JP2008531054A - マルチアニオン処理ダイズタンパク質および該物質の調製方法 - Google Patents

Abstract

ダイズタンパク質をマルチアニオン試薬で処理するための新規プロセスが開示される。プロセスは、酸沈殿ダイズタンパク質カードをマルチアニオン化学種で処理してタンパク質分子上の静電荷を修正し、酸性環境で使用されたときの得られたダイズタンパク質含有組成物の機能性を改善するステップを含む。得られたダイズタンパク質含有組成物は、酸性環境内において改善された溶解性、懸濁性、および安定性を有し、酸性飲料で使用するのに高度に適している。方法は、ダイズタンパク質含有組成物をさらに改善するために、任意に安定剤を使用するステップおよびフィターゼ処理ステップを含んでもよい。

Description

本発明は、一般にマルチアニオン化学種を使用して、変性ダイズタンパク質含有組成物および変性ダイズタンパク質含有組成物を生成する方法に関する。より詳しくは、本発明は、酸性溶液中において優れた安定性、溶解性、および懸濁性を有する、変性ダイズタンパク質含有組成物を生成する方法に関する。

ダイズに由来するタンパク質は、可食タンパク源としてここしばらく利用されており、一般的にいくつかの消費者食品に含まれている。これらのダイズタンパク質は、乳化およびゲル形成特性などのいくつかの機能特性を有するので、肉製品、魚すり身製品、付け合わせ、パン、菓子製品、および清涼飲料やスポーツ飲料などの酸性飲料中で原料として広く使用されてきた。ダイズタンパク質が血液コレステロールレベルを低下させ、優れた栄養的および生理学的機能を提供することが認識されているため、食品および酸性飲料中でのダイズタンパク質の利用は、将来増大する一方であるように見える。

ダイズタンパク質は、いくつかの消費者食品および飲料中で使用されているが、清涼飲料、スポーツドリンク、および健康飲料などの酸性タイプ飲料中で利用する場合、ダイズタンパク質、特に主要ダイズ貯蔵タンパク質であるグリシニンおよびβ−コングリシニンの飲料それ自体への溶解性が、添加できるダイズタンパク質の量を制限するかもしれない。例えばｐＨ約５未満を有する酸性飲料中では、ダイズタンパク質の溶解性は非常に低く、タンパク質はそれらの機能特性を示さないので、ダイズタンパク質の使用は顕著に制限されるかもしれない。これは主として、多くのダイズタンパク質の等電点はｐＨ約３〜５前後であるという事実に起因する。これはダイズタンパク質がそれに添加される飲料中に、沈降分離問題を引き起こす。さらにダイズタンパク質がそれに添加される多くの酸性飲料は、望ましくない渋い風味を帯びる。

酸性飲料中のダイズタンパク質の溶解性を改善することでダイズタンパク質レベルを増大した消費者飲料を提供するために、いくつかの方法が以前に利用されている。これらの方法は、主に低ｐＨでのタンパク質の凝集および／または沈殿を防止することに向けたものである。例えばいくつかの方法は、ペクチンなどの安定剤または１３以上のＨＬＢを有する糖脂肪酸などの乳化剤を添加して、ダイズタンパク質の溶解性を改善する。さらに酸性飲料中のダイズタンパク質の溶解性は、ダイズタンパク質を酵素的に加水分解させて、改善された溶解性を有するより小型のペプチドにタンパク質を分割することによって改善されている。またダイズタンパク質は、ｐＨ範囲約３〜約５でスクシニル化を通じて化学的に変性され、それらの溶解性が改善されている。

近年、米国特許公報（特許文献１）では、水性溶液中においてタンパク質表面の電荷を増大させるための化学試薬（例えばＣａＣｌ₂およびキトサン）と組み合わさった酵素（例えばフィターゼ）の使用を通じて、酸性環境内でのダイズタンパク質の溶解性を改善する方法が開示されている。方法は、ｐＨ３〜４．５においてダイズタンパク質の溶解性および透光性を改善すると主張している。

米国特許出願公開第２００４／００８６６２４号明細書

これらのアプローチのいくつかは一般に酸性水性溶液中で溶解性を増大するか、またはダイズタンパク質を安定化しているが、それらは酸性飲料および食品系中で味が良く、水溶性が改善された、未加水分解、実質的に未加水分解、および／または非安定化ダイズタンパク質を提供するという問題を解決していない。このためこの業界において、酸性飲料などの酸性溶液中で、改善された溶解性と味を示すダイズタンパク質およびダイズタンパク質を生成する方法に対する必要性が存在する。

本発明は、食物および飲料製品中、具体的には酸性飲料製品中に含めるのに適したダイズタンパク質含有組成物、およびダイズタンパク質含有組成物の製造方法を提供する。ダイズタンパク質含有組成物は、酸性飲料をはじめとする酸性ｐＨ環境内で、従来のダイズタンパク質含有組成物と比べて改善された安定性、懸濁性、および溶解性を有する。

ここで述べられる製造方法は、酸性環境内で改善された機能性を有する変性沈殿ダイズタンパク質スラリーを生成するためのマルチアニオン化学種試薬と沈殿ダイズタンパク質カードとの混合の新規プロセスと組み合わさった、従来のダイズフレーク加工ステップを含む。ここで述べられる製造方法は任意に、ここで述べられる変性ダイズタンパク質含有組成物を使用して、酸性環境内での溶解性を改善するためのフィターゼ処理、および製品の味を改善するための安定剤処理をはじめとするいくつかのステップを含むことができる。ここで述べられる製造方法で使用するのに適したマルチアニオン試薬としては、多価アニオン、または多価アニオンのアルカリ土類金属塩が挙げられる。

したがって本発明は、ダイズタンパク質含有組成物の製造方法に関する。製造方法は、最初にダイズフレークからダイズタンパク質抽出物を調製するステップと、次にダイズタンパク質抽出物と酸とを接触させてダイズタンパク質カードを生成し、次にそれをマルチアニオン試薬と接触させて、変性ダイズタンパク質スラリーを生成するステップとを含む。次にこの変性ダイズタンパク質スラリーを酸性ｐＨで加熱し、噴霧乾燥してダイズタンパク質含有組成物を生成する。

