JP2008532949A - ヒト化ｌ２４３抗体 - Google Patents

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Abstract

ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合するヒト化抗体類が提供される。本抗体類は、マウスモノクローナル抗体Ｌ２４３によって認識されるエピトープを認識する。そのような抗体、そのような抗体を含む薬学的組成物を調製するため、およびそのような抗体の臨床治療および診断、ならびに研究に関連した使用のための方法が提供される。

Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下、２００５年３月３日に提出された、米国特許仮出願明第６０／６５７，６９５号の優先権を主張する。前記出願は、すべての目的のために、その全体が参考により本明細書に組み込まれる。
［発明の分野］
本発明は、マウスモノクローナル抗体Ｌ２４３によって認識されるエピトープに対するヒト化抗体に関する。１つの実施形態において、本発明は、そのような抗体を調製するためおよび使用するための組成物および方法に関する。特に、本発明は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）のＨＬＡ遺伝子クラスターのＤ領域中でコードされたヒト白血球抗原（ＨＬＡ）またはＨＬＡ−ＤＲとして知られているものに対して特異的な、ヒト化モノクローナル抗体ｈＬ２４３を提供する。抗体は、ＨＬＡ−ＤＲ+細胞の増殖を阻害し、ＴＮＦ分子の発現および放出を誘導する。
ヒトにおいて、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）は、第６染色体上のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子クラスターであり、Ｄ、Ｂ、ＣおよびＡと呼ばれる領域に分けられる。Ｄ領域には、クラスＩＩタンパク質に対する遺伝子が含まれ、免疫系の細胞間の協調および相互作用に関与する。Ｄ領域は、ほとんどの自己免疫疾患を含む多くの疾患に関与している。
１つの抗体、Ｌ２４３（以下ｍＬ２４３）は、マウスＩｇＧ２ａ抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体である。この抗体は、マウスＨＬＡ遺伝子のＤ領域を標的化することによって自己免疫疾患のような疾患の処置において使用される可能性があり得る。ｍＬ２４３は、インビトロ免疫機能の強力な抑制を示し、すべてのＨＬＡ−ＤＲに対して単型（ｍｏｎｏｍｏｒｐｈｉｃ）である。しかしながら、ヒト患者に対するマウス抗体の投与によって、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答の誘導のような問題が存在する。ヒト対象に投与し得る、ｍＬ２４３の抗原特異性を有する抗体に対する必要性が存在する。
本発明の１つの実施形態は、マウスモノクローナル抗体ｍＬ２４３によって認識されるエピトープに対する特異性を有する組換えヒト化抗体分子を提供する。このエピトープは、ＤＲα鎖に依存する抗原決定であり得る。本実施形態にしたがって、抗体は、ヒト化ＣＤＲ移植抗体であり得る。
たとえば、１つの実施形態において、マウスモノクローナル抗体ｍＬ２４３によって認識されるエピトープに対する特異性を有するヒト化抗体分子は、可変ドメインの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）が、マウスモノクローナル抗体ｍＬ２４３（ＭＡｂ Ｌ２４３）に由来し、このヒト化抗体分子の残りの免疫グロブリン由来部分が、ヒト免疫グロブリンまたはその類似体に由来する、抗原結合部位を有する。本発明の１つの特定の実施形態において、ヒト化抗体の３つの重鎖および軽鎖ＣＤＲのすべては、ｍＡｂ ｍＬ２４３に由来する。本発明の他の実施形態において、ヒト化抗体分子を、エフェクターまたはレポーター分子にコンジュゲートし得る。
１つの実施形態において、本発明は、可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域、および１つ以上のフレームワーク残基２７、３８、４６、６８および９１が、マウスモノクローナル抗体ｍＬ２４３重鎖からのものであり、免疫グロブリンフレームワークドメインの残りが、１つ以上のヒト重鎖からのものである、重鎖可変ドメインを有する、ヒト化Ｌ２４３抗体を提供する。本実施例にしたがって、抗体は、ＨＬＡ−ＤＲ+細胞上のＨＬＡ−ＤＲの少なくとも１つのエピトープに結合することができ、細胞の殺傷を増加させる。１つの特定の実施形態において、細胞殺傷は、細胞傷害性の追加物あるいは免疫学的エフェクター機構のいずれも殺傷のために必要としないで増加し得る。
本発明の他の実施形態において、ヒト化Ｌ２４３抗体は、可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域、および１つ以上のフレームワーク残基３７、３９、４８および４９が、マウスモノクローナル抗体ｍＬ２４３軽鎖からのものであり、免疫グロブリンフレームワークドメインの残りが、１つ以上のヒト軽鎖からのものである、軽可変ドメインを含み得る。本実施形態にしたがって、抗体は、ＨＬＡ−ＤＲ*細胞上のＨＬＡ−ＤＲの少なくとも１つのエピトープに結合することができ、細胞の殺傷を増加させる。１つの特定の実施形態において、細胞殺傷は、細胞傷害性の追加物あるいは免疫学的エフェクター機構のいずれも殺傷のために必要としないで増加し得る。
本発明の他の実施形態において、ヒト化Ｌ２４３抗体は、重鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域、および１つ以上のフレームワーク残基２７、３８、４６、６８および９１が、マウスモノクローナル抗体ｍＬ２４３重鎖からのものであり、免疫グロブリン重鎖フレームワークドメインの残りが、１つ以上のヒト重鎖からのものである、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含み得る。１つの特定の実施形態において、ヒト化Ｌ２４３抗体は、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域、および１つ以上のフレームワーク残基３７、３９、４８および４９が、マウスモノクローナル抗体ｍＬ２４３軽鎖からのものであり、免疫グロブリン軽鎖フレームワークドメインの残りが、１つ以上のヒト軽鎖からのものである、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含み得る。さらに、抗体はＨＬＡ−ＤＲ+細胞上ＨＬＡ−ＤＲの少なくとも１つのエピトープに結合することができ、細胞の殺傷を増加させる。１つの特定の実施形態において、細胞殺傷は、細胞傷害性の追加物あるいは免疫学的エフェクター機構のいずれも殺傷のために必要としないで増加し得る。
本発明の１つの実施形態において、上述したような抗体の任意の１つを、薬学的組成物中で使用し得る。本実施形態にしたがって、本明細書で記述した１つ以上の抗体を含む薬学的組成物は、さらに以下で記述されるような治療的薬剤を含み得る。
さらに、本発明における１つの実施形態によって、以下で記述されるような、１つ以上の開示された抗体組成物、コンジュゲート体および融合タンパク質をコードする核酸分子が提供される。これらの核酸を含む発現ベクターおよび宿主細胞も含まれ得る。
これらの実施形態にしたがって、抗体を産出するために好適な増殖培地中で培養した宿主細胞の使用などの、抗体を作成するための方法が含まれ得る。
本発明の１つの実施形態にしたがって、本発明で開示された抗体の１つ以上を、治療および／または診断目的のために薬学的組成物中で使用してもよい。たとえば、１つ以上の抗体を、処置を必要としている対象（たとえば自己免疫疾患のような免疫疾患を有する対象）に、治療的または薬学的組成物中で投与してもよい。
本発明のより特定の実施形態において、ヒト化Ｌ２４３抗体は、図４で示した配列を有する重鎖可変ドメイン、および／または図３で示した配列を有する軽鎖可変ドメインを有する。
他の実施形態において、薬学的組成物はさらに、ＣＤ４、ＣＤＳ、ＣＤＳ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ６６（ａ、ｂ、ｃ、ｄ）、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２６、ＣＤ１３８、ＣＤ１５４、Ｂ７、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１６、１ａ、ＨＭ１．２４、テネイシン、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、ＣＳＡｐ、ＩＬＧＦ、胎盤増殖因子、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＩＬ−６、ＳＩ００、ＭＡＲＴ−１、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ｇｐｌＯＯ、アミロイドおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される１つ以上の抗原に特異的に結合する、１つ以上の追加結合分子を含み、前記追加結合分子は、ヒト化Ｌ２４３抗体組成物および／または抗体のための送達媒体を含む、本明細書で開示された任意の薬学的組成物の前、一緒または後に投与される。
１つの実施形態において、そのような処置を必要とする対象に投与するために薬学的組成物は、ヒト化Ｌ２４３抗体および１つ以上のペプチド、脂質、重合化担体、ミセル、ナノ粒子、またはこれらの組み合わせ、および１つ以上のエフェクターを含んでよい。
本発明の開示方法の１つ以上を、限定はしないが、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性および慢性リンパ性白血病、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、急性および慢性骨髄性白血病Ｔ細胞リンパ腫および白血病、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、カルシノーマ、メラノーマ、サルコーマ、グリオーマおよび皮膚がんを含む疾患を処置するために使用してもよい。カルシノーマは、口腔、胃腸管、肺気管、乳、卵巣、前立腺、子宮、膀胱、膵臓、肝臓、胆嚢、皮膚および精巣のカルシノーマからなる群より選択され得る。さらに、１つ以上の開示された方法を、たとえば、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性紅斑性狼瘡、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、溶連菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、血栓血管炎血管内膜炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変症、橋本甲状腺炎、甲状腺機能亢進症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ヴェーゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、または線維化肺胞炎のような自己免疫疾患を処置するために使用してもよい。
１つの実施形態において、本発明の薬学的組成物を、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病または急性骨髄性白血病のような白血病を有する対象を処置するために使用してもよい。
１つの実施形態において、本発明の薬学的組成物を、アミロイドーシスのような代謝性疾患、アルツハイマー病のような神経変性疾患を有する対象を処置するために使用してもよい。さらに、本発明の薬学的組成物を、免疫調節不全疾病を有する対象を処置するために使用してもよい。
本発明の他の目的、特徴および利点が、以下の詳細な記述より明らかになる。しかしながら、詳細な記述および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示唆する一方で、本発明の精神および範囲の中での種々の変化および変更が、この詳細な記述から当業者に明らかになるので、例示の目的のみによって提供されると理解されるべきである。
以下の図面は、本発明の一部分を形成し、本発明の特定の実施形態をさらに例示することを意図している。実施形態は、本明細書で提示された特定の実施形態の詳細な記述との組み合わせで、１つ以上のこれらの図面を参照することによってより理解され得る。
以下のセクションにて、いくつかの方法が、本発明の様々な実施形態を詳細に説明するために記述されている。様々な実施形態の実施には、本明細書で概略された特定の詳細のすべて、またはそれらのいくつかを利用する必要はなく、濃度、時間および他の特定の詳細を、日常的な実験を介して改変し得ることが当業者に対して明らかであり得る。いくつかの場合、周知の方法または組成物は、様々な実施形態の不必要な遮蔽を防ぐために、本記述には含まれていない。
本発明の１つの実施形態において、ＨＬＡ−ＤＲに結合するヒト化マウス抗体が提供される。１つの特定の実施形態において、ＨＬＡ−ＤＲに結合するが、相当するマウス抗体と比較して免疫原性が減少した、ヒトｍＬ２４３抗体が提供され得る。本実施形態にしたがって、抗体が、リンパ腫細胞のようなＨＬＡ−ＤＲ分子を発現する細胞の増殖を阻害（または細胞殺傷を誘導）し得る。あるいは、本明細書で開示されている抗体を、標的分子に結合し、細胞殺傷の可能性を増加させるために使用してもよい。抗体を含む薬学的組成物、およびＨＬＡ−ＤＲ+細胞の増殖に関連した疾患を処置する方法が提供される。
ｍＬ２４３は、Ｌａｍｐｓｏｎ ＆ Ｌｅｖｙ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８０）１２５ ２９３）によってすでに記述されたモノクローナル抗体である。本抗体の軽鎖および重鎖可変領域のアミノ酸配列を図１および２（それぞれまた配列番号１および２）にて示している。ｍＬ２４３は、アクセッション番号ＡＴＣＣ ＨＢ５５で、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤにて寄託されている。
以下の記述において、多数の語句を使用し得、以下の定義が、本発明の理解を促進するために提供される。
他に特定しない限り、「ａ」または「ａｎ」は「１つ以上」を意味する。
本明細書において、記述「対象」は、限定はしないが、ヒト、またはたとえばイヌ、ネコ、フェレット、ウサギ、ブタ、ウマまたはウシのような哺乳動物を含み得る。
「抗体依存性細胞仲介性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃレセプターを発現する非特異的細胞傷害性細胞（ナチュラルキラー細胞、好中球およびマクロファージ）が、標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞仲介反応である。ＡＤＣＣを仲介するための初代細胞は、（ＦｃＤＲＩＩＩのみを発現する）ナチュラルキラー細胞および単球（ＦｃＤＲＩ、ＦｃＤＲＩＩおよびＦｃＤＲＩＩＩを発現する）である。
「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下での標的の溶解を指す。補体活性化経路は、補体系（Ｃｌｑ）の第一成分の、同起源抗原と複合体形成した分子（たとえば抗体）の結合によって開始される。
「Ｆｃレセプター」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記述するために使用される。ＣＤＣおよびＡＤＤＣ両方が、ＭＡｂのＦｃ部分を必要とし、ＡＤＤＣの効果が、エフェクター細胞上、ＦｃｙＲ（ＩｇＧ Ｆｃレセプター）に対する結合親和力の増加によって増大され得る（Ｓｈｉｎｋａｗａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６−３４７３，２００３；Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２１１：２６７３３−２６７４０，２００２；Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６６０４，２００２；Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７４：２８８−２９４，２００１；およびＵｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７６−１８０，１９９９）。「エフェクター細胞」は、エフェクター細胞機能を実施することが可能な任意の型の細胞を指す。異なる特定化免疫機能を有するエフェクター細胞を、結合ドメインポリペプチドが特異的に結合可能である、本明細書で記述した多くの抗原のような広く種々の細胞表面抗原のそれらの異なる発現に基づいて、互いに区別可能であることが周知である。エフェクター細胞には、限定はしないが、天然に、または遺伝子工学的な改変の結果として、免疫系機能の一成分である活性を直接調節できる能力を有する細胞を含む、任意の細胞が含まれる。エフェクター細胞は、免疫グロブリン定常領域に対するレセプターとしてのような免疫グロブリンに対する細胞表面レセプターを含み、「Ｆｃレセプター」（ＦｃＲ）として一般的に参照されるレセプターのクラスを含む。ＡＤＣＣを仲介可能な細胞が、エフェクター細胞の例である。他の例には、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、腫瘍浸潤Ｔリンパ球（ＴＩＬ）、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、およびアレルギー応答機構を含む細胞のような顆粒球細胞が含まれる。エフェクター細胞はまた、骨髄性およびリンパ系系列内での種々の分化の段階にある細胞を含む造血由来の細胞に影響を与え、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、好中球、好塩基球、好酸球、マスト細胞、血小板、赤血球、およびそのような細胞の前駆体、子孫（たとえば造血幹細胞）、休眠、活性化および成熟形態のような、１つ以上の型の機能的細胞表面ＦｃＲを（必要はないが）発現し得る。他のエフェクター細胞には、免疫機能を仲介可能な非造血起源の細胞、たとえば、上皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、骨芽細胞、内皮細胞および他の細胞が含まれ得る。免疫エフェクター細胞にはまた、細胞傷害性または細胞増殖抑制事象、エンドサイトーシス、食細胞、または飲細胞事象を仲介する、またはアポトーシスの誘導に影響を与える、または細菌免疫または細菌感染の中和に影響を与える細胞、またはアレルギー、炎症、過敏症および／または自己免疫反応を仲介する細胞が含まれる。
「増殖を阻害する」抗体は、インビトロおよび／またはインビボで疾患細胞の増殖を阻害するものである。疾患細胞の増殖を阻害することによって、Ｓ期の細胞の割合が減少する。本発明の抗体による増殖阻害の好ましい割合は、インビトロで約０．５μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬの抗体濃度で、そして約０．５ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇの成人患者における用量で、２０％を超える、好ましくは５０％を超えるものであり得る。
本明細書において、「抗体」は、全長（すなわち天然に存在するか、正常免疫グロブリン遺伝子断片の組換えステップによって形成される）免疫グロブリン分子（たとえばＩｇＧ抗体）、または抗体断片のような、免疫学的に活性な（すなわち特異的に結合している）免疫グロブリン分子の部分を指す。語句「抗体」にはまた、「ヒト化」抗体、およびファージディスプレイ、遺伝子およびクロモソームトランスフェクション法によって、ならびに他の方法によって産出可能である完全ヒト抗体も含まれる。本語句にはまた、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体（たとえば二重特異性抗体）も含まれる。
「免疫原性応答」または「抗原性応答」は、適切な細胞が化合物に接触した後に、結果としてその化合物に対する抗体を産出することである。免疫原性応答を誘発するために使用される化合物は、免疫原または抗原と呼ばれる。免疫原性応答にて産出された抗体は、応答を誘発するために使用した免疫原に特異的に結合する。
免疫原性応答を誘発するために使用される化合物は、免疫原または抗原と呼ばれる。「エピトープ」または「抗原性決定基」は、エピトープを指向する特異的免疫応答を刺激する免疫原の表面上の領域である。タンパク質、特に変性タンパク質において、エピトープは典型的には連続アミノ酸配列によって定義され、表される。しかしながら、未変性（ｎｏｎｄｅｎａｍｒｅｄ）タンパク質の場合、エピトープにはまた、タンパク質のアミノ酸配列の離れた部分からのアミノ酸が互いに近い物理的接触となるような様式で、タンパク質の三次元折りたたみによって形成される活性部位のような構造も含まれる。
天然に存在する（野生型）抗体分子は、４つのポリペプチド鎖、ジスルフィド結合によって互いに共有結合している２つの同一重鎖および２つの同一軽鎖からなるＹ型分子である。両方の型のポリペプチド鎖は、同一のクラスの抗体（すなわちＩｇＡ、ＩｇＭなど）内で変わらないか、または最小限変化した、定常領域および可変領域を有する。可変領域は、特定の抗体に対して固有であり、エピトープに対する認識要素を含む。重鎖および軽鎖両方のカルボキシ末端領域は、配列中で保存され、定常領域（またＣドメインとして知られている）と呼ばれる。アミノ末端領域（またＶドメインとして知られている）は配列中で変化し、抗体特異性に関連する。抗体は、そのＶドメイン中に局在する６つの短い相補性決定領域（ＣＤＲ）を主に介して特異的に抗原を認識し、結合する。
抗体の各軽鎖が１つの重鎖に結合し、２つの鎖が抗原結合ドメインを構築する各鎖のアミノ末端領域から遠位である各鎖のカルボキシ末端領域中のシステイン残基間で形成されたジスルフィド架橋によって連結する。抗体分子はさらに、重鎖および軽鎖間のジスルフィド架橋が形成される局所よりも重鎖のカルボキシ末端により近い局所の、ヒンジ領域として知られている領域において、２つの重鎖間のジスルフィド架橋によってさらに安定化される。ヒンジ領域はまた、抗体の抗原結合部分に関して柔軟性を提供する。
抗体の抗原結合特異性は、軽鎖および重鎖のアミノ末端領域に局在する可変領域によって決定可能である。軽鎖および関連した重鎖の可変領域が、特定のエピトープを認識する「抗原結合ドメイン」を形成し、したがって抗体は２つの抗原結合ドメインを有する。野生型抗体における抗原結合ドメインは、免疫原性タンパク質の同一のエピトープを指向し、したがって、単一野生型抗体は、免疫原性タンパク質の２つの分子に同時に結合可能である。したがって、野生型抗体は、単一特異性（すなわち固有の抗原を指向する）、および二価（すなわち抗原の２つの分子に結合可能である）である。
「ポリクローナル抗体」は、多くのエピトープを有するタンパク質に対する免疫原性応答にて産出される。したがってポリクローナル抗体の組成（たとえば血清）には、タンパク質内の同一および異なるエピトープを指向する種々の異なる抗体が含まれる。ポリクローナル抗体を産出するための方法は、当分野で公知である（たとえば、Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｃｔｉｏｎ ＩＩＩ ｏｆ Ｃｈａｐｔｅｒ １１ ｉｎ：Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２，ｐａｇｅｓ １１−３７ ｔｏ １１−４１を参照のこと）。
「抗ペプチド抗体」（また「単一特異性抗体」としても知られている）は、由来するタンパク質の２、３の（好ましくは１つの）単離エピトープに対応する短い（典型的には５〜２０アミノ酸）免疫原性ポリペプチドに対する体液性応答中で産出される。複数の抗ペプチド抗体には、タンパク質の特定の部分に、すなわち、少なくとも１つの、好ましくはただ１つのエピトープを含むアミノ酸配列に指向する種々の異なる抗体が含まれる。抗ペプチド抗体を産出するための方法は、当分野で公知である（たとえば、Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｃｔｉｏｎ ＩＩＩ ｏｆ Ｃｈａｐｔｅｒ １１ ｉｎ：Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２，ｐａｇｅｓ １１−４２ ｔｏ １１−４６を参照のこと）。
「モノクローナル抗体」は、免疫原性タンパク質の単一の特異的エピトープを認識する特異的抗体である。複数のモノクローナル抗体において、各抗体分子は、他の複数の抗体と同質である。モノクローナル抗体を単離するために、特定のモノクローナル抗体を発現、提示および／または分泌するクローン細胞系がまず同定される。このクローン細胞系は、本発明の抗体を産出する１つの方法において使用可能である。クローン細胞系の作製と、それによって発現されたモノクローナル抗体の調製のための方法は、当分野で公知である（たとえば、Ｆｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｃｔｉｏｎ ＩＩ ｏｆ Ｃｈａｐｔｅｒ １１ ｉｎ Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２，ｐａｇｅｓ １１−２２ ｔｏ １１−３６を参照のこと）。
「裸抗体」は、毒素との、または放射性核種に結合するためのキレートとの複合体のような、さらなる改変を含まない本来の抗体分子である。裸抗体のＦｃ部分によって、結果として細胞溶解となり得る活性の機構である補体固着およびＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）などのエフェクター機能が提供され得る。たとえば、Ｍａｒｋｒｉｄｅｓ，「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ」，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５０：５９−８７，１９９８を参照のこと。１つの実施形態において、抗体の治療活性は、Ｆｃ領域のエフェクター機能を必要とし得る（たとえば、Ｇｏｌａｙ ｅｔ ａｌ．，「Ｂｉｏｌｏｇｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ Ｂ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ａｎｔｉ−ＣＤ２０ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｉｔｕｘｉｍａｂ インビトロ：ＣＤ５５ ａｎｄ ＣＤ５９ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ．」，Ｂｌｏｏｄ ９５：３９００−３９０８，２０００を参照のこと）。
他の実施形態において、Ｆｃ部分は、対象の治療的処置のために、必要ないか、もしくはいくつかの例で望まれない可能性がある。本実施形態にしたがって、アポトーシスのような他の機構が関与し得る。Ｖａｓｗａｎｉ ａｎｄ Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｄｒｕｇｓ．Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｓｔｈｍａ Ｉｍｍｕｎｏｌ．８１：１０５−１１９，１９９８。
「抗体断片」は、Ｆ（ａｂ’）ａ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖなどのような本来の抗体の一部分である。構造にかかわらず、抗体断片は、全長抗体によって認識されるものと同一の抗原に結合する。たとえば、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体断片は、ＣＤ２０のエピトープに結合する。語句「抗体断片」はまた、特定の抗体に結合して複合体を形成することによって抗体のように働く、任意の合成または遺伝的に改変したタンパク質を含む。たとえば、抗体断片には、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」断片、軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカーによって連結される組換え体単一鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」、および高度可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識ユニットのような、可変領域からなる単離断片が含まれる。
野生型抗体の限定タンパク質分解によって産出された抗体断片は、タンパク質分解抗体断片と呼ばれる。これらには、限定はしないが、以下が含まれる。「Ｆ（ａｂ’）2断片（」は、抗体のタンパク質分解酵素、たとえばペプシンまたはフィシンに対する限定暴露によって抗体より放出される。Ｆ（ａｂ’）２断片は、２つの「アーム」を含み、それぞれが、共通抗原を指向し、特異的に結合する可変領域を含む。２つのＦａｂ’分子は、重鎖のヒンジ領域中の鎖内ジスルフィド結合によって連結する。Ｆａｂ’分子は、同一の（二価）または異なる（二特異性）エピトープに対して指向し得る。
「Ｆａｂ1断片」は、Ｆａｂと、ヒンジ領域を介して、重鎖のさらなる部分を含む単一の抗結合ドメインを含む。
「Ｆａｂ’−ＳＨ断片」は典型的に、Ｆ（ａｂ’）２断片中のＨ鎖間のジスルフィド結合によって互いに維持されるＦ（ａｂ’）２断片から産出される。非限定例として、β−メルカプトエチルアミンのような穏やかな還元剤での処置によってジスルフィド結合が破壊され、２つのＦａｂ’断片が、１つのＦ（ａｂ’）2断片より放出される。Ｆａｂ’−ＳＨ断片は一価および単一特異性である。
「Ｆａｂ断片」（すなわち、抗原結合ドメインを含み、ジスルフィド結合によって架橋された軽鎖と重鎖の部分を含む抗体断片）が、本来の抗体のパパイン消化によって産出される。簡便な方法は、酵素が簡単に除去され、消化が終結するように樹脂上に固定したパパインを使用することである。Ｆａｂ断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片中に存在するＨ鎖間にジスルフィド結合を有さない。
「一本鎖抗体」は、抗体断片の１つの型である。語句「一本鎖抗体」はしばしば、「ｓｃＦｖ」または「ｓＦｖ」と略される。これらの抗体断片は、分子遺伝学および組換えＤＮＡ技術を用いて産出される。一本鎖抗体は、抗原結合部位を形成するために相互作用するＶＨおよびＶＬドメイン両方を含むポリペプチド鎖からなる。ＶＨおよびＶＬドメインは通常、１０〜２５アミノ酸残基のペプチドによって連結される。
語句「一本鎖抗体」にはさらに、限定はしないが、ジスルフィド結合によって互いに連結した（それぞれが異なるエピトープを指向し得る）２つの一本鎖抗体、異なる特異性の２つの別個のｓｃＦｖがペプチドリンカーと連結した二特異的ｓＦｖ、ジアボディ（第一ｓＦｖのＶＨドメインが、第二ｓＦｖのＶＬドメインとアセンブルされ、第一ｓＦｖのＶＬドメインが第二ｓＦｖのＶＨドメインとアセンブルされる時に形成される二量体化ｓＦｖ。ジアボディの２つの抗原結合領域は、同一または異なるエピトープを指向し得る）、およびトリアボディー（三量体化ｓＦｖ、ジアボディと同様の様式で形成される、ただし、３つの抗原結合ドメインが、一つの複合体中で作成される。３つの抗原結合ドメインは、同一または他のエピトープに指向し得る。）が含まれる。
「相補性決定領域ペプチド」または「ＣＤＲペプチド」は、抗体断片の他の形態である。（また「最小認識ユニット」とも呼ばれる）ＣＤＲペプチドは、単一相補性決定領域（ＣＤＲ）に相当するペプチドであり、対象となる抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって調製可能である。そのような遺伝子は、たとえばポリメラーゼ連鎖反応を用いて、抗体産出細胞のＲＮＡから可変領域を合成することによって調製される。たとえばＬａｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：１０６，１９９１を参照のこと。
「システイン改変抗体」において、システインアミノ酸が、遺伝的操作によって抗体の表面上に挿入または置換され、たとえばジスルフィド架橋を介して抗体を他の分子にコンジュゲートさせるために使用される。抗体に対するシステイン置換または挿入が記述されている（米国特許第５，２１９，９９６号を参照のこと）。抗体の部位特異的コンジュゲートにおいて使用するためにＩｇＧ抗体の定常領域内へＣｙｓ残基を導入するための方法が、Ｓｔｉｍｍｅｌ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７５：３３０４４５−３０４５０，２０００）によって記述されている。
