JP2008508877A - 駆虫性物質をコードする核酸およびそれから生産される植物 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は植物病理学および植物遺伝的形質転換の分野に関する。より詳しくは、本発明は、例えば植物寄生性線虫のような植物病原体の防除を含む産業目的のためのトランスジェニック植物における新規脂肪酸の産生を増強するための方法および組成物に関する。
本発明は、脂肪酸ヒドロキシラーゼまたはエポキシゲナーゼをコードする配列を含むDNA構築物、そのような構築物を含有するトランスジェニック植物、およびそのようなトランスジェニック植物の生産方法に関する。これらのトランスジェニック植物は線虫に対する耐性の増強を示しうる。また、これらのトランスジェニック植物は、環境に安全な態様で線虫を防除するのに有用でありうる。本発明は部分的には、あるヒドロキシル化またはエポキシ化脂肪酸およびメチルエステル(例えば、リシノレアート、ベルノラート)が殺線虫活性を示すという驚くべき知見に基づくものである。これらの脂肪酸は、他の炭素数18の遊離脂肪酸(例えば、オレアート、エライダートおよびリノレアート)と比較して有意に増強された殺線虫活性を示す。ヒドロキシル化またはエポキシ化脂肪酸のレベルを増加させて、商業的に重要な植物種における線虫被害の防除を補助するために、ヒドロキシラーゼまたはエポキシゲナーゼポリペプチドをコードする核酸を植物内に導入することが可能である。これらの新規ヒドロキシラーゼおよびエポキシゲナーゼ構築物は、他の産業用途(例えば、安全なリシノール酸源の提供)のためにヒドロキシおよびエポキシ脂肪酸の蓄積を増加させるためにも有用である。
本発明は、驚くべき殺線虫活性を示す小分子化合物の産生に有効なポリペプチドをコードする遺伝子および遺伝的構築物を記載する。殺線虫活性は部分的には、線虫には必須であるらしいが脊椎動物および植物には存在しないか又は必須でない代謝過程の選択的抑制によるものである。したがって、本発明は、環境に安全な植物寄生性線虫防除のための緊急に必要とされているDNA構築物、トランスジェニック植物およびそのような植物の生産方法を提供する。
不飽和脂肪酸は生体膜の適切な機能に必須である。生理的温度では、飽和脂肪酸のみを含有する極性グリセロ脂質は、生体膜の基本構造である液体-結晶二重層を形成し得ない。膜グリセロ脂質の脂肪酸脂肪への適当な数の二重結合の導入(不飽和化と称される過程)はゲルから液体-結晶相への転移温度を減少させ、必要な流動性を膜に付与する。膜の流動性は脂質二重層のバリヤー特性の維持ならびに或る膜結合酵素の活性化および機能に重要である。不飽和化がエタノールおよび酸化ストレスに対する何らかの防御をもたらすという証拠も存在し、このことは、膜脂肪酸の不飽和化度が温度適応異常に重要であることを示唆している。不飽和脂肪酸は、重要なプロスタグランジン源である、動物における多不飽和酸(PUFA)アラキドン酸およびエイコサペンタエン酸の前駆体でもある。これらの分子は、それらが合成される細胞の活性および細胞の結合を改変して生殖、免疫、神経生理学、温度生物学ならびにイオンおよび流体輸送の過程を媒介する局所ホルモンである。
本発明での使用に適したポリペプチドは、基質からC16、C18またはC20モノ不飽和脂肪酸産物、例えばヒドロキシル化脂肪酸またはエポキシ化脂肪酸への変換を触媒するのに有効である。本発明において有用なヒドロキシラーゼまたはエポキシゲナーゼ酵素の酵素産物は典型的には炭素数16、18もしくは20の長さの脂肪酸またはそれらの類似体である。そのような産物は典型的にはデルタ-9位(カルボニル(カルボキシル)炭素から数えてC9とC10との間)にシス(Z)またはトランス(E)炭素二重結合を有する。そのような産物はC12、C13またはC12とC13との両方にヒドロキシまたはエポキシ修飾をも有する。本発明の脂肪酸ヒドロキシラーゼまたはエポキシゲナーゼには、適当な条件下で補酵素A、アシルキャリヤータンパク質(ACP)または脂質結合モノエン脂肪酸基質からリシノール酸、レスクエロール(lesquerolic)酸、ヒドロキシエルカ酸(16-ヒドロキシドコサ-シス-13-エン酸)またはヒドロキシパルミトレイン酸(12-ヒドロキシヘキサデカ-シス-9-エン酸)を産生するのを触媒する能力を示すポリペプチドが含まれる。
本発明に適した核酸としては、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。典型的には、そのような核酸は、植物内への導入および植物ゲノム内への組込みに適したDNA構築物内に組込まれる。ヒドロキシラーゼまたはエポキシゲナーゼポリペプチドをコードする核酸を含むDNA構築物は、植物の栄養組織または種子の組織の少なくとも1つにおける発現をもたらす1以上の調節要素に機能しうる形で連結されている。典型的には、DNA構築物は形質転換植物内での発現のための5'-調節要素および3'-調節要素を含む。いくつかの実施形態においては、そのような構築物はキメラである。すなわち、コード配列と1以上の調節配列とが、異なる起源に由来する。例えば、ポリペプチドコード配列はRicinus communisヒドロキシラーゼであることが可能であり、5'-調節要素はジャガイモS27aプロモーターであることが可能である。しかし、非キメラDNA構築物も使用されうる。DNA構築物はクローニングベクター核酸をも含みうる。本発明での使用に適したクローニングベクターは商業的に入手可能であり、当業者により通常に使用されている。
本発明のもう1つの態様においては、トランスジェニック植物を提供する。そのような植物は、典型的には、本明細書に記載のDNA構築物のポリペプチドコード配列を発現して、そのような植物の栄養植物組織または種子の組織の少なくとも1つにおけるヒドロキシル化またはエポキシ化脂肪酸の量の増加をもたらす。植物種または品種は、異なる植物種または品種に由来するポリペプチドをコードするDNA構築物で形質転換されうる(例えば、ダイズは、ヒマ酵素をコードする遺伝子で形質転換されうる)。あるいは、植物種または品種は、同一植物種または品種に由来するポリペプチドをコードするDNA構築物で形質転換されうる。
非種子組織内のヒドロキシ-およびエポキシ-脂肪酸の産生に関してトランスジェニック植物を試験することが可能である。そのような植物を殺線虫活性に関しても試験することが可能である。ヒドロキシル化およびエポキシ化脂肪酸の産生および殺線虫活性に関する同様の試験は、A. rhizogenesでの形質転換により形成される毛状根培養上で行うことが可能である。したがって、本発明は、駆虫活性に関してトランスジェニック植物をスクリーニングするための方法であって、該植物を、該植物が駆虫活性を有するか否かを判定するのに有効な条件下で線虫と接触させることを含んでなる方法に関する。該トランスジェニック植物は、本明細書に記載のヒドロキシラーゼまたはエポキシゲナーゼポリペプチドをコードする核酸を含む。駆虫活性を判定するための適当な条件は本明細書に記載されている。該方法は、トランスジェニック植物からの植物組織、例えば根組織、葉組織または茎組織で行うことも可能である。
opholus similis, Radopholus citrophilus (フロリダのみ), Hemicycliophora arenaria, Pratylenchus spp., Meloidogyne spp., Bolonolaimus longicaudatus (フロリダのみ), Trichodorus, Paratrichodorus, Xiphinema spp.; クローバー: Meloidogyne spp., Heterodera trifolii; ココヤシ: Rhadinaphelenchus cocophilus; コーヒー: Meloidogyne incognita (ブラジルにおいて最重要), Meloidogyne exigua (広範), Pratylenchus coffeae, Pratylenchus brachyurus, Radopholus similis, Rotylenchulus reniformis, Helicotylenchus spp.; トウモロコシ: Pratylenchus spp., Paratrichodorus minor, Longidorus spp., Hoplolaimus columbus; ワタ: Meloidogyne incognita, Belonolaimus longicaudatus, Rotylenchulus reniformis, Hoplolaimus galeatus, Pratylenchus spp., Tylenchorhynchus spp.,Paratrichodorus minor; ブドウ: Xiphinema spp., Pratylenchus vulnus, Meloidogyne spp., Tylenchulus