JP2008521388A - メチル化dnaを検出する方法、及びキット - Google Patents
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Abstract
Description
私たちのゲノムを「つづる」4つの塩基−アデニン、グアニン、シトシン、及びチミンは別として、複製後のDNAの一時的変異により産生される5番目の塩基もある。DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)は、メチル供与体S−アデノシルメチオニンからシトシン環へのメチル基の移転を触媒し得る、そしてその結果、5−メチルシトシン塩基を形成する。特定のシトシン残基が哺乳類において修飾され、それは、DNA配列のグアノシン残基の前にある(CpGジヌクレオチド)(Singal,Blood93(1999),4059-4070);Robertson,Nat.Rev.Genet.1(2000),11−19;Ng,Curr.Opin.Genet.Dev.(2000),158−163;Razin,EMBO J.17(1998),4905−4908)。当該CpGジヌクレオチドのメチル化は、一般的に、安定した転写抑制と関連し、おそらく、非コードゲノムの大部分、及びトランスポゾン、繰り返し体、ウイルス性挿入部分の如き潜在的に有害な配列は転写されないといった事実を導く。CpGジヌクレオチドが、ゲノム中において、非常に遍在していることは興味深い(Singal(1999),loc.cit,Robertson(2000),loc.cit.,Ng(2000),loc.cit.,Razin(1998),loc.cit.)。
DNAメチル化パターンが胚形成の過程中でどのように確立されるのか、及びCpGメチル化がどのようにゲノム中に維持され、調節されるのかは、一部しかわかっていない(Singal(1999),loc.cit,Ng(2000),loc.cit.,Razin(1998),loc.cit.)。哺乳類において、DNAメチル化過程を触媒する既知の3つのDNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT1、3a、及び3b)がある。各DNMTがCpGメチル化の維持、及び調節に寄与する対応分担は、明らかとされなければならないが、いまだ明らかではない。しかし、全3つの酵素は、明らかに胚形に必要不可欠であり、対応するノックアウトマウスは、生まれる前に、又は生後間もなく死に至る(Bestor,Hum.MoI.Genet.9(2000),2395−2402;El Osta,Bioessays 25(2003),1071−1084)。その間、DNAメチル化、クロマチン構造の一時的変異と、特定のヒストン一時的変異との関連は、数回見られる。DNAのメチル化は、ヒストン脱アセチル化、及びヒストンH3でのリジン9残基のメチル化と大部分関係がある(Sims,Trends Genet.19(2003),629−639,Fahrner,Cancer Res.62(2002),7213−7218)。従って、DNMTは、ヒストンアセチラーゼ(HDAC)又はコリプレッサー複合体と関連する。メチル基がどのようにCpG残基から除かれるのかもほとんどわかっていない。増殖細胞において、DNAメチル化は、おそらく複製の間にも受動的に生じ得るだろう。しかしながら、活性のある未知のデメチラーゼの存在により説明され得る有糸分裂細胞におけるDNA脱メチル化の例もある(Wolffe,Proc.Natl.Acad.Sd.96(1999),5894−5896)。
プロモーターのメチル化(しかし、非調節配列のものではない)は、安定、転写抑制と相互に関連する(Singal(1999),loc.cit.,Ng(2000),loc.cit.,Razin(1998),loc.cit.)。5−メチルシトシンの抑制特性は、2つの機構により影響され得る。第1に、DNAメチル化は、転写因子の結合を直接的に損なわせ得るというもの。第2に、抑制の最大部分に関与しそうな可能性は、メチル−CpG−結合タンパク質(MBP)の増大であるというものである(Ballestar,Eur.J.Biochem.268(2001),1−6)。MECP2又はMBD2(MeCP1複合体の構成要素)の如きMBPは、コリプレッサー複合体、及び抑制作用を有するHDACを伴い、そして転写因子に利用できない高密度クロマチン構造(ヘテロクロマチン)の形成に関与する(Ballestar(2001),loc.cit)。
