JP2008520586A - 免疫グロブリン可変領域カセット交換 - Google Patents

Abstract

本発明は、参照抗体のVHおよびVL配列の一部をヒト抗体レパートリーからの配列に置き換えることによって、参照抗体の特異性を有するヒト抗体を生成する方法を提供する。本発明はまた、異なる抗体クローンからのフレームワーク（FR）とCDRとの組み合わせを含むハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインを含む新規組成物を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その出願が参照により本明細書に組み入れられる、2004年11月16日に提出された米国特許仮出願第60/628,581号の恩典を主張する。

発明の背景
抗体の抗原結合部分は、典型的に二つの免疫グロブリンドメイン、すなわち重鎖可変（V_H）ドメインおよび軽鎖可変（V_L）ドメインを含む。それぞれのドメインは、相補性決定領域（CDR）を形成する多様な配列の三つのループを有する。6個のCDR（V_Hから3個、およびV_Lから3個）が、可変領域構造の一つの面から伸長して抗原結合部位を形成する。ほとんどの抗体において、有意な親和性で抗原に結合するためには、二つの鎖の適当な会合が必要である。このように、V_HおよびV_Lドメインは共に、最小の抗原結合単位を形成する。

モノクローナル抗体、特にマウスを含む齧歯類に由来するモノクローナル抗体が広く利用されている。しかし、それらはヒトの臨床での使用において頻繁に免疫応答を生じる（例えば、Miller, R. A. et al., Blood 62:988〜995 (1983)；Schroff, R. W. et al., Cancer Res. 45:879〜885 (1985)）。当技術分野は、動物の抗原結合可変ドメインがヒト定常ドメインに共役している「キメラ」抗体を構築することによって、この問題を克服しようと試みた（米国特許第4,816,567号；Morrison, S. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851〜6855(1984)；Boulianne, G. L. et al., Nature 312:643〜646 (1984)；Neuberger, M. S. et al., Nature 314:268〜270 (1985)）。

ヒト抗体における異種配列の使用を最小限にするさらなる努力において、多数のヒト化アプローチが記述されている（例えば、Jones, P. T. et al., Nature 321 :522〜525(1986)；Riechmann, L. et al., Nature 332:323-327(1988)；Verhoeyen, M. et al., Science 239:1534〜1536(1988)；Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA. 86:10029〜33(1989)；米国特許第5,693,762号および第5,585,089号）。そのような技術では、ドナー免疫グロブリンからのCDRがヒトのフレームワークに挿入される。典型的に、完全な結合活性を回復するために必要な齧歯類のCDRの本来のコンフォメーションを保存するために、ヒトアクセプター抗体のフレームワークにおけるさらなる残基を同様に齧歯類の残基に置換する。このように、ヒト化抗体はしばしば、齧歯類抗体からのCDR 6個と、フレームワーク領域においてさらにいくつかの齧歯類残基を保持する。齧歯類抗体からのCDR 6個をヒトフレームワークに移入することによって、開始抗体の特異性は、典型的にヒト化抗体において保持されるが、ヒト化抗体の親和性は、多くの場合、開始抗体と比較して低減される。その結果、ヒト化プロセスを数回繰り返すことが必要となる可能性があり、その中で、適当な結合親和性を得るために、フレームワーク領域において復帰変異の別の組み合わせを構築してこれを試験する。多数回繰り返した後でさえも、開始抗体と同等の親和性を有するCDR移植（CDR-grafted）抗体を必ずしも同定できるとは限らない。

ヒト抗体はまた、微生物発現系における抗体遺伝子のレパートリーの発現によって、インビトロで単離されている。発現された抗体断片が、微生物細胞またはバクテリオファージの表面に繋がれた融合タンパク質として示される、多数のディスプレイ技術が存在する。ファージまたは宿主細胞は、複製可能な遺伝子ディスプレイパッケージ（rgdp）として役立ち、特定の抗原が結合するrgdpを選択して、培養において増殖させて、選択された抗原に対する抗体をコードする遺伝子を単離することができる。抗体断片は、酵母（Feldhaus et al., Nat Biotechnol. 21:163〜70, 2003）、細菌細胞（Daugherty et al., Protein Eng. 12:613〜21, 1999）または最も一般的にファージの表面上での発現からこのようにして単離することができる。ファージディスプレイによって、大きい組み合わせライブラリを、まれな抗原結合抗体に関してスクリーニングすることができる（Hoogenboom and Winter, J Mol Biol. 227:381, 1992；Marks et al., J Mol Biol. 222:581, 1991；Winter et al., Annu Rev Immunol. 12:433〜55, 1994）。望ましい組み合わせを選択するために、より小さい二つのライブラリから、可能性がある結合体の大きい組み合わせライブラリを作製することができる。例えば、H鎖10⁷個の第一のライブラリを作製して、バクテリオファージ上で提示することができる。これらの軽鎖に関するコード配列がプラスミドベクター内に存在するL鎖10⁷個の第二のライブラリを、宿主細菌のペリプラスム間隙に発現させる。H鎖およびL鎖ライブラリを組み合わせて、細菌上清において、得られたファージの表面上にHおよびL鎖の組み合わせ10¹⁴個を提供する。

ファージ-抗体ライブラリにおける多様性を増加させる様々な方法が当技術分野で公知である。そのような一つの方法は、ヒト抗体の人工ライブラリを生成するために、生殖系列コードCDR配列の無作為な組み合わせを、一組のヒトフレームワーク領域に組み合わせることを必然的に伴う（「CDRシャッフリング」）。例えば、Jirholt et al., Gene 215: 471, 1998；Soderlind et al., Nat Biotechnol. 18:852-6, 2000を参照されたい。

ファージディスプレイはまた、ヒトV_L鎖のライブラリが齧歯類抗体のV_H鎖と対を形成して、半ヒト抗体を抗原結合に関して選択する、誘導選択の二段階プロセスによって、齧歯類抗体の結合特異性を有するヒト抗体を同定するために用いることができる。次に、抗原に結合することができるヒトV_H-V_L対を同定するために、同定されたヒトの鎖を、ヒトV_H鎖のライブラリと対を形成させる（例えば、米国特許第5,565,332号；Jespers, et al., Bio/Technology 12:899〜903, 1994；Beiboer et al., J Mol Biol. 296:833〜49, 2000）。いくつかの場合において、齧歯類抗体の重鎖CDR3は、誘導選択において保持される（Klimka et al., Br J Cancer 83:252〜60, 2000）。他の場合において、齧歯類抗体のCDRH3およびCDRL3はいずれも、誘導選択後の最終的なヒト化抗体において保持される（例えば、Rader et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 95:8910〜5, 1998）。

これらの場合の全てにおいて、高い親和性を有する抗体を同定するために、大きく、非常に多様なライブラリが典型的に用いられる。したがって、当技術分野における技術に由来するヒト抗体は、最も近縁の生殖系列配列とは有意な数のアミノ酸の差を有する傾向がある。そのような体細胞変異は、天然の抗体における高親和性抗体の生成に寄与して（例えば、England et al., J. Immunol. 162:2129, 1999）、一般的に、インビトロライブラリから生成された抗体における高親和性抗体の生成にとって重要であると見なされている。しかし、そのような変異は、体の免疫系によって異物であると認識される可能性がある新規タンパク質配列を生成する。免疫系は、発達の際に広く発現される免疫グロブリン、すなわち生殖系列において見いだされる非変異型の配列に対して非反応性（「寛容」）であると予想されるが、これらの配列における変異によって、免疫系はこれらを異物タンパク質として区別することがありうる。このように、生殖系列の配列と多数の差を有する抗体は、ヒトにおいて治療的に用いた場合に、免疫原性であると予想されるであろう。

したがって、開始抗体の特異性および結合親和性を保持しながら、免疫原性の可能性をさらに低減させるために、齧歯類抗体をヒト化するための改善された方法が必要である。同様に、開始参照抗体、例えばマウス抗体の特異性を有するが、生殖系列であるまたは生殖系列に近いヒト免疫グロブリンを利用するヒト抗体を同定するための方法も必要である。本発明はこのような必要性に取り組む。

本発明はさらに、鎖誘導選択およびCDR移植を含む、抗体ヒト化技術における固有の信頼性の問題に対する解決策を提供する。CDR移植技術は、ヒトV_HおよびV_Lフレームワーク配列を有するが、参照抗体の可変領域の有意な部分を保持する抗体を提供する。これらは、開始抗体と比較して親和性が低減されている可能性があり、多数の繰り返し操作段階によって産生するために労力がかかりうる。本発明は、標的抗原に対する親和性を保持するヒト化抗体を提供するために参照抗体を操作する方法を提供する。

発明の簡単な概要
本発明は、参照抗体のV_HおよびV_L配列の一部をヒト抗体レパートリーからの配列に置き換えることによって、参照抗体の特異性を有する設計された抗体を生成するための方法を提供する。本発明はまた、異なる抗体クローンからのフレームワーク（FR）とCDRの組み合わせを含むハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインを含む新規組成物を提供する。さらに、本発明はハイブリッドV領域のライブラリを提供する。

このように、一つの局面において、本発明は、以下の段階を含む、標的抗原に関する参照抗体の結合特異性を保持する抗体を設計する方法を提供する：（a）参照抗体からの重鎖または軽鎖可変領域を得る段階；（b）交換カセットが3個未満のフレームワーク領域を有することを条件として、可変領域のV遺伝子セグメントの少なくとも一つの交換カセットを、ヒトV遺伝子セグメントからの対応する交換カセットのライブラリに置き換えて、それによってハイブリッドV領域のライブラリを生成する段階；（c）（b）のハイブリッドV領域のライブラリを相補的V領域と対を形成させる段階；および（d）標的抗原に対して結合親和性を有するハイブリッドV領域を含む抗体を選択する段階。交換カセットは一般的に、FRl-CDR1、FR1-CDR1-FR2、FR2-CDR2-FR3、CDR2-FR3、CDRl-FR2、CDR1-FR2-CDR2、CDR1-FR2-CDR2-FR3、FRl-CDRl-FR2-CDR2、およびFR2-CDR2からなる群より選択される。しばしば、交換カセットは、FRl-CDRl、FRl-CDR1-FR2、FR2-CDR2-FR3、およびCDR2-FR3からなる群より選択される。いくつかの態様において、交換カセットの少なくとも一つのCDR配列またはFR配列は部分的CDRである。他の態様において、少なくとも一つのFR配列は部分的FR配列となりうる。さらに、ヒト交換カセットの少なくとも一つは、ヒト生殖系列配列となりうる。選択される抗体は、Fv断片、Fab、Fab'、F(ab')₂、scFv、またはCH2もしくはCH3において欠失されている断片のような、免疫グロブリンのもう一つの断片となりうる。

方法はまた、以下のさらなる段階を含みうる：（e）V領域の第二の交換カセットを、ヒトV遺伝子セグメントからの対応する交換カセットのライブラリに置き換えて、ハイブリッドV領域の第二のハイブリッドライブラリを作製する段階；（f）ハイブリッドV領域の第二のライブラリを相補的V領域と対を形成させる段階；（g）標的抗原に対して結合親和性を有する、第二のハイブリッドV領域を含む抗体を選択する段階；および（h）（d）の抗体のヒト交換カセットを（g）の抗体の第二のヒト交換カセットと組み合わせて、少なくとも二つのヒト交換カセットを有する参照抗体の結合特異性を有する抗体を得る段階。これらの段階は、（b）から（d）まで同時に行うことができ；または段階（b）〜（d）に関して任意の順序で、連続的に行うことができる。第二のカセットはまた、部分的CDR配列またはFR配列である、少なくとも一つのCDR配列またはFR配列を有しうる。

いくつかの態様において、方法はさらに、ハイブリッド可変領域のCDR3-CDR4領域を、CDR3-CDR4領域のライブラリに置き換える段階、可変領域を相補的可変領域と対を形成させる段階、および標的抗原に対して高い結合親和性を有する抗体を選択する段階を含む。

（c）または（f）の相補的V領域は、例えば天然に存在するVセグメントを含むV領域、ハイブリッドV領域、または異なるハイブリッドV領域を含むライブラリのメンバーであるハイブリッドV領域となりうる。

本発明のいくつかの態様において、一つまたは複数のハイブリッドV領域を含む抗体が発現されて、宿主細胞、例えば原核細胞、酵母、または哺乳動物細胞から可溶型で分泌されて、抗原に結合する。

もう一つの態様において、ハイブリッドV領域を含む抗体は細胞、胞子、またはウイルス上で提示される。

例としてのカセット交換技法において、本発明は、以下の段階を含む、抗体を設計する方法を提供する：（a）望ましい結合特異性を有する参照抗体の可変領域（重鎖または軽鎖可変領域のいずれか）を得る段階；（b）参照抗体の可変領域のFR1-CDR1-FR2を、ヒトFR1-CDR1-FR2領域のライブラリに置き換えて、ハイブリッド可変領域のライブラリを作製する段階、ハイブリッド可変領域を相補的可変領域と対を形成させる段階、および標的抗原に対して検出可能な親和性を有する抗体を選択する段階；（c）参照抗体の可変領域のFR2-CDR2-FR3を、ヒトFR2-CDR2-FR3領域のライブラリに置き換えて、ハイブリッド可変領域のライブラリを作製する段階、ハイブリッド可変領域を相補的可変領域と対を形成させる段階、および標的抗原に対して検出可能な親和性を有する抗体を選択する段階；（d）（b）において選択された抗体のハイブリッド可変領域のFR1-CDR1-FR2を、（c）において選択された抗体のハイブリッド可変領域のFR2-CDR2-FR3と組み合わせて、参照抗体の結合特異性を有するヒト可変領域Vセグメントを有する抗体を得る段階。一つの態様において、FR2配列またはFR3配列は部分的FR配列である。さらなる態様において、FR1-CDR1-FR2および／またはFR2-CDR2-FR3は、ヒト生殖系列配列のライブラリからの配列である。

方法の段階は、同時または連続的に行うことができる。さらに、連続的に行う場合、段階（b）および（c）は任意の順序で行うことができる。

（b）または（c）の相補性V領域は、例えば天然に存在するVセグメント、ハイブリッドV領域、または異なるハイブリッドV領域を含むライブラリのメンバーであるハイブリッドV領域となりうる。

一つの態様において、FR1-CDR1-FR2をFR2-CDR2-FR3と組み合わせる段階は、相同性領域においてFR2領域を組み合わせる段階を含み、すなわちFR1-CDR1-FR2およびFR2-CDR2-FR3を、FR2領域において例えば、少なくとも70％、75％、80％、85％、または90％もしくはそれより多い配列同一性を有する領域で組み合わせる。「組み合わせる」段階は、例えば組換えを通して起こりうる。

または、FR1-CDR1-FR2をFR2-CDR2-FR3と組み合わせる段階は、FR1-CDR1-FR2からのFR2を、FR2-CDR2-FR3からのFR2に置き換える段階、またはFR2-CDR2-FR3からのFR2を、FR1-CDR1-FR2からのFR2に置き換える段階を含む。

先に記述した方法はまた、上記の少なくとも一つのヒトVセグメントを含むハイブリッド可変領域のCDR3-FR4領域を、ヒトCDR3-FR4領域のライブラリに置き換える、可変領域を相補的可変領域と対を形成させる、および標的抗原に結合する抗体を選択する、さらなる段階を含みうる。