「ヒト化抗体」は、１つの種からの抗体、たとえば齧歯類抗体からのＣＤＲ、齧歯類抗体の可変重鎖および可変軽鎖が、たとえばタンパク質工学的技術を用いてヒトの重鎖および軽鎖可変ドメインに対して変換されることにより、非ヒトタンパク質の量を減少するために使用される組換えタンパク質である。抗体分子の定常ドメインは、ヒト抗体のものに由来する。Ｇｕｓｓｏｗ ａｎｄ Ｓｅｅｍａｎｎ，「Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」，Ｍｅｔｈｏｄ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３：９９−１２１，１９９１およびＶａｓｗａｎｉ ａｎｄ Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｓｔｈｍａ Ｉｍｍｕｎｏｌ．８１：１０５−１１９，１９９８を参照のこと。
＜抗体断片の産出＞
主張された方法および／または組成物のいくつかの実施形態が、抗体断片に関係する。そのような抗体断片は、従来の方法による全抗体のペプシンまたはパパイン消化によって入手し得る。たとえば、抗体断片を、Ｆ（ａｂ’）2と呼ばれる５Ｓ断片を得るためにペプシンで抗体を酵素的に開裂させることによって産出し得る。この断片をさらに、チオール還元剤および、任意にジスルフィド結合の開裂によるスルフヒドリル基のためのブロッキング基を使用して開裂して、３．５Ｓ Ｆａｂ’一価断片を産出し得る。あるいは、ペプシンを用いる酵素的断片によって、２つの一価Ｆａｂ断片およびＦｃ断片が産出される。抗体断片を産出するための例示的方法は、米国特許第４，０３６，９４５号、米国特許第４，３３１，６４７号、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９６０，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０；Ｐｏｒｔｅｒ，１９５９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，７３：１１９；Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９６７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｐａｇｅ ４２２（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、およびＣｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），１９９１，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）にて開示されている。
一価軽鎖重鎖断片を形成するための重鎖の分離、さらなる断片の開裂または他の酵素的、化学的または遺伝子技術のような、抗体を開裂する他の方法もまた、断片が、本来の抗体によって認識される抗原に結合する限り使用し得る。たとえば、Ｆｖ断片は、ＶHおよびＶL鎖の結合を含む。この結合は、Ｉｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．，１９７２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９；２６５９にて記述されたような非共有結合であり得る。あるいは、可変鎖は、分子内ジスルフィド結合、またはグルタルアルデヒドのような化学物質による架橋によって連結され得る。Ｓａｎｄｈｕ，１９９２，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ，１２：４３７を参照のこと。
好ましくは、Ｆｖ断片は、ペプチドリンカーによって連結されるＶHおよびＶL鎖を含む。これらの一本鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドリンカー配列によって連結した、ＶHおよびＶLドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。構造遺伝子を、発現ベクター内に挿入し、大腸菌のような宿主細胞内に次いで導入する。組換え宿主細胞が、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単一ポリペプチド鎖を合成する。ｓＦｖｓを産出するための方法が当分野で周知である。Ｗｈｉｔｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：８７；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３；米国特許第４，９４６，７７８号，Ｐａｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：１２７１，およびＳａｎｄｈｕ，１９９２，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ，１２：４３７を参照のこと。
抗体断片の他の形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識ユニット」）は、対象となる抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。そのような遺伝子は、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて抗体産出細胞のＲＮＡから可変領域を合成することによって調製される。Ｌａｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：１０６；Ｒｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），１９９５，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．」ｐａｇｅｓ １６６−１７９（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｂｉｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．）１９９５、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，ｐａｇｅｓ １３７−１８５（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｅｓｓ，Ｉｎｃ．）を参照のこと。
１つの実施形態において、ヒト化抗体を、エフェクターまたはレポーター分子に連結してもよい。たとえば、重金属原子、またはリシンのような毒素をキレートするための大員環を、共有架橋構造によってヒト化抗体に連結してもよい。あるいは、組換えＤＮＡ技術の手順を使用して完全抗体分子のＦｃ断片、Ｃｕ３またはＣｎ２ドメインが、酵素または毒素分子のような機能的非免疫グロブリンタンパク質によって置換、またはペプチド連結によって連結される、ヒト化抗体分子を産出してもよい。
本発明の他の実施形態において、ヒト化抗体には、全長重鎖および軽鎖を有する完全抗体分子、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｖ断片のようなその断片、たとえば一本鎖Ｆｖ、軽鎖または重鎖モノマーまたはダイマーのような一本鎖抗体断片、連結構造によって互いに結合した２，３、４以上の抗体またはその断片を含む多価一特異性抗原結合タンパク質、またはＭＡｂ ｍＬ２４３と同様の特異性を有する任意のこれらのまたは任意の他の分子の断片または類似体が含まれ得る。１つの特定の実施形態において、抗体には、全長重鎖および軽鎖を有する完全抗体分子が含まれ得る。
＜ヒト化Ｌ２４３抗体＞
キメラおよびヒト化抗体
キメラ抗体は、ヒト抗体の可変領域がたとえばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗Ｌ２４３マウス抗体の可変領域によって置換された組換えタンパク質である。キメラ抗体は、対象に投与したときに、免疫原性の減少および安定性の増加を示す。キメラ抗体を構築するための方法が当分野で周知である（たとえばＬｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １３：４６９）。
キメラモノクローナル抗体を、マウス免疫グロブリンの可変重鎖および可変軽鎖からのマウスＣＤＲを相当するヒト抗体の可変ドメインに移すことによってヒト化してもよい。キメラモノクローナル抗体中のマウスフレームワーク領域（ＦＲ）はまたヒトＦＲ配列によって置換される。ヒト化モノクローナルの安定性と抗体特異性を保存するために、１つ以上のヒトＦＲ残基を、マウス対応物残基によって置換してもよい。ヒト化モノクローナル抗体は、対象の治療的処置のために使用されてもよい。標的に対するヒト化抗体の親和性はまた、ＣＤＲ配列の選択改変によって増加され得る（ＷＯ００２９５８４Ａ１）。ヒト化モノクローナル抗体の産出のための技術が、当分野において周知である（たとえばＪｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３２：３２３；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５、Ｓａｎｄｈｕ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９９２，１２：４３７；Ｔｅｍｐｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：２６６、Ｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．，１９９３，１５０：２８４４を参照のこと）。
他の実施形態は、非ヒト霊長類抗体に関係する。ヒヒにて治療的に有用な抗体を生じるための一般的技術が、たとえばＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９１／１１４６５（１９９１）およびＬｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４６：３１０（１９９０）にて見ることができる。
他の実施形態において、抗体はヒトモノクローナル抗体であり得る。そのような抗体は、抗原チャレンジに対する応答で特異的ヒト抗体を産出するために工学的に改変したトランスジェニックマウスから得る。本技術において、ヒト重および軽鎖座の要素は、内因性重鎖および軽鎖座の標的とした破壊を含む胚幹細胞株から派生したマウス株内に導入される。このトランスジェニックマウスはヒト抗原に対して特異的なヒト抗体を合成可能であり、マウスを使用して、ヒト抗体分泌ハイブリドーマを産出可能である。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．７：１３（１９９４），Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６（１９９４），およびＴａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（１９９４）によって記述されている。
１つの実施形態において、ヒト化抗体には、ヒト抗体フレームワーク配列内にｍＬ２４３のＣＤＲ領域配列が含まれ、ヒト抗体定常領域配列を有し得る。より詳しくは、ヒト化抗体には、ＣＤＲ１（３１〜３５）、ＣＤＲ２（５０〜６５）およびＣＤＲ３（９５〜１０２）のすべてでｍＬ２４３−ＶＨ残基を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が含まれる。他の実施形態において、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のＣＤＲは、ＣＤＲ１（２４〜３４）、ＣＤＲ２（５０〜５６）およびＣＤＲ３（８９〜９７）のすべてにおいてｍＬ２４３−ＶＬ残基に相当する。本発明の他の特定の実施形態において、ヒト化設計で維持される他のマウスＬ２４３−ＶＨ残基は、１つ以上の以下の位置においてである。Ｆ２７、Ｋ３８、Ｋ４６、Ａ６８およびＦ９１。同様に、ヒト化設計中で維持されるＶＬ中のマウスＬ２４３残基は、１つ以上の以下の位置においてである。Ｒ３７、Ｋ３９、Ｖ４８、Ｆ４９およびＧ１００。
抗体配列のヒト化のためのさらなる詳細は、元の非ヒト抗体の抗原特異性を維持する一方で、たとえば、その全文章が参考により本明細書に組み込まれる、２００１年１１月１６日に提出された、米国特許出願第０９／９８８，０１３号にて開示されている。
１つの実施形態において、本発明はさらに、サブグループＩのヒト重鎖に由来するアクセプターフレームワークと、フレームワークが１つ以上の位置Ｆ２７、Ｋ３８、Ｋ４６、Ａ６８およびＦ９１にてｍＬ２４３ドナー残基を含むｍＬ２４３に由来する抗原結合領域を含む、可変領域ドメインを有するＣＤＲ移植ヒト抗体重鎖を提供する。それぞれ図３および４を参照のこと。
本発明の１つの実施形態において、ＣＤＡ移植ヒト化抗体軽鎖がサブグループＩのヒトκ軽鎖に由来するアクセプターフレームワークと、フレームワークが１つ以上の位置Ｒ３７、Ｋ３９、Ｖ４８、Ｆ４９およびＧ１００にてｍＬ２４３ドナー残基を含む、ｍＬ２４３ドナー抗原結合領域を含む、可変領域ドメインを含むことを提供し得る。
本発明の実施形態のＣＤＲ移植ヒト化抗体分子において、残りの非Ｌ２４３免疫グロブリン由来（アクセプター）部分は、ヒト化抗体がＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する能力を維持するように折りたたまれ得るという条件で、任意の好適なヒト免疫グロブリンに由来し得る。好ましくは、使用されたヒトフレームワーク（ＦＲ）の型は、ドナー抗体と同様／類似のクラス／型である。
本発明の１つの実施形態において、ヒトフレームワークは、特にＣＤＲに空間的に近いか隣接する位置でドナー抗体配列との相同性を最大化するように選択し得る。本実施形態にしたがって、ヒト化Ｌ２４３−ＶＨまたはＶＬのフレームワーク（すなわちＦＲ１−４）は、ヒト抗体の組み合わせに由来し得る。ＣＤＲ移植抗体を構築するために使用し得るヒトフレームワークの例は、ＬＡＹ、ＰＯＭ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＲＦおよびＥＵであり、好ましくは、ＲＦ−ＴＳ３ ＦＲ１−３およびＮＥＷＭ ＦＲ４を重鎖のために使用し、ＲＥＩ ＦＲ１−４を軽鎖のために使用する。本明細書で使用するＶドメイン残基番号付けシステムが、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９１），「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓに記述されている。ヒトＲＦ−ＴＳ３（ＦＲ１−３およびＮＥＷＭ ＦＲ４）、ｍＬ２４３およびｈＬ２４３ ＶＨ鎖の比較アミノ酸配列アライメントに関して、図５を参照のこと。ヒトＲＥＩ、ｍＬ２４３およびｈＬ２４３ ＶＬ鎖の比較アミノ酸配列アライメントに関して、図６を参照のこと。
ヒト化抗体分子の軽鎖および重鎖可変ドメインを、適切にヒト軽鎖または重鎖定常ドメインに融合し得る（語句「重鎖定常ドメイン」は、他に特定しない限りヒンジ領域を含む）。ヒト化抗体分子のヒト定常ドメインは、存在するならば、抗体の予定された機能にしたがって選択されてもよい。１つの実施形態において、ヒト定常ドメインは、エフェクター機能の欠如に基づいて選択され得る。重鎖可変領域に融合した重鎖定常ドメインは、ヒトＩｇＡ（ａ１またはａ２鎖）、ＩｇＧ（７１、７２、ｊ３＞またはｙ４鎖）またはＩｇＭ（ｕ鎖）のものであり得る。好ましくは、ヒトｙ鎖が使用される。軽鎖可変領域に融合され得る軽鎖定常ドメインには、ヒトλおよびκ鎖が含まれる。
本発明の１つの特定の実施形態において、ｙ１鎖を使用する。本発明のまた他の特定の実施形態において、γ４鎖が使用される。ｙ４鎖の利用は、いくつかの場合で、ｈＬ２４３の対象中での耐性を増加し得る（副作用および注入反応の減少、より大きな耐性など）。
１つの実施形態において、ヒト定常ドメインの類似体を使用し得る。これらには限定はしないが、相当するヒトドメイン以外の１つ以上の追加アミノ酸を含む定常ドメイン、または１つ以上のアミノ酸が欠損または変更された定常ドメインが含まれる。そのようなドメインは、たとえばオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によって得てもよい。
本明細書において、抗体の補体を固定する能力に関連して使用される語句「変化した」は、元の非変化抗体と比較して補体を固定する抗体の能力が減少することを示唆する。適切なアミノ酸を変化させることにより、補体を固定する抗体の能力が変化する。本明細書において、語句、補体固定化を「本質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」減少させるは、ヒト補体固定化が好ましくは、野生型抗体で見られるレベルの３０％以下、より好ましくは２０％以下、最も好ましくは１０％以下であることを示している。
変化した補体固定化能力は、たとえば残基の削除、分子中の好適な部分での糖付加部位の挿入、または異なるイソタイプの抗体のより低いヒンジ領域の変換のような、当分野で周知の技術によって産出し得る。
＜ＨＬ２４３抗体をコードする遺伝子の調製＞
当分野で公知の分子生物学の任意の標的技術を、本発明にしたがって抗体をコードするＤＮＡ配列を調製するために使用し得る。たとえば、ＤＮＡ配列を、オリゴヌクレオチド合成技術を用いて、完全にまたは部分的に合成してもよい。部位特異的変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を適切に使用し得る。好適なステップには、たとえば「ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」（１９８９），Ｅｄ．Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ Ｐｆｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｌｏｎｄｏｎにて記述されたようなＰＣＲ鎖重複手順およびＰＣＲ変異誘発、およびオリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発（Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２ ９４４１（１９８４））が含まれる。
分子生物学の任意の標準技術をまた、ＣＤＲ移植産物をコードするＤＮＡ配列を調製するために使用し得る。たとえば、ＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成技術を用いて、完全にまたは部分的に合成し得る。部位特異的変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を適切に使用してもよい。オリゴヌクレオチド特異的合成（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１ ５２２−５２５）および先に存在している可変ドメイン領域のオリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３ １５３４−１５３６）を使用してもよい。Ｔ４−ＤＮＡポリメラーゼを用いるギャップオリゴヌクレオチドの酵素的埋め（Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６ １００２９−１００３３）をまた使用してもよい。任意の好適な宿主細胞／発現ベクターシステムを、キメラまたはＣＤＲ移植重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡ配列の発現のために使用してもよい。「組換え宿主」は、クローニングベクターまたは発現ベクターいずれかを含む任意の真核または原核細胞であり得る。本語句にはまた、宿主細胞または細胞のクロモソームまたはゲノム中にクローン化された遺伝子を含むように遺伝し工学的に改変した原核または真核細胞、ならびにトランスジェニック動物が含まれる。たとえば大腸菌のような細菌、および他の微生物システムを、特に抗原断片、たとえばＦｖ、ＦａｂおよびＦａｂ’断片、および一本鎖抗体断片、たとえば一本鎖Ｆｖｓの発現のために有利に使用し得る。真核宿主、たとえば哺乳動物細胞発現システムはまた、本発明にしたがって、特に、より大きなキメラまたはＣＤＲ−移植抗体産物の産出のための抗体を得るために使用されてもよい。好適な哺乳動物宿主細胞には、Ｓｐ２／０およびＮＳＯ細胞のような骨髄腫細胞、ならびにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ハイブリドーマ細胞株、および抗体を発現するために有用な他の哺乳動物細胞が含まれる。
本明細書において、「発現ベクター」は、宿主細胞中で発現する対象となる遺伝子を含むＤＮＡ分子である。典型的には、遺伝子発現は、構造的または誘導可能プロモーター、組織特異的制御要素およびエンハンサーを含む特定の調節要素の制御下におかれる。そのような遺伝子は、調節要素「に動作可能に連結され」ていると言われる。さらなる態様にて、１つの実施形態には、本発明の抗体の重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡ配列、これらのＤＮＡ配列を含むクローニングおよび発現ベクター、これらのＤＮＡ配列で形質導入した宿主細胞、形質導入宿主細胞中でのこれらのＤＮＡ配列の発現を含む、重鎖または軽鎖および抗体分子を産出するためのステップも含まれる。
ヒト免疫グロブリン配列をコードするＤＮＡを、当分野で公知の任意の方法によって得てもよい。たとえば、−ＬＡＹ、ＰＯＭ、ＫＯＬ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＲＦおよびＮＥＷＭのような、好ましいヒトアクセプター・フレームワークのアミノ酸配列が広く利用可能である。同様に、ヒト軽鎖および重鎖サブグループのコンセンサス配列もまた利用可能である。当業者は、複数のコドン配列が同一のアミノ酸をコードできること、および種々の実施形態にて、開示核酸配列が、アミノ酸の同一配列をコードする異なる配列で置換し得ることを理解する。当業者はまた、核酸配列からタンパク質を発現するために使用した細胞株に対する由来の種に依存して、コドン使用頻度を選択した種での発現を増強するために最適化してもよいことを理解する。そのような種の好ましいコドン頻度が当分野で周知である。
１つの実施形態において、本明細書で開示される抗体は、完全抗体、または以上で説明したように、その断片、モノマーまたはダイマーまたは多価単一特異性抗原結合タンパク質であってもよい。したがって、さらに本発明の１つの態様に対して、多価単一特異性抗原結合タンパク質が、連結構造によって互いに結合した、２、３、４以上の抗体断片を含み、タンパク質が天然の免疫グロブリンではなく、前記抗体または断片のそれぞれが、マウスＭＡｂであるＬ２４３によって認識されたエピトープに対して特異性を有し、前記抗原結合タンパク質が任意にエフェクターまたはレポーター分子とコンジュゲートするように提供され得る。
これらの実施形態にしたがって、それぞれの抗体または断片は、以上で定義したような、ヒト化抗体またはその断片であり得、多価単一特異性抗原結合タンパク質は、ヒト化多価単一特異性抗原結合タンパク質であり得る。しかしながら、非ヒト化、たとえばマウス、多価単一特異性抗原結合タンパク質が意図されてもよく、実施形態が適用可能なところでこれらに拡大され得る。
１つの特定の実施形態において、多価抗原結合タンパク質が、連結構造によって互いに結合した、２、３または４つの抗体またはその断片を提供し得る。他の実施形態において、ヒト化抗体を産出するためのステップには、ｉ）可変ドメインのＣＤＲの少なくとも１つがｍＬ２４３−ＭＡｂに由来することができ、抗体鎖の残りの非免疫グロブリン由来部分が、ヒト免疫グロブリンに由来する可変ドメインを含む抗体重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡ配列を、発現ベクター中に作製するステップと、ｉｉ）可変ドメインのＣＤＲの少なくとも１つがｍＬ２４３−ＭＡｂに由来し、抗体鎖の残りの免疫グロブリン由来部分がヒト免疫グロブリンに由来する可変ドメインを含む相補的抗体軽鎖または重鎖をコードするＤＮＡ配列を、発現ベクター中に作製するステップと、ｉｉｉ）上記ＤＮＡ配列を宿主細胞にトランスフェクトするステップと、ｉｖ）トランスフェクト細胞株を培養して、ヒト化抗体分子を産出するステップとが含まれる。
＜宿主細胞内での組換えｈＬ２４３の産出＞
１つの実施形態において、組換えｈＬ２４３を産出するために使用した宿主細胞株を２つのベクターでトランスフェクトしてもよく、第一ベクターは軽鎖由来ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含み、第二ベクターは、重鎖由来ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む。好ましくは、ベクターは、コード配列および選別可能マーカーが連結している限りを除いて同一であり、それによって、各ポリペプチド鎖が等しく発現される可能性が確保される。トランスフェクションは、当業者に公知の任意の技術によって実施され得る。たとえばＭａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ（１９８２）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびＰｒｉｍｒｏｓｅ ａｎｄ Ｏｌｄ（１９８０）（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，Ｏｘｆｏｒｄ）を参照のこと。トランスフェクションのための１つの特定の技術は、エレクトロポレーションであり得る。他の例には、リン酸カルシウム仲介トランスフェクション、カチオン脂質仲介トランスフェクションなどが含まれる。１つの他の実施形態において、単一ベクターを使用してもよく、ベクターには、軽鎖および重鎖由来ポリペプチド両方をコードするＤＮＡ配列、および選別可能マーカーが含まれる。
＜抗体断片を含む組換え融合タンパク質の産出のための一般的方法＞
特定のエピトープを認識する抗体断片をコードする核酸配列を、当分野で周知の技術によって得ることが可能である。たとえば、所望の特異性の抗体を分泌しているハイブリドーマを使用して、たとえばＰＣＲによって、または伝統的なｃＤＮＡクローニング技術によって公知の技術を用いて調製可能である抗体をコードするＤＮＡを得ることができる。あるいは、Ｆａｂ’発現ライブラリーまたは抗体ファージディスプレイライブラリーを所望の特異性を有する抗体断片に対してスクリーニングするために構築可能である。
次いで抗体断片をコードする核酸を、直接、またはペプチドスペーサーをコードする配列を介して、ＤＤＤまたはＡＤいずれかをコードする核酸に連結可能である。これらの型の融合タンパク質をコードする核酸配列を産出する方法が、当分野で周知であり、以下の実施例でさらに議論されている。
他の実施形態において、追加アミノ酸残基を、Ａ／ＤＤＤまたはＥ／ＡＤからなるモジュラーサブユニットのＮまたはＣ末端いずれかに加えてもよく、実際の融合部位は、ＤＤＤまたはＡＤがＮまたはＣ末端へ（または内部部位にて）連結するかどうかに依存し得る。追加アミノ酸残基には、ペプチドタグ、シグナルペプチド、サイトカイン、酵素（たとえばプロドラッグ活性化酵素）、ホルモン、毒素、ペプチド薬物、膜相互作用ペプチド、または他の機能的タンパク質が含まれ得る。
タンパク質またはペプチドを、従来の技術にしたがって、全体でまたは部分的に溶液内または固体支持体上で合成してもよい。種々の自動合成器が市販されており、公知のプロトコールにしたがって使用可能である。たとえば、Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，（１９８４，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ．ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）；Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．，（１９８３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０５：６４４２）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，（１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３２：３４１−３４７）；およびＢａｒａｎｙ ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９７９，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１−２８４）を参照のこと。通常約６から約３５〜５０アミノ酸の短いペプチド配列がそのような方法によって簡単に合成可能である。あるいは、対象となるペプチドをコードする核酸配列を発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞に形質導入またはトランスフェクトし、発現に好適な条件下で培養する組換えＤＮＡ技術を利用してもよい。
所望の宿主細胞中で、組換えタンパク質を産出するための方法が、当分野で周知である。精製を促進するために、安定連結構造がＦＬＡＧ配列またはポリＨＩＳ配列のような好適なペプチドタグを含んでよく、関連するアフィニティカラムでのそれらの精製を促進する。
１つの実施形態において、Ｆｖ断片には、ペプチドリンカーによって連結したＶHおよびＶL鎖が含まれ得る。これらの一本鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドリンカー配列によって連結した、ＶHおよびＶLドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製する。構造遺伝子を発現ベクター内に挿入し、次いで大腸菌のような宿主細胞に導入する。組換え宿主細胞が、２つのＶドメインを架橋しているリンカーペプチドを有する単一ポリペプチド鎖を合成する。ｓＦｖｓを産出するために方法が当分野で周知である。Ｗｈｉｔｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：９７；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３；米国特許第４，０４６，７７８号；Ｐａｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：１２７１，およびＳａｎｄｈｕ，１９９２，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１２：４３７を参照のこと。
抗体断片の他の形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識ユニット」）は、対象となる抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。そのような遺伝子は、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、抗体産出細胞のＲＮＡから可変領域を合成することによって調製する。Ｌａｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：１０６，Ｒｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），１９９５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ｐａｇｅｓ １６６−１７９（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｂｉｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），１９９５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ １３７−１８５（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）を参照のこと。
安定連結構造の構成サブユニットの発現のために好適な宿主細胞または細胞株が、当業者に公知である。ヒト宿主細胞の使用によって、任意の発現した分子をヒト糖鎖修飾パターンで改変可能である。しかしながら、ヒト宿主細胞が開示方法のために必須または好ましいという示唆は存在しない。
＜二重特異性抗体およびコンジュゲート体＞