腫瘍の形成が、遺伝子病変(例えば、突然変異又は転座)だけでなく、後成的変化によっても支持されることが明らかとなっている。異常なクロマチン構造又はDNAメチル化は、腫瘍遺伝子又は腫瘍抑制遺伝子の転写状態に影響を与え得、及び腫瘍の成長を促進し得る。当該DNAメチル化における変化は、正常なメチル化配列におけるメチル化の損失(低メチル化)、あるいは正常な非メチル化配列におけるメチル化(高メチル化)のいずれかを含む(Roberston(2000),Ioc.cit.,Herman,N.Engl.J.Med.349(2003),2042−2054;Momparler,Oncogene22(2003),6479−6483;Esteller,Science297(2002),1807−1808;Plass,Hum.Mol.Genet11(2002),2479− 488)。
広範囲のDNA低メチル化は、ほぼ全ての種類の腫瘍について記載される。腫瘍組織において、5−メチルシトシン含有量は、反復サテライト配列又は染色体のセントロメア領域に見られる脱メチル化事象の大部分を有する正常な組織と比較して、低減される。しかしながら、個々の場合、bcl-2又はc-mycの如き原がん遺伝子の脱メチル化、及び活性化もまた記載される(Costello,J.Med.Genet.38(2001),285−303)。
CpGアイランドは、通常、遺伝子調節機能に影響を及ぼす。これは、メチル化状態における変化が、関連する遺伝子座の転写活性における変化と主に直接的に関与することによる(Robertson(1999);Herman(2003);Esteller(2002);Momparler(2003);Plass(2002),all Ioc.cit。)。大抵のCpGアイランドは、正常細胞における非メチル化形態中に存在する。しかしながら、ある態様において、CpGアイランドは、遺伝子調節事象においてもメチル化され得る。例えば雌性細胞の非活性化X染色体のCpGアイランドの大部分は、メチル化される(Goto,Microbiol.Mol.Biol.Rev.62(1998),362−378)。CpGアイランドは、正常な老化作用の過程においてもメチル化され得る(Issa,Clin.Immunol.109(2003),103−108).
がん(例えば突然変異)の遺伝的原因は不可逆的なものであるが、腫瘍形成に対する役割に寄与する後成的変化は可逆的となり得る。それ故、後成的変化の可能な処置は、新組織形成の治療のための新たな可能性を提示する(Herman(2003);Momparler(2003);Plass(2002),allloc.cit.;Leone,Clin.Immunol.109(2003),89−102;Claus,Oncogene 22 (2003), 6489−6496)。
ゲノムのCpGメチル化分析のための検出方法の開発は、CpGメチル化パターンにおける変化ががんの如き疾患に関連し得ることが見出される事実に起因する重要性を主に有している。現在のところ、主に、既知の遺伝子座のCpGメチル化の検出のために使用されることが知られている技術がある(Dahl,Biogerontology4(2003),233−250)。ゲノムを通じてCpGメチル化の分析を可能とする方法は、ほとんど確立されていない。以下に、適用の主要分野と共にCpGメチル化の分析のための最も一般的な方法を要約する。
特異的CpGジヌクレオチドのメチル化状態が、5−メチルシトシンに対する異なる感受性により特徴づけられる細菌の制限エンドヌクレアーゼのイソシゾマーを使用して、検出され得る。それらの例は、双方ともCCGG配列を切断する酵素HpaII、及びMspIであって、しかしながら、HpaIIは、内部シトシンがメチル化されない場合に限られる。いくつかのアッセイは、メチル化感受性制限酵素の使用に基づき、上記アッセイは、個々の遺伝子の分析、及び当該ゲノムを通じたCpGメチル化の分析の双方のために使用され得る。メチル化感受性制限消化の断片は、サザンブロット又は制限部位の側面に接する領域のゲノムPCRにより、主に検出される(Dahl(2003),loc.cit.)。現在までに刊行されている、ゲノムを通じたCpGメチル化の全分析法は、当該方法の構成成分として、メチル化感受性制限酵素を使用する。制限ランドマークゲノムスキャニング法(Restriction Landmark genomic Scanning、RLGS)(Costello,Methods27(2002),144−149)は、例えば、全次元が異なるメチル化感受性制限酵素で消化され2つのDNA母集団のCpGメチル化における相違を特定する、一種の2次元アガロースゲル電気泳動を使用する。メチル化CpGアイランド増幅法(Methylated CpG Island Amplification、MCA)は、メチル化SmaI制限部位を有する断片を充実させ、そして当該断片を増やすためにLM−PCRを使用する。かかる増幅産生物は、表示差異分析(Representational Difference Analyzis、RDA)(Smith,Genome Res.13(2003),558−569)又はCpGアイランドマイクロアレイ(Yan,Cancer Res.6(2001),8375−8380)を用いて、すでに成功裏に分析されている。
