JP2008536521A - K−252aの発酵肉汁抽出物 - Google Patents
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Abstract
親発酵肉汁の細胞塊からK−252aを分離する方法が開示される。
Description
本発明は、親発酵肉汁からK−252aを分離する方法に関する。
本明細書においてK−252aとされる化合物は、医薬として有用な化合物の合成における中間体である。しかしながら、K−252aの大量生産では、それが親発酵肉汁の細胞塊から容易に分離できないことが障害となっている。従って、K−252aをそれの親発酵肉汁の細胞塊から分離する方法が、工程および治療の業界において現在も必要とされている。
従って本発明の1実施形態は、K−252aをそれの親発酵肉汁の細胞塊から分離する方法において、
(a)親発酵肉汁を提供する段階であって、前記親発酵肉汁が水および細胞塊を含み、前記細胞塊が細胞内または細胞外K−252aを伴っている段階;
(b)前記親発酵肉汁およびK−252aが溶解度を有し前記親発酵肉汁が実質的に分離可能な乳濁液を形成する溶媒を混合し、抽出物を単離する段階であって、前記抽出物が前記溶媒、水およびK−252aを含む段階;および
(c)前記溶媒で段階(b)を繰り返すか繰り返さず、そして前記K−252aを単離する段階
を有することを特徴とする方法に関するものである。
(a)親発酵肉汁を提供する段階であって、前記親発酵肉汁が水および細胞塊を含み、前記細胞塊が細胞内または細胞外K−252aを伴っている段階;
(b)前記親発酵肉汁およびK−252aが溶解度を有し前記親発酵肉汁が実質的に分離可能な乳濁液を形成する溶媒を混合し、抽出物を単離する段階であって、前記抽出物が前記溶媒、水およびK−252aを含む段階;および
(c)前記溶媒で段階(b)を繰り返すか繰り返さず、そして前記K−252aを単離する段階
を有することを特徴とする方法に関するものである。
別の実施形態は、K−252aをそれの親発酵肉汁の細胞塊から分離する方法において、
(a)親発酵肉汁を提供する段階であって、前記親発酵肉汁が水および細胞塊を含み、前記細胞塊が細胞内または細胞外K−252aを伴っている段階;
(b)前記親発酵肉汁およびK−252aが溶解度を有し前記親発酵肉汁が実質的に分離可能な乳濁液を形成する溶媒を混合し、抽出物を単離する段階であって、前記抽出物が前記溶媒、水およびK−252aを含む段階;および
(c)前記肉汁からの単離抽出物で段階(b)を繰り返すか繰り返さず、そして前記K−252aを単離する段階
を有することを特徴とする方法に関するものである。
(a)親発酵肉汁を提供する段階であって、前記親発酵肉汁が水および細胞塊を含み、前記細胞塊が細胞内または細胞外K−252aを伴っている段階;
(b)前記親発酵肉汁およびK−252aが溶解度を有し前記親発酵肉汁が実質的に分離可能な乳濁液を形成する溶媒を混合し、抽出物を単離する段階であって、前記抽出物が前記溶媒、水およびK−252aを含む段階;および
(c)前記肉汁からの単離抽出物で段階(b)を繰り返すか繰り返さず、そして前記K−252aを単離する段階
を有することを特徴とする方法に関するものである。
さらに別の実施形態は、K−252aをそれの親発酵肉汁の細胞塊から分離する方法において、
(a)親発酵肉汁から単離細胞塊を提供する段階であって、前記単離細胞塊が水および細胞内または細胞外K−252aを伴うものである段階;
(b)前記細胞塊およびK−252が溶解度を有する溶媒を混合し、抽出物を単離する段階であって、前記抽出物が前記溶媒、水およびK−252aを含む段階;および
(c)前記溶媒で段階(b)を繰り返すか繰り返さず、そして前記K−252aを単離する段階
を有することを特徴とする方法に関するものである。
(a)親発酵肉汁から単離細胞塊を提供する段階であって、前記単離細胞塊が水および細胞内または細胞外K−252aを伴うものである段階;