semipenetrans, Rotylenchulus reniformis; 草類: Pratylenchus spp., Longidorus spp., Paratrichodorus christiei, Xiphinema spp., Ditylenchus spp.; ラッカセイ: Pratylenchus spp., Meloidogyne hapla., Meloidogyne arenaria, Criconemella spp., Belonolaimus longicaudatus (米国東部); キマメ: Heterodera cajani, Rotylenchulus reniformis, Hoplolaimus seinhorsti, Meloidogyne spp., Pratylenchus spp.; パイナップル: Paratrichodorus christiei, Criconemella spp., Meloidogyne spp., Rotylenchulus reniformis, Helicotylenchus spp., Pratylenchus spp., Paratylenchus spp.; ジャガイモ: Globodera rostochiensis, Globodera pallida, Meloidogyne spp., Pratylenchus spp., Trichodorus primitivus, Ditylenchus spp., Paratrichodorus spp., Nacoabbus aberrans; イネ: Aphelenchiodes besseyi, Ditylenchus angustus, Hirchmanniella spp., Heterodera oryzae, Meloidogyne spp.; 小果類: Meloidogyne spp.; Pratylenchus spp., Xiphinema spp., Longidorus spp., Paratrichodorus christiei, Aphelenchoides spp. (イチゴ); ダイズ: Heterodera glycines, Meloidogyne incognita, Meloidogyne javanica, Belonolaimus spp., Hoplolaimus columbus; テンサイ: Heterodera schachtii, Ditylenchus dipsaci, Meloidogyne spp., Nacobbus aberrans, Trichodorus spp., Longidorus spp., Paratrichodorus spp.; サトウキビ: Meloidogyne spp., Pratylenchus spp., Radopholus spp., Heterodera spp., Hoplolaimus spp., Helicotylenchus spp., Scutellonema spp., Belonolaimus spp., Tylenchorhynchus spp., Xiphinema spp., Longidorus spp., Paratrichodorus spp.; チャ: Meloidogyne spp., Pratylenchus spp., Radopholus similis, Hemicriconemoides kanayaensis, Helicotylenchus spp., Paratylenchus curvitatus; タバコ: Meloidogyne spp., Pratylenchus spp., Tylenchorhynchus claytoni, Globodera tabacum, Trichodorus spp., Xiphinema americanum, Ditylenchus dipsaci (ヨーロッパのみ), Paratrichodorus spp.; トマト: Pratylenchus spp., Meloidogyne spp.; 果樹: Pratylenchus spp. (リンゴ、セイヨウナシ、核果), Paratylenchus spp. (リンゴ、セイヨウナシ), Xiphinema spp. (セイヨウナシ、オウトウ、モモ), Cacopaurus pestis (クルミ), Meloidogyne spp. (核果、リンゴなど), Longidorus spp. (オウトウ), Criconemella spp. (モモ), and Tylenchulus spp. (オリーブ)。
二本鎖RNA(dsRNA)分子は、RNA媒介干渉として公知の方法(Fireら (1998) Nature 391:806-811およびGonczyら (2000) Nature 408:331-336)によりデルタ-12脂肪酸デサチュラーゼ(デルタ-12 fat2)遺伝子を細胞内で不活性化するために使用されうる。該dsRNA分子はデルタ-12 fat2核酸(好ましくはエキソン)またはその断片のヌクレオチド配列を有しうる。該dsRNA分子は、直接注入により又は濃縮dsRNAを含有する水溶液への線虫の浸漬により又は該dsRNA分子を産生するよう遺伝的に操作された大腸菌(E. coli)上で細菌食性(bacteriovorous)線虫を成長させることにより、線虫に運搬されうる。
デルタ-12 fat2活性の抑制効果を調べるために、基本的にはMelloら (1991) EMBO J. 10:3959-3970に記載されているとおりに、C. elegansデルタ-12 fat2遺伝子に対応するdsRNAを該線虫内に注入した。簡潔に説明すると、第1エキソンの全体を含有し第1エキソンと第1イントロンとの間の保存イントロンスプライス部位の直前で終結するC. elegansデルタ-12 fat2配列の一部(詳しくは、651ヌクレオチド長の断片)を含有するプラスミドを構築した。この構築物はC. elegansデルタ-12 fat2遺伝子の最初の約217アミノ酸をコードする。この配列を直鎖状dsDNAとして特異的に増幅するためのプライマーを使用した。T7 RNAポリメラーゼおよびSP6 RNAポリメラーゼを使用して、これらの断片から一本鎖RNAを転写した(該RNAはセンスおよびアンチセンスRNA鎖に対応する)。RNAを沈殿させ、RNアーゼ非含有水に再懸濁させた。ssRNAをアニーリングしてdsRNAを形成させるために、それらのssRNAを一緒にし、95℃まで2分間加熱し、ついで1.5〜2.5時間にわたって70℃〜室温に冷却した。
デルタ-12 fat2発現を抑制するよう設計された二本鎖RNA(dsRNA)を産生するよう遺伝的に操作された大腸菌(E. coli)の菌叢上でC. elegansを成長させることが可能である。簡潔に説明すると、第1エキソンの全体を含有し第1エキソンと第1イントロンとの間の保存イントロンスプライス部位の直前で終結するC. elegans fat2遺伝子配列の一部のゲノム断片(詳しくは、651ヌクレオチド長の断片)で大腸菌(E. coli)を形質転換した。この構築物はC. elegansデルタ-12 fat2遺伝子の最初の約217アミノ酸をコードする。該651ヌクレオチドゲノム断片を対向T7ポリメラーゼプロモーター間の大腸菌(E. coli)発現ベクター内にクローニングした。ついで該クローンを、IPTG誘導性T7ポリメラーゼを含有する大腸菌(E. coli)の株で形質転換した。対照として、グリーン蛍光タンパク質(GFP)をコードする遺伝子で大腸菌(E. coli)を形質転換した。C. elegans卵から、またはC. elegans L4から、摂食RNAiを開始させた。C. elegansデルタ-12 fat2またはGFP dsRNAを発現する大腸菌(E. coli)およびIPTGを含有するNGMプレート上、摂食性RNAiをC. elegans卵から23℃で開始させた場合には、該C. elegansデルタ-12 fat2 RNAi摂食性表現型は、部分的に生殖不能なF1個体および死亡したF2胚を示した。C. elegansデルタ-12 fat2またはGFP dsRNAを発現する大腸菌(E. coli)およびIPTGを含有するNGMプレート上、摂食性RNAiをC. elegans L4幼虫から23℃で開始させた場合には、該C. elegans RNAi摂食性表現型は、発生停止した生殖不能なF1線虫と共に、部分的に生殖不能なP0個体(すなわち、最初に曝露された個体)を示した。fat2遺伝子の配列は、該RNAiが他の遺伝子との交差反応性を表すとは考えられないくらいに十分に高い複雑性(すなわち、特有性)を有する。