特定の実施形態において、本明細書で開示したＬ２４３リガンドをリガンドに連結した他の分子との組み合わせで使用してもよい。連結は、共有または非共有いずれかであってもよい。いくつかの実施形態において、Ｌ２４３リガンドを、二重特異性抗体、すなわち２つの異なる結合部位、１つはＬ２４３リガンドに対して、他は疾患関連標的抗原に対して、を有する抗体に連結してもよい。限定はしないが、原発がん、転移がん、新生物、関節リウマチ、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、サルコイドーシス、喘息、浮腫、肺高血圧症、腫瘍組織の形成および発達、乾癬、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、角膜移植片拒絶、血管新生緑内障、心筋血管新生、プラーク新血管形成、再狭窄、血管外傷後の内膜新生、毛細血管拡張症、血友病関節、血管線維腫、慢性炎症に関連した線維症、肺線維症、深部静脈血栓症および創部肉芽形成を含む、血管新生、がん、転移または細胞運動性に関連する任意の疾患または状態を標的とし得る。二特異性および多重特異性抗体の構築および使用のための方法が、たとえば、すべての文章が参考により本明細書に組み込まれる、２００４年１１月２日に出願された米国特許出願第２００５０００２９４５号で開示されている。
二重特異性抗体が、部分的に腫瘍関連抗原を標的化する場合、任意の型の腫瘍および任意の型の腫瘍抗原を標的化し得ることが見込まれる。標的化し得る腫瘍の例示的型には、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、胆管がん、乳がん、子宮がん、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、大腸がん、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、頭頸部がん、ホジキンリンパ腫、肺がん、甲状腺髄様、非ホジキンリンパ腫、卵巣がん、膵臓がん、グリオーマ、メラノーマ、肝がん、前立腺がんおよび膀胱がんが含まれる。好ましくは、Ｌ２４３の構造的発現を有する、またはＬ２４３を産出するために刺激可能な腫瘍である。
種々の組換え法を使用して、二重特異性抗体および抗体断片を産出可能である。たとえば、二重特異性抗体および抗体断片を、トランスジェニック家畜の乳中で産出可能である（たとえば、参考により本明細書に組み込まれる、Ｃｏｌｍａｎ，Ａ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｙｍｐ．，６３：１４１−１４７，１９９８；米国特許第５，８２７，６９０号を参照のこと）。２つのＤＮＡ構造物を、それぞれ、対になる免疫グロブリン重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡ区画を含むように調製する。断片を、哺乳動物上皮細胞中で優先的に発現するプロモーター配列を含む発現ベクター内にクローン化する。例としては、制限はしないが、ウサギ、ウシおよびヒツジカゼイン遺伝子、ウシα−ラクトグロブリン遺伝子、ヒツジβ−ラクトグロブリン遺伝子、およびマウスホエー酸タンパク質遺伝子からのプロモーターが含まれる。好ましくは、挿入断片が、哺乳動物特異的遺伝子からの同種ゲノム配列によってその３’側上で隣接する。これによって、ポリアデニル化部位および転写安定化配列が提供される。発現カセットを、受精した哺乳動物卵の前核内に共注入し、次いでこれをレシピエントメスの子宮内に移植し、妊娠させる。誕生後、子孫をサザン解析によって両方のトランスジーンの存在に関して選別する。抗体が存在するためには、重鎖および軽鎖遺伝子両方が、同一の細胞内で同時に発現すべきである。トランスジェニックメスからの乳を、当分野で公知の標準の免疫学的方法を用いて抗体または抗体断片の存在および機能性に関して解析する。抗体を、当分野で公知の標準の方法を用いて乳より精製可能である。
＜プレ標的化＞
二重特異性抗体の使用のための１つの戦略にはプレ標的化法が含まれ、そこでは、抗血管新生または抗腫瘍リガンドのようなエフェクター分子を、二重特異性抗体を投与した後に対象に投与する。Ｌ２４３リガンドに対する結合部位、および疾患組織に対する結合部位を含み得る二重特異性抗体が疾患組織に局在化し、エフェクターＬ２４３リガンドの疾患組織への局在化の特異性を増加させる（米国特許出願第２００５０００２９４５号）。エフェクター分子が、二重特異性抗体よりも非常に迅速に循環より消えるので、正常組織は、エフェクター分子が直接疾患標的化抗体に連結する時よりもプレ標的化戦術を使用したときに、エフェクター分子への暴露が減少し得る。
プレ標的化方法は、検出または治療薬剤の標的：バックグラウンド比を増加させるように発展してきた。プレ標的化およびビオチン／アビジンアプローチの例が、たとえば、すべてが参考により本明細書に組み込まれる、Ｇｏｏｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８６３，７１３号、Ｇｏｏｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：２２６，１９９８；Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：１２９４，１９８７；Ｏｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：７２８，１９８８；Ｋｌｉｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：１９５１，１９８８；Ｓｉｎｉｔｓｙｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３０：６６，１９８９；Ｋａｌｏｆｏｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３１：１７９１，１９９０；Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４８：１６７，１９９１；Ｐａｇａｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：５９６０，１９９１；Ｐａｇａｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２：２１１，１９９１；米国特許第５，２５６，３９５号、Ｓｔｉｃｋｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：６６５０，１９９１，Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：３１１９，１９９１；米国特許第６，０７７，４９９号、米国特許第０９／５９７，５８０号、米国特許第１０／３６１，０２６号、米国特許第０９／３３７，７５６号、米国特許第０９／８２３，７４６号、米国特許第１０／１１６，１１６号、米国特許第０９／３８２，１８６号、米国特許第１０／１５０，６５４号、米国特許第６，０９０，３８１号、米国特許第６，４７２，５１１号、米国特許第１０／１１４，３１５号、米国仮出願第６０／３８６，４１１号、米国仮出願第６０／３４５，６４１号、米国仮出願第６０／３３２８，８３５号、米国仮出願第６０／４２６，３７９号、米国特許第０９／８２３，７４６号、米国特許第０９／３３７，７５６号および米国仮出願第６０／３４２，１０３号にて記述されている。
特定の実施形態において、二重特異性抗体および標的化可能構造物は、たとえば、それぞれ参考により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１２６，９１６号、第６，０７７，４９９号、第６，０１０，６８０号、第５，７７６，０９５号、第５，７７６，０９４号、第５，７７６，０９３号、第５，７７２，９８１号、第５，７５３，２０６号、第５，７４６，９９６号、第５，６９７，９０２号、第５，３２８，６７９号、第５，１２８，１１９号、第５，１０１，８２７号および第４，７３５，２１０号にて記述された方法を用いて、正常または疾患組織および器官の処置および／またはイメージングで使用され得る。さらなる方法が、１９９９年６月２２日に出願された米国特許第０９／３３７，７５６号および２００１年４月３日に出願された米国特許第０９／８２３，７４６号にて記述されている。
＜ｈＬ２４３の治療的および診断的使用＞
他の実施形態において、本発明はまた、本発明の実施形態の抗体を含む治療的および診断的組成物を提供する。そのような組成物には、たとえばインビボ使用のために、薬学的に許容可能な賦形剤、希釈液または担体と一緒に、本発明にしたがった抗体を含んでよい。
「治療薬剤」は、抗体部分と別々に、同時にまたは連続して投与される、または抗体部分、すなわち抗体または抗体断片またはサブ断片にコンジュゲートした、疾患の処置において有用である分子または原子である。治療薬剤の例には、抗体、抗体断片、薬物、毒素、酵素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節物、オリゴヌクレオチド、干渉ＲＮＡ、キレート、ボロン化合物、光学活性薬剤または色素および放射性同位体が含まれる。
「診断／検出薬剤」は、抗体部分、すなわち、抗体または抗体断片、またはサブ断片に連結またはコンジュゲートして投与され、抗原を含む細胞を局在化することによって疾患を診断または検出することにおいて有用である分子または原子である。有用な診断／検出薬剤には、限定はしないが、放射性同位体、（ビオチン−ストレプトアビジン複合体とのような）色素、造影剤、蛍光化合物または分子および磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）のための増強薬剤（たとえば常磁体イオン）、および超音波イメージングのために使用する薬剤の例として粒子またはリポソームが含まれる。超音波増強薬剤は、米国特許第ＵＳ２００４０２１９２０３ Ａ１号およびＵＳ２００５００１４２０７Ａ１号にて開示されており、したがって、参考により、そのすべてが組み込まれている。好ましくは、気体封入リポソームである。Ｍａｒｅｓｃａ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｒａｄｉｏｌ．Ｓｕｐｐｌ ２ Ｓ１７１−１７８（１９９８）；Ｄｅｍｏｓ，Ｓｍ．Ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ ５ ５０７−５１８（１９９８）；およびＵｎｇｅｒ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．８１ ５８Ｇ−６１Ｇ（１９９８）を参照のこと。あるいは、二重特異性抗体を使用して、リポソームを標的化し得る。そのような１つの実施形態において、リポソームは、リポソーム脂質膜の外側表面に共有結合した二価ＤＴＰＡペプチドとの気体充填リポソームである。米国特許第ＵＳ２００４００１８５５７Ａ１号がそのようなリポソームを開示しており、そのすべてが参考により組み込まれる。
米国特許第６，３３１，１７５号は、ＭＲＩ技術、およびＭＲＩ増強薬剤にコンジュゲートした抗体の調製を記述しており、参考によりその全体が組み込まれている。１つの特定の方法において、診断／検出薬剤は、放射性同位体、磁気共鳴映像法における使用のための増強薬剤、超音波薬剤および蛍光化合物からなる群より選択してもよい。抗体成分を、放射活性金属または常磁体イオンとロードするために、イオンに結合するために多数のキレート基に連結する長い尾部を有する試薬と反応させる必要があり得る。そのような尾部は、ポリリシン、ポリサッカライドのようなポリマー、またはたとえばエチレンジアミンエテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビスチオセミカルバゾン、ポリオキシム、および本目的のために有用であると知られている類似の基のようなキレート基に結合可能であるペンダント基を有する他の誘導体化または誘導可能な鎖であり得る。キレートは、標準の化学反応を用いて抗体に結合可能である。キレートを、免疫反応性の最小欠損、および最小凝集および／または内部架橋により分子に対する結合を形成可能にする基によって抗体に連結し得る。他の、より通常ではないが、キレートを抗体にコンジュゲートさせるための方法および試薬については、以下の開示が、参考によりそのすべてが本明細書に組み込まれる、Ｈａｗｔｈｏｒｎｅに付与された、１９８９年４月２５日に刊行された、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」という名称の米国特許第４，８２４，６５９号にて開示されている。他の特定の実施形態において、有用な金属−キレート組み合わせには、放射イメージングのための、125Ｉ、131Ｉ、123Ｉ、124Ｉ、62Ｃｕ、MＣｕ、18Ｆ、inＩｎ、67Ｇａ、68Ｇａ、nnnＴｃ、94mＴｃ、HＣ、13Ｎ、15Ｏ、76Ｂｒ、97Ｚｒのような、一般的に、６０〜４，０００ＫｅＶのエネルギー範囲である診断アイソトープとともに使用する、２−ベンジル−ＤＴＰＡおよびそのモノメチルおよびシクロヘキシル類似体が含まれ得る。マグネシウム、鉄およびガドリニウムのような非放射活性金属と複合体形成した場合、同様のキレートが、本明細書で開示した任意の抗体と一緒に使用した場合に、ＭＲＩのために有用であり得る。ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡおよびＴＥＴＡのような巨大環状キレートが、種々の金属および放射金属と、最も詳しくは、それぞれガリウム、イットリウムおよび銅の放射性核種とともに使用される。そのような金属キレート複合体は、環のサイズを対象となる金属にあわせて調整することによって安定化可能である。ＲＡＩＴのための223Ｒａのような、核種を安定に結合させることを関心対象とした巨大環状ポリエーテルのような他の環の型のキレートが、本明細書における実施形態によって意図される。
治療薬剤の例には、限定はしないが、抗体、抗体断片、化学療法薬、毒素、酵素、酵素阻害剤、ヌクレアーゼ、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、免疫調節物、サイトカイン、キレーター、ボロン化合物、ウラニウム原子、光学活性薬剤および放射性核種を含む薬物が含まれる。
有用な診断／検出薬剤には、限定はしないが、放射性同位体、（ビオチン−ストレプトアビジン複合体と一緒のような）色素、放射線不透過性物質（たとえばヨウ素、バリウム、ガリウムおよびタリウム化合物など）、造影剤、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）のための蛍光化合物または分子および増強剤（たとえば常磁体イオン）が含まれる。米国特許第６，３３１，１７５号は、ＭＲＩ技術、およびＭＲＩ増強剤にコンジュゲートした抗体の調製を記述しており、参考によりその全体に組み込まれている。好ましくは、診断／検出薬剤は、核イメージング、手術中および内視鏡的検出のための放射性同位体、磁気共鳴映像法、または超音波検査での使用のための増強薬剤、Ｘ線およびコンピュータ断層撮影法のための放射線不透過性および造影剤、および内視鏡蛍光板透視を含む蛍光版透視のための蛍光化合物からなる群より選択される。
本開示の目的のための化学療法薬には、すべての公知の化学療法薬が含まれる。公知の化学療法薬には、限定はしないが、タキサン類、窒素マスタード類、エチレンイミン誘導体類、スルホン酸アルキル類、ニトロソウレア類、トリアゼン類、葉酸類似体類、ピリミジン類似体類、プリン類似体類、アンチセンスオリゴヌクレオチド類、転写因子のアンタゴニストまたは阻害剤、干渉ＲＮＡ、アルカロイド類、抗生物質類、酵素類、白金配位錯体類、ＣＯＸ−２阻害剤類、アポトーシス薬剤類、置換ウレア、メチルヒドラジン誘導体類、アドレノコルチコ抑制剤類、またはアンタゴニスト類が含まれる。より特定の実施形態において、化学療法薬には、ステロイド類、プロゲスチン類、エストロゲン類、アンチエストロゲン類またはアンドロゲン類が含まれ得る。他の特定の実施形態において、化学療法薬には、アクチノマイシン、アザリビン、アナストロゾール、アザシチジン、ブレオマイシン、ブリオスタチン−１、ブスルファン、カルムスチン、セレブレックス（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ）、クロラムブシル、シスプラチン、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、カルボプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ドセタキセル、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デキサメタゾン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン、エチニルエストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、フロキシウリジン、フルダラビン、フルタミド、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、ゲムシタビン、ヒドロキシプロゲステロンカプロエート、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、Ｌ−アスパラギナーゼ、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、酢酸メドロプロゲステロン、酢酸メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ミタラマイシン、マイトマイシン、マイトタン、オキサリプラチン、フェニルブチラート、プレドニゾン、プロカルバジン、パクリタキセル、ペントスタチン、セムスチンストレプトゾシン、ＳＮ−３８、タモキシフェン、タキサン類、タキソール、プロピオン酸テストステロン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、ビンブラスチン、ビノレルビンまたはビンクリスチンが含まれ得る。
いくつかの好適な化学療法薬が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １９ｔｈ Ｅｄ．（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．１９９５）にて記述されている。実験的薬物のような、他の好適な化学療法薬が当業者に公知である。
本発明の１つの実施形態において、毒素には、限定はしないが、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素、または緑膿菌内毒素が含まれ得る。
本発明の１つの実施形態において、酵素がまた有用な治療薬剤であり、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、ストレプトコッカスヌクレアーゼ、デルタ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、ａ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ｐ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼを含む群より選択してもよい。
本明細書において、語句「免疫調節物（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ）」には、サイトカイン類、幹細胞増殖因子類、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のようなリンホトキシン類、およびインターロイキン類（たとえばインターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１）のような造血性因子類、コロニー刺激因子類（たとえば顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）および顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））、インターフェロン類（たとえばインターフェロン−α、−βおよび−γ）、「Ｓ１因子」と呼ばれる幹細胞増殖因子、およびエリスロポエチンおよびトロンボポエチンが含まれる。好適な免疫調節物部分の例には、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、インターフェロン−γ、ＴＮＦ−αなどが含まれる。あるいは、対象に本発明の組成物、および本明細書で開示された組成物の投与前、一緒または後に投与可能な別に投与したサイトカインを与えることが可能である。本発明の実施形態には、免疫調節物にコンジュゲートした組成物が含まれ得る。
本開示物の目的のために、サイトカインには、限定はしないが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、インターフェロン−α、インターフェロン−βおよびインターフェロン−γを含む任意のサイトカインが含まれる。ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、エリスロポエチン、トロンボポエチンなどのようなコロニー刺激因子でもあってもよい。
さらに、キレーターには限定はしないが、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡまたはＮＯＴＡ、または蛍光分子のような検出可能標識、または重金属または放射性核種のような細胞傷害性薬剤をコンジュゲートさせることが可能な好適なペプチドが含まれ得る。たとえば、治療的に有用な免疫コンジュゲート体を、光学活性薬剤または色素を抗体組成物にコンジュゲートさせることによって得ることができる。フルオロクロムのような蛍光組成物、および他の色素原、可視光に感受性のポルフィリンのような色素を使用して、好適な光を損傷に指向させることによって、損傷を検出し、処置されることが、本明細書で意図されている。治療において、これは、光学放射、光学治療、または光線力学療法と呼ばれてきている（Ｊｏｒｉ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），「Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｔｕｍｏｒｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ」（Ｌｉｂｒｅｒｉａ Ｐｒｏｇｅｔｔｏ，１９８５）、ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇｈ，Ｃｈｅｍ．Ｂｒｉｔａｉｎ ２２：４３０，１９８６）。さらに、光学治療を達成するために、光学活性化色素とコンジュゲートしたモノクローナル抗体を、本明細書の診断または治療目的で使用し得ることが意図される。Ｍｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３０：１４７３，１９８３，ｉｄｅｍ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４５：４３８０，１９８５，Ｏｓｅｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：８７４４，１９８６，ｉｄｅｍ．，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．４６：８３，１９８７，Ｈａｓａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．２８８：４７１，１９８９，Ｔａｔｓｕｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｓｅｒｓ Ｓｕｒｇ．Ｍｅｄ．９：４２２，１９８９，Ｐｅｌｅｇｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ ６７：２５２９，１９９１。しかしながら、これらの早期の研究には、特に、抗体断片またはサブ断片の使用と一緒の、内視鏡治療適用の使用は含まれていなかった。したがって、１つの実施形態で本明細書で意図されるのは、光学活性薬剤または色素を含む免疫コンジュゲート体の治療的使用である。したがって、本治療的方法には、光学活性薬剤または色素を含む免疫コンジュゲート体の治療的使用が含まれ得る。検出および治療の内視鏡的方法は、その全体が参考により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，９３２，４１２号、第５，５２５，３３８号、第５，７１６，５９５号、第５，７３６，１１９号、第５，９２２，３０２号、第６，０９６，２８９号および第６，３８７，３５０号にて記述されている。
本発明の１つの実施形態において、核種を使用してもよい。１つの特定の実施形態において、それぞれインジウム−１１１またはイットリウム−９０のような有用な診断または治療特性を有する放射性核種が本明細書で意図される。他の有用な核種には、限定はしないが、Ｆ−１８、Ｐ−３２、Ｓｃ−４７、Ｃｕ−６２、Ｃｕ−６４、Ｃａ−６７、Ｇａ−６７、Ｇａ−６８、Ｙ−８６、Ｙ−９０、Ｚｒ−８９、Ｔｃ−９９ｍ、Ｐｄ−１０９、Ａｇ−１１１、Ｉｎ−１１１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｓｍ−１５３、Ｇｄ−１５５、Ｇｄ−１５７、Ｔｂ−１６１、Ｌｕ−１７７、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｐｔ−１９７、Ｐｂ−２１２、Ｂｉ−２１２、Ｂｉ−２１３、Ｒａ−２２３、Ａｃ−２２５、Ａｓ−７２、Ａｓ−７７、Ａｔ−２１１、Ａｕ−１９８、Ａｕ−１９９、Ｂｉ−２１２、Ｂｒ−７５、Ｂｒ−７６Ｂ、Ｃ−１１、Ｃｏ−５５Ｃｏ、Ｄｙ−１６６、Ｅｒ−１６９、Ｆ−１８、Ｆｅ−５２、Ｆｅ−５９、Ｇａ−６７、Ｇａ−６８、Ｇｄ−１５４−１５８、Ｈｏ−１６６、１−１２０、１−１２１、１−１２４、Ｉｎ−１１０、Ｉｎ−１１１、Ｍ１９４、Ｌｕ−１７７、Ｍｎ−５１、Ｍｎ−５２、Ｍｏ−９９、Ｎ−１３、Ｏ−１５Ｐ−３２、Ｐ−３３、Ｐｂ−２１１、Ｐｂ−２１２、Ｐｄ−１０９、Ｐｍ−１４９、Ｐｒ−１４２、Ｐｒ−１４３、Ｒｂ−８２、Ｒｅ−１８９、Ｒｈ−１０５、Ｓｃ−４７、Ｓｅ−７５、Ｓｒ−８３、Ｓｒ−８９、Ｔｂ−１６１、Ｔｃ−９４、Ｔｃ−９９、Ｙ−８６、Ｙ−９０またはＺｒ−８９が含まれる。たとえば、好適な診断放射性核種には、限定はしないが、Ｉｎ−１１０、Ｉｎ−１１１、Ｌｕ−１７７、Ｆ−１８、Ｆｅ−５２、Ｃｕ−６２、Ｃｕ−６４、Ｃｕ−６７、Ｇａ−６７、Ｇａ−６８、Ｙ−８６、Ｚｒ−８９、Ｔｃ−９４ｍ、Ｔｃ−９４、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉ−１２０、Ｉ−１２３、Ｉ−１２４、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｇｄ−１５４−１５８、Ｐ−３２、Ｃ−１１、Ｎ−１３、Ｏ−１５、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｍｎ−５１、Ｍｎ−５２ｍ、Ｃｏ−５５、Ａｓ−７２、Ｂｒ−７５、Ｂｒ−７６、Ｒｂ−８２ｍ、Ｚｒ−８９およびＳｒ−８３が含まれる。典型的な診断放射性核種は、２５〜１０，０００ｋｅＶの間を有する粒子および／またはポジトロンを放射する。
さらに、好適な治療放射性核種には、限定はしないが、Ｉｎ−１１１、Ｌｕ−１７７、Ｂｉ−２１２、Ｂｉ−２１３、Ａｔ−２１１、Ｃｕ−６２、Ｃｕ−６４、Ｃｕ−６７、Ｙ−９０、１−１２５、１−１３１、Ｐ−３２、Ｐ−３３、Ｓｃ−４７、Ａｇ−１１１、Ｇａ−６７、Ｐｒ−１４２、Ｓｍ−１５３、Ｔｂ−１６１、Ｄｙ−１６６、Ｈｏ−１６６、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｒｅ−１８９、Ｐｂ−２１２、Ｒａ−２２３、Ａｃ−２２５、Ｆｅ−５９、Ｓｅ−７５、Ａｓ−７７、Ｓｒ−８９、Ｍｏ−９９、Ｒｈ−１０５、Ｐｄ−１０９、Ｐｒ−１４３、Ｐｍ−１４９、Ｅｒ−１６９、Ｉｒ−１９４、Ａｕ−１９８、Ａｕ−１９９、Ａｃ−２２５およびＰｂ−２１１が含まれる。典型的な治療カチオンは、２０〜１０，０００ｋｅＶの間を有する粒子および／またはポジトロンを放射する。
有用なβ粒子放射性核種の最大崩壊エネルギーは好ましくは２０〜５，０００ｋｅＶ、より好ましくは１００〜４，０００ｋｅＶ、最も好ましくは５００〜２，５００ｋｅＶである。また、Ａｕｇｅｒ−放射粒子をともなって本質的に崩壊する放射性核種が好ましい。たとえば、Ｃｏ−５８、Ｇａ−６７、Ｂｒ−８０ｍ、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０３ｍ、Ｐｔ−１０９、Ｉｎ−１１１、Ｓｂ−１１９、１−１２５、Ｈｏ−１６１、Ｏｓ−１８９ｍおよびＩｒ−１９２。有用なＡｕｇｅｒ粒子放射性核種の崩壊エネルギーは、好ましくは１，０００ｋｅＶ未満、より好ましくは１００ｋｅＶ未満、最も好ましくは７０ｋｅＶ未満である。α粒子の発生をともなって本質的に崩壊する放射性核種が好ましい。そのような放射性核種には、限定はしないが、Ｄｙ−１５２、Ａｔ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｒａ−２２３、Ｒｎ−２１９、Ｐｏ−２１５、Ｂｉ−２１１、Ａｃ−２２５、Ｆｒ−２２１、Ａｔ−２１７、Ｂｉ−２１３およびＦｍ−２５５が含まれる。有用なα粒子放出放射性核種の崩壊エネルギーは、好ましくは２，０００〜１０，０００ｋｅＶ、より好ましくは３，０００〜８，０００ｋｅＶ、および最も好ましくは４，０００〜７，０００ｋｅＶである。
他の有用な治療薬剤には、光線力学療法の一部である金属、中性子捕獲手順に基づく治療で価値のある核種が含まれる。特に、亜鉛、アルミニウム、ガリウム、ルテチウムおよびパラジウムが光線力学療法のために有用であり、Ｂ−１０、Ｇｄ−１５７およびＵ−２３５がニュートロン捕獲治療のために有用である。
１つの実施形態において、金属は磁気共鳴映像法技術のためのものを含む診断薬剤として利用してもよい。これらの金属には、限定はないが、ガドリニウム、マンガン、鉄、クロム、銅、コバルト、ニッケル、ジスプロシウム、レニウム、ユーロピウム、テルビウム、ホルミウムおよびネオジムが含まれる。放射活性金属または常磁体イオンで抗体成分をロードするために、イオンを結合させるための多数のキレート基を接着させる長い尾部を有する試薬と反応させる必要があり得る。たとえば、そのような尾部は、ポリリシン、ポリサッカライドのようなポリマー、またはたとえば、エチレンジアミンエテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビス−チオセミカルバゾン、ポリオキシム、および本目的のために有用であると知られている類似の基のようなキレート基に結合可能であるペンダント基を有する他の誘導体化または誘導可能な鎖であり得る。さらに、キレートを、標準化学反応を用いてペプチド抗原にコンジュゲートし得る。キレートは、免疫活性の欠損が最小であり、凝集が最小であり、および／または内部架橋が最小である分子に対する結合の形成を発生させる基によって抗体に連結可能である。他の、抗体にキレートをコンジュゲートさせる方法および試薬については、以下の開示が、参考により、そのすべてが本明細書に組み込まれる、Ｈａｗｔｈｏｒｎｅに付与された、１９８９年４月２５日に刊行された、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」という名称の米国特許第４，８２４，６５９号にて開示されている。１つの特定の実施形態において、有用な金属−キレートの組み合わせには、限定はしないが、２０〜２，０００ｋｅＶの一般的エネルギー範囲での診断アイソトープと一緒に使用される２−ベンジル−ＤＴＰＡおよびそのモノメチルおよびシクロヘキシル類似体が含まれ得る。マンガン、鉄およびガドリニウムのような非放射性金属と錯体化した場合の同様のキレートが、本明細書で開示された実施形態の抗体と一緒に使用した場合に、ＭＲＩにとって有用である。ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡおよびＴＥＴＡのような巨大環状キレートが、種々の金属および放射性金属、最も詳しくはそれぞれガリウム、イットリウムおよび銅の放射性核種と一緒に利用され得る。そのような金属−キレート錯体は、環のサイズを対象となる金属にあわせて調整することによって強く安定化できる。ＲＡＩＴのための223Ｒａのような、核種を安定に結合させるために関心対象である巨大環状ポリエーテルのような他の環の型のキレートが、本明細書における実施形態によって意図される。
本発明の１つの実施形態において、治療的に有用な免疫コンジュゲート体が、光学活性薬剤または色素を抗体組成にコンジュゲートさせることによって得られ得る。蛍光および他の色素原、可視光に感受性なポルフィリン類のような色素を使用して、好適な光を損傷に指向させることによって損傷を検出および処置してきた。治療において、これは、光学放射、光学治療、または光線力学療法と呼ばれてきている（Ｊｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，「Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｔｕｍｏｒｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ」（Ｌｉｂｒｅｒｉａ Ｐｒｏｇｅｔｔｏ，１９８５），ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇｈ，Ｃｈｅｍ．Ｂｒｉｔａｉｎ ２２：４３０，１９８６）。さらに、モノクローナル抗体は、光学治療を達成するために光学活性化色素と結合された。Ｍｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３０：１４７３，１９８３，ｉｄｅｍ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４５：４３８０，１９８５，Ｏｓｅｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：８７４４，１９８６、ｉｄｅｍ．，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．４６：８３，１９８７，Ｈａｓａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．２８８：４７１，１９８９，Ｔａｔｓｕｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｓｅｒｓ Ｓｕｒｇ．Ｍｅｄ．９：４２２，１９８９，Ｐｅｌｅｇｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ ６７：２５２９，１９９１。しかしながら、これらの早期の研究には、特に、抗体断片またはサブ断片の使用を伴った、内視鏡治療適用の使用は含まれていなかった。したがって、本発明の１つの実施形態において、光学活性薬剤または色素を含む免疫コンジュゲート体の治療的使用が意図される。
