KR100644296B1 - 생체 공학적 턱뼈 및 치아 재건 방법 - Google Patents

Abstract

치아가 있는 포유류 동물 배아의 턱뼈원기 부위나 구강상피를 분리 채취하는 단계; 배아의 분리부분에 성장인자나 필요한 조절인자를 삽입 또는 혼합하는 단계; 배아의 분리부분을 시험관내(in vitro)에서 3차원적 기관배양을 실시하는 단계; 배아의 분리부분을 생체 내에서 기관배양을 실시하는 단계; 치배 부위의 탁뼈원기를 다른 배아의 치아가 없는 턱뼈원기 부위에 이식한 후 기관 배양을 실시하여 치아를 포함한 배양턱뼈를 재건하는 단계; 배양턱뼈 부위를 결손된 턱뼈 부위로 이식하는 단계를 포함하는 생체 공학적 턱뼈 및 치아 재건 방법이 개시된다.

생체공학, 배양치아, 배양턱뼈, 임플란트, 바이오 장기

Description

생체 공학적 턱뼈 및 치아 재건 방법{Bioengineering of the tooth and jaws via organ culture system}

도 1a는 발생중인 생쥐 치배의 제 1 세궁의 하악 원기를 분리하는 과정을 나타낸 사진

도 1b는 발생 중인 하악 원기 측면에 위치한 구치 치배를 분리해낸 사진

도 1c는 생쥐 치간극에 치배를 이식한 모습으로 화살표는 이식된 치배를 나타낸 사진

도 2a는 하악 간극에 이식한 치배로부터 치아가 발생한 모습으로 화살표는 발생된 치아를 표시한 사진

도 2b는 도 2a의 발생중인 치아가 치관을 형성하여 종상기와 양립된 모양을 나타낸 사진

도 3a와 도 3b는 절개된 치간극에 이식된 치배에서 발생한 치아의 모습과 치아가 지지조직을 형성한 것을 나타낸 사진

도 4a는 치아가 없는 치간극에 치배를 이식하고 골 형성 단백 BMP-4를 처리하여 배양한 후의 사진

도 4b는 도 4a와 같이 골 형성 단백을 처리한 상태에서 발생한 치아가 성숙 한 치관을 형성한 모습을 나타낸 사진

도 4c는 도 4b의 모상기로 발달된 치아에서 에나멜과 상아질을 형성한 모습을 나타낸 사진

본 발명은 생체공학적 방법을 적용한 치아 결손부의 수복 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 치아의 발생 원리에 기초하여 생쥐 배아의 구강조직을 이용한 치아 결손부에서의 치아 형성 및 발육 방법에 관한 것이다.

더 상세하게는, 치아 발생원리를 기초로 하여, 발생중인 생쥐의 치아가 될 부위의 조직(배아구강상피)을 채취하여 기관 배양하므로써 치아 결손부에서의 치아 형성 및 발육이 가능한 방법을 제공하고, 또한 치아가 형성되지 않는 치간극(diastema area)에 이식하므로써 배양치아 혹은 배양턱뼈를 이식하는 방법에 관한 것이다.

치아는 척추동물에서만 나타나는 구조물로서, 두 인접 조직 즉, 상피와 간엽의 연속적인 상호작용에 의해 형성된다. 다른 기관과 마찬가지로 치아 형성은 다음의 세 가지 과정을 거친다.

첫째는 개시단계(initiation)로 이는 치아 형성에 적절한 장소로의 위치 정 보의 전달과 기관 형성을 시작하는 단계이며, 다음 단계는 형태 형성(morphogenesis)으로 세포가 모여 기관을 형성하고, 최종적으로 이러한 세포가 기관에 특이하도록 분화(differentiation)하는 단계로 이루어진다는 사실이 밝혀져 있다.

이러한 연속적이고 상호적인 작용의 결과 구강상피는 국소적인 증식과 성장을 보여 복잡한 형태의 치아형성을 보이게 된다. 발생중인 생쥐의 치아는 상기 발달 단계 및 상호 작용을 가지므로 우리가 생체공학적으로 치아를 배양하는데 이용된다. 즉 필요한 적합한 시기의 구조물을 현미경하에서 미세 수술을 통해 분리하여, 치배 이식이나 이에 관련된 기술 또는 유전자 발현을 고려한 분자생물학적 관련 인자를 이용하여 치아배양을 하게된다.