C. elegansデルタ-12脂肪酸デサチュラーゼ(FAT-2タンパク質)はモノ不飽和オレイン酸をジ不飽和脂肪酸リノール酸へ変換する。デルタ-12 fat2 RNAiはデルタ-12脂肪酸デサチュラーゼの発現を妨げ、これは線虫におけるリノール酸のレベルの減少を引き起こし、発生停止および死亡を招くと予想される。該RNAi実験に使用したNGM培地への3mM リノール酸メチルエステルの添加はデルタ-12 fat2 RNAi摂食性表現型の部分的レスキューを引き起こす。3mM オレイン酸メチルエステルの添加は該デルタ-12 fat2 RNAi摂食性表現型をレスキューしない(以下の表1を参照されたい)。
混合段階(mixed stage)のC. elegansを、M9溶液を使用して、OP50細菌が播かれたプレートから洗い落とした。約50〜100匹の該線虫を含有する250μlの該M9溶液を24ウェルプレートの各ウェル内にピペッティングした。
各ウェルに、脂肪酸エマルションまたは対照エマルションを加え、渦巻き回転により迅速に混合した。エマルションまたは対照の添加の24時間後の種々の時点で、視覚的観察および運動性アッセイにより、線虫生存性を評価した。試験した脂肪酸エマルションはノナン酸(ペラルゴン酸)、リシノール酸、ベルノール酸、リノール酸、オレイン酸のメチルエステル、および脂肪酸を欠く対照エマルションであった。
M. incognitaおよびM. javanicaをトマト根から得た。該根を漂白し、濾過およびそれに続くスクロース密度勾配遠心分離により残渣をJ2幼虫および卵から分離した。卵を15℃で4日間かけて孵化させ、フィルターに通し次いで遠心分離することによりJ2幼虫を集めた。
滅菌トマト種子を、Gamborg寒天培地を含有するマジェンタジャー内で発芽させた。2週間の成長のあと、茎-培地界面に直接適用する250μlの1%脂肪酸メチルエステルエマルション(ノナン酸、リシノール酸、リシノエライジン酸、オレイン酸、またはいずれの脂肪酸をも欠く対照エマルション)で実生を処理した。トマト実生をエマルションの適用後の種々の時点で評価した。試験した脂肪酸のうち、1%ノナン酸メチルエステルエマルションのみが該トマトに対して明らかな細胞毒性効果を示した。ノナン酸エマルション適用の18時間以内に、それらのトマトは膨圧の顕著な低下(萎れ表現型)を示し、外観上、緑色の淡化が認められるようになった。24時間以内に、ノナン酸処理トマトは淡白色へとほぼ完全に漂白され、ほぼ完全に倒れ、ほとんどの葉は寒天培地表面上に直に横たわった。重要なことに、その他の脂肪酸メチルエステルエマルションで処理されたトマトはいずれも、可視効果を示さなかった。したがって、リシノール酸およびリシノエライジン酸メチルエステルは、高い殺線虫特性と好ましい低植物毒性とを併せ持つことから、駆虫化合物としての優れた可能性を示している。
簡潔に説明すると、示されている脂肪酸エマルションを24ウェルプレートのウェル内の線虫に加え、渦巻き回転させることにより迅速に混合した。エマルションの添加の24時間後(植物寄生性線虫MeloidogyneおよびHeterodera種に関しては48時間後)、視覚的観察および運動性アッセイにより線虫の生存性を評価した。試験した脂肪酸エマルションはノナン酸(ペラルゴン酸)、リシノエライジン酸、リシノール酸、ベルノール酸、リノール酸およびオレイン酸のメチルエステルであった。多様な生活様式を示す線虫に対する種々のエマルション活性の比較を容易にするために、自由生活性、動物寄生性および植物寄生性線虫に対する脂肪酸エマルションに関する結果を1つの表にまとめた。示されている結果は、複数の独立した実験から得られた平均%値である。
ゲノムDNAをRicinus communisの葉組織から単離した。センスプライマーHyd1(配列番号46)およびアンチセンスプライマーHyd2(配列番号47)を使用して、標準的な条件下でのKTLA DNAポリメラーゼでの勾配(Gradient)PCR反応[30サイクルの加熱サイクル(95℃で1分間、48〜63℃で30秒間、68℃で2分間)]においてヒマヒドロキシラーゼ遺伝子のゲノムコピーを増幅した。PCR産物を1%アガロースゲル中で分画した。約1100bp長のバンドを切り出し、ゲル精製(QIAquick Gel Extraction)した。TOPO TAキット (Invitrogen)を使用してDNAをクローニングした。候補クローンをそれらの全体において自動DNAシークエンサー(例えば、Applied Biosystems, Inc.のモデル373)で配列決定した。
ゲノムDNAをL. lindheimeriおよびL. gracilisの葉組織から単離した。センスプライマーLes1(配列番号48)およびアンチセンスプライマーLes10(配列番号49)を使用して、標準的な条件下でのKTLA DNAポリメラーゼでの勾配(Gradient)PCR反応[30サイクルの加熱サイクル(94℃で2分間、55℃で1分間、68℃で2分間)]において両方のLesquerella二官能性ヒドロキシラーゼ遺伝子のゲノムコピーを増幅した。PCR産物を1%アガロースゲル中で分画した。約1100bp長のバンドを切り出し、ゲル精製(QIAquick Gel Extraction)した。TOPO TAキット (Invitrogen)を使用してDNAをクローニングした。候補クローンをそれらの全体において自動DNAシークエンサー(例えば、Applied Biosystems, Inc.のモデル373)で配列決定した。
ゲノムDNAをL. fendleriの葉組織から単離した。センスプライマーLes1(配列番号48)およびアンチセンスプライマーLes6(配列番号50)を使用して、標準的な条件下でのKTLA DNAポリメラーゼでの勾配(Gradient)PCR反応[30サイクルの加熱サイクル(95℃で1分間、45〜63℃で30秒間、68℃で2分間)]において両方のL. fendleri二官能性ヒドロキシラーゼ遺伝子のゲノムコピーを増幅した。PCR産物を1%アガロースゲル中で分画した。約1100bp長のバンドを切り出し、ゲル精製(QIAquick Gel Extraction)した。TOPO TAキット (Invitrogen)を使用してDNAをクローニングした。候補クローンをそれらの全体において自動DNAシークエンサー(例えば、Applied Biosystems, Inc.のモデル373)で配列決定した。
ゲノムDNAをC. biennisから単離した。センスプライマーEcrep2(配列番号51)およびアンチセンスプライマーEcrep8(配列番号52)を使用して、標準的な条件下でのKTLA DNAポリメラーゼでの勾配(Gradient)PCR反応[30サイクルの加熱サイクル(95℃で1分間、45〜63℃で30秒間、68℃で2分間)]においてC. biennisエポキシゲナーゼ遺伝子の部分的ゲノムクローンを増幅した。PCR産物を1%アガロースゲル中で分画した。約1100bp長のバンドを切り出し、ゲル精製(QIAquick Gel Extraction)した。ついで、TOPO TAクローニングキット (Invitrogen)を使用して該遺伝子断片をクローニングした。候補クローンをそれらの全体において自動DNAシークエンサー(例えば、Applied Biosystems, Inc.のモデル373)で配列決定して、プラスミドクローンDiv2966を得た。コドン33-374および3'終止コドンのヌクレオチド配列を含む、C. biennisエポキシゲナーゼに関する部分配列データをDiv2966から得た。該クローンは、C. biennisエポキシゲナーゼの最初の32コドンおよび5'非翻訳領域を欠いていた。該C. biennisエポキシゲナーゼ遺伝子の欠落した5'配列を得るために、逆PCR技術を用いた。逆PCRは、標的配列に直に隣接している未知DNAセグメントの迅速な増幅を可能にする。簡潔に説明すると、C. biennisゲノムDNAを、選択された制限酵素で消化し、ついで連結して、より小さなゲノムDNAセグメントを環化する。ついでこれらの環化セグメントをPCRの鋳型として使用する。該PCRにおいては、欠落隣接配列を増幅するために、関心遺伝子の既知領域から外側へのDNA増幅を導くプライマーを使用する。逆PCRを用いて欠落5'または3'配列を増幅することが可能である。消化され連結され環化されたゲノムDNAを直接的にPCR増幅した。該PCRにおいては、関心遺伝子内にアニールする、既知配列から設計された遺伝子特異的プライマー(Crep12F; 配列番号115およびCrep13R; 配列番号116)を使用した。この方法を行ってクローンDiv4373を得た。これはコドン1-137および355-374を含有する。総合すると、クローンDiv2966およびDiv4373は、C. biennisのエポキシゲナーゼ遺伝子の完全なオープンリーディングフレームを含む配列を含有する。
