JP2008520591A

JP2008520591A - Ｅｆｇシグナル伝達経路を混乱させる薬剤とクラステリンレベルを減少させるオリゴヌクレオチドとの併用による癌の治療

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Publication number: JP2008520591A
Application number: JP2007541607A
Authority: JP
Inventors: グリーブ、マーティン; ツィピ、ガブリエラ
Original assignee: ザユニバーシティーオブブリティッシュコロンビアユニバーシティー−インダストリーリエゾンオフィス
Priority date: 2004-11-23
Filing date: 2005-11-22
Publication date: 2008-06-19
Anticipated expiration: 2025-11-22
Also published as: CA2584646A1; PL1814595T3; DK1814595T3; AU2005309274A1; US20080014198A1; AU2005309274B2; US20110142827A1; ES2456017T3; CA2584646C; EP1814595B1; SI1814595T1; EP1814595A1; PT1814595E; EP1814595A4; WO2006056054A1; JP4980919B2

Abstract

ＥＧＦシグナル伝達経路を混乱させ、癌の治療に有用であることが知られている薬剤がまた、クラステリンタンパク質の発現の増大をもたらすことが発見された。クラステリンは、アポトーシスからの保護をもたらすことができるので、この副次的な作用は治療薬の有効性を低下させる。これは、ＥＧＦシグナル伝達経路の混乱による治療すべき癌に対する既知の治療有効性を有し、副次的な作用としてクラステリンの発現を刺激する薬剤と、癌細胞におけるクラステリンの量を減少させるのに有効であるオリゴヌクレオチドとの組合せを用いて克服される。例えば、薬剤は、ＨＥＲ−２に対して特異的な抗体、ＨＥＲ−２の小分子阻害薬、ＨＥＲ−２に対して特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド又はＨＥＲ−２タンパク質を妨害することができるペプチド薬剤であってよい。オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はＲＮＡｉオリゴヌクレオチドであってよい。

Description

本出願は、両方とも参照により本明細書に組み込まれる２００４年１１月２３日に出願された米国仮出願番号第６０／５２２，９４８号及び２００４年１１月２４日に出願された第６０／５２２，９６０号の優先権を主張する。

本出願は、１つがクラステリンの量を減少させるのに有効であり、癌細胞におけるテストステロン抑制前立腺メッセージ−２（ＴＲＰＭ−２）としても知られているオリゴヌクレオチドであり、もう１つがＥＧＦ細胞シグナル伝達経路を混乱させ、また標的に対するその作用の結果としてクラステリンの発現を刺激する薬剤である治療薬の組合せを用いて哺乳類対象における癌を治療する方法に関する。ＥＧＦ細胞シグナル伝達経路を混乱させる薬剤の例としては、ＨＥＲ−２を標的にする薬剤などが挙げられる。

肺癌に続いて、乳癌は女性における癌死の第２位の原因である。世界保健機構によれば、本年全世界で１２００万人以上が乳癌と診断され、米国癌協会は２００４年に米国の２０万人以上の女性が浸潤性乳癌（第Ｉ〜ＩＶ期）と診断され、２００４年に米国で約４万人の女性と約５００人の男性が乳癌より死亡すると推定している。

乳癌の発生率（１０万人の女性当たりの新たな乳癌の例数）は、１９８０年代に約４％増加したが、１９９０年代には１０万人の女性当たり１００．６例と横ばいになった。

標準的療法としては、手術、放射線、化学療法及びホルモン療法などがある。これらの療法のそれぞれが、乳房組織の喪失、放射線又は化学療法に関連する疾患、生殖及びホルモン副作用並びに信頼できない生存率などの欠点を有する。

このように、乳癌は、深刻な疾患であり、多くの場合に致命的で、死亡及び罹病を低減するために治療の改善を必要とする。

クラステリン又は「ＴＲＰＭ−２」は、多様な範囲の提案された活性を有する遍在性タンパク質である。前立腺上皮細胞において、クラステリンの発現は、去勢の直後に増加し、去勢の３〜４日後にラット前立腺細胞において最大レベルに達し、これは大量細胞死の開始と一致している。これらの結果は、一部の研究者らがクラステリンは細胞死のマーカーであり、アポトーシスのプロモーターであるという結論を下すことにつながった。他方で、セルトーリ細胞及びいくつかの上皮細胞は、細胞死のレベルの増加を伴うことなく、高レベルのクラステリンを発現する。Ｓｅｎｓｉｂａｒら（１９９５年）［１］は、前立腺細胞死におけるクラステリンの役割をより明確に解明するために実施されたｉｎｖｉｔｒｏ実験について報告した。著者らは、クラステリンをエンコードする遺伝子をトランスフェクトしたＬＮＣａＰ細胞を用い、このタンパク質の発現が、ＬＮＣａＰ細胞が非常に高い感受性を示す腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の影響を変化させるかどうかを観察した。トランスフェクトＬＮＣａＰ細胞のＴＮＦαによる処理は、クラステリンレベルの数時間にわたる一時的な増加をもたらしたが、これらのレベルは、ＤＮＡ断片化が細胞死に先行することが認められた時点までに低下した。

米国特許出願公開第２００３０１６６５９１号明細書は、前立腺癌及び腎細胞癌の治療のためのクラステリンの発現を減少させるアンチセンス療法の使用を開示している。

米国特許第６，３８３，８０８号明細書は、クラステリンの発現を調整するための組成物、特にオリゴヌクレオチド及び方法を開示している。

米国特許出願公開第２００４０９６８８２号明細書は、クラステリンを含む癌関連タンパク質を標的とするＲＮＡｉ治療プローブを開示している。

米国特許出願公開第２００４０５３８７４号明細書は、クラステリン発現のアンチセンスモジュレーションを開示している。

米国特許出願公開第２００３１６６５９１号明細書は、２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル修飾を有するオリゴヌクレオチドを用いたクラセリンアンチセンス療法を開示している。