もう一つの態様において、方法は、上記の少なくとも一つのヒトVセグメントを含むハイブリッド可変領域のFR3-CDR3-FR4を、FR3-CDR3-FR4領域のライブラリに置き換える段階、可変領域を相補的可変領域と対を形成させる段階、および標的抗原に対して検出可能な親和性を有する抗体を選択する段階を含みうる。本態様はさらに、上記の選択された抗体のハイブリッド可変領域のFR3-CDR4-FR4を、（d）において選択された抗体のハイブリッド可変領域のFR2-CDR2-FR3と組み合わせて、参照抗体の結合特異性を有する、これらのヒト可変領域Vセグメントを有する抗体を得る段階を含む。

本発明のもう一つの例としての抗体の設計技法において、方法は以下の段階を含む：
（a）望ましい結合特異性を有する参照抗体の可変領域を得る段階；
（b）参照抗体の可変領域のFR1-CDR1-FR2を、ヒトFR1-CDR1-FR2領域のライブラリに置き換えて、ハイブリッド可変領域のライブラリを作製し、ハイブリッド可変領域を相補的可変領域と対を形成させ、標的抗原に対して検出可能な親和性を有する抗体を選択する段階；
（c）CDR2が部分的CDR2である参照抗体の可変領域のCDR2-FR3を、対応する部分的CDR2-FR3配列を含むヒトCDR2-FR3領域のライブラリに置き換えて、ハイブリッド可変領域のライブラリを作製し、ハイブリッド可変領域を相補的可変領域と対を形成させ、標的抗原に対して検出可能な親和性を有する抗体を選択する段階；ならびに
（d）（b）において選択された抗体のハイブリッド可変領域のFR1-CDR1-FR2を、（c）において選択された抗体のハイブリッド可変領域のCDR2-FR3と組み合わせて、参照抗体の結合特異性を有し、ヒト可変領域Vセグメントを有する抗体を得る段階。いくつかの態様において、方法はまた、参照抗体のCDR3-FR4をヒトCDR3-FR4領域のライブラリに置き換える段階、可変領域を相補的可変領域と対を形成させる段階、および標的抗原に結合する抗体を選択する段階も含む。ヒトCDR3-FR4のライブラリのCDR3領域は、完全なCDR3領域または部分的CDR3領域となりうる。

もう一つの態様において、例としての方法はさらに以下の段階を含む：（e）開始参照抗体または設計された抗体の可変領域のFR4を、FR4領域のライブラリに置き換え、可変領域を相補性可変領域と対を形成させ、標的抗原に対する検出可能な親和性を有する抗体を選択する段階。

もう一つの局面において、本発明は、参照抗体、例えば非ヒト抗体の結合特異性を有し、以下を含む、設計された抗体を提供する：交換カセットが3個未満のフレームワーク領域を有することを条件として、第一および第二の交換カセットがそれぞれ、一つのCDRに天然の順序で接合した少なくとも一つのフレームワークを有する、一つのヒト抗体遺伝子からのヒト交換カセットと、異なる抗体遺伝子からの第二の交換カセットとを有するV遺伝子セグメントを含む可変ドメイン；ならびに参照抗体からのCDR3およびFR4。いくつかの態様において、第一および／または第二の交換カセットはヒト生殖系列配列である。

本発明はまた、参照抗体、例えば非ヒト参照抗体の結合親和性を有し、以下を含む設計された抗体を提供する：交換カセットが3個未満のフレームワーク領域を有することを条件として、一つのヒト抗体遺伝子からのヒト交換カセットと、異なるヒト抗体遺伝子からの第二の交換カセットとを有するV遺伝子セグメントを含む可変ドメイン；ならびに参照抗体からの少なくとも部分的CDR3配列、および参照抗体からのFR4配列またはヒトFR4配列。いくつかの態様において、参照抗体からの部分的CDR3配列は、CDR3の最小の必須結合特異性決定因子（MEBSD）である。しばしば、部分的CDR3配列は参照抗体からのDセグメントを有する。そのような設計された抗体は典型的に、ヒトFR4配列、例えばヒト生殖系列FR4配列を有する。

もう一つの局面において、本発明は参照抗体の少なくとも一つがヒトFR3に置き換えられている設計された抗体を提供する。FR3は、重鎖または軽鎖FR3となりうる。いくつかの態様において、重鎖および軽鎖FR3領域はいずれも置き換えられる。

もう一つの局面において、本発明は、ハイブリッドV領域のライブラリを提供した。本発明のハイブリッドV領域のライブラリは、異なるV領域を有するメンバーを含む。交換カセットが3個未満のフレームワーク領域を有することを条件として、ライブラリにおけるハイブリッドV領域は、参照抗体からの少なくとも部分的CDR、例えばMEBSD、およびヒトレパートリーからの少なくとも一つの交換カセットを有する。CDR配列の少なくとも一つおよび／または交換カセットのFR配列の少なくとも一つは、部分的CDR配列またはFR配列となりうる。交換カセットは例えば、FRl-CDRl、FRl-CDR1-FR2、FR2-CDR2-FR3、またはCDR2-FR3となりうる。いくつかの態様において、交換カセットはヒト生殖系列配列である。

ライブラリのメンバーは、ヒトレパートリーからの少なくとも二つの交換カセットを有しうる。

典型的な態様において、ライブラリのメンバーに存在する参照抗体からのCDRまたは部分的CDRは、CDR3配列である。さらに、ライブラリのメンバーはしばしば、ヒトFR4配列を有するが、これはライブラリの様々なメンバーにおける同じ配列または異なる配列となりうる。典型的に、部分的CDR3は、参照抗体からのMEBSDおよび／またはDセグメントである。

なおもう一つの局面において、本発明は、参照抗体の結合特異性を保持するV_H二量体を含む抗体を設計する方法を提供する。しかし、そのような方法は、抗体の産生の際に本明細書に記述される交換カセットを用いるが、ハイブリッドV_H領域を相補的V_L領域と対を形成させる段階が存在しない。このように、方法は典型的に、（a）参照抗体からの、例えばラクダ科動物参照抗体からの重鎖可変領域を得る段階；（b）交換カセットが3個未満のフレームワーク領域を有することを条件として、可変領域のV遺伝子セグメントの少なくとも一つの交換カセットを、ヒトV遺伝子セグメントからの対応する交換カセットのライブラリに置き換えて、それによってハイブリッドV領域のライブラリを生成する段階；および（d）標的抗原の結合親和性を有するハイブリッドV領域を含む抗体を選択する段階。交換カセットは一般的に、FRl-CDRl、FR1-CDR1-FR2、FR2-CDR2-FR3、CDR2-FR3、CDRl-FR2、CDR1-FR2-CDR2、CDR1-FR2-CDR2-FR3、FRl-CDRl-FR2-CDR2、およびFR2-CDR2からなる群より選択される。しばしば、交換カセットは、FRl-CDRl、FRl-CDR1-FR2、FR2-CDR2-FR3、およびCDR2-FR3からなる群より選択される。いくつかの態様において、交換カセットの少なくとも一つのCDR配列またはFR配列は、部分的CDR配列またはFR配列である。そのような抗体は、例えば、原核細胞、酵母、もしくは哺乳動物細胞のような宿主細胞において発現されうる、または細胞、胞子、もしくはウイルスの表面上に提示されうる。

発明の詳細な説明
定義
本明細書において用いられるように、「抗体」は、結合タンパク質であると機能的に定義され、当業者によって、抗体を産生する動物の遺伝子をコードする免疫グロブリンのフレームワーク領域に由来すると認識されるアミノ酸配列を含むとして構造的に定義されるタンパク質を指す。抗体は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的にコードされる一つまたは複数のポリペプチドからなりうる。認識される免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子と共に、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、κまたはλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεとして分類され、これは次に、免疫グロブリンのクラス、IgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEをそれぞれ定義する。

典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含むことが知られている。それぞれの四量体は、それぞれの対が一つの「軽鎖」（約25 kD）および一つの「重鎖」（約50〜70 kD）を有するポリペプチド鎖の二つの同一の対からなる。それぞれの鎖のN-末端は、主に抗原認識に関与する約100〜110個またはそれより多いアミノ酸の可変領域を定義する。可変軽鎖（V_L）および可変重鎖（V_H）という用語はそれぞれ、これらの軽鎖および重鎖を指す。

抗体は、完全な形の免疫グロブリンとして、または十分に特徴が調べられた多数の断片として存在する。このように、例えばペプシンは、ヒンジ領域においてジスルフィド連結の下で抗体を消化して、F(ab)'2を生成するが、これはジスルフィド結合によってVH-CH1に接合した軽鎖であるFabの二量体である。F(ab)'2は、軽度の条件で還元されて、ヒンジ領域のジスルフィド連結が切断され、それによってF(ab)'2二量体はFab'単量体に変換される。Fab'単量体は本質的に、ヒンジ領域の一部を有するFabである（例えば、他の抗体断片のより詳細な説明に関して、Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, N. Y. (1993)を参照されたい）。様々な抗体断片が、完全な形の抗体の消化に関して定義されているが、当業者は、断片がデノボで化学的にまたは組換えDNA方法論を利用して合成されうることを認識するであろう。このように、本明細書において用いられるように、抗体という用語には、抗体全体の改変によって産生された、または組換えDNA方法論を用いて合成された抗体断片が含まれる。好ましい抗体には、可変重鎖および可変軽鎖領域が共に接合して（直接またはペプチドリンカーを通して）、連続したポリペプチドを形成する一本鎖Fv抗体（sFvまたはscFv）のような一本鎖抗体（単一のポリペプチド鎖として存在する抗体）を含む、V_H-V_L二量体が含まれる。一本鎖Fv抗体は、直接接合されたまたはペプチドコードリンカーによって接合されたV_H-およびV_L-コード配列を含む核酸から発現されうる、共有結合したV_H-V_Lヘテロ二量体である（例えば、Huston, et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879〜5883, 1988）。V_HおよびV_Lは、単一のポリペプチド鎖としてそれぞれに接続するが、V_HおよびV_Lドメインは、非共有結合によって会合する。または、抗体はもう一つの断片となりうる。組換え技術を用いることを含む他の断片も同様に、生成することができる。例えば、Fab分子は、鎖（重鎖または軽鎖）の一つがg3カプシドタンパク質に融合して、可溶性分子としてペリプラスムに相補鎖が輸送されれば、ファージ上に提示されうる。二つの鎖は、同じまたは異なるレプリコンにおいてコードされうる；それぞれのFab分子における二つの抗体鎖は、翻訳後に集合して、鎖の一つのgp3への連結によって二量体がファージ粒子に組み入れられる（例えば、米国特許第5733743号を参照されたい）。抗体V領域からの天然に凝集した、しかし化学的に分離した軽鎖および重鎖ポリペプチド鎖を、抗原結合部位の構造と実質的に類似の三次元構造に折り畳まれる分子に変換する、scFv抗体および多くの他の構造が当業者に公知である（例えば、米国特許第5,091,513号、第5,132,405号、および第4,956,778号を参照されたい）。特に好ましい抗体には、ファージ上に表示されている、または鎖が可溶性タンパク質、例えばscFv、Fv、Fab、pr(Fab')2として分泌される、ベクターを用いる組換え技術によって産生される、または鎖が可溶性タンパク質として分泌されるベクターを用いる組換え技術によって産生される抗体が含まれる。抗体にはまた、二抗体およびミニ抗体が含まれうる。

本発明の抗体にはまた、ラクダ科動物からの抗体のような、重鎖二量体が含まれる。ラクダ科動物における重鎖二量体IgGのVH鎖は、軽鎖と疎水性相互作用を形成しないことから、通常、軽鎖に接触する重鎖における領域は、ラクダ科動物において親水性アミノ酸残基に変化する。重鎖二量体IgGのVHドメインはVHHドメインと呼ばれる。

ラクダ科動物において、抗体レパートリーの多様性は、VHまたはVHH領域における相補性決定領域（CDR）1、2、および3によって決定される。ラクダのVHH領域におけるCDR3は、平均でアミノ酸16個というその比較的長い長さを特徴とする（Muyldermans et al., 1994, Protein Engineering 7(9):1129）。これは、他の多くの種の抗体のCDR3領域とは対照的である。例えば、マウスV_HのCDR3は平均でアミノ酸9個を有する。

ラクダ科動物の可変領域のインビボ多様性を維持する、ラクダ科動物由来抗体可変領域のライブラリは、例えば2005年2月17日に公表された米国特許出願第20050037421号において開示される方法によって作成されうる。

「V領域」は、B-細胞分化の際の重鎖および軽鎖V領域遺伝子の再配列の結果としてセグメントがVセグメントに付加される、CDR3およびフレームワーク4を含む、フレームワーク1、CDR1、フレームワーク2、CDR2、およびフレームワーク3のセグメントを含む抗体可変領域ドメインを指す。

「相補的可変領域」は、V領域と二量体を形成して、関心対象の抗原に特異的に結合する機能的結合断片を生じる領域を指す。相補的可変領域は、可変領域がV_H領域である場合、典型的にV_L領域である；または可変領域がV_L領域である場合には、V_H領域である。相補的可変領域はしばしば、関心対象の抗原に結合する参照抗体からのCDR3を含む。

「Vセグメント」という用語は、V遺伝子によってコードされるV領域（重鎖または軽鎖）の領域を指す。「D-セグメント」は、D-遺伝子によってコードされるV領域の領域（この場合、V領域におけるCDR3）を指す。同様に、「J-セグメント」は、J遺伝子によってコードされる領域を指す。これらの用語には、成熟の際に起こりうる様々な改変、付加、欠失、および体細胞変異が含まれる。

本明細書において用いられるように、「交換カセット」は、典型的に、共に天然に存在する少なくとも一つの無傷のフレームワーク領域に随伴した少なくとも一つの無傷のCDRを指す。「交換カセット」はまた、共に天然に存在する少なくとも一つのフレームワークに随伴する一つのCDRの少なくとも一部を指すことができる。他の態様において、交換カセットは、共に天然に存在する一つのFRの少なくとも一部に接合した少なくとも一つのCDRを指す。「交換カセット」はまた、共に天然に存在する少なくとも一つの部分的FRに随伴した少なくとも一つの部分的CDRを含みうる。「交換カセット」はまた、CDRの一つまたは複数が変異している合成ライブラリからも単離することができる。この場合、変異誘発の前のCDRとフレームワーク領域は、共に天然に存在する。

本発明の文脈における「部分的CDR」もしくは「CDRの一部」、または「部分的CDR配列」は、無傷のCDR配列のサブ領域、例えば交換カセットに存在する最小必須結合部位の外側のCDR領域を指す。このように、本発明の交換カセットは、「部分的」CDRを有しうる。ハイブリッドV領域における最終的な結果は、ハイブリッドCDRである。例えば、CDR2-FR3交換カセットには、CDR2-FR3交換に起因するハイブリッドV領域が、CDR2の一部が交換カセットに由来して、一部が参照抗体のCDR2に由来するCDR2を有するように、CDR2配列のサブ領域がCDR2-FR3交換カセットに存在する態様が含まれる。「部分的」CDR配列は、少なくとも20％、典型的に、無傷のCDRの少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、もしくは90％またはそれより多い連続残基のサブ領域を含む。