ゲノムDNAをS. laevisから単離した。多数の植物エポキシゲナーゼの間で高度の配列保存性を示すと予想されるS. laevisエポキシゲナーゼ遺伝子内の領域にアニールする縮重プライマーを設計した。センスプライマーEstok14(配列番号117)およびアンチセンスプライマーEstok17(配列番号118)を使用して、S. laevisエポキシゲナーゼ遺伝子のゲノム断片を増幅した。ついで、増幅されたPCR産物をDNA分析のための適当なベクター内にクローニングした。この方法を行ってクローンDiv4023を得た。このクローンはコドン88-356を含有していた。該遺伝子の5'末端配列を得るために、関心遺伝子内にアニールする遺伝子特異的プライマーを既知配列から設計し、センスプライマーS1-1(配列番号119)およびアンチセンスプライマーStok1R(配列番号120)を使用して、該エポキシゲナーゼ遺伝子の残部を増幅した。これはプラスミドクローンDiv4172を与えた。このクローンはコドン1-260を含有していた。S. laevisエポキシゲナーゼ遺伝子の3'末端を得るためには、逆PCR技術を用いた。逆PCRは、標的配列に直に隣接している未知DNAセグメントの迅速な増幅を可能にする。簡潔に説明すると、S. laevisゲノムDNAを、選択された制限酵素で消化し、ついで連結して、より小さなゲノムDNAセグメントを環化する。ついでこれらの環化セグメントをPCRの鋳型として使用する。該PCRにおいては、欠落隣接配列を増幅するために、関心遺伝子の既知領域から外側へのDNA増幅を導くプライマーを使用する。逆PCRを用いて欠落5'または3'配列を増幅することが可能である。消化され連結され環化されたゲノムDNAを直接的にPCR増幅した。該PCRにおいては、関心遺伝子内にアニールする、既知配列から設計された遺伝子特異的プライマーStok12R(配列番号121)およびStok14F(配列番号122)を使用した。この方法を行ってクローンDiv4324を得た。これはコドン1-108および254-377を含有する。総合すると、クローンDiv4023、Div4172およびDiv4324は、S. laevisのエポキシゲナーゼ遺伝子の完全なオープンリーディングフレームを含む配列を含有する。
完全長R. communisヒドロキシラーゼ遺伝子からヌクレオチド245-247(CTA)を除去する特異的プライマーを設計した。2ラウンドのPCRに基づくサブクローニング法を用いて、ΔT L. gracilis二官能性ヒドロキシラーゼを作製した。第1ラウンドのPCRプライマーは以下のとおりであった:ヌクレオチド245-247以外の二官能性ヒドロキシラーゼの5'末端を増幅するためには、クローニングベクターpCR2.1内に含有されているL. gracilis二官能性ヒドロキシラーゼ遺伝子のコピーを鋳型として使用するPCR反応において、センスプライマーM13リバース(配列番号100)およびアンチセンスプライマー3'ΔT(配列番号97)を使用した。ヌクレオチド245-247以外の二官能性ヒドロキシラーゼの3'末端を増幅するためには、センスプライマー5'ΔT(配列番号96)およびアンチセンスプライマーgracilis XbaI MfeI R(配列番号101)を使用した。第2ラウンドのPCRには、センスプライマーHIII NcoI gracilis F (配列番号102) およびアンチセンスプライマーgracilis XbaI Mfe R (配列番号101)を使用して、最終PCR産物ΔT L. gracilisヒドロキシラーゼを得た。5サイクルの加熱サイクル(94℃で1分間、50℃で30秒間、68℃で1.5分間)およびそれに続く15サイクルの加熱サイクル(94℃で1分間、57℃で30秒間、68℃で1.5分間)を用いて、標準的な条件下、KTLA DNAポリメラーゼを使用して、PCR産物を増幅した。ついで、NcoIおよびXbaI制限酵素部位を使用して、該構築物を植物発現ベクター内にサブクローニングした。
完全長R. communisヒドロキシラーゼ遺伝子からヌクレオチド53-64(AGAAAGGAGGAA, 配列番号140)を除去する特異的プライマーを設計した。2ラウンドのPCRに基づくサブクローニング法を用いて、ΔKKGG Ricinus communisヒドロキシラーゼ遺伝子を作製した。第1ラウンドのPCRプライマーは以下のとおりであった:ヌクレオチド53-64以外のRicinusヒドロキシラーゼ遺伝子の5'末端を増幅するためには、クローニングベクターpCR2.1内に含有されているR. communisヒドロキシラーゼ遺伝子のコピーを鋳型として使用するPCR反応において、センスプライマーM13リバース(配列番号100)およびアンチセンスプライマー3'ΔKKGG2(配列番号95)を使用した。ヌクレオチド53-64以外のRicinusヒドロキシラーゼ遺伝子の3'末端を増幅するためには、センスプライマー5'ΔKKGG2(配列番号94)およびアンチセンスプライマー ヒマXbaI MfeI R(配列番号98)を使用した。第2ラウンドのPCRには、センスプライマーHIII NcoIヒマF (配列番号99) およびヒマXbaI Mfe R (配列番号98)を使用して、最終PCR産物ΔKKGG Ricinus communisヒドロキシラーゼを得た。5サイクルの加熱サイクル(94℃で1分間、50℃で30秒間、68℃で1.5分間)およびそれに続く15サイクルの加熱サイクル(94℃で1分間、57℃で30秒間、68℃で1.5分間)を用いて、標準的な条件下、KTLA DNAポリメラーゼを使用して、PCR産物を増幅した。ついで、NcoIおよびXbaI制限酵素部位を使用して、該構築物を植物発現ベクター内にサブクローニングした。
全RNAをA. thalianaの葉組織から単離した(Qiagen RNeasy)。センスプライマー5'UTR-HIIIF (配列番号53) およびアンチセンスプライマー3'UTR-SphIR (配列番号54)と共にRoche Titan One Tube RT-PCR系を使用して、RT-PCRを行った。該キットの説明書に従いRT-PCRを設定した[1サイクル(50℃で30分間)、1サイクル(94℃で2分間)、10サイクル(94℃で10秒間、60℃で30秒間、68℃で1分間)、25サイクル(94℃で10秒間、60℃で30秒間、68℃で1分間 + 各サイクルごとに5秒間のサイクル延長)、1サイクル(68℃で7分間)]。約1100bp長のバンドを切り出し、ゲル精製した(QIAquick Gel Extraction)。TOPO TA kit (Invitrogen)を使用してDNAをクローニングした。候補クローンをそれらの全体において自動DNAシークエンサー(例えば、Applied Biosystems, Inc.のモデル373)で配列決定した。
ゲノムDNAをA. thalianaの葉組織から単離した。センスプライマー5'UTR-HIIIF(配列番号53)およびアンチセンスプライマー3'UTR-SphIR (配列番号54)を使用して、標準的な条件下でのKTLA DNAポリメラーゼでのPCR反応[5サイクルの加熱サイクル(95℃で1分間、54℃で30秒間、68℃で2分間)、25サイクルの加熱サイクル(95℃で1分間、62℃で30秒間、68℃で2分間)]においてゲノムfad2 DNAを増幅した。PCR産物を1%アガロースゲル中で分画した。約2400bp長のバンドを切り出し、ゲル精製(QIAquick Gel Extraction)した。TOPO TAキット (Invitrogen)を使用してDNAをクローニングした。候補クローンをそれらの全体において自動DNAシークエンサー(例えば、Applied Biosystems, Inc.のモデル373)で配列決定した。
2ラウンドのPCRに基づくサブクローニング法を用いて、該キメラcDNAのすべてを作製した。第1ラウンドのPCRにおいては、センスプライマーFad-HIIIF (配列番号55) およびアンチセンスプライマー3' Fad/cas (配列番号57) を使用して、該fad2 cDNAクローンからの最初の114塩基を増幅した。センスプライマー5' -Fad/cas (配列番号58) およびアンチセンスプライマーCas-SalR (配列番号59)を使用して、標準的な条件下でのKTLA DNAポリメラーゼでのPCR[1サイクルの加熱サイクル(94℃で4分間)、5サイクルの加熱サイクル(94℃で45秒間、50℃で45秒間、68℃で60秒間)、25サイクルの加熱サイクル(94℃で45秒間、57℃で45秒間、68℃で60秒間)]により、Ricinus communisヒドロキシラーゼcDNAクローンの最後の1034塩基(TAAを除く)を増幅した。PCR産物を1%アガロースゲル中で分画した。該バンドを切り出し、クリーニングした(QIAquick Gel Extraction - 最終容量50μl)。そのクリーニングされた産物を1:100(TE)希釈し、両方のDNAを第2ラウンドのPCRにおいて鋳型(各1μl)として使用した。第2ラウンドのPCRにおいては、センスプライマーFad-HIIIF (配列番号55) およびアンチセンスプライマーCas-SalR (配列番号59) を使用して、標準的な条件下、KTLA DNAポリメラーゼで最終的なPCR産物fad2/Ricinus communisキメラcDNA[1サイクルの加熱サイクル(94℃で4分間)、5サイクルの加熱サイクル(94℃で45秒間、50℃で45秒間、68℃で60秒間)、25サイクルの加熱サイクル(94℃で45秒間、57℃で45秒間、68℃で60秒間)]を得た。約1300bp長のバンドを切り出し、ゲル精製した(QIAquick Gel Extraction)。TOPO TA kit (Invitrogen)を使用してDNAをクローニングした。候補クローンをそれらの全体において自動DNAシークエンサー(例えば、Applied Biosystems, Inc.のモデル373)で配列決定した。