米国特許出願公開第２００３１５８１３０号明細書は、アンチセンスクラストゲリンオリゴデオキシヌクレオチドによる癌の化学療法感作及び放射線感作の使用を開示している。

出願者らは、ＥＧＦシグナル伝達経路を混乱させ、癌の治療に有用であることが知られている薬剤がクラステリンタンパク質の発現の増大をもたらし得ることを発見した。クラステリンはアポトーシスからの保護をもたらすことができるので、この副次的な作用は治療薬の有効性を低下させる。これを克服するために、本発明は、癌の治療に有用である治療薬の組合せを提供する。該組合せは、（ｉ）治療する癌に対する既知の治療有効性を有し、副次的な作用としてＥＧＦシグナル伝達経路を混乱させ、クラステリンの発現を刺激する薬剤、及び（ｉｉ）癌細胞におけるクラステリンの量を減少させるのに有効であるオリゴヌクレオチドを含む。本発明のいくつかの実施形態において、癌に対する既知の治療有効性を有する薬剤は、ＥＧＦ細胞シグナル伝達経路を混乱させ、ＨＥＲ−２と相互作用する薬剤である。例えば、薬剤は、ＨＥＲ−２に対して特異的な抗体、ＨＥＲ−２の小分子阻害薬、ＨＥＲ−２に対して特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド又はＨＥＲ−２タンパク質を妨害することができるペプチド薬剤であってよい。オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はＲＮＡｉオリゴヌクレオチドであってよい。

本発明の組合せは、既知の治療薬と癌細胞におけるクラステリンの量を減少させるのに有効なオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含む、哺乳類対象における癌を治療する方法に有用である。

癌は、例えば、乳癌、骨肉腫、肺癌、膵臓癌、唾液腺癌、大腸癌、前立腺癌、子宮内膜癌及び膀胱癌であってよい。

本発明の他の態様及び特徴は、添付の図面とともに本発明の特定の実施形態の以下の説明を検討することにより、当業者には明らかになろう。

図面において、本発明の実施形態を例示する。

定義
本出願の明細書及び特許請求の範囲で用いられるように、「ＥＦＧ細胞シグナル伝達経路」という用語は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦｒ）ファミリーのメンバーへのリガンドの結合時に刺激される細胞経路を指す。ＥＧＦｒファミリーは、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３及びＨＥＲ−４を含む。ＥＧＦｒファミリーは、細胞増殖、生存、移動及び分化を調整する複雑なシグナル変換／伝達経路の開始時に存在する。

本出願の明細書及び特許請求の範囲で用いられるように、「ＥＦＧ細胞シグナル伝達経路を混乱させる薬剤」という句は、ＥＧＦ細胞シグナルを妨害することができる任意の薬剤を指し、ＥＧＦｒファミリーのメンバーのいずれかに対して特異的な抗体、ＥＧＦｒファミリーのいずれかのメンバーに対する正常な結合の小分子阻害薬、ＥＧＦｒファミリーのメンバーの発現を特異的に阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド又はＥＧＦｒファミリーのメンバーのシグナル伝達機能を妨害することができるペプチド薬剤などである。

本出願の明細書及び特許請求の範囲で用いられるように、「クラステリン」という用語は、最初に雄ヒツジ（ｒａｍｒｅｔｅ）精巣から得られた糖タンパク質を指し、また、クラステリンとして又は別名で呼ばれているかにかかわりなく、ヒトを含む他の哺乳類動物種由来の相同タンパク質を指す。多数のクラステリン種の配列が知られている。例えば、ヒトクラステリンの配列は、Ｗｏｎｇら（１９９４年）［２］により、またＮＣＢＩ配列アクセッション番号ＮＭ＿００１８３１として報告されており、配列番号１に示されている。この配列において、コーディング配列は塩基４８から１３９７までである。

本出願において用いられるように、「クラステリンの量」という用語は、抗アポトーシス保護をもたらすために機能し得る形態で存在するクラステリンの量を指す。クラステリンの有効量は、クラステリンの産生を制限する（転写又は翻訳レベルで）ことにより、或いは産生されるよりも速い速度でクラステリンを分解することにより、減少させることができる。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドが投与されなかった場合に、クラステリンが存在するような時に阻害が起こることは十分に理解されよう。

本明細書において用いられるように、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、通常化学的に修飾され、その配列（３’→５’）がｍＲＮＡの分子のセンス配列と相補的である、１本鎖ＤＮＡの伸長を指す。アンチセンス分子は、それによりＲＮＡ／ＤＮＡ二重らせんを形成することにより、遺伝子発現を効果的に阻害し、化学療法や放射線よりも多い、癌療法の標的選択肢を提供する。アンチセンスは、リボソームがメッセンジャーＲＮＡに沿って移動する能力を物理的に阻害し、ｍＲＮＡが細胞質ゾル中で分解する速度を速くすることなどの様々なメカニズムにより作用すると考えられている。アンチセンスオリゴヌクレオチドを指すのに、略語ＡＳＯを用いることもできる。