硫酸水素ナトリウムでの二本鎖ゲノムDNAの処理は、非メチル化シトシン残基の脱アミノ化を導きウラシル残基とし、及びもはや相補的ではない2つの一本鎖の形成を導く。この処理の間、5−メチルシトシンが維持される。このようにして形成された配列間の相違は、メチル化DNAと非メチル化DNAとの相違の根拠を作り出す(Frommer,Proc.Natl.Acad.Sci.889(1992),1827−1831)。亜硫酸水素塩で処理されたDNAは、ウラシル残基(以前は非メチル化シトシンであったもの)とチミジン残基がチミジンとして増幅され、5−メチルシトシン残基のみがシトシン残基として増幅されるPCRにおいて直接的に使用され得る。増幅に依存して、PDRに使用されるプライマーは、メチル化配列と非メチル化配列とを区別し、又はメチル化状態とは無関係に、断片を増幅する。例えば、非特徴的なプライマーを使用して増幅されるPCR断片は、直接的にシークエンスされ、メチル化、及び非メチル化CpGの占有率を決定し得る。
変性された一本鎖DNA内のCpGメチル化を認識する5-メチルシトシンに対する抗体は、主に個々の固定細胞の染色体上のCpGメチル化の免疫組織化学的染色のために使用される。
(a)メチル化DNAに結合することができるポリペプチドで、容器をコーティングし;
(b)前記ポリペプチドを、メチル化DNA、及び/又は非メチル化DNAを含むサンプルと接触させ;そして
(c)前記ポリペプチドのメチル化DNAへの結合を検出する、
を含む、メチル化DNAの生体外検出方法に関する。
(a)メチル−DNA結合タンパク質(MBD)ファミリーに属するポリペプチド;
(b)メチル化DNAに結合することができる、前記(a)のポリペプチドの断片;
(c)前記(a)のポリペプチド又は前記(b)の断片と比較して1又は複数のアミノ酸残基が置換され、かつ、メチル化DNAに結合することができる前記(a)のポリペプチド又は前記(b)の断片の変異体;
(d)抗メチル化DNA抗体又はそれらの断片であるポリペプチド;及び
(e)(a)〜(c)のいずれか1つのポリペプチドと少なくとも70%一致し、かつ、メチル化DNAに結合することができるポリペプチド、
からなる群より選択される。
(a)配列番号1(図7)に示されるヌクレオチド配列を有する核酸配列;
(b)配列番号2(図7)に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸配列;
(c)配列番号2(図7)に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの断片をコードするヌクレオチド配列を有する核酸配列であって、ここで当該断片が前記ポリペプチドの少なくとも130〜361のアミノ酸を含み、かつメチル化DNAに結合することができる、前記核酸配列;
(d)前記(a)〜(c)のいずれか1つのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの変異体をコードするヌクレオチド配列を有する核酸配列であって、前記変異体の1又は複数のアミノ酸残基が前記ポリペプチドと比較して置換され、かつ前記変異体がメチル化DNAに結合することができる、前記核酸配列;
(e)前記(a)〜(d)のいずれか1つの核酸とハイブリダイズし、かつ(a)の核酸分子のヌクレオチド配列と少なくとも65%一致し、メチル化DNAに結合することができるポリペプチドをコードする、前記核酸配列;
(f)前記(b)の核酸分子によりコードされるポリペプチドと少なくとも65%一致し、かつメチル化DNAに結合することができる、ポリペプチドをコードする核酸分子;及び
(g)前記(a)〜(f)のいずれか1つのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に変性されるヌクレオチド配列を有する核酸配列、
あるいは、かかるポリヌクレオチドの相補鎖からなる群より選択される、本発明のヌクレオチド配列を含む核酸配列によりコードされる。
(a)本明細書中に記載されるようなメチル化DNAに結合することができるポリペプチド;