(b)前記細胞塊およびK−252が溶解度を有する溶媒を混合し、抽出物を単離する段階であって、前記抽出物が前記溶媒、水およびK−252aを含む段階;および
(c)前記溶媒で段階(b)を繰り返すか繰り返さず、そして前記K−252aを単離する段階
を有することを特徴とする方法に関するものである。
さらに別の実施形態は、K−252aをそれの親発酵肉汁の細胞塊から分離する方法において、
(a)親発酵肉汁から単離細胞塊を提供する段階であって、前記単離細胞塊が水および細胞内または細胞外K−252aを伴うものである段階;
(b)前記細胞塊およびK−252が溶解度を有する溶媒を混合し、抽出物を単離する段階であって、前記抽出物が前記溶媒、水およびK−252aを含む段階;および
(c)前記肉汁からの単離抽出物で段階(b)を繰り返すか繰り返さず、そして前記K−252aを単離する段階
を有することを特徴とする方法に関するものである。
(a)親発酵肉汁から単離細胞塊を提供する段階であって、前記単離細胞塊が水および細胞内または細胞外K−252aを伴うものである段階;
(b)前記細胞塊およびK−252が溶解度を有する溶媒を混合し、抽出物を単離する段階であって、前記抽出物が前記溶媒、水およびK−252aを含む段階;および
(c)前記肉汁からの単離抽出物で段階(b)を繰り返すか繰り返さず、そして前記K−252aを単離する段階
を有することを特徴とする方法に関するものである。
さらに別の実施形態は、前記のいずれかの方法によって製造されるK−252aに関するものである。
本明細書で使用される「K−252a」という用語は、下記式(I)を有する化合物を意味する。
本発明に関して、K−252aには、(1R,2S,4R)−2,4−(6,7,12,13−テトラヒドロ−5H−インドロ[2,3−a]ピロロ[3,4−c]カルバゾール−5−オンジイル)−1−ヒドロキシ−2−メチルテトラヒドロフランカルボン酸メチルという名称が割り当てられている。
K−252aは、乾癬または急性骨髄性白血病の治療において有用であり得る下記式(II)および式(III)を有する化合物の合成における有用な中間体である。
親発酵肉汁は、1kg当たり約1g〜4gのK−252aを含むことが認められている。親発酵肉汁の細胞塊からK−252aを分離するのが困難なことは、文献で報告されている(Biosci. Biotechnol. Biochem., 62(8), 1627-1629, 1998)。理論に拘束されるものではないが、その困難さは、少なくとも一部において、肉眼で観察できる界面層の形成を妨害する実質的に分離できない乳濁液の形成によるものであると考えられている。従って、本明細書で使用される「実質的に分離可能な乳濁液」という表現は、それぞれ肉眼観察可能な界面層または層を有する2以上の相を意味する。本明細書で使用される「界面層」という用語は、2以上の本質的に不混和性の溶媒の混合物中でそれらの溶媒が出会う箇所を意味する。
本明細書で使用される「溶媒」という用語は、液体物質または複数の液体物質の混合物を意味する。本発明の実施における溶媒の例には、アセトン、エタノール、イソプロパノール、メタノール、酢酸エチル、メチルテトラヒドロフラン(MTHF)、酢酸メチル、それらの混合物および前記のものと水の混合物などがあるが、それらに限定されるものではない。
理解すべき点として、多くの溶媒が不純物を含むことから、不純物が存在する場合、本発明の実施における溶媒中の不純物のレベルは、それらを含む溶媒の所期の用途をそれらが妨害しないだけの低濃度である。
さらに理解すべき点として、本質的に不混和性の溶媒の混合物の場合、一つの溶媒が別の溶媒中に若干可溶である可能性があるが、肉眼観察可能な界面層が形成される上で十分な溶媒間の溶解度差がある。
表1は、22℃での各種溶媒中のK−252aの溶解度を示している。