本発明の実施形態での使用のために好適である常磁体イオンには、限定はしないが、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＨＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イットリビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）およびエルビウム（ＩＩＩ）が含まれ、ガドリニウムが特に好ましい。
Ｘ線イメージングのような他の文脈中の有用なイオンには、限定はしないが、トランサヌム（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）および特にビスマス（ＩＩＩ）が含まれる。蛍光標識には、ローダミン、フルオレセインおよびレノグラフィンが含まれる。ローダミンおよびフルオレセインはしばしば、イソチオシアネート中間体を介して連結する。放射線不透過および造影剤が、Ｘ線およびコンピュータ断層撮影法を増強するために使用され、ヨウ素化合物、バリウム化合物、ガリウム化合物、サリウム化合物などが含まれる。特定の化合物には、バリウム、ジアトリゾエート、エチオダイズド油、クエン酸ガリウム、イオカルミン酸、イオセタミン酸、ヨードアミド、ヨージパルムド、ヨードキサミン酸、イオグルタミド、イオヘキソール、イオパミドール、イオパノン酸、イオプロセミン酸、イオセファミン酸、イオセリン酸、イオスルアミドメグルミン、イソセメチン酸、イオタスル、イオテトリン酸、イオサラミン酸、イオトロキシ酸、イオキサグリ酸、イオキソトリゾン酸、イポデート、メグルミン、メトリザミド、メトリゾエート、プロピリドンおよび塩化タリウムが含まれる。したがって、他の実施形態において、薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤または担体との組み合わせでの、本明細書で開示した抗体を含む治療的、薬学的または診断的組成物が提供され得る。
本発明の他の実施形態において、薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤または担体と一緒に、本明細書にて開示された抗体を混合することを含む、治療的、薬学的または診断的組成物の調製のためのステップが提供され得る。
抗体および組成物は、使用される治療にしたがった、任意の適切な形態および量で投与されるためのものであり得る。
１つの実施形態において、治療的、薬学的または診断的組成物は、投与のために任意の好適な形態を取ることができ、好ましくは、非経口投与のために好適な形態、たとえば注射または注入によってであり、たとえばボーラス注射または連続注入によってである。製品が注射または注入のためのものである場合、油性または水性媒体中の懸濁液、溶液またはエマルジョンの形態を取ることができ、懸濁、防腐、滅菌および／または分散剤のような処方薬剤を含み得る。あるいは、抗体または組成物は、適切な滅菌液体との使用の前の再構築のために乾燥形態であり得る。
治療的および診断的使用は、本明細書で開示された実施形態にしたがった有効量の抗体をヒト対象に投与することが含まれ得ることが本明細書で意図される。投与される実際の用量は、抗体の使用にしたがって、そして患者の年齢、性別および状態にしたがって変化するが、一般的に、約０．１ｍｇ〜１０００ｍｇ、たとえば約１ｍｇ〜５００ｍｇ変化し得る。抗体は、単一用量として、または時間にわたり連続様式で投与してもよい。投与は必要に応じて繰り返してもよい。
１つの実施例において、本明細書で開示された抗体および組成物は、使用される治療にしたがった任意の適切な形態および量での投与のために使用し得る。抗体を投与する用量は、処置すべき状態の性質に依存し、抗体が予防的に使用されるかどうかまたは存在する状態を処置するかどうかに依存して投与される。用量はまた、患者の年齢および状態にしたがって選別される。したがって、抗体の治療用量は、たとえば好ましくは０．１〜２５ｍｇ／ｋｇ体重／単一治療用量、最も好ましくは、単一治療用量に対して、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。
１つの実施形態において、本明細書で開示された任意の抗体は、任意の好適な経路による投与のために従来の実施にしたがって処方してもよく、一般的に、たとえば静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内経路による投与のために、液体形態（たとえば無菌生理学的に許容可能な緩衝液中の抗体の溶液）であり得る。
本明細書で意図される「免疫強薬物」は、少なくとも１つの治療的および／または診断的／検出薬剤にコンジュゲートした、抗体、融合タンパク質、またはその断片である。診断的／検出薬剤には、放射性核種または非放射性核種、（磁気共鳴映像法、コンピュータ断層撮影法または超音波のためのような）造影剤を含んでよく、放射性核種は、γ−、β−、α−、Ａｕｇｅｒエレクトロン−、またはポジトロン−放射性同位体であり得る。
本明細書において、語句「抗体融合タンパク質」は、２つ以上の同一または異なる天然の抗体、同一または異なる特異性を有する一本鎖抗体または抗体断片区画が連結した、組換え的に産出された抗原結合分子である。融合タンパク質の価数は、融合タンパク質が有する、抗原またはエピトープに対する結合アームまたは部位の総数を示唆し、すなわち、一価、二価、三価または四価である。多価の抗体融合タンパク質は、抗原への結合における多数の相互作用を利用することができることを指し、したがって、抗原に対する結合の親和力の増加を利用することができることを意味する。特異性は、どれくらい多くの異なる抗原またはエピトープに、抗体融合タンパク質が結合可能であるか、を示唆しており、すなわち一特異性、二特異性、三特性、多特異性である。これらの定義を用いて、天然の抗体、たとえばＩｇＧは、２つの結合アームを有するので二価であるが、１つの抗原に結合するので、一特異性である。一特異性、多価融合タンパク質は、エピトープに対して１つより多い結合部位を有するが、同一の抗原上の同一のエピトープにのみ結合し、たとえば、同一の抗原と反応する２つの結合部位を有するジアボディである。融合タンパク質には、異なる抗体成分の多価または多特異性組み合わせ、または同一の抗体成分の多重コピーの組み合わせが含まれ得る。融合タンパク質は、さらに、治療薬剤を含んでよい。そのような融合タンパク質のために好適な治療薬剤の例には、免疫調節物（「抗体免疫調節物融合タンパク質」）および毒素（「抗体毒素融合タンパク質」）が含まれる。１つの好ましい毒素には、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、好ましくは組換えＲＮアーゼが含まれる。
他の実施形態において、選択的結合を、マレイミド−ヒドロキシスクシンイミドエステルのようなヘテロ二機能リンカーを用いることによって達成し得る。エステルの抗体または断片との反応により、抗体または断片上のアミン基を誘導可能であり、次いで、誘導体がたとえば遊離スルフヒドリル基をもつ抗体Ｆａｂ断片（または、たとえばトラウト試薬によって、付加するスルフヒドリル基を有するより大きな断片または本来の抗体）と反応可能である。そのようなリンカーは、同一の抗体中の架橋基に連結する可能性は少なく、結合の選択性を改善する。
１つの特定の実施形態において、本明細書で開示される抗体または断片を、抗体結合部位から離れた部位で結合してもよい。これは、たとえば以上で述べたように、開裂した鎖間のスルフヒドリル基への結合によって達成可能である。他の方法には、酸化炭水化物部分を有する抗体を、少なくとも１つの遊離アミン官能基を有する他の抗体に反応させることが含まれる。これによって、初期シフ塩基（イミン）結合となり、好ましくは、たとえばボロヒドリド反応によって、第二アミンへの還元によって安定化され、最終産物が形成される。そのような部位特異的結合が、小分子に関して米国特許第４，６７１，９５８号、およびより大きな追加物に関して米国特許第４，６９９，７８４号にて開示されている。
標的特異性を有するＦ（ａｂ’）２断片の鎖間ジスルフィド架橋をシステインで還元させ、軽鎖−重鎖結合を避けて、Ｆａｂ’−ＳＨ断片を形成可能である。ＳＨ基を、過剰のビス−マレイミドリンカー（１，１’−１５（メチレンジ−４，１−フェニレン）ビス−マレイミド）で活性化可能である。
１つの実施形態において、本明細書で開示されたｈＬ２４３抗体、ならびに異なる特異性を有する他の結合分子を組み合わせ治療で使用してもよい。たとえば、多特異性抗体には、マウスモノクローナル抗体ｍＬ２４３によって認識されるエピトープまたは抗原への少なくとも１つの結合部位、およびマウスモノクローナル抗体ｍＬ２４３によって認識された他のエピトープまたは他の抗原に対する少なくとも１つの結合部位が含まれ得る。さらに、（同一のエピトープまたは抗原に対する多結合部位を含む）多価抗体、または抗体が、多価および多特異性両方であり得る。
１つの特定の実施形態において、結合分子は、融合タンパク質であり得る。１つのより特定の実施形態において、融合タンパク質は、本明細書で記述されたような、ヒト化、キメラ、ヒトまたはマウスＬ２４３抗体または断片の、４以上のＦｖまたはＦａｂ’を含み得る。他の実施形態において、抗体融合タンパク質は、本明細書で記述したような、ヒト化、キメラ、ヒトまたはマウスＬ２４３−ＭＡｂまたは断片のｍＡｂまたは断片の１つ以上のＦｖまたはＦａｂ’を含み得る。これらの実施形態にしたがって、ＨＬＡ抗原以外の細胞マーカーに対して特異的である他の抗原に対して特異的な抗体からの１つ以上のＦｖまたはＦａｂ’が含まれ得る。たとえば、非ＨＬＡ抗原には、Ｂ細胞系列抗原（たとえば、Ｂ細胞悪性腫瘍の処置のためのＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２２）から選択される腫瘍マーカーが含まれ得る。他の実施例において、非ＨＬＡ抗原はまた、メラノーマ中のＳＩ００のような他の型の悪性腫瘍を引き起こす他の細胞上に発現し得る。さらに、細胞マーカーは、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３０、ＣＤＳ３、ＣＤ５２、ＣＤ６６、ＭＵＣ１およびＴＡＣからなる群より選択されるような非Ｂ細胞系列抗原であり得る。
１つの実施形態において、本明細書で開示されたＬ２４３抗体を他の抗体と組み合わせ、疾患を有するか、または進行が疑われる対象を処置するために使用し得る。本実施形態にしたがって、Ｌ２４３抗体またはその組成物を、ヒト化モノクローナル抗体（たとえばｈＡ２０（ＣＤ２０−Ｍａｂ））のような抗がんモノクローナル抗体と組み合わせてもよく、がんを処置するために使用してもよい。より特定の実施形態において、Ｌ２４３のＨＬＡ−ＤＲ抗体を、抗がんモノクローナル抗体（たとえばｈＡ２０）と組み合わせて、疾患の進行の疑いを有する患者を処置するために使用してもよい。ｈＬ２４３抗体を、１つ以上の他の別の抗体組成物と組み合わせて別の抗体組成物として使用してもよく、またｈＬ２４３の１つ、およびｈＡ２０の他の１つに対する二機能性抗体として使用してもよいことが、本明細書で意図されている。この実施形態にしたがって、ｈＬ２４３抗体は、ｈＬ２４３のＨＬＡ−ＤＲであってもよい。他の特定の実施形態において、疾患には、そのような疾患を有する対象における、Ｂ細胞悪性腫瘍疾患を標的化することが含まれ得る。Ｂ細胞悪性腫瘍は、Ｂ細胞リンパ腫の無痛性形態、Ｂ細胞リンパ腫の悪性形態、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、ワルデンストレームマクログロブリン血症および多発性骨髄腫からなり得る。また、免疫調節不全疾患における敗血症および敗血性ショックを含む多くの自己免疫および免疫調節不全疾患のような非悪性腫瘍Ｂ細胞疾病および関連疾患が存在する（またＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈａｎｓｅｎによって２００４年１２月８日に出願され、そのすべてが本明細書に組み込まれている、米国特許仮出願明第６０／６３４，０７６号を参照のこと）。特に、本明細書で記述した組成物は、種々の自己免疫疾患、ならびにＢ細胞リンパ腫の無痛性形態、Ｂ細胞リンパ腫の亜性形態、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、およびワルデンストレームマクログロブリン血症、ならびに急性および慢性骨髄性白血病およびＴ細胞白血病およびリンパ腫のような他の造血系悪性腫瘍の処置のために特に有用である。たとえば、ｈＬ２４３抗体成分および免疫コンジュゲート体を、非ホジキンリンパ腫およびリンパ性白血病の無痛性および悪性形態両方を好ましく処置するために使用可能である。
標的化し得る腫瘍関連抗原には、限定はしないが、Ａ３３抗体に対して特異的なＡ３抗原、ＢｒＥ３抗原、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、ＨＣＧおよびそのサブユニット、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ−５）、ＣＥＡＣＡＭ−６、ＣＳＡｐ、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、Ｅｐ−ＣＡＭ、Ｂａ７３３、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、低酸素症誘導因子（ＨＩＦ）、ＫＣ４抗原、ＫＳ−１抗原、ＫＳ１−４、Ｌｅ−Ｙ、マクロファージ阻害因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＰＡＭ−４抗原、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＲＳ５、Ｓ１００、ＴＡＧ−７２、ｐ５３、タナスシン、ＩＬ−６、ＩＬ−８、インスリン増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、Ｔｎ抗原、トムソン−フリーデンライチ抗原、腫瘍壊死抗原、ＶＥＧＦ、１７−１Ａ−抗原、血管新生マーカー（たとえばＥＤ−Ｂフィブロネクチン）、オンコジーンマーカー、オンコジーン産物、および他の腫瘍関連抗原が含まれる。腫瘍関連抗原における最近の報告には、それぞれ参考により本明細書に組み込まれる、Ｍｉｚｕｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，（２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１１：９９２−９７），Ｈａｔｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，（２００５，Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ５：２２９−４８），Ｖａｌｌｂｏｈｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２３：３５３６−４４）およびＲｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００５，Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２４２：５５−６３）が含まれる。
さらに、本発明の他の実施形態には、免疫強薬物および組成物を調製するための二特異性または多特異性抗体が含まれ得る。これらの実施形態にしたがって、Ｌ２４３抗体または断片またはその抗体融合タンパク質を、がんマーカー基質、感染性疾患器官の表面上のエピトープ、または血液または他の体液中の有害な基質に対して特異的な抗体または抗体断片に連結してもよい。二特異性および多特異性抗体は、種々の有害な基質のクリアランスを誘導するために有用であり得る。たとえば、二重特異性抗体は、病原体微生物のような有害な基質に対する１つ以上の特異性、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡクラスＩＩ不変鎖（ｌｉ）に対する１つ以上の特異性を有し得る。ＨＬＡクラス−ＩＩ不変鎖（ｌｉ）は、その全体が参考により本明細書に組み込まれる、表題「二重特異性抗体の治療的使用（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）」、１９９９年５月１９日に出願された米国特許第０９／３１４，１３５号にて詳細に記述されている。
他の実施形態において、本明細書で開示されている免疫コンジュゲート体および組成物はまた、Ｌ２４３多価抗体を含み得る。本実施形態にしたがって、多価標的結合タンパク質を、第一および第二ポリペプチドの結合によって構築してもよい。第一ポリペプチドには、好ましくは免疫グロブリン軽鎖可変領域ドメインである、第一免疫グロブリン様ドメインに共有結合した、第一一本鎖Ｆｖ分子が含まれ得る。第二ポリペプチドには、好ましくは免疫グロブリン重鎖可変領域ドメインである第二免疫グロブリン様ドメインに共有結合した第二一本鎖Ｆｖ分子が含まれ得る。第一および第二一本鎖Ｆｖ分子それぞれが、標的結合部位を形成し、第一および第二免疫グロブリン様ドメインが結合して、第三の標的結合部位を形成する。
他の実施形態において、ヒト化、キメラまたはヒトＬ２４３モノクローナル抗体を用いて、抗原特異的ジアボディ、トリアボディーおよびテトラボディーを産出してもよい。たとえば、単一特異性ジアボディ、トリアボディーおよびテトラボディーは、選択的に標的化抗原に結合し、その結果分子上の結合部位の数が増加するので、標的細胞に対する親和性が増加し、より長い居留時間が所望の局所で観察される。ジアボディに関して、５アミノ酸残基リンカーによってヒト化Ｌ２４３ ｍＡｂのＶＫポリペプチドに連結したヒト化Ｌ２４３ ｍＡｂのＶＨポリペプチドを含む２つの鎖を利用可能である。それぞれの鎖が、ヒト化Ｌ２４３ジアボディの二分の一を形成する。トリアボディーの場合、リンカーなしで、ヒト化Ｌ２４３ ＭＡｂのＶＫポリペプチドに連結したヒト化Ｌ２４３ ＭＡｂのＶＨポリペプチドを含む三つの鎖が利用される。それぞれの鎖は、ｈＬ２４３トリアボディーの三分の一を形成する。
他の実施形態において、本明細書で開示される免疫コンジュゲート体および組成物にはまた、機能的二特異性一本鎖抗体（ｂｓｃＡｂ）も含まれ得る（たとえば、参考により本明細書に組み込まれる、Ｍａｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：７０２１−７０２５，１９９５を参照のこと）。たとえば、ｂｓｃＡｂを、組換え法を用いてグリシン−セリンリンカーを介して２つの一本鎖Ｆｖ断片を連結することによって産出可能である。対象となる２つの抗体のＶ軽鎖（ＶＬ）およびＶ重鎖（ＶＨ）ドメインを、標準のＰＣＲ法を用いて単離可能である。各ハイブリドーマから得たＶＬおよびＶＨのｃＤＮＡを、二段階融合ＰＣＲにて連結させて一本鎖断片を形成してもよい。１つの実施例において、第一ＰＣＲ段階によって、（Ｇｌｙ４−ＳｅｒＩ）３リンカーが導入され、第二段階でＶＬおよびＶＨ増幅物が連結される。各一本鎖分子を、細菌発現ベクター内にクローン化可能である。増幅に続いて、１つの一本鎖分子を活性化させ、他のベクター内にサブクローン化し、対象となる第二一本鎖分子を含む。次いで、ｂｓｃＡｂ断片を、真核発現ベクター内にサブクローン化可能である。機能性タンパク質発現を、チャイニーズハムスター卵巣細胞内にこのベクターをトランスフェクトすることによって得ることが可能である。他の二特異性融合タンパク質を同様の様式で調製する。二特異性一本鎖抗体および二特異性融合タンパク質は薬物担体を調製するために使用されてもよい。
さらに、１つの実施形態には、二重特異性を有する四価タンデムジアボディー（タンダブと呼ばれる）が含まれ得る（Ｃｏｃｈｌｏｖｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （２０００）６０：４３３６−４３４１）。二特異性タンダブは、自己結合に際して、２つの異なる特異性のそれぞれに対して２つの可能性ある結合部位の形成を促進する方向で連結した２つの異なる抗体の４つの可変ドメイン（ＶＨ１、ＶＬ１、ＶＨ２、ＶＬ２）をそれぞれ含む、２つの同一ポリペプチドのダイマーである。
他の実施形態において、コンジュゲート多価Ｌ２４３抗体を使用して、免疫コンジュゲート体または組成物を調製してもよい。追加アミノ酸残基を、第一または第二ポリペプチドのＮまたはＣ末端いずれかに加えてもよい。追加アミノ酸残基は、ペプチドタグ、シグナルペプチド、サイトカイン、酵素（たとえばプロドラッグ活性化酵素）、ホルモン、オリゴヌクレオチド、干渉ＲＮＡ、シュードモナスエキソトキシンのようなペプチド毒素、ペプチド薬物、細胞傷害性タンパク質または他の機能的タンパク質を含み得る。本明細書において、機能的タンパク質は、生物学的な機能を有するタンパク質である。
また他の実施形態において、ｈＬ２４３抗体またはその断片を、多価タンパク質複合体、３または４つの抗原結合部位を含む新規抗体融合タンパク質を調製するために使用してもよい。これらの実施形態にしたがって、１つ以上の抗原結合部位は、ｈＬ２４３可変ドメインからなってもよく、１つ以上の残りの抗原結合部位には、所望のような他の抗原特異的抗体の可変ドメインが含まれ得る。そのような多価タンパク質複合体は、ＰＣＴ刊行物ＷＯ０４０９４６１３Ａ２（Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，２００４）にて記述されている。適切な抗原特異的抗体可変鎖と組み合わせる場合、ｈＬ２４３可変ドメインを含む多価タンパク質複合体を種々の新生物、感染、代謝性、神経変性、自己免疫、または免疫調節不全疾患を処置するために使用してもよい。
本発明の１つの実施形態において、薬物、毒素、放射活性化合物、酵素、ホルモン、細胞傷害性タンパク質、オリゴヌクレオチド、干渉ＲＮＡ（たとえばＲＮＡｉ分子）、キレート、サイトカインおよび他の機能的薬剤が多価標的結合タンパク質にコンジュゲートし得る。これらの実施形態にしたがって、たとえばアミン、カルボキシル、フェニル、チオールまたはヒドロキシル基など、多価標的結合タンパク質のアミノ酸残基の側鎖への共有結合を使用してもよい。種々の従来のリンカーを本目的のために使用してもよく、たとえば、ジイソシアネート、ジイソチオシアネート、ビス（ヒドロキシスクシンイミド）エステル、カルボジイミド、マレイミド−ヒドロキシスクシンイミドエステル、グルタルアルデヒドなどを使用してもよい。多価タンパク質に対する薬剤のコンジュゲートは、好ましくは、その標的に対するタンパク質の結合特異性または親和性に有意な影響を与えない。本明細書において、機能的薬剤は、生物学的機能を有する薬剤である。好ましい機能的薬剤は、細胞傷害性薬剤である。
また他の実施形態において、インビボ標的に対する治療またはプロドラッグポリマーの二重特異性抗体由来伝達を、放射性核種の二重特異性抗体伝達と組み合わせることが可能であり、組み合わせ化学治療および放射免疫治療が達成される。各治療薬剤を、標的化可能コンジュゲート体にコンジュゲートさせ、同時に投与可能であり、または核種を第一標的化可能コンジュゲート体の一部として与え、薬物を、第二標的化可能コンジュゲート体の一部として後の段階で与えることが可能である。好適な標的化可能コンジュゲート体および薬物が当分野で公知である。
他の実施形態において、細胞傷害性薬剤を重合化担体にコンジュゲートしてもよく、重合化担体を続いて、多価標的結合タンパク質にコンジュゲートしてもよい。本方法に関して、参考により本明細書に組み込まれる、Ｒｙｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５：３８６７−３８７０，１９７８、米国特許第４，６９９，７８４号、および米国特許第４，０４６，７２２号を参照のこと。コンジュゲートは、好ましくは、多価結合タンパク質の結合特異性または親和性に有意な影響を与えない。
＜処置および診断のための、ヒト化抗体、キメラ抗体およびヒト抗体使用＞
本明細書で記述しているヒト化抗体、キメラ抗体およびヒトモノクローナル抗体が、本明細書で記述しているような免疫強薬物および組成物を利用する治療法および診断法での使用のために好適である。したがって、免疫コンジュゲート体または組成物には、裸のヒト化抗体、キメラ抗体およびヒト抗体または抗体が含まれ得、これらは、担体、治療薬剤、または診断薬剤にコンジュゲートしてもよい。免疫コンジュゲート体を、多重モデル治療として投与してもよい。たとえば、追加治療または診断薬剤を、免疫コンジュゲート体または組成物の投与前、同時または後に投与してもよい。免疫コンジュゲート体または組成物の効果を、ヒト化抗体、キメラ抗体およびヒトＬ２４３免疫コンジュゲート体をまたは組成物に、１つ以上の他の結合分子（すなわち、ＣＤ４、ＣＤＳ、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２６、ＣＣＤ１３８、ＣＤ１５４、Ｂ７、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１６、ＮＣＡ６６、壊死抗原、ＰＡＭ−４、ＫＳ−１、Ｌｅ（ｙ）、ＭＡＧＥ、１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、テナスシン、ＨＭ１．２４、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、葉酸レセプター、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、大腸特異的抗原ｐ（ＣＳＡｐ）、インスリン様増殖因子（ＩＬＧＦ）、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）、前立腺酸ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、Ｔ１０１、ＴＡＧ、ＴＡＧ−７２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、カルボニックアンヒドラーゼＩＸ、ＩＬ−６、ＳＩ００、αフェトプロテイン、Ａ３、ＧＡ１２５、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｈＬ２４３抗体とのＣＤ６６（ａ、ｂ、ｃ、ｄ）、ＭＡＲＴ−１、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ｇｐｌＯＯ、アミロイドのような非特異性交差反応抗原、またはその免疫コンジュゲート体、またはこれらの引用した抗原に対する抗体）を補充することによって増強し得る。好ましいＢ細胞関連抗原には、ヒトＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ７４、ＣＤ８０およびＣＤＳ抗原と等価のものが含まれる。好ましいＴ細胞抗原には、ヒトＣＤ４、ＣＤＳおよびＣＤ２５（ＩＬ−２レセプター）抗原に等価のものが含まれる。
あるいは、ＨＬＡ−ＤＲ抗原に対する置換分子を、Ｂ細胞およびＴ細胞疾病両方の処置で使用してもよい。１つの特定の実施形態において、Ｂ細胞抗原は、ヒトＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ７４、ＣＤ８０およびＨＬＡ−ＤＲ抗原に等価であり得る。他の特定の実施形態において、ヒトＣＤ４、ＣＤＳおよびＣＤ２５抗原と等価のＴ細胞抗原を使用可能である。あるいは、補体依存性溶解（ＣＤＣ）を防止するがん細胞の表面上のＣＤ４６およびＣＤ５９抗原を使用してもよい。１つの実施形態において、ＭＡＲＴ−１、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２およびｇｐｌＯＯとの等価物のような、悪性メラノーマ関連抗原を使用してもよい。さらに、１つの実施形態において、多重メラノーマ関連抗原は、ＭＵＣ１、ＣＤ３８およびＣＤ７４に等価なものである。
１つの実施例において、補足結合分子は裸であるか、脂質、ポリマー、薬物、毒素、免疫調節物、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、干渉ＲＮＡおよび治療放射性核種などを含む、担体、治療薬剤または診断薬剤とコンジュゲートされていてもよい。本実施形態にしたがって、補足結合分子を、ヒト化、キメラおよびヒトＬ２４３免疫コンジュゲート体または組成物と、同時に、連続して、または処方された投与計画にしたがって、投与してもよい。
さらに、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、および他の疾患または疾病での診断および治療的使用のための免疫コンジュゲート体または組成物の投与が本明細書で意図される。本明細書で記述したような、免疫コンジュゲート体は、担体にコンジュゲートした結合分子を含む分子であり得る。本実施形態にしたがって、免疫コンジュゲート体を、治療的または診断薬剤をさらに含む組成物を形成するために使用してもよく、これには、診断または治療薬剤を有し得るペプチドが含まれ得る。免疫コンジュゲート体は、結合分子の免疫応答性を残す（すなわち、抗体部分は、コンジュゲート後、コンジュゲート前とほとんど同一か、またはわずかに減少した同種抗原に結合する能力を有する）。免疫コンジュゲート体には、任意の好適な第二分子（たとえば、より高次の構造を形成し得る脂質、タンパク質、炭水化物、またはリポソーム、ミセルおよび／またはナノ粒子のような高次構造それ自体）にコンジュゲートした結合分子が含まれ得る。特定のエフェクターの伝達を促進するために、高次構造（たとえば両親媒性脂質）を形成可能である１つ以上の分子に対してｈＬ２４３抗体をコンジュゲートさせることが望ましい。両親媒性分子がまた、水溶液中の溶解性の制限を示すエフェクターの伝達を促進するために望ましい。
他の実施形態において、広く種々の診断および治療薬剤を使用して、本明細書で記述したような免疫コンジュゲート体および組成物を形成可能である。治療薬剤には、たとえば、ビンカアルカロイド類、アントラサイクリン類、エピドフィロ毒素類（ｅｐｉｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、タキサン類、代謝拮抗物質類、アルキル化剤類、抗生物質類、Ｃｏｘ−２阻害剤類、抗有糸分裂剤類、抗血管新生およびアポトーシス剤類、特にドキソルビシン、メトトレキサート、タキソール、ＣＰＴ−１１、カンプトテカン類、およびこれらのそして他のクラスの抗がん剤からの他のものなどの化学療法薬が含まれる。免疫コンジュゲート体および抗体融合タンパク質の調製のための他の有用ながん化学療法薬には、ニトロゲンマスタード、スルホン酸アルキル、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、ＣＯＸ−２阻害剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、白金配位複合体、ホルモンなどが含まれる。好適な化学療法薬が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ Ｅｄ．（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．１９９５）にて、およびＧｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｏｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，７ｔｈ Ｅｄ．（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．１９８５）にて、ならびにこれらの刊行物の改訂版にて記述されている。実験薬物のような他の好適な化学療法薬を使用してもよく、当分野で公知である。