本出願の明細書及び特許請求の範囲で用いられるように、「組合せ」という用語は、同時又は同時期の投与による治療用の試薬の組合せを指す。同時投与は、ＥＧＦ細胞シグナル伝達経路を混乱させる薬剤とオリゴヌクレオチドの混合物（真の混合物、懸濁液、乳濁液又は他の物理的組合せにかかわりなく）の投与を指す。この場合、組合せは、投与の直前に組み合わせた薬剤とオリゴヌクレオチドの混合物又は別個の容器であってよい。同時期の投与は、同じ時点、又は薬剤若しくはオリゴヌクレオチド単独の活性に対する相乗的活性が認められる互いに十分に近い時点の薬剤とオリゴヌクレオチドの別個の投与を指す。これについては、組合せは、薬剤とオリゴヌクレオチドの別個の容器からなる。

ＥＧＦ細胞シグナル伝達経路を混乱させる薬剤
上記のように、１つの実施形態において、本発明はＥＧＦ細胞シグナル伝達経路を混乱させる薬剤を使用する。この薬剤は、ＥＧＦ細胞シグナルを妨害することができる任意の薬剤であってよく、ＥＧＦｒファミリーのメンバーのいずれかに対して特異的な抗体、ＥＧＦｒファミリーのいずれかのメンバーに対する正常な結合の小分子阻害薬、ＥＧＦｒファミリーのメンバーの発現を特異的に阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド又はＥＧＦｒファミリーのメンバーのシグナル伝達機能を妨害することができるペプチド薬剤などである。

本発明のいくつかの実施形態において、該薬剤は、ＨＥＲ−２との相互作用によりＥＧＦ細胞シグナル伝達経路を混乱させるものである。ＥＲＢＢ２又はヒト表皮成長因子受容体２としても知られているＨＥＲ−２は、細胞がどのように成長し、分裂し、それ自体を修復するかを調節することを助ける。１９８０年代から始まったＨＥＲ−２遺伝子及び癌におけるＨＥＲ−２タンパク質の役割について行われた広範な研究が存在した。ＨＥＲ−２遺伝子は、ＨＥＲ−２受容体と呼ばれる特殊なタンパク質の産生を導く。ＨＥＲ−２は、すべての乳癌の約３分の１において過剰発現し、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）の標的である。

ＨＥＲ−２受容体と相互作用し、ＥＧＦシグナル伝達経路を混乱させるのに用いることができる１つの種類の薬剤は、薬剤モノクローナル抗体である。該抗体は、ＨＥＲ−２受容体に対して特異的で、結合することができる。或いは、該抗体は、関連受容体に結合し、そのようにＨＥＲ−２経路に影響を及ぼすことができる。この抗体は、過剰発現が存在するときにＨＥＲ−２受容体を阻害し、それにより腫瘍の成長及び発達を阻害すると考えられているトラスツズマブであってよい。商標名Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）のもとに販売されているトラスツズマブは、乳癌を治療するために静脈内投与される組換えモノクローナル抗体である。トラスツズマブは、現在パクリタキセルと併用されており、腫瘍がＨＥＲ−２タンパク質を過剰発現する転移性乳癌を有する患者の治療に適用される。

ＨＥＲ−２細胞シグナル伝達経路を混乱させることができる他の薬剤は、ＨＥＲ−２発現を阻害することができるアンチセンス薬剤を含む。米国特許出願公開第２００３１０５０５１号明細書は、ＨＥＲ−２のレベルに関連する状態に対する核酸療法を開示しており、米国特許第５，９１０，５８３号及び第６，３６５，３４５号明細書は、ｃ−ｅｒｂＢ又はｅｒｂＢ２の発現が役割を果たす障害の予防及び治療のためのアンチセンス核酸を開示している。

下の実施例は、乳癌細胞におけるＨＥＲ−２に標的を定めるためにトラスツズマブを用いる場合にクラステリンの発現の増加が認められることを示している。特に、以前の研究で逆の効果、すなわち、例えば腎細胞におけるＥＧＦ経路の刺激がクラステリン発現の抑制をもたらすことが示されたことを考慮すると、ＥＧＦシグナル伝達経路へのこの知見の拡大は一般的に妥当である。

ＨＥＲ−２と相互作用し、ＥＧＦ細胞シグナル伝達を混乱させる薬剤として作用することができる小分子としては、例えば、公開特許文書米国特許第５，７２１，２３７号明細書、国際公開第０３０３５８４３号パンフレット及び欧州特許第１１３１３０４号明細書に開示されているものが挙げられる。ＨＥＲ−２受容体と相互作用し、ＥＧＦシグナル伝達経路を混乱させる薬剤として作用することができるペプチド及びペプチド模倣物としては、アダマノロール並びに例えば、公開特許文書カナダ特許第２３７３７２１号明細書及び米国特許出願公開第２００４００６１０６号明細書に開示されているものなどがある。

ＨＥＲ−２と相互作用する薬剤に代わるものとして、ＥＧＦｒファミリーの他のメンバーと相互作用する薬剤も本発明に用いることができる。例えば、Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標）（セツキシマブｃｅｔｕｘｉｍａｂ）は、結腸並びに頭部及び頚部癌におけるＥＧＦｒを介してＥＧＦ細胞シグナル伝達経路を標的とする既知の薬剤モノクローナル抗体である。

オリゴヌクレオチド
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡにおけるもののようなデオキシヌクレオチドの単量体からなる合成ポリマーである。本出願では、アンチセンスオリゴヌクレオチドという用語は、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを含む。