생쥐에서의 치아발생은 태중 11.5일경에 시작되며 일차적으로 구강상피 층으로 증식하면서 치아 발육 및 형태형성을 보인다. 아울러 이 시기 상피세포 증식과 더불어 치아형성을 위한 신호 중심체(epithelial signaling center)의 형성이 동반된다. 이후 상피세포 층의 계속적인 증식은 뇌상기(bud stage), 모상기(cap stage), 종상기(bell stage)를 거쳐 치관의 형태를 만든다고 알려져 있다.

태중 11.5일에서 12일 사이 상피신호전달 중심체의 출현은 치아형성의 잠재력이 상피에서 간엽으로 이전되는 것과 시기적으로 일치하는 것으로 알려져 있으며 치성 상피 및 간엽의 재조합 실험에서 태생 11일의 치성상피는 모든 경우 치아 발생을 유도하였지만, 태생 12일의 경우 간엽에 의한 치아 발생이 보인다고 보고되었다.

이 사실은 태생 11.5일에서 간엽에서의 신호전달이 상피 신호전달 중심체의 형성을 조절하며, 간엽 조직은 상피로부터의 상호작용에 의하여 이후 치아 발달에 필요한 잠재력을 보유하기 때문이다. 이러한 신호 전달은 증식되는 상피 주변에 집중된 간엽에 의해 이전에 발현되었던 많은 유전자 발현을 유지시키며 한편으로 외배엽성 간엽에 다른 유전자 발현을 유도한다고 알려져 있다.

신호전달 물질의 상승작용 및 길항작용이 치아 발달의 각각의 단계에서 국소적인 조직반응에 관여한다. 이러한 역할을 하는 물질은 형질전환인자(transforming growth factor, TGF), 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF), Hedgehog 유전자군, Wnt 유전자군이 관여하는 것으로 알려졌다.

이 중 형질전환인자에 속하는 골형성 단백(bone morphogenetic protein, BMP)은 이소성 골 형성 능력을 보이는 특징 이외에 발생과정 중에 광범위한 신호전달 기능에 관여하며, 특히 골형성 단백 유전자의 기능 이상을 보이는 경우 다양한 발육 장애를 보이는 것이 알려져 있다.

치아 형성의 개시에 관여하는 물질에 대한 연구는 발생중인 제 1 세궁에서의 Bmp-4 발현에서 비롯되었다. 발생중인 상, 하악 돌기에서 Bmp -4 발현 부위는 초기 치아 발생에 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 특히 하악돌기에서 태중 10일경 Bmp-4의 발현은 절치 발생부위에서 나타나며, 12시간 후 그 발현 부위는 치아 발육 개시에 앞서 구치발생부위의 상피에 국한되는 특징을 보인다.

또한, Bmp -4는 치성 간엽 조직에서의 발현에 자가조절 기능을 가지고 있으며 이는 Msx -1 유전자에 의해 조절된다. 한편 Bmp -4와 Msx -1은 되먹임 기전을 가지고 있어서 상호 발현을 조절하는 것으로 알려졌다.

태중 13.5일경의 생쥐 치아 발육은 뇌상기에 도달한 것이며, 조직학적으로 이 시기는 치판이 하방의 간엽으로 증식되어 들어가는 것으로, 이러한 상피증식에 의해 바로 인접한 부위에서 간엽 세포의 밀도를 증가시킨다. 이러한 간엽 세포의 군집부인 치유두(dental papilla)는 향후 상아질과 치수를 형성하며, 이러한 간엽 조직 상방에 위치한 상피 증식 부분은 최종적으로 법랑질을 형성하게 된다.

이 후 치아 발육은 뇌상기에서 모상기로 진행되며 이러한 이행은 치아 형태 형성에 있어서 가장 중요한 단계로서, 치관 발달의 시작이다. 이러한 과정은 발육 중인 치배 첨단부위 상피 층에 법랑결절(enamel knot)의 형성에 의해 매개되며, 유전자 Bmp 2, Lef 1, Msx 1, Bmp 4, Pax9 등의 상호 작용에 의하여 치아 발달이 진행되는 것으로 알려졌다. 모상기 동안 치유두에서의 Bmp -4 발현은 계속되며 법랑결절의 원심부 상피에서 발현된다.