さらに、他の実施形態において、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡまたはＮＯＴＡのようなキレーターを、本明細書で記述したような組成物の１つ以上の成分とコンジュゲートさせてもよい。あるいは、検出可能標識（たとえば蛍光分子）、または細胞傷害性薬剤（たとえば重金属または放射性核種）を含む好適なペプチドを、本明細書で記述したような組成物のより多くの成分と共有的、非共有的または結合させ得る。たとえば、１つの治療的に有用な免疫コンジュゲート体を、本明細書に記述したように、組成物中、光学活性薬剤または色素を組み込むことによって得てもよい。蛍光発色団、および他の発色団、または可視光に感受性のポルフィリンのような色素などの蛍光組成物を使用して、損傷に好適な光を指向させることによって損傷を検出し、処理してきた。治療において、これは、光学放射、光学治療、または光線力学療法と呼ばれてきている（Ｊｏｒｉ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），「腫瘍および他の疾患の光線力学療法（ＰＨＯＴＯＤＹＮＡＭＩＣ ＴＨＥＲＡＰＹ ＯＦ ＴＵＭＯＲＳ ＡＮＤ ＯＴＨＥＲ ＤＩＳＥＡＳＥＳ）」（Ｌｉｂｒｅｒｉａ Ｐｒｏｇｅｔｔｏ，１９８５）、ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇｈ，Ｃｈｅｍ．Ｂｒｉｔａｉｎ ２２：４３０，（１９８６））。さらに、モノクローナル抗体は、光学治療を達成するために光学活性化色素とコンジュゲートした。Ｍｅｗ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３０：１４７３（１９８３）；ｉｄｅｍ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４５：４３８０（１９８５）；Ｏｓｅｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：８７４４（１９８６）；ｉｄｅｍ．，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．４６：８３（１９８７）；Ｈａｓａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．２８８：４７１（１９８９）；Ｔａｔｓｕｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｓｅｒｓ Ｓｕｒｇ．Ｍｅｄ．９：４２２（１９８９）；Ｐｅｌｅｇｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ ６７：２５２９（１９９１）。内視鏡適用もまた意図される。検出および治療の内視鏡法が、その全体が参考により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，９３２，４１２号、第５，５２５，３３８号、第５，７１６，５９５号、第５，７３６，１１９号、第５，９２２，３０２号、第６，０９６，２８９号および第６，３８７，３５０号にて記述されている。
１つの実施形態において、光活性薬剤または色素を含むｈＬ４２３免疫コンジュゲート体組成物の治療的使用が本明細書で意図されており、および本診断／治療法には、光活性薬剤または色素を含むｈＬ４２３免疫コンジュゲート体組成物の診断または治療利用が含まれ得る。免疫コンジュゲート体はまた、以上で議論した型の超音波薬剤も含まれ得る。また、本明細書で記述したようなヒト化、キメラおよびヒトＬ４２３免疫コンジュゲート体組成物中での診断薬剤としての放射活性および非放射活性薬剤の使用も意図される。好適な非放射活性診断薬剤は、磁気共鳴映像法、コンピュータ断層撮影法または超音波のために好適な造影剤である。磁気イメージング薬剤には、たとえば、本明細書で記述した抗体と一緒に使用した場合、２−ベンジル−ＤＴＰＡおよびそのモノメチルおよびシクロヘキシル類似体を含む金属−キレート組み合わせと錯体化したマグネシウム、鉄およびガドリニウムのような非放射活性金属が含まれる。（参考によりその全体が組み込まれる、２００１年１０月１０日に出願された、米国特許第０９／９２１，２９０号を参照のこと）。
他の実施形態において、ヒト化、キメラおよびヒトＬ４２３免疫コンジュゲート体組成物には、診断イメージングのために有用な放射性同位体またはポジトロンエミッターが含まれ得る。好適な放射性同位体には、６０〜４，０００ｋｅＶのエネルギー範囲でのものが含まれ得る。好適な放射性同位体には、１８−Ｆ、５２−Ｆｅ、６２−Ｃｕ、６４−Ｃｕ、６７−Ｃｕ、６７−Ｇａ、６８−Ｇａ、８６−Ｙ、８９−Ｚｒ、９４−Ｔｃ、９４ｍ−Ｔｃ、９９ｍ−Ｔｃ、１１１−Ｉｎ、１２３−１、１２４−１、１２５−１、１３１−1などが含まれる（たとえば、イメージング目的のための１８−Ｆ、６８−Ｇａ、９４ｍ−Ｔｃなどのようなポジトロンエミッターを開示しており、参考によりそのすべてが組み込まれている、本発明者Ｇ．Ｌ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ａｎｄ Ｗ．Ｊ．ＭｃＢｒｉｄｅの表題「Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇａｌｌｉｕｍ−６８」の米国特許出願（米国仮出願第６０／３４２，１０４号）を参照のこと）。
本発明の他の実施形態において、緑膿菌外毒素のような毒素が、本明細書で記述したようなヒト化、キメラおよびヒトＬ２４３抗体またはその免疫コンジュゲート体または組成物中に存在し得る。たとえば、毒素は、本明細書で記述したｈＬ２４３抗体の抗体融合タンパク質に複合体化するか、またはその治療薬剤部分を形成することができる。他の毒素には、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリン毒素、緑膿菌外毒素および緑膿菌内毒素が含まれる（たとえば、Ｐａｓｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４７：６４１（１９８６）、およびＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，ＣＡ−Ａ Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ ４４：４３（１９９４）を参照のこと。本明細書での使用に好適なさらなる毒素が当業者に公知であり、参考によりそのすべてが組み込まれている米国特許第６，０７７，４９９号にて開示されている。
あるいは、サイトカインのような免疫調製物がまた、本明細書で記述したような投与されるｈＬ４２３免疫コンジュゲート体組成物中に存在してもよい。たとえば、免疫調節物は、抗体融合タンパク質の治療薬剤部分に複合体化するか、またはその治療薬剤部分を形成するか、または本明細書で記述したヒト化、キメラおよびヒトＬ４２３免疫コンジュゲート体組成物の一部として投与してもよい。好適なサイトカインには、限定はしないが、以下で記述するような、インターフェロン類およびインターロイキン類が含まれる。
１つの実施形態において、ヒト化Ｌ２４３抗体を、先に標的化した、非免疫原性、診断および治療適用のための非常に選択的な変法の一部として使用可能であり、そこで二重特異性抗体を担体分子上の腫瘍抗原および１つ以上のハプテンを共認識するために使用し、担体分子にはエフェクター分子が含まれる。二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）は、比較的非免疫学的ヒト化タンパク質として改変可能であるという利点を有する。ｂｓＡｂの結合親和性は、初期標的化薬剤の結合親和性に依存し得る。二価ペプチドを用いることによって、親和性増強が達成され得、一価ペプチドと比較して、標的部位に対するペプチドの結合を大きく改善させる。たとえば、そのすべてが参考により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，２５６，３９５号を参照のこと。
１つの実施形態において、ｈＬ２４３−ｂｓＡｂで先に標的化することには、本明細書で記述したように、ｈＬ２４３抗体の可変領域に由来するｂｓＡｂの１つのアーム、および診断または治療薬剤（たとえば、「標的化可能構造」として診断または治療薬剤と一緒の担体）を含む部分を認識する抗体の第二アームが含まれる。好適な標的化可能構造物および使用の方法が、米国特許出願第２００５０００２９４５号にて記述されており、その内容は、そのすべてが本明細書にて参考により組み込まれる。標的化可能構造物は、当業者が他の標的化可能構造物を使用し得ることを理解するけれども、たとえば、（ｉ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ2、（ｉｉ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−（ＨＳＧ）−ＮＨ2、または（ｉｉｉ）Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃ8−Ｃｙｓ）−ＮＨ2であり得る。他の系において、標的化可能構造物には、抗体の第二アームによって認識されるハプテン部分、および治療または診断薬剤が含まれ得る。たとえば、治療薬剤は、以上で記述したもののような化学療法薬または毒素であり得る。
１つの特定の実施形態には、種々のエフェクター基質が調製可能である認識系のようなヒスタミン誘導体、ヒスタミン−スクシニル−グリシル（ＨＳＧ）に対して指向する抗体を使用するＪａｎｅｖｉｋ−Ｉｖａｎｏｖｓｋａ ｅｔ ａｌ．によって記述された前標的化系が含まれる。本発明のヒト化Ｌ２４３抗体をそのような系にて使用し得る。この前標的化系は、種々の異なるイメージングまたは治療薬剤と一緒に使用可能である他の前標的化系に対して有意な利点を表している。１つの実施例において、この系は、ＤＴＰ ＡまたはＨＳＧに対して指向する抗体の使用、およびＤＴＰＡまたはＨＳＧ残基を含むペプチドの開発に基づき得る。ＤＴＰＡ含有および／またはＨＳＧ含有ペプチドが合成可能であり、そこでペプチドはＤＴＰＡを含み、ペプチドをＩｎ、ＹまたはＬｕのようなキレート化核種で標識化してもよく、治療または診断にて有用であり得る。抗体はＤＴＰＡ−Ｉｎ部分に対して産出されてきた。他の実施形態において、系には、ハプテンのペプチドおよび／またはＤＴＰＡのようなキレーターが含まれ、90Ｙ、’’’ｉｎおよび177Ｌｕならびに99mＴｃでの放射標識のために好適であり得る。
＜免疫コンジュゲート体の調製＞
本明細書で記述した免疫コンジュゲート体を、抗体を脂質、炭化水素、タンパク質、または他の原子および分子に連結する公知の方法によって調製してもよい。たとえば、本明細書で記述した結合分子を本明細書で記述した１つ以上の担体（たとえば脂質、ポリマー、リポソーム、ミセルまたはナノ粒子）にコンジュゲートさせて免疫コンジュゲート体を形成可能であり、免疫コンジュゲート体は共有、非共有、またはその他いずれかで、治療または診断薬剤を組み込み得る。さらに、本明細書で記述した結合分子を、本明細書で記述した１つ以上の治療または診断薬剤、またはさらなる担体とコンジュゲート可能である。一般的に、１つの治療または診断薬剤を、各結合分子に連結してもよいが、１つより多い治療薬剤または診断薬剤を同一の結合分子に連結可能である。１つの実施形態において、本明細書で意図する抗体融合タンパク質には、２つ以上の抗体またはその断片が含まれてもよく、この融合タンパク質を含む、各抗体を、本明細書で記述した１つ以上の融合担体とコンジュゲートしてもよい。さらに、１つ以上の抗体融合タンパク質の抗体が、１つ以上の連結した治療または診断薬剤を有し得る。さらに、治療薬剤は、同一のものである必要はなく、異なる治療薬剤であり得る。たとえば、本明細書で記述した組成物には、薬物および放射性同位体が含まれ得る。
１つの実施例において、ＩｇＧを、１３１−１で放射標識化してもよく、ＩｇＧ−脂質コンジュゲート体がリポソームを形成可能であるように脂質にコンジュゲートしてもよい。この実施例にしたがって、リポソームは、１つ以上の治療または診断薬剤（たとえばＦＵｄＲ−ｄＯのような薬物）を組み込み得る。あるいは、担体に加えて、ＩｇＧを、１３１−１（たとえばチロシン残基）および薬物（たとえばリシン残基のεアミノ基）にコンジュゲートしてもよく、担体はさらなる治療または診断薬剤を組み込み得る。治療および診断薬剤を、結合分子と共有結合してもよい（たとえば、結合分子上の還元ジスルフィド基、炭化水素側鎖、または任意の他の反応基にコンジュゲートしてもよい）。
他の実施形態において、担体、治療薬剤または診断薬剤を、ジスルフィド結合形成を介して、還元抗体成分のヒンジ領域で結合してもよい。あるいは、ペプチドを、Ｎ−スクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）のようなヘテロ二機能架橋剤を用いて抗体成分に結合可能である。Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５６：２４４（１９９４）。そのようなコンジュゲート体のための一般技術が当分野で周知である（たとえば、Ｗｏｎｇ，「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ」（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９１）；Ｕｐｅｓｌａｃｉｓ ｅｔ ａｌ．，「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ」，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｒｃｈ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ １８７Ｄ２３０（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）、Ｐｒｉｃｅ，「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」，Ｍｏｎｉｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｔｉｎｇ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ ６０Ｄ８４（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）を参照のこと）。あるいは、担体、治療薬剤または診断薬剤を、抗体のＦｃ領域中の炭化水素部分を介してコンジュゲート可能である。炭化水素基を使用して、チオール基に結合する同一のペプチドの積み込み量を増加可能であり、または炭化水素部分を使用して異なるペプチドを結合可能である。
抗体炭化水素部分を介したペプチドを抗体成分にコンジュゲートするための方法が、当業者に周知である（たとえば、すべてが参考によりそのすべてが組み込まれているＳｈｉｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４１：８３２（１９８８）；Ｓｈｉｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４６：１１０１（１９９０）；およびＳｈｉｈ ｅｔａｌ．，米国特許第５，０５７，３１３号を参照のこと）。同様の化学反応を使用して、１つ以上のｈＬ２４３抗体またはその成分を、１つ以上の担体、治療薬剤または診断薬剤にコンジュゲートするために使用してもよい。１つの実施形態において、１つの一般法には、酸化炭化水素部分を有する抗体成分を、少なくとも１つの遊離アミン官能基を有し、複数のペプチドをロードした担体ポリマーと反応させることが含まれる。本反応によって、初期シフ塩基（イミン）結合となり、これは第二アミンへの還元によって安定化し、最終コンジュゲート体を形成可能である。
１つの実施形態において、たとえばｈＬ４２３結合分子が抗体断片である場合、Ｆｃ領域は存在しなくてもよい。あるいは、炭化水素部分を、全長抗体または抗体断片の軽鎖可変領域内に導入してもよい（たとえば、すべてが参考によりそのすべてが組み込まれている、Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５９１９（１９９５）；Ｈａｎｓｅｎ ｅｔａｌ．，米国特許第５，４４３，９５３号（１９９５）；Ｌｅｕｎｇ ｅｔａｌ．，米国特許第６，２５４，８６８号を参照のこと）。これらの実施形態にしたがって、工学的に改変した炭化水素部分を、担体、治療または診断薬剤に結合させるために使用してもよい。
＜担体（脂質、リポソーム、ミセル、ポリマーおよびナノ粒子）＞
リポソームおよびミセルの形成のための任意の方法を使用してもよく、当分野で公知である（たとえば、Ｗｒｏｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１２３５：２９６（１９９５）；Ｌｕｎｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５１：１０９９−１１０５（１９９９）；Ｌｕｎｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，２０５：１０１−１０８（２０００）；Ｌｕｎｄｂｅｒｇ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，８３：７２−７５（１９９４）；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｎ，１：３３７−３４６（２００２）；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：６０３９−６０４４（２００３）、米国特許第５，５６５，２１５号、米国特許第６，３７９，６９８号、および米国特許第２００３／００８２１５４号を参照のこと）。薬物輸送またはイメージングのために本明細書で意図されている、ポリマー、シリカまたは金属から形成されるナノ粒子またはナノカプセルが記述されてきている（たとえば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｔｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：２１５−２１７（２０００）；米国特許第５，６２０，７０８号、米国特許第５，７０２，７２７号および米国特許第６，５３０，９４４号を参照のこと）。
＜免疫リポソーム＞
抗体または結合分子をリポソームに結合し、治療または診断薬剤のための標的化担体を形成するための方法が記述されてきている（たとえば、Ｂｅｎｄａｓ，Ｂｉｏｄｒｕｇｓ，１５：２１５−２２４（２００１）；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．，１：３３７−３４６（２００２）；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１００：６０３９−６０４４（２００３）；Ｂａｌｌｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ．，８：２９９−３３５（１９９８）；Ｌｕｎｄｂｅｒｇ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，１０９：７３−８１（１９９４）；Ｌｕｎｄｂｅｒｇ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４９：１６−２１（１９９７）；Ｌｕｎｄｂｅｒｇ，Ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，１３：４５３−４６１（１９９８）を参照のこと）。また米国特許第６，３０６，３９３号、米国特許第１０／３５０，０９６号、米国特許第０９／５９０，２８４号、および１９９９年６月９日に出願された米国特許第６０／１３８，２８４号も参照のこと。すべてのこれらの参考は、参考により本明細書に組み込まれる。
＜薬学的に許容可能な賦形剤＞
１つの実施形態において、免疫コンジュゲート体または組成物には、１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤、１つ以上の追加成分またはこれらの組み合わせが含まれてもよい。
他の実施形態において、本明細書で開示された免疫コンジュゲート体または組成物を、公知の方法にしたがって処方して薬学的に有用な組成物を調製してもよく、それによって、免疫コンジュゲート体または組成物を薬学的に好適な賦形剤との混合液中で組み合わせる。無菌リン酸緩衝食塩水が、薬学的に好適な賦形剤の１つの例である。他の好適な賦形剤が、当業者に周知である（たとえば、Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，５ｔｈ （Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ １９９０）、ａｎｄ Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９０），およびそれらの改訂版を参照のこと）。
他の実施形態において、本明細書で開示した免疫コンジュゲート体または組成物を、たとえばボーラス注射または連続注入を介して静脈内投与のために処方可能である。
注射のための処方は、添加保存剤とともにたとえばユニット投与形態、たとえばアンプル中または多数回投与型の容器中で存在してもよい。組成物は、油性または水性媒体中の懸濁液、溶液またはエマルジョンの形態であってもよく、懸濁、安定および／または分散薬剤のような処方薬剤を含み得る。あるいは、活性成分は、使用の前に、たとえば発熱物質を含まない無菌水のような好適な媒体との組成のための粉末形態で存在してもよい。さらなる薬学的方法を使用して、治療、診断コンジュゲート体または裸の抗体の活性の期間を制御してもよい。たとえば、制御放出調製物を、免疫コンジュゲート体または裸の抗体を複合体化または吸着するためにポリマーの使用を介して調製してもよい。１つの実施例において、生物適合性ポリマーには、ポリ（エチレン−コ−ビニル酢酸）のマトリックスおよびステアリン酸ダイマーとセバシン酸のポリアンヒドリドコポリマーのマトリックスが含まれる。Ｓｈｅｒｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１４４６（１９９２）。そのようなマトリックスからの免疫コンジュゲート体または抗体の放出のいくつかの速度は、免疫コンジュゲート体または抗体の分子量、免疫コンジュゲート体、抗体のマトリックス中の量、および分散粒子のサイズに依存する。Ｓａｌｔｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．５５：１６３（１９８９）；Ｓｈｅｒｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，上記。他の固体用量形態が、Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ；５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ １９９０）；およびＧｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），Ｒａｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９０）、およびその改訂版にて記述されている。
１つの実施形態において、免疫コンジュゲート体または組成物はまた、哺乳動物皮下にまたは他の非経口経路にて投与してもよい。さらに、投与は、連続注入または単一もしくは複数ボーラスでよい。１つの実施例において、ヒトに対する投与された免疫コンジュゲート体、融合タンパク質または裸の抗体の用量は、患者の年齢、体重、身長、年齢、一般病状および過去の治療歴などのような因子に依存して変化する。特定の実施形態において、より低いまたはより高い用量も環境規定として投与し得るけれども、レシピエントに単一静脈内注入として、約１ｍｇ／ｋｇ〜ｍｇ／ｋｇの範囲で免疫コンジュゲート体、または免疫コンジュゲート体を含む組成物の用量を投与し得る。この用量は、必要に応じて、たとえば４〜１０週間、１週間あたり１回、好ましくは８週間、１週間あたり１回、より好ましくは、４週間、１週間あたり１回繰り返し得る。数ヶ月にわたり隔週でのようなより低い頻度で投与してもよい。用量およびスケジュールの適切な調節をともなって種々の非経口経路を介して投与してもよい。
１つの実施形態において、治療の目的のために、免疫コンジュゲート体、または免疫コンジュゲート体を含む組成物を治療的に有効量で哺乳動物に投与する。本明細書で開示された治療および診断方法のために好適な対象は、非ヒト動物対象も意図されるけれども、ヒトであり得る。
１つの実施例において、抗体調製物を、投与された量が生理学的に有意である場合に、「治療的に有効量」にて投与されると言われる。その存在によって、レシピエント哺乳動物の生理学において検出可能な変化となる場合に、薬剤が治療的に有意である。特に、抗体調製物は、その存在が抗腫瘍反応を誘引するか、または自己免疫疾患状態の兆候および症状を軽減する場合に、その抗体調製物が生理学的に有意である。生理学的に有意な効果はまた、レシピエント哺乳動物における体液性および／または細胞性免疫応答の誘引でもあり得る。
＜ヒト化、キメラおよびヒトＬ２４３抗体を含む組成物を用いる処置の方法＞
１つの実施形態において、本発明の抗体で処置し得る免疫学的疾患には、たとえば強直性脊椎炎、若年性関節リウマチ、関節リウマチのような関節疾病、多発性硬化症および重症筋無力症のような神経学的疾患、糖尿病、特に若年性発症糖尿病のような膵臓疾患、慢性活動性肝炎、セリアック病、潰瘍性大腸炎、クローン病、悪性貧血のような胃腸管疾患、乾癬または強皮症のような皮膚疾患、喘息のような、また移植片対宿主疾患および同種移植片拒絶のような移植関連状態でのアレルギー疾患が含まれる。
本発明の他の実施形態において、組成物および方法は、自己免疫疾患または疾病を処置するために、本明細書で開示された抗体またはその免疫コンジュゲート体を含むことができ提供される。Ｂ細胞を標的とする抗体を用いる自己免疫疾病の免疫治療が、それぞれの内容が、そのすべてが本明細書にて組み込まれている、米国特許仮出願明第６０／１３８，２８４号の優先権を主張している、ＰＣＴ公開特許公報第ＷＯ００／７４７１８号にて記述されている。例示的自己免疫疾患には、限定はしないが、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、溶連菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、血栓血管炎動脈硬化、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変症、橋本甲状腺炎、甲状腺機能亢進症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬および線維化肺胞炎が含まれる。
本発明の他の実施形態において、癌、肉腫、グリオーマ、リンパ腫、白血病または皮膚がんからなる群より選択される疾病を処置するために組成物および方法が提供される。がんは、皮膚、食道、胃、大腸、直腸、膵臓、肺、乳、卵巣、膀胱、子宮内膜、頸部、膀胱、腎臓、副腎または肝臓がんからなる群より選択され得る。Ｂ細胞関連疾患は、無痛性Ｂ細胞リンパ腫、悪性Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、ワルデンストレームマクログロブリン血症、または多発性骨髄腫であり得る。さらに、Ｂ細胞関連疾患は、ヒトまたは家畜型の疾患であり得る。他方Ｔ細胞関連疾患には、ヒトまたは他の哺乳動物Ｔ細胞白血病またはリンパ腫、皮膚乾癬、乾癬性関節炎または菌状息肉腫が含まれ得る。１つの実施例において、代謝性疾患は、アミロイドーシスであり得る。１つの実施例において、神経変性疾患は、アルツハイマー病であり得る。
また、本発明の１つの実施形態にて本明細書で意図されるものは、任意の以下の疾患または疾病の処置のための組成物として免疫コンジュゲート体を含む抗体の使用であり、前期疾患または疾病は、免疫調節不全疾患、自己免疫疾患、器官移植片拒絶、移植片対宿主疾患、代謝性疾患（たとえばアミロイドーシス）、および神経変性疾患（たとえばアルツハイマー病）からなる群より選択される。悪性疾患または疾病は、固形腫瘍、造血系腫瘍（リンパ腫、白血病、ミエローマなど）からなる群より選択される。固形腫瘍は、メラノーマ、カルシノーマおよびサルコーマからなる群より選択され、カルシノーマは、腎臓がん、乳がん、肺がん、胃腸がんおよび尿生殖器がんからなる群より選択される。Ｂ細胞悪性腫瘍は、無痛性Ｂ細胞リンパ腫、悪性Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、ワルデンストレームマクログロブリン血症および多発性骨髄腫からなる群より選択される。免疫調節不全疾患における敗血症および敗血性ショックを含む多くの自己免疫および免疫調節不全疾患のような非悪性Ｂ細胞疾病および関連疾患も存在する（免疫調節不全疾患のリストは、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈａｎｓｅｎによって、２００４年１２月８日に提出された米国特許仮出願明第６０／６３４，０７６号にてより包括的に見ることができ、そのすべてが本明細書に組み込まれている）。特に、本明細書で記述された組成物が、種々の自己免疫疾患、ならびに無痛性Ｂ細胞リンパ腫、悪性Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、多発性骨髄腫およびワルデンストレームマクログロブリン血症、ならびに急性および慢性骨髄性白血病およびＴ細胞白血病およびリンパ腫のような他の造血性悪性腫瘍の処置のために特に有用である。たとえば、ｈＬ２４３抗体成分および免疫コンジュゲート体を、好ましくは、無痛型および悪性型の非ホジキンリンパ腫およびリンパ性白血病両方を処置するために使用可能である。
他の実施形態において、本発明のヒト化、キメラおよびヒトＬ２４３抗体を、必要に応じて、ヒト、および限定はしないがイヌ、ネコ、ウマおよびウシを含む家畜哺乳動物を含む全ての哺乳動物における、上記疾患および疾病を処置するために使用してもよい。
１つの特定の実施形態において、Ｂ細胞悪性腫瘍を処置するための方法には、薬学的に許容可能な担体、治療薬剤、およびＬ２４３抗体またはその成分（たとえば、ヒト化、キメラ、またはヒトＬ２４３抗体またはその断片またはその抗体融合タンパク質）を含む免疫コンジュゲート体を含む治療組成物を、Ｂ細胞関連悪性腫瘍を患っている対象に投与することが含まれてもよく、そこで、Ｂ細胞悪性腫瘍はリンパ腫または白血病である。より詳しくは、Ｂ細胞悪性腫瘍は、無痛型のＢ細胞リンパ腫、悪性のＢ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、または急性リンパ性白血病である。より特定の実施形態において、免疫コンジュゲート体または免疫コンジュゲート体を含む組成物を、Ｂ細胞悪性腫瘍を検出または処置するために使用される少なくとも１つの追加治療薬剤または診断薬剤の投与の前、同時または後に、免疫コンジュゲート体または組成物を投与することをさらに含んで、約２０〜２０００ｍｇの用量で、静脈内または筋肉内に投与してもよい。たとえば、追加薬剤には、治療または診断薬剤を含む、本明細書に記述されたような追加免疫コンジュゲート体が含まれ得る。これらの実施形態にしたがって、治療薬剤には、裸の抗体、免疫調節物、ホルモン、細胞傷害性薬剤、酵素、および／または少なくとも１つの免疫調節物にコンジュゲートした抗体、放射活性標識、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、干渉ＲＮＡ、または細胞傷害性薬剤、またはこれらの組み合わせが含まれ得る。１つの特定の実施例において、免疫調節物はサイトカインであってもよく、細胞傷害性薬剤は、薬物または毒素であってもよい。より特定の実施形態において、裸の抗体としてまたは補助免疫コンジュゲート体としての組み合わせで投与し得る抗体は、好ましくは、ＣＤ４、ＣＤＳ、ＣＤＳ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２６、ＣＤ１３８、ＣＤ１５４、Ｂ７、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１６、ＮＣＡ６６、壊死抗原、ＰＡＭ−４、ＫＳ−１、９０Ｌｅ（γ）、ＭＡＧＥ、１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、テナスシン、ＨＭ１．２４、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、葉酸レセプター、ヒトコリン性ゴナドトロピン、ＣＥＡ、大腸特異的抗原ｐ（ＣＳＡｐ）、インスリン様増殖因子（ＩＬＧＦ）、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）、前立腺酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、Ｔ１０１、ＴＡＧ、ＴＡＧ−７２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、カルボニックアンヒドラーゼＩＸ、ＩＬ−６、ＳＩ００、αフェトプロテイン、Ａ３、ＣＡ１２５、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ６６（ａ、ｂ、ｃ、ｄ）、ＭＡＲＴ−１、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、アミロイドまたはｇｐ１００のような非特異的交差反応抗原と反応する。