ヒトにおける癌の治療のための本発明の組合せ及び方法に用いるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１に示されているヒトクラステリンのヌクレオチド配列に対して相補性を有する。特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、クラステリンの翻訳開始部位又は終結部位に及んでいてよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２〜１９、又はより具体的には配列番号４、配列番号５及び配列番号１２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを含み、またそれから本質的になり得る。本出願の明細書及び特許請求の範囲で用いられるように、「本質的になる」という句は、オリゴヌクレオチドが特定された配列の塩基をちょうど含む、又はそのような塩基と該オリゴヌクレオチドのアンチセンス機能を実質的に変化させない少数のその他の塩基とを含むことを意味する。ＤＮアーゼによる消化を避けるために、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドは、しばしば化学的に修飾される。例えば、ヌクレアーゼ消化に対して抵抗性をもたせるために、ＤＮＡの非結合性ホスホリル酸素のうちの１つを硫黄で置換することによってホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドを安定化させる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの安定性の増大は、そのような組込みを許容する管轄区域において参照により組み込まれる米国特許第６，４５１，９９１号明細書、及び米国特許出願公開第２００３−０１５８１４３−Ａ１号明細書に一般的に記載されている２−メトキシエチル（ＭＯＥ）置換骨格を有する分子を用いて達成することもできる。したがって、本発明の組合せ及び方法において、アンチセンスオリゴヌクレオチドを修飾して、同じ配列の非修飾オリゴヌクレオチドと比べてｉｎｖｉｖｏ安定性を増大させることができる。修飾は、（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル））修飾であってよい。オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を全体にわたって有していてよく、ヌクレオチド１〜４及び１８〜２１の糖部分は２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を受けていてよく、残りのヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドであってよい。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、下の配列番号５に対応する５−１０−５ギャップマー（ｇａｐ−ｍｅｒ）メトキシエチル修飾（ＭＯＥ）オリゴヌクレオチドであってよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが１０〜２５塩基、又は長さが１５〜２３塩基、又は長さが１８〜２２塩基、又は長さが２１塩基であってよい。

本発明の組合せ及び方法にアンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いることができる具体例としての配列は、そのような組込みを許容する管轄区域においてすべてが参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ特許国際公開第００／４９９３７号パンフレット、米国特許出願公開２００２−０１２８２２０−Ａ１号明細書及び米国特許第６，３８３，８０８号明細書に開示されている。特定のアンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、本願書に配列番号２〜１９として記載し、表１に示す。

特に好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’−ＭＯＥ修飾を含むヒトクラステリン配列の翻訳開始コドン及び次の６コドンを標的とした２１ｍｅｒオリゴヌクレオチド（ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＧＴＣＴＴＣＡＴＣＡＴ；配列番号４）である。１つの実施形態において、このオリゴヌクレオチドは、全体にわたってホスホロチオエート骨格を有する。ヌクレオチド１〜４及び１８〜２１の糖部分（ウイング（ｗｉｎｇｓ））は２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を有し、残りのヌクレオチド（ヌクレオチド５〜１７；「デオキシギャップ」）は２’−デオキシヌクレオチドである。ウイング（すなわち、ヌクレオチド１、４及び１９）におけるシトシンは、５−メチルシトシンである。

ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド
クラステリンの量の減少は、ＲＮＡ干渉、すなわち「ＲＮＡｉ」を用いることによっても達成することができる。ＲＮＡｉは、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が遺伝子発現を阻害することができるという知見を記述するためにＦｉｒｅと共同研究者らによって最初に造りだされた用語である［３］。２本鎖ＲＮＡ、すなわちｄｓＲＮＡは、脊椎動物を含む多くの生物における遺伝子特異的転写後サイレンシングを誘導する。ＲＮＡｉはｍＲＮＡの分解を伴うが、この干渉の基礎をなす生化学的メカニズムの多くは、不明である。ＲＮＡｉの使用はさらに記載された［３，４］。

ＲＮＡｉのための最初の薬剤は、標的核酸に対応する２本鎖ＲＮＡ分子である。該ｄｓＲＮＡは次にｉｎｖｉｖｏで長さが２１〜２３ヌクレオチドである短い干渉性ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡｓ）（１９〜２１ｂｐ二重鎖、それぞれ２ヌクレオチド３’オーバーハングを有する）に切断されると考えられる。或いは、ＲＮＡｉは、そのようなｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ様分子を細胞中に直接導入することによってもたらされるか、又はその適切な前駆体（例えば、ベクター等）を細胞内に導入することによって細胞内で発生する。ｓｉＲＮＡは、次に他の細胞内成分と結合してＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成する。

本発明の実施形態に用いるＲＮＡ分子は、一般的にＲＮＡ部分とその他のある種の部分、例えば、デオキシリボヌクレオチド部分を含む。ＲＮＡ分子におけるヌクレオチドの総数は、ＲＮＡｉの有効なメディエーターであるために４９未満であることが適切である。好ましいＲＮＡ分子において、ヌクレオチドの数は、１６〜２９、より好ましくは１８〜２３、最も好ましくは２１〜２３である。

本発明の特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ様分子は、長さが約３０ヌクレオチド未満である。さらなる実施形態において、ｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ様分子は、長さが約２１〜２３ヌクレオチドである。１つの実施形態において、ｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ様分子は、各鎖が２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有する、１９〜２１ｂｐ二重らせん部分を含む。

本発明の特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ様分子は、クラステリンをエンコードする核酸又はそのフラグメント若しくは変異体（若しくは変異体のフラグメント）と実質的に同じである。そのような変異体は、クラステリン様活性を有するタンパク質をエンコードすることができる。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ様分子のセンス鎖は配列番号４又はそのフラグメントのアンチセンス種に対するものと同じ標的領域に対するものである（ＤＮＡ配列のＴ残基の代わりにＵを有するＲＮＡ）。他の実施形態において、ＲＮＡｉ配列は、配列番号４１又は４３からなる。例えば、米国特許出願公開第２００４０９６８８２号明細書は、クラステリンを標的とするＲＮＡｉ治療プローブを開示している。さらに、ＲＮＡｉを実施するための試薬及びキットは、例えば、ＡｍｂｉｏｎＩｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）及びＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓＩｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）により市販されている。本発明においてＲＮＡｉとして用いるための適切な配列は、本願書に表２に示す配列番号２１〜４４として記載する。