또한 종상기로 진행되면서 치성 상피에서의 Bmp -4 발현은 법랑결절의 소실과 함께 사라지나 전상아 세포층을 포함한 치유두의 교두 발생 부위에서는 더욱 뚜렷해진다.

다른 포유류와 비교하여 생쥐의 치열은 1/4악당 한 개의 절치와 세 개의 구치로 구성되며, 절치와 구치 사이는 치아가 형성되지 않는 치간극을 갖고 있는 것이 특징이다. 이러한 생쥐 치간극은 턱뼈 내 치아 이식 및 치아 형성에 관여하는 유전자의 특징을 연구하는 데 좋은 모델로 제시되고 있다.

일반적으로 1/4악당 세 개의 절치와 한 개의 견치, 네 개의 소구치 그리고 세 개의 구치를 가지는 다른 포유류와는 달리 생쥐의 기능적 치열은 발생과정 중에 상당히 감소된다. 즉, 성장한 생쥐 치열은 하나의 절치와 세 개의 구치로 구성되어 있으며 절치와 구치 사이는 치아가 존재하지 않는 치간극(diastema)이 나타난다.

한편, 발생중인 생쥐에서 일시적으로 절치와 구치 사이에 치아 원기(dental primordia)가 나타나는 것으로 알려졌으나, 이러한 흔적기관은 발생과정에서 퇴화되며 상피세포사(epithelial apoptosis)가 이에 관여하는 것으로 알려졌다. 또한 생쥐 상악골 발생 과정 중의 세포사의 분포 영역과 Bmp 2, Bmp 4 발현 영역 사이의 연관성으로 인하여 골 형성 단백이 흔적 기관으로 치간극에 나타나는 치아원기의 세포사에 관여하며, 발생 과정의 진행에 활발한 조절인자로 작용하는 것으로 알려졌다.

한편, 치아가 결손된 경우의 치아 대체물로서는 금속 임플란트인 인조치아를 이용하고 있다. 그러나, 금속 인조치아는 생체적합성 문제와 함께 골유합증에 의해 금속치아와 골이 유합함으로써 실제 치아에서 치근막에 의해 생기는 쿠션이 없어 충격력을 흡수할 수 없으며, 교정력을 줄 수 없어 이동이 불가능하다.

또한, 인조치아 주위의 골 흡수가 있는 단점 등이 있어 이를 해결할 수 있는 바이오 장기로서의 생체치아 제작의 필요성이 대두된다.

따라서, 본 발명은 이러한 문제점을 해결하고자 발생 원리에 기초하여 생체공학적 방법을 적용한 생체기관의 인위적 배양 기법을 치아 발생에 적용하여 치아 결손부의 수복 회복을 가능하게 하는 것을 그 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적은 금속 임플란트인 인조치아를 대체할 바이오 장기로서의 생체 공학적 치아 배양 방법과 생체공학적 턱뼈 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적과 특징들은 이하에 서술되는 바람직한 실시예를 통하여 명확하게 이해될 것이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 인간 이외의 치아가 있는 포유류 동물 배아의 턱뼈원기 부위나 구강상피를 분리 채취하는 단계; 배아의 분리부분에 성장인자나 필요한 조절인자를 삽입 또는 혼합하는 단계; 배아의 분리부분을 시험관내(in vitro)에서 3차원적 기관배양을 실시하는 단계; 배아의 분리부분을 생체 내에서 기관배양을 실시하는 단계; 배양된 치아를 포함한 배양턱뼈 부위를 다른 배아의 턱뼈원기 부위에서 치아가 없는 부위에 이식한 후 기관 배양을 실시하여 치아를 포함한 배양턱뼈를 재건하는 단계; 배양턱뼈 부위를 결손된 턱뼈 부위로 이식하는 단계를 포함하는 생체 공학적 턱뼈 및 치아 재건 방법이 개시된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 인간 이외의 치아가 있는 포유류 동물 배아의 턱뼈원기 부위나 구강상피를 분리 채취하는 단계; 배아의 분리부분에 성장인자나 필요한 조절인자를 삽입 또는 혼합하는 단계; 배아의 분리부분을 시험관내(in vitro)에서 3차원적 기관배양을 실시하는 단계; 배아의 분리부분을 생체 내에서 기관배양을 실시하는 단계; 배양된 치아를 치아가 없는 턱뼈 부위로 이식하는 단계를 포함하는 생체 공학적 치아 제조 및 치아 재건 방법이 개시된다.

