JP2008523094A5

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Publication number: JP2008523094A5
Application number: JP2007545671A
Authority: JP
Filing date: 2005-12-09
Publication date: 2011-11-24
Anticipated expiration: 2025-12-09

Description

一実施形態において、本発明の核酸分子は、中枢神経系（ＣＮＳ）または末梢神経系（ＰＮＳ）に投与される。実験から、ニューロンによる核酸の有効なｉｎｖｉｖｏでの取り込みが証明された。神経細胞への核酸の局所投与の例として、ソマー（Ｓｏｍｍｅｒ）ら、１９９８、ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＮｕｃ．ＡｃｉｄＤｒｕｇＤｅｖ．，８，７５は、ｃ−ｆｏｓに対する１５塩基長のホスホロチオエートアンチセンス核酸分子を、脳へ
のマイクロインジェクションによりラットに投与する研究について述べている。テトラメチルローダミン−イソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）またはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識されたアンチセンス分子は、注入後３０分の間に専らニューロンによって取り込まれた。広範な細胞質染色および核染色がこれらの細胞において見られた。神経細胞への核酸の全身投与の例としては、エパ（Ｅｐａ）ら、２０００、ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＮｕｃ．ＡｃｉｄＤｒｕｇＤｅｖ．，１０，４６９は、神経系に分化したＰＣ１２細胞においてｐ７５ニューロトロピン受容体を標的とするためにβ−シクロデキストリン−アダマンタン−オリゴヌクレオチド複合体を使用した、マウスでのｉｎｖｉｖｏ研究について述べている。２週間にわたる腹腔内投与に続いて、ｐ７５ニューロトロピン受容体アンチセンスの顕著な取り込みが、後根神経節（ＤＲＧ）細胞において観察された。さらに、ｐ７５の際だった一貫したダウンレギュレーションが、ＤＲＧニューロンにおいて観察された。核酸の標的をニューロンに定めるためのさらなるアプローチが、ブローダス（Ｂｒｏａｄｄｕｓ）ら、１９９８、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．，８８（４），７３４；カーレ（Ｋａｒｌｅ）ら、１９９７、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍｏｃｏｌ．，３４０（２／３），１５３；バナイ（Ｂａｎｎａｉ）ら、１９９８、ＢｒａｉｎＲｅｓｅａｒｃｈ，７８４（１，２），３０４；ラジャクマー（Ｒａｊａｋｕｍａｒ）ら、１９９７、Ｓｙｎａｐｓｅ，２６（３），１９９；ウー‐ポン（Ｗｕ−ｐｏｎｇ）ら、１９９９、ＢｉｏＰｈａｒｍ，１２（１），３２；バナイ（Ｂａｎｎａｉ）ら、１９９８、ＢｒａｉｎＲｅｓ．Ｐｒｏｔｏｃ，３（１），８３；シマトフ（Ｓｉｍａｎｔｏｖ）ら、１９９６、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，７４（１），３９に記載されている。したがって、本発明の核酸分子は、ＣＮＳおよび／またはＰＮＳにおいて細胞に送達され取り込まれやすい。

ＩＦＮ−α誘導性ＲＮＡ配列の同定
グアノシンおよびウリジンに富む一本鎖ＲＮＡがＰＤＣにおけるＩＦＮ−αを誘導することが報告されている。グアノシンおよびウリジンモノマーの混合物もまた、免疫刺激活性を示した。したがって、我々の研究におけるｓｉＲＮＡのグアノシンおよびウリジン含量の違いが、ｓｉＲＮＡのＰＤＣにおけるＩＦＮ−α誘導能力の差をもたらしているのではないかとの仮説をたてた。ｓｉＲＮＡは二本鎖であるので、１９塩基長のｓｉＲＮＡ中のグアノシンおよびウリジンの総含量は、常に１９である。調べたｓｉＲＮＡ内のウリジンの数は、９から１１の範囲であり、ウリジンの数とＩＦＮ−α誘導活性との間には何ら相関関係は無かった（表１を参照）。免疫活性ｓｉＲＮＡは、様々なグアノシンおよびウリジン含量の特異的一本鎖（センスまたはアンチセンス）を含みうる。しかしながら、グアノシンとウリジンの合計数は、活性ｓｉＲＮＡ（ＴＬＲ９．２およびＴＬＲ９．３）の一本鎖において、またより低い活性を有するｓｉＲＮＡ（ＴＬＲ９．１，ＴＬＲ９．４，ＴＬＲ２．１，ＴＬＲ４．１，ＴＬＲ４．２，ＴＬＲ３．１，ＴＬＲ３．２）の一本鎖においても、７〜１２の範囲であり、さらに、グアノシンに対するウリジンの比は、免疫学的活性とは関連がなかった（表１を参照）。したがって、単にグアノシンおよびウリジンの含量ではなく、特定の配列がＴＬＲ９．２およびＴＬＲ９．３の免疫学的活性に関与していると思われる。

