、また、その増殖はｂＦＧＦにかなり依存するはずである。細胞増殖は、播種してから１、４及び７日目の細胞密度を計測することによって定量される。細胞の計測から、培養物中で７日後の細胞数が６倍増加することが示されるはずである。
ニューロン前駆体（ネスチン）、減数分裂後のニューロン（微小管付属タンパク質２；ＭＡＰ２）、神経膠星状細胞（神経膠線維酸性タンパク質；ＧＦＡＰ）及び乏突起神経膠芽細胞系列細胞（Ｏ４、Ｇａｌ−Ｃ）に特異的な抗体で調製物を染色することも可能である。ネスチン陽性細胞は、各時間で、全細胞集団の８０％以上でなければならない；ＭＡＰ２陽性細胞は、全細胞集団の１０〜１５％でなければならない；およびＧＦＡＰ陽性細胞は、全細胞集団の２％以下でなければならない。この調製物にはＯ４−またはＧａｌ−Ｃ−陽性細胞は存在しないはずである。
さらに、成体の中枢神経系から単離された神経前駆体は、脳への移植後にニューロン及びグリア細胞に分化し、脊髄への移植後は乏突起神経膠芽細胞及び神経膠星状細胞に分化する。同様にして、幹細胞は、分化及び移入を受ける脊髄に移植されてもよく、損傷を受けた脊髄の回復を促進する。McDonald et al., 1999, Nature Medicine 5:1410-1412は、神経への分化を誘導するようにＲＡ（レチノイン酸）に予め暴露した（５００ｎＭ全トランス型レチノイン酸に４日間暴露）ＥＳ細胞を移植し、神経膠星状細胞、乏突起神経膠芽細胞及びニューロンへの分化、脊髄での移動、ならびに損傷を受けた脊髄での回復を示す挙動（運動）の結果を観察した。
一実施態様においては、ＨＳ細胞を、ＥＳ細胞の代わりに使用して、分化及び移動を受け、このような治療を必要とする患者の回復を促進するように脊髄に移植してもよい。ＨＳ細胞由来の胚様体（４日間レチノイン酸なしで、さらに４日間レチンありで）を移植に使用し、この際、ＲＡは神経への分化を誘導するのに使用される。部分的にトリプシン処理された胚様体を、脊髄挫傷してから９日目に形成する空洞に細胞凝集物として移植する。見せかけで操作したコントロールは、細胞の移植の代わりに培養液のみを空洞内に注射する以外は、同様にして扱った。運動機能を、バッソ−ビーティー−ブレスナハン(Basso-Beattie-Bresnahan)（ＢＢＢ）ロコモーターレーティングスケール(Locomotor Rating Scale)を用いて評価する。
移植前日（損傷後８日目）、ＢＢＢスコアを得て、コントロール及び実験群を突合せ、被検者をランダムにグループに選定して、初期の運動スコアを群間で等しくなるようにする。衝突損傷から９日後に、被検者に、脊髄定位固定フレーム(spinal stereotaxic frame)、５μｌのハミルトンシリンジに配置される直径１００μｍの先端を有するガラスピペット、またはコフ微定位固定注入システム(Kopf microstereotaxic injection system)(Kopf Model 5000 & 900; Kopf, Tujunga, California)によって神経分化ＨＳ細胞（約１×１０６）またはベヒクル培地を移植する。ＨＳ細胞またはベヒクル培地（５μｌ）を、５分間にわたってＴ９レベルで空洞の中央に注射する。コントロールと同じ時間、３回個々の実験を全部終了した。１回目のシリーズは、移植してから５週間目に挙動分析及び後期組織分析(late histologic analysis)（１群当たりｎ＝１１）について終了して、ＨＳ細胞移植をコントロールと比較する。２回目のシリーズは、初期（移植してから２週間）及び後期（移植してから５週間）の組織学的な結果（１群当たりｎ＝１１）を比較するのに使用し、ＨＳ細胞移植（ＲＯＳＡ ｌａｃＺトランスジーン系）をコントロールと比較する。
遺伝学的に印をつけ、１０ｕＭのＢｒｄＵの２４時間パルスでインビトロで予め標識したＨＳ細胞由来の細胞を、移植してから１４〜３３日にｉｎ ｓｉｔｕで同定する。同定はまた、特異的な抗体で達成されうる。移植してから２〜５週間に、ＨＳ細胞由来の細胞は、凝集物中に見出されるまたは損傷部位にわたって別々に分散しているべきである。さらに、単一の細胞は、頭または尾のいずれかの方向で空洞から８ｍｍはなれて見出されるはずである。ほとんどの移植患者では、移植してから２週間までに、ＨＳ細胞由来の細胞が、培地で処置された患者に一般的に占められる空間を満たすはずである。５週間までに、この領域でのＨＳ細胞由来の細胞の密度は、減少し、細胞外マトリックスを含む線維で置換されるはずである。
生き残ったＨＳ細胞由来の細胞は、乏突起神経膠芽細胞（腺腫様多発結腸ポリープ遺伝子産物）、神経膠星状細胞（神経膠線維酸性タンパク質）、及びニューロン（ニューロンに特異的な核タンパク質）に特異的なマーカーに対する抗体で同定されうる。核は、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２染色ではっきりと同定できる。ほとんどの生き残ったＨＳ細胞由来の細胞は、乏突起神経膠芽細胞及び神経膠星状細胞であるはずであるが、ＨＳ細胞由来のニューロンによっては、脊髄の中間に存在するものもある。また、ＨＳ細胞由来の乏突起神経膠芽細胞の多くは、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンの必須成分に免疫反応性であるはずである。
「開電場運動(open field locomotion)」における性能は、ＨＳ細胞移植によって促進する。見せ掛けで操作された移植群が体重を支持できないのに対して、ＨＳ細胞を移植した患者は部分的に体重を支持する歩行を示すはずである。ＢＢＢスコアの統計学的な相違は移植してから２週間までに達成されるはずである。１ヶ月後では、見せ掛けで操作された及びＨＳ移植群間でＢＢＢスケールで２ポイントの差異があるはずである。前者で得られたスコアは体重負荷及び協調運動を示さないのに対して、後者のスコアは部分的な肢の体重負荷及び部分的な肢の協調によって特徴付けられる歩行を示す。
要約すると、ＨＳ細胞由来の細胞は、落錘損傷(weight-drop injury)から９日目に脊髄に移植されると、少なくとも５週間は生存し；移植部位から少なくとも８ｍｍは移動し；腫瘍を形成せずに神経膠星状細胞、乏突起神経膠芽細胞及びニューロンに分化し；さらに運動機能が改善するはずである。
ｂＦＧＦを抜くことによって分化が以前に誘導された神経細胞は、２週間以上、Ｂ２７サプリメント及び５％ウシ胎仔血清を加えた神経基本培地中に有意に細胞を死亡させることなく維持できる。このような長期間の培養は、Ｊｌ、ＣＪ７及びＤ３細胞系に良好に適用される。しかしながら、長期間の培養は、Ｎ３を基本として血清を含まない培地中では困難である。
ＭＡＰ２及び神経フィラメント−Ｍ（ＮＦ−Ｍ）による培養液における細胞の２重標識により、２クラスの神経突起が存在することが示されるはずである。抗ＭＡＰ２抗体は、短い厚い(thick)突起(process)及び細胞体を染色し、また、抗ＮＦ−Ｍは薄い長い突起を染色する。２重標識時のＨＳ細胞由来のニューロンは、ＭＡＰ２に陽性な樹状突起及びＮＦ−Ｍに陽性な軸索を有するはずである。
抗シナプシンＩ(synapsin I)による染色は、樹状突起の細胞膜に密接に関連する分断構造を示す。このような染色パターンは、軸策に沿った異なる部位へのシナプスベヒクルの分離を示すはずである。
神経伝達物質の表現型を調べるために、神経細胞に分化するＨＳ細胞を、神経伝達物質に対する様々な抗体で染色する。結果から、多数のグルタメートに陽性な細胞が完全に陰性な細胞と混合されることが示されるはずである。
さらに、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）に陽性な細胞は共通であり、ＧＡＢＡ染色もまた利用できる。したがって、ＧＡＢＡに陽性であるがＭＡＰ２に陰性である薄い(thin)突起を同定することが可能である。この知見から、ＧＡＢＡ作動性ニューロン(GABA-nergic neuron)の軸策がＧＡＢＡに陽性でありＭＡＰ２に陰性であるため、樹状及び軸策構造の分化が示唆される。
さらに、ニューロン遺伝子の発現は、ニューロンに特異的なプライマーのパネルを用いた逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって分析されてもよい。調製物は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ６５）’カルビンジンＤ２８(calbindinD２８)、ＮＭＤＡレセプター１、２Ａ、２Ｂ、２０、１−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチルイソオキサゾール−４−プロピオネート(1-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionate)（ＡＭＰＡ）レセプター、及びＧＡＢＡＡレセプターを発現する細胞を含む。どの場合でも、かなりより多くの量の転写物が分化細胞の全ＲＮＡ中で検出される。
これらのニューロン細胞が特異的なＣＮＳ領域での細胞に相当するかどうかを調べるために、前後軸に沿った３位置に特異的なマーカーの発現を分析する。Ｏｔｘ−１は、主に、前脳及び中脳で発現し、Ｅｎ−１は中脳−後脳の境界で発現し、さらにＨｏｘａ−７は後脊髄で発現する。未分化のＨＳ細胞は、Ｈｏｘａ−７を発現するが、Ｏｔｘ−ｌ及びＥｎ−ｌを発現しないはずである。したがって、後脳マーカーであるＨｏｘａ−７の発現は、１０日以上、ｂＦＧＦの存在下で増殖するネスチンに陽性な細胞でダウンレギュレーションされるはずである。これに対して、Ｏｔｘ−１及びＥｎ−１は、これらの増殖細胞ではアップレギュレーションされるはずである。Ｂ２７及び血清を含む神経基本培地に切り換えることによる分化後は、Ｈｏｘａ−７の発現は再度アップレギュレーションされ、また、Ｏｔｘ−１及びＥｎ−ｌの発現は維持されるはずである。異なる転写因子の存在から、調製物が異なるＣＮＳ領域に特徴的なニューロンを生成することが示唆される。
（ｄ）感覚器官及び末梢ニューロンの支持細胞
感覚器官及び末梢ニューロンの支持細胞の例としては、以下に制限されないが、Ｃｏｒｔｉの器官の支持細胞（例えば、内及び外柱細胞、内及び外趾節骨細胞(phalangeal cell)、境界細胞、ヘンゼン細胞）；前庭の支持細胞；味蕾の支持細胞；嗅上皮の支持細胞；シュヴァン細胞；腸のグリア細胞；及び衛星細胞が挙げられる。
本発明の単離されたＨＳ細胞は、直接またはＥＳ細胞、ＥＣ細胞、他の種類の多分化能性または幹細胞、および／またはテラトカルシノーマ細胞の分化に関する当該分野において既知な技術を用いて適当な前駆細胞を介してこのような支持細胞に分化しうる。
（ｅ）感覚伝達細胞
感覚伝達細胞の例としては、以下に制限されないが、１）光レセプター；聴覚（例えば、Ｃｏｒｔｉの内及び外毛細胞）；２）加速及び重力感覚；２）味覚（タイプＩＩ味蕾細胞）；３）臭覚（例えば、嗅覚ニューロン）；血液のｐＨセンサー（頚動脈小体細胞、タイプＩ、タイプＩＩ）；４）触覚（例えば、表皮のメルケル細胞、１次感覚ニューロン(primary sensory neuron)）；５）温度及び痛みのセンサー（例えば、１次感覚ニューロン）；及び６）筋骨格系の形状及び力のセンサー（固有受容１次感覚ニューロン）が挙げられる。
本発明の単離されたＨＳ細胞は、直接、またはＥＳ細胞、ＥＣ細胞、他の種類の多分化能性または幹細胞、および／またはテラトカルシノーマ細胞の分化に関する当該分野において既知な技術を用いて、基底細胞等の適当な前駆細胞を介して、感覚伝達細胞、特に１次感覚ニューロンに分化しうる。
生殖細胞の分化
生殖にかかわる細胞としては、卵母細胞及び精母細胞等の生殖細胞、ならびに卵胞細胞、胸腺上皮細胞、及びセルトリ細胞等の栄養細胞がある。
本発明の単離されたＨＳ細胞は、直接またはＥＳ細胞、ＥＣ細胞、他の種類の多分化能性または幹細胞、および／またはテラトカルシノーマ細胞の分化に関して当該分野において既知であるものなどの定常的な実験及び公知の技術を用いて、卵原細胞、精原細胞若しくは原始生殖細胞（卵黄嚢の内胚葉由来）等の適当な前駆細胞を介して、生殖細胞に分化しうる。
Ｅ．実施例
実施例１ ホモ接合性幹細胞の形成、ならびに前駆細胞及び奇形腫内の３種の胚性胚葉の様々な組織へのこれらの分化
実施例１（ａ）：活性化さらには第二極体の放出の防止によるマウスの減数分裂Ｉ後の卵母細胞からのＨＳ細胞の誘導