親発酵肉汁が実質的に分離可能な乳濁液を形成する一つの液体物質で親発酵肉汁を抽出する場合に、本発明の実施において好ましい溶媒には、メチルテトラヒドロフランおよび酢酸メチルなどがあるがこれらに限定されるものではない。
親発酵肉汁が実質的に分離可能な乳濁液を形成する複数の液体物質の混合物で親発酵肉汁を抽出する場合に、本発明の実施において好ましい溶媒には、THF、メタノール、エタノールまたはイソプロパノールと組み合わせた酢酸エチルまたは酢酸イソプロピルなどがあるがこれらに限定されるものではない。
本発明の方法の際に、実質的に細胞塊の凝集、単離および除去を含む段階を用いて、K−252aの抽出、単離または精製を容易にすることができる。細胞塊の凝集、単離または除去は、限外濾過膜を用いたり、または遠心および傾斜法除去によって行うことができる。これらの技術のいずれかを親発酵肉汁について用いる場合、少量の残留水および細胞内または細胞外K−252aを伴う単離細胞塊を得ることができる。親発酵肉汁の抽出に代えて単離細胞塊を抽出する利点は、その場合には、より広い範囲の溶媒を使用可能であるという点である。
例えば、肉汁/溶媒比が約1:≦1での酢酸エチル、酢酸イソプロピルまたはTHFによる親発酵肉汁の単独抽出では、分離できない乳濁液が形成された。しかしながら同じ肉汁/溶媒比でのTHF、メタノール、エタノールまたはイソプロパノールと組み合わせた酢酸エチルまたは酢酸イソプロピルによって、肉汁/溶媒比約1:2で酢酸メチル単独での場合のように、実質的に分離可能な乳濁液が得られた。
最終肉汁/溶媒比が約1:8での酢酸メチルによる親発酵肉汁の連続2回抽出では、K−252aがほぼ定量的に回収されたが、より好ましい方法では、最初の抽出からの単離抽出物を、同じ親発酵肉汁の第2の抽出に用いて、同様の結果を得た。理論に拘束されるものではないが、第1の抽出物中の水がK−252aの溶解度を高めて、より好適な第2の抽出媒体を与えたと考えられる。
K−252aの単離は、溶媒除去によって行うことができ、それ以上の精製は行う場合と行わない場合がある。K−252aの精製は、濾過、再結晶、カラムクロマトグラフィーまたはそれらの組み合わせなどの当業界で公知の従来の手段によって行うことができる。
下記の実施例および表は、本発明の手順および概念的な態様の最も有用かつ容易に理解される説明であると考えられているものを提供するためのものである。
(実施例1)
酢酸メチルによる抽出
肉汁基準のパーセント
K−252aを含むノカルディオプシス(Nocardiopsis)種が産生した親発酵肉汁を酢酸メチル(体積比1:4)と混合し、第1の抽出物を単離した。肉汁を再度新鮮な酢酸メチルで抽出し(体積比1:4)、第2の抽出物を単離した。K−252aを含む別の親発酵肉汁を第1の抽出物と混合し、第3の抽出物を単離した。次に、第2の親発酵肉汁を第2の抽出物で抽出し、第4の抽出物を単離した。これらの4つの抽出物を用いて各肉汁を再抽出し、合わせ、ブラインで2回洗浄し、濃縮した。
酢酸メチルによる抽出
肉汁基準のパーセント
K−252aを含むノカルディオプシス(Nocardiopsis)種が産生した親発酵肉汁を酢酸メチル(体積比1:4)と混合し、第1の抽出物を単離した。肉汁を再度新鮮な酢酸メチルで抽出し(体積比1:4)、第2の抽出物を単離した。K−252aを含む別の親発酵肉汁を第1の抽出物と混合し、第3の抽出物を単離した。次に、第2の親発酵肉汁を第2の抽出物で抽出し、第4の抽出物を単離した。これらの4つの抽出物を用いて各肉汁を再抽出し、合わせ、ブラインで2回洗浄し、濃縮した。
注:抽出は、肉汁および酢酸メチルを混合し、沈降(重力)または遠心後に抽出物を単離することで行うことができる。
濃縮物をメチルテトラヒドロフラン(1.0:0.067(重量比))に溶かし、その溶液をFILTROL(登録商標)(1.0:0.0017(重量比))で処理し、70℃で少なくとも15分間攪拌し、濾過し、濃縮した。濃縮物のメタノール溶液(1.0:0.03(重量比))を少なくとも1時間還流させ、冷却して22℃とし、4時間攪拌し、濾過した。濾過物をメタノール(1.0:0.01(重量比))で洗浄し、60℃で16時間乾燥させて、K−252aの推定量の88%および94%を得た。