悪性腫瘍の処置に、リンパ腫または白血病以外の悪性腫瘍を患う対象に、（１）ｈＬ２４３抗体、またはその免疫コンジュゲート体、および担体と、（２）エフェクターと、（３）薬学的に許容可能な賦形剤を含み得る治療組成物とを投与することが含まれ得ることがまた、本明細書で意図される。組成物は、２０〜２０００ｍｇの用量で静脈内または筋肉内に投与してもよい。さらに、組成物を、少なくとも１つの追加治療薬剤または診断薬剤の投与前、同時または後に投与してもよい。以上および本明細書にわたって記述しているように、治療薬剤には、免疫調節物、ホルモン、細胞傷害性薬剤または結合分子（裸であるか、または少なくとも１つの免疫調節物、放射活性標識、酵素、ホルモン、細胞傷害性薬剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、干渉ＲＮＡまたはそれらの組み合わせにコンジュゲートしているかいずれかであり、前記免疫調節物が好ましくはサイトカインであり、細胞傷害性薬剤が好ましくは薬物または毒素である）を含み得る。治療薬剤または診断薬剤には、本明細書で開示したような組成物または免疫コンジュゲート体が含まれ得る。特定の実施形態において、Ｂ細胞悪性腫瘍ではないが、処置される悪性腫瘍を含む細胞が発現するマーカー（ｈＬ２４３抗体によって認識されるもの以外）と反応し得る悪性腫瘍を処置するために、抗体を治療および／診断組成物との組み合わせで投与してもよく、抗体は薬学的に許容可能な媒体中で処方されるべきである。悪性メラノーマ関連抗原に対して投与し得る抗体の例は、ＭＡＲＴ−１、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２およびｇｐｌＯＯと反応性の抗体である。さらに、多重メラノーマ関連抗原に対する好ましい抗体は、ＭＵＣ１、ＣＤ７４およびＣＤ３８と反応性のものが含まれる。処置のための組成物は、単独で、または他のヒト化、キメラまたはヒト抗体のような他の抗体との組み合わせでＷＬ２４３抗体またはその免疫コンジュゲート体を含み得る。
１つの実施例において、組成物には、エフェクターとして免疫調節物が含まれ得る。本明細書において、語句「免疫調節物」には、サイトカイン類、幹細胞増殖因子類、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のようなリンホトキシン類、およびインターロイキン類（たとえばインターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、およびＩＬ−２１）、コロニー刺激因子類（たとえば顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）および顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭＤＣＳＦ））、インターフェロン類（たとえば、インターフェロン−α、βおよびγ）のような造血性因子類、「ＳＩ因子」と呼ばれる幹細胞増殖因子、エリスロポエチン、トロンボポエチンまたはこれらの組み合わせが含まれる。好適な免疫調節物部分の例には、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１およびその組み合わせ、およびインターフェロン−α、βおよびγ、ＴＮＦ−αおよびβなどが含まれる。１つの実施形態において、免疫調節物は、組成物中で存在してもよいか、または免疫コンジュゲート体を、治療および／診断組成物の投与の前、同時または後に投与可能である。１つの特定の実施形態において、ｈＬ２４３抗体はまた、免疫調節物にコンジュゲートしてもよい。免疫調節物はまた、異なる抗原に結合している１つ以上の抗体からなるハイブリッド抗体にコンジュゲートしてもよい。
１つの実施例において、本明細書にて意図されている多重モデル治療には、追加結合分子（たとえば抗ＣＤ２２、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２１、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ２３、抗ＣＤ４６またはＨＬＡ−ＤＲ、好ましくは、裸抗体、融合タンパク質の形態での、または免疫コンジュゲート体としての、成熟ＨＬＡ−ＤＲダイマー抗体）の投与を加えたｈＬ２４３抗体のような免疫コンジュゲート体での免疫治療が含まれる。さらに、本明細書で記述したような、ミセル、リポソーム、またはナノ粒子には、ｈＬ２４３抗体に加えて、結合分子が含まれ得る。たとえば、抗体は、上記抗原決定基上の少なくとも１つのエピトープを認識する、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒトまたはヒト化抗体であり得る。さらに、抗ＣＤ１９および抗ＣＤ２２抗体が当分野で公知である（たとえば、そのすべてが参考により組み込まれる、Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８：２６１０（１９８８）；Ｈｅｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３２：３６４（１９９１）；Ｌｏｎｇｏ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．８：３５３（１９９６）および米国特許第５，７９８，５５４号および第６，１８７，２８７号を参照のこと）。
１つの特定の実施例において、他の形態の多重モデル治療は、標準のがん化学治療との組み合わせで対象にｈＬ２４３免疫コンジュゲート体を与えるものであってもよい。たとえば、「ＣＶＢ」（１．５ｇ／ｍ2シクロホスファミド、２００〜４００ｍｇ／ｍ2エトポシド、および１５０〜２００ｍｇ／ｍ2カルムスチン）が、非ホジキンリンパ腫を処置するために使用される投与計画である。Ｐａｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．５１：１８（１９９３）。他の好適な組み合わせ化学治療投与計画が、当業者に周知である（たとえば、Ｆｒｅｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，「非ホジキンリンパ腫（Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ）」 Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌｕｍｅ ２，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ ２０２８−２０６８（Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ １９９３））。例示のように、中間グレード非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の処置のための第一世代化学治療投与計画両方には、Ｃ−ＭＯＰＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プロカルバジンおよびプレドニゾン）およびＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾン）が含まれる。本発明の１つの特定の実施形態において、第二世代化学治療投与計画は、ｍ−ＢＡＣＯＤ（メトトレキサート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、デキサメタゾンおよびロウコボリン）であってもよく、好適な第三世代投与計画は、ＭＡＣＯＰ−Ｂ（メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン、ブレオマイシンおよびロウコボリン）である。さらなる治療には、フェニルブチラートおよびブリオスタチン−１が含まれ得る。好ましい多重モデル治療において、化学治療薬物およびサイトカイン両方を、抗体、免疫コンジュゲート体または融合タンパク質と同時投与してもよい。サイトカイン、化学治療薬物および抗体または免疫コンジュゲート体は、任意の順番で、または同時に投与してもよい。
特定の実施形態において、ＮＨＬは４連続週または２週間ごと２５〜７００ｍｇ／ｍ2の用量で（２〜８時間にわたりｉｖ）、必要に応じて次の月／年にわたり繰り返し、より好ましくは、４連続週または２週間ごと１００〜４００ｍｇ／ｍ2（２〜８時間にわたりｉｖ）、必要に応じて次の月／年にわたり繰り返し、ｈＬ２４３免疫コンジュゲート体（たとえば治療組成物）の４週間注入によって処置し得る。さらに、ＮＨＬは、上記のように４半月注入で処理し得るが、同日に、１時間にわたるｉｖ注入として、ｈＬ２４３抗体免疫コンジュゲート体注入の前、間または後いずれかで、３６０ｍｇ／ｍ2の用量で、エプラツズマブ（抗ＣＤ２２ヒト化抗体）と組み合わせ得る。あるいは、ＨＬは、上記のようにｈＬ２４３抗体免疫コンジュゲート体の４週間注入で処理し、イットリウム９０のような治療用のアイソトープにて放射標識したＣＤ２２−ｍＡｂの１回以上の注射と組み合わせてもよい（数週間または数ヶ月の期間にわたる１以上の注入として、５〜３５ｍＣｉ／メートル平方の間の９０−Ｙ用量）。１つの実施例において、ＣＤ２０抗体に対してより低い応答をもつ患者で使用する場合、ＷＬ２４３を、リツキシマブまたはｈＡ２０のようなＣＤ２０抗体と組み合わせてもよい。本実施例にしたがって、後者の組み合わせは、同一の日または週の間いずれかで、各種用量にて連続的にまたは同時に、そしてリツキシマブまたはｈＡ２０に対してｉ．ｖ．注入によって１週間に１回３７５ｍｇ／ｍ2にて投与され、またｉ．ｖ．注入によって、２５０ｍｇ／ｍ2のｈＬ２４３もまた一週間に一回投与し得る。すべての上記の場合において、用量は分画し、連続注入として、または当分野で公知の非経口経路によって投与してもよい。これらはまた、皮下のような他の経路によって投与してもよい。
さらに、１つの実施形態において、本明細書で開示したような治療組成物には、ｈＬ２４３抗体によって認識される、異なる非ブロッキングエピトープに指向するｈＬ２４３免疫コンジュゲート体の混合物またはハイブリッド分子が含まれ得る。本実施形態にしたがって、治療組成物には、ｈＬ２４３抗体に認識される少なくとも２つのエピトープにて結合するｈＬ２４３免疫コンジュゲート体の混合物が含まれ得る。また、本明細書で記述された免疫コンジュゲート体は、種々のＣＤＲ配列を有するｈＬ２４３抗体の混合物を含み得る。
本発明の１つの実施形態において、ｈＬ４２３抗体、またはその免疫コンジュゲート体を、Ｂ細胞リンパ腫および白血病、および他のＢ細胞疾患または疾病、ならびに影響を受けるか関連した悪性腫瘍細胞がｈＬ２４３抗体によって認識されるエピトープと反応性である、他の悪性疾患を処置するために使用してもよい。たとえば、ｈＬ２４３抗体またはその免疫コンジュゲート体は、限定はしないが、たとえば、免疫仲介血小板減少症、たとえば急性特発性血小板減少性紫斑病および慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シューグレン症候群、多発性硬化症、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性紅斑性狼瘡、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、溶連菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎、原発性胆汁性肝硬変症、橋本甲状腺炎、甲状腺機能亢進症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ヴェーゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎および線維化肺胞炎のような、クラスＩＩＩ自己免疫疾患を含む、免疫調節不全疾患および関連自己免疫疾患を処置するために使用してもよい。
より特定の実施形態において、ｈＬ２４３抗体またはその免疫コンジュゲート体または断片、またはその抗体融合タンパク質を、１つ以上の上記の自己免疫疾患を患う対象に投与してもよい。本明細書で開示されたｈＬ２４３抗体は、そのすべてが参考により本明細書に組み込まれる、２０００年６月９日に出願された、表題「Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ Ｔａｇｅｔｓ Ｂ−Ｃｅｌｌｓ」の、係願中米国特許第０９／５９０，２８４号にて開示された、自己免疫疾患を処置する方法において特に有用である。１つの特定の実施形態において、ｈＬ２４３抗体を、２０〜２０００ｍｇの用量で静脈内または筋肉内に投与してもよい。さらに、ｈＬ２４３抗体は、少なくとも１つの治療薬剤または診断薬剤の投与前、間または後に投与してもよい。より特定の実施形態において、本明細書で記述したような治療薬剤には、抗体、免疫調節物、ホルモン、酵素、細胞傷害性薬剤、少なくとも１つの免疫調節物にコンジュゲートした抗体、放射活性標識、ホルモン、酵素または細胞傷害性薬剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、干渉ＲＮＡまたはその混合物を含むことができ、そこで免疫調節物はサイトカインであり、前記細胞傷害性薬剤は薬物または毒素である。たとえば、治療薬剤には、本明細書で記述したような免疫コンジュゲート体が含まれ得る。１つの特定の実施形態において、裸抗体として、または補足免疫コンジュゲート体としての組み合わせで投与し得る抗体には、薬学的に許容可能な媒体中に処方されたＣＤ４、ＣＤＳ、ＣＤＳ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２６、ＣＣＤ１３８、ＣＤ１５４、Ｂ７、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１６、ＮＣＡ６６、壊死抗原、ＰＡＭ−４、ＫＳ−１、Ｌｅ（γ）、ＭＡＧＥ、１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、テナスシン、ＨＭ１．２４、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、葉酸レセプター、ヒトコリン性ゴナドトロピン、大腸特異的抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）、インスリン様増殖因子（ＩＬＧＦ）、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）、前立腺酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、Ｔ１０１、ＴＡＧ、ＴＡＧ−７２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、カルボニックアンヒドラーゼＩＸ、ＩＬ−６、ＳＩ００、αフェトプロテイン、Ａ３、ＣＡ１２５、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ６６（ａ、ｂ、ｃ、ｄ）、ＭＡＲＴ−１、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、アミロイドおよびｇｐｌＯＯのような非特異的交差反応抗原などの特定の抗原、すなわちｍＡｂに反応する抗体が含まれる。
本明細書において、「薬学的組成物」は、担体が薬学的に許容可能な担体である薬物を含む組成物を指し、一方で、「獣医学組成物」は、担体が獣医学的に許容可能な担体であるものである。語句「薬学的に許容可能な担体」または「獣医学的に許容可能な担体」は、生物学的でない、または望まない任意の培地または物質を含むことができ、すなわち担体を、複合体または任意のその組成物または有機体と有害な様式で任意の望まない生物学的効果または相互作用を引き起こすことなく、本発明の組成物または化合物と一緒に、有機体に投与し得る。薬学的に許容可能な試薬の例が、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ＆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，７ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，１９９９であるように、本出願内の本明細書に参考としてそのすべてが組み込まれている、Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ，Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ １９９０にて提供されている。
薬物（すなわち標的化可能構造または複合体）を、患者における所望の効果を産出するために十分な量で薬学的組成物内に含めることができる。本発明の薬学的組成物にはさらに、希釈剤および賦形剤のような他の化学成分を含み得る。「希釈剤（ｄｉｌｕｅｎｔ）」は、溶媒中の薬物の溶解を促進する溶媒、好ましくは水溶液中に希釈された化学化合物であり、薬物または１つ以上のその成分の生物学的活性を安定化するためにも利用可能であり得る。緩衝溶液中に溶解した塩は、当分野で希釈剤として利用される。たとえば、好ましい希釈剤は、１つ以上の異なる塩を含む緩衝溶液である。好ましい緩衝溶液は、ヒト血液の塩状態を模倣するので、（特に、薬学的投与のために意図された組成物との組み合わせでの）リン酸緩衝食塩水である。緩衝塩が、低濃度で溶液のｐＨを制御可能であるので、緩衝希釈剤は生物学的に活性なペプチドの生物学的活性をほとんど改変しない。
本発明の１つの実施形態において、薬学的組成物は、有機体、好ましくは動物、好ましくは哺乳動物へのヒト化抗体の投与を促進する。特定の哺乳動物には、ウシ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジおよびブタ動物、および非ヒト霊長類が含まれる。ヒトが特に好ましい。化合物を投与するまたは伝達する多数の技術が当分野で存在し、限定はしないが、経口、直腸（たとえば浣腸または坐薬）、エアロゾル（たとえば、経鼻または肺伝達のため）、非経口（たとえば、ｉ．ｖ．、ｉ．ｍ．、ｓ．ｃ．）および局所投与が含まれる。好ましくは、十分な量の組成物または化合物を、意図する効果を達成するために伝達し得る。伝達すべき特定の量の組成物または化合物は、達成すべき効果、組成物を伝達する有機体の型、伝達経路、投与計画、および有機体の年齢、健康および性別を含む多くの因子に依存する。そのような所与の処方中の、本明細書で開示された実施形態の組成物または化合物の特定の用量は、当業者の判断に任される（たとえば医療機関の判断）。
当業者は、本発明の薬学的組成物を、（ワクチン化を含む）治療または保護効果を含み得る特定の所望の生物学的結果を達成するために薬剤として投与する場合、本明細書で開示された組成物または化合物を好適な薬学的担体と混合する必要があり得る。薬学的担体の選択、および治療または保護薬剤としての組成物または化合物の調製は、意図する使用および投与の様式に依存する。治療薬剤の投与の好適な処方および方法には、限定はしないが、経口、経肺、経鼻、口腔、眼内、皮膚、直腸または膣伝達のためのものが含まれる。
使用する伝達の様式に依存して、状況依存機能存在物を、種々の薬学的に許容可能な形態中で伝達可能である。たとえば、状況依存機能存在物を、ピル、カプセル、タブレット、坐薬、エアロゾル、液滴またはスプレー内に組み込んだ、固体、溶液、エマルジョン、分散、ミセル、リポソームなどの形態で伝達可能である。ピル、タブレット、坐薬、エアロゾル、粉末、液滴およびスプレーは、複合、多重層構造を有してもよく、大きな範囲のサイズを有する。エアロゾル、粉末、液滴およびスプレーは、サイズにおいて、小（およそ１ミクロン）〜大（およそ２００ミクロン）の範囲であり得る。
本明細書で開示された薬学的組成物は、固体、凍結乾燥粉末、溶液、エマルジョン、分散、ミセル、リポソームなどの形態で使用してもよく、得られた組成物は、腸内または非経口適用のために好適な有機または無機担体または賦形剤との混合で、活性成分として、本発明の実施形態の１つ以上の標的化可能構造または複合体を含む。活性成分は、たとえば、タブレット、ペレット、カプセル、坐薬、溶液、エマルジョン、懸濁液、および使用のために好適な任意の他の形態のために、通常の非毒性、薬学的に許容可能な担体と混合し得る。使用可能な担体には、グルコース、ラクトース、マンノース、アカシアゴム、ゼラチン、マンニトール、デンプンペースト、マグネシウムトリシリケート、タルク、トウモロコシデンプン、ケラチン、コロイドシリカ、ジャガイモデンプン、尿素、中鎖長トリグリセリド、デキストラン、および固体、半固体または液体形態で、調製物を製造することにおいて使用するために好適な他の担体が含まれる。さらに、補助剤、安定剤、増粘剤および着色剤および香料を使用してもよい。安定化乾燥薬剤の例には、好ましくは０．１％以上の濃度でトリウロースが含まれる（たとえば、米国特許第５，３１４，６９５号を参照のこと）。
個々の要求は変化し得るが、有効量の薬学的組成物の最適範囲の決定は、当業者の範囲内である。ヒト用量は、動物研究から推定し得る（Ｋａｔｏｃｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ２７ Ｉｎ：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０）。一般的に、当業者によって適合され得る、薬学的組成物の効果的量を提供するために必要とする用量は、レシピエントの年齢、健康、健康状態、体重、疾患または疾病の型および程度、処置の頻度、（存在するなら）同時治療の性質、および所望の効果の性質および範囲に依存して変化する。たとえば、Ｎｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ３ Ｉｎ：Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｏｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９６を参照のこと）。
治療組成物の投与は、数日から数ヶ月維持される処置の過程で、または治癒が効果を有するか、または疾患状態の減少が達成されるまで、処置されるべき疾患状態の重症度および反応性に依存する。最適投与スケジュールは、患者の体内の薬物蓄積の測定より計算可能である。語句「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」は、動物（たとえばネコ、イヌおよびウマ）ならびにヒトを含むことが意図される。当業者は、最適用量、用量法および繰り返し速度を簡単に決めることが可能である。最適用量は、個々の治療薬剤の相対的強度に依存して変化してもよく、一般的に、インビトロおよびインビボ動物モデルにおいて効果的であると発見されるＥＣ50に基づいて推定可能である。
用量（投与した標的化可能構造または複合体の量）の範囲は、典型的には、異なる哺乳動物のための治療的影響の効果が、ラットでよりもヒトで２０、３０または４０倍小さい（ユニット体重あたり）用量で広く変化するので、広範である。一般に、投与量は、０．０１μｇ〜１００ｍｇ／体重ｋｇ、好ましくは０．０１μｇ〜１０ｍｇ／体重ｋｇ、０．０１μｇ〜５０μｇ／体重ｋｇ、０．０１μｇ〜１００ｍｇ／体重ｋｇ、０．０１μｇ〜１０ｍｇ／体重ｋｇ、０．０１μｇ〜１ｍｇ／体重ｋｇ、０．０１μｇ〜１００μｇ／体重ｋｇ、０．０１μｇ〜１０μｇ／体重ｋｇ、０．０１μｇ〜１μｇ／体重ｋｇ、０．０１μｇ〜１０μｇ／体重ｋｇ、０．０１μｇ〜１μｇ／体重ｋｇ、０．０１μｇ〜０．１μｇ／体重ｋｇであり、先行する濃度範囲の境界に基づいて及ぶ。したがって、たとえば先行する用量の記述は、１０ｍｇ〜１００ｍｇ／体重ｋｇ、１．０ｍｇ〜１００ｍｇ／体重ｋｇ、０．１ｍｇ〜１００ｍｇ／体重ｋｇなどの範囲内での投与量を包含する。
１つの実施形態において、投与は、１以上、毎日、毎週、毎月または毎年、または２〜５以上の年ごとに１回与えられ得る。当業者は、標的化可能構造物または複合体の、体液または組織中の測定残余時間および濃度に基づいた投与の繰り返し頻度を推定し得る。成功した処置に続いて、疾患状態の再発を防止するために患者に対して治療を維持することが望ましく、そこで、治療薬剤は、０．０１ｕｇ〜１００ｍｇ／体重ｋｇの範囲で、１日１回以上から毎５年に１回まで、維持用量で投与される。
１つの実施形態において、特定の用量は、患者のおよその体重または表面積にしたがって計算してもよい。適切な用量を決定することにおける他の因子には、処理または予防されるべき疾患または状態、疾患の重症度、投与経路、患者の年齢、性別および病状が含まれ得る。処置のための適切な用量を決定するために必要な計算のさらなる改良が、特に本明細書で開示された用量情報およびアッセイの観点から、当業者によって日常的に実施される。用量はまた、適切な用量反応データと組み合わせて使用する用量を決定するための公知のアッセイの使用を介して決定可能である。
１つの実施形態において、個々の患者の投与量は、疾患の進行をモニターすることで適合してもよい。標的化可能構造または複合体の患者内での血液レベルを、所望の結果を得るために投与量を適合する必要があるかどうか見るために測定してもよい。
１つの実施例において、薬理ゲノミクスを使用して、標的化可能構造および／または複合体、およびその用量が、該個体に対して最も効果的であり得るかを決定してもよい（Ｓｃｈｍｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａ ＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ ３０８：４３−５３，２００１；Ｓｔｅｉｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａ ＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ ３０８：３３−４１，２００１）。
本明細書で開示されたヒト化抗体の投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、くも膜下、腔内、カテーテルを介したかん流によって、または直接病巣内注入によってを含む非経口であり得る。この投与にしたがって、抗体を、１日１回以上、毎週１回以上、毎月１回以上、および毎年１回以上投与してもよい。
本明細書で言及したか、または引用した文献、特許、および特許出願、およびすべての他の文書および電子的に入手可能な情報は、それぞれの個々の刊行物が、特別にそして個々に、参考により組み込まれるべきと示唆される場合と同様の程度まで、それらのすべてが参考により本明細書に組み込まれる。本出願者らは、任意のそして任意のそのような文献、特許、特許出願または他の分子からのすべての要素および情報を本出願に物理的に組み入れる権利を有する。
本明細書で例示的に記述した実施形態は、本明細書で特に開示されたものでない、任意の要素または要素類、制限または制限類の非存在下で好適に実施することができる。したがって、たとえば語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などは、発展的に、そして制限なしに読まれるべきである。さらに、本明細書で使用する語句および表現は、制限の語としてでなく、記述の語として使用されており、そのような語句および表現の使用において、示され記述された特徴の任意の等価物、またはその部分を除く意図はないが、しかし、種々の改変が請求した本発明の範囲内である可能性があることが認識される。したがって、本発明は、好ましい実施形態および最適な特徴によって特に開示されてはいるけれども、本明細書で開示された改変および変化様態が当業者によって再分類され得ること、およびそのような改変および変化が、本発明の範囲内であることが考えられることが理解されるべきである。
本発明の実施形態は本明細書で広く、そして一般的に記述されている。一般的開示の範囲内に含まれる、それぞれのより狭い種および亜属グループ化がまた、本発明の一部を形成し得る。これには、切除物質が特に本明細書で引用されているかどうかにかかわらず、属から任意の対象事象を除去する条件またはネガティブな制限をともなう、本明細書の一般的な記述が含まれる。
さらに、特徴または態様が、Ｍａｒｋｕｓｈのグループの語句によって記述されている場合、当業者は、実施形態が、Ｍａｒｋｕｓｈのグループの任意の個々のメンバー、またはメンバーのサブグループに関して記述されていることを認識する。
実施形態はさらに、以下の実施例および詳細なプロトコールによって例示されている。しかしながら、実施例は単に、実施形態を例示する目的のみであり、本明細書の範囲を制限するために構築されるわけではない。本出願にわたり引用されているすべての参考文献、および刊行された特許および特許出願の内容が、参考により本明細書に組み込まれる。
ヒト化Ｌ２４３抗体の構築
＜Ｌ２４３ＶｋおよびＶＨ遺伝子の分子クローニング＞
１つの例示的方法において、ｍＡｂ−ｍＬ２４３を産出しているハイブリドーマ細胞クローンを、１０％ＦＢＳ（ハイクロン（Ｈｙｃｌｏｎｅ））で補充されるＨＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）中で培養した。ｍＬ２４３のＶＫ（ＶＫ１ＢＡＣＫ／ＣＫ３’）およびＶＨ（ＶＨ１ＢＡＣＫ／ＶＨ１ＦＯＲ）をコードする遺伝子を、ＲＴ−ＰＣＲによってクローン化し、配列をＤＮＡシークエンシングによって決定した。多重独立クローンを配列決定して、ＰＣＲ反応からの結果である可能性があるエラーを排除した。
＜ｈＬ２４３のＶ遺伝子の配列デザイン＞
１つの実施例において、Ｋａｂａｔデータベース中のヒトＶＫおよびＶＨ配列を検索することによって、ｍＬ２４３のＶＫおよびＶＨのＦＲが、それぞれヒトＲＥＩのＶＫおよびＲＦ−ＴＳ３のＶＨに対する高程度の配列相同性を示すことがわかった。１つの例外は、ｍＬ２４３ＶＨのＦＲ４であって、これは、ＮＥＷＭのＶＨと最も高い配列相同性を示した。したがって、１つの実施例において、ヒトＲＥＩフレームワーク配列を、ｍＬ２４３ＶＫのＣＤＲを接ぐための足場として使用し（図５）、ＲＦ−ＴＳ３およびＮＥＷＭフレームワーク配列の組み合わせをｈＬ２４３Ｖｎのために使用した（図６）。実際、ｈＬ２４３ のＶＨは、他のヒト化Ａｂ、ｈＲＳ７（Ｇｏｖｉｎｄａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．８４，１７３−１８２，２００４）のものと同一のヒトＶＨフレームワークを有する。開始ヒト抗体フレームワークと比較した場合、ＣＤＲ領域の外の各鎖中に多数のアミノ酸変化が存在する。推定ＣＤＲに隣接したマウスＦＲ中の種々のアミノ酸残基が、すでに確立されたガイドライン（Ｑｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９９）５ ３０９５ｓ−３１００ｓ）に基づいて、再形成されたｈＬ２４３ Ｆｖ中で維持された。これらの残基は、ｍＬ２４３のＶｋのＲ３７、Ｋ３９、Ｖ４８、Ｆ４９およびＧ１００、およびｍＬ２４３ ＶＨのＦ２７、Ｋ３８、Ｋ４６、Ａ６８およびＦ９１である（それぞれ図３および４）。また、それぞれｈＬ２４３のＶＬおよびｈＬ２４３ＶＨの配列に関して、それぞれ配列番号３および４を参照のこと。
＜ｈＬ２４３のＶ配列の構築＞
Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５）３２ １４１３−１４２７）によって記述されたような改変戦略を使用して、図４で例示したような長オリゴヌクレオチドシンターゼとＰＣＲの組み合わせを用いて、ｈＬ２４３に対する設計されたＶＫおよびＶＨ遺伝子を構築した。ｈＬ２４３のＶＨドメインの構築のために、２つの長オリゴヌクレオチド、ｈＬ２４３ＶＨＡ（１７５塩基）およびｈＬ２４３ＶＨＢ（１６８塩基）を、自動化ＤＮＡ合成器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）上で合成した。
ｈＬ２４３ＶＨＡは、ＨＬ２４３ＶＨドメインのｎｔ２３〜１９７を表している。
５’−ＧＧＴＣＴＧＡＧＴＴ ＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴ ＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧ ＴＧＡＡＧＧＴＴＴＣ ＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴ ＴＣＴＧＧＡＴＴＴＡ ＣＣＴＴＣＡＣＡＡＡ ＣＴＡＴＧＧＡＡＴＧ ＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡ ＡＧＣＡＧＧＣＣＣＣ ＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧ ＣＴＴＡＡＧＴＧＧＡ ＴＧＧＧＣＴＧＧＡＴ ＡＡＡＣＡＣＣＴＡＣ ＡＣＴＡＧＡＧＡＧＣ ＣＡＡＣＡＴＡＴＧＣ ＴＧＡＴＧＡＣＴＴＣ ＡＡＧＧＧ−３’（配列番号１６）ｈＬ２４３ ＶＨＢは、ｎｔ１７６〜３４３に相補的なｈＬ２４３ＶＨドメインのマイナス鎖を表している。
５’−ＡＣＣＣＴＴＧＧＣＣ ＣＣＡＧＴＡＧＴＣＡ ＡＡＡＣＣＣＧＴＡＧ ＧＴＡＣＡＡＣＣＧＣ ＡＧＴＡＡＴＡＴＣＴ ＣＴＴＧＣＡＣＡＧＡ ＡＡＴＡＣＡＣＧＧＣ ＡＧＴＧＴＣＧＴＣＡ ＧＣＣＴＴＴＡＧＧＣ ＴＧＣＴＧＡＴＣＴＧ ＧＡＧＡＴＡＴＧＣＣ ＧＴＧＣＴＧＡＣＡＧ ＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡ ＧＧＡＧＡＡＧＧＣＡ ＡＡＣＣＧＴＣＣＣＴ ＴＧＡＡＧＴＣＡＴＣ ＡＧＣＡＴＡＴＧ−３’（配列番号１７）。