７３個の卵母細胞を、下記方法を用いて過排卵によってハイブリッド(BDA2 F1: C57 black x DBA2, Charles River Laboratories, Wilmington, MA)、８週齢の、メスマウスから得た。３匹のハイブリッドマウスに、５ＩＵ／１００ｕｌの妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳ；PCCA, Houston, TX (29-1000-1BX)）、及び５ＩＵ／１００μｌのヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ；Sigma, St. Louis, MO, (C8554)）を約４８時間離して注射して投与した。
卵母細胞を、ＨＣＧを注射してから約１７時間後に集めて、新たに得られた卵母細胞を最終濃度０．３ｍｇ／ｍｌのＭ２培地（Ｍ７１６７，Sigma）に溶かした少量（約３００μｌ）のヒアルロニダーゼ（Ｈ４２７２，Sigma）中でインキュベートすることによって、卵丘細胞塊を除去した。次に、卵母細胞を、さらに処理する前にＨＥＰＥＳ緩衝化Ｍ２培地で３回洗浄した。
次に、卵母細胞を、室温で５分間、５μＭカルシウムイオノホア（Ｃ７５２２、Ｓｉｇｍａ：Ｃａ２＋ １ｍｇ／７６４．８ｕｌ；ＤＭＳＯ ２．５ｍＭ＝５００×（ストック）；最終濃度２ｕｌ Ｃａ２＋（５００Ｘ）／１ｍｌ Ｍ２＝５μＭ）溶液で処理することによって活性化した。次に、卵母細胞を、ＨＥＰＥＳ緩衝化Ｍ２培地で２回洗浄した。
Ｃａ＋＋活性化卵母細胞を、５％ ＣＯ２及び３７℃で３時間、６−ジメチルアミノプリン（６−ＤＭＡＰ（Ｄ２６２９，Ｓｉｇｍａ）：２５０ｍＭ＝５０ｘ（ストック）；最終濃度：２０μｌ／１ｍｌ Ｍ１６＝５ｍＭ）を含むＭ１６重炭酸塩緩衝化培養液（Ｍ７２９２， Ｓｉｇｍａ）中でインキュベートした。さらに、卵母細胞を、Ｍ１６培地で３回洗浄し、少なくとも４日間、鉱油下で少量のＭ１６培地中でインキュベートした。
Ｍ１６培地で４〜５日インキュベートした後、胚盤胞に似た細胞塊がＣａ＋＋活性化卵母細胞から得られた。これらの胚盤胞様塊を囲むシェルを外した（「孵化させた(hatching)」）後、幹細胞の形成のために、ＥＳ培地(DMEM: Gibco, Life Technologies, Rockville, MD (11995-065); 20% FBS: Gibco (16141-079))中で少なくとも１５日間、マイトマイシンＣで処理したマウスの胚のフィーダー細胞層に移した。
または、幹細胞を、免疫手術によって孵化させた胚盤胞様塊から誘導した。孵化させた胚盤胞様塊を、３７℃で１時間、抗マウスＴｈｙ−１ウサギ血清(1:10, ACL2001, Accurate Chemical, Westbury, NY)及び抗ヒトリンパ球ウサギ血清(1:10, CL8010, Accurate Chemical)と共にインキュベートした。細胞塊をＭ２培地で３回洗浄し、３７℃で３０分間、モルモット補体(1:10, ACL4051, Accurate Chemical)と共にインキュベートして、栄養膜細胞を溶解した。次に、補体で処理した細胞塊をＭ２培地中で３回洗浄し、少なくとも１５日間、幹細胞の形成を目的としてマイトマイシンＣで処理したマウスの胚のフィーダー細胞層に移した。
マウスの胚線維芽細胞フィーダー細胞は、Stemcell, Inc. (00308)から購入し、２〜３回継代した。コンフルエントに拡張したフィーダー細胞の６０ｍｍのディッシュ１枚を、３７℃で３時間、マイトマイシンＣ（最終濃度１０μｇ／ｍｌ、Sigma M4287）を含む５ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ ＦＢＳ培地で処理した。次に、処理されたフィーダー細胞を、５ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ ＦＢＳで３回洗浄し、３７℃で５分間の１ｍｌのトリプシン処理、５ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ ＦＢＳ培地による中和、及び１０００ｒｐｍで５分間の遠心によって集めた。得られたマイトマイシンで処理した細胞ペレットを、１５ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ ＦＢＳ培地に再懸濁し、３枚の６０ｍｍのディッシュ（５ｍｌの細胞懸濁液／ディッシュ）に播種し、さらに使用する前に一晩、３７℃でインキュベートした。
実施例１（ｂ）：活性化さらには第二極体の放出の防止によるヒト２倍体卵母細胞からの胚盤胞様細胞塊の発達
メス卵ドナーを、ロイルポライドアセテート(leurpolide acetate)(Lupron: TAP Pharmaceuticals, Deerfield, IL)でダウンレギュレーションした後、３００ＩＵ／日の投与量で卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）(Seromo Pharmaceutical)処理を行なって適当な多卵胞応答(multifollicular response)を誘導することによってＣＯＨ（制御卵巣過刺激(Controlled Ovarian hyper-stimulation)）を開始した。卵胞の成熟に関する超音波検査による基準を満たしたら、１０，０００ＩＵ量のｈＣＧを１回投与し、ｈＣＧを投与してから約３６時間後に経腟卵胞吸引を行なった。８０ＩＵ／ｍｌのヒアルロニダーゼに約３０秒間さらには１０％ヒト血清アルブミン(InVitroCare, Inc., San Diego, CA)を捕捉したＨＥＰＥＳ緩衝化ヒト卵管液に暴露することによって、回収された卵母細胞から卵丘細胞を除去した。
有糸分裂活性化を達成するために、卵丘細胞を含まない成熟Ｍ−ＩＩ卵母細胞を、３３℃で５分間、５μＭのカルシウムイオノホア(A23187, Sigma)処理した後、３７℃で３〜５時間、１〜５ｍＭの６−ジメチルアミノプリン(6-DMAP, Sigma)中でインキュベートした。活性化卵母細胞を、３日間、ＩＶＣ−１培地(InVitroCare, Inc.)中でインキュベートし、さらに細胞分裂及び胚盤胞形成を目的として、２日間、ＩＶＣ−３(InVitroCare, Inc.)中でインキュベートした。または、２日胚様細胞塊(day number 2 embryo like cell mass)を、ＳＴＯフィーダー細胞上に共培養してもよい。６日目に、他方の腕で透明帯を固定しながら、マイクロマニピュレーターの一方の腕を用いて、透明帯の全外表面の約１／８に酸性化タイロード溶液(acidified tyrodes solution)を適用することによって、マイクロマニピュレーター下で補助孵化を行なった。次に、胚盤胞を弱くなった透明帯から放出させた後、抗Ｔｈｙ１及び補体で処理して、栄養外胚葉の細胞を免疫手術により排除した。さらに、処理された胚盤胞を、非必須アミノ酸、ペン−ストレップ(pen-strep)(Life Technologies)、β−メルカプトエタノール(Sigma)、及びＬＩＦ(Chemicon)を捕捉したＤＭＥＭ培地において２０％のウシ胎児血清(Life technologies)を含む幹細胞培養液中でマイトマイシンで処理されたＳＴＯフィーダー細胞（ＡＴＣＣ）上で培養した。図８Ｄを参照。
実施例１（ｃ）：活性化さらには第二極体の及びゲノムの自己複製によるヒト減数分裂Ｉ後の２倍体卵母細胞からの胚盤胞様細胞塊の発達
メス卵ドナーを、ロイルポライドアセテート(leurpolide acetate)(Lupron: TAP Pharmaceuticals, Deerfield, IL)でダウンレギュレーションした後、３００ＩＵ／日の投与量で卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）(Seromo Pharmaceutical)処理を行なって適当な多卵胞応答(multifollicular response)を誘導することによってＣＯＨ（制御卵巣過刺激(Controlled Ovarian hyper-stimulation)）を開始した。卵胞の成熟に関する超音波検査による基準を満たしたら、１０，０００ＩＵ量のｈＣＧを１回投与し、ｈＣＧを投与してから約３６時間後に経腟卵胞吸引を行なった。８０ＩＵ／ｍｌのヒアルロニダーゼに約３０秒間さらには１０％ヒト血清アルブミン(InVitroCare, Inc., San Diego, CA)を捕捉したＨＥＰＥＳ緩衝化ヒト卵管液に暴露することによって、回収された卵母細胞から卵丘細胞を除去した。
有糸分裂活性化を達成するために、卵丘細胞を含まない成熟Ｍ−ＩＩ卵母細胞に、見かけのＩＣＳＩ（細胞質内精子注入(intracytoplasmic sperm injection)）を行ない、精子によって導入される活性化を模倣した後、３３℃で５分間、２５μＭのカルシウムイオノホア(A23187, Sigma)と共にインキュベートした。このようにして活性化された卵母細胞は、第二極体を放出し、２倍体になる。このような２倍体の卵母細胞を、ＩＶＣ−１培地(InVitroCare, Inc.)中で３日間、インキュベートし、さらに細胞分裂及び胚盤胞形成のためにＩＶＣ−３(InVitroCare)中で２日間、インキュベートした。または、２日胚様細胞塊(day number 2 embryo like cell mass)を、ＳＴＯフィーダー細胞上に共培養してもよい。６日目に、胚盤胞の透明帯の外に酸性化タイロードを適用することによって、マイクロマニピュレーター下で補助孵化を行なった。次に、胚盤胞を弱くなった透明帯から放出させた後、非必須アミノ酸、ペン−ストレップ(pen-strep)(Life Technologies)、β−メルカプトエタノール(Sigma)、及びＬＩＦ(Chemicon)を捕捉したＤＭＥＭ培地において２０％のウシ胎児血清(Life technologies)を含む幹細胞培養液中でマイトマイシンで処理されたＳＴＯフィーダー細胞（ＡＴＣＣ）上で培養した。
活性化から得られた２倍体卵母細胞は、細胞質分裂なしでゲノムの自己複製ができ、２倍体細胞を生じる(Taylor, A.S., et al., "The early development and DNA content of activated human oocytes and parthenogenetic human embryos," Hum. Reprod. 9(12):2389-97 (1994); Kaufman, M.H. et al., "Establishment of pluripotential cell lines from haploid mouse embryos," J. Embryol. Exp. Morphol. 73:249-61 (1983))。６日目に、胚盤胞の透明帯の外に酸性化タイロードを適用することによって、マイクロマニピュレーター下で補助孵化を行なった。次に、胚盤胞を弱くなった透明帯から放出させた後、非必須アミノ酸、ペン−ストレップ(pen-strep)(Life Technologies)、β−メルカプトエタノール(Sigma)、及びＬＩＦ(Chemicon)を捕捉したＤＭＥＭ培地において２０％のウシ胎児血清(Life technologies)を含む幹細胞培養液中でマイトマイシンで処理されたＳＴＯフィーダー細胞（ＡＴＣＣ）上で培養した。図８Ａ−Ｃを参照。
実施例１（ｄ）：マウスＨＳ細胞の成長、マウス腎臓被膜下でのこのようなＨＳ細胞の分化、およびこのような細胞の胚様体形成
実施例１（ａ）に記載されるのと同様の胚盤胞様塊から得られたＨＳ細胞を、１，４００Ｕ／ｍｌの白血病抑制因子（ＬＩＦ）(ESGROＴＭ)、ケミコンＥＳＧ１１０６(Chemicon ESG1106)１０６単位／ｍｌを含むＥＳ細胞培地でに０．１％ゼラチン被覆ディッシュ（１０ｃｍ）に播種した。［ＥＳ培地５００ｍｌ：コロニーを生育させるために実施例１（ｂ）に記載されるのと同様のマウスフィーダー細胞の層上に、ノック−ＤＭＥＭ(knock-DMEM)(Gibco 10829-018)４２５ｍｌ；ＦＣＳ（ＥＳ細胞用、Gibco 16141-061)７５ｍｌ；ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液(MEM non-essential AA solution)(Gibco 11140-050)５ｍｌ；ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン(Gibco 10378-016)５ｍｌ；２−メルカプトエタノール(Gibco 21985-023)０．５ｍｌから最終１００μＭ］。