治療することができる癌
本出願の組合せは、ＥＧＦｒ阻害が重要である様々な癌の治療に有用である。これらの癌は、乳癌、骨肉腫、肺癌、膵臓癌、唾液腺癌、大腸癌、前立腺癌、子宮内膜癌及び膀胱癌などである。

ＥＧＦｒファミリーを標的とする様々な試薬が、肺癌の治療における有効性に関して試験された。これらの報告は、Ｔｉｓｅｏ（２０００年）［９］に要約されている。

Ｈｅｒ２／ｎｅｕ発現のターゲティングは、前立腺癌の発現及び進行のコントロールにおける治療可能性を有することが示された（ＤｉＬｏｒｅｎｚｏ（２００４年）［１０］）。Ｈｅｒ２／ｎｅｕは、卵巣癌、Ｘｕ（２００３年）［１１］、唾液腺癌、Ｓｃｈｏｌｌ（２００１年）［１２］、子宮内膜癌、Ｃｉａｎｃｉｕｌｌｉ（２００３年）［１３］及びＳｌｏｍｏｖｉｔｚ（２００４年）［１４］、膵臓癌、Ｂａｘｅｖａｎｉｓ（２００４年）［１５］、結腸及び直腸癌、Ｐａｒｋ（２００４年）［１６］、Ｈａｌｆ（２００４）［１７］及びＮａｔｈａｎｓｏｎ（２００３年）［１８］並びに膀胱癌、Ｂｅｌｌｍｕｎｔ（２００３年）［１９］における標的であることが示された。

方法
アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与は、担体を用いない投与及び製薬上許容できる脂質担体を用いた投与を含む当技術分野で知られている様々なメカニズムを用いて行うことができる。例えば、アンチセンス送達用脂質担体は、米国特許第５，８５５，９１１号及び第５，４１７，９７８号に開示されている。一般的に、アンチセンスは、静脈内、腹腔内、皮下若しくは経口経路又は腫瘍への直接局所注射により投与される。

投与するアンチセンスオリゴヌクレオチドの量は、特に及び驚くべきことに、ＨＥＲ−２細胞シグナル伝達経路を混乱させる薬剤と併用したとき、癌細胞におけるクラステリンの発現を減少させるのに有効な量である。この量は、用いるアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性及び用いる任意の担体の性質によって異なることは理解されよう。所与の組成物の適切な量の決定は、適切な治療レベルを評価するためにデザインされた一連の標準的試験による、当分野の技術の範囲内である。１つの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはヒト患者に４０〜６４０ｍｇ、又はより詳細には、３００〜６４０ｍｇの量で投与する。他の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは治療を必要とする患者の体重に応じて投与する。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与することができる。

モノクローナルトラスツズマブは、４４０ｍｇの薬剤を含むバイアル入りの散剤として入手可能である。これは、静脈内注射の前に液体と混合しなければならない。しばしば、初回用量として体重１ｋｇ当たり４ｍｇとした後、週１回体重１ｋｇ当たり２ｍｇの用量を用いる。例えば、ＳｌａｍｏｎＤＪら、２００１年［５］を参照のこと。

追加の治療薬
本発明の１つの実施形態による癌を治療する方法は、乳癌の治療に有用な化学療法薬若しくは他の薬剤及び／又は活性クラステリンの量を低減するのに有効な治療と組み合わせた種々の標的に向けられた追加のアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与をさらに含めることができる。例えば、アンチセンスクラステリンオリゴヌクレオチドは、タキサン（パクリタキセル又はドセタキセル）、ミトキサントロン、ドキソルビシン、ゲムシタビン、シクロホスファミド、デカルバジン、トポイソメラーゼ阻害薬、脈管形成阻害薬、分化薬及びシグナル変換阻害薬などのより多くの従来の化学療法薬と併用することができる。

適用例は、以下の非限定的な実施例にさらに記載する。

実施例
（材料及び方法）
腫瘍細胞
ＢＴ４７４ヒト乳癌細胞系を、５％ＣＯ_２−９５％空気雰囲気中、１０％ウシ胎児血清、グルタミン、ペニシリン及び硫酸ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ中で３７℃で培養した。細胞培養試薬は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）から購入した。

（試薬）
トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ（Ｍｏｎｚａ、Ｉｔａｌｙ）から購入）を４℃で保存し、培地で最終濃度に調整した。

本試験に用いたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、ＬａＪｏｌｌａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓＣｏ．（ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入するか、又はＯｎｃｏＧｅｎｅｘＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）により提供された。用いたクラステリンＡＳＯの配列は、ヒトクラステリン翻訳開始部位（５’−ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＧＴＣＴＴＣＡＴＣＡＴ−３’）（配列番号４）に相当していた。２塩基クラステリンミスマッチオリゴヌクレオチド（５’−ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＧＴＡＴＴＴＡＴＣＡＴ−３’）（配列番号２０）を対照として用いた。オリゴヌクレオチドは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）との複合体の形で細胞中に送達させた。細胞をＯＰＴＩＭＥＭ（商標）培地（Ｇｉｂｃｏ）中で種々の濃度のオリゴヌクレオチド及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）とともに６時間インキュベートした。オリゴヌクレオチド処理の終了時に、培地を２％ウシ胎児血清を含む新しい増殖培地と交換し、種々の時点に、細胞を実施すべき種々の分析に従って処理した。