本発明は、ダイズタンパク質を含んでなるダイズタンパク質含有組成物にさらに関する。組成物は少なくとも約７０００ｐｐｍのリンを含んでなり、４を超える等電点を有する。

本発明は、ダイズタンパク質を含んでなるダイズタンパク質含有組成物にさらに関する。組成物は４を超える等電点を有し、マルチアニオン試薬処理ステップを含む方法によって調製される。

本発明は、一般にダイズタンパク質含有組成物およびダイズタンパク質含有組成物を生成する方法に向けたものである。ここで述べられる方法は、従来法によって沈殿されたダイズタンパク質カードをマルチアニオン試薬で処理して、変性ダイズタンパク質スラリーを生成するステップを含む。意外にも従来法で沈殿されたダイズタンパク質カードをマルチアニオン試薬で処理することにより、得られた変性ダイズタンパク質スラリーは、食品中、具体的には酸性飲料中で実質的に改善された特性を示した。とりわけ得られたダイズタンパク質含有組成物は、酸性飲料中での溶解性、懸濁性、安定性、透光性、および風味などの改善された特性を有する。

上述のように、本発明の方法はいくつかのステップを含む。方法の第１のステップは、ダイズフレーク、ダイズ穀粉などのダイズタンパク質源から、ダイズタンパク質抽出物を調製してダイズタンパク質カードを生成することを含む。ここでの用法では、「ダイズフレーク」という用語は、ダイズフレーク、ダイズ穀粉、およびその他の一般的なダイズ出発原料を含むことを意図する。ここで述べられる組成物で使用するためのダイズタンパク質カードを調製するための適切な一抽出法は、最初にダイズを挽き割りして外皮を除去するステップと、それらを圧扁機でフレークに圧延するステップと、フレークに溶剤抽出法を施すステップと、溶剤を蒸発させて脱脂白色フレークを生成するステップと、白色フレークを水溶液に懸濁するステップと、可溶性タンパク質溶液から不溶性繊維を分離するステップと、酸によってそれからダイズタンパク質カードを沈殿させるステップを含む。適切な圧扁機は、一組の水平逆転滑面鋼ロールからなってもよい。ロールは、強力バネの手段によって、または制御される油圧装置によって互いに押しつけられる。ダイズはロールの間に供給され、ロールが互いに回転すると平らになる。ロールツーロール圧力を調節してフレークの平均厚を決定できる。圧延加工は油細胞を崩壊させて、フレークからの油の溶剤抽出を容易にする。具体的には、圧扁は油料種子組織と溶剤（典型的に下記のようにヘキサンまたはヘプタン）間の接触面を増大させ、下で述べられるように抽出法において、溶剤と抽出物が移動しなくてはならない距離を低下させる。フレーク厚の典型的な値は、０．２〜０．３５ｍｍの範囲である。

次に処理済ダイズフレーク材料に溶剤抽出法を施して、それから油を除去する。典型的に抽出法のための溶剤は、非水性ヘプタンまたはヘキサン溶剤である。溶剤は、ダイズ油およびレシチンをはじめとする、その中に可溶性の材料を除去して脱脂材料を生じる。

好ましくはダイズフレーク材料を溶剤溶液中で撹拌し、次にダイズフレーク材料から、溶剤溶液に可溶性の材料を除去するのを容易にする時間にわたって遠心分離する。次に溶剤溶液をダイズフレーク材料からデカントし、溶剤回収ステップを経て油を生じさせる。ダイズフレーク中の残留含油量が所望のレベルに低下するまで、回収溶剤溶液を抽出物に再循環させる。

ひとたび所望レベルの脱脂が得られたら、一般に残留固体材料を乾燥させて、さらなる加工に適した乾燥白色フレークを生成する。従来の乾燥方法としては、熱風または蒸気乾燥が挙げられる。

ひとたび脱脂白色フレークが生成すると、それらを任意に水溶液に懸濁して、分散体と称されることもある懸濁ダイズタンパク質抽出物を生成してもよい。典型的に水溶液は約９０°Ｆの温度を有する水を含んでなるが、水およびその他の化合物を含んでなるその他の溶液、および技術分野において従来法で知られているその他の温度もまた使用してもよい。遠心分離機を任意に利用して、可溶性タンパク質抽出物からあらゆる不溶性繊維を除去してもよい。

最後に、酸によって懸濁ダイズタンパク質抽出物からダイズタンパク質カードが沈殿される。沈殿は、ダイズタンパク質抽出物から炭水化物および脂肪などの残留不純物を除去する。典型的に酸は、塩酸（ＨＣｌ）、リン酸、クエン酸、硫酸、およびそれらの組み合わせであり、約４．０〜約５．０のｐＨを生じさせ、沈殿ダイズタンパク質カードを形成するために使用される。その他の有機または無機酸もまた適切であるかもしれず、当業者によく知られている。特定の実施態様では、リン酸が単独でまたはクエン酸と組み合わさって使用され、ｐＨ約３．５〜約３．８でカードを沈殿させる。

ここで述べられるようなダイズタンパク質カードを変性するためのマルチアニオン試薬での処理に適した沈殿ダイズタンパク質カードが、上述のようにして調製されるのに加えて、いくつかの市販されるダイズタンパク質がマルチアニオン試薬による変性に適する。市販されるダイズタンパク質を上述のように水溶液に単に懸濁して、上述のように酸によって沈殿させて、変性に適した沈殿ダイズタンパク質カードを生成する。マルチアニオン処理のために選択された市販されるダイズタンパク質は、望ましくは未加水分解の低溶解性ダイズタンパク質である。酸飲料用途のための市販されるダイズタンパク質は、一般に約１８，０００ダルトン〜約２２，０００ダルトンの範囲の分子量、および約３０μｍ〜約５０μｍ（容積加重質量）の粒度分布を有する。適切な市販されるダイズタンパク質は、ＸＴ−４０（ミズーリ州セントルイスの本願特許出願人）である。