ＨＳ細胞のコロニーを幾つかの片に解剖して、２６匹のハイブリッドマウスの２個の腎臓被膜の一方に内植して、ステムプラズムの形成を誘導した。次に、内植してから１、３、６、９．５、１０．５、１１、１２、及び１４週間でマウスを剖検することによって、ステムプラズムを集めた。各ステムプラズムの半分を形態学的な研究のためにホルマリンに固定し、他の半分を分子の特性化のために−８０℃で凍結した。ステムプラズムは、およそ３週間で目視できる大きさにまで形成し始めた。ステムプラズムの収集をずらすことによって、ステムプラズム内に発達する様々な組織型を研究した。ここで同定されたすべての組織型が、当該ステムプラズム内に生成した。ステムプラズムの遺伝子型を、前記段落で記載したＰＣＲを基礎とする対立遺伝子分析によって確認した。
胚様体（ＥＢ）を作製するために、６０ｍｍディッシュのＨＳ細胞を、始めにＰＢＳで２回洗浄した。次に、１ｍｌのトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を加え、細胞を３７℃の温度で５分間維持した。さらに、５ｍｌのＥＳ培地を添加して、細胞を細胞スクレーパーで持ち上げ、１０００ｒｐｍで５分間回転して沈殿させた。次に、このようにして得られた細胞ペレットを、ＬＩＦを含まないＥＳ培地５ｍｌ中に再懸濁し、細胞数を計測した。さらに、細胞を２×１０６／１０ｃｍディッシュで細菌培養用ディッシュ上に播種した。細胞を４日間ＥＳ培地で培養したが、この際、培地は、細胞を１５ｍｌ管に移し、細胞が管の底に沈殿するまで約５分間待った後、培地を交換することによって、２日毎に交換した。次に、細胞を凝集させて、ＥＢを形成し、さらに分化させるために元のディッシュに移した。
実施例１（ｅ）：奇形腫内のヒトＨＳ細胞の分化、およびこのような分化組織の遺伝的なホモ接合性
３１個の奇形腫を、Armed Forces Institute of Pathology, Washington, DC、及びDepartment of Pathology, New York University. New York, NY (Dr. J. Liu)のファイルから取得した。様々な異なる種類の排他的に分化した組織が、女性患者において２０個の卵巣腫瘍で見つかった。分化組織は、当該分野において既知の方法を用いて代表的な症例で行なわれたＦＩＳＨ分析、及び染色体３及び８に対するα−サテライトプローブによって確認されたところ２倍体であることが分かった。女性患者の７個の卵巣腫瘍及び男性患者の４個の睾丸腫瘍で見つかった未分化及び分化組織の３〜１２個の組織学的な領域を同定し、遺伝分析のために各症例から選択的に顕微解剖した。それぞれの場合において、分化組織は、遺伝学的にホモ接合性であることが分かり、また、未分化組織は、遺伝学的にヘテロ接合性であることが分かった。
顕微解剖 ガラススライド上の未染色の６ミクロンの切片をキシレンで脱パラフィンし、１００％から８０％のエタノールで洗浄して、ヘマトキシリン及びエオシンで簡単に染色して、ＴＥ緩衝液における１０％グリセロールで洗浄した。組織の顕微解剖を、光学顕微鏡で目視しながら行なった。それぞれの場合で、異なる組織分化の６〜１２領域を、別々に遺伝分析のために顕微解剖した。加えて、幾つかの正常な、非腫瘍組織領域を入手した。
ＤＮＡの抽出 入手した細胞を、Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ ８．０；１．０ｍＭ エチレンジアミン４酢酸、ｐＨ ８．０；１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、及び０．５ｍｇ／ｍｌ プロティナーゼＫを含む２５μｌの緩衝液に直ちに再懸濁して、３７℃で一晩インキュベートした。この混合物を５分間煮沸して、プロティナーゼＫを不活性化し、１．５μｌのこの溶液をＤＮＡのＰＣＲ増幅用に使用した。
遺伝分析 顕微解剖後に利用できる限定量のＤＮＡにおいてホモ接合性を信頼性高く同定するために、複数の異なる顕微解剖された組織サンプルを、ＤＩＳ１６４６及びＤ１Ｓ２４３（ｌｐ）、Ｄ３Ｓ２４５２（３ｐ）、Ｄ５Ｓ３４６（５ｑ）、Ｄ７Ｓ１８２２（７ｑ）、Ａｎｋ−１（８ｐ）、Ｄ９Ｓ１７１（９ｐ）、Ｄ９Ｓ３０３（９ｑ）、Ｉｎｔ−２及びＰＹＧＭ（１１ｑ）、ＩＦＮＡ（９ｐ）、Ｄ１７Ｓ２５０（１７ｑ）、ＣＹＰ２Ｄ（２２ｑ）、及びＡＲ（Ｘｑ）などの１４個以下の別個の非常に多形なミクロサテライトマーカー(highly polymorphic microsatellite marker)を用いて分析した。各ＰＣＲサンプルは、全容１０μｌにおける１．５μｌの上記した鋳型ＤＮＡ、各１０ｐｍｏｌのプライマー、各２０ｎｍｏｌのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ＤＧＴＰ、及びＤＴＴＰ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、０．０５ｍｌ ［３２Ｐ］ｄＣＴＰ（６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、及び１μｌの１０×緩衝液を含んでいだ。ＰＣＲを、３５サイクル行なった：９５℃で１分間の変性、１分間のアニーリング（マーカーによって５５〜６０℃のアニーリング温度）及び７２℃で６０秒間の拡張。最後の拡張は１０分間連続した。標識増幅ＤＮＡを、等容のホルムアルデヒドローディング染料（９５％ホルムアルデヒド、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノールブルー、及び０．０５％キシレンシアノール）と混合した。
サンプルを９５％で５分間変性し、６％アクリルアミド（アクリルアミド：ビスアクリルアミド ４９：１）から構成されるゲルにのせ、１８００Ｖで９０分間、電気泳動した。電気泳動後、ゲルを３ｍｍのワットマン紙に移して、乾燥した。オートラジオグラフィーを、Ｋｏｄａｋ Ｘ−ＯＭＡＴフィルム(Eastman Kodak, Rochester, NY)で行なってもよい。
結果 同じ対立遺伝子の一致したホモ接合性を示す分化奇形腫組織は、扁平上皮、グリア、及び軟骨（マーカーＡｎｋｌ（トップ）及びＤ１Ｓ１６４６（下部））の顕微解剖サンプルを含んでいた。正常な卵巣組織を、コントロールとして含ませた。
奇形腫のサブセットでは、一致しないホモ接合性対立遺伝子を有することが見出された（マーカーＩｎｔ−２、Ｄ９Ｓ３０３、Ｄ１Ｓ１６４６、Ｄ３Ｓ２４５２，及びＡｎｋｌで分析）分化奇形腫組織としては、表皮、皮脂腺、呼吸上皮、及びグリアがあった。正常な卵巣組織を、コントロールとして含ませた。このような腫瘍では、対立遺伝子のヘテロ接合性は、生殖細胞における減数分裂Ｉ前の腫瘍形成の開始から生じると考えられる。催奇性腫瘍細胞開始後は、さらにランダムな独立した事象により減数分裂後の遺伝子型を有する前駆細胞が形成する。
分化及び未分化組織双方を含む一連の卵巣奇形腫及び睾丸生殖細胞もまた分析した。各腫瘍において、未分化及び分化組織要素双方を入手した。ホモ接合性及びヘテロ接合性成分を、マーカーＤ３Ｓ２４５２、Ｄ３Ｓ３０３、ＣＹＰ２Ｄ、及びＤ１７Ｓ２５０を用いて検出した。正常な卵巣及び睾丸組織を、コントロールとして含ませた。ヘテロ接合性対立遺伝子を、未成熟な扁平上皮、神経組織（場合によっては同じ腫瘍内の別の神経組織領域由来）、軟骨、腺構造、及び間葉等の未分化組織要素で検出した。顕微解剖によって同じ腫瘍から単離した分化組織要素は、同じマーカーについてホモ接合性であることが分かった。試験された成熟要素は、下記のとおりであった：皮脂腺組織、毛嚢、及び成熟扁平上皮（場合によっては同じ腫瘍内の別の扁平上皮領域由来）。腫瘍によっては、分化要素は反対のホモ接合性対立遺伝子を示したことから、組換えが示されたあるいは様々な要素が別の減数分裂後細胞から別に生じたことが示唆された。
実施例１（ｆ） ヒトＨＳ細胞からの前駆細胞の誘導
１次分化
１次胚性線維芽細胞層を有する６０ｍｍディッシュ(Falcon, #353802)および／または０．１％ゼラチン被覆ディッシュで生育させたＨＳ細胞を、１．５ｍｌトリプシン／ＥＤＴＡ(Invitrogen, # 25300-050)でトリプシン処理し、１５ｍｌのコニカルチューブの１．５ｍｌのＥＳ−ＬＩＦ培地に移す。次に、細胞を１２００ｒｐｍで回転し、上清を除去する。細胞ペレットを２ｍｌのＥＳ−ＬＩＦ培地における単細胞懸濁液中に再懸濁し、１〜３×１０６細胞の密度で懸濁培養物−３５＊１０ｍｍディッシュ(NalgeNunc, # 171099)中で懸濁細胞として培養して、幹細胞から、４〜６日間で、胚様体（ＥＢ）として知られる、丸い球状のクラスターを形成させる。形成したＥＢを、ＥＢを１５ｍｌのコニカルチューブに移した後、底に沈殿させることによって、２日毎に洗浄した。上清を除去して、新たなＥＳ−ＬＩＦを添加する。次に、ＥＢを懸濁培養ディッシュに戻す。胚様体として生育させたＨＳ細胞は、すべての生殖細胞層、外胚葉、内胚葉、及び中胚葉から構成される。
外胚葉前駆体 ４〜６日後、ＥＢを１ｍｌのトリプシン／ＥＤＴＡでトリプシン処理し、４ｍｌのＥＳ−ＬＩＦ培地で洗浄して、１０％血清置換(Serum Replacement)(Invitrogen, #10828)、及びＧ５(Invitrogen, #17503)、Ｎ２(Invitrogen, #I7502-048)またはベータＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）(R&D Systems, #256-GF)を捕捉したＤＭＥＭ／ノックアウト培地(Invitrogen, #10829-018)における単細胞懸濁液に再懸濁する。培地を２〜３日おきに交換しながら、これらの細胞を、１０日間、フィブロネクチンで被覆した３５ｍｍのディッシュ（５０ｕｇ／ｍｌ）(Sigma, #F-0895)中で３〜５×１０５／３ｍｌで培養する。
または、ＥＢを、１〜２日間、ＥＳ−ＬＩＦ培地中で０．１％ゼラチンで被覆したディッシュで培養した後、培地を、６日間、インスリン（５ｕｇ／ｍｌ）、塩化セレン（．０１５ｎＭ）、トランスフェリン（５０ｕｇ／ｍｌ）、及びフィブロネクチン（５ｕｇ／ｍｌ）(Sigma)を捕捉した無血清培地に交換する。この細胞をトリプシン処理し、単細胞懸濁液をＮ２培地（Ｎ２(Invitrogen, # I7502-048)、Ｂ２７(Invitrogen, # I7504-44)、及びｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）(Invitrogen, #13256-029)を捕捉した無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２）で培養する。次に、細胞を計測し、ポリ−Ｌ−オルニチン（１５ｕｇ／ｍｌ）(Sigma, #P36550)で予め被覆された２４ウェルプレートで２〜５×１０４細胞／ウェル／４００ｕＬ Ｎ２培地の密度で播種し、６日間、拡張する。
さらに、これらの前駆体を、Ｇ５、ＲＡ、ＦＧＦ、ＮＧＦ、ＧＮＤＦ、またはＢＮＤＦを添加することによって異なるニューロン細胞型に分化させる。これらはまた、細胞拡張のために馴化培地中に維持する。
中胚葉前駆体 中胚葉前駆体では、上記したのと同様の１０％血清置換(Serum Replacement)及びベータ−ＮＧＦを捕捉したＤＭＥＭ／ノックアウト培地における単細胞懸濁液を、培地を２／３日ごとに交換しながら、１０日間培養する。この期間後、細胞をさらに、心臓前駆細胞を目的としてさらに１０日間、アクチビンＡ捕捉（２０ｎｇ／ｍｌ）(Sigma, #A4941)馴化培地で培養する。または、腎臓及びミュラー管前駆細胞を目的として、細胞を、４〜６日間、アクチビンＡ捕捉（２０ｎｇ／ｍｌ）(Sigma, #A4941)馴化培地で培養した後、２ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−ベータ(R&D Systems, #)を培地に添加して、細胞をさらに４〜６日間、培養する。
内胚葉前駆体 内胚葉前駆体では、ラミニン被覆（１０ｕｇ／ｍｌ）(Sigma, #L2020)、またはコラーゲンＩ被覆（１０ｕｇ／ｍｌ）(Sigma, #C-7661)にＧ５またはベータ−ＮＧＦに加えて、１０％血清置換(Serum Replacement)を捕捉したＤＭＥＭ／ノックアウト培地における単細胞懸濁液を、１０日間、培養する。ＨＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）および／またはＴＧＦ−アルファ（２ｎｇ／ｍｌ）を培地に添加して、Ｇ５またはベータ−ＮＧＦを置換して、細胞をさらに６〜８日間、培養する。