(実施例2)
メチルテトラヒドロフランによる抽出
肉汁基準のパーセント
K−252aを含む親発酵肉汁を遠心および傾斜法分離した(その後、残った細胞塊を水で処理し(1:2重量比)、5分間攪拌し、遠心し、傾斜法分離しても良い)。残りの細胞塊をメチルテトラヒドロフラン(1:1.25(重量比))で5分間抽出し、遠心し、傾斜法分離し、この手順を繰り返した。合わせた抽出物をブライン(1:0.375(重量比))で2回洗浄し、FILTROL(登録商標)フィルター助剤(1:0.0025(重量比))で処理し、70℃で15分間攪拌し、熱濾過し、濃縮した。濃縮物のメタノール溶液(1.0:0.03(重量比))を1時間還流し、冷却して22℃とし、4時間攪拌し、濾過した。濾過物をメタノール(1.0:0.01(重量比))で洗浄し、60℃で16時間乾燥させて、K−252aの推定量の100%を得た。
メチルテトラヒドロフランによる抽出
肉汁基準のパーセント
K−252aを含む親発酵肉汁を遠心および傾斜法分離した(その後、残った細胞塊を水で処理し(1:2重量比)、5分間攪拌し、遠心し、傾斜法分離しても良い)。残りの細胞塊をメチルテトラヒドロフラン(1:1.25(重量比))で5分間抽出し、遠心し、傾斜法分離し、この手順を繰り返した。合わせた抽出物をブライン(1:0.375(重量比))で2回洗浄し、FILTROL(登録商標)フィルター助剤(1:0.0025(重量比))で処理し、70℃で15分間攪拌し、熱濾過し、濃縮した。濃縮物のメタノール溶液(1.0:0.03(重量比))を1時間還流し、冷却して22℃とし、4時間攪拌し、濾過した。濾過物をメタノール(1.0:0.01(重量比))で洗浄し、60℃で16時間乾燥させて、K−252aの推定量の100%を得た。
(実施例3A)
アセトンによる抽出
肉汁基準のパーセント
K−252aを含む親発酵肉汁を遠心および傾斜法分離した(その後、残った細胞塊を水で処理し(1:2重量比)、5分間攪拌し、遠心し、傾斜法分離しても良い)。残りの細胞塊をアセトン(1:1.05(重量比))で5分間抽出し、遠心し、傾斜法分離し、この手順を繰り返した。合わせた抽出物をFILTROL(登録商標)(1:0.002(重量比))で処理し、22℃で15分間攪拌し、濾過し、濃縮して、最初の容量の約2/10とした。メタノール(1:0.05(重量比))を加え、蒸留することで最初の容量とすることによって、残ったアセトンを除去した。濃縮物をメタノール(1:0.1(重量比))で処理し、70℃で1時間、次に22℃で4時間攪拌し、濾過し、水またはメタノールで洗浄し(1:0.02(重量比))、風乾して、湿ケーキを得た。
アセトンによる抽出
肉汁基準のパーセント
K−252aを含む親発酵肉汁を遠心および傾斜法分離した(その後、残った細胞塊を水で処理し(1:2重量比)、5分間攪拌し、遠心し、傾斜法分離しても良い)。残りの細胞塊をアセトン(1:1.05(重量比))で5分間抽出し、遠心し、傾斜法分離し、この手順を繰り返した。合わせた抽出物をFILTROL(登録商標)(1:0.002(重量比))で処理し、22℃で15分間攪拌し、濾過し、濃縮して、最初の容量の約2/10とした。メタノール(1:0.05(重量比))を加え、蒸留することで最初の容量とすることによって、残ったアセトンを除去した。濃縮物をメタノール(1:0.1(重量比))で処理し、70℃で1時間、次に22℃で4時間攪拌し、濾過し、水またはメタノールで洗浄し(1:0.02(重量比))、風乾して、湿ケーキを得た。
(実施例3B)
湿ケーキ基準のパーセント