同じ2ラウンドのPCRに基づくサブクローニング法を用いて、fad2/Lesquerella fendleriキメラcDNAを作製した。第1ラウンドのPCRプライマーは以下のとおりであった:A. thaliana fad2の5'末端を増幅するためには、センスプライマーFad-HIIIF (配列番号55) およびアンチセンスプライマー3'-Fad/les (配列番号60)を使用した。L. fendleri二官能性ヒドロキシラーゼ遺伝子の3'末端を増幅するためには、センスプライマー5' Fad/lesプライマー (配列番号61) およびアンチセンスプライマーLes-SalIR (配列番号62)を使用した。第2ラウンドのPCRにおいては、センスプライマーFad-HIIIF (配列番号55)およびアンチセンスプライマーLes-SalIR (配列番号62)を使用して、最終PCR産物fad2/Lesquerella fendleriキメラcDNAを作製した。
同じ2ラウンドのPCRに基づくサブクローニング法を用いて、fad2/ Lesquerella lindheimeriキメラcDNAを作製した。第1ラウンドのPCRプライマーは以下のとおりであった:A. thaliana fad2の5'末端を増幅するためには、センスプライマーFad-HIIIF (配列番号55) およびアンチセンスプライマー3'-Fad/lind (配列番号63)を使用した。L. lindheimeri二官能性ヒドロキシラーゼ遺伝子の3'末端を増幅するためには、センスプライマー5' Fad/lindプライマー (配列番号64) およびアンチセンスプライマーLind-SalIR (配列番号65)を使用した。第2ラウンドのPCRにおいては、センスプライマーFad-HIIIF (配列番号55)およびアンチセンスプライマーLind-SalIR (配列番号65)を使用して、最終PCR産物fad2/ Lesquerella lindheimeriキメラcDNAを作製した。
同じ2ラウンドのPCRに基づくサブクローニング法を用いて、fad2/Lesquerella gracilis AキメラcDNAを作製した。第1ラウンドのPCRプライマーは以下のとおりであった:A. thaliana fad2の5'末端を増幅するためには、センスプライマーFad-HIIIF (配列番号55) およびアンチセンスプライマー3'-Fad/grac (配列番号66)を使用した。L. gracilis二官能性ヒドロキシラーゼ遺伝子の3'末端を増幅するためには、センスプライマー5' Fad/gracプライマー (配列番号67) およびアンチセンスプライマーGrac-SalIR (配列番号68)を使用した。第2ラウンドのPCRにおいては、センスプライマーFad-HIIIF (配列番号55)およびアンチセンスプライマーGrac-SalIR (配列番号68)を使用して、最終PCR産物fad2/Lesquerella gracilis AキメラcDNAを作製した。
同じ2ラウンドのPCRに基づくサブクローニング法を用いて、fad2/Crepis biennisキメラcDNAを作製した。第1ラウンドのPCRプライマーは以下のとおりであった:A. thaliana fad2の5'末端を増幅するためには、センスプライマーFad-HIIIF (配列番号55) およびアンチセンスプライマー3'-Fad/crep (配列番号69)を使用した。C. biennisエポキシゲナーゼの3'末端を増幅するためには、センスプライマー5' Fad/crepプライマー (配列番号70) およびアンチセンスプライマーCrep-SalIR (配列番号71)を使用した。第2ラウンドのPCRにおいては、センスプライマーFad-HIIIF (配列番号55)およびアンチセンスプライマーCrep-SalIR (配列番号71)を使用して、最終PCR産物fad2/ Crepis biennisキメラcDNAを作製した。
これらの研究の全体にわたり、Saccharomyces cerevisiae株YPH499(MATa ura3-52 lys2-801 ase2-101 trp1-Δ63 his3-Δ2000 leu2-Δ1) およびINVsc1 (MATa his3-Δ1 leu2 trp1-289 ura3-52/MATαhis3Δ1 leu2 trp1-289 ura3-52)を使用した。
酵母株を形質転換するために、プラスミドpYES2 (Invitrogen)を使用した。該プラスミドは大腸菌(E. coli)複製起点、酵母プラスミド複製起点、大腸菌(E. coli)アンピシリン耐性遺伝子および酵母遺伝子URA3を含有する。それは、ガラクトース誘導性プロモーター(GAL-1)を含む発現カセットを使用する。
R. communisヒドロキシラーゼおよびL .gracilis二官能性ゲノムクローンの修飾を、特異的プライマーを使用するPCR増幅により行った。
R. communisヒドロキシラーゼ、N末端HAタグを有するR. communisヒドロキシラーゼ、C末端HAタグを有するR. communisヒドロキシラーゼ、L. lindheimeri二官能性酵素、N末端HAタグを有するL. lindheimeri二官能性酵素、ΔT L. gracilisおよびΔKKGG R. communisヒドロキシラーゼの配列決定を、当業者によく知られた方法を用いて自動シークエンサー(例えば、Applied Biosystems, Inc.のモデル373)を使用して行った。
Invitrogen pYES2キット (V825-20)に従い、形質転換を行った。新鮮な酵母培養(初期吸光度 = 0.4)をYPD培地内で4時間成長させた。該細胞を集め、1×TE中で1回洗浄し、2 mLの1×LiAc/0.5×TE (100mm 酢酸リチウム pH 7.5, 5mm tris-HCL pH 7.5, 0.5mm EDTA)に再懸濁させた。100μgの変性ニシン精子DNAをDNA担体として、1μgの該プラスミドDNAに加えた。100μlのコンピテント酵母および700μlの1×liAc/40%PEG-3350/1×TE (100mM 酢酸リチウム pH 7.5, 40% PEG-3350, 10 mM tris-HCL pH 7.5, 1 mM EDTA)を加えた。該混合物を30℃で30分間インキュベートした。88μlのDMSOを加え、該混合物を42℃で7分間インキュベートした。遠心分離後、該細胞を1×TE(100μl)に再懸濁させ、適当な補足物を含有する最少培地上でプレーティングした。
ヒドロキシラーゼまたは二官能性酵素のインサートも遺伝子も含有しない、pYES2プラスミドで形質転換された酵母株を、同時に増殖させた。リシノール酸の分析のために、2%グルコースおよび1%カザアミノ酸で補足されたSC-URA(ウラシルを欠く酵母合成完全培地, Sigma)内で、2,5の光学濃度(600nm)になるまで形質転換細胞を30℃で増殖させた。ついで細胞を遠心分離し、グルコースを含有しないSC-URA培地内で3回洗浄し、2%グルコースおよび1%カザアミノ酸で補足されたSC-URA培地(ウラシルを欠く酵母合成完全培地, Sigma)内で30℃で48時間培養した。培養を遠心分離し、乾燥させた。
乾燥酵母ペレットを(メタノール中の400μLの1%ナトリウムメトキシド)でメチル化し、ヘキサンで抽出し、トリメチルシリル化(100μLのBSTAFA-TMCS, Supelco, 90℃で45分間)した。サンプルをAgilent 6890 GC-5973 Mass Selective Detector (GC/MS) およびAgilent DB-23キャピラリーカラム (0.25 mm×30 m×0.25 μm)上で分析した。インジェクターを250℃に維持し、オーブン温度を235℃にし、1.0mL/分のヘリウム流を維持した。
pUCAPベクター[Engelenら (1995) Transgenic Res. 4(4):288-290]を修飾して、pUCAP2、pUCAP3、pUCAP4、pUCAP5およびpUCAP6を得た。
オリゴヌクレオチドHAタグ-F (配列番号109) およびHA-タグ-R (配列番号110)を混合し、標準的な方法を用いてアニールさせた。該アニール化産物はHidIIIおよびBamHI制限部位の適合性末端を生成し、該産物をプラスミドベクターpUC118内にクローニングしてプラスミドpUC-HAを得た。