または、ＥＢを、コラーゲンＩ被覆ディッシュに播種して、４日間、ＥＳ−ＬＩＦ培地で培養する。ＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）を添加して、細胞をさらに３日間培養する。この期間後、ＨＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）および／またはＴＧＦ−アルファ（２ｎｇ／ｍｌ）を添加して、細胞をさらに６日間培養する。
また、ＥＢを、ラミニン被覆付着ディッシュ(adherent dish)（１０ｎｇ／ｍｌ）(Sigma, #L2020)または０．１％ゼラチン被覆３５＊１０ｍｍディッシュ付着ディッシュに移して、ＥＳ−ＬＩＦ培地で１〜２日間、培養する。培地を除去して、インスリン（５ｕｇ／ｍｌ）(Invitrogen, # I1882)、塩化セレン（０．０１５ｎＭ）(Sigma, #S5261)、トランスフェリン（５０ｕｇ／ｍｌ）(Sigma, #T-2036)、及びフィブロネクチン（５ｕｇ／ｍｌ）(Sigma)を捕捉した無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２(Invitrogen, # 11330-0321)培地。この培地をＩＴＳＦｎ培地と称する。細胞をＩＴＳＦｎ培地で６日間培養し、この際、培地は２日毎に交換する。
実施例１（ｇ）：移植ＨＳ細胞からのホモ接合性前駆細胞の発達および単離
ホモ接合性前駆細胞を得るために、前記説明及び実施例で前記で開示された方法由来の多分化能性ＨＳ細胞を、腎臓被膜下で免疫−妥協した(immuno-compromised)マウスに移植して、Ｎ２培地（Ｎ２(Invitrogen, # I7502-048)、Ｂ２７(Invitrogen, # I7504-44)、及びｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）(Invitrogen, #13256-029)を捕捉した無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２）で培養する。次に、細胞を計測し、ポリ−Ｌ−オルニチン（１５ｕｇ／ｍｌ）(Sigma, #P36550)で予め被覆された２４ウェルプレートで２〜５×１０４細胞／ウェル／４００ｕＬ Ｎ２培地の密度で播種し、６日間、拡張する。
さらに、これらの前駆体を、Ｇ５、ＲＡ、ＦＧＦ、ＮＧＦ、ＧＮＤＦ、またはＢＮＤＦを添加することによって異なるニューロン細胞型に分化させる。これらはまた、細胞拡張のために馴化培地中に維持する。
中胚葉前駆体 中胚葉前駆体では、上記したのと同様の１０％血清置換(Serum Replacement)及びベータ−ＮＧＦを捕捉したＤＭＥＭ／ノックアウト培地における単細胞懸濁液を、培地を２／３日ごとに交換しながら、１０日間培養する。この期間後、細胞をさらに、心臓前駆細胞を目的としてさらに１０日間、アクチビンＡ捕捉（２０ｎｇ／ｍｌ）(Sigma, #A4941)馴化培地で培養する。または、腎臓及びミュラー管前駆細胞を目的として、細胞を、４〜６日間、アクチビンＡ捕捉（２０ｎｇ／ｍｌ）(Sigma, #A4941)馴化培地で培養した後、２ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−ベータ(R&D Systems, #)を培地に添加して、細胞をさらに４〜６日間、培養する。
内胚葉前駆体 内胚葉前駆体では、ラミニン被覆（１０ｕｇ／ｍｌ）(Sigma, #L2020)、またはコラーゲンＩ被覆（１０ｕｇ／ｍｌ）(Sigma, #C-7661)にＧ５またはベータ−ＮＧＦに加えて、１０％血清置換(Serum Replacement)を捕捉したＤＭＥＭ／ノックアウト培地における単細胞懸濁液を、１０日間、培養する。ＨＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）および／またはＴＧＦ−アルファ（２ｎｇ／ｍｌ）を培地に添加して、Ｇ５またはベータ−ＮＧＦを置換して、細胞をさらに６〜８日間、培養する。
または、ＥＢを、コラーゲンＩ被覆ディッシュに播種して、４日間、ＥＳ−ＬＩＦ培地で培養する。ＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）を添加して、細胞をさらに３日間培養する。この期間後、ＨＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）および／またはＴＧＦ−アルファ（２ｎｇ／ｍｌ）を添加して、細胞をさらに６日間培養する。
また、ＥＢを、ラミニン被覆付着ディッシュ(adherent dish)（１０ｎｇ／ｍｌ）(Sigma, #L2020)または０．１％ゼラチン被覆３５＊１０ｍｍディッシュ付着ディッシュに移して、ＥＳ−ＬＩＦ培地で１〜２日間、培養する。培地を除去して、インスリン（５ｕｇ／ｍｌ）(Invitrogen, # I1882)、塩化セレン（０．０１５ｎＭ）(Sigma, #S5261)、トランスフェリン（５０ｕｇ／ｍｌ）(Sigma, #T-2036)、及びフィブロネクチン（５ｕｇ／ｍｌ）(Sigma)を捕捉した無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２(Invitrogen, # 11330-0321)培地。この培地をＩＴＳＦｎ培地と称する。細胞をＩＴＳＦｎ培地で６日間培養し、この際、培地は２日毎に交換する。
実施例１（ｇ）：移植ＨＳ細胞からのホモ接合性前駆細胞の発達および単離
ホモ接合性前駆細胞を得るために、前記説明及び実施例で前記で開示された方法由来の多分化能性ＨＳ細胞を、腎臓被膜下で免疫−妥協した(immuno-compromised)マウスに移植して、４〜６週間インビボで生育させた。次に、得られた細胞塊を単細胞に細かく切り刻み、さらなる繁殖及び細胞系への発達を目的としてフィーダー細胞上で培養する。
系列拘束（前駆細胞の型）を評価するために、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、免疫組織化学等の、遺伝子発現アッセイを、既知の系列に特異的なマーカー、例えば、外胚葉に関してはＮＦ−Ｈ、ケラチン、Ｄ−ベータ−Ｈ、中胚葉に関してはエノラーゼ、ＣＭＰ、レニン、カリクレイン、ＷＴ１、デルタ−グロビン、ベータ−グロビン、および内外胚葉前駆体系列に関してはアルブミン、アルファ−１−ＡＴ、アミラーゼ、ＰＤＸ−１、インスリン、アルファ−ＦＰについて行なった。
実施例２ 中胚葉胚層由来の細胞へのマウスＨＳ細胞の分化
実施例２（ａ）：造血細胞への分化
マウスＨＳ細胞を、３〜５日間、ＬＩＦ（１０００ＩＵ／ｍｌ）を含むＥＳ培地（ＤＭＥＭ Gibco 1195-065；ＦＢＳ Gibco 16141-079、１００μＭ 非必須アミノ酸 Gibco 11140-050；５０単位／ｍｌ ペニシリン−ストレプトマイシン Gibco 15070-063；１００μＭ β−メルカプトエタノール Gibco 21985-023）で培養した。次に、細胞を、３７℃で５分間、トリプシン／ＥＤＴＡ（Gibco 25300-054、１ｍｌ／６０ｍｍディッシュ）でトリプシン処理し、５ｍｌのＥＳ培地を添加した。次に、マウス幹細胞を、細胞スクレーパーによってディッシュから持ち上げ、細胞懸濁液を１０００ｒｐｍで５分間、回転した。得られた細胞ペレットを、３７℃及び５％ＣＯ２で４日間、２×１０６／１０ｃｍディッシュの細胞濃度で、ＬＩＦを含まず４．５×１０−４Ｍ ＭＴＧ（モノチオグリセラール(monothioglyceral)、Sigma M6145）を含むＥＳ培地に再懸濁した。さらに、マウスＨＳ細胞を懸濁液中で凝集させて、胚様体（ＥＢ）を形成した。
形成した３０〜４０個のＥＢを、ウシ胎児血清、ウシ血清アルブミン、ウシ膵臓インスリン、ヒトトランスフェリン（鉄飽和）、β−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミン、ｒｍ ＩＬ−３、ｒｈ ＩＬ−６、ｒｍ ＳＣＦ及びｒｈ−エリスロポイエチンを含む、３ｍｌのメチルセルロースを基礎とした造血細胞分化培地Ｍ３４３４(Stemcell 03434)の入った３５ｍｍディッシュに移し、３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートした。１０日間インキュベートした後、幾つかのコロニー及び異なる型の細胞をピペットチップで選び、５００μｌのＩＭＤＭ培地(Sigma I3390)中に再懸濁した。次に、この混合物を、４ウェルのチャンバー−スライド(chamber-slide)に移し、コロニー及び細胞を、３７℃で少なくとも３時間、チャンバー−スライドをインキュベートすることによって、スライドに付着させた。細胞をスライドに付着させた後、ＩＭＤＭ培地を捨て、細胞をメタノール中に７分間固定した。スライドをメタノール固定化後風乾し、室温で３０分間、１：２０の希釈ギームザ染色液(Sigma GS-500)で染色した後、３回水浄した。コロニー及び異なる型の造血細胞の観察を、培養して１０日後に開始した。ＣＦＵ（コロニー形成単位）に関しては図５Ａを、赤血球に関しては図５Ｂを、単球に関しては図５Ｃを、及び上記したプロトコールを用いて得られたリンパ球に関しては図５Ｄを参照。
また、Ｍ３４３４中で１０〜１５日間生育させたＥＢを、ＩＭＤＭ、１０％ ＦＢＳ及びＩＬ−３(Stemcell 02733)単独またはＩＬ−３及びＧＭ−ＣＳＦ(Stemcell 02732)の組み合わせのいずれかを含む３５ｍｍのディッシュに移した。細胞を固定し、上記と同様にして染色し、ＥＢからの細胞分化の観察をサイトカインを含む液体ＩＭＤＭ中で５日以内に開始した。ＩＬ−３を含むＩＭＤＭから分化した細胞は、顆粒を含むが単球は含まず、また、ＩＬ−３及びＧＭ−ＣＳＦを含むＩＭＤＭからの細胞は、顆粒及び幾つかの単球を含んだ（図５Ｅ及び５Ｆを参照）。
実施例２（ｂ）：自発的に収縮する筋細胞への分化
マウスのＨＳ細胞を、３〜５日間、ＬＩＦ（１０００ＩＵ／ｍｌ）を含むＥＳ培地（ＤＭＥＭ Gibco 1195-065；ＦＢＳ Gibco 16141-079、１００μＭ 非必須アミノ酸 Gibco 11140-050；５０単位／ｍｌ ペニシリン−ストレプトマイシン Gibco 15070-063；１００μＭ β−メルカプトエタノール Gibco 21985-023）で培養した。次に、細胞を、３７℃で５分間、トリプシン／ＥＤＴＡ（Gibco 25300-054、１ｍｌ／６０ｍｍディッシュ）でトリプシン処理し、５ｍｌのＥＳ培地を添加した。次に、マウスの幹細胞を、細胞スクレーパーによってディッシュから持ち上げ、細胞懸濁液を１０００ｒｐｍで５分間、回転した。得られた細胞ペレットを、３７℃及び５％ＣＯ２で４日間、２×１０６／１０ｃｍディッシュの細胞濃度で、ＬＩＦを含まないＥＳ培地に再懸濁した。さらに、マウスのＨＳ細胞を懸濁液中で凝集させて、胚様体（ＥＢ）を形成した。
形成した１０〜１５個のＥＢを、ゼラチンで被覆した（１ｍｌの０．１％ゼラチンを各ウェルに添加して、２時間以上、フードの中に放置した。次に、ゼラチンを除去して、プレートを３０分間乾燥した。）２４ウェルのプレートに移し、２日毎に交換したＬＩＦを含まないＥＳ培地中でインキュベートした。４日目あたりに、自発的に収縮する細胞または脈拍する(beating)ＥＢが出現し、３〜４日間、脈拍し続けた。（図６参照）。
加えて、脈拍するＥＢを、３７℃及び５％ＣＯ２で、ウシ胎児血清、ウシ血清アルブミン、ウシ膵臓インスリン、ヒトトランスフェリン（鉄飽和）、β−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミン、ｒｍ ＩＬ−３、ｒｈ ＩＬ−６、ｒｍ ＳＣＦ及びｒｈ−エリスロポイエチンを含む、Ｍ３４３４(Stemcell 03434)と称する半固体培地（１％メチルセルロースを含む）中で上記したのと同様にして得られたＥＢをインキュベートすることによって、誘導した。脈博するＥＢは、インキュベートしてから３〜４日後に観察された。
脈博するＥＢはまた、３７℃及び５％ＣＯ２で、上記したＥＢを４日間インキュベートした後に、インスリン（５μｇ／ｍｌ、Sigma I1882）、塩化セレン（３０ｎＭ、Sigma S5261）及びフィブロネクチン（５μｇ／ｍｌ、Sigma F1141）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２(Gibco 11320-033)を含む、無血清ＩＴＳＦｎ培地中でも形成された。