ｈＬ２４３ＶＨＡおよびＢの３’末端配列（２２ｎｔ残基）は、上記配列中で下線を引いたように、互いに相補的である。１つの実施例において、定義されたＰＣＲ条件下、ｈＬ２４３ＶＨＡおよびＢの３’末端がアニールし、残りの長オリゴヌクレオチドによって隣接された短い二本鎖ＤＮＡを形成する。それぞれのアニールした末端が、ＰＣＲ反応中の一本鎖ＤＮＡの複製に対するプライマーとして働き、結果として、ｈＬ２４３ＶＨのｎｔ２３〜３４３からなる二本鎖ＤＮＡとなる。このＤＮＡをさらに、短いオリゴヌクレオチドプライマー対、ｈＲＳ７ＶＨＢＡＣＫおよびｈＬ２４３ＶＨＦＯＲの存在下で増幅させ、全長ｈＬ２４３ＶＨを形成した。この領域でのｈＲＳ７ＶＨとｈＬ２４３ＶＨ間の配列同一性のために、ｈＲＳ７Ａｂのために先に設計され、使用されたｈＲＳ７ＶＨＢＡＣＫをここで使用した。
ｈＲＳ７ＶＨＢＡＣＫ ５’−ＧＴＧＧＴＧＣＴＧＣ ＡＧＣＡＡＴＣＴＧＧ ＧＴＣＴＧＡＧＴＴＧ ＡＡＧＡＡＧＣＣ−３’（配列番号１８）
ｈＬ２４３ＶＨＦＯＲ ５’−ＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧ ＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧ ＡＣＣＣＴＴＧＧＣＣ ＣＣＡＧＴＡＧＴ−３’（配列番号１９）。
本実施例において、（実験的に決定された）最小量のｈＬ２４３ＶＨＡおよびＢを、１０μｌの１０×ＰＣＲ−Ｂｕｆｆｅｒ（５００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣＬ緩衝液、ｐＨ８．３、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2）、２μｍｏｌのｈＲＳ７ＶＨＢＡＣＫおよびｈＬ２４３ＶＨＦＯＲ、および２．５ユニットのＴａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ、Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）の存在下で増幅した。この反応混合液を９４℃にて１分間の変性、４５℃にて１分間のアニーリング、および７２℃にて１．５分間の重合化からなる３サイクルのＰＣＲ反応と、続く、９４℃にて１分間の変性、５５℃にて１分間のアニーリング、および７２℃にて１分間の重合化からなる２７サイクルのＰＣＲ反応にかけた。ｈＬ２４３ＶＨに対する二本鎖ＰＣＲ増幅産物をゲル精製し、ＰｓｔＩおよびＢｓｔＥＩＩにて制限消化し、重鎖ステージングベクター、ＶＨｐＢＳ４の相補的ＰｓｔＩ／ＢｓｔＥＩＩ部位でクローン化した。
１つの実施例において、ヒト化ＶＫ配列の全長ＤＮＡを構築するために、ｈＬ２４３ＶＫＡ（１５５塩基）およびｈＬ２４３ＶＫＢ（１５５塩基）を以上で記述したように合成した。ｈＬ２４３ＶＫＡおよびＢを、上述のように、２つの短いオリゴヌクレオチドｈｌｍｍｕ３１ＶＫＢＡＣＫおよびｈｌｍｍｕ３１ＶＫＦＯＲによって増幅した。ｈｌｍｍｕＳ１ＶＫＢＡＣＫおよびｈｌｍｍｕＳ１ＶＫＦＯＲを設計し、前もってヒト化抗ＡＦＰ−Ａｂに対して使用した（Ｑｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９９）５ ３０９５−３１００）。
ｈＬ２４３ＶＫＡは、ｈＬ２４３ＶＤドメインのｎｔ２１〜１７５を表している。
５’−ＴＣＣＡＴＣＡＴＣＴ ＣＴＧＡＧＣＧＣＡＴ ＣＴＧＴＴＧＧＡＧＡ ＴＡＧＧＧＴＣＡＣＴ ＡＴＣＡＣＴＴＧＴＣ ＧＡＧＣＡＡＧＴＧＡ ＧＡＡＴＡＴＴＴＡＣ ＡＧＴＡＡＴＴＴＡＧ ＣＡＴＧＧＴＡＴＣＧ ＴＣＡＧＡＡＡＣＣＡ ＧＧＧＡＡＡＧＣＡＣ ＣＴＡＡＡＣＴＧＣＴ ＧＧＴＣＴＴＴＧＣＴ ＧＣＡＴＣＡＡＡＣＴ ＴＡＧＣＡＧＡＴＧＧ ＴＧＴＧＣ−３’（配列番号２０）
ｈＬ２４３ ＶＫＢは、ｎｔ１５４〜３１２に相補的なｈＬ２４３ＶＫドメインのマイナス鎖を表している。
５’−ＣＡＧＣＴＴＧＧＴＣ ＣＣＴＣＣＡＣＣＧＡ ＡＣＧＣＣＣＡＣＧＧ ＡＧＴＡＧＴＣＣＡＡ ＡＡＡＴＧＴＴＧＡＣ ＡＡＴＡＡＴＡＴＧＴ ＴＧＣＡＡＴＧＴＣＴ ＴＣＴＧＧＴＴＧＡＡ ＧＡＧＡＧＣＴＧＡＴ ＧＧＴＧＡＡＡＧＴＡ ＴＡＡＴＣＴＧＴＣＣ ＣＡＧＡＴＣＣＧＣＴ ＧＣＣＡＧＡＧＡＡＴ ＣＧＣＧＡＡＧＧＣＡ ＣＡＣＣＡＴＣＴＧＣ ＴＡＡＧＴＴＴＧＡ−３’（配列番号２１）
ｈＩｍｍｕ３１ ＶＫＢＡＣＫ
５’−ＧＡＣＡＴＴＣＡＧＣ ＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣ ＴＣＣＡＴＣＡＴＣＴ ＣＴＧＡＧＣＧＣ−３’（配列番号２２）
ｈＩｍｍｕ３１ ＶＫＦＯＲ
５’−ＣＣＧＧＣＡＧＡＴＣ ＴＧＣＡＧＣＴＴＧＧ ＴＣＣＣＴＣＣＡＣＣ Ｇ−３’（配列番号２３）。
本実施例におけるｈＬ２４３ＶＫに関するゲル精製ＰＣＲ産物を、ＰｖｕＩＩおよびＢｇｌＨＩで制限消化し、軽鎖ステージングベクター、ＶＫｐＢＲ２の相補的ＰｖｕＩ／ＢｃｌＩ部位内にクローン化した。最終発現ベクターｈＬ２４３ｐｄＨＬ２は、上記のようにｐｄＨＬ２へｈＬ２４３ＶｉｃおよびＶＨのＸｂａｌ−ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ断片それぞれを連続サブクローニングによって構築した。
＜ｈＬ２４３抗体に対する発現ベクターの構築＞
１つの実施例において、最終発現ベクターｈＬ２４３ｐｄＨＬ２を、先に記述されたように（Ｌｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ，８０：２６６０（１９９７））、それぞれｈＬ２４３ＶｘおよびＶＨのＸｂａｌ−ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ断片を、ｐｄＨＬ２内に連続サブクローニングすることによって構築した。Ｇｉｌｌｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１（１９８９））によって記述されたような、発現ベクターｐｄＨＬ２は、ヒトｙｌ鎖のゲノム配列を含み、したがって、ｈＬ２４３はＩｇＧ１／Ｋイソタイプである。
１つの例示的方法において、ＩｇＧ４／Ｋのような、他のイソタイプのｈＬ２４３に対する発現ベクターを構築するために、ヒトγ１鎖のゲノム配列を、ＰＣＲ増幅によって得たγ４鎖のものと置換した。使用した鋳型は、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１１３９７細胞から抽出したゲノムＤＮＡであり、プライマー対はＰ−ＳａｃＩＩ（５’−ＣＣＧＣＧＧＴＣＡＣＡＴＧＧＣＡＣＣＡ ＣＣＴＣＴＣＴＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡ ＡＧＧＧＣＣＣ−３’）（配列番号２４）およびＰ−ＥａｇＩ（５’−ＣＣＧＧＣＣＧＴＣＧ ＣＡＣＴＣＡＴ ＴＴＡ ＣＣＣＡＧＡＧＡＣＡ ＧＧＧ−３’）（配列番号２５）であった。増幅ＰＣＲ産物は、ＴＯＰＯ−ＴＡシークエンシングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へクローン化し、配列はＤＮＡシークエンシングによって確認した。
（Ｋａｂａｔ番号付けに基づく）点変異、Ｓｅｒ２４１Ｐｒｏを、γ４配列のヒンジ領域に導入して、ＩｇＧ４−Ａｂが哺乳動物培養液中に発現した場合に半分子の形成を避けた（Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：１（２００１））。ＰｓｔＩおよびＳｔｕＩ制限部位間のヒトγ４ヒンジ領域配列（５６ｂｐ）を、Ｓｅｒ２４１のためのＴＣＡコドンの、ＰｒｏのためのＣＣＧへの置換を有する合成ＤＮＡ断片で置換した。ｈＬ２４３ｐｄＨＬ２中のヒトγ１ゲノム配列を、突然変異誘発ｙ４配列で置換し、結果として、ＩｇＧ４アイソタイプｈＬ２４３に対する、ｈＬ２４３γ４ＰｐｄＨＬ２と呼ばれる最終発現ベクターを得た。
＜ｈＬ２４３抗体のトランスフェクションおよび発現＞
１つの例示的方法において、およそ３０μｇのｈＬ２４３またはｈＬ２４３γ４Ｐに対する発現ベクターを、Ｓａｉｌと共に消化することによって直線化し、エレクトロポレーション（４５０Ｖおよび２５ｕＦ）によってＳｐ２／０−Ａｇｌ４細胞内にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を２日間、９６ウェルプレート中にまき、次いで、最終濃度０．０２５ｐＭにて培地中にＭＴＸを加えることによって薬物耐性に関して選別した。２〜３週間、ＭＴＸ−耐性コロニーがウェル中で出現した。選別を耐えたコロニーの上清を、ＥＬＩＳＡアッセイによってヒトＡｂ分泌のためにスクリーンした。簡単に記すと、１００ｕｌ上清を、ＧＡＨ−ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２断片特異的Ａｂにて先にコートしたマイクロタイタープレートのウェル内に加え、１時間室温にてインキュベートした。未結合のタンパク質を、洗浄緩衝液（０．０５％ポリソルベート２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄することによって除去した。ＨＲＰ−コンジュゲートＧＡＨ−ＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的Ａｂをウェルに加えた。１時間のインキュベーション後、プレートを洗浄した。結合したＨＲＰ−コンジュゲートＡｂを、４ｍＭのＯＰＤおよび０．０４％のＨ2Ｏ2を含む基質溶液の添加後、Ａ490ｎｍを読むことによって明らかにした。陽性細胞クローンを増殖させ、ｈＬ２４３およびｈＬ２４３γ４Ｐを、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａカラム上のアフィニティクロマトグラフィーによって細胞培養上清より精製した。
＜ｈＬ２４３のＡｇ結合特異性＞
１つの実施例において、ＨＬ２４３のＡｇ結合活性および特異性を、細胞表面結合アッセイによって示した。Ｒａｊｉ細胞を、飽和濃度の精製ｈＬ２４３（２０μｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳ／ＢＳＡ（１％）中で、１時間、４℃にてインキュベートした。洗浄後、細胞表面結合ｈＬ２４３を、ＰＥ−コンジュゲート２nd抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的）を含む緩衝液中でＲａｊｉ細胞をインキュベートし、Ｇｕａｖｅ−ＰＣＡ系（Ｇｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｈａｙｗｏｒｄ、ＣＡ）にて計数することによって検出した。図７で示すように、結合がｍＬ２４３での細胞のプレインキュベーションによって特異的にブロックされるので、ｈＬ２４３は、ｍＬ２４３によって認識されるＲａｊｉ細胞上の抗原に結合し、これはｍＬ２４３のＡｇ結合特異性がヒト化バージョンにて保存されていることを示している。
ｈＬ２４３γ４ＰのＡｇ結合活性
１つの例示的方法において、競合細胞結合アッセイを実施して、親ｍＬ２４３と比較したｈＬ２４３γ４Ｐの免疫活性を査定した。一定量の125Ｉ−標識化マウスＬ２４３またはｈＬ２４３γ４Ｐ（１００，０００ｃｐｍ、−１０ｕＣｉ／ｕｇ）を、種々の濃度（０．２〜７００ｎＭ）の精製ｈＬ２４３γ４ＰまたはマウスＬ２４３の存在下で、４℃にて１〜２時間、ヒトリンパ腫細胞（Ｒａｊｉ、ＤａｕｄｉまたはＲａｍｏｓ）とインキュベートした。未結合Ａｂを、ＰＢＳ中で細胞を洗浄することによって除去した。細胞に結合した放射活性を洗浄後決定した。図８で示すように、マウスＬ２４３およびｈＬ２４３γ４Ｐ ｍＡｂが、細胞表面抗原への結合に関して互いに競合し、これは、これらが同一の抗原性決定基を認識することを示唆している。ｈＬ２４３γ４Ｐは、ｍＬ２４３よりもよく競合するために、ｍＬ２４３よりも見かけ上約２倍強い結合活性を示した（ＥＣ50 約７ｎＭ対約１６．５ｎＭ）。
ｈＬ２４３γ４Ｐの抗原結合親和定数を、放射標識抗体の直接細胞表面結合アッセイおよびスキャッチャードプロット解析によって決定した。特異的細胞表面抗原結合を測定するために、２つの組の細胞を調製し、それぞれ放射活性の非特異的および総結合を推定するために結合アッセイにて使用した。非特異的結合のための細胞を、放射標識抗体を加える前にすべての表面抗原部位をブロックするために過剰な量の非標識化Ａｂでプレインキュベートし、一方、総結合のためのものは、ＰＢＳ中でプレインキュベートした。プレインキュベーション後、種々の量の、125Ｉ−ｈＬ２４３γ４Ｐまたは125Ｉ−ｍＬ２４３いずれかを加え、２×１０5のヒトリンパ腫細胞（Ｒａｊｉ、ＤａｕｄｉまたはＲａｍｏｓ）とともに、４℃にて２時間インキュベートし、未結合抗体を洗浄により除去した。細胞に結合した放射活性を計数した。所与の濃度の放射標識抗体における放射標識抗体の特異的細胞表面結合を、総結合基質の数より非特異的結合の数から差し引いて計算した。次いでスキャッチャードプロット解析を実施して、細胞あたりのｈＬ２４３γ４ＰおよびｍＬ２４３結合部位の最大数、および平衡結合の見かけ解離定数を決定した。図９にて示すように、ｈＬ２４３γ４ＰおよびｍＬ２４３のＤａｕｄｉ細胞への最大結合は実質的に同一であり、約６×１０5分子／細胞であり、これは、これらが同一のＡｇに結合したことを示している。ｈＬ２４３γ４ＰおよびｍＬ２４３に対する見かけ解離定数値は、それぞれ２．６および１４ｎＭと計算された。同様の結果が、ＲａｊｉおよびＲａｍｏｓ細胞にて得られた（データは示していない）。
＜ｈＬ２４３γ４Ｐ機能性研究＞
１つの例示的方法において、インビトロの細胞に基づく研究を実施して、ｈＬ２４３γ４Ｐがその抗増殖性効果を維持したかどうか、およびエフェクター細胞および補体結合機能が無効にされたかどうかを決定した。この実施例において、以下で記述した研究によって、抗増殖性効果が維持されたが、エフェクター細胞および補体結合機能は無効にされたことが示唆されている。
＜エフェクター細胞アッセイ＞
ｈＬ２４３のＦｃ領域を、ＩｇＧ４イソタイプＦｃ領域で置換する目的は、Ｆｅｙ−レセプターおよび補体結合を通した、エフェクター細胞機能を無効にすることであった。ＣＤＣおよびＡＤＣＣアッセイを実施して、ｈＬ２４３ｙ４Ｐによるこれらの機能を査定した。
＜ＣＤＣ＞
Ｄａｕｄｉ細胞を、ヒト補体の存在下で２時間、抗体ｈＬ２４３、ｈＬ２４３γ４Ｐ、ｈＡ２０（他の陽性対照として）およびｈＭＮ１４（陰性対照）の連続希釈とともにインキュベートした。次いで細胞生存を査定するためにレサズリンを添加した。未処理および最大溶解対照両方を含めた。蛍光読み取りをレサズリン添加後５時間得た。得られた蛍光レベルは生細胞の量と直接相関する。％生細胞を式（試験−最大溶解）／（未処理対照−最大溶解）×１００によって計算した。結果によって、ｈＬ２４３γ４Ｐは、ｈＬ２４３（ＥＣ50＝２．６ｎＭ）およびｈＡ２０（ＥＣ50＝０．６６ｎＭ）と比較して、細胞上で任意の補体仲介細胞傷害性効果を産出しないことが示されている。図１０を参照のこと。
＜ＡＤＣＣ＞
Ｄａｕｄｉ細胞を、５μｇ／ｍｌにてｈＡ２０、ｈＬ２４３、ｈＬ２４３γ４ＰおよびｈＭＮ−１４とともにインキュベートした。エフェクター細胞を５０：１の比で加えた。４時間後、細胞溶解を、ＬＤＨ放出（図１１Ａ）および細胞溶解によってアッセイした（図１ＩＢ）。
抗体のみの効果がエフェクター細胞上で見られたこれらの結果において、ＫＬ２４３が有意なエフェクター細胞の溶解を誘導し、一方でｈＬ２４３γ４Ｐは示さなかったことを見ることができる。特異的溶解数が、エフェクター細胞における効果に補正される場合、ｈＬ２４３γ４Ｐは、ｈＬ２４３と比較して標的細胞の溶解を非常に減少させたことが示されている（１２％対４８％）。
＜インビトロ増殖アッセイ＞
ＭＴＳ生体内還元性（生細胞の数の決定のため）、およびＢｒｄＵ（ＤＮＡ合成の間のＢｒｄＵ組み込みの測定に基づく細胞増殖の定量化のため）両方を用いる多重比色アッセイを実施した。ＤａｕｄｉおよびＲａｊｉ細胞を、２および３日間、ｈＬ２４３γ４Ｐの連続希釈とともにインキュベートした。ｍＬ２４３およびｈＭＮ−１４をそれぞれ陽性および陰性対照として使用した。インキュベーション後、ＢｒｄＵおよびＭＴＳアッセイを実施した。ＭＴＳアッセイの結果を以下に示している。ＢｒｄＵアッセイが同様の結果を示した。
１つの例示的方法において、ＭＴＳ生体内還元性（生細胞の数の決定のため）、およびＢｒｄＵ（ＤＮＡ合成の間のＢｒｄＵ組み込みの測定に基づく細胞増殖の定量化のため）両方を用いる多重比色アッセイを実施した。ＤａｕｄｉおよびＲａｊｉ細胞を、２および３日間、ｈＬ２４３γ４Ｐの連続希釈とともにインキュベートした。マウスＬ２４３およびｈＭＮ１４をそれぞれ陽性および陰性対照として使用した。インキュベーション後、ＢｒｄＵおよびＭＴＳアッセイを実施した。ＭＴＳアッセイの結果を図１２および１３で示している。ＢＲＤＵアッセイが同様の結果を示した（示してはいない）。これらの結果によって、ｈＬ２４３γ４ＰがＲａｊｉおよびＤａｕｄｉ細胞株の増殖を阻害することが示される。しかしながら、ＥＢＶ陰性細胞株Ｒａｍｏｓでの同様の実験において、増殖の阻害は、架橋抗Ｆｃ（Ｆａｂ）2の存在下でのみ観察された。
＜ヒト非ホジキンリンパ腫の異種移植モデルにおけるｈＬ２４３γ４ＰおよびｍＬ２４３（ＩｇＧ２ａ）のインビボ効果の比較＞
１つの例示的方法において、治療的研究を実施して、ヒト非ホジキンリンパ腫（Ｒａｊｉ）の異種移植モデルにおけるヒト化Ｌ２４３−ＩｇＧ４およびマウスＬ２４３−ＩｇＧ２ａモノクローナル抗体イソタイプのインビボ効果を比較した。先のインビトロ研究によって、ＩｇＧ４イソタイプでのＬ２４３−ＩｇＧ１のＦｃ領域の置換が、抗体のエフェクター細胞機能（ＡＤＣＣおよびＣＤＣ）を無効にし、一方で抗増殖効果を維持することが示された。ＩｇＧ４イソタイプとして改変された完全なヒト抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体を用いた先の研究がまた、Ｆｃ部分を介したエフェクター機能のために副作用を最小化し、一方で、長期血液学的影響なしに、非ホジキンリンパ腫の異種移植モデル、および動物モデル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｕｓサル）におけるインビトロおよびインビボでの素晴らしい殺腫瘍活性が提供されることを示した。Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，８：８０１（２００２）を参照のこと。したがって、本研究は、ｈＬ２４３−ＩｇＧ４が、異種移植モデルにおける有意な抗腫瘍効果を維持し得るかどうかを決定することを目的とした。十分な量のｈＬ２４３−ＩｇＧ１の非存在下で、ｍＬ２４３−ＩｇＧ２ａを使用した（マウスＩｇＧ２ａは、補体固定化においてヒトＩｇＧ１の等価物であり、ＡＤＣＣに影響を与える）。
ＳＣＩＤマウスに、２５０万のＲａｊｉ細胞を注射した。ｈＬ２４３−ＩｇＧ４またはｍＬ２４３−ＩｇＧ２ａでの治療を、腫瘍細胞投与後１日で開始した。生理食塩水または非特異的対照抗体、ｈＭＮ−１４を注射したマウスの両方の群が、１７日の中間値生存時間（ＭＳＴ）を有した。ヒト化またはマウスＬ２４３いずれかで処理したマウスのすべての群が、生理食塩水またはｈＭＮ−１４を注射したマウスと比較して、有意に生存期間が改善された（ＰＯ．０００１）。種々の用量のｈＬ２４３−ＩｇＧ４が、用量反応相関となり、より高い用量を得たマウスが、よりよい生存時間であった。種々の用量のｍＬ２４３ ＩｇＧ２ａで処理した動物の群で、治癒率は、８０〜１００％の範囲であった。図１４を参照のこと。
本研究によって、Ｌ２４３の抗腫瘍効果、およびＩｇＧ４構造の補体結合活性の除去の同時保持が示された。本研究をマウスで実施したけれども、上記の構築物を用いる有意な治療利点が、自己免疫疾患、リンパ腫または白血病を患っているすべての哺乳動物で達成され得る。特に、上記構築物を、（ｉ）自己免疫疾患およびリンパ腫／白血病を処置するため、家畜動物、特にネコ、イヌおよびウマ、および（ｉｉ）自己免疫疾患、リンパ腫および白血病、ならびにＨＬＡ−ＤＲ発現を伴う免疫調節不全、代謝性疾患および神経変性疾患のためのヒトにて効果的に使用可能である。
＜ヒトおよびイヌリンパ腫の処置にのＬ２４３および抗−Ｂ細胞ＭＡｂとのｈＬ２４３のインビトロ比較＞
０．５ｍｇのｈＬ２４３（ＩｇＧ４イソタイプ）試料を、マウスＬ２４３との比較、ならびに他の抗Ｂ細胞ＭＡｂとの比較でリンパ腫細胞株およびイヌＢ細胞リンパ腫吸引物との反応性に関して試験した。２つの機能的研究もまた実施した。ｈＬ２４３の、イヌリンパ腫吸引物においてアポトーシスを誘導する能力を決定し、ｈＬ２４３の抗増殖活性をＮａｍａｌｗａ、リツキシマブに対して耐性であると報告されたヒトリンパ腫細胞株に対して試験した。
ヒト化またはキメラＭＡｂの、ヒトＢ細胞リンパ腫上の結合を、以下のＭＡｂ−ｈＭＮ−１４、ｈＬＬ１、ｈＬＬ２、ｈＡ２０ ＲｉｔｕｘａｎおよびｈＬ２４３をＦＩＴＣヤギ抗−ヒト（ＧＡＨ）ＩｇＧ Ｆｃで染色したＦｌｕｏｒｏｓｃｅｎｃｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ（ＦＡＣＳ）を用いるフローサイトメトリーによって測定した。選択した細胞株は、Ｎａｍａｌｗａ（リツキシマブ耐性ヒトＢ細胞リンパ腫細胞株）、ＳＵ−ＤＨＬ−６（ヒトＢ細胞非ホジキンリンパ腫）、ＷＳＵ−ＦＳＣＣＬ（ＥＢＶ−陰性低悪性度ヒトＢ細胞リンパ腫細胞株）、Ｒａｊｉ、ＤａｕｄｉおよびＲａｍｏｓ細胞であった。表２で示すように、ｈＬ２４３がすべての上記細胞株に結合した。特に、ｈＬ２４３は、ＣＤ２０無反応性であるＮａｍａｌｗａ細胞に結合し、これは、他のヒト化ＭＡｂよりもより結合することを示している。表１を参照のこと。さらに、３Ｈ−チミジン取り込みアッセイによって測定したように、ｈＬ２４３は、リツキシマブ耐性ヒトＢ細胞リンパ腫細胞株、Ｎａｍａｌｗａにて抗増殖性活性を示した。Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．によって開発された、他のＣＤ２０抗体、ヒト化Ａ２０（ｈＡ２０）は、リツキシマブ、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）として知られているキメラ抗−ＣＤ２０に対して同様の結果を示した。Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０：２８６８−２８７８を参照のこと。
図１６Ａ〜Ｂで示すように、ｈＬ２４３が、単独で与えられるときに、２８％の増殖抑制を産出し、これは、ｈＬ２４３を抗ヒトＩｇＧ第二抗体との組み合わせで与えた時に、５１％まで増加した。リツキシマブとの組み合わせで使用した場合、活性は、いずれかＭＡｂ単独のものよりも大きなレベルまで増加した。図１６−Ｂを参照のこと。
研究によって、ｈＬ２４３が、他のヒト化ＭＡｂよりもイヌリンパ腫細胞に対して、より大きな結合親和性を有することも示された。表３を参照のこと。さらに、ＫＬ２４３は、サブＧＯ／Ｇ１期ＤＮＡ含量にて％細胞として測定した、抗−ヒトＩｇＧ第二抗体と架橋したときに、イヌリンパ腫細胞中でアポトーシスを誘導可能であった。図１５を参照のこと。
ｈＬ２４３抗体組み合わせおよびそれらの効果
方法
＜抗体＞
１つの例示的方法において、抗ＨＬＡ−ＤＲモノクローナル抗体、Ｌ２４３を産出しているハイブリドーマ細胞クローンを、ＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−５５）から得た。細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）で補充されるＨＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）中で培養した。Ｌ２４３のＶκおよびＶＨ遺伝子をコードする遺伝子をＲＴ−ＰＣＲによってクローン化した。ヒト化Ｌ２４３（ＩｇＧ１／κイソタイプ）、ｈＬ２４３γ１を、先に記述されたように（Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １３：４６９（１９９４）、Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１４１３（１９９５），Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０４：３７０５（２００４）；Ｇｏｖｉｎｄａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．８４：１７３（２００４））、同様に産出した。
ｈＬ２４３のＩｇＧ４／κイソタイプ、ｈＬ２４３γ４ｐを、ヒトγ１鎖に対する配列をコードする重鎖定常領域をγ４鎖のものと置換することによって構築可能である。点変異、Ｓｅｒ２４１Ｐｒｏ（Ｋａｂａｔ番号付けに基づく）を、抗体が発現され哺乳動物細胞培養液中で産出される場合に、半分子の形成を避けるために、γ４配列のヒンジ領域内に組みこんだ（Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：１（２００１））。本研究で使用した他のＭＡｂは、たとえばＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入したリツキシマブ、イムノメディックス社（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ，）によって提供されるｈＭＮ−１４またはラベツズマブ（ヒト化抗がん胎児性抗原ＩｇＧ１）であった。陰性イソタイプ対照としてここで使用したｈＭＮ−１４の構築および特性化はすでに記述されている。
＜細胞＞
例示的細胞株をいくつかの研究で使用した。たとえば、Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫株、Ｄａｕｄｉ、ＲａｊｉおよびＲａｍｏｓを、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）より購入した。非バーキットリンパ腫細胞株を以下のように得た。染色体転座ｔ（１４：１８）を含むＲＬおよびＳＵ−ＤＨＬ−６はそれぞれ、Ｊｏｈｎ Ｇｒｉｂｂｅｎ博士（Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）およびＡｌａｎ Ｅｐｓｔｅｉｎ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）より得た。細胞株ＳＵ−ＤＨＬ−４、ＳＵ−ＤＨＬ−１０およびＫａｒｐａｓ４２２は、Ｍｙｒｏｎ Ｃｚｕｃｚｍａｎ博士（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｕｆｆａｌｏ，ＮＹ）より提供され、ＷＳＵ−ＦＣＣＬおよびＤｏＨＨ２細胞株は、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ Ｓｍｉｔｈ博士（Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）より得た。細胞は、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）およびＬ−グルタミン（２ｍＭ）で補充されるＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）（完全培地）中の上清培養液として増殖させた。
＜ｈＬ２４３−ＭＡｂの抗原結合特異性＞
ｈＬ２４３γ１の抗原結合活性および特異性を、細胞表面結合アッセイによって示した。Ｒａｊｉ細胞を、飽和濃度の精製ｈＬ２４３（２０μｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳ／ＢＳＡ（１％）中で、４℃にて１時間インキュベートした。洗浄後、細胞表面結合ｈＬ２４３γ１を、Ｒａｊｉ細胞をＰＥ−コンジュゲート第二抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的）を含む緩衝液中でインキュベートし、たとえばＧｕａｖｅ ＰＣＡシステム（Ｇｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈａｙｗｏｒｄ，ＣＡ）で計数することによって検出した。
競合細胞結合アッセイを実施して、親ｍＬ２４３と比較してｈＬ２４３γ４Ｐの活性を査定した。定量の125Ｉ−標識化マウスＬ２４３またはｈＬ２４３γ４Ｐ（１００，０００ｃｐｍ、約１０μＣｉ／μｇ）を、種々の濃度（０．２〜７００ｎＭ）の精製ｈＬ２４３γ４ＰまたはマウスＬ２４３の存在下で、４℃にて１〜２時間、ヒトリンパ腫細胞（Ｒａｊｉ、ＤａｕｄｉまたはＲａｍｏｓ）とともにインキュベートした。未結合ＭＡｂは、細胞をＰＢＳ中で洗浄することによって除去された。細胞に関連した放射活性を洗浄後に決定した。
１つの実施例において、ｈＬ２４３γ４Ｐの抗原結合親和性定数を、放射標識化抗体の直接細胞表面結合アッセイおよびスキャッチャードプロット解析によって決定した。細胞表面抗体結合を測定するために、２つの組の細胞を調製し、結合アッセイで使用して、それぞれ放射活性の非特異的および総結合を推定した。非特異的結合のための細胞は、放射標識化抗体を添加する前にすべての表面抗原部位をブロックするために過剰量の未標識ＭＡｂとプレインキュベートし、一方で、総結合のための細胞は、ＰＢＳ中でプレインキュベートした。プレインキュベーションの後、種々の、125Ｉ−ｈＬ２４３γ４Ｐまたは125Ｉ−ｍＬ２４３いずれかを加え、２×１０5ヒトリンパ腫細胞（Ｒａｊｉ、ＤａｕｄｉまたはＲａｍｏｓ）とともに、４℃にて２時間インキュベートし、未結合抗体を洗浄によって除去した。細胞関連放射活性を計数した。所与の濃度の放射標識抗体での放射標識抗体の特異的細胞表面結合を、総結合の数から非特異的結合の数を引いて計算した。
＜フローサイトメトリーアッセイ＞
免疫フェノタイピング：間接免疫蛍光アッセイを、特にすでに記述したように、ＦＩＴＣ−ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｔａｇｏ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を用いて、上述の細胞株のパネルで実施し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いてフローサイトメトリーによって解析した。
アポトーシスの試料解析：細胞ＤＮＡのフローサイトメトリー解析を、ヨウ化プロピジウム染色に続いて実施した。細胞を２４ウェルプレート（５×１０5細胞／ウェル）に置き、続いてＭＡｂ（５μｇ／ｍｌ）で処理した。３つのウェルをそれぞれのＭＡｂで調製し、抗−マウスまたはヤギ抗−ヒト二次抗体での架橋の効果を研究した。一次ＭＡｂとの２０分間インキュベーション（３７℃、５％ ＣＯ2）に続いて、Ｆ（ａｂ’）2ヤギ抗−マウスＩｇＧ Ｆｃγ特異的二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を、それぞれの一次ＭＡｂからの１つのウェルに加えて、二次抗体濃度を２０μｇ／ｍｌに調節した。Ｆ（ａｂ’）2ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃγ特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を同様に、各一次ＭＡｂからの第二ウェルに加え、第三の組の容量を培地の添加によって平衡化した。４８時間のインキュベーション（３７℃、５％ ＣＯ2）に続いて、細胞を試験チューブに移し、ＰＢＳで洗浄し、次いで低張ヨウ化プロピジウム溶液（０．１％ クエン酸ナトリウム、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中の５０ｍｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム）中に再懸濁した。試料を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒを用いるフローサイトメトリーによって解析した。アポトーシス細胞の割合を、Ｇ１／Ｇ０ピーク前のＤＮＡ染色での細胞の割合（低二倍体）として定義した。
＜ｈＬ２４３の構築および特性化＞
１つの例示的方法において、２つのヒト化抗ＤＲ−ＭＡｂを産出した。ｈＬ２４３γ１を、ヒトＩｇＧ１／κ定常状態を有するように設計し、ｈＬ２４３γ４Ｐを、ヒトγ１鎖に関する配列をコードする重鎖定常領域をヒトγ４鎖のものと置換することによって構築した。点変異Ｓｅｒ２４１Ｐｒｏを、抗体が哺乳動物細胞培養液中で発現し産出されるときに、半−分子の形成を減少させるために、γ４配列のヒンジ領域内に導入した（Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：１（２００１））。２つのヒト化Ｌ２４３抗体、γ１およびγ４Ｐの、Ｒａｊｉ細胞に結合する能力を図７、８および１７で示している。図７において、Ｒａｊｉ細胞に結合しているｈＬ２４３γ１は、親マウスＬ２４３（ｍＬ２４３）での細胞のプレインキュベーションによって特異的にブロックされており、これは、ｍＬ２４３の抗原結合特異性が、ヒト化バージョンで保存されていることを示唆している。