A. thalianaゲノムDNAを鋳型として使用した。KTLAは、PCRに適したDNAポリメラーゼであった。プライマーFad5'UTR-F (配列番号111) およびFad5'UTR-R (配列番号112)を使用して、5'UTR、第1イントロンおよびfad2(5'末端において制限部位XhoIに、および3'末端においてNcoI、BamHIに隣接するもの)の第1コドンをPCR増幅した。PCR反応は標準的な条件下で以下のとおりに行った:97℃で30秒間、35サイクルの増幅(94℃で45秒間、55℃で1分間、72℃で90秒間)および72℃で5分間の最終伸長。PCR産物をプラスミドベクターpCR2.1 (Invitrogen)内にクローニングした。
R. communisヒドロキシラーゼおよびL. lindheimeri二官能性ヒドロキシラーゼゲノムクローンを、特異的プライマーを使用するPCR増幅により作製した。
構築物Rc-pUCAP3、Ll-pUCAP4およびRc-pUCAP6をAscIおよびPacIで消化してインサートを遊離させ、ついでインサートを、[Engelenら (1995) Transgenic Res. 4(4):288-290]に記載のとおりに操作されたpBinPlusARSバイナリーベクターのAscI/PacI部位内にサブクローニングして、Rc-3pBinPlusARS、Ll4-pBinPlusARSおよびRc6-pBinPlusARSを得た。
ヒドロキシラーゼ、エポキシゲナーゼまたはキメラfad2構築物をコードする遺伝子を含有する植物発現ベクターを、以下のとおりにAgrobacterium tumefaciens LB4404内に形質転換した。Agrobacteriumを100mLのLB[カナマイシン(50μg/mL)、リファンピシン(10μg/mL)およびストレプトマイシン(150μg/mL)で補足された(1% バクトトリプトン、0.5% 塩化ナトリウムおよび0.5% バクト-酵母エキス)]中、一晩増殖させた。同様にして補足された100mLのLBを1mLの該一晩培養物に接種し、30℃で4時間成長させた。該培養を10分間冷却し、細胞を遠心分離により集めた。細胞を1mLの氷冷CaCl2 (20 mM)に再懸濁させ、100μLアリコートに分配した。1μgのプラスミドDNAを該細胞に加え、ドライアイス上で凍結させ、37℃で5分間放置し、1mLのLB中、30℃で90分間振とうした。細胞をペレット化し、100μLのLBに再懸濁させ、LBプレート[カナマイシン(50μg/mL)、リファンピシン(10μg/mL)およびストレプトマイシン(150μg/mL)で補足された(1% バクトトリプトン、0.5% 塩化ナトリウム、0.5% バクト-酵母エキスおよび0.15% 寒天)]上でプレーティングした。
CloughおよびBent [Clough & Bent (1998) Plant J. 19(3):249-257]に従い、Agrobacterium tumefaciensを介して、Arabidopsis thalianaを形質転換した。簡潔に説明すると、形質転換されたLB4404(LB-10μg/mL リファンピシン、50μg/mL カナマイシン、150μg/mL ストレプトマイシン)の5mLの一晩培養物を30℃で成長させた。該5ml培養物を使用して500mL LB(10μg/mL リファンピシン、50μg/mL カナマイシン、150μg/mL ストレプトマイシン)に接種し、30℃で一晩成長させた。培養を遠心沈殿(5K, 5分間)させた。ペレットを5%グルコース + 0.02% Silwet L-77に再懸濁させた。該植物の地上部を、穏やかに攪拌しながらAgrobacterium溶液に5分間浸漬した。植物をドームの下に一晩覆った。
植物材料の作製
種子の滅菌: 該形質転換植物からの約200個の第2世代種子をエッペンドルフチューブ内に配置した。エタノール中の1mLの20%漂白剤を加え、該チューブを室温で15分間放置した。ついで該種子を100%エタノールで2回洗浄し、開いたチューブを層流フード内に放置して一晩乾燥させた。
植物材料の調製: このプロトコールはトマトの根の形質転換のために用いた。形質転換剤としてはA. rhizogenesの多数の株を使用することが可能であるが、この場合には株A4 (ATCC番号43057)を使用した。Lycopersicon esculentum cv. Rutgers、Money MakerまたはMountain Springを使用したが、Meloidogyne incognita (M. incognita)感染に対して感受性である他の品種を使用することも可能である。対照として、耐性品種Motelleを使用した [Vosら (1998) Nat. Biotechnol. 16: 1365-1369]。このプロトコールは、Arabidopsis thaliana, ecotype Columbiaからの毛状根培養を作製するためにも用いることが可能である。
約0.25gの根組織を1.5mLエッペンドルフチューブ内に配置し、ドライアイス上で凍結させ、ついで乳棒で粉砕した。ついで該粉砕根組織をメチル化(メタノール中の500μLの1%ナトリウムメトキシド)し、ヘキサンで抽出し、トリメチルシリル化(100μLのBSTAFA-TMCS, Supelco, 90℃で45分間)した。サンプルをAgilent 6890 GC-5973 Mass Selective Detector (GC/MS) およびAgilent DB-23キャピラリーカラム (0.25 mm×30 m×0.25 μm)上で分析した。インジェクターを250℃に維持し、オーブン温度を235℃にし、1.0mL/分のヘリウム流を維持した。
種子の滅菌: 約250個の種子を100×25mmプレート内に配置し、換気フード内のデシケーター内に配置した。350mLビーカーを使用して、2mLの濃HClを200mLの100%漂白剤に注意深く加え、該種子が滅菌ガスにさらされるよう該ビーカーをデシケーター内に配置した。24時間後、該方法を繰返した。合計3回の滅菌のために、これを3回行った。無菌性を試験するために、10個の種子をLB内に配置し、37℃で24時間、振とう器上に配置した。該LBが、細菌増殖の非存在を示す透明であれば、該種子をペトリディッシュ内で密封し、後日、発芽させた。細菌増殖が見られたら、該滅菌法を再度行った。
種子の滅菌: 約200個の種子をエッペンドルフチューブ内に配置した。エタノール中の1mLの20%漂白剤を加え、該チューブを室温で15分間放置した。ついで該種子を100%エタノールで2回洗浄し、開いたチューブを層流フード内に放置して一晩乾燥させた。
植物材料の調製: このプロトコールはトランスジェニックトマトアルスの作製のために用いられうる。行った全ての形質転換においては、Agrobacterium tumefaciens株LB4404およびトマト品種Lycopersicon esculentum cv. Rutgers、Money MakerまたはMountain Springを使用した。毛状根形質転換の節において記載されているとおりに、トマト子葉を成長させた。
Agrobacterium rhizogenes A4培養を、適当な抗生物質を含有するルリアブロス(Luria Broth)内で30℃で一晩成長させた。培養を4,000gで10分間遠心沈殿させた。細胞を0.2〜0.5の最終O.D.600nmまで1/4 MSに懸濁させた。
ゴール(虫こぶ)の数: 30〜35日後に、低倍率下で計数することにより、1プレート当たりのゴールの数を測定した。ゴールの総数ならびに成体および卵保有雌の数を記録した。あるいは、根のフクシン染色により[Eisenback (2000) Techniques for measuring nematode development and egg production. in Laboratory Techniques in Nematode Ecology. Wheelerら編, Society of Nematologists: Hyattsville, MD. p.1-4]、すべての段階におけるM. incognitaの総数を測定した。
0 ゴールは無し
1 1〜2個の小さなゴール
3 3〜5個の小さなゴール
5 5個を超えるゴール、しかし複合ゴールは無し
10 いくつかの小さなゴールおよび少なくとも1つの複合ゴール
25 該根の25%が複合ゴールを有する; 多数の小さなゴール
50 該根の50%が複合ゴールを有する
75 該根の75%が複合ゴールを有する
90 根全体がゴール形成しており、矮化している