바람직하게, 턱뼈원기 부위나 구강상피를 분리하는 단계는, 배아에서 턱뼈원기 부위를 분리 채취하거나, 턱뼈원기의 구강상피 부위를 하부(mesenchyme)와 함께 분리채취하거나, 또는 턱뼈원기의 구강상피 부위를 하부의 간엽층(mesenchyme)과 분리하여 상피층과 간엽층을 각각 분리하여 각각을 혼합하여 쓸 수 있게 분리 채취한다.

또한, 배아의 분리부분에 성장인자나 필요한 조절인자를 삽입 또는 혼합하는 단계에서, 조절인자 즉 성장인자, 억제인자 등 부착분자 등 관련 분자 및 단백질을 비드(bead) 형태로 삽입하거나 혼합하여 배양함에 있어서, 비드는 37℃에서 30 내지 60분간 배양하여 사용한다.

또한, 3차원적 기관배양을 실시하는 단계에서, 분리한 기관이 배양액과 기체를 모두 접할 수 있도록 배양배지가 굴곡이 있게 하여 이중구조로 되어 내부와 외부가 분리되게 하고 내부에는 배양액을 넣고 그 위에 금속 그리드를 놓고 그 위에 배양액이 흡수 가능한 판을 놓고 그 판위에 분리한 기관을 놓아 기관이 배양액과 기체를 모두 접할 수 있게 하고, 배양배지 가장자리 외부에는 습도를 유지할 수 있는 액체를 넣을 수 있게 한 것으로, 기관을 배양액과 기체의 계면(medium-gas interface)에 위치시켜 영양분에 대한 접근이 용이한 동시에 기체 교환이 가능하도록 한다.

더욱이, 3차원적 기관배양을 실시하는 단계에서, 분리한 기관조직을 밀리셀(Millicel, Millipore Corp., Billerica, USA)에 넣고 10 % FBS를 포함한 D-MEM을 용매로 사용한 hydrogel(poly-N-isopropylacrylamide, NIPAM)로 포매한 후, 밀리셀을 10% FBS를 함유한 D-MEM이 담긴 배지에 부유시킨 상태로 섭씨 37도로 습도를 유지하며 배양한다.

생체내에서 기관배양을 실시하는 단계에서, 분리한 조직이나 시험관내에서 배양한 조직을 그 조직의 동물과 면역반응이 없는 동물의 콩팥(kidney capsule), 복강망(omentum), 구강낭(buccal pouch), 두개골 두피의 골막 하부나 피하부위, 안구 속, 또는 등이나 배의 피하 부위 내에 넣어 생체 내에서 배양한다.

또한, 배양 턱뼈 부위를 결손된 턱뼈 부위로 이식하는 단계에서, 필요한 치아부위를 주변골과 함께 결손된 턱뼈부위로 이식하여 철사나 금속 또는 흡수성 뼈 고정재로 고정한다.

바람직하게, 조절인자 중 치아 교두 발달과 주변 골 형성 촉진을 위한 골형성 단백이 BMP-4로 처리된다.

또한 조절인자 중 테나신(Tenascin)으로 처리함으로써 치아의 상아질 발달과 치수부위 및 주변 골 형성을 촉진한다.

본 발명에 따르는 생쥐는 태중 11.5일경의 생쥐 치아를 사용하였다. 생쥐 태아 연령의 정확한 결정을 위하여 상악, 하악 원기의 상대적 크기, 사지 발달 정도 등의 형태학적 기준을 사용하였다. 발생 11.5일경의 생쥐 치아는 구강내 상피가 두꺼워지기 시작하는 시기로 이 두꺼워지는 상피가 하부의 간엽으로 침투하면서 치아가 형성되는데 이시기의 구강 상피 부위를 기관배양 하였다. 이 때 필요한 조절인자의 단백질을 생체흡수성 비드(bead)에 침투시켜 이 비드를 상피부위에 고정시켜 조절인자 특성이 발현되도록 하였다. 이때 목적에 따라 상피와 하부의 간엽을 분리하여 상기 조절인자를 혼합 재조합(recombination)하여 기관배양 하였다.