本発明の文脈において、「部分的FR」、「FRの一部」、または「部分的FR配列」は、交換カセットに存在する無傷のFRのサブ領域を指す。したがって、本発明の交換カセットは、部分的FRを有する交換カセットから生成されたハイブリッドV領域が、交換カセットに由来するそのFR配列の一部および参照抗体のV領域に由来するFRの一部を有するように、「部分的FR」を有しうる。「部分的」FR配列は、少なくとも20％、典型的に少なくとも20％、典型的に無傷のFRの少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、もしくは90％またはそれより多い連続残基のサブ領域を含む。

本明細書において用いられるように、「伸長カセット」は、さらなるフレームワーク領域を含む交換カセットを指す。このように、本明細書において、「伸長カセット」は、いずれも天然に存在する少なくとも一つのCDRおよび少なくとも二つのフレームワーク領域を有する交換カセットである。「伸長カセット」はまた、CDRの一つまたは複数が変異している合成ライブラリから単離することができる。この場合、変異誘発前のCDRおよびフレームワーク領域は共に天然に存在する。

交換および伸長カセットの文脈において用いられる「天然に存在する」とは、その成分が、組換え手段によって変更されていない単一の遺伝子によってコードされること、および未処置の細胞または抗原に曝露された細胞から作製された抗体ライブラリに既に存在することを意味する。

「対応する」交換カセットは、異なる抗体遺伝子または遺伝子セグメント（交換を受けるべき抗体と比較して）によってコードされるが、一般的な抗体構造に関してその抗体と同じCDRおよびフレームワーク領域である、CDRおよびフレームワーク領域を指す。例えば、CDR1-FR1交換カセットは、参照CDR1-FR1と比較して異なる抗体遺伝子によってコードされる「対応する」CDR1-FR1カセットによって置き換えられる。定義はまた、部分的CDR配列および／または部分的FR領域配列を有する交換カセットにも当てはまる。

「ハイブリッドV領域」は、少なくとも一つの交換カセットが、異なる抗体遺伝子または遺伝子セグメントからの対応する交換カセットによって置き換えられているV領域を指す。

「抗原」は、適当な条件で、特異的免疫応答を誘導することができ、その反応の産物、すなわち特異的抗体または特異的に感作されたT-リンパ球またはその双方と反応することができる物質を指す。抗原は、毒素および外来タンパク質のような可溶性物質、または細菌および組織細胞のような微粒子であってもよい；しかし、抗原決定因子（エピトープ）として知られるタンパク質または多糖類分子のごく一部が、リンパ球上で抗体または特異的受容体と連合する。より大まかに言えば、「抗原」という用語は、物質が免疫原性であるか否かによらず、それに対して抗体が結合する、またはそれに対する抗体が望ましい任意の物質を指すために用いてもよい。そのような抗原に関して、抗体は、如何なる免疫応答とも無関係に、組換え法によって同定されてもよい。

抗体の「結合特異性」は、それに対して抗体が結合する抗原の同一性、好ましくはそれに対して抗体が結合するエピトープの同一性を指す。

「キメラポリヌクレオチド」は、ポリヌクレオチドが野生型である領域と、変異している領域とを含むことを意味する。同様に、ポリヌクレオチドは、一つのポリヌクレオチドからの野生型領域と、もう一つの関連するポリヌクレオチドからの野生型領域とを含むことを意味してもよい。

「相補性決定領域」または「CDR」は、Kabat and Chothiaによって例示されるように当技術分野において認識されている用語を指す。CDRはまた、一般的に高度可変領域または高度可変ループとしても知られている（Chothia and Lesk (1987)J. Mol. Biol. 196:901；Chothia et al. (1989) Nature 342:877；E. A. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md.)(1987)；およびTramontano et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:175）。「フレームワーク領域」または「FR」は、CDRに隣接するVドメインの領域を指す。CDRおよびフレームワーク領域の位置は、当技術分野で周知の様々な定義、例えばKabat, Chothia, international ImMunoGeneTics database（IMGT）、およびAbM（例えば、Johnson et al., 前記；Chothia & Lesk, 1987, Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J. Mol. Biol. 196, 901〜917；Chothia C. et al., 1989, Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature 342, 877〜883；Chothia C. et al., 1992, structural repertoire of the human VH segments J. Mol. Biol. 227, 799〜817；Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol 1997, 273(4)を参照されたい）を用いて決定することができる。抗原連合部位の定義も同様に以下において記述される：Ruiz et al., IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res., 28, 219〜221(2000)；およびLefranc, M.-P. IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res. Jan l;29(l):207〜9 (2001)；MacCallum et al., Antibody-antigen interactions : Contact analysis and binding site topography, J. Mol. Biol, 262 (5), 732〜745 (1996)；およびMartin et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86, 9268〜9272 (1989)；Martin, et al., Methods Enzymol, 203, 121〜153,(1991)；Pedersen et al., Immunomethods, 1, 126, (1992)；およびRees et al., In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141〜172 1996）。

「エピトープ」は、抗体の可変領域結合ポケットと相互作用する結合相互作用を形成することができる抗原または他の高分子のその部分を指す。典型的に、そのような結合相互作用は、CDRの一つまたは複数のアミノ酸残基との分子間接触として現れる。しばしば、結合は、CDR3またはCDR3対を必然的に伴う。

「発現ベクター」には、その中に含まれる核酸配列、すなわちその中に配置された特定の核酸コードの発現を行うことができる任意の核酸配列（コード配列はその発現を行うことができる他の配列に機能的に連結している）を発現することができるベクターが含まれる。いくつかの発現ベクターは、宿主生物においてエピソームまたは染色体DNAの肝要な部分として複製可能である。有効な発現ベクターの有用な、しかし必ずしも必要ではない要素は、マーカーコード配列、すなわちそれによってタンパク質を含む細胞の表現型特性（例えば、テトラサイクリン抵抗性）が得られ、それによってそれらの細胞を容易に同定することができるタンパク質をコードする配列である。発現ベクターはプラスミドまたはウイルスの形であることが多い。しかし、本発明には、同等の機能を有し、いずれ当技術分野で公知となるであろう他の形のそのような発現ベクターが含まれると意図される。

「相同体」は、その一次、二次、または三次構造において対応する位置で同じまたは保存された残基を有するポリペプチドを意味する。この用語はまた、相同なポリペプチドをコードする二つまたはそれより多いヌクレオチド配列にも及ぶ。例としての相同なペプチドは免疫グロブリンアイソタイプである。

「宿主細胞」は、その中に本発明のベクターが導入、発現、および／または繁殖されてもよい原核細胞または真核細胞を指す。微生物宿主細胞は、細菌、酵母、顕微鏡的真菌、ならびに真菌および粘菌の生命サイクルにおける顕微鏡的相を含む、原核細胞または真核細胞微生物の細胞である。典型的な原核生物宿主細胞には、様々な株の大腸菌が含まれる。典型的な真核生物宿主細胞は、酵母もしくは糸状菌、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞、マウスNIH 3T3線維芽細胞、ヒト胎児腎193細胞、もしくは齧歯類の骨髄腫もしくはハイブリドーマ細胞のような哺乳動物細胞である。

「単離された」とは、核酸またはポリペプチドの天然の起源に存在する他の核酸またはポリペプチドのみならず、ポリペプチドから分離された核酸またはポリペプチドを指し、好ましくは通常同じ溶液に存在する溶媒、緩衝液、イオン、または他の成分のみ（もしあれば）の存在下で見いだされる核酸またはポリペプチドを指す。「単離された」または「精製された」という用語は、その天然の起源に存在する核酸またはポリペプチドを含まない。

「精製された」とは、表記の核酸またはポリペプチドが、他の生物学的高分子、例えばポリヌクレオチド、タンパク質等の実質的に非存在下で存在することを意味する。一つの態様において、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、存在する表記の生体高分子（しかし、水、緩衝液、および他の低分子、特に分子量1000ダルトン未満の分子は存在しうる）の重量で少なくとも95％、より好ましくは重量で少なくとも99.8％を構成するように精製される。

「組換え型核酸」は、天然において通常見いだされない形の核酸を指す。すなわち、組換え型核酸は、核酸に本来隣接しないヌクレオチド配列によって隣接される、または天然において通常見いだされない配列を有する。組換え型核酸は当初、制限エンドヌクレアーゼによる核酸の操作によって、またはポリメラーゼ連鎖反応のような技術を用いてインビトロで形成されうる。組換え型核酸が作成されて、宿主細胞または生物に再導入されると、これは、すなわちインビトロ操作よりむしろ宿主細胞のインビボ細胞機構を用いて、非組換え的に複製するであろうと理解される；しかし、そのような核酸は、一度組換えによって産生された後、非組換え的に複製されるが、なおも本発明の目的に関する組換え体であると見なされる。

「組換え型ポリペプチド」は、組換え型核酸から発現されたポリペプチド、またはインビトロで化学的に合成されたポリペプチドを指す。

「組換え型変種」は、組換えDNA技術を用いて作製された、アミノ酸挿入、欠失、および置換によって天然に存在するポリペプチドとは異なる任意のポリペプチドを指す。酵素活性または結合活性のような関心対象の活性を消失させることなく、どのアミノ酸残基を置換、付加、または欠失させるかを決定するための指針は、特定のポリペプチドの配列を相同なペプチドの配列と比較する段階によって、および高い相同性の領域においてなされたアミノ酸配列変化の数を最小限にする段階によって、見いだされる可能性がある。

好ましくは、アミノ酸「置換」は、一つのアミノ酸を、類似の構造および／または化学特性を有するもう一つのアミノ酸に置換した結果、すなわち保存的アミノ酸置換である。アミノ酸置換は、関係する残基の極性、荷電、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性特性における類似性に基づいて行ってもよい。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれる；極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれる；陽性荷電（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれる；ならびに陰性荷電（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。

「挿入」または「欠失」は典型的に、アミノ酸約1〜5個の範囲である。許容される変更は、組換えDNA技術を用いてポリペプチド分子にアミノ酸の挿入、欠失、または置換を系統的に作成する段階、および得られた組換え型変種を活性に関してアッセイする段階によって実験的に決定されてもよい。

または、機能の変更が望ましい場合、挿入、欠失、または非保存的変更を行って変更されたポリペプチドを産生することができる。そのような変更は、例えば本発明のポリペプチドの一つまたは複数の生物機能または生化学特徴を変更することができる。例えば、そのような変更は、リガンド結合親和性、鎖間親和性、または分解／代謝回転速度のようなポリペプチド特徴を変化させてもよい。さらに、そのような変更は、発現のために選択された宿主細胞における発現、規模拡大等にとってより適したポリペプチドを産生するように選択することができる。例えば、ジスルフィド架橋を消失させるために、システイン残基を欠失させる、またはもう一つのアミノ酸残基に置換することができる。

または、これらの同じまたは類似のポリペプチドをコードする組換え型変種を、遺伝子コードの「縮重」を利用することによって合成または選択してもよい。プラスミドもしくはウイルスベクターへのクローニング、または特定の原核もしくは真核細胞系における発現を最適にするために、様々な制限部位を産生するサイレント変化のような様々なコドン置換を導入してもよい。ポリヌクレオチド配列における変異は、ポリペプチドの任意の部分の特性を改変するために、リガンド結合親和性、鎖間親和性、または分解／代謝回転速度のような特徴を変化させるために、ポリペプチド、またはポリペプチドに付加された他のペプチドのドメインにおいて反映される可能性がある。

「レパートリー」または「ライブラリ」は、抗体、Fab、scFv、Fd、LC、V_H、もしくはV_Lのような抗体断片、または例えばヒトドナーに存在する抗体遺伝子の天然の集合体もしくは「レパートリー」から得られた、ならびに末梢血および脾臓の細胞から主に得られた可変領域のサブ断片、例えば交換カセットをコードする遺伝子のライブラリを指す。いくつかの態様において、ヒトドナーは、「非免疫」である、すなわち感染症状を呈しない。本発明において、ライブラリまたはレパートリーは、しばしば、V領域の所定の部分の交換カセットであるメンバーを含む。

「合成抗体ライブラリ」は、一つまたは複数の相補性決定領域（CDR）が、例えばオリゴヌクレオチド特異的変異誘発によって部分的または完全に変更されている、抗体、Fab、scFv、Fd、LC、V_H、もしくはV_Lのような抗体断片、または可変領域のサブ断片、例えば交換カセットをコードする遺伝子のライブラリを指す。「無作為化」は、CDRをコードする配列の一部または全てが、20個全てのアミノ酸またはいくつかのサブセットのアミノ酸を無作為にコードする配列によって置換されていることを意味する。

「標的」は、それに対して参照抗体が結合する分子を指し、「参照抗体」は、実践者がそれに対して「改善された」特徴を有する変種を得ようとする抗体である。このように、「標的」は、本明細書において「抗原」と同義で用いられる可能性がある。

「ベクター」は、DNA（RNA）配列からポリペプチドを発現させるためのプラスミド、ファージ、ウイルス、またはベクターである。ベクターは、（1）遺伝子発現において調節的役割を有する遺伝要素または複数の要素、例えばプロモーターまたはエンハンサー、（2）mRNAに転写されて、タンパク質に翻訳される構造またはコード配列、および（3）適当な翻訳開始および終止配列、のアセンブリを含む転写単位を含みうる。酵母または真核細胞発現系において用いることが意図される構造単位には、宿主細胞による翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列が含まれてもよい。

緒言
本発明は、参照抗体のV_HおよびV_L配列の一部を、ヒト抗体レパートリーからの配列と置き換えることによって、参照抗体の特異性を有する設計された抗体を生成するための方法を提供する。本発明はまた、異なる抗体クローンからのフレームワークおよびCDRの組み合わせ（「カセット」）を含むハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインを含む新規組成物を提供する。

参照抗体は、最適以下の親和性を有するヒト抗体となりえて、その場合、本発明の方法を用いて、親和性を増加させる、または免疫原性に関する可能性をさらに低減することができる。または、参照抗体は非ヒト抗体、例えばマウス抗体であってもよく、本発明の方法は、非ヒト抗体の特異性を有するヒトまたはヒト化抗体を誘導するために用いられる。本発明の抗体は、抗体配列のライブラリから迅速に単離されて、参照抗体の親和性を保持し、ヒト抗体V領域と高い程度の相同性を有する。しばしば、本発明の抗体は、参照抗体からのCDR3、またはCDR3のMEBSDを保持する。いくつかの態様において、抗体は、参照抗体からのCDR3対（すなわち、V_H CDR3およびV_L CDR3）を含んでもよい。

V遺伝子カセットライブラリ
重鎖および軽鎖の双方のV遺伝子セグメントは、フレームワークおよびCDRセグメントによって形成される多くのカセットを含むと見なされうる。このように、V_HおよびV_L遺伝子セグメントはそれぞれ、「最小のカセット」5個（CDR1、CDR2、FR1、FR2、およびFR3）を含む。本発明において、V領域は、交換カセットに、天然の順序で連結された少なくとも一つのCDRおよび少なくとも一つのFRが含まれる、二つまたはそれより多い最小のカセットを含む「交換カセット」で構成されると考えられる。このように、例えば、CDR1に関する交換カセットは、FR1-CDR1、またはFR1-CDR1-FR2からなってもよい。それぞれのV遺伝子セグメントには、適当な順序で少なくとも一つのフレームワークおよび一つのCDR（および3個未満のフレームワーク）からなるそのような交換カセットが9個存在する。