このアッセイは、根におけるダイズシスト線虫(Heterodera glycines)の感染およびその繁殖に対するダイズ植物の耐性を評価するために用いる。直径3〜4インチ平方のポットを清潔な砂で満たし、それに十分に水をやった。ダイズ種子または任意の発根植物部分をポットの中央にポットごとに植付けし、それに十分に水をやって、空気塊を除去した。該植物が、接種に適した齢になるまで、該ポットを温室またはグロースチャンバー内で20℃〜30℃でインキュベートした。種子から開始したダイズは、典型的には、植付けの2〜3週間後に接種し、一方、移植体は、植付けの1〜3日後に接種する。試験接種物は、侵襲されたダイズ植物の土壌および根から集めた成熟H. glycinesシストからの卵よりなるものであった。250ミクロンメッシュの篩いを使用して該シストを集め、ついでそれをTenbroeckガラス組織ホモジナイザー内で粉砕して卵を遊離させた。該卵を更に、篩い及び40%スクロース溶液上での4000RPMで5分間の遠心分離により精製した。実験用接種物は、1mL当たり500個の虫様卵を含有する水よりなるものであった。該卵懸濁液の5mLを、該試験植物を含有する砂の表面上でピペッティングし、該卵を軽く水で濡らした。ついで該試験植物を温室またはグロースチャンバーに戻し、3〜4週間インキュベートして、根感染およびシスト形成を引き起こさせた。ついで該ポットおよび砂を穏やかに除去し、水中ですすぐことにより、該根を集めた。該根系に付着した白色線虫シストの数を計数することにより、線虫感染の重症度を測定した。あるいは、該砂および根を水で希釈し、250ミクロンの篩いに通して、保存または計数のために該シストを集め濃縮することが可能であろう。
本発明はその詳細な説明と共に記載されているが、前記の説明は、添付の特許請求の範囲により定められる本発明を例示するものであり、本発明の範囲を限定するものではないと意図される。他の態様、利点および修飾も特許請求の範囲内に含まれる。
Claims (118)
- 少なくとも1つのDNA構築物を含有するトランスジェニック植物であって、該構築物が、
(a)
i)
ii)
よりなる群から選ばれるC16、C18またはC20モノ不飽和脂肪酸産物への、基質からの変換を触媒するのに有効なポリペプチドをコードする核酸と、
(b)該ポリペプチドをコードする核酸に機能しうる形で連結された、該植物の栄養組織における発現をもたらす調節要素とを含む、トランスジェニック植物。 - 第9炭素と第10炭素との間の二重結合がシスである、請求項1記載の植物。
- 第9炭素と第10炭素との間の二重結合がトランスである、請求項1記載の植物。
- 該調節要素が5'-調節要素である、請求項1記載の植物。
- 5'-調節要素が根組織における発現をもたらす、請求項4記載の植物。
- 該植物が、該DNA構築物を欠く対応植物と比較して有意に増加した量のヒドロキシ脂肪酸を該植物の根に含有する、請求項5記載の植物。
- ヒドロキシ脂肪酸がリシノール酸である、請求項6記載の植物。
- リシノール酸が該根の全脂肪酸含量の約0.1%〜約25%を構成する、請求項7記載の植物。
- 該植物が、該DNA構築物を欠く対応植物と比較して有意に増加した量のエポキシ脂肪酸を該植物の根に含有する、請求項5記載の植物。
- エポキシ脂肪酸がベルノール酸である、請求項9記載の植物。
- ベルノール酸が該根の全脂肪酸含量の約0.1%〜約25%を構成する、請求項10記載の植物。
- 5'-調節要素が、CaMV35Sプロモーター、ジャガイモリボソームタンパク質S27a Ubi3プロモーター、RB7プロモーター、アルファルファヒストンH3.2プロモーター、IRT2プロモーター、Arabidopsis FAD2 5'-UTR、Arabidopsis FAD3 5'-UTR、Ubi3 5'-UTR、アルファルファヒストンH3.2 5'-UTRおよびCaMV35S 5'-UTRよりなる群から選ばれる、請求項4記載の植物。
- 該調節要素が、第2の5'-調節要素に機能しうる形で連結された第1の5'-調節要素を含み、第1の5'-調節要素がUbi3プロモーターであり、第2の5'-調節要素が、Arabidopsis FAD2 5'-UTR、Arabidopsis FAD3 5'-UTR、ジャガイモリボソームタンパク質S27 a 5'-UTR、Ubi3 5'-UTRおよびCaMV35S 5'-UTRよりなる群から選ばれる、請求項1記載の植物。
- 該DNA構築物が更に、3'-調節要素を含む、請求項4記載の植物。
- 3'-調節要素がUbi3ターミネーターまたはE9エンドウ(pea)ターミネーターを含む、請求項4記載の植物。
- 5'-調節要素が、Arabidopsis FAD2 5'-UTRおよびArabidopsis FAD3 5'-UTRよりなる群から選ばれ、3'-調節要素が、Arabidopsis FAD2 3'-UTRおよびArabidopsis FAD3 3'-UTRよりなる群から選ばれる、請求項14記載の植物。
- 5'-調節要素が配列番号43または44を含み、3'-調節要素が配列番号45を含む、請求項16記載の植物。
- 前記の少なくとも1つのDNA構築物が更に、PDATまたはDAGATポリペプチドをコードする核酸に機能しうる形で連結された、植物の栄養組織における発現をもたらす少なくとも1つの調節要素を含む、請求項1記載の植物。
- 該植物が更に、第2のDNA構築物を含み、この第2のDNA構築物が、PDATまたはDAGATポリペプチドをコードする核酸に機能しうる形で連結された、植物の栄養組織における発現をもたらす少なくとも1つの調節要素を含む、請求項1記載の植物。
- R3がC2アルキルまたはC4アルキルである、請求項1記載の植物。
- 該ポリペプチドが、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、C. palaestinaエポキシゲナーゼGenBank(登録商標)No. CAA76156、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137および配列番号138よりなる群から選ばれる、請求項1記載の植物。
- 該ポリペプチドが配列番号37を含む、請求項21記載の植物。
- 該ポリペプチドが配列番号38を含む、請求項21記載の植物。
- 該ポリペプチドが配列番号14を含む、請求項21記載の植物。
- 該ポリペプチドが配列番号15を含む、請求項21記載の植物。
- 該ポリペプチドが配列番号16を含む、請求項21記載の植物。
- 該ポリペプチドが配列番号40を含む、請求項21記載の植物。
- 該ポリペプチドが配列番号41を含む、請求項21記載の植物。
- 該ポリペプチドをコードする核酸がGenBank(登録商標)アクセッション番号CAA76156を含む、請求項21記載の植物。
- 該ポリペプチドが配列番号34を含む、請求項21記載の植物。
- 該ポリペプチドが配列番号35を含む、請求項21記載の植物。
- 該ポリペプチドをコードする核酸が配列番号28である、請求項22記載の植物。
- 該ポリペプチドをコードする核酸が配列番号29である、請求項23記載の植物。
- 該ポリペプチドをコードする核酸が配列番号2である、請求項24記載の植物。
- 該ポリペプチドをコードする核酸が配列番号3である、請求項25記載の植物。
- 該ポリペプチドをコードする核酸が配列番号4である、請求項26記載の植物。
- 該ポリペプチドをコードする核酸が配列番号31である、請求項27記載の植物。
- 該ポリペプチドをコードする核酸が配列番号32である、請求項28記載の植物。
- 該ポリペプチドをコードする核酸が配列番号25である、請求項30記載の植物。
- 該ポリペプチドをコードする核酸が配列番号26である、請求項31記載の植物。
- 該ポリペプチドが、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24およびC. palaestinaエポキシゲナーゼキメラよりなる群から選ばれる、請求項1記載の植物。
- 該ポリペプチドが配列番号19である、請求項41記載の植物。
- 該ポリペプチドが配列番号20である、請求項41記載の植物。
- 該ポリペプチドが配列番号21である、請求項41記載の植物。
- 該ポリペプチドが配列番号22である、請求項41記載の植物。
- 該ポリペプチドが配列番号23である、請求項41記載の植物。
- 該ポリペプチドが配列番号24である、請求項41記載の植物。
- 該ポリペプチドをコードする核酸が配列番号7である、請求項42記載の植物。
- 該ポリペプチドをコードする核酸が配列番号8である、請求項43記載の植物。
- 該ポリペプチドをコードする核酸が配列番号9である、請求項44記載の植物。
- 該ポリペプチドをコードする核酸が配列番号10である、請求項45記載の植物。
- 該ポリペプチドをコードする核酸が配列番号11である、請求項46記載の植物。
- 該ポリペプチドをコードする核酸が配列番号12である、請求項47記載の植物。
- 該植物が、タバコ、トマト、ダイズ、トウモロコシ、ワタ、イネ、コムギ、バナナ、ニンジン、ジャガイモ、イチゴおよび芝生草植物よりなる群から選ばれる、請求項1記載の植物。
- 請求項1記載の構築物を植物内に導入することを含んでなる、トランスジェニック植物の生産方法。