ＴＬＲ９．２およびＴＬＲ９．３の配列は、１３塩基の重複を示している（表１を参照）。どちらのｓｉＲＮＡもＰＤＣにおけるＩＦＮ−αの強力な誘導剤であるので、ＩＦＮα誘導に関与する配列モチーフがこのＴＬＲ９．２とＴＬＲ９．３との重複領域に存在するとの仮説をたてた。このように、免疫刺激モチーフの局在化から、ＴＬＲ９．２のセンス鎖の３’末端にある１３塩基に着目した。この仮説は、ＦＩＴＣ分子を３’末端に連結し、５’末端には連結しない場合に、センス鎖の活性が低下したことから支持された（図３Ａ、５’Ｆを３’Ｆと比較のこと）。ポリ（Ａ）には免疫学的活性が欠如していることから（図３Ａ）、モチーフを絞り混むために、ＴＬＲ９．２のセンス鎖内の塩基をＡに置換することができた。ＴＬＲ９．２のセンス鎖の３’末端の１３塩基内に免疫刺激モチーフが局在することと矛盾することなく、３’末端の８塩基を置換すると（Ｒ８Ａ，Ｒは右を表す）、センス鎖の免疫学的活性が無効となり、５’末端の８塩基を置換しても（Ｌ８Ａ，Ｌは左を表す）センス鎖の免疫学的活性は無効とはならなかった（図３Ｂ）。５’末端からＡの数をさらに増加させることにより（Ｌ８ＡからＬ１２Ａ）、部位１１が３’末端のモチーフに必須であることが同定され、ＴＬＲ９．２センス鎖の３’末端の９塩基（５’ＧＵＣＣＵＵＣＡＡ３’，配列番号：１）がＴＬＲ９．２センス鎖の免疫刺激活性に関与していることが示唆される。この９塩基長配列における塩基の交換数を増加していくと、ＴＬＲ９．２センス鎖の免疫学的活性が徐々に低下し、９塩基長の配列のうちの６塩基を交換した場合に活性は完全に損失した（図３Ｂ；Ｒ８Ａ）。ＩＦＮα誘導に必要なＲＮＡの最小の長さは１９塩基の範囲内にあることが判ったが、これは、前記９塩基長の配列を含む１２塩基長および１６塩基長はいずれもはるかに低い活性しか示さなかったためである（図３Ｂ）。一方、１９塩基長のＲＮＡオリゴヌクレオチド中に９塩基長の配列を２度配置することにより（ＤＲとよぶ）、１つの免疫刺激性９塩基長の配列しか含まないＴＬＲ９．２のセンス鎖（ｎとよぶ、図３Ｂ）と比べて免疫学的活性はさらに増加する。