(b)前記ポリペプチドでコートされ得る容器;並びに
(c)前記容器をコートする手段;及び
(d)メチル化DNAを検出する手段、
を含む、本発明の方法によりメチル化DNAを検出するキットに関する。
この方法は、ELISAに似たアプローチを使用する。CpGメチル化DNAに対する高親和性を有するタンパク質を、PCRサイクラー互換性反応容器の壁上にコートし、ゲノムDNA混合物からの強力にメチル化されたDNA断片を選択的に捕捉するために使用する。特定のDNA断片(例えば、CpGアイランドプロモーター又は特定の遺伝子)の保持を、PCR(標準的PCRかリアルタイムPCRのいずれか、シングルかマルチプレックスのいずれか)を使用して、同一のチューブ内において検出し得る。メチル化の程度は、ゲノム入力DNAのPCR反応に関連して見積もられ得る。図1は、MB−PCRの略図を示す。
細胞
末梢血単核球(MNC)を、健常なドナーの白血球搬出法により分離し、その後Ficoll/Hypaqueにかかる濃度勾配遠心により分離した。Krause,J.Leukoc.Biol.60(1996),540−545に記載されるようにJ6ME遠心分離器(Beckman,Munchen,Germany)における逆流遠心洗浄により、単球をMNCから単離した。ショウジョウバエS2細胞をATTCから入手し、そして、10%ウシ胎仔血清(FCS;PAA)を含むInsect−Xpress培地(BioWhittaker)において、インキュベーター内、21℃で培養した。ヒト骨髄性白血病細胞系THP−1、NB−4、KG−1、K562、HL−60、及びU937を、10%で補充されたRPMI1640培地内で培養した。ヒト骨髄性白血病細胞系MonoMac6を、10%FCS、及び1%OPI培地補助栄養物(Sigma)を補充したRPMI1640培地内で培養した。ヒト骨髄性白血病細胞系MUTZ−3を、20%FCS、及び10ng/mlの幹細胞因子を追加したαMEM内で維持した。DNA脱メチル反応のために、U937細胞を、指示された量のデシタビン(2−デオキシ−5’−アザシチジン、Sigma)で、数日間処理した。
新たに診断される及び非処理のデノボ又は二次的AMLを有する35人の患者からの新鮮な末梢血サンプル、及び骨髄を、試験のために使用した。全患者を、German AML Cooperative GroupのAMLCG−2000プロトコルに従い処理した。当該試験は、Institutional Ethics Committeeにより承認され、当該試験に入る前に、各患者から書面によるインフォームドコンセントを得た。
本明細書中に記載される細胞系(例えば、KG1、U937、及びTHP−1)、正常なヒト単球(健常なドナー)、及びAMLを有する患者からの凍結芽細胞を含む、様々な細胞起源からのゲノムDNAを、血液及び細胞培養Midiキット(Qiagen)を使用して調整した。ゲノムDNA調整の質を、アガロースゲル電気泳動により制御し、DNA濃度をUV光度分析法により測定した。ゲノムDNAをMseI(NEB)で消化し、そしてPicoGreen dsDNA定量試薬(Molecular Probes)を使用して最終的に定量した。示されたDNAを、SssIメチラーゼ(NEB)を使用して生体外でメチル化した。
ヒトMBD2のメチル−CpG結合ドメイン(MBD)に対応するcDNA(Genbank acc.no.NM 003927;AA 144−230)を、MBD2−Nhe S(5’−AGATGCTAGCACGGAGAGCGGGAAGAGG−3’)(SEQ ID NO:4)と、MBD2−Not AS(5’−ATCACGCGGCCGCCAGAGGATCGTTTCGCAGTCTC−3’)(SEQ ID NO:5)のプライマー、及びHerculase DNAポリメラーゼ(Stratagene)を使用して、逆転写されたヒト初代マクロファージ総RNAからPCR増幅した。サイクルパラメータを、以下の:95℃、3分間の変性;95℃で20秒間、65℃で20秒間、72℃で80秒間の増幅を34サイクル;72℃、5分間の最終伸長、とした。当該PCR産物を沈殿させ、NotI/NheIで消化し、Signal plgプラスベクター(Ingenius,R&D Systems)のNotI/NheI部位にクローンし、得られたplg/MBD2-Fc(真核性発現ベクター)を配列検証した。ショウジョウバエS2細胞内の組み換え発現のためにpMTBip/MBD2-Fcをクローンするため、ヒトIgG1のFcテイルと融合されたヒトMBD2のMBDを含むplg/MBD2-FcのApaI/NheI断片を、pMTBiP/V5−HisB(Invitrogen)のApaI/SpeI部位にサブクローンした。