- 該構築物の調節要素が5'-調節要素である、請求項55記載の生産方法。
- 5'-調節要素が、CaMV35Sプロモーター、ジャガイモリボソームタンパク質S27a Ubi3プロモーター、RB7プロモーター、アルファルファヒストンH3.2プロモーター、IRT2プロモーター、Arabidopsis FAD2 5'-UTR、Arabidopsis FAD3 5'-UTR、Ubi3 5'-UTR、アルファルファヒストンH3.2 5'-UTRおよびCaMV35S 5'-UTRを含む、請求項56記載の生産方法。
- 該調節要素が、第2の5'-調節要素に機能しうる形で連結された第1の5'-調節要素を含み、第1の5'-調節要素がUbi3プロモーターであり、第2の5'-調節要素が、Arabidopsis FAD2 5'-UTR、Arabidopsis FAD3 5'-UTR、ジャガイモリボソームタンパク質S27 a 5'-UTR、Ubi3 5'-UTRおよびCaMV35S 5'-UTRよりなる群から選ばれる、請求項56記載の生産方法。
- 該DNA構築物が更に、3'-調節要素を含む、請求項56記載の生産方法。
- 5'-調節要素が配列番号43または配列番号44を含み、3'-UTRが配列番号45を含む、請求項59記載の生産方法。
- 該DNA構築物の核酸が、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、C. palaestinaエポキシゲナーゼGenBank(登録商標)No. CAA76156、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137および配列番号138よりなる群から選ばれるポリペプチドをコードする、請求項55記載の生産方法。
- 該ポリペプチドが配列番号13を含む、請求項55記載の生産方法。
- 該ポリペプチドが配列番号19を含む、請求項55記載の生産方法。
- 該ポリペプチドが配列番号20を含む、請求項55記載の生産方法。
- 該ポリペプチドが配列番号21を含む、請求項55記載の生産方法。
- 該ポリペプチドが配列番号22を含む、請求項55記載の生産方法。
- 該ポリペプチドが配列番号23を含む、請求項55記載の生産方法。
- 該ポリペプチドが配列番号24を含む、請求項55記載の生産方法。
- 該ポリペプチドが配列番号36を含む、請求項55記載の生産方法。
- 該ポリペプチドが配列番号37を含む、請求項55記載の生産方法。
- 該ポリペプチドが配列番号38を含む、請求項55記載の生産方法。
- 該ポリペプチドが配列番号40を含む、請求項55記載の生産方法。
- 該ポリペプチドが配列番号41を含む、請求項55記載の生産方法。
- 配列番号3〜12または25〜33または129〜133のいずれか1つに記載のヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸。
- 該ヌクレオチド配列が配列番号3である、請求項74記載の単離された核酸。
- 該ヌクレオチド配列が配列番号4である、請求項74記載の単離された核酸。
- 該ヌクレオチド配列が配列番号5である、請求項74記載の単離された核酸。
- 該ヌクレオチド配列が配列番号28である、請求項74記載の単離された核酸。
- 植物の栄養組織における発現をもたらす少なくとも1つの調節要素を含んでなる組換え核酸構築物であって、該調節要素が、配列番号3〜12または25〜33または129〜133のいずれか1つに記載のヌクレオチド配列を有する核酸に機能しうる形で連結されている、組換え核酸構築物。
- 前記の少なくとも1つの調節要素が、配列番号43または配列番号44に記載のヌクレオチド配列を有する5'-調節要素を含む、請求項79記載の核酸構築物。
- 該構築物が更に、配列番号45に記載のヌクレオチド配列を有する3'-調節要素を含む、請求項80記載の核酸構築物。
- 請求項1記載のトランスジェニック植物を、該植物が駆虫活性を有するか否かを判定するのに有効な条件下で複数の線虫と接触させることを含む、トランスジェニック植物を駆虫活性に関してスクリーニングするための方法。
- 該線虫を該トランスジェニック植物の根の1以上と接触させる、請求項82記載の方法。
- 請求項1記載のトランスジェニック植物からの組織を、該植物組織が駆虫活性を有するか否かを判定するのに有効な条件下で複数の線虫と接触させることを含む、トランスジェニック植物を駆虫活性に関してスクリーニングするための方法。
- 該組織が根組織である、請求項84記載の方法。
- 脂肪酸エポキシゲナーゼポリペプチドまたは脂肪酸ヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする核酸を含むDNA構築物を含有するトランスジェニック植物であって、該核酸が、該植物の栄養組織における該ポリペプチドの発現をもたらす調節要素に機能しうる形で連結されている、トランスジェニック植物。
- 該ポリペプチドが、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、C. palaestinaエポキシゲナーゼ(GenBank(登録商標)No. CAA76156)、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137および配列番号138よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む、請求項86記載の植物。
- 該植物が、該DNA構築物を欠く対応植物と比較して有意に増加した量のヒドロキシ脂肪酸を該植物の根に含有する、請求項86記載の植物。
- ヒドロキシ脂肪酸がリシノール酸である、請求項88記載の植物。
- リシノール酸が該根の全脂肪酸含量の約0.1%〜約25%を構成する、請求項89記載の植物。
- 該植物が、該DNA構築物を欠く対応植物と比較して有意に増加した量のエポキシ脂肪酸を該植物の根に含有する、請求項86記載の植物。
- エポキシ脂肪酸がベルノール酸である、請求項91記載の植物。
- ベルノール酸が該根の全脂肪酸含量の約0.1%〜約25%を構成する、請求項92記載の植物。
- 該ポリペプチドが配列番号42を含む、請求項21記載の植物。
- 該ポリペプチドが配列番号134を含む、請求項21記載の植物。
- 該ポリペプチドが配列番号135を含む、請求項21記載の植物。
- 該ポリペプチドが配列番号136を含む、請求項21記載の植物。
- 該ポリペプチドが配列番号137を含む、請求項21記載の植物。
- 該ポリペプチドが配列番号138を含む、請求項21記載の植物。
- 該ポリペプチドをコードする核酸が配列番号33である、請求項94記載の植物。
- 該ポリペプチドをコードする核酸が配列番号129である、請求項95記載の植物。
- 該ポリペプチドをコードする核酸が配列番号130である、請求項96記載の植物。
- 該ポリペプチドをコードする核酸が配列番号131である、請求項97記載の植物。
- 該ポリペプチドをコードする核酸が配列番号132である、請求項98記載の植物。
- 該ポリペプチドをコードする核酸が配列番号133である、請求項99記載の植物。
- 該ポリペプチドが配列番号42を含む、請求項55記載の植物。
- 該ポリペプチドが配列番号134を含む、請求項55記載の植物。
- 該ポリペプチドが配列番号135を含む、請求項55記載の植物。
- 該ポリペプチドが配列番号136を含む、請求項55記載の植物。
- 該ポリペプチドが配列番号137を含む、請求項55記載の植物。
- 該ポリペプチドが配列番号138を含む、請求項55記載の植物。
- 少なくとも1つのDNA構築物を含有するトランスジェニック植物であって、該構築物が、
a)
i)
ii)
よりなる群から選ばれるC16、C18またはC20モノ不飽和脂肪酸産物への、基質からの変換を触媒するのに有効なポリペプチドをコードする核酸と、
(b)該ポリペプチドをコードする核酸に機能しうる形で連結された、該植物の種子の組織の少なくとも1つにおける発現をもたらす調節要素とを含む、トランスジェニック植物。 - 該調節要素が5'-調節要素である、請求項112記載の植物。
- 該植物が、該DNA構築物を欠く対応植物と比較して有意に増加した量のヒドロキシ脂肪酸を該植物の種子の組織の少なくとも1つに含有する、請求項113記載の植物。
- ヒドロキシ脂肪酸がリシノール酸である、請求項114記載の植物。
- 該植物が、該DNA構築物を欠く対応植物と比較して有意に増加した量のエポキシ脂肪酸を該植物の種子の組織の少なくとも1つに含有する、請求項113記載の植物。
- エポキシ脂肪酸がベルノール酸である、請求項116記載の植物。
- 請求項112記載の構築物を植物内に導入することを含んでなる、トランスジェニック植物の生産方法。
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