ｓｉＲＮＡおよびＴＬＲ９リガンド（ＣｐＧＤＮＡ）の認識に関して、ｓｉＲＮＡと微生物ＤＮＡのいずれも最初は二本鎖（ウィルスまたは細菌のＤＮＡゲノムは通常は二本鎖）であるにもかかわらず、免疫刺激配列モチーフの検出は一本鎖レベルにおいて行われるということは興味深い。これまで、ヘリカーゼ活性が認識プロセスの一部であるかどうかについての情報はなかった。ＲＮＡおよびＤＮＡのいずれに対しても、対応するタイプの免疫反応を誘起するために、適当な配列モチーフを含む合成一本鎖オリゴヌクレオチドを用いることができる。免疫刺激性ＲＮＡオリゴヌクレオチドの最短の長さは、約１９塩基であった。同様に、活性ＴＬＲ９リガンドになるためには、６量体ＣｐＧモチーフは、より長いオリゴヌクレオチドの一部でなければならない（ハートマン、ジー（Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｇ．）ら、ＪＩｍｍｕｎｏｌ２０００，１６４：９４４〜５３）。ポリＡＲＮＡは免疫学的活性を全く示さないので、９塩基長の刺激配列を含むＲＮＡオリゴヌクレオチドを、１９塩基長の長さにまで延長するためにポリＡの添加を利用することができた。１９塩基長のＲＮＡオリゴヌクレオチド中に２つの刺激性９塩基長の配列を挿入することによって、免疫刺激活性がさらに増大した。同様に、ポリ（Ｃ）ＤＮＡ（ホスホロチオエート修飾を有するものも有しないものも）は免疫刺激活性を欠如していることから、ポリ（Ｃ）は、以前の研究においてオリゴデスオキシヌクレオチドを含んだＣｐＧモチーフの延長のために用いられていた（ハートマン、ジー（Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｇ．）らＪ
Ｉｍｍｕｎｏｌ２０００，１６４：９４４〜５３）。

水疱性口内炎ウィルスやインフルエンザウィルスなどのある種の一本鎖ＲＮＡウィルスは、ＴＬＲ７を介して免疫細胞によって認識されることが報告されているが（ランド（Ｌｕｎｄ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ２００４，１０１：５５９８〜６０３；ハイル（Ｈｅｉｌ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２００４，３０３：１５２６〜９；ディーボルト（Ｄｉｅｂｏｌｄ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２００４，３０３：１５２６〜９）、ウィルスＲＮＡの認識に関与する特定の配列モチーフはこれまで同定されていない。その代わりに、ポリ（Ｕ）が活性であることが報告されており、ウィルスＲＮＡにおいてはＧＵが豊富な配列が免疫認識に関与し、さらにモノマーのＧおよびＵの混合物が免疫刺激性であることが提案されている。後者は、ＲＮＡ分解産物の関与している可能性を示すものである。本研究におけるＲＮＡ分子の免疫刺激活性がＧＵ含量によるものではないという証拠がいくつかある。最初に、当然のことながら、二本鎖ＲＮＡのＧおよびＵの総数は、二本鎖の長さと常に一致する（すなわち、１９塩基長の二本鎖のＧＵ数は、常に１９である）。第２に、ｓｉＲＮＡの２つの一本鎖の一方または他方において、ＧまたはＵの数、またはＧ対Ｕの比が大きくなっても、ｓｉＲＮＡの免疫学的活性には関係しなかった。第３に、免疫刺激性一本鎖ＲＮＡにおけるＧの数を増加すると、免疫学活性は強化されるよりもむしろ減少した。そして、第４に、本研究において記載する免疫刺激性ＲＮＡ配列を含むＲＮＡオリゴヌクレオチドと比べて、ポリ（Ｕ）は弱かった。

【図３】ＲＮＡ９．２センス鎖３’末端の９塩基の配列が、免疫刺激活性に関与して
いることを示す図。ＰＤＣを種々のＲＮＡオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。３６時間後、上清中のＩＦＮ−α産生を測定した。Ａ：ＴＬＲ９．２のセンス鎖（ＲＮＡ９．２ｓ、元の配列については「ｎ」で示す）およびＲＮＡ９．２ｓにフルオレセインタグを付加したもの（５’Ｆまたは３’Ｆ）でＰＤＣをトランスフェクトした。＊はｐ＜０．０５を示す。Ｂ：ＴＬＲ９．２のセンス鎖、１９塩基長のポリＡオリゴヌクレオチド、５’末端から数えて塩基番号８〜１２がアデノシンに置換された一連のＲＮＡ９．２ｓ（Ｌ８Ａ〜Ｌ１２Ａ）、３’末端から数えて９塩基対（推定モチーフ）以内にある１つ、２つ、３つまたは６つの塩基が（推定９塩基長のモチーフに混乱をきたすために）アデノシンまたはウリジンで置換された一連のＲＮＡ９．２ｓ誘導体、または２つのＲＮＡ９．２ｓ短縮物（いずれもＲＮＡ９．２ｓの３’末端の推定９塩基長のモチーフを含む１６塩基長または１２塩基長）ならびに配列内に推定９塩基長のモチーフを２回含む１９塩基長のＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＤＲ）でＰＤＣをトランスフェクトした。使用したすべての配列の詳細については表２に示す。４名の個別ドナーからの結果を平均値±ＳＥＭとして示す。