１つの実施例において、親ｍＬ２４３と比較したｈＬ２４３γ４Ｐの反応性を査定し、競合細胞結合アッセイを実施した。一定量の125Ｉ−標識化ｍＬ２４３またはｈＬ２４３γ４Ｐを、種々の濃度の精製ｈＬ２４３γ４ＰまたはｍＬ２４３の存在下で、ヒトリンパ腫細胞（Ｒａｊｉ、ＤａｕｄｉまたはＲａｍｏｓ）とともにインキュベートした。図８で示すように、ｍＬ２４３およびｈＬ２４３γ４Ｐ−ＭＡｂは、細胞表面抗原に対する結合に関して互いに競合し、これは、共通の抗原性決定基の認識を示唆している。ｈＬ２４３γ４Ｐは、ｍＬ２４３と比べて明らかにおよそ２倍強い結合活性を有した（ＥＣ50約７ｎＭ対約１６．５ｎＭ）。細胞あたりのｈＬ２４３γ４ＰおよびｍＬ２４３の結合部位の最大数、および平衡結合の明白な解離定数をスキャッチャードプロット解析によって決定した。図１７で示すように、ｈＬ２４３γ４ＰおよびｍＬ２４３のＤａｕｄｉ細胞への最大結合は、実質的に同一であり、およそ６×１０5分子／細胞であり、共通抗原への結合と一致する。ｈＬ２４３γ４ＰおよびｍＬ２４３に対する明白な解離定数値が、それぞれ２．６ｎＭおよび１４ｎＭであると計算された。同様の結果が、ＲａｊｉおよびＲａｍｏｓ細胞で得られた（データは示していない）。
＜培養リンパ腫細胞の抗原発現＞
１つの例示的方法において、フローサイトメトリー解析を、ｈＬ２４３γ４Ｐが、培養ヒトＢ細胞リンパ腫のパネルに結合することを示すために、間接免疫蛍光染色を用いて実施した。他の表面抗原に対する比較を示している。表４で見られるように、ｈＬ２４３γ４Ｐ ＭＡｂは、すべての試験した細胞株に結合する。より強い発現が、ＤａｕｄｉおよびＲａｊｉで観察されたが、蛍光染色のレベルは、すべての細胞株で強力である。結合を、他のＢ細胞抗原（ＣＤ７４、ＣＤ２２、ＣＤ２０）に対するヒト化ＭＡｂ、マウス−ヒトキメラ抗−ＣＤ２０ ＭＡｂリツキシマブ、およびヒト化抗−ＣＥＡ ＭＡｂ（陰性対照）のものと比較した。ｈＬ２４３γ４Ｐでの染色は、すべての７つの細胞株においてＣＤ２２およびＣＤ７４のものより顕著に大きい。ＣＤ２０染色は、ヒト化（ｈＡ２０）およびキメラ（リツキシマブ）ＭＡｂとの反応性によって示されたようにより変化した。バーキット株、Ｄａｕｄｉ、ＲａｊｉおよびＲａｍｏｓは、中間レベルのＣＤ２０を発現しており、一方瀘胞性およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫株は変化に富んで査定された。ｈＬ２４３γ４Ｐ結合によって測定されたＨＬＡ−ＤＲ発現と比較して、ＳＵ−ＤＨＬ−６はより大きなＣＤ２０発現をし、ＮａｍａｌｗａおよびＷＳＵ−ＦＳＣＣＬはより低いＣＤ２０発現をし、ＲＬは両方の抗原をほぼ等しく発現する。
＜エフェクター細胞アッセイ＞
１つの実施例において、ｈＬ４３のＦｃ領域を、Ｆｃレセプターおよび補体結合を介したエフェクター細胞機能を抑制するために、ＩｇＧ４イソタイプＦｃ領域と置換した。ＣＤＣおよびＡＤＣＣアッセイを実施してこれらの機能を査定した。
他の例示的方法において、ＣＤＣ Ｄａｕｄｉ細胞を、ヒト補体の存在下で２時間、抗体ｈＬ２４３γ１、ｈＬ２４３γ４Ｐ、ｈＡ２０（他の陽性対照として）、およびｈＭＮ１４（抗ＣＥＡ、陰性対照）の連続希釈とともにインキュベートした。これに続いて、細胞生存を査定するために、レサズリンを添加した。未処理および最大溶解対照両方を含めた。蛍光読み取りをレサズリン添加の５時間後に得た。得られた蛍光レベルは、生存細胞の数に直接相関する。この結果、ｈＬ２４３γ４Ｐは、ＣＭＣが観察されたｈＬ２４３γ１（ＥＣ50＝２．６ｎＭ）およびｈＡ２０（ＥＣ50＝０．６６ｎＭ）と比較して細胞において、補体−仲介細胞傷害性効果を産出しないことが示唆される。
ＡＤＣＣの誘導をまた、カルセインＡＭ放出によってＲａｊｉ、ＤａｕｄｉおよびＳＵ−ＤＨＬ−６中で測定した。ｈＬ２４３γ４Ｐの活性を、陽性対照として、マウスＬ２４３とリツキシマブのものと比較した。予想されたように、リツキシマブおよびマウスＬ２４３は、陰性対照（ＭＡｂなし、およびマウスおよびヒト化ＭＮ−１４）よりも、有意により細胞融解を誘導したが、ｈＬ２４３γ４Ｐはしなかった（図１９）。
＜インビトロ抗増殖効果＞
１つの実施例において、細胞増殖におけるｈＬ２４３の効果を、Ｒａｊｉ、ＦＳＣＣＬおよびＮａｍａｌｗａ上での3Ｈ−チミジン取り込みアッセイを用いて査定した（図２０Ｂおよび表５）。ｈＬ２４３γ４Ｐの効果を、架橋抗Ｆｃ抗体の存在下または非存在下で、リツキシマブおよびｈＬ２４３γ４Ｐと組み合わせたリツキシマブのものと比較した。リツキシマブに対して比較的不感受性であることがすでに示されたＦＳＣＣＬにおいて、ｈＬ２４３γ４ｐが、リツキシマブと比較してより大きな増殖の阻害を有意に産出した。Ｒａｍｏｓにおいて、ｈＬ２４３およびリツキシマブ活性は同様であり、組み合わせは、いずれかのみよりも効果的であった。組み合わせは、相乗効果を有し得る。抗ヒトＦｃ抗体との架橋が、Ｒａｍｏｓにて見られる有意な抗増殖活性のために必要である。Ｎａｍａｌｗａにおいて、ＦＳＣＣＬでと同様に、ｈＬ２４３γ４Ｐがリツキシマブよりも有意に大きな増殖の阻害を産出し、リツキシマブおよびｈＬ２４３γ４Ｐの組み合わせが、いずれかのＭＡｂのみよりも有意により増殖の阻害を産出した。
＜アポトーシス誘導の査定＞
１つの例示的方法において、ｈＬ２４３γ４ｐ誘導細胞死アッセイの機構を、種々のアポトーシスマーカーを測定することによって評価して実施した。これらには、ＤＮＡ断片化の誘導、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／７−ＡＡＤ染色、活性化カスパーゼ−３の測定、ミトコンドリア膜電位の欠損およびＡＫＴ生存経路の活性化が含まれた。
他の実施例において、ＤＮＡ断片化を、ＳＵ−ＤＨＬ−６およびＮａｍａｌｗａにおけるフローサイトメトリーによって評価した。細胞を、架橋のために第二ＭＡｂあり、またはなしで４８時間ＭＡｂとともに培養し、続いてヨウ化プロピジウムでＤＮＡ染色した。細胞をフローサイトメトリーによって解析し、Ｇ１領域以下の陽性蛍光がＤＮＡ断片化を表し、アポトーシスの測定である。ｈＬ２４３γ４Ｐの活性を、抗ＣＤ７４（ｈＬＬ１）、抗ＣＤ２２（ｈＬＬ２、エプラツズマブ）、抗ＣＤ２０（ｈＡ２０）ならびにマススヒトキメラＭＡｂ リツキシマブを含む他のＢ細胞抗原に対するヒト化ＭＡｂのものと比較した。対照には、第一ＭＡｂを含まず、陰性対照はヒト化抗ＣＥＡ ＭＡｂ、ｈＭＮ−１４が含まれた。ｈＬ２４３γ４Ｐは、他の抗Ｂ細胞ＭＡｂと同様か、以上のレベルで両方の細胞株でアポトーシスを誘導した（図２１Ａおよび２１Ｂ）。
１つの特定の実施形態において、Ｄａｕｄｉ細胞内でのアポトーシスおよび非アポトーシス死細胞を見分けるために、キットを使用した（たとえばＧｕａｖａ Ｎｅｘｉｎ（商標）キット）。本実施例において、キットは、アポトーシス細胞の外膜上のホスファチジルセリン（ＰＳ）を検出するためにＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ−ＰＥを、そして膜構造の完全性の指標として、細胞不透過色素７−ＡＡＤを使用する。７−ＡＡＤは、生、健康細胞および早期アポトーシス細胞からは除外されるが、後期ステージアポトーシスおよび死細胞では透過される。図２１Ｂで示すように、本研究の結果は、ｈＬ２４３γ４Ｐが、４時間および２４時間処理両方にて、ｍＬ２４３と同様にアポトーシスを誘導したことを示唆した。反対に、抗ＣＤ２０−ＭＡｂはＤａｕｄｉにて測定可能なアポトーシスを誘導しなかった。したがって、抗−ヒトＩｇＧまたはプロテインＡのような二次薬剤によるハイパー架橋が、Ｄａｕｄｉを含む多くの細胞株にて抗ＣＤ２０−ＭＡｂによるアポトーシスの誘導のために使用され得る。
他の実施例において、ミトコンドリア電位におけるヒト化およびマウスＬ２４３の効果を、ＳＵ−ＤＨＬ−６、Ｄａｕｄｉ、Ｒａｊｉ、ＷＳＵ−ＦＳＣＣＬ、ＲＬおよびＮａｍａｌｗａと呼ばれる異なる細胞にて研究した。結果は図２２で示しており、ミトコンドリア膜電位のアポトーシス変化が、マウスおよびヒト化Ｌ２４３−ＭＡｂ両方で観察されたことを示唆している。二次抗体との架橋は必要ではないが、評価した６細胞株のうち２つ、ＦＳＣＣＬおよびＮａｍａｌｗａにて効果を増加させることができた。ｈＬ２４３γ４Ｐによって誘導されたミトコンドリア膜電位の欠損は、架橋剤なしで抗−ＣＤ２０ ＭＡｂ（ｈＡ２０）のものよりも大きかった。ｈＡ２０との架橋により、レベルが６細胞株のうち３つ（ＲＬ、ＳＵ−ＤＨＬ−６およびＤａｕｄｉ）にてｈＬ２４３γ４Ｐのものまで増加する。
１つの実施例において、ヒト化およびマウスＬ２４３による活性化カスパーゼ−３の誘導をリンパ腫細胞株のパネルにおいてフローサイトメトリーによってアッセイした。表６にて要約した結果は、マウスおよびヒト化Ｌ２４３両方が二次抗体との架橋の非存在下で、同様のレベルにて、カスパーゼ−３の活性化を誘導することを表している。活性化カスパーゼ−３のＬ２４３−ＭＡｂでの誘導は、すべての細胞株で、ｈＡ２０のものよりも大きい。二次抗体にて、これらのレベルは増加し、ｈＡ２０の効果はＮａｍａｌｗａおよびＦＳＣＣＬを除いて、ｈＬ２４３γ４Ｐのものと同様であり、この２つの細胞株では、抗ＣＤ２０−ＭＡｂに対して比較的不感受性であることがすでに観察されている。開裂カスパーゼ−３をまた、２日間の時間経過にわたりＤａｕｄｉにてアッセイした（図２３Ａ）。活性は、Ｌ２４３γ４Ｐインキュベーションのおよそ２日間、増加を続ける。１時間未満の時間点は実施しなかった。
１つの実施例において、Ｌ２４３の活性機構におけるＡＫＴの関与を、フローサイトメトリーによって６つの細胞株でアッセイした。細胞を種々のＭＡｂとともに２日間インキュベートし、次いでリン酸化ＡＫＴに関してアッセイした。表７にて列挙した結果は、Ｌ２４３が、すべての細胞株でＡＫＴを活性化することを示している。抗−ＣＤ２０、ｈＡ２０、処理細胞ならびに抗−ＣＤ７４および抗−ＣＤ２０処理細胞（示していない）におけるリン酸化ＡＫＴレベルが、すべての細胞株において未処理細胞と同様である。Ｐ−ＡＫＴ活性化の時間経過を決定するために、Ｄａｕｄｉ細胞を種々の時間、ＭＡｂとともにインキュベートし、ＭＡｂを０分〜２日の時間点で（遠心によって）除去した（図２３Ｂ）。これらの結果は、０時間点においてさえ、Ｐ−ＡＫＴレベルが２日時間点と等しいので、Ｌ２４３によるＡＫＴの活性化が本アッセイによって測定可能であるよりも早くに発生可能であることを示している。
＜非ホジキンリンパ腫（Ｒａｊｉ）の異種移植モデルにおけるｈＬ２４３のインビボ治療効果＞
１つの例示的方法において、治療研究を実施して、ヒト非ホジキンリンパ腫（Ｒａｊｉ）の異種移植モデルにおけるｈＬ２４３γ４ＰおよびｍＬ２４３（ＩｇＧ２ａイソタイプ）モノクローナル抗体のインビボ効果を比較した。本研究の目的は、異種移植モデルにおいてｈＬ２４３γ４Ｐが有意な抗腫瘍効果を維持可能であるかどうかを決定することであった。ＳＣＩＤマウスに、２．５×１０6のＲａｊｉ細胞を注射した。ｈＬ２４３γ４ＰまたはｍＬ２４３での治療を腫瘍細胞投与後１日で開始した。結果を図２４に示している。生理食塩水または非特異的対照抗体、ｈＭＮ１４を注射した両方の群のマウスが、１７日の中間生存時間（ＭＳＴ）であった。ヒト化またはマウスＬ２４３いずれかで処理したすべての群のマウスが、生理食塩水またはｈＭＮ１４を注射したマウスと比べて有意に生存時間が改善された（Ｐ＜０．０００１）。種々の用量のｈＬ２４３γ４Ｐでの処理が、結果として、用量反応性の関係となり、より高用量を与えられたマウスがより生存時間が長かった。種々の用量のｍＬ２４３−ＩｇＧ２ａで処理した動物の群において、治癒率は、８０〜１００％の範囲であった。
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本明細書で開示され、請求されたすべての組成物および／または方法および／または装置は、本開示物に関して必要以上の実験なしで、作成し、実施することが可能である。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態に関して記述されている一方で、当業者にとって、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書で記述した方法の段階、または連続段階において、変更を組成物および／または方法および／または装置に適用してもよいことが明らかである。より詳しくは、化学的および生理学的両方に関連した特定の薬剤を、本明細書で記述された薬剤で置換してもよく、同一または同様の結果が達成されることが明らかである。すべてのそのような同様の置換および改変が、添付の特許請求の範囲によって定義されたような本発明の精神、範囲および概念内であると考えられることが明らかである。
（また配列番号１および配列番号２）は、マウス抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体Ｌ２４３のＶＫをコードするＤＮＡおよびアミノ酸配列を例示している。推定ＣＤＲ領域に下線を引き、示唆している。ヌクレオチド残基を連続的に番号付けする。ＫａｂａｔのＩｇ分子番号付けをアミノ酸残基のために使用する。文字（上部）を有する残基に対する番号付けは、先行する残基の数＋文字であり、たとえばＮ５２に続くＴに対する数字は５２Ａであり、８２に続くＮ、ＮおよびＬの数字はそれぞれ８２Ａ、８２Ｂおよび８２Ｃである。 （また配列番号３および配列番号４）は、マウス抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体Ｌ２４３のＶＨをコードするＤＮＡおよびアミノ酸配列を例示している。推定ＣＤＲ領域に下線を引き、示唆している。ヌクレオチド残基を連続的に番号付けする。ＫａｂａｔのＩｇ分子番号付けを、上述のようにアミノ酸残基のために使用する。 （また配列番号５および配列番号６）は、ヒト化Ｌ２４３ＶＲのＤＮＡおよびアミノ酸配列を例示している。アミノ酸配列の太字および下線区画が、Ｋａｂａｔ番号付けスキームによって定義されたように、ＣＤＲを示唆している。 （また配列番号７および配列番号８）は、ヒト化Ｌ２４３ＶＨのＤＮＡおよびアミノ酸配列を例示している。アミノ酸配列の太字および下線区画が、Ｋａｂａｔ番号付けスキームによって定義されたように、ＣＤＲを示唆している。 （また配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２）は、ヒトＲＦ−ＴＳ３およびＮＥＷＭ（フレームワーク４）、マウスＬ２４３およびｈＬ２４３ ＶＨ鎖のアミノ酸配列アライメントを例示している。点線は、Ｌ２４３における残基を示し、そのヒト化バージョンはＲＦ−ＴＳ３またはＮＥＷＭにおける対応する残基に同一である。破線は、アライメントを補助するために導入されたギャップを示している。四角は、ＣＤＲ領域を示している。ｈＬ２４３のＮおよびＣ末端残基両方が、使用したステージングベクターによって固定されている。したがって、Ｌ２４３の相当する末端残基を、ヒトＶＨ配列のものとは比較していない。 （また配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５）は、ヒトＲＥＩ、マウスＬ２４３およびｈＬ２４３のＶＫ鎖の例示アミノ酸配列アライメントを例示している。点線は、ＲＥＩ中の相当する残基と同一であるＬ２４３中の残基を示唆している。破線は、アライメントを補助するために導入されたギャップを示している。四角は、ＣＤＲ領域を表している。ｈＬ２４３のＮおよびＣ末端残基両方が、使用したステージングベクターによって固定されている。したがって、Ｌ２４３の相当する末端残基を、ヒト配列のものとは比較していない。Ｋａｂａｔ番号付けスキームを使用する。 ｈＬ２４３の例示抗原結合特異性を例示している。（細胞表面抗原（「Ａｇ」）部位をブロックするために）飽和濃度ｍＬ２４３とともに、またはなしでプレインキュベートしたＲａｊｉ細胞を、１％ＢＳＡおよび１０μｇ／ｍｌの精製ｈＬ２４３を含むＰＢＳ中に再懸濁させ、４℃にて１時間インキュベートした。洗浄後、細胞を１％ＢＳＡおよびＰＥ−標識化ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的抗体を含むＰＢＳ中に再懸濁した。さらに４℃にて３０分間のインキュベーション後、細胞を、Ｇｕａｖａ−ＰＣＡ中で計数した。（Ａ）は、Ｌ２４３での細胞のプレインキュベーションによってブロックされた（青色トレース）、Ｒａｊｉヒトリンパ細胞に対するｈＬ２４３の特異的結合（赤トレース）を示している。（Ｂ）は陰性結合対照であり、同一の条件下、ｈＬ２４３の代わりに抗ＣＥＡ抗体（ｈＭＮ−１４）で実施する。 競合的細胞表面結合アッセイ中でｈＬ２４３γ４ＰおよびｍＬ２４３を比較している例示Ａｇ結合親和力を例示している。一定量（１００，０００ｃｐｍ、−１０ｕＣｉ／ｕｇ）の125Ｉ−標識化ｍＬ２４３（Ａ）またはｈＬ２４３γ４Ｐ（Ｂ）を、種々の濃度（０．２〜７００ｎＭ）の非標識化ｈＬ２４３γ４Ｐ（Ａ）またはｍＬ２３４３（＊）と混合した。この混合液をＲａｊｉ細胞に加え、室温にて２時間インキュベートした。細胞を洗浄して、非結合抗体を除去し、細胞に関連した放射活性を計数した。ｈＬ２４３γ４ＰおよびｍＬ２３４が、細胞表現Ａｇの結合に対して互いに競合することが示された。両方の場合で、ｈＬ２４３γ４Ｐが、ｍＬ２４３よりも強くＲａｊｉ細胞に結合することが明らかになった。 直接細胞表面飽和結合およびスキャッチャードプロット解析によって決定されたｈＬ２４３γ４ＰおよびｍＬ２４３の例示Ａｇ結合親和力を例示している。種々の濃度の125Ｉ−標識化ｍＬ２４３（＞＞）またはｈＬ２４３γ４Ｐ（Ａ）を、４℃にて２時間、２×１０5Ｄａｕｄｉヒトリンパ腫細胞とともにインキュベートし、未結合放射活性を洗浄によって細胞上清より除去した。細胞関連放射活性を計数し、放射標識化抗体の細胞表面抗原への特異的な結合を計算し、次いでスキャッチャードプロット解析を適用して、細胞あたりの結合部位の最大数、および明確な抗原結合親和定数を決定した。ｍＬ２３４またはｈＬ２４３γ４Ｐの、Ｄａｕｄｉ細胞表面への最大結合は、６×１０6分子／細胞であった。ｍＬ２３４またはｈＬ２４３γ４Ｐに関して決定した解離定数は、それぞれ１４および２．６ｎＭであった。 ヒト血清補体の存在下で、例示ｈ２４３が標的細胞を殺傷することにおいて効果的であることを例示している。Ｄａｕｄｉ細胞を、ヒト血清補体の存在下で、ｈＬ２４３、ｈＬ２４３γ４Ｐ、ｈＡ２０（陽性対照）、およびｈＭＮ−１４（陰性対照）とともにインキュベートした。ｈＬ２４３γ４Ｐは、任意の補体誘導細胞毒性を産出しないことが示された。 ｈＬ２４３、ｈＬ２４３γ４Ｐ、ｈＡ２０（陽性対照）および１ ｈＭＮ−１４（陰性対照）に関して観察したように、ＡＤＣＣによる例示ＬＤＨ放出（Ａ）および％細胞溶解（Ｂ）を例示している。 図１２Ａ〜Ｂは、２日の終了時点で、ＤａｕｄｉおよびＲａｊｉ細胞株上での例示インビトロ増殖アッセイを例示している。 図１３Ａ〜Ｂは、３日の終了時点で、ＤａｕｄｉおよびＲａｊｉ細胞株上での例示インビトロ増殖アッセイを例示している。 ｈＬ２４３γ４Ｐを注射したがんを有するＳＣＩＤマウスに関する例示中間生存時間を例示している。 Ｌ２４３、ｈＬ２４３（ＩｇＧ４イソタイプ）、ｈＭＮ−１４（ヒト化ＭＮ−１４ ＩｇＧ）、およびＡｇ８（マウスミエローマ由来ｍＡｂ）によって引き起こされた（サブＧＯ／Ｇ１相ＤＮＡ含量での％細胞として測定）イヌリンパ腫細胞におけるアポトーシスの例示比較誘導を例示している。それぞれヤギ抗マウス（ＧＡＭ）およびヤギ抗ヒト（ＧＡＨ）抗体と架橋した時に、Ｌ２４３およびｈＬ２４３がアポトーシスを引き起こした。 図１６Ａ〜Ｂは、3Ｈ−チミジン取り込みアッセイによって決定したような、ＮａｍａｌｗａヒトＢ細胞リンパ腫細胞株上での、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＧＡＨ）の有無での、ヒト化抗体（ｈＬＬ１、ｈＬＬ２、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、ｈＡ２０、ｈＭＮ−１４およびｈＬ２４３（ＩｇＧ４イソタイプ）の例示抗増殖効果を例示している。 親マウスＬ２４３に関連したｈＬ２４３γ４Ｐの結合特性を例示している。 図１８Ａおよび１８Ｂは、本明細書で開示された様々な抗体に暴露した時のＲａｊｉ、ＲａｍｏｓおよびＮａｍａｌｗａ細胞株中でのＣＤＣアッセイを例示している。 ＳＵ＿ＤＨＬ−６細胞を、本明細書で開示された様々な抗体に暴露したときのＡＤＣＣアッセイおよびカルセインＡＭ放出を例示している。 図２０Ａおよび２０Ｂは、本明細書で開示されたいくつかの細胞株におけるｈＬ２４３γ４Ｐの抗−増殖効果を例示している。Ａ．ＭＴＴ試験およびＢ．3Ｈ−チミジン取り込みアッセイ。Ｂ．の軸ラベルにおいて、ｈＬ２４３はγ４Ｐを形成することを指す。 図２１Ａおよび２１Ｂは、アポトーシスの誘導を例示しており、死細胞は白の棒グラフで示しており、アポトーシス細胞は黒の棒グラフで例示されている。Ａ．ＳＵ−ＤＨＬ−６およびＮａｍａｌｗａ細胞中でのサブＧ０ ＤＮＡの測定、およびＢ．４および２４時間の時点でのアネキシンＶ／７−ＡＤＤ。使用した細胞は、処理の前で、９７％生存率であった。 いくつかの細胞株におけるＪＣ−１アッセイを用いるミトコンドリア膜電位を例示している。 図２３Ａおよび２３Ｂは、Ｄａｕｄｉ細胞における開裂カスパーゼ−３（Ａ）およびＰ−ＡＫＴ（Ｂ）時間経過研究を例示している。 マウスＬ２４３およびＬ２４３γ４ＰでのＲａｊｉ−ＳＣＩＤマウスの治療を例示している。

Claims (54)

  1. 重鎖可変ドメインを含むヒト化Ｌ２４３抗体であって、前記可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域およびフレームワーク残基２７、３８、４６、６８および９１が、マウスモノクローナル抗体ｍＬ２４３重鎖に由来するものであり、免疫グロブリンフレームワークドメインの残りの部分が、１つ以上のヒト重鎖に由来するものであり、前記ヒト化Ｌ２４３抗体が、ＨＬＡ−ＤＲ+細胞上のＨＬＡ−ＤＲのうちの少なくとも１つのエピトープに結合できる能力を有し、細胞毒性の追加物又は免疫学的エフェクター機能が前記細胞の殺傷に必要とされない様式で、前記ヒト化Ｌ２４３抗体が前記細胞の殺傷を引き起こすか、または前記細胞の殺傷を導く、ヒト化Ｌ２４３抗体。
  2. 軽鎖可変ドメインを含むヒト化Ｌ２４３抗体であって、前記可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域、およびフレームワーク残基３７、３９、４８および４９が、マウスモノクローナル抗体ｍＬ２４３軽鎖に由来するものであり、免疫グロブリンフレームワークドメインの残りの部分が、１つ以上のヒト軽鎖に由来するものであり、前記ヒト化Ｌ２４３抗体が、ＨＬＡ−ＤＲ+細胞上ＨＬＡ−ＤＲのうちの少なくとも１つのエピトープに結合できる能力を有し、細胞毒性の追加物または免疫学的エフェクター機能が前記細胞の殺傷に必要とされない様式で、前記ヒト化Ｌ２４３抗体が、前記細胞の殺傷を引き起こすか、または前記細胞の殺傷を導く、ヒト化Ｌ２４３抗体。
  3. 重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含むヒト化Ｌ２４３抗体であって、前記重鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域、およびフレームワーク残基２７、３８、４６、６８および９１が、マウスモノクローナル抗体ｍＬ２４３重鎖に由来するものであり、免疫グロブリン重鎖フレームワークドメインの残りの部分が、１つ以上のヒトに由来するものであり、前記軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域、およびフレームワーク残基３７、３９、４８および４９が、マウスモノクローナル抗体ｍＬ２４３に由来するものであり、免疫軽鎖グロブリンフレームワークドメインの残りの部分が、１つ以上のヒト軽鎖に由来するものであり、前記ヒト化Ｌ２４３抗体が、ＨＬＡ−ＤＲ+細胞上のＨＬＡ−ＤＲのうちの少なくとも１つのエピトープに結合できる能力を有し、細胞毒性の追加物又は免疫学的エフェクター機能が前記細胞の殺傷に必要とされない様式で、前記抗体が、前記細胞の殺傷を引き起こすか、または前記細胞の殺傷を導く、ヒト化Ｌ２４３抗体。
  4. 請求項３に記載の抗体を含む薬学的組成物。
  5. １つ以上の腫瘍関連抗原に特異的に結合する１つ以上の追加的結合分子をさらに含み、前記追加的結合分子が、請求項３の組成物の前に、一緒にまたは後に与えられる、請求項４の組成物。
  6. 請求項３に記載の組成物の有効量を、疾患を患っている患者に投与することを含む、ＨＬＡ−ＤＲを発現する細胞の望まない増殖に関連した状態を処置する方法。
  7. 前記細胞がリンパ球細胞である、請求項６に記載の方法。
  8. 前記細胞が固形がん細胞である、請求項６に記載の方法。
  9. 前記固形がん細胞が、カルシノーマ、メラノーマ、サルコーマ、グリコーマおよび皮膚がんからなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
  10. 前記状態が自己免疫疾患である、請求項６に記載の方法。
  11. 前記状態が、白血病またはリンパ腫である、請求項６に記載の方法。
  12. 前記状態が、代謝性疾患である、請求項６に記載の方法。
  13. 前記状態が、神経変性疾患である、請求項６に記載の方法。
  14. 前記状態が、免疫調節不全から選択される、請求項６に記載の方法。
  15. １つ以上のペプチド、脂質、重合化担体、ミセル、ナノ粒子、またはそれらの組み合わせ、および１つ以上のエフェクターにコンジュゲートした、請求項３に記載のヒト化Ｌ２４３抗体を含む薬学的組成物。
  16. 前記組成物が免疫コンジュゲート体である、請求項１５に記載の組成物。
  17. 前記抗体が、１つ以上の脂質にコンジュゲートしている、請求項１５に記載の組成物。
  18. １つ以上の腫瘍関連抗原に特異的に結合する、１つ以上の追加的結合分子をさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
  19. 前記ヒト化Ｌ２４３抗体が、ＨＬＡ−ＤＲに対する特異性を少なくとも１つ有し、残りの特異性は、１つ以上の腫瘍関連抗原に結合する追加的結合分子に特異的に結合するペプチドに対するものである、請求項１５に記載の組成物。
  20. 前記エフェクターが、治療薬剤または診断薬剤を含む、請求項１５に記載の組成物。
  21. 前記エフェクターが、薬物、プロドラッグ、毒素、酵素、放射性同位体、免疫調節物、サイトカイン、ホルモン、結合分子、オリゴヌクレオチド、干渉ＲＮＡ、光力学薬剤またはこれらの混合物を含む、請求項１５に記載の組成物。
  22. 前記エフェクターが、ＦＵｄＲ、ＦＵｄＲ−ｄＯまたはこれらの混合物を含む、請求項１５に記載の組成物。
  23. グループＩＩ、グループＩＩＩ、グループＩＶ、グループＶ、遷移、ランタニドまたはアクチニド金属カチオンまたはこれらの混合物から選択されるカチオンをさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
  24. Ｔｃ、Ｒｅ、Ｂｉ、Ｃｕ、Ａｓ、Ａｇ、Ａｕ、Ａｔ、Ｐｂまたはこれらの混合物から選択されるカチオンをさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
  25. ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ、ＴＥＴＡ、Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ、Ｔａｃａ−Ｃｙｓ、またはこれらの混合物をさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
  26. 前記エフェクターが、放射性核種を含む、請求項１５に記載の組成物。
  27. 前記エフェクターが、酵素を含む、請求項１５に記載の組成物。
  28. 前記エフェクターが、免疫調節物を含む、請求項１５に記載の組成物。
  29. 前記エフェクターがが、抗血管新生薬剤を含む、請求項１５に記載の組成物。
  30. 前記抗体が、１つ以上の治療薬剤、診断薬剤またはこれらの混合物にコンジュゲートしている、請求項１５に記載の組成物。
  31. 請求項１５の組成物を用いる、患者を処置する方法。
  32. 前記組成物が、静脈内、皮下または筋肉内に、２０〜２０００ｍｇの用量で投与される、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記組成物が、光線力学治療のための１つ以上の薬剤を含む、請求項３１に記載の方法。
  34. 光線力学治療のための前記薬剤が、光線感作物質である、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記組成物が、１つ以上の診断薬剤を含む、請求項３１に記載の方法。
  36. 前記組成物が、診断薬剤を含む、請求項３１に記載の方法。
  37. 前記診断薬剤が、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）を実施するために使用される、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記診断薬剤が、１つ以上のイメージ増強薬剤を含み、前記方法が、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）を実施することをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
  39. 前記組成物が、Ｘ線またはコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）のための、１つ以上の放射線不透過性薬剤または造影剤を含む、請求項３１に記載の方法。
  40. 治療薬剤、診断薬剤またはそれらの混合物を含む、追加組成物を投与することをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
  41. 前記追加組成物が、ヒト化Ｌ２４３抗体が１つ以上の脂質、重合化担体、ミセル、ナノ粒子、またはこれらの組み合わせ、および１つ以上のエフェクターにコンジュゲートした、免疫コンジュゲート体を含む、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記ヒト化Ｌ２４３抗体またはその断片が、化学的な連結または遺伝的な融合によって、治療薬剤、診断薬剤またはそれらの混合物にコンジュゲートしている、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記組成物が、追加組成物の投与前、間、同時または後に投与される、請求項４０に記載の方法。
  44. 請求項３０の組成物を含むキット。
  45. 少なくとも１つの結合部位が、請求項３に記載したようなｈＬ２４３可変ドメインの任意の１つからなるか、腫瘍関連に対する１つ以上の結合部位からなる、３つの結合部位を含む、「裸の」多価タンパク質複合体を前記対象に投与することを含む、対象の疾病を処置する方法。
  46. 前記疾病が、新生物疾患、自己免疫疾患または免疫調節不全疾病、代謝疾病または神経変性疾患である、請求項４５に記載の方法。
  47. （Ａ）ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する少なくとも１つのアーム、および標的化可能なコンジュゲート体に特異的に結合する少なくとも１つの他のアームを含む、有効量の二重特異性抗体または抗体断片を投与するステップと、ここでＨＬＡ−ＤＲに結合する前記１つのアームがｈＬ２４３抗体またはその断片であり、前記標的化可能なコンジュゲート体がハプテン部分および治療薬剤を含む、（Ｂ）前記標的化可能なコンジュゲート体を、前記状態の患者に投与するステップとを含む、ＨＬＡ−ＤＲを発現する細胞の増殖に関連する状態を処置する方法。
  48. ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する１つのアームおよび腫瘍関連抗原に結合する１つのアームを含む、有効量の二重特異性抗体または抗体断片を、ＨＬＡ−ＤＲを発現する細胞の増殖に関する状態の被験対象に投与することを含む、ＨＬＡ−ＤＲを発現する細胞の増殖に関する状態を処置する方法であって、ＨＬＡ−ＤＲに結合する前記１つのアームが、ｈＬ２４３抗体またはその断片である、方法。
  49. 前記状態が、Ｂ細胞悪性腫瘍を含む、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記腫瘍関連抗原がＣＤ２０である、請求項４８に記載の方法。
  51. （Ａ）ＨＬＡ−ＤＲを発現する細胞の増殖に関連した状態を有する被験対象に、有効量の、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体または抗体断片を投与するステップと、ここで、前記ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体が、ｈＬ２４３抗体またはその断片である、（Ｂ）前記対象に、前記抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の前、後または同時に、腫瘍関連抗原に結合する有効量の抗体または抗体断片を投与するステップとを含む、ＨＬＡ−ＤＲを発現する細胞の増殖に関連した状態を処置する方法。
  52. 前記状態が、Ｂ細胞悪性腫瘍を含む、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記抗腫瘍関連抗原抗体または抗体断片が、ヒト化抗体または抗体断片を含む、請求項５１に記載の方法。
  54. 前記腫瘍関連抗原がＣＤ２０である、請求項５１に記載の方法。
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