ヒト メチル−CpG結合ドメイン2(MBD2)のメチル−CpG結合ドメイン(MBD)を含む組み換えMBD2−Fcタンパク質の50μl、フレキシブルリンカーポリペプチド、及びヒトIgG1のFc部分(10mMのTris/Hcl pH7.5で希釈されたもの)を、熱安定性TopYield(登録商標)ストリップ(Nunc Cat.No.248909)の各ウェルに添加し、4℃で一晩インキュベートした。ウェルを、200μlのTBS(170mMのNaClを含む20mMのTris、pH7.4)で3回洗浄し、そして100μlのブロッキング溶液{170mMのNaClを含む10mMのTris pH7.5、5%スキムミルク粉末、5mMのEDTA、及び1μg/mlの各ポリd(l/C)、ポリd(A/T)、及びポリd(CG)、全てAmershamからのもの}で、3〜4時間、室温で、ブロッキングした。チューブを200μlのTBST(0.05%のTween−20を含むTBS)で3回洗浄した。
50μlの結合緩衝液(400nmのNaClを含むpH7.5、20mMのTris、2mMのMgCl2、0.5mMのEDTA、及び0.05%のTween−20)を、各ウェルに添加し、そして2μlのMseIで消化されたDNA(5ng/μl)を各第2ウェル(M反応)に添加した。ウェルを、室温で40〜50分間、振とう器上にインキュベートした。チューブを200μlの結合緩衝液で2回洗浄し、そして10mMのpH8.0、Tris/Hclで1回洗浄した。
PCRを、処理され洗浄されたTopYield(登録商標)ストリップ内で直接的に実施した。PCRミックス{PCR Master Mix(Promega):50μl反応/ウェル}は、10pmolの各遺伝子特異的プライマー(Metabionにより合成されたもの)を含んだ。プライマー配列は、P15S(5'−GGCTCAGCTTCATTACCCTCC−3’)(配列番号6)、P15AS(5'−AAAGCCCGGAGCTAACGAC−3’)(配列番号7)、ESR1S(5'−GACTGCACTTGCTCCCGTC−3’)(配列番号8)、ESR1AS(5’−AAGAGCACAGCCCGAGGTTAG−3’)(配列番号9)、ICSBP S(5’−CGGAATTCCTGGGAAAGCC−3’)(配列番号10)、ICSBP AS(5’−TTCCGAGAAATCACTTTCCCG−3’)(配列番号11)、MET S(5’−AATTGCGTCTGAAGTCTGCGG−3’)(配列番号12)、MET AS(5’−TCCCACACAACAGAGAGGCG−3’)(配列番号13)、DP103 S(5’−GCTGTTAGTCCAGTTCCAGGTTCC−3’)(配列番号14)、DP103 AS(5’−GTGCAACCACATTTATCTCCGG−3’)(配列番号15)だった。
亜硫酸水素ナトリウムでのDNAの修飾を、前述のように実施した。亜硫酸水素塩で処理されたDNAをnestedPCR反応において増幅した。使用したプライマーは、第1に、icsbp−out S(5’−GGGGTAGTTAGTTTTTGGTTG−’)(配列番号16)及びicsbp−out AS(5’−ATAAATAATTCCACCCCCAC−3’)(配列番号17)、そして増幅の第2ラウンドのために、icsbp−in S(5’−TTGTGGATTTTGATTAATGGG−3’)(配列番号18)及びicsbp−in AS(5’−CCRCCCACTATACCTACCTACC−3’)(配列番号19)。PCR産物を、TOPO−TAクローニングキット(Invitrogen)を使用してクローンし、そしていくつかの独立したクローンをシークエンスした。
総RNAを、グアニジン チオシアネート/酸 フェノール法により異なる細胞系から単離した{Chomczynski,Anal.Biochem.162(1987),156−159}。RNA(2μg)を、Superscript II MMLV−RT(Invitrogen)を使用して逆転写した。リアルタイムPCRをLightcycler(Roche)上で、Quantitectキット(Quiagen)を使用して説明書に従い実施した。使用したプライマーは、以下の:ヒトICSBP:センス5’−CGTGGTGTGCAAAGGCAG−3’(配列番号20)、アンチセンス5’−CTGTTATAGAACTGCTGCAGCTCTC−3’(配列番号21);ヒトACTB(β−アクチン):センス5’−TGACGGGGTTCACCCACACTGTGCCCATCTA−3’(配列番号22)、アンチセンス5’−CTAGAAGCATTTGTGGTGGACGATGGAGGG−3’(配列番号23)だった。