【図５Ａ】マウスｉｎｖｉｖｏにおけるｓｉＲＮＡによる全身免疫応答の配列依存
性誘導を示す図。Ａ：マウス骨髄培養物（１２９Ｓｖ）を、ｓｉＲＮＡＴＬＲ９．２の二本鎖、センス鎖もしくはアンチセンス鎖または１９塩基長のポリ（Ａ）オリゴヌクレオチドをポリカチオン性ペプチドと複合化したもので刺激した。ＯＤＮ１８２６（６μｇ
／ｍＬ）およびＲ８４８（１Ｈ−イミダゾ（４，５−ｃ）キノリン−１−エタノール（エトキシメチル）−α；０．５μｇ／ｍＬ）を陽性対照とした。３６時間後、上清を回収し、ＩＦＮ−α産生をＥＬＩＳＡによって評価した。データは、マウス３個体の骨髄培養物をプールしたものの３連実験の平均値±ＳＥＭとして示す。

【図６Ａ】ｓｉＲＮＡ認識にはＴＬＲ７が必要であることを示す図。Ａ：野生型（
黒色バー）またはＴＬＲ７−／−（白抜きバー）のＣ５７ＢＬ／６マウスからの骨髄培養物を、ｓｉＲＮＡＴＬＲ９．２とともに、ＴＬＲ９．２のセンス鎖またはアンチセンス鎖とともに、またはポリカチオン性ペプチドと複合化した１９塩基長のポリ（Ａ）オリゴヌクレオチドとともにインキュベートした。ＣｐＧＯＤＮ１８２６（ＴＬＲ９）およびロキソリビン（ＴＬＲ７）をそれぞれ６μｇ／ｍＬまたは０．５μｇ／ｍＬの濃度で使用した。刺激から３６時間後、上清を回収し、ＩＦＮ−α産生をＥＬＩＳＡによって評定した。データは、２個体のマウスからプールした骨髄培養物の３連実験の平均値±ＳＥＭとして示す。