턱뼈원기의 이식 실험은 생쥐 태아 13.5일의 배아에서 하는데 발생 13.5일경의 생쥐 치아는 흔적기관인 치아원기가 원심부에 치우쳐 형성되어, 제 1 대구치의 근심부 형성에 관여하여 점차적으로 중앙부 및 원심부 형성에 영향을 미친다. 따라서 이 시기의 발생중인 하악 원기에서 현미경을 통한 절치와 구치 치배의 명확한 관찰이 가능하므로, 이의 실험적 조작이 용이하고 치아원기 흔적이 치간극 사이에 가장 적게 분포하므로 용이한 치배 이식이 가능하였다.

본 발명에 따르는 치배는 제 1 세궁의 하악 원기를 박리하였다. 치배 이식시에는 현미경하에서 미세수술기구를 이용한 미세수술 박리를 시행하고 이를 다치지 않게 이식하여야 한다. 즉 섬세한 미세수술 기법이 동반하여야 원하는 결과에 영향을 미치지 않게 되므로 주의하여야 한다. 분리한 치배는 시험관내(in vitro)에서 3차원적 기관배양을 실시하는데, 분리한 기관이 배양액과 기체를 모두 접할 수 있도록 배양배지가 굴곡이 있게 하여 이중구조로 되어 내부와 외부가 분리되게 하여 내부에는 배양액을 넣고 그 위에 금속 그리드를 놓고 그 위에 배양액이 흡수 가능한 판을 놓고 그 판위에 분리한 기관을 놓아 기관이 배양액과 기체를 모두 접할 수 있게 하고 배양배지 가장자리 외부에는 습도를 유지할 수 있는 액체를 넣을 수 있게 한 것으로 기관을 배양액과 기체의 계면(medium-gas interface)에 위치시켜 영양분에 대한 접근이 용이한 동시에 기체 교환이 가능하도록 한 것을 특징으로 하는 시험관내 기관배양법을 하였다.

또 다른 방법으로 상기 배아의 분리부분을 시험관내(in vitro)에서 3차원적 기관배양을 실시하는 방법은 분리한 기관조직이 Millicel (Millipore Corp., Billerica, USA)에 넣고 10 % FBS를 포함한 D-MEM을 용매로 사용한 hydrogel(poly-N-isopropylacrylamide, NIPAM)로 포매한 후, Millicel을 10% FBS를 함유한 D-MEM이 담긴 배지에 부유시킨 상태로 섭씨 37도로 습도를 유지하며 배양하는 것을 특징으로 하는 시험관내 기관배양법을 개발하였다.

본 발명에서, 상기 배아에서 분리한 턱뼈원기조직이나 시험관내에서 배양한 기관, 혹은 치배는 생쥐의 신장에 이식하여 생체 배양하였다. 이식된 치배 및 하악 원기의 생리적 환경 내에서의 성장과 분화를 위하여 신장에서의 배양을 실시하였다

이하, 실시예를 통해 본 발명에 대해 보다 상세하게 설명하나, 본 발명의 권리 범위에 대해 제한을 하는 것은 아니다.

실시예 1: 치배의 분리 및 이식된 치배에서 치아 형성

본 발명에 사용된 생쥐는 CD-1 종의 생쥐 태아를 사용하였다. 임신이 확인된 날의 정오를 태중 0.5일(Embryonic day 0.5, Edd0.5)로 정하여 태아의 연령을 결정하였다. 또한 태아 연령의 정확한 결정을 위하여 상악, 하악 원기의 상대적 크기, 사지 발달 정도 등의 형태학적 기준을 사용하였다.

태중 13.5일(E13.5)의 생쥐 태아를 자궁에서 박리하여 Dulbeccos phosphate buffered saline(D-PBS, Gibco-BRL Laboratories, Detroit, MI, supplemented with 20 IU/ml penicillin-streptomycin)이 들어있는 페트리 디시에 위치시킨 후 현미경하에서 발생중인 제 1 세궁의 하악 원기를 박리하였다. 그 결과 도 1a와 같이 분리되었다.