完全なV領域には、さらに二つの最小カセット、CDR3およびFR4が含まれ、これらはさらに別個の生殖系列遺伝子セグメント（V_HにおけるD-セグメントならびにV_HおよびV_Lの双方におけるJ-セグメント）の体細胞再配列および変異誘発によって形成される。CDR3関連交換カセットには、CDR3-FR4またはFR3-CDR3-FR4が含まれる。したがって、完全なV領域は、フレームワーク1〜3個およびCDR 1〜3個の交換カセットを全体で20個有する。

いくつかの態様において、伸長カセットは、本発明の置き換え法において用いられる。これらの伸長カセットは、少なくとも一つのCDRおよび天然に存在する、すなわち同じ遺伝子によってコードされるフレームワーク2個を有する。伸長カセットには、FR1-CDR1-FR2、FR2-CDR2-FR3が含まれ、CDR3配列の交換を伴う態様ではFR3-CDR3-FR4が含まれる。

一つまたは複数の交換カセットをコードする複数の配列、および参照抗体からの一つまたは複数のクローニングされたセグメントを含む新規抗体V領域のレパートリーは、組換えDNA技術によって構築することができる。そのようなレパートリーは、天然に存在せず、異なる抗体V遺伝子からの組換え配列を含むハイブリッドV領域をコードする。

可変領域の交換カセットを異なる遺伝子によってコードされる抗体からの対応する交換カセットに置き換える段階を含む方法は、連続的または同時に行うことができる。このように、一つの交換カセットが、他の抗体遺伝子からの配列の対応するライブラリに置き換えられている参照抗体を、異なる交換カセットが対応する交換カセット配列の異なるライブラリによって置き換えられて、抗原結合に関して選択されるのと同時に、抗原結合に関して選択することができる。または、一つの選択段階をもう一つの選択段階の後に行うことができる。

参照抗体配列のクローニングされたカセットおよびヒト免疫グロブリン由来配列のレパートリーを用いてライブラリを生成する。ヒトレパートリーは、末梢血または脾臓から得られたcDNAからの望ましいセグメントにとって適当であるプライマーを用いてPCR増幅によって産生することができ、この場合レパートリーは体細胞変異を有するクローンを含むと期待される。または、レパートリーは、非変異の生殖系列コード配列を得るために、非免疫系の細胞からのゲノムDNAの増幅によって得ることができる。

カセットライブラリは、多様な発現ベクターにおいて発現され、ウイルス、細胞、または胞子の表面上で提示されうる。ディスプレイシステムの例には、酵母、細菌、またはファージが含まれる。この場合、宿主細胞またはファージは、抗原結合抗体を発現するクローンを単離するために、標的抗原において選択される。

または、カセットライブラリを、可溶性抗体または抗体断片として発現させて、宿主細胞から分泌させることができる。例えば、ライブラリは、大腸菌または酵母からの分泌によって発現されうる、および抗原結合物質を発現する細胞のコロニーを、コロニーリフト結合アッセイによって明らかにする。任意の適した宿主細胞を用いることができる。そのような細胞には、原核細胞および真核細胞の双方、例えば細菌、酵母、または哺乳動物細胞が含まれる。

カセットライブラリを用いる抗体の設計
一つの局面において、本発明は、抗体を設計する方法、例えば参照抗体の重鎖または軽鎖の可変領域の一部を、様々な領域配列のレパートリーからの対応する配列に置き換える段階を必然的に伴う、抗体をヒト化する方法を提供する。例えば、ヒト化抗体は以下によって生成されうる：
抗体V遺伝子セグメントのレパートリーを構築する段階（レパートリーA）。レパートリーAは、ライブラリのそれぞれのメンバーが、完全なV遺伝子セグメントが生成されるように適当な位置で参照抗体からの交換カセットをコードする配列に融合されている、ヒト抗体配列のライブラリである。
レパートリーAの抗体V遺伝子セグメントを参照抗体からのCDR3配列およびFR4をコードする配列に融合させて、機能的V領域のレパートリーが生成されうるように、発現ベクターに挿入する段階（レパートリーB）。
レパートリーBを、クローニングした相補的V領域または相補的なV領域のレパートリーと対を形成させて、抗原に結合することができる機能的V_H-V_L二量体を含むレパートリーCを形成する段階。
V_H-V_L二量体が、宿主細胞から分泌される、または細胞表面上の融合タンパク質として提示されるように、宿主細胞においてレパートリーCを発現させる段階。
レパートリーCのV_H-V_L二量体を抗原に接触させて、抗原に結合するV_H-V_L二量体を発現するクローンを単離する段階。
フレームワークおよび一つまたは複数のCDRのそれぞれが、ヒトレパートリーに由来するように、段階5の抗原に結合することができる、ヒト化抗体V領域またはV領域のレパートリーを同定する段階（レパートリーD）。

参照抗体からの代用カセットがヒト配列に置き換えられるように、プロセスを繰り返してもよい。プロセスはまた、参照抗体のV遺伝子セグメントの全てまたは大きい割合がヒト配列によって置き換えられるように、連続的に置き換えられるように繰り返し行ってもよい。

一つの態様において、レパートリーAは、参照抗体からの機能的カセットと複数のヒト配列とを含むハイブリッドV_H遺伝子配列からなり、完全なV_Hドメインを生成する。この場合、相補的V領域はV_L領域である。

もう一つの態様において、レパートリーAは、ハイブリッドV_L配列からなり、相補的Vドメインは、V_Hドメインである。

V_H-V_L二量体は、機能的Fv断片からなってもよく、またはそれらはFab、Fab'、F(ab')₂、scFv、または免疫グロブリン全体のような、より長い抗体断片からなってもよい。V_H-V_L二量体はまた、例えば糸状バクテリオファージの表面上で融合タンパク質として発現されてもよい。好ましくは、V_H-V_L二量体は、発現されて宿主細胞から分泌され、可溶型の抗原に結合する。例えば、FabまたはFab'分子は、発現されて、大腸菌または酵母のような宿主細胞から分泌されうる。

ハイブリッドV遺伝子セグメントは、参照抗体からの交換カセットおよびヒト配列のレパートリーから完全なV遺伝子セグメントまで提供されるさらなるヒト配列からなる。好ましくは、参照抗体は、齧歯類抗体のような非ヒト抗体であるが、参照抗体はまたそれ自身ヒト抗体であってもよい。交換カセットは、天然の順序で連結された少なくとも一つのフレームワークと一つのCDRとを有し、フレームワークわずか2個およびCDR 2個を有する。しばしば用いられる交換カセットの例には、以下が含まれる：
FRl-CDRl
FRl-CDRl-FR2
FR2-CDR2-FR3
CDR2-FR3、または
FR3-CDR3。

いくつかの態様において、交換カセットにおけるCDRは、ハイブリッドCDRである。「ハイブリッドCDR」は本発明の文脈において、参照抗体からのMEBSDと、参照抗体のCDR配列とは異なるCDRにおけるさらなる配列とを含むCDRを指す。MEBSD配列の位置は、以下により詳細に記述される、アラニンスキャン、X-線結晶学、無作為点突然変異等が含まれるがそれらに限定されるわけではない一つまたは複数の方法によって経験的に決定されうる。MEBSDサブ配列は、CDR内の任意の位置に存在してよく、典型的にアミノ酸1個〜数個を含む。CDRカセットは、V_H-V_L内に含まれるCDR 6個のいずれかを用いて構築することができる。

CDR MEBSDを含むレパートリーライブラリを作製するために、いずれもMEBSDをコードして、最終的なCDRカセットのいくつかの部分がヒトIgレパートリーにおいて表される配列多様性を含むように、CDRの異なる領域からの生殖系列配列にアニールするヌクレオチドによってプライマーを設計する。カセットCDRに本来随伴する一つまたは双方のフレームワーク領域が、作製されたレパートリーに含まれる。次に、CDR-FRカセットレパートリーを、完全なV領域を作製するために必要な相補的配列と組み合わせる。相補的配列は、参照抗体配列または抗原結合を支持することが知られている他の交換カセットに由来しうる。CDR-FRカセットは、相補的なV_HまたはV_L鎖と共に発現ベクターに挿入される。

ハイブリッドV遺伝子セグメントをCDR3配列と組み合わせる
それぞれのハイブリッドV遺伝子セグメントを、典型的に参照抗体の対応する鎖からのCDR3配列および適したFR4セグメントと組み合わせて、完全なVドメインのアセンブリを可能にする。FR4は参照抗体からであってもよく、またはクローニングされたヒトJ-セグメント遺伝子、もしくはFR4配列のレパートリーからであってもよい。または、CDR3のMEBSDは、参照抗体から提供されてもよく、完全なヒトJ-セグメントを用いて、FR4の他にCDR3の一部を提供してもよい。

MEBSDはCDR3配列内の領域であるか、またはCDR3の残りとV領域の残りとを再構築するヒト配列と組み合わせた場合に、参照抗体の結合特異性を保持するために必要なCDR3の対である。MEBSDは、実験的に定義されうるか、または構造的検討から予測することができる。

実験的決定の場合、抗原に対する結合において役割を有する残基を同定するために、アラニンスキャン変異誘発のような方法を、参照抗体のCDR3領域に行うことができる（Wells, Proc. Natl Acad. Sci USA 93:1〜6, 1996）。さらなる分析には、単なるアラニンによる置き換えよりむしろ、その中でCDR3のそれぞれの残基が、一度に代用アミノ酸19個のそれぞれに置き換えられている包括的スキャン変異誘発が含まれうる。結合アッセイ、例えばコロニーリフト結合アッセイを用いて、結合特異性を保持する変異体を決定するために、そのような変異体のライブラリをスクリーニングすることができる。参照抗体と比較して少なくとも10倍低減されたアッセイシグナルを有する抗体断片を分泌するコロニーをシークエンシングして、そのDNA配列を用いて結合の保持にとって重要であるCDR3におけるアミノ酸の位置のデータベースを生成することができる。次に、一部位置換を認容しない、または保存的アミノ酸置換のみを認容する残基の組としてMEBSDを定義することができる。

MEBSDはまた、構造的検討から推理することができる。例えば、X-線結晶構造が公知である場合、または抗体と抗原の相互作用モデルが利用可能である場合、エピトープとの適した接触を形成するために必要な、および抗原結合表面の構造を保持するために必要なアミノ酸から、MEBSDを定義してもよい。

または、MEBSDは、CDR3の一次構造から予測してもよい。例えばV_Hドメインにおいて、MEBSDはいくつかの抗体において、D-セグメントに対応してもよい（参照抗体の再配列および成熟に起因する任意の欠失または同定可能なN-付加を含む）。この場合、J-セグメントはクローニングされたヒトJ-セグメントまたはJ-セグメントのレパートリーによって置き換えられてもよい。置換J-セグメントを有する改変された参照V_Hドメインの結合特異性を、適した相補的軽鎖と組み合わせて決定してもよい。この相補鎖は、参照抗体の軽鎖となりえて、または参照抗体の軽鎖のCDR3を含むヒト軽鎖となりうる。結合特異性は、コロニーリフト結合アッセイ、またはもう一つの公知のアッセイ方法論によって決定されうる。抗原結合抗体を分泌するコロニーがこのアプローチによって同定されない場合、参照抗体CDR3からのさらなる配列を、J-セグメントにおける対応する配列の代わりに置換して、MEBSAが同定されるまで相補的軽鎖によってこれらのさらなる変異体をスクリーニングしてもよい。

MEBSDは、軽鎖のCDRにおいて同様に同定されうるが、この場合スクリーニングアッセイにおいて用いた相補鎖はV_Hドメインを含む。この場合、V_Hドメインは、参照抗体に由来してもよく、または参照抗体からのCDR3を有するヒトV_Hドメインであってもよい。軽鎖にはD-セグメントが存在しないことから、スキャン変異誘発によって、またはCDR3の配列の検分およびV遺伝子セグメントによってコードされるCDR3におけるそれらの配列の置換またはJ-セグメントによってコードされるそれらの配列の置換によって、MEBSDを推定することができる。例えばコロニーリフト結合アッセイによる抗原結合に関するスクリーニングを用いて、CDR3のどのセグメントがMEBSDを構成するかを定義することができる。

さらに、JOINSOLVER（商標）Souto-Carneiro, et al., J. Immunol. 172:6790〜6802, 2004のようなソフトウェアプログラムを用いて、D生殖系列配列に関して検索するために免疫グロブリン遺伝子のCDR3を分析することができる。JOINSOLVER（登録商標）の戦略は、V_HおよびV_L生殖系列遺伝子に隣接するD生殖系列配列を検索することである。さらに、このプログラムはV_HDおよびDJ_H接合部におけるP-およびN-型付加を検索する。用いたヒトD生殖系列遺伝子データベースには、リバースおよびDIR生殖系列遺伝子と同様にIMGTデータバンクからの全てのDセグメントが含まれる。

このように、例えば本発明のハイブリッドV_Hドメインは、マウス抗体、ヒトレパートリーからの残りのV遺伝子配列、参照抗体からのD-セグメント、およびヒトJHセグメントのような参照抗体からの交換カセットを含んでもよい。第二の例において、ハイブリッドV_HまたはVドメインは、齧歯類参照抗体からの交換カセット、ヒトレパートリーからの残りのV遺伝子配列、参照抗体からのCDR3領域、およびヒトFR-4セグメントを含んでもよい。

もう一つの態様において、ハイブリッドV遺伝子セグメントは、二つまたはそれより多い異なるヒトV_HまたはV_L遺伝子からのヒト交換カセット全体を含んでもよい。このように、例えば、一つの交換カセットを一つのヒトV_H遺伝子から得てもよく、これを同じまたは異なるサブクラスの異なるヒトV_H遺伝子からの第二の交換カセットに融合してもよい。しばしば、機能的カセットはいずれも、配列が生殖系列であるか、または生殖系列に近い配列を有する。

抗原結合と適合性の機能的ヒトV遺伝子カセットを同定するための連続的置き換えは、完全なヒト配列による参照抗体のV遺伝子セグメントの急速な置き換えを許容する。二つまたはそれより多い異なる抗体遺伝子からの交換カセットを組換えできることによって、ヒトV遺伝子ライブラリから生成された配列の潜在的多様性が増加する。このアプローチによって、おそらく免疫原性の点突然変異を導入することなく、生殖系列において見いだされないさらなる配列多様性を生成するために、二つまたはそれより多い生殖系列カセットを組み換えすることが可能である。

選択された交換カセットを組み合わせる
いくつかの態様において、交換したカセットを含む抗体の選択には、複数の選択段階で交換カセットに同じフレームワーク領域が含まれるような段階が含まれ、例えば参照抗体からのFR1-CDR1-FR2を置き換える段階を行って、参照抗体からのFR2-CDR2-FR3を置き換える段階を同様に行う。これらの場合、選択された抗体が同定されて、次に、重なり合うフレームワーク領域（この場合、FR2）が組み合わさって、参照抗体の結合特異性を有する新しい抗体を作製する。重なり合うフレームワーク領域（すなわち、本実施例においてFR2）を組み合わせる段階は、高い相同性領域において独立して選択される二つのフレームワーク領域を組み合わせる段階、または組み入れるために一つもしくは他のフレームワーク領域を選択する段階を含みうる。フレームワーク領域を組み合わせる段階は、「設計された抗体」の章でさらに記述される。典型的に、二つのフレームワーク領域を組み合わせる場合、それらは、同じサブクラスのフレームワークである。したがって、それらは高い程度の相同性を有する（すなわち、典型的に80％より高い同一性）。