Claims

哺乳類における免疫応答を刺激する医薬組成物であって、
前記哺乳類に、配列番号：１を含むか、または配列番号：１の配列から１以下または２以下のヌクレオチドだけが異なる配列を含むオリゴヌクレオチド剤であって、１２以上の長さを有するオリゴヌクレオチド剤
を含む医薬組成物。
哺乳類において遺伝子の発現の阻害と、免疫応答の誘導とを同時に行う医薬組成物であって、前記哺乳類に、配列番号：１を含むか、または配列番号：１の配列から１以下または２以下のヌクレオチドだけが異なる配列を含むヌクレオチド剤であって、１２以上の長さを有するオリゴヌクレオチド剤
を含む医薬組成物。
オリゴヌクレオチド剤は、配列番号：１を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の医薬組成物。
前記配列は、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、および配列番号：６からなる群より選択される請求項１または２に記載の医薬組成物。
前記オリゴヌクレオチドは、ｉＲＮＡ剤である請求項１または２に記載の医薬組成物。
前記免疫応答は哺乳動物におけるＩＦＮ−α発現の測定により決定される請求項１または２に記載の医薬組成物。
前記オリゴヌクレオチド剤は１９以上の長さを有する請求項１または２に記載の医薬組成物。
前記オリゴヌクレオチド剤はセンス鎖とアンチセンス鎖からなるｓｉＲＮＡであり、前記アンチセンス鎖は１９、２０、２１、または２３ヌクレオチド以上の長さの配列を有する請求項１または２に記載の医薬組成物。
前記センス鎖は配列番号２０または配列番号２２の１９、２０、２１、または２３ヌクレオチド以上の連続するヌクレオチドの配列を有する請求項８に記載の医薬組成物。
前記センス鎖は配列番号２０または配列番号２２の配列からなる請求項８に記載の医薬組成物。
前記センス鎖は配列番号：１を含むか、または配列番号：１の配列から１以下または２以下のヌクレオチドだけが異なる配列を含む請求項８に記載の医薬組成物。
前記オリゴヌクレオチド剤は一本鎖ＲＮＡである請求項１または２に記載の方法。
前記オリゴヌクレオチド剤はハイブリッドオリゴヌクレオチドである請求項１または２に記載の医薬組成物。
前記組成物は、がん、自己免疫疾患、ぜんそく、呼吸器系アレルギー、食品アレルギー、細菌感染、寄生虫感染、またはウィルス感染の治療に用いられ、前記哺乳動物は該治療を必要とする請求項１または２に記載の医薬組成物。
前記オリゴヌクレオチド剤の５’末端以外の位置で抗原が連結されている請求項１または２に記載の医薬組成物。
非ヌクレオチドリンカーにより、前記オリゴヌクレオチドに抗原が連結されている請求項１または２に記載の医薬組成物。
前記オリゴヌクレオチド剤の３’末端以外の位置で抗原が連結されている請求項１６に記載の医薬組成物。
前記オリゴヌクレオチドの免疫認識がＴｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）を必要とする請求項１または２に記載の医薬組成物。
前記オリゴヌクレオチドは配列番号：１の２つの繰り返しを有する請求項１または２に記載の医薬組成物。
前記オリゴヌクレオチドは配列番号３８からなる請求項１９に記載の医薬組成物。
前記オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの２’−フルオロ修飾ヌクレオチドをさらに含み、該２’−フルオロ修飾ヌクレオチドは、配列番号：１からの４以上の連続したヌクレオチドを含む配列の一部ではない請求項１に記載の医薬組成物。
ｓｉＲＮＡのサイレンシング活性を無効にしながら免疫刺激活性が維持される請求項８に記載の医薬組成物。
配列番号：１、または配列番号：１の配列から１以下または２以下のヌクレオチドだけが異なる配列からなるオリゴヌクレオチド。
少なくとも１つの２’−フルオロ修飾ヌクレオチドをさらに含み、該２’−フルオロ修飾ヌクレオチドは、配列番号：１からの４以上の連続したヌクレオチドを含む配列の一部ではない請求項２３に記載のオリゴヌクレオチド。
配列番号３８からなるオリゴヌクレオチド。
非ヒト哺乳類における免疫応答を刺激する方法であって、
前記非ヒト哺乳類に、配列番号：１を含むか、または配列番号：１の配列から１以下または２以下のヌクレオチドだけが異なる配列を含むオリゴヌクレオチド剤であって、１２以上の長さを有するオリゴヌクレオチド剤を投与する工程を含む方法。
哺乳類細胞におけるインビトロでの免疫応答を刺激する方法であって、
前記細胞に、配列番号：１を含むか、または配列番号：１の配列から１以下または２以下のヌクレオチドだけが異なる配列を含むオリゴヌクレオチド剤であって、１２以上の長さを有するオリゴヌクレオチド剤を投与する工程を含む方法。
哺乳類において免疫応答の刺激を回避するためのオリゴヌクレオチド剤の製造方法であって、潜在薬剤プールから、配列番号：１を含むか、または配列番号：１の配列から１以下または２以下のヌクレオチドだけが異なる配列を含むオリゴヌクレオチド剤であって、１２以上の長さを有するオリゴヌクレオチド剤を含む任意の剤を除去する工程を含む方法。
哺乳類における免疫応答の刺激を回避するためのオリゴヌクレオチド剤の製造方法であって、
配列番号：１を含むか、または配列番号：１の配列から１以下または２以下のヌクレオチドだけが異なる配列を含むオリゴヌクレオチド剤であって、１２以上の長さを有するオリゴヌクレオチド剤を、該オリゴヌクレオチド剤が少なくとも２つ、または少なくとも４つの２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含むように提供することを含む方法。
少なくとも１つの２’−フルオロ修飾ヌクレオチドをさらに含み、該２’−フルオロ修飾ヌクレオチドは、配列番号：１からの４以上の連続したヌクレオチドを含む配列の一部ではない請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の方法。