いくつかの白血病細胞系を、ESR1、CDKN2B(p15INK4b)、及びICSBPのプロモーターのCpGアイランドメチル化状態について、MB−PCRにより分析した。ゲノムDNAをMseIで消化した。この酵素を選択した理由は、メチル化感受性であり、及びDNAを小断片に切断するが、CpGアイランドを比較的そのまま放置するからである。各遺伝子の第1イントロンに対する当該遺伝子特異的MseI断片の位置、並びにPCRに使用された遺伝子特異的プライマーの位置を、図2Aに示す。全断片を、推測上の近位プロモーター領域を含むよう選択した。制限されたDNAの総量10ngを、M反応のために使用し、同様に制限されたDNAの5ngをP反応に使用した。8つの異なる白血病細胞系からの典型的なMB−PCR実験の結果を、図2Bに示す。当該ESR1プロモーターは、全8つのサンプルのM反応において様々な程度まで増幅され、そしてそのことは、ヒト造血系腫瘍の86%における異常なメチル化を示す先行文献と一致する。CDKN2B(p15INK4b)プロモーターについてのP反応は、双方の対立遺伝子における突然変異又は欠失を提示する3つの細胞系(THP−1、NB−4、K562)について完全に失敗し、そのことは以前にも示されていた。2つの細胞系(KG−1及びMUTZ3)は、CDKN2B(p15INK4b)プロモーターについてのM反応においてポシティブを示し、一方3つの細胞系(U937、MonoMac6、HL−60)は、ネガティブだった。観察された結果は、これらの細胞系のいくつかにおけるESR1及びCDKN2B(p15INK4b)プロモーターの以前に刊行されたメチル化分析に従っていた。一部の例では、P反応が他の細胞系と比較して弱く、1つの対立遺伝子(例えば、U937細胞中のESR1)の欠失又は突然変異を示した。ICSBPプロモーターは、6つの細胞系のM反応においても増幅させた。
他の態様において、白血病細胞において頻繁にメチル化されることが以前から示されている単一のCpGアイランドプロモーター、すなわち、ヒトCDKN2B遺伝子(p15INK4bとしても知られる。)、及びヒト エストロゲン受容体(ESR1)遺伝子のCpGメチル化の程度を分析することにより、当該MB−PCR方法を調査した。既に確立された腫瘍マーカーに加えて、腫瘍抑制遺伝子として潜在的に働くことが可能なCpGアイランドプロモーターを伴う3つの付加遺伝子を選択した。それらは、ヒト インターフェロン コンセンサス結合タンパク質(ICSBP)遺伝子、ヒトEts変異体3遺伝子(ETV3)、及びヒトDEADボックスポリペプチド20遺伝子(DDX20)である。ICSBP、インターフェロン(IFN)調整因子ファミリー(IRF)の転写因子は、ヒト骨髄性白血病において頻繁に下方制御され(Schmidt,Blood 91(1991),22−29)、及びICSBP欠損マウスは、ヒトにおける慢性骨髄性白血病(CML)と似た血液学的変化を示し(Holtschke,Cell 87(1996),307−317)、造血細胞におけるICSBPについての腫瘍抑制機能を示唆する。
他の実験において、MB−PCRが生体サンプルにおける上記遺伝子座のメチル化状態を検出可能かどうか試験し、いくつかの白血病細胞系を分析した。規定通りに、総量10ngの制限されたDNAをM反応のために使用し、そして、同様に制限されたゲノムDNAの5ngをP反応のために使用した。8つの異なる白血病細胞系からの典型的MB−PCR実験の結果を、図9Aに示す。ESR1プロモーターを、全8サンプルのM反応において様々な程度に増幅したところ、それは、ヒト造血系腫瘍の80%超において異常なメチル化を示すという従前の報告と一致した。両対立遺伝子において突然変異又は欠失を提示する3つの細胞系(THP−1、NB−4、K562)において、CDKN2BプロモーターについてのP反応は完全に失敗し、そしてその事は、NB−4(Chim,Ann.Hematol.82(2003),738−742)、及びK562(Paz,Cancer Res.63(2003),1114−1121)の場合において、従前に示されていた。2つの細胞系、KG−1及びMUTZ3は、CDKN2BについてのポジティブM反応を示した、一方3つの細胞系(U937、MonoMac6、HL−60)はネガティブだった。