（増殖アッセイ）
５×１０^５個の細胞を６０ｍｍ培養皿（Ｎｕｎｃ（商標）、ＭａｓｃｉａＢｒｕｎｅｌｌｉ、Ｍｉｌａｎｏ、Ｉｔａｌｙ）に播種し、付着させた。播種後４８時間目に細胞を５００ｎＭのクラステリンＡＳＯで６時間処理した。オリゴヌクレオチド処理後、細胞を２５μＭの濃度のトラスツズマブに曝露した。処理中の種々の時点に細胞を採取し、ＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＡｎａｌｙｚｅｒ（商標）（Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＭｏｄｅｌＶｉ−ＣｅｌｌＸＲ，Ｂｅｃｋｍａｎ、ＦＬ、ＵＳＡ）を用いて評価した。

（ウエスタンブロット）
ウエスタンブロット及び検出は、例えば、［７］に以前に報告したように実施した。簡単に述べると、４０μｇの総タンパク質を変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥに加えた。クラステリン及びＰＡＲＰタンパク質の免疫検出は、それぞれマウス抗クラステリン（１：１０００、４１Ｄ、ＵｐｓｔａｔｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＮＹ、ＵＳＡ）及びウサギ抗ＰＡＲＰ（１：２０００、ＶＩＣ５、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行った。ニトロセルロース膜に転移されたタンパク質の量を調べるために、ＨＳＰ７２／７３を対照として用い、抗ヒトＨＳＰ７２／７３（１：１０００、ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍＣａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）により検出した。転移タンパク質の相対量は、オートラジオグラフフィルムをゲルデンシトメータースキャナ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｍｉｌａｎｏ、Ｉｔａｌｙ）によりスキャンし、関連ＨＳＰ７２／７３の量に対して標準化して定量した。

（細胞周期の分析）
細胞周期の種々の段階の細胞の割合の測定は、以前に記載されたようにフローサイトメトリ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により行った（ＴｅｌｆｏｒｄＷ．Ｇ．、Ｌ．Ｅ．Ｋｉｎｇ及びＰ．Ｊ．Ｆｒａｋｅｒ（１９９２年）フローサイトメトリによるアポトーシス関連クロマチン分解の検出におけるいくつかのＤＮＡ結合色素の比較による評価（ＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｓｅｖｅｒａｌＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇｄｙｅｓｉｎｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｃｈｒｏｍａｔｉｎｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、１３：１３７〜１４３頁［８］。簡単に述べると、２×１０^５個の付着細胞を固定し、ヨードプロピジウム（ＰＩ）色素を含む溶液中に５０μｇ／ｍｌの濃度で再懸濁した。ＣＥＬＬＱｕｅｓｔ（商標）ソフトウエア（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて細胞周期の種々の段階の細胞の割合を計算した。

（アポトーシスの評価）
アポトーシスは、サブＧ１ピークのフローサイトメトリ分析により検出し、また、ＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＦＩＴＣｖｅｒｓｕｓＰＩアッセイ（Ｖｙｂｒａｎｔ（商標）ＡｐｏｐｔｏｓｉｓＡｓｓａｙ、Ｖ−１３２４２、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、ＵＳＡ）によっても分析した。簡単に述べると、付着細胞を収集し、アネキシン結合緩衝液中に懸濁し（１×１０^６細胞／ｍｌ）、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ及びＰＩと共に暗所で室温で１５分間インキュベートし、直ちにフローサイトメトリにより分析した。データは、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ緑色蛍光対ＰＩ赤色蛍光を示す２パラメータードットプロットとして表示した。

ＢＴ４７４ＨＥＲ−２過剰発現乳癌細胞におけるトラスツズマブで処理した後のクラスタリンの発現の増大
ＨＥＲ−２遺伝子を過剰発現するヒト乳癌細胞系ＢＴ４７４を臨床的に意味のある濃度のトラスツズマブに曝露した。トラスツズマブによるＢＴ４７４細胞の処理により、ＨＥＲ−２タンパク質の発現が用量依存的にダウンレギュレートした。フローサイトメトリによる分析により、１０及び２５μｇ／ｍｌのトラスツズマブで処理したＢＴ４７４細胞における蛍光の平均チャネルがそれぞれ１７３から１１２及び７２に低下したことが明らかになった。図１Ａに無処理（灰色部分）及び１０（細線）、２５μｇ／ｍｌ（太線）のトラスツズマブで４８時間処理したＢＴ４７４細胞並びに陰性対照（打点部分）におけるＨＥＲ−２タンパク質発現の細胞蛍光測定分析を示す。

トラスツズマブによって媒介されるＨＥＲ−２タンパク質発現の低下は、アポトーシスに影響を及ぼすことなく、ＢＴ４７４細胞増殖の阻害を伴う（図１Ｂ）。生存及びアポトーシス細胞の数の同時分析により、それぞれ１０及び２５μｇ／ｍｌのトラスツズマブで処理したＢＴ４７４細胞の細胞数が約１×１０^６個から８×１０^５及び６×１０^５個に減少したことから、トラスツズマブによる処理によって細胞増殖が用量依存的に有意に低下したことが示された。しかし、２５μｇ／ｍｌの最高用量でさえもトラスツズマブ処理は、アポトーシス細胞の割合の増加をほとんど又は全くもたらさなかった（１０％未満）。