実施例３ 内胚葉の胚層由来の細胞へのマウスＨＳ細胞の分化
実施例３（ａ）：膵臓細胞への分化
１次胚性線維芽細胞層を有する６０ｍｍディッシュ(Falcon, #353802)および／または０．１％ゼラチン被覆ディッシュで生育させたＨＳ細胞を、１．５ｍｌトリプシン／ＥＤＴＡ(Invitrogen, # 25300-050)でトリプシン処理し、１５ｍｌのコニカルチューブの１．５ｍｌのＥＳ−ＬＩＦ培地に移した。次に、細胞を１０００ｒｐｍで回転・沈殿させて、上清を除去した。
得られた細胞ペレットを、２ｍｌのＥＳ−ＬＩＦ培地における単細胞懸濁液中に再懸濁し、懸濁培養物−３５＊１０ｍｍディッシュ(NalgeNunc, # 171099)中で懸濁細胞として培養して、幹細胞から、４〜６日間で、胚様体（ＥＢ）として知られる、丸い球状のクラスターを形成させた。形成したＥＢを、ＥＢを１５ｍｌのコニカルチューブに移すことによって２日毎に洗浄した。ＥＢを、底に沈殿させて、上清を除去した。さらに、新たなＥＳ−ＬＩＦを添加し、ＥＢを懸濁培養ディッシュに戻す。胚様体として生育させたＨＳ細胞は、すべての生殖細胞層、外胚葉、内胚葉、及び中胚葉から構成される。
膵臓の前駆細胞の選択 胚様体として４〜６日培養した後、細胞を１５ｍｌのコニカルチューブに移して、沈殿させた。培地の半分を除去し、１．５ｍｌの新鮮なＥＳ−ＬＩＦをチューブに添加した後、一晩培養するためにチューブの全内容物を０．１％ゼラチン被覆３５＊１０ｍｍ付着ディッシュに移した。ＥＳ−ＬＩＦ培地を翌日除去して、インスリン（５ｕｇ／ｍｌ）(Invitrogen, # I1882)、塩化セレン（０．０１５ｎＭ）(Sigma, #S5261)、トランスフェリン（５０ｕｇ／ｍｌ）(Sigma, #T-2036)、及びフィブロネクチン（５ｕｇ／ｍｌ）(Sigma, #F-0895)を捕捉した無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２(Invitrogen, # 11330-0321)培地。この培地をＩＴＳＦｎ培地と称する。細胞をＩＴＳＦｎ培地で６日間培養し、この際、培地は２日毎に交換する。
また、ＥＢを、２〜４日間、ＥＳ−ＬＩＦ培地中でラミニン被覆付着ディッシュ（１０ｎｇ／ｍｌ）(Sigma, #L2020)で培養して、内胚葉細胞を胚様体から移動させ、４日間、Ｎ２(Invitrogen, # I7502-048)、Ｂ２７(Invitrogen cat# I7504-44)、及びｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）(Invitrogen, #13256-029)を捕捉した８．７ｍＭグルコースＤＭＥＭ／Ｆ１２無血清培地で拡張した。内胚葉拡張後、培地をＩＴＳＦｎ培地に交換し、２日毎に培地を交換しながら６日間生育させて、膵臓前駆細胞を選択した。
または、４〜６日後、ＥＢを、１ｍｌのトリプシン／ＥＤＴＡでトリプシン処理し、ＥＳ−ＬＩＦ培地中で洗浄し、さらに１０％血清置換(Serum Replacement)(Invitrogen, #10828)、及びＧ５(Invitrogen, #17503)、またはベータＮＧＦ(R&D Systems, #256-GF)を捕捉したＤＭＥＭ／ノックアウト培地(Invitrogen, #10829-018)における単細胞懸濁液に再懸濁した。培地を２日おきに交換しながら、これらの細胞を、４〜６日間、フィブロネクチンで被覆した３５ｍｍのディッシュ（１０ｕｇ／ｍｌ）中で３〜５×１０５／３ｍｌで培養した。４〜６日後、ＩＴＳＦｎ培地を添加して、ＤＭＥＭ／ノックアウト培地と交換し、細胞を、膵臓前駆細胞を選択するために、さらに６日間培養した。
膵臓前駆細胞は、初期マーカー、ネスチン、ニューロゲニン３(neurogenin 3)、及びチロシンヒドロキシラーゼに対して陽性である。
ｂＦＧＦによる膵臓前駆細胞の拡張 ＩＴＳＦｎ培地に維持された細胞を、培地を除去した後、ＰＢＳで２回洗浄した。１ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡを添加し、細胞を、３７℃で５分間インキュベートして、解離させた。付着細胞を、細胞スクレーパーを用いることによってさらに解離させた。次に、３ｍｌのＥＳ−ＬＩＦ培地をディッシュに加え、その完全な内容物を１５ｍｌのコニカルチューブに移した。膵臓前駆体選択から残ったＥＢを、約２〜５分間、沈殿させて、上清を新たな１５ｍｌのコニカルチューブに移し、１２００ｒｐｍで回転した。上清を捨て、細胞ペレットを、Ｎ２(Invitrogen、# I7502-048)、Ｂ２７(Invitrogen、# I7504-44)、及びｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）(Invitrogen、#13256-029)を捕捉した、５．８ｍＭ以下のグルコースの、無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中に再懸濁した。このような培地は、Ｎ２培地と称される。
細胞を計測し、ポリ−Ｌ−オルニチン（１５ｕｇ／ｍｌ）(Sigma, #P36550)で予め被覆された２４ウェルプレートで２〜５×１０５細胞／ウェル／４００ｕＬ Ｎ２培地の密度で播種し、６〜８日間、拡張した。または、細胞を、２〜５×１０４細胞／ウェル／４００ｕＬ Ｎ２培地の密度で播種し、８〜１０日間、拡張した。
予備被覆プロトコルは下記のとおりであった：４００ｕｌの１５ｕｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−オルニチンを、２４ウェルプレートの各ウェルに添加して、室温で一晩放置した；次に、プレートをＰＢＳで２回洗浄し、新鮮なＰＢＳを添加して、プレートを３７℃で３０分間、インキュベートした；プレートをＰＢＳで洗浄し、さらに４００ｕｌのフィブロネクチン（１０ｕｇ／ｍｌ）を添加した後、プレートを、使用する前に、室温で少なくとも２時間、インキュベートした。
インスリン分泌β−島細胞への膵臓前駆体の分化
膵臓前駆体を、Ｎ２培地からｂＦＧＦを抜くことによって、ならびに１００ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ(Invitrogen, #53003-018)、２０ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦ(Sigma, # H1404)、及び２０ｎｇ／ｍｌ アクチビンＡ(Sigma,#A4941)または２０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ(R&D Systems,#298-VS)の存在下で、インスリン分泌β−島細胞に分化するように誘導した。細胞を、培地を２日毎に交換しながら、６日間分化させた。分化すると、上皮膵臓細胞は、小さな丸い細胞を生じ、これは迅速に増殖して、器質化した細胞クラスターを形成し、平滑な球状物に見えた。図７Ａを参照。
インスリン分泌β−島細胞の検出 インスリンの生産及び分泌を検出するために、分化培地を除去して、１０ｍＭ ニコチンアミド、０．０１５ｎＭ 塩化セレン、５０ｕｇ／ｍｌ トランスフェリン、０．１ｍＭ プトレシン(Sigma, #P5780)、及び２０ｎＭ プロゲステロン(Sigma, #P8783)を捕捉した高グルコースＤＭＥＭ／Ｆ１２に置換した。次に、これらの細胞を３７℃で３時間培養した。３時間後、各ウェルの培地を集めて、インスリン放出アッセイ用に−７０℃に貯蔵し、各ウェルの細胞を、免疫細胞化学用に室温で３０分間４％パラホルムアルデヒド(EMS, #15712)中で固定した、または各ウェルのＲＮＡを、遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析用に、ＲＮＡｚｏｌ(Tel-Test, Inc., Friendswood, TX, #CS-105)によって集める。実験によっては、膵臓−球状クラスター(pancreatic-spheroid cluster)のインスリン含量を、４℃で一晩酸−エタノールで抽出することによって、免疫細胞化学またはＲＴ−ＰＣＲの代わりに、測定する。細胞を含まない抽出物を集めて、０．４Ｍ Ｔｒｉｓ−塩基で中和し、インスリン含量アッセイ用に−７０℃で貯蔵する。
免疫細胞化学 室温で３０分間４％パラホルムアルデヒド中で固定した後、細胞をＰＢＳ(Biofluids, #P312-500)で３回洗浄した。これらの細胞をさらに固定し、室温で５分間、１００％メタノール(Fischer Scientific, #HC400-1gal)中で浸透させた。次に、細胞をＰＢＳ中で３回以上洗浄し、遮断溶液(DAKO Envision double stain system, #K1395)中で５分間遮断した。過剰の遮断溶液を軽くたたいて落として、１次抗体を適用した後、細胞を室温で２時間インキュベートした。インスリンに関しては、使用される１次抗体は、１：５０希釈のポリクローナルモルモット抗インスリン(DAKO, #A0564)であった。希釈は、培地Ｂ(Caltag, #GAS002)でなされた。
次に、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＨＲＰ−接合２次抗体、ボトル２(Bottle 2)(DAKO, #K1395)を適用した後、３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、過剰の液体を吸収し、液体ＤＡＢ＋クロモゲン基質、ボトル３(Bottle 3)を５〜１０分間、添加した。最後に、細胞をＰＢＳで再度洗浄し、顕微鏡下で試験した、図７Ｂを参照。
グルカゴン、１：３００(DAKO, # A0565)に関する２重染色を、DAKO Envision２重染色プロトコルに従って行なった、図７Ｂを参照。Ｐａｘ６， １：３００(Covance, #PRB-278P)、及び他の細胞型に印をつけるための抗体もまた使用する。または、すべての免疫染色を、蛍光色素−接合２次抗体(Sigma, Molecular Probes, or Jackson Labs)を用いて行ない、ライカ倒立蛍光顕微鏡下で目視した。
インスリン放出及び細胞含量検出アッセイ インスリンタンパク質分泌または膵臓球状クラスターのインスリン含量を測定するために、各ウェルから集められた培地またはエタノール抽出物を、酵素様免疫吸着法、ＥＬＩＳＡ(Crystalchem, Chicago, Illinois)に適用する。
実施例３（ｂ）：肝細胞へのＨＳ細胞の分化
ＨＳ細胞の肝細胞分化に関する下記プロトコルは、Hamazaki et al,, "Hepatic maturation in differentiating embryonic stem cells in vitro", FEBS Lett. 497(1):15-9 (2001)に基づくものである。
ホモ接合性幹細胞を、非必須アミノ酸、ペン−ストレップ(pen-strep)(Life Technologies)、β−メルカプトエタノール(Sigma)、及びＬＩＦ(Chemicon)を捕捉したＤＭＥＭ培地において２０％のウシ胎児血清(Life technologies)を含む幹細胞培養液中で組織細胞ディッシュ（FALCON 35-3802、６０×１５ｍｍスタイル、ポリスチレン、発熱性物質なし、Becton Dickinson Labware）でマイトマイシンで処理したマウス胚性線維芽細胞（ＳＴＯ細胞）上に播種する。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養する。次に、ＨＳ細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡ（０．０５％〜０．５％）(Life Technologies)でトリプシン処理し、５日間、ＬＩＦを含まない同様の培地で胚様体形成を目的として懸濁ディッシュ（蓋及びベントを有する懸濁ディッシュ(Suspension Dish)、Nalge Nunc International, 171099、３５×１０ｍｍ）で培養する。さらに、形成した胚様体を、１００ｎｇ／ｍｌの酸性線維芽細胞成長因子(Sigma, F-3133)を含むＬＩＦを含まない幹細胞培地中で０．１％コラーゲンタイプＩ(Sigma, C-7661)で被覆された２４ウェルプレート（Corning Incocrporated/Costar 3524、蓋／発熱性物質なしのポリスチレンを有する２４ウェル細胞培養クラスター／平底(24 well cell culture Cluster/Flatbottom with Lid/ non-pyrogenic polystyrene)）に移して、３日間培養する。