ひとたび適切なダイズタンパク質カードが沈殿すると、それを一般に水中に導入して水性タンパク質スラリーを形成し、それを引き続いて下で述べられるマルチアニオン試薬で処理する。一般に水性タンパク質スラリーは、約５重量％〜約２０重量％固形物、望ましくは約８重量％〜約１５重量％固形物、およびより望ましくは約１０重量％〜約１２重量％固形物の固形物濃度を有する。

マルチアニオン化学種での処理に先だって形成された水性タンパク質スラリーのｐＨは、一般にｐＨ約２．５〜約４．５に調節される。望ましくは水性スラリーのｐＨは約２．５〜約３．５、より望ましくは約２．８〜約３．２である。

マルチアニオン試薬による沈殿ダイズタンパク質カード（典型的に上述のようにタンパク質スラリーに形成された）の処理は、タンパク質表面に含有される荷電アミノ酸側鎖に会合するマルチアニオン化学種を有する、変性ダイズタンパク質スラリーを生成する。陽イオンと陰イオンの会合は、静電相互作用である。本例では、負に帯電したマルチアニオンが、正に帯電したアミノ酸側鎖（例えばアルギニンおよびリジン）と会合する。マルチアニオンとタンパク質表面の荷電部位との静電相互作用のために、マルチアニオン処理は、ダイズタンパク質スラリー上に存在するダイズタンパク質の総体的表面電荷の変更をもたらす。ダイズタンパク質表面電荷の変化は、ダイズタンパク質の等電点（すなわち分子が０の正味電荷を有するｐＨ）の変化をもたらす。換言すると、マルチアニオン試薬によるダイズタンパク質の処理および得られるダイズタンパク質表面の電荷の変更は、ダイズタンパク質の等電点をシフトすることで、特定ｐＨにおけるダイズタンパク質の溶解性および／または懸濁性に影響を与える。例えば負に帯電したマルチアニオン化学種による処理のためにダイズタンパク質の等電点が増大する場合、マルチアニオン処理ダイズタンパク質（すなわち変性ダイズタンパク質）の溶解性は、より低いｐＨ（一般に高度に酸性の環境）で増大する。換言すると、マルチアニオン処理ダイズタンパク質の等電点がおよそ４からより高い等電点値に増大するにつれて、ｐＨ３．８におけるマルチアニオン処理ダイズタンパク質の溶解性は増大する。

さらに同一ｐＨでマルチアニオン処理ダイズタンパク質と天然ダイズタンパク質とを比較すると、マルチアニオン処理ダイズタンパク質の表面電荷の増大は、より高い溶解性を有する処理ダイズタンパク質をもたらす。これは主に、隣接するタンパク質表面のより大きい表面電荷の反発による、粒子凝集の減少のためであると考えられる。したがってダイズタンパク質のマルチアニオン処理は、平均で例えば約１５〜約２５μｍ（容積加重質量）であってもよいより小さな平均粒度をもたらす。

多様なマルチアニオン化学種（マルチアニオン試薬）を使用して、沈殿ダイズタンパク質カードを変性できる。一般に本発明に従って沈殿ダイズタンパク質カードを変性するのに適したマルチアニオン化学種は、イオン化後に陰イオンを形成できる２つ以上のイオン性基を有する。例えば多価アニオンのアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩、およびそれらの組み合わせを含んでなるマルチアニオンが、本発明の方法で使用するのに適したマルチアニオン化学種である。

適切なマルチアニオン化学種としては、例えばクエン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなど、およびそれらの組み合わせが挙げられる。マルチアニオン試薬を含んでなるマルチアニオン化学種が、タンパク質表面の正に帯電したイオンに対して高親和力を有することが望ましい。例示的な一実施態様では、適切なマルチアニオン試薬は、イオン化後に陰イオンを形成できる３つ以上のイオン性基を有する。理論による拘束は意図しないが、３つ以上のイオン性基を有するマルチアニオンは、三価のまたはより大きな原子価のアニオンのより大きな電荷ポテンシャルのために、ダイズタンパク質陽イオンに対してより大きな親和力を有すると考えられる。当業者は本願明細書の開示に基づいて、多数のその他のマルチアニオン化学種が、ここで述べられるマルチアニオン試薬中での使用に適するかもしれないことを認識する。

マルチアニオン試薬による処理は、一般に得られるダイズタンパク質組成物に所望の特性を与えるのに十分な時間行われる。マルチアニオン試薬処理は、一般に約１分〜約２０分、適切には約１分〜約１０分、より適切には約５分〜約１０分行われる。さらにマルチアニオン試薬処理は、一般に室温またはわずかに高い温度で行われる。高温は一般にタンパク質を望ましくないように変性させるかもしれないので、これらの温度は好ましくない。

上述のようにダイズタンパク質カードは、一般にマルチアニオン試薬での処理に先立って水性溶液に入れられる。これが行われると、ダイズタンパク質カードを含有する溶液中の上述のマルチアニオン試薬の濃度は、一般に約０．１％（ダイズタンパク質カードの重量基準）から約５％（ダイズタンパク質カードの重量基準）、望ましくは約０．５％（ダイズタンパク質カードの重量基準）から約３％（ダイズタンパク質カードの重量基準）になる。

一般に変性ダイズタンパク質スラリーの低ｐＨにおける溶解性は、最適マルチアニオン濃度まで、マルチアニオン化学種の濃度の増大と共に増大する。この最適濃度を越えると、変性ダイズタンパク質スラリー（またはそれから得られた組成物）の低ｐＨにおける溶解性は低下する。換言すると変性ダイズタンパク質スラリーは、それが望ましくない溶解特性を有する程度まで「過剰変性」させることができる。理論による拘束は意図しないが、マルチアニオン濃度の増大と共に溶剤活性が低下するので、過剰変性ダイズタンパク質スラリーの溶解性の低下は、ダイズタンパク質の「塩析」に起因するかもしれない。