交換カセットを組み合わせる段階は、相同な領域間の組換えによって、または隣接するカセットを天然の順序で融合することによって、行うことができる。組換えは、宿主細胞における天然の組換えプロセスによって起こることが許容されうる、またはインビトロ分子生物学技術によって行うことができる。例えば、相補的カセットからの二つの相同な配列を制限酵素によって消化して、互いにライゲーションすることができる。または、望ましい組換え配列を設計して、合成DNAを用いて生成することができ、または当技術分野で公知の標準的な技術を用いて合成オリゴヌクレオチドを用いて集合させることができる。隣接する交換カセットの融合は、例えばPCRを用いる標準的な組換えDNA技術によって行われる。

CDR3を含むカセットの置き換えによるV領域の生成
先に示したように、完全なV領域は、V遺伝子セグメントには存在しないさらに二つの最小カセット（CDR3およびFR4）を有する。参照抗体からのこれらのさらなるカセットはまた、参照抗体の抗体結合特異性を保持しながらV領域が完全なヒト配列から生成されるように、ヒト抗体配列のライブラリからの配列によって置換されうる。

この場合、V遺伝子セグメントは最初に、先に記述した機能的カセットの連続的置き換えによってヒト化される。次に、ヒト化V遺伝子セグメントを用いて、ヒトCDR3およびFR4配列を含む配列のレパートリーの選択を誘導する。ヒト配列を含む少なくとも一つのCDR3を有するヒト化または完全なヒト抗体は、以下によって生成される：
上記のレパートリーDからのV遺伝子配列を得て、CDR3-FR4配列のライブラリからのCDR3配列およびFR4配列と組み合わせて、レパートリーEを形成する段階。
宿主細胞においてレパートリーEを発現させて、V_H-V_L二量体のレパートリーが生成されるように、一つまたは複数の相補鎖を同時発現させる段階。
V_H-V_L二量体を抗原に接触させて、抗原に結合するV_H-V_L二量体を単離する段階。

レパートリーDからのV遺伝子配列は、V_H配列であってもよく、この場合相補鎖はV_L鎖である。または、レパートリーDにおけるV遺伝子配列はV_L配列であってもよく、相補鎖はV_H鎖である。

CDR3-FR4配列のライブラリは完全にヒト起源であってもよく、または参照抗体から保持されたいくつかの配列を有するヒト配列を部分的に含んでもよい。例えば、J-セグメントコード領域の配列は、一つまたは多数のヒトJ-セグメントによって提供されてもよく、D-セグメントおよび任意のN-付加を含むCDR3の残りは参照抗体に由来してもよい。または、CDR3はランダム配列または合成配列を含んでもよい。

いくつかの態様において、CDR3-FR4領域は、FR3-CDR3-FR4領域によって含まれてもよい。そのような態様において、FR3は、例えば先に記述したようにCDR3-FR4領域を有するヒトレパートリーからであってもよい。

設計された抗体
本明細書に記述されるように設計された本発明の抗体は、一つの抗体遺伝子からの少なくとも一つの交換カセットと、もう一つの抗体遺伝子からの第二のカセットとを有する。二つまたはそれより多い交換カセットを組み合わせることによって形成される抗体は、天然に存在するヒト抗体、およびその配列に基づいて設計された、またはインビトロもしくはインビボで選択された他の形の抗体とは区別される。二つの交換カセットを組み合わせる段階によって、天然の抗体において見いだされないさらなる組み合わせ多様性が生成される。生殖系列交換カセットの組み合わせの場合、それぞれのカセットの起源は、ヒト生殖系列V領域配列のデータベースから容易に同定される。体細胞変異抗体からの交換カセットを含む組み合わせの場合、最も近いヒト生殖系列配列は、V領域配列のデータベースによって順にそれぞれの最小のカセットを比較することによって同定される。この手段によって、組み換えたV領域の構築において用いられる交換カセットを同定することができる。

全てのヒト生殖系列V領域遺伝子の配列が公知であり、MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, United Kingdomによって提供されたV-baseデータベースにおいてアクセスすることができる（Honegger & Pluckthun, J Mol. Biol. 309:657, 2001；Tomlinson, et al., J. Mol. Biol. 227:776, 2002；Cox, et al., Eur. J. Immunol. 24:827, 1994）。

本発明はまた、一つまたは双方のV領域における交換カセットのあいだの組換えによって生成された新規ヒト抗体を提供する。交換カセットの置き換えにより、異なるV遺伝子のあいだの組換えからさらなる多様性が提供される。カセットは、非ヒトおよびヒトカセットの組み合わせであってもよく、または完全にヒトであってもよい。

ヒトには生殖系列V_H遺伝子51個が存在し、これらのそれぞれを組換えすることができる。V_κ遺伝子は40個存在し、V_λ遺伝子は31個存在し、κおよびλ遺伝子のそれぞれを組換えすることができる。好ましくは、組換えは、同じサブクラスのメンバー間である。V_H生殖系列遺伝子はサブクラス7個（V_H1〜V_H7）にさらに細分されて、生殖系列軽鎖は、サブクラス16個（V_K1〜V_K6およびV_λ1〜V_λ10）に細分される。

機能的カセット間の組換えは、フレームワークの一つにおける相同な配列を用いて都合よく行われる可能性がある。例えば、同じV_Hサブクラス内の抗体のFR2領域は非常に相同である。ヒト生殖系列抗体のFR2領域配列を以下に示す。V_H2サブクラスの生殖系列抗体はFR2における同一のアミノ酸配列を有する。V_H3サブクラスにおいて、生殖系列抗体配列の22個中9個が、このサブクラスのコンセンサスと同一のアミノ酸配列を有する。ヒト生殖系列抗体51個中2個のみが、FR2におけるアミノ酸14個中複数個のアミノ酸によって、この特定のサブクラスに関するコンセンサスFR2配列とは異なっている。これらを以下の表1に示す。

（表１）ヒト生殖系列V_Hドメインのフレームワーク-2領域のアミノ酸配列。表における配列は複数のメンバーを有するサブクラスのみを表す。それぞれのサブクラスに関してコンセンサス配列との差を下線で示す。

さらに、V遺伝子セグメントは、ヒトとなりうる、またはヒトおよび非ヒト配列を含みうるCDR3-FR4カセットと組換えしてもよい。

このように、一つの態様において、V_HドメインまたはV_Lドメインは以下の要素を含む：
一つのヒト抗体遺伝子からのヒト交換カセットと、異なるヒト抗体遺伝子からの第二の交換カセットとを含むV遺伝子セグメント
参照抗体に少なくとも部分的に由来するCDR3
FR4配列。

しばしば、交換カセットの少なくとも一つは、ヒト生殖系列配列と同一である。この態様において、V_H-V_Lドメインは、相補鎖と対を形成して、定義された抗原に結合することができる機能的V_H-V_L二量体を形成する。相補鎖は典型的に、CDR3-対が抗原結合の特異性を定義するように、第一の鎖と同じ参照抗体に由来するCDR3配列を有する。最もしばしば、第二の鎖は、参照抗体からのCDR3と、ヒト生殖系列遺伝子のような単一の抗体クローンからの完全なV遺伝子セグメントとを有する。

もう一つの態様において、本発明は、以下を含む予め定義された特異性で抗原に結合することができるヒトV_H-V_L二量体を提供する：
生殖系列コードV遺伝子セグメント；参照抗体に由来するCDR3の一部；ならびにCDR3およびFR4配列を完全にするためのさらなる配列、を含む第一のV領域。
その少なくとも一つが生殖系列配列のカセットである組換えされた二つの交換カセットから構成されるV遺伝子セグメント；参照抗体に由来するCDR3の一部；ならびにCDR3およびFR4配列を完全にするためのさらなる配列、を含む相補的V領域。

一つの例において、第一のV領域は、V_H領域であり、参照抗体からのCDR3の部分は、予め定義された特異性の抗原に結合する齧歯類抗体からのD-セグメントである。この場合、相補的V領域はV_L領域であり、参照抗体からのCDR3の一部は、JL-セグメントに由来するV遺伝子となりうる、またはJL-セグメントの一部となりうる。

いくつかの場合において、参照抗体からの完全なCDR3を用い、この場合CDR3-対は、参照抗体のエピトープと同じエピトープにヒトV_H-V_L二量体の結合特異性を向けるために十分である。

異なるヒト抗体からの二つの交換カセットの組換えは、望ましい抗原に対して適した親和性の抗体を産生するために、天然のヒト生殖系列遺伝子において見いだされないが、体細胞変異を利用する必要のない、さらなる配列多様性に近づくために用いられる。そのような抗体は、完全に生殖系列免疫グロブリン配列を含むV遺伝子セグメントを有し、したがってヒトにおいて臨床で用いるために最小の免疫原性であると期待される。しかし、別個の2個の遺伝子の組み換えによって、「接合部エピトープ」、すなわち天然に見いだされず、異物T-細胞エピトープとしてT-細胞受容体によって認識されて、したがって免疫応答を誘発する可能性がある組換え部位での配列が導入されうる。しかし、組換え部位を適切に選択することによって、そのような接合部エピトープは、低減または全く回避される可能性がある。このように、例えば重鎖のV_H3サブクラスの異なるメンバーは、フレームワーク2において非常に相同であり、この領域での組換えを用いて、有意な接合T-細胞エピトープの生成を回避することができる。

ヒトVセグメントクローニング
交換カセットに対応するヒトVセグメントは、当技術分野で公知の技術を用いて読み取って（reading）得ることができる。例えば、生殖系列および親和性成熟の双方のVセグメントは、通常のcDNAクローニング法（Sambrook and Russell, eds, Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 3rd Ed, vols. 1〜3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）を用いて、多数の個体からプールした末梢血リンパ球（PBL）からのV領域レパートリーから得ることができる。PCRを用いて、クローニングにとって望ましいVセグメントを増幅してもよい。しかし、指数的増幅メカニズムは、無作為なバイアスがかかりがちであり、これは、多様なプライミング効率を有する縮重プライマーを用いることによって倍加し、多様性が有意に失われる可能性がある。このように、増幅が望ましい場合、インビトロ転写のようなプライマー非依存的リニア増幅法を用いることが望ましいかも知れない（Sambrook and Russell, eds, Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 3rd Ed, vols. 1〜3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）。

一つの態様において、mRNAは、標準的な方法（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc. New York, 1997）を用いてヒトPBLまたは脾臓のようなリンパ球に富む他の組織から単離される。

生殖系列ヒトVセグメント配列は、再配列されたまたは体細胞変異したVセグメント配列がcDNAからクローニングされる方法と同じ方法で、PCRまたはリニア増幅法によってヒトゲノムDNAからクローニングすることができる。

スクリーニング法
発現ベクターの選択に応じて、多くの異なるスクリーニング技法を用いることができる。ディスプレイスクリーニング法は当技術分野において周知である（例えば、先に引用した例示的なディスプレイ参考文献を参照されたい）。

一つの態様において、抗体レパートリーは、大腸菌（E. coli）においてFabまたはFab'断片として発現される。そのような抗体断片は、例えばコロニーリフトアッセイにおいて検出されうる。免疫グロブリンヒンジと共にFab'断片を用いることによって、一価のFab'分子と二価のF(ab')₂断片との混合物を生成することができる。F(ab')₂分子の存在は、それに対する二価の結合が抗体結合力に寄与して、このように検出アッセイにおけるシグナルの強度に寄与する可能性がある特定の抗原に対する抗体の検出において有利となる可能性がある。分泌された分子をコロニーリフトアッセイによってスクリーニングするための例示的なプロトコールを以下に簡単に記述する。

大腸菌からの抗体断片を発現させるためのベクターおよび方法は、当技術分野で公知である（例えば、Pluckthun, Methods 2:88〜96, 1991；Corisdeo and Wang, Protein Expr Purif. 34:270〜9, 2004；Humphreys et al., Protein Expr Purif. 26:309〜20, 2002）。重鎖および軽鎖は、異なる二つのプロモーター（tac、lac、またはAraプロモーターのような）から発現されうる、または二シストロニックメッセージから発現されうるが、その場合は単一のプロモーターが用いられる。それぞれの鎖は翻訳される。いくつかの態様において、分泌を指示するために、シグナルペプチドがペプチドに与えられてもよい。そのようなシグナルペプチドはPelBもしくはOmpAのような天然の原核細胞シグナルペプチドであってもよく、または非天然のシグナルペプチドであってもよい（例えば、米国特許出願第2002/0072093号）。

フィルター上にコーティングされた抗原に対する分泌された抗体断片の結合を検出するためのコロニーリフト結合アッセイも同様に公知である（例えば、Govannoni et al., Nucleic Acids Research 29:e27, 2001）。ライブラリスクリーニングの場合、ライブラリを、抗生物質を有するが、転写誘導物質を含まない固体培地において、150 mmプレートまたは同等物あたり〜10⁴個のみの密度で播種する。よって、10⁶個のライブラリの場合、これは150 mmプレートまたは同等物を少なくとも100個必要とする。一晩増殖後、得られたコロニーをニトロセルロースフィルターに乗せて、転写誘導物質、例えばlacプロモーターの場合はIPTGの存在下で新鮮な培地において数時間インキュベートする。抗原（0.5〜20μg/ml）をコーティングして、脱脂粉乳によってブロックし、および誘導物質を含む新鮮な固体培地に入れた第二のフィルター上に、フィルターをコロニー面を上にして移す。フィルターをさらに数時間インキュベートして、そのあいだに抗体は、コロニーから各コロニーの真下のフィルター上の抗原へと拡散する。次に、抗原をコーティングしたフィルターを処理して、抗原に結合した抗体を検出する。フィルターを洗浄して、各Fab上のエピトープタグに結合して、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）に共役する抗タグ抗体と共に数時間インキュベートする。共役は直接または間接的、例えばビオチン-ストレプトアビジンドッキングによって等であってもよい。未結合の抗タグ抗体／HRPを洗浄後、フィルターを、販売元によって処方された基質（ECL Plus reagent, Amersham Biosciences）の存在下でインキュベートして、結合したFabを、得られた化学発光の分光光度法またはオートラジオグラフィーによる検出によって検出および定量する。それぞれのフィルターは、コロニーを乗せたプレートの画像であることから、抗原結合Fabを産生するコロニーが容易に同定および回収される。CLBAに関する条件は、実験的に最適化してもよい。例えば、転写誘導因子は、汎用Fab結合因子、例えば抗ヒトIg抗体をフィルター上の抗原として用いた場合にFabライブラリの化学発光による例えば100％のバックグラウンドより10倍高い検出にとって必要な量を実験によって決定することによって、過剰発現または過小発現を回避するように最適化してもよい。

選択のストリンジェンシーも同様に、フィルター上の抗原の濃度を調節することによって操作することができる。例えば、ヒト化すべきFabが最小のシグナル、例えばバックグラウンドより10倍高いに過ぎないシグナルを産生する抗原濃度を決定して、より高い親和性および／またはより高い発現レベルを有するFabがそのシグナル強度によって容易に同定されるように、選択のために用いてもよい。発現レベルは、複製のコロニーリフトを作成して、抗ヒトIg抗体のような汎用Fab結合因子によってコーティングしたフィルター上でそれらをインキュベートすることによって同時に決定してもよい。次に、各コロニーに関する相対的親和性を、抗原フィルターからのその化学発光シグナル対Fab結合因子フィルターからのそのシグナルの比として決定して、比を互いに、および親の非ヒトFabに関する同じ比と比較して、選択されたFabを親和性に従って階数にすることができる。次に、絶対的な親和性を、いくつかの任意の方法、例えば表面プラズモン共鳴法（SPA, Fagerstam et al., 1992, J Chromatog 597:397〜410）によって決定してもよい。