발생 중인 하악 원기 측면에 위치한 구치 치배를 분리해냈으며(도 1b) 분리한 치배를 상기 기술한 시험관내 기관배양법을 2일간 실시하였다. 그 결과 도 1c에서 볼 수 있듯이 치간극에 치배가 이식되었다. 화살표는 이식된 치배를 보여주는 것이다.

상기 배양한 치배를 수컷 생쥐의 신장에 이식하여 2주간 배양하였으며, 실험실에서 배양한 이식된 치배를 함유한 하악 원기는 치배를 함유한 치간극 부위를 박리하여 생쥐 신장에 이식하여 2주간의 생체 배양을 실시하였다. 생체 배양이 끝난 후 생쥐를 희생시켜 발생중인 치아부위를 채취하였다.

이후 4% paraformaldehyde에 고정한 후 탈수 과정을 거쳐 파라핀 포매를 실시하였으며, 5um 두께의 절편을 제작하고 Hematoxylin-Eosin, Mason-Trichrome으로 염색 후 현미경하에서 관찰하였다. 그 결과 도 2a 및 도 2b에서 볼 수 있듯이 발육중인 치배는 후기 종상기, 치관 형성기에 도달하였으며, 치관부에서는 상아질 및 법랑질 형성을 동반한 뚜렷한 교두 발달을 보였고, 치경부에서는 Hertwig의 상피근초의 형성을 동반한 치근 형성을 보였다.

또한, 치배 이식을 통한 치아형성을 관찰하기 위하여 박리한 치배를 발생중인 다른 하악 원기의 치간극에 위치시킨 후 상기 기술한 시험관내 기관배양법을 이 용한 기관배양을 실시하였다. 그 결과 도 3a에서 볼 수 있듯이 치아의 형성 및 발육 모습이 관찰되었고 도 3b에서 볼 수 있듯이 발육중인 치배는 치관의 형태 형성을 보이는 종상기에 도달하여 내치상피세포(internal dental epithelium)층의 증식 및 만곡으로 인한 치관의 형태를 형성하였다.

상기 내치상피의 만곡은 치아기의 성상세망의 감소를 보인 후 정점에서는 법랑질 및 상아질 형성을 동반한 교두 형성을 보였다. 또한 일부에서는 치경부에서 내, 외치상피의 증식을 통한 치근 형성을 시작했으며 발육중인 치아 하방으로 치조골의 증식을 동반한 치아 지지조직을 형성하였다.

실시예 2: 골 형성 단백에 의한 치아 형성 방법

상기 실시예 1에서의 치간극에 치배를 이식한 곳에 아울러 골 형성 단백에 의한 형태 형성을 관찰하기 위하여, Affigel-blue agarose beads(직경75-150㎛, Bio-Rad, USA)를 37℃에서 30분간 100 ㎍/㎕의 recombinant human BMP-4(Genetics Institute, Cambridge, MA, USA)에 배양하였다. 배양된 beads를 이식된 치배 주위에 위치시킨 후 2일간 기관배양을 실시하였다.

배양된 치배를 수컷 생쥐의 신장에 이식하여 2주간 배양하였으며, 실험실에서 배양한 이식된 치배를 함유한 하악 원기는 치배를 함유한 치간극 부위를 박리하여 생쥐 신장에 이식하여 2주간의 생체 배양을 실시하였다. 생체 배양이 끝난 후 생쥐를 희생시켜 발생중인 치아부위를 채취하였다.

이후 4% paraformaldehyde에 고정한 후 탈수 과정을 거쳐 파라핀 포매를 실 시하였으며, 5um 두께의 절편을 제작하고 Hematoxylin-Eosin, Mason-Trichrome으로 염색 후 현미경하에서 관찰하였다. 그 결과, 도 4a와 4b에서 볼 수 있듯이 하악 치간극에 이식 후 배양 기간 중 골 형성 단백을 투여한 치배는 후기 종상기, 치관 형성기에 도달하였으며 도 4c에서 볼 수 있듯이 교두 발들을 동반한 치관 형성을 보였으며, 치관부 전체에 걸친 상아질, 법랑질층 형성이 관찰되었다.