ひとたび変性ダイズタンパク質スラリーが形成すると、それを任意に加熱処理して変性ダイズタンパク質を低温殺菌し、細菌生育を低下させて、食品系での使用に許容可能なダイズタンパク質含有組成物を提供してもよい。典型的には変性後に行われるが、本発明の変性ダイズタンパク質組成物の熱処理は、マルチアニオン化学種によるダイズタンパク質カード処理の前後に起きてもよい。望ましくはマルチアニオン試薬は、熱処理に先だって水性ダイズタンパク質に添加される。熱処理の温度および継続時間は、変性ダイズタンパク質混合物を低温殺菌するのに十分でなくてはならない。典型的に低温殺菌は、より高温でより短時間、またはより低温でより長時間行われる。適切な１つの熱処理法では熱処理法は、５００ｐｓｉｇの圧力で１５０℃（３００〜３０５°Ｆ）の温度に９〜１５秒間真空内で加熱するステップを含んでなる。別の実施態様では、加熱するステップは、５００ｐｓｉｇで３０５°Ｆ（１５２℃）の真空内で１５秒間で完了できる。一般に熱処理中の溶液のｐＨは約２．５〜約４．５、適切には約２．８〜約３．５である。

理論による拘束は意図しないが、ダイズタンパク質が熱に接するとそれらは三次元構造をアンフォールドするので、熱処理に先だつマルチアニオン化学種によるダイズタンパク質カードの変性が望ましいと考えられる。冷却するとダイズタンパク質はリフォールディングし、新しい構造を形成する。熱処理中にマルチアニオン化学種とタンパク質のより大きな表面積とを相互作用させることで、ダイズタンパク質のより多くの部分が接触し、マルチアニオン化学種との静電相互作用を形成するのかもしれない。マルチアニオン試薬の添加後、タンパク質表面の負電荷が、複数のタンパク質がより大きな凝塊に共に凝集するのを防止すると考えられる。追加的負電荷をタンパク質に導入することで反発が増大し、改善された溶解性をもたらすと考えられる。

変性ダイズタンパク質スラリーを典型的に、従来の乾燥方法を使用して変性後のある時点で乾燥させ、ダイズタンパク質含有組成物を生成する。適切な一実施態様では、温度約１８０°Ｆ（８２℃）で適切な時間の噴霧乾燥によって、変性ダイズタンパク質スラリーを乾燥させる。変性ダイズタンパク質スラリーを乾燥するのに使用される正確な方法および条件は重大でなく、当業者に既知の多くの方法の１つが適切である。噴霧乾燥は、酸性飲料中などの酸性環境内で利用すると、改善された特性を有するダイズタンパク質含有組成物を生じる。ダイズタンパク質含有組成物は、酸性環境内で改善された懸濁性、溶解性、および安定性を有する。またここで述べられるいくつかの実施態様では、得られた生成物の透光性が改善されてもよい。

本発明の方法の代案の実施態様では、ダイズタンパク質含有組成物の調製中に安定剤を利用してもよい。ダイズタンパク質含有組成物の製造中に添加された安定剤は、マルチアニオン処理中にタンパク質の球形構造と相互作用してもよく、したがって酸性環境内で使用すると、これらの分子および構成要素の懸濁および溶解性を増大させる。さらに安定剤はまた、あらゆる渋味またはその他の異臭を減少させまたは排除してもよい。

安定剤は、ダイズタンパク質組成物の製造工程中にいくつかの時点で導入できるが、それは一般にマルチアニオン試薬と同時に工程中に導入される。上述のように、安定剤はタンパク質の球形表面およびその他の構成要素と相互作用する。この相互作用は、分子と構成要素間の静電相互作用を安定化させ、それによってタンパク質分子が共に凝集して、酸性環境内で低下した溶解性および安定性を有する大型凝塊を形成する可能性を低下させる。典型的に安定剤がそれに添加されるダイズタンパク質カードのｐＨは約２．５〜約４．０、望ましくは約２．８〜約３．５である。安定剤は、約２０％以下（タンパク質カードの重量基準）、適切には約１５％以下（タンパク質カードの重量基準）、より適切には約５％以下（タンパク質カードの重量基準）の量で添加されてもよい。

本発明の方法で使用するための適切な安定剤としては、例えばアルギン酸プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロース、グアーガム、アラビアゴム、キサンタンガム、およびそれらの組み合わせが挙げられる。これらの安定剤のいずれも変性（すなわち加水分解された）または未変性状態で使用できる。好ましい安定剤としては、グアーガム、アラビアゴム、および加水分解グアーガムが挙げられる。

本発明の別の実施態様では、ｐＨ約３〜約４．５で使用するために、ダイズタンパク質含有組成物の製造中に存在するフィチンの量を低下させる任意の処理を使用して、ダイズタンパク質含有組成物の機能性をさらに改善してもよい。この処理は、得られるダイズタンパク質含有組成物の溶解性、懸濁性、および安定性を改善してもよい。フィチンを低下させる方法の適切な例としては、例えば透析、限外濾過、および電気透析などの膜による処理が挙げられる。またイオン交換樹脂も使用してよい。フィチンを処理する好ましい方法としては、フィチン酸加水分解活性を有する酵素または酵素製剤（フィターゼ）の使用が挙げられる。

フィターゼを使用する実施態様では、上述のマルチアニオン化学種によるダイズタンパク質カード処理に先だって、それと同時に、またはその後で、ダイズタンパク質カードをフィターゼで処理することで、ダイズタンパク質含有組成物の機能性が改善される。フィターゼ処理は、食物および食品中で使用すると、特に低ｐＨレベルでダイズタンパク質の機能性を低下できる、ダイズタンパク質中に自然に存在する酸であるフィチンの量を低下させる。具体的には、フィチンは多くの負電荷集中部位を有し、そのため１つを超えるダイズタンパク質単位との顕著な静電相互作用を有することができる。フィチンとダイズタンパク質単位との複数相互作用は、大型タンパク質凝塊の原因となることができる、そのときに水性溶液中でのダイズタンパク質の溶解性、安定性、および懸濁性を低下させる。