親和性の決定
分泌された抗体の一次スクリーニングから単離された、またはディスプレイ技術から選択された抗体を、標的抗原に対する定量的親和性を決定するためにさらなる分析に供する。典型的に、抗体はこの目的のために可溶型で発現され、抗体が表面ディスプレイアプローチから融合タンパク質として当初単離された場合には、可溶性断片として、または全IgGとして再フォーマッティングを必要とする可能性がある。

親和性は、溶液中の抗体と、溶液中または細胞上のいずれかの未変性の抗原との相互作用を必要とする多様な競合結合試験によって、およびスキャッチャードプロットからの親和性の分析によって決定することができる。または、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）または表面プラズモン共鳴分析もしくは当技術分野で公知の多数の他のイムノアッセイ（例えば、Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999を参照されたい）によって、単離された抗原に関して親和性を決定してもよい。Harlow & Laneおよび類似の技法マニュアルはまた、エピトープをマップするための技術、またはドナー抗体と同じエピトープに抗体が結合するか否かを決定するための競合実験を開示する。

第一のスクリーニング段階、例えば、抗体配列の残りが参照抗体である一つの交換カセットの置き換えを分析するスクリーニング、抗体に対して証明可能な親和性を有する抗体が選択される。親和性は参照抗体より低くてもよい。

本発明の抗体は典型的に、高親和性抗体であり、50 nM〜1 pMの範囲で一価の解離定数を有してもよい。好ましくは、抗体は10 nM未満の、および最も好ましくは1 nM未満の一価の親和性を有する。

抗体は、好ましくは参照抗体より5倍低いに過ぎない親和性を有し、最も好ましくは参照抗体より高い親和性を有する。

実施例
V _H またはV _L カセットライブラリの構築およびスクリーニング
参照抗体の一部を、ヒトV領域レパートリーから作製したカセットライブラリと組換えすることによって、ハイブリッドV領域を作製する。組換えプロセスは典型的に、当業者に周知の技法であるオーバーラップ伸長PCR（Mehta, RK and Singh, J., Biotechniques 26:1082〜1086,1999）によって行われる。ハイブリッド鎖はV_HまたはV_Lのいずれかとなりうる。ヒトVセグメントレパートリーは、末梢血または脾臓における細胞を含む多数のIg産生B細胞のいずれかから単離されたmRNAによってコードされたVセグメントに由来しうる。V_HまたはV_Lカセットライブラリは、参照抗体、ヒト鎖、またはヒト-参照ハイブリッド鎖のいずれかからとなりうる相補鎖と対を形成して、これを標的抗原に対する結合に関して試験することができる。

交換カセットライブラリは典型的に、PCRの2回またはそれより多いラウンドによって作製される。第一段階において、参照抗体の配列を用いて、N-末端またはC-末端領域、および組み換えたライブラリにおける全ての分子に対して共通となるV領域内の一つの領域または複数の領域（典型的にCDR）に対するPCRプライマーを設計する。V領域ファミリーにおいて見いだされるヌクレオチドおよびアミノ酸配列保存を利用して、ヒトV領域レパートリーに対して相補的であるPCRプライマーも同様に設計される。レパートリープライマーは、配列の不均一性を説明するために一つまたは複数の位置で縮重しうる。プライマーまたはプライマーの組は、一つまたは複数のV領域ファミリーを増幅するように設計することができる。

実施例1．FR1-CDR1-FR2交換カセット
例として、三つのPCR反応を用いてハイブリッドV領域を作製する。第一のPCRは、プライマーAおよびBを用いてヒトVセグメントレパートリーからヒトFR1-CDR1-FR2領域を増幅する（図1a）。プライマーAは、全ての生殖系列V_L領域を増幅するように設計されたN-末端プライマーの組の一つまたは複数から選択される（Welschof, M. et al, J. Immunological Methods 179: 203-214, 1995）。さらに、発現ベクターにその後クローニングするために、プライマーAの5'末端に制限酵素部位を付帯させる。プライマーBは、ヒトFR2の中央またはC-末端で保存領域と相補的な一つまたは複数のプライマーである；相補性領域は典型的に、12〜15ヌクレオチド（nt）であり、これにはヒト生殖系列における不均一性を説明するために縮重位置が含まれうる。

さらに、プライマーBは、その5'末端で参照抗体の12〜15ヌクレオチドと相補的な12〜15ヌクレオチドの領域を有する。第二のPCRは、プライマーCおよびDを用いて参照抗体のCDR2-FR3-CDR3-FR4領域を増幅するものであり（図1b）、プライマーCおよびDは、参照抗体の公知のヌクレオチド配列を用いて設計されている。典型的に、プライマーDは発現ベクターへのその後のクローニングのためにその5'末端に付帯された制限部位を有する。PCR反応は標準的な条件（例えば、94℃で10秒間、50℃で1分、および72℃で30秒間を12〜25サイクル繰り返す）を用い、得られた断片を増幅プライマーA、B、CおよびDからゲル精製して、産物の収量を定量する。第三および最終的なPCRにおいて、等モル量の二つのPCR産物を混合して、標準的なサイクリング条件を用いてプライマーAおよびプライマーDによって増幅する。プライマーBおよびCの相補的領域はアニールして、ヒトレパートリーFR1-CDR1-FR2と参照抗体CDR2-FR3-CDR3-FR4とのハイブリッドである連続V領域の合成を支持する（図1c）。プライマーAおよびD上の制限部位を用いてハイブリッドV領域ライブラリを発現ベクターにクローニングして、典型的にクローン10,000個をさらなる分析のために単離する。

FR1-CDR1-FR2交換カセットの具体例は以下のとおりである。FR1-CDR1-FR2配列のヒトレパートリーを、抗ヒトサイトカイン抗体19のマウスCDR2-FR3-CDR3-FR4領域に付帯させて、抗原結合を支持するヒトFR1-CDR1-FR2交換カセットをレパートリーから選択した。プライマーAはヒトVkI V領域のN-末端に関して特異的であり；BssHII部位は、プライマーAに付帯されて、発現ベクターへのクローニングのために用いられた。プライマーBは、ヒトFR2レパートリーのC-末端にアニールする三つのプライマーの混合物である。マウス抗体19 CDR2配列のさらなる15ヌクレオチドが、最終的なV領域を構築するために用いたオーバーラップ伸長PCRにおいてプライマーCにアニールする領域として、プライマーBの5'末端に付加された。プライマーCは、マウス抗体19 V_LのCDR2にアニールして、プライマーBを含む配列の5'末端と重なりあう。プライマーDは、マウスFabのFR4にアニールし、かつ、発現ベクターへのクローニングのために用いるSpeI部位が付帯されている。

第一のPCRにおいて、プライマーAおよびBを用いて、末梢血および脾臓に由来するヒト免疫Igレパートリーの第一鎖cDNAからヒトFR1-CDR1-FR2交換カセットを増幅した。第二のPCRにおいて、マウス19 V_L CDR2-FR3-CDR3-FR4を増幅した。等モル量の二つのPCRを混合して、最終的なV領域を構築するためにプライマーAおよびDによって増幅した。ヒトレパートリーFR1-CDR1-FR2交換カセットのライブラリはこのように構築された。マウス抗体19 CDR3-FR4を含むヒト生殖系列Vh1-02重鎖を、相補鎖のために用いた。

得られた組換え型抗体約10,000個を、ヒトサイトカインタンパク質を標的抗原として用いるコロニーリフト結合アッセイ（CLBA）において試験した。抗原に結合する二つのクローン、FB27-A11およびFB27-A12を選択した。それぞれは、マウスCDR2-FR3-CDR3-FR4配列に随伴するヒトVkI FR1-CDR1-FR2配列であった。FB27クローンは、ELISAアッセイにおいてヒトサイトカイン抗原に結合することが示された。

実施例2．FR2-CDR3-FR3交換カセット
本発明のもう一つの態様において、ヒトFR2-CDR2-FR3レパートリーを、参照抗体のFR1-CDR1およびCDR3-FR4領域と組み換える。本実施例において、三つのPCR反応を行って、最終的なハイブリッドV領域を得る。ヒトV領域レパートリーは、それに対して参照抗体のCDR3-FR4領域が標準的な組換えDNA技法によって付帯されているヒトVセグメントのライブラリから得られる。プライマーAおよびプライマーB（図2a）は、V領域のN-末端および参照抗体のCDR1のC-末端領域と相補的となるように設計される；典型的に、発現ベクターへのその後のクローニングのために、プライマーAの5'末端に制限部位が付帯される。第一のPCR反応に関して、プライマーAおよびBを用いて、PCRの標準的なサイクリング条件を用いて、参照抗体のFR1-CDR1領域を増幅する。得られたPCR産物をプライマーAおよびBからゲル精製して、定量する。第二のPCR反応に関して、V領域ヒトIgレパートリーのFR2領域と相補的となるように、プライマーC（図2b）を設計する；プライマーBのいくつかの位置は、ヒト生殖系列ヌクレオチド配列における変動の原因となるよう縮重してもよい。さらに、オーバーラップ伸長PCRを促進するために、参照抗体のCDR1の最後の12〜18ヌクレオチドと相補的な12〜18ヌクレオチドの配列が、プライマーCの5'末端に付帯される。プライマーD（図2b）は、FR4の3'末端と相補的である；典型的に、発現ベクターへのその後のクローニングのためにプライマーDの5'末端制限部位が付帯される。プライマーCおよびDを用いて、PCRの標準的なサイクリング条件を用いて、ヒトレパートリーFR2-CDR2-FR3とヒトV領域レパートリーライブラリからの参照CDR3-FR4領域を増幅する。得られたPCR産物をプライマーCおよびDからゲル精製して、定量する。第三および最終的なPCRにおいて、等モル量の第一および第二のPCR産物を混合して、標準的なサイクリング条件を用いてプライマーAおよびプライマーDによって増幅する。プライマーBおよびCの相補的領域はアニールして、参照V領域FR1-CDR1、ヒトレパートリーFR2-CDR2-FR3、および参照V領域CDR3-FR4のハイブリッドである連続V領域の合成を支持する（図2b）。ハイブリッドV領域ライブラリを、プライマーAおよびDにおける制限部位を用いて発現ベクターにクローニングして、典型的にクローン10,000個をさらなる分析のために単離する。

具体例として、マウス抗サイトカイン抗体19のV_Lにおいて、ヒトFR2-CDR2-FR3交換カセットレパートリーを構築した。プライマーAは、マウスV_LのN-末端領域と相補的であり、発現ベクターへのクローニングのために5'末端に付帯されたBssHII部位を有する。プライマーBは、マウス抗体19 V_L CDR1の最後の18ヌクレオチドと相補的である。プライマーCは、VkI FR2ヒトレパートリーのN-末端領域とアニールする；その5'末端において、プライマーBと相補的な18ヌクレオチドの領域が付帯されている。プライマーDは、マウス19 V領域のC-末端にアニールし、かつ、発現ベクターへのクローニングのために用いられるSpeI部位が付帯されている。

第一のPCRにおいて、プライマーAおよびBを用いてマウスFR1-CDR1領域を増幅する。第二のPCRにおいて、プライマーCおよびDを用いて、ライブラリのそれぞれのメンバーがマウス抗体19 V_L CDR3とマウスまたはヒトのいずれかの生殖系列FR4とを含むヒトV領域ライブラリからのFR2-CDR2-FR3レパートリーを増幅する。第三のPCRにおいて、等モル量の最初の二つのPCR反応物をプライマーAおよびDによって増幅して、ヒトFR2-CDR2-FR3交換カセットV領域レパートリーの構築を完成させる。マウス19 CDR3-FR4領域を含むヒト生殖系列Vh1-02重鎖を相補鎖のために用いた。

得られた組換え型抗体約10,000個を、標的抗原としてヒトサイトカインタンパク質を用いてコロニーリフト結合アッセイ（CLBA）において試験した。標的抗原に結合する組換え型抗体4個、FB25-6-1、FB25-D3、FB25-E1、およびFB26-E9を回収して精製した。クローンのうち2個は、マウスFR1-CDR1およびCDR3-FR4配列に随伴したヒトVkI FR2-CDR2-FR3配列であった。他の二つのクローンは、マウスFR1-CDR1およびCDR3-FR4配列に随伴したヒトVkIII FR2-CDR2-FR3配列であった。VkIII FR2-CDR2-FR3交換カセットは、プライマーCがヒトVkIII Vセグメント配列に交叉ハイブリダイズすることから、ライブラリに含まれた可能性が高い。FB25およびFB26クローンは、ELISAアッセイにおいてヒトサイトカイン抗原に結合することが示された。

実施例3．FR3-CDR3-FR4ライブラリ
FR3-CDR3-FR4ライブラリは、V_HまたはV_Lのいずれかに由来することができ、以下のように構築される。免疫レパートリーを発現する細胞、例えば末梢血または脾臓からのB細胞に由来するmRNAから標準的な技法を用いて第一鎖cDNAを調製する。FR1からFR3までの領域を含むVセグメントcDNAライブラリを、PCRによって第一鎖cDNAから調製する。FR1のN-末端領域でのフォワードプライマー、およびFR3のC-末端領域からのリバースプライマーを用いて、cDNAをPCRによって増幅する。Vセグメントファミリーにおいて見いだされるヌクレオチドおよびアミノ酸配列保存を利用して、ヒトVセグメントレパートリーと相補的となるようにPCRプライマーを設計する。レパートリープライマーは、配列の不均一性の原因となるよう一つまたは複数の位置で縮重しうる。プライマーまたはプライマーの組は、一つまたは複数のVセグメントファミリーを増幅するように設計することができる。

参照CDR3およびFR4を含むV領域ライブラリを最初に構築する。参照抗体のCDR3-FR4領域を、適合する制限部位によるライゲーションを含むいくつかの方法の一つ、またはオーバーラップ伸長PCRによってVセグメントレパートリーに付着させる。FR4領域は参照抗体と同じとなりうる、または参照およびヒト生殖系列J領域が異なる残基において、ヒト生殖系列配列に変換されうる。

FR3-CDR3-FR4レパートリーは、以下のように3回のPCR反応によって構築される。第一のPCRにおいて（図3a）、プライマーAおよびプライマーBを用いて、参照抗体のFR1-CDR1-FR2-CDR2領域を増幅する。典型的に、プライマーAは、発現ベクターにクローニングするために付帯された制限部位を有する。第二のPCRにおいて、FR3-CDR3-FR4レパートリーは、FR3のN-末端に対するフォワードプライマー、およびFR4のC-末端に対するリバースプライマーDを用いた第一のPCRによって構築されたV領域ライブラリに由来しうる。典型的に、PCRプライマーは、長さが15〜20ヌクレオチドであり、フォワードプライマーCは、オーバーラップ伸長PCRのために用いられるその5'末端で参照CDR2の12〜15ヌクレオチドの領域を有する。プライマーCは、一つまたは複数のメンバーを含んでもよく、これらの位置でヒト生殖系列における配列の不均一性を反映するために一つまたは複数の位置で縮重してもよい。典型的に、プライマーDは、発現ベクターにクローニングするために付帯された制限部位を有する。PCR反応は標準的な条件（例えば、94℃で10秒間、50℃で1分間、および72℃で30秒間を12〜25サイクル繰り返す）を用い、得られた断片を、増幅プライマーA、B、C、およびDからゲル精製して、産物の収量を定量する。第三のPCRにおいて、等モル量の最初の2回のPCR反応物をプライマーAおよびDによって増幅して、ヒトFR3-CDR3-FR4レパートリーの構築を完成させる。FR3-CDR3-FR4ヒトIgレパートリーは、FR3が多様であり、CDR3-FR4領域が共通である。FR3-CDR3-FR4ライブラリを発現ベクターにクローニングして、相補的なV_HまたはV_L鎖と同時発現させる。V_HまたはV_L鎖は、参照抗体に由来しうるか、または設計されたヒト鎖となりうる。