DNAを、数人の健常者(n=4)の血中単球、及びこれまでに非処置のAMLを有する患者(n=35)の白血病性芽球から準備し、MseIで消化し、そしてMB−PCRに供した。図10は、典型的ICSBP MB−PCRを示し、対応するbisulfiteシークエンシングは、9人のAML患者及び1人の健常人の結果である。通常、M反応において観察されるバンドの強度は(対応するP反応と比較して)、サンプルにおけるメチル化の平均密度と非常によく一致する。試験した35人のAML患者のうち、7人の患者(20%)はICSBPについてのポジティブなMB−PCR結果を示し、ESR1については21人の患者(60%)、及びCDKN2Bについては25人の患者(71%)がポジティブなMB−PCR結果示した(データは示していない)。観察されたESR1及びCDKN2Bのメチル化の頻度は、以前の研究において記載されたものと同意である。ICSBPメチル化は、明らかに、患者の部分群に影響を与えるだけである。12人の患者を、ETV3及びDDX20遺伝子のメチル化について試験したところ、白血病細胞系において観察されたように、当該サンプルのいかなるサンプルにおいても著しいメチル化を検出しなかった。
Claims (14)
- 以下のステップ:
(a)メチル化DNAに結合することができるポリペプチドで、容器をコーティングし;
(b)前記ポリペプチドを、メチル化DNA、及び/又は非メチル化DNAを含むサンプルと接触させ;そして
(c)前記ポリペプチドのメチル化DNAへの結合を検出する、
を含む、メチル化DNAの生体外検出方法。 - 前記ステップ(c)が、制限酵素による消化、bisulfiteシークエンシング、ピロシークエンシング、サザンブロット又はPCRを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ステップ(c)が、PCRを含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 以下のステップ:
(d)前記メチル化DNAを分析する、
をさらに含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 - 前記分析メチル化DNAを分析するステップが、シークエンシングを含む、請求項4の方法。
- 前記ポリペプチドが、以下の:
(a)メチル−DNA結合タンパク質(MBD)ファミリーに属するポリペプチド;
(b)メチル化DNAに結合することができる、前記(a)のポリペプチドの断片;
(c)前記(a)のポリペプチド又は前記(b)の断片と比較して1又は複数のアミノ酸残基が置換され、かつ、メチル化DNAに結合することができる、前記(a)のポリペプチド又は前記(b)の断片の変異体;
(d)抗メチル化DNA抗体又はそれらの断片である、ポリペプチド;及び
(e)前記(a)から(c)のいずれか1つのポリペプチドと少なくとも70%一致し、かつメチル化DNAに結合することができる、ポリペプチド、
からなる群より選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。 - 前記ポリペプチドが、異種ポリペプチドと融合する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記異種ポリペプチドが、HA−タグ、myc6−タグ、FLAG−タグ、STREP−タグ、STREP II−タグ、TAP−タグ、HAT−タグ、キチン質結合ドメイン(CBD)、マルトース結合タンパク質、His6−タグ、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)タグ、インテイン−タグ、ストレプトアビジン結合タンパク質(SBP)タグ、及び抗体のFc部分からなる群より選択される、請求項7に記載の方法。
- 前記抗メチル化DNA抗体が、抗5−メチルシトシン抗体、あるいはそれらのFab、F(ab’)2、Fv又はscFv断片である、請求項6に記載の方法。
- 前記容器が、前記ポリペプチドで、直接的又は間接的にコートされる、請求項1に記載の方法。
- 前記サンプルが、患者からのものである、請求項1に記載の方法。
- 前記患者が、低、及び/又は高メチル化遺伝子座を有する疑いがある、請求項11に記載の方法。
- 前記低、及び/又は高メチル化遺伝子座が、がん、腫瘍又は転移を示す、請求項12に記載の方法。
- 以下の
(a)メチル化DNAに結合することができるポリペプチド;
(b)前記ポリペプチドでコートされ得る容器;並びに
(c)前記容器をコートする手段;及び
(d)メチル化DNAを検出する手段、
を含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法によりメチル化DNAを検出するキット。
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