トラスツズマブ処理がクラステリン／アポリポタンパク質Ｊの発現を調節することができるかどうかを次に評価した。トラスツズマブ（１０〜２５μｇ／ｍｌ）に最長４８時間曝露したＢＴ４７４細胞の溶解物中のクラステリンタンパク質のウエスタンブロット分析を行った。転移クラステリンタンパク質の相対量を定量し、対応するＨＳＰ７２／７３タンパク質の量に対して標準化した。同様な結果の独立した３つの実験の代表的なものを評価した。どちらのトラスツズマブ濃度もクラステリンタンパク質発現をアップレギュレートした。２５μｇ／ｍｌのトラスツズマブは６０ｋＤ形を３倍増加させ、４０ｋＤ形の出現が認められた。

ＢＴ４７４細胞増殖率に対するクラステリンＡＳＯとトラスツズマブとの併用処理の影響
クラステリンタンパク質発現に対するオリゴヌクレオチドによる処理の影響を評価した。ＢＴ４７４細胞に３００又は５００ｎＭクラステリンＡＳＯ（配列番号４、ＭＯＥ修正を含む）（又は上述のような対照としての同じ濃度のそのミスマッチオリゴヌクレオチド）をトランスフェクトし、処理の４８時間後にウエスタンブロットによりクラステリン発現を分析した。１００又は５００ｎＭクラステリンＡＳＯによる６時間にわたるＢＴ４７４の処理は、ミスマッチ対照と比較してクラステリンタンパク質発現をそれぞれ３０及び５０％低下させた。

分析は、処理の終了の４８時間後に行った。転移クラステリンタンパク質の相対量を定量し、対応するＨＳＰ７２／７３タンパク質の量に対して標準化した。

これに対して、クラステリンレベルは、用いたいずれの濃度の２塩基ミスマッチ（ＭＭ）対照オリゴヌクレオチドによる影響も受けなかった。

クラステリンＡＳＯ（配列番号４、ＭＯＥ修正を含む）による処理がトラスツズマブの細胞毒性作用を増大させるかどうかを検討するために、ＢＴ４７４細胞を５００ｎＭクラステリンＡＳＯ又はＭＭ対照オリゴヌクレオチドで処理し、次いで、２５μｇ／ｍｌのトラスツズマブに４８時間曝露した。図２に無処理並びにトラスツズマブ単独及びクラステリンＡＳＯ又はＭＭ対照オリゴヌクレオチドと併用して処理したＢＴ４７４における細胞数を示す。トラスツズマブは、ＢＴ４７４の増殖を約５０％減少させたが、クラステリンＡＳＯによる処理は細胞増殖に対する影響を示さなかった。トラスツズマブとクラステリンＡＳＯとの併用（ＭＭ対照オリゴヌクレオチドとの併用ではない）は細胞の薬剤感受性を有意に増大させ、細胞増殖は最大８５％低下した。

クラステリンＡＳＯによる処理がトラスツズマブに対する細胞の薬剤感受性を増大させるメカニズムを検討するために、フローサイトメトリにより細胞周期分布を分析した。図３に無処理及び単一薬剤単独で又は併用処理したＢＴ４７４細胞におけるＤＮＡ含量のヒストグラムを示す。分析は、処理の終了の４８時間後に行った。

細胞周期の種々の段階の細胞の割合の分析により、クラステリンＡＳＯによる処理は細胞周期分布に対する影響を示さなかったが、トラスツズマブへの細胞の曝露は増殖性コンパートメント（Ｓ〜Ｇ_２／Ｍ）の減少と細胞周期のＧ_０／Ｇ_１期の付随した増加をもたらしたことが明らかになった。しかし、両処理は、サブＧ１ＤＮＡ含量を有する集団の出現を誘発しなかった。トラスツズマブ＋ＭＭ対照オリゴヌクレオチドで処理した細胞の細胞周期分布は、トラスツズマブ単独の場合と同様であった。これに対して、トラスツズマブ及びクラステリンＡＳＯで処理した細胞に細胞周期の著しい混乱が認められ、細胞集団の有意な部分（約４０％）がサブＧ_１コンパートメントにあった。

アポトーシスの誘導に対するクラステリンＡＳＯとトラスツズマブによる併用処理の影響
種々の処理に曝露したＢＴ４７４細胞におけるアポトーシスを評価した。図４に、無処理並びにトラスツズマブ単独及びクラステリンＡＳＯ又はＭＭ対照オリゴヌクレオチドと併用して処理したＢＴ４７４において実施したアネキシンＶ対ＰＩ染色の細胞蛍光測定分析を示す。上記と同じ処理スケジュールを用いて、アポトーシス（ドットプロットパネルのアネキシンＶ^＋／ＰＩ⁻領域として示す）がクラステリンＡＳＯ＋トラスツズマブの併用処理後にのみ認められた。アネキシンＶ^＋／ＰＩ⁻細胞の割合は、トラスツズマブ／クラステリン組合せで約４０％であり、他のすべての処理では１０％未満であった。

クラステリンタンパク質発現に対する影響
クラステリンタンパク質発現及びＰＡＲＰ切断に対するクラステリンＡＳＯとトラスツズマブの組合せの影響についても評価した。細胞を５００ｎＭのクラステリンＡＳＯ又はＭＭ対照オリゴヌクレオチドで６時間処理し、次いで、２５μｇ／ｍｌのトラスツズマブ又は対照培地に曝露した。クラステリンタンパク質発現及びポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）切断をウエスタンブロットにより分析した。転移クラステリンタンパク質の相対量を定量し、対応するＨＳＰ７２／７３タンパク質の量に対して標準化した。

トラスツズマブとＭＭ対照オリゴヌクレオチドとの組合せにおけるクラステリンの発現は、トラスツズマブ単独の処理の後と同じであるが、トラスツズマブとクラステリンＡＳＯとの組合せは、その発現を特異的に阻害することによってトラスツズマブ誘発性クラスタリン発現を阻害した。