ヒトサイトカインタンパク質に結合するマウス参照抗体クローン10のV_HまたはV_L鎖の双方に関してFR3-CDR3-FR4ライブラリを作製した。V_HまたはV_L鎖の双方に関して得られた組換え型抗体約10,000個を、標的抗原としてヒトサイトカインタンパク質を用いてコロニーリフト結合アッセイ（CLBA）において試験した。標的抗原に結合するVH FR3-CDR3-FR4ライブラリからの二つの組換え型抗体、B-17-11-H1、およびB-17-15-H5を回収して精製した。標的抗原に結合するV_L FR3-CDR3-FR4ライブラリからの二つの組換え型抗体、B-18-17-H7、およびB-18-20-H10を回収して精製した。V_HまたはV_Lクローンは全て、ヒト生殖系列FR3配列と類似、および時に同一のFR3配列を有した。V_HまたはV_L鎖の双方に関するB抗体クローンは、ELISAアッセイにおいてヒトサイトカイン抗原に結合することが示された。

実施例4．CDR3-FR4置き換え
参照抗体のCDR3-FR4領域を、ヒトレパートリーから選択されたCDR3-FR4交換カセットによって置き換えることができる。CDR3-FR4ライブラリは、参照抗原に結合することが知られているV領域に由来するVセグメントの一つまたはプールに融合させることができる。第一のPCRにおいて、プライマーAおよびB（図4a）を用いて、参照抗体からの、または標的抗原に結合することが知られている設計されたヒトVセグメントのいずれかからのVセグメントを増幅する。図4aにおいて、プライマーAは、V領域のN-末端にアニールして、典型的に発現ベクターにクローニングするために5'末端に付帯された制限部位を有する。プライマーBは、FR3のC-末端にアニールして、PCR産物をCDR3-FR4交換カセットレパートリーに付着させるためにそれに付帯した制限部位を有する。第二のPCRにおいて、プライマーCおよびD（図4b）を用いて、末梢血リンパ球および／または脾臓リンパ球に由来するヒトIgレパートリーmRNAからのCDR3-FR4交換カセットを増幅する。プライマーCは、FR3に、またはFR3とCDR3の一部にアニールする。プライマーCはまた、CDR3-FR4交換カセットライブラリをVセグメントに融合させるために用いることができる制限部位を含む。プライマーDは、ヒトV領域のC-末端にアニールする一つまたは複数の配列を含む；プライマーDは、ヒトJ-領域レパートリーにおいて配列の多様性を反映する一つまたは複数の位置で縮重ヌクレオチドミクスを含んでもよい。さらに、プライマーDは、得られたV領域を発現ベクターに挿入するために用いることができる制限部位を含む。

具体例として、設計されたヒト抗サイトカイン抗体19のマウスV_L CDR3-FR4領域を、ヒトCDR3-FR4交換カセットに置き換えた。プライマーAは、相補的V_Hと対を形成した場合にそのそれぞれがヒトサイトカインに結合する、設計されたヒトV_L鎖プールであるFB39-3、FB38-4、FB44-15、およびFB44-16のN-末端領域に結合する。プライマーAは、発現ベクターにクローニングするために用いられるBssHII制限部位を含む。プライマーBは、FB39-3、FB38-4、FB44-15、およびFB44-16のプールのそれぞれのV_Lに関してFR3のC-末端にアニールする。プライマーBは、CDR3-FR4交換カセットライブラリに対するVセグメントのライゲーションを促進するためにBst1107I制限部位を含む。プライマーCは、VkIII V_LファミリーのヒトFR3にアニールする。プライマーDは、ヒトJk1、Jk2、Jk3、Jk4、およびJk5 J-領域に関するFR4配列にアニールする三つのプライマーを含む。プライマーDは、発現ベクターにV領域をクローニングするために用いられるSpeI部位を含む。

第一のPCRにおいて、プライマーAおよびBを用いて、マウス参照抗体19 CDR3-FR4を含む四つの設計されたヒトV_L鎖のプールからVセグメントを増幅する。V_L鎖は、参照V_H CDR3および設計されたヒトFR4が付着する相補的ヒト生殖系列Vh1-02重鎖と対を形成した場合に、ヒトサイトカイン抗原に結合することが知られている。第二のPCRにおいて、プライマーCおよびDを用いて、ヒト脾臓第一鎖cDNAからのCDR3-FR4交換カセットを増幅する。第一および第二の反応からのPCR産物をBst1107Iによって消化して、ゲル精製し、標準的な技法を用いて共にライゲーションする。得られたライゲーション産物をBssHIIおよびSpeIによって消化して、発現ベクターに挿入する。ヒト生殖系列Vh1-02重鎖、マウス19 CDR3およびヒト生殖系列FR4を含むVセグメントを、相補鎖のために用いた。

得られた組換え型抗体約10,000個を、標的抗原としてヒトサイトカインタンパク質を用いるコロニーリフト結合アッセイ（CLBA）において試験した。標的抗原に結合する一つの組換え型抗体、FB67-2を回収して精製した。CDR3-FR4交換カセットは、参照CDR3-FR4とは異なるアミノ酸配列であり、ヒトVLのVkIIIサブクラスに由来するように思われた。FB67-2クローンは、ELISAアッセイにおいてヒトサイトカイン抗原に結合することが示された。

実施例4．CDR2-FR3カセット
先の実施例は、完全なCDR領域および少なくとも一つの随伴するフレームワークを含む交換カセットを記述する。または、CDRカセットは、CDR領域の残りを含むレパートリーライブラリと共に参照抗体に由来するCDRのサブ配列を含みうる。

具体例として、ヒトサイトカインに結合するマウス参照抗体クローン10のV_H CDR2-FR3領域に関してカセットライブラリを作製した。クローン10 Vh CDR2は、長さがアミノ酸17個であり、そのアミノ酸配列はヒトVh3サブクラスに最も類似している。MEBSDは、点突然変異を用いて経験的に定義された。参照CDR2の1〜6位における全ての変更によって、結合活性の完全な喪失が起こったが、7〜17位でのアミノ酸置換は抗原結合を消失させなかった。

図5に示すように5回のPCR反応によって、CDRカセットライブラリを含むV領域を構築する。PCR反応は標準的な条件（例えば、94℃で10秒間、50℃で1分間、および72℃で30秒間を12〜25サイクル繰り返す）を用い、得られた断片を増幅プライマーからゲル精製して、産物の収量を定量する。第一のPCR反応はプライマーAおよびBによって行う。プライマーAは、ヒトVh3ファミリーのほとんどの生殖系列CDR2配列にアニールする下流の13ヌクレオチドに沿ってMEBSDをコードするヌクレオチド配列を含む。プライマーBは、FR3のC-末端にアニールして、Vh3レパートリーのヒト生殖系列配列を捕獲するように設計される。プライマーAおよびBを用いて脾臓の第一鎖cDNAからヒトIgレパートリーを増幅して、それによってCDR2-FR3交換カセットライブラリが得られる。第二のPCR反応において、プライマーCおよびDを用いて、相補的V_Lと対を形成した場合に標的抗原に結合することが知られているV_H鎖からヒトFR1-CDR1-FR2を増幅する。プライマーCは、発現ベクターに最終的なV領域をクローニングするために用いられる制限部位を含む。プライマーDは、オーバーラップ伸長PCRを促進するためにプライマーAと相補的な領域を含む。第三のPCRにおいて、プライマーEおよびFは、参照V_Hの、または相補的VLと対を形成した場合に抗原結合を支持することが知られている設計されたヒトV_Hの、いずれかのCDR3-FR4領域を増幅するように設計される。プライマーEは、オーバーラップ伸長PCRを促進するためにプライマーBと相補的な領域を有する。プライマーFは、V領域を発現ベクターにクローニングするために用いられる制限部位を含む。

第四のPCRにおいて、第一および第二のPCR反応の等モル量を、プライマーCおよびBと共にPCR反応に含める。得られた断片を増幅プライマーBおよびCからゲル精製して、産物の収量を定量する。最終的なPCR反応において、第四および第三のPCR反応物の等モル量を合わせて、プライマーCおよびFによって増幅して、最終的なV領域を構築する。PCR産物を精製して、プライマーCおよびFに含まれる部位を切断する制限酵素によって消化する。CDR2-FR3カセットライブラリを、相補的V_L鎖と共に発現ベクターに挿入する。典型的に、メンバー10,000個のライブラリをCLBAによって抗原の結合に関してスクリーニングする。

CDR2-FR3カセットライブラリを、標的としてヒトサイトカイン抗原を用いてCLBAによってスクリーニングした。ELISAアッセイにおいて試験した場合にヒトサイトカインタンパク質に対する結合を示す、B180-27-4B、B180-32-6F、B180-33-7BおよびBl80-34-7Fを含むいくつかの抗体を精製した。

実施例4．繰り返し交換カセット構築およびスクリーニング
先の実施例は、ヒトIgレパートリーライブラリと、参照抗体からの共通の配列とのハイブリッドである交換カセットライブラリの構築を記述している。共通の配列が参照抗体由来ではなく、むしろ選択された交換カセットまたは選択された設計ヒトV領域由来である交換カセットライブラリも同様に、構築することができる。そのような繰り返し交換カセット戦略は、V_HまたはV_Lのいずれに関しても用いることができる。反復交換カセットライブラリを発現ベクターにクローニングして、相補的V_HまたはV_L鎖と同時発現させる。相補的V_HまたはV_L鎖は、参照抗体、または設計されたヒトV領域のいずれかに由来しうる。

具体例として、FR2-CDR2-FR3のヒトIgレパートリーライブラリを、選択されたFR1-CDR1-FR2交換カセットと接合させた；接合領域はFR2内の共通の配列であった。構築は、図6に示すように、3回のPCR反応によって行った。参照抗体19は、ヒトサイトカイン抗原に結合する。ヒトサイトカイン抗原に対する結合を示すFab（FB42-8）からV_H-領域を選択した。V_H領域は、参照CDR3およびヒト生殖系列FR4に接合したヒトVセグメントを含んだ。第一のPCR（図6a）において、プライマーAおよびプライマーBを用いてFB42-8からのFR1-CDR1-FR2カセットを増幅した；プライマーBは、FR2のC-末端にアニールした。プライマーAは、発現プラスミドへのクローニングのために用いられる制限部位を含む。第二のPCR反応において（図6b）、プライマーCおよびプライマーDを用いて参照CDR3およびヒト生殖系列FR4を含むV_H-領域ライブラリからFR2-CDR2-FR3領域を増幅した。プライマーCは、FR2のC-末端にアニールするものであり、プライマーBの相補的配列である。典型的に、プライマーDは、発現ベクターへのクローニングのために付帯された制限部位を有する。PCR反応は標準的な条件（例えば、94℃で10秒、50℃で1分、および72℃で30秒を12〜25サイクル繰り返す）を用い、得られた断片を増幅プライマーA、B、CおよびDからゲル精製して、産物の収量を定量する。第三のPCRにおいて、最初の2回のPCR反応物の等モル量を、プライマーAおよびDによって増幅して、ヒトFR2-CDR2-FR3交換カセットレパートリーを含むV領域の構築を完成させる。FR2-CDR2-FR3交換カセットライブラリを発現ベクターにクローニングして、相補的な設計ヒトV_L鎖と同時発現させた。

FR2-CDR2-FR3交換カセットライブラリに関して得られた組換え型抗体約10,000個を、標的抗原としてヒトサイトカイン抗原を用いてコロニーリフト結合アッセイ（CLBA）において試験した。ELISAアッセイにおいてヒトサイトカイン抗原に対する結合を示すFab 3個（FB48-12、FB48-18、およびFB48-20）を選択した。

実施例5．カセットの再構築
先の実施例において記述された交換カセットは、ヒトと参照配列とのハイブリッドであった。完全な、または部分的なヒトV領域を作製するために、選択されたヒト交換カセットを組換えすることができる。典型的に、Fabから選択された、標的抗原に結合する一つまたは数個のヒト交換カセットを、オーバーラップ伸長PCRまたはライゲーションによって融合してV領域を作製し、これを抗原結合に関して試験する。そのような交換カセット再構築戦略は、V_HまたはV_Lのいずれにも用いることができる。交換カセットは、最終的に再構築されたV領域が単一のヒト生殖系列と類似である、または二つもしくはそれより多いヒト生殖系列と類似のハイブリッドであるように、同じまたは異なるヒト生殖系列を起源としうる。再構築された交換カセットまたは交換カセットライブラリを発現ベクターにクローニングして、相補的V_HまたはV_L鎖と同時発現させる。相補的なV_HまたはV_L鎖は、参照抗体または設計ヒトV領域のいずれかに由来しうる。

具体例として、3回のPCR反応を用いて交換カセットを組換えすることができる（図7）。ヒトサイトカイン抗原に結合する参照抗体19に関するいくつかのV_L FR1-CDR1-FR2ヒト交換カセットが同定された。第一のPCRにおいて（図7a）、プライマーAおよびプライマーBを用いて、V領域DNAからFR1-CDR1-FR2交換カセット領域を増幅した。典型的に、プライマーAは、発現ベクターにクローニングするために付帯された制限部位を有する。プライマーAは、増幅されるそれぞれの交換カセットのFR1のN-末端領域にアニールするプールまたはプライマーとなりうる。プライマーBは増幅されるそれぞれの交換カセットのFR2内でアニールする一つのプライマーまたはプールまたは複数のプライマーとなりうる。ヒトサイトカイン抗原に結合するいくつかのVL FR2-CDR3-FR3ヒト交換カセットを同定した。第二のPCRにおいて（図7b）、プライマーCおよびプライマーDを用いて、参照CDR3およびFR4と共にV領域DNAからのFR2-CDR2-FR3領域を増幅した。典型的に、プライマーDは、発現ベクターへのクローニングのために付帯された制限部位を有する。プライマーCは、増幅されるそれぞれの交換カセットのFR2内でアニールする一つまたはプールまたはプライマーとなりうる。典型的に、プライマーBおよびプライマーCは、オーバーラップ伸長（第三PCR）を促進するための相補的配列である。PCR反応は標準的な条件（例えば、94℃で10秒、50℃で1分、および72℃で30秒を12〜25サイクル繰り返す）を用い、得られた断片を増幅プライマーA、B、CおよびDからゲル精製して、産物の収量を定量する。第三のPCRにおいて、最初の2回のPCR反応物の等モル量を、プライマーAおよびDによって増幅して、ヒトV_L V領域レパートリーの構築を完成させる。V_Lレパートリーを発現ベクターにクローニングして、相補的なV_H鎖と同時発現させた。

V領域レパートリーライブラリに関する得られた組換え型抗体約10,000個を、標的抗原としてヒトサイトカインタンパク質を用いてコロニーリフト結合アッセイ（CLBA）およびELISAアッセイにおいて試験した。ELISAアッセイにおいてヒトサイトカイン抗原に対する結合を示すFab 3個（FB30-G4、FB31-13-1、およびFB40-1-1H）を選択した。