前記湿ケーキを25%(重量基準)メタノール/アセトン(1:20(重量比))およびFILTROL(登録商標)(1:0.5(重量比))で処理し、得られたスラリーを1時間還流し、熱濾過し、25%(重量比)メタノール/アセトン(1:5(重量比))で洗浄し、濃縮して半分の容量とし、メタノール(1:10(重量比))で処理し、1時間還流し、冷却して22℃とし、4時間攪拌し、濾過した。濾過物をメタノール(1:5(重量比))で洗浄し、60℃〜65℃で16時間真空乾燥して、K−252aの推定量の95%を得た。
湿ケーキ基準のパーセント
前記湿ケーキを25%(重量基準)メタノール/アセトン(1:20(重量比))およびFILTROL(登録商標)(1:0.5(重量比))で処理し、得られたスラリーを1時間還流し、熱濾過し、25%(重量比)メタノール/アセトン(1:5(重量比))で洗浄し、濃縮して半分の容量とし、メタノール(1:10(重量比))で処理し、1時間還流し、冷却して22℃とし、4時間攪拌し、濾過した。濾過物をメタノール(1:5(重量比))で洗浄し、60℃〜65℃で16時間真空乾燥して、K−252aの推定量の95%を得た。
(実施例4)
酢酸エチル/エタノール混合物による抽出
K−252aを含む親発酵肉汁(100mL;肉汁力価:1.42mg/mL)を酢酸エチル(10mL)/エタノール(50mL)で抽出し、次に酢酸エチル(70mL)/エタノール(10mL)で2回抽出して、それぞれK−252a(HPLC)を82%、15%および3%含む抽出物を得た。抽出物を合わせ、ハイフロ(hyflo)層で濾過し、濃縮してほぼ乾固させた。濃縮物をメタノール(6mL)で処理し、冷却して室温とし、濾過した。濾過物を最少量のメタノールで洗浄し、60℃で真空乾燥してK−252aを得た(136mg)。
酢酸エチル/エタノール混合物による抽出
K−252aを含む親発酵肉汁(100mL;肉汁力価:1.42mg/mL)を酢酸エチル(10mL)/エタノール(50mL)で抽出し、次に酢酸エチル(70mL)/エタノール(10mL)で2回抽出して、それぞれK−252a(HPLC)を82%、15%および3%含む抽出物を得た。抽出物を合わせ、ハイフロ(hyflo)層で濾過し、濃縮してほぼ乾固させた。濃縮物をメタノール(6mL)で処理し、冷却して室温とし、濾過した。濾過物を最少量のメタノールで洗浄し、60℃で真空乾燥してK−252aを得た(136mg)。
(実施例5)
酢酸イソプロピル/イソプロパノールによる抽出
K−252aを含有する親発酵肉汁(100mL;肉汁力価:1.42mg/mL)を酢酸イソプロピル(90mL)/イソプロパノール(50mL)で抽出し、次に酢酸イソプロピル(80mL)/イソプロパノール(20mL)で2回抽出して、それぞれK−252a(HPLC)を78%、11%および11%含む抽出物を得た。抽出物を合わせ、ハイフロ層で濾過し、濃縮してほぼ乾固させた。残留物をテトラヒドロフラン(20mL)に溶かし、ハイフロ層で濾過し、濃縮してほぼ乾固させた。濃縮物をメタノール(5mL)で処理し、冷却して室温とし、濾過した。濾過物をメタノール(4mL)で洗浄し、60℃で真空乾燥してK−252aを得た(147mg)。
酢酸イソプロピル/イソプロパノールによる抽出
K−252aを含有する親発酵肉汁(100mL;肉汁力価:1.42mg/mL)を酢酸イソプロピル(90mL)/イソプロパノール(50mL)で抽出し、次に酢酸イソプロピル(80mL)/イソプロパノール(20mL)で2回抽出して、それぞれK−252a(HPLC)を78%、11%および11%含む抽出物を得た。抽出物を合わせ、ハイフロ層で濾過し、濃縮してほぼ乾固させた。残留物をテトラヒドロフラン(20mL)に溶かし、ハイフロ層で濾過し、濃縮してほぼ乾固させた。濃縮物をメタノール(5mL)で処理し、冷却して室温とし、濾過した。濾過物をメタノール(4mL)で洗浄し、60℃で真空乾燥してK−252aを得た(147mg)。
表2、表3および表4に、他の抽出方法の結果をまとめてある。
以上の内容は本発明を説明するためのものであって、本発明を開示の実施形態に限定するものではない。当業者には自明である改変および変更は、特許請求の範囲で定義の本発明の範囲および性質の範囲内であるものとする。