３日後、培地を、６日間、２０ｎｇ／ｍｌの肝細胞成長因子(hepatic growth factor)(Sigma、H-1404)を含むＬＩＦを含まない幹細胞培地と交換し、さらに１０ｎｇ／ｍｌ ＯＳＭ(Sigma、O-9635)、１０μＭ デキサメタゾン(Sigma、D-6645)、５μｇ／ｍｌ 亜セレン酸(Aldrich、22985-7)、５０μｇ／ｍｌ インスリン(Invitrogen、I-1882)、及び５０μｇ／ｍｌ トランスフェリン(Sigma、T-2036)を含むＬＩＦを含まない幹細胞培地中で培養する。次に、分化細胞について、肝臓に特異的な遺伝子の発現を分析する。分析される遺伝子、ＰＣＲでのアニーリング温度、予想される産物の大きさ、及びＲＴ−ＰＣＲにおけるプライマー配列は、下記のとおりである：トランスチレチン(transthyretin)（ＴＴＲ） ５５℃、２２５ｂｐ、５−ＣＴＣ ＡＣＣ ＡＣＡ ＧＡＴ ＧＡＧ ＡＡＧ、５−ＧＧＣ ＴＧＡ ＧＴＣ ＴＣＴ ＣＡＡ ＴＴＣ；(−フェトプロテイン（ＡＦＰ） ５５℃、１７３ｂｐ、５−ＴＣＧ ＴＡＴ ＴＣＣ ＡＡＣ ＡＧＧ ＡＧＧ、５−ＡＧＧ ＣＴＴ ＴＴＧ ＣＴＴ ＣＡＣ ＣＡＧ；(−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）、５５℃、４８４ｂｐ、５−ＡＡＴ ＧＧＡ ＡＧＡ ＡＧＣ ＣＡＴ ＴＣＧ ＡＴ、５−ＡＡＧ ＡＣＴ ＧＴＡ ＧＣＴ ＧＣＴ ＧＣＡ ＧＣ；アルブミン（ＡＬＢ）、５５℃、２６０ｂｐ、５−ＧＣＴ ＡＣＧ ＧＣＡ ＣＡＧ ＴＧＣ ＴＴＧ、５−ＣＡＧ ＧＡＴ ＴＧＣ ＡＧＡ ＣＡＧ ＡＴＡ ＧＴＣ；グルコース−６−ホスファターゼ(glucose-6-phophatase)（Ｇ６Ｐ）、５５℃、２１０ｂｐ、５−ＣＡＧ ＧＡＣ ＴＧＧ ＴＴＣ ＡＴＣ ＣＴＴ、５−ＧＴＴ ＧＣＴ ＧＴＡ ＧＴＡ ＧＴＣ ＧＧＴ；チロシンアミノトランスフェラーゼ（ＴＡＴ）、５０℃、２０６ｂｐ、５−ＡＣＣ ＴＴＣ ＡＡＴ ＣＣＣ ＡＴＣ ＣＧＡ、５−ＴＣＣ ＣＧＡ ＣＴＧ ＧＡＴ ＡＧＧ ＧＴＡ Ｇ；β−アクチン、５５℃、２００ｂｐ、５−ＴＴＣ ＣＴＴ ＣＴＴ ＧＧＧ ＴＡＴ ＧＧＡ ＡＴ、５−ＧＡＧ ＣＡＡ ＴＧＡ ＴＣＴ ＴＧＡ ＴＣＴ ＴＣ；及びＳＥＫ１、５０℃、３００ｂｐ、５−ＴＧＴ ＡＴＧ ＧＡＧ ＣＴＣ ＡＴＧ ＴＣＴ ＡＣＣ；５−ＧＴＣ ＴＡＴ ＴＣＴ ＴＴＣ ＡＧＧ ＴＧＣ ＣＡ。
実施例４ 外胚葉の胚層由来の細胞へのマウスＨＳ細胞の分化
実施例４（ａ）：ニューロン前駆細胞及び機能性減数分裂後神経細胞への分化
一実施態様においては、ＨＳ細胞を、ニューロン前駆細胞を形成するように、誘導した。ＨＳ細胞由来の神経上皮前駆細胞を、ニューロン及びグリア双方に分化させ、さらに分化させることによって、広範なニューロンに特異的な遺伝子を発現させ、興奮性及び抑制性シナプス連結双方を形成させる。ＥＳ細胞に見られる位置特異的な神経マーカーの発現パターンから、様々な中枢神経系（ＣＮＳ）のニューロン細胞型の存在が示される。相似によって、ＨＳ細胞は多様なＣＮＳ構造を有する機能性減数分裂後ニューロンに効率よく分化できるニューロン前駆細胞をも生じると考えられる。
Okabe et al.の方法を用いて、ＨＳ細胞の様々なニューロン細胞及びニューロンへの分化を誘発した(Okabe et al., Mech. Dev. 59: 89-102 (1996))。
材料 材料は、下記源から購入した：フィブロネクチン、ラミニン、神経基本培地、Ｂ２７サプルメント、及びスーパースクリプトＩＩＲＮａｓｅ Ｈ−逆転写酵素(superscript II RNase H-reverse transcriptase)は、Gibco/BRL (Grand Island, NY)から；ｂＦＧＦは、R&D Systems (Minneapolis, MN)から；インスリン、トランスフェリン、塩化セレン、ポリオルニチン、プロゲステロン、プトレシン、Ｔ３、シトシンアラビノシド、抗ＭＡＰ２抗体、抗ＮＦ−Ｍ抗体、抗ＧＡＢＡ抗体、及び抗グルタメート抗体は、Sigma (St. Louis, MO)から；Ｔａｑポリメラーゼは、Bushranger-Mannheim (Mannheim, Germany)から；抗ＧＦＡＰ抗体は、ICN Biomedicals (Costa Mesa, CA)から；抗ケラチン８抗体は、American Type Culture Collection (Rockville, MD)から；Vectastain ABC kitは、Vector laboratories (Burlingame, CA)から；２重染色キット(double staining kit)及びアミノ−エチルカルバゾール(amino-ethyl carbazole)は、Zymed Laboratories Inc. (Carlton Court, CA)から；抗リン酸化ＣＲＥＢ抗体は、Upstate Biotechnology Inc. (Lake Placid, NY)から；ＢｒｄＵ染色キット(BrdU staining kit)は、Amersham (Arlington Heights; IL)から；蛍光２次抗体は、Cappe1 (Durham, NC)から。
ネスチン陽性細胞の分泌 ４日間、ＥＳ培地懸濁培養物（培養成分に関しては前の実施例を参照）中に保持されるＨＳ細胞塊（またはＥＢ）を、１５ｍｌのチューブに移した。ＥＢを沈殿させた後、ＥＳ培養物の半分を除去し、２．５ｍｌの新鮮なＥＳ培地を元の培養ディッシュに添加した。次に、ディッシュをＥＳ培地で洗浄して、同じ１５ｍｌのチューブに添加した。さらに、ＥＢを新たな組織培養ディッシュに移した。ＥＳ培地を２４時間後に交換し、フィブロネクチン（ＦＮ）を含むＩＴＳ培地、（ＥＳ細胞限定水(ES cell-qualified water)を５ｍｇのＦＮ（１ｍｇ／ｍｌ）上に注意深く積層し、４℃で３０分間放置することによって作製された２５ｕｌのストック／５ｍｌの培地）を添加した。（５００ｍｌ ＩＴＳ培地：ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）(Gibco 12500-039)６ｇ；０．５ｍｌ滅菌Ｈ２Ｏ及び５ｍｃｌの１０Ｎ ＮａＯＨに溶解したインスリン(Intergen 4501-01)２．５ｍｇ；３０ｍｃｌの塩化セレン（０．５ｍＭ）；０．７７５ｇのグルコース；０．０３６５ｇのグルタミン；１．２ｇ ＮａＨＣＯ３；及びトランスフェリン(Sigma T-2036)２５ｍｇ；ｐＨ ７．５；５ｍｌ １００×Ｐ／Ｓ）。
次に、細胞をＦＮを含むＩＴＳ培地中で６〜１０日間培養したが、この際、培地は２日毎に交換した；図９Ａから、培養してから６日後にネスチン陽性細胞が示される。
ｂＦＧＦによるネスチン陽性細胞の拡張 ＩＴＳ／ＦＮ培地に維持された細胞をＰＢＳで２回洗浄した。次に、１ｍｌのトリプシン／ＥＤＴＡ溶液（０．０５％ トリプシン／０．０４％ ＥＤＴＡ）を培地に加えて、細胞を３７℃で５分間、維持して、細胞の解離を行なった。さらに、５ｍｌのＥＳ培地（前記実施例に記載）を加えて、細胞を１５ｍｌのチューブに移した。
ＥＢをまず沈殿させた後、遠心によって集めた。細胞ペレットを、Ｂ２７培地サプルメント(media supplement)（Ｂ２７無血清サプルメント５０Ｘ、液体、Gibco 17504-44）を含む５ｍｌのＮ２培地に再懸濁した。（Ｎ２培地 ５００ｍｌ：ｆ１２／ＤＭＥＭ ６ｇ；グルコース０．７７５ｇ；グルタミン０．０３６５ｇ；ＮａＨＣＯ３ ０．８４５ｇ；インスリン０．０１２５ｇ；１Ｍ プトレシン（ストック）５０ｕｌ（最終 １００ｕＭ）；０．５ｍＭ 亜セレン酸塩（ストック）３０ｍｃｌ（最終 ３０ｎＭ）；０．１ｍＭ プロゲステロン（ストック）１００ｍｃｌ（最終 ２０ｎＭ）；調節 ｐＨ ７．２；５ｍｌ １００ＸＰ／Ｓ）。
次に、細胞を計測し、双方ともBector Dickinson Labware, Bedford, MAから得た、ポリ−Ｌ−オルニチン（１５ｕｇ／ｍｌ）及びラミニン（１ｕｇ／ｍｌ）で予め被覆されたディッシュで２４ウェルプレート（４００ｍｃｌ Ｎ２培地）では５×１０５細胞／ウェルまたは６ｃｍディッシュ（３ｍｌ Ｎ２培地）では５〜７×１０６細胞／ディッシュの細胞密度で播種した。（予備被覆プロトコル：滅菌カバースリップ（アシステント(assistent)１００１／００１２、１２ｍｍ）を各ウェル（２４ウェルプレート）に挿入した；次に、４００ｕｌのポリ−Ｌ−オルニチン（１５ｕｇ／ｍｌ）を加えた後、１０００×ストックからＰＢＳで希釈して、一晩放置した；プレートをＰＢＳで洗浄した後、新鮮なＰＢＳを添加して、プレートを３７℃で３０分間放置した；さらに、プレートを再度ＰＢＳで洗浄して、４００ｕｌのＦＮ（１ｕｇ／ｍｌ）をさらに添加した後１０００×ストックからＰＢＳで希釈した；プレートを３７℃で少なくとも２時間放置した）。
次に、１０〜２０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ(R & D Systems, Minneapolis, MN)及びＢ２７サプルメントを含むＮ２培養培地を、播種した細胞に添加して、細胞を６日間このような培地で培養した。培地は、２日毎に交換した。継代では、細胞を、ＰＢＳにおける０．０５％ トリプシン及び０．０４％ ＥＤＴＡで解離し、遠心で集め、再播種した。
ｂＦＧＦによって拡張したネスチン陽性細胞の分化 分化を、細胞培養物からｂＦＧＦを除去することによって誘導した。細胞塊を、双方ともSigma, St. Louis, MOから得た、ｃＡＭＰ（１ｍＭ）、及びＡＡ（２００ｕＭ）の存在または不存在下でラミニン（１ｍｇ／ｍｌ）を捕捉したＮ２培地中で３〜４日間広げた。次に、細胞を６〜１５日間、分化条件下でインキュベートした。
免疫細胞化学 細胞を、２０〜３０分間、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ ７．４）における２％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳにおける０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を浸透させ、５％正常ヤギ血清で処置した。細胞を、ネスチンに対する１次抗体（１：１０００；Dr. M. Marvin, NIHから）で３０分〜１時間、インキュベートした。また、細胞を、ケラチン８（１：１０００）、脳脂肪酸結合タンパク質（１：１０００）、ＭＡＰ２（１：２００）、ＮＦ−Ｍ（１：１００）、シナプシンＩ(Synapsin I)（１：１０００）、ＧＦＡＰ（１：５０）、Ｏ４、ＧａｌＣ（ｓ生産細胞の上清）、ＧＡＢＡ（１：１０００）、及びグルタメート（１：５００）に対する１次抗体と共にインキュベートしてもよい。ＰＢＳで洗浄した後、細胞をVectastain ABC kitに関する方法に従って処理した。
ＭＡＰ２及びＮＦ−Ｍによる２重免疫蛍光染色では、細胞を、固定し、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を浸透させ、同様にしてＮＧＳで処理してもよい。次に、細胞を、抗ＭＡＰ２モノクローナル抗体、さらにはフルオレセイン標識抗マウスＩｇＧと共にインキュベートした後、３０分間、２％パラホルムアルデヒドで再度固定してもよい。再固定化後、細胞を、抗ＮＦ−Ｍモノクローナル抗体、さらにはローダミン標識抗マウスＩｇＧと共にインキュベートする。２回目の固定によって、ローダミン−接合抗マウスＩｇＧの抗ＭＡＰ２モノクローナル抗体への交差反応が排除される。
酵素結合２次抗体による２重標識免疫細胞化学では、２重染色キット(Zymed Laboratories, Inc.)の指示に従う。抗リン酸化ＣＲＥＢ抗体（１：１０００）を用いた染色技術は、Ginty et al. (1993)に記載される。
増殖アッセイ 細胞を３７℃で８時間、ＢｒｄＵと共にインキュベートする。インキュベーション後、細胞を即座インキュベートに固定し、ＢｒｄＵ染色キットの指示に従って処理する。着色反応後、細胞を、３０分間、ＰＢＳにおける０．８％過酸化水素及び５％ＮＧＳと共にインキュベートして、ＨＡＲＰ活性を不活性化する。よく洗浄した後、抗ネスチンまたは抗ＭＡＰ２抗体染色のいずれかを目的として処理して、細胞質中の赤みを帯びた反応産物をアミノエチルカルバゾールで可視化する。
２００倍での１視野当たりの細胞数を計測することによって、細胞密度を測定する。８視野を各サンプルについて分析し、細胞密度を検量して、平均する。