FB30-G4からのFR1-CDR1-FR2およびFR2-CDR2-FR3交換カセットはいずれもヒトVkIサブクラスに最も類似している。FB31-13-1からのFR1-CDR1-FR2およびFR2-CDR2-FR3交換カセットは、ヒトVkIIサブクラスに最も類似している。FB40-1-1HからのFR1-CDR1-FR2およびFR2-CDR2-FR3交換カセットはそれぞれ、ヒトVkIIIおよびヒトVkIサブクラスに最も類似している。

表面プラズモン共鳴分析（Biacore）を用いて、カセット再構築に由来する設計されたヒトFabの結合親和性を決定した。この目的のため、プロテインGアフィニティクロマトグラフィーを用いて、Fabを発現する大腸菌クローンの培養培地からFab断片を精製した。表面プラズモン共鳴分析から決定される結合速度論から、抗体19に関する結合特異性を有するカセット再構築されたFabが同定され、親和性は20 pMであり、これは抗体19参照抗体の親和性（10 pM）と類似である。

親和性0.4 nM（クローン10に関する親和性1.5 nMと比較して）を有する抗体10の特異性を有する再構築Fabが同定され、このことは、交換カセットを用いて、対応する参照抗体より高い親和性を有するFabを同定できることを証明している。

上記の実施例は、説明のために限って提供され、制限するためではない。当業者は変更または可変されても本質的に類似の結果を生じうる多様な非重要パラメータを容易に認識するであろう。

本明細書において引用した全ての刊行物、特許出願、アクセッション番号、および他の参考文献は、それぞれの個々の刊行物または特許出願が具体的におよび個々に参照により本明細書に組み入れられることが示されるように、参照により本明細書に組み入れられる。

a〜cは、参照抗体におけるFR1-CDR1-FR2カセットの交換カセット置換を示す略図を提供する。 a〜cは、参照抗体におけるFR2-CDR2-FR3カセットの交換カセット置換を示す略図を提供する。 a〜cは、参照抗体におけるFR3-CDR3-FR4の置換を示す略図を提供する。 a〜cは、参照抗体のCDR3-FR4領域の置換を示す略図を提供する。 CDR2が最小必須結合特異性決定因子を保持する、参照抗体におけるCDR2-FR3カセットの交換カセット置換を示す略図を提供する。 a〜cは、反復的交換カセット構築を示す略図を提供する。 a〜cは、カセット再構築を示す略図を提供する。

Claims (69)

1. 以下の段階を含む、標的抗原に対する参照抗体の結合特異性を保持する抗体を設計する方法：
   （a）参照抗体由来の可変領域を得る段階；
   （b）交換カセットが3個未満のフレームワーク領域を有することを条件として、参照抗体の可変領域のV遺伝子セグメントの少なくとも一つの交換カセットを、ヒトV遺伝子セグメント由来の対応する交換カセットのライブラリに置き換えて、それによってハイブリッドV領域のライブラリを生成する段階；
   （c）（b）のハイブリッドV領域のライブラリを相補的V領域と対を形成させる段階；および
   （d）標的抗原に対して結合親和性を有する少なくとも一つの交換カセットを有するハイブリッドV領域を含む抗体を選択する段階。
2. 交換カセットのCDRの少なくとも一つが部分的CDR配列である、請求項1記載の方法。
3. 交換カセットのFRの少なくとも一つが部分的FR配列である、請求項1記載の方法。
4. 相補的V領域が天然に存在するVセグメントを有する、請求項1記載の方法。
5. 相補的V領域が生殖系列Vセグメントを有する、請求項1記載の方法。
6. 相補的V領域がハイブリッドV領域である、請求項1記載の方法。
7. 相補的V領域が、異なるハイブリッドV領域を含むライブラリのメンバーであるハイブリッドV領域である、請求項1記載の方法。
8. 交換カセットが、FRl-CDRl、FR1-CDR1-FR2、FR2-CDR2-FR3、およびCDR2-FR3からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
9. 以下の段階をさらに含む、請求項1記載の方法：
   （e）参照抗体のV領域の第二の交換カセットを、ヒトV遺伝子セグメント由来の対応する交換カセットのライブラリと置き換えて、ハイブリッドV領域の第二のハイブリッドライブラリを作製する段階；
   （f）ハイブリッドV領域の第二のライブラリを相補的V領域と対を形成させる段階；
   （g）標的抗原に対して結合親和性を有する、第二のハイブリッドV領域を含む抗体を選択する段階；および
   （h）（d）の設計された抗体のヒト交換カセットを（g）の抗体の第二のヒト交換カセットと組み合わせて、少なくとも二つのヒト交換カセットを含むハイブリッドV領域を有し、参照抗体の結合特異性を有する抗体を得る段階。
10. ハイブリッドV領域のCDR3-FR4をCDR3-FR4領域のライブラリに置き換える段階、可変領域を相補的可変領域と対を形成させる段階、および標的抗原に対する結合特異性を保持する抗体を選択する段階をさらに含む、請求項9記載の方法。
11. ハイブリッドV領域のFR4をFR4配列のライブラリに置き換える段階をさらに含む、請求項9記載の方法。
12. （e）の交換カセットの少なくとも一つのCDRが部分的CDR配列である、請求項9記載の方法。
13. （f）の相補的V領域が天然に存在するVセグメントを含む、請求項9記載の方法。
14. （f）の相補的V領域がハイブリッドV領域である、請求項9記載の方法。
15. （f）の相補的V領域が、異なるハイブリッドV領域を含むライブラリのメンバーであるハイブリッドV領域である、請求項9記載の方法。
16. 可変領域が参照抗体の重鎖に由来する、請求項1記載の方法。
17. 可変領域が参照抗体の軽鎖に由来する、請求項1記載の方法。
18. 抗体が、Fv断片、Fab、Fab'、F(ab')₂、またはscFvである、請求項1記載の方法。
19. 抗体が発現されて宿主細胞から可溶型で分泌され、抗原に結合する、請求項1記載の方法。
20. 宿主細胞が原核細胞、酵母、または哺乳動物細胞である、請求項19記載の方法。
21. 抗体が細胞、胞子、またはウイルス上に提示される、請求項1記載の方法。
22. 以下の段階を含む、標的抗原に対する参照抗体の結合特異性を保持する抗体を設計する方法：
    （a）望ましい結合特異性を有する参照抗体の可変領域を得る段階；
    （b）参照抗体の可変領域のFR1-CDR1-FR2を、ヒトFR1-CDR1-FR2領域のライブラリに置き換えて、ハイブリッド可変領域のライブラリを作製し、ハイブリッド可変領域を相補的可変領域と対を形成させ、標的抗原に対する検出可能な親和性を有する抗体を選択する段階；
    （c）参照抗体の可変領域のFR2-CDR2-FR3を、ヒトFR2-CDR2-FR3領域のライブラリに置き換えて、ハイブリッド可変領域のライブラリを作製し、ハイブリッド可変領域を相補的可変領域と対を形成させ、標的抗原に対する検出可能な親和性を有する抗体を選択する段階；
    （d）（b）において選択された抗体のハイブリッド可変領域のFR1-CDR1-FR2を、（c）において選択された抗体のハイブリッド可変領域のFR2-CDR2-FR3と組み合わせて、参照抗体の結合特異性を有し、ヒト可変領域Vセグメントを有する抗体を得る段階。
23. （b）および（c）が連続的に行われる、請求項22記載の方法。
24. （b）または（c）の相補的可変領域が天然に存在するVセグメントを含む、請求項22記載の方法。
25. （b）または（c）の相補的可変領域がハイブリッドV領域である、請求項22記載の方法。
26. （b）または（c）の相補的可変領域が生殖系列Vセグメントである、請求項22記載の方法。
27. （b）または（c）の相補的可変領域が、ハイブリッドV領域のライブラリのメンバーである、請求項22記載の方法。
28. 参照抗体の可変領域が重鎖可変領域である、請求項22記載の方法。
29. 参照抗体の可変領域が軽鎖可変領域である、請求項22記載の方法。
30. FR1-CDR1-FR2をFR2-CDR2-FR3と組み合わせる段階が、FR2領域を相同的な領域において組み合わせる段階を含む、請求項22記載の方法。
31. FR1-CDR1-FR2をFR2-CDR2-FR3と組み合わせる段階が、FR1-CDR1-FR2からのFR2を、FR2-CDR2-FR3からのFR2に置き換える段階、またはFR2-CDR2-FR3からのFR2を、FR1-CDR1-FR2からのFR2に置き換える段階を含む、請求項22記載の方法。
32. ハイブリッド可変領域のCDR3-FR4をヒトCDR3-FR4領域のライブラリに置き換える段階、可変領域を相補的可変領域と対を形成させる段階、および標的抗原に結合する抗体を選択する段階をさらに含む、請求項22記載の方法。
33. ヒトCDR3-FR4領域のライブラリのCDR3領域が部分的CDR3領域である、請求項32記載の方法。
34. 以下の段階をさらに含む、請求項22記載の方法：
    （v）（iv）のヒトVセグメントを含む可変領域のFR3-CDR3-FR4をFR3-CDR3-FR4領域のライブラリに置き換え、可変領域を相補的可変領域と対を形成させ、標的抗原に対する検出可能な親和性を有する抗体を選択する段階；
    （vi）（v）において選択された抗体のハイブリッド可変領域のFR3-CDR4-FR4を、（iv）において選択された抗体のハイブリッド可変領域のFR2-CDR2-FR3と組み合わせて、参照抗体の結合特異性を有し、ヒト可変領域Vセグメントを有する抗体を得る段階。
35. ヒト交換カセットの一つまたは複数が生殖系列である、請求項22記載の方法。
36. 抗体がFv断片、Fab、Fab'、F(ab')₂、またはscFvである、請求項22記載の方法。
37. 抗体が発現されて宿主細胞から可溶型で分泌され、抗原に結合する、請求項22記載の方法。
38. 宿主細胞が原核細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞である、請求項37記載の方法。
39. 抗体が細胞、胞子、またはウイルスの表面上に提示される、請求項22記載の方法。
40. 以下の段階を含む、標的抗原に対する参照抗体の結合特異性を保持する抗体を設計する方法：
    （a）望ましい結合特異性を有する参照抗体の可変領域を得る段階；
    （b）参照抗体の可変領域のFR1-CDR1-FR2を、ヒトFR1-CDR1-FR2領域のライブラリに置き換えて、ハイブリッド可変領域のライブラリを作製する段階、
    ハイブリッド可変領域と相補的可変領域と対を形成させる段階、および
    標的抗原に対して検出可能な親和性を有する抗体を選択する段階；
    （c）参照抗体の可変領域のCDR2-FR3を、ヒトCDR2-FR3領域のライブラリに置き換えて、ハイブリッド可変領域のライブラリを作製する段階であって、参照抗体のCDR2-FR3のCDR2が部分的CDR2であり、ヒトCDR2-FR3配列のライブラリが対応する部分的CDR2-FR3配列を含む、段階、
    ハイブリッド可変領域を相補的可変領域と対を形成させる段階、および
    標的抗原に対して検出可能な親和性を有する抗体を選択する段階；ならびに
    （d）（b）において選択された抗体のハイブリッド可変領域のFR1-CDR1-FR2を、（c）において選択された抗体のハイブリッド可変領域のCDR2-FR3と組み合わせて、参照抗体の結合特異性を有し、ヒト可変領域Vセグメントを有する抗体を得る段階。
41. 参照抗体のCDR3-FR4をヒトCDR3-FR4領域のライブラリに置き換える段階、可変領域を相補的可変領域と対を形成させる段階、および標的抗原に結合する抗体を選択する段階をさらに含む、請求項40記載の方法。
42. ヒトCDR3-FR4領域のライブラリのCDR3領域が部分的CDR3領域である、請求項41記載の方法。
43. 以下の段階をさらに含む、請求項40記載の方法：
    （e）参照抗体cの可変領域のFR4をFR4領域のライブラリに置き換える段階、可変領域を相補的可変領域と対を形成させる段階、および標的抗原に対して検出可能な親和性を有する抗体を選択する段階。
44. ヒト交換カセットの一つまたは複数が生殖系列である、請求項40記載の方法。
45. 抗体がFv断片、Fab、Fab'、F(ab')₂、またはscFvである、請求項40記載の方法。
46. 抗体が発現されて宿主細胞から可溶型で分泌され、抗原に結合する、請求項40記載の方法。
47. 宿主細胞が原核細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞である、請求項46記載の方法。
48. 抗体が細胞、胞子、またはウイルスの表面上に提示される、請求項40記載の方法。
49. 参照抗体の結合特異性を有する、設計された抗体であって、
    それぞれの交換カセットが3個未満のフレームワーク領域を有することを条件として、一つのヒト抗体遺伝子由来のヒト交換カセット、および異なるヒト抗体遺伝子由来の第二の交換カセットを有するV遺伝子セグメントを含む、可変ドメイン；ならびに
    参照抗体由来のCDR配列またはCDR配列の一部
    を含む、抗体。
50. 第一および第二の交換カセットがヒト生殖系列配列である、請求項49記載の抗体。
51. CDR配列またはCDR配列の一部が、CDR3配列または部分的CDR3配列である、請求項49記載の抗体。
52. ヒトFR4配列を含む、請求項51記載の抗体。
53. 部分的CDR3配列が、参照抗体由来のMEBSDである、請求項51記載の抗体。
54. 部分的CDR3配列が、参照抗体由来のCDR3のDセグメント配列である、請求項49記載の抗体。
55. CDR3が非ヒトCDR3である、請求項51記載の抗体。
56. 参照抗体の少なくとも一つのFR3がヒトFR3に置き換えられている、設計された抗体。
57. 置き換えられるFR3が重鎖FR3である、請求項56記載の抗体。
58. 置き換えられるFR3が軽鎖FR3である、請求項56記載の抗体。
59. 重鎖および軽鎖FR3の双方が置き換えられている、請求項56記載の抗体。
60. V領域の多様性を有するメンバーを含む、ハイブリッドV領域のライブラリであって、交換カセットが3個未満のフレームワーク領域を有することを条件として、メンバーが少なくとも参照抗体由来のCDRのMEBSDおよび抗体レパートリー由来の少なくとも一つの交換カセットを有する、ライブラリ。
61. 抗体レパートリーがヒトレパートリーである、請求項60記載のライブラリ。
62. 交換カセットが、FRl-CDRl、FR1-CDR1-FR2、FR2-CDR2-FR3、およびCDR2-FR3からなる群より選択される、請求項60記載のライブラリ。
63. 交換カセットのCDRの少なくとも一つが部分的CDRである、請求項60記載のライブラリ。
64. ライブラリのメンバーがヒトレパートリー由来の少なくとも二つの交換カセットを有する、請求項60記載のライブラリ。
65. 交換カセットがヒト生殖系列配列である、請求項60記載のライブラリ。
66. MEBSDが参照抗体のCDR3由来のものである、請求項60記載のライブラリ。
67. ライブラリのメンバーが参照抗体由来のCDR3を有する、請求項66記載のライブラリ。
68. メンバーが参照抗体由来のCDR3およびヒトFR4を有する、請求項67記載のライブラリ。
69. メンバーが、Dセグメントが参照抗体由来であるCDR3を有する、請求項67記載のライブラリ。

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