JP2008543301A5 - - Google Patents
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Description
本発明は、APCの適切な選択および成熟を誘導し、最終的に効果的な特異的CTL応答をもたらし得る、TLR4発現細胞へ抗原送達のための理論的手段としての、TLR4に対する潜在的な天然リガンドであるフィブロネクチン・エクストラ・ドメインA(EDA)に関する。フィブロネクチン分子は、１つの遺伝子産物であって、得られる該タンパク質は、一つの前駆体mRNAの選択的スプライシングから生じる複数の形態で存在できる(Pankov R and Kenneth MY, "Fibronectin at a glance". Journal of Cell Science, 2002; 115:3861 3863)。スプライシングの主なタイプは、タイプIIIリピートの中心的な型において認められる。エキソン用法またはスキッピングは、２つのタイプIIIリピートのいずれかの包含または排除に導く：エクストラドメインB(EDB、EIIIBまたはEDIIとも呼ばれる)、およびエクストラドメインA(EDA、EIIIAまたはEDIとも呼ばれる)。選択的スプライシングによるEDAおよびEDBを含有する細胞性フィブロネクチンは組織損傷への応答の際に産生される。他の生物学機能のなかの一つには、EDAはプロテオグリカン放出およびメタロプロテイナーゼ(MMP1、3および9)および炎症誘発性サイトカインの発現を誘導することが示されている(Saito S et al. "フィブロネクチンエクストラドメインAはマトリックスメタロプロテイナーゼ遺伝子発現をインターロイキン-1依存機構により誘導する", J. Biol. Chem. 1999; 161:3071-3076を参照されたい)。EDAはTLR4を活性化し、LPS様応答を誘導できることも示されている(Okamura Y et al.,"フィブロネクチンのエクストラドメインAはトル様受容体4を活性化する", J. Biol. Chem. 2001; 276:10229-10233)。
本発明の目的とする他の特定の実現において、目的とする該分子は、タンパク質性ベクターと化学的または遺伝子的に結合された化学物質または薬物である。このように該タンパク質性ベクターは、TLR4発現細胞への特異的な薬物標的化に有用である。
タンパク質性ベクターに導入したEDAドメインは、TLR4に結合すること、さらにTLR4発現細胞のサイトゾルへの目的とする分子輸送を促進することを特徴とする。
実施例２．EDA含有融合タンパク質はイン・ビトロおよびイン・ビボで樹状細胞成熟を誘導し、細胞傷害性Tリンパ球の誘導を可能にする
2.1 材料および方法
2.1.1. 骨髄由来樹状細胞産生
樹状細胞を骨髄細胞から生育させた。ACK溶菌緩衝液をもちいて赤血球を溶菌した後に、細胞を洗浄し、次にCD4 (GK1; ATCC, Manassas, VA)、CD8(53.6.72; ATCC)、Ly-6G/Gr1(BD-Pharmingen; Sandiego CA)およびCD45R/B220 (BD-Pharmingen)に対する抗体の混合物とのインキュベーションにより、その後にウサギ補体によってリンパ球および顆粒球を枯渇させた。残存細胞を、mGM-CSF（20 ng/ml）およびmIL-4（20 ng/ml）(Peprotech; London, UK両方)を有する強化完全培地中で、12-ウェルプレートにおいて、106細胞/mlで生育させた。２日毎に、培地をサイトカイン含有する新規培地で置換した。非付着性樹状細胞を、7日で収穫し、37℃および5%CO2で、LPS(Sigma)（1μg/mlまたは15ng/ml）、EDA-SIINFEKL (500 nM)またはSIINFEKL (10μM)の存在または非存在下で培養した。幾つかの実験において、ポリミキシン(10μg/ml)を培養物に加え、エンドトキシン汚染物質の影響を阻害する。24時間培養後、上清を回収し、IL-12およびTNF-αを、生成者指示書に従ってELISA(BD-Pharmingen)によって測定した。
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2.1.1. 骨髄由来樹状細胞産生
樹状細胞を骨髄細胞から生育させた。ACK溶菌緩衝液をもちいて赤血球を溶菌した後に、細胞を洗浄し、次にCD4 (GK1; ATCC, Manassas, VA)、CD8(53.6.72; ATCC)、Ly-6G/Gr1(BD-Pharmingen; Sandiego CA)およびCD45R/B220 (BD-Pharmingen)に対する抗体の混合物とのインキュベーションにより、その後にウサギ補体によってリンパ球および顆粒球を枯渇させた。残存細胞を、mGM-CSF（20 ng/ml）およびmIL-4（20 ng/ml）(Peprotech; London, UK両方)を有する強化完全培地中で、12-ウェルプレートにおいて、106細胞/mlで生育させた。２日毎に、培地をサイトカイン含有する新規培地で置換した。非付着性樹状細胞を、7日で収穫し、37℃および5%CO2で、LPS(Sigma)（1μg/mlまたは15ng/ml）、EDA-SIINFEKL (500 nM)またはSIINFEKL (10μM)の存在または非存在下で培養した。幾つかの実験において、ポリミキシン(10μg/ml)を培養物に加え、エンドトキシン汚染物質の影響を阻害する。24時間培養後、上清を回収し、IL-12およびTNF-αを、生成者指示書に従ってELISA(BD-Pharmingen)によって測定した。
3.3. 考察
前記結果に示したように、EDAタンパク質は、OVAタンパク質からのSIINFEKLエピトープをTLR4分子発現細胞に標的化するための有用なベクターとして機能し、それらの免疫原性を増強出来る。より高分子のタンパク質の免疫原性を増強するEDAの能力を評価するために、我々は、完全なOVA(397個のアミノ酸)を含有するEDA-OVA 融合組換えタンパク質およびC型肝炎ウイルスからのNS3タンパク質のプロテアーゼ活性を有するフラグメントを含有するEDA-NS3タンパク質を構築した。
前記結果に示したように、EDAタンパク質は、OVAタンパク質からのSIINFEKLエピトープをTLR4分子発現細胞に標的化するための有用なベクターとして機能し、それらの免疫原性を増強出来る。より高分子のタンパク質の免疫原性を増強するEDAの能力を評価するために、我々は、完全なOVA(397個のアミノ酸)を含有するEDA-OVA 融合組換えタンパク質およびC型肝炎ウイルスからのNS3タンパク質のプロテアーゼ活性を有するフラグメントを含有するEDA-NS3タンパク質を構築した。
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