실시예 3 : 하악원기의 배양

본 발명에 사용된 생쥐는 CD-1 종으로 태중11.5 일의 생쥐 태아를 자궁에서 박리하여 Dulbeccos phosphate buffered saline(D-PBS, Gibco-BRL Laboratories, Detroit, MI, supplemented with 20 IU/ml penicillin-streptomycin)이 들어있는 페트리 디시에 위치시킨 후 현미경하에서 발생중인 제 1 세궁의 하악 원기를 전체를 박리하였다. 하악원기를 상기 기술한 시험관내 기관배양법을 4일간 실시하였다.

상기 배양한 하악원기 전체를 생쥐의 신장에 이식하여 4주간 생체배양하였다. 생체 배양이 끝난 후 생쥐를 희생시켜 하악골 전체의 생체배양 여부와 그속의 발생중인 치아발생 여부를 확인하였다.

이후 4% paraformaldehyde에 고정한 후 탈수 과정을 거쳐 파라핀 포매를 실시하였으며, 5um 두께의 절편을 제작하고 Hematoxylin-Eosin, Mason-Trichrome으로 염색 후 현미경하에서 관찰하였다. 그 결과 하악원기 전체는 잘 발육하였으며 그하악원기 내의 치아도 발육하여 치아 자체도 정상구조와 형태를 지니고 있었다. 발 육중인 치배는 후기 종상기, 치관 형성기에 도달하였으며, 치관부에서는 상아질 및 법랑질 형성을 동반한 뚜렷한 교두 발달을 보였고, 치경부에서는 Hertwig의 상피근초의 형성을 동반한 치근 형성을 보였다.

즉 하악원기 전체를 모두 배양하여 정상적인 치아와 턱뼈 구조를 제작할수 있다는 점이 본 발명의 특징이다.

이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 중심으로 설명하였지만, 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변경이나 변형을 가할 수 있다. 따라서, 본 발명의 범위는 상기한 실시예에 국한되어서는 안되며, 이하에 서술되는 특허청구범위에 의해 결정되어야 한다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따르는 생체 공학적 치아 배양 방법은 인체에 적용할 시 금속 임플란트 인조 치아의 단점인 생체 적합성, 인조 치아 주변의 골 흡수 및 충격력을 흡수하지 못하는 단점, 교정력을 가할수 없는 단점등을 개선할 수 있는 매우 유용한 발명이다. 또한 치아를 포함한 배양턱뼈를 이식하여 지금까지의 자가 골 이식, 타인의 골 이식, 동물뼈 이식, 인조합성 뼈이식에 따른 문제점을 해결할 수 있는 방법으로서 턱뼈자체를 배양할 수 있으며 치아를 함유하는 배양 턱뼈이식 방법을 개발한 점에서 매우 유용한 발명이다.

Claims (10)

1. 인간을 제외한 치아가 있는 포유류 동물 배아의 턱뼈원기 부위나 구강상피를 분리 채취하는 단계;

   상기 배아의 분리부분에 성장인자나 필요한 조절인자를 삽입 또는 혼합하는 단계;

   상기 배아의 분리부분을 시험관내(in vitro)에서 3차원적 기관배양을 실시하는 단계;

   상기 배아의 분리부분을 생체 내에서 기관배양을 실시하는 단계;

   배양된 치아를 포함한 배양턱뼈 부위를 다른 배아의 턱뼈원기 부위에서 치아가 없는 부위에 이식한 후 기관 배양을 실시하여 치아를 포함한 배양턱뼈를 재건하는 단계;

   배양턱뼈 부위를 결손된 턱뼈 부위로 이식하는 단계를 포함하는 생체 공학적 턱뼈 및 치아 재건 방법.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 턱뼈원기 부위나 구강상피를 분리하는 단계는, 배아에서 턱뼈원기 부위를 분리 채취하거나, 턱뼈원기의 구강상피 부위를 하부(mesenchyme)와 함께 분리채취하거나, 또는 턱뼈원기의 구강상피 부위를 하부의 간엽층(mesenchyme)과 분리하여 상피층과 간엽층을 각각 분리하여 각각을 혼합하여 쓸 수 있게 분리 채취하는 것을 특징으로 하는 생체 공학적 턱뼈 및 치아 재건 방법.
3. 제 1 항에 있어서,