Claims (10)
- K−252aをそれの親発酵肉汁の細胞塊から分離する方法において、
(a)親発酵肉汁を提供する段階であって、前記親発酵肉汁が水および細胞塊を含み、前記細胞塊が細胞内または細胞外K−252aを伴っている段階;
(b)前記親発酵肉汁およびK−252aが溶解度を有し前記親発酵肉汁が実質的に分離可能な乳濁液を形成する溶媒を混合し、抽出物を単離する段階であって、前記抽出物が前記溶媒、水およびK−252aを含む段階;および
(c)前記溶媒で段階(b)を繰り返すか繰り返さず、そして前記K−252aを単離する段階
を有することを特徴とする方法。 - 前記溶媒がアセトン、酢酸メチル、メチルテトラフランまたはそれらの混合物である請求項1に記載の方法。
- 前記溶媒が酢酸メチルである請求項2に記載の方法。
- 前記溶媒がメチルテトラヒドロフランである請求項2に記載の方法。
- 前記溶媒がアセトンである請求項2に記載の方法。
- K−252aをそれの親発酵肉汁の細胞塊から分離する方法において、
(a)親発酵肉汁を提供する段階であって、前記親発酵肉汁が水および細胞塊を含み、前記細胞塊が細胞内または細胞外K−252aを伴っている段階;
(b)前記親発酵肉汁および酢酸メチルを混合し、抽出物を単離する段階であって、前記抽出物が前記酢酸メチル、水およびK−252aを含む段階;および
(c)前記肉汁からの単離抽出物で段階(b)を繰り返すか繰り返さず、そして前記K−252aを単離する段階
を有することを特徴とする方法。 - K−252aをそれの親発酵肉汁の細胞塊から分離する方法において、
(a)親発酵肉汁を提供する段階であって、前記親発酵肉汁が水および細胞塊を含み、前記細胞塊が細胞内または細胞外K−252aを伴っている段階;
(b)前記親発酵肉汁およびメチルテトラヒドロフランを混合し、抽出物を単離する段階であって、前記抽出物が前記酢酸メチル、水およびK−252aを含む段階;および
(c)前記肉汁からの単離抽出物で段階(b)を繰り返すか繰り返さず、そして前記K−252aを単離する段階
を有することを特徴とする方法。 - K−252aをそれの親発酵肉汁の細胞塊から分離する方法において、
(a)親発酵肉汁を提供する段階であって、前記親発酵肉汁が水および細胞塊を含み、前記細胞塊が細胞内または細胞外K−252aを伴っている段階;
(b)前記親発酵肉汁およびアセトンを混合し、抽出物を単離する段階であって、前記抽出物が前記酢酸メチル、水およびK−252aを含む段階;および
(c)前記肉汁からの単離抽出物で段階(b)を繰り返すか繰り返さず、そして前記K−252aを単離する段階
を有することを特徴とする方法。 - K−252aをそれの親発酵肉汁の細胞塊から分離する方法において、
(a)親発酵肉汁から単離細胞塊を提供する段階であって、前記単離細胞塊が、水および細胞内または細胞外K−252aを伴っている段階;
(b)前記細胞塊およびK−252aが溶解度を有する溶媒を混合し、抽出物を単離する段階であって、前記抽出物が前記溶媒、水およびK−252aを含む段階;および
(c)前記溶媒で段階(b)を繰り返すか繰り返さず、そして前記K−252aを単離する段階
を有することを特徴とする方法。 - K−252aをそれの親発酵肉汁の細胞塊から分離する方法において、
(a)親発酵肉汁から単離細胞塊を提供する段階であって、前記単離細胞塊が、水および細胞内または細胞外K−252aを伴っている段階;
(b)前記細胞塊およびK−252aが溶解度を有する溶媒を混合し、抽出物を単離する段階であって、前記抽出物が前記溶媒、水およびK−252aを含む段階;および
(c)前記単離抽出物で段階(b)を繰り返すか繰り返さず、そして前記K−252aを単離する段階
を有することを特徴とする方法。
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