ＲＴ−ＰＣＲ 全ＲＮＡを、Chomczynski and Sacchi (Chomczynski and Sacchi, Anal Biochem 162: 156-159 (1987))の方法によって各細胞調製物から抽出する。全ＲＮＡを、ＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅで処理し、ｃＤＮＡ合成をsuperscript II RNase H−逆転写酵素に関する指示に従って行なった。ＰＣＲ反応は、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．３μＭ 各前及び逆方向プライマー、及び０．２５ＵのＴａｑポリメラーゼを含むＰＣＲ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．８）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０〜００１％（ｗ／ｖ）ゼラチン）で行なった。サイクルパラメーターは、９−Ｃで３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で６０秒間の伸張であった。サイクル時間は、各プライマーセットが増幅の対数期内にあるように決定される。
ゲノムＤＮＡの増幅は、生成物−アクチン−ＮＭＤＡＲｌ、ＮＭＤＡＲ２Ｄ、カルビンジン(calbindin)Ｄ２８、ＧＡＤ６５、ＧＡＢＡＡａ３、ＡＭＰＡレセプターの大きさによって区別してもよい。他のプライマーでは、コントロール増幅を、逆転写酵素を加えずに行ない、ゲノムＤＮＡの増幅を見る。ゲノムＤＮＡの増幅はコントロールの実験では観察されないはずである。
電気生理学 細胞を、１３０ｍＭ酢酸カリウム（または１２０ ＣｓＣｌ＋１０ ＫＣ１）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＡＴＰ、０．１ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ｍＭ ＮａＣｌを含む３〜６ＭΩパッチピペット(patch pipette)を用いて室温で記録した後、ＫＯＨでｐＨを７．２に調節し、さらに浸透圧モル濃度をスクロースで３００ｍｏｓＭに調節する。記録整理食塩水は、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣ１、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、及び１０ｍＭグルコースを含む。浸透圧モル濃度をスクロースで３２０ｍｏｓＭに調節し、ｐＨをＮａＯＨで７．４に調節する。グルタメート（記録整理食塩水において１ｍＭ）に、１００μｍの記録細胞内で、記録細胞付近にまたは視野における隣接した細胞付近に位置するマイクロピペットで圧力をかける。電流シグナルを、Ａｘｏｐａｔｃｈ増幅器(Axopatch amplifier)で増幅し、貯め、ｐＣｌａｍｐ−６ソフトウェアを用いてＩＢＭコンピューターで分析する。
電子顕微鏡 プラスチックディッシュの細胞を、ＰＢＳにおける２％パラホルムアルデヒド及び１％グルタルアルデヒドで１時間固定する。次に、細胞を水洗し、１％ ＯｓＯ４で処理して、酢酸ウラニルでブロック染色し(block-stain)、エタノールで脱水して、アラルダイト樹脂に包埋する。薄切片サンプルを、ＪＥＯＬ １２００ ＥＸ電子顕微鏡下で観察する。
分化したニューロン培養物の刺激 ニューロン基本培地にＢ２７及び５％ ＦＣＳを加えたもので分化させた細胞を、１０分間、１０μＭのグルタメートまたはＮＭＤＡのいずれかを含む同様に培地でインキュベートする。細胞を、ホスホ−ＣＲＥＢ染色用に刺激後即座に固定する。細胞を刺激後５０分間インキュベートし、ＲＮＡをｃ−ｆｏｓ誘導の分析用に抽出する。
実施例４（ｂ）：チロシンヒドロキシラーゼ陽性に細胞の分化
ＨＳ細胞は、以下に記載される幾つかの分化段階後にインビトロでチロシンヒドロキシラーゼを産生できた。ＥＢを、４日間、実施例１（ｄ）に記載されるのと同様にして形成した後、ＥＳ細胞培地で付着組織培養物表面に播種した。
２４時間培養後、ネスチン陽性細胞の選択を、ＥＳ細胞培地を、インスリン(Sigma I1882)５μｇ／ｍｌ、塩化セレン(Sigma S5261)３０ｎＭ及びフィブロネクチン(Sigma F1141)５μｇ／ｍｌを捕捉したＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）、Gibco 11320-033を含む無血清インスリン／トランスフェリン／セレン／フィブロネクチン（ＩＴＳＦｎ）培地に交換することによって開始した。
ネスチン選択６〜１０日後、細胞の拡張を開始した。詳しくは、細胞を０．０５％ トリプシン／０．０４％ ＥＤＴＡで解離し、Ｎ２サプルメント(100X、Gibco 17502-048)、２０μｇ／ｍｌ インスリン、１μｇ／ｍｌのラミニン(Sigma, L2020)、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ(R& D Systems, 233-FB)、５００ｎｇ／ｍｌ ＳＨＨのマウスＮ−末端断片(R&D Systems, 461-SH)及び１００ｎｇ／ｍｌ マウスＦＧＦ８イソ型ｂ(R&D Systems, 423-F8)を捕捉したＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）、Gibco 11320-033を含むＮ２培地において１．５〜２×１０５細胞／ｃｍ２の濃度で、１５μｇ／ｍｌ ポリオルニチン(Sigma, P3655)及び１μｇ／ｍｌ ラミニン(Sigma, L2020)で予め被覆された、組織培養プラスチックまたはガラスカバーガラス上に播種した。培地を２日毎に交換した。
チロシンヒドロキシラーゼ陽性細胞の分化を、１μＭ ｃＡＭＰ(Sigma, A6885)、２００μＭ アスコルビン酸(Sigma, A5960)の存在または不存在下でラミニン（１ｍｇ／ｍｌ）を含む拡張用の上記培地からｂＦＧＦを除去することによって誘導した。細胞を、６〜１５日間、分化条件下でインキュベートした。
チロシンヒドロキシラーゼ陽性細胞を検出するために、誘導されたＨＳ細胞培養物をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ ７．４）で１回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド(Electron Microscopy Sciences, 15712)で３０分間固定した。次に、固定された細胞をＰＢＳで３回洗浄し、５分間、メタノールで処理した。
メタノールで処理された細胞を、ＰＢＳで３回再度洗浄し、５分間、Envision+ System (Dako, K4010)の遮断溶液（ボトル１）で遮断した。
過剰の遮断緩衝液を軽くたたいて落とし、１次抗体ウサギ抗チロシンヒドロキシラーゼ（Pel Freez, P40101-0, ＰＢＳにおいて１：３００）を細胞に適用して、室温で６０分間、インキュベートした。
１次抗体で染色された細胞を、ＰＢＳで３回洗浄して、Envision+ Systemsの２次抗体標識ポリマー（ボトル２）を適用して、細胞培養物を被覆し、室温で３０分間、インキュベートした。
２次抗体で染色された細胞を、ＰＢＳで３回洗浄して、Envision+ Systemsの液体ＤＡＢ＋基質（ボトル３）を添加して、細胞培養物を被覆し、５分間、インキュベートした。最後に、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、チロシンヒドロキシラーゼ陽性細胞を顕微鏡下で検出した（６日間選択した後のネスチン陽性細胞を示す図９Ｂを参照）。
卵母細胞の単為生殖活性化(parthenogenetic activation)の産物を示す図である。 精子形成及び卵形成の概略図である。 卵母細胞の融合及び卵母細胞融合産物の発達を示す図である。 卵母細胞の単為生殖活性化の産物の詳細を示す図である。 マウスＨＳ細胞由来のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の形態の写真である。 マウスＨＳ細胞由来の赤血球の形態の写真である。 マウスＨＳ細胞由来の単球の形態の写真である。 マウスＨＳ細胞由来のリンパ球の形態の写真である。 マウスＨＳ細胞由来の顆粒を有する造血細胞の形態の写真である。 マウスＨＳ細胞由来の顆粒及び単球双方を有する造血細胞の形態の写真である。 マウスＨＳ細胞由来の脈拍筋細胞(beating muscle cell)の形態の写真である。 マウスＨＳ細胞由来の膵臓細胞のクラスターの形態の写真である。 インスリン染色が茶色で示され、グルカゴン染色が赤色で示されるマウスＨＳ細胞由来の脾臓細胞インスリン及びグルカゴン染色の写真である。 ヒトのホモ接合性減数分裂Ｉ後の２倍体卵母細胞由来の桑実胚様塊の発達を示す写真である。 ヒトのホモ接合性減数分裂Ｉ後の２倍体卵母細胞由来の初期胚盤胞塊の発達を示す写真である。 ヒトのホモ接合性減数分裂Ｉ後の２倍体卵母細胞由来の内部細胞塊を現わす胚盤胞様塊の写真である。 ヒトのホモ接合性減数分裂Ｉ後の２倍体卵母細胞由来のフィード層（Ｄ）上に成育する単離された内部細胞塊の写真である。 マウスＨＳ細胞由来のネスチン(Nestin)陽性ニューロン前駆細胞の形態の写真である。 マウスＨＳ細胞由来のチロシンヒドロキシラーゼ陽性ニューロン細胞の形態の写真である。

Claims (72)

  1. 単離されたホモ接合性幹細胞（ＨＳ）。
  2. ヒト由来の単離されたホモ接合性幹細胞（ＨＳ）。
  3. 非ヒト種由来の単離されたホモ接合性幹細胞（ＨＳ）。
  4. 非ヒト種は、マウス、ハムスター、イヌ、ネコ、ウサギ、フェレット、ミンク、モルモット、ハリネズミ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、ウマ、シカ、ブタ、サル、及び類人猿からなる群より選択される、請求項３に記載の単離されたホモ接合性幹細胞。
  5. （ａ）２個の卵母細胞または２個の精子細胞を融合する、卵形成中の第二極体の放出を防止する、適当な条件下で第二極体の放出及び自発的な自己複製を行なわせる、または２個の精子または２個の１倍体卵核を除核した卵母細胞に移すことによって有糸分裂で活性化されたホモ接合性減数分裂Ｉ後の２倍体生殖細胞を生産し；
    （ｂ）該活性化されたホモ接合性減数分裂Ｉ後の２倍体生殖細胞を培養して、胚盤胞様塊を形成し；さらに
    （ｃ）該胚盤胞様塊の内部細胞塊からホモ接合性幹細胞を単離する
    ことを有する方法由来の単離されたホモ接合性幹細胞。
  6. 有糸分裂で活性化された減数分裂Ｉ後の２倍体生殖細胞が（ａ）２個の卵母細胞または２個の精子細胞を融合する、または（ｂ）２個の精子または２個の１倍体卵核を除核した卵母細胞に移すことによって生産される際に遺伝子型別によってホモ接合性である幹細胞をスクリーニングすることをさらに有する、請求項５に記載の方法由来の単離されたホモ接合性幹細胞。
  7. （ａ）２個の卵母細胞または２個の精子細胞を融合する、卵形成中の第二極体の放出を防止する、適当な条件下で第二極体の放出及び自発的な自己複製を行なわせる、または２個の精子または２個の１倍体卵核を除核した卵母細胞に移すことによって有糸分裂で活性化されたホモ接合性減数分裂Ｉ後の２倍体生殖細胞を生産し；
    （ｂ）該活性化されたホモ接合性減数分裂Ｉ後の２倍体生殖細胞を培養して、胚盤胞様塊を形成し；さらに
    （ｃ）該胚盤胞様塊の内部細胞塊からホモ接合性幹細胞を単離する
    ことを有するホモ接合性幹細胞の生産方法。
  8. 有糸分裂で活性化された減数分裂Ｉ後の２倍体生殖細胞が（ａ）２個の卵母細胞または２個の精子細胞を融合する、または（ｂ）２個の精子または２個の１倍体卵核を除核した卵母細胞に移すことによって生産される際に遺伝子型別によってホモ接合性である幹細胞をスクリーニングすることをさらに有する、請求項７に記載の方法。
  9. 単離されたホモ接合性幹細胞を適当な条件下で分化するように誘導することを有する、所望の前駆細胞、分化細胞、分化細胞の群、または組織型の作製方法。
  10. 分化は、培養液中に細胞調節因子、ホルモンまたはサイトカインを含ませることによって達成される、請求項９に記載の方法。
  11. 所望の細胞または細胞の群はケラチン化上皮細胞である、請求項９に記載の方法。