   상기 배아의 분리부분에 성장인자나 필요한 조절인자를 삽입 또는 혼합하는 단계에서, 조절인자 즉 성장인자, 억제인자 등 부착분자 등 관련 분자 및 단백질을 비드(bead) 형태로 삽입하거나 혼합하여 배양함에 있어서, 비드는 37℃에서 30 내지 60분간 배양하여 사용하는 것을 특징으로 하는 생체 공학적 턱뼈 및 치아 재건 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 3차원적 기관배양을 실시하는 단계에서,

   분리한 기관이 배양액과 기체를 모두 접할 수 있도록 배양배지가 굴곡이 있게 하여 이중구조로 되어 내부와 외부가 분리되게 하고 내부에는 배양액을 넣고 그 위에 금속 그리드를 놓고 그 위에 배양액이 흡수 가능한 판을 놓고 그 판위에 분리한 기관을 놓아 기관이 배양액과 기체를 모두 접할 수 있게 하고, 배양배지 가장자리 외부에는 습도를 유지할 수 있는 액체를 넣을 수 있게 한 것으로, 기관을 배양액과 기체의 계면(medium-gas interface)에 위치시켜 영양분에 대한 접근이 용이한 동시에 기체 교환이 가능하도록 한 것을 특징으로 하는 생체 공학적 턱뼈 및 치아 재건 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 3차원적 기관배양을 실시하는 단계에서,

   분리한 기관조직을 밀리셀(Millicel, Millipore Corp., Billerica, USA)에 넣고 10% FBS를 포함한 D-MEM을 용매로 사용한 hydrogel(poly-N-isopropylacrylamide, NIPAM)로 포매한 후, 밀리셀을 10% FBS를 함유한 D-MEM이 담긴 배지에 부유시킨 상태로 섭씨 37도로 습도를 유지하며 배양하는 것을 특징으로 하는 생체 공학적 턱뼈 및 치아 재건 방법.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 생체내에서 기관배양을 실시하는 단계에서,

   분리한 조직이나 시험관내에서 배양한 조직을 그 조직의 동물과 면역반응이 없는 동물의 콩팥(kidney capsule), 복강망(omentum), 구강낭(buccal pouch), 두개골 두피의 골막 하부나 피하부위, 안구 속, 또는 등이나 배의 피하 부위 내에 넣어 생체 내에서 배양하는 것을 특징으로 하는 생체 공학적 턱뼈 및 치아 재건 방법.
7. 제 1 항에 있어서, 상기 배양 턱뼈 부위를 결손된 턱뼈 부위로 이식하는 단계에서, 필요한 치아부위를 주변골과 함께 결손된 턱뼈부위로 이식하여 정확히 맞추어 고정하거나, 철사나 금속 또는 흡수성 뼈 고정재로 고정하는 것을 특징으로 하는 생체 공학적 턱뼈 및 치아 재건 방법.
8. 제 1 항에 있어서,

   상기 조절인자 중 치아 교두 발달과 주변 골 형성 촉진을 위한 골형성 단백이 BMP-4로 처리되는 것을 특징으로 하는 생체 공학적 턱뼈 및 치아 재건 방법.
9. 제 1 항에 있어서,

   상기 조절인자 중 테나신(Tenascin)으로 처리함으로써 치아의 상아질 발달과 치수부위 및 주변 골 형성을 촉진하는 것을 특징으로 하는 생체 공학적 턱뼈 및 치아 재건 방법.
10. 인간을 제외한 치아가 있는 포유류 동물 배아의 턱뼈원기 부위나 구강상피를 분리 채취하는 단계;

    상기 배아의 분리부분에 성장인자나 필요한 조절인자를 삽입 또는 혼합하는 단계;

    상기 배아의 분리부분을 시험관내(in vitro)에서 3차원적 기관배양을 실시하는 단계;

    상기 배아의 분리부분을 생체 내에서 기관배양을 실시하는 단계;

    배양된 치아를 치아가 없는 턱뼈 부위로 이식하는 단계를 포함하는 생체 공학적 치아 제조 및 치아 재건 방법.

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