ＰＡＲＰ切断の分析により、ＰＡＲＰの１１６ＫＤ完全形は検討したすべての試料で認められるのに対して、８５ＫＤのＰＡＲＰ切断フラグメントはトラスツズマブ＋クラステリンＡＳＯの併用処理後にのみ検出されることが実証された。

引用した文書のすべては、そのような組込みを許容する管轄区域において参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の特定の実施形態を記述し、例示したが、そのような実施形態は、本発明を例示するものにすぎず、本発明を限定するものではないとみなすべきである。

無処理（灰色部分）及び１０（細線）、２５μｇ／ｍｌ（太線）のトラスツズマブで４８時間処理したＢＴ４７４細胞並びに陰性対照（打点部分）におけるＨＥＲ−２タンパク質発現の細胞蛍光測定分析を示す。無処理並びに１０及び２５μｇ／ｍｌのトラスツズマブで４８時間処理したＢＴ４７４細胞における接着細胞の数（黒色カラム）及びアポトーシス細胞の割合（白色カラム）を示す。５００ｎＭのクラステリンＡＳＯ又はミスマッチ（ＭＭ）対照オリゴデオキシヌクレオチドで６時間処理した後、２５μｇ／ｍｌのトラスツズマブ又は対照培地に処理後４８時間目に曝露した細胞に関するデータを示す。５００ｎＭのクラステリンＡＳＯ又はＭＭ対照オリゴヌクレオチドで６時間処理した後、２５μｇ／ｍｌのトラスツズマブ又は対照培地に曝露した後の細胞周期の種々の段階における細胞の相対的割合（ヨードプロピジウム染色及びフローサイトメトリを用いて測定）を示すヒストグラムである。５００ｎＭのクラステリンＡＳＯ又はＭＭ対照オリゴヌクレオチドで６時間処理した後、２５μｇ／ｍｌのトラスツズマブ又は対照培地に曝露した細胞のアネキシンＶ／ＰＩ染色の細胞蛍光測定分析を示す。アネキシンＶ陽性細胞は、囲みで表示される。

Claims

クラステリン以外の主要な標的を有し、哺乳類対象における癌を治療するのに有効であり、クラスリンの発現レベルを増大させ、ＥＧＦ細胞シグナル伝達経路を混乱させる薬剤と、癌細胞における有効な量のクラステリンを減少させるのに有効なオリゴヌクレオチドとを含む、哺乳類対象における癌を治療するための組合せ。
ＥＧＦ細胞シグナル伝達経路を混乱させる薬剤がＨＥＲ−２と相互作用する請求項１記載の組合せ。
薬剤がＨＥＲ−２に対して特異的なモノクローナル抗体である請求項２記載の組合せ。
薬剤がトラスツズマブである請求項３記載の組合せ。
クラステリンの量を減少させるのに有効なオリゴヌクレオチドが抗クラステリンアンチセンスオリゴヌクレオチドである請求項１〜４のいずれか一項に記載の組合せ。
抗クラステリンアンチセンスオリゴヌクレオチドがクラステリンの翻訳開始部位又は終結部位に及ぶ請求項５記載の組合せ。
抗クラステリンアンチセンスオリゴヌクレオチドが、同じ配列の非修飾オリゴヌクレオチドと比較してイン・ビボ（ｉｎｖｉｖｏ）での安定性を増大させるために修飾されている請求項５又は６に記載の組合せ。
修飾が（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル））修飾である請求項７記載の組合せ。
アンチセンスオリゴヌクレオチドが全体にわたってホスホロチオエート骨格を有し、ヌクレオチド１〜４及び１８〜２１の糖部分である「ウイング（ｗｉｎｇｓ）」が２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を有し、残りのヌクレオチドが２’−デオキシヌクレオチドである請求項８記載の組合せ。
抗クラステリンアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号２〜１９からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドから本質的になる請求項５〜９のいずれか一項に記載の組合せ。
抗クラステリンアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号４、配列番号５及び配列番号１２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドから本質的になる請求項５〜９のいずれか一項に記載の組合せ。
クラステリンの量を減少させるのに有効なオリゴヌクレオチドがＲＮＡｉオリゴヌクレオチドである請求項１〜４のいずれか一項に記載の組合せ。
ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが配列番号２１〜４４からなる群から選択される配列を含む請求項１２記載の組合せ。
クラステリンの量を減少させるのに有効なオリゴヌクレオチド及び薬剤が製薬上許容できる共通の担体中に存在する請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組合せ。
クラステリンの量を減少させるのに有効なオリゴヌクレオチド及び薬剤が製薬上許容できる別個の担体中に存在する請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組合せ。
薬剤と、クラステリンの量を減少させるのに有効なオリゴヌクレオチドとをそれぞれ一緒に又は別個に単位剤形として供給する請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組合せ。
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組合せを哺乳類対象に投与することを含む該対象における癌を治療する方法。
癌が乳癌、骨肉腫、肺癌、膵臓癌、唾液腺癌、大腸癌、前立腺癌、子宮内膜癌及び膀胱癌からなる群から選択される請求項１７記載の方法。
癌が乳癌である請求項１８記載の方法。
癌の治療用の医薬品の配合における請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組合せの使用。
癌が乳癌、骨肉腫、肺癌、膵臓癌、唾液腺癌、大腸癌、前立腺癌、子宮内膜癌及び膀胱癌からなる群から選択される請求項２０記載の使用。
癌が乳癌である請求項２０記載の使用。