  12. 該ケラチン化上皮細胞は、表皮のケラチノサイト、表皮の基底細胞、指の爪および／または足指の爪のケラチノサイト、爪床の基底細胞、毛幹細胞、毛根鞘細胞、及び毛母基細胞からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
  13. 所望の細胞または細胞の群は湿性重層バリヤ上皮である、請求項９に記載の方法。
  14. 所望の細胞または細胞の群は、外分泌について特化した上皮細胞である、請求項９に記載の方法。
  15. 所望の細胞または細胞の群は、ホルモンの分泌について特化した細胞である、請求項９に記載の方法。
  16. 所望の細胞または細胞の群は、腸、外分泌腺、または尿生殖路の上皮吸収性細胞である、請求項９に記載の方法。
  17. 所望の細胞または細胞の群は、代謝及び貯蔵に特化した細胞である、請求項９に記載の方法。
  18. 所望の細胞または細胞の群は、肺、腸、外分泌腺若しくは尿生殖路をライニングするものとしてまたはバリヤとして機能する上皮細胞である、請求項９に記載の方法。
  19. 所望の細胞または細胞の群は、閉鎖した内部体腔をライニングする上皮細胞である、請求項９に記載の方法。
  20. 所望の細胞または細胞の群は、前方突進機能を有する線毛細胞である、請求項９に記載の方法。
  21. 所望の細胞または細胞の群は、細胞外マトリックスの分泌に特化した細胞である、請求項９に記載の方法。
  22. 所望の細胞または細胞の群は収縮性細胞である、請求項９に記載の方法。
  23. 所望の細胞または細胞の群は、血液及び免疫系の細胞である、請求項９に記載の方法。
  24. 所望の細胞または細胞の群は、感覚伝達細胞である、請求項９に記載の方法。
  25. 所望の細胞または細胞の群は、自律性ニューロンである、請求項９に記載の方法。
  26. 所望の細胞または細胞の群は、感覚器官の及び末梢ニューロンの支持細胞である、請求項９に記載の方法。
  27. 所望の細胞または細胞の群は、中枢神経系のニューロンまたはグリア細胞である、請求項９に記載の方法。
  28. 所望の細胞または細胞の群はレンズ細胞である、請求項９に記載の方法。
  29. 所望の細胞または細胞の群は色素細胞である、請求項９に記載の方法。
  30. 所望の細胞または細胞の群は生殖細胞である、請求項９に記載の方法。
  31. 所望の細胞または細胞の群は栄養細胞である、請求項９に記載の方法。
  32. 所望の細胞または細胞の群は、外胚葉、内胚葉または中胚葉からなる胚性胚葉の一由来である、請求項９に記載の方法。
  33. （ａ）２個の卵母細胞または２個の精子細胞を融合する、卵形成中の第二極体の放出を防止する、適当な条件下で第二極体の放出及び自発的な自己複製を行なわせる、または２個の精子または２個の１倍体卵核を除核した卵母細胞に移すことによって有糸分裂で活性化されたホモ接合性減数分裂Ｉ後の２倍体生殖細胞を生産し；
    （ｂ）該活性化されたホモ接合性減数分裂Ｉ後の２倍体生殖細胞を培養して、胚盤胞様塊を形成し；
    （ｃ）該胚盤胞様塊の内部細胞塊からホモ接合性幹細胞を単離し；さらに
    （ｄ）該ホモ接合性幹細胞の分化を誘導して、前駆細胞を生産する
    ことを有する前駆細胞の生産方法。
  34. 有糸分裂で活性化された減数分裂Ｉ後の２倍体生殖細胞が（ａ）２個の卵母細胞または２個の精子細胞を融合する、または（ｂ）２個の精子または２個の１倍体卵核を除核した卵母細胞に移すことによって生産される際に遺伝子型別によってホモ接合性である幹細胞をスクリーニングすることをさらに有する、請求項３３に記載の方法。
  35. 該前駆細胞を単離し、永久前駆細胞系を維持することをさらに有する、請求項３３に記載の方法。
  36. 該胚盤胞様塊の細胞は、未分化幹細胞の不存在下で分化するように誘導される、請求項３３に記載の方法。
  37. （ａ）ＨＳ細胞中に所望の遺伝子を挿入、除去または修飾して、遺伝的に変更されたＨＳ細胞を作製し；さらに
    （ｂ）該遺伝的に変更されたＨＳ細胞の分化を誘導する
    ことを有する、遺伝的に変更された前駆細胞の生産方法。
  38. （ａ）ＨＳ細胞由来の前駆細胞中に所望の遺伝子を挿入、除去または修飾して、遺伝的に変更された前駆細胞を作製し；さらに
    （ｂ）該遺伝的に変更された前駆細胞を培養して、遺伝的に変更された前駆細胞を成長させる
    ことを有する、遺伝的に変更された前駆細胞の生産方法。
  39. 該ホモ接合性幹細胞は、平坦な付着環境中で分化するように誘導される、請求項９、３３、または３７に記載の方法。
  40. 該ホモ接合性幹細胞は、３次元の付着環境中で分化するように誘導される、請求項９、３３、または３７に記載の方法。
  41. 該ホモ接合性幹細胞は、微小重力環境中で分化するように誘導される、請求項９、３３、または３７に記載の方法。
  42. 該ホモ接合性幹細胞は、免疫不全マウスでステムプラズムを生成することによって分化するように誘導される、請求項９、３３、または３７に記載の方法。
  43. 該前駆細胞は、３種の胚層、外胚葉、中胚葉または内胚葉の一のみに由来の様々な組織及び細胞に分化できるものである、請求項３３、３７、または３９に記載の方法。
  44. 請求項９、３３、３７、または３８に記載の方法を用いて得られた細胞を、このような治療の必要な患者に投与することを有する、治療方法。
  45. 請求項９、３３、３７、または３８に記載の方法を用いて得られた細胞を投与して、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、ＡＬＳ、脊髄異常または損傷、多発性硬化症、筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、肝疾患、糖尿病、心臓病、軟骨異常または損傷、火傷、足の潰瘍、血管疾患、尿路疾患、ＡＩＤＳ及び癌からなる群より選択される病気または状態を処置することを有する、治療方法。
  46. 患者はヒトであり、細胞は動物種由来である、請求項９、３３、３７、または３８に記載の方法を用いて得られた細胞を、このような治療の必要な患者に投与することを有する、治療方法。
  47. 患者は動物種であり、細胞はヒト由来である、請求項９、３３、３７、または３８に記載の方法を用いて得られた細胞を、このような治療の必要な患者に投与することを有する、治療方法。
  48. 患者はヒトであり、細胞はヒト由来である、請求項９、３３、３７、または３８に記載の方法を用いて得られた細胞を、このような治療の必要な患者に投与することを有する、治療方法。
  49. 患者は動物種であり、細胞は動物種由来である、請求項９、３３、３７、または３８に記載の方法を用いて得られた細胞を、このような治療の必要な患者に投与することを有する、治療方法。
  50. 患者はヒトであり、細胞はヒトである、請求項９、３３、３７、または３８に記載の方法を用いて得られた細胞を、このような治療の必要な患者に投与することを有する、治療方法。
  51. ヒト由来の細胞は同種異系である、請求項５０に記載の方法。
  52. ヒト由来の細胞は同種同系である、請求項５０に記載の方法。
  53. （ａ）有糸分裂で活性化されたホモ接合性減数分裂Ｉ後の２倍体生殖細胞を生産し；
    （ｂ）該活性化されたホモ接合性減数分裂Ｉ後の２倍体生殖細胞を培養して、胚盤胞様塊を形成し；
    （ｃ）該胚盤胞様塊の内部細胞塊からホモ接合性幹細胞を単離し；さらに
    （ｄ）該ホモ接合性幹細胞の分化を誘導して、前駆細胞を生産する
    ことを有する方法由来の前駆細胞。
  54. 有糸分裂で活性化された減数分裂Ｉ後の２倍体生殖細胞が（ａ）２個の卵母細胞または２個の精子細胞を融合する、または（ｂ）２個の精子または２個の１倍体卵核を除核した卵母細胞に移すことによって生産される際に遺伝子型別によってホモ接合性である幹細胞をスクリーニングすることをさらに有する、請求項５３に記載の方法由来の前駆細胞。
  55. 該前駆細胞を永久前駆細胞系として単離、維持することをさらに有する、請求項５３に記載の前駆細胞。
  56. 該胚盤胞様塊の細胞は、未分化幹細胞の不存在下で分化するように誘導される、請求項５３に記載の前駆細胞。
  57. 該胚盤胞様塊由来の該ホモ接合性幹細胞は、平坦な付着環境中で分化するように誘導される、請求項５３に記載の前駆細胞。
  58. 該胚盤胞様塊由来の該ホモ接合性幹細胞は、３次元の付着環境中で分化するように誘導される、請求項５３に記載の前駆細胞。
  59. 該胚盤胞様塊由来の該ホモ接合性幹細胞は、微小重力環境中で分化するように誘導される、請求項５３に記載の前駆細胞。
  60. 該胚盤胞様塊由来の該ホモ接合性幹細胞は、免疫不全マウスでステムプラズムを生成することによって分化するように誘導される、請求項５３に記載の前駆細胞。
  61. 該前駆細胞は、３種の胚層、外胚葉、内胚葉または中胚葉の一のみに分化できるものである、請求項５３に記載の前駆細胞。
  62. 請求項５３に記載の前駆細胞を、このような治療の必要な患者に投与することを有する、治療方法。
  63. 請求項５３に記載の前駆細胞を投与して、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、ＡＬＳ、脊髄異常または損傷、多発性硬化症、筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、肝疾患、糖尿病、心臓病、軟骨異常または損傷、火傷、足の潰瘍、血管疾患、尿路疾患、ＡＩＤＳ及び癌からなる群より選択される病気または状態を処置することを有する、治療方法。
  64. 患者はヒトであり、分化細胞は動物種由来である、請求項５３に記載の前駆細胞を、このような治療の必要な患者に投与することを有する、治療方法。
  65. 患者は動物種であり、分化細胞はヒト由来である、請求項５３に記載の前駆細胞を、このような治療の必要な患者に投与することを有する、治療方法。
  66. 患者は動物種であり、細胞は動物種由来である、請求項５３に記載の前駆細胞を、このような治療の必要な患者に投与することを有する、治療方法。
  67. 患者はヒトであり、細胞はヒトである、請求項５３に記載の前駆細胞を、このような治療の必要な患者に投与することを有する、治療方法。
  68. ヒト由来の細胞は同種異系である、請求項６７に記載の方法。
  69. ヒト由来の細胞は同種同系である、請求項６７に記載の方法。
  70. （ａ）２個の卵母細胞または２個の精子細胞を融合する、卵形成中の第二極体の放出を防止する、適当な条件下で第二極体の放出及び自発的な自己複製を行なわせる、または２個の精子または２個の１倍体卵核を除核した卵母細胞に移すことによって有糸分裂で活性化されたホモ接合性減数分裂Ｉ後の２倍体生殖細胞を生産し；
    （ｂ）該活性化されたホモ接合性減数分裂Ｉ後の２倍体生殖細胞を培養して、透明帯で囲まれている胚盤胞様塊を形成し；
    （ｃ）補助孵化の方法を用いて該透明帯から該胚盤胞様塊を放出させ；さらに
    （ｄ）該胚盤胞様塊の内部細胞塊からホモ接合性幹細胞を単離する
    ことを有する方法由来の単離されたホモ接合性幹細胞。
  71. 補助孵化の方法は、透明帯が弱くなって、胚盤胞様塊が放出されるように、一方の腕が該胚盤胞様塊を所定の位置に保持し、かつ他方の腕が、該透明帯の全表面の約１／８に等しい面積の透明帯の表面に酸性化タイロード溶液を適用するような２本の腕を有するマイクロマニピュレーターに該胚盤胞様塊を固定することを有する、請求項７０に記載の単離された幹細胞。
  72. （ａ）２個の卵母細胞または２個の精子細胞を融合する、卵形成中の第二極体の放出を防止する、適当な条件下で第二極体の放出及び自発的な自己複製を行なわせる、または２個の精子または２個の１倍体卵核を除核した卵母細胞に移すことによって有糸分裂で活性化されたホモ接合性減数分裂Ｉ後の２倍体生殖細胞を生産し；
    （ｂ）該活性化されたホモ接合性減数分裂Ｉ後の２倍体生殖細胞を培養して、透明帯で囲まれている胚盤胞様塊を形成し；
    （ｃ）胚盤胞様塊が形成されるまで、活性化してから２日目の該活性化されたホモ接合性減数分裂Ｉ後の２倍体生殖細胞を、マウスの胚線維芽細胞のマイトマイシンＣで処理したフィーダー層に移し；
    （ｄ）補助孵化の方法を用いて該透明帯から該胚盤胞様塊を放出させ；さらに
    （ｅ）該胚盤胞様塊の内部細胞塊からホモ接合性幹細胞を単離する
    ことを有する方法由来の単離されたホモ接合性幹細胞。
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