高レベルの加水分解は、低分子加水分解産物の増加によって、例えばゲル形成能力、味の劣化などをはじめとするダイズタンパク質の機能特性を低下させることができるので、望ましくは処理において使用されるフィターゼは、ダイズタンパク質を実質的に加水分解しない。フィターゼ処理の条件は一般に重要でなく、フィターゼを反応させる方法は限定されないが、プロテアーゼ活性が低いまたは皆無のフィターゼを使用して、タンパク質加水分解の可能性を低下させることが一般に望ましい。

フィターゼ酵素またはフィターゼ酵素製剤の起源は、それが有益であるのに十分なフィチン酸加水分解活性を有する限り、具体的には限定されない。一般に微生物に由来するフィターゼはより高いフィチン酸加水分解活性とより低い共存プロテアーゼ活性を有するので、加水分解予防およびタンパク質損傷の点から見て、植物に由来するものよりも有利である。

適切な一実施態様では、ｐＨ２．５〜７．５および温度２０〜７０℃で約５分〜３時間、０．１〜１００単位／ｇ、好ましくは０．５〜５０単位／ｇの固形分の量でフィターゼを沈殿ダイズタンパク質カードと反応させる。ここでの用法では、１単位のフィターゼ活性は、標準条件（すなわちｐＨ５．５、３７℃）下における反応の初期段階の１分間で、基質フィチン酸から１μｍｏｌのリン酸を遊離させるのに必要な酵素の量に相当する。フィターゼ処理の正確なパラメーターは重要でなく、当業者は適切なパラメーターを判定できる。

ここで述べられる本発明の方法は、ｐＨが典型的に約３〜約４．５、およびより典型的に約３．２〜約３．８である酸性飲料中などの酸性環境内で利用すると、優れた機能性を有するダイズタンパク質含有組成物を生成する。ダイズタンパク質含有組成物は、酸性環境内において従来法で調製されたダイズタンパク質含有組成物と比べて、改善された溶解性、透光性、懸濁性、および安定性を有し、長期にわたり顕著な沈降分離を生成しない。換言すると、本発明の方法によって生成されるダイズタンパク質含有組成物は、従来のダイズタンパク質含有組成物よりも高い等電点を有する。等電点がより高いので、ダイズタンパク質含有組成物の溶解性および懸濁性はより低いｐＨにおいてより高く、望ましい特性がもたらされる。

本発明のダイズタンパク質含有組成物は、典型的に４を超え、適切には４．１、４．２、４．３、４．４、または４．５さえ超える等電点を有する。等電点がこの範囲にあると、ｐＨ約３．２〜約３．８におけるダイズタンパク質含有組成物の溶解性は顕著に改善される。

本発明のダイズタンパク質含有組成物は、上述のように従来のダイズタンパク質含有組成物と比べて、低ｐＨで改善された溶解性を有する。一般にここで述べられるダイズタンパク質含有組成物はｐＨ約３〜約４の範囲、具体的には約３．２〜約３．８にわたり改善された溶解性を有する。具体的な一実施態様では、本発明に従って調製されたダイズタンパク質含有組成物は、ｐＨ３．５の水中で約４０％を超える溶解性を有する。別の具体的な一実施態様では、本発明に従って調製されたダイズタンパク質含有組成物は、ｐＨ３．７の水中で約５０％または７０％さえも超える溶解性を有する。

より高い等電点に加えて、本発明の方法で生成されたダイズタンパク質含有組成物のいくつかは、マルチアニオン試薬での処理のために、リンのレベルが増大する。一実施態様では、ダイズタンパク質含有組成物は少なくとも約７０００ｐｐｍのリンの濃度を有する。

（実施例１）
この実施例では、ここで述べられるマルチアニオン化学種での処理を含む方法を使用して、３つの実験的なダイズタンパク質含有サンプルを生成する。次にこれらの３つの実験サンプルをそれらの溶解性プロフィールについてｐＨ２〜７で、均一性についてｐＨ３．８で評価する。さらにマルチアニオン化学種処理を施さなかった１つの対照サンプル（ミズーリ州セントルイスの本願特許出願人から市販されるＸＴ−４０）もまた、溶解性および均一性について評価する。

マルチアニオン化学種による処理および評価の前日に、ここで述べられるようにして従来の様式で塩酸で沈殿させたダイズタンパク質カードを使用して、ベンチトップで３つの各実験的ダイズタンパク質含有サンプルを調製する。第２の抽出物に添加された水酸化ナトリウムでの向流抽出によりカードを生成し、沈殿酸としては塩酸を使用する。カードを一晩冷却する。沈殿カードを水中で１０％（固形物基準）に希釈して、３つの実験サンプルに分割する。次に３つの各サンプルを塩酸でｐＨ３．５に調節する。次に第１の実験サンプル（サンプル１）に５．０％（固形物基準）のリン酸二水素ナトリウムを添加する。第２の実験サンプル（サンプル２）に３．０％（固形物基準）のリン酸二水素ナトリウムを添加する。第３の実験サンプル（サンプル３）に１．５％のリン酸二水素ナトリウムを添加する。対照（ミズーリ州セントルイスの本願特許出願人から市販されるＸＴ−４０）もまた１０％（固形物基準）に希釈するが、いかなるリン酸二水素もそれに添加しない。サンプル１、２、および３を室温でリン酸二水素ナトリウムによって１０分間処理する。

次に３つの実験サンプルをマイクロサーミックス（Ｍｉｃｒｏｔｈｅｒｍｉｃｓ）ユニット内で直接蒸気によって、約２５０°Ｆの温度で約８〜９秒間処理する。対照を直接蒸気によって、約２５０°Ｆの温度で約１０．５秒間処理する。熱処理後、３つの各実験サンプルおよび対照サンプルをふるい（６０メッシュ）に通して、ニロ（Ｎｉｒｏ）乾燥機内で噴霧乾燥する。

次に３つの実験サンプルおよび対照サンプルについて、次のように機能性を評価する。（１）酸性環境内での溶解性、および（２）ｐＨ３．８での均一性。

３つの実験サンプルおよび対照サンプルを最初に、異なるｐＨにおけるそれらの酸溶解性について試験する。酸性飲料に関する特定の関心のために、サンプルをｐＨ３、３．５、３．８、４．０、４．５、５．０、および６．０における溶解性について試験する。試験方法は次のとおり。各サンプルについて、０．４８ｇのサンプルを６０．０ｇの水と共に１００ｍＬビーカー内に入れ、分散体が得られるまで磁気撹拌機で撹拌する。ひとたびサンプルが分散すると、希釈塩酸または希釈水酸化ナトリウムのどちらかで水性溶液のｐＨを試験のための所望のｐＨ（すなわち３、３．５、３．８、４．０、４．５、５．０、または６．０）に調節する。ひとたびｐＨが調節されると、ビーカーを振盪機浴内に入れて、１分あたり１００回転で約１時間振盪する。振盪後、サンプルのｐＨを調べ、必要ならば希釈塩酸または希釈水酸化ナトリウムのどちらかで所望のｐＨに調節し直す。次にサンプルをｐＨが再調節されたかどうかにかかわらず、１分あたり１００回転でさらに１時間振盪する。

振盪完了後、各サンプルを同一量で遠心管に入れて２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。遠心処理後、各管から１ｍＬのサンプルを取りだして標識した試験管内に入れる。１ｍＬのサンプルを含有する各管に、４ｍＬのビウレット溶液を入れ、混合物を数秒間ボルテックスして混合する。次に各管を３０分間静置して発色させる。１ｍＬの脱イオン水およびビウレット溶液を含んでなる空試験もまた調製する。撹拌後、各管を５５０ｎｍの分光光度計内で読み取り、空試験管の読み取りを差し引いて、サンプルの読み取りを総タンパク質の読み取りで除して結果に１００を乗じて、可溶性タンパク質の量を計算する。

さらに３つの実験サンプルおよび対照サンプルを均一性について評価し、それは最小の混合で調製された単離分散体の分離を測定し、調製された懸濁液の外観を判断する手段を提供する。１０ｇの各実験サンプルおよび対照を秤取りブレンダージャー内の蒸留水（２３℃±５℃で２００ｍＬ）に入れる。３滴の脱泡剤（ペゴスパース（Ｐｅｇｏｓｐｅｒｓｅ））を各実験サンプルおよび対照に添加して、塩酸で液体のｐＨを３．８に調節する。次にブレードアセンブリーを取り付けて、標準ブレンダー内で各サンプルを低速で１０秒間混合する。２４時間経過後、各サンプルを写真撮影して均一性を評価する。

溶解性プロフィールの結果を図１に示す。この図１から、最も関心のある酸性範囲、ｐＨ約３．５〜約４．０にわたり、サンプル３（１．５％処理）が最も可溶性であることが容易に分かる。さらにサンプル１および２もまた、ｐＨ約３．５〜約４．０の範囲で高い溶解性を示す。さらに３つの全実験サンプルは、ｐＨ約３．８で対照よりも可溶性である。このデータは、マルチアニオン処理が低ｐＨで高溶解性であるダイズタンパク質組成物を生成することを示唆する。

ｐＨ３．８における均一性評価の結果を図２に示す。図２から２４時間の静置後、対照サンプルは透明な上層とふわふわした沈降物を有することが分かる。３つの実験サンプルは、シリンダー全体にわたって均質であり目に見える沈降分離はない。これに基づいて、実験サンプルは２４時間後に観察すると、対照と比べて沈降分離に関してはるかに良好に機能する。３つの実験サンプルの沈降分離に関して差は観察されない。

この実施例で得られたデータから、３つの実験サンプルへのマルチアニオン化学種の導入が、サンプルの酸性溶解性および均一性を増大させることが示される。３．０％および５．０％の添加は、対照と比べてそれぞれのサンプルの溶解性を増大させるが、１．５％添加ほどではない。顕著に、マルチアニオン化学種によって処理された３つの実験サンプルは、２４時間後に沈降分離を示さない一方、対照は顕著な沈降を示す。

（実施例２）
この実施例では、実施例１に記載するのと類似の方法を使用して、４つの実験的ダイズタンパク質含有サンプルを生成する。次にこれらの４つの実験サンプルをｐＨ３〜６での溶解性プロフィール、およびｐＨ３．８での均一性について評価する。さらに実施例１に記載されるマルチアニオン化学種処理を施さなかった１つの対照サンプル（ミズーリ州セントルイスの本願特許出願人から市販されるＸＴ−４０）もまた、溶解性および均一性について評価する。

調製した４つの実験サンプルを実施例１の方法に従って、マルチアニオン化学種で次のように処理する。（１）サンプル１：１．２３％クエン酸ナトリウム、（２）サンプル２：２．５％クエン酸ナトリウム、（３）サンプル３：４．９％クエン酸ナトリウム、および（４）サンプル４：１．０％リン酸二水素ナトリウム。４つのサンプルをｐＨ３．４５で処理し、２５０°Ｆの温度に１０秒間加熱すること以外は、実施例１に記載の方法を利用する。対照は実施例１に記載するように調製される。

実施例１の溶解性プロフィール試験方法を使用して、サンプル１、２、および３（それぞれクエン酸ナトリウムで処理済み）をｐＨ範囲３〜６におけるそれらの溶解性について評価する。さらにサンプル１および４をｐＨ範囲３〜６にわたって対照サンプルと比較する。

さらに実施例１に記載する均一性試験方法を使用して、４つの実験サンプルおよび対照を２４時間後にそれらの均一性について評価する。

サンプル１、２、および３（クエン酸ナトリウム処理サンプル）の溶解性プロフィールの結果を図３に示す。この図３からクエン酸ナトリウムで処理した各実験サンプルが、ｐＨ範囲３〜４において溶解性にわずかな違いしか示さないことが容易に分かる。試験された３つの各サンプルは、この範囲において非常に高い溶解性を有する。

サンプル１、４、および対照の溶解性プロフィールの結果を図４に示す。この図４からクエン酸ナトリウム処理サンプルおよびリン酸処理サンプルが、どちらもｐＨ範囲３〜４において対照と比べて顕著により可溶性であることが分かる。実験サンプル１および４はこのｐＨ範囲で同様の溶解性を示す。特に興味深いのは、可溶性が２０％〜３０％のみの対照と比べて、クエン酸処理サンプルおよびリン酸処理サンプルのどちらも可溶性が８０％を越える、ｐＨ３．８である。

ｐＨ３．８における均一性評価の結果から、２４時間の静置後、対照サンプルは透明な上層とふわふわした沈降物を有することが観察される。４つの実験サンプルはシリンダー全体にわたって均質であり、目に見えるマーブリングの沈降分離はない。これに基づいて、４つの実験サンプルは、２４時間後に観察すると、対照と比べて沈降分離に関してはるかに良好に機能する。４つの実験サンプルの沈降分離に関して差は観察されない。

（実施例３）
この実施例では、実施例１に記載するのと類似の方法を使用して、実験的ダイズタンパク質含有サンプルを生成する。次にこれらの４つの実験サンプルをｐＨ３〜６での溶解性プロフィールについて評価する。さらに実施例１に記載するマルチアニオン化学種処理を施さなかった１つの対照サンプル（ミズーリ州セントルイスの本願特許出願人から市販されるＸＴ−４０）もまた、溶解性について評価する。

調製した実験サンプルを実施例１の方法に従って、硫酸水素ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｃｉｄ ｓｕｌｆａｔｅ）マルチアニオン化学種（固形物基準で１．０％）で処理する。サンプルをｐＨ３．４５で処理して、２５０^oＦの温度に１０秒間加熱すること以外は、実施例１に記載の方法を利用する。対照は実施例１に記載されるようにして調製される。

実施例１の溶解性プロフィール試験法を使用して、実験サンプルおよび対照をｐＨ範囲３〜６においてそれらの溶解性について評価する。実験サンプルおよび対照の溶解性プロフィールの結果を図５に示す。この図５から硫酸水素ナトリウムで処理した実験サンプルは、ｐＨ範囲３〜４において、対照と比べて顕著により高い溶解性を有することが容易に分かる。

（実施例４）
この実施例では、実施例１で調製されたサンプル１、２、および３（すなわちマルチアニオン処理ステップを含む方法で調製された３つのダイズタンパク質含有組成物）を２つの異なる酸性飲料モデル中に導入し、得られた飲料を１ヶ月後に安定性について評価する。第１の酸飲料は、８オンス飲料中の実施例１からの３．０ｇのサンプル１、２、または３のいずれかをベースとし、第２の酸飲料は、８オンス酸飲料中の実施例１からの６．５ｇのサンプル１、２、または３のいずれかをベースとする。

実施例１からのサンプルがその中で試験される酸飲料は、表１（第１の飲料）および表２（第２の飲料）に記載の以下の成分を含む。

試験された第１の飲料および第２の飲料は、脱イオン水中にサンプルタンパク質を高剪断で５分間分散し、６６℃で１０分間加熱して作られる。このタンパク質スラリーに残りの成分を添加して、必要ならばｐＨを約３．７〜約３．９に調節する。次に各飲料を２つのサンプルに分割し、第１のサンプルは１０２℃で３０秒間熱処理して８５℃に冷却し、第２のサンプルは９１℃で６０秒間熱加工する。次に双方の飲料を水道水の下で２５〜２７℃に冷却する。このようにして全部で１２の飲料を作る。

この実施例で作られる全飲料を１ヶ月後に懸濁安定性について評価する。実施例１からのサンプルで作られた１２の全飲料は、サンプル（ダイズタンパク質）濃度および低温殺菌温度設定にかかわらず優れた安定性を示す。１ヶ月の貯蔵後、１２の全サンプルは実質的に沈降分離を示さない。サンプルのいくつかに存在する微量の沈降分離は、容易かつ迅速に振盪により溶液に戻る。

（実施例５）
この実施例では、実施例１に記載するのと類似の方法を使用して、３つの実験的ダイズタンパク質含有サンプルを生成し、ｐＨ３〜６におけるそれらの正味イオン電荷（粒子電荷分布とも称される）について評価する。さらに実施例１に記載のマルチアニオン化学種処理を施されない１つの対照サンプル（いかなるマルチアニオン試薬もない天然タンパク質）もまた正味イオン電荷について評価する。

実施例１に方法に従って調製され、マルチアニオン化学種試薬で処理される３つの実験サンプルは、次のとおり。（１）サンプル１：２．５％クエン酸ナトリウム、（２）サンプル２：１．０％リン酸二水素ナトリウム、および（３）サンプル３：１．０％硫酸水素ナトリウム。

次に上述のように、３つの実験サンプルおよび対照サンプルを異なるｐＨにおけるそれらの粒子電荷分布について試験する。サンプルおよび対照を一連の５回の滴定（ｐＨ３、３．５、４、４．５、および６）において試験する。試験方法は次のとおり。各サンプルおよび対照で、５．０ｇを４９５ｇの脱イオン水と共に６００ｍＬビーカーに入れ、分散体が得られるまで磁気撹拌機で撹拌する。ひとたびタンパク質材料が水中に分散すると、希釈塩酸または希釈水酸化ナトリウムのどちらかで水性溶液のｐＨを試験のための所望のｐＨ（すなわち３、３．５、４、４．５、および６）に調節する。

ｐＨを調節してから、１０ｇの水性分散体をピストンおよびはねよけ付き試験容器（品番ＰＣＤ ０２−４ＰＴＦＥ）に入れる。次にＰＴＦＥ試験容器をカナダのＴＭＩ社（ＴＭＩ Ｉｎｃ．，Ｃａｎａｄａ）からのミュテック（Ｍｕｔｅｋ）粒子電荷検出器ＰＣＤ０２にマウントする。滴定装置を稼働できるコンピューターにＰＣＤを接続し、異なる滴定ｐＨにおけるサンプルの電荷を評価する。異なる試験ｐＨにおける電荷を判定してから、各サンプルの等電点を判定する。

粒子電荷分布分析の結果を図６に示す。図６から対照サンプルの電荷が、４に非常に近いｐＨにおいてアニオン性からカチオン性（すなわち等電点）に移動することが分かる。サンプル１およびサンプル２の電荷は、ｐＨ４．５前後でアニオン性からカチオン性に移動する。サンプル３の電荷分布は、ｐＨ４〜４．５でアニオン性からカチオン性に移動する。この実施例で得られたデータから、３つの実験サンプルへのマルチアニオン化学種の導入は、サンプルの等電点を対照の等電点と比べてより高いｐＨに移動させることが示される。この等電点中の電荷は、より低いｐＨにおいて溶解性増大を有するマルチアニオン化学種サンプルをもたらす。

ｐＨの関数としてのリン酸水素ナトリウム処理ダイズタンパク質およびダイズタンパク質対照の溶解性のグラフである。 ｐＨ３．８においてサンプルおよび対照が２４時間静置された、リン酸水素ナトリウム処理ダイズタンパク質およびダイズタンパク質対照の写真である。 ｐＨの関数としてのクエン酸ナトリウム処理ダイズタンパク質の溶解性のグラフである。 ｐＨの関数としてのクエン酸ナトリウムおよびリン酸水素ナトリウム処理ダイズタンパク質および対照の溶解性のグラフである。 ｐＨの関数としての硫酸水素ナトリウム処理ダイズタンパク質および対照の溶解性のグラフである。 対照、リン酸ナトリウム処理ダイズタンパク質、クエン酸ナトリウム処理ダイズタンパク質、および硫酸ナトリウム処理ダイズタンパク質の総体的なダイズタンパク質の電荷のグラフである。

Claims (23)

1. ダイズタンパク質含有組成物の製造方法であって、
   ダイズフレークを抽出溶液に懸濁し遠心処理してダイズタンパク質抽出物を生成することでダイズタンパク質抽出物をダイズフレークから調製するステップと、
   前記ダイズタンパク質抽出物と酸とを接触させてダイズタンパク質カードを形成するステップと、
   前記ダイズタンパク質カードとマルチアニオン試薬とを接触させて変性ダイズタンパク質スラリーを生成するステップと、
   前記変性ダイズタンパク質スラリーを酸性ｐＨで加熱するステップと、
   前記変性ダイズタンパク質スラリーを噴霧乾燥してダイズタンパク質含有組成物を生成するステップと
   を含むことを特徴とする、製造方法。
2. 変性沈殿ダイズタンパク質スラリーの加熱に先だって、前記変性ダイズタンパク質スラリーに安定剤を導入するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
3. 前記安定剤が、アルギン酸プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロース、グアーガム、アラビアゴム、キサンタンガム、およびそれらの組み合わせよりなる群から選択されることを特徴とする、請求項２に記載の製造方法。
4. マルチアニオン試薬の接触ステップが、前記ダイズタンパク質カードとフィターゼとを接触させるステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
5. 前記ダイズタンパク質カードを沈殿させるのに使用される酸が、塩酸、リン酸、クエン酸、硫酸、およびそれらの組み合わせよりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
6. 前記マルチアニオン試薬が、多価アニオンのアルカリ金属塩、多価アニオンのアルカリ土類金属塩、およびそれらの組み合わせを含んでなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
7. 前記マルチアニオン試薬が、クエン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、およびそれらの組み合わせよりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
8. 前記マルチアニオン試薬が、前記ダイズタンパク質カードの接触中に約０．１％（ダイズタンパク質カードの重量基準）〜約５％（ダイズタンパク質カードの重量基準）の量で存在することを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
9. 前記マルチアニオン試薬が、前記ダイズタンパク質カードの接触中に約０．５％（ダイズタンパク質カードの重量基準）〜約３％（ダイズタンパク質カードの重量基準）の量で存在することを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
10. 前記ダイズタンパク質カードを前記マルチアニオン試薬と接触させる前に、それを水性溶液中に導入するステップをさらに含んでなることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
11. 前記水性溶液のｐＨが約２．５〜約４．５であることを特徴とする、請求項１０に記載の製造方法。
12. 前記水性溶液のｐＨが約２．５〜約３．５であることを特徴とする、請求項１０に記載の製造方法。
13. 前記水性溶液のｐＨが約２．８〜約３．２であることを特徴とする、請求項１０に記載の製造方法。
14. 前記変性ダイズタンパク質スラリーがｐＨ約２．５〜約４．５で加熱されることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
15. 前記変性ダイズタンパク質スラリーがｐＨ約２．８〜約３．５で加熱されることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
16. ダイズタンパク質を含み、４を超える等電点を有するダイズタンパク質含有組成物であって、沈殿ダイズタンパク質カードをマルチアニオン試薬で処理するステップを含んでなる処理ステップを含む方法によって調製されることを特徴とする、ダイズタンパク質含有組成物。
17. 前記ダイズタンパク質含有組成物が４．２を超える等電点を有することを特徴とする、請求項１６に記載のダイズタンパク質含有組成物。
18. 前記マルチアニオン試薬が、クエン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、およびそれらの組み合わせよりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１６に記載のダイズタンパク質含有組成物。
19. 請求項１６に記載のダイズタンパク質含有組成物であって、
    沈殿ダイズタンパク質カードをマルチアニオン試薬で処理するステップを含む処理ステップが、約０．１％（沈殿ダイズタンパク質カードの重量基準）〜約５％（沈殿ダイズタンパク質カードの重量基準）のマルチアニオン試薬を使用するステップを含むことを特徴とするダイズタンパク質含有組成物。
20. 請求項１６に記載のダイズタンパク質含有組成物であって、
    沈殿ダイズタンパク質カードをマルチアニオン試薬で処理するステップを含む処理ステップが、約０．５％（沈殿ダイズタンパク質カードの重量基準）〜約３％（沈殿ダイズタンパク質カードの重量基準）のマルチアニオン試薬を使用するステップを含むことを特徴とするダイズタンパク質含有組成物。
21. ダイズタンパク質および少なくとも約７０００ｐｐｍのリンを含み、４を超える等電点を有することを特徴とする、ダイズタンパク質含有組成物。
22. 前記等電点が４．２を超えることを特徴とする、請求項２１に記載のダイズタンパク質含有組成物。
23. 前記等電点が４．４を超えることを特徴とする、請求項２１に記載のダイズタンパク